Regulación de la expresión génica en un modelo de insuficiencia renal crónica

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE CIENCIAS MÉDICAS Y QUIRÚRGICAS “REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN UN MODELO DE INSUFICIENCIA RENAL CRÓNICA” MEMORIA PRESENTADA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR POR ALEJANDRO ÁLVAREZ PRATS Bajo la di ección de los Doc o es: Oc a io He nández Pe e a. José Ca los Rod íguez Pé ez. Los di ec o es El doc o ando Las Palmas de G an Cana ia, 2010 D. OCTAVIO HERNÁNDEZ PERERA, INVESTIGADOR DE LA UNIDAD DE INVESTIGACIÓN DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO DE GRAN CANARIA DR. NEGRÍN. CERTIFICA: Que el abajo de in es igación i ulado “REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN UN MODELO DE INSUFICIENCIA RENAL CRÓNICA.”, ha sido ealizado po D. Alejand o Ál a ez P a s, en la Unidad de In es igación del Hospi al Uni e si a io de G an Cana ia D . Neg ín, bajo su di ección y aseso amien o écnico, y que una ez e isada la p esen e Memo ia la encuen a ap a pa a su de ensa como Tesis Doc o al. Y pa a que así cons e y su a los e ec os opo unos, ex iende el p esen e ce i icado en Las Palmas de G an Cana ia a 10 de Diciemb e de 2010. Fdo: D . Oc a io He nández Pe e a. D. JOSÉ CARLOS RODRÍGUEZ PÉREZ, INVESTIGADOR DE LA UNIDAD DE INVESTIGACIÓN DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO DE GRAN CANARIA DR. NEGRÍN Y PROFESOR TITULAR DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. CERTIFICA: Que el abajo de in es igación i ulado “REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN UN MODELO DE INSUFICIENCIA RENAL CRÓNICA.”, ha sido ealizado po D. Alejand o Ál a ez P a s, en la Unidad de In es igación del Hospi al Uni e si a io de G an Cana ia D . Neg ín, bajo su di ección y aseso amien o écnico, y que una ez e isada la p esen e Memo ia la encuen a ap a pa a su de ensa como Tesis Doc o al. Y pa a que así cons e y su a los e ec os opo unos, ex iende el p esen e ce i icado en Las Palmas de G an Cana ia a 10 de Diciemb e de 2010. Fdo: D . José Ca los Rod íguez Pé ez. “Un cien í ico debe oma se la libe ad de plan ea cualquie cues ión, de duda de cualquie a i mación, de co egi e o es”. Julius Robe Oppenheime . AGRADECIMIENTOS Quie o exp esa mi ag adecimien o a los D s. Oc a io He nández Pe e a y José Ca los Rod íguez Pé ez po su di ección, ayuda y con inuo es ímulo en la elabo ación del p esen e p oyec o de esis doc o al. También me gus a ía ag adece a odos los compañe os de la Unidad de In es igación del Hospi al Uni e si a io de G an Cana ia D . Neg ín la ayuda p es ada du an e es os años, especialmen e a A ánzazu Anabi a e P ie o, ca iñosamen e A anxa, po habe compa ido desin e esadamen e sus conocimien os de ci ugía expe imen al conmigo con an o humo y disposición. A la D a. Pila Díaz He e a po su ayuda y en ega en los análisis his ológicos. Al D . G ego io Ca e e o He nández po habe me con agiado su en usiasmo y habe in luido de o ma muy posi i a en mi o mación como in es igado . A oda mi amilia po su apoyo y su capacidad pa a sopo a es os años de abajo y sac i icio. RESUMEN La in lamación y la ib osis son ca ac e ís icas undamen ales de las en e medades enales. Nues o obje i o ue e alua las en ajas de di e en es a amien os a macológicos y su elación con la ac i ación de NF- κB y AP-1. Las a as some idas a 5/6 de ne ec omía ue on u ilizadas como con oles o a adas con losa án, ce i as a ina, losa án más ce i as a ina, ca edilol, o el an agonis a no selec i o de los ecep o es ETA/ETB , Ro 48- 5695, desde el día 7 has a el día 42 de la ne ec omía. En con as e con el g upo Sham, a los 7 días las a as ne ec omizadas no mos a on lesiones enales pe o sí albuminu ia y aumen o de la p esión a e ial sis ólica (PAS). Po o a pa e, no se de ec a on cambios en la exp esión génica de TGF-β pe o sí educción de BMP7 y de KCP. Es os esul ados con as a on con los ni eles de ánsc i o de di e en es colágenos, ib onec ina 1, laminina B1 y MCP-1, que expe imen a on un cla o inc emen o, lo que sugie e que la educción de los ni eles de BMP7 y KCP pod ía juga un papel impo an e en la génesis de la en e medad enal c ónica (ERC). A las 6 semanas, las a as ne ec omizadas sin a amien o mos a on albuminu ia, inc emen o de la PAS y lesiones enales. Los ex ac os nuclea es aislados de la co eza enal de las a as some idas a ablación enal, p esen a on ni eles aumen ados de la subunidad NF-κB p65 y de c-Fos, miemb o p incipal de la amilia AP-1. También, se obse ó aumen o de exp esión génica de TGF- β1, a ios ipos de colágeno, ib onec ina 1, p e-p oendo elina-1 y MCP-1. Cuando las a as ecibie on la e apia combinada de losa án y ce i as a ina, la exp esión de los mediado es molecula es de la ib osis enal, así como las ac i idades de AP-1 y NF- κB, ue on muy pa ecidas a las del g upo Sham; sin emba go, la e icacia del es o de a amien os ue cla amen e más limi ada. Tan o la ac i idad de NF-κB como de AP-1 mos a on asociación con las asas de daño enal y con la exp esión del RNAm de ib onec ina 1, p e-p oendo elina-1 y MCP-1. Sin emba go, la al a de co elación en e las ac i idades de AP-1 y NF-κB sugi ie e que ambos ac o es de ansc ipción pod ían con ibui independien emen e al desa ollo de la ib osis enal en el modelo de 5/6 de ne ec omía, y que la combinación a macológica de un ARAII y una es a ina pod ía o ece mayo enop o ección po su capacidad pa a no maliza las ac i idades de NF-κB y AP-1 simul áneamen e. SUMMARY In lamma ion and ib osis a e he main cha ac e is ics o enal diseases. Ou aim was o e alua e he ad an ages o di e en pha macological app oaches and hei ela ion wi h he ac i a ion o NF-κB and AP-1. Sub o ally neph ec omized (Nx) a s we e used as con ols o we e ea ed wi h losa an, ce i as a in, losa an plus ce i as a in, ca edilol, o he ETA/ETB ecep o an agonis Ro 48-5695 om day 7 o day 42 a e neph ec omy. In con as o he Sham g oup, a se en days Nx a s showed no kidney damage, bu albuminu ia and inc eases in sys olic blood p essu e (SBP) we e obse ed. BMP7 and KCP genes we e down egula ed, whe eas no change in he exp ession o TGF-β was de ec ed. Fu he mo e, ansc ip le els o se e al collagen molecules, ib onec in 1, laminin B1 and MCP-1 we e inc eased sugges ing ha down egula ion o BMP7 and KCP could be playing an impo an ole in he genesis o ch onic kidney disease (CKD). A 6 weeks, un ea ed Nx a s displayed albuminu ia, inc eases in SBP and enal lesions. Nuclea ex ac s om enal co ex o Nx a s gi en ehicle exhibi ed inc eased le els o NF-κB p65 subuni and c-Fos, a main AP-1 amily membe . T ansc ip le els o TGF-β1, se e al collagen molecules, ib onec in 1, p e-p oendo helin-1 and MCP-1 we e also aised. When a s ecei ed adjunc i e he apy wi h losa an plus ce i as a in, exp ession o he molecula media o s o enal ib osis and he ac i i y o AP-1 and NF-κB closely esembled ha o he sham g oup, whe eas he e ec i eness o o he ea men s was much mo e limi ed. Ac i i y o bo h NF-κB and AP-1 was associa ed wi h enal inju y sco es and wi h mRNA exp ession o ib onec in 1, p e-p oendo helin-1 and MCP-1. Howe e , alues o NF-κB ac i i y we e no co ela ed wi h hose o AP-1, sugges ing ha bo h nuclea ac o s could con ibu e independen ly o he enal disease p og ession and ha combina ion he apy wi h an angio ensin II ecep o an agonis and a s a in could con e ad an ages on kidney p o ec ion h ough simul aneous no maliza ion o NF-κB and AP-1 ac i i y.  ÍNDICE Índice  ÍNDICE ABREVIATURAS…………………………………………………………………… 2 INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………… 8 1. Pano ámica gene al…………………………………………………………… 8 2. Mecanismos molecula es de la en e medad enal…………………………… 9 2.1 TGF-β y BMP7…………………………………………………… 10 2.2 MCP-1………..…………………………………………………… 16 2.3 ET-1………….…………………………………………………… 17 3. Sis ema Renina-Angio ensina y la egulación ansc ipcional en la ERC….... 18 4. NF-κB y AP-1: Fac o es de ansc ipción implicados en la ERC…………… 19 5. Modelo de 5/6 de ne ec omía: ca ac e ís icas molecula es………………...... 25 6. Es a egias enop o ec o as…………………………………………………… 25 6.1 Bloqueado es de los canales de calcio.……..……………………... 27 6.2 Bloqueo del SRA………………………………………………… 27 6.3 Be abloquean es….………………………………………………. 29 6.4 Es a inas….……………………………………………………….. 30 6.5 Inhibido es de NF-κB……………………………………………. 32 6.6 An agonis as de los ecep o es de la ET….……………………... 34 6.7 T a amien o combinado…..……………………………….......... 35 OBJETIVOS…….…………………………………………………………………… 40 MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………… 44 1. Modelo expe imen al y seguimien o de la en e medad………………………. 44  INTRODUCCIÓN  In oducción INTRODUCCIÓN 1. Pano ámica gene al. La insu iciencia enal c ónica (IRC) es una de las en e medades con más p e alencia en occiden e. Sólo en España la ci a de pacien es en diálisis supe a los 30.000; un alo simila de o os an os ha sido some ido a asplan e enal. El en ejecimien o de la población gene al, así como el inc emen o de la incidencia de la diabe es melli us (DM) y de la en e medad ascula enal (EVR), han in luido en el aumen o an espec acula del núme o de pacien es some idos a diálisis en los úl imos ein e años. En e el 6.2 y el 7.8% de la población mundial p esen a algún g ado de en e medad enal c ónica (ERC). Los cos es anuales es imados pa a el a amien o sus i u i o con diálisis son ap oximadamen e de unos 600 millones de eu os, mien as que pa a el asplan e enal son de unos 150 millones. El sínd ome de hipe il ación glome ula o de la ne ona emanen e es el mecanismo pa ogénico común del desa ollo inal de la ERC e minal, independien emen e de la e iología que enga luga . Su desa ollo comienza a pa i de una pé dida de ne onas po pa e del iñón, de mane a que las ne onas emanen es se en obligadas a compensa el abajo de las lesionadas. Seguidamen e, iene luga un p oceso de hipe o ia compensa o ia con un aumen o de la p esión en el capila glome ula y de la acción de il ación glome ula . Es e p oceso se e ielmen e ep oducido en el modelo expe imen al de 5/6 de ne ec omía u ilizado en es e abajo, y en el que p o undiza emos más adelan e. Exis en dos concep os bien de inidos en la ac ualidad en ocados sob e odo a la clínica, que deben queda acla ados en es e apa ado: en e medad enal c ónica (ERC) e insu iciencia enal c ónica (IRC). Si bien el p ime o se iene de iniendo como la exis encia de lesión enal o il ado glome ula (FG) < 60 ml/min/1,73 m2 du an e un pe íodo ≥ 3 meses, el segundo se de ine como la exis encia de lesión enal o il ado glome ula (FG) < 60 ml/min/1,73 m2 co espondien es a las ases 3, 4 y 5 de la ERC publicadas po la Na ional Kidney Founda ion, en sus co espondien es guías clínicas ( e Tabla1), ac ualmen e en e isión. 8  In oducción  Tabla 1. Es a i icación de la en e medad enal c ónica NKF- K/DOQI Fase Desc ipción FG Ac uación (ml/min/1,73m 2 ) 1 Lesión enal con FG > 90 Diagnós ico y a amien o no mal o aumen ado T a amien o de la como bilidad Ralen iza la p og esión Reduci el iesgo ca dio ascula 2 Lesión enal con 60-89 Es ima la p og esión ↓ FG le e 3 ↓FG mode ada 30-59 E alua y a a complicaciones 4↓FG se e a 15-29 P epa ación pa a el a amien o sus i u i o 5 Insu iciencia o < 15 T a amien o sus i u i o allo enal (si u emia) 2. Mecanismos molecula es de la en e medad enal. Desde un pun o de is a molecula , la ERC es una pa ología compleja. En la e olución de la misma se an a cumpli de o ma gené ica, oda una se ie de acon ecimien os, independien emen e de que el p oceso desencadenan e pueda se de o igen di e so. B e emen e, la exp esión de moléculas de adhesión y de ac o es quimio ác icos y ac i ado es especí icos de monoci os en el luga de o igen del daño enal, conduci á a la in il ación de monoci os y a su ac i ación a mac ó agos. Las p opias células enales (mesangiales, endo eliales, in e s iciales o ubula es) y los mac ó agos esiden es e in il ados, ac ua án de o ma conce ada en la gene ación de di e sos ac o es de c ecimien o, mediado es de in lamación y ci ocinas, p o ocando p oli e ación celula y expansión de ma iz. El esul ado inal de es os p ocesos es la apa ición de glome uloscle osis y ib osis in e s icial. Aunque aún no se conocen con exac i ud los mecanismos de p og esión de la en e medad enal, ha quedado demos ada la pa icipación de cie as moléculas mediado as como la endo elina-1 (ET-1), el Fac o de C ecimien o T ans o man e-β1 (TGF-β1), la p o eína quimioa ayen e de monoci os-1 (MCP-1) y el Fac o de Nec osis Tumo al-α (TNF- α). Es e úl imo puede se sec e ado en el iñón po las p opias células enales y po los 9  In oducción agoci os in il ados. Sus acciones p oin lama o ias incluyen mue e celula , quimio axis y modulación de la sec eción de o os mediado es de in lamación y componen es de ma iz ex acelula (O iz, A. y col., 1995). La exp esión de su RNAm se encuen a aumen ada en los glomé ulos y la médula du an e el es adio ne ó ico del daño enal agudo p o ocado po aminonucleósidos en a as. En la obs ucción unila e al de u é e ambién se ha obse ado una exp esión ele ada de TNF-α, conc e amen e en los úbulos de la po ción co ical del iñón obs uido, pe o no en los glomé ulos. Sin emba go, la inducción de la sín esis de TNF-α no pa ece cons i ui un mecanismo gene al de ac i ación de las ías que conducen al daño enal. Median e análisis de No he n no ha podido de ec a se exp esión de TNF-α en el modelo de educción de masa enal, mien as que el TGF-β1 y el MCP-1 sí pa ecen desempeña un papel p eponde an e en la esolución de la en e medad en es e modelo expe imen al (Lee, L.K. y col., 1995; Schille , B. y Mo an, J., 1997). Es po ello, que los es ue zos de es e abajo se han cen ado en el análisis de los mecanismos y mediado es molecula es que se exponen a con inuación. 2.1 TGF-β y BMP7. La supe amilia del TGF- β engloba un g an g upo de polipép idos ex acelula es con g andes simili udes es uc u ales, que pa icipan en p ocesos de c ecimien o, desa ollo, di e enciación y homeos asis a a és de su in e acción con ecep o es de la memb ana celula (Massagué, J., 1990; Spo n, M.B. y Robe s, A.B., 1990). Den o de es a supe amilia exis en cua o sub amilias cla amen e de inidas: i) la del TGF-β, ii) la de las p o eínas mo ogénicas óseas (BMPs), iii) la de la p o eína Nodal y sus de i ados, y i ) la de las ac i inas. En es e abajo nos cen a emos en las dos p ime as, y especí icamen e, en dos iso o mas conc e as: TGF- β1 y BMP7. De o ma gene al, el TGF-β es una ci ocina con p opiedades an iin lama o ias e inmuno egulado as que a ni eles isiológicos es á implicado en el co ec o desa ollo y uncionamien o de algunos ó ganos como el iñón, así como en la epa ación isula ; sin emba go, cuando ienen luga p ocesos de ib osis se sob eexp esa de mane a signi ica i a. De las cinco iso o mas conocidas pe enecien es a la sub amilia del TGF-β, las es p ime as, TGF-β1, TGF-β2 y TGF-β3, es án p esen es en mamí e os y p esen an una al a homología en e sí, mien as que el TGF-β4 se ha aislado en pollo y el TGF-β5 en Xenopus. 10  In oducción  Se ha obse ado que, in i o, las es p ime as iso o mas ienen unciones muy pa ecidas; sin emba go, in i o, la p ime a de ellas ha des acado sob e el es o po su mayo implicación en los p ocesos de ib osis enal (Ke ele , M. y col., 1995; MacKay, K. y col., 1990; Ando, T. y col., 1995; Wilson, H.M. y col., 2000). El TGF-β lle a a cabo sus acciones a ni el enal al in e ac ua con sus co espondien es ecep o es (TGF-β RI, TGF-β RII y TGF-β RIII). Es os son p o eínas in eg ales con un único dominio ansmemb ana con ac i idad se ina- eonina kinasa, que al uni se a sus co espondien es ligandos desencadenan una cascada de señalización en la que la pa icipación de p o eínas Smad es undamen al. Es as p o eínas ac úan como ac o es de ansc ipción que egulan la exp esión de cie os genes, p incipalmen e de TGF-β, de mane a que en los p ocesos de ib osis, algunas como Smad2 y Smad3 o man un complejo con Smad4, que se ansloca al núcleo e in e ac úa con di e en es ac o es de ansc ipción, egulando la ac i idad del p omo o de dis in os genes p o ib ó icos (Blobe, G.C. y col., 2000). El TGF-β1 egula la composición y a qui ec u a de la ma iz ex acelula en glomé ulo e in e s icio g acias a su habilidad pa a modi ica la exp esión de g an núme o de genes. És e es imula la sín esis de p o eínas de ma iz (laminina, colágenos y ib onec ina) y bloquea la deg adación de las mismas disminuyendo la exp esión de p o easas y aumen ando los ni eles de algunos de sus inhibido es, como po ejemplo, el Inhibido de Ac i ado de Plasminógeno-1 (PAI-1) y los Inhibido es Tisula es de Me alop o einasas (TIMPs) (Laiho, M. y col., 1987; Tomooka, S. y col., 1992; Ziyadeh, F.N. y Sha ma, K., 1995). A ni el expe imen al nume osos abajos han pues o de mani ies o la exis encia de aumen o de exp esión de TGF-β en a ios modelos animales que ec ean dis in as pa ologías enales: modelo de glome ulone i is p oli e a i a po inyección de sue o an i imoci o (an i- Thy-1) en a a, glome ulone i is de la memb ana basal glome ula en conejos, glome ulone i is de Habu- enom y ne opa ía asociada con obs ucción u e e al (Bo de , W.A. y Noble, N.A., 1994; Bi ze , M. y col., 1998; Miyajima, A. y col., 2000; Ma, L.J. y col., 2000; Kane o, H. y col., 1993). En el caso conc e o del modelo u ilizado en es e abajo se ha encon ado un inc emen o paula ino de exp esión de TGF-β1 y de p o eínas de ma iz como ib onec ina y laminina en los iñones de las a as ne ec omizadas, inicialmen e en el endo elio y pos e io men e ambién en células mesangiales, pa icula men e en las egiones con mayo g ado de escle osis (Lee, L.K. y col., 1995). Asimismo, se ha demos ado 11  In oducción sob eexp esión de TGF-β en es adios emp anos (14 días), y de o ma más cla a una ez es ablecida la p o einu ia en los animales ne ec omizados (Abba e, M. y col., 2002a). Se han ealizado ans ecciones in i o del gen que codi ica pa a TGF-β1 en iñones de a as no males con el consiguien e aumen o de la p oducción de TGF-β en glomé ulo que se acompañó de una glome uloescle osis “galopan e” (Isaka, Y. y col., 1993). Di e en es abajos en cul i o de células ubula es expues as a sob eca ga p o eica han expe imen ado aumen o en la p oducción de di e en es moléculas p oin lama o ias como endo elina-1, MCP-1, RANTES (Zoja, C. y col., 1995; Zoja, C. y col., 1998; Wang, Y. y col., 1997) y TGF-β (Ya d, B.A. y col., 2001). Po o a pa e, se ha obse ado en cul i os de podoci os expues os a albúmina, caída de la exp esión de sinap opodina, una p o eína de di e enciación celula p esen e en podoci os, y aumen o de TGF-β1 (Abba e, M. y col., 2002b). Nume osos abajos en dis in os modelos expe imen ales an o de diabe es ipo 1 como ipo 2 han demos ado una cla a sob eexp esión de es a ci ocina a ni el enal (Bollineni, J.S. y Reddi, A.S., 1993; E man, A. y col., 2004; Rise , B.L. y col., 2000; González-Alba án, O. y col., 2003; Shinomiya, K. y col., 2002). En el p oceso de ib ogénesis elacionado con la ne opa ía diabé ica se sabe que el TGF-β juega un papel undamen al. Igualmen e, se ha demos ado la es echa y di ec a elación exis en e en e la glucemia y la exp esión de TGF-β en ensayos an o in i o (Ziyadeh, F.N. y col., 1998) como in i o (Yang, C.W. y col., 1994; Zhou, G. y col., 2004; Yamamo o, T. y col., 1993). Po o o lado, en pacien es diabé icos y con ne opa ía memb anosa se han encon ado ni eles aumen ados de TGF-β en o ina, asν como co elaciσn de los mismos con los alo es ob enidos de p o einu ia (Ri a ola, E.W. y col., 1999; Honkanen, E. y col., 1997). El bloqueo de TGF-β, y po an o, su es ablecimien o como diana e apéu ica, es algo que se iene in es igando desde hace algún iempo, y los esul ados que se han ob enido son bas an e espe anzado es. La acumulación de p o eínas de ma iz ex acelula a ni el enal así como las mani es aciones his ológicas de la pa ología p o ocada en un modelo de glome ulone i is p oli e a i a po inyección de sue o an i imoci o en a a se han is o a enuadas al hace uso de an icue pos especí icos con a TGF-β (Bo de , W.A. y col., 1992). Algo simila se ha obse ado en el modelo mu ino de diabe es db/db (Ziyadeh, F.N. y col., 2000; Chen, S. y col., 2003). Sin emba go, la comunidad cien í ica es á de acue do en que es e abo daje e apéu ico oda ía necesi a á de mucho abajo de in es igación pa a log a e ec os bene iciosos sin comp ome e las unciones básicas de es a ci ocina. 12  In oducción  BMP7 pe enece a la sub amilia de las P o eínas Mo ogénicas Óseas (BMPs), cuyos miemb os es án implicados de o ma muy impo an e en el desa ollo a ni el emb iona io de di e en es ó ganos. Así, BMP7 es á in oluc ada en el desa ollo de huesos, ojos y iñones, en e o os ó ganos, y desde un pun o de is a molecula se encuen a en la na u aleza en o ma dimé ica. Cuando iene luga el nacimien o del indi iduo, los ni eles de és a BMP disminuyen en la mayo ía de los ó ganos y ejidos, sin emba go, en el iñón se man ienen, sob e odo, en podoci os, úbulos dis ales y en los úbulos colec o es (Wang, S.N. y col., 2001; We zel, P. y col., 2006; De Pe is, L. y col., 2007). Es a p o eína ha susci ado un al o in e és po sus p opiedades an i ib ó icas y su capacidad pa a neu aliza la ib ogénesis enal (H uska, K. A y col., 2000; Klah , S. y col., 2002; Mi u, G. y Hi schbe g, R., 2008). En di e en es modelos animales que p o ocan daño enal se ha comp obado que la exp esión de es a p o eína decae conside ablemen e (Wang, S.N. y col., 2001; Wang, S. y col., 2003; Mo issey, J. y col., 2002). Po úl imo, abajos ecien es sugie en que los e ec os an iapop ó icos de BMP7 pod ían p o ege en e a la podoci u ia (Mi u, G.M. y col., 2007). Un concep o que cada día a adqui iendo mayo impo ancia en el es udio de los p ocesos de ib osis, y en especial del iñón, es la llamada T ansición Epi elio-Mesénquima (TEM) (Iwano M. y col., 2002). Es e concep o, como su nomb e indica, con empla la ansición de células epi eliales a mesenquima osas que se ans o man en mio ib oblas os p oduc o es de ma iz en condiciones pa ológicas (Yang, J. y Liu, Y., 2001). Exis en e idencias que demues an que el eje TGF-β/BMP7 juega un papel modulado undamen al en es e p oceso (Lin, J. y col., 2005). En é minos gene ales, la ac i ación de los ecep o es de TGF-β en la célula epi elial induce la os o ilación de Smad2 y Smad3, y su anslocación al núcleo jun o con Smad4. Una ez den o, es as p o eínas Smad ope an conce adamen e con a ios ac o es de ansc ipción p omo iendo la TEM. Po o a pa e, la ac i ación de cie os ecep o es de BMP7 induce la os o ilación de Smad1, Smad5 y Smad8, que al o ma sus espec i os complejos con Smad4 se ansloncan al núcleo eniendo luga el p oceso in e so. Así, mien as TGF-β a o ece la o mación de ib oblas os y po an o la ib osis, BMP7 iende a p ese a el eno ipo epi elial ( igu a 1). En odo es e p oceso pa icipan una se ie de p o eínas capaces de uni se a ligandos especí icos que denomina emos en es e documen o como P o eínas T ampa de Ligando (PTL). És as pueden ac ua como modulado es posi i os o nega i os de cada uno de los componen es del binomio TGF-β/BMP7, a o eciendo o di icul ando la unión de los mismos a sus co espondien es ecep o es (Lin, J. y col., 2005; Tanaka, M. y col., 2008). En la siguien e abla (Tabla 2) exponemos las más es udiadas: 13  In oducción Tabla 2. P o eínas T ampa de Ligando implicadas en el binomio TGF-β/BMP7. Ligando PTL nega i as PTL posi i as TGF-β Deco ina, LAP, α-2 Mac oglobulina, Endoglina, KCP. CTGF. KCP. BMP7 Nogina, Co dina, Folis a ina, CTGF, USAG-1, Escle os ina. TGF-β: Fac o de C ecimien o T ans o man e; BMP7: P o eína Mo ogénica Ósea-7; LAP: Polipép ido Asociado de La encia; KCP: P o eína análoga a Kielina/Co dina; USAG-1: Gen Asociado a Sensibilización U e ina-1; CTGF: Fac o de C ecimien o de Tejido Conec i o. Den o de és as PTL, una de ecien e descub imien o, KCP, llama pode osamen e la a ención. Los úl imos abajos en o no a ella apun an a que pod ía juga un papel muy impo an e en la modulación de la TEM po su capacidad pa a a o ece la ía de señalización de BMP7 (Lin, J. y col., 2005) así como pa a an agoniza la de TGF-β (Lin, J. y col., 2006) ( igu a 1). Una cues ión de suma impo ancia es que BMP7 juega un papel esencial en el desa ollo emb iona io del iñón (Dudley, A. T. y col., 1995; Ka sen y, G. y col., 1996) mien as que KCP no pa ece a ec a lo en lo absolu o; sin emba go, a ones knock-ou pa a es e gen han mos ado se más suscep ibles al daño enal y ene mayo índice de mo alidad y ib osis que los a ones no males (Lin, J. y col., 2005). Es o pod ía si ua a KCP como mejo candida a que BMP7 an o como diana diagnós ica como e apéu ica. 14  In oducción   CélulaEpi elial Núcleo Deco ina LAP α‐2mac oglobulina CTGF Nogina Co dina Folis a ina CTGF USAG‐1 Escle os ina P o eínas T ampa deLigando T ansición Epi elio‐Mesénquima T ansición Mesénquima‐Epi elio Recep o de TGF‐β Recep o de BMP 7 Fib oblas os Epi elio Figu a 1. Pano ámica de la T ansición Epi elio-Mesénquima con olada po TGF-β y BMP7. Tan o TGF-β como BMP7 son modulados de o ma bidi eccional po sus co espondien es P o eínas T ampa de Ligando (PTL) en el medio ex acelula . Las PTL posi i as a o ecen la unión del ligando a su ecep o y las nega i as la di icul an. La ía de señalización de TFG-β a o ece la o mación de ib oblas os median e la ansición epi elio-mesénquima mien as que la de BMP7 iende a p ese a el eno ipo epi elial. (Adap ado de Neilson E.G., 2005). 15  In oducción 2.2 MCP-1. Es ecuen e encon a monoci os y mac ó agos p esen es en las glome ulone i is clínicas y expe imen ales. Se c ee que és os pa icipan en la pa ogénesis de la en e medad p oduciendo mediado es de in lamación. Las quimiocinas, un g upo de ci ocinas con ac i idad quimioa ayen e de neu ó ilos y monoci os, pod ían es a implicadas en la localización de es as células in il adas du an e la in lamación glome ula . Los monoci os se ex a asan y mig an siguiendo el g adien e químico de MCP-1, que es sin e izado po los p opios monoci os esiden es y po las células endo eliales y mesangiales del iñón. Los da os ecogidos en di e en es modelos expe imen ales como la ne opa ía di usa po es ep ozo ocina en a ón (Chow, F.Y. y col., 2006), glome ulone i is p oli e a i a po inyección de sue o an i imoci o en a a (Schneide , A. y col., 1999) o ne i is lúpica en a ones MLR/lp (Shimizu, S. y col., 2004) sugie en un papel uncional de es a quimiocina en el daño enal, así como la u ilidad de di e sas es a egias molecula es y a macológicas que a enúen sus acciones (Shimizu, S. y col., 2004; Sánchez-López, E. y col., 2009). En a as con educción de masa enal se ha encon ado un aumen o de MCP-1 en las zonas que p esen an glome uloscle osis ocal y en la egión apical de las células ubula es dis ales, a la ez que un mayo núme o de mac ó agos en glomé ulo e in e s icio (Schille , B. y Mo an J., 1997). MCP-1 juega un papel undamen al en la ac i ación an o de NF-κB como de AP-1 en células humanas del epi elio ubula del iñón (Vied , C. y col., 2002). A su ez, se ha obse ado que ambos ac o es de ansc ipción es án in oluc ados en la exp esión de MCP-1 en células p oximales ubula es de a a (Wang, Y. y col., 2000). Todo pa ece indica que MCP-1 es un ac o cla e en la in lamación, la ib osis y el daño enal en la ne opa ía diabé ica, ya que sus ni eles en o ina es án es echamen e elacionados con la p oducción de dicha molécula a ni el enal y co elacionan signi ica i amen e con ni eles de albuminu ia, albúmina glicosilada en sue o, N- Ace ilglucosaminidasa (NAG) en o ina y mac ó agos CD68+, an o en humanos como a ni el expe imen al en modelos animales (Banba, N. y col., 2000; Wada, T. y col., 2000; Mo ii, T. y col., 2003; Chow, F.Y. y col., 2006; Chow, F.Y. y col.; 2007). Po úl imo, en humanos, la p esencia del alelo de MCP-1 A (-2518) se ha asociado con la diabe es ipo 1 (Yang, B. y col., 2004) y con la ne i is lúpica (Kim, H.L. y col., 2002). 16  In oducción  di e en es p o eínas implicadas y o os ac o es de ansc ipción y/o co ac o es. En es e sen ido, se ha demos ado en un modelo de ne i is po ne o oxicidad en a a, que c-Jun y c- Fos son las iso o mas que mayo aumen o de exp esión expe imen an, y que exis e una es echa co elación en e la ac i ación de AP-1 y el aumen o de exp esión de MCP-1 (Zhang, A.H. y col., 2004). Asimismo, en células úbulo-epi eliales humanas se ha obse ado que un inhibido selec i o de Jun kinasa, el SP600125, es capaz de educi la os o ilación de c-Jun, a enuando de es a o ma la sob eexp esión de colágeno I y de MCP-1 mediada po TGF-β (de Bo s , M.H. y col., 2007). Po o a pa e, se ha obse ado que la p o eína nuclea JunD es un de e minan e de suma impo ancia en la ac i idad de mac ó agos y es á asociado con la suscep ibilidad a glome ulone i is en a as Wis a Kyo o (Behmoa as, J. y col., 2008). AP-1 egula la exp esión de a ios genes implicados en la pa ogénesis del daño glome ula , como la endo elina, el TGF-β1, la in e leucina-6, el MCP-1 y el colágeno I. De hecho, las ías de ac i ación del TGF-β ac úan coo dinadamen e con AP-1 en la ac i ación ansc ipcional de la p e-p oET-1 (Rod íguez-Pascual, F. y col., 2003), y el colágeno I (Tha aux, P.L. y col., 2000; de Bo s , M.H. y col., 2007), y se ha demos ado que se equie e la inducción de AP-1 pa a el aumen o de exp esión de ib onec ina mediada po TGF-β1 (Hoce a , B.A. y col., 1999). La ac i idad de AP-1 puede se modulada po di e en es e ec o es: ci ocinas, ac o es de c ecimien o, señales de es és, es ímulos oncogénicos en e o os, que p o ocan la ac i ación de di e sos mecanismos de ansducción de señales (Young, M.R. y Colbu n, N.H., 2006; Ka in, M., 1995). Asimismo, la ac i ación del ac o de ansc ipción AP-1 pa ece se esponsable pa cial de las acciones p o ib ogénicas de la angio ensina II (Hamaguchi, A. y col., 1999). Es e p oceso pa ece es a ligado, a su ez, a la capacidad de la angio ensina II pa a es imula la p oducción de ROS (Me aala, E. y col., 2003). Como ya se ha comen ado, la angio ensina II induce ib osis median e la ac i ación de la ía de señalización del TGF-β (Bo de , W. y Noble, N.A., 1998) y la subsiguien e inducción de ac o es nuclea es Smad (Massagué, J. y Chen, Y.G., 2000). La ac i ación simul ánea de AP- 1 y de ac o es nuclea es Smad inducida po angio ensina II pod ía a o ece las acciones coo dinadas de es os ac o es nuclea es en la egulación de la exp esión de o os genes p o ib ogénicos. Po o a pa e, las posibles conexiones en e las acciones de NF- kB y AP-1 es algo que desde hace iempo inquie a a la comunidad cien í ica dedicada a es udia la isiología y 23  In oducción isiopa ología enales. En es e sen ido, los an agonis as del ecep o AT1 de la angio ensina II (ARAII) educen el inc emen o de endo elina (La i ie e, R. y col., 1998), de TGF-β1 y de p o eínas de ma iz ex acelula (Lee, L.K. y col., 1995) en el iñón de a as ne ec omizadas. Se ha demos ado que la endo elina 1 y el TGF-β1 ac úan de o ma siné gica en la po enciación de la sín esis de colágeno I as adminis ación in a enosa de angio esina II (Fakhou i, F. y col., 2001). Un e ec o simila se ha obse ado en piezas de co eza enal expues as a angio ensina II ex i o (Tha aux, P. L. y col., 2000). En es e modelo, es necesa ia la ac i ación de las ías de señalización del TGF-β1 y de la p o eína kinasa ac i ada po mi ógenos-kinasa egulada po es ímulos ex acelula es (MAPK/ERK), que pa ecen coope a en la o mación del complejo ansc ipcional AP-1 y en la consiguien e ac i ación de la exp esión génica del colágeno I. Resul a llama i o que la ac i ación de NF-κB po angio ensina II no pa ece gua da elación con la ib ogénesis en es e es udio. Es o sugie e que las acciones de los ac o es nuclea es AP-1 y NF-κB en el daño enal pod ían anscu i po ías independien es. Figu a 3. Fac o de ansc ipción p o eína ac i ado a 1 (AP-1). Es un ac o de ansc ipción dimé ico compues o po p o eínas Jun y Fos. Las p o eínas Jun o man homo o he e odíme os con las p o eínas Fos median e dominios c emalle a de leucina. Las dis in as combinaciones dimé icas econocen secuencias pe enecien es a p omo o es o ac i ado es de di e en es genes diana; es os úl imos son egulados posi i amen e (+), nega i amen e (-) o posi i a y nega i amen e (+/-) según el ipo de díme o de AP-1. Se mues a el elemen o de espues a clásico a és e es de o bol (TRE) y la secuencia consenso co espondien e (TGACTCA). 24  In oducción  5. Modelo de 5/6 de ne ec omía: ca ac e ís icas molecula es. La educción qui ú gica se e a de masa enal (5/6 de ne ec omía) en animales de expe imen ación p og esa ine i ablemen e hacia el allo enal. La hipe pe usión de las ne onas emanen es cons i uye la espues a enal adap a i a a la educción de la masa enal. Los p ocesos de adap ación hemodinámicos dan luga a la apa ición de hipe ensión sis émica y glome ula , que p e isiblemen e e mina á a ec ando a la pe meabilidad selec i a de la ba e a de il ado glome ula . Es a p ecede al desa ollo de glome uloscle osis, que se acompaña de p o einu ia c ecien e, insu iciencia enal p og esi a y de hipe o ia enal y ca díaca. La impo ancia del SRA en la pa ogénesis del daño enal ha sido desc i a en es e modelo expe imen al (La aye e, R. A. y cols., 1992). Sin emba go, los e ec os enop o ec o es de los IECA y de los an agonis as de los ecep o es AT1 de la angio ensina II no pa ecen es a canalizados exclusi amen e po una educción en los alo es de la p esión a e ial. Es e modelo p esen a di e encias impo an es en la exp esión de ci ocinas y ac o es de c ecimien o, y en el iempo de e olución de la pa ología enal espec o a o os modelos expe imen ales. Así, como se ha comen ado an e io men e en el apa ado 2, se ha obse ado que en el modelo de 5/6 de ne ec omía no hay aumen o de exp esión de TNF-α (Schille , B. y Mo an, J., 1997), mien as que en modelos expe imen ales como la ne i is lúpica en a ón o la ne i is po aminonucleósidos en a a (Neale, T.J. y col., 1995) sí pa ece juga un papel des acado en la p og esión de la en e medad. Es as di e encias es án elacionadas p e isiblemen e con los mecanismos pa icula es que en an en juego en los p ime os es adios de la en e medad en cada modelo expe imen al. El modelo de 5/6 de ne ec omía es uno de los más acep ados de insu iciencia enal c ónica. Es ex apolable al humano, como se ha podido obse a en di e en es p ocesos pa ológicos (escle osis ocal y segmen a ia, agenesia enal, e c.) y es de los pocos modelos que o ece odo el espec o de e olución de la en e medad enal: p o einu ia, hipe ensión a e ial y pé dida de unción enal. En és e coexis en el daño glome ula , ubuloin e s icial y ascula . 6. Es a egias enop o ec o as. Muchas son las es a egias enop o ec o as u ilizadas has a la echa. G an pa e de ellas se basan en e apias an ihipe ensi as y an ip o einú icas; de hecho, di e en es es udios han demos ado que el con ol de la hipe ensión en sí mismo, es capaz de incidi en la disminución de la p o einu ia (Pe e son, J.C. y col., 1995; Sch ie , R.W. y col., 2002; W igh , J.T., J . y Douglas, J., 2003). Si bien alcanza una p esión a e ial ela i amen e baja (< 125 25  In oducción mmHg) debe ía se el obje i o de cualquie a amien o an ihipe ensi o en ocado a la enop o ección (Pe e son, J.C. y col., 1995; Sch ie , R.W. y col., 2002) en el caso de un a amien o an ip o einú ico lo ideal se ía alcanza alo es de p o einu ia in e io es a 300 mg/m2/día, debido a que se han asociado con cla os e ec os enop o ec o es (Ja a , T.H. y col., 2001; Ruggenen i, P. y col., 2001). En nues o es udio hemos empleado á macos con capacidad enop o ec o a o bien aquellos en los que se ha hipo e izado que pueden p o ege el iñón. En p ime luga , u ilizamos un agen e an ihipe ensi o bloquean e del SRA, especí icamen e, un ARAII (losa án). Nos decan amos po es e á maco en luga de po un IECA debido a que conside amos que las ías al e na i as pa a p oduci angio ensina II a ni el isula , independien es del enzima con e so de angio ensina, pueden escapa al abo daje e apéu ico de es e ipo de agen e a macológico, mien as que el ARAII, que ac úa sob e los ecep o es AT1, se ía capaz de neu aliza los e ec os de la angio ensina II independien emen e de la ía po la que és a úl ima se hubie a gene ado. En segundo luga , u ilizamos el ca edilol, un be abloquean e y asodila ado con capacidad enop o ec o a p e iamen e documen ada en 5/6 de ne ec omía po nues o g upo (Rod íguez-Pé ez, J.C. y col., 1997). Como ya habíamos elegido dos á macos con capacidades an ihipe ensi as y enop o ec o as bien documen adas en 5/6 de ne ec omía (La i ie e, R. y col., 1998; Rod íguez-Pé ez, J.C. y col., 1997), decidimos u iliza o os que nos pe mi ie an analiza la enop o ección independien emen e del con ol de la p esión a e ial. Las es a inas son capaces de educi la p oducción de MCP-1 (Kim, S.Y. y col., 1995) y NF-κB en células mesangiales humanas (Guija o, C. y col., 1996). Asimismo, se ha pos ulado que las es a inas pod ían disminui el a ance de la p og esión de la ERC como consecuencia de sus acciones pleio ópicas (Eps ein, M. y Campese, V.M., 2005; Campese, V.M. y col., 2005), po lo que decidimos u iliza una de ellas, especí icamen e, la ce i as a ina. Po o a pa e, debido al p o agonismo que es aba adqui iendo la endo elina-1 en la p og esión de la ERC en el 5/6 de ne ec omía (Remuzzi, G. y col., 1997) u ilizamos un an agonis a no selec i o de los ecep o es ETA y ETB (Ro 48-5695). A con inuación se comen an las di e sas es a egias que han sido u ilizadas o pod ían llega a se de u ilidad en la clínica pa a el a amien o de la ERC, aunque no odas ellas han sido analizadas en el p esen e es udio. 26  In oducción  6.1 Bloqueado es de los canales de calcio. Aunque el po encial enop o ec o de es os á macos no es á del odo cla o, odo apun a a que sus acciones pleio ópicas pod ían con ibui a p o ege el iñón del daño p o ocado po la hipe ensión, ya que son capaces de no maliza los alo es de p esión a e ial (PA) en pacien es con ERC. Si bien se ha documen ado que algunos bloqueado es de los canales de calcio (BCC) dihid opi idínicos, como el ni edipino o el amlodipino pueden se ine icaces o incluso con ap oducen es, o os BCC no-dihid opi idínicos como el e apamil o el dil iazem pueden ene cie o e ec o an ip o einú ico y, en consecuencia, pod ían se buenos candida os a la enop o ección (Remuzzi, G. y col., 1997). Ac ualmen e se sabe que los BCC dihid opi idínicos de e ce a gene ación como el manidipino, el nil adipino o el benidipino o ecen bene icios en la unción enal po su capacidad pa a eje ce asodila ación an o de las a e iolas e e en es como a e en es (Hayashi, M. y col., 2000; Hayashi, K. y col., 2003). Sin emba go, es necesa io ealiza ensayos clínicos su icien es que acla en el po encial de es os á macos en la ERC. 6.2 Bloqueo del SRA. Exis en di e en es al e na i as e apéu icas elacionadas con el sis ema enina- angio ensina-aldos e ona. La gene ación ano mal de angio ensina II es á cla amen e implicada en el desa ollo de la en e medad enal p og esi a, como se comen ó en el apa ado 3. Po ello, en e las es a egias e apéu icas más u ilizadas se encuen an las des inadas al bloqueo del SRA median e el uso de á macos como los an agonis as de la enina, los IECA y los ARAII. Los an agonis as de la enina inhiben selec i amen e los ecep o es p o enina implicados en la sín esis de angio ensina I a pa i de angio ensinógeno. Los IECA obs aculizan la con e sión de angio ensina I en angio ensina II, inhibiendo la enzima que ca aliza dicha eacción, mien as que los ARAII bloquean los ecep o es ipo 1 de la angio ensina II, y po an o, las acciones de es a úl ima mediadas po dicho ecep o . Los an agonis as de la enina se pos ulan como posibles candida os pa a el a amien o de la en e medad enal po su capacidad pa a el bloqueo pa cial de es e sis ema. El caso del aliski en es una p ueba de ello, pues se ha demos ado que es capaz de no maliza los alo es de PA en pacien es hipe ensos (Opa il, S. y col., 2007), y con ibuye a la educción de la albuminu ia en pacien es con ne opa ía diabé ica en a amien o con ARAII (Pa ing, H.H. y cols., 2008). Sin emba go, aún no hay es udios su icien es sob e su capacidad enop o ec o a. 27  In oducción Los IECA y los ARAII son capaces de educi la p esión in aglome ula y la p o einu ia, de disminui la libe ación local de ci ocinas y de quimiocinas, así como de con ola los mecanismos de in lamación implicados, de mane a que la escle osis e hipe o ia glome ula , la in lamación úbuloin e s icial y la ib osis se en conside ablemen e a enuados, e asando la apa ición del daño enal (Lewis, E.J. y col., 1993; Maschio, G. y col., 1996; Izuha a, Y. y col., 2005). En el caso pa icula que nos in e esa, los ARAII, como el losa án, ac úan bloqueando compe i i a y selec i amen e los ecep o es AT1, inhibiendo así los e ec os hipe ensi os de la angio ensina II, especialmen e los elacionados con la asocons icción y la libe ación de aldos e ona. Los ARAII se di iden en dos subg upos químicos: los bi enil e azoles y no bi enil e azoles. El losa án pe enece al p ime o de los subgupos y no se une ni bloquea o os ecep o es ho monales o canales de iones impo an es en la egulación ca dio ascula . Es os á macos han demos ado una al a segu idad y e icacia, además de eje ce e ec os bene iciosos independien es de su acción an ihipe ensi a en pacien es con insu iciencia ca díaca, diabe es melli us ipo 1 y ne opa ías. Asimismo, los ARAII disminuyen la p o einu ia y la glome uloescle osis en modelos animales de insu iciencia enal asociada o no a diabe es, debido, en pa e, a una disminución de la ib osis in e s icial y de la exp esión glome ula de TGFβ-1, colágenos ipo I, III y IV, y FN-1 (Timme mans, P.B. y col., 1993; Bu nie , M., 2001; Goa, K.L. y Wags a , A.J., 1996; C oom, K.F. y col., 2004; Sha pe, M. y col., 2001; Eas hope, S.E. y Ja is, B., 2002; Welling on, K. y Faulds, D.M., 2002; Unge , T. y col., 2004; Ho iuchi, M. y col., 1999). Di e en es ensayos clínicos han a ojado esul ados posi i os sob e es e á maco. El es udio LIFE (Losa an In e en ion Fo Endpoin educ ion in hype ension), que se lle ó a cabo en pacien es hipe ensos cons a ó la capacidad del losa án pa a educi las ci as de p esión a e ial. Aunque la capacidad an ihipe ensi a del losa án ue simila a la del a enolol con el que es aban a ados los pacien es del g upo con ol, el losa án edujo el iesgo de su i in a o de mioca dio, acciden e ce eb o ascula y mue e po en e medad ca dio ascula en elación al a enolol. El losa án pa ece con e i , po an o, bene icios más allá de la educción de la p esión a e ial (Dahlö , B. y col., 2002; Egan, B. y col., 2004). Po o a pa e, el es udio RENAAL (Reduc ion o End poin s in NIDDM wi h he Angio ensin II Recep o An agonis Losa an), demos ó que el losa án es capaz de educi la p o einu ia y el iesgo de p og esión hacia insu iciencia enal e minal en un g upo de pacien es con diabe es ipo 2 y ne opa ía (B enne , B.M. y col., 2001; Egan, B. y col., 2004). Asimismo, en 28  In oducción  pacien es no mo ensos con ne opa ía IgA, el losa án edujo la p o einu ia y la exc eción de N-ace ilglucosaminidasa en o ina y, po an o, la magni ud de las lesiones ubula es, con independencia de la PA (Shimizu, A. y col., 2008). Los an agonis as de la aldos e ona, po sus p opiedades diu é icas, se han u ilizado en el a amien o de la hipe ensión y de la ERC en asociación con o os á macos como ARAII o IECA. Es os á macos lle an implíci o el iesgo de p o oca hipe po asemia, así como la apa ición de posibles e ec os secunda ios elacionados con el sis ema endoc ino; no obs an e, el desa ollo de nue os p incipios ac i os ha ido supe ando es e úl imo escollo. Un ejemplo de ello es la eple enona, que al con a io que la espi inolac ona, iene menos a inidad po los ecep o es de p oges e ona y and ogénicos, y se ha demos ado que sus e ec os secunda ios apenas di ie en de los co espondien es al placebo (Whi e, W.B. y col., 2003). 6.3 Be abloquean es. El bloqueo de los ecep o es pos sináp icos be a conlle a, en e o os e ec os, una disminución de los alo es de PA en pacien es con ERC. Se ha demos ado que el me op olol y el a enolol ienen capacidad enop o ec o a (Pa ing, H.H. y col., 1983; Ma chi, F. y Ci iello, G., 1995) si bien be abloquean es más no edosos como el ca edilol esul an más e icaces en la p o ección enal (Ma chi, F. y Ci iello, G., 1995; Fassbinde , W. y col., 1999). Es e á maco es un an ihipe ensi o con acción be a-bloquean e no ca dioselec i a sin ac i idad simpa icomimé ica in ínseca, al a1-bloquean e a ni el pos sináp ico y asodila ado a. Tiene la capacidad de no modi ica los ni eles de glucosa, ni el pe il lipídico, ni la unción enal. P oduce una ápida caída de la esis encia ascula pe i é ica así como de la p esión a e ial sin modi ica la ecuencia ca díaca ni el olumen minu o. Son bien conocidas las p opiedades ca diop o ec o as de los be abloquean es, sin emba go, los e ec os nega i os sob e el me abolismo de ca bohid a os y lípidos ha hecho que su u ilización sea con o e ida en pacien es diabé icos, cuya p edisposición a padece ERC es ele ada. Así, los e ec os secunda ios de es e ipo de á macos en pacien es diabé icos con emplan disminución de los ni eles de LDLs, aumen o de los ni eles de iglicé idos y aumen o de insulino- esis encia. El es udio GEMINI compa a los e ec os del ca edilol y del a a o de me op olol sob e el con ol de la glucemia. Los au o es obse a on que los alo es de mic oalbuminu ia más bajos co espondie on a los pacien es que ue on a ados con ca edilol (Bak is, G. L. y col., 2004; Phillips, R. A. y col., 2008). Es os mismos pacien es 29  In oducción p esen a on un aumen o de la sensibilidad a la insulina, no obse ada en aquellos a ados con me op olol, y no se ap ecia on di e encias signi ica i as en la a iación p omedio de hemoglobina glicosilada espec o del ing eso mien as que en el g upo a ado con me op olol sí hubo aumen o de p o eína glicosilada. Algunos es udios apo an in o mación que ponen de mani ies o las p opiedades an ip oli e a i as y an ioxidan es del ca edilol (Sung, C.P. y col., 1993; Sung, C.P. y col., 1997; Yue, T.L. y col., 1992a; Yue, T.L. y col., 1992b; Yue, T.L. y col., 1992c; Yue, T.L. y col., 1993; Yue, T.L. y col., 1994a; Yue, T.L. y col., 1994b; Van den B anden, C. y col. , 1997; A umanayagam, M. y col., 2001). En un modelo de ne o oxicidad inducida po cispla ino en a as, el ca edilol edujo los ni eles de malonildialdehído (MDA) enal inc emen ados po el cispla ino, y no malizó los co espondien es a enzimas an ioxidan es como la glu a ión pe oxidasa y la ca alasa, disminuidos ambién po la acción del mismo quimio e ápico (Gamal el-Din, A. M. y Al-Bekai i, A. M., 2006). Igualmen e, en a as some idas a daño enal po isquemia/ epe usión, el ca edilol ue capaz de educi conside ablemen e los ni eles de c ea inina sé ica espec o al g upo con ol y a o o a ado con me op olol (Hayashi, T. y col., 2008). Po o o lado, nues o g upo ha encon ado mejo a en la asa de il ado glome ula , educción de la ac i idad de la enina plasmá ica y del daño enal en a as some idas a 5/6 de ne ec omía a adas con dis in as dosis de ca edilol. Es e e ec o es u o p esen e incluso a dosis no an ihipe ensi as (Rod íguez-Pé ez, J.C. y col., 1997). 6.4 Es a inas. La in oducción de los inhibido es de la HMG-CoA educ asa, comúnmen e denominados es a inas, ha e olucionado el a amien o a macológico de las dislipidemias debido a su ele ada e icacia y ole ancia. La inhibición de la biosín esis del coles e ol se acompaña de una mayo p esencia de ecep o es hepá icos de LDL, que p omue en la cap ación y el acla amien o de coles e ol del o en e sanguíneo (Knopp, R.H., 1999). El mecanismo de acción de es os á macos se basa en la inhibición compe i i a y e e sible de la ans o mación del HMG-CoA a me alona o, que es el p ecu so de los es e oles celula es, incluidos el coles e ol y los lípidos isop enoides (Golds ein, J.L. y B own, M.S., 1990; G unle , J. y col., 1994). En e es os úl imos se encuen a el dolicol, necesa io pa a la glicosilación de p o eínas, las ubiquinonas de la cadena espi a o ia mi ocond ial, la 30  In oducción  isopen enil adenina, que in e iene en la modi icación de cie as o mas de RNA , y los isop enoides a nesil pi o os a o (FPP) y ge anilge anil pi o os a o (GGPP) que pa icipan en la modi icación pos aduccional de g an a iedad de p o eínas que es án in oluc adas en mecanismos de señalización celula . La modi icación p o eica po a nesilación o ge anilge anilación a a condiciona la localización subcelula y la ac i idad de es as p o eínas. Los miemb os de la supe amilia Ras, cons i uida po p o eínas monomé icas capaces de uni GTP, ambién conocidas como p o eínas G de bajo peso molecula , como Ras, Rac y Rho, son los sus a os p incipales de modi icación pos aduccional po isop enilación y pueden se dianas de in e és pa a la inhibición po es a inas. No debe esul a ex año, po an o, que las es a inas, además de su capacidad pa a inhibi la sín esis hepá ica de coles e ol, ambién sean capaces de modi ica o as unciones celula es, como las ela i as al con ol del ciclo celula , la mig ación celula y el es ado edox. Respec o a la u ilidad de es os á macos como agen es enop o ec o es, di e sos es udios han demos ado que ienen la capacidad de e asa la pé dida de la unción enal en pacien es con IRC mode ada, diabe es o p oblemas ca díacos (Tonelli, M. y col., 2003, 2005a y 2005b). Las es a inas pueden ena la p og esión de la en e medad enal a a és de sus conocidas acciones pleio ópicas (Eps ein, M. y Campese, V.M., 2005), en e las que se incluyen la e e sión de la dis unción endo elial, la egulación del SRA, y sus acciones an iin lama o ias, an ip oli e a i as y an ihipe ensi as. T abajos ecien es e idencian que son capaces de educi el es és oxida i o, así como la exp esión génica de laminina, CTGF, TGF- β y ib onec ina, a la ez que pueden aumen a la biodisponibilidad de óxido ní ico (NO) (Koepke, M.L. y col., 2007; Zhou, M.S. y col., 2008). Po o a pa e, en los úl imos años se ha a ibuído un papel ele an e a la ía RhoA/Rho-quinasa en la p og esión de la en e medad enal en gene al y en la podoci u ia en pa icula , de modo que el e ec o enop o ec o de algunas es a inas pod ía esidi en su capacidad pa a modula es a ía de señalización (Shiba a, S. y col., 2006; Peng, F. y col., 2008). Sin emba go, odo pa ece indica que a pesa de ene e ec os bene iciosos en la p o einu ia y la p o ección enal, las es a inas po sí solas son incapaces de log a una enop o ección e icaz (Sandhu, S. y col., 2006). La ce i as a ina, el inhibido de la HMG-CoA educ asa u ilizado en es e abajo, es un de i ado pi idínico sin é ico, enan iomé icamen e pu o. Tiene una al a selec i idad hepá ica, no a a iesa la ba e a hema oence álica y se ha demos ado que, an o in i o como in i o, su a inidad enzimá ica es supe io a la de o as es a inas como lo as a ina, sim as a ina y p a asa a ina. Posee una semi ida de eliminación ela i amen e co a (2 a 3 31  In oducción ho as pa a una dosis única de 0,2mg), aunque se as o ma en los me aboli os M1, M23 y M24 que e ienen las capacidadades inhibido as del á maco o iginal. Además de su capacidad pa a inhibi la sín esis de coles e ol, se ha demos ado que la ce i as a ina puede educi la p o einu ia y e asa la apa ición de u emia, a enua la ib osis enal e inhibi la in il ación de células in lama o ias en un modelo de ib osis enal p og esi a (Koepke, M.L. y col., 2007). 6.5 Inhibido es de NF-κB. T abajos ecien es man ienen a NF-κB en el pun o de mi a como u u a diana e apéu ica po su impo an e papel en el p og eso del daño enal en di e en es modelos animales, así como po las e idencias de e e sión del daño al u iliza inhibido es especí icos de es e ac o nuclea (Fujiha a, C.K. y col., 2007; Wang, H. y col., 2008; Kosaka, T. y col., 2008). Algunos á macos mencionados an e io men e en es a sección in oduc o ia son capaces, al menos pa cialmen e, de modula la ac i ación de NF-κB. En e ellos podemos ci a los IECA y los ARAII, cuyo uso clínico en la p o ección enal es á ampliamen e con as ado, y las es a inas, a las cuales se les han a ibuído capacidades enop o ec o as (Abba e, M. y col., 2006; Gilmo e, T.D., 2006). Aunque es os á macos pueden in e e i con el mecanismo de ac i ación de NF-κB, no hay que ol ida que además pueden ac ua en o as ías de señalización. P obablemen e, el bene icio del uso de es os á macos es é elacionado con el conjun o de e ec os que pueden desencadena y no sólo con su capacidad pa a inhibi NF-κB. No es á del odo cla o si la modulación especí ica de la ac i idad de NF-κB pod ía esul a aún más bene iciosa pa a el a amien o de la ERC. Con el obje i o de da espues a a és a incógni a se es án lle ando a cabo nume osos es udios y se es á in es igando en el desa ollo de inhibido es especí icos de es e ac o de ansc ipción pa a su uso en la clínica (Gilmo e, T.D. y He sco i ch, M., 2006). Se piensa que los inhibido es de las IkappaB quinasas (IKKs) pod ían se candida os a apa ece muy p on o en el escena io clínico debido a que ac ualmen e se encuen an en ase p eclínica, y los esul ados que se han ob enido son bas an e alen ado es (Heckmann, A. y col., 2004). Los da os ecogidos en di e sos modelos expe imen ales de en e medad enal ambién pa ecen e idencia la u ilidad de la inhibición especí ica de la ac i ación de NF-κB. En es e sen ido, Sánchez-López, E. y col. some ie on a a amien o con pa enolida, un inhibido de NF-κB, a a ones a los que se les había adminis ado CTGF du an e 24h y que como 32   MATERIALESYMÉTODOS  Ma e iales y Mé odos  1. Modelo expe imen al y seguimien o de la en e medad Se u iliza on a as Sp ague-Dawley con un peso comp endido en e 250-300 g de peso de la colonia c iada en nues a Unidad de In es igación. Los animales se man u ie on según condiciones es ablecidas en el RD 1201/2005; Ley 32/2007. Todos los es udios se ealiza on aco de a la “Guide o he Ca e and Use o Labo a o y Animals”. El iñón de echo se ex ajo bajo anes esia lige a con é e . Nue e días más a de, los animales se anes esia on con iopen al sódico (Pen o al: 50 mg/kg i.p.; Lab. Abbo , Chicago IL) y se lle a on a la mesa qui ú gica donde se ealizó una lapa o omía media con ampliación a incisión subcos al izquie da, isualizando el hilio y iñón izquie do. Una ez ligadas dos de las es amas a e iales, el iñón su ió un in a o de sus 2/3 pa es, que incluyó polo supe io , in e io y ca a pos e io . La empe a u a del animal se man u o en e 37-38 ºC has a ecupe ación de la anes esia. Se ealiza on dos se ies de expe imen os. La p ime a es u o compues a po animales a los que se les ealizó la écnica qui ú gica de 5/6 de ne ec omía y que se ían sac i icados 7 días después de la ci ugía (C 5/6Nx-7d; n=12). En es a misma se ie se añadió un g upo de a as a las que se some ió al mismo es és qui ú gico, ealizándoles una lapa o omía media con ampliación a incisión subcos al izquie da, con isualización del hilio y iñón izquie do, pe o sin lle a a cabo la ablación enal (Sham-7d; n=8). La segunda se ie de expe imen os es u o compues a po un g upo sham (n=11) y animales con ne ec omía pa cial que se ían sac i icados a los 42 días de la ci ugía. Como se mues a en la igu a 4, las a as ne ec omizadas ue on alea o izadas pa a se u ilizadas como con oles (C 5/6Nx-42d; n=8), o bien ecibi los co espondien es a amien os a macológicos: i) losa án (n=8; 200 mg/L en agua de bebida; Me ck Sha p & Dohme, España); ii) ce i as a ina (n=7; 0,1 mg/kg/día median e sonda o al; Baye AG, Wuppe al, Alemania); iii) losa án con ce i as a ina (n=9) a las mismas dosis y median e la misma ía de adminis ación que los a amien os indi iduales, y i ) ca edilol (n=8; 20 mg/L en agua de bebida; Ho mann-La Roche, G enzach, Alemania). Den o de es a misma se ie de expe imen os se añadie on, a pos e io i, dos g upos adicionales que ecibie on a amien o con un an agonis a no selec i o de los ecep o es de endo elina ETA/ETB (Ro 48-5695; n=6; 30 mg/kg/día median e sonda o al; Ho mann-La Roche, G enzach, Alemania) y con el inhibido selec i o de NF-κB, PDTC (n=6; 200 mg/kg/día, inyección subcu ánea; Sigma-Ald ich, San Louis, MO, USA). 44  Ma e iales y Mé odos  Con el obje i o de obse a qué e ec os eje cían los á macos desde los momen os iniciales de la ablación enal p o ocada po el modelo empleado, los a amien os comenza on una semana después de la ci ugía y con inua on has a el inal del es udio. Las dosis de los di e en es á macos se escogie on en base a di e en es abajos e isados en la li e a u a cien í ica (La aye e, R.A. y col., 1992; Rod íguez-Pé ez, J.C. y col., 1997; Bischo , H. y col., 1997; Clozel, M. y col., 1999). Los animales ue on en enados en sus co espondien es cepos du an e 14 días an es del comienzo de los expe imen os pa a asegu a unas medidas de ensión a e ial iables. El día de la unine ec omía se de e minó la p esión a e ial basal de o ma inc uen a en la cola de la a a (Le ica Scien i ic Ins umen s: LE-5007; Ba celona). Jus o an es del inicio del a amien o, a los 24 días y al inal del expe imen o se ealiza on nue as medidas elec ónicas de la p esión a e ial ( igu a 4). Se oma on cinco medidas po animal, desca ando siemp e la más ele ada y la más baja de las ob enidas, de mane a que el alo inal ue la media de las es medidas es an es. Igualmen e se egis a on los pesos de cada animal y se ecolec a on las co espondien es o inas, pa a lo que se les dejó 24 ho as en jaula me abólica. El día del sac i icio se ealizó pe usión ca díaca con sue o isiológico a 37ºC y se ecogie on sang e y mues as de co eza enal pa a los es udios his ológicos y las de e minaciones molecula es. Se u o especial cuidado en la ecogida de co eza enal pa a lo que se dejó un ma gen amplio de sepa ación con la médula. 45  Ma e iales y Mé odos   5/6Nx 1d 3d 7d ‐9d07d24d42d Unine ec omía de echa 2/3in a o enal izquie do Iniciode a amien os PAS PAS PAS PAS Eu anasia Con ol(C 5/6Nx‐42d) Losa án Ce i as a ina Losa án +Ce i as a ina Ca edilol An agonis aETR A /ETR B (Ro48‐5695) PDTC C 5/6Nx‐7d Sham‐7d Eu anasia Figu a 4. Modelo expe imen al y seguimien o de la en e medad. En la pa e supe io se mues a el diseño expe imen al, que incluye los días a los cuales se e ec úa la ci ugía, cuando se ealizan las omas de PAS y se sac i ican las a as de los expe imen os a 7 y 42 d, y el momen o de la alea o ización pa a el inicio de los a amien os del expe imen o a 42 días. Abajo se mues an o og a ías del momen o de la ligadu a de una de las amas de la a e ia enal izquie da y del aspec o del iñón izquie do ex aído 1, 3 ó 7 días después de comple a la ne ec omía pa cial (5/6 Nx), donde se ap ecia como 1/3 de la masa enal p esen a un aspec o no mal. 5/6Nx 1d 3d 7d5/6Nx 1d 3d 7d ‐9d07d24d42d Unine ec omía de echa 2/3in a o enal izquie do Iniciode a amien os PAS PAS PAS PAS Eu anasia Con ol(C 5/6Nx‐42d) Losa án Ce i as a ina Losa án +Ce i as a ina Ca edilol An agonis aETR A /ETR B (Ro48‐5695) PDTC C 5/6Nx‐7d Sham‐7d Eu anasia Figu a 4. Modelo expe imen al y seguimien o de la en e medad. En la pa e supe io se mues a el diseño expe imen al, que incluye los días a los cuales se e ec úa la ci ugía, cuando se ealizan las omas de PAS y se sac i ican las a as de los expe imen os a 7 y 42 d, y el momen o de la alea o ización pa a el inicio de los a amien os del expe imen o a 42 días. Abajo se mues an o og a ías del momen o de la ligadu a de una de las amas de la a e ia enal izquie da y del aspec o del iñón izquie do ex aído 1, 3 ó 7 días después de comple a la ne ec omía pa cial (5/6 Nx), donde se ap ecia como 1/3 de la masa enal p esen a un aspec o no mal. 46  Ma e iales y Mé odos  2. Aislamien o de RNA y de e minación de la exp esión génica. Las mues as de ejido enal se disg ega on en solución de iso iociana o de guanidinio y el aislamien o del RNA o al se ealizó po el mé odo de Chomczynski (Chomczynski, P. y col., 1987). El RNA o al (2 µg en un olumen o al de 20 µl) ue e o ansc i o a cDNA a 37ºC du an e 60 min en p esencia de 200 unidades de MMLV-RT (P omega, Madison, WI), 20 unidades de inhibido de ibonucleasas RNasin (P omega) y 100 pmol de hexanucleó idos andomizados (Ame sham Biosciences, Buckinghamsha e, England). El ni el de exp esión de los genes de in e és se de e minó de o ma semicuan i a i a median e RT-PCR en Tiempo Real (Ligh Cycle Ins umen , Roche Applied Science), u ilizando el ki come cial Fas S a DNA Mas e SYBR G een I (Roche Applied Science, Mannheim, Ge many). Es e mé odo es cla amen e más en ajoso que la PCR con encional debido a que es más sensible, más p eciso, y menos labo ioso. Como se puede obse a en la igu a 5, pe mi e abaja con alo es de concen ación co espondien es a la zona de la cu a en que su segunda de i ada oma un alo máximo (c ossing poin ), donde la homogeneidad de los da os con as a con la a iabilidad exis en e en la ase pla eau, a la que se suele llega en el p oceso de cuan i icación median e PCR con encional. Se diseña on pa ejas de p ime s especí icos pa a la ampli icación de MCP-1, TGF-β1, colágenos (I, II, III, IV, V y VI), ib onec ina 1, laminina B1, p e-p oendo elina-1, BMP7, KCP, RNA-pol2a y GAPDH. Las condiciones de las PCRs se exponen en la Tabla 3. El núme o de ciclos de PCR eque idos pa a alcanza la ase loga í mica del p oceso de ampli icación o c ossing poin se de e minó au omá icamen e con el so wa e del Ligh Cycle median e el cálculo del Máximo de la Segunda De i ada. Pa a la cons ucción de las cu as es ánda se u iliza on diluciones se iadas de una mezcla de cDNA de los animales del g upo Sham. Cada mues a se analizó en es expe imen os de PCR independien es. Como medida de la a iabilidad en la eacción de PCR se calculó el coe icien e de a iación (CV) de las es de e minaciones de cada mues a y se ob u o la media de los CV pa a el conjun o de las mues as analizadas (Tabla 3). Los alo es de exp esión génica ue on no malizados po los ni eles de exp esión de GAPDH, que ue u ilizado como gen con ol o housekeeping gene. Al e na i amen e, se ealiza on no malizaciones de la exp esión génica haciendo uso de RNA-pol2a como gen con ol, ob eniendo esul ados muy simila es a los ob enidos con GAPDH. La especi icidad de los p oduc os se e i icó median e el análisis de las cu as de usión inmedia amen e después de la inalización de la eacción de PCR y median e elec o o esis en geles de aga osa. Se 47  Ma e iales y Mé odos  con i mó la secuencia de cDNA u ilizando secuenciado au omá ico ABI PRISM® 310 (Applied Biosys ems, Fos e Ci y, CA). 48  Ma e iales y Mé odos  RNAm Núme o de acceso (GenBank) Secuencias/p ime s (Fo wa d and Re e se) MgCl 2 (mM) P og ama CV (%) MCP-1 M57441 GTGCTGACCCCAATAAGGAA GCTTGAGGTGGTTGTGGAAA 3.0 45 x (95ºC, 10 seg; 63ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) 18.2 TGF-β1X52498 TGAGTGGCTGTCTTTTGACG TGGGACTGATCCCATTGATT 3.0 50 x (95ºC, 10 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 6 seg) 9.5 Bmp7 NM_001191856 AGGAGGGCTGGTTGGTATTT TGAAGGGTTGCTTGTTCTGG 2.25 40 x (95ºC, 5 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) 14.5 Kcp XM_001064164 ACCCTGCCAACATCCTACC ACACCTCACAGTCCCATCCT 3.5 43 x (95ºC, 5 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) 24.7 Colágeno I NM_053304 GTGCTCCTGGTATTGCTGGT GGGCTCCTCGTTTTCCTTC 3.0 50 x (95ºC, 5 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) 17.3 Tabla 3. Secuencia de los p ime s y condiciones de las PCR ealizadas en el Te mociclado Ligh cycle 49  Ma e iales y Mé odos  RNAm Núme o de acceso (GenBank) Secuencias/p ime s (Fo wa d and Re e se) MgCl 2 (mM) P og ama CV (%) Colágeno II NM_012929 CTCACGCCTTCCCATTGTT TCAGGTCAGGTCAGCCATTC 3.5 50 x (95ºC, 5 seg; 60ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) n.d. Colágeno III NM_032085 ATCCCATTTGGAGAATGTTGTGC GGACATGATTCACAGATTCCAGG 3.0 50 x (95ºC, 5 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) 19.1 Colágeno IV NM_001135009 GCCAAGTGTGCATGAGAAGA AGCGGGGTGTGTTAGTTACG 2.0 40 x (95ºC, 10 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 9 seg) 11.3 Colágeno V NM_134452 CCCAGCAGAACATCACCTACA CAATCTCCAGCACCGTCTTC 3.0 50 x (95ºC, 5 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) 15.4 Colágeno VI XM_215375 AAAAGGGAAGCCGTGGAG CCATCAAATCCTGGCGAAC 3.0 50 x (95ºC, 5 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) 12.9 Tabla 3 (con inuación) 50  Ma e iales y Mé odos   RNAm Núme o de acceso (GenBank) Secuencias/p ime s (Fo wa d and Re e se) MgCl 2 (mM) P og ama CV (%) Fib onec ina 1 NM_019143 2.5 40 x (95ºC, 10 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 10 seg) 10.0 Laminina-B1 M15525 3.0 45 x (95ºC, 10 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 6 seg) 5.5 Endo elina-1 NM_012548 2.5 42 x (95ºC, 10 seg; 65ºC, 1 seg; 72ºC, 27 seg) 19.2 GAPDH BC059110 2.5 35 x (95ºC, 10 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 13 seg) 6.9 RNA-pol2a XM_343922 2.25 40 x (95ºC, 10 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) 8.5 CV: Valo medio de los coe icien es de a iación de los genes analizados; n.d.: no de e minado. Tabla 3 (con inuación) GTGGCTGCCTTCAACTTCTC AGTCCTTTAGGGCGGTCAAT CGCTTGTTCTCATGCCCTAC CACACTCCTGCTGTTCTCCA GTTGCTCCTGCTCCTCCTTG GCATGGAGAGCGCAGAGTTG TCCCTCAAGATTGTCAGCAA AGATCCACAACGGATACATT CAGGCAAGCAAATCTTCTCC ACCAGAGAGCCTGCTGATGT 51  Ma e iales y Mé odos   ppET-1 GAPDH 5/6 Nx Sham 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Núme o de ciclo Fluo escencia de ppET-1 ShamPool Sham 1:1 5/6 NxPool Sham 4:1 A B                   Figu a 5. De e minación de la exp esión génica median e PCR con encional y PCR en Tiempo Real. A) P oduc os de ampli icación de p e-p oET-1 y GAPDH median e PCR con encional, que pe mi en es ima de o ma semicuan i a i a la di e encia de exp esión en e a as ne ec omizadas (5/6Nx) y no ne ec omizadas (Sham). Pa a que las señales de b omu o de e idio de los p oduc os sepa ados en geles de aga osa ue an de ec ables y cuan i icables, las eacciones de PCR se ala ga on ap oximadamen e has a el inal de la ase loga í mica e inicio de la ase pla eau de la PCR, donde el e o en la es imación de la exp esión del RNAm se inc emen a de o ma conside able. B) G á ico co espondien e a la e olución de una PCR en Tiempo Real pa a el ánsc i o p e-p oET-1. Se ha señalado la zona de la cu a donde se encuen a el c ossing poin , cuyo alo se u iliza pa a de e mina la asa de exp esión del ánsc i o en las mues as indicadas. Po an o, es e mé odo pe mi e calcula la exp esión de un RNAm conc e o en la egión de la eacción de la PCR donde la a iabilidad es mínima. Se mues an las cu as de ampli icación de p e-p oET-1 en es a as ne ec omizadas (5/6Nx) y es no ne ec omizadas (Sham) y dos cu as co espondien es a mues as sham de concen ación ela i a conocida en una p opo ción 4:1 (líneas discon ínuas). C ossing Poin s ppET-1 GAPDH 5/6 Nx Sham ppET-1 GAPDH A B 5/6 Nx Sham 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Núme o de ciclo Fluo escencia de ppET-1 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Núme o de ciclo Fluo escencia de ppET-1 C ossing Poin s ShamPool Sham 1:1 ShamPool Sham 1:1 5/6 NxPool Sham 4:1 5/6 NxPool Sham 4:1 52  Ma e iales y Mé odos  AP-1 ue on muy simila es en los cua iles 1, 2 y 3 y di e ían cla amen e de los del cua il 4, en algunos análisis los cua iles 1, 2 y 3 se ag upa on en una sola ca ego ía. La asociación en e a iables con inuas se ealizó median e el cálculo del coe icien e de co elación de Pea son, sal o cuando alguna de las a iables no se ajus aba a la no malidad, en cuyo caso se calculó la Rho de Spea man. Con obje o de a e igua si NF-κB y AP-1 con ibuían independien emen e a la a ianza de la exp esión del RNAm de colágeno IV, ib onec ina 1, p e-p oET-1 y MCP-1 se ealiza on análisis de eg esión lineal múl iple. El ni el de signi icación es adís ica se es ableció pa a una P < 0,05. El análisis de los da os se lle ó a cabo u ilizando el Paque e Es adís ico SPSS 15.0.     59   RESULTADOS   Resul ados  Resul a lógico pensa que pa a encon a el a amien o más adecuado de cualquie pa ología, pueda se de g an ayuda ene un conocimien o p o undo de los mecanismos que la o iginan, de igual o ma que es necesa io dispone de he amien as a macológicas ap opiadas pa a hace le en e. En el modelo de insu iciencia enal c ónica u ilizado en nues o es udio, conside amos que aunque a los 7 días de la ablación enal aún es emp ano pa a ap ecia cambios his opa ológicos en el iñón, se pod ían es a desencadenando los mecanismos molecula es esponsables de la génesis y p og esión de la en e medad. Debido a que la mayo ía de modelos expe imen ales eúnen g andes analogías en e apas a anzadas de la en e medad enal, noso os p e e imos cen a nos en ases ela i amen e emp anas. Po ello se selecciona on iempos de seguimien o a 7 y 42 días. En la igu a 8 se mues a el es ado de los iñones a los iempos indicados, e aluado inicialmen e en base a la deposición de p o eínas de ma iz ex acelula . És as se isualizan en azul median e la inción T ic ómica de Masson. 7días 42días Sham C 5/6Nx 7días 42días Sham C 5/6Nx Figu a 8. De e minación de deposición de ma iz ex acelula a los 7 y 42 días de la ablación enal. Secciones de 5µm de co eza enal de las a as as 7 y 42 días de ealizada la ne ec omía y sus co espondien es con oles ue on isualizadas median e inción ic ómica de Masson y e aluadas con mic oscopio Olympus BX50 y BX-FLA. El colo azul co esponde a ib as de ma iz ex acelula y pone de elie e el eng osamien o de las memb anas basales en los glomé ulos y la expansión del espacio ubuloin e s icial. Aumen o o iginal en e 200x y 400x. 62  Resul ados  En los apa ados sucesi os, se mues an los esul ados ob enidos a los 7 y 42 días de la ne ec omía, así como los co espondien es a las di e en es es a egias a macológicas u ilizadas. Los expe imen os ealizados es u ie on encaminados a dilucida la elación exis en e en e los esul ados del es udio his ológico y los indicado es molecula es de daño a los espec i os iempos de e olución en el modelo de 5/6 de ne ec omía.  1.NEFRECTOMÍA:7DÍAS 1.1. Pa áme os sis émicos Se alo ó si los animales ne ec omizados expe imen aban cambios de p esión a e ial y se analizó si había indicios de daño mic o ascula median e la de e minación de la albuminu ia. Como se mues a en la igu a 9, desde los 7 días los animales ne ec omizados p esen a on un inc emen o acusado de la PA sis ólica (P < 0,0001, s. Sham). La hipe ensión se acompañó de un aumen o muy ma cado de exc eción u ina ia de albúmina (P < 0,0001, s. Sham). 5/6 NxSham PA Sis ólica (mmHg) 200 180 160 140 120 100 **** Basal 7 días 5/6 NxSham Albuminu ia (mg/L) 60 50 40 30 20 10 0 -10 **** Basal 7 días Figu a 9. E ec o de la ablación enal en la PA sis ólica y la albuminu ia a los 7 días. Las medidas de la PAS se ealiza on de o ma inc uen a en la cola de los animales con un analizado au omá ico de p esión a e ial (LE-5007 Le ica Scien i ic Ins umen s). La albuminu ia se de e minó en mues as de o ina ( ecogidas du an e 24 ho as) median e es inmuno u bidimé ico (Roche Diagnos ics). La PA sis ólica y la albuminu ia basales ue on medidas an es de p ac ica la unine ec omía de echa. Las ba as ep esen an un in e alo de con ianza del 95%. ****P < 0,0001 s. Sham. 63  Resul ados  1.2. Análisis His ológico y Mo ológico La apa iencia his ológica de los iñones del g upo Sham-7d y del g upo C 5/6Nx-7d ue o almen e no mal sin di e encias en e ellos ( igu a 8). Sólo se ap ecia inción de p o eínas de ma iz ex acelula en la ad en icia de los capila es y en las delgadas láminas basales de úbulos y glomé ulos. 1.3. Exp esión génica Aunque a los 7 días no se ap ecia on cambios mo ológicos en las a as ne ec omizadas, nos p egun amos si pod ían de ec a se cambios de exp esión en di e sos genes que codi ican pa a p o eínas de ma iz, así como en aquellos capaces de egula la sín esis de es as p o eínas. Es as al e aciones a ni el molecula pod ían se una mani es ación emp ana de los cambios mo ológicos que se obse an a los 42 días y de los p ocesos isiopa ológicos in oluc ados en la p og esión de la en e medad enal c ónica. Como se mues a en la igu a 10, el g upo de a as al que se le ealizó el p ocedimien o qui ú gico (C 5/6Nx-7d) p esen a on un inc emen o signi ica i o de exp esión del RNAm de las p o eínas de ma iz ex acelula indicadas: colágenos ipo I, III, IV, V y VI (P < 0,05 s. Sham), ib onec ina 1 (P < 0,001 s. Sham) y laminina B1 (P < 0,05 s. Sham). El aumen o de exp esión de las p o eínas de ma iz ex acelula , no se acompañó de una modi icación de la exp esión del RNAm de TGF-β1 ( igu a 11A). Sin emba go, BMP7 y KCP, dos p o eínas que p omue en acciones opues as a TGF-β1 en células epi eliales enales, p esen a on una educción signi ica i a de exp esión en los animales con ablación enal (15%, P < 0,05 y 50%, P < 0,0001 de inhibición s. Sham, espec i amen e). Como se mues a en la igu a 11B, la asa de exp esión de BMP7 gua dó una es echa co elación con la de su agonis a KCP ( = 0,66; P < 0,01). 64  Resul ados  0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 RNAm de Colágenos Sham 5/6 Nx Tipo I Tipo III Tipo IV Tipo V TipoVI * * * **  Sham 5/6 Nx 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 RNAm de Fib onec ina 1 *** RNAm de Laminina B1 0 0,5 1,0 1,5 2,0 * Sham 5/6 Nx Figu a 10. Exp esión del RNAm de p o eínas de ma iz ex acelula a los 7 días de la ne ec omía. El ni el de exp esión de los genes analizados se de e minó de o ma semicuan i a i a median e RT-PCR en iempo eal (Ligh Cycle Ins umen ) como se indica en la sección de Ma e ial y Mé odos. Las mues as ue on analizadas al menos en es expe imen os de PCR independien es y el p omedio se u ilizó pa a el análisis es adís ico pos e io . Los alo es de exp esión génica ue on no malizados u ilizando GAPDH como gen con ol. Los da os co esponden a la media ± el e o ípico. ***P < 0,001 s. Sham, *P < 0,05 s. Sham. 65  Resul ados  A Sham 5/6 Nx RNAm de KCP 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 ****P < 0,0001 Sham 5/6 Nx RNAm de BMP7 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 * *P < 0,05 Sham 5/6 Nx RNAm de TGF-β1 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Sham 5/6 Nx **** BMP7 = 0,66 P < 0,01 0,6 0,8 1,0 1,2 5/6 Nx Sham KCP 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 B Figu a 11. Exp esión del RNAm de TGF-β1, BMP7 y KCP a los 7 días de la ablación enal. A) El ni el de exp esión de TGF-β1, BMP7 y KCP se de e minó de o ma semicuan i a i a median e RT-PCR en iempo eal (Ligh Cycle Ins umen ) como se indica en la sección de Ma e ial y Mé odos. Las mues as ue on analizadas en es expe imen os de PCR independien es. Los alo es de exp esión génica ue on no malizados u ilizando GAPDH como gen con ol. Las columnas ep esen an la media ± el e o ípico. ****P < 0,0001 s. Sham, *P < 0,05 s. Sham B) G á ico de co elación en e la exp esión génica de BMP7 y KCP. : coe icien e de co elación de Pea son. 66  Resul ados  Po o a pa e, la asa de exp esión del RNAm de la ci ocina quimio ác ica MCP-1, que pa icipa en el eclu amien o de monoci os en las zonas de lesión enal, p esen ó un inc emen o de dos eces en los animales ne ec omizados espec o a los del g upo Sham-7d ( igu a 12). Sin emba go, es a di e encia no llegó a alcanza signi icación es adís ica (P = 0,098).  Sham 5/6 Nx 0 RNAm de MCP-1 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0   Figu a 12. Exp esión del RNAm de MCP-1 en los g upos Sham-7d y C 5/6Nx-7d a los 7 días. El ni el de exp esión de MCP-1 se de e minó de o ma semicuan i a i a median e RT-PCR en iempo eal (Ligh Cycle Ins umen ) como se indica en la sección de Ma e ial y Mé odos. Las mues as ue on analizadas en es expe imen os de PCR independien es y el p omedio se u ilizó pa a el análisis es adís ico pos e io . Los alo es de exp esión génica ue on no malizados u ilizando GAPDH como gen con ol. Los da os co esponden a la media ± el e o ípico. 67  Resul ados  2.NEFRECTOMÍA:42DÍAS 2.1. Pa áme os sis émicos Pa a alo a el es ado de los animales as 42 días de ne ec omía se midió la PA inmedia amen e an es de la eu anasia y se de e mina on los alo es de albuminu ia y c ea inina en plasma. Como se obse a en la igu a 13, la PAS es aba cla amen e inc emen ada espec o al g upo Sham (C 5/6Nx-42d: 204±4, Sham-42d: 129±3 mmHg, P < 0,0001). Es as ci as ue on incluso supe io es a las obse adas a los 7 días (C 5/6Nx-7d: 179±2 mmHg; e apa ado 1.1. de es a sección). Igualmen e, la albuminu ia y la c ea inina p esen a on ni eles conside ablemen e ele ados en las a as ne ec omizadas ( igu a 13). 68  Resul ados  Sham 5/6 Nx 200 150 50 0 100 GIS Sham 5/6 Nx 3 2 0 1 DTI PAS (mmHg) Sham 5/6 Nx 220 200 180 140 120 160 Sham 5/6 Nx 40 30 10 0 20 Albuminu ia (mg/día) Sham 5/6 Nx 1,5 0,5 1,0 C ea inina (mg/dL) **** *** **** ** ****   Figu a 13. P esión a e ial, albuminu ia, c ea inina en plasma y pa áme os mo ológicos en los animales ope ados sin a amien o (C 5/6Nx-42d) en e a los no ope ados (Sham-42d) a los 42 días. Las medidas de la PAS se ealiza on de o ma inc uen a en la cola de los animales con un analizado au omá ico de p esión a e ial (LE-5007 Le ica Scien i ic Ins umen s). La albuminu ia se de e minó en mues as de o ina ( ecogidas du an e 24 ho as) median e es inmuno u bidimé ico (Roche Diagnos ics GmbH). La c ea inina sé ica ue medida median e un es enzimá ico colo imé ico (Boeh inge -Mannheim) en au o-analizado (Hi achi 717; Boeh inge -Mannheim Biochemical). Los índices de daño enal GIS y DTI se de e mina on po el mé odo de Koma su y median e escala semicuan i a i a según Cao, Z. y col., 2002, espec i amen e. Las ba as ep esen an un in e alo de con ianza del 95%. ****P < 0,0001, ***P < 0,001 y **P < 0,01 s. Sham. 69  Resul ados  A con inuación, analizamos si los alo es de c-Fos es aban elacionados con los pa áme os mo ológicos de daño glome ula (GIS) y úbuloin e s icial (DTI). Pa a ello, omando en cuen a el amaño de nues a mues a, ca ego izamos c-Fos en cua iles. Como los alo es de cFos e an muy simila es en los cua iles 1, 2 y 3 y di e ían cla amen e de los del cua il 4, es ablecimos dos ca ego ías: cua iles 1 a 3 y cua il 4 ( igu a 17B). En los animales con ni eles de c-Fos en el cua il 4, los alo es de GIS y DTI ue on de dos a es eces supe io es a las asas de daño co espondien es a los cua iles 1 a 3 de c-Fos ( igu a 17B). 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 c-Fos FosB c-Jun JunD Sham 5/6 Nx AP-1 A 0 50 100 150 GIS 0,0 1,0 2,0 3,0 DTI 1 a 3 4 Cua iles de c-Fos 1 a 3 4 * B  Figu a 17. AP-1 en modelo de 5/6 de ne ec omía. A) Valo es ela i os de las di e en es p o eínas de la amilia AP-1 (c-Fos, FosB, c-Jun y JunD) en los g upos Sham-42d y C 5/6Nx-42d. La ac i idad de AP-1 ue medida usando el ki T ans-AMTM AP-1 Family (Ac i e Mo i ). Con el in de de e mina la can idad de AP-1 unido al DNA, se u iliza on an icue pos p ima ios especí icos pa a las p o eínas c-Fos, FosB, c-Jun y JunD. B) Análisis de los pa áme os mo ológicos de daño glome ula (GIS) y ubuloin e s icial (DTI) en el conjun o de animales de los g upos Sham-42d y C 5/6Nx-42d pa a las dos ca ego ías de c-Fos es ablecidas (cua iles 1 a 3 y cua il 4). Los pa áme os GIS y DTI se de e mina on median e mé odo de Koma su y median e escala semicuan i a i a según Cao, Z. y col., 2002 espec i amen e, como se desc ibe en la sección de Ma e iales y Mé odos. *P < 0,05 s. cua iles 1 a 3. 76  Resul ados  También analizamos si la ac i idad de AP-1 en el modelo de 5/6Nx es aba asociada a la exp esión génica de p o eínas in oluc adas en la p og esión del daño enal como ib onec ina 1, MCP-1, p e-p oET-1 y colágeno IV. Pa a ello, ealizamos un análisis de co elación omando los da os de exp esión génica ob enidos de los animales de los g upos C 5/6Nx-42d y Sham-42d y los co espondien es alo es de ac i idad del ac o nuclea AP-1. Los esul ados mos a on la exis encia de co elación en e la ac i idad de AP-1 y la exp esión de ib onec ina 1, MCP-1 y colágeno IV (Tabla 6). Aunque no se encon ó una co elación signi ica i a en e la exp esión de la p e-p oET-1 y la ac i idad de AP-1, pudimos ap ecia cie a endencia a la asociación de ambas a iables (P = 0,07). P Tabla 6. Co elación en e la ac i idad de AP-1 y la exp esión de di e en es genes in oluc ados en el daño enal en los animales de los g upos Sham-42d y C 5/6Nx-42d. Co elación de Pea son Fib onec ina 1 MCP-1 P e-p oET-1 Colágeno IV 0,61 0,70 0,42 0,59 <0,01 < 0,01 = 0,07 < 0,01 77  Resul ados  Como ya hemos comen ado, AP-1 es capaz de ac ua de o ma coo dinada con el TGF-β pa a egula la exp esión de di e en es genes p o ib ó icos (Rod íguez-Pascual, F. y col., 2003; Tha aux, P. L. y col., 2000; de Bo s , M. H. y col., 2007; Hoce a , B. A. y col., 1999). Igualmen e, se ha hecho e e encia a di e en es abajos que ponen de mani ies o la capacidad del TGF-β1 pa a egula la composición y a qui ec u a de la ma iz ex acelula en glomé ulo e in e s icio g acias a su habilidad pa a modi ica la exp esión de p o eínas de ma iz como laminina, colágenos y ib onec ina 1 ( e apa ado 2.1 de la sección In oducción). Po ello, ealizamos un análisis de co elación en e la exp esión del RNAm del TGF-β1 y de los genes p o ib ó icos que se mues an en la Tabla 7. Las mues as u ilizadas co espondie on al conjun o de animales de los g upos C 5/6Nx-42d y Sham-42d. Los esul ados ob enidos pusie on de mani ies o la es echa co elación exis en e en e la asa de exp esión génica del TGF-β1 y la co espondien e a los genes ib onec ina 1, p e-p oET-1, colágeno I y colágenos III a VI (Tabla 7) en el modelo de 5/6Nx.   Co elación de Pea son Fib onec ina 1 Colágeno I P e-p oET-1 Colágeno III Colágeno IV Colágeno V Colágeno VI P 0,83 0,85 0,72 0,88 0,84 0,91 0,72 <0,0001 < 0,0001 <0,001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,001 Tabla 7. Co elación en e los ni eles de exp esión de TGF-βyla exp esión de di e en es genes in oluc ados en el daño enal en los animales de los g upos Sham-42d y C 5/6Nx-42d.  78  Resul ados   3.EFECTOSDELOSTRATAMIENTOSFARMACOLÓGICOSALOS42 DÍAS 3.1. Pa áme os sis émicos Las cu as de ganancia de peso ue on simila es en odos los g upos expe imen ales. Con is as a de e mina qué e ec os u ie on los di e en es á macos sob e la p esión a e ial, se hicie on de e minaciones de PAS a di e en es iempos ( igu as 18 y 19). Los a amien os con losa án, losa án + ce i as a ina y ca edilol eduje on la PAS a ni eles simila es a los del g upo Sham-42d, siendo el g upo Losa án + Ce i as a ina el que alcanzó los alo es más bajos (131±1 mmHg) ( igu a 18). En los dos g upos que ecibie on a amien o con losa án, la PAS expe imen ó una educción pa cial desde el día 24 del expe imen o, pe o no se alcanzó una no malización comple a has a el día 42 ( igu a 19). Sin emba go, el ca edilol alcanzó un e ec o an ihipe ensi o máximo desde los 24 días. Aunque ni la ce i as a ina ni el an agonis a de los ecep o es ETA y ETB (Ro 48-5695) ue on capaces de no maliza las ci as de PAS, sí que de u ie on su aumen o a pa i del día 7 del expe imen o ( igu a 19); de hecho, la ce i as a ina p o ocó una educción de la PAS de 10 mmHg, que se ap eció desde el día 24 y se man u o has a el inal del expe imen o. 79  Resul ados      100 120 140 160 180 200 220 240 PAS (mmHg) * *† *† ‡ ‡ ‡  Figu a 18. E ec o de los a amien os con losa án, ce i as a ina, losa án + ce i as a ina, ca edilol y Ro 48-5695 sob e los alo es de la PAS al inal del es udio. Las medidas de la PAS se ealiza on de o ma inc uen a en la cola de los animales con un analizado au omá ico de p esión a e ial (LE-5007 Le ica Scien i ic Ins umen s). Las ba as ep esen an in e alos de con ianza de un 95%. *P < 0,0001 s. Sham, ‡P < 0,0001, †P < 0,001 s. C 5/6Nx. 80  Resul ados  100 120 140 160 180 200 220 b 7 24 42 Ce i as a ina ** *† 100 120 140 160 180 200 220 b72442 Ro 48-5695 ** * PAS (mmHg) 100 120 140 160 180 200 220 b724 42 Ca edilol * ‡‡ 100 120 140 160 180 200 220 b72442 Losa án * ‡ *‡ 100 120 140 160 180 200 Losa án + Ce i as a ina b72442 * ‡ *† PAS (mmHg) Figu a 19. E olución de la PAS en los animales a ados con losa án, ce i as a ina, losa án + ce i as a ina, ca edilol y Ro 48-5695 a lo la go del es udio. Las medidas de la PAS se ealiza on de o ma inc uen a en la cola de las a as con un analizado au omá ico de p esión a e ial (LE-5007 Le ica Scien i ic Ins umen s) en los momen os indicados: el día de la unine ec omía de echa (basal:b) y los días 7 (inicio de los a amien os), 24 y 42 as la ne ec omía. Las ba as ep esen an in e alos de con ianza de un 95%. El análisis es adís ico se ealizó median e el es de la de S uden pa a da os apa eados. *P < 0,001 s. basal, ‡P < 0,001 s. 7 días, †P < 0,05 s. 7 días. 81  Resul ados  A con inuación se e aluó el e ec o de los a amien os a macológicos sob e el es ado de la ba e a de il ado glome ula . La albuminu ia se man u o ele ada has a el inal del es udio en las a as ne ec omizadas que no ecibie on a amien o. Ni el ca edilol, ni la ce i as a ina pudie on p e eni la exc eción u ina ia de albúmina (Tabla 8). Po el con a io, los animales pe enecien es al g upo Losa án + Ce i as a ina expe imen a on una e e sión comple a de la albuminu ia, mien as que el g upo en a amien o con losa án p esen ó alo es de exc eción de albúmina ce canos a los del g upo Sham. El g upo Ro 48-5695 mos ó alo es de albuminu ia educidos espec o al g upo C 5/6Nx-42d, aunque con inua on siendo mode adamen e ele ados espec o al g upo Sham (P < 0,05). La disminución de la unción enal, e aluada según los ni eles de c ea inina sé ica, ue e e ida pa cialmen e en los animales del g upo Losa án (50% de e e sión, P < 0,01) y de o ma aún más cla a en los g upos a ados con ce i as a ina o con losa án más ce i as a ina (60% de e e sión, P < 0,001). Po o a pa e, el a amien o con el an agonis a de los ecep o es de endo elina, Ro 48-5695, ue incapaz de educi el inc emen o de c ea inina sé ica p o ocado po la pé dida de masa enal (Tabla 8). Tabla 8. Albuminu ia, c ea inina sé ica y pa áme os mo ológicos de odos los g upos al inal del es udio. Los alo es ep esen an las medias ± SEM. aP < 0,05, bP < 0,01, cP < 0,001 y dP < 0,0001 s. Sham-42d; P < 0,05, xP < 0,01, yP < 0,001 y zP < 0,0001 s. C 5/6Nx-42d; GIS, índice de daño glome ula ; DTI, índice de daño ubuloin e s icial; n. d., no de e minado. 82  Resul ados  3.2. Análisis His ológico y Mo ológico Pa a a e igua si los dis in os a amien os u ie on alguna in luencia en la mo ología del iñón emanen e con 2/3 de ne ec omía, se ealiza on alo aciones his ológicas con ayuda de las inciones ic ómica de Masson y del ácido pe yódico de Schi , y se de e mina on las asas de daño enal GIS y DTI. Cuando los animales ue on a ados con losa án ( igu as 20g y 20h) o con la combinación de losa án más ce i as a ina ( igu as 20i y 20j), las al e aciones mo ológicas en glomé ulos y en el espacio ubuloin e s icial mejo a on conside ablemen e, si bien es a mejo a ue más cla a en el g upo que ecibió la e apia combinada. En es e sen ido, la acumulación de p o eínas de ma iz, de e minada median e inción con APS, es u o pa cialmen e inc emen ada en las láminas basales de las a as del g upo Losa án ( igu a 20h). También se con abiliza on algunos glomé ulos e aídos en á eas ocales del ejido enal de los animales de es e g upo, mien as que no se obse a on di e encias mo ológicas en e los g upos Losa án + Ce i as a ina y Sham-42d. En consonancia con es os da os, el a amien o combinado (losa án + ce i as a ina) p e ino el inc emen o de GIS que siguió a la ablación enal (P < 0,0001, Tabla 8). Aunque con meno in ensidad, un e ec o simila se obse ó as el a amien o con losa án usado indi idualmen e (P < 0,001) o con ca edilol (P < 0,01). Po el con a io, la es a ina usada como mono e apia no edujo signi ica i amen e el daño glome ula (Tabla 8). En compa ación con las a as ne ec omizadas sin a amien o a macológico, la asa de lesiones ubuloin e s iciales es u o cla amen e a enuada en la a as que ecibie on a amien o con losa án, losa án + ce i as a ina o ca edilol (P < 0,01 pa a los es g upos s. C 5/6Nx-42d), mien as que el inhibido de la HMG-CoA educ asa ue menos e icaz en es e sen ido (P < 0,05 s. C 5/6Nx-42d). Po o a pa e, el an agonis a de los ecep o es de ET (Ro 48-5695) ue incapaz de p e eni el daño an o a ni el glome ula como ubuloin e s icial. 83  Resul ados   ShamCon ol 5/6 NxCon ol 5/6 Nx Losa án + Ce i as a ina Losa án hg e ij ab cd  Figu a 20. E ec o de los a amien os con losa án y losa án más ce i as a ina a ni el glome ula y ubuloin e s icial. Las al e aciones his ológicas obse adas en glomé ulo y ubuloin e s icio de las a as some idas a 5/6 de ne ec omía expe imen a on una conside able mejo ía al u iliza el ARAII (losa án) en combinación con la es a ina (ce i as a ina). El losa án, po sí solo, ambién demos ó ene capacidad pa a mejo a dichas al e aciones, si bien se de ec ó un inc emen o pa cial en la deposición de p o eínas de ma iz ex acelula no obse ado en el g upo que ecibió la e apia combinada. Tinción ic ómica de Masson ( igu as a la izquie da) y inción de APS ( igu as a la de echa). 84  Resul ados  3.3. E ec os de los á macos en la egulación de la exp esión génica A con inuación, con la in ención de e alua qué e ec os p o oca on los di e en es a amien os en la exp esión de genes de conocida implicación en el daño enal, analizamos, en p ime luga , la ac i ación de NF-κB y AP-1 en los dis in os g upos expe imen ales, y seguidamen e de e minamos la exp esión génica de TGF-β1, BMP7, KCP, colágenos (I, III, IV, V y VI), ib onec ina 1, laminina B1, p e-p oET-1 y MCP-1. Los esul ados del an agonis a no selec i o de los ecep o es ETA y ETB de la endo elina-1 se p esen an en un subapa ado di e en e, debido a que ue un g upo que se añadió a pos e io i. 3.3.1. Ac i idad de NF-κB y AP-1. El g upo Losa án expe imen ó disminución de la ac i idad de NF-κB, aunque las di e encias obse adas no llega on a alcanza signi icación es adís ica espec o al g upo C 5/6Nx-42d. Si bien la ce i as a ina po sí sola no eje ció ningún e ec o en la modulación de la ac i idad de es e ac o nuclea , su adminis ación combinada con el losa án ue capaz de educi la de mane a signi ica i a. El g upo Ca edilol mos ó una disminución pa cial de la ac i idad de NF-κB ( igu a 21A). El es udio de localización de p65 median e inmunohis oquímica en las a as ne ec omizadas puso de mani ies o la p esencia de lesiones ocales en el núcleo de células mesangiales y epi eliales de la cápsula de Bowman ( igu a 21Ba), en células ubula es ( igu a 21Bb) y pe enecien es al in e s icio ( igu a 21Bc). En consonancia con los ensayos de ac i idad, los animales del g upo Losa án alcanza on una e e sión pa cial de la ac i idad de NF-κB ( igu a 21Be) mien as que en el g upo que ecibió el a amien o simul áneo (losa án + ce i as a ina) la e e sión de la ac i idad de NF-κB ue p ác icamen e o al ( igu a 21B ).  85  Resul ados  Colágeno IV: La combinación del ARAII (losa án) con el an agonis a de la HMG- CoA educ asa (ce i as a ina) demos ó se el a amien o más e icaz pa a con ola la exp esión del colágeno IV. En es e sen ido, el losa án, aunque ambién ue capaz de educi la, no log ó la e icacia alcanzada con el a amien o combinado. Po o a pa e, ni la ce i as a ina po sí sola, ni el ca edilol, ue on capaces de disminui de o ma cla a la exp esión génica de es e colágeno. Los esul ados co espondien es a los g upos Losa án y Losa án + Ce i as a ina ue on co obo ados con el análisis inmunohis oquímico, ya que la sob eexp esión obse ada, especialmen e en espacio in e s icial y en lámina basal ubula de los animales ne ec omizados no a ados a macológicamen e ( igu a 27Bb) se edujo cla amen e con ambos a amien os, si bien la e apia combinada ue más e icaz que la mono e apia en es e sen ido ( igu as 27Bc y 27Bd). ab cd 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 RNAm de Colágeno IV *** *** ** †† ** ‡ # B A Figu a 27. E ec o del losa án, ce i as a ina y ca edilol en la exp esión del RNAm de colágeno IV. A) El ni el de exp esión génica del colágeno IV se de e minó median e RT-PCR en iempo eal (Ligh Cycle Ins umen ) como se desc ibe en la sección de Ma e iales y Mé odos. Cada mues a se analizó po iplicado en expe imen os de PCR independien es. La no malización de la exp esión se ealizó u ilizando GAPDH como housekeeping gene. Los da os co esponden a la media ± el e o ípico. Los + Ce i : losa án + ce i as a ina. ***P < 0,001 s. Sham, **P < 0,01 s. Sham, †† P < 0,01 s. C 5/6Nx, ‡P < 0,001 s. C 5/6Nx, #P < 0,01 s. Losa án. B) La inmunohis oquímica se ealizó a ando las mues as con an icue po monoclonal de a ón an i- colágeno IV (C-1926), al y como se desc ibe en la sección de Ma e iales y Mé odos. Sham(a), C 5/6Nx (b), Losa án (c) y Losa án + Ce i as a ina (d). 92  Resul ados  Colágeno V: Tan o el losa án como la ce i as a ina, u ilizados indi idualmen e, ue on capaces de disminui pa cialmen e la exp esión del colágeno V. No obs an e, el uso combinado de ambos á macos e i ió po comple o el aumen o de exp esión obse ado en los animales con ablación enal que no ecibie on a amien o (P < 0,01). Resul a des acable el hecho de que el g upo que ecibió la e apia combinada (losa án más ce i as a ina), p esen ase ci as de exp esión signi ica i amen e más bajas que el g upo que sólo ue a ado con losa án (P < 0,05; igu a 28). El ca edilol no eje ció e ec o alguno en la exp esión génica del colágeno V. 0 2,5 2,0 0,5 1,0 RNAm de Colágeno V 1,5 Sham C 5/6 Nx Losa án Ca edilol Ce i as a ina Los + Ce i ** ** †† # 0 2,5 2,0 0,5 1,0 RNAm de Colágeno V 1,5 Sham C 5/6 Nx Losa án Ca edilol Ce i as a ina Los + Ce i 0 2,5 2,0 0,5 1,0 RNAm de Colágeno V 1,5 Sham C 5/6 Nx Losa án Ca edilol Ce i as a ina Los + Ce i Sham C 5/6 Nx Losa án Ca edilol Ce i as a ina Los + Ce i ** ** †† # Figu a 28. E ec o del losa án, ce i as a ina y ca edilol en la exp esión del RNAm de colágeno V. La exp esión de RNAm se de e minó median e PCR en iempo eal (Ligh Cycle Ins umen ) como se desc ibe en la sección de Ma e iales y Mé odos. Cada mues a se analizó en es expe imen os de PCR independien es. Los da os de exp esión ob enidos se no maliza on u ilizando GAPDH como gen con ol. El his og ama co esponde a la media ± el e o ípico. Los+Ce i : losa án + ce i as a ina. **P < 0,01 s. Sham, †† P < 0,01 s. C 5/6Nx, #P < 0,01 s. Losa án. 93  Resul ados  Colágeno VI: El a amien o combinado (losa án más ce i as a ina) ue capaz de e e i casi po comple o el aumen o de exp esión de colágeno VI expe imen ado po los animales ne ec omizados que no ecibie on a amien o a macológico ( igu a 29). Sin emba go, los g upos a ados con ca edilol, losa án o ce i as a ina expe imen a on disminución pa cial de dicha exp esión. 4,0 3,0 2,0 1,0 0 RNAm de Colágeno VI Sham C 5/6 Nx Losa án Ca edilol Ce i as a ina Los + Ce i 4,0 3,0 2,0 1,0 0 RNAm de Colágeno VI Sham C 5/6 Nx Losa án Ca edilol Ce i as a ina Los + Ce i 4,0 3,0 2,0 1,0 0 RNAm de Colágeno VI Sham C 5/6 Nx Losa án Ca edilol Ce i as a ina Los + Ce i Sham C 5/6 Nx Losa án Ca edilol Ce i as a ina Los + Ce i ** ** * † Figu a 29. E ec o del losa án, ce i as a ina y ca edilol en la exp esión del RNAm de colágeno VI. El ni el de exp esión del colágeno VI se de e minó de o ma semicuan i a i a median e RT-PCR en iempo eal en un equipo Ligh Cycle como se desc ibe en la sección de Ma e iales y Mé odos. Cada mues a ue analizada po iplicado en expe imen os de PCR independien es. La no malización de la exp esión se ealizó u ilizando GAPDH como housekeeping gene. Las ba as co esponden a la media ± el e o ípico. Los+Ce i : losa án + ce i as a ina. **P < 0,01 s. Sham, *P < 0,05 s. Sham, † P < 0,05 s. C 5/6Nx. 94  Resul ados  Fib onec ina 1: Los g upos de animales a ados con ca edilol, losa án o ce i as a ina expe imen a on una educción pa cial de la exp esión génica de ib onec ina 1, mien as que el g upo Losa án + Ce i as a ina expe imen ó una e e sión p ác icamen e o al ( igu a 30A). En consonancia con es os esul ados, los análisis inmunohis oquímicos pusie on de mani ies o que el a amien o consis en e en la combinación del losa án más la ce i as a ina ue capaz de e e i casi comple amen e la exp esión de es a p o eína ( igu a 30Bd), p incipalmen e inc emen ada en láminas basales eng osadas de glomé ulos y úbulos, así como en la ma iz mesangial de los glomé ulos escle osados de los animales ne ec omizados sin a amien o ( igu a 30Bb). 0 1 2 3 4 5 6 RNAm de Fib onec ina 1 **** * † * A a b c B d Figu a 30. E ec o del losa án, ce i as a ina y ca edilol en la exp esión del RNAm de ib onec ina 1. A) La exp esión de RNAm se de e minó median e PCR en iempo eal (Ligh Cycle Ins umen ) como se desc ibe en la sección de Ma e iales y Mé odos. Cada mues a se analizó po iplicado en expe imen os de PCR independien es. Los da os de exp esión ob enidos se no maliza on u ilizando GAPDH como gen con ol. Las columnas co esponden a la media ± el e o ípico. Los + Ce i : losa án + ce i as a ina. ****P < 0,0001 s. Sham, *P < 0,05 s. Sham, †P < 0,01 s. C 5/6Nx. B) La inmunohis oquímica se ealizó a ando las mues as con an icue po policlonal de conejo an i- ib onec ina (F-3648) de Sigma, como se desc ibe en la sección de Ma e iales y Mé odos. Sham(a), C 5/6Nx (b), Losa án (c) y Losa án + Ce i as a ina (d). 95  Resul ados  Laminina B1: No se de ec a on di e encias signi ica i as en la exp esión génica de la laminina B1 en e los g upos analizados ( igu a 31).    0 0,5 1,0 1,5 2,0 RNAm de Laminina B1  Figu a 31. E ec o del losa án, ce i as a ina y ca edilol en la exp esión de RNAm de Laminina B1. El ni el de exp esión génica de la laminina B1 se de e minó median e RT-PCR en iempo eal (Ligh Cycle Ins umen ) como se desc ibe en la sección de Ma e iales y Mé odos. Cada mues a se analizó en es expe imen os de PCR independien es. La no malización de la exp esión se ealizó u ilizando GAPDH como housekeeping gene. El his og ama co esponde a la media ± el e o ípico. Los + Ce i : losa án + ce i as a ina. 96  Resul ados  P e-p oET-1: Todos los a amien os eduje on de o ma signi ica i a la exp esión génica de es a sus ancia asoac i a llegando a alo es muy p óximos a los del g upo Sham ( igu a 32A). Los esul ados co espondien es a los g upos Losa án y Losa án + Ce i as a ina ue on co obo ados con el análisis inmunohis oquímico, ya que el aumen o de exp esión obse ado en los animales ne ec omizados que no ecibie on a amien o ( igu as 32Bc y 32Bd) se edujo conside ablemen e en ambos g upos ( igu as 32Be y 32B ). 0 1 2 3 4 RNAm de P e-p oET-1 ‡ † * †† c db a e BA Figu a 32. E ec o del losa án, ce i as a ina y ca edilol en la exp esión del RNAm de p e-p oET-1. A) La exp esión de RNAm se de e minó median e PCR en iempo eal (Ligh Cycle Ins umen ) como se desc ibe en la sección de Ma e iales y Mé odos. Cada mues a se analizó po iplicado en expe imen os de PCR independien es. Los da os de exp esión ob enidos se no maliza on u ilizando GAPDH como gen con ol. Las ba as co esponden a la media ± el e o ípico. Los+Ce i : losa án + ce i as a ina. *P < 0,01 s. Sham, †P < 0,01 s. C 5/6Nx., ‡P < 0,001 s. C 5/6Nx. B) La inmunohis oquímica se ealizó a ando las mues as con an icue po policlonal de conejo an i-endo elina-1 (6901, 1:100) de Península Lab., como se desc ibe en la sección de Ma e iales y Mé odos. Sham (a y b), C 5/6Nx (c y d), Losa án (e) y Losa án + Ce i as a ina ( ). 97  Resul ados  MCP-1: De odos los a amien os u ilizados sólo el co espondien e al g upo Losa án + Ce i as a ina ue capaz de e e i la exp esión de RNAm a ni eles ce canos a los del g upo Sham-42d. El es o de g upos p esen a on alo es muy ce canos a los del g upo C 5/6Nx-42d ( igu a 33). 0 1 2 3 4 5 6 RNAm de MCP-1 ** ** ** * †# Figu a 33. E ec o del losa án, ce i as a ina y ca edilol en la exp esión del RNAm de MCP-1. El ni el de exp esión del MCP-1 se de e minó de o ma semicuan i a i a median e RT-PCR en iempo eal en un equipo Ligh Cycle como se desc ibe en la sección de Ma e iales y Mé odos. Cada mues a se analizó en es expe imen os de PCR independien es. Los alo es de exp esión génica se no maliza on de o ma ela i a a los ni eles de exp esión de GAPDH. Las columnas ep esen an la media ± el e o ípico. Los+Ce i : losa án + ce i as a ina. **P < 0,01 s. Sham, *P < 0,05 s. Sham, †P < 0,05 s. C 5/6Nx, #P < 0,05 s. Losa án. 98  Resul ados  3.3.3. E ec os de un an agonis a no selec i o de ETA/ETB en la egulación de la exp esión génica. La ac i ación de los ac o es nuclea es NF-κB y AP-1 obse ada en el g upo de animales a ados con el an agonis a no selec i o de los ecep o es de ET-1, Ro 48-5695, ue muy simila a la que expe imen ó el g upo de a as ne ec omizadas sin a amien o ( igu a 34A). En es e mismo sen ido, el Ro 48-5695, a pesa de pode a enua el g ado de exp esión génica de la p e-p oET-1 en un 55% (P < 0,05), se mos ó incapaz de e e i los ni eles de exp esión de genes como TGF-β1, colágeno-IV, ib onec ina 1 y MCP-1 ( igu a 34B). 3.4. NF-κB y AP-1 en el pe il de exp esión génica de los animales con ablación enal A con inuación, pa a in es iga la in luencia de la ac i idad de los ac o es nuclea es de in e és en la p og esión de la en e medad enal y omando en cuen a el amaño mues al del que disponíamos, ca ego izamos los alo es de ac i idad de NF-κB y de c-Fos (AP-1) de odos los g upos de a as obje o de es udio en cua iles, y los compa amos con sus espec i os ni eles de exp esión génica de colágeno IV, ib onec ina 1, p e-p oET-1 y MCP-1, y con sus co espondien es pa áme os mo ológicos de daño glome ula (GIS) y ubuloin e s icial (DTI) ( igu a 35). Al analiza odos los g upos expe imen ales en su conjun o, no se encon ó co elación en e las ac i idades de c-Fos y de NF-κB (Tabla 9), pe o se de ec ó asociación en e los ni eles de ac i idad de NF-κB y la exp esión del RNAm de colágeno IV, ib onec ina 1, p e- p oET-1 y MCP-1 ( igu a 35A y co elaciones de Pea son en Tabla 9) así como en e los ni eles de ac i idad de NF-κB y el índice de daño glome ula y úbuloin e s icial ( igu a 35B). Igualmen e, las asas de exp esión de los genes mencionados y los índices de daño glome ula y úbuloin e s icial se ie on inc emen ados de o ma signi ica i a en el cua il 4 de c-Fos espec o a los cua iles 1 a 3, donde se obse a on alo es muy simila es de exp esión génica y de las asas de daño enal GIS y DTI ( igu as 36A y 36B). 99  Resul ados  C 5/6 Nx Sham Ro 48-5695 ** Fib -1 TGF-β1 ppET-1 * † * * * * MCP-1 * * 80 60 40 20 0 120 140 160 180 Exp esión de RNAm 200 B Col-IV 100 (% de 5/6 ne ec omizados) (% de 5/6 ne ec omizados) NF-κBc-Fos 100 80 60 40 20 0 120 140 160 180 * * 200 A Ac i idad de unión al DNA  Figu a 34. E ec os del an agonis a no selec i o de los ecep o es de ET-1 (ETA/ETB), Ro 48-5695, en a as 5/6 ne ec omizadas. Una semana después de comple a la ci ugía los animales ue on seleccionados alea o iamen e pa a ecibi a amien o con ehículo o Ro 48-5695 (30 mg/kg/día median e sonda o al) du an e cinco semanas. A) Las ac i idades de NF-κB (p65) y AP-1 (c-Fos) se midie on usando los ki s T ans-AMTM NF- κB p65 y T ans-AMTM AP-1 Family (Ac i e Mo i , Ca lsbad, CA) espec i amen e, como se desc ibe en la sección de Ma e iales y Mé odos. B) La exp esión de RNAm se de e minó median e PCR en Tiempo Real como se desc ibe en la sección de Ma e iales y Mé odos. Cada mues a se analizó en es expe imen os de PCR independien es. Los alo es de exp esión génica ue on no malizados u ilizando GAPDH como gen con ol. El his og ama ep esen a la media ± el e o ípico. Los da os se p esen an como po cen ajes espec o al g upo C 5/6Nx-42d debido a que la ablación enal p o ocó cambios he e ogéneos an o de ac i idad de unión al DNA (A) como de exp esión de RNAm (B) dependiendo del gen analizado. Col-IV: colágeno IV, Fib -1: ib onec ina 1. *P < 0,05 s. Sham; †P < 0,05 s. C 5/6Nx. 100  Resul ados  1234 Cua iles de NF-κB 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 DTI 1234 Cua iles de NF-κB 0 25 50 75 100 125 150 GIS 1234 Cua iles de NF-κB 0 1 2 3 4 5 6 7 123 4 Cua iles de NF-κB 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 1234 Cua iles de NF-κB 0 1 2 3 4 5 6 AB Cua iles de NF-κB 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 1 2 3 4 **P < 0,0001 *P < 0,01 s. cua il 4 ** * **P < 0,01 *P < 0,05 s. cua il 4 ** * *P < 0,05 s. cua il 4 * * *P < 0,001 s. cua il 4 **P < 0,0001 *P < 0,001 s. cua il 4 ‡ P < 0,001 † P < 0,01 s. cua il 3 **‡ *† ** *P < 0,01 s. cua il 4 RNAm de Colágeno IV RNAm de Fib onec ina 1 RNAm de P e-p oET-1 RNAm de MCP-1 Figu a 35. In luencia de la ac i ación de NF-κB en la exp esión de genes in oluc ados en la p og esión de la en e medad enal, y en el daño glome ula y ubuloin e s icial. A) Ac i idad de NF-κB (p65) ca ego izada en cua iles y exp esión génica de colágeno IV, ib onec ina 1, p e-p oET-1 y MCP-1. La ac i idad de NF-κB (p65) se midió usando el ki T ans-AMTM NF-κB p65 Family (Ac i e Mo i , Ca lsbad, CA). La exp esión de RNAm se de e minó median e PCR en iempo eal como se desc ibe en la sección de Ma e iales y Mé odos. Cada mues a se analizó en es expe imen os de PCR independien es. Los alo es de exp esión génica ue on no malizados u ilizando GAPDH como housekeeping gene. El his og ama ep esen a la media ± el e o ípico. B) Ac i idad de NF-κB (p65) ca ego izada en cua iles y asas de daño glome ula (GIS) y ubuloin e s icial (DTI). Los pa áme os GIS y DTI se de e mina on median e mé odo de Koma su y median e escala semicuan i a i a según Cao, Z. y col., 2002 espec i amen e, como se desc ibe en la sección de Ma e iales y Mé odos. Los da os mos ados se co esponden con las medias ± e o ípico. 101  Discusión 1.Laablación enal.7y42días. A los 7 días del expe imen o, se obse ó una cla a hipe ensión acompañada de albuminu ia en las a as ne ec omizadas a pesa de no encon a se di e encias a ni el mo ológico en e sus iñones y los pe enecien es a las del g upo Sham. Es e hallazgo pod ía debe se a la pues a en ma cha de mecanismos molecula es especí icos en espues a a la pé dida de masa enal, que comenza ían a eje ce e ec os en el endo elio y en la ba e a de il ado glome ula . Es a explicación se con i ma al obse a los ni eles de exp esión génica de p o eínas de MEC como los colágenos ipo I, III, IV, V y VI, ib onec ina 1 y laminina B1, cla amen e inc emen ados. Debido a que el TGF-β es capaz de induci la sín esis de es as p o eínas en di e en es modelos animales de en e medad enal (Bo de , W.A. y Noble, N.A., 1994; Bi ze , M. y col., 1998; Miyajima, A. y col., 2000; Ma, L.J. y col., 2000) incluido el 5/6Nx (Lee, L.K. y col., 1995; Abba e, M. y col., 2002a) se ía lógico pensa que es a ci ocina pudie a es a implicada en es e enómeno; sin emba go, noso os no encon amos aumen o de exp esión emp ana de TGF-β1, algo que se co esponde con o os abajos, donde los in es igado es de ec a on un débil inc emen o de exp esión de es e ac o de c ecimien o a los 7 días de la ne ec omía (Abba e, M. y col., 2002a) o no encon a on modi icación de la exp esión en absolu o (Lee L.K. y col., 1995). No obs an e, sí que obse amos caída de la exp esión del RNAm de BMP7, que an agoniza la ía de señalización del TGF-β, y de KCP, que a o ece la unión de BMP7 a su ecep o . Los esul ados de BMP7 ob enidos se co esponden con los obse ados en un es udio donde, en e o os análisis, los au o es de e mina on la exp esión génica de es a BMP en el modelo de 5/6Nx a dos, diez y doce semanas de e olución del daño enal (Dube, P. H. y col., 2004). Es os au o es obse a on caída de la exp esión a las dos semanas, es ablecimien o a las diez y caída nue amen e a las doce. En nues o caso encon amos disminución de la exp esión a la semana y es ablecimien o a las seis semanas. Es os esul ados pod ían explica pa cialmen e, pe o de o ma plausible, el aumen o de exp esión génica de p o eínas de MEC: la ía de señalización de BMP7 pod ía habe se is o a ec ada, y po an o la exp esión de los genes que p omue en la ansición mesénquima-epi elio o que obs aculizan el p oceso in e so, como ocu e con Smad6, que es capaz de an agoniza la ía de señalización del TGF-β ( igu a 39). Los ni eles educidos de BMP7 y KCP pod ían p o oca disminución de la asa de ansc ipción de Smad6 y a su ez del an agonismo de la ía del TGF-β. Así, sin necesidad de que enga luga aumen o de exp esión del TGF-β, su ía de señalización pod ía e se 110  Discusión ac i ada. Po o a pa e, llamó la a ención que a los 42 días no se ap ecia an di e encias en los ni eles de exp esión génica de BMP7 ni de KCP, y sí un aumen o cla o de TGF-β, acompañado de un inc emen o de exp esión de la mayo ía de las p o eínas de ma iz (colágenos ipo I, III, IV, V y VI, y ib onec ina 1) lige amen e supe io al encon ado a los 7 días. Es as obse aciones sugie en que con la ayuda de KCP, la ía de BMP7 pod ía habe se es ablecido en un in en o de egene a ejido sano y ayuda en la ecupe ación del iñón; sin emba go, el TGF-β, que no p esen ó cambios de exp esión a los 7 días, hab ía omado las iendas del p oceso, in luyendo en la hipe o ia, hipe plasia y ib osis encon adas en el ejido emanen e al inal del es udio. Que los ni eles de exp esión génica de las di e en es p o eínas de MEC a los 42 días ue an sólo lige amen e supe io es a los obse ados a 7 días, nos hace pensa que BMP7 y KCP pod ían juga un papel impo an e en la génesis de la en e medad enal en el modelo de 5/6Nx. Resul ó cu ioso que la laminina B1 no p esen a a el mismo compo amien o que el es o de p o eínas de ma iz a los 42 días de la ablación enal, pues su exp esión génica se io disminuida a ni eles simila es a los ob enidos en el g upo Sham; es e esul ado pod ía es a elacionado con el es ablecimien o de la ía de señalización de BMP7 suge ida an e io men e, que pod ía eje ce un con ol mayo sob e la exp esión de laminina B1 que el p opio TGF-β. Po o a pa e, se ap eció un aumen o de exp esión de MCP-1 desde los 7 días que llegó a se de mayo magni ud a los 42 días, alcanzando signi icación es adís ica. Debido a que se ha demos ado que el TGF-β puede es imula la exp esión de MCP-1 en células mesangiales sin que medie ac i ación de la ía del NF-κB (Cheng, J. y col., 2005), así como que BMP7 puede inhibi la (Lee, M.J. y col., 2003), pensamos que la caída de la ía de BMP7 pod ía se esponsable del inc emen o de MCP-1 obse ado a los 7 días, independien emen e de que se hubie an pues o en ma cha o os mecanismos, como la ac i ación de NF-κB, no analizada po nues o g upo en es a e apa del es udio. Los esul ados has a aquí discu idos nos lle an a pensa en posibles hipó esis de abajo u u as. Se ía in e esan e in es iga si la caída de exp esión de BMP7 y KCP es á in oluc ada en la ac i ación de la ía del TGF-β y po an o en la sob eexp esión de p o eínas de MEC, al y como hemos suge ido con an e io idad, o si, po el con a io, las acciones bene iciosas de ac i a la ía del BMP7 discu en po mecanismos no elacionados con la inhibición de los mecanismos de ansducción de señales del TGF-β. Cab ía p egun a se, 111  Discusión además, si NF-κB y/o c-Fos pod ían juga algún papel en dicho enómeno a iempos an co os. Se ía de in e és lle a a cabo es udios en ocados a escla ece si es as p o eínas, o posibles me aboli os de las mismas, pod ían ac ua como ma cado es p ecoces y/o u u as dianas e apéu icas en la ERC. En es e sen ido, en la úl ima década han apa ecido múl iples abajos en los que se ha u ilizado BMP7 ecombinan e humana como a amien o en di e en es modelos de daño enal con esul ados bas an e p ome edo es (H uska, K.A. y col., 2000; H uska, K.A. y col., 2005; Zeisbe g, M. y col., 2003; Zeisbe g, M. y col., 2008; Wang, S. y col., 2006; Sugimo o, H. y col., 2007). Kcp Figu a 39. Modelo simpli icado del mecanismo de inhibición de las señales de TGF-β po BMP7. Muchos de los e ec os p o ib ogénicos del TGF-β son ansducidos po smad3 as o ma un he e odíme o con smad4 y asloca se al núcleo, ac uando en elemen os de espues a especí icos en el p omo o de di e sos genes. BMP7 ac i a smad5 que induce ansc ipcionalmen e la sín esis de smad6. Es a smad inhibido a in e acciona con smad3, posiblemen e a a és de la o mación de he e odíme os smad3/smad6, p e iniendo la anslocación al núcleo de los complejos smad3/smad4 y, po an o, las acciones sob e sus genes diana. 112  Discusión Es a esis doc o al pone de mani ies o una no able asociación en e la ac i idad de NF-κB y la p og esión de la en e medad enal en el modelo expe imen al de 5/6 de ne ec omía. Nues os da os mues an que la ac i ación de es e ac o nuclea co elaciona es echamen e con la exp esión de ib onec ina 1, MCP-1 y p e-p oET-1, así como con las asas de daño glome ula y ubuloin e s icial GIS y DTI. Asimismo, en los animales ne ec omizados a ados con el inhibido selec i o de NF-κB, PDTC, obse amos una cla ísima disminución de la exp esión de ib onec ina 1, MCP-1, p e-p oET-1 y TGF-β1, lo que pone de elie e la implicación di ec a de NF-κB en la p og esión de la en e medad enal en es e modelo expe imen al de ERC. Es os esul ados es án en consonancia con los ob enidos en abajos p e ios (Donadelli y col., 2000; Takase, O. y col., 2003; Fujiha a y col., 2007). El con ol de la ac i idad de NF-κB median e PDTC, glio oxina o pa enolida (Rangan G.K. y col., 1999; Mulle D.N. y col., 2000; López-F anco y col., 2002) o la ans ección génica de IκBα uncada (Takase, O. y col., 2003) ha pues o de mani ies o la impo ancia de es e ac o nuclea en la p og esión de la en e medad enal y su posible u ilización como diana e apéu ica en el u u o. En es os abajos, NF-κB se de e minó po su capacidad de unión a una secuencia de DNA consenso median e ensayos de e a do en gel, o median e inmunohis oquímica. Sin emba go, la pa icipación de las subunidades p50 y p65 sólo ue es imada de o ma cuali a i a. Po el con a io, en nues o abajo la ac i idad de NF-κB se de e minó cuan i icando la subunidad p65, que con iene un dominio de ac i ación de la ansc ipción ca en e en la subnidad p50 (Guija o, C. y Egido, J., 2001), de mane a que nues os da os e lejan el g ado de ac i ación de NF-κB y no sólo su capacidad de unión al DNA. Po o a pa e, el papel cen al de p65 en la p og esión de la en e medad enal con as a con el compo amien o ambiguo de la subunidad p50, aunque es udios ealizados en los úl imos años pa ecen empeza a escla ece su papel. En es e sen ido, ecien emen e se ha demos ado que la p o ección que o ece el p econdicionamien o isquémico en e al daño p o ocado po isquemia- epe usión, es á asociado con la ac i ación del homodíme o p50/p50 (Cao, C. y col., 2010). Po o a pa e, dos modelos expe imen ales de ne i is aguda, an i-Thy- 1 y ne i is inducida po LPS, p esen an una ac i ación bi ásica de NF-κB, con p edominio del he e odíme o NF-κB p65/p50 du an e la ase de inducción del daño, mien as que en la 113  Discusión ase de esolución p edomina el homodíme o NF-κB p50/p50 (Panze , U. y col., 2009). La posible pa icipación del homodíme o p50/p50 en la p o ección del daño enal nos induce a pensa , po an o, que la cuan i icación de la subunidad p65 pe mi e de e mina de una o ma más p ecisa el g ado de pa icipación de NF-κB en la p og esión del daño enal, compa ado con la es imación de NF-κB sin de e mina de o ma cuan i a i a las subunidades in oluc adas. Los ni eles de ac i idad de c-Fos de e minados en las mues as de co eza enal del g upo C 5/6Nx-42d se ie on inc emen ados en e al g upo Sham-42d, aunque es e e ec o no ue homogéneo en odos los animales del g upo. Es os ni eles ele ados co elaciona on con los ni eles de exp esión de di e en es mediado es de in lamación y ib osis enal, po an o, no podemos desca a que la ac i ación de AP-1, a a és del inc emen o de los ni eles nuclea es de c-Fos, ambién pueda es a in oluc ada en el desa ollo de la ERC. 2.E ec osdelos a amien os a macológicosalos42díasde laablación enal. La e apia combinada de losa án y ce i as a ina demos ó se la más e icaz pa a disminui la p og esión de la en e medad enal en nues o es udio, aunque debemos menciona que el an agonismo del SRA solamen e con losa án a enuó la albuminu ia, la c ea inina en plasma y los índices de glome uloescle osis y daño ubuloin e s icial, demos ando ene una capacidad enop o ec o a impo an e. Debido a que el ca edilol dio luga a la no malización de la PAS más ápidamen e que el losa án, y que los e ec os bene iciosos en el daño glome ula y en la albuminu ia de es e úl imo supe a on al p ime o, nos inclinamos a pensa que el e ec o sob e la p esión a e ial juega un papel limi ado en las acciones p o ec o as de los ARAII. En consonancia con es a hipó esis, La aye e, R. A. y col. (1992) han demos ado que los e ec os del bloqueo del SRA con un IECA o un ARAII en el modelo de 5/6Nx, dependen de la educción de los ni eles y de la ac i idad de la angio ensina II, más que de la no malización de la p esión a e ial sis émica p o ocada po es os á macos. La ce i as a ina ambién edujo, aunque de o ma modes a, las ci as de p esión a e ial exis en es al inicio del a amien o, mien as que en los animales no a ados se obse ó un inc emen o adicional de PAS al inal del pe íodo expe imen al. La modes a capacidad asodila ado a de las es a inas, 114  Discusión ha sido eseñada en di e sos abajos (Glo ioso, N., 1999; Sposi o, A.C., 1999) y pod ía es a elacionada con su capacidad pa a modi ica la sín esis de di e sos mediado es asoac i os como la ET-1 y el NO (He nández-Pe e a, O. y col., 1998; He nández-Pe e a, O. y col., 2000). La capacidad an ip o einú ica de los ARAII ya ha sido demos ada en es udios an o in i o como in i o (Takao, T. y col., 2009; Tojo, A. y col., 2003), algo que se con i ma en nues o es udio, donde los dos g upos a ados con el ARAII, expe imen an una cla a e e sión de la albuminu ia. Sin emba go, esul ó llama i o que el ca edilol, que e i ió el daño ubuloin e s icial y edujo pa cialmen e el daño glome ula , o la ce i as a ina, que disminuyó de o ma pa cial el daño ubuloin e s icial, no u ie an e ec o alguno en la albuminu ia. Una posible explicación a es e enómeno se ía que es os á macos es én ac uando, al menos pa cialmen e, en algunos de los mecanismos p oin lama o ios que se ponen en ma cha como consecuencia de la exposición de la célula ubula a un exceso de albúmina, pe o que no sean capaces de epa a las al e aciones su idas po la ba e a de il ación glome ula y consecuen emen e, no lleguen a bloquea el inc emen o de albúmina en o ina. En e los mecanismos suscep ibles de se bloqueados median e a amien o a macológico pod ía ci a se la ac i ación del sis ema del complemen o. De hecho, exis en abajos que demues an que el bloqueo de cie os componen es de es e sis ema es capaz de a enua el daño enal, independien emen e de que pe sis a la p o einu ia (Mo i a, Y. y col., 1997; Nangaku, M. y col., 2002; Nangaku, M., 2004). Po an o, nos inclinamos a pensa que la p o einu ia, a pesa de se un excelen e ma cado del daño enal, no siemp e lo es de la e icacia a macológica en la p og esión de la en e medad, ya que aunque pe manezca ele ada du an e el a amien o, sus acciones lesi as en el iñón pod ían es a a enuadas. Los animales a ados con el an agonis a no selec i o de los ecep o es de ET-1, Ro 48-5695, p esen a on asas de exp esión génica y magni ud de daño enal muy simila es a los animales del g upo C 5/6Nx-42d. La al a de e ec i idad de es e á maco en el modelo u ilizado pod ía debe se al hecho de se un an agonis a no selec i o de los ecep o es de la ET-1, ETA y ETB, ya que se ha obse ado que és e úl imo es á implicado en la libe ación de NO y PGI2, po lo que su bloqueo pod ía i en de imen o de su capacidad como modulado de la asocons icción, mediada, sob e odo, po el ecep o ETA (Shimizu, T. y col., 1999). En es e sen ido, ecien emen e se ha demos ado en glomé ulos aislados de a a, que la 115  Discusión pe meabilidad glome ula a la albúmina se educe de mane a signi ica i a median e el uso de un an agonis a selec i o de los ecep o es ETA, pe o no al u iliza un an agonis a selec i o de los ecep o es ETB (Saleh, M.A. y col., 2010). Nues os da os demues an que el an agonis a no selec i o u ilizado en es e es udio posee la capacidad de educi pa cialmen e la p o einu ia. Todos los a amien os u ilizados en el es udio ue on capaces de disminui el inc emen o de ET-1 expe imen ado po los animales ne ec omizados, aunque debemos ma iza que en el caso del Ro 48-5695 la educción no ue comple a, pues los animales a ados p esen a on ni eles de exp esión dos eces supe io es a los del g upo Sham. Es e hallazgo pod ía es a elacionado con el hecho de que odos los a amien os a macológicos, a excepción del Ro 48-5695, p esen a on ni eles de c-Fos simila es a los del g upo Sham. En consonancia con es a hipó esis, en un modelo de daño enal inducido po in usión de aldos e ona, se ha demos ado que el uso de un an agonis a del ecep o ETA es capaz de a enua la ac i idad de AP-1 (Tos es, R. C. y col., 2002). Quizás el uso de un an agonis a selec i o de los ecep o es ETA hab ía gene ado esul ados di e en es en nues o es udio. De hecho, en la úl ima década, la mayo ía de los abajos sugie en que el bloqueo selec i o de ETA pod ía se más bene icioso que el bloqueo no selec i o (B ochu, E. y col., 1999; Cao, Z. y col., 2000; Dhaun, N. y col., 2009; Neuho e , W. y col., 2009); sin emba go, es un ema con o e ido que necesi a se escla ecido con la ealización de ensayos clínicos alea o izados. Es e abajo demues a que el a amien o combinado de los animales ne ec omizados con un ARAII más una es a ina es capaz de p omo e la no malización de la ac i idad de NF- κB, así como la exp esión de MCP-1, p e-p oET-1, TGF-β1, ib onec ina 1, colágeno I, colágeno III, colágeno IV, colágeno V y colágeno VI. Sin emba go, los a amien os sólo con losa án o con ce i as a ina u ie on una escasa epe cusión en la exp esión de la mayo ía de los genes analizados. Es as di e encias an e iden es a ni el molecula según el modelo de a amien o elegido no lo ue on an o en los análisis mo ológicos y isiológicos. Debido a que los genes analizados en es e abajo son ac o es pa ogénicos cla es, pudiendo ac ua como p edic o es del daño glome ula y ubuloin e s icial, cab ía espe a que el a amien o combinado con ambos á macos pudie a demos a una capacidad enop o ec o a cla amen e supe io , espec o al a amien o con un ARAII en ausencia de una es a ina, as pe íodos más p olongados de e olución de la en e medad. En es e sen ido, se ha documen ado una emisión de la p o einu ia y una educción del daño enal median e la adminis ación simul ánea de un IECA, un ARAII y una es a ina en un modelo se e o de 116  Discusión ne i is pasi a de Heymann (Zoja C. y col., 2002b). Es os e ec os enop o ec o es se acompaña on de una educción impo an e de la exp esión de TGF-β1. El bloqueo a macológico del SRA en ausencia de la es a ina, o el a amien o con la es a ina solamen e, u ie on e ec os de meno magni ud an o en la p e ención de la p og esión del daño enal como en la inhibición del inc emen o de exp esión de TGF-β1. Igualmen e, la combinación de un inhibido de la ECA y una es a ina ha esul ado especialmen e bene iciosa en la educción de la exp esión de MCP-1 en a as con glome ulone i is (Zoja, C. y col., 2002a). De acue do con es os esul ados, noso os encon amos que la exp esión de MCP-1 y TGF-β1 p esen a una espues a simila al a amien o combinado con un agen e bloquean e del SRA y una es a ina en un modelo expe imen al de ERC. Además, hemos ampliado es os hallazgos a la ac i idad de NF-κB p65, que como ya se ha comen ado, es un ac o de g an ele ancia de los p ocesos in lama o ios que ienen luga du an e la p og esión de la en e medad enal, y a la exp esión de las p o eínas de ma iz ex acelula como ib onec ina 1, colágeno I, colágeno III, colágeno IV, colágeno V y colágeno VI, cuya sob eexp esión da luga a su acumulación a ni el glome ula e in e s icial, siendo esponsable del desa ollo de ib osis enal. La u ilidad del a amien o combinado de un ARAII y una es a ina debe ía con i ma se con la ealización de ensayos clínicos su icien es que demues en su alía. En es e sen ido, Ruggenen i, P. y col. han lle ado a cabo un es udio en pacien es con IRC que p esen aban p o einu ia esidual. Los indi iduos es aban siendo a ados simul áneamen e con un ARAII y un IECA; al añadi una es a ina a la e apia no se encon ó disminución de los ni eles de p o eínas en la o ina. Aunque es os esul ados pod ían hace nos pensa que la es a ina no es á apo ando bene icio alguno al a amien o con el ARAII más el IECA, se ía in e esan e hace un seguimien o a más la go plazo con la in ención de e cuán os de es os pacien es llegan a insu iciencia enal e minal, ya que cab ía la posibilidad de que la es a ina es u ie a ealizando acciones bene iciosas en el iñón no de ec ables con la medición exclusi a de la p o einu ia. Fujiha a, C.K. y col. (2005) han demos ado que dosis muy ele adas de losa án apo an una mayo enop o ección en a as some idas al modelo de 5/6 de ne ec omía, sugi iendo que las dosis u ilizadas habi ualmen e, an o en es udios expe imen ales como en la p ác ica clínica, no son su icien es pa a bloquea comple amen e los ecep o es AT-1 de la angio ensina II. Es e descub imien o induce a pensa que el losa án a las dosis u ilizadas en la clínica, combinado con algún agen e a macológico capaz de ac ua de mane a complemen a ia en el SRA, pod ía o ece una mayo e icacia en el a amien o de la ERC. 117  Discusión Los mecanismos median e los que las es a inas pueden magni ica los e ec os enop o ec o es de los ARAII pod ían es a elacionados con sus conocidas p opiedades pleio ópicas. El a amien o con es a inas puede inhibi la ac i idad de la ECA (Luo, J.D. y col., 1999), pudiendo con ibui a la ob ención de un bloqueo comple o del SRA (Zoja, C. y col., 2002b). Además, la ce i as a ina es capaz de educi el aumen o de angio ensina II expe imen ado po a as dTGR (Dechend, R. y col., 2002). Po o a pa e, la sim as a ina puede p e eni los e ec os ad e sos asociados con la in usión c ónica de angio ensina II, como el desa ollo de hipe ensión y la inducción de especies eac i as de oxígeno (Delbosc, S. y col., 2002). Asimismo, las es a inas a enúan la exp esión de los ecep o es AT1 a a és de la inhibición de las modi icaciones pos aducionales de la GTPasa Rho A, disminuyendo la unción biológica de la angio ensina II (Ichiki, T. y col., 2001). En co espondencia con es os hallazgos, la ía de la Rho-quinasa ha sido elacionada con el daño enal causado po la angio ensina II (Rupé ez, M. y col., 2005); además, la inhibición de dicha ía con ibuye a la disminución del daño enal, debido en pa e, a la a enuación de la ac i idad de NF-κB p65 (Meye -Schwesinge , S. y col., 2009). Po o a pa e, el a amien o de células mesangiales con es a inas p o oca educción signi ica i a de la ac i idad de NF-κB (Guija o, C. y col., 1996). En nues o es udio, aunque la ce i as a ina pe se no demos ó ene capacidad pa a p e eni la ac i ación de NF-κB en las a as ne ec omizadas, en el con ex o de una en e medad enal a enuada como la obse ada en animales bajo a amien o con losa án, la ce i as a ina demos ó ene capacidad pa a in e e i en la ac i idad de NF-κB y con ibui a la no malización de la ac i idad de es e ac o nuclea . En nues o abajo, la ac i idad de NF- κB p65 sólo e ie e comple amen e con la combinación del ARAII y el inhibido de la HMG-CoA educ asa. Sin emba go, la ac i idad de AP-1 ambién se no maliza con el ARAII o el inhibido de la HMG-CoA educ asa usados indi idualmen e. La mayo e icacia del a amien o combinado de ARAII e inhibido de la HMG-CoA educ asa en la e e sión de los cambios de exp esión génica, en e a las acciones más limi adas de los á macos po sepa ado, pa ecen suge i un papel cen al de NF-κB, más que de AP-1, en es e modelo de allo enal p og esi o. Una segunda explicación a es os hallazgos pod ía es a elacionada con la necesidad de inhibi simul áneamen e ambos ac o es nuclea es y, po an o, las ías de señalización en las que in e ienen pa a alcanza el obje i o e apéu ico deseado. En es a di ección pa ecen apun a los hallazgos de un es udio (Mezzano, S.A. y col., 2001) donde sus au o es han encon ado que la coac i ación de NF-κB y AP-1, más que la simple ac i ación de NF-κB, es á elacionada con la p esencia de lesiones 118  Discusión enales en pacien es con sínd ome ne ó ico. Po o o lado, la educción selec i a y e icaz de NF-κB en di e sos modelos expe imen ales no ga an iza la e e siσn comple a de la en e medad enal p og esi a (Rangan, G.K. y col., 1999; Mudge, S.J. y col., 2001), lo que sugie e la pa icipación de o ma independien e de o os mediado es molecula es en los mecanismos isiopa ológicos de la en e medad. En los análisis de eg esión lineal múl iple ealizados, NF-κB p65 y c-Fos esul a on a iables p edic o as independien es de los ni eles de exp esión de colágeno IV, ib onec ina 1, p e-p oET-1 y MCP-1. Sin emba go, no se encon ó asociación en e las ac i idades de c-Fos y NF-κB, sugi iendo que ambos ac o es de ansc ipción pod ían con ibui independien emen e al desa ollo de la ib osis enal en el modelo de 5/6Nx. Nues os da os pa ecen con e i un papel ele an e al TGF-β1 en el desa ollo de ib osis en el modelo de 5/6Nx. Como se ha comen ado p e iamen e, las ías de ac i ación de TGF-β1 pueden ac ua de o ma coo dinada con AP-1 en la egulación ansc ipcional de genes como colágeno I, ib onec ina y p e-p oET-1 (Tha aux, P.L. y col., 2000; de Bo s , M.H. y col., 2007; Hoce a , B.A. y col., 1999; Rod íguez-Pascual, F. y col., 2003). Pod íamos especula con la idea de que el TGF-β1, a a és de la ac i ación de las p o eínas nuclea es Smad, pueda con ibui a la p og esión del daño de o ma complemen a ia a la ac i ación de NF-κB. En es e sen ido, el TGF-β se ha mos ado capaz de es imula la exp esión de MCP-1 en células mesangiales sin que medie ac i ación de NF-κB (Cheng, J. y col., 2005). En esumen, es a esis doc o al pone de mani ies o que la e apia combinada de un ARAII y una es a ina pod ía se de g an u ilidad pa a a a la ERC. La capacidad de es e a amien o pa a educi la ac i idad de ac o es nuclea es como NF-κB y AP-1, así como la exp esión de genes p o ib ó icos in oluc ados en la en e medad enal como TGF-β, colágeno I, III, IV, V y VI, ib onec ina 1, laminina B1, p e-p oET-1 y MCP-1, a ala es a idea. La impo ancia de educi NF-κB, en pa icula la subunidad p65, pa ece más que jus i icada debido a su es echa asociación con los ma cado es de daño glome ula y úbulo-in e s icial. Po o a pa e, la co elación en e los ni eles nuclea es de c-Fos y la exp esión de di e en es genes implicados en la in lamación y ib osis enal, sugie e que la ac i ación de AP-1 pod ía con ibui al desa ollo de la ERC. Po úl imo, nues o abajo p opone que el eje TGF- β/BMP7 puede es a jugando un papel impo an e en la génesis de la ERC. La pé dida de ac i idad de la ía del BMP7 pod ía con ibui di ec a o indi ec amen e al inc emen o de la 119  Bibliog a ía  Behmoa as, J. y col. "Jund is a de e minan o mac ophage ac i a ion and is associa ed wi h glome uloneph i is suscep ibili y." Na .Gene . 2008; 40: 553-59. Benigni, A. y col. "Blocking bo h ype A and B endo helin ecep o s in he kidney a enua es enal inju y and p olongs su i al in a s wi h emnan kidney." Am J Kidney Dis. 1996; 27: 416-23. Benndo , R.A. y col. "Angio ensin II ype 2 ecep o de iciency agg a a es enal inju y and educes su i al in ch onic kidney disease in mice." Kidney In . 2009; 75: 1039-49. Bes , P.J. y col. 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