Ictus isquémico en la población de las Islas Canarias y su asociación con los genes de la metilentetrahidrofolato reductasa, del sistema renina-agiotensina y de las paroxinasas 1 y 2

i ii AN E X O I I UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Facultad Ciencias de la Salud, Departamento Ciencias Médicas y Quirúrgicas Programa de doctorado “Avances en Medicina Interna” TÍTULO DE LA TESIS ICTUS ISQUÉMICO EN LA POBLACIÓN DE LAS ISLAS CANARIAS Y SU ASOCIACIÓN CON LOS GENES DE LA METILENTETRAHIDROFOLATO REDUCTASA, DEL SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA Y DE LAS PAROXONASAS 1 Y 2 Tesis Doctoral presentada por D/Dª Juan Carlos López Fernández Dirigida por el Dr. D. Pedro Betancor León Dirigida por el Dr. D. Francisco Rodríguez Esparragón Dirigida por el Dr. D. José Carlos Rodríguez Pérez El Director, El Director, El Director, El Doctorando (Firma) (Firma) (Firma) (Firma) Las Palmas de Gran Canaria, a 30 de Septiembre de 2014 iii Agradecimientos Deseo agradecer el trabajo a todos aquellos que han contribuido a llevar a cabo esta tesis, sin cuyo esfuerzo no se hubiese podido conseguir. En primer lugar a los tres directores de la misma, los doctores D. Pedro Betancor León, D. José Carlos Rodríguez Pérez, y especialmente al Dr. D. Francisco Rodríguez Esparragón que ha tenido una enorme implicación en el proyecto. Ellos me han brindado su amistad, su consejo y su apoyo incondicional, además de haber aportado un gran esfuerzo personal por conseguir este objetivo. Es justo reconocer además el trabajo del personal de la Unidad de Investigación en el procesado y genotipado de las muestras, en especial a la Dra. Nisa Buset Ríos y a Arancha Anabitarte. También ha sido indispensable el trabajo de Miguel Ángel García Bello por su inestimable ayuda para realizar el análisis estadístico. Además deseo reseñar otro reconocimiento a la Dra. Fiuza Pérez, con la que me une una amistad de muchos años, cuyo ánimo y orientación han resultado ser un impulso determinante. También deseo agradecer a los pacientes que participaron desinteresadamente en el estudio y a todo el personal del Servicio y la planta de Neurología, especialmente la ayuda de la supervisora Amparo Balea que no solo hace habitualmente un gran esfuerzo en la coordinación del trabajo de nuestra planta de hospitalización, sino que además fue una figura indispensable para este trabajo. No puedo dejar pasar tampoco mi reconocimiento a “Verona” (Juan Ramírez Verona), un referente imprescindible en la ilustración de los trabajos científicos en nuestro hospital. Desde principio de los 90 contamos con su iv valiosa ayuda para elaborar cualquier comunicación científica, y son incontables los ejemplos en los que su esfuerzo y creatividad le ha añadido un valor estético y de calidad a nuestros trabajos. Un último reconocimiento a la dirección de nuestro hospital por el apoyo que presta a las iniciativas científicas y que siempre hace gala de un talante constructivo y cooperativo. En el terreno personal deseo dedicar y agradecer este trabajo tanto a mis amigos, como a mis padres, a mis hijas Laura y Julia que han vivido este proyecto con entusiasmo a pesar de la distancia, y a Anabel que ha sido un apoyo incondicional en todo momento. v Índice de contenidos vi Índice 1. Introducción 1 1. Definición del ictus, epidemiología y repercusiones 1 2. Clasificación del ictus: Topográfica y etiológica 3 2. Factores de riesgo asociados al ictus 7 1. Factores de riesgo no modificables 9 i. Edad 9 ii. Sexo 9 iii. Raza 9 iv. Herencia 10 2. Factores de riesgo modificables 11 i. Alcohol 11 ii. Tabaco 12 iii. Drogas 13 iv. Anticonceptivos y terapia hormonal 13 v. Sedentarismo 13 vi. Dieta 15 vii. Obesidad 16 viii. Diabetes Mellitus 16 ix. Dislipemia 17 x. Hipertensión arterial 19 xi. Síndrome metabólico 20 xii. Cardiopatías embolígenas 21 xiii. Migraña 22 xiv. Síndrome Apneas-Hipopnea 22 vii xv. Síndrome antifosfolípido 23 xvi. Hiperhomocisteinemia 24 xvii. Procesos inflamatorios crónicos 25 3. Actualización de la Genética en el Ictus 25 1. Métodos diagnósticos 28 2. Polimorfismos e Ictus en estudios de asociación y GWAS 32 i. Sistema Renina-Angiotensina 32 ii. Óxido Nítrico sintetasa 33 iii. Paraxonosasas 33 iv. Loci PHACTR1 36 v. Locus 9p21 37 vi. Polimorfismo KIV2 39 vii. Polimorfismo PRKCH 39 viii. Variantes genéticas gen Transtiretina 40 ix. Polimorfismos vinculados a la inflamación 41 x. Polimorfismos BRCA-1 41 xi. Sistema de coagulación y fibrinólisis 42 xii. Migraña 43 xiii. Enfermedades monogénicas 44 3. Ictus hemorrágicos 45 4. Trombosis de senos 46 5. Aneurismas 47 6. Farmacogenómica 47 4. Justificación del trabajo 51 5. Objetivos 52 1 El término ictus, ataque cerebral, o golpe en latín, representa a una entidad de causa vascular, con una presentación brusca o violenta que conduce a la necrosis tisular, y así afecta a la funcionalidad del encéfalo, y que puede presentar manifestaciones clínicas variables en función del territorio arterial afectado (1, 2). A lo largo de la historia este proceso clínico-patológico se ha conocido bajo diversas denominaciones, por ejemplo apoplejía, término de implicaciones históricas, asociado a una connotación de mal pronóstico y de imposibilidad de recuperación. El ictus se debe considerar un síndrome y no una entidad única, ya que es una patología heterogénea que agrupa por un lado a la patología isquémica y por otro a la hemorrágica, y que puede afectar tanto a la patología de vaso pequeño como a gran vaso, teniendo además la posibilidad de estar relacionado con múltiples etiologías (3). El ictus constituye un problema clínico de primer orden y representa la segunda causa de muerte en todo el mundo (4-6). No obstante asistimos a una disminución de la mortalidad en países desarrollados (7-9). Este descenso en la mortalidad tendrá un impacto limitado en la carga que representa el ictus, dado el envejecimiento de la población que conlleva una mayor incidencia del mismo. De esta manera el descenso de la mortalidad por si mismo no va a ser suficiente para disminuir las que repercusiones sociales y personales (10, 11) Se estima que 1 de cada 5 mujeres y 1 de cada 6 hombres sufrirán un ictus a lo largo de su vida (12). La incidencia del ictus presenta variaciones geográficas tanto en nuestro país como en el resto de Europa (6, 13, 14). La tasa de mortalidad en Cataluña en relación con ictus fue de 92 en hombres y 119 en mujeres por cada 100.000 habitantes mayores de 24 años; las tasas ajustadas por edad fueron de 58 (IC [intervalo de confianza] 95%: 56 a 61) y 43 (IC 95%: 2 41 a 44), respectivamente (15); la incidencia acumulada (casos mortales y no mortales) fue de 218 (IC 95%: 214 a 221) en hombres y de 127 (IC 95%: 125 a 128) en mujeres por 100.000 habitantes (15, 16). Otros estudios han arrojado una incidencia menor con 150 nuevos casos por 100.000 habitantes (17). A este respecto debemos señalar que los estudios epidemiológicos sobre el ictus están lastrados por problemas metodológicos dado que en la mayoría de ellos la información disponible se basa en registros hospitalarios, en encuestas realizadas puerta a puerta, en población total por muestreo o mediante el registro de las defunciones. Con respecto a la prevalencia, los datos disponibles en nuestro país la sitúan en torno al 2% en mayores de 20 años en el área de Alcoy (18). Las cifras serían más altas cuando se restringe la población estudiada a los subgrupos de mayor edad, alcanzando un 16,8 % en el área de Madrid (19). Un metanálisis de diversos estudios realizados en mayores de 70 años y en distintas zonas geográficas halló que las tasas de prevalencia ajustadas por edad fueron el 7,3% para los varones, 5,6% para las mujeres, y el 6,4% para ambos sexos (20). Entre las posibles consecuencias del ictus está la discapacidad que llega a alcanzar en algunas series una tasa del 7 % (21), entre las causas de discapacidad relacionadas con el ictus podemos encontrar los déficits motores o los del lenguaje, alteraciones psíquicas, crisis epilépticas secundarias o el deterioro cognitivo (22). Debemos señalar además, que la enfermedad vascular es la segunda causa de demencia y se relaciona no solo con la demencia vascular, sino que también tiene una acción sinérgica sobre la enfermedad de Alzheimer, ya que favorece su aparición precoz (23). 3 A la vista de los datos citados vemos que los costes atribuibles al ictus, ya sea personales, familiares o sociales son enormes (24, 25), siendo miles las personas afectadas en nuestro país, así como millones las horas empleadas en el cuidado tanto por la familia como personal sanitario (26). En la estimación de los costes debemos considerar tanto los costes indirectos, como los ligados a la pérdida de la capacidad productiva, que dependerán de la edad y de la profesión del sujeto afectado (27). Además cada una de las intervenciones diagnósticas y terapéuticas que se practican en el ictus supone un coste y con frecuencia se plantea la relación coste-efectividad de las mismas (26, 28). Clasificación Los ictus se clasifican en diversos subtipos siguiendo criterios clínicos, topográficos, patogénicos, diagnósticos y pronósticos (2, 29). Después de dos ediciones previas, en 1990 el “National Institute of Neurological Disorders and Stroke” (NINDS) de Estados Unidos trató de definir las variadas formas de ictus según su presentación clínica, sus mecanismos patogénicos y sus lesiones anatomopatológicas (29). En líneas generales los ictus pueden dividirse en dos grandes grupos según su mecanismo de producción: la isquemia cerebral o ictus isquémico (IS) y la hemorragia intracraneal o ictus hemorrágico (IH) (10, 30). Los IS representan entre el 80 y el 85 % de todos los ictus, mientras que el 15-20% restante obedecen a un IH (30). A su vez, dentro de la isquemia cerebral se puede distinguir entre la isquemia cerebral focal, que afecta a una sola zona del encéfalo, y la isquemia cerebral global, que afecta al encéfalo de forma difusa. Por otra parte, dentro de los IH se diferencian los hematomas cerebrales, ya sean profundos o corticales, además de la hemorragia subaracnoidea (HSA) (10). 4 Según la duración del proceso isquémico, clásicamente se consideran dos tipos de isquemia cerebral focal: el Ataque Isquémico Transitorio (AIT) y el infarto cerebral (2). El AIT se define como un episodio de isquemia cerebral focal o monocular de duración inferior a 24 horas, mientras que el infarto cerebral produce un déficit neurológico que persiste más de 24 horas, indicando la presencia de necrosis tisular (2), aunque se han planteado diversas objeciones a la definición de AIT en estos términos. La duración de 24 horas se considera arbitraria, de hecho, la mayoría de los AIT duran menos una hora (típicamente menos de 10 minutos). Hoy en día se postula que las medidas terapéuticas para la isquemia cerebral se deberían poner en marcha en las primeras horas y, por tanto, el intervalo de 24 horas para definir los AIT puede resultar excesivo. Además una proporción importante de estos episodios transitorios se asocian a lesiones cerebrales que aparecen como establecidas en los estudios de neuroimagen, especialmente cuando empleamos la Resonancia Magnética Craneal (RMN) para el diagnóstico (31). Por otra parte, el diagnóstico de AIT puede dar una falsa impresión de benignidad, cuando en realidad los pacientes que han sufrido un AIT tienen un riesgo alto de sufrir un ictus y de aparición de otros eventos vasculares, lo que obliga a adoptar medidas de prevención secundaria globales (32). Según la causa subyacente se distinguen varias categorías clínicas de IS (33), en primer lugar tenemos la enfermedad ateromatosa de gran vaso que puede afectar a las arterias carótidas o vertebrales de localización extracraneal, enfermedad que también puede asentar en las principales arterias intracraneales (34, 35). Las placas pueden ser estables y condicionar un evento clínico por una estenosis o que actúe por un mecanismo hemodinámico, 5 o producir la clínica a nivel distal por un embolismo arteria-arteria en relación con la presencia de una placa heterogénea e inestable. Los ictus cardioembólicos se relacionan con una fuente cardíaca de émbolos ya sea en presencia o no de patología estructural, siendo el ejemplo fundamental la fibrilación auricular (FA), ya sea valvular (FAV) o no valvular (FANV); aunque el ictus embólico puede relacionarse con muchas otras patologías cardíacas, como una válvula protésica, endocarditis, trombos murales secundarios a etiología isquémica entre muchas otras causas (10). Los ictus de origen ateromatoso al igual que los de causa cardioembólica se suelen expresar como síndromes territoriales presentando clínica cortical como la afasia, las agnosias y los déficits campimétricos. Otra de las alternativas etiológicas fundamentales es la patología lacunar o de pequeño vaso que afecta a arterias perforantes y que tiene como sustrato la lipohialinosis y la microateromatosis, y que se relaciona desde el punto de vista etiológico con la hipertensión o la diabetes, y desde el punto de vista clínico con la presentación en forma de síndromes lacunares. El resto de las etiologías comprende un conjunto de entidades menos frecuentes entre las que podemos encontrar disecciones, vasculitis, síndrome antifosfolípido (SAF), causas genéticas y muchas otras (10). El estudio etiológico a veces es difícil y requiere un esfuerzo diagnóstico a pesar del cual nos encontramos en torno a un 25-40% de ictus que se consideran de causa indeterminada (36). Los ictus también se pueden clasificar desde el punto de vista topográfico en función del vaso afectado, lo que lleva aparejada una variabilidad clínica en función del lecho arterial lesionado (37). Tenemos en primer lugar los ictus territoriales que pueden afectar a la totalidad del territorio anterior o de manera parcial, clasificándose conforme a la clasificación 6 ”Oxfordshire Stroke Project Classication” (OCSP) en 4 categorías. Estas serían en primer lugar los síndromes territoriales tipo “Total anterior circulation infarct (TACI)” o “Partial anterior circulation infarct (TACI)”; además estarían los infartos lacunares que se denominan “Lacunar anterior circulation infarct” (LACI) y los ictus de circulación posterior o “Posterior circulation infarct” (POCI) (38). La isquemia cerebral global tiene su origen en un descenso del flujo sanguíneo de todo el encéfalo, como ocurre con la parada cardíaca. Afecta a los hemisferios cerebrales de forma difusa, con o sin lesión asociada del tronco del encéfalo y/o cerebelo. Clínicamente puede provocar síndromes cerebrales focales que se localizan de manera característica en los territorios frontera entre las áreas irrigadas por la cerebral anterior y la media y la que limita entre los territorios irrigados por las arterias cerebrales media y posterior; también puede presentarse como déficits cognitivos como puede ser un trastorno de memoria, un estado vegetativo persistente o la muerte cerebral. Los IH, hematomas o hemorragias cerebrales son extravasaciones de sangre hacia el parénquima cerebral. La etiología más frecuente de los mismos es la hipertensión arterial, que se asocia hemorragias subcorticales. Otras causas de IH incluyen la angiopatía amiloide que es más propia de ancianos, cuya topografía es cortical denominándose hematomas lobares, además están las malformaciones vasculares, fármacos (p. ej. anticoagulantes), tóxicos (p. ej. alcohol, cocaína), diátesis hemorrágicas y tumores. Según la topografía, podemos clasificar la hemorragia parenquimatosa en: lobar, profunda (ganglios basales, capsular o subtalámica), troncoencefálica y cerebelosa. La presentación clínica depende de la localización y el volumen del sangrado. Los 7 signos y síntomas de una hemorragia cerebral pueden ser indistinguibles de los de los IS, aunque en la hemorragia cerebral son más frecuentes la disminución de la conciencia y la cefalea intensa. El diagnóstico requiere la realización de una Tomografía computarizada craneal (TAC). La hemorragia subaracnoidea (HSA) primaria que consiste en la extravasación primaria de sangre al espacio subaracnoideo que se debe generalmente a la rotura de un aneurisma y que típicamente provoca una cefalea brusca e intensa, con frecuencia asociada a signos meníngeos y alteración del nivel de conciencia. Factores de riesgo El IS es una de las manifestaciones de la enfermedad vascular, como también lo son la enfermedad de arterias coronarias o cardiopatía isquémica (EAC) o la enfermedad arterial periférica (EAP). Estas enfermedades comparten factores de riesgo (FR) y mecanismos patogénicos, y además ocurre que con frecuencia estas enfermedades se solapan (39, 40). La mayor parte de los ictus, tanto isquémicos como hemorrágicos, se relacionan con un grupo reducido de 10 factores de riesgo (41). No obstante los FR conocidos no explican la totalidad del riesgo relacionado con esta enfermedad, aunque las estimaciones son variables se especula que este riesgo no explicado puede alcanzar el 50 % (42). Se han encontrado vínculos epidemiológicos entre los ictus y múltiples FR, algunos de los FR están bien documentados, mientras que otros aún deben ser confirmados. Los FR pueden clasificarse como modificables, potencialmente modificables y no modificables. Tenemos además que la adición de FR incrementa el riesgo de sufrir un ictus. Es importante detectar pacientes con FR no modificables ya que, aunque éstos no se puedan tratar, identifican sujetos de alto riesgo en los que la coexistencia de FR 8 modificables sugiera la necesidad de realizar un control preventivo más estricto. En la tabla se recoge una clasificación de los factores de riesgo tanto para los IS como para los hemorrágicos (IH) (43). Tabla Factores de riesgo de los ictus isquémicos Fuente: Sacco et al (43) 9 Factores de riesgo no modificables La edad es el principal FR no modificable para el ictus, de manera que la incidencia de ictus se duplica aproximadamente cada 10 años a partir de los 55 años, aunque las cifras varían considerablemente, incluso dentro de una misma región (44, 45). A partir de los 75 años, las tasas específicas de mortalidad vascular referidas al ictus por grupo de edad (década) se sitúan en la primera causa de muerte (46, 47). El sexo es otro FR ya que el ictus es más prevalente en hombres que en mujeres, salvo por encima de los 85 años y entre los 35 y 45 años (45, 47). Las muertes por enfermedad vascular en España son más numerosas en mujeres que en hombres, aunque la tasa ajustada por edad y tipo de enfermedad vascular es superior en los hombres (48, 49). La raza constituye otro de los FR no modificable pues en diversos estudios se ha visto que las personas de origen afroamericano e hispanoamericano presentan una mayor incidencia y mortalidad por ictus (47, 50), hallazgo significativo para el IH (51). Una explicación de este hecho puede ser la mayor prevalencia de factores de riesgo como la hipertensión o la diabetes entre la población negra afroamericana, aunque es improbable que estos factores puedan explicar el exceso de carga en ciertas razas. En nuestro entorno no hemos hallado diferencias significativas en relación con la prevalencia de los principales factores de riesgo entre la población española con ictus respecto la del norte de Europa, salvo en lo relativo a la hipertensión, que fue más prevalente en población española (52). Por otra parte se han visto 10 diferencias raciales en lo relación con la respuesta a los fármacos antiagregantes y a hipotensores (53, 54). La historia familiar de ictus confiere un mayor riesgo de padecer un ictus, este hecho se ha vinculado en parte con una mayor susceptibilidad a padecer estos factores, y en parte con el compartir un mismo estilo de vida (55, 56). La historia familiar ha mostrado un mayor riesgo para los gemelos homocigotos respecto a los heterocigotos en una revisión sistemática de estudios observacionales, este riesgo afecta tanto a la microangiopatía como a la patología de vaso grande (57). Los estudios en gemelos apoyan el papel de la herencia en la patogenia del ictus, no obstante el número de casos es pequeño y el intervalo de confianza amplio (58, 59). Se plantea obtener más información por el estudio de historias familiares de casos índice, aunque es susceptible de sesgos (57, 60). Se estima que la herencia participa en la patogenia del ictus en un 37,5 % de los casos de IS, distribuyéndose por subtipos etiológicos en un 40.3% para la enfermedad de gran vaso, 32.6% para el cardioembólico y para la enfermedad de pequeño vaso el 16.1% (61). El riesgo diferencial de la ateroesclerosis en la población general puede reflejar variaciones en los genes que modulan la respuesta inflamatoria a los lípidos oxidados en la pared arterial (62). Por ello se ha sugerido un papel diferencial de los genes que participan en la patogenia de la aterosclerosis (63, 64). La historia familiar de patología vascular ocurre con más frecuencia en mujeres que en hombres (65). El riesgo aumentado de padecer un ictus se puede relacionar con diversos mecanismos como la transmisión hereditaria de los factores de riesgo 17 tempranas (49). En los hombres diabéticos se eleva la probabilidad de sufrir un ictus entre 2,5 y 4,1 veces, y en mujeres, entre 3,6 y 5,8 veces (148, 154). La relación entre los niveles altos de colesterol y el riesgo de ictus ha constituido un tema de controversia a pesar de que esta relación se halla bien establecida con el riesgo vascular global (155-157). En un metanálisis de datos individuales (61 estudios prospectivos, 55.000 muertes vasculares) el colesterol total se asoció a la mortalidad por cardiopatía isquémica en edades medias y avanzadas. Además observó que por cada unidad (mmol/l) de descenso de colesterol en plasma la mortalidad por cardiopatía isquémica se reducía a la mitad, un tercio y un sexto en ambos sexos, para las edades comprendidas entre 40 y 49 años, 50 y 69 años y 70 y 89 años respectivamente (156). La mayoría de los estudios epidemiológicos han mostrado una relación inversa entre el riesgo de ictus y el colesterol ligado a lipoproteínas de alta densidad (75, 157, 158), manteniendo esta relación en diversos grupos étnicos (159). En el estudio “Cardiovascular Health Study” (CHS) los niveles altos de colesterol HDL se asociaron a un riesgo de ictus disminuido solo en hombres (160), en el estudio ARIC (Atherosclerosis Risk in Commnunities) no se documentó una relación con el IS (161). En diversas cohortes se ha observado que por cada incremento de 10 mg/dL del colesterol asociado a lipoproteínas de alta densidad (HDL) se produce una disminución del riesgo de ictus del 1115 % (162). Por otra parte también se ha demostrado una asociación entre los niveles elevados de TG y el riesgo de IS, y con el ictus de gran vaso (163-165). No obstante hay diversidad de datos que en parte guardan relación al hecho de hacer el estudio de los TG en ayunas o posprandiales (161). Además diversas revisiones sistemáticas han analizado la eficacia de diferentes intervenciones 18 orientadas a la disminución de lípidos en sangre en pacientes con y sin antecedentes de EAC mostrando una disminución significativa del riesgo de ictus con el empleo de estatinas (166-168). Muchos estudios han encontrado una relación entre niveles bajos de colesterol y un riesgo aumentado de IH. En el estudio MRFIT (Multiple Risk Factor Intervention Trial) el riesgo de muerte en relación con el IH se multiplica por 3 en presencia de concentraciones de colesterol <160 mg/dL respecto al correspondiente riesgo con los niveles de colesterol superiores (169, 170). En el estudio APCSC (Asia Pacific Cohort Studies Collaboration) hubo una disminución del 20% de riesgo de IH (95% IC, 8% a 30%) por cada 1 mmol/L (38.7 mg/dL) de incremento del colesterol, total (171). No obstante esta relación no se ha documentado en otros trabajos (172). La lipoproteinlipasa A o Lp(a) es un complejo lipoproteico de baja densidad, donde la apolipoproteína B-100 está unida de forma covalente con la glicoproteína, apoproteína(a). Este complejo lipoproteico tiene una similitud estructural con las lipoproteínas de baja densidad (LDL), actuando en el transporte del colesterol a los tejidos y arterias. La apoproteína (a) también tienen analogía estructural con el plasminógeno, sin tener actividad enzimática, así favorece la inhibición de la fibrinólisis y la aterogénesis. Se encuentra implicado en estados protrombóticos, que favorece la ateromatosis, y que tiene propiedades antifibrinolíticas y promotoras de la ateromatosis. Valores elevados de Lp(a) se han asociado a un aumento de riesgo de enfermedad vascular cerebral y de EAC (173, 174). En el estudio ARIC la incidencia de ictus isquémico se encontraba aumentada un 80% (RR, 1,79; 95% IC, 1,322,42) en pacientes con elevación de los niveles de Lp(a) tras ajustar por edad, 19 sexo y raza (175). La Lp(a) se encuentra asociada además a las características de la placa incluida con el grado de estenosis (176). De forma genérica se considera a la hipertensión arterial (HTA) como el principal FR después de la edad tanto para el IS como para el IH, incrementando entre tres y cinco veces el riesgo de padecer un ictus (41). La relación entre ictus e HTA es fuerte, graduada, consistente, independiente, predictiva y etiológicamente significativa, incrementándose el riesgo de ictus de forma paralela a la elevación de la HTA (177, 178). La prevalencia de la HTA está en ascenso, especialmente la sistólica; este incremento se relaciona en parte con el de la obesidad y el sobrepeso (179-181). Además los sujetos con hipertensión con frecuencia asocian otros factores de riesgo como obesidad, sedentarismo o consumo de alcohol (182). Los valores de referencia para considerar un sujeto como hipertenso se han ido corrigiendo siendo en la actualidad los límites inferiores a los considerados previamente y hoy se propugna definir la hipertensión por encima de 115/75 mmHg (177). En este sentido señalaremos con resultados de un metanálisis reciente que postula que la prehipertensión (TAS≥ 120-129 y TAD≥ 80-84) se asocia a morbilidad por ictus tras ajustar por múltiples FR vasculares (183). La prevalencia de la HTA en nuestro país está próxima al 46,8% de la población de entre 35 y 64 años según un estudio que evaluaba la prevalencia de HTA en seis países europeos, Canadá y Estados Unidos. El estudio mostraba una mayor prevalencia de HTA en Europa y un patrón similar para las tasas por muerte por ictus (184). Este hecho ya se observó en el estudio internacional MONICA (Monitory Cardiovascular Diseases), que constató una relación similar entre hipertensión e incidencia de ictus (185). En nuestro país 20 el control de los factores de riesgo y el cumplimiento de las recomendaciones al respecto es muy pobre, de esta manera el control deficiente de las cifras de presión arterial y la presencia de hipertrofia ventricular izquierda (HVI) se asociaron significativamente con la mortalidad por ictus (186, 187). El síndrome metabólico (SM) es una combinación de factores de riesgo en un individuo que incrementa el riesgo vascular, se incluyen entre estos factores a la obesidad abdominal, la dislipemia aterogénica (elevación de los triglicéridos y disminución del colesterol HDL, la HTA, la DM y la elevación de la glucemia en ayunas. Posteriormente se ha ampliado la definición incluyendo la inflamación subclínica, además de los trastornos de la trombosis, fibrinólisis y de función endotelial que se ha demostrado tienen una transmisión genética (188-190). La resistencia a la insulina se describe como un estado fisiopatológico en el que su efecto es inferior al esperable y tiene como consecuencia la reducción de la captación periférica de glucosa (en el músculo y la grasa), un aumento de la producción de glucosa hepática, y de la secreción compensatoria de insulina pancreática (191). Los criterios más ampliamente aceptados para su definición son los de la ATP III-modificados (Adult Treatment Program) del año 2006, así como los criterios de la IDF (International Diabetes Federation) del año 2005. La prevalencia del SM en nuestro entorno se estima de un 25% en hombres y un 20% en mujeres (192, 193), y entre los pacientes con IS es del 40-50% (194, 195). El riesgo de enfermedad vascular y muerte es un 78% superior en pacientes con SM, siendo mayor en mujeres que en los hombres y en sujetos sin EAC de base (196). Estos hallazgos son concordantes con los datos ofrecidos por cohortes 21 prospectivas posteriores en los que está aumentado el riesgo de ictus de cualquier tipo (197, 198). Las cardiopatías embolígenas agrupan un conjunto heterogéneo de entidades que representan una causa importante de ictus. Los pacientes afectos de un IAM se pueden complicar con la aparición de un ictus secundario a un embolismo, lo que ocurre hasta en el 1,2% de los IAM (199, 200). Entre las circunstancias que la favorecen están edad, la HTA, la fibrilación auricular (FA), el ictus previo o una fracción de eyección reducida, áreas discinéticas o la presencia de trombos intramurales (199, 201, 202). La miocardiopatía dilatada y otras entidades con una fracción de eyección baja también están en riesgo de presentar eventos embólicos, aunque es relativamente bajo aún en presencia de un trombo intracavitario (203). La FA no valvular (FANV) es el trastorno del ritmo cardíaco más frecuente, cuya prevalencia aumenta con la edad y es el factor de riesgo más importante para el ictus tras la hipertensión, asociándose a ictus más graves y con mayores mortalidad y discapacidad (204, 205). La enfermedad valvular y el recambio de las mismas también se han asociado a un aumento del riesgo de eventos vasculares cerebrales de origen embólico. El aumento del riesgo es mayor en las válvulas mecánicas que en las biológicas, precisando por este motivo un rango mayor de anticoagulación para una prevención adecuada del riesgo de embolias (206, 207). La estenosis mitral es el ejemplo clásico de patología valvular asociado al riesgo embolígeno, que está especialmente incrementado en los casos que asocian FA (208, 209). El Prolapso de la válvula mitral (PVM) es una afección valvular frecuente generalmente benigna, aunque en ciertas circunstancias el riesgo de embolias 22 se encuentra elevado. Entre estas últimas tenemos una regurgitación significativa, el grosor de la válvula mitral (>5 mm) o el tamaño de la aurícula izquierda (>50 mm), la presencia de un trombo en aurícula izquierda o de FA (210-212). La persistencia de un “Foramen Ovale Permeable” (FOP) es frecuente en la población general dado que se ha objetivado hasta en un 25,6%, el defecto aneurismático del septo (ASA) es menos frecuente y puede afectar hasta al 2% de la población general (213, 214). El hecho de que la presencia de un FOP puede ser una causa de ictus es una cuestión muy debatida, aunque hay estudios que sí demuestran una relación especialmente ante la presencia de un ASA (213, 215). La migraña, especialmente la que asocia la presencia de aura migrañosa se ha vinculado a un aumento del riesgo vascular cerebral y este riesgo se encuentra incrementado con el uso concomitante de ACO (216-219). En diversos estudios se ha demostrado que roncar representa un factor de riesgo para el IS independientemente de otros factores de confusión como pueden ser la HTA, la EAC, la obesidad o la edad (220, 221). Esta patología presenta una asociación con variaciones topográficas en la localización arterial preferente de la afectación arteriosclerótica, de esta manera vemos que el riesgo es mayor en la arteria carótida que en la femoral (222). En la línea de estos hallazgos tenemos un estudio observacional encontró en pacientes con “Síndrome Apneas-hipopneas graves de sueño” (SAHOS), es decir más de 30 por hora de sueño, tenían un mayor riesgo de eventos cardiovasculares mortales y no mortales. Los pacientes que recibían tratamiento con presión positiva continua (CPAP) no diferían de los sujetos sanos en relación con el 23 número de eventos cardiovaculares (223). El SAHOS tiene una asociación independiente con el riesgo de ictus y muerte (HR, 1.97; 95% IC, 1.123.4; P<0.01), tras ajustar por edad, sexo, raza, hábito tabáquico, consumo de alcohol, IMC, FA e HTA (224, 225). El riesgo para desarrollar un IS en relación con el índice de apnea-hiponea basal está elevado 2-5 veces (HR, 2.52; 95% CI, 1.04 - 6.01; P<0.04). Se postula como base de esta relación causal el empeoramiento de la HTA con la que mantiene una relación dosis-respuesta, el empeoramiento de la enfermedad cardíaca, la reducciones en el flujo sanguíneo cerebral (FSC), pérdida de la autorregulación vascular cerebral, pérdida de la función endotelial, aterogénesis acelerada, inflamación y embolismo paradójico en pacientes con FOP (226-229). En pacientes con trastornos de sueño graves y evolucionados hay un aumento del riesgo de arritmias auriculares y de bloqueo aurículoventricular cuando la saturación de oxihemoglobina es inferior al 65 % (230-232). También se ha encontrado un mayor número de lesiones isquémicas silentes en los estudios de RMN cerebral en los controles sanos o respecto a los sujetos con SAOS leve(233). El síndrome antifosfolipídico (SAF) es una entidad de origen multifactorial, que puede ser primaria o asociada a otras enfermedades autoinmunes. En el SAF la presencia en plasma de anticuerpos antifosfolípidos de membrana (AFL), especialmente los anticuerpos anticardiolipina y el anticoagulante lúpico (AL), incrementan la tendencia a la morbilidad obstétrica y a los eventos trombóticos tanto en hombres como en mujeres, con una tasa anual que puede llegar al 3,8 % (234-236). No obstante el papel de los AFL en la aparición de un primer evento vascular o en la aparición de recurrencias ha sido objeto de controversia, por un lado la mayor parte de los trabajos son no 24 controlados, además hay trabajos en los que no se muestra su papel predictivo en las recurrencias o en el patrón de respuesta a la medicación antitrombótica en la prevención secundaria (237). La homocisteína (Hcy) es un aminoácido producto del metabolismo de la metionina, que se incrementa con frecuencia en situaciones en las que la actividad enzimática de las diferentes vías está reducida como entre ellas la cistationina beta sintetasa y la metilenetetrahidrofolato reductasa (MTHFR). También se puede aumentar su concentración por la falta de depuración renal o a por la carencia de otros cofactores como la piridoxina, el ácido fólico o la cobalamina. La hiperhomocisteinemia se ha vinculado con un aumento del riesgo de enfermedad vascular en 2-3 veces, incluyendo al IS, especialmente en los casos en los que se encuentra ligada a las mutaciones del gen de la MTHFR (238-242). Además en diversos estudios se ha establecido la relación entre el Grosor Íntima Media (GIM) y la estenosis carotídea con los niveles elevados de Hcy aunque hay datos contradictorios (243-245). En este sentido los trabajos realizados con el empleo de ácido fólico para prevenir la recurrencia de episodios vasculares han sido inconsistentes, aunque en algunos se ha encontrado una disminución significativa de la recurrencia de eventos vasculares (246, 247). La inflamación afecta al inicio, crecimiento y desestabilización de las lesiones ateroscleróticas (248). Algunos marcadores séricos de inflamación como el fibrinógeno, amiloide sérico, Lp-PLA2, la proteína C reactiva de alta sensibilidad (PCRus) e interleukina 6 (IL6), se han propuesto como marcadores de riesgo vascular (249-251). Se ha postulado una relación entre Lp-PLA2 y el riesgo de ictus y de EAC (252-254). Otra vía para evaluar el rol 25 de la inflamación como FR es analizar la incidencia de la enfermedad vascular en personas con enfermedades inflamatorias sistémicas como la artritis reumatoide (AR) y el lupus (LES), en numerosos estudios se ha documentado un aumento del riesgo con una Odds Ratio de 1.4 a 2, que a su vez estaría aumentado en caso de que existan otros FR asociados (255-258). También las infecciones crónicas juegan un papel parecido en acelerar la aterosclerosis, en este sentido se han implicados diversos virus y bacterias como el Helicobacter pylori. No obstante, no se ha obtenido beneficio al emplear antimicrobianos a la hora de prevenir eventos vasculares (259-261). Se han postulado como participantes en la patogenia de la aterosclerosis asociada a inflamación e infecciones, y la inducción de reactantes de fase aguda procoagulantes como el fibrinógeno (262). A este respecto se ha comprobado en estudios casos-control y de cohortes una disminución del riesgo de ictus vinculada a la vacunación para la gripe (263, 264). Actualización en genética del ictus Para la mayoría de las enfermedades comunes, incluyendo enfermedades cardíacas, DM, HTA y cáncer, múltiples factores genéticos y ambientales influyen en el riesgo que tiene un individuo de verse afectado. Esta complejidad contrasta con el patrón de herencia de enfermedades monogénicas, en el que la presencia o ausencia de alelos de enfermedad predice por lo general completamente la presencia o ausencia de la enfermedad (aunque la edad de debut y la gravedad de la misma pueden variar). La susceptibilidad a la enfermedad puede estar condicionada por la presencia de polimorfismos comunes en el ADN. 26 Un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) es una variación de la secuencia de ácido desoxirribonucleico (ADN) que afecta a una sola base adenina (A), timina (T), citosina (C) o guanina (G) de una secuencia del genoma. Los SNPs son generalmente bialélicos y constituyen hasta el 90% de todas las variaciones genómicas humana, apareciendo de media cada 1.300 bases a lo largo del genoma humano (265). La distribución genómica de SNPs no es homogénea, los SNPs generalmente ocurren en regiones no codificantes con más frecuencia que en regiones codificantes o, en general , donde la selección natural está actuando y fijando el alelo del SNP que constituye la adaptación genética más favorable (266). Los SNPs que no están en regiones codificantes de proteínas pueden afectar al proceso de traducción, especialmente en el ensamblaje (splicing) de genes, unión a factor de transcripción, la degradación del ARN mensajero, o la secuencia de ARN no codificante. La expresión de genes afectados por este tipo de SNP se conoce como un ESNP (expresión SNP) y puede ser corriente arriba o corriente abajo del gen (upstream vs downstream). Los SNPs dentro de una secuencia de codificación no cambian necesariamente la secuencia de aminoácidos de la proteína que se produce, debido a la degeneración del código genético. SNPs en la región codificante pueden ser en primer lugar sinónimos (o mutación silenciosa), estos no afectan a la secuencia de la proteína, y por otra parte tenemos los no sinónimos que pueden cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína. En este segundo grupo los SNPs pueden ser “sin o con sentido”. Encontramos que se han comunicado más de 600 asociaciones positivas entre las variantes genéticas comunes y enfermedades (267), lo que tendría una enorme importancia para la prevención, predicción y tratamiento de 33 También se han establecido relaciones entre variantes en el gen de la aldosterona con la enfermedad cerebrovascular y la muerte por ictus (303). Estudios de intervención con fármacos que inhiben el SRA han demostrado un beneficio en la incidencia de ictus y de enfermedad vascular en general (304, 305). Un metanálisis del polimorfismo M235T del angiotensinógeno sugiere aumento del riesgo de infarto de miocardio y de IS en población asiática (306). El Óxido Nítrico (ON), es un gas regulatorio pluripotente en el sistema vascular que puede tener un efecto antitrombótico al reducir la adhesión y agregación plaquetarias (307, 308). El ON se sintetiza a través del gen de las isoenzimas de la óxido nítrico sintetasa, de la que hay 3 variantes que son endotelial (eNOS), neural (nNOS), y la inducible por citocinas (iNOS). La eNOS es la fundamental en la síntesis de ON y de mantener el flujo sanguíneo cerebral (309). Los genes que codifican la eNOS se localizan en el cromosoma 7 (7q35–q36), y hay 3 polimorfismos habitualmente considerados, 4b/a, T-786C and G894T en relación con la patogenia del ictus, además de haberse relacionado con la hipertensión, los niveles de colesterol total y del colesterol asociado a lipoproteínas de baja densidad (310-313). Por otra parte un metanálisis de 2.011 en población asiática también apoya esta relación (313). Hay un metanálisis posterior que encuentra asociación entre eNOS T786C e IS especialmente en la población entre 60 y 65 años (314). El sistema de las paroxonasas (PON) comprende 3 genes que comparten 60-65% de similitud en los aminoácidos (315), que codifican 3 isoenzimas las cuales participan en prevenir la oxidación de los lípidos. Los polimorfismos genéticos asociados a las PON afectan a la actividad de la 34 enzima y se han asociado a un incremento en el riesgo de IS, aunque con datos controvertidos (316, 317). El gen de la paraoxonasa 1 (PON1) se localiza en el cromosoma 7q21.3–22, y codifica una enzima con una amplia especificidad de sustrato y cuyas funciones no están completamente descubiertas (318), así se ha implicado en la aterogénesis en virtud de su unión a partículas HDL y en la prevención de la oxidación de las LDL, además se ha especulado sobre su influencia en el grosor íntima-media y en la inflamación con un papel potencial en la ateroprotección (319-321). Otro importante sustrato para la PON1 puede ser la homocistein tiolactona, que se correlaciona negativamente con la Nhomocisteinalación y sugiere otro mecanismo beneficioso en la prevención de la aterosclerosis (322). Los niveles aumentados de PON1 se han asociado en algunos estudios con mayores niveles de HDL (323), que poseen la mayor capacidad predictiva negativa para enfermedad vascular. No obstante en estudios realizados en EAC se ha planteado un mayor valor pronóstico en relación con la actividad de arilesterasa, que mide la función de la PON 1, respecto a la medida de la PON 1 (324). En un trabajo en pacientes con ictus se postula que el cociente entre PON y arilesterasa predice mejor el pronóstico en términos de discapacidad, respecto a la capacidad predictiva de cada uno por separado (325). Este gen se ha investigado como potencial factor de riesgo para fenotipos relacionados con la aterosclerosis, incluyendo la EAC, EAP e IS (326, 327). La actividad de la PON 1 depende de diversos factores, entre los que se encuentran factores genéticos, edad, sexo, estilo de vida y fármacos (324). 35 Los polimorfismos de la PON 1 rs662 (c.575A>G o p.Gln192Arg) y rs854560 (c.163T>A o p.Leu55Met), se han relacionado con la patogenia de la EAC, ictus y EAP (327, 328). Diversas revisiones han confirmados el papel del alelo G de rs662 en un discreto incremento del riesgo de IS (por-alelo OR=1.12) y no del segundo (328, 329). En un análisis combinado de estudios se ha evidenciado que la asociación del polimorfismo Gln192Arg SNP con el riesgo de ictus (330, 331). También se ha descrito que un polimorfismo funcional de la PON 1 interfiere la unión con microRNA e incrementa el riesgo de ictus y de ateromatosis carotídea (332). Las variaciones genéticas del gen de la PON 1 tienen relación con el “Grosor Íntima Media” (GIM), teniendo el G-824A una capacidad predictiva independiente (327). Las PON 2 y 3 también han sido implicadas como genes candidatos en la patogenia de la aterosclerosis y las enfermedades cardiovasculares debido a su capacidad de atenuar la peroxidación de los lípidos (333-335). Los bajos niveles de actividad de PON se han asociado a un incremento del riesgo vascular (316), aunque se han dado resultados discordantes en relación con diferencias étnicas (336-338). En un metanálisis se ha demostrado una asociación nominal significativa entre el polimorfismo rs662 e IS (P = 0.0100, OR = 1.08 [95% IC = 1.02-1.15](339). En otro trabajo en población china se ha encontrado también una asociación nominal entre rs705381 (−162) con el ictus de forma global y con el isquémico, pero no con el hemorrágico, entre rs854571 (−824) e ictus, con el alelo T como factor protector (335). La Paraoxonasa 2 (PON2) se expresa de manera ubicua, estando presente en múltiples tejidos humanos como pulmón, hígado, corazón e 36 intestino (331), y al contrario que las PON 1 no parece estar asociada a las partículas de HDL (340). También se considera con propiedades antiaterogénicas al proteger a las lipoproteínas de baja densidad de la oxidación (337). Hay 2 polimorfismos frecuentes del gen de la PON 2, que serían PON2-148 [C/G: Ala (A)/Gly (G)] y PON2-311 [C/G: Cys (C)/Ser (S)], y el PON2-148 "G" (variante G), asociados a altos niveles basales de glucosa; el PON2-311 "G" (alelo S) se ha asociado a EAC (341). A pesar del interés creciente hay menos información acerca de la PON2 y sus funciones. Pan y colaboradores encontraron que el polimorfismo PON2 Ser311 se asociaba a EAC (342), por el contrario otro trabajo solo encontró asociación en los sujetos con tabaquismo (343). Este polimorfismo se ha descrito en pacientes con ictus de gran vaso (344), aunque hay datos contrapuestos (330, 337). Un metanálisis posterior tampoco encontró asociación, aunque un análisis por etnias sugería una posible asociación en población europea (345). Este polimorfismo se ha asociado a ictus de mayor gravedad (346). Otro trabajo, realizado por Cozzi y colaboradores encontró que el polimorfismo PON2 Cys311Ser un cofactor de riesgo en la asociación anterior de PON1 y con otros factores de riesgo (347). El ictus de gran vaso se ha relacionado con el loci PHACTR1, que ya había sido descrito en el infarto agudo de miocardio (61). El riesgo diferencial de la ateroesclerosis en la población puede reflejar variaciones en los genes que modulan la respuesta inflamatoria a los lípidos oxidados en la pared arterial (62, 348, 349), influyendo así los genes en la patogenia de la aterosclerosis (64, 350). En relación con la patología de gran vaso se ha demostrado en estudios de gemelos que las características de la placa (ecogenicidad, número, 37 lateralidad) tienen un papel la herencia hasta en el 78 % de los casos (349, 351). En un trabajo realizado en 2011 en población dominicana residente en Estados Unidos se describió la asociación de 7 genes relacionados con la inflamación 8TNF, NOS2A, IL6R, TNFSF4, PPARA, IL1A, TLR4) y de 2 genes relacionados con la función endotelial (ITGA2, HABP2) con los fenotipos de la placa carotídea; además se identificó un haplotipo VCAM1 relacionado con la placa carotídea calcificada (352), ninguno de los genes relacionados con la inflamación se asoció con el grosor íntima-media (GIM). La identificación del locus 9p21 (Chr9p21) ha sido un descubrimiento de primer orden en la genética cardiovascular., su presencia aumenta el riesgo vascular independientemente de los factores de riesgo de convencionales (340), también es independiente de un locus próximo relacionado con la DM (353). De esta forma se postula que Chr9p21 podría afectar la aterosclerosis a través de un mecanismo totalmente nuevo. Otro hallazgo interesante es que la región genómica que comprende el haplotipo relacionado con la EAC es un "desierto de genes", carente de genes codificadores de proteínas anotadas. Los genes codificantes más próximos son 2 inhibidores de quinasa cicloindependiente CDKN2B (codificación p15INK4b) y CDKN2A (codificación p16INK4a y p14ARF), así como la metiltioadenosina fosforilasa (MTAP). CDKN2Ay CDKN2B están involucrados en el control del ciclo celular, y MTAP que interviene en preservar la adenina y la metionina, que es importante para la proliferación de células del músculo liso y en la aterogénesis (354). La región contiene un ARN largo no codificantes intergénico anti sentido denominado ARN en el INK4 locus (ANRIL). Un sinónimo es CDKN2BAS (CDKN2B ARN anti sentido) (355). Los estudios recientes han demostrado que la expresión 38 está regulada por ANRIL Chr9p21 y podría constituir en un factor clave para la comprensión la fisiopatología del locus. Diversos estudios han investigado la relación entre Chr9p21 con fenotipos que están posiblemente relacionados con la EAC, se han detectado asociaciones robustas con un aumento de la reactividad plaquetaria (356). Otra asociación es la de EAC y peridodontitis (357, 358). Se ha descrito una fuerte asociación entre la región Chr9p21 y la placa carotídea (OR 1.31–1.46), además de la asociación con la progresión de la placa aunque no con el GIM (359, 360). Su papel en la placa no es importante en fases iniciales de la enfermedad ateromatosa sino en la progresión, esto se apoya por la falta de relación con la vasodilatación braquial como un marcador de etapas iniciales (361). Una variante en el cromosoma 9p21 que fue descrita en la cardiopatía isquémica se ha asociado con el IS ateromatoso de vaso grande y a muchas otras manifestaciones de enfermedad vascular como la EAP, insuficiencia cardiaca y mortalidad cardiovascular (340, 362). Esta variante también se ha vinculado con los aneurismas intracraneales y de aorta abdominal (363). El efecto no tiene relación con los factores de riesgo tradicionales, además se trata de una región del genoma no implicada en la codificación de proteínas. También se ha asociado con el IS cardioembolico y la fibrilación auricular el locus del gen PITX2 en el cromosoma 4q25 (364); respecto a la fibrilación auricular se han descrito posteriormente su asociación con otros SNP (365). El “Wellcome Trust Case Control Consortium Ischemic Stroke” GWAS identificó una asociación novel en 7p21; en el gen HDAC9 (366) que codifica para una histona deacetilasa 9. Esta asociación se limita al ictus ateromatoso 39 de vaso grande, influyendo en el GIM y un aumento en la expresión del mRNA (367). El gen probablemente participa de la aceleración de la aterosclerosis y el ácido valproico actúa inhibiendo el gen y se asocia a una menor tasa de ictus (368). El polimorfismo KIV2 está implicado en el 69% de la variabilidad del nivel de Lp(a) (369, 370), y con una disminución del riesgo de Infarto agudo de miocardio(371). Se ha establecido la relación de los poliformismos de la liproproteinlipasa Ser447Ter y Asn291Ser, aunque su relación con el ictus es controvertida (372), un metanálisis encontró que el polimorfismo Ser447Ter se relaciona con un menor riesgo de ictus especialmente el aterosclerótico (373). Se ha encontrado que la asociación entre Lp(a) parece tener relación solo con ciertas localizaciones de la enfermedad aterosclerótica como la EAC y la EAP, pero no con el ictus (374). Trabajos en población asiática han demostrado un SNP en una proteinkinasa (PKC), PRKCH, que se ha asociado a enfermedad de pequeño vaso y a lesiones silentes en RMN (375). Las lesiones de sustancia blanca en RMN son un marcador de enfermedad de pequeño vaso y se estima que la herencia juega un papel hasta en el 70% de los casos (68, 376, 377). Las bases genéticas están aún por dilucidar y un metanálisis de 19 genes candidatos, entre los que se incluían APOE, MTHFR y angiotensina, no identificó una asociación (378). También se ha vinculado la patología de pequeño vaso tanto isquémica como hemorrágica con el genoma mitocondrial y variantes de los genes de la fosforilación oxidativa (379). Un trabajo reciente encontró asociación entre las lesiones de sustancia blanca y un nuevo locus en el cromosoma 17q25, aunque sin relación con el ictus lacunar, por ello se 40 plantean que no actúa sobre la arteriopatía responsable del infarto lacunar (380). La transtiretina es una de las muchas proteínas que pueden causar amiloidosis, encuadrándose en un grupo de enfermedades caracterizado por el depósito extracelular de proteínas fibrilares patológicas insolubles en órganos y tejidos (381). El depósito de amiloide está condicionado por la desestabilización de la misma, proceso que puede ser bloqueado por tiroxina, y por las drogas que estabilizan tetrámeros de transtiretina (382, 383). Estudios de genotipado para 2 variantes genéticas en el gen transtiretina (TTR), R104H y T119M, que determinaron la asociación de genotipos con niveles plasmáticos de transtiretina, las medidas de la función tiroidea, el riesgo de la enfermedad vascular y la esperanza de vida, concluyeron que estas variantes disminuyeron el riesgo de enfermedad cerebrovascular, aumentando la esperanza de vida en la población general (384). El fibrinógeno está elevado en las patologías inflamatorias juega un papel importante en la trombosis y tiene capacidad predictiva la patología vascular (385, 386). En metanálisis de GWAS se ha establecido la relación de diversas variantes génicas que afectan a los niveles de fibrinógeno (387), aunque metanálisis posteriores no han encontrado relación causal con el ictus (388). En un estudio, sobre la base de un tagSNP se demostró que el polimorfismo rs380092 en IL-1RN mostró una asociación con la asociación con el IS y en especial con el ictus criptogénico (389). 41 Se ha demostrado relación entre vinculados a la inflamación y el riesgo de ictus, entre ellos los que codifican el factor de necrosis tumoral  (TNF) que tienen una acción pro inflamatoria (390-392). Por contra se han descrito otros polimorfismos de la IL10 que tienen la acción contraria, y limitan las reacciones inflamatorias al antagonizar las TNF-a, IL-1b, IL (393). Se han descrito 3 SNP en el gen promotor de IL-10 (_1082 G/A, _819 C/T, _592 C/A) que muestran un marcado desequilibrio de ligamiento, los cuales forman 3 haplotipos que se han asociado a un descenso en la síntesis de IL 10 y a diversas patologías (394). La IL-1 RA, antagoniza la actividad de IL-1 y controla la actividad del SNP del antagonista del receptor de IL-1b, y de IL-1 A (IL-1RA), habiéndose descrito la asociación a la predisposición a aterosclerosis e ictus (395-397). También se ha comunicado una mayor frecuencia del genotipo IL-1 VNTR 86 bp 2/2 en sujetos con IS lacunar (OR = 6.05; p = 0.017) (396). Otros genes que participan en los fenómenos inflamatorios también se han relacionado con el ictus, como el de la IL 6 y el de la metaloproteinasa 3 (MMP3) (398-401). El gen BRCA-1 associated protein (BRAP) se ha identificado como relacionado con la susceptibilidad para el IAM (402). El poco frecuente SNP GG homocigoto rs11066001 en el gen BRAP se ha asociado en población japonesa y china con un incremento de a 1.31 a 1.47 veces el riesgo de IAM, con el índice tobillo-brazo y con la aterosclerosis carotídea (403, 404). El gen participa como mediador de la inflamación, y la translocación se ha relacionado con la producción citocinas inflamatorias aunque no hay datos concluyentes de su participación en la patogenia del ictus (405). 42 Polimorfismos del gen que codifica la linfotoxina-alfa (LTA) pueden aumentar la transcripción, asociarse a procesos inflamatorios crónicos y aumentar riesgo de IAM; en el ictus también se han asociado significativamente en sujetos no hipertensos: LTA 252A_G (modelo aditivo; OR, 1.4; 95% IC de 1.20 - 1.65; P<0.00002) y LTA 26Thr_Asn (OR, 1.19 con 95% IC, 1.061.34; P_0.003). LTA 252A_G (406). Diversos estudios han mostrado la herencia en los componentes de la coagulación y de los fenotipos de la fibrina en relación con la patogenia del ictus (407, 408). Muchas coagulopatías se heredan con un patrón autosómico dominante, y entre estas afecciones se incluyen las deficiencias de las proteínas C y S, las mutaciones del factor V Leiden (FVL) y otras deficiencias que aumentan el riesgo de trombosis venosas (409-413). Algunas coagulopatías adquiridas pueden ser familiares hasta en el 10 % de los casos (414, 415). Un estudio sugería que los estados de hipercogulabilidad eran más frecuentes en pacientes con FOP respecto a los que no lo tenían, sin encontrar diferencias en la prevalencia de FVL o de la mutación 20210 del gen de la protrombina. La prevalencia de la mutación 20210 de la protrombina aislada era mayor en sujetos con ictus criptogénico y FOP, lo que plantea que este mayor riesgo se relacione con el FOP (416). El sistema de coagulación y fibrinólisis mantiene un equilibrio dinámico que en condiciones patológicas se altera sobrepasando los mecanismos regulatorios iniciando el proceso trombótico (417). Se ha demostrado herencia de fenotipos de la estructura de la fibrina y estudios GWAS han identificado loci genéticos comunes asociados con fenotipos de coagulación y se han asociado con EAC e ictus de vaso grande (408). De esta manera los factores 49 potente interacción relacionada con el ictus corresponde al polimorfismo CETP (Cholesteryl ester transfer protein) rs5883 (63), no obstante en este trabajo no se encontró relación entre las variantes estudiadas y la aparición de ictus o de infarto de miocardio. Estudios GWAS de pacientes tratados con 80 mg de simvastatina han identificado variantes frecuentes de SLCO1B1 asociadas con el desarrollo de miopatía (480). Por otra parte el uso de estatinas se ha observado que puede conferir un mayor riesgo de IH lobar en los sujetos que lleven la ApoE4/E4 y ApoE2/E4, lo que se ha confirmado en las cohortes de replicación (481). El clopidogrel es un antiagregante que se emplea en la prevención de la enfermedad vascular (39), y se han descrito polimorfismos que modulan la activación metabólica del profármaco clopidogrel (CYP2C19) que conducen a un mayor riesgo de complicaciones vasculares en pacientes que lo emplean como prevención secundaria de la enfermedad vascular en los portadores de al menos de un alelo CYP2C19*2 (482, 483). También se han documentado variaciones en la respuesta antiagregante al clopidogrel en relación con genotipos PON Q192R, siendo esta respuesta inferior en los portadores de los alelos QR y RR respecto a los pacientes portadores de los alelos QQ (484). El activador tisular del plasminógeno recombinante es el único tratamiento recanalizador arterial por vía intravenosa en la fase aguda del IS; su uso está condicionado por múltiples riesgos, especialmente por el riesgo de transformación hemorrágica del ictus (485). Se han descrito polimorfismos asociados a seguridad en el uso y se ha desarrollado un score para intentar predecir la respuesta y seguridad del tratamiento (486). 50 Justificación y objetivos 51 Justificación del trabajo Diversos estudios epidemiológicos apoyan la relación entre el ictus como enfermedad de base multifactorial y factores genéticos que pueden predisponer a sufrirlo. Los avances en los estudios de asociación genómica (GWAS) están transformando el conocimiento de los factores genéticos relacionados con la patogenia del ictus, se están descubriendo nuevos genes implicados y estableciendo vínculos entre los distintos tipos de ictus y variantes genéticas en estos genes. De esta manera se podrá abrir la puerta a la obtención de nuevos tratamientos tanto por la identificación de estos genes y de sus productos, como por el descubrimiento de variantes nuevas o por aquellas ya caracterizadas que pueden tener un efecto fenotípico mensurable. Las variantes genéticas descritas hasta el momento explican una parte del riesgo global de sufrir un ictus. De esta manera una predicción real del riesgo vascular dependerá de conocer un mayor número de variantes genéticas asociadas y así poder incorporarlas a los algoritmos predictivos. Es importante señalar que algunas de estas variantes se han asociado en estudios previos, realizados a pacientes con ictus específicamente con formas diferenciadas de presentación clínica. Por lo tanto su replicación es decir la confirmación de la asociación en diferentes poblaciones constituye un requisito indispensable para su validación y utilidad futuras. Objetivos Considerando la hipótesis que las variantes genéticas comunes en los genes paraoxonasa 1 y paraoxonasa 2, de la metilentetrahidrofolato reductasa y en el receptor 1 de la angiotensina-II se asociarían con el ictus isquémico en la población evaluada. 52 Para evaluar estas hipótesis nos hemos planteamos los siguientes objetivos: 1. Determinar la prevalencia de los polimorfismos descritos en nuestra población y la asociación con ictus isquémico. 2. Evaluación de la distribución de las frecuencias alélicas mediante un estudio de casos y controles (base poblacional del estudio PROCAGENE) 3. Correlacionar los distintos genotipos con los factores de riesgo y características fenotípicas en la población reclutada 53 Material y métodos 54 Material y métodos Se diseñó un estudio de prospectivo de casos y controles, en el que incluiríamos a todos los pacientes consecutivos ingresados por un IS o por Ataque Isquémico Transitorio (AIT) en el Servicio de Neurología del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín durante el periodo de estudio. La inclusión en el estudio de los pacientes estaba condicionada a la firma el consentimiento informado para participar en el mismo. El estudio se puso en marcha sin financiación en enero de 2009. Nuestro objetivo inicial era recoger todos los pacientes ingresados en nuestra unidad durante un periodo de 6 meses. Para la estimación del tamaño de la muestra empleamos el software Quanto (http://hydra.usc.edu/gxe/). Reclutamiento poblacional: Casos Se definió el ictus como cualquier alteración neurológica focal de inicio brusco y duración mayor de 24 horas en las que las pruebas de neuroimagen descarten otro proceso causal (tumoral, infeccioso, inflamatorio o desmielinizante) o cualquier alteración neurológica focal en la que las pruebas de neuroimagen confirmen un evento isquémico o hemorrágico, independientemente de la duración. Se definió el AIT como cualquier alteración neurológica focal de inicio brusco y duración menor de 24 horas en las que las pruebas de neuroimagen descarten otro proceso causal (tumoral, infeccioso, inflamatorio o desmielinizante) y además no muestren ninguna lesión isquémica compatible. La clasificación etiológica del IS se realizará según los criterios TOAST 55 revisados. Los IH se clasificaron conforme a la localización to pográfica en lobares y en subcorticales. En la visita basal recogimos los antecedentes personales de interés relacionados con la patología vascular HTA, DM, DLP, cardiopatía, EAP, hiperuricemia, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), hipotiroidismo, neoplasias previas…); los hábitos tóxicos (tabaco, alcohol, consumo de sustancias vasoactivas); los tratamientos que recibían previamente y el tratamiento recomendado al alta. Se clasificó el ictus según su subtipo etiológico. Se recogieron las variables TA al ingreso (sistólica y diastólica), la glucemia, los niveles de colesterol total, cLDL, cHDL y triglicéridos, las concentraciones de apolipoproteínas (AI y B), la microalbuminuria, la uricemia, la homocisteína, la vitamina B12, el ácido fólico, las hormonas tiroideas y el fibrinógeno Además se realizó en los isquémicos un duplex de troncos supraaórticos para cuantificar la repercusión en términos de grados de estenosis, y en los casos en los que estuvo indicado se llevó a cabo un estudio angiográfico complementario, ya fuese con arteriografía convencional, con angio-TAC o resonancia magnética. En esta visita se extrajo una muestra de sangre venosa para el análisis de los distintos polimorfismos incluidos en el estudio. Reclutamiento poblacional: Controles Hemos utilizado la base de datos del estudio PROCAGENE para el reclutamiento de controles (487, 488). Para las variantes Paraoxonasa 1 (PON1) Gln192Arg y Leu55Met así como para la variante PON2 Cys311Ser el 56 número de controles disponibles genotipados en esta base de datos era de 562. Extracción del DNA Los métodos de extracción de DNA, en general, tienen una serie de pasos básicos que se cumplen independientemente del origen de la muestra. Estos son disrupción celular (ruptura de la bicapa lipídica de las membranas celulares por tratamiento con detergentes, empleo de agentes quelantes que secuestran cationes estabilizantes de la membrana, etc.), seguido de eliminación de las proteínas (que constituyen los principales contaminantes del extracto), concentración del DNA (por precipitación con alcoholes), lavado (para eliminar restos de reactivos y solventes que puedan inhibir la Taq polimerasa) y resuspensión en presencia de bajas concentraciones de sales. Posteriormente se verifica un ligero aumento en la solubilidad de las proteínas (salting-in) por aumento de la fuerza iónica del medio respecto de soluciones acuosas. Por el otro lado, en presencia de altas concentraciones de sales, la solubilidad de las proteínas disminuye y terminan por precipitar. El DNA fue extraído de leucocitos de sangre periférica utilizando el procedimiento que se describe a continuación, referenciado como "Salting out procedure" (489), con algunas modificaciones: 5 ml de sangre total en EDTA (tubo BD Vacutainer 15% 0,12ml) fueron congelados a -4°C para romper las células rojas. Posteriormente se descongeló la muestra y pasó a un tubo Falcon de 50 ml al que se le añadió 10 m1 de PBS (Phosphate Buffered Saline). Se centrifugó a 3000 rpm (Centrífuga Kubota 8800) durante 10 minutos, desechando el sobrenadante y resuspendiendo el pellet en 10 m1 de PBS para un segundo lavado. El pellet resultante se resuspendió en 5 ml de 57 DEB (10mM Trizma Base (Tris[hydroximethylJ aminoetano), 150mM NaCl (Sodium Chloride) y de 3mM EDTA (Ethylenediaminetetraacetate acid) y se agitó en un vortex hasta que se disolvió perfectamente, para posteriormente añadirle 100μ1 de SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) al 10%, mezclándolo sin agitar. Al tubo se le añadió 10 μl de RNasa (RNase from Bovine Pancreas 100 mg/ml) y se dejó en la estufa a 37°C durante 1 hora. Una vez trascurrido ese tiempo se añadió 100 μl de proteinasa K (Proteinase K Lyophillized powder 37 units/mg) y se mezcló sin agitar, incubando el resultado durante 1 hora a 56º C, mezclando por inversión cada 20 minutos y posteriormente a 37º C durante 12 horas. A continuación se añadió al tubo Falcon 2 m1 de ClNa 6M y se agitó fuertemente durante 1 minuto, pasando el resultado a ser centrifugado 30 minutos a 3000 rpm. Se desechó el pellet y el sobrenadante se transfirió a un tubo Falcon de 50 ml, añadiendo un volumen igual al que tenemos de isopropanol (2 isopropanol). Se agitó suavemente hasta concentrar el DNA en un filamento fino que se "pescó" y fue introducido en etanol al 80% para ser lavado durante 2 minutos. Posteriormente el filamento limpio se deja secar en un Eppendorf roscado abierto durante 12 horas, protegiendo la boca del tubo con parafina perforada. Una vez seco se resuspende el DNA en 100 μl de agua bidestilada y se pone en el agitador 12 horas. Posteriormente se tomó la dilución preparada y se llevó a una concentración final de 100 μgr/ml, determinando la concentración de partida y su pureza mediante un espectrofotómetro Nanodrop. Determinación de la variante C677T (rs1801133, g.14783C>T, pAla222Val) del gen MTHFR 58 La determinación del polimorfismo génico C677T del gen MTHFR, se realizó mediante digestión enzimática HinfI. Se siguió el protocolo de Frosst y colaboradores con algunas variaciones (490). Para la amplificación por PCR se utilizaron los primers HM1 (5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’) y HM2 (5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’) como primer forward (sentido) y primer reverse (anti sentido) respectivamente. Se amplificó un fragmento de 198bp, el cual se sometió al proceso de digestión enzimática HinfI (New England Biolabs, UK). Se identificó el alelo 677T, por la presencia de un sitio HinfI, resultando como consecuencia de la digestión dos fragmentos de 175 bp y 23 bp respectivamente. A diferencia, el alelo C en la posición 677 (677C) carece de sitio HinfI. Los productos derivados de la PCR y de la digestión enzimática se analizaron en un gel de agarosa TBE al 3%. Se estableció la categoría de las muestras como homocigótica para la variante termolábil (677T), heterocigótica (C677T) o la tipo salvaje (677CC). Determinación de los genotipos Gln192Arg (rs662, g21439A>G, pGln192Arg) y Met55Leu (rs854560 del gen PON1) La determinación de los genotipos Gln192Arg y Met55Leu del gen PON1 se realizó utilizando PCR-RFLP según las técnica descrita por Humbert y cols (491), y por Shanguera y cols (492). La técnica radica en el corte con endonucleasas de restricción de los productos amplificados por la PCR. Para la identificación del polimorfismo Gln192Arg se emplearon los primers de la PON 1ª (5’TATTGTTGCTGTGGGACCTGAG-3’) y de la PON 1B (5’CACGCTAAACCCAAATACATCTC-3’). En la tipificación del polimorfismo Met55Leu se utilizaron los primers de la PON1 55f (5`-GAA 65 La columna “Gene” refleja el número de pares casos-controles necesarios y Po es el riesgo basal. Como puede observarse el valor “N” se aproxima al de casos reclutados en este estudio para un riesgo relativo alto. Alternativamente puede utilizarse el análisis Quanto para determinar qué poder estadístico se alcanza, una vez conseguida una muestra de tamaño determinado. La variante elegida fue, por su frecuencia, Cys311Ser en el gen Paraxonasa 2 (PAlelo S= 0.798), es decir se mantuvo la aproximación a efecto genético exclusivamente, se mantuvo así mismo la tasa de casos-controles en 2.63. Basado en este análisis para un valor de N = 213, se obtuvo un poder estadístico de ~60% para detectar un riesgo relativo de 2.7 con un valor de significación del 0.05. 66 1.2.- Casos 1.3.- Emparejamiento por edad e sexo con la base de datos poblacional del Estudio PROCAGENE Se reclutaron 216 pacientes de los que pudieron obtenerse datos genéticos y clínicos de 200 de ellos. En relación con la patología hemorrágica tuvimos que excluir los casos recogidos dado que la tasa de inclusión fue baja. También excluimos a los ictus en los que posteriormente se demostró una causa infrecuente (apartado 4 de la clasificación TOAST), como trombofilias hereditarias. La base de datos poblacional así obtenida se utilizó para emparejar por edad y por sexos con la base de datos poblacional PROCAGENE (488). El resultado del emparejamiento fue una pérdida del número de casos, fundamentalmente añosos, quedando constituida por grupos y sexos según la siguiente distribución: Tabla de contingencia caso * Género 98 31 129 76.0% 24.0% 100.0% 32.1% 10.2% 42.3% 136 40 176 77.3% 22.7% 100.0% 44.6% 13.1% 57.7% 234 71 305 76.7% 23.3% 100.0% 76.7% 23.3% 100.0% Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total CASO CONTROL caso Total Hombre Mujer Género Total 67 Pruebas de chi-cuadrado .071 b 1 .790 .017 1 .897 .071 1 .790 .786 .447 .071 1 .790 305 Chi-cuadrado de Pearson Corrección por continuidad a Razón de verosimilitudes Estadístico exacto de Fisher Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) Sig. exacta (bilateral) Sig. exacta (unilateral) Calculado sólo para una tabla de 2x2. a. 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 30.03. b. Como puede observarse no se hallaron diferencias significativas en la distribución de casos y controles por géneros. 1.4.- Comparación entre casos y controles: Prueba T Las variables continuas compartidas entre la población de casos y la de controles fueron la edad, PAS (presión arterial sistólica), PAD (presión arterial diastólica), concentración de Ácido Fólico, Vitamina B12, perfil lipídico (Colesterol total, LDL-Colesterol, HDL-Colesterol, Triglicéridos), concentración de Homocisteína plasmática total (tHcy) y Creatinina plasmática. El contraste de valores medios de estas variables entre la población de casos y de controles obtenidos fue: 68 Estadísticos de grupo 129 62.56 8.872 .781 176 61.68 7.826 .590 90 153.27 29.071 3.064 176 146.15 26.124 1.969 90 83.18 14.538 1.532 176 87.26 11.907 .898 119 8.790 3.7899 .3474 81 6.157 1.9722 .2191 118 455.396 249.0028 22.9226 81 556.185 388.4404 43.1600 128 175.08 41.770 3.692 176 234.92 38.689 2.916 122 108.34 39.543 3.580 176 153.03 34.878 2.629 122 42.28 15.006 1.359 176 51.90 13.212 .996 125 151.38 81.833 7.319 176 149.97 74.910 5.647 106 16.142 7.3686 .7157 174 17.805 7.7658 .5887 127 .8697 .28467 .02526 176 .9193 .39362 .02967 caso CASO CONTROL CASO CONTROL CASO CONTROL CASO CONTROL CASO CONTROL CASO CONTROL CASO CONTROL CASO CONTROL CASO CONTROL CASO CONTROL CASO CONTROL EDAD TAS INGRESO TAD INGRESO Fólico B12 COLESTEROL TOTAL LDL HDL TRIGLICERIDOS Homocisteína Creatinina N Media Desviación típ. Error típ. de la media 69 Prueba de muestras independientes 2.240 .136 .919 303 .359 .882 .960 -1.007 2.771 .901 254.972 .368 .882 .979 -1.046 2.810 .005 .942 2.022 264 .044 7.113 3.519 .185 14.042 1.953 163.500 .053 7.113 3.642 -.079 14.306 2.498 .115 -2.448 264 .015 -4.078 1.666 -7.358 -.798 -2.296 151.466 .023 -4.078 1.776 -7.587 -.569 19.411 .000 5.743 198 .000 2.6334 .4585 1.7292 3.5376 6.411 186.928 .000 2.6334 .4108 1.8231 3.4437 6.515 .011 -2.230 197 .027 -100.7894 45.1930 -189.9136 -11.6652 -2.062 124.712 .041 -100.7894 48.8696 -197.5105 -4.0683 2.825 .094 -12.874 302 .000 -59.842 4.648 -68.989 -50.695 -12.719 261.142 .000 -59.842 4.705 -69.107 -50.578 4.549 .034 -10.293 296 .000 -44.693 4.342 -53.238 -36.149 -10.062 238.696 .000 -44.693 4.442 -53.443 -35.944 .160 .689 -5.843 296 .000 -9.619 1.646 -12.859 -6.379 -5.710 238.374 .000 -9.619 1.685 -12.937 -6.301 .339 .561 .154 299 .878 1.404 9.107 -16.517 19.326 .152 252.217 .879 1.404 9.244 -16.801 19.610 1.341 .248 -1.771 278 .078 -1.6623 .9387 -3.5101 .1854 -1.794 230.983 .074 -1.6623 .9267 -3.4883 .1636 .091 .764 -1.211 301 .227 -.04963 .04100 -.13032 .03105 -1.274 300.997 .204 -.04963 .03897 -.12631 .02705 Se han asumido varianzas iguales No se han asumido varianzas iguales Se han asumido varianzas iguales No se han asumido varianzas iguales Se han asumido varianzas iguales No se han asumido varianzas iguales Se han asumido varianzas iguales No se han asumido varianzas iguales Se han asumido varianzas iguales No se han asumido varianzas iguales Se han asumido varianzas iguales No se han asumido varianzas iguales Se han asumido varianzas iguales No se han asumido varianzas iguales Se han asumido varianzas iguales No se han asumido varianzas iguales Se han asumido varianzas iguales No se han asumido varianzas iguales Se han asumido varianzas iguales No se han asumido varianzas iguales Se han asumido varianzas iguales No se han asumido varianzas iguales EDAD TAS INGRESO TAD INGRESO Fólico B12 COLESTEROL TOTAL LDL HDL TRIGLICERIDOS Homocisteína Creatinina F Sig. Prueba de Levene para la igualdad de varianzas t gl Sig. (bilateral) Diferencia de medias Error típ. de la diferencia Inferior Superior 95% Intervalo de confianza para la diferencia Prueba T para la igualdad de medias 1.5.- Comparación entre casos y controles: Prueba χ2 Se contrastó mediante χ2 la distribución de casos y controles para las siguientes categorías compartidas: HTA (presencia = 1, ausencia = 0), Diabetes (DM) (presencia = 1, ausencia = 0) y Tabaco (fumador y/o exfumador ≤ 1 año = 1, no fumador y/o exfumador > 1 año =2). Los resultados obtenidos se muestran a continuación: 70 Tabla de contingencia 49 79 128 38.3% 61.7% 100.0% 16.1% 26.0% 42.1% 100 76 176 56.8% 43.2% 100.0% 32.9% 25.0% 57.9% 149 155 304 49.0% 51.0% 100.0% 49.0% 51.0% 100.0% Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total CASO CONTROL caso Total 0 1 HTA Total Pruebas de chi-cuadrado 10.190 b 1 .001 9.461 1 .002 10.262 1 .001 .002 .001 10.156 1 .001 304 Chi-cuadrado de Pearson Corrección por continuidad a Razón de verosimilitudes Estadístico exacto de Fisher Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) Sig. exacta (bilateral) Sig. exacta (unilateral) Calculado sólo para una tabla de 2x2. a. 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 62.74. b. Estimación de riesgo .471 .296 .750 .674 .522 .869 1.429 1.150 1.777 304 Razón de las ventajas para caso (CASO / CONTROL) Para la cohorte HTA = 0 Para la cohorte HTA = 1 N de casos válidos Valor Inferior Superior Intervalo de confianza al 95% 71 Tabla de contingencia 77 52 129 59.7% 40.3% 100.0% 25.2% 17.0% 42.3% 146 30 176 83.0% 17.0% 100.0% 47.9% 9.8% 57.7% 223 82 305 73.1% 26.9% 100.0% 73.1% 26.9% 100.0% Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total CASO CONTROL caso Total 0 1 DM Total Pruebas de chi-cuadrado 20.496 b 1 .000 19.330 1 .000 20.408 1 .000 .000 .000 20.429 1 .000 305 Chi-cuadrado de Pearson Corrección por continuidad a Razón de verosimilitudes Estadístico exacto de Fisher Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) Sig. exacta (bilateral) Sig. exacta (unilateral) Calculado sólo para una tabla de 2x2. a. 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 34.68. b. Estimación de riesgo .304 .180 .516 .720 .615 .842 2.365 1.605 3.485 305 Razón de las ventajas para caso (CASO / CONTROL) Para la cohorte DM = 0 Para la cohorte DM = 1 N de casos válidos Valor Inferior Superior Intervalo de confianza al 95% 72 Tabla de contingencia 42 85 127 33.1% 66.9% 100.0% 13.9% 28.1% 41.9% 43 133 176 24.4% 75.6% 100.0% 14.2% 43.9% 58.1% 85 218 303 28.1% 71.9% 100.0% 28.1% 71.9% 100.0% Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total CASO CONTROL caso Total 1 2 TABAQUISMO Total Pruebas de chi-cuadrado 2.728 b 1 .099 2.317 1 .128 2.709 1 .100 .120 .064 2.719 1 .099 303 Chi-cuadrado de Pearson Corrección por continuidad a Razón de verosimilitudes Estadístico exacto de Fisher Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) Sig. exacta (bilateral) Sig. exacta (unilateral) Calculado sólo para una tabla de 2x2. a. 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 35.63. b. Estimación de riesgo 1.528 .922 2.532 1.354 .946 1.938 .886 .764 1.027 303 Razón de las ventajas para caso (CASO / CONTROL) Para la cohorte TABAQUISMO = 1 Para la cohorte TABAQUISMO = 2 N de casos válidos Valor Inferior Superior Intervalo de confianza al 95% 73 2.-Frecuencias alélicas y genotípicas (R): 2.1.-Variante MTHFR (C677T) Number of samples typed: 302 (99%) Allele Frequency: (2 alleles) Count Proportion C 376 0.62 T 228 0.38 NA 6 NA Genotype Frequency: Count Proportion C/C 113 0.37 C/T 150 0.50 T/T 39 0.13 NA 3 NA Heterozygosity (Hu) = 0.4707588 Poly. Inf. Content = 0.3595391 2.2.-Variante PON1 (Met55Leu) Number of samples typed: 297 (97.4%) Allele Frequency: (2 alleles) 74 Count Proportion L 372 0.63 M 222 0.37 NA 16 NA Genotype Frequency: Count Proportion L/L 109 0.37 L/M 154 0.52 M/M 34 0.11 NA 8 NA Heterozygosity (Hu) = 0.4689049 Poly. Inf. Content = 0.3585494 2.3.-Variante PON1 (Gln192Arg) Number of samples typed: 303 (99.3%) Allele Frequency: (2 alleles) Count Proportion Q 428 0.71 R 178 0.29 NA 4 NA 81 5.-Variante C677T por sexos 5.1.- Genotipos C677T en hombres No se especifica el valor del riesgo por alelos ya que el análisis no resultó en diferencias estadísticamente significativas: Tabla de contingencia 34 48 16 98 34.7% 49.0% 16.3% 100.0% 14.7% 20.7% 6.9% 42.2% 54 62 18 134 40.3% 46.3% 13.4% 100.0% 23.3% 26.7% 7.8% 57.8% 88 110 34 232 37.9% 47.4% 14.7% 100.0% 37.9% 47.4% 14.7% 100.0% Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total CASO CONTROL caso Total CC CT TT C677T Total Pruebas de chi-cuadrado .880 a 2 .644 .881 2 .644 .863 1 .353 232 Chi-cuadrado de Pearson Razón de verosimilitudes Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 14.36. a. 5.2.- Genotipos C677T en mujeres No se especifica el valor del riesgo por alelos ya que el análisis no resultó en diferencias estadísticamente significativas: 82 Tabla de contingencia 11 16 3 30 36.7% 53.3% 10.0% 100.0% 15.7% 22.9% 4.3% 42.9% 14 24 2 40 35.0% 60.0% 5.0% 100.0% 20.0% 34.3% 2.9% 57.1% 25 40 5 70 35.7% 57.1% 7.1% 100.0% 35.7% 57.1% 7.1% 100.0% Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total CASO CONTROL caso Total CC CT TT C677T Total Pruebas de chi-cuadrado .747 a 2 .688 .740 2 .691 .054 1 .816 70 Chi-cuadrado de Pearson Razón de verosimilitudes Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) 2 casillas (33.3%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 2.14. a. 5.3.-Variante C677T: Relación con variables cuantitativas en el total de la población analizada, en casos y en controles Se realizó un contraste de medias mediante el test ANOVA de un factor de acuerdo a los genotipos C677T con respecto a las siguientes variables continuas (aparecen subrayadas aquellas disponibles solo en casos): Edad, PAS, PAD, Hemoglobina glicada, Urea, Urato, Na2+, K+, Proteínas totales, CK, Calcio, Mg2+, Homocisteína, Fólico, Vitamina B12, Proteína C reactiva, Colesterol total, Colesterol LDL, Colesterol HDL, Apolipoproteína A1, Apolipoproteína B, Creatinina, Microalbuminuria (mg/ml), T4L, TSH, Leucocitos, Hemoglobina, Plaquetas, Velocidad de Sedimentación Globular y Fibrinógeno. 83 Observamos diferencias estadísticamente significativas de acuerdo a los genotipos C677T con respecto a la concentración de Homocisteína (p <0.0001), Creatinina (p = .023) y Hb Glicada (sólo en casos) (p = 0.037). Se observó una gradación por genotipos para esta diferencia para los valores medios de homocisteína (también para los valores medios de vitamina B12 y ácido fólico pero en ambos casos sin alcanzar significación estadística) y para creatinina. Por el contrario la diferencia observada en casos respecto a Hb Glicada es no resultó en gradación por genotipos siendo probablemente espuria. Gráficamente: Los intervalos muestran la media de +/- 1.0 DT Las barras muestran Medias 1 2 3 C677T 0.0 10.0 20.0 30.0 Homocisteína    15.7 16.3 23.7 1:CC; 2:CT; 3:TT 84 Los intervalos muestran la media de +/- 1.0 DT Las barras muestran Medias 1.00 2.00 3.00 C677T 0.00 0.50 1.00 Creatinina    0.86 0.88 1.00 1:CC; 2:CT; 3:TT 85 Comparaciones múltiples Bonferroni .5237 .3086 .278 -.228 1.275 -.4391 .4172 .885 -1.455 .577 -.5237 .3086 .278 -1.275 .228 -.9627 .3970 .051 -1.929 .004 .4391 .4172 .885 -.577 1.455 .9627 .3970 .051 -.004 1.929 -.01494 .03435 1.000 -.0976 .0678 -.13719 * .05106 .023 -.2601 -.0142 .01494 .03435 1.000 -.0678 .0976 -.12225 * .04931 .041 -.2410 -.0035 .13719 * .05106 .023 .0142 .2601 .12225 * .04931 .041 .0035 .2410 -.1520 .5277 1.000 -1.426 1.122 -.1700 .7943 1.000 -2.088 1.748 .1520 .5277 1.000 -1.122 1.426 -.0180 .7727 1.000 -1.884 1.848 .1700 .7943 1.000 -1.748 2.088 .0180 .7727 1.000 -1.848 1.884 -32.7425 48.8722 1.000 -150.765 85.280 7.8160 74.6998 1.000 -172.578 188.210 32.7425 48.8722 1.000 -85.280 150.765 40.5585 72.7332 1.000 -135.086 216.203 -7.8160 74.6998 1.000 -188.210 172.578 -40.5585 72.7332 1.000 -216.203 135.086 -.6295 .9083 1.000 -2.817 1.558 -7.9497 * 1.3350 .000 -11.165 -4.734 .6295 .9083 1.000 -1.558 2.817 -7.3202 * 1.2878 .000 -10.422 -4.218 7.9497 * 1.3350 .000 4.734 11.165 7.3202 * 1.2878 .000 4.218 10.422 (J) C677T CT TT CC TT CC CT CT TT CC TT CC CT CT TT CC TT CC CT CT TT CC TT CC CT CT TT CC TT CC CT (I) C677T CC CT TT CC CT TT CC CT TT CC CT TT CC CT TT Variable dependiente Hb GLICADA Creatinina Fólico B12 Homocisteína Diferencia de medias (I-J) Error típico Sig. Límite inferior Límite superior Intervalo de confianza al 95% La diferencia de medias es significativa al nivel .05. *. La diferencia en la concentración media de homocisteína se mantiene en casos (p = 0.006) y controles (p <0.0001) 5.4.-Variante C677T: Relación con variables categóricas (consumo de tabaco, hipertensión arterial y diabetes) La evaluación de la distribución de genotipos C677T en función de las variables categóricas mostró diferencias significativas en el global de la 86 población analizada que se pierden por subgrupos no encontrándose cuando el análisis se efectúa en casos o en controles. Tabla de contingencia 75 120 25 220 34.1% 54.5% 11.4% 100.0% 24.8% 39.7% 8.3% 72.8% 38 30 14 82 46.3% 36.6% 17.1% 100.0% 12.6% 9.9% 4.6% 27.2% 113 150 39 302 37.4% 49.7% 12.9% 100.0% 37.4% 49.7% 12.9% 100.0% Recuento % de DM % del total Recuento % de DM % del total Recuento % de DM % del total 0 1 DM Total CC CT TT C677T Total Pruebas de chi-cuadrado 7.783 a 2 .020 7.849 2 .020 .575 1 .448 302 Chi-cuadrado de Pearson Razón de verosimilitudes Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 10.59. a. 87 Diabetes y AleloC677 Tabla de contingencia 195 25 220 88.6% 11.4% 100.0% 64.6% 8.3% 72.8% 68 14 82 82.9% 17.1% 100.0% 22.5% 4.6% 27.2% 263 39 302 87.1% 12.9% 100.0% 87.1% 12.9% 100.0% Recuento % de DM % del total Recuento % de DM % del total Recuento % de DM % del total 0 1 DM Total Alelo C TT AleloC677 Total Estimación de riesgo 1.606 .789 3.267 1.069 .958 1.192 .666 .364 1.217 302 Razón de las ventajas para DM (0 / 1) Para la cohorte AleloC677 = Alelo C Para la cohorte AleloC677 = TT N de casos válidos Valor Inferior Superior Intervalo de confianza al 95% Pruebas de chi-cuadrado 1.732 b 1 .188 1.261 1 .261 1.649 1 .199 .246 .132 1.726 1 .189 302 Chi-cuadrado de Pearson Corrección por continuidad a Razón de verosimilitudes Estadístico exacto de Fisher Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) Sig. exacta (bilateral) Sig. exacta (unilateral) Calculado sólo para una tabla de 2x2. a. 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 10.59. b. 88 Diabetes y AleloT677 Tabla de contingencia 75 145 220 34.1% 65.9% 100.0% 24.8% 48.0% 72.8% 38 44 82 46.3% 53.7% 100.0% 12.6% 14.6% 27.2% 113 189 302 37.4% 62.6% 100.0% 37.4% 62.6% 100.0% Recuento % de DM % del total Recuento % de DM % del total Recuento % de DM % del total 0 1 DM Total CC Alelo T AleloT677 Total Pruebas de chi-cuadrado 3.828 b 1 .050 3.323 1 .068 3.771 1 .052 .061 .035 3.816 1 .051 302 Chi-cuadrado de Pearson Corrección por continuidad a Razón de verosimilitudes Estadístico exacto de Fisher Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) Sig. exacta (bilateral) Sig. exacta (unilateral) Calculado sólo para una tabla de 2x2. a. 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 30.68. b. Estimación de riesgo .599 .358 1.003 .736 .547 .990 1.228 .983 1.534 302 Razón de las ventajas para DM (0 / 1) Para la cohorte AleloT677 = CC Para la cohorte AleloT677 = Alelo T N de casos válidos Valor Inferior Superior Intervalo de confianza al 95% 89 Tabaquismo y genotipos C677T Tabla de contingencia 29 36 17 82 35.4% 43.9% 20.7% 100.0% 9.7% 12.0% 5.7% 27.3% 84 113 21 218 38.5% 51.8% 9.6% 100.0% 28.0% 37.7% 7.0% 72.7% 113 149 38 300 37.7% 49.7% 12.7% 100.0% 37.7% 49.7% 12.7% 100.0% Recuento % de TABAQUISMO % del total Recuento % de TABAQUISMO % del total Recuento % de TABAQUISMO % del total 1 2 TABAQUISMO Total CC CT TT C677T Total Pruebas de chi-cuadrado 6.708 a 2 .035 6.188 2 .045 2.741 1 .098 300 Chi-cuadrado de Pearson Razón de verosimilitudes Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 10.39. a. Tabaquismo y aleloC677 Tabla de contingencia 65 17 82 79.3% 20.7% 100.0% 21.7% 5.7% 27.3% 197 21 218 90.4% 9.6% 100.0% 65.7% 7.0% 72.7% 262 38 300 87.3% 12.7% 100.0% 87.3% 12.7% 100.0% Recuento % de TABAQUISMO % del total Recuento % de TABAQUISMO % del total Recuento % de TABAQUISMO % del total 1 2 TABAQUISMO Total Alelo C TT AleloC677 Total 90 Pruebas de chi-cuadrado 6.635 b 1 .010 5.670 1 .017 6.110 1 .013 .018 .011 6.613 1 .010 300 Chi-cuadrado de Pearson Corrección por continuidad a Razón de verosimilitudes Estadístico exacto de Fisher Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) Sig. exacta (bilateral) Sig. exacta (unilateral) Calculado sólo para una tabla de 2x2. a. 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 10.39. b. Estimación de riesgo .408 .203 .819 .877 .779 .988 2.152 1.197 3.870 300 Razón de las ventajas para TABAQUISMO (1 / 2) Para la cohorte AleloC677 = Alelo C Para la cohorte AleloC677 = TT N de casos válidos Valor Inferior Superior Intervalo de confianza al 95% 97 6.7.- Variante Met55Leu: Relación con variables cuantitativas en el total de la población analizada, en casos y en controles Se realizó un contraste de medias mediante el test ANOVA de un factor de acuerdo a los genotipos PON 1 (Met55Leu) con respecto a las siguientes variables continuas (aparecen subrayadas aquellas disponibles solo en casos): Edad, PAS, PAD, Hemoglobina glicada, Urea, Urato, Na2+, K+, Proteínas totales, CK, Calcio, Mg2+, Homocisteína, Fólico, Vitamina B12, Proteína C reactiva, Colesterol total, Colesterol LDL, Colesterol HDL, Apolipoproteína A1, Apolipoproteína B, Creatinina, Microalbuminuria (mg/ml), T4L, TSH, Leucocitos, Hemoglobina, Plaquetas, Velocidad de Sedimentación Globular y Fibrinógeno. No observamos diferencias significativas de acuerdo a los genotipos analizados en el total de la población analizada. No se observaron diferencias significativas en función de los genotipos tras categorizar por sexos. Se observaron diferencias significativas en la población de casos de acuerdo a valores medio de PAD (p = 0.03) y a la concentración media de fibrinógeno (p = 0.005) observándose, respecto a esta última, una gradación por genotipos. ANOVA 1455.610 2 727.805 3.643 .030 17179.941 86 199.767 18635.551 88 39212.347 2 19606.174 5.671 .005 290414.744 84 3457.318 329627.091 86 Inter-grupos Intra-grupos Total Inter-grupos Intra-grupos Total TAD INGRESO Fibrinógeno Suma de cuadrados gl Media cuadrática F Sig. 98 Pruebas post hoc Comparaciones múltiples Bonferroni -12.900 * 4.787 .025 -24.59 -1.21 -10.702 4.869 .092 -22.59 1.19 12.900 * 4.787 .025 1.21 24.59 2.198 3.210 1.000 -5.64 10.04 10.702 4.869 .092 -1.19 22.59 -2.198 3.210 1.000 -10.04 5.64 -60.40577 * 22.68219 .028 -115.8154 -4.9962 -77.02625 * 22.92610 .004 -133.0317 -21.0208 60.40577 * 22.68219 .028 4.9962 115.8154 -16.62048 13.25738 .640 -49.0065 15.7655 77.02625 * 22.92610 .004 21.0208 133.0317 16.62048 13.25738 .640 -15.7655 49.0065 (J) Met55Leu LM LL MM LL MM LM LM LL MM LL MM LM (I) Met55Leu MM LM LL MM LM LL Variable dependiente TAD INGRESO Fibrinógeno Diferencia de medias (I-J) Error típico Sig. Límite inferior Límite superior Intervalo de confianza al 95% La diferencia de medias es significativa al nivel .05. *. Gráficamente 1:MM; 2:LM; 3:LL 99 6.8.- Variante Met55Leu: Relación con variables categóricas (consumo de tabaco, hipertensión y diabetes) La evaluación de la distribución de genotipos PON1 (Met55Leu) en función de las variables categóricas no mostró diferencias significativas en el global de la población analizada ni en el análisis por subgrupos de casos o controles. 7.- Tablas de contingencia y riesgo en análisis univariante 7.1.- Variante PON1 (Gln192Arg) Tabla de contingencia 63 62 4 129 48.8% 48.1% 3.1% 100.0% 20.8% 20.5% 1.3% 42.6% 84 72 18 174 48.3% 41.4% 10.3% 100.0% 27.7% 23.8% 5.9% 57.4% 147 134 22 303 48.5% 44.2% 7.3% 100.0% 48.5% 44.2% 7.3% 100.0% Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total CASO CONTROL caso Total QQ QR RR RPON192 Total Pruebas de chi-cuadrado 6.107 a 2 .047 6.686 2 .035 1.161 1 .281 303 Chi-cuadrado de Pearson Razón de verosimilitudes Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 9.37. a. 100 7.2.- Alelo Gln192 (alelo Q) y riesgo Tabla de contingencia 125 4 129 96.9% 3.1% 100.0% 41.3% 1.3% 42.6% 156 18 174 89.7% 10.3% 100.0% 51.5% 5.9% 57.4% 281 22 303 92.7% 7.3% 100.0% 92.7% 7.3% 100.0% Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total CASO CONTROL caso Total Alelo Q RR AleloQ Total Pruebas de chi-cuadrado 5.773 b 1 .016 4.747 1 .029 6.355 1 .012 .023 .012 5.754 1 .016 303 Chi-cuadrado de Pearson Corrección por continuidad a Razón de verosimilitudes Estadístico exacto de Fisher Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) Sig. exacta (bilateral) Sig. exacta (unilateral) Calculado sólo para una tabla de 2x2. a. 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 9.37. b. Estimación de riesgo 3.606 1.190 10.927 1.081 1.019 1.147 .300 .104 .864 303 Razón de las ventajas para caso (CASO / CONTROL) Para la cohorte AleloQ = Alelo Q Para la cohorte AleloQ = RR N de casos válidos Valor Inferior Superior Intervalo de confianza al 95% 101 7.3.- Alelo Arg192 (alelo R) y riesgo Tabla de contingencia 63 66 129 48.8% 51.2% 100.0% 20.8% 21.8% 42.6% 84 90 174 48.3% 51.7% 100.0% 27.7% 29.7% 57.4% 147 156 303 48.5% 51.5% 100.0% 48.5% 51.5% 100.0% Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total CASO CONTROL caso Total QQ Alelo R AleloR Total Pruebas de chi-cuadrado .009 b 1 .923 .000 1 1.000 .009 1 .923 1.000 .508 .009 1 .923 303 Chi-cuadrado de Pearson Corrección por continuidad a Razón de verosimilitudes Estadístico exacto de Fisher Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) Sig. exacta (bilateral) Sig. exacta (unilateral) Calculado sólo para una tabla de 2x2. a. 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 62.58. b. Estimación de riesgo 1.023 .648 1.613 1.012 .800 1.279 .989 .793 1.234 303 Razón de las ventajas para caso (CASO / CONTROL) Para la cohorte AleloR = QQ Para la cohorte AleloR = Alelo R N de casos válidos Valor Inferior Superior Intervalo de confianza al 95% 102 7.4.- Variante PON1 (Gln192Arg) por sexos 7.5.- Genotipos Gln192Arg en hombres No se especifica el valor del riesgo por alelos ya que el análisis no resultó en diferencias estadísticamente significativas: Tabla de contingencia 51 45 2 98 52.0% 45.9% 2.0% 100.0% 22.0% 19.4% .9% 42.2% 67 55 12 134 50.0% 41.0% 9.0% 100.0% 28.9% 23.7% 5.2% 57.8% 118 100 14 232 50.9% 43.1% 6.0% 100.0% 50.9% 43.1% 6.0% 100.0% Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total CASO CONTROL caso Total QQ QR RR RPON192 Total Pruebas de chi-cuadrado 4.843 a 2 .089 5.494 2 .064 1.228 1 .268 232 Chi-cuadrado de Pearson Razón de verosimilitudes Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 5.91. a. 103 7.6.- Genotipos Gln192Arg en mujeres No se especifica el valor del riesgo por alelos ya que el análisis no resultó en diferencias estadísticamente significativas: Tabla de contingencia 12 17 2 31 38.7% 54.8% 6.5% 100.0% 16.9% 23.9% 2.8% 43.7% 17 17 6 40 42.5% 42.5% 15.0% 100.0% 23.9% 23.9% 8.5% 56.3% 29 34 8 71 40.8% 47.9% 11.3% 100.0% 40.8% 47.9% 11.3% 100.0% Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total CASO CONTROL caso Total QQ QR RR RPON192 Total Pruebas de chi-cuadrado 1.749 a 2 .417 1.815 2 .403 .090 1 .764 71 Chi-cuadrado de Pearson Razón de verosimilitudes Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) 2 casillas (33.3%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 3.49. a. 7.7.- Variante Gln192Arg: Relación con variables cuantitativas en el total de la población analizada, en casos y en controles. Se realizó un contraste de medias mediante el test ANOVA de un factor de acuerdo a los genotipos PON1 (Gln192Arg) con respecto a las siguientes variables continuas (aparecen subrayadas aquellas disponibles solo en casos): Edad, PAS, PAD, Hemoglobina glicada, Urea, Urato, Na2+, K+, Proteínas totales, CK, Calcio, Mg2+, Homocisteína, Fólico, Vitamina B12, Proteína C 104 reactiva, Colesterol total, Colesterol LDL, Colesterol HDL, Apolipoproteína A1, Apolipoproteína B, Creatinina, Microalbuminuria (mg/ml), T4L, TSH, Leucocitos, Hemoglobina, Plaquetas, Velocidad de Sedimentación Globular y Fibrinógeno. No observamos diferencias significativas de acuerdo a los genotipos analizados en el total de la población analizada. No se observaron diferencias significativas en función de los genotipos tras categorizar por sexos. 7.8.- Variante Gln192Arg: Relación con variables categóricas (consumo de tabaco, hipertensión y diabetes). La evaluación de la distribución de genotipos PON1 (Gln192Arg) en función de las variables categóricas no mostró diferencias significativas en el global de la población analizada ni en el análisis por subgrupos de casos o controles. 7.9.- Haplotipos Paraoxonasa 1: Inferencia y Contraste (R) Estimamos el valor D´, es decir el valor del desequilibrio de ligamiento entre las variantes PON1Gln192Arg y PON1 Met55Leu analizadas usando el programa “genetics” implementado en R (D´= 0.79 en el total de la población analizada, D´= 0.8 en controles y D´= 0.75 en controles) De igual forma se implementó en R el programa haplo.stat a fin de evaluar la frecuencia poblacional de haplotipos e inferir su estima en dobles homocigóticos. El resultado en el total de la población se muestra a continuación: 105 Haplotipos: frecuencia en la población general, en casos y en controles -------------------------------------------------------------------------------- Counts per Grouping Variable Value -------------------------------------------------------------------------------- Grupos 1 2 128 172 -------------------------------------------------------------------------------- Haplotype Frequencies By Group -------------------------------------------------------------------------------- PON1(55) PON1(192) Total Casos Cotroles 1 L Q 0.35229 0.39470 0.32140 2 L R 0.26937 0.24592 0.28615 3 M Q 0.35604 0.33577 0.37046 4 M R 0.02229 0.02361 0.02199 106 Contraste de haplotipos inferidos entre casos y controles Global Score Statistics global-stat = 3.3167, df = 3, p-val = 0.34533 Counts for Cases and Controls control case 172 128 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ----- Haplotype Scores, p-values, Hap-Frequencies (hf), and Odds Ratios (95% CI) -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------ pon55 pon192 Hap-Score p-val pool.hf control.hf case.hf glm.eff OR.lower OR OR.upper 2 L R -1.03915 0.298733 0.269376 0.286154 0.24592 Eff 0.60555 0.94229 1.4663 3 M Q -0.80036 0.423503 0.356042 0.370456 0.33577 Base NA 1.00000 NA 4 M R -0.31484 0.752880 0.022291 0.021986 0.02361 Eff 0.26203 1.17534 5.2719 1 L Q 1.79180 0.073165 0.352291 0.321405 0.39470 Eff 0.90293 1.36077 2.0507 Contraste de haplotipos inferidos entre casos y controles: modelo aditivo Haplotype Effect Model: additive Global Score Statistics global-stat = 3.3167, df = 3, p-val = 0.34532 Haplotype-specific Scores pon55 pon192 Hap-Freq Hap-Score p-val [1,] L R 0.26938 -1.03916 0.29873 [2,] M Q 0.35604 -0.80036 0.4235 [3,] M R 0.02229 -0.31484 0.75288 [4,] L Q 0.35229 1.7918 0.07316 113 Tabla de contingencia 2 4 25 31 6.5% 12.9% 80.6% 100.0% 2.8% 5.6% 35.2% 43.7% 1 13 26 40 2.5% 32.5% 65.0% 100.0% 1.4% 18.3% 36.6% 56.3% 3 17 51 71 4.2% 23.9% 71.8% 100.0% 4.2% 23.9% 71.8% 100.0% Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total CASO CONTROL caso Total CC SC SS Cys311Ser Total Pruebas de chi-cuadrado 4.042 a 2 .133 4.232 2 .120 .776 1 .378 71 Chi-cuadrado de Pearson Razón de verosimilitudes Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) 2 casillas (33.3%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 1.31. a. 8.7.- Variante Cys311Ser: Relación con variables cuantitativas en el total de la población analizada, en casos y en controles Se realizó un contraste de medias mediante el test ANOVA de un factor de acuerdo a los genotipos PON2 (Cys311Ser) con respecto a las siguientes variables continuas (aparecen subrayadas aquellas disponibles solo en casos): Edad, PAS, PAD, Hemoglobina glicada, Urea, Urato, Na2+, K+, Proteínas totales, CK, Calcio, Mg2+, Homocisteína, Fólico, Vitamina B12, Proteína C reactiva, Colesterol total, Colesterol LDL, Colesterol HDL, Apolipoproteína A1, Apolipoproteína B, Creatinina, Microalbuminuria (mg/ml), T4L, TSH, Leucocitos, Hemoglobina, Plaquetas, Velocidad de Sedimentación Globular y Fibrinógeno. 114 No se observaron diferencias estadísticamente significativas de acuerdo a los genotipos Cys311Ser. 8.8.- Variante Cys311Ser: Relación con variables categóricas (consumo de tabaco, hipertensión y diabetes) La evaluación de la distribución de genotipos PON2 (Cys311Ser) en función de las variables categóricas tabaco e hipertensión no mostró diferencias significativas en el global de la población analizada ni en el análisis por subgrupos de casos o controles. La homocigosis Cys311Cys asoció con un riesgo significativo de diabetes que se perdió en el análisis por grupos. 9.- Tablas de contingencia y riesgo en análisis univariante 9.1.- Variante AT1R (A1166C) Tabla de contingencia caso * A1166C 63 58 8 129 48.8% 45.0% 6.2% 100.0% 20.8% 19.1% 2.6% 42.6% 88 74 12 174 50.6% 42.5% 6.9% 100.0% 29.0% 24.4% 4.0% 57.4% 151 132 20 303 49.8% 43.6% 6.6% 100.0% 49.8% 43.6% 6.6% 100.0% Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total CASO CONTROL caso Total AA AC CC A1166C Total 115 Pruebas de chi-cuadrado .200 a 2 .905 .200 2 .905 .021 1 .884 303 Chi-cuadrado de Pearson Razón de verosimilitudes Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 8.51. a. 9.2.- Alelos 1166C y riesgo Tabla de contingencia caso * AleloC1166 63 66 129 48.8% 51.2% 100.0% 20.8% 21.8% 42.6% 88 86 174 50.6% 49.4% 100.0% 29.0% 28.4% 57.4% 151 152 303 49.8% 50.2% 100.0% 49.8% 50.2% 100.0% Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total CASO CONTROL caso Total AA AleloC AleloC1166 Total Pruebas de chi-cuadrado .089 b 1 .765 .033 1 .855 .089 1 .765 .817 .427 .089 1 .765 303 Chi-cuadrado de Pearson Corrección por continuidad a Razón de verosimilitudes Estadístico exacto de Fisher Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) Sig. exacta (bilateral) Sig. exacta (unilateral) Calculado sólo para una tabla de 2x2. a. 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 64.29. b. 116 Estimación de riesgo .933 .592 1.471 .966 .767 1.215 1.035 .826 1.297 303 Razón de las ventajas para caso (CASO / CONTROL) Para la cohorte AleloC1166 = AA Para la cohorte AleloC1166 = AleloC N de casos válidos Valor Inferior Superior Intervalo de confianza al 95% 9.3.- Alelo A1166 y riesgo Tabla de contingencia caso * AleloA1166 121 8 129 93.8% 6.2% 100.0% 39.9% 2.6% 42.6% 162 12 174 93.1% 6.9% 100.0% 53.5% 4.0% 57.4% 283 20 303 93.4% 6.6% 100.0% 93.4% 6.6% 100.0% Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total CASO CONTROL caso Total Alelo A CC AleloA1166 Total Pruebas de chi-cuadrado .058 b 1 .810 .000 1 .994 .058 1 .809 1.000 .501 .058 1 .810 303 Chi-cuadrado de Pearson Corrección por continuidad a Razón de verosimilitudes Estadístico exacto de Fisher Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) Sig. exacta (bilateral) Sig. exacta (unilateral) Calculado sólo para una tabla de 2x2. a. 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 8.51. b. 117 Estimación de riesgo 1.120 .444 2.826 1.007 .949 1.070 .899 .379 2.136 303 Razón de las ventajas para caso (CASO / CONTROL) Para la cohorte AleloA1166 = Alelo A Para la cohorte AleloA1166 = CC N de casos válidos Valor Inferior Superior Intervalo de confianza al 95% 9.4.-VarianteAT1R (A1166C) por sexos 9.5.- Genotipos A1166C en hombres No se especifica el valor del riesgo por alelos ya que el análisis no resultó en diferencias estadísticamente significativas: Tabla de contingencia caso * A1166C 47 47 4 98 48.0% 48.0% 4.1% 100.0% 20.3% 20.3% 1.7% 42.2% 67 57 10 134 50.0% 42.5% 7.5% 100.0% 28.9% 24.6% 4.3% 57.8% 114 104 14 232 49.1% 44.8% 6.0% 100.0% 49.1% 44.8% 6.0% 100.0% Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total CASO CONTROL caso Total AA AC CC A1166C Total 118 Pruebas de chi-cuadrado 1.491 a 2 .474 1.538 2 .464 .028 1 .868 232 Chi-cuadrado de Pearson Razón de verosimilitudes Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) 0 casillas (.0%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 5.91. a. 9.6.- Genotipos A166C en mujeres No se especifica el valor del riesgo por alelos ya que el análisis no resultó en diferencias estadísticamente significativas: Tabla de contingencia caso * A1166C 16 11 4 31 51.6% 35.5% 12.9% 100.0% 22.5% 15.5% 5.6% 43.7% 21 17 2 40 52.5% 42.5% 5.0% 100.0% 29.6% 23.9% 2.8% 56.3% 37 28 6 71 52.1% 39.4% 8.5% 100.0% 52.1% 39.4% 8.5% 100.0% Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total Recuento % de caso % del total CASO CONTROL caso Total AA AC CC A1166C Total Pruebas de chi-cuadrado 1.511 a 2 .470 1.509 2 .470 .321 1 .571 71 Chi-cuadrado de Pearson Razón de verosimilitudes Asociación lineal por lineal N de casos válidos Valor gl Sig. asintótica (bilateral) 2 casillas (33.3%) tienen una frecuencia esperada inferior a 5. La frecuencia mínima esperada es 2.62. a. 119 9.7.- Variante A1166C: Relación con variables cuantitativas en el total de la población analizada, en casos y en controles Se realizó un contraste de medias mediante el test ANOVA de un factor de acuerdo a los genotipos C677T con respecto a las siguientes variables continuas (aparecen subrayadas aquellas disponibles solo en casos): Edad, PAS, PAD, Hemoglobina glicada, Urea, Urato, Na2+, K+, Proteínas totales, CK, Calcio, Mg2+, Homocisteína, Fólico, Vitamina B12, Proteína C reactiva, Colesterol total, Colesterol LDL, Colesterol HDL, Apolipoproteína A1, Apolipoproteína B, Creatinina, Microalbuminuria (mg/ml), T4L, TSH, Leucocitos, Hemoglobina, Plaquetas, Velocidad de Sedimentación Globular y Fibrinógeno. No observamos diferencias significativas de acuerdo a los genotipos analizados en el total de la población analizada. No se observaron diferencias significativas en función de los genotipos tras categorizar por sexos. 9.8.- Variante A166C: Relación con variables categóricas (consumo de tabaco, hipertensión y diabetes) La evaluación de la distribución de genotipos AT1R (A1166C) en función de las variables categóricas tabaco e hipertensión no mostró diferencias significativas en el global de la población analizada ni en el análisis por subgrupos de casos o controles. Se observó una diferencia estadísticamente significativa en la distribución de genotipos respecto a la diabetes que se perdió en el análisis por grupos. 10.- Análisis de regresión logística binaria multivariante Para evaluar la capacidad de predicción de la variable independiente “ictus isquémico” (caso versus control), se realizaron diversos análisis de 120 regresión logística múltiple. El objetivo principal de este trabajo fue replicar asociaciones genéticas con SNPs de los genes candidato MTHFR, PON1, PON2 y AT1R. Por tanto, tratamos de determinar la relevancia de las asociaciones caracterizadas en nuestra población en análisis univariante mediante análisis multivariante utilizando inicialmente el método introducir. Éste, se constituye en el método adecuado cuando el objetivo del estudio es el ajuste de variables de confusión y la exploración de términos de interacción. Evaluamos además si los coeficientes fueron significativos para su inclusión o eliminación del modelo aplicando el test de Hosmer–Lemeshow. Todas las variables categóricas fueron transformadas en variables dummy, tomando el valor 1 para la presencia de la característica y 0 por su ausencia. Se consideró la introducción de genotipos para modelos de herencia dominante/recesivo. Se introdujeron en el modelo genotipos, las variables categóricas HTA, tabaco y diabetes y las variables continuas compartidas entre casos y controles. Estas fueron la edad, PAS, PAD, concentración de Ácido Fólico, Vitamina B12, perfil lipídico (Colesterol total, LDL-Colesterol, HDLColesterol, Triglicéridos), concentración de Homocisteína plasmática total (tHcy) y Creatinina plasmática. No obstante, es importante señalar que el contraste univariante de las medias entre variables continuas mostró diferencias significativas de forma tal que los casos se caracterizaron por menores concentraciones plasmáticas medias de HDL, Vitamina B12 y mayores valores medios de triglicéridos así como valores superiores de presión arterial sistólica. Sin embargo algunas de las diferencias observadas muestran, paradójicamente, cifras superiores en los controles respecto a los casos. Así, el colesterol total, los valores de LDL, creatinina y tHcy resultaron 121 significativamente superiores en controles respecto a los casos. No obstante todas las variables continuas se introdujeron en el modelo con independencia de si diferían o no en análisis univariante. Resumen de casos incluidos y excluidos: Tabla de clasificación a,b 0 65 .0 0 73 100.0 52.9 Observado CASO CONTROL caso Porcentaje global Paso 0 CASO CONTROL caso Porcentaje correcto Pronosticado En el modelo se incluye una constante. a. El valor de corte es .500 b. Prueba Omnibus: Muestra una prueba Chi Cuadrado (χ2) que evalúa la hipótesis nula de que los coeficientes (β) de todos los términos (excepto la constante) incluidos en el modelo son cero. Pruebas omnibus sobre los coeficientes del modelo 139.250 18 .000 139.250 18 .000 139.250 18 .000 Paso Bloque Modelo Paso 1 Chi-cuadrado gl Sig. 122 Verosimilitud: Resumen de los modelos 51.595 a .635 .848 Paso 1 -2 log de la verosimilitud R cuadrado de Cox y Snell R cuadrado de Nagelkerke La estimación ha finalizado en el número de iteración 8 porque las estimaciones de los parámetros han cambiado en menos de .001. a. El valor de -2 log de la verosimilitud inicial es: 190.845 Bondad de ajuste: Prueba de Hosmer-Lemeshow. La prueba evalúa si las tasas de eventos observados coinciden con las tasas de eventos previstos en los subgrupos de la población modelo. Prueba de Hosmer y Lemeshow 103.758 8 .000 Paso 1 Chi-cuadrado gl Sig. Tabla de contingencias para la prueba de Hosmer y Lemeshow 14 14.000 0 .000 14 14 13.981 0 .019 14 14 13.696 0 .304 14 14 12.043 0 1.957 14 6 7.816 8 6.184 14 2 2.761 12 11.239 14 0 .613 14 13.387 14 0 .080 14 13.920 14 1 .010 13 13.990 14 0 .000 12 12.000 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Paso 1 Observado Esperado caso = CASO Observado Esperado caso = CONTROL Total 129 remetilación, transfiera un grupo metilo a la Hcy y así transformarla en metionina (498). El gen de la MTHFR se encuentra ubicado en el brazo corto del cromosoma 1 (1p36.3). Goyette y colaboradores describieron inicialmente dos mutaciones en el gen que codifica para la MTHFR, en la primera se produce una sustitución de citosina por timina en la posición 559 del gen (499). De esta manera se elimina uno de los dos sitios de reconocimiento de la enzima de restricción FOPI. La segunda mutación ocurre en el gen que codifica para la MTHFR, consiste en una transición de una guanina por adenina en la posición 482 del gen, que produce el cambio de una arginina por una glutamina. Esta mutación conduce a la creación de un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción PstI (499). El mismo grupo identificó otras siete mutaciones relacionadas (500). Frosst y colaboradores en 1995, identificaron una nueva mutación causada por la sustitución de una citosina por una timina en la posición 667 del gen (C677T), lo que ocasiona el cambio de una alanina por una valina en la secuencia aminoacídica en la posición 233, originando una variante termolábil de la MTHFR, que conllevaba reducción de hasta un 50% de la actividad de la enzima (490). Van der Put y colaboradores en 1998 comunicaron otra mutación en el gen que codifica para la MTHFR, que cambia una adenina por una citosina en la posición 1298 (A1298C). Observaron que la combinación heterocigota de ambas mutaciones (C677T+A1298C) reduce de manera significativa la actividad de la MTHFR en comparación con cada una de las formas heterocigotas de las dos alteraciones de manera individual (501). En un estudio realizado en Rumania en el que se analizaban ambos polimorfismos no 130 se demostró relación con el IS, por el contrario sí que hubo una mayor incidencia de IH en el grupo control donde era más prevalente el polimorfismo C677T (502). Kang y colaboradores (1991) encontraron que la mutación C677T estaba presente en el 17% de los pacientes con enfermedades cardíacas y en el 5% de los controles (503). Además mostraron una correlación entre la deficiencia de la enzima y el riesgo a desarrollar EAC, ya que en la mayoría de los pacientes con la alteración que provoca una proteína termolábil poseían altos niveles de homocisteína (503). Aunque hay datos contradictorios, hay trabajos en los que el suplemento con vitamina B12 disminuye el riesgo de ictus en sujetos de alto riesgo (504, 505), lo que apoyaría su papel en la patogenia de la patología vascular. En este sentido hay trabajos que postulan el beneficio de la riboflavina en pacientes hipertensos que son portadores del polimorfismo C677T (506), Se han realizado diversos estudios GWAS de los niveles de Hcy con resultados variables; y se han postulado diversas regiones de ligamiento en los cromosomas 1q42, 9q34, 11q23, 12q24, 13q, 14q32, 16q y 1913 (507, 508). Además se han descrito otros polimorfismos asociado a incremento de los niveles de Hcy como metiltransferasa 2756A3G, MTRR 66A3G, cSHMT 1420C3T, TC 67A3G, TC 776C3G, y GCPll 1561C3T (509). Por otro lado hay trabajos en los que se postula el efecto acumulativo de diversas variantes de los genes implicados en el metabolismo de la homocisteína, con bajo o moderado riesgo cada una, pueden jugar un papel en el riesgo de IS (510). La Cistationina Beta-Sintasa (CBS) produce cistationina a partir de cisteína y serina por la vía de la transulfuración. El gen de la CBS se encuentra 131 en el brazo largo del cromosoma 21 en la posición q22.3 (511). Entre las mutaciones más frecuentes están la que provoca el cambio de una isoleucina por triptófano en la posición 278 y la que provoca un cambio de glicina por serina en la posición 307. Se ha descrito la mutación G1330A, que genera una transición de una guanina por una adenina, provocando un cambio de ácido aspártico por asparragina (D444N), lo que afecta el dominio regulatorio de la proteína CBS (512). Boers et al, 1985 encontraron que una alta frecuencia de heterocigocidad para la deficiencia en esta enzima predispone al desarrollo de enfermedad arterial oclusiva prematura (513), se considera que los polimorfismos de la CBS están menos relacionados con la enfermedad vascular que aquellos de la MTHFR. Existen varios factores que determinan una elevación de los niveles de homocisteína, en primer lugar nutricionales dado que puede deberse una a ingesta baja de vitaminas B6, B12 y ácido fólico; también pueden guardar relación con un síndrome de mala absorción y con el consumo de alcohol (514). Los niveles de homocisteína aumentan con la edad y son mayores en hombres, en parte en relación a la masa muscular y la síntesis de creatinina/creatina y en parte en relación con las concentraciones de vitaminas y hormonas. Diversos fármacos pueden incrementar también las concentraciones de homocisteína, como el metotrexato, fenitoína e hipolipemiantes. Finalmente están las causas que se relacionan con defectos en los genes de las enzimas que catalizan la degradación de la metionina y la homocisteina, o de enzimas que sintetizan cofactores necesarios para ello (515). 132 Durante la autoxidación de la homocisteína se generan como productos derivados, potentes especies reactivas de oxígeno (ROS), como el anión superóxido, el peróxido de hidrógeno y el anión hidroxilo. Estas ROS pueden provocar disfunción de endotelio, con el consiguiente daño de la pared vascular, alteración vasomotora, activación y agregación plaquetaria, activación de elastasa, depósito intimal de calcio, peroxidación de lípidos, proliferación de células musculares lisas (516), y además disminuye la disponibilidad de óxido nítrico (517). El resultado es un aumento en la aterogénesis y facilitar fenómenos trombóticos (498). Un ejemplo es el trabajo de cuantificación de la ateromatosis del arco aórtico en el que la hiperhomocistenemia es un factor de riesgo independiente de la progresión de la misma (518). En nuestra serie se realizó el estudio del polimorfismo C677T de la MTHFR y se analizó la prevalencia de los alelos, de esta manera encontramos que era mayor la prevalencia del alelo C, 376 frente a 228 T, así como del genotipo C/T, 150 seguido de 113 C/C y por último 39 TT. No observamos diferencias respecto a lo esperado de acuerdo al equilibrio Hardy-Weinberg para ninguna de las poblaciones analizadas. La estimación del riesgo asociado para el alelo C no resultó significativa, no encontrándose diferencias en función del sexo. Diversos estudios prospectivos y de casos y controles que la elevación de los niveles de Hcy en plasma es un factor de riesgo para la enfermedad cardiovascular, para las trombosis venosas (502), y arteriales, incluyendo el ictus (519, 520). El metanálisis de 22 estudios publicado en 2004 mostró una odds ratio (OR) 1.24 (IC 1.08 a 1.42) al tener un genotipo CC comparado con el TT(519). Otro metanálisis con 2034 casos demostró una asociación 133 significativa del polimorfismo MTHFR C677T con el riesgo de IH bajo el modelo dominante (OR,1.61; 95% IC, 1.3 a 1.9) y en el recesivo (OR, 1.6, 95% IC, 1.4 a 2.0) (521). Un metanálisis posterior con 2.223 casos demostró una asociación significativa con el IS para el polimorfismo del alelo T [OR=1.28, 95% (95% IC): 1.17-1.40, P<0.00001] y una asociación marginal con el genotipo CT (OR=1.13, 95% IC: 1.01-127, P=0.04) y el TT (OR=1.43, 95% IC: 1.20-1.70, P<0.001) (522). Por otra parte también se han descrito interacciones entre SNP de la MTHFR y factores ambientales, asociándose a síndrome metabólico (523), además se ha descrito efecto sinérgico en el aumento del riesgo de IS con la mutación 20210 del gen de la protrombina (524). En nuestra serie la relación documentada entre genotipos y niveles de Hcy sí fue detectada, sin embargo el riesgo no se demostró lo que probablemente se justifica por la reducción de casos en aras del emparejamiento que hemos descrito. Es importante señalar que en un análisis multivariante no incluido en los resultados se incluyeron las variables Hcy, genotipos C677 portador y la interacción entre ambas variantes sin obtener significación estadística. Polimorfismos de paraoxonasa 1 El sistema de las paroxonasas (PON) comprende 3 genes que comparten 60-65% de similitud en los aminoácidos (315), que se localizan en el cromosoma 7 (7q21.3–22) y codifican 3 isoenzimas las cuales participan en prevenir la oxidación de los lípidos. Los polimorfismos genéticos asociados a las PON afectan a la actividad de la enzima y se han asociado a un incremento en el riesgo de IS, aunque con datos controvertidos (316, 317). Los niveles 134 aumentados de PON1 se han asociado en algunos estudios con mayores niveles de HDL (323, 525), que poseen la mayor capacidad predictiva negativa para enfermedad vascular. No obstante en estudios realizados en EAC se ha planteado un mayor valor pronóstico en relación con la actividad de arilesterasa, que mide la función de la PON 1, respecto a la medida de la PON 1 (324), y en este sentido postulan una capacidad predictiva alta para identificar sujetos de alto riesgo en una cohorte de prevención primaria. El gen de la PON 1 se ha investigado como potencial factor de riesgo para fenotipos relacionados con la aterosclerosis, incluyendo la EAC, EAP e IS (326, 328). La actividad de la enzima y la frecuencia de los alelos varían de forma amplia, de esta manera la inconsistencia de los estudios de asociación con la enfermedad vascular se podrían explicar por la variabilidad genotípica. La actividad de la PON 1 depende de diversos factores, entre los que se encuentran factores genéticos, edad, sexo, estilo de vida y fármacos (324). La actividad de PON1 disminuye con la edad, además puede estar ligada a circunstancias en las que está incrementado el estrés oxidativo como puede ser la aterosclerosis (526). En relación con el efecto del alcohol hay datos controvertidos, aunque se ha evidenciado un incremento en la actividad de la PON relacionado con el consumo moderado en hombres de mediana edad y mujeres postmenopáusicas (527, 528). También diversas entidades se han asociado a menor actividad de la PON1 como son la diabetes (529), hipertiroidismo (530), artritis reumatoide (531), insuficiencia renal crónica (532) o las demencias de Alzheimer y vascular (533) . La actividad de la PON1 está reducida en los pacientes con infarto agudo de miocardio, e hipercolesterolemia (534). 135 En nuestra serie se genotipó la variante PON1 (Met55Leu) y se analizó la prevalencia de los alelos, resultando un total de 372 L y de 222 M; respecto a la frecuencia de los genotipos obtuvimos 154 L/M y 109 L/L y 39 M/M. No observamos diferencias respecto a lo esperado de acuerdo al equilibrio HardyWeinberg para ninguna de las poblaciones analizadas. No observamos diferencias significativas de acuerdo a los genotipos analizados en el total de la población analizada, tampoco se demostraron diferencias significativas en función de los genotipos tras categorizar por sexos. Se observaron diferencias significativas en la población de casos de acuerdo a valores medios de PAD (p = 0.03) y a la concentración media de fibrinógeno (p = 0.005) observándose, respecto a esta última, una gradación por genotipos. Existen varios mecanismos descritos que justificarían la asociación observada con la PAD. La enzima paraoxonasa 1 posee actividad antioxidante y se ha caracterizado como una tiolactona hidrolasa. Diversos estudios vinculan ambas capacidad con el alelo de riesgo L55 de la variante Met55Leu. En el estudio de la variante PON1 (Gln192Arg) documentamos una mayor frecuencia del alelo Q (428 respecto a 178 R) y del genotipo Q/Q Q (147 respecto a 134 QR). En el análisis del equilibrio de Hardy-Wiemberg no hallamos diferencias respecto a lo esperado. La distribución de genotipos resultó en diferencias significativas. Paradójicamente detectamos un riesgo significativo 3.606 (IC 95%: 1.19010.927) asociado al alelo Q, riesgo que se justifica debido a la mayor frecuencia de heterocigotos QR en los casos. En el análisis del riesgo en función del sexo de la variante Gln192Arg no se documentaron diferencias estadísticamente significativas. La evaluación de la distribución de genotipos PON1 (Gln192Arg) en función de las variables categóricas no mostró 136 diferencias significativas en el global de la población analizada ni en el análisis por subgrupos de casos o controles. La mayoría de los estudios analizan 1 o 2 polimorfismos de la PON 1, hay un trabajo con 187 pacientes con hipercolesterolemia familiar que hace un análisis amplio de los polimorfismos, Q192R y L55M en la región codificante, además de T-107C, C-126G, G-162A, G-824A, y C-907G SNPs en la región promotora de la PON1 (327). De esta manera estudiaron combinaciones de haplotipos de la PON1 en relación con la enfermedad vascular. Demostraron que 2 haplotipos discordantes tenían hasta un 22% de diferencias en relación con el GIM, lo que apoyaría la base genética (327). Se ha demostrado la influencia en la actividad de la PON 1 de estos polimorfismos (Gln/Arg en posición 192 y sustitución Leu/Met en posición 55) (491). Estos polimorfismos se han asociado a ictus en pacientes jóvenes y en ancianos respectivamente (535, 536). Se ha sugerido que la presencia de estos alelos en individuos simultáneamente expuestos a otros factores como la diabetes o el tabaco, que también incrementan el estrés oxidativo pueden potenciar el riesgo vascular (537, 538). En un trabajo de Lazaros que analizó la relación de polimorfismos de las paraoxonasas (PON1 (Q/R) 192, PON1 (M/L) 55, y PON2 (Cys311Met) con la gravedad del ictus no encontró diferencias significativas, salvo en el caso de la PON2 (S/C) 311), y así se sugería su posible papel predisponente a sufrir ictus grave (346). Otro trabajo de Pasdar en población caucásica en el que se incluyó el análisis de PON1(Met 55Leu) tampoco observó el papel de los polimorfismos de genes paraoxonasa individuales en la patogenia del ictus isquémico (337). También se subrayó la importancia de utilizar un programa de análisis de haplotipos bien validados y 137 que los resultados de las diferencias de haplotipos deberían ser confirmados en estudios a gran escala. Tampoco se encontró asociación en un trabajo de Voescht en población joven con ictus (535). En el estudio “Austrian Stroke Prevention” el genotipo 55 LL se asoció a progresión de lesiones de sustancia blanca (539), y a la frecuencia y gravedad de estenosis carotídea (540). Bonafé y colaboradores examinaron el polimorfismo Q192R en 308 centenarios italianos no relacionados y 579 individuos italianos de edades comprendidas entre 20 y 65 años (541). El porcentaje de portadores del alelo R192 fue significativamente mayor en los centenarios que en las personas jóvenes (0,539 vs 0,447, p = 0,011). No se observó ninguna diferencia significativa entre los centenarios y los individuos jóvenes para el polimorfismo PON1 L55M (168820.0002). Los autores proponen que el alelo R192 disminuye la mortalidad en los portadores, pero que el efecto de la variabilidad PON1 sobre la mortalidad general de la población es escaso. Los resultados sugirieron que la PON1 es uno de los genes que afectan a la capacidad de adaptación individual y por lo tanto es uno de los genes que afectan la velocidad y la calidad del envejecimiento. En un estudio longitudinal de la supervivencia que incluyó 1.932 individuos daneses, Christiansen encontró que las mujeres homocigotas para el alelo R192 tuvieron una tasa de supervivencia menor en comparación con los homocigotos Q192 (razón de riesgo, 1,38; p = 0,04) (542). Una muestra independiente de 541 individuos daneses confirmó los hallazgos para R192 mujeres homocigotas, con un OR de 1,38 (p = 0,09). La combinación de las 2 muestras no cambió la estimación del riesgo, pero aumentó la significación estadística (p = 0,008). Utilizando los datos de auto-reporte de la enfermedad 138 isquémica del corazón, los autores sólo encontraron una tendencia no significativa de la homocigosis R192 en las mujeres a constituir un factor de riesgo. Los investigadores concluyeron que la homocigosis R192 de la PON1 se asocia con una mayor mortalidad en las mujeres en la segunda mitad de la vida y que este aumento de la mortalidad tiene una posible relación con la gravedad y la supervivencia de las enfermedades del corazón, en lugar de la susceptibilidad al desarrollo de las mismas. PON1 Gln192Arg asocia un incremento del riesgo de ictus en el análisis univariante, pero se produce un efecto de riesgo asociado al alelo Q. Este efecto no es real en el sentido de que el riesgo sea del alelo Q lo que ocurre es que hay pocos casos RR (y también pocos QQ en realidad) y muchos QR un problema denominado de exceso de heterocigotos. Este exceso podría en este caso ser atribuido a la presencia de una selección sobredominante o la existencia de migraciones en la población estudiada. En un trabajo de Voescht en población joven se encontró que el polimorfismo Gln/Arg192 (genotipo RR) estaba de manera independiente asociado a ictus no mortal en adultos jóvenes (535), con incremento del riesgo de 4 veces (OR 4,1; 95% IC, 1.14 a 14.73). Ellos encontraron al calcular el número de alelos de riesgo 192R y 55L que portaba cada sujeto, que se duplicaba el riesgo de IS entre los portadores de 2 o más de estos alelos (OR=1.5; 95%IC, 0,94-3.2). La asociación no randomizada es debida al desequilibrio de ligamiento que une el alelo R en posición 192 al alelo frecuente L en posición 55. Se ha sugerido que la presencia de ambos alelos en sujetos expuestos a otros factores de riesgo incrementa la peroxidación de las partículas LDL y disminuye la actividad de la PON 1 como tabaco, (537), o