Identificación de regiones del ADN con baja frecuencia de lectura

1 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC Memo ia del T abajo de Fin de Tí ulo de Ca e a de Adap ación al G ado de Ingenie ía en In o má ica de la Uni e sidad de Las Palmas de G an Cana ia TÍTULO Iden i icación de egiones del ADN con baja ecuencia de lec u a AUTOR Deyán Fab icio Guaca án Sabogal TUTORES An onio Tugo es Ces e . Je e de Se icio Unidad de In es igación del Complejo Hospi ala io Uni e si a io Insula – Ma e no In an il. F ancisca Quin ana Domínguez. P o eso a Ti ula de Uni e sidad del Depa amen o de In o má ica y Sis emas de la Uni e sidad de Las Palmas de G an Cana ia. FECHA Julio de 2014 2 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC Con enido 1. Ag adecimien os. ............................................................................................................. 4 2. Resumen del T abajo Fin de G ado. .............................................................................. 6 3. In oducción. ..................................................................................................................... 7 3.1 Aplicaciones Médicas. ....................................................................................................... 10 4. Es ado Ac ual y Obje i os. .......................................................................................... 13 5. Flujo de Análisis y búsqueda de a ian es en el ADN. ....................................... 15 5.1 P epa ación de hipó esis o suposición. ....................................................................... 15 5.2 Ob ención del ADN. ............................................................................................................ 16 5.3 Secuenciación del ADN. .................................................................................................... 16 5.4 Alineamien os de las Secuencias. .................................................................................. 17 5.5 Localización de a ian es. ............................................................................................... 21 5.6 Ano ación de a ian es..................................................................................................... 22 5.7 Fil ado. ................................................................................................................................. 23 6. Desa ollo de la aplicación. ....................................................................................... 25 6.1 PLANIFICACIÓN................................................................................................................... 25 6.1.1 Me odología de T abajo. .................................................................................................................25 6.1.2 Pla a o mas de desa ollo. ............................................................................................................27 6.1.3 Recu sos. ................................................................................................................................................28 6.2 DESARROLLO. ...................................................................................................................... 29 6.2.1 Obje i os. ...............................................................................................................................................32 6.2.2 Requisi os Funcionales ...................................................................................................................34 6.3 RESULTADOS ....................................................................................................................... 38 6.3.1 Dep hs .....................................................................................................................................................39 6.3.2 In e sec ion ...........................................................................................................................................42 6.3.3 S a is ical Resul s ...............................................................................................................................42 6.3.4 Caso P ác ico ........................................................................................................................................44 7. Conclusiones y T abajos Fu u os. ............................................................................ 47 8. Apo aciones. ................................................................................................................. 49 9. Compe encias Cubie as. ............................................................................................ 50 9.1 CII01 .............................................................................................................................................................50 9.2 CII02 .............................................................................................................................................................50 9.3 CII04 .............................................................................................................................................................51 9.4 CII08 .............................................................................................................................................................51 9.5 CII018 ..........................................................................................................................................................52 9.6 TFG01 ..........................................................................................................................................................52 10. No ma i a y Legislación. .......................................................................................... 54 10.1 Ley de P o ección de da os. .......................................................................................... 54 10.2 Leyes sob e Segu idad. .................................................................................................. 54 11. Manual de Usua io y So wa e................................................................................ 56 11.1 Acceso a la aplicación. .................................................................................................... 56 11.2 P oceso “Dep hs”. ............................................................................................................ 56 11.3 P oceso “Compa ison”. .................................................................................................. 60 11.4 P oceso “S a i iscal Resul s”......................................................................................... 63 12. Fuen es de in o mación. ........................................................................................... 66 13. Anexo 1: Fo ma o de iche os. ................................................................................ 68 3 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 14. Anexo 2: He amien as Adicionales. .................................................................... 72 15. Glosa io. ......................................................................................................................... 78 4 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 1. Ag adecimien os. Quie o da las g acias a odas las pe sonas que han pa icipado en el desa ollo de es e T abajo Fin de G ado: A mi u o An onio Tugo es, po enseña me y compa i sus conocimien os, ya que sin él no hubie a sido posible edac a es a memo ia. Po o o lado a mi u o a, F ancisca Quin ana, po da me la opo unidad de pa icipa en es e p oyec o, da me odo su apoyo y ayuda me en la di ulgación y ec i icación de dicha memo ia. A mi compañe o y amigo Pascual, po habe me ayudado du an e el anscu so del desa ollo del p oyec o y compa i sus conocimien os conmigo. Sin él, no hubie a sido posible la inalización del mismo. Es e T abajo Fin de G ado ambién le pe enece a él. A odos las pe sonas pe enecien es a UICHUIMI (Juan Ca los, Paloma, C is ina, Te esa…), po los momen os buenos que hemos pasado y que me han ayudo a ealiza es e p oyec o de o ma más amena y ag adable. A odos mis compañe os de clase y amigos (Da id, Dalia, Xe ach, F ancisco, Ay hami, Cyn hia, Román, Ai o Ca dona, Ai o He nández, C is ián, Na alia, Pablo, Reynie …), ya que con ellos he compa ido y i ido momen os muy boni os du an e oda mi ca e a y he ap endido mucho de cada uno de ellos. A mis amigos que he enido el place de conoce los es e año (Helena, Alba, Ylenia, Pa icsua, Ad ián, Allende, Bo ja, Ca los, Pa icia, Elena, Jezabel, Pablo, Vicen e,…) y que me han dado m omen os muy di e idos y aleg es du an e odos es os meses. Todos ellos ambién o man pa e de es e p oyec o. A odos mis p o eso es de la Uni e sidad, a ellos les debo mis conocimien os y cualidades adqui idas en odos es os años de mi ca e a. A oda mi amilia y a Jesús, po habe me dado su apoyo en odos los momen os de mi ida uni e si a ia. Sin ellos, no hab ía sido posible llega has a donde he llegado y se la pe sona que soy en es os momen os de mi ida. A mi segunda amilia, po que los conside o como al, po odo el apoyo incondicional que me han dado y po es a ahí pa a mos a me odo 5 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC su apoyo en odos los momen os de mi ida en es os años. En especial ambién a mis abuelos po da me odos sus buenos consejos y de ellos he ap endido los alo es de la ida y que hay que segui adelan e supe ando odas las ad e sidades que nos ponga la ida. A Ri a, una pe sona muy especial en mi ida, po habe me dado odo su apoyo pa a segui adelan e y dis u a y su i cada uno de los momen os du an e mi paso en la ida uni e si a ia. G acias po es a ahí siemp e que lo he necesi ado, sin i es o ampoco se ía posible. Tú ambién o mas pa e de cada una de es as líneas de es e p oyec o. Y en especial, a mi mad e, g acias po odos los es ue zos que has pues o en mí y po da me la opo unidad de es udia lo que he que ido. Sin i, no llega ía a donde he llegado ni end ía la opo unidad de esc ibi e es as líneas pa a i. Po es a ahí en odos mis momen os an o buenos como di íciles que he pasado en mi ida, y que po i he ap endido que hay que lucha y segui pa a adelan e en odas las ba e as que nos pongan. G acias po odos us consejos. Muchas G acias a odos. Deyán Fab icio Guaca án Sabogal 6 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 2. Resumen del T abajo Fin de G ado. El ADN es un políme o i que con iene la mayo pa e de la in o mación necesa ia pa a el desa ollo y uncionamien o de odos los o ganismos i os conocidos. La in o mación es á accionada en di e en es segmen os, los genes, que con ienen a iables que son indi iduales y que de e minan las ca ac e ís icas de cada pe sona. En e ellas, hay dos que son de especial impo ancia pa a la a ención sani a ia: la suscep ibilidad gené ica de padece una en e medad y la capacidad de esponde de o ma di e encial a un medicamen o, denominado a macogené ica ii . Pode iden i ica dichas a ian es puede ayuda a comp ende la en e medad e indi idualiza el a amien o del pacien e espec i amen e. Pa a conoce es as a ian es debemos conoce la secuencia de ADN de los genes implicados en las pa ologías o en las ca ac e ís icas a macogené icas pa a un indi iduo de e minado, un p oceso denominado secuenciación. La secuenciación comple a del genoma, po su complejidad, es á oda ía lejos de encon a un hueco en e las aplicaciones médicas de uso u ina io. Sin emba go, exis en écnicas pa a selecciona y secuencia el exoma, que es la pa e del genoma que con ienen los exones, acciones de los genes que con ienen la in o mación necesa ia pa a la ab icación de las p o eínas. El exoma supone ap oximadamen e un 2% del o al del genoma, y su secuenciación se ealiza en la Unidad de In es igación del Complejo Hospi ala io Ma e no In an il (UICHUIMI) pa a iden i ica la causa de en e medades a as y de o igen gené ico. La secuenciación de exoma cub e la mayo pa e de los exones del genoma, pe o no de ec a algunas egiones, lo que imposibili a la de ección de a ian es en ellas. Es e hecho c ea una ince idumb e diagnós ica, lo que limi a el pode de es a he amien a pa a la de ección de mu aciones pa ogénicas iii , ya que genes clínicamen e ele an es pueden habe se quedado sin analiza po un de ec o expe imen al. Po ello, necesi amos sabe con p ecisión qué egiones exómicas han quedado ue a del análisis. Así, el obje i o p incipal del T abajo Fin de G ado es la c eación de una he amien a in o má ica que pe mi a al pe sonal clínico, sin conocimien os in o má icos la de ección de egiones del exoma con poca cobe u a de secuenciación, es deci , egiones del ADN con una ecuencia de lec u a baja compa ándolo con espec o al genoma de e e encia (ADN es ánda ). 7 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 3. In oducción. El ácido desoxi ibonucleico (ADN) es un ácido nucleico que con iene la in o mación gené ica de los o ganismos i os y es esponsable de su almacenamien o y ansmisión he edi a ia. La o alidad de la in o mación gené ica que posee un o ganismo o una especie en pa icula se denomina genoma, es deci , un conjun o de genes donde es án almacenadas las cla es pa a la di e enciación de las células que o man los di e en es ejidos y ó ganos de un indi iduo. El genoma codi ica una se ie de ca ac e ís icas o asgos obse ables de un o ganismo, como su mo ología, desa ollo, p opiedades bioquímicas, isiología y compo amien o. A odas es as ca ac e ís icas la denominamos eno ipo, y a oda la in o mación gené ica, el geno ipo. El ADN es á es uc u ado, como obse amos en la Figu a 3.1, po dos la gas cadenas complemen a ias de nucleó idos unidas en e sí o mando una doble hélice. Las dos cadenas de nucleó idos que cons i uyen una molécula de ADN, se man ienen unidas en e sí po que se o man enlaces en e las bases ni ogenadas i de ambas cadenas que quedan en en adas. Es a con igu ación le apo a es abilidad a la molécula de ADN. Las cua o bases ni ogenadas que se encuen an en el ADN son la Adenina (A), Timina (T), Ci osina (C) y Guanina (G). La unión de las bases se ealiza median e puen es de hid ógeno, y es e apa eamien o es á condicionado químicamen e de o ma que la Adenina se complemen a con la Timina y la Guanina con la Ci osina. Figu a 3.1 8 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC En el se humano, las células somá icas poseen 46 cadenas de ADN, llamados c omosomas i , dis ibuidos en 23 pa ejas. Cada pa es á o mado po un c omosoma de o igen ma e no y o o pa e no. Vein idós de es as pa ejas ienen la misma es uc u a y el amaño, es deci , son homólogos. Pe o el sexo de la pe sona es á de e minado po el úl imo pa de c omosomas, los c omosomas sexuales. La muje con iene dos c omosomas X, mien as que el homb e con iene un c omosoma X y o o Y (es deci , c omosomas he e ólogos). Las células ge minales con ienen la mi ad de la in o mación, que esul a de la ecombinación de los c omosomas pa e no y ma e no pa a o igina c omosomas únicos esponsable de la he encia. El genoma humano con iene ap oximadamen e en e 20.000 y 25.000 genes. Se conside an genes las egiones del genoma que codi ican pa a p o eínas, es o es, las egiones que se ansc iben pa a gene a ARN mensaje os que luego se aducen en p o eínas en los ibosomas. De media, los genes ienen un amaño de 3.000 nucleó idos o bases. Teniendo en cuen a que el o al del genoma asciende a 3.164,7 millones de bases, la suma de odos los genes ep esen a un 2% del genoma humano. Po an o, el 98% del genoma humano es ADN-no codi ican e, o lo que es lo mismo, no con iene in o mación ele an e pa a la sín esis de p o eínas.[2] La es uc u a de los genes con iene, además, elemen os que pa icipan en la egulación de su exp esión como los p omo o es ii y po enciado es iii de la ansc ipción. La es uc u a in ón-exón de los genes ue descubie a en 1977 (podemos obse a dicha es uc u a en la Figu a 3.2). [2] Es uc u as que di e encian a Euca io as de P oca io as ix . Un in ón es una egión del ADN que debe se eliminada del ansc i o de ARN an es de que salga del núcleo y sea aducido. Los exones ep esen an las secciones en la e sión inal del ARNm que se unen en e sí du an e el p oceso de splicing ( ambién llamado co e y empalme) y, po an o, se aduci án inalmen e en p o eínas. 9 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC Figu a 3.2 La exp esión génica, enca gada de la sín esis de p o eínas a pa i de los genes, comp ende po dos e apas: ase de ansc ipción y la ase de aducción. En la ase de ansc ipción consis e en que a pa i de un agmen o del ADN es ansc i o po ARN polime asa (ARNP) en un ARN nuclea que, as el p ocedimien o (splicing), se con ie e en mensaje o (ARNm). En la ase de aducción se gene a la p o eína a pa i del ARNm y es á comp endida po es sub ases: iniciación de la sín esis p o eica, elongación de la cadena polipep ídica y inalización de la sín esis de las p o eínas. Podemos obse a es as dos e apas en las siguien es imágenes Figu a 3.3 y Figu a 3.4 espec i amen e.¡E o ! No se encuen a el o igen de la e e encia. Figu a 3.3 16 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC Figu a 5.1 Una ez es ablecidas una o a ias hipó esis, pod emos decidi qué segmen os del ADN se an a secuencia y ealiza di e en es compa aciones de los esul ados ob enidos. En la Unidad de In es igación se abaja con es ipos de hipó esis: homocigo os, dominan es ecesi os y uno o más genes candida os ( a ian es). 5.2 Ob ención del ADN. En es a ase se les ex ae a los pacien es que que emos in es iga una pequeña mues a de sang e con una can idad ap oximada de 10 milili os, de la que se ex ae el ma e ial gené ico de las células blancas según el mé odo de p ecipi ación accionada de Mille .[3] 5.3 Secuenciación del ADN. Una ez ob enidas las mues as de ADN, son en iadas al Ins i u o de Genómica de Pekín (Beijing Genomics Ins i u e – BGI) pa a que se enca guen de ealiza la secuenciación po el mé odo NGS.[4] En es e ins i u o se ealiza el p oceso de agmen ación del ADN en di e en es acciones de ap oximadamen e 150 pa es de bases. Con 17 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC di e en es mé odos ísico-químicos se ejecu a una sepa ación de las acciones que no o man pa e del exoma y con iene una calidad meno . Median e el sis ema “Illumina HiSeq 2000” las acciones es an es co espondien es a una calidad posi i a se secuencian en una di ección y su in e sa, ob eniéndose in o mación de las dos cadenas del ADN.[5] Es e sis ema de secuenciación no sólo o ece unos esul ados sin p eceden es y de bajo cos e, sino ambién una expe iencia de usua io a anzada. Con dicha ecnología supe a las de iciencias de las écnicas de secuenciación adicionales como de al o cos e en mano de ob a y ma e iales. Los mé odos al e na i os de p epa ación de mues as pe mi en una amplia gama de aplicaciones incluyendo la exp esión génica, pequeño descub imien o de ARN o las in e acciones p o eína-ácido nucleico. Los esul ados ob enidos se gua dan en di e en es a chi os in o ma izados en el que incluyen una sucesión de secuencias con sus co espondien es alo es de calidad. Es a in o mación es á almacenada en dos a chi os en o ma o “.FASTQ”, en el cual cada uno de ellos con iene las secuencias de una de las dos di ecciones del ADN(5’ y 3’). Pa a sabe como es á es uc u ado es os iche os bas a con i nos al inal de la memo ia a l anexo “Fo ma o de los iche os”. 5.4 Alineamien os de las Secuencias. Los a chi os ecibidos de la secuenciación no malmen e con ienen 30 millones de secuencias con longi udes de ap oximadamen e de 90 pa es de bases, po lo que almacena unos 3 mil millones en su o alidad. El p oblema que exis e es que la in o mación que apo a es os iche os no de e mina en qué posiciones se encuen an las secuencias, po lo que se lle a a cabo el p oceso de alineamien o pa a o dena cada secuencia en su posición exac a o ap oximada. Pa a lle a a cabo es e p oceso se u iliza un genoma de e e encia, en el cual se hace las compa aciones con cada una de las secuencias ecibidas. Los obje i os al hace la compa ación de dos o más secuencias son:  De e mina (y cuan i ica ) el g ado de simili ud que hay en e ellas.  De e mina si exis e algún ipo de elación en e ellas o si el pa ecido es simplemen e u o de la casualidad. 18 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC  De ec a la p esencia de mo i os es uc u ales y/o uncionales conse ados.  Cons ui á boles ilogené icos xiii que e lejen sus elaciones e olu i as. Realiza el alineamien o de las secuencias equie e un gas o muy al o an o en compu ación como en memo ia, po lo que u iliza mé odos habi uales se hace in iable. Pa a ello se emplea di e en es algo i mos que con ibuyan a una mejo e iciencia del p oceso en ez de una mayo e icacia. Exis en dos ipos de algo i mos que pueden soluciona es a cues ión: algo i mos en unción de una abla hash y algo i mos basados en á boles su ijo/p e ijo. En unción del núme o de secuencias que se compa an podemos dis ingui :  Alineamien o de dos secuencias: se compa an dos secuencias u ilizando di e sos mé odos como, po ejemplo, la ma iz de pun os (do -plo ), algo i mos de p og amación dinámica (Needleman- Wunsch o Smi h- Wa e man) o algo i mos heu ís icos (FAST, BLAST).  Alineamien o de múl iples secuencias: se compa an más de dos secuencias. Pa a ello se pueden u iliza di e sos p og amas basados en algo i mos heu ís icos como, po ejemplo, CLUSTALW. Pa a el mé odo de alineamien o de dos secuencias las écnicas más conocidas pa a ealiza es e p oceso son:  Alineamien o global: Es especialmen e ú il cuando las secuencias se pa ecen bas an e, ienen una longi ud simila y los dominios conse ados se encuen an en el mismo o den. Aba ca la o alidad de las secuencias compa adas, es deci , in en a alinea odos y cada uno de los esiduos de las dos secuencias. Es e ipo de alineamien o nos pe mi i á de e mina si las secuencias son homólogas o no, si pe enecen a una misma amilia o cons ui un á bol ilogené ico. Pa a es e p oceso se u iliza el algo i mo de Needleman-Wunsch.  Alineamien o local: Es el más u ilizado y esul a especialmen e ú il cuando se compa an secuencias muy di e gen es, de igual o dis in a longi ud, pe o que pueden con ene una o más egiones conse adas con simili ud local. Las egiones conse adas suelen 19 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC co esponde a dominios es uc u ales o uncionales que esul an c uciales pa a el man enimien o de la es uc u a y/o unción de la molécula. Pa a es e p ocedimien o se emplea el algo i mo de Smi h – Wa e man.  Alineamien o semiglobal: Es especialmen e ú il cuando se compa an secuencias de longi ud muy dis in a o secuencias en las que el inal de una se solapa con el inicio de o a. Pe mi e (1) de ec a egiones de solapamien o que nos pe mi an ensambla con igs a pa i de agmen os más pequeños, (2) compa a EST (exp essed sequence ags) con ADN genómico pa a así pode dis ingui los exones de los in ones y de e mina la es uc u a del gen, y (3) descub i pa ones en una secuencia mucho más la ga. Pa a es e p oceso se u iliza el algo i mo de Smi h – Wa e man ya que no aplica penalizaciones ni al inicio ni al inal de la secuencia más la ga. Figu a 5.2 Pa a el mé odo de alineamien o de múl iples secuencias las écnicas más u ilizadas pa a ealiza es e p oceso son:  P og amación dinámica: La écnica de p og amación dinámica es eó icamen e aplicable a cualquie núme o de secuencias; sin emba go, y pues o que es compu acionalmen e cos osa an o en iempo como en memo ia, a amen e se usa en su o ma más básica pa a más de es o cua o secuencias.  Mé odos p og esi os: Los mé odos p og esi os, je á quicos, o po á bol, gene an un alineamien o múl iple de secuencias alineando p ime o las secuencias más simila es, pa a i añadiendo sucesi amen e al alineamien o secuencias o g upos menos elacionados, has a que el conjun o p oblema comple o ha sido inco po ado a la solución.  Mé odos i e a i os: Los mé odos i e a i os in en an mejo a el pun o débil de los mé odos p og esi os: su ue e dependencia de la p ecisión de los alineamien os de los empa ejamien os iniciales. Los mé odos i e a i os op imizan una unción obje i o basada en un 20 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC mé odo seleccionado de pun uación de alineamien o median e la asignación de un alineamien o global inicial y el pos e io ealineamien o de subconjun os de secuencias. P ime amen e sabemos que enemos un genoma de e e encia que posee ap oximadamen e 3x10^9 nucleó idos. Como sabemos, las cadenas aisladas del ADN (mues as) se en ían a Beijing Genome Ins i u e pa a que ellos se enca guen de la secuenciación po NGS. Una ez ecibida la agmen ación de dicho ADN en millones de ozos en e 150 y 200 pa es (en iche os in o má icos en o ma o “. as q), hacemos una compa ación de cada secuencia con el genoma de e e encia en el que se ob iene di e en es lec u as (DP) en odas las posiciones. Es as lec u as se gua dan en el iche o de alineamien o (.bam) además de in o mación adicional (c omosoma, calidad del mapeo, longi ud de la secuencia…). Med ian e la he amien a desa ollada, pod emos eco e odas esas lec u as y ob ene las egiones de e minadas po el umb al in oducido po el usua io. Como hemos is o exis en di e en es p og amas de alineamien o de secuencias, sin emba go, en UICHUIMI se u iliza uno en conc e o llamado BWA. Desc ibi emos a con inuación es e ipo de so wa e. Bu ows – Wheele Aligne BWA es un paque e de so wa e pa a el mapeo de secuencias pequeñas con a un genoma de e e encia, como po ejemplo el genoma humano. Dicho so wa e se compone de es algo i mos: BWA-back ack, BWA-SW y BWA-MEM. El p ime algo i mo es á diseñado pa a la secuencia de Illumina en el cual lee has a 100 pa es de bases, mien as que las dos es an es es án diseñadas pa a las secuencias más la gas que oscilan en e 70 y 1 millón de pa es de bases. BWA-MEM y BWA-SW compa en ca ac e ís icas simila es, como po ejemplo el sopo e de lec u as la gas y alineamien os de up u as, pe o BWA-MEM, po lo gene al se ecomienda pa a consul as de al a calidad, ya que es más ápido y p eciso. BWA-MEM ambién o ece un mayo endimien o que BWA-BackT ack pa a lec u as Illumina de 70 a 100 pa es de bases. BWA-back es á p incipalmen e diseñado pa a las asas de e o de secuenciación po debajo del 2%. Aunque los usua ios pueden ole a más e o es a a és de líneas de comandos, su endimien o se deg ada ápidamen e. Hay que ene en cuen as que pa a lec u as Illumina, bwa- 21 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC back ack puede opcionalmen e sup imi bases de baja calidad del alelo 3’ an es de la alineación y po lo an o es capaz de alinea más lec u as con una al a asa de e o en la cola, que es una pos u a ípica de Illumina. BWA-SW y BWA-MEM ole an más e o es con alineamien os más la gos. Las simulaciones sugie en que pueden unciona bien con un e o del 2% pa a una alineación de 100 pa es de bases, el e o de 3% pa a una de 200 pb (pa es de bases), 5% pa a 500 pb y 10% pa a 1000 pb o más.[8] El esul ado de los algo i mos BWA es á en o ma o “.SAM”, adecuado pa a la búsqueda de las a ian es. 5.5 Localización de a ian es. Una ez hemos hecho el alineamien o de las secuencias, en es a ase i emos desde el p incipio has a el inal del genoma de e e encia compa ándolo con el exoma econs uido, pa a así i iden i icando en qué posiciones es di e en e. Es e p oceso es el más complicado de odos, ya que en cada posición no malmen e se encuen a a ias lec u as alineadas y hay que sabe que exis en a ian es en las que sob a o al a un agmen o. Pa a ello an es de ealiza el p oceso de localización de a ian es, se hace un e inamien o a los alineamien os. Pa a ealiza es e p oceso se emplea un sis ema llamado Genome Analysis Toolki . Po o a pa e exis e una he amien a llamada Pica d en el cual és e se enca ga de ealiza una eliminación de lec u as epe idas que no ag egan in o mación, analiza cobe u as de p o undidad y ecalib a los alo es de calidad. Con odas es as uncionalidades ayudan a acili a la de ección de Indels xi .[9] [10] A con inuación obse amos en la siguien e Figu a 5.3 como se ubican las secuencias en un iche o en o ma o “.SAM”: Re : TCGTAATCACGACA seq1: --GTAAACAC---- seq2: TCGTAAACACG--- sep3: ---TAAACACGA-- seq4: -CGTAATCACG--- Figu a 5.3 En es a imagen podemos obse a como en la posición 7 de la e e encia hay una Timina, sin emba go, en es de las cua o secuencias a 22 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC compa a emos que hay una Adenina. Con es o podemos llega a la hipó esis de que puede habe una a ian e en dicha posición, pe o ambién cabe des aca que hay que ene en cuen a algunos pun os de is a. Sabemos que a cada una de las lec u as le co esponde un alo de calidad, po lo que podemos a llega a plan ea nos que es e esul ado puede se debido a un e o del apa a o de secuenciamien o. También puede habe sido un allo en el p og ama de alineamien o, ya que cada uno de los alineamien os le co esponde un alo de bondad. El obje i o es u iliza un p og ama que localice el mayo núme o de a ian es e ídicas posibles. En es e caso la búsqueda de a ian es es más ácil ya que sabemos que exis en a ian es po la inexis encia de una o más bases, po una epe ición de un agmen o de cadena o po la inclusión de una cadena. 5.6 Ano ación de a ian es. En es a ase ob enemos un iche o con miles de a ian es, en el cual nues o obje i o es iden i ica unas cuan as en e odas ellas. Pa a ello debemos hace una se ie de il os con espec o a unas cie as no mas. La in o mación sob e la ubicación de las a ian es es pob e ya que sólo indica la posición en la que se ha p oducido la a ian e, po lo que es 23 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC necesa ia ag ega más in o mación sob e ello. Los campos más ecuen es que se añaden son:  Localización: Indica que codón pe enece al genoma de e e encia y qué codón pe enece la a ian e.  Sinonimia: Las a ian es son sinónimas cuando no ep esen an un cambio en el aminoácido que codi ica el codón donde se encuen a.  Pelig o: Den o de las a ian es que no son sinónimas, se hallan ambién las ole adas y pelig osas, dependiendo del cambio de las a ian es.  F ecuencia: Repe ición de la a ian e en las dis in as bases de da os. Habi ualmen e es án clasi icadas po egiones, po lo que se puede sabe en qué pa es del mundo son más usuales o no.  Conocimien o: Base de da os e in o mación donde se encuen a la a ian e, y así nos in o ma de has a qué pun o es conocida la a ian e. Aunque exis en he amien as de ano ación que pe mi en ejecu a se de o ma local, es más ecomendable ealiza la en los se icios web ya que los esul ados es a án ac ualizados. 5.7 Fil ado. Es a e apa es la más impo an e ya que en la an e io ase de localización de a ian es, se iden i ican una media de 150.000 a ian es. La inalidad de es a ase es hace un il ado de las a ian es que pueden se sospechosas de causa una en e medad. Pa a ello se hace un il ado po el mé odo po ecuencias, en el cual se sup imen las a ian es que con engan una ecuencia muy al a, ya que se conside an que con dicha ecuencia pe judica ía a muchas pe sonas. Po o a pa e, ambién se sup imen las a ian es con lec u as meno es que 10, 24 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC que engan alo es de calidad po debajo de 50 y que no sean la opción más e iden e. Po úl imo se clasi ican las a ian es según el ipo de hipó esis que se a e (homocigo os, dominan e ecesi o o uno o más a ian es). También se pueden busca a ian es comunes en e di e en es pacien es sob e una misma en e medad. 25 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 6. Desa ollo de la aplicación. En es a e apa desc ibi emos odo el p oceso en la c eación de la aplicación sob e la iden i icación de egiones de baja ecuencia de lec u a en el ADN, desde la plani icación del abajo has a la implemen ación de la he amien a. Se ha decidido que la aplicación sea llamada MIST (Missing Sequencing Tools). 6.1 PLANIFICACIÓN. En es e capí ulo habla emos sob e la me odología de abajo que se a a u iliza , las di e en es pla a o mas usadas y los equisi os asignados pa a el desa ollo. 6.1.1 Me odología de T abajo. Pa a el desa ollo del módulo de so wa e de iden i icación de egiones pob es en el ADN se ha u ilizado como p ocedimien o de abajo la me odología de desa ollo ágil. Es e mé odo basado en el desa ollo i e a i o e inc emen al, donde los equisi os y soluciones e olucionan median e la colabo ación de g upos au o o ganizado y mul idisciplina io. Cada i e ación del ciclo de ida incluye: plani icación, análisis de equisi os, diseño, codi icación, e isión y documen ación. Una i e ación no debe ag ega demasiada uncionalidad, sino que el obje i o es ene una especie de “dem o” a l inal de cada i e ación. Con es o pe mi e al clien e p oba y u iliza la e sión ya desa ollada. Po ello se puede ealiza los cambios en los equisi os desde el p incipio del desa ollo. La inalidad es que los desa ollado es engan una acilidad en los cambios del so wa e a la ho a de añadi o sup imi equisi os, y así no haya du ación en e la i e ación ac ual y la siguien e. En el 2001 se c eo un mani ies o ágil con la inalidad de descub i mejo es o mas mejo es de desa olla so wa e pa a nues a p opia expe iencia, y no sólo pa a educi el iempo de desa ollo sino pa a mejo a ambién la e iciencia. Es os son los 4 pun os del mani ies o ágil:  Indi iduos e in e acciones sob e p ocesos y he amien as.  So wa e uncionando sob e documen ación ex ensi a.  Colabo ación con el clien e sob e negociación con ac ual. 32 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC Figu a 6.3 En dicha imagen pod emos e que la in o mación es á es uc u ada además de la cabece a, con los siguien es campos:  @SQ: Iden i icado .  SN: Nomb e del c omosoma.  LN: Núme o de pa es de bases que con iene dicho c omosoma. 6.2.1 Obje i os. En es e capí ulo desc ibi emos los di e sos obje i os que necesi an los usua ios en UICHUIMI y sus di e en es ca ac e ís icas. El desa ollo de es os obje i os se da án po co ec os cuando sean alidados po el/los clien es. A con inuación mos a emos es os obje i os: 33 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC Obje i o 1 Localización de egiones pob es Ve sión 1.0 Au o es Deyán F. Guaca án Sabogal An onio Tugo es Ces e Desc ipción La he amien a debe pe mi i hace una búsqueda de egiones con lec u as de baja ecuencia, de e minada po un umb al in oducido po el usua io. Además debe ealiza una compa ación con las egiones de los exones de los humanos. Impo ancia Muy Al a Es ado Validado Tabla 6.1: Obje i o 1 Obje i o 2 In e sección en e egiones pob es. Ve sión 1.0 Au o es Deyán F. Guaca án Sabogal An onio Tugo es Ces e Desc ipción La he amien a debe pe mi i hace una in e sección de las egiones con baja ecuencia de lec u a en e múl iples pacien es. Impo ancia Muy Al a Es ado Validado Tabla 6.2: Obje i o 2 Obje i o 3 Resul ados Es adís icos Ve sión 1.0 Au o es Deyán F. Guaca án Sabogal An onio Tugo es Ces e Desc ipción La he amien a debe pe mi i ex ae esul ados es adís icos de los iche os an o de las egiones con baja ecuencia de lec u a como en la in e sección en e múl iples pacien es. Impo ancia Al a Es ado Validado Tabla 6.3: Obje i o 3 34 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 6.2.2 Requisi os Funcionales Los equisi os uncionales son aquellos que de inen una unción del sis ema de so wa e o sus componen es, con la inalidad de que los usua ios log en sus obje i os. Requisi o Funcional 1 P og eso Ve sión 1.0 Au o es Deyán F. Guaca án Sabogal Desc ipción La he amien a debe á mos a el p og eso de ejecución median e una ba a de p og eso. Impo ancia Al a Es ado Validado Tabla 6.4: Requisi o Funcional 1 6.2.2.1 Casos de Uso En es e capí ulo habla emos sob e los casos de uso, aquellos que ealizan una desc ipción de los pasos o las ac i idades que debe án ealiza se pa a lle a a cabo algún p oceso. An es de explica los casos de uso, señalamos el ac o que in e ac úa con la aplicación. Ac o 1 Usua io Ve sión 1.0 Au o es Deyán F. Guaca án Sabogal Desc ipción El ac o ep esen a a oda en idad ex e na al sis ema que gua da una elación con és e y que le demanda una uncionalidad. Tabla 6.5: Ac o 1 1 A con inuación mos a emos odos los casos de uso que in e ienen en el p og ama y sus elaciones, po lo que pa a ello ealiza emos un esquema en UML. Lo podemos obse a en la siguien e Figu a 6.4: 35 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC Figu a 6.4 Una ez especi icados los casos de uso que el p og ama con iene, p ocede emos a hace una desc ipción del lujo de acciones de cada uno de ellos. Pa a ello ambién ha emos cap u as de pan alla de cómo es á o ganizado odos ellos. Caso de Uso 1 Localización de egiones pob es Ve sión 1.0 Au o es Deyán F. Guaca án Sabogal Ac o P incipal Usua io Desc ipción El usua io localiza las egiones con una ecuencia de lec u a baja. P econdición Que ha ya un iche o en o ma o “.bam” co espondien e al alineamien o de las secuencias de un de e minado pacien e. Flujo 1. El usua io selecciona el iche o en o ma o “.BAM” como iche o de en ada. 2. El usua io selecciona el iche o de e e encia de los exones de los humanos como iche o ambién de en ada. 3. El usua io in oduce el umb al de lec u as. 4. El usua io gua da el iche o de salida en la ubicación que desee. 5. El usua io pulsa el b o ón “S a ”. 6. El sis ema mues a el p og eso de ejecución median e la ba a de p og eso. 7. El sis ema mues a un panel de la consola con los cálculos que se es án ealizando en ese momen o. Tabla 6.6: Caso de Uso 1 36 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC A con inuación e emos una ilus ación del caso de uso “Localización de egiones pob es” median e la Figu a 6.5, en el cual pod emos e el p oceso de ejecución de búsqueda de egiones con baja ecuencia. Pa a ello hemos pues o de ejemplo un umb al de 10, es deci , egiones que engan lec u as de ce o a nue e: Figu a 6.5 Caso de Uso 2 In e sección en e egiones pob es Ve sión 1.0 Au o es Deyán F. Guaca án Sabogal Ac o P incipal Usua io Desc ipción El usua io ealiza la in e sección de egiones pob es en e múl iples pacien es. 37 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC P econdición Que haya disponible como mínimo dos o más iche os de di e en es pacien es con sus co espondien es egiones pob es. Flujo 1. El usua io selecciona una lis a de iche os de los di e en es pacien es con egiones pob es como iche os de en ada. 2. El usua io gua da el iche o de salida en la ubicación que desee. 3. El usua io pulsa el b o ón “S a ”. Tabla 6.7: Caso de Uso 2 A con inuación mos a emos una ilus ación de cómo es á es uc u ado el caso de uso “In e sección en e egiones pob es” median e la Figu a 6.6: Figu a 6.6 Caso de Uso 3 Resul ados Es adís icos Ve sión 1.0 Au o es Deyán F. Guaca án Sabogal Ac o P incipal Usua io Desc ipción El usua io ob iene di e en es esul ados es adís icos an o pa a la in e sección de egiones pob es de 38 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC múl iples pacien es como ambién pa a pacien es indi iduales. P econdición Que haya disponible iche os con egiones con baja ecuencia de lec u a de di e en es pacien es o la in e sección en e ellos. Flujo 1. El usua io selecciona el iche o pa a ob ene los esul ados es adís icos como iche o de en ada. 2. El usua io gua da el iche o de salida en la ubicación que desee. 3. El usua io pulsa el b o ón “S a ”. Tabla 6.8: Caso de Uso 3 A con inuación mos a emos una ilus ación de cómo es á es uc u ado el caso de uso “Resul ados Es adís icos” median e la Figu a 6.7: Figu a 6.7 6.3 RESULTADOS En es e capí ulo habla emos sob e los di e en es esul ados que gene an la aplicación sob e la localización de egiones con baja ecuencia de lec u as, además de o as unciones adicionales como los esul ados es adís icos de dichos esul ados gene ados. 39 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 6.3.1 Dep hs En es a ase habla emos sob e el iche o que se gene a al ealiza el cálculo del núme o de lec u as de odos los c omosomas. Du an e el p oceso se ex aen las egiones con espec o al umb al in oducido po el usua io. Una ez ob enido dichas egiones pob es, se ealiza una compa ación con las egiones del genoma de e e encia de los “homo sapiens” pa a sabe en que zonas son a ec adas. A con inuación emos una ilus ación de un iche o gene ado de un de e minado pacien e al ealiza la ejecución en la Figu a 6.8 y explica emos cada uno de los campos:  Ch om: Nomb e del c omosoma. En nues os iche os i án del c omosoma 1 al c omosoma Y.  Exon_S a : Comienzo de la posición de la egión del exón.  Exon_End: Final de la posición de la egión del exón.  Poo _S a : Comienzo de la posición de la egión pob e.  Poo _End: Final de la posición de la egión pob e.  Gene_ID: El iden i icado es able pa a el gen.  Gene_Name: Nomb e del gen.  Exon_Numbe : Posición del exón en la ansc ipción.  Exon_ID: El iden i icado es able pa a el exón.  T ansc ip _Name: El nomb e de la ansc ipción.  T ansc ip _In o: In o mación de la anscipción.  Gene_Bio ype: El bio ipo de es e gen.  Ma ch: La zona del exón que esul a a ec ada. Pueden se de cua o opciones: le , igh , inside y o e lap. Habla emos sob e ello a con inuación. Figu a 6.8 40 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC En el p ime caso, puede ocu i que la zona que es é a ec ada sea una pa e izquie da de la egión del exón. Podemos e un caso en la siguien e ilus ación (Figu a 6.9): Figu a 6.9 En el segundo caso, puede ocu i que la zona que es é a ec ada sea una pa e de echa de la egión del exón. Podemos obse a un caso en la siguien e ilus ación (Figu a 6.10): Figu a 6.10 En el e ce caso, puede ocu i que la zona a ec ada se encuen e den o de la egión del exón. Podemos e un caso en la siguien e ilus ación (Figu a 6.11): 41 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC Figu a 6.11 En el úl imo caso, puede da se la opción de que la zona a ec ada sea su o alidad ya que la egión con baja de ecuencia de lec u a sea de más amaño que la egión del genoma de e e encia. Podemos e el caso en la siguien e ilus ación (Figu a 6.12): Figu a 6.12 48 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC en la cobe u a 100x que no encon amos en los pacien es con asa de cobe u a 50x. La o a conclusión que hemos llegado es que al hace una compa ación es adís ica a ni el an o de genes como de exones que codi ican p o eínas, podemos analiza que exis e una mejo a al hace una cobe u a de 100x con espec o al 50x. Secuencia con una p o undidad de 100x es mucho mejo que con la de 50x, ya que la cobe u a de encon a genes codi ican es mal secuenciados es mucho mayo , po lo que la en abilidad en cuán o a cos e mone a io se ía más bene iciosa secuencia di ec amen e con una p o undidad mucho mayo (100x). Es ob io que con MIST (Missing Sequencing Tools) solo hemos hu gado una pequeña pa e de algo más g ande. La búsqueda de egiones en el ADN que son sospechosos de habe sido mal secuenciados ep esen a un log o cien í ico y ecnológico pa a la sanidad. Pode con dicha ecnología descub i egiones causan es de o igina una posible en e medad, o a e igua si el indi iduo es más o menos suscep ible de un de e minado medicamen o cons i uye un g an a ance en el a amien o médico, y supone an o un bene icio económico bas an e g ande como p eciso que los sis emas ac uales. Aun así, oda ía quedan cosas po hace en el lujo de abajo de la localización de egiones mal secuenciadas en el ADN. A con inuación exponemos unas cuan as:  Op imización y mejo a de la he amien a MIST de localización de egiones del ADN con baja ecuencia de lec u a.  Añadi la he amien a desa ollada al so wa e gene al DNAnaly ics como módulo adicional.  Implemen a , o encon a nue os algo i mos pa a la búsqueda de iden i icación de egiones mal secuenciadas en el ADN.  Reduci el iempo de p ocesamien o de los esul ados ob enidos, adap ando la he amien a en máquinas más po en es.  Encon a y es udia o as he amien as ya desa olladas simila es a nues o p og ama, con el in de ealiza una compa ación sob e és e. 49 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 8. Apo aciones. En es e capí ulo habla emos de las di e en es apo aciones que p esen a nues o T abajo Fin de G ado. Con la implemen ación de la aplicación hemos a anzado conside ablemen e en muchos ac o es muy impo an es. En p ime luga , dicha aplicación (MIST) apo a sabe qué zonas del exoma han sido mal secuenciadas. Po ello si, po ejemplo, un 90 % ha sido de las egiones han sido bien secuenciadas el p og ama de ec a qué zonas del 10 % es an e no lo han sido. Con es o nos podemos aho a nos iempo y ecu sos (ya que educe el núme o de exones a secuencia po Sange ). Po o a pa e, en cuán o al ac o cien í ico-médico, busca qué zonas han sido mal secuenciadas es de i al impo ancia ya que exis en egiones que pueden causa en e medades o incluso la mue e del pacien e. Así que las de ecciones de es os posibles genes candida os, pe mi e conoce qué a ian es son sospechosas de causa iesgos de salud o nue as a ian es que no han sido descubie as has a aho a. Además es a aplicación educe, cla amen e, la posibilidad de e o po pa e de los empleados de la Unidad de In es igación, ya que no sólo se e alúan los esul ados ob enidos sino que el expe o puede ealiza sus compa aciones con los da os suyos llegando así a conclusiones más óp imas. En la ac ualidad, no exis e es e mé odo in o ma izado y que cub a es a necesidad. Con el desa ollo de es a aplicación, conseguimos que los p o esionales de dicho sec o se encuen en con una he amien a sencilla, in ui i a y ú il que agiliza á y mejo a á las in es igaciones pa a es e ipo de es udios. 50 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 9. Compe encias Cubie as. Pa a la ealización y e aluación de es e abajo in de g ado, se equie e de una se ie de compe encias, de las cuales enume a emos y jus i ica emos las siguien es: 9.1 CII01 Capacidad pa a diseña , desa olla , selecciona y e alua aplicaciones y sis emas in o má icos, asegu ando su iabilidad, segu idad y calidad, con o me a p incipios é icos y a la legislación y no ma i a igen e. 1. Se han diseñado, desa ollado, seleccionado y e aluado aplicaciones y sis emas in o má icos ya que se ha enido que hace un es udio p e iamen e sob e como se ía la ob ención de las egiones con baja ecuencia de lec u a en el genoma de e e encia. 2. Se ha desa ollado una aplicación con la capacidad de au oma iza dicha búsqueda, incluyendo las di e en es p uebas an o de iabilidad y segu idad como las de calidad, conside ando las di e en es no mas igen es. 3. En dicha memo ia podemos e que hemos incluido los apa ados “Es ado Ac ual y O bje i os” y “Recu sos” (en el apa ado de “Plani icación” ), con el in de cub i po comple o dicha compe encia. 9.2 CII02 Capacidad pa a plani ica , concebi , desplega y di igi p oyec os, se icios y sis emas in o má icos en odos los ámbi os, lide ando su pues a en ma cha y su mejo a con inua y alo ando su impac o económico y social. 1. Pa a la ealización de es e p oyec o de dicha magni ud, ene una plani icación es imp escindible pa a alcanza los plazos es ablecidos del mismo. 2. Si se alcanza sa is ac o iamen e la p esen ación del p oyec o, a i ica que la compe encia ha sido cubie a. 51 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 3. Cabe des aca que dicho p oyec o aunque es é en un p oceso de in es igación y expe imen ación, puede ene en un u u o un impo an e impac o y alo económico. Es o es así, po que dicha he amien a p opo ciona un aho o an o de iempo como económico muy conside able pa a los in es igado es. 9.3 CII04 Capacidad pa a elabo a el pliego de condiciones écnicas de una ins alación in o má ica que cumpla los es ánda es y no ma i as igen es. Pa a una ace ada u ilización de la he amien a desa ollada se ha plan eado las siguien es condiciones écnicas: 1. La implemen ación del módulo de so wa e debe ene una se ie de equisi os pa a lle a a cabo la ins alación del mismo:  Fiabilidad.  Compo amien o cons an e.  Buena calidad del so wa e.  Que sea segu o. 2. La in ención es que dicha he amien a sea u ilizada de o ma global pa a los in es igado es quie an hace uso de ella. En un p incipio la aplicación se ha plan eado en el idioma español, pe o cabe la posibilidad de amplia la a o o idioma si es necesa io. 3. En el caso de que ue a necesa io ealiza di e en es co ecciones a dicha he amien a, el p oceso de p uebas no debe ía de a ec a a la ac i idad del mismo. Es p eciso analiza y comp oba el uncionamien o an es de e ec ua la di usión del p oduc o. 9.4 CII08 Capacidad pa a analiza , diseña , cons ui y man ene aplicaciones de o ma obus a, segu a y e icien e, eligiendo el pa adigma y los lenguajes de p og amación más adecuados. 1. Como hemos dicho en la an e io compe encia, la aplicación debe con ene una se ie de equisi os pa a que sea obus a, segu a y e icien e. 52 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 2. Pa a la implemen ación de la aplicación, es ecomendable que se ome como pa adigma la o ien ación a obje os y que dicho lenguaje sea ambién impe a i o. 3. La po abilidad es écnicamen e di ícil de log a , po ello se ha u ilizado como lenguaje de desa ollo Ja a ya que ac úa independien emen e de la pla a o ma que es emos abajando. 9.5 CII018 Conocimien o de la no ma i a y la egulación de la in o má ica en los ámbi os nacional, eu opeo e in e nacional. Ac ualmen e las leyes que es án pues as en di e en es países guiadas a p o ege la u ilización desmedida o/e ilegal de la in o mación ob enida y a ado en equipos in o má icos. Desde hace a ias años, la mayo ía de los países en el ámbi o eu opeo e in e nacional, han in en ado c ea /ejecu a leyes elacionados con el acceso ilegal a los sis emas in o má icos o el man enimien o indebido de es os accesos, la p opagación de i us u o os mé odos pa a adqui i in o mación ilegal. Todos es os en oques en países occiden ales son muy pa ecidos a los eu opeos, ya que el obje i o ambién es p o ege la in o mación que puede se adqui ida de o ma ilíci a median e di e en es mé odos como la comunicación segu a o que la ans e encia in o mación sea de lo más con idencial posible. 9.6 TFG01 Eje cicio o iginal a ealiza indi idualmen e y p esen a y de ende an e un ibunal uni e si a io, consis en e en un p oyec o en el ámbi o de las ecnologías especí icas de la Ingenie ía en In o má ica de na u aleza p o esional en el que se sin e icen e in eg en las compe encias adqui idas en las enseñanzas. Es a compe encia ha sido o almen e cubie a en la p esen e memo ia sob e es e T abajo Fin de G ado, en el cual ambién se ha desa ollado la aplicación a la que se hace mención. 53 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC Pa a ello hemos hecho p e iamen e un es udio sob e el desa ollo del mismo, desde la plani icación e implemen ación de la he amien a has a los esul ados ob enidos al ealiza la ejecución de los di e en es algo i mos desa ollados. Todos es os aspec os pe enecen, e iden emen e, a ámbi os de las ecnologías especí icas de la Ingenie ía en In o má ica. 54 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 10. No ma i a y Legislación. A con inuación se inclui á la legislación igen e que a ec a a es e T abajo Fin de G ado en ma e ia de segu idad in o má ica: 10.1 Ley de P o ección de da os. En es e apa ado explica emos las azones po las cuales es a ley es impo an e en nues o p oyec o. Una de las p incipales azones po la que se u iliza es a ley es que la aplicación ealiza sus p ocesos a pa i de unos iche os elacionados con el alineamien o del ADN. Es os iche os ienen o iginalmen e de mues as de sang e ex aída en de e minados pacien es, po lo que es de i al impo ancia p o ege cualquie in o mación conce nien e a dichas pe sonas iden i icadas. Además du an e la implemen ación de la aplicación, hacemos ope aciones y p ocedimien os écnicos los cuales nos pe mi en la ecogida, elabo ación y modi icación de los da os. En nues o caso, es os da os de ca ác e pe sonal ecogidos en pacien es, sólo pod án se usados pa a inalidades elacionadas con las in es igaciones biomédicas. Po o o lado, el a amien o de dichos da os eque i á del consen imien o inequí oco del a ec ado, sal o que la ley disponga o a cosa. 10.2 Leyes sob e Segu idad. En es e apa ado habla emos sob e los di e en es aspec os elacionados con la segu idad que necesi a la aplicación desa ollada en es e T abajo Fin de G ado. Pa a ello enume amos las siguien es conside aciones a ene en cuen a: 1. La in o mación de los a chi os que ayamos a a a elacionado con de e minados pacien es sean de o al con idencialidad. 2. Con la posibilidad de que la in o mación en dicho a chi os su a pelig o de con idencialidad e in eg idad en los da os, los equipos in o má icos donde ayamos a ins ala la aplicación debe án ene un sis ema de p o ección. 55 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 3. Gene almen e las amenazas in e nas pueden se más se ias que las ex e nas, ya aquellas pe sonas den o la in es igación conocen la ed y saben cómo es su uncionamien o, ubicación de la in o mación, da os de in e és, e c. Po ello es necesa io ealiza copias de segu idad, e incluso, si es necesa io sis emas de espaldo emo o que pe mi an man ene la in o mación en dos ubicaciones de o ma asínc ona. 4. Aunque en nues os equipos in o má icos ienen el sis ema ope a i o Linux, los i us son uno de los medios más adicionales de a aque a los sis emas y a la in o mación que los sos ienen. Pa a pode e i a su con agio se deben igila los equipos y los medios de accesos a ellos, p incipalmen e la ed. 56 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 11. Manual de Usua io y So wa e. En es e apa ado exponemos un sencillo manual de usua io sob e la aplicación desa ollada pa a los usua ios co espondien es an o al pe sonal clínico como a los usua ios ex e nos. Pa a acili a la in e p e ación del uncionamien o del mismo, mos a emos a ios ejemplos median e cap u as de pan alla. 11.1 Acceso a la aplicación. 1. Haga clic dos eces sob e el a chi o llamado “MIST” o selecciónelo y pulse la ecla “En e ”. 2. A con inuación se ab i á la in e az del p og ama en el cual es á compues a po es pes añas supe io es: “Dep hs”, “Compa ison” y “S a is ical Resul s”. 11.2 P oceso “Dep hs”. El p oceso que ealiza es la localización de egiones del ADN con lec u as po debajo del lími e que hemos in oducido en el campo numé ico “Th eshold”. 1. Hace clic en la pes aña “Dep hs”. Se o ece á la in e az: 57 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 2. Dicha in e az es á compues a po dos secci ones: “Inpu ” y “Ou pu ”. 3. Hace clic en el bo ón “B owse…” co espondien e a “File BAM” pa a elegi el iche o de alineamien o del ADN. 4. MIST sólo pe mi e elegi iche os c on ex ensión “.BAM”. 5. Hace clic en el bo ón “B owse…” co espondien e al “File Exons” (Base de da os de exones). 64 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 2. Hace clic en el bo ón “B owse…” co espondien e al campo “File” pa a elegi el iche o al que que emos ealiza el a amien o. 3. En la sección “Ou pu ” hace clic en el bo ón “B owse…”, pa a selecciona la ubicación del a chi o dónde que emos gua da nues os esul ados. El a chi o lo podem os gene a del ipo “. x ” o “. s ” (Tab Sepa a ed V alues). 4. Hace clic en el bo ón “S a ” pa a ejecu a el p oceso del p og ama. 5. El p og ama mos a á un mensaje de e o al pulsa el b o ón “S a ” en el caso de que no se haya ealizado ninguna de las an e io es ins ucciones. 65 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 6. Una ez que el p oceso de la aplicación haya e minado, podemos ol e a ce a la aplicación o di ec amen e pasa a o a pes aña. 66 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 12. Fuen es de in o mación. [1] U.S. DOE Human Genome P ojec . [2] Pe e J. Russell. Gene ics. 4ª. Ed. Ha pe Collins, 1996. [3] Mille SA, Dykes DD y Polesky HF. “A sim ple sal ing ou p ocedu e o ex a c ing DNA om human nuclea ed cells”. En: Nucleic Acids Resea ch 16.3 ( eb. de 1988), pág. 1215. [4] Abou BGI. URL: www.genomics.cn [5] Illumina HiSeq 2000. URL: h p://www.genomics.cn/en/na iga ion/show_na iga ion?nid=4145 [6] An In oduc ion o Nex -Gene a ion Sequencing Technology. URL: h p:// es.illumina.com/documen s/p oduc s/illumina_sequencing_in od uc ion.pd [7] Mille SA, Dykes DD y Polesky HF. “A sim ple sal ing ou p ocedu e o ex a c ing DNA om human nuclea ed cells”. En: Nucleic Acids Resea ch 16.3 ( eb. de 1988), pág. 1215. [8] Bu ows-Wheele Aligne . URL: h p://bio-bwa.sou ce o ge.ne / [9] McKenna A y col. “ The Genome Analysis Toolki : a Ma- pReduce amewo k o analyzing nex -gene a ion DNA seque ncing da a”. En: Genome Res. 20. (sep. de 2010), pa gs. 1297-1303. [10] Pica d. URL: h p://pica d.sou ce o ge.ne / [11] Wo king wi h BAM Files. URL: h p://www.ncbi.nlm.nih.go / ools/gbench/ u o ial6/ [12] BamView. URL: h p://bam iew.sou ce o ge.ne / [13] Sam ools. URL: h p://sam ools.sou ce o ge.ne / [14] Li H. e al. The Sequence Alignmen /Map o ma and SAM ools. Bioin o ma ics. 2009 Aug 15; 25(16):2078-9. [15] The Va ian Call Fo ma and VCF ools, Pe Danecek, Adam Au on, Goncalo Abecasis, Co nelis A. Albe s, E ic Banks, Ma k A. DeP is o, Robe Handsake , Ge on Lun e , Gabo Ma h, S ephen T. She y, Gilean McVean, Richa d Du bin and 1000 Genomes P ojec Analysis G oup, Bioin o ma ics, 2011. [16] Danecek P. e al. The a ian call o ma and VCF ools. Bioin o ma ics. 2011 Aug 1; 27(15):2156-8. 67 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC [17] Fe nando Ga cía-Alcalde, Kons an in Okonechniko , José Ca bonell, Luis M. C uz, S e an Gö z, Sonia Ta azona, Joaquín Dopazo, Thomas F. Meye , and Ana Conesa "Qualimap: e alua ing nex -gene a ion sequencing alignmen da a." Bioin o ma ics 28, no. 20 (2012): 2678-2679. [18] Xosé M. Fe nández-Suá ez and Michael K. Schus e Using he Ensembl Genome Se e o B owse Genomic Sequence Da a. UNIT 1.15 in Cu en P o ocols in Bioin o ma ics, Jun 2010. www.ncbi.nlm.nih.go /pubmed/20521244 [19] Blas . Al schul S.F., Gish W., Millwe W., Mye s E.W. and Lipman D.J. (1990) Basic local alignmen sea ch ool. J. Mol. Biol. 215: 403-410. [20] Paul Flicek, M. Ridwan Amode, Daniel Ba ell, Ka h yn Beal, Kons an inos Billis, Simon B en , Denise Ca alho-Sil a, Pe e Clapham, Guy Coa es, S ephen Fi zge ald, Lau en Gil, Ca los Ga cía Gi ón, Leo Go don, Thibau Hou lie , Sa ah Hun , Na han Johnson, Thomas Jue emann, And eas K. Kähä i, S ephen Keenan, Eugene Kulesha, Fe gal J. Ma in, Thomas Mau el, William M. McLa en, Daniel N. Mu phy, Rishi Nag, Be O e duin, Miguel Pigna elli, Be han P i cha d, Emily P i cha d, Ha p ee S. Ria , Magali Ru ie , Daniel Sheppa d, Kie on Taylo , Anja Tho mann, S ephen J. T e anion, Alessand o Vullo, S e en P. Wilde , Ma k Wilson, Amonida Zadissa, B onwen L. Aken, Ewan Bi ney, Fiona Cunningham, Jenni e Ha ow, Ja ie He e o, Tim J.P. Hubba d, Rhoda Kinsella, Ma hieu Mu a o, Anne Pa ke , Giulie a Spudich, Andy Ya es, Daniel R. Ze bino, and S ephen M.J. Sea le Ensembl 2014 Nucleic Acids Resea ch 2014 42 Da abase issue:D749-D755. doi: 10.1093/na /gk 1196 68 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 13. Anexo 1: Fo ma o de iche os. FASTQ En la siguien e Figu a 1.1 obse amos como es á es uc u ado los p ime as líneas de un iche o “. as q”. La p ime a línea es el iden i icado (comenzando po @), después del cual iene la secuencia. La línea que comienza con + suele con ene o a ez el mismo iden i icado , aunque se puede omi i pa a aho a espacio en disco. Al inal iene una se ie de ca ac e es que ep esen an la calidad, un ca ác e po cada le a de la secuencia. Pa a que la cadena de alo es de calidad enga la misma longi ud que la secuencia, se codi ica el núme o con i iéndolo en un ca ác e ascii. Pa a e i a ca ac e es ascii que no se pueden desplega en pan alla, se suele ag ega 33 al núme o de calidad an es de codi ica lo. Figu a 1.1 VCF En las siguien es Figu as 1.2 y 1.3 podemos obse a como es á es uc u ado un a chi o de a ian es de o ma o “.VCF” [15] : 69 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC Figu a 1.2 En es a p ime a imagen obse amos las p ime as líneas del a chi o “. c ”, en el cual nos expone una in o mación (me a-in o mación) de cómo se á el con enido y la es uc u a que end á dicho iche o. Es a me a- in o mación es inc luida después de la cadena “##” y debe se o mada po “cla e = alo ”. En es as p ime as líneas encon amos los siguien es campos asociados a sus alo es:  File o ma : Es e campo siemp e es eque ido y debe se la p ime a línea del iche o. In o ma del núme o de la e sión del iche o de las a ian es.  In o: Es e campo puede se de a ios ipos: en e o, eal, lag, ca ác e y cadena. Ta mbién con iene un campo “Numbe ” que es de ipo en e o en el cuál se desc ibe el núme o de alo es que puede se incluido con el camp o “In o”.  Fil e : Es e campo in o ma de los il os que se han aplicado a los da os.  Fo ma : Es e campo indica los di e en es campos del Geno ipo que se an a expone .  Con ig: Es un conjun o de lec u as con iguas que es án elacionadas en e sí median e la supe posición de secuencias. Al igual que con las secuencias c omosómicas es muy ecomendable que la cabece a incluya e ique as que d esc iben los “con igs” que hacen e e encia al iche o “. c ”. El o ma o es idén ico a la de una secu encia de e e encia, pe o con una e ique a URL adicional que indica dónde puede se encon ado la secuencia. 70 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC En la Figu a 5.6 emos como es á es uc u ado las líneas de los da os del iche o. Es á o mado po 8 campos (además de 2 campos más que son opcionales), en el cuál odas sus líneas es án delimi ados po abulado es. Los alo es pe didos es án especi icados po un “.”. A con inuación explica emos cada uno de los campos que es á es uc u ado dichas líneas:  CHROM (c omosoma): Con iene un iden i icado a pa i del genoma de e e encia o una cadena ID en e co che es que apun a a un “con ig” en el a chi o de ensamblado. Todas las en adas pa a un especí ico c omosoma deben o ma un bloque con iguo en el VCF.  POS: La posición de e e encia, con la p ime a base que iene la posición 1. Las posiciones son o denadas numé icamen e, en o den c ecien e, den o de cada secuencia de e e encia CHROM. Se pe mi e ene múl iples egis os con el mismo pun o de en a. Los elóme os x ii son indicados usando las posiciones 0 o N+, dónde N es la longi ud del co espondien e c omosoma o con ig.  ID: Iden i icado de la a ian e. Si se a a de una a ian e de ipo “dbSNP” se inci a a u iliza el/los núme o/s s. Sin iden i icado debe ía es a p esen e en más de un egis o de da os. Si no exis ie a ninguna iden i icación posible, se le asigna el alo pe dido po de ec o.  REF (base de e e encia): Cada base debe se uno de A, C, G, T, N. Se pe mi en múl iples bases. El alo en el campo POS se e ie e a la posición de la p ime a base de la cadena. Pa a inse ciones y deleciones en los que an o REF o uno de los alelos de ALT debe ían de o o modo se acíos/nulos, las cadenas REF y ALT deben inclui la base an es del e en o (debe e leja se en el Figu a 1.3 71 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC campo POS), a menos que el e en o se p oduzca en la posición 1 en el con ig en cuyo caso se debe inclui la base después del e en o.  ALT (base al e na i a): Las opciones son cadenas de bases o madas po las bases A, C, G, T, N o un iden i icado ID o una cadena al e na i a llamada “b eakend”. Si no hay alelos al e na i os, en onces se debe usa el alo pe dido.  QUAL: En campo se u iliza pa a asigna un alo de calidad con espec o al campo ALT. Las pun uaciones al as indican llamadas de al a con ianza.  FILTER: Es e campo end á el alo “PASS” si la posición ha pasado odos los il os, es deci , si se ha ealizado una llamada a es a posición. De lo con a io, si no se ha pasado odos los il os, se hace una lis a sepa ados po “;” de los il os que han sido us ados.  INFO: En es e campo se añade in o mación adicional si se equi e e. Es á codi icado como una se i e sepa ada po “;” con el o ma o “cla e = alo ”. 72 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC 14. Anexo 2: He amien as Adicionales. Exis en he amien as adicionales pa a se u ilizadas en el a amien o de iche os especí icos, aunque no es án elacionadas con alguna ase en pa icula en el lujo de análisis del ADN. Una de las he amien as que son imp escindibles pa a el a amien o con el ADN es el conjun o de paque es Sam ools/Pica d. Es os dos paque es se enca gan de la manipulación de los iche os en o ma o SAM y su co espondien e bina io BAM, e e en e al alineamien o de secuencias. Sam ools Es un conjun o de u ilidades que manipulan los alineamien os en el o ma o de BAM. Impo a y expo a a pa i del o ma o SAM (Sequence Alignmen / Map), la no clasi icación, la usión y la indexación, y pe mi e ecupe a lec u as en cualquie egión con apidez. [14] Sam ools es á diseñado pa a abaja en “s eam” (lec u a con inua). Conside a un a chi o de en ada "-" como la en ada es ánda (s din) y un a chi o de salida "-" como la salida es ánda (s dou ). Va ios comandos de se pueden combina con “pipes” x iii de Unix. Sam ools siemp e ale a de las salidas y los mensajes de e o a la salida de e o es ánda (s de ). También es capaz de ab i un BAM (no SAM) de a chi os en un FTP emo o o se ido HTTP si el nomb e de a chi o de BAM comienza con " p://" o "h p://". Sam ools comp ueba el di ec o io de abajo ac ual pa a el a chi o de índice y se desca ga á el índice sob e la ausencia. No ecupe a el a chi o de alineación en e o, a menos que le pidamos que lo haga. Una ez ins alada la he amien a, pod emos isualiza es e ipo de iche os de alineamien o de secuencias. Dicha he amien a posee di e en es opciones que amos a e a con inuación:  sam ools iew: Ex ae o imp ime odo o pa e de los alineamien os en el o ma o SAM o BAM. Si no se especi ica ninguna egión, se imp imi án odas las egiones; de lo con a io sólo alineamien os supe pues os de las egiones especi icadas se án mos adas. Un alineamien o se puede adminis a a ias eces si es la supe posición de a ias egiones. 73 Escuela de Ingenie ía In o má ica - ULPGC  sam ools so : O dena alineamien os po las coo denadas del ex emo izquie do.  sam ools index: Indexa el alineamien o o denado pa a acceso a lea o io ápido. Gene a un iche o en o ma o “.BAI”.  sam ools idxs a s: Recupe a e imp ime es adís icas en el iche o índice. La salida es á delimi ado po abulado es con cada línea que consis e en nomb e de la secuencia de e e encia, longi ud de la secuencia, lec u as mapeadas y lec u as no mapeadas.  sam ools me ge: Combina múl iples alineamien os o denados. La lis as de e e encias de cabece a de odos los a chi os de BAM de en ada, y los @SQ cabece as, si los hay, odos deben e e i se al mismo conjun o de secuencias de e e encia.  sam ools aidx: Indexa la secuencia de e e encia en el o ma o FASTA o ex ae una subsecuencia de la secuencia de e e encia indexada. Si no se especi ica ninguna egión, “ aidx” indexa á el a chi o y c ea < e . as a> en el disco. Si las egiones son especi icadas, las subsecuencias se ecupe a án y se imp imen po la salida es ánda en el o ma o FASTA. El a chi o de en ada puede se comp imido en el o ma o RAZF.  sam ools mpileup: Gene a BCF o “pileup” xix pa a uno a ios a chi os de BAM. Los egis os de alineamien o son ag upados po iden i icado es de mues a en @RG líneas de cabece a. Si los iden i icado es se encuen an ausen es, cada a chi o de en ada se conside a una mues a.  Sam ools iews: Viso de alineamien o de ex o (basado en la biblio eca ncu ses). O a he amien a que explica emos a con inuación se llama “VCFTools” diseñado pa a la manipulación de iche os VCF. VCFTools Es un paque e de p og amas diseñados pa a abaja con a chi os VCF, como los gene ados po el P oyec o 1000 genomas. El obje i o de