Estudio de microorganismos de la clase "Mollicutes" en organismos marinos

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE VETERINARIA INSTITUTO UNIVERSITARIO DE SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA TESIS DOCTORAL Estudio de microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos. Orestes Manuel Vega-Orellana LAS PALMAS DE GRAN CANARIA 2014 I. APITULO I I. Índices i II. ÍNDICE GENERAL I . ÍNDICE GENERAL .................................................................................................................. I II . ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................................. VII III. ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................. X IV. AGRADECIMIENTOS .......................................................................................................... XV V. RESUMEN ...................................................................................................................... XVII VI. ABSTRACT......................................................................................................................... XIX VII.ABREVIATURAS ................................................................................................................ XXI I. CAPÍTULO I: Introducción, Objetivos y Revisión Bibliográfica ......................................... 1 I.1 INTRODUCCIÓN.............................................................................................................. 1 I.2 OBJETIVOS ..................................................................................................................... 4 I.2.1 OBJETIVO GENERAL .............................................................................................. 4 I.2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................................... 4 I.3 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................. 5 I.3.1 MOLLICUTES ........................................................................................................... 5 I.3.1.1 Características generales .................................................................................... 5 I.3.1.2 Taxonomía y filogenia ......................................................................................... 7 I.3.1.3 Características ultraestructurales ........................................................................13 I.3.1.3.1 Estructura celular y cápsula ..........................................................................14 I.3.1.3.2 Membrana celular y estructura antigénica ......................................................15 I.3.2 TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MOLLICUTES ...........16 I.3.2.1 Procedimientos preliminares (Tully y Whitcomb, 1995; Ramírez, 1999) ................16 I.3.2.1.1 Cultivo puro ..................................................................................................16 I.3.2.1.2 Ausencia de pared celular .............................................................................17 I.3.2.1.3 Detección de formas L bacterianas ................................................................17 I.3.2.1.4 Morfología de las colonias .............................................................................17 I.3.2.1.5 Requerimientos de esteroles .........................................................................18 I.3.2.2 Métodos bioquímicos y enzimáticos ....................................................................18 I.3.2.2.1 Hidrólisis de la urea ......................................................................................19 I.3.2.2.2 Hidrólisis de azúcares ...................................................................................19 I.3.2.2.3 Hidrólisis de la arginina .................................................................................22 I.3.2.2.4 Actividad de la fosfatasa ...............................................................................23 Índices ii I.3.2.2.5 Reducción del Tetrazolium ........................................................................... 23 I.3.2.2.6 Formación de películas y cristales ................................................................ 24 I.3.2.3 Perfiles de proteínas totales ............................................................................... 25 I.3.2.4 Métodos serológicos .......................................................................................... 25 I.3.2.4.1 Inhibición de crecimiento .............................................................................. 25 I.3.2.4.2 Inhibición del metabolismo ........................................................................... 25 I.3.2.5 Inmunofluorescencia ......................................................................................... 26 I.3.2.6 Inmunohistoquímica .......................................................................................... 27 I.3.2.7 Métodos de biología molecular .......................................................................... 27 I.3.2.7.1 Reacción en Cadena de la Polimerasa – PCR .............................................. 27 I.3.2.7.2 Secuenciación de ADN ................................................................................ 28 I.3.2.7.3 PCR a tiempo real ........................................................................................ 30 I.3.2.7.4 DGGE.......................................................................................................... 30 I.3.2.7.5 Microarrays .................................................................................................. 31 I.3.2.7.6 Tipificación .................................................................................................. 32 I.3.3 HÁBITATS Y ENFERMEDADES.............................................................................. 36 I.3.3.1 Patogenicidad y factores de virulencia .......................................................... 39 I.3.3.2 Enfermedades más importantes producidas por mollicutes ............................ 40 I.3.4 MOLLICUTES Y ORGANISMOS ACUÁTICOS ........................................................... 45 I.3.4.1 Invertebrados .................................................................................................... 45 I.3.4.2 Peces ............................................................................................................... 50 I.3.4.2.1 Mycoplasma mobile ..................................................................................... 53 I.3.4.3 Mamíferos marinos ............................................................................................ 58 II. CAPITULO II: Estudio metodológico – Evaluación de la sensibilidad y especificidad de seis pares de cebadores utilizados en la detección e identificación de microorganismos de la Clase Mollicutes ................................................................................................................. 65 II.1 ANTECEDENTES ........................................................................................................... 65 II.2 MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................ 70 II.2.1 ORGANISMOS Y CONDICIONES DE CULTIVO ........................................................ 70 II.2.2 EXTRACCIÓN Y MEDICIÓN DE ADN ........................................................................ 70 II.2.3 CONFIRMACIÓN DE LA IDENTIDAD DEL ADN ........................................................ 74 II.2.4 COMPARACIÓN DE SEIS PARES DE CEBADORES (PCR’S). .................................. 75 II.2.5 PRUEBAS DE ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DE LAS PCR’S ............................ 75 Índices iii II.2.5.1 Pruebas de especificidad....................................................................................75 II.2.5.2 Pruebas de sensibilidad .....................................................................................76 II.2.6 PCR A TIEMPO REAL ...............................................................................................77 II.3 RESULTADOS ................................................................................................................78 II.3.1 ORGANISMOS Y ADN ...............................................................................................78 II.3.2 ESPECIFICIDAD........................................................................................................78 II.3.2.1 Mollicutes ..........................................................................................................78 II.3.2.2 Bacterias no-mollicutes ......................................................................................79 II.3.3 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD ...................................................................................81 II.3.4 CÁLCULO DE SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD .....................................................82 II.4 DISCUSIÓN ....................................................................................................................84 II.4.1 CEBADORES .. ………………………………………………………………………………...85 II.4.2 ESPECIES UTILIZADAS. ...........................................................................................87 II.4.3 MOLLICUTES……… ..................................................................................................89 II.4.4 BACTERIAS NO-MOLLICUTES .................................................................................92 II.4.5 SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD ............................................................................93 II.4.6 PCR A TIEMPO REAL ...............................................................................................95 III. CAPÍTULO III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos. ............99 III.1 ANTECEDENTES ...........................................................................................................99 III.1.1 MAMÍFEROS MARINOS ...........................................................................................99 III.1.1.1 Importancia y situación del estudio de mamíferos marinos...................................99 III.1.1.2 Origen de las muestras de mamíferos marinos utilizadas .................................. 101 III.1.1.2.1 Cetáceos ................................................................................................... 101 III.1.1.2.2 Pinnípedos de la Isla Decepción (Antártica) ................................................ 102 III.1.2 INVERTEBRADOS Y PECES MARINOS ............................................................... 103 III.1.2.1 Importancia y situación del estudio de invertebrados y peces marinos. .............. 103 III.1.2.2 Origen de las muestras de invertebrados y peces marinos utilizadas. ............... 104 III.1.2.2.1 Invertebrados marinos ............................................................................... 104 III.1.2.2.2 Peces ........................................................................................................ 105 III.2 METODOLOGÍA ............................................................................................................ 106 III.2.1 MATERIAL BIOLÓGICO. ......................................................................................... 106 III.2.1.1 Cetáceos ........................................................................................................ 106 III.2.1.2 Pinnípedos de la Antártica ............................................................................... 107 Índices iv III.2.1.3 Peces marinos ............................................................................................... 108 III.2.1.4 Invertebrados marinos .................................................................................... 109 III.2.1.4.1 Medusas ................................................................................................... 109 III.2.1.4.2 Cefalópodos .............................................................................................. 110 III.2.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS ............................................................... 110 III.2.2.1 Filtración y verificación del crecimiento bacteriano ............................................ 110 III.2.2.2 Clonación ........................................................................................................ 111 III.2.2.3 Mantención y almacenamiento de los cultivos .................................................. 111 III.2.3 TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR ............................................................... 115 III.2.3.1 Extracción de ADN ......................................................................................... 115 III.2.3.2 PCR (Polymerase Chain Reaction) a tiempo real ............................................. 115 III.2.3.3 PCR para secuenciación ................................................................................ 115 III.2.3.4 Secuenciación y análisis de las secuencias ..................................................... 119 III.2.3.5 DGGE (Denatured Gradient Gel Electrophoresis) ............................................ 120 III.2.4 PRUEBAS DE CRECIMIENTO (Cefalópodos) ........................................................ 121 III.2.5 PRUEBAS BIOQUÍMICAS .................................................................................... 121 III.2.6 ANÁLISIS HISTOLÓGICOS (Cefalópodos)............................................................. 122 III.3 RESULTADOS ............................................................................................................. 123 III.3.1 MAMÍFEROS MARINOS......................................................................................... 123 III.3.1.1 Cetáceos........................................................................................................ 123 III.3.1.2 Pinnípedos de la Antártica .............................................................................. 133 III.3.2 INVERTEBRADOS Y PECES MARINOS ................................................................ 141 III.3.2.1 Peces marinos ............................................................................................... 143 III.3.2.2 Invertebrados marinos .................................................................................... 145 III.3.2.2.1 Medusas ................................................................................................... 145 III.3.2.2.2 Cefalópodos ............................................................................................. 147 III.4 DISCUSIÓN ................................................................................................................. 163 III.4.1 DE LA METODOLOGÍA EMPLEADA ...................................................................... 163 III.4.2 DE LOS MAMÍFEROS MARINOS ESTUDIADOS .................................................... 165 III.4.2.1 Cetáceos......................................................................................................... 165 III.4.2.2 Pinnípedos de la Antártica .............................................................................. 171 III.4.2.2.1 Uso de la ISR y DGGE .............................................................................. 174 III.4.3 DE LOS PECES E INVERTEBRADOS MARINOS ................................................... 175 III.4.3.1 Peces ............................................................................................................. 175 Índices v III.4.3.2 Invertebrados .................................................................................................. 178 III.4.3.2.1 Medusas ................................................................................................... 178 III.4.3.2.2 Cefalópodos .............................................................................................. 180 IV. CAPÍTULO IV: Conclusiones ............................................................................................ 191 V. CAPÍTULO V: Anexos ....................................................................................................... 195 V.1 MOLLICUTES EN ORGANISMOS ACUÁTICOS ............................................................. 195 V.1.1 MOLLICUTES EN BRIOZOOS, CNIDARIOS Y CTENÓFOROS. .............................. 195 V.1.2 MOLLICUTES EN MOLUSCOS. .............................................................................. 196 V.1.3 MOLLICUTES EN CRUSTÁCEOS ........................................................................... 197 V.1.4 MOLLICUTES EN PECES ....................................................................................... 198 V.1.5 MOLLICUTES EN PINNÍPEDOS Y SIRÉNIDOS ...................................................... 200 V.1.6 MOLLICUTES EN CETÁCEOS ................................................................................ 202 V.2 PROTOCOLOS Y MATERIALES .................................................................................... 203 V.2.1 PROTOCOLO: Toma de muestras en cetáceos para la identificación de mollicutes... 203 V.2.2 MEDIOS DE CULTIVO............................................................................................ 204 V.2.2.1 Medio de colecta y transporte ........................................................................... 204 V.2.2.2 Medios de aislamiento: ..................................................................................... 204 V.2.2.2.1 FRIIS (Ross y Whittlestone, 1983) .............................................................. 204 V.2.2.2.2 PH (Kirchhoff y Rosengarten, 1984) ........................................................... 205 V.2.2.2.3 SP4-II (Ramírez et al., 1997). ..................................................................... 206 V.2.2.3 Medios para la caracterización bioquímica de mollicutes (Poveda, 1998) ........... 208 V.2.3 REACTIVOS Y SOLUCIONES.................................................................................. 210 V.2.3.1 Solución protectora para liofilización ................................................................. 210 V.2.3.2 Reactivos de la electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización ........... 210 V.2.4 EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN .............................................................. 210 V.3 PCR´S …….. ............................................................................................................ 212 V.3.1 PCR’S ESPECÍFICAS PARA LA DETECCIÓN DE MOLLICUTES. ............................ 212 V.3.1.1 Hotzel y colaboradores (2003). . ....................................................................... 212 V.3.1.2 Spergser y colaboradores (2002).. .................................................................... 212 V.3.1.3 Mc Auliffe y colaboradores (2005).. ................................................................... 213 V.3.1.4 Van Kuppeveld y colaboradores (1992)............................................................. 213 V.3.1.5 Botes y colaboradores (2005). .......................................................................... 214 Índices vi V.3.2 GENES RIBOSÓMICOS Y REGIONES INTERGÉNICAS. ........................................ 214 V.3.2.1 Yavari (2010). Gen ARNr 16S. ......................................................................... 214 V.3.2.2 Poveda (2012). Gen ARNr 23S. ..................................................................... 215 V.3.2.3 Ramírez y colaboradores (2008). ISR …… ....................................................... 216 V.3.2.4 Ramírez y colaboradores (2010). ISR2 …….. ................................................... 216 V.4 OTROS … .................................................................................................................... 217 V.4.1 ANTECEDENTES DE LOS CETÁCEOS UTILIZADOS. .......................................... 217 V.4.2 ALINEAMIENTO de la secuencia del gen ARNr 16S entero de “Candidatus Mycoplasma corallicola”, Myc-POTA 5H y Myc-PULPO PE. .............................................. 220 V.4.3 CORTES HISTOLÓGICOS DE POTA (Todarodes sagittatus). ................................ 221 V.4.4 COMUNICACIONES ORIGINADAS ....................................................................... 223 VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................... 225 Índices vii III. ÍNDICE DE TABLAS Tabla I-1: Diferencias entre mollicutes, bacterias y virus (Howard y Gourlay, 1978). ...................... 9 Tabla I-2 : Descripción de la Clase Mollicutes (Brown et al., 2010F) ............................................12 Tabla II-1: Especies de microorganismos de la Clase mollicutes utilizadas en la comparación de seis pares de cebadores de PCR’s utilizadas para esta clase. ..............................................71 Tabla II-2: Especies de bacterias no-mollicutes utilizadas en la comparación de seis pares de cebadores de PCR’s.. .........................................................................................................73 Tabla II-3: Pares de cebadores comparados, nombre y secuencia de los cebadores, tamaño del amplicón amplificado y su referencia. ..................................................................................76 Tabla II-4: Diluciones, unidades formadoras de colonias (UFC) y concentración de ADN de M. mycoides subsp. capri (Y-GOAT) (MMC) y Acholeplasma laidlawii (PG8) (ACO) utilizadas para las pruebas de sensibilidad de los seis pares de cebadores comparados. .....................81 Tabla II-5: Límite de las diluciones de ADN de M. mycoides subsp. capri (Y-GOAT) (MMC) y Acholeplasma laidlawii (PG8) (ACO) detectado por los seis pares de cebadores comparados y en dos PCR’s a tiempo real. ................................................................................................82 Tabla II-6: Especificidad, sensibilidad y valores predictivos para cada PCR utilizada para la detección de mollicutes (nivel de confianza de 95%) empleando el software win-epi 2.0 (de Blas, 2006), versión online del software win episcope 2.0 (Thrusfield et al., 2001).................83 Tabla III-1: Pares de cebadores utilizados para la amplificación del gen ARNr 23S (Poveda et al., 2012)................................................................................................................................ 119 Tabla III-2: Cetáceos varados en las Islas Canarias o Almería entre los años 2010-2013 utilizados en el estudio de identificación de mollicutes. ...................................................................... 126 Tabla III-3: Secuencia del gen ARNr 16S de Acholeplasma axanthum AJ311394 (93% - gen ARNr 16S) detectado en ojo y pulmón de un zifio de true, Mesoplodon mirus y su porcentaje de similitud con otras especies. .............................................................................................. 127 Tabla III-4: Secuencia de la ISR de Mycoplasma sp. Phocoena c-264-gen (97% -ISR) detectado en dos ejemplares de delfín listado, Stenella coeruleoalba (en mama y vulva en uno y en oído, ojo, pulmón, abertura genital y articulación artrítica, en el otro), y su porcentaje de similitud con otras especies. ........................................................................................................... 127 Tabla III-5: Secuencia del gen ARNr 16S de Mycoplasma sp. phocoena c-264-gen (99% - gen ARNr 16S) detectado en dos ejemplares de delfín listado, Stenella coeruleoalba (en mama y vulva Índices xiv Figura III-29: Alineamiento de la secuencia del gen ARNr 16S entero de dos muestras de pota 5H (branquias) y 6H (branquias). Su similitud es del 100%. Ambas especies fueron denominadas Myc-POTA. ...................................................................................................................... 155 Figura III-30: Alineamiento de la secuencia del gen ARNr 16S entero de Myc-POTA 5H y MycPULPO PE. Su similitud es del 98,6 %. ............................................................................ 157 Figura III-31: Alineamiento de la secuencia de la región intergénica entre los genes ARNr 23S y ARNr 5S (ISR2) entre Myc-POTA 5H y Myc-PULPO PE. ................................................... 158 Figura III-32: Árboles filogenéticos en base a las secuencias del gen ARNr 16S y con el método de Neighbor-Joining (1000 replicaciones), donde se muestra la posición de los micoplasmas aislados de cefalópodos Myc-PULPO y Myc-POTA representantes de los grupos filogenéticos y en el caso del grupo M. hominis, los representantes de sus “clusters”. En el recuadro se muestra un detalle de las especies más cercanas. ............................................................ 159 Figura III-33: Electroforesis en gel de DGGE de productos de una PCR específica para la clase Mollicutes basada en un fragmento del gen ARNr 16S (McAuliffe et al., 2005) provenientes de muestras tomadas en esófago (PE) y glándula digestiva (PG) de pulpo (Octopus vulgaris) (Myc-PULPO); y en branquias (5H y 6H) e intestino (7H) de dos potas (Todarodes sagittatus) (Myc-POTA). .................................................................................................................... 160 Agradecimientos xv V. AGRADECIMIENTOS Esta Tesis Doctoral no hubiera sido posible sin la participación de diversas personas que me han brindado apoyo y me han animado durante su ejecución y redacción. Aún a riesgo de olvidar a alguien me gustaría citar de manera muy especial: A mi madre María Orellana Ramírez y abuela Hilda Ramírez Quiroga, por todo el apoyo incondicional sentimental y logístico eterno para la realización de mis metas y vida!!! Más que gracias!!! A mi hermana Sara y familiares a distancia. A mis tutores Dr. José Bismarck Poveda Guerrero y Dra. Ana Sofía Ramírez Corbera por brindarme la oportunidad de estudiar todo el campo de la micoplasmología y ofrecerme los conocimientos y medios para la realización de este trabajo. Especialmente a Ana Sofía su apoyo incondicional y su inquebrantable optimismo, profesionalidad y gran amistad durante todos estos años. Gracias por haberme insertado en el rico mundo de la biología molecular y sus consejos y ayuda como tutora y amiga. A todos los grupos de investigación del IUSA y cada uno de sus integrantes, los que siempre me apoyaron cuando se los solicité. A Mercedes por su disponibilidad, buen humor y ayuda siempre. Al GIA el que, a través del Dr. Daniel Montero, Dr. Juan Stefanell y Dr. Juan Socorro, generosamente me cedió muestras de algunos de sus experimentos. A los grupos de Enfermedades Infecciosas y de Genética que no dudaron en cederme muestras o dejarme utilizar sus equipos cuando fue necesario. A Josué Díaz Delgado y a todo el equipo de cetáceos. Gracias a Ester, por su magnífica asistencia técnica, disponibilidad y experiencia. Agradecimientos xvi A dos grandes investigadores y hermanos de corazón, Rachid Ganga y Eneko Ganuza Taberna, su compañía, amistad y apoyo siempre han sido increíbles!!! Gracias!!!. A mis colegas de laboratorio y grandes profesionales y amigos: Carlos Poveda Turrado, Alejandro Suárez Pérez, Rubén Sebastián Rosales Santana, Borja Díaz Gutiérrez y Emmanuel Martín Díaz. En diferentes épocas pero todas llenas de trabajo, aprendizaje y amistad. A tod@s l@s “compis” que han estado siempre dándome su apoyo y compañía: Javi Roo, Silvia, Alex, Moneiba, Ada, Valentina, Lidia, Judith, Jimena, Fatma, Lita, Lorena, Belinda, Fatma Saara, Davinia, Ana, Manola, Andrea. A Carmen Quintana, una colega, amiga y gran técnico, por su apoyo durante las diferentes fases de mi doctorado. Gracias!!! A quienes fuera del trabajo han sido mi apoyo y compañía durante mi vida en Canarias, Jonatan Díaz Quintana, Fabio Fabres, Sergio Formoso, Borja, Jaime, Lukas, Mario Pérez, Francisco Vargas, mi primo Jojô, Ulises, José Tur, Carmelo, Miguel, Juan Pulpo, Néstor, Pablito, Remi Lender, Manolo; Vane, Nati, Yraida, Idaira, Bea, Carol, Chris, Janaina, Waldo, Meyling, Antía, Olga, Carola, Victor, Dudu, Manolo, Silvia Italiana, Andreja, familia Sambadailha, alumn@s de los gyms… y a la distancia: Adilson, Karine, Glaucya, Carola, Victor capitán, Adriana y much@s más.. .. Resumen xvii VI. RESUMEN La presente tesis describe el estudio de microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos. El primer capítulo corresponde a la justificación, a una revisión bibliográfica de las bases teóricas del estudio, así como sus objetivos propuestos. El segundo capítulo concierne a la elección de la pareja de cebadores de Van Kuppeveld y colaboradores (1992) para la detección de mollicutes a través de una PCR a tiempo real. Fueron escogidos por su adecuada especificidad y sensibilidad después de compararlos con otros cuatro pares de cebadores específicos para la detección de mollicutes indicados por otros autores. El tercer capítulo relata la metodología y resultados de la búsqueda de mollicutes en 72 cetáceos varados en el Archipiélago Canario entre los años 2010-2013, 80 pinnípedos de la Antártica (2010-2011), 112 peces de acuicultura o del medio natural, 12 grupos de 20 a 40 medusas y 9 cefalópodos. Para su detección e identificación fueron utilizadas técnicas rutinarias de cultivo de mollicutes y de genética molecular. El análisis de la secuencia entera o de fragmentos de los genes ARNr 16S y ARNr 23S, así como de la región intergénica entre ellos (ISR) fue una valiosa herramienta para la identificación taxonómica de las especies encontradas, cuando fue posible. En los cetáceos fueron identificadas cuatro especies de mollicutes: Mycoplasma sp. CSL7529-conjunctiva (99% - gen ARNr 16S) encontrada en un delfín común, Delphinus delphis; Mycoplasma sp. Phocoena C-264-GEN (97%- ISR), en dos delfines listados Stenella coeruleoalba; Mycoplasma sp. AB703210 (98%- gen ARNr 16S), en un cachalote pigmeo Kogia breviceps; y Acholeplasma axanthum AJ311394 (93%- gen ARNr 16S), en un zifio de True Mesoplodon mirus. Adicionalmente, fueron detectados mollicutes en: Balaenoptera borealis, Globicephala macrorhynchus, Stenella frontalis, Tursiops truncatus, Physeter macrocephalus, Mesoplodon europaeus y Ziphius cavirostris; sin embargo no fue posible su identificación específica debido a la poca cantidad de ADN disponible. En los pinnípedos de la Antártica fueron aisladas, cultivadas e identificadas seis especies de mollicutes: M. zalophidermidis (99% - ISR) y M. sp. CSL7529-conjunctiva (99% - ISR) en el lobo marino antártico Arctophoca gazella; M. sp. Resumen xviii Mirounga ES2805-ORL (99% - ISR) y M. sp. Mirounga ES2774-NASSP4 (91%- ISR) en focas de Weddell Leptonychotes weddellii; M. lipofasciens ATCC 35015 (78% - ISR) en focas de Weddell y en el elefante marino Mirounga leonina; y M. zalophi (99% - ISR) encontrado en las tres especies. En ninguno de los casos fue posible establecer algún tipo de relación entre la presencia de mollicutes y patologías presentes. Por otra parte, fueron detectados mollicutes en dos ejemplares de dorada Sparus aurata (branquia e intestino) pero no pudieron ser identificados ni cultivados. En las medusa Pelagia nocticula fue detectado un Spiroplasma sp., mientras que en el pulpo común (Octopus vulgaris) y en pota (Todarodes sagittatus) fueron detectadas, identificadas, aisladas y cultivadas dos especies de mollicutes nuevas, siendo denominadas Myc-PULPO y MycPOTA, respectivamente. Ambas están relacionadas entre sí pero son muy diferentes a las especies ya conocidas. Abstract xix VII. ABSTRACT The present thesis describes the study of microorganisms belonging to Mollicutes class in marine organisms. Chapter I consists of an updated literature review related to the theoretical basis of the study and its objectives. Chapter II explains the primers pairs (Van Kuppeveld et al., 1992) used to detect mollicutes using a real-time PCR technique. The latters were chosen based on their adequate specificity and sensitivity in comparison with four other counterparts specific to mollicutes detection as reported by other authors. Chapter III describes the methodology and results of the screening for mollicutes in 72 cetaceans stranded from Canary Islands during the period between 2010 and 2013, 80 Antarctic pinnipeds (2010-2011), 112 farmed or wild fish, 12 pool of 20 to 40 jellyfish, and 9 cephalopods, using microbiological routine culture and molecular biology techniques. The analysis of the entire or partial sequence of 16S rRNA and 23S rRNA genes, as well as the intergenic space region between the latters (ISR), was a valuable tool for the taxonomic identification of the species found, when it was possible. Therefore, in cetaceans, four species of mollicutes were identified including, Mycoplasma sp. CSL7529 conjunctiva (99% - 16S rRNA gene) found in a common dolphin, Delphinus delphis; Mycoplasma sp. Phocoena C-264-GEN (97% - ISR), two striped dolphins Stenella coeruleoalba; Mycoplasma sp. AB703210 (98% -16S rRNA gene), a pygmy sperm whale Kogia breviceps; and Acholeplasma axanthum AJ311394 (93% - 16S rRNA gene) in a True's beaked whale Mesoplodon mirus. In addition, mollicutes were also detected in Balaenoptera borealis, Globicephala macrorhynchus, Stenella frontalis, Tursiops truncatus, Physeter macrocephalus, Mesoplodon europaeus and Ziphius cavirostris ; however due to the limited amount of DNA material available, no further species identification was performed. Six mollicutes species were isolated, cultivated and identify in Antarctic pinnipeds including M. zalophidermidis (99% - ISR) and M. sp. CSL7529 - conjunctiva (99% - ISR) in Antarctic fur seal Arctophoca gazella ; M. sp. Mirounga ES2805 - ORL (99% - ISR) and M. sp. Mirounga ES2774 - NASSP4 (91% - ISR) in Abstract xx Weddell seals Leptonychotes weddellii ; M. lipofasciens ATCC 35015 (78% - ISR) in Weddell seals and elephant seals Mirounga leonina ; and M. zalophi (99% - ISR ) found in the three species. No relationship could not be established between the presence of mollicutes and pathologies in all the cases. Moreover, mollicutes were detected in gilthead seabream Sparus aurata (gill and intestine) but could not be identified or cultured. Similarly, Spiroplasma sp. was detected in jellyfish Pelagia nocticula. Interestingly, two new mollicutes species were detected, identified, isolated and cultured in common octopus (Octopus vulgaris) and squid (Todarodes sagittatus) and were called Myc-PULPO and Myc-POTA, respectively. Both latter species are related to each other, being very different from the known (published) species. Abreviaturas xxi VIII. ABREVIATURAS A: Adenina. ADN: Ácido desoxirribonucleico. ADNr: Ácido desoxirribonucleico ribosómico. ARN: Ácido ribonucleico. ARNr: Ácido ribonucleico ribosómico. ARNt: Ácido ribonucleico de transferencia. C: Citosina. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis): Electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización. g: Fuerza de gravedad. g: Gramo. G: Guanina. h: Hora. ISR (Intergenic space region): Región entre los genes ARNr 16S y ARNr 23S. ISR2: Región entre los genes ARNr 23S y ARNr 5S. M: Adenina o citosina. M: Molar. mA: Miliamperio. MC: Mycoplasma sp. CSL7529-conjunctiva. Abreviaturas xxii mg: Milígramo. min: Minuto. ml: Mililitro. ML: Mycoplasma lipofasciens ATCC 35015 (78%- ISR). mm: Milímetro. mM: Milimolar. MM1: Mycoplasma sp. Mirounga ES2805-ORL. MM2: Mycoplasma sp. ES2774-NASSP4 (91%- ISR). MZ: Mycoplasma zalophi MZD: Mycoplasma zalophidermidis pb: Pares de bases. PCR (Polymerase Chain Reaction): Reacción en cadena de la polimerasa. s: Segundo. UFC: Unidades formadoras de colônias. V: Voltios. W: Adenina o timina. Y: Citosina o timina. μl: Microlitro. μm: Micrómetro. μM: Micromolar CAPÍTULO I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 6 emplean azúcares o arginina como fuente principal de energía, aunque algunas especies pueden emplear ambas, o bien fuentes alternativas como piruvato y/o ácidos orgánicos. Por otra parte, el colesterol es un requerimiento para el crecimiento de algunos de estos microorganismos (Miles y Lee, 1983; Miles y Agbanyim, 1998; Brown et al., 2010F) A diferencia de otras bacterias, la mayoría de mollicutes presentan sólo una o dos copias de los genes ARN ribosómico (ARNr), encontrándose el caso excepcional del género Mesoplasma que presenta tres. El gen ARNr 5S es notablemente menor en número de nucleótidos, y el número de genes ARNt es menor al de otras bacterias. La ARN-polimerasa es resistente a la rifampicina y en algunos géneros el codón UGA codifica triptófano en lugar de ser una señal de terminación (Brown et al., 2010F). Estas bacterias pueden crecer en medios artificiales que les proporcionen esteroles y les satisfagan otros requerimientos nutricionales y físicos especiales. Las colonias formadas en estos medio de cultivo miden en su mayoría menos de 1 mm de diámetro y tienen el aspecto característico de “huevo frito” cuando se observan al microscopio (Figura VIII-1) debido a que la tendencia de la colonia es crecer penetrando en el medio sólido para después hacerlo superficialmente (Poveda,1998). La mayoría de los mollicutes son inmóviles, encontrándose como excepciones a todas las especies del género Spiroplasma (Trachtenberg, 2006; Wada y Netz, 2009; Yu et al., 2009), además de Mycoplasma (M.) pneumoniae (Bredt et al., 1970), M. gallisepticum (Erdmann, 1976), M. pulmonis, (Bredt y Radestock, 1977), M. genitalium, (Taylor-Robinson y Bredt, 1983), M. mobile (Kirchhoff et al., 1984) y M. amphoriforme (Hatchell et al., 2006). Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 7 Figura VIII-1: Colonias típicas en forma de “huevo frito” de Acholeplasma laidlawii (40X). I.3.1.2 Taxonomía y filogenia La taxonomía se ocupa de la clasificación de los seres vivos, es decir, de su nomenclatura y ordenamiento en taxones, mientras que la filogenia es la ciencia que estudia las relaciones evolutivas entre las distintas especies, reconstruyendo la historia de su diversificación desde el origen de la vida en la tierra hasta la actualidad (Tortora et al., 2007). El gen ARNr 16S es la macromolécula más ampliamente utilizada en estudios de filogenia y taxonomía bacterianas (Rosselló-Mora y Amann, 2001; Rodicio y Mendoza, 2004). Algunas de las razones por las que se utiliza son que: a) es una molécula muy antigua y está en todas las bacterias actuales; b) su estructura y función han permanecido sin alteraciones durante un tiempo prolongado, de manera que las alteraciones en su secuencia reflejan probablemente cambios aleatorios; c) su tamaño relativamente grande (~1500 nucleótidos) minimiza las fluctuaciones estadísticas; y d) su fácil secuenciación favorece que hayan bases de datos en continuo crecimiento (Rodicio y Mendoza, 2004). Otra característica por la que se considera un excelente marcador es Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 8 que entre las regiones conservadas en su gen se encuentran regiones variables que permiten detectar un amplio número de individuos filogenéticamente diversos. Por otro lado, la posibilidad de divergencia intragenómica por una posible transferencia horizontal de genes ribosómicos es prácticamente nula (Atlas y Philips, 2005). No obstante, el análisis del gen del ARNr 16S refleja la filogenia de los microorganismos, pero no su evolución (Rosselló-Mora y Amann, 2001). La aplicación del gen ARNr 16S como cronómetro molecular fue propuesta por Carl Woese a principios de los años `70 (Woese and Fox, 1977; Woese, 1987). Sus estudios originaron la división de los procariotas en dos reinos: Eubacteria y Archaeobacteria, así como sus divisiones mayores y subdivisiones. Desde entonces, y en paralelo con el desarrollo y perfeccionamiento de las técnicas de biología y genética molecular, el análisis del gen ARNr 16S se ha utilizado para establecer las relaciones filogenéticas entre especies bacterianas, incidiendo directamente en su clasificación e identificación así como en la determinación de su historia evolutiva (Rodicio y Mendoza, 2004). Dentro de este sistema se definió la especie bacteriana como el “conjunto de cepas que comparten una similitud del 70% ó más en experimentos de hibridación ADNADN”. Stackebrandt y Goebel (1994) afirmaron que cepas con este nivel de relación presentaban una identidad del 97% ó más entre sus genes ARNr 16S, de tal manera que aquellas que tuvieran valores menores era improbable que estuvieran relacionadas. Sin embargo, con el tiempo se observó que existían cepas que compartían una similitud menor del 50% en experimentos de hibridación y que eran clasificadas como especies diferentes, pero que presentaban una identidad del 99% al 100% en el referido gen. Rosselló-Mora y Amann (2001) sugieren que el gen ARNr 16S carece de resolución filogenética a nivel de especies, considerando especie procariota el grupo de organismos que muestran un elevado grado de similitud global y que difieren claramente de otras especies. Por ello, actualmente se recomienda que la identificación taxonómica sea polifásica, esto es, basada en criterios fenotípicos y al mismo tiempo en datos de Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 9 secuenciación genómica (Stackebrandt et al., 2002). Aunque se considera que el término especie polifásica es un sinónimo inadecuado del concepto fenético de especie (Rosselló-Mora, 2003). El caso de los mollicutes no es simple, ya que son un grupo de bacterias que ha creado controversia y confusión a la hora de establecer su identidad y estatus taxonómico. Hasta los años 30 se les consideró virus, ya que podían atravesar filtros que otras bacterias no lo hacían. Más de 50 años después se volvió a repetir el mismo error al considerarse como virus a mollicutes encontrados en pacientes con SIDA (Lo, 1986). En 1935, el descubrimiento de formas L o variantes en fase L (bacterias que han perdido entera o parcialmente la pared celular) de cultivos de Streptobacillus moniliformis (Klienenberger, 1935) creó una gran confusión respecto al estado taxonómico independiente de los mollicutes, lo que duró hasta finales de los años 60 cuando se introdujeron los primeros análisis genómicos (Razin, 1992). Posteriormente, se sugirió que podían estar clasificados entre los virus y las bacterias debido a algunas claras diferencias que existen entre los tres, aunque hasta ahora no se ha encontrado una razón de peso para ello (Tabla VIII-1). Tabla VIII-1: Diferencias entre Mollicutes, Bacterias y Virus (Howard y Gourlay, 1978). Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 10 Junto con el desarrollo y perfeccionamiento de las técnicas de biología molecular y el análisis secuencial del gen ARNr 16S fue posible caracterizar los mollicutes (Woese et al., 1980; Johansson et al., 1998), determinándose que forman un grupo coherente de organismos derivados de los clostridios (bacterias Gram Positivas), por evolución regresiva y reducción del genoma, produciéndose así células de vida libre y autoreplicantes menores y más simples (Woese et al., 1985; Trachtenberg, 1998). Basados en la filogenia del gen ARNr 16S la Clase Mollicutes fue en un comienzo situada en la división Firmicutes (Garrity et al., 2007), sin embargo, debido a estudios posteriores basados en marcadores genéticos alternativos (subunidad β de la ARN-polimerasa, chaperonina GroEL, algunas diferencias entre las aminoacils ARNtsintetasas y las subunidades F0F1-ATPasa) y a la ausencia de pared celular, fueron finalmente situados dentro de la División Tenericutes, quedando así registrado en la 2ª Edición del Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology de 2009 (Ludwig y Schleifer, 2005; Ludwig et al., 2009). Gracias a estudios filogenéticos, fisiológicos y de genética molecular ha sido posible reorganizar la taxonomía de la Clase Mollicutes (Tabla VIII-2) (Tully y Whitcomb, 1995; Brown et al., 2010F). De esta manera, ha sido dividida en cuatro órdenes subdivididos a su vez en familias, basadas en el hábitat, requerimientos de esteroles para crecer, tamaño del genoma y tolerancia al oxígeno (Freundt, 1955; Woese et al., 1980; Razin y Freundt, 1984; Weisburg et al., 1989; Razin, 1992; Nicolet, 1996). Adicionalmente, Neimark y colaboradores (2001) propusieron transferir algunos miembros de los géneros Haemobartonella y Eperythrozoon al género Mycoplasma. Por otra parte, filogenéticamente los mollicutes han sido divididos en cinco grupos: M. hominis, M. pneumoniae, Spiroplasma, Anaeroplasma y Asteroleplasma (Weisburg et al., 1989; Peters et al., 2008; Brown et al., 2010F) (Figura VIII-2). Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 11 Evolutivamente, el género Acholeplasma parece ser el más antiguo, cuya formación implicó la pérdida de la pared celular y una marcada reducción genómica. Son muy difícilmente distinguibles de Anaeroplasma, debido a que su gen ARNr 16S es muy similar, sin embargo, la condición anaerobia de este último permite su distinción (Weisburg et al., 1989). Las separación de los diferentes linajes de mollicutes a partir de Acholeplasma ha ido acompañada por alteraciones génicas traducidas en cambios estructurales (carácter helicoidal y motilidad en Spiroplasma) o bien, en posteriores reducciones genómicas más importantes, como en el caso de Mycoplasma. El género Mycoplasma es el que sin duda posee el mayor número de especies reconocidas (117 especies y 14 especies candidatas a la caracterización oficial hasta el año 2010), muchas de ellas consideradas patógenas para humanos, ganado (bovino, caprino y porcino) o aves. Debido a la descripción de nuevas especies su número aumenta cada año, por ejemplo: Mycoplasma haemolamae (Crosse et al., 2012) y M. neophronis (Suárez-Pérez et al., 2012). Los microorganismos clasificados a nivel taxonómico dentro de este género se encuentran divididos en tres de los grupos filogenéticos: grupo hominis (con los clústeres M. equigenitalium, M. bovis, M. lipophilum, M. synoviae, M. hominis, M. pulmonis, M. sualvi y M. neurolyticum) y grupo pneumoniae (con los clústeres M. fastidiosum, hemotrópico, M. pneumoniae, M. muris, y Ureaplasma) (Johansson y Pettersson, 2002) y el grupo Spiroplasma (Brown et al., 2010F). El número de especies de los restantes géneros de la Clase Mollicutes (Ureaplasma, Entomoplasma, Mesoplasma, Spiroplasma, Acholeplasma, “Candidatus Phytoplasma”, Anaeroplasma y Asteroleplasma) también está en constante crecimiento y es muy dinámico, bien por el descubrimiento de nuevas especies como por la reclasificación de otras ya descritas pero clasificadas erróneamente (Johansson et al., 1998; Neimark et al., 2001; Brown et al., 2010F). Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 12 Tabla VIII-2 : Descripción de la Clase Mollicutes (Brown et al., 2010F) Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 13 Figura VIII-2: Agrupación filogenética de la Clase Mollicutes (Wang et al., 2004B) Finalmente, se ha propuesto el género Hepatoplasma (Mollicutes, Mycoplasmatales) a partir de “Candidatus Hepatoplasma crinochetorum” un simbionte encontrado en ocho especies de isópodos terrestres (Wang et al., 2004B; Fraune y Zimmer, 2008; Leclercq et al., 2014). I.3.1.3 Características ultraestructurales Los mollicutes poseen solamente aquellos orgánulos y rutas metabólicas indispensables para su crecimiento y replicación. Así, su estructura se reduce a una membrana citoplasmática, una molécula bicatenaria circular de ácido desoxirribonucleico Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 14 (ADN), moléculas de ácido ribonucleico (ARN), ribosomas y gránulos citoplasmáticos (Figura VIII-3). Figura VIII-3: Esquema de la estructura celular de un mollicutes. (http://www.invivogen.com) No presentan orgánulos subcelulares organizados, como mitocondrias, ni tampoco membranas intracitoplasmáticas. La membrana citoplasmática es la única separación entre el citoplasma y el medio, siendo estructuralmente muy similar a las membranas celulares eucariotas. Corresponde a una estructura trilaminar compuesta por dos tercios de proteínas y un tercio de lípidos, principalmente fosfolípidos y glucolípidos, que junto con las primeras constituyen los determinantes antigénicos más importantes. Como no poseen pared celular, necesitan vivir en un entorno de elevada presión osmótica para equilibrar así su propia presión osmótica interna (Poveda et al., 2002). I.3.1.3.1 Estructura celular y cápsula A través de microscopía electrónica ha sido posible identificar algunas de las principales estructuras celulares de los mollicutes: su membrana celular de estructura bilaminar y el citoplasma, donde se pueden diferenciar los ribosomas y el material nucleico. Adicionalmente, el uso de esta técnica junto con la tinción de rojo rutenio, que tiñe específicamente mucopolisacáridos ha mostrado la presencia de una matriz Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 15 extracelular fibrilar o “cápsula” que presenta una estrecha relación con la membrana celular (Wilson y Collier, 1976; Minion y Rosenbusch, 1993). Esta cápsula ha sido observada en varias especies de los géneros Mycoplasma (por ejemplo: M. gallisepticum, M. hominis, M. hyopneumoniae, M. meleagridis, M. pneumoniae y M.synoviae, entre otras) y Ureaplasma (U. urealyticum) (Boatman y Kenny, 1971; Robertson y Smook, 1976; Rurangirwa et al., 1987). Su función no es totalmente clara (Minion y Rosenbusch, 1993), aunque se cree que puede desempeñar un rol en su patogenicidad, favoreciendo la adhesión de estas bacterias al tejido del hospedador (Robb, 1984), incrementando su toxicidad y/o eludiendo la respuesta inmune celular al dificultar o inhibir los procesos de fagocitosis (Rosenbusch y Minion, 1992, Marshall et al., 1995). I.3.1.3.2 Membrana celular y estructura antigénica Al igual que en otras células, la membrana celular de los mollicutes es una membrana permeable selectiva flexible y trilaminar que rodea el citoplasma. Está formada por una bicapa de fosfolípidos, por proteínas de membrana insertadas en ella y una pequeña porción de carbohidratos complejos en forma de glicoproteínas y glicolípidos (Kahane y Tully, 1976; Rottem y Kahane, 1993). La porción lipídica constituye un tercio de su composición y las proteínas, los otros dos restantes (Razin et al., 1998). A diferencia de las bacterias gram-negativas, en los mollicutes las proteínas se encuentran ancladas exclusivamente a la parte externa de la membrana y no en diferentes localizaciones dependiendo de su función. Una forma característica en que se encuentran dichas proteínas es como lipoproteínas que, al igual que los lipopolisacáridos en bacterias gram‐negativas, pueden modificar su secuencia e incrementar así la variabilidad antigénica de la bacteria, así como jugar un papel importante en la modulación de la respuesta inmune del hospedador (Chambaud et al., 1999). A pesar de que existe una gran variedad de proteínas de membrana sólo han sido descritas cuatro funciones: proteínas de transporte ABC, lipoproteínas con función estructural y proteínas Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 22 I.3.2.2.3 Hidrólisis de la arginina Esta capacidad hidrolítica la poseen algunas especies del género Mycoplasma, ya fermenten o no la glucosa. La hidrólisis de la arginina se produce por la acción de tres enzimas: arginina-deiminasa, ornitina-transcarbamilasa y carbamato-quinasa, hasta producir amoniaco, CO2 y ATP (Barile, 1983). Schimke y colaboradores (1966) describieron un método sencillo y práctico para comprobar esta acción hidrolítica. Está basado en la detección del amoniaco a través de la alcalinización del medio de cultivo. Para evitar que algunos tubos inoculados puedan mostrar un incremento de pH debido a efectos inespecíficos deben emplearse concentraciones muy bajas de suero de caballo, o incluso reemplazarlo con la fracción sérica bovina. De esta forma también se evita el excesivo efecto tampón que genera una gran cantidad de suero (Barile, 1983). Pese a lo anterior, el procedimiento preferido y recomendado para investigar la hidrolisis de la arginina es la determinación de la actividad arginina-deiminasa, basada en la formación de citrulina. Es empleado un medio de cultivo líquido, con pH 6,5, suplementado con arginina el cual muestra un color amarillo-naranja cuando se forma citrulina. Posteriormente, el cambio es medido por espectrofotometría a una absorbancia máxima de 490ηm (Archibald, 1944; Poveda, 1988). El sistema enzimático comentado ha sido estudiado en varias especies de bacterias (Cohen y Brown, 1960), y usado también para la caracterización de los mollicutes, iniciándose con las investigaciones de Smith (1955) sobre micoplasmas uretrales humanos. Posteriormente, Schimke y Barile (1963), Barile y Schimke (1963) y Barile y colaboradores (1966) llegaron a categorizar las especies del género Mycoplasma, como arginina positivos y arginina negativos, clasificación que en la actualidad tiene una importante vigencia (Barile, 1983). Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 23 I.3.2.2.4 Actividad de la fosfatasa La actividad fosfatásica está presente en aproximadamente un tercio de las especies conocidas del género Mycoplasma y puede ser observada a través de procedimientos relativamente simples. Es utilizada en conjunto con otras pruebas bioquímicas en la investigación preliminar de una especie desconocida, permitiendo reducir el número de pruebas serológicas necesarias para establecer su identidad. Sin embargo, esta prueba no tiene valor práctico en la investigación de las especies del género Acholeplasma, exceptuando a A. laidlawii que posee esta propiedad de manera muy limitada (Williams y Wittler, 1971); ni en cepas del género Ureaplasma todas las cuales son positivas a esta prueba (Black, 1973). Por otra parte, la actividad de la fosfata también puede ser determinado a través del método basado en la acción que tiene la fosfatasa producida por los microorganismos sobre el difosfato de fenolftaleína del medio de cultivo sólido (Aluotto et al., 1970). Por la acción hidrolítica de la enzima, se libera la fenolftaleína, siendo fácilmente detectable por la aparición de un color rojo-violeta en presencia de álcalis (pH entre 9 y 10) después de siete días de incubación (Freundt et al., 1979). La hidrólisis del difosfato de fenoftaleína puede ser determinada tanto en medio líquido como en sólido. Para evitar resultados falso-positivos y/o dudosos es aconsejable calentar el suero de caballo y el extracto de levadura (1 h a 60 ºC) con el fin de inactivar su posible actividad fosfatásica (Bradbury, 1983). I.3.2.2.5 Reducción del Tetrazolium La habilidad de reducir el 2,3,5-trifenil-tetrazolium, dando una coloración rojiza al medio, es una característica de numerosas especies del género Mycoplasma, y de un gran valor en la identificación presuntiva de M. pneumoniae en los procesos clínicos Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 24 humanos, ayudando también en la identificación al elegir los antisueros que deben ser utilizados en su tipificación serológica. La técnica de Erno y Stipkovits (1973), demostró la actividad reductora, agregando al medio líquido el 2,3,5-trifenil-tetrazolium a una concentración de 0,2%. La inoculación de los tubos con el organismo objeto de estudio se hace por duplicado, incubándose uno en aerobiosis y el otro en anaerobiosis durante dos semanas. La reacción se considera positiva si aparece un precipitado rojizo en alguno de los tubos. La densidad de cultivo utilizada puede influir en los resultados obtenidos (Senterfit, 1983). Aluotto y colaboradores (1970) bien como Woods y Smith (1972) adaptaron este método para utilizarlo en cultivos hechos en medio sólido, siendo así más rápido e independiente de la densidad de cultivo y de la cantidad de inóculo. Después de tres o cuatro horas de incubación puede observarse el color rosa inicial que virará a rojo púrpura. I.3.2.2.6 Formación de películas y cristales Hay mollicutes que después de unos días creciendo en medio sólido desarrollan una película característica y cristales alrededor de las colonias. La película está formada por colesterol y fosfolípidos, mientras que los cristales se atribuyen a depósitos de sales de calcio y magnesio procedentes de los ácidos grasos que son liberados por la actividad lipolítica de estos microorganismos. La intensidad de ambas reacciones depende del organismo en cuestión y de la composición del medio de cultivo (Freundt, 1983). Este fenómeno fue descrito por primera vez por Edward en 1950, empleando un medio que contenía un 20% de suero de caballo, observación corroborada más tarde por (Fabricant y Freundt, 1967), quienes obtuvieron también un gran número de reacciones positivas en medios enriquecidos con suero de cerdo y emulsión de yema de huevo al 10%. Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 25 Si se trabaja con medios que contienen suero de caballo y emulsión de yema de huevo, existe también la posibilidad de detectar si se produce actividad proteolítica. En caso positivo, aparecerán unas zonas adyacentes al área de crecimiento de las colonias. Este fenómeno es muchas veces transitorio y puede estar o no asociado con la producción de películas y cristales (Freundt, 1983). Es necesario señalar que este fenómeno carece de valor diagnóstico significativo, pero es interesante notar que algunos mollicutes no producen tales reacciones bajo las condiciones de prueba. I.3.2.3 Perfiles de proteínas totales El conjunto de proteínas celulares es extraído y sometido a electroforesis, unidimensional o bidimensional en un gel de poliacrilamida que contiene también el agente desnaturalizante dodecilsulfato sódico (SDS). De esta forma se obtienen perfiles característicos que sirven para el agrupamiento de las cepas objeto de estudio (Kersters et al., 1994) I.3.2.4 Métodos serológicos I.3.2.4.1 Inhibición de crecimiento Es realizada en un medio sólido y está basada en una reacción antígenoanticuerpo específica en la que se produce la lisis del microorganismo sin mediación del complemento. La capacidad del antisuero de inhibir el crecimiento del microorganismo se observa por medio de un halo de inhibición superior a 2 mm alrededor de un disco inerte impregnado con él (Poveda y Nicholas, 1998). I.3.2.4.2 Inhibición del metabolismo Corresponde a un procedimiento alternativo a la inhibición de crecimiento, realizado en medio líquido y especialmente útil para organismos aislados que no crecen Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 26 bien en medio sólido. Está basado en los cambios de pH que se originan cuando son metabolizados los sustratos usados como fuentes de nutrientes en los medios de cultivo. Adicionalmente, son complementados con indicadores que cambian de color de acuerdo al pH del medio. La correspondencia antígeno-anticuerpo produce la lisis de los microorganismos que no utilizan el sustrato en cuestión, previniendo así el cambio de color del medio (Poveda y Nicholas, 1998). I.3.2.5 Inmunofluorescencia Los procedimientos de inmunofluorescencia en la identificación de mollicutes fueron introducidos por Del Giudice et al. (1967). Una de sus principales aplicaciones es la tipificación serológica de los microorganismos obtenidos directamente en un primer aislamiento. La gran ventaja es que pueden ser detectadas e identificadas especies que pueden estar mezcladas con otras. Otras ventajas adicionales son: que excluyen la necesidad de utilizar cultivos puros; la relativa facilidad con que un número de micoplasmas puede ser identificado secuencialmente en la muestra a investigar; la posibilidad de detectar microorganismos que están presentes minoritariamente en una muestra; y que aseguran la pureza de los cultivos mediante clonajes sucesivos (Gardella et al., 1983). Estas técnicas, directas o indirectas, están basadas en el marcaje de las inmunoglobulinas específicas presentes en los antisueros usando un fluorocromo del tipo del isotiocianato de fluoresceína. El proceso de marcaje o de conjugación suele ser complicado puesto que exige no sólo el fraccionamiento proteico mediante sales neutras u otros sistemas para la extracción de los anticuerpos del suero, sino también una posterior diálisis y la conjugación propiamente tal con el fluorocromo en cuestión (Poveda, 1988). En los procedimientos directos se adiciona una pequeña cantidad de inmunoglobulinas marcadas sobre bloques de agar que contienen las colonias en Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 27 estudio. Posteriormente, son incubados y se realizan varios lavados con tampón PBS. Son depositados en un portaobjetos y observados en un microscopio de epifluorescencia, utilizando un objetivo débil para la localización de colonias y luego un objetivo apocromático de 40x (Freundt et al., 1979). El método directo es similar al indirecto, aunque esté último dispone de un tercer elemento: un suero antiglobulinas de la especie, conjugado con el fluorocromo. Se considera que este método es más sensible y específico que los directos (Rosendal y Black, 1972). I.3.2.6 Inmunohistoquímica Este tipo de prueba permite la determinación de la localización de los microorganismos en los tejidos afectados a través del uso de anticuerpos monoclonales y policlonales (Rodríguez et al., 1998). I.3.2.7 Métodos de biología molecular I.3.2.7.1 Reacción en Cadena de la Polimerasa – PCR La reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction – PCR) es una técnica de biología molecular cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular partiendo de un mínimo. Esta técnica consiste en utilizar pequeñas secuencias de ADN (cebadores o primers) que limitan áreas del genoma a ser copiadas y se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse las polimerasas para que vuelvan a duplicarlas (Bartlett y Stirling, 2003). Las fases de una PCR son: Fase de inicio (Initialization step) para activar la enzima; desnaturalización (denaturation) al separarse las doble cadenas Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 28 de ADN; alineamiento (annealing) cuando se unen los cebadores a la cadena de ADN; extensión o elongación de la cadena (extension/elongation) cuando son realizadas copias del fragmento de ADN deseado; y la fase de elongación final (final elongation) en la que se completan todas las copias inconclusas (Biau, 1997). I.3.2.7.2 Secuenciación de ADN La secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuyo objetivo es la determinación del orden de los nucleótidos (Adenina, Citosina, Guanina y Tirosina) en un oligonucleótido de ADN. El desarrollo de esta técnica ha acelerado significativamente la investigación y permitido importantes descubrimientos biológicos en diversas áreas como taxonomía, filogenia, estudios poblaciones, heredabilidad de caracteres, etc. Fue desarrollada en la década de los ’70 y con el tiempo sufrió un gran desarrollo, pasando de ser una técnica manual y lenta a ser una totalmente automatizada, con secuenciadores automáticos que pueden analizar gran número de muestras en poco tiempo, permitiendo incluso la secuenciación de genomas completos de microorganismos, plantas y animales (Prescott et al., 2004; Hall, 2007). Actualmente, existen bases de datos vía online que alojan todas las secuencias genómicas que han sido determinadas en estudios de genética, siendo abiertas y accesibles para cualquier investigador. Todas ellas están integradas en la International Nucleotide Sequence Database Collaboration donde se encuentran: DNA DataBank of Japan - DDBJ de Japón; el European Molecular Biology Laboratory – EMBL (Europa); y el GenBank del National Institutes of Health – NIH (U.S.A.). Esta última está disponible junto con la base de datos RefSeq en la página del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/). La secuenciación de productos de PCR ha sido aplicada a la caracterización y clasificación filogenética de los organismos, entre ellos, los mollicutes (Hopert et al., 1993; Uphoff y Drexler, 2002; McAuliffe et al., 2003). La secuencia más utilizada es la del gen ARNr 16S (gen que codifica el ARN ribosómico) que se ha mostrado como una Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 29 excelente herramienta taxonómica en bacterias y a través de la cual se han redefinido las relaciones filogenéticas que con anterioridad eran dependientes de pruebas relacionadas con metabolismo celular. La explicación es que tal secuencia abarca regiones altamente conservativas y otras muy variables que pueden usarse para diferenciar géneros y especies (Göbel et al., 1987; Rodicio y Mendoza, 2004). El estudio de este gen ha llevado a la detección e identificación de varias especies de bacterias (Deng et al., 1992). En el caso particular de procariotas, el loci del ADNr contiene los genes que codifican los tres tipos de subunidades estructurales de sus ribosomas: 16S, 23S y 5S. Estos genes están separados entre sí por regiones de distinto tamaño y secuencia dependiendo del género y especie de la bacteria. Dentro de ellas, la región intergénica (Intergenic Spacer Region - ISR) entre los genes ARNr 16S y 23S es la más variable y últimamente ha sido utilizada para establecer relaciones filogenéticas entre microorganismos muy próximos, presentando la ventaja de que al encontrarse entre genes altamente conservados es posible amplificarla en prácticamente cualquier microorganismo utilizando cebadores universales (Rodicio y Mendoza, 2004). La ISR ha sido utilizada para identificar especies de mollicutes que poseen el gen ARNr 16S muy similar (Ej. M. auris vs M. alkalescens: 98,8% de similitud) (Harasawa, 1996; Tang et al., 2000; Volokhov et al., 2006; Ramírez et al., 2011; Rebelo et al., 2011). Sin embargo, existen especies de mollicutes que tienen un alto grado de similitud como es el caso de M. canadense y M. arginini que poseen porcentajes de similitud entre ellos de 99% y 96,9% para el gen ARNr 16S y la ISR, respectivamente; por lo que se ha conseguido diferenciar ciertas especies basándose en el ARNr 23S (Hotzel et al., 2003; Ramírez et al., 2008B; 2012). Actualmente, se intenta discernir si la comparación entre diferentes especies de la región comprendida entre los genes ARNr 23S y 5S podría aportar información de utilidad en la comparación entre especies (Ramírez et al., 2010). Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 30 I.3.2.7.3 PCR a tiempo real De manera adicional, se ha trabajado en la creación y adaptación de protocolos de PCR a tiempo real (real-time PCR), debido a que es una técnica más sensible y específica que la PCR convencional, y al mismo tiempo puede dar información cuantitativa del ADN replicado (Baczynska et al., 2004; Dubosson et al., 2004; Rebelo et al., 2011). Básicamente, la técnica consiste en el uso de un fluorocromo (ej. SYBR Green) o sonda marcada con un fluoróforo que aumenta su emisión cada vez que se acopla a uno o más productos específicos de ADN replicados, permitiendo medir su tasa de generación y tener resultados cuantitativos (Stirling, 2003). I.3.2.7.4 DGGE Otro avance que es necesario destacar es la estandarización de la Electroforesis en Gel con Gradiente de Desnaturalización (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis – DGGE), una técnica de trazado molecular consistente en la separación de las cadenas complementarias de ADN bicatenario dependiendo de su punto de desnaturalización (McAuliffe et al., 2003; 2005). Fue desarrollada en un principio para detectar mutaciones puntuales en las secuencias de ADN (Fischer y Lerman, 1983; Lerman y Beldjord, 1999), y después modificada y aplicada al análisis de poblaciones bacterianas, a través del análisis de los perfiles de fragmentos amplificados de sus genes ribosómicos (Muyzer et al., 1993). Esta técnica está basada en que un fragmento de ADN de doble cadena puede ser desnaturalizado por medios físicos (temperatura) o químicos (urea o formamida). Tal punto de desnaturalización aumentará con el tamaño y composición de la secuencia de nucleótidos que la conforman, aumentando con altos contenidos de guanina (G) y citosina (C). Cuando un fragmento de ADN se desnaturaliza su migración en un gel de electroforesis se detiene o se vuelve más lenta. En forma práctica, se utiliza un gel con gradiente de desnaturalización durante la migración de los fragmentos. Mediante esta técnica es posible convertir estados iniciales de ADN de doble cadena en estados de cadena sencilla desnaturalizada en algún punto de la migración para fragmentos de tamaño y secuencia específicos (Lerman y Beldjord, 1999). Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 31 McAuliffe y colaboradores (2003 y 2005) aplicaron esta técnica en la diferenciación de 67 especies de mollicutes y demostraron su utilidad y grado de especificidad, consiguiendo incluso diferenciar especies cuyo porcentaje de similitud basado en el gen ARNr 16S era de 98 % (Jensen et al., 2003). Esta técnica permitió la identificación y diferenciación de mollicutes aviares encontrados en especies silvestres muestreadas en la isla de Gran Canaria, permitiendo la discriminación de las diferentes especies a través de esta técnica. Debido a que cada especie presente daba como resultado una única banda en el gel de DGGE también fue posible conocer la presencia de más de una especie de mollicutes en las muestras, sin necesidad de cultivarlas o clonarlas (Suárez Pérez, 2012). Sin embargo, existen especies cuyo perfil de DGGE es idéntico como el caso de los micoplasmas aviares M. columbinum y M. columbinasale aislados en palomas, pero que mostraban una similitud de sólo 84% de la ISR. Otras especies con perfil similar son: M. gatae aislado en gatos y M. phocicerebrale aislado en mamíferos marinos; M. maculosum aislado en cánidos y M. leopharyngis aislado en leones; así como los micoplasmas caninos M. canis y M. edwardii (McAuliffe et al., 2005). Los análisis previos de la secuencia del gen ARNr y de la ISR en estas especies mostró que poseían un alto grado de similitud genómica (Pettersson et al., 2000; Chalker y Brownlie, 2004) Actualmente, la DGGE es usada en conjunto con criterios fenotípicos para identificar organismos (identificación polifásica) (Stackebrandt et al., 2002). I.3.2.7.5 Microarrays El último avance en la detección e identificación de mollicutes es el desarrollo de chips de microarrays (Volokhov et al., 2006; Schnee et al., 2012). Esta técnica utiliza un chip en cuya superficie se muestra una colección de fragmentos de ADN (sondas específicas de los genes a estudiar). La muestra de ADN a ser analizada (molécula diana) es puesta sobre este chip y es leída su fluorescencia, observando así el nivel de Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 38 Las infecciones por micoplasmas normalmente son leves y de naturaleza crónica. Las tres localizaciones más comunes en los humanos y animales son el tracto respiratorio (neumonía, aerosaculitis y sinusitis), el digestivo, el genitourinario (abortos, vaginitis, vesiculitis seminal, infertilidad), las glándulas mamarias (mamitis) y las articulaciones (artritis) (Weisburg et al., 1989; Yoder, 1990; Razin et al., 1998; Brown et al., 2010I). Las enfermedades producidas por micoplasmas son de carácter multifactorial, desarrollándose si están presentes otros factores como infecciones recurrentes, hacinamiento de animales y personas, condiciones climáticas inadecuadas, edad, constitución genética y/o estrés, entre otros (Rosendal, 1988; DaMassa et al., 1992). Adicionalmente, estas bacterias pueden actuar como inmunodepresores permitiendo la entrada y desarrollo de otras enfermedades (Weisburg et al., 1989; Neimark et al., 2001). Al igual que los micoplasmas, los representantes del género Ureaplasma pueden ser comensales o patógenos oportunistas aunque sólo en hospedadores vertebrados, principalmente aves y mamíferos (primates, ungulados y carnívoros) (Robertson y Taylor-Robinson, 2010). Por su parte, los géneros Eperythrozoon y Haemobartonella comprenden especies hemotrópicas que pueden infectar mamíferos, incluyendo humanos; produciendo anemia crónica entre otros síntomas (Brown et al., 2010G; 2010H). Los representantes de los géneros Entomoplasma y Mesoplasma, entretanto, han sido aislados de artrópodos (insectos) y plantas, no existiendo evidencias de su patogenicidad, por lo que se ha asumido que son parte de su población bacteriana inocua (Brown et al., 2010D y 2010E). Por otra parte, mollicutes del género Spiroplasma han sido aislados de la superficie de las flores y otras partes de plantas, así como del tracto digestivo y hemolinfa de varios insectos y crustáceos. También han sido aislados en fluidos de plantas vasculares (savia del floema) y de los insectos que se alimentan de ellos. Algunas especies son patógenas de plantas o insectos (Williamson et al., 2010). Otras especies patógenas de plantas e insectos son los fitoplasmas (género Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 39 “Candidatus Phytoplasma”), afectando el rendimiento de algunos cultivos en todo el mundo (Oshima et al., 2013). El género Acholeplasma, por su parte, corresponde a especies saprófitas, encontradas en el suelo, materia orgánica en descomposición y aguas residuales; o bien como especies comensales de vertebrados, insectos o plantas. Hasta hace pocos años se creía que ninguna especie de este género podía actuar como patógeno primario, sin embargo, existen dos estudios mostrando que Acholeplasma (A.) axanthum actúa como patógeno en polluelos y embriones de gallina; mientras que A. laidlawii puede causar alteraciones en la organización ultraestructural del arroz (Chernov et al., 2012). Se ha observado, además, que pueden causar efectos citopáticos en cultivos celulares. Este género posiblemente es el más común de los mollicutes encontrados en vertebrados, localizándose frecuentemente en su tracto respiratorio superior y en el urogenital (Brown et al., 2010C). Los géneros correspondientes a la familia Anaeroplasmataceae (Anaeroplasma y Asteroleplasma) se encuentran en el rumen de ovinos y bovinos y no existen evidencias de que sean patógenos (Brown et al., 2010B). El género Hepatoplasma, con su representante “Candidatus Hepatoplasma crinochetorum” es un simbionte encontrado en ocho especies de isópodos terrestres (Wang et al., 2004B; Fraune y Zimmer, 2008; Leclercq et al., 2014) I.3.3.1.1 Patogenicidad y factores de virulencia A pesar de que existe una clara asociación entre algunos mollicutes y ciertas enfermedades aún no existe mucha información sobre los mecanismos exactos que influyen en su patogenicidad. Uno de los factores de patogenicidad observados deriva de la dependencia nutricional y metabólica que presentan los mollicutes. La necesidad de estar en estrecho contacto con las células del hospedador ha llevado al desarrollo de estructuras u Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 40 orgánulos especializados de ensamblaje o proteínas variables de superficie (Balish, 2006; Balish y Krause, 2006). Algunas especies no solo se adhieren a las células del hospedador sino que también pueden invadirla y penetrarla parcialmente (ej. M. penetrans) (Lo et al., 1992). Ahora bien, la producción de productos tóxicos propios del metabolismo de estas bacterias (peróxido de hidrógeno y radicales superóxido) pueden causar un daño oxidativo en la membrana de las células del hospedador a las cuales se han adherido (Almagor et al., 1984; 1986; Razin, 1991). Otros posibles factores de patogenicidad son: a) la presencia de ureasas, que podrían producir amoniaco; b) la presencia de la fosfolipasa A2 en Ureaplasma spp., lo que influenciaría el metabolismo de la prostaglandina y podría generar problemas durante la gestación (Razin et al., 1998); c) la capacidad de fusionarse parcialmente con las células hospedadoras, incrementado así el daño causado por los radicales superóxido (Wang et al., 1993); y, por último, d) la composición de la cápsula externa de polisacáridos que podría reducir la capacidad de fagocitosis del organismo hospedador, favoreciendo así la colonización bacteriana (Marshall et al., 1995). I.3.3.1.2 Enfermedades más importantes producidas por mollicutes I.3.3.1.2.1 Animales importantes en veterinaria: I.3.3.1.2.1.1 Aves Los principales mollicutes patógenos de aves conocidos son aquellos que afectan la producción avícola. Se destacan tres especies: a) M. meleagridis que produce cuadros de aerosaculitis así como alteraciones musculo-esqueléticas y reproductivas en pavos (Kleven, 1998); b) M. synoviae, que ataca varias especies de aves causando procesos sinovíticos infecciosos y procesos respiratorios (Stipkovits y Kempf, 1996); y c) M. gallisepticum, que produce una enfermedad crónica respiratoria en gallináceas y la Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 41 sinusitis en pavos (Kleven, 1998). La acción de estos patógenos produce un impacto negativo y pérdidas en la avicultura industrial (Mohammed et al., 1987; Bradbury, 2005). Adicionalmente, se ha identificado otras dos especies que igualmente presentan características citopatogénicas, aunque aparecen con menor frecuencia: M. iowae (AlAnkari y Bradbury, 1996) y M. pullorum (Moalic et al., 1997). Finalmente, también se ha comprobado que puede existir transmisión de estos agentes patógenos entre aves silvestres y domésticas, asunto que todavía es objeto de estudio (Poveda et al., 1990; Lierz et al., 2000; Luttrell et al., 2001). I.3.3.1.2.1.2 Carnívoros (perros y gatos) En perros y gatos han sido encontrados varios mollicutes representantes del género Mycoplasma y Acholeplasma, formando parte de la población bacteriana usual en el tracto respiratorio superior y en el genital, y muy pocas de ellas han sido asociadas a algún tipo de patología. En general, en perros están asociadas a infecciones en el tracto urinario y a prostatitis, epididimitis y orquitis; en gatos, con conjuntivitis, enfermedades del tracto respiratorio superior y piotórax; mientras que en ambas especies se asocian a procesos de bronconeumonía, infecciones (abcesos) del tejido blando y piel, meningoencefalitis y poliartritis (Sykes, 2014). En perros se ha identificado M. canis, un patógeno oportunista asociado con cuadros de neumonía, uretritis, cistitis, infertilidad y complicaciones durante la gestación, (Chalker, 2005); además de relacionarse con meningoencefalitis granulomatosa y meningoencefalitis necrotizante (Barber et al., 2012). Su transmisión es por vía sexual o aerosol. Hay que destacar que esta especie también ha sido identificada en procesos de neumonía en humanos inmunodeprimidos (Armstrong et al., 1971). Sin embargo, los micoplasmas que actúan como patógenos directos en canes son M. cynos y el hemoplasma M. haemocanis. El primero es causante de neumonía, bronquitis e incluso, aunque más raramente, cistitis y es transmitido por aerosol (Rosendal y Vinther, 1977); mientras que el segundo puede localizarse en la sangre del hospedador y producir Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 42 anemia hemolítica, transmitiéndose a través de la picadura de garrapatas (Brown et al., 2006F). Por otra parte, se encontraron indicios que indicaban la presencia de Mycoplasma y Ureaplasma spp. en el semen y la orina de individuos que presentaban epididimitis purulenta e infertilidad (L’Abee-Lund et al., 2003) y M. spumans y M. edwardii en cuadros de poliartritis en ejemplares inmunodeprimidos. Esta última especie también fue identificada en el cerebro de un can de seis semanas que presentaba convulsiones (Ilha et al., 2010). El papel de los mollicutes encontrados en estos casos todavía no está claro, debido a que los hospedadores se encontraban inmunodeprimidos por otras infecciones lo que podría haber permitido su desarrollo (Sykes, 2014). Igualmente, en gatos han sido encontrados Mycoplasma spp. asociados a conjuntivitis y a enfermedades del tracto respiratorio superior, así como queratitis ulcerativa, aunque en esta última enfermedad se cree que puedan tener un papel secundario, desarrollándose una vez que el hospedador está inmunodeprimido debido a infecciones por herpevirus 1 (FHV1) (Sykes, 2014). En gatos, además, también se encuentra una especie de hemoplasma: M. haemofelis que, al igual que su homólogo en canes, produce anemia hemolítica y tiene como vía de transmisión la picadura de pulgas (Woods et al., 2005). La segunda especie patógena importante en gatos domésticos es M. felis, el que está asociado con conjuntivitis, rinitis, queratitis ulcerativa, artritis y poliartritis (Liehmann et al., 2006) y meningoencefalitis (Beauchamp et al., 2011). Hasta ahora su modo de transmisión aún no está totalmente claro. Además, esta especie también fue aislada del líquido sinovial de un humano inmunocomprometido (Lemcke, 1979). Finalmente, M. gateae, al igual que M. felis, ha sido relacionado con poliartritis (Liehmann et al., 2006). Por último, hay que destacar que han sido identificadas nuevas especies de hemoplasmas: “Candidatus Mycoplasma haemominutum” y “Candidatus Mycoplasma turicensis” en gatos y ““Candidatus Mycoplasma haemoparvum” en perros que han sido asociadas también a cuadros de anemia, aunque todavía su identificación y rol son objeto de estudio (Sykes y Tasker, 2014). Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 43 I.3.3.1.2.1.3 Rumiantes y porcinos Son varias las especies de mollicutes, exclusivamente del género Mycoplasma, que afectan a animales de producción, causando muerte, haciendo descender las tasas de fertilidad y producción de leche o produciendo abortos. El ganado bovino es afectado principalmente por dos especies: M. mycoides subsp. mycoides “Small Colony” que produce la Pleuroneumonía Contagiosa Bovina, enfermedad que causó grandes pérdidas mundiales durante el siglo pasado (Westberg et al., 2004), y que continúa siendo un problema sanitario en África y Asia (Lesnoff et al., 2004; Fischer et al., 2012); y por M. bovis que está relacionado con mastitis y con procesos poliartríticos y urogenitales (Pfützner y Sachse, 1996; Nicholas y Ayling, 2003). En los pequeños rumiantes uno de los principales patógenos es M. capricolum subsp. capripneumoniae, ya que produce Pleuroneumonía Contagiosa Caprina, una enfermedad caracterizada por cuadros respiratorios graves y elevada mortalidad y que actualmente tiene un enorme impacto en el ganado caprino de África y en algunas zonas de Asia (Mc Martin et al.,1980; Nicholas y Churchward, 2012); mientras que las especies M. agalactiae, M. mycoides subsp. capri, M. capricolum subsp. capricolum y M. putrefaciens pueden afectar al ganado caprino y ovino, ocasionando mastitis, artritis y queratoconjuntivitis, participando así en la producción del Síndrome de Agalaxia Contagiosa, el cual puede cursar con gravedad y es endémico en el área mediterránea (Bergonier y Berthelot, 2008). Por otra parte, el ganado porcino es susceptible a M. hyopneumoniae que actúa como el agente etiológico de la Neumonía Enzoótica Porcina (NEP), una enfermedad que tiene un gran impacto negativo directo en la producción porcina (Kobisch y Friis, 1996; Thacker, 2006; Maes et al., 2008) así como por la asociación con otras bacterias (Veenhuizen, 1998) y virus patógenos, como el del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (Thacker, 2001); el virus de la Influenza Porcina (Thacker et al., 2001); y el Circovirus porcino (Kim et al., 2003) en el denominado “Complejo Respiratorio Porcino”. Los micoplasmas M. hyosynoviae y M. hyorhinis también pueden producir cuadros de artritis y poliserositis, especialmente en animales jóvenes (Kobisch y Marois, 2008). Por último, se ha observado que M. suis, Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 44 una especie hemotrópica e incultivable, actúa como patógeno en porcinos domésticos y salvajes, produciéndoles un grave cuadro de anemia (Hoelzle et al., 2007; Groebel et al., 2009; Hoelzle et al., 2010). I.3.3.1.2.2 Humanos Los patógenos primarios más importantes que afectan a los humanos son M. pneumoniae, M. hominis, y M. genitalium (Krause y Taylor-Robinson, 1992; Blanchard y Bébéar, 2002). El primero de ellos está relacionado con complicaciones de tipo respiratorio, especialmente cuadros de bronquitis infecciosa (Atkinson et al., 2008), los que pueden derivar en complicaciones de tipo dermatológico (Schalock et al., 2006), artrítico (Ramírez et al., 2005) o cardiovascular (Meseguer et al., 2003), pudiendo afectar incluso al sistema nervioso central (Powers y Johnson, 2012). M. hominis, por su parte, es un parásito comúnmente asociado al tracto urogenital femenino cuando hay cuadros de vaginitis, vaginosis bacteriana e infecciones intrauterinas (Keane et al., 2000); asociándose también al aumento de la mortalidad y morbilidad perinatal debido a la capacidad que tiene de acceder al feto (Waites et al., 1988; Gonçalves et al., 2002). M. genitalium, por otra parte, se presenta en cuadros de uretritis no gonocócicas en hombres (Gambini et al., 2000; Jensen, 2004) y, al igual que la especie anterior, está asociado a procesos urogenitales infecciosos en mujeres (Baseman et al., 2004; Blaylock et al., 2004). Coloniza principalmente el área vaginal aunque también puede causar cervitis (Manhart et al., 2001; Casin et al., 2002). Existen otras especies de micoplasmas que a pesar de no ser patógenos primarios, pueden estar asociados a ciertas patologías como M. penetrans que está asociado con las infecciones de VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) y es considerado un patógeno de alto riesgo (Tully, 1993; Blanchard, 1997; Blanchard et al., 1997; Waites y Talkington, 2005). Por otra parte, se sospecha que M. fermentans (Gilroy et al., 2001), y M. salivarium (Watanabe et al., 1998) podrían estar asociados a procesos Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 45 artríticos, mientras que M. hyorhinis (Huang et al., 2001) y otros Mycoplasma spp. han sido localizados en carcinomas (Zhao et al., 2006). En la literatura se encuentra asimismo casos de infecciones zoonóticas como aquella asociada a M. phocicerebrale (Baker et al., 1998) el cual es un habitante de la boca de focas y leones marinos, pero que al ser inoculado en seres humanos a través de una mordedura produce la enfermedad ocupacional “seal finger”. Igualmente, se ha observado que sujetos inmunodeprimidos pueden ser susceptibles a este tipo de infecciones como es el caso de un paciente con VIH en el cual fue identificado M. haemofelis, una especie patógena que afecta a gatos (Lemcke, 1979, Dos Santos et al., 2008); y otros casos de humanos inmunodeprimidos en los que ha sido identificado M. canis, un patógeno de canes asociado a cuadros de neumonía (Armstrong et al., 1971). Además, dentro del género Ureaplasma se encuentran dos especies que son patógenas en humanos: Ureaplasma parvum y U. urealyticum las cuales pueden localizarse en el tracto genital femenino y producir infecciones e infertilidad, pudiendo provocar complicaciones en el embarazo y afectar al desarrollo fetal (Huang et al., 2013; Kasprzykowska et al., 2013). I.3.4 MOLLICUTES Y ORGANISMOS ACUÁTICOS I.3.4.1 Invertebrados Existen estudios que han encontrado mollicutes en algunos invertebrados acuáticos: briozoos, cnidarios, ctenóforos, moluscos y una gran variedad de crustáceos. El primer registro de micoplasmas en invertebrados fue realizado por Zimmer y Woollacott (1983) quienes observaron (por microscopía electrónica) que sobre la superficie corporal de larvas y adultos del briozoo marino Watersipora (W.) cucullata se encontraban unas formas celulares procariotas de 3-14 µm de diámetro que carecían de Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 46 pared celular, muy semejantes a mollicutes. Fueron denominadas organismos “tipomicoplasmas” (Mycoplasma-like). Los autores sugirieron una posible relación de simbiosis entre ambas especies. En un estudio posterior realizado por Boyle y colaboradores (1987) fue identificada una especie de Acholeplasma en larvas y adultos de otro briozoo marino, W. arcuata. Fue caracterizado a partir de cultivos, microscopía electrónica, pruebas bioquímicas, la proporción de Guanina + Citosina en su ADN y por pruebas serológicas. Todas estas observaciones deben ser tomadas con discreción debido a que en las fechas en que fueron realizadas aún no se contaba con técnicas como la PCR que pudieran caracterizar e identificar de forma determinante y segura los “potenciales” mollicutes observados. Dentro del filo Cnidaria también se han encontrado micoplasmas. A través de PCR, Penn y colaboradores (2006) detectaron un representante de la familia Mycoplasmataceae en corales de aguas someras de Alaska. Posteriormente, y empleando la hibridación fluorescente in situ y PCR, fue posible detectar una bacteria igualmente perteneciente a la familia Mycoplasmataceae en los tentáculos del coral Lophelia pertusa (Neulinger et al., 2008). El micoplasma encontrado fue posteriormente denominado “Candidatus Mycoplasma corallicola” (GenBank: AM911412) (Neulinger et al., 2009). Tales resultados fueron confirmados por Kelloggy y colaboradores (2009) quienes detectaron la misma especie de micoplasma más otros 15 adicionales en la misma especie coralina, sugiriendo que se trataría de especies simbiontes específicas de este coral. Adicionalmente, en el GenBank es posible encontrar la información genética de 14 clones de Mycoplasma sp. (DQ917809 - DQ917899) hallados en el coral Muricea elongata (Ranzer et al., No publicado). Finalmente, Work y Aeby (2011) sugieren que los mollicutes podrían estar asociados a lesiones detectadas en corales, pero que sería necesaria su verificación experimental. Daniels y Breitbart (2012) a través de técnicas de PCR identificaron Mycoplasma sp (GenBank: JN653273) y Spiroplasma sp. (GenBank: JN653133) en la ctenóforos Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 47 Mnemiopsis leidyi y Beroe ovata, respectivamente, como parte de su población bacteriana normal. Por otra parte, el primer registro de mollicutes en moluscos corresponde al de Harshbarger y colaboradores (1976) en cuyo estudio observaron (por microscopía electrónica) estructuras procariotas “tipo-micoplasmas” en la superficie de las células caliciformes del tracto digestivo de la ostra Crassostrea virginica. Gracias al avance de estudios de identificación y caracterización de micoplasmas a través de técnicas de PCR, ha sido posible determinar que algunas especies parecen ser parte de la micro población normal de algunos moluscos. En el estómago de C. virginica, por ejemplo, fue observado que un micoplasma cercano (93% de similitud al comparar el gen 16S del ARNr) a M. mobile representaba hasta el 80% de la población bacteriana total (King et al., 2012). En esta misma línea, aunque no siendo la especie bacteriana predominante, se han encontrado mollicutes en Crassostrea gigas (Fernández-Piquer et al., 2012), en la glándula digestiva de la ostra Saccostrea glomerata (Green y Barnes, 2010) y en el tracto digestivo de los abalones Haliotis discus hannai (Tanaka et al., 2004), H. diversicolor (Huang et al., 2010) y H. gigantea (GenBank: AB621871; Iehata et al., No publicado). Adicionalmente, en el tracto digestivo de la liebre de mar Elysia rufescens fueron encontradas cinco especies desconocidas del género Mycoplasma y cuatro más sobre el alga Bryopsis sp de la cual se alimenta el molusco, las que según los autores podrían tener alguna relación con los encontrados en el molusco (Davis et al., 2013). Hay que destacar que han sido encontradas algunas nuevas especies de mollicutes asociadas a esta alga (Hollants et al., 2013). En todos estos estudios la identificación ha sido realizada a través del análisis de una parte de la secuencia del gen ARNr 16S. Por otra parte, hay estudios que han mostrado que los mollicutes pueden comportarse como patógenos potenciales en ciertos moluscos bivalvos, siendo asociados con algunos daños en los hospedadores, pero no como causantes de mortalidad (Paillard et al., 2004; Romalde y Barja, 2010). A través de fotografías de microscopia electrónica fueron observadas estructuras que coincidían con mollicutes Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 54 medios con el inóculo filtrado fueron sembrados en placas de agar entre 4 y 10 días después. Hay que hacer notar que los medios de cultivos utilizados incluían una fuente de colesterol (suero bovino, equino u ovino), esencial para el crecimiento de la mayoría de los mollicutes y un antibiótico β-lactámico (penicilina) para evitar el crecimiento de otras bacterias. Pasado un tiempo de incubación (no indicado por los autores) fueron observadas colonias con la morfología típica de mollicutes en 16 de los 85 peces estudiados, creciendo en aquellas placas que habían sido sembradas con la muestras sin filtrar, provenientes de tenca, carpa y trucha; siendo la mayoría de muestras de branquias puestas en medio SP4 y en menor grado de muestras de branquias, piel e intestino puestas en medio Hayflick y de Urea. A pesar de tener tantas muestras positivas sólo fue posible subcultivar y mantener el cultivo vivo de las colonias provenientes de las branquias con eritrodermatitis de un ejemplar de tenca puestas en medio modificado Hayflick e incubado a 25 ºC. La cepa fue designada como 163K. Pruebas posteriores mostraron que a) las placas mostraba colonias en forma de huevo frito, típicas de mollicutes, b) también crecía bien en medio Friis; c) en medio líquido presentaba un crecimiento flocular, indicando su tendencia a formar agregados; d) crecía bien bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas entre 17 y 30 ºC, con un crecimiento óptimo a 25 ºC; e) que no crecía en medios carentes de suero, haciéndolo débilmente en el medio agar sangre; f) era sensible a digitonina 1% (p/v); g) fermentaba glucosa pero no hidrolizaba arginina; h) en placas de medio Hayflick con suero equino producía películas y cristales, pero no si era con suero bovino o en medio Friis; i) era pleomórfico con forma de botella o ánfora (flask-shape) con un protrusión terminal (“head-like” structure) y j) que era móvil, desplazándose (gliding) sobre superficies. Esta última característica le facilitó su nombre mobile (latín) motil (Kirchhoff et al., 1987). Posteriormente, se han realizado estudios para determinar su rol como patógeno y las estructuras y funciones involucrados en él (Kirchhoff et al., 1984; Stadtländer y Kirchhoff, 1990,1995; Adan-Kubo et al., 2012); determinándose que puede provocar Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 55 hemoadsorción con eritrocitos ovinos, equinos, bovinos y de trucha y carpa (Fischer y Kirchhoff, 1987). Asimismo, a través de pruebas de laboratorio se ha determinado que puede producir eritrodermatitis necrótica en branquias de tenca y de trucha arco-iris (Oncorhynchus mykiss) (Stadtländer et al., 1995) Descripción formal (Kirchhoff et al., 1987; Williamson et al., 2010): Mobile.; adj. mobile, motil Células cónicas o con forma de botella y con una protrusión terminal diferenciada designada como estructura “head-like”. Las células muestran un rápido desplazamiento cuando se encuentra sobre superficies en dirección de la “head-like” (Miyata et al., 2000; 2002). Las colonias que crecen sobre medios sólidos tienen la típica forma de huevo frito. Crecen muy bien en medio de Aluotto suplementado con glucosa o arginina. Su rango de temperatura ideal para el crecimiento es de 17-30 ºC y el crecimiento óptimo se obtiene a 25 ºC (Kirchhoff et al., 1987). El contenido G+C de su ADN es de 24,9 mol%. Patogenicidad: Causa eritrodermatitis necrótica en tenca (Tinca tinca). El modo de transmisión no ha sido determinado. Fuente: Aislado de las branquias del pez dulceacuícola tenca con la “enfermedad roja” (infección de las branquias). Cepa Tipo: 163K, ATCC 43663, NCTC 11711. Nº de secuencia (gen ARNr 16S): M24480 (Weisburg et al., 1989). Nº de secuencia (genoma completo de la cepa 163K): NC_006908 (Jaffe et al., 2004). I.3.4.2.1.2 Mycoplasma mobile y movilidad Dentro de los procariotas existen especies inmóviles y otras con capacidad de movimiento. Estas últimas emplean una amplia variedad de estructuras para poder desplazarse. Algunas, como ciertas cianobacterias y bacterias verdes del azufre, poseen vesículas de gas con las que pueden controlar su flotabilidad y así alcanzar un óptimo de luz y alimento subiendo y bajando en la columna de agua (Walsby, 1994). Otras poseen uno o más flagelos (Ej. familia Vibrionaceae) o utilizan pili de tipo IV (Ej. Pseudomonas aeruginosa) para generar fuerzas móviles mediante contracciones; mientras que otras se Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 56 deslizan sobre superficies, como es el caso de ciertas cianobacterias filamentosas, algunas especies del grupo Cytophaga-Flavobacterium y ciertos micoplasmas (Bardy et al., 2003; Jarrell y McBride, 2008). Entre las especies de mollicutes que se movilizan por desplazamiento (gliding) se encuentran M. pneumoniae, M. gallisepticum, M. pulmonis, M. genitalium, M. amphoriforme y M. mobile (McBride, 2001; Shimizu y Miyata, 2002; Miyata, 2008). A pesar de que estas especies poseen un genoma mínimo han desarrollado sistemas que les permiten deslizarse sobre superficies. Carecer de pared celular les permite adoptar formas con características protrusiones de la membrana que usan para desplazarse (Uenoyama y Miyata, 2005A; Nakane y Miyata, 2007; Miyata, 2010). Desde que M. mobile fue descrito su peculiar sistema de desplazamiento generó un amplio interés, por lo que ha sido objeto de muchos estudios. En general, se ha observado que tiene una forma celular especializada (forma de “botella” o “ánfora”) con una estructura terminal especializada o protrusión denominada “head-like” (Miyata y Uenoyama, 2002; Shimizu y Miyata, 2002); que puede adherirse fuertemente a superficies plásticas y de vidrio así como a células animales (Kirchhoff y Rosengarten, 1984; Kirchhoff et al., 1984); pueden desplazarse muy rápidamente (7 µm/s) sobre superficies inertes (Kirchhoff y Rosengarten, 1984; Kirchhoff et al., 1984; Jaffe et al., 2004) y sobre la de los eritrocitos (Fischer y Kirchhoff, 1987; Fischer et al., 1987); que exhiben comportamiento quimiotáctico en respuesta a varios compuestos (Kirchhoff et al., 1987; Piper et al., 1987) además de presentar reotaxis positiva (Rosengarten et al., 1988). Existen muchos estudios que han descrito la composición y forma de membrana de esta especie, las proteínas asociadas al movimiento así como la fuente de energía que usa este micoplasma para conseguirlo (Fischer et al., 1988; Wu y Miyata, 2012). Se ha observado que el movimiento se produce de manera centrípeta, mediante unión, tracción y liberación por parte de múltiples proteínas de 50 ηm de longitud, las que en Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 57 conjunto con cuatro grandes proteínas localizadas en la base del “head-like” y sustentadas por un citoesqueleto interno, compondrían el sistema de desplazamiento, sirviendo de “piernas” y permitiéndole al micoplasma “caminar” sobre una superficie, así como lo haría un ciempiés (Piper et al., 1987; Miyata et al., 2002; Miyata 2008; 2010). Estas “piernas” tienen la capacidad de reconocer y adherirse a oligosacáridos sialilados (con ácido siálico) que se encuentran en la superficie de células animales pudiendo de esta manera invadirlas y desplazarse sobre ellas (Miyata et al., 2000; Nagai y Miyata, 2006; Kasai et al., 2013). Cuatro de estas proteínas han sido identificadas y caracterizadas estructural y funcionalmente: P42, Gli123, Gli349 y Gli521. (Uenoyama et al., 2004; Seto et al., 2005; Uenoyama y Miyata, 2005B; Adan-Kubo et al., 2006; Uenoyama et al., 2009; Nonaka et al., 2010).De manera complementaria, se ha podido observar y describir la estructura del citoesqueleto que tiene una forma de “medusa”, y está especializado también para el desplazamiento (Nakane y Miyata, 2007). Se ha determinado, asimismo, que la energía requerida para el desplazamiento de este microorganismo proviene del trabajo metabólico de una ATPasa especializada (Jaffe et al., 2004; Miyata, 2008). Hasta ahora se ha identificado una nucleósidotrifosfatasa, la P42, que podría ser tal enzima, sin embargo, todavía faltan evidencias para poder confirmarlo certeramente (Ohtani y Miyata, 2007). Por otro lado, existen estudios que han buscado la manera de aprovechar la movilidad y fuerza observadas en M. mobile (Hiratsuka et al., 2005; 2006). Se ha conseguido que esta bacteria se desplace sobre superficies inertes cubiertas con proteínas unidas a una molécula con ácido siálico, la sialilactosa. El micoplasma lo reconoce y se desplaza sobre él como si lo hiciera sobre una superficie celular animal (Nagai y Miyata, 2006). A partir de esto surgió la idea de crear una cepa que, a través de modificaciones químicas, expresara en la superficie de su membrana moléculas de biotina. A continuación se utilizó estreptavidina, un compuesto con alta afinidad con la biotina, para cubrir una superficie inerte, consiguiendo así que M. mobile se desplazara sobre ella, “estimulado” por la afinidad entre ambos compuestos, que hacía que Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 58 funcionara toda su maquinaria de desplazamiento (Hiratsuka et al., 2006). Todo este sistema fue instalado dentro de un motor de microrrotación dentro de una micromáquina de silicona de 20 µm de diámetro, “cargado” con glucosa como carburante, consiguiendo que la velocidad y fuerza del desplazamiento de los micoplasmas pudiera mover este motor y crear trabajo mecánico. De esta manera se consiguió con éxito un sistema híbrido que combinaba organismos vivos y sistemas artificiales para generar movimiento, esto es, un motor dirigido por bacterias (Hiratsuka et. al., 2006) (Video disponible en: http://www.youtube.com/watch?v=oZVzJtK3vM0). Sin embargo, trabajar con microorganismos fuera del laboratorio comporta algún riesgo, sobre todo biológico, debido a la dificultad de controlarlos eficientemente y a su patogenicidad, por lo que se ha ideado la posibilidad de utilizar tal maquinaria bacteriana sin estar viva. Uenoyama y Miyata (2005A) consiguieron permeabilizar parcialmente la membrana de la bacteria, manteniendo la estructura de su citoesqueleto, logrando así matar a la bacteria pero dejar intacta las estructuras implicadas en el movimiento. El experimento resultó pues con la sola adición de ATP fue posible recuperar la movilidad original. La maquinaria implicada en el movimiento que queda dentro de la estructura bacteriana sin vida recibió el nombre de “ghost”. Actualmente se está buscando un campo en el que pueda ser aplicado este sistema híbrido motor-bacteria. I.3.4.3 Mamíferos marinos A nivel mundial son muy pocos los estudios que se han realizado en identificación de mollicutes en mamíferos marinos. El primer registro corresponde a la identificación (a través de serología y fotos de microscopia electrónica) y descripción de tres especies de micoplasmas encontradas en ejemplares de foca de puerto (Phoca vitulina) en Norteamérica: Mycoplasma phocae (antes M. phocidae), M. phocirrinis y M. phocicerebrale. Todas ellas fueron detectadas en dos episodios en los que se produjeron Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 59 mortalidades masivas de P. vitulina, aunque no fue posible determinar una relación clara entre su presencia y la mortalidad de las focas, asumiendo que no correspondían a los patógenos primarios pero sí podrían contribuir al desarrollo de la infección (Geraci et al., 1982; Giebel et al., 1991; Ruhnke y Madoff, 1992; Higgins, 2000). Tiempo después, además, pudo identificarse M. phocicerebrale como el agente causante de la enfermedad zoonótica conocida como “Seal Finger” (Cowan et al., 2001; Hunt et al., 2008). Posteriormente, fueron identificados cuatro nuevos micoplasmas en el león marino californiano (Zalophus californianus): en abscesos subdérmicos fue encontrado M. zalophi y M. zalophidermidis (Haulena et al., 2006); en los pulmones, Mycoplasma sp. CSL7503-lung (GenBank: EU714238); y en la sangre, “Candidatus Mycoplasma haemozalophi sp. nov.” (GenBank: GU905012-GU904996) (Volokhov et al., 2010 y 2011). M. zalophi fue asociado a la presencia de lesiones subdermales y musculares, así como a artritis y linfadenopatía (Haulena et al., 2006). Paralelamente, Lynch y colaboradores (2011), analizando ejemplares juveniles y adultos del lobo marino australiano (Arctocephalus pusillus doriferus), y encontraron que 55 de 80 ejemplares aparentemente saludables presentaban tres micoplasmas en su cavidad nasal: M. phocae, M. zalophi, y Mycoplasma sp. (GenBank: EU714238). Estas dos últimas especies, además, también fueron aisladas en muestras de pulmón de juveniles mientras que en un adulto fue identificado M. phocicerebrale. Como no fue observado ningún tipo de lesión, se consideraron estas especies como parte de la población bacteriana normal. En los fetos, por el contrario, fueron observadas lesiones neumónicas y en algunos casos miocarditis o pericarditis. En los pulmones fetales estudiados fue detectado ADN de Mycoplasma sp. (Mycoplasma sp. Phocoena 94%- ARNr 16S GenBank: FJ876266), Mycoplasma sp. CSL7529-conjunctiva (GenBank: EU859984) y de M. phocicerebrale. Los autores indican la importancia de estudiar a fondo si alguna de estas tres especies de micoplasmas está relacionada con el aborto de tales fetos. Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 60 Finalmente, existen más especies de mollicutes que han sido descritas en pinnípedos, que poseen número de registro GenBank pero que aún no han sido formalmente identificadas. Mycoplasma sp. Mirounga (GenBank: JN644768) y Ureaplasma sp (GenBank: JF731006JF731007) en el elefante marino Mirounga angustirostris; y diversas cepas de Mycoplasma sp. (GenBank: EU714237) y Ureaplasma sp (GenBank: HQ377524HQ377518) en Z. californianus. Volokhov y colaboradores (2012B) han propuesto que estos Ureaplasmas que detectaron en M. angulirostris y en Z. californianus sean denominados “Ureaplasma miroungigenitalium” y “Ureaplasma zalophigenitalium”, respectivamente. Por otra parte, en el sirénido Trichechus manatus latirostris ha sido encontrado un Acholeplasma sp. (GenBank: FJ590762.1) (Volokhov. No publicado) En cetáceos, por otra parte, solamente se encuentra un estudio registrando la presencia de M. phocicerebrale (en un hígado y en tres pulmones) y Mycoplasma sp. (en un riñón y cinco pulmones) en ejemplares de Marsopa común (Phocoena phocoena), así como un Mycoplasma sp. en el riñón de un zifio de Sowerdy (Mesoplodon bidens) (Foster et al., 2011). Los autores indican la importancia de estudiar los efectos que puedan producir estas especies de micoplasmas sobre los hospedadores, teniendo en cuenta que en mamíferos terrestres pueden debilitar el sistema inmune o ser vectores directos de enfermedades. Además, en un análisis de las heces de la marsopa sin aleta (Neophocaena phocaenoides asiaeorientalis) fueron encontradas dos especies de Mycoplasma sp. (GenBank: JN792315 - JN792314) y 47 secuencias de clones de Ureaplasma sp. (GenBank: JN792313 - JN792267) (Mc Laughlin et al., 2012). En un ejemplar de delfín de dientes rugosos (Steno bredanensis) varado en las Islas Canarias fueron detectados los micoplasmas M. opalescens y M. phocirhinis en la abertura genital y útero, respectivamente. Ambas especies fueron cultivadas e identificadas a través de su secuencia de la ISR (Poveda et al., 2009). Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 61 Por otra parte, existen registro de nuevas especies encontradas en Marsopa común que aún no han sido descritas formalmente en ninguna publicación: Mycoplasma sp. Phocoena C-264-GEN (GenBank: GU905021), Mycoplasma sp. Phocoena C-269 (GenBank: FJ876266) (Volokhov y Gulland, no publicado) y cuatro Mycoplasma sp. (GenBank: FJ233100 - FJ233097) (McAuliffe et al., no publicado). El estudio de mollicutes en este tipo de organismos es muy interesante y puede ser útil para conocer aspectos importantes de su ecología y fisiología, que son relevantes a la hora de determinar las causas que pueden llevar a un animal a morir y/o para realizar programas de manejo y protección basados en su biología. Descripción de Mycoplasma phocicerebrale ((correg) Giebel et al., 1991; Williamson et al., 2010) pho.ci.ce.re.bra´.le.; phoca, foca; cerebrale, perteneciente al cerebro; phocicerebrale, perteneciente al cerebro de una foca. Células cocoides o mostrando una forma de mancuerna. No ha sido confirmada su motilidad. Las colonias que crecen sobre medios sólidos tienen la típica forma de huevo frito. Crecen muy bien en medio SP4 suplementado con arginina a 37 ºC. Patogenicidad: Asociado con enfermedades respiratorias y conjuntivitis en focas de puerto (Kirchhoff et al., 1989) y una clara queratitis ulcerativa debido a mordidas de focas (conocida como “seal finger”) y artritis secundarias en humanos (Baker et al., 1998). La transmisión entre focas de puerto no ha sido determinada definitivamente; la transmisión a humanos es de naturaleza zoonótica, debido a mordiscos de focas. Fuente: Aislado del cerebro, fosas nasales, garganta, pulmones y corazón de focas de puerto (Phoca vitulina) durante un brote de enfermedades respiratorias (Kirchhoff et al., 1989) y desde lesiones de humanos con “seal finger” (Baker et al., 1998; Ståby, 2004) El contenido G+C de su ADN es de 25,9 mol%. Cepa Tipo: 1049, ATCC 49640, NCTC 11721. Nº de secuencia (gen ARNr 16S): AF304323. Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 62 Comentarios: El nombre original de phocacerebrale, fue corregido por (Königsson et al., 2001). Descripción de Mycoplasma phocidae (Ruhnke y Madoff, 1992; Williamson et al., 2010) pho.ci´.dae.; phoca, foca; phocidae de una foca. Células cocoides primarias. No ha sido confirmada su motilidad. Las colonias que crecen sobre medios sólidos tienen la típica forma de huevo frito. Crecen muy bien en medio SP4 o Hayflick suplementado con arginina a 37 ºC. Produce la reacción de “Películas y Cristales”. Patogenicidad: Patógeno oportunista, asociado con neumonía secundaria en focas de puerto (Kirchhoff et al., 1989) y subsecuente infección por influenza. No ha sido posible producir la enfermedad en focas de puerto o focas grises a partir de un cultivo puro de M. phocidae (Geraci et al., 1982). Su forma de transmisión no ha sido determinada definitivamente. Fuente: Aislado de pulmones, tráquea y corazón de focas comunes (Phoca vitulina). El contenido G+C de su ADN es de 27,8 mol%. Cepa Tipo: 105, ATCC 33657. Nº de secuencia (gen ARNr 16S): AF304325. Comentarios: La designación de la especie como “Mycoplasma phocae” fue sugerido (Königsson et al., 2001), sin embargo, el nombre original “phocidae” fue conservado. Descripción de Mycoplasma phocirhinis ((correg) Giebel et al., 1991; Williamson et al., 2010) pho.ci.rhi´.nis.; phoca, foca; rhis, rhinos, nariz; phocirhinis, de la nariz de foca. Células cocoides. No ha sido confirmada su motilidad. Las colonias que crecen sobre medios sólidos usualmente tienen la típica forma de huevo frito. Crecen bien en medio Friis o Hayflick a 37ºC. Produce la reacción de “Películas y Cristales”. Patogenicidad: Asociado con enfermedades respiratorias y conjuntivitis en focas de Harbor (Kirchhoff et al., 1989). Su forma de transmisión no ha sido determinada definitivamente. Capítulo I: Introducción, Objetivos y Revisión bibliográfica 63 Fuente: Aislado de fosas nasales, faringe, pulmones, tráquea y corazón de focas de común (Phoca vitulina). El contenido G+C de su ADN es de 26,5 mol%. Cepa Tipo: 852, ATCC 49639, NCTC 11722. Nº de secuencia (gen ARNr 16S): AF304324. Comentarios: El nombre original de M. phocarhinis, fue corregido por Königsson y colaboradores (2001). Descripción de “Mycoplasma zalophi” (en estudio) (Haulena et al., 2006; Williamson et al., 2010) za.lo´.phi.; zalophi, de Zalophus, el género de león marino que incluye el León marino de California (Zalophus californianus) del cual fue aislado este micoplasma. Su morfología celular aún no ha sido descrita. Fuente: Aislado de un absceso subdérmico de un león marino en cautividad. Hospedador habitual: Abscesos subdérmicos e intramusculares, articulaciones, pulmones y ganglios linfáticos de leones marinos en cautividad. Filogenia: Asignado al Clúster Mycoplasma hominis del Grupo Hominis del género Mycoplasma. Cultivo: Cultivable en medio SP4 suplementado con glucosa. Temperatura óptima de crecimiento: 37 ºC. Nº de secuencia (gen ARNr 16S): AF493543. Capítulo II: Estudio metodológico 68 2011). Otro método convencional de diagnóstico se basa en pruebas serológicas, como prueba de fijación del complemento, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o inmunotransferencia, sin embargo, pueden consumir mucho tiempo y carecen de sensibilidad y especificidad (Mc Auliffe et al., 2003). Adicionalmente, se ha desarrollado métodos basados en la tecnología de amplificación del ácido nucleico (NAT) para detectar mollicutes (Kong et al., 2007) y las recomendaciones para la evaluación de los ensayos NAT para las pruebas de mollicutes fueron incluidas en la Farmacopea Europea (Kong et al., 2007; European Pharmacopoeia, 2011; Burgher et al., 2013). En los últimos años las técnicas moleculares de hibridación de ácidos nucleicos (HAN) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han sido ampliamente utilizadas en la identificación de micoplasmas (Wirth et al., 1994). La técnica de HAN requiere del desarrollo de sondas géneroespecíficas como la H-900 y sondas específicas para diferentes especies. Si bien las técnicas HAN son más sensibles que el cultivo de micoplasmas, resultan ligeramente menos sensibles que la PCR (Lobo et al., 2006). La aplicación de técnicas como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha atraído mucha la atención por presentar una alta sensibilidad y especificidad, por lo que se aplica en la actualidad en la determinación de especies de Mollicutes (Hopert et al., 1993; McAuliffe et al., 2003). Otras características que le han aportado popularidad a la técnica son su simplicidad, el tiempo asociado al análisis y su aplicación en productos y muestras biológicas. Todo esto ha llevado a mejorar la eficiencia y eficacia en la detección de mollicutes (Kong et al., 2007). Sin embargo, algunos métodos de PCR no son capaces de detectar algunas especies de Mollicutes por no tener un nivel de sensibilidad necesario para reemplazar a las pruebas generales de mollicutes basados en su cultivo (Eldering et al., 2004; Zhi et al., 2010). Con la intención de incrementar la sensibilidad en el diagnóstico se ha desarrollado diferentes tipos de PCR tales como PCR anidada (Wirth et al., 1994) y RT- Capítulo II: Estudio metodológico 69 PCR, esta última usa como molécula diana el ARN, cuyo número de copias es mayor en las células que su correspondiente AND (Brown et al., 2009). Otro tipo que se ha desarrollado y está cobrando gran importancia es la PCR a tiempo real (Harasawa et al., 2005; Ishikawa et al., 2006), la que es mucho más sensible y rápida que una PCR convencional, por lo que se han adaptado muchos protocolos a este tipo de PCR para una detección rápida de algunos mollicutes (Baczynska et al., 2004; Dubosson et al., 2004; Rebelo et al., 2011). Se ha desarrollado métodos de PCR con diana en diferentes marcadores genéticos de mollicutes y se han aplicado para la detección de una variedad de agentes infecciosos donde la técnica tiene que ser especie específica. Sin embargo, cuando el objetivo es la detección simultánea de un amplio rango de especies de mollicutes, la PCR tiene que estar basada en regiones altamente conservadas como el gen ARNr 16S (Deng, et al., 1992; Van Kuppeveld et al., 1992; Sung et al., 2006), las regiones adyacentes a la región intergénica entre los genes ARNr 16S y 23S (ISR) (Harasawa, 1996; Tang et al., 2000; Ramírez et al., 2008) o el ARNr 23S (Hotzel et al., 2003). McAuliffe y colaboradores (2003) desarrollaron una técnica que combina la PCR con la electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE) para micoplasmas. Se trata de un test genérico simple que permite la identificación de los microorganismos hasta un nivel de especie. Más recientemente, se ha desarrollado pruebas de microarray de ADN para la identificación de especies de micoplasmas (Volokhov et al., 2006; Schnee et al., 2012). El objetivo de este estudio fue evaluar seis pares de cebadores respecto a su sensibilidad frente a una batería de mollicutes y su especificidad respecto a otras bacterias. Adicionalmente, los dos pares de cebadores con mejores resultados se adaptaron a una PCR a tiempo real. Capítulo II: Estudio metodológico 70 II.2 MATERIALES Y MÉTODOS II.2.1 ORGANISMOS Y CONDICIONES DE CULTIVO En las Tablas II-1 y II-2 se relaciona los microorganismos utilizados en el presente estudio. Todos los mollicutes fueron cultivados en el medio SP4-II (Ramírez et al., 1997) entre 2 a 5 días a condiciones atmosféricas normales y 37 ºC, con la excepción de Mesoplasma lactucae y Spiroplasma spp., que se incubaron a 25 ºC. Cada cultivo fue filtrado y clonado para asegurar su pureza. Las bacterias no-mollicutes fueron cultivadas en agar-sangre (Prodanisa) a 37 ºC. En el estudio se incluyó el ADN de trece especies bacterianas cedido, tras su identificación por métodos convencionales y de biología molecular, por el Laboratorio de Enfermedades Infecciosas e Ictiopatología (IUSA/ Universidad de Las Palmas de Gran Canaria). II.2.2 EXTRACCIÓN Y MEDICIÓN DE ADN El ADN fue extraído utilizando el kit comercial Realpure Genomic (Real) y siguiendo sus instrucciones. Su concentración fue cuantificada en un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). Para verificar la integridad del ADN en los casos con poca cantidad de ADN fue realizada una electroforesis (100 V por 50 min) en un gel de agarosa (1% p/v en tampón TAE 1x) teñido con Gel-Red (Biotium) (0,025 µl/ml) utilizando el marcador molecular Lambda DNA/HindIII (Thermo Scientific) y, posteriormente, visualizado en un transiluminador (Bio-Rad Laboratories). Para su análisis fue utilizado el software Quantity-One (Bio-Rad Laboratories). Capítulo II: Estudio metodológico 71 Tabla II-1: Especies de microorganismos de la Clase Mollicutes utilizadas en la comparación de seis pares de cebadores de PCR’s utilizadas para esta clase. Se muestra la detección de su ADN por cada protocolo de PCR, temperatura de fusión (ºC) de la PCR a tiempo real empleando el par de cebadores Nº 4 y 5 y la concentración de ADN de la especie analizada. Capítulo II: Estudio metodológico 72 Capítulo II: Estudio metodológico 73 Tabla II-2: Especies de bacterias no-mollicutes utilizadas en la comparación de seis pares de cebadores de PCR’s. Se muestra la detección de su ADN por cada protocolo de PCR, temperatura de fusión (ºC) de la PCR a tiempo real empleando el par de cebadores Nº 4 y 5 y la concentración de ADN de la especie analizada. Capítulo II: Estudio metodológico 74 II.2.3 CONFIRMACIÓN DE LA IDENTIDAD DEL ADN Para verificar la identidad y pureza de los mollicutes fue analizada la secuencia de la región localizada entre los genes ARNr 16S y 23S (ISR) de todas las especies utilizadas (Ramírez et al., 2008). La identidad de las especies del género Acholeplasma fue determinada utilizando la secuencia de un fragmento del gen ARNr 16S con los cebadores indicados por Spergser y colaboradores (2002). El ADN de las bacterias Actinobacter baumannii, Aeromonas spp., Clostridium spp., Fusobacterium spp. y Erysipelothrix rhusiopathiae fue confirmado por el análisis de la secuencia de su ISR. Las cepas comerciales de Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica sv enteridis, Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae fueron obtenidas de Oxoid (Thermo Scientific). La secuenciación fue llevada a cabo por la empresa Macrogen Europe (Holanda) con un modelo de secuenciador de Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer. Para la lectura de los cromatogramas (formato ABI) se utilizó el programa informático FinchTV versión 1.3.1 (Geospiza, Inc.). Programa que también se empleó para exportar las secuencias de dichos cromatogramas (formato SEQ). El programa Gene Runner 3.05 (Hasting Software Inc.) se utilizó para alinear las secuencias de ida y de vuelta de cada producto, así como en el caso de necesitar más de un producto para completar la secuenciación de los genes, obteniendo una secuencia consenso. Para comparar secuencias se utilizó el programa BioEdit Sequence Aligment Editor (Isis Pharmaceuticals, Inc.) y para calcular los porcentajes de similitudes entre ellas. Empleándose también para obtener las imágenes de las comparaciones entre secuencias. La secuencia de nucleótidos obtenida, comparada con la base de datos GenBank mediante la aplicación Basic Local Alignment Search Tool (BLASTn) (Atschul et al., 1997). Capítulo II: Estudio metodológico 75 II.2.4 COMPARACIÓN DE SEIS PARES DE CEBADORES (PCR’S). Fueron comparados seis pares de cebadores con sus respectivos protocolos de PCR, específicos para la detección de microorganismos de la Clase Mollicutes o Género Mycoplasma (Tabla II-3). En el caso de los cebadores descritos por McAuliffe y colaboradores (2005), la visualización de los productos de la PCR se hizo en gel de agarosa en vez de en gel con gradiente de desnaturalización. Fue utilizado el ADN genómico de todas las especies listadas en las Tablas II-1 y II-2. El sistema de reacción (25 µl) usando “beads” illustraTMPureTaqTM Ready-to-GoTM PCR (GE Healthcare) consistió en 1 µl (20 µM) de cada cebador (forward y reverse), 3 µl de ADN genómico y agua PCR-grade (Sigma). El protocolo de cada PCR fue realizado en un termociclador Mastercycler Gradient (Eppendorf) y repetido al menos tres veces. El control positivo en cada prueba fue el ADN de M. mycoides subsp. capri (Y-GOAT), mientras que el control negativo fue realizado colocando agua en lugar del ADN genómico. Cada PCR fue repetida al menos dos veces utilizando otro termociclador. Para confirmar la amplificación de producto por cada par de cebadores se realizó una electroforesis (100 V por 50 min) en un gel de agarosa (1% p/v en tampón TAE 1x) teñido con Gel-Red (Biotium) (0,025 µl/ml) para, posteriormente, visualizarlo en un transiluminador (Bio-Rad). Fue necesario utilizar un gel al 3% de agarosa para visualizar el producto de pequeño tamaño amplificado por el par de cebadores de Hotzel y colaboradores (2003). Para estimar el tamaño de los productos amplificados se recurrió al marcador molecular Amplisize 2000-50 pb (Bio-Rad). II.2.5 PRUEBAS DE ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DE LAS PCR’S II.2.5.1 Pruebas de especificidad En las pruebas de especificidad fueron utilizadas las bacterias no-mollicutes listadas en la Tabla II-2. Capítulo II: Estudio metodológico 76 Tabla II-3: Pares de cebadores comparados, nombre y secuencia de los cebadores, tamaño del amplicón amplificado y su referencia. II.2.5.2 Pruebas de sensibilidad La sensibilidad fue medida de dos formas: empleando un panel de especies de mollicutes y también utilizando una serie de diluciones de ADN, hasta 10-10, provenientes de cultivos seriados de M. mycoides subsp. capri (Y-GOAT) (MMC) y Acholeplasma laidlawii (PG8) (ACO). Fue contado el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por 100 µl de cada cultivo (Bradbury, 1977). En paralelo, fue extraído el ADN y la PCR fue llevada a cabo con cada dilución. La especificidad, sensibilidad y valores predictivos positivos (VPP) y negativos (VPN) para cada PCR fueron calculadas (nivel de confianza de 95%) usando el software Win-Epi 2.0 (De Blas, 2006), versión online del software Win Episcope 2.0 (Thrusfield et al., 2001). Como este tipo de prueba es utilizado sobre todo cuando se verifica la eficacia para detectar una enfermedad, las definiciones utilizadas son: VPP: la probabilidad de tener la enfermedad si el resultado de la prueba diagnóstica es positivo; VPN: la probabilidad de no tener la enfermedad si el resultado de la prueba diagnóstica es negativo (Greiner y Gardner, 2000). Estos valores fueron interpretados en nuestro Capítulo II: Estudio metodológico 77 estudio como “la probabilidad de detectar un mollicute cuando la bacteria es realmente un mollicute” y “la probabilidad de indicar que la bacteria detectada no es un mollicute cuando realmente no lo es”, respectivamente. II.2.6 PCR A TIEMPO REAL Los cebadores y protocolo descritos por Van Kuppeveld y colaboradores (1992) fueron utilizados en una PCR a tiempo real. El sistema de reacción (25 µl) consistió en 12,5 µl de iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad), 1 µl (20 µM) de cada cebador (forward y reverse), 5 µl de ADN genómico y agua PCR-grade (Sigma). El protocolo de PCR fue realizado en un termociclador MyiQi Cycler Detection System (Bio-Rad); y el análisis, con su propio software MyiQ system 1.0.410. Los controles positivos y negativos fueron los mismos que en las PCR’s convencionales. Fue analizada la temperatura de fusión de la curva de disociación de cada muestra. Fue calculada su especificidad, sensibilidad y valores predictivos como fue explicado anteriormente. Adicionalmente, y con fines comparativos, también fue realizada una PCR a tiempo real empleando los cebadores descritos por Botes y colaboradores (2005), que corresponden a una modificación de los indicados por Van Kuppeveld y colaboradores (1992). Capítulo II: Estudio metodológico 84 II.4 DISCUSIÓN Considerando que el objetivo de la presente tesis era la detección de mollicutes en organismos marinos en una gran cantidad estimada de muestras, necesitábamos encontrar una técnica que pudiera mostrarnos rápidamente si había ADN de mollicutes en las muestras obtenidas. De esta manera podría concentrarse el trabajo en aquellas positivas y descartar las sospechosas que finalmente no tuvieran ningún tipo de mollicutes. En este sentido, el uso de la PCR se ha mostrado rápido y muy eficiente en la detección de mollicutes, ahorrando técnicas de cultivo que anteriormente eran imprescindibles para detectar e identificar estas bacterias, pudiendo detectar incluso ADN de microorganismos no viables (Hopert et al., 1993; Eldering et al., 2004; Lobo et al., 2006; Nicholas et al., 2008; Zhi et al., 2010). Hay que destacar que para validar el uso de nuevos cebadores y protocolos de PCR para la detección de algún microorganismo como un método estándar y oficial es necesario realizar diversas pruebas de sensibilidad y especificidad bajo determinadas directrices establecidas por las instituciones responsables de análisis microbiológicos, como la Farmacopea Europea (2011). En nuestro caso, el propósito fue solamente comparar cebadores y PCR’s ya descritos y escoger el más adecuado para nuestro estudio final con mollicutes de organismos acuáticos, por lo que las pruebas realizadas fueron dirigidas a nuestros propósitos y no a validar algún método estándar en concreto. Un último aspecto a considerar es que existen muchos compuestos que pueden inhibir alguna fase de una PCR (convencional o a tiempo real), uniéndose a la enzima (Taq Polimerasa), al propio ADN o interactuando con la enzima en la fase de extensión. Entre los inhibidores más comunes se encuentran algunos compuestos orgánicos como sales biliares, urea, fenol, etanol, polisacáridos, dodecilsulfato sódico SDS, ácidos húmicos, entre otros (Opel et al., 2010; Schrader et al., 2012). No realizamos ningún tipo de prueba para estos compuestos, debido a que el ADN utilizado proviene de cultivos Capítulo II: Estudio metodológico 85 puros y ha sido extraído eficientemente descartando todas las moléculas diferentes a ADN. II.4.1 CEBADORES Cuando se selecciona un par de cebadores para la detección de alguna especie o grupo específico es necesario considerar dos parámetros muy importantes: su sensibilidad, esto es, la capacidad que tiene de amplificar una cantidad de copias de ADN adecuada para ser analizada partiendo de una cierta concentración de ADN genómico. A medida que la amplificación requiere más ADN para tales copias menos sensible será el par de cebadores. He y colaboradores (1994) comprobaron que la sensibilidad de una PCR está directamente relacionada con la “calidad” de los cebadores empleados. En su estudio buscaban los cebadores más adecuados para la detección de Borrelia burgdorferi, mycobacteria y Bordetella pertussis, y observaron que algunos pares de cebadores podían ser 100 ó hasta 1000 veces más sensibles que otros, no importando la cantidad de ADN que utilizaban. También observaron que no existe una manera teórica de predecir esto, sino que la comprobación es sólo a través de ensayos prácticos. Hay estudios que muestran que emplear una PCR anidada permitiría aumentar la sensibilidad y detectar pequeñas cantidades de ADN (Nicholas et al., 2008). El segundo parámetro importante es la especificidad del par de cebadores, o sea, la capacidad de detectar sólo aquel grupo para el cual fue diseñado y que no amplifique productos de otras especies/grupos que representen “falsos positivos”. Actualmente hay varios programas (Ej. Oligo7 y PrimerPremier) o aplicaciones online (Ej. http://simgene.com/Primer3; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ y http://molbioltools.ca/PCR.htm) que sirven para diseñar cebadores, considerando que “encajen” (sean compatibles) con las secuencias buscadas, evitando la coincidencia con otras no deseadas. Sin embargo, siempre es necesario hacer ensayos prácticos para verificar su especificidad. Capítulo II: Estudio metodológico 86 En el presente estudio fueron considerados ambos parámetros en la elección del mejor par de cebadores para la detección de microorganismos de la Clase Mollicutes, por lo se utilizó una gran variedad de especies pertenecientes a ella así como de bacterias no-mollicutes para probar cada par de cebadores. En la literatura se puede encontrar varios estudios indicando pares de cebadores para la detección de mollicutes, inclusive, actualmente hay muchas pruebas con kits comerciales disponibles, utilizadas, sobre todo, para la detección de mollicutes en cultivos celulares o productos biofarmacéuticos, que frecuentemente son contaminados por estas bacterias (Hopert et al., 1993; Eldering et al., 2004; Lobo et al., 2006; Zhi et al., 2010). La Farmacopea Europea ha validado la utilización de esta técnica para este uso (Edginton, 2000). Dentro de todos aquellos cebadores encontramos algunos que llamaron nuestra atención: Los indicados por Hotzel y colaboradores (2003) que a través del análisis de un fragmento de aproximadamente 102-110 pb del gen ribosómico ARNr 23S conseguía detectar mollicutes. La mayoría de los cebadores utilizados están diseñados para amplificar fragmentos del gen ARNr 16S por lo que probar unos que consideraran otra parte del genoma nos pareció interesante. Otro par de cebadores fue el descrito por Spergser y colaboradores (2002) que a través de un fragmento de 580 pb del gen ARNr 16S podía teóricamente detectar mollicutes con una muy buena sensibilidad. El tercer par fue el descrito por McAuliffe y colaboradores (2005) y amplifica un fragmento de 340 pb del mismo gen y ha sido utilizado en nuestro grupo para la realización de la técnica de DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). En ella se realiza una electroforesis utilizando un gel con gradiente de desnaturalización que permite la visualización de bandas a diferentes alturas de acuerdo a la secuencia amplificada, incluso si son diferentes una de otra por tan sólo un par de bases. Este par de cebadores y esta técnica fueron utilizados exitosamente por Suárez-Pérez (2012) en un estudio con mollicutes de aves silvestres, en el que consiguió diferenciar especies muy próximas. El cuarto par elegido fue el descrito por Van Kuppeveld y colaboradores (1992) el cual comenzó a ser utilizado en nuestro laboratorio en la detección de mollicutes en ovejas y mostró buenos resultados (Relancio, 2010), además, de haber Capítulo II: Estudio metodológico 87 sido utilizado con éxito en otros estudios (Lobo et al., 2006; Kilic et al., 2013). Revisando la bibliografía encontramos que Botes y colaboradores (2005), trabajando en la detección de mollicutes en avestruces, habían aumentado la sensibilidad de estos cebadores, cambiando la posición en dos pb del cebador forward, por lo que también nos pareció importante compararlo con los anteriores. Por último, el par de cebadores indicado por Ramírez y colaboradores (2008), para la amplificación de la ISR, ha sido utilizado para la identificación y diferenciación de especies de mollicutes (Harasawa, 1996; Tang et al., 2000; Volokhov et al., 2006; Ramírez et al., 2011; Rebelo et al., 2011). Al ser una región que se encuentra entre genes altamente conservados es posible amplificarla en prácticamente cualquier microorganismo utilizando cebadores universales (Rodicio y Mendoza, 2004). En el presente estudio este par de cebadores junto con la secuenciación de su producto fue utilizado para la verificación de la identidad de las cepas trabajadas, como prueba de oro, y, al mismo tiempo, quisimos observar su límite de detección así como su capacidad de amplificar productos de buena calidad para su secuenciación a partir de cualquier mollicute o bacteria diferente. II.4.2 ESPECIES UTILIZADAS. Para validar nuestras observaciones fue necesario comprobar si los diferentes cebadores podrían detectar cualquier microorganismo de la Clase Mollicutes o si eran útiles solamente para cierto grupo o “cluster” dentro de ella, así como verificar si el ADN de bacterias no-mollicutes podría amplificar algún producto, dándonos un resultado “falso positivo”. Nuestro grupo de investigación tiene más de 20 años trabajando en el área de la micoplasmología y ha tenido la oportunidad durante todo ese tiempo de reunir una colección de especies y cepas de varios mollicutes, producto de su aislamiento en nuestro propio laboratorio o cedidas por otros grupos mediante convenios de cooperación. Todas las especies se encontraban liofilizadas y mantenidas a 4 ºC, por lo que hubo que reactivarlas con agua bidestilada estéril y su medio de cultivo correspondiente: PH, SP4-II o Friis, de acuerdo al medio en el que crecían antes de ser Capítulo II: Estudio metodológico 88 liofilizadas. Algunas de ellas crecieron sin problemas pero hubo otras que no crecieron, de las que, igualmente, fue extraído ADN. Hay que notar que algunas cepas estaban guardadas desde la década de los ’70, tiempo en el que su identificación específica era realizada sólo en base a su perfil bioquímico, antisueros y/o de acuerdo al hospedador y la sintomatología que éste podía manifestar como señal de alguna infección por mollicutes, por lo que fue necesario confirmar su especie. Tal verificación se hizo extrayendo el ADN y secuenciando el producto de PCR de la ISR o el fragmento del gen ARNr 16S como en el caso de los representantes del género Acholeplasma. En la mayoría de las especies fue confirmada su identidad original, sin embargo, algunas habían sido identificadas en su momento en forma equivocada o eran mezcla de más de una especie. De las especies puras fueron escogidas las más representativas para el estudio, de tal manera que abarcaran todas las especies dentro de la variedad que presenta la Clase Mollicutes, considerando su grupo filogenético según lo descrito por Brown y colaboradores (2010E). Fueron utilizadas especies pertenecientes a cuatro de estos cinco grupos filogenéticos: el grupo Anaeroplasma, con representantes del Género Acholeplasma; grupo Spiroplasma, con representantes del Género Spiroplasma, miembros del “cluster” Mycoides y un hemoplasma (M. wenyonii); grupo M. pneumoniae, con representantes de cuatro “cluster” del Género Mycoplasma, así como un Ureaplasma; y finalmente, el grupo M. hominis, con miembros del Género Mycoplasma, pero “clusters” diferentes a los del grupo anterior. El quinto es el grupo Asteroplasma con un única especie Asteroplasma anaerobium, a la cual no tuvimos acceso. Entre las especies escogidas hubo algunas provenientes de diferentes tipos de hospedadores: aves (ej. M. gallisepticum y M. gallopavonis), bovinos (ej. M. bovis y M. bovigenitalium), caprinos (ej. M. agalactiae y M. auris), cetáceos (M. sp Phocoena), cánidos (M. maculosum), humanos (ej. M. hominis y M. pneumoniae), ovinos (ej. M. arginini y M. capricolum), pinnípedos (ej. M. phocicerebrale y M. phocidae), porcinos (ej. M. hyorhinis y M. hyopneumoniae), e, incluso, de plantas (Mesoplasma florum). Debido al lento o nulo crecimiento de algunas cepas, la cantidad de ADN de algunas especies fue muy poca (como M. gallopavonis con una concentración menor de Capítulo II: Estudio metodológico 89 2 ηg/µl calculado por nanodrop y menor de 1,5 ηg/µl calculado por la integridad del ADN), circunstancia que al comienzo fue un problema, pues la idea principal era evaluar si los cebadores conseguían detectar todas las especies de mollicutes de las que disponíamos, sin embargo, posteriormente esta diferencia de concentraciones de ADN fue una herramienta que nos confirmó la sensibilidad de los cebadores utilizados. El caso de bacterias no-mollicutes fue diferente, ya que empleamos bacterias que crecían muy rápido por lo que disponer de su ADN era relativamente sencillo. Las bacterias escogidas para la pruebas fueron las que usualmente se utilizan cuando se evalúa la especificidad de un par de cebadores: Bacillus cereus, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica sv enteridis, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli, todas cepas comerciales. Además, y considerando que trabajaríamos con muestras procedentes del medio acuático, fueron escogidas algunas bacterias marinas (Photobacterium damselae, Aeromonas spp, Vibrio anguillarum, Fusobacterium spp.) y otras de agua dulce (dos cepas de Lactococcus garviae una patógena de trucha (8831) y otra de anguila (4976)). Adicionalmente, y para aprovechar mucho más este estudio y verificar la especificidad de los cebadores, también se empleó el ADN de dos bacterias patógenas de cerdo que frecuentemente se encuentran asociadas a enfermedades o infecciones provocadas por micoplasmas: Streptococcus suis y Actinobacillus pleuropneumoniae (Fablet et al., 2012; Kang et al., 2012); así como otras bacterias que en algún momento aparecieron en muestras de campo y/o contaminaron nuestros cultivos. II.4.3 MOLLICUTES Los resultados mostraron que los cebadores que detectaron todas las especies de mollicutes fueron los indicados por Spergser y colaboradores (2002); seguidos por los de Van Kuppeveld y colaboradores (1992) (4) y Botes y colaboradores (2005) (5) que detectaron 60 de los 61 mollicutes utilizados; y por los de McAuliffe y colaboradores (2005) que detectaron 58; finalmente, los cebadores de Hotzel y colaboradores (2003) (1) que detectaron sólo un 62,3% de ellos. Al analizar los resultados de la sensibilidad en los micoplasmas, se percibe que la detección de una especie es debida a la cantidad de Capítulo II: Estudio metodológico 90 ADN utilizada y no por el cebador en sí. Es claro que cuando su concentración es menor de 10 ηg/µl los cebadores de estos últimos autores no consiguen amplificar una cantidad de producto suficiente para ser visualizado en el gel de electroforesis. Se observa también que si la concentración de ADN es de 4,6 ηg/µl o inferior, son los cebadores de McAuliffe y colaboradores (2005) los que no consiguen amplificar suficiente producto. Los cebadores de Van Kuppeveld y colaboradores (1992) (4) y Botes y colaboradores (2005) (5) pudieron amplificar producto observable hasta la concentración de 4,6 ηg/µl bajo la cual no fue amplificada la cantidad de copias necesaria para visualizar el producto de PCR. La PCR descrita por Spergser y colaboradores (2002), por otra parte, mostró la mayor sensibilidad, al amplificar suficiente producto como para ser visualizado, incluso cuando la concentración de ADN fue tan baja como con una cantidad menor de 2 ηg/µl. Finalmente, los cebadores utilizados para la amplificación de la ISR resultaron en la amplificación de un producto de buena calidad en la mayoría de los mollicutes, dependiendo, eso sí, de la cantidad de ADN utilizada en la PCR. En el caso de M. gallopavonis (concentración de ADN menor de 2 ηg/µl) fue perceptible un producto en el gel de agarosa, sin embargo, demasiado leve como para ser utilizado para secuenciar su ISR. Nuestras observaciones muestran que concentraciones mayores de 10 ηg/µl de ADN darían un número de copias del amplicón adecuadas para ser enviada a secuenciar e identificar su especie. El tamaño de las bandas de la ISR de muchas especies es similar por lo que no es posible identificar sólo a través de su peso molecular la especie. Por otra parte, es importante observar que cuando fue utilizado ADN de algún acholeplasma se visualizaron al menos dos bandas claramente de diferente tamaño. Esto se explica considerando que las especies de este género poseen al menos dos copias de la ISR, teniendo en una de ellas un gen de ARNt, lo que haría que ambas ISR fuesen de diferente tamaño (Nakagama et al., 1992). Un caso similar acontece con Bacillus subtilis (Loughney et al., 1982) y Escherichia coli (Morgan et al., 1978) las cuales presentan hasta ocho copias de la ISR algunas de las cuales también con genes ARNt insertados. Capítulo II: Estudio metodológico 91 Estos valores de sensibilidad fueron confirmados en las pruebas utilizando diluciones seriadas del ADN de M. mycoides subsp. capri (Y-GOAT) y Acholeplasma laidlawii (PG8). Los cebadores de Spergser y colaboradores (2002) (2) se mostraron como los más sensibles, mostrando bandas en el gel de electroforesis hasta la dilución 10-5 (1,5 y 2,1 ρg/ µl de ADN de MMC y ACO, respectivamente). Los menos sensibles fueron los indicados por Hotzel y colaboradores (2003) (1) que detectaron sólo el micoplasma a la dilución 10-1 (15,5 ηg/µl de ADN) y no amplificando ningún producto de acholeplasma. La sensibilidad de los pares McAuliffe y colaboradores (2005) (3) y los de Van Kuppeveld y colaboradores (1992) (4) fueron iguales, detectando hasta concentraciones de ADN de 1,5 y 2,5 ηg/µl de ADN de MMC y ACO, respectivamente. Por otra parte, hay que destacar que al comparar los cebadores de este último autor con los de Botes y colaboradores (2005) (5) se aprecia un aumento de sensibilidad de estos últimos, consiguiendo detectar hasta 151 ρg/µl de ADN. Hay que recordar que fue por esta razón que este autor modificó el cebador de ida (forward) propuesto por Van Kuppeveld y colaboradores (1992) ya que observó que trasladando su posición dos pares de bases aumentaba su sensibilidad de detección de mollicutes. Finalmente, los cebadores para amplificar la ISR se mostraron bastante sensibles, llegando a detectar hasta 151 y 210 ρg/µl de ADN para cada especie. Es evidente que los cebadores de Hotzel y colaboradores (2003) no detectan ninguno de los tipos de acholeplasma utilizados aquí. Al observar la cantidad de ADN disponible se aprecia que está dentro de su rango de detección, por lo que seguramente este par de cebadores no encaja en la secuencia del gen ARNr 23S de este género. En el caso de Mesoplasma florum, una especie que antiguamente pertenecía al género Acholeplasma, la explicación de no haber sido detectado debería ser por la poca cantidad de ADN de la muestra utilizada, aunque también podría ser debido a que los cebadores no fuesen compatibles con su secuencia del 23S. Al analizar estas especies se observa que la similitud entre Acholeplasma y Mesoplasma florum en la secuencia del gen ARNr 23S, en el cual están basados este par de cebadores, es de 75,1%, mientras que la similitud de ambos géneros con MMC es de aproximadamente 46,2%. Podría Capítulo II: Estudio metodológico 92 inferirse, con esto que, aunque hubiera suficiente cantidad de ADN como para ser detectado, no se amplificaría ningún producto debido a la incompatibilidad de los cebadores y la secuencia del 23S de ambas especies y géneros. II.4.4 BACTERIAS NO-MOLLICUTES De las 21 bacterias no-mollicutes analizadas el 90,5% fue detectado por los cebadores de Spergser y colaboradores (2002) (2), mostrándose como el menos específico de todos los utilizados, mientras que el 81,2%, 76,2%, 38,1% y 4,8% con los de Hotzel y colaboradores (2003) (1), McAuliffe y colaboradores (2005) (3), Botes y colaboradores (2005) (5) y Van Kuppeveld y colaboradores (1992) (4), respectivamente. Los cebadores de Ramírez y colaboradores (2008) para la amplificación de la ISR mostraron la amplificación de uno o más productos de acuerdo a la especie de bacteria. Como se comentó anteriormente, hay bacterias que, al igual que los acholeplasmas, tienen insertado algún gen ARNt en algunas de sus copias de la ISR, lo que permite la visualización en el gel de más de un producto amplificado en la PCR. Nuestros resultados concuerdan con lo encontrado en otros estudios, quienes describen que observaron un producto amplificado al trabajar con la ISR de Mycobacterium avium sp., (Van der Giessen et al., 1994), Streptococcus sp. (Tung et al., 2007), Lactococcus garvieae (Blaiotta et al., 2002), Acinetobacter baumannii (Hernández et al., 2011) y Erysipelothrix rhusiopathiae (Ogawa et al., 2011); y más de uno con Bacillus cereus (Cherif et al., 2003), Staphylococcus aureus (Dolzani et al., 1994), Clostridium spp. (Indra et al., 2010), Fusobacterium spp. (Conrads et al., 2002), Aeromonas spp. (East y Collins, 1993), Escherichia coli (Morgan et al., 1978), Salmonella enterica (Christensen et al., 2000), Actinobacillus pleuropneumoniae (Fussing et al., 1998), Photobacterium damselae (Osorio et al., 2005) y Vibrio anguillarum (Fernández y Avendaño-Herrera, 2009). La única diferencia fue la observada con la ISR de Pseudomonas aeruginosa que en el presente estudio mostró sólo una banda pero que en el estudio de Tyler y colaboradores (1995) mostró tres. Esto podría ser, tal vez, por alguna diferencia de la cepa utilizada o al diseño de los cebadores que solo fue capaz de unirse a un operón. Capítulo II: Estudio metodológico 93 II.4.5 SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD Como se ha mencionado anteriormente, en la elección de un par de cebadores utilizados para la detección de un grupo de organismos específicos hay que considerar su sensibilidad y especificidad. Los cebadores indicados por Hotzel y colaboradores (2003) (1) resultaron ser los menos sensibles (62,3%) con límite de detección de 15,5 ηg/µl de ADN y baja especificidad (19%), no detectando ninguno de los cinco representantes del género Acholeplasma utilizados y detectando positivamente el ADN de 16 de las 21 bacterias utilizadas: todas las bacterias del filo Firmicutes y Clase Bacilli (géneros Bacillus, Lactococcus, Streptococcus y Staphylococcus) además de otras de diversas clases y familias. Este par no nos serviría para nuestros propósitos, ya que detecta la mayoría de las bacterias acuáticas que empleamos (excepto Vibrio anguillarum) por lo que podría darnos resultados “falsos positivos”. Hay que añadir a esto el inconveniente que tiene el visualizar en gel la electroforesis de un amplicón tan pequeño (102-110 pb) como el amplificado en este caso, pues es necesario utilizar un gel al 3% de agarosa, el triple de un gel utilizado normalmente, para poder discriminar entre las últimas bandas de pb del marcador molecular, además de no confundir la banda del producto amplificado con la marca final del ADN cuando corre por electroforesis. Considerando el valor y gasto de agarosa, esta PCR encarecería el gasto total del análisis. Por todo lo anterior estos cebadores no serían los adecuados para nuestro estudio. Los cebadores de Spergser y colaboradores (2002) (2) fueron los más sensibles (100%), ya que a mínimas concentraciones de ADN consiguieron amplificar productos de buena calidad. Sin embargo, su bajísima especificidad (9,5%), ya que detectó 19 de las 21 bacterias utilizadas, hacen que sea ineficaz cuando se trabaja con muestras de campo, sin filtrar o contaminadas. Ahora bien, si se tiene un cultivo puro, esta PCR es muy útil, sobre todo cuando los microorganismos crecen lentamente y se consigue extraer poco ADN de su cultivo. Aún con poco ADN genómico la secuencia del amplicón de estos cebadores serviría para ser secuenciada e identificar parcialmente una especie. III. CAPÍ Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 99 III.1 ANTECEDENTES El presente capítulo da cuenta del trabajo de identificación de mollicutes en cetáceos varados en las Islas Canarias entre los años 2010 y 2013; de pinnípedos muestreados en la Isla Decepción (Shetland del Sur, Antártica) entre los años 20102011; así como de invertebrados marinos muestreados en las costas canarias y peces provenientes de cultivos marinos experimentales o del ambiente natural. A continuación se presenta la metodología, resultados y discusión del trabajo llevado a cabo con las muestras. III.1.1 MAMÍFEROS MARINOS III.1.1.1 Importancia y situación del estudio de mamíferos marinos. El grupo de mamíferos marinos comprende aproximadamente 120 especies que se han adaptado a la vida acuática en el mar o dependen directamente de él para su alimentación. Taxonómicamente es muy diverso, incluyendo dos órdenes exclusivamente acuáticos CETÁCEA (ballenas, delfines, marsopas, etc.) y SIRENIA (dugongo y manatíes), así como a tres superfamilias del orden CARNIVORA: PINNIPEDIA (focas, otáridos y morsas), MUSTELIDAE (nutrias) y URSIDAE (oso polar), que considera especies adaptadas a la alimentación en el medio acuático. Estos mamíferos pueden ser encontrados en todos los océanos, desde las aguas de los polos hasta las del Ecuador y son parte esencial de la biodiversidad del ecosistema marino. A pesar de que el número de estas especies es menor en comparación con las terrestres, su biomasa total es grande y nada despreciable, siendo componentes integrales y esenciales dentro de su ecosistema y jugando un papel muy importante al regular las poblaciones de sus presas. Además, son considerados excelentes bioindicadores de los cambios ambientales a medio y largo plazo debido a la longevidad de algunas especies y su posición en la cima de la cadena trófica (Rengifo-Herrera, 2013). A pesar de su importancia ecológica, muchas de estas especies se consideran en riesgo o bajo amenaza de extinción debido, entre otros factores, a su caza indiscriminada y a la Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 100 contaminación y ocupación antropogénica de sus hábitats. Con el objetivo de minimizar estos impactos negativos y proteger las especies más amenazadas se han llevado a cabo muchos planes de protección a nivel mundial, considerando el estudio de su ecología y biología con el propósito de diseñar protocolos y estrategias de manejo de protección, así como para la determinación de áreas de preservación natural (International Fund for Animal Welfare, www.ifaw.org; International Union for Conservation of Nature, www.iucn.org; Oceana www.oceana.org; Whale and Dolphin Conservation, uk.whales.org; entre otras organizaciones). El Archipiélago Canario es una excelente fuente de material de estudio de mamíferos marinos, principalmente de cetáceos ya que es el hábitat permanente o de pasaje de casi 30 especies de estos mamíferos. Entre los factores que hacen de este archipiélago un lugar ideal para los cetáceos están: su posición geográfica estratégica, entre aguas tropicales y frías, justo en la ruta migratoria de varias especies; sus particularidades oceanográficas (temperaturas, grandes profundidades cerca de la costa al carecer de plataforma continental por ser de origen volcánico y la existencia de zonas de calmas en el sur-sureste insular, entre otras), o bien por la abundancia de presas en sus aguas (Carrillo et al., 2006; Arbelo-Hernández, 2007; Ortega-Martín et al., 2009). Existen también registros del siglo pasado de colonias de foca monje (Monachus monachus) en las islas más orientales aunque actualmente sólo han sido observados algunos ejemplares de forma esporádica y no hay una población fija residente (Espino et al., 2006). Otro ecosistema que también posee grandes poblaciones de mamíferos marinos corresponde al territorio Antártico. Este ecosistema ha sido durante mucho tiempo uno de los menos afectados por la influencia antropogénica, sin embargo, en los últimos años las presencia humana ha ido en aumento. Algunas de las consecuencias de tal incremento están relacionadas con aspectos sanitarios, como la aparición o reaparición de enfermedades virales, bacterianas, fúngicas o parasitarias entre la fauna nativa (Rengifo-Herrera, 2013), así como la bioacumulación de contaminantes químicos en los Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 101 tejidos de los organismos y una mayor susceptibilidad a enfermedades infecciosas (Rengifo-Herrera, 2013). Los pinnípedos antárticos constituyen uno de los grupos más representativos en el ecosistema antártico y se ha comprobado que constituyen excelentes especies centinelas para estudiar tales impactos; por lo que se han realizado diversos estudios para conocer el estado sanitario de las poblaciones naturales y sus cambios en el tiempo; de esta manera, se ha estudiado la presencia y frecuencia de agentes parasitarios e infecciosos relevantes en ellas (García-Peña et al., 2010; Pedraza-Díaz et al., 2011; Tryland et al., 2012). Hasta ahora no se ha realizado ningún estudio de identificación de mollicutes en estas especies antárticas por lo que hacerlo representa un gran aporte a la generación de conocimiento acerca de ellas, considerando sobretodo que estas bacterias podrían estar relacionadas con enfermedades. III.1.1.2 Origen de las muestras de mamíferos marinos utilizadas III.1.1.2.1 Cetáceos Las muestras de CETÁCEOS provinieron de los muestreos realizados por la División de Histología y Patología Animal del IUSA (Instituto de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria, Universidad de las Palmas de Gran Canaria - ULPGC), quienes entre sus líneas de investigación cuentan con la de “Patología de los Cetáceos”, uno de cuyos objetivos es el estudio de los cetáceos presentes en el archipiélago canario. Para tal propósito son monitorizados todos los ejemplares que varan en las islas. Un equipo del grupo de investigación se desplaza al lugar del varamiento o traslada el ejemplar a las instalaciones de la Facultad de Veterinaria de la ULPGC y recoge muestras para diferentes análisis que puedan determinar la condición fisiológica y nutricional del ejemplar, así como su causa de muerte y posibles patologías. Su protocolo de trabajo incluye, por lo tanto, el registro de sus medidas morfométricas, la evaluación de su condición fisiológica basada en clasificaciones específicas para cetáceos, además de la toma de muestras de sus órganos para posteriores análisis histopatológicos. La Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 102 oportunidad de trabajar con esta División fue posible gracias a su director, Dr. Antonio Jesús Fernández Rodríguez quien, junto a su equipo de trabajo, se mostró dispuesto a colaborar con nuestros objetivos mediante la toma de muestras para la identificación de mollicutes en los cetáceos trabajados. Para este propósito, fue adicionado a su protocolo usual de muestreo un “Protocolo para la toma de muestras en cetáceos para la identificación de mollicutes” (Anexo V.2.1), que fue llevado a cabo cada vez que se analizó un cetáceo varado. Una vez que las muestras llegaban al IUSA eran recogidas por el doctorando y continuado el proceso de cultivo microbiológico e identificación específica. Hay que recalcar la buena disposición de este equipo de trabajo y su cooperación en todo momento, siguiendo rigurosamente el protocolo de toma de muestras, así como en posteriores análisis y datos solicitados para completar la información de los ejemplares procesados. III.1.1.2.2 Pinnípedos de la Isla Decepción (Antártica) El trabajo con muestras de PINNÍPEDOS, por otra parte, se pudo realizar gracias a un convenio de trabajo realizado con el Laboratorio Central de Veterinaria de Algete (Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino, Algete-Madrid). A través del Jefe de su Departamento de Bacteriología General, Dr. Francisco Javier García Peña, fue posible acceder a muestras microbiológicas tomadas en pinnípedos en la Isla Decepción (latitud 62° 58′S; longitud 60° 40′O), en las Islas Shetland del Sur (Antártica), durante 2010. Tales muestras correspondían al proyecto “Presencia de Agentes Infecciosos y Parasitarios en Fócidos y Otáridos” de la Universidad Complutense de Madrid y llevado a cabo dentro de la Campaña Antártica del Ejército de Tierra 2010-2011. Se colectaron muestras para su análisis microbiológico. Se determinó la presencia de varias especies bacterianas, incluyendo a microorganismos de la clase Mollicutes. En el laboratorio de Algete se aislaron unos 70 mollicutes, que fueron enviados a nuestro laboratorio donde fueron procesados, cultivándolos e identificándolos posteriormente Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 103 mediante los protocolos de cultivo y técnicas de genética molecular utilizadas usualmente en nuestro grupo. III.1.2 INVERTEBRADOS Y PECES MARINOS III.1.2.1 Importancia y situación del estudio de invertebrados y peces marinos. Como se dijo anteriormente, debido a su posición geográfica y riqueza de nutrientes que posee en sus aguas, entre otros factores, las islas Canarias poseen un rico y valioso ecosistema marino. Debido a las consecuencias negativas que muchas veces puede tener la acción entrópica sobre los ecosistemas, en general es necesario preservarlos a través de medidas que consideren muchos aspectos. Una de las formas de hacer esto es generar conocimiento científico de él, estudiando por ejemplo: dinámicas poblacionales, composición específica, estado sanitario, etc. Uno de los aspectos que es interesante estudiar tiene relación con las poblaciones microbiológicas (bacterias y virus) que se encuentran en el ecosistema. Se sabe que algunas especies bacterianas pueden ser simbiontes o beneficiosas para el hospedador, mientras que otras, muy por el contrario, pueden ser patógenas. Las nuevas técnicas de análisis molecular ayudan bastante en este tipo de estudio, permitiendo detectar y describir de forma relativamente fácil las poblaciones bacterianas presentes en la muestra de un cierto hábitat u organismo. Como se demostró en la revisión bibliográfica, existe interés en conocer qué tipos de mollicutes pueden estar asociados a los organismos acuáticos y qué papel cumplen dentro de su ecosistema, por lo que cada vez que es posible acceder a muestras de organismos acuáticos es deseable muestrearlo y analizarlo desde este punto de vista. Por otra parte, y también ligado a la riqueza del ecosistema marino de Canarias ha surgido en los últimos años la idea de diversificar la economía de las islas a través del aprovechamiento de sus recursos naturales. Una forma de llevar esto a cabo es la implantación de centros de cultivos de acuicultura, que puedan cultivar especies locales, abriendo así un nuevo tipo de actividad profesional unido a la disminución de la Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 104 explotación de las poblaciones silvestres de tales especies. El Gobierno de Canarias viene invirtiendo en esta área a través de algunas líneas de investigación del Instituto Canario de Ciencias Marinas – ICCM y del Instituto Tecnológico de Canarias (ITC). Está claro que invertir en el conocimiento biológico de las especies empleadas en acuicultura es extremadamente importante, útil y necesario, para el desarrollo de estrategias de cultivo y producción eficientes. Debido a que actualmente las reservas naturales de peces están siendo excesivamente explotadas, la acuicultura se presenta como una buena opción en la producción de recursos pesqueros, con fines económicos o inclusive para repoblación. Uno de los problemas con que se enfrenta el cultivo de especies acuáticas corresponde a la falta de conocimiento biológico de ellas, aspecto fundamental a la hora de establecer protocolos de cultivo eficientes. Uno de estos aspectos está relacionado directamente con las enfermedades y patógenos asociados a las especies en cultivo, especialmente en cultivos comerciales intensivos en los que se emplean altas densidades, provocando estrés y la subsecuente inmunodepresión en los peces cultivados. Los mollicutes son bacterias que han sido estudiadas e indicadas como causantes o asociadas a enfermedades en especies ganaderas. En peces se han encontrado algunas especies de mollicutes pero los estudios de su identificación en peces son escasos y su papel en el desarrollo de enfermedades en peces todavía no está claro, identificándose hasta ahora una única especie, M. mobile, asociada directamente con la producción de enfermedades de peces de agua dulce. III.1.2.2 Origen de las muestras de invertebrados y peces marinos utilizadas. III.1.2.2.1 Invertebrados marinos Se tomaron muestras de medusa luminiscente, Pelagia nocticula, y de carabela portuguesa, Physalia physalis, aprovechando los varamientos masivos que se produjeron entre 2011 y 2013 en la playa Las Canteras (Latitud: 28° 8' 25'' N - Longitud: 15° 26' 9'' O) en la isla de Gran Canaria (España). Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 105 Las muestras de pota (Todarodes sagittatus,), así como algunas de peces, fueron tomadas gentilmente por las Dras. María José Caballero y Mónica Betancor, ambas pertenecientes al Grupo de Investigación en Acuicultura (GIA) de la ULPGC, quienes se trasladaron a la isla canaria de “El Hierro”, con el objetivo de tomar muestras para sus propias investigaciones histopatológicas de las especies que estaban muriendo por causa de una erupción volcánica submarina en sus proximidades. Las muestras de pulpo (Octopus vulgaris) provinieron de ejemplares mantenidos en cultivos experimentales por el GIA. El encargado de esa especie, Dr. Juan Estefanell, y su director, Dr. Juan Socorro, cedieron gentilmente todos los individuos que tenían disponibles para la toma de muestra para la presente tesis. III.1.2.2.2 Peces La mayoría de las muestras de peces utilizadas provinieron de los cultivos experimentales llevados a cabo por el GIA. Gracias a las gestiones realizadas por uno de los encargados del GIA, Dr. Daniel Montero, fue posible acceder a los ejemplares una vez que las experiencias terminaran. Hay que destacar la ayuda de las integrantes del Grupo de Enfermedades Infecciosas e Ictiopatología del IUSA, que prestaron toda su cooperación cuando fue necesario. El resto de los peces provinieron de cuatro muestreos realizados en la proximidades de la erupción volcánica submarina cerca del la isla “El Hierro”. Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 106 III.2 METODOLOGÍA El tratamiento de las muestras de cetáceos, pinnípedos, peces e invertebrados marinos (dos especies de medusa y dos de cefalópodos) utilizadas en el presente estudio fue muy similar. Una vez que las muestras fueron tomadas, procesadas y puestas en el medio general para bacterias o uno para el cultivo de mollicutes (hisopos estériles o líquido) se mantenían en incubación a 37 ºC (mamíferos marinos) ó 25 ºC (peces e invertebrados marinos) al menos 24 h, después de lo cual fueron filtradas al medio para mollicutes y puestas a incubar con las mismas condiciones anteriores donde eran mantenidas hasta que se observase un cambio de turbidez o color, como señal de crecimiento bacteriano. Si las muestras no cambiaban en turbidez ni color por lo menos durante un mes, se les extraía ADN y se le sometía a una PCR a tiempo real para detectar la presencia de mollicutes. Todos los pasos restantes relacionados con el cultivo microbiológico (crecimiento en placa, mantenimiento del cultivo, etc.) e identificación y caracterización de mollicutes fueron muy similares para todos explicándose en detalle aquellos aspectos particulares a cada grupo o especie trabajada. III.2.1 MATERIAL BIOLÓGICO. III.2.1.1 Cetáceos Las muestras fueron tomadas de cetáceos varados: 72 ejemplares de 15 especies diferentes en las Islas Canarias y Almería (cinco ejemplares) entre los años 2010-2013 (Tabla III-2). Los muestreos fueron realizados en terreno o durante la necropsia de ejemplares varados frescos y de algunos que llevaban de 1 a 3 meses congelados a -20 ºC en la Facultad de Veterinaria de la ULPGC. La recogida de muestras de boca, conjuntiva, espiráculo, pulmones, hígado, riñón, genitales (testículos u ovarios y útero), orificio urogenital; así como en cualquier zona que presentase algún tipo de infección conspicua (mamitis, artritis, etc.) fue realizada por arrastre utilizando hisopos estériles. Una vez tomadas las muestras los hisopos eran inoculados inmediatamente en tubos plásticos que contenían 2 ml del medio de cultivo general RPMI-1640 Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 107 suplementado con 10% de suero equino (fuente de colesterol) e incubados a 37 ºC en condiciones aeróbicas (Figura III-1). Figura III-1: Toma de muestras de un delfín listado (Stenella coeruleoalba) en las instalaciones de la Facultad de Veterinaria de la ULPGC (A). Introducción de un hisopo estéril en el ano (B). También fueron tomadas muestras de las articulaciones que mostraban artritis (C). Los hisopos eran inoculados inmediatamente en tubos conteniendo 2 ml del cultivo general RPMI-1640 suplementado con 10% de suero equino (fuente de colesterol) e incubados a 37 ºC en condiciones aeróbicas (D). III.2.1.2 Pinnípedos de la Antártica Las muestras se tomaron con torundas de la boca y vagina de 58 ejemplares de lobo marino antártico Arctophoca gazella [anteriormente Arctocephalus gazella (Berta y Churchill, 2012)]; 17 de focas de Weddell Leptonychotes weddellii; y 5 elefantes marinos Mirounga leonina de la Isla Decepción (Islas Shetland del Sur, Antártica) (Figura III-2 y Tabla III-8). Los muestreos fueron realizados en 2010 y las torundas fueron colocadas en el medio de transporte FBP (Gorman and Adley, 2004) con un 0,5% de carbón activado y se mantuvieron a -20 ºC hasta la llegada al Laboratorio Central de Veterinaria Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 114 Figura III-7: Toma de muestras de un ejemplar de pulpo (Octopus vulgaris) (A): Disección (B) y el muestreo por arrastre usando un hisopo estéril en las branquias (C), esófago (D), ojos (E) y glándula digestiva (F). Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 115 III.2.3 TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR III.2.3.1 Extracción de ADN El ADN fue extraído utilizando el kit comercial Realpure Genomic (Real) y su concentración fue cuantificada en un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). III.2.3.2 PCR (Polymerase Chain Reaction) a tiempo real Para confirmar la presencia de ADN de alguna especie de la clase Mollicutes fue realizada una PCR a tiempo real utilizando cebadores para amplificar un fragmento del gen ARNr 16S que resultó ser específico para mollicutes (ver Capítulo II) (Van Kuppeveld et al., 1992) (Figura III-8). Los cebadores utilizados fueron GPO-3 (5’-GGG AGC AAA CAG GAT TAG ATA CCC T-3’) (forward) y MGSO (5’-TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC-3’) (reverse), y el protocolo consideraba un ciclo de desnaturalización de 94 ºC por 5 min; 40 ciclos de 94 ºC por 30 s, 60 ºC por 30 s y 72 ºC por 30 s y un ciclo final de 72 ºC por 30 s. Dicho protocolo fue llevado a cabo en un MyiQi Cycler Detection System (Bio-Rad) empleando un sistema de incubación de 25 µl, conteniendo 12,5 µl de iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad), 1 µl (20 µM) de cada cebador, 5 µl de muestra, y agua PCR-grade (Sigma). Como control positivo fue utilizado ADN de Mycoplasma mycoides subsp. capri (Y-GOAT) y como negativo, agua. Los resultados fueron analizados empleando el programa MyiQ system 1.0.410. También fue analizada la curva de disociación resultante, considerando una muestra como positiva cuando su temperatura de fusión estuvo entre 85 y 87 ºC. III.2.3.3 PCR para secuenciación Todas las muestras que fueron positivas por PCR a tiempo real a la presencia de mollicutes fueron sometidas a PCR’s convencionales, amplificando el gen ARNr 16S entero (Yavari, 2010) y la región intergénica entre los genes ARNr 16S y 23S (ISR) (Ramírez et al., 2008A) (Figura III-9). Cuando el producto amplificado de ISR obtenido Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 116 era muy poco debido a poca cantidad de ADN disponible se utilizó una PCR más sensible fragmento del gen ARNr 16S de 580 pb para su identificación específica, por medio de una PCR muy sensible (Spergser et al., 2002) (Figura III-8). Adicionalmente, y para la descripción de nuevas especies encontradas fue secuenciado el gen ARNr 23S (Poveda et al., 2012) (Figura III-10) y la región entre los genes ARNr 23S y 5S (ISR2) (Ramírez et al., 2010) (Figura III-11). Para obtener la secuencia entera del gen ARNr 16S fue necesario dividirla en tres fragmentos que fueron amplificados mediante PCR’s separadas. Para el fragmento A fueron utilizados los cebadores 16S-Start pos (5'-GAG AGT TTG ATC CTG CGT CAG G-3’) y 16S-550 neg (5'-CCC AAT AAA TCC GGA TAA CGC TTG C-3’); para el B, 16S–510 pos (5'-CTG ACG CGT AAC TAT GTC CCA GCA G-3’) y 16S–1050 neg (5'-GCT GAC GAC AAC CAT GCA GC-3’); y para el C, 16S–980 pos (5'-CGA AGA ACC TTA CCC ACT CTT GAC ATC-3’) y 16S–end neg (5'-GGT AAT CCA TCC CCA CGT TCT CG-3’). Para la ISR se utilizaron los cebadores 16S+C (5'- CGT TCT CGG GTC TTG TAC AC-3’) y 23S-B (5'-CGC AGG TTT GCA CGT CCT TCA TCG-3’). El protocolo de PCR fue igual para todos los fragmentos amplificados e ISR y consistió en un ciclo de desnaturalización de 94 ºC por 2 min; 35 ciclos de 94 ºC por 15 s, 60 ºC por 30 s y 72 ºC por 30 s; y un ciclo final de 72 ºC por 30 s. Los cebadores para la amplificación de un fragmento del gen ARNr 16S fueron MW28 (5’-CCA GAC TCC TAC GGG AGG CA-3’) y MW29 (5’-TGC GAG CAT ACT CAG GC-3’), y su protocolo de pcr consideró un ciclo de desnaturalización de 94 ºC por 1 min; 35 ciclos de 94 ºC por 80 s, 55 ºC por 80 s y 72 ºC por 2,5 min; y un ciclo final de 72 ºC por 5 min. La amplificación del gen ARNr 23S fue dividida en seis fragmentos, utilizando los juego de cebadores mostrados en la Tabla III-1. La ISR2 fue amplificada usando los cebadores 23S+S (5'- GCT CTT AGT ACG AGA GG-3’) y 5S-A (5'- GCT TAA CTT CTG TGT TCG GAA TGG G-3’). El protocolo de PCR para los fragmentos A y F, así como ISR2 consistió en un ciclo de desnaturalización de 94 ºC por 2 min; 35 ciclos de 94 ºC por 15 s, 45 ºC por 30 s y 72 ºC por 2 min; y un ciclo final de 72 ºC por 1 min. El protocolo para los restantes fragmentos fue similar, difiriendo sólo en la temperatura de alineamiento que en vez de ser de 45 ºC fue de 55 ºC. Todos estos protocolos fueron ejecutados en un termociclador Mastercycler Gradient (Eppendorf) con un sistema de incubación de 25 µl utilizando Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 117 illustraTMPureTaqTM Ready-to-GoTM PCR beads (GE Healthcare), 1 µl (20 µM) de cada cebador, 3 µl de muestra, y agua PCR-grade (Sigma). Los controles positivo y negativo fueron los mismos que los utilizados anteriormente. Para confirmar su amplificación, a los productos de PCR se les realizó una electroforesis (100 V por 50 min) en un gel de agarosa (1% p/v en tampón TAE 1x) teñido con Gel-Red (Biotium) (0,025 µl/ml) y posteriormente visualizado en un transiluminador (Bio-Rad). Figura III-8: Representación esquemática de los cebadores indicados por Van Kuppeveld y colaboradores (1992)a y Spergser y colaboradores (2002)b. R: Regiones complementarias. Figura III-9: Representación esquemática de los cebadores utilizados para amplificar el gen ARNr 16S (Yavari, 2010) y la región intergénica ISR (cebadores 16S+C y 23S-B) (Ramírez et al., 2008). R: Regiones complementarias. Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 118 Figura III-10: Representación esquemática de los cebadores utilizados para amplificar el gen ARNr 23S (Poveda et al., 2012). R: Regiones complementarias. Figura III-11: Representación esquemática de los cebadores utilizados para amplificar la región intergénica ISR2 (Ramírez et al., 2010). R: Regiones complementarias. Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 119 Tabla III-1: Pares de cebadores utilizados para la amplificación del gen ARNr 23S (Poveda et al., 2012) III.2.3.4 Secuenciación y análisis de las secuencias La secuenciación fue llevada a cabo por la empresa Macrogen Europe (Holanda) con un modelo de secuenciador de Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer. Para la lectura de los cromatogramas (formato ABI) se utilizó el programa informático FinchTV versión 1.3.1 (Geospiza, Inc.). Programa que también se empleó para exportar las secuencias de dichos cromatogramas (formato SEQ). El programa Gene Runner 3.05 (Hasting Software Inc.) se utilizó para alinear las secuencias de ida y de vuelta de cada producto, así como en el caso de necesitar más de un producto para completar la secuenciación de los genes, obteniendo una secuencia consenso. Para comparar secuencias se utilizó el programa BioEdit Sequence Aligment Editor (Isis Pharmaceuticals, Inc.) y para calcular los porcentajes de similitudes entre ellas. Usándose también para obtener las imágenes de las comparaciones entre secuencias. La secuencia de nucleótidos obtenida, comparada con la base de datos GenBank empleando la aplicación Basic Local Alignment Search Tool (BLASTn) (Atschul et al., Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 120 1997). Los dendogramas se obtuvieron con la ayuda de la herramienta informática MEGA 5.05 (Tamura et al., 2011) Este análisis también permite la construcción de árboles filogenéticos que reflejan esquemáticamente el grado de parentesco genético entre los mollicutes analizados. Para poder llevar a cabo este análisis se necesitó de la secuencia del gen ARNr 16S. Para un análisis filogenético más completo de las secuencias del gen ARNr 16S, las secuencias de los micoplasmas de cefalópodos se añadieron a la base de datos de secuencias del gen ARNr 16S (LTP_s104, http://www.arb-silva.de/projects/living-tree/) que recopila todas las secuencias de las cepas tipo que presenten datos de alta calidad (Yarza et al., 2010). Las secuencias fueron alineadas usando el paquete informático ARB (Ludwig et al., 2004) (www.arb-home.de), y mejorado el alineamiento manualmente. Todas las reconstrucciones de árboles se realizaron empleando la versión 7.0 del algoritmo RAxML con el modelo GTRGAMMA (Stamatakis, 2006). En todos los casos, la reconstrucciones de los árboles se realizaron utilizando un filtro de conservación de secuencias del 40% para todas las bacterias (Yarza et al., 2010). III.2.3.5 DGGE (Denatured Gradient Gel Electrophoresis) Con el objetivo de caracterizar y comparar los mollicutes identificados en las muestras provenientes de pinnípedos se realizó la técnica de la DGGE con un fragmento amplificado del gen ARNr 16S (McAuliffe et al., 2005). Los cebadores utilizados en la PCR fueron GC341F (5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’) y R543 (5'-ACC TAT GTA TTA CCG CG3’), y el protocolo consideraba un ciclo de desnaturalización de 94 ºC por 5 min; 29 ciclos de 95 ºC por 60 s, 56 ºC por 45 s y 72 ºC por 60 s; un ciclo final de 72 ºC por 10 min. Para confirmar su amplificación, los productos de PCR fueron corridos por electroforesis Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 121 (100 V por 50 min) en un gel de agarosa (1% p/v en tampón TAE 1x) teñido con Gel-Red (Biotium) (0,025 µl/ml). El gel de DGGE fue elaborado a partir de dos soluciones de acrilamida al 60% y 30% p/v de urea (Anexo V.2.3.2), mezclando 20 ml de cada una con 182 µl de APS al 10% p/v (Sigma) y 9 µl de TEMED (Sigma). Los geles fueron montados en cristales previamente limpiados con etanol 70% y aclarados con agua bidestilada y colocados en el tanque de electroforesis con siete litros de tampón TAE 1x y mantenidos a 60 ºC. El gel fue cargado con 10 µl de cada muestra mezclados con 10 µl de Loading Buffer (BioRad). Finalmente, el gel fue sometido a una corriente constante de 60 V a 60 ºC durante 16 h en un DCode Universal Mutation Detection System (Bio-Rad). Posteriormente, dicho gel fue teñido con SYBR® Gold (Invitrogen) (10 % v/v en tampón TAE 1x) dejándose en oscuridad durante 30 min para después ser visualizado en un transiluminador (Bio-Rad). III.2.4 PRUEBAS DE CRECIMIENTO (CEFALÓPODOS) Con el objetivo de determinar los rangos adecuados de temperatura y salinidad de los mollicutes aislados de cefalópodos en el medio de cultivo empleado, fueron realizadas pruebas de crecimiento sometiendo a subcultivos progresivos de cada muestra positiva a seis temperaturas de cultivo diferentes (4, 10, 18, 25, 30 y 37 ºC) y, posteriormente, y basados en los resultados obtenidos, a una batería de trece porcentajes de salinidades (de 0 a 6% de cloruro sódico, con valores intermedios crecientes de 0,5 %) a dos temperaturas de cultivo, 18 y 25 ºC. III.2.5 PRUEBAS BIOQUÍMICAS Se procedió a la determinación del perfil bioquímico de cada mollicute identificado según lo descrito por Poveda (1998). En 2 ml de medio de glucosa, manosa, urea, arginina y trifenil-tetrazolium fueron inoculados 200 µl de cultivo fresco (Anexo V.2.2.3). En el caso de invertebrados marinos fueron utilizados medios con un 3% de cloruro sódico. Para garantizar un medio anaerobio fueron añadidos a cada tubo 300 µl Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 122 de parafina estéril. Para cada prueba fue considerado un tubo como control negativo que contenía el medio de prueba para bioquímica pero sin inóculo. La fermentación de la glucosa y manosa fue interpretada como positiva cuando el medio cambió de color, de rojo a amarillo. La reducción de arginina fue positiva cuando el medio pasó de rojo a color violeta, así como la hidrólisis de urea. La reducción de trifenil-tetrazolium fue positiva si se formaba un precipitado rojo en el fondo del tubo. El tiempo máximo para esperar una reacción positiva del cultivo fue de 2 semanas desde su inoculación. Paralelamente, fue realizada la prueba de producción de Películas y Cristales, sembrando una placa del medio utilizado con 200 µl de cultivo fresco. La prueba fue considerada positiva si se observaba la formación de cristales alrededor de las colonias y una película en la superficie. III.2.6 ANÁLISIS HISTOLÓGICOS (CEFALÓPODOS) Fueron realizados los análisis histológicos de las branquias y glándula digestiva de pota. Las muestras fueron mantenidas en formol tamponado (4%) hasta su procesamiento. Cada muestra fue deshidratada en alcohol en un procesador de tejidos (Histokinette 2000) e incluida en parafina (dispensador Jung Histoembedder, Leica) para después aplicarle un protocolo de tinción con hematoxilina-eosina. Posteriormente, se cortaron secciones de 5 µm en un micrótomo (Leica) para su observación en el microscopio (Olympus CX41) según los procedimientos descritos por Martoja y colaboradores (1970). Las fotografías fueron realizadas con una cámara Olympus XC30 (Olympus). Las imágenes obtenidas fueron procesadas con el programa de edición de fotografías CellB (Olympus). Capítulo III: Microorganismos de la Clase Mollicutes en organismos marinos 123 III.3 RESULTADOS La Figura III-12 muestra una curva de disociación obtenida por la PCR a tiempo real empleando cebadores específicos para la detección de mollicutes basados en un fragmento del gen ARNr 16S (Van Kuppeveld et al., 1992). Figura III-12: Curva de disociación obtenida por PCR a tiempo real usando cebadores específicos para la detección de mollicutes basados en un fragmento del gen ARNr 16S (Van Kuppeveld et al., 1992). Las flechas indican las curvas de su mismo color, siendo: C+: control positivo (M. mycoides subsp. capri (Y-GOAT)); C-: control negativo (agua); M+: muestras positivas; M-: muestra negativa. III.3.1 MAMÍFEROS MARINOS III.3.1.1 Cetáceos La Tabla III-2 muestra los aislamientos de mollicutes identificados en los cetáceos varados en las Islas Canarias y cinco de Almería entre los años 2010-2013. La identificación de las especies de mollicutes fue realizada sin inconvenientes utilizando la secuencia de la ISR o del gen ARNr 16S. Muchas muestras que fueron positivas a la presencia de mollicutes por PCR no pudieron ser secuenciadas debido a la poca Capítulo V: Anexos 222 Corte tranversal (40x) de la pared del estómago. Corte tranversal (40x) de la pared del intestino. Capítulo V: Anexos 223 V.4.4 COMUNICACIONES ORIGINADAS  Vega-Orellana O.M.; Poveda J.B.; García-Peña, F.J.; García-Párraga, D.; Pedraza-Díaz, S.; Ortega-Mora, L.M.; Ramírez, A.S. 2014. “Mollicutes Found in Pinnipeds from Deception Island (Antarctica)”. 20th International Congress of the International Organization for Mycoplasmology – IOM.1-6 de Junio. Blumeau, Brasil. Programs and Abstracts. (Póster).  Vega-Orellana O.M.; Poveda J.B.; Mederos-Iriarte, L.E.; Poveda, C.; SuárezPérez, A.; Ramírez, A.S. 2014. “A putative Spiroplasma isolated from jellyfish (Pelagia nocticula) in Canary Islands (Spain)”. 20th International Congress of the International Organization for Mycoplasmology – IOM.1-6 de Junio. Blumeau, Brasil. Programs and Abstracts. (Póster).  Vega-Orellana O.M.; Poveda J.B.; Estefanell, J.; Socorro J.; Roselló-Móra, R.; Ramírez, A.S. 2014. “A Putative Mycoplasma Isolated from Common Octopus (Octopus vulgaris) and its Relationship with a Mycoplasma Isolated from European Flying Squid (Todarodes sagittatus)”. 20th International Congress of the International Organization for Mycoplasmology – IOM.1-6 de Junio. Blumeau, Brasil. Programs and Abstracts. (Póster).  Vega-Orellana, O.M., Poveda, J.B., Mederos-Iriarte, L.E., Poveda, C.G., Caballero, M.J., Betancor, M.B., Roselló-Móra, R., Ramírez, A.S. 2013. “Mollicutes of non-mammal marine animals”. European Mycoplasma Meeting “Mycoplasmas – a practical approach”. 6-7 de Junio. Dubrovnik, Croacia. Book of Abstract, p. 27. (Presentación oral).  Vega-Orellana O.M., Ramírez Corbera A.S., Poveda C., Mederos-Iriarte L.E., Suárez-Pérez A., Sierra, E., Arbelo M., Fernández A., Poveda J.B. 2012. “Mycoplasma sp Phocoena Found in Two Striped Dolphins, Stenella Capítulo V: Anexos 224 coeruleoalba, from Canary Islands (Spain)”. 19th International Congress of the International Organization for Mycoplasmology – IOM.15-20 de Julio. Toulouse, Francia. Programs and Abstracts, p. 122. (Póster).  Vega-Orellana O.M., Ramírez Corbera A.S., Mederos-Iriarte L.E., Poveda C., Suárez-Pérez A., Betancor, M., Caballero M.J., Poveda J.B. 2012. “A putative mycoplasma isolated from European flying squid, Todarodes sagittatus, in Canary Islands (Spain)”. 19th International Congress of the International Organization for Mycoplasmology – IOM.15-20 de Julio. Toulouse, Francia. Programs and Abstracts, p. 122. 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