Polimorfismos de los genes TNF, LTA, IL-1RN y TNFR2: papel en la susceptibilidad, gravedad y pronóstico de la neumonía adquirida en la comunidad

Polimorfismos de los genes TNF-α, LT-α, IL1RN y TNF-R2. Papel en la susceptibilidad, gravedad y pronóstico de la neumonía adquirida en la comunidad. UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS MÉDICAS Y QUIRÚRGICAS José María Ferrer Agüero Las Palmas de Gran Canaria, 2010 Tesis Doctoral Certificado del Secretario del Departamento UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Facultad de Ciencias de la Salud Departamento: Ciencias Médicas y Quirúrgicas Programa de Doctorado: Avances en Medicina Interna Polimorfismos de los genes TNF-α, LT-α, IL-1RN y TNF-R2. Papel en la susceptibilidad, gravedad y pronóstico de la neumonía adquirida en la comunidad. Tesis Doctoral presentada por D. José María Ferrer Agüero para optar al grado de Doctor Director Dr. D. Jordi Solé Violán Codirector Dr D. Felipe Rodríguez de Castro El/la Director/a El/la Codirector/a El/la Doctorando/a Las Palmas de Gran Canaria a 15 de marzo de 2010 Dedicatorias A Julia, mi esposa Quien con su presencia, paciencia, aliento y compañía me ha dado fuerza y esperanza tantas veces. A mis padres, Por la infancia que me dieron y los principios y gustos con que me educaron. A mis hijos, José María y Miguel Cuyas vidas, aún en cierne, completan mi existencia. A mi hermano Luis María, Quien, con su claridad de ideas y cultura, tanto influyó en mi vida, sin proponérselo. “EL ELOGIO ES EL ESTÍMULO DEL NECIO, Y ALIMENTO DEL VANIDOSO”. JOSÉ MARÍA FERRER AGÜERO. Agradecimientos Al Dr. JORDI SOLÉ VIOLÁN, quien con su vigor intelectual y su inestimable aporte en conocimientos y formación médicos, me ha guiado escrupulosamente y alentado en el desarrollo de esta Tesis Doctoral. Al Prof Dr. FELIPE RODRÍGUEZ DE CASTRO, el docente por excelencia, de cuyo talante aleccionador y rigor científico en sus publicaciones recogí simientes que dieron su fruto en el presente trabajo. Al Servico de Inmunología del Hospital Universitario Dr. Negrín, en especial distinción al Prof. CARLOS RODRÍGUEZ GALLEGO, que sin sus ricos conocimientos y sin su generoso aporte , no hubiese sido posible concretar esta Tesis. Merece asimismo todo mi reconocimiento el Personal de dicho Servicio: Isabel García Laorden, Ayose García Saavedra, Nereida Gónzalez Quevedo y Javier Hernández López, que invirtieron su tiempo en ayudarme en esta labor científica. Al Servicio de MICROBIOLOGÍA, por su valioso apoyo en la custodia y en el procesamiento de las muestras; el trabajo del Personal de su laboratorio, tiene su reflejo en esta Tesis Doctoral. Mi particular reconocimiento a la Dra. ANA BORDES. A la Dra MARÍA DOLORES FIUZA por su inestimable ayuda en el procesamiento de los datos estadísticos. A los Doctores JOSÉ LUIS MANZANO y JUAN JOSÉ MANZANO, que contribuyeron, con sus conocimientos médicos y su dilatada experiencia, a mi formación en esta especialidad. Al Dr. JOSÉ BOLAÑOS GUERRA, figura del trabajador incansable, siempre entregado a sus enfermos en sus maduros años con el espíritu joven del médico de “La Ciudadela”, de Cronin. Finalmente, en mis recuerdos, El Rdo. P. JUAN A. FASOLATO, quien me enseñó en mis años jóvenes a reflexionar con sensatez, y por su sabiduría y vida al servicio de los demás. Al Dr. JORGE O. DZIENISIK, el clínico por excelencia; compañero argentino que fuera mi ideal como médico, y que lo será siempre. A ISABEL SANZ DÍAZ, la amiga con quien he compartido momentos ora gratos, ora difíciles, cuya presencia siempre ha sido cálida y cercana. ADN: Ácido Desoxirribonucleico. APACHE: Acute Physiology and Chronic Health Evaluation. ATS: American Thoracic Society. BPI: Proteína Ligadora Incrementadora de Permeabilidad. CARS: Síndrome de Respuesta Inflamatoria Compensadora. CMH: Complejo Mayor de Histocompatibilidad. CID: Coagulación Intravascular Diseminada. EPOC: Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica. Fc: Fracción cristalizable de la inmunoglobulina FiO2: Fracción Inspirada de Oxígeno. FMO: Fracaso Multiorgánico. GH: Genoma Humano. IgG: Inmunoglobulina clase G. IL: Interleucina o interleuquina. IL-1RN: Antagonista del Receptor de la IL-1. LBA: Lavado Broncoalveolar. LBP Proteína Ligadora de LPS. LTA: Linfotoxina Alfa. LPS: Lipopolisacárido. NAC: Neumonía Adquirida en la Comunidad. NaCl: Cloruro Sódico. OR: Odds Ratio. ABREVIATURAS p: Probabilidad. PaO2: Presión Parcial de Oxígeno. Pb: Pares de bases PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa. PORT: Pneumonia Patient Outcomes Research Team. PMAP: Patrón Molecular Asociado a Patógenos. PSI: Pneumonia Severity Index. rpm: Revoluciones por minuto. RRP: Receptores Reconocedores de Patrones. SDRA: Síndrome de Distrés Respiratorio Agudo. SNP: Polimorfismos de un Solo Nucleótido. TNF: Factor de Necrosis Tumoral. TLR: Receptores Tipo “Toll”. ufc: Unidades Formadoras de Colonias. UCI : Unidad de Cuidados Intensivos . VIH: Virus de Inmunodeficiencia Humana. 4 Tesis Doctoral motivos de esta gran variabilidad clínica de la NAC. Desde hace tiempo se sospecha que algunos factores genéticos determinan la susceptibilidad y la resistencia a las enfermedades infecciosas graves. Diversos informes procedentes de estudios en modelos animales, en grupos raciales, en casos familiares y en gemelos, han presentado pruebas definitivas de la importancia de la genética en las infecciones graves (14). Las estimaciones de la importancia de la genética del huésped, independientemente de los efectos del medio ambiente, se pueden obtener también mediante estudios en niños adoptados. Sorensen et al (15), publicaron un estudio sobre las causas de muerte prematura en familias con niños adoptados en edad temprana. Encontraron que si los padres biológicos habían muerto por una infección antes de la edad de 50 años, su hijo tenía un riesgo relativo de morir por infección de 5,81; mientras que por el contrario, el fallecimiento de los padres adoptivos por una infección no confería un mayor riesgo al hijo de fallecer por esta causa. Por tanto, la conclusión que se obtiene de este estudio es que la susceptibilidad y la respuesta a la infección tiene una influencia genética sorprendentemente importante. (Tabla 1) Tabla 1.- Efectos de las causas del fallecimiento sobre adoptados. Sorensen et al. N Engl J Med 1988; 318:727-32 Causa de muerte Naturales Biológico Adoptivo Infección Biológico Adoptivo Vascular Biológico Adoptivo Cáncer Biológico Adoptivo Padre/Madre fallecido antes de 50 años Padre/Madre fallecido antes de 70 años 1,98 0,96 5,81 0,73 4,52 3,02 1,19 5,16 1,49 0,96 5,00 1,00 1,92 1,50 0,87 1,49 5 Tesis Doctoral El estudio del genoma humano (GH) ha proporcionado un punto de partida para el análisis sistemático de la diversidad génica en el hombre. El GH completo está formado por unos 3,1 gigabases y, aunque se desconoce el número exacto de genes que contiene, se estiman en torno a los 20.000 o 25.000 genes, si bien sólo la mitad tiene un patrón de secuencia de bases que sugiere una posible función. Una de las características del GH con relevancia médica y social es que, como promedio, dos individuos no relacionados genéticamente, comparten más del 99% de sus secuencias de ADN. Sin embargo, dado que existen más de tres mil millones de pares de bases en el GH, la secuencia de ADN de dos personas difiere en varios millones de bases. A estas variantes nos referimos habitualmente con la denominación de polimorfismos (16,17). 1.2ALGUNOS CONCEPTOS PREVIOS. Un polimorfismo genético es, por tanto, una región del genoma que varía entre los individuos de una población. Esta variante alélica debe afectar a una porción significativa de la población normal, generalmente a más del 1% (lo que excluye a las mutaciones espontáneas que pueden ocurrir y extenderse a la descendencia, en el seno de una familia), y puede tratarse de la sustitución de un solo nucleótido, o afectar al número de secuencias cortas repetitivas (microsatélities y minisatélites) de nucleótidos que constituyen más del 50% del GH (16). Particularmente importantes son los llamados polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Los SNP son la forma más importante y frecuente de variación en el GH y la mayoría de las diferencias genéticas entre individuos es de este tipo. La diferencia puede radicar en la sustitución, la inserción o la delección de una base (17). Se cree que hay aproximadamente diez millones de estos polimorfismos en la especie humana, lo que significa que unos diez millones de posiciones a lo largo del genoma (cada 300-500 nucleótidos) tienen variaciones frecuentes. 6 Tesis Doctoral Para que un polimorfismo sea relevante desde el punto de vista funcional, debe alterar bien la cantidad o la calidad de la proteína que expresa el gen. Estos polimorfismos están habitualmente situados en la región promotora del gen, que es la zona que tiene la información necesaria para activarlo o desactivarlo y que por tanto condicionan el nivel de producción de una proteína, o bien en los exones, que son la región codificante del gen y que al modificar el aminoácido en la proteína que codifica el gen, pueden alterar su función (17-18). Sin embargo, es importante señalar que estos polimorfismos funcionales son los menos frecuentes, pues con diferencia los más comunes son los que se localizan en los intrones, que son las regiones del gen que no se traducen en proteínas (18). De cualquier forma, todos los polimorfismos tienen un valor potencial muy interesante como marcadores genéticos. Para algunas enfermedades, la mutación en un solo gen es a la vez necesaria y suficiente para producir el fenotipo clínico y provocar la enfermedad (19). En estos casos, los patrones de herencia son sencillos y generalmente es posible rastrear el gen mediante análisis de ligamiento, que comparan la segregación de la enfermedad con la segregación de marcadores genéticos en familias con varios miembros afectos (19). En conjunto, se han identificado más de 200 mutaciones monogénicas importantes y poco frecuentes (no se puede hablar de polimorfismos en sentido estricto) que se asocian con frecuencia a infecciones bacterianas recurrentes, y se detectan en la infancia (20-21). Sin embargo, la mayoría de los rasgos fenotípicos de las enfermedades comunes están determinados por muchos genes que colaboran en diferentes loci, y carecen del patrón de herencia simple (mendeliana) que caracteriza a las enfermedades monogénicas. Estas enfermedades complejas o poligénicas son el resultado de la combinación de diferentes factores genéticos y 7 Tesis Doctoral ambientales e incluyen enfermedades tan frecuentes como la diabetes, la hipertensión o la arteriosclerosis y, naturalmente, también la susceptibilidad y la respuesta a la infección. Estas enfermedades tienen un patrón de herencia no mendeliano (19). La mayoría de las evidencias del papel genético en las infecciones procede de los estudios de asociación, en los que se compara la incidencia de mutaciones específicas (frecuencias alélicas) de genes que se sabe o se presume que influyen en la intensidad de la respuesta inflamatoria en una población con infección y una población control extraída del mismo grupo étnico (22-23). Los requisitos que deben cumplir los estudios de casos y controles son básicamente cuatro: 1.- Las poblaciones deben ser étnicamente homogéneas. Un grupo étnico puede estar predispuesto a desarrollar una enfermedad por razones exclusivamente socioculturales. En estas circunstancias, una muestra aleatorizada de casos de la enfermedad contendrá una proporción de ese grupo étnico mayor de la que se encuentra en la población general y, por tanto, existe el riesgo de encontrar aparentes “asociaciones genéticas” que pueden reflejar simplemente diferencias étnicas, y no la existencia de genes de susceptibilidad. 2.- El polimorfismo del gen debe ser importante. Es decir, que la mutación debe ser suficientemente frecuente como para afectar a una porción significativa de la población, y sus efectos han de ser relevantes. Como ya se ha mencionado anteriormente, la mayoría de los SNP no modifican la cantidad o la calidad del producto del gen, por lo que se denominan silentes (no cambia el aminoácido a pesar de cambiar el nucleótido) o conservadores (aunque cambia el aminoácido, éste es sustituido por otro de estructura similar que no modifica la función de la proteína). Por el contrario, los polimorfismos son importantes cuando modifican la regulación del gen (SNP del promotor o del potenciador) o la estructura primaria del gen (SNP de exón). Es preciso tener en cuenta, además, que aunque genes diferentes dentro de un mismo cromosoma pueden determinar la susceptibilidad a la infección de forma independiente, también puede suceder 8 Tesis Doctoral que la asociación observada entre un gen y una enfermedad sólo esté reflejando lo que está sucediendo en un gen vecino. Existen evidencias de que muchos alelos se segregan en bloque formando haplotipos. Mientras que un SNP representa una variante de un solo nucleótido, un haplotipo representa un grupo de polimorfismos o alelos estrechamente ligados en un cromosoma y que se heredan como una unidad. El Proyecto Internacional sobre Haplotipos se propone identificar los patrones de variación comunes en el GH lo que, a su vez, facilitará la selección de ciertos SNP (tag-SNP), que identifican de manera exclusiva ciertos haplotipos. 3.- El producto del gen candidato debería estar implicado en la fisiopatología de la enfermedad y por tanto, en los estudios de asociación debería proporcionarse, siempre que sea posible, información acerca de la funcionalidad del gen y de qué forma se modifica en las variantes polimórficas. 4.- La definición del fenotipo también es un aspecto clave en cualquier estudio genético cuyo objetivo sea detectar los genes de la enfermedad. Por otra parte, la evolución de ésta debe ser lo suficientemente frecuente o lo suficientemente grave como para permitir las comparaciones. Esto puede ser relativamente fácil en algunas enfermedades, pero es más complicado de establecer en algunos cuadros infecciosos como las neumonías, cuyas manifestaciones clínicas, evolución y etiología pueden ser muy variables. La defensa del huésped contra los microbios es un proceso extraordinariamente complejo que se fundamenta tanto en componentes innatos como adaptativos. El sistema inmune innato constituye la primera línea de defensa que impide la invasión y diseminación de patógenos durante las primeras horas posteriores a la invasión. La protección inmediata frente a microorganismos incluye tres mecanismos: a) el reconocimiento del patógeno; b) la fagocitosis de los microorganismos invasores, y c) el desarrollo de una respuesta inflamatoria (16,18). 9 Tesis Doctoral 1.3PREDISPOSICIÓN GENÉTICA A LA INFECCIÓN. A lo largo de la evolución, la inmunidad innata ha desarrollado un sistema altamente eficiente de reconocimiento de un patrón molecular común y constante de la superficie de los microorganismos denominado patrón molecular asociado a patógenos (PMAP), a través de los receptores reconocedores de patrones (RRP). Entre los principales PMAP se encuentran el lipopolisacárido (LPS) de las bacterias Gram negativas, ácido lipoteicoico y peptidoglicano (Grampositivos), zymosan (levaduras), secuencias de ADN CpG no metiladas, manosa y ARN bicatenario (virus) (17-18). Por otra parte, hay distintos tipos de proteínas que presentan características de RRP capaces de reconocer patrones moleculares asociados a patógenos, y que se pueden dividir en tres categorías: a) Las proteínas humorales que circulan en el plasma, como el sistema del complemento y la lectina de unión a manosa (MBL), que se une a sus ligandos en la superficie de muchos microorganismos e inducen la activación del complemento y la fagocitosis de los patógenos. b) Los receptores endocíticos, como los receptores de la manosa, y los receptores para la región Fc de las inmunoglobulinas (FcγR), que promueven la fagocitosis. c) Los receptores señaladores, como los receptores similares a Toll (TLR) y CD-14, expresados fundamentalmente en la superficie de las células epiteliales y en las células presentadoras de antígenos (monocitos/macrófagos y células dendríticas). Al unirse los PMAP a los RRP se activa el NF-κB que es una proteína intracelular que provoca la transcripción de citocinas pro (TNF, IL-1, IL-6) y antiinflamatorias (IL-10), que son los reguladores proteicos clave de la inflamación (18,24). Cada uno de los escalones de esta respuesta inmune puede verse afectado por los 10 Tesis Doctoral polimorfismos de los genes que pueden provocar una susceptibilidad o resistencia a la infección. 1.4 POLIMORFISMOS IMPLICADOS EN LA RESPUESTA A LA INFECCIÓN. 1.4.1 Polimorfismos implicados en el reconocimiento del microorganismo. 1.4.1.1 Proteínas ligadoras de lipopolisacárido. Los LPS son componentes estructurales de la pared celular de las bacterias, principalmente de las Gram negativas. Los LPS se consideran como uno de los factores biológicos fundamentales en el inicio del proceso infeccioso e inflamatorio (16). Aunque la endotoxina se puede unir a proteínas transportadoras inespecíficas, son sus uniones con proteínas especificas, como la proteína ligadora de LPS (LBP) o la proteína ligadora incrementadora de permeabilidad (BPI), las implicadas en la activación o neutralización fagocitaria (25-28). Ambas proteínas son estructuralmente muy parecidas, aunque difieren en su función. La LBP facilita la transferencia del LPS al CD14 y a las lipoproteínas de la pared del fagocito, facilitando la activación del mismo. La BPI, producida fundamentalmente por los leucocitos, actúa sobre la pared bacteriana incrementando su permeabilidad y es, por tanto, bactericida para muchos patógenos Gram negativos. Dos grupos de investigadores (29,30) han estudiado distintos polimorfismos de la LBP y de la BPI con resultados discrepantes. Mientras unos (29) encuentran que uno de los polimorfismos estudiados del gen de la LBP (Cys98Gly) se asocia a un riesgo aumentado de sepsis en varones y, probablemente, a un peor pronóstico, los otros autores (30) no pudieron reproducir esos resultados y ni siquiera pudieron identificar uno de los SNP descritos por los anteriores autores. 11 Tesis Doctoral 1.4.1.2 CD14. La CD14 es una proteína de membrana que se expresa en los macrófagos y monocitos y, en menor proporción, en los neutrófilos. Además de unirse al lípido A del LPS, CD14 también se puede unir al peptidoglicano del Staphylococcus aureus, al lipoarabinoman de las micobacterias y a otros componentes de la pared de los estreptococos (31). Se ha descrito un SNP ubicado en la posición –159 de la región promotora del gen (cromosoma 5), que afecta a una transición citosinatimina, y que en los sujetos homocigotos para el alelo T condiciona mayores niveles circulantes de CD14 soluble y una mayor producción de IFN-γ. El genotipo CD14 –159 TT apareció con más frecuencia en una población de pacientes con shock séptico en relación con un grupo control de sujetos sanos, asociándose, además, a una mayor mortalidad (32). Otros autores no han encontrado asociación de este SNP con formas más graves o con peor pronóstico de la infección (33). 1.4.1.3 Receptores tipo Toll. Existen al menos diez TLR diferentes, con distintas afinidades por diferentes antígenos microbianos. TLR-4 parece ser esencial para el reconocimiento de la endotoxina, mientras que TLR-2 es más importante en el reconocimiento de diversos componentes de M. tuberculosis y de los peptidoglicanos de Gram positivos. La activación de los TLR implica un aumento de la expresión de moléculas del CMH, de moléculas coestimuladoras y un aumento de la expresión de genes dependientes de NFκB, como IL-1, IL-6, IL-12 y TNFα. (34). Se han identificado varios SNP de TLR4 y TLR2 (cromosoma 9) que parecen incrementar el riesgo de infecciones bacterianas graves, aunque los resultados son discrepantes (34-35). TLR5 reconoce la proteína flagelina, que constituye un estímulo inflamatorio muy potente y que está presente en la estructura flagelar de muchas bacterias. Recientemente se ha descrito un SNP en un codon de parada (que señaliza la terminación de la síntesis proteica) en la posición 392 del gen de TLR5, que codifica una proteína 12 Tesis Doctoral incapaz de reconocer la flagelina y, como consecuencia, incrementa la susceptibilidad a la infección por Legionella pneumophila (36). 1.4.1.4 Lectina de unión a manosa. La MBL es una molécula pluripotencial del sistema inmune innato que, tras su unión a diversos azúcares de las superficies microbianas, es capaz de activar el complemento. Además, la MBL puede actuar directamente como opsonina y unirse a receptores específicos expresados en la superficie de varios tipos de células (37-38). Esta proteína está codificada por un gen único (mbl2) localizado en el cromosoma 10 y existen tres variantes alélicas estructurales y otras en la región promotora del gen que reducen significativamente sus niveles plasmáticos (16). Algunos autores han encontrado que los polimorfismos de MBL son un factor de riesgo para el desarrollo de sepsis grave (31,39-40). Estos datos han sido corroborados por nuestro grupo que ha estudiado distintos polimorfismos de la MBL en pacientes con NAC y ha encontrado que, las variantes alélicas asociadas a niveles bajos de la proteína tienen un mayor riesgo de desarrollar las formas más graves de la enfermedad (41). 1.4.1.5 Receptores de inmunoglobulinas. Ciertos agentes etiológicos de la NAC como S. pneumoniae o H. influenzae, se encuentran protegidos por una cápsula de polisacárido que protege la bacteria de la fagocitosis. Sin embargo si la inmunoglobulina G2 (IgG2) reconoce y se fija al antígeno capsular, la bacteria puede ser fagocitada. El único receptor capaz de interaccionar eficientemente con los anticuerpos IgG2 es el receptor Fcγ IIa ( Fcγ-RIIa) (16). A consecuencia de un SNP, se identifican dos alotipos de FcγRIIa que exhiben diferente capacidad para unirse a la IgG2. Los receptores que llevan una arginina en la posición 131 (FCγRIIA-R131) se unen con mucha menos eficacia a las Fc, mientras que 13 Tesis Doctoral aquéllos que poseen histidina en esta posición (FCγRIIA-H131) presentan una gran afinidad por las Fc de la IgG2. Varios estudios han evaluado la asociación entre los polimorfismos de Fcγ-RIIa y la infección meningocócica o la periodontitis. De hecho, los pacientes homocigotos para FcγRIIaR131 presentan unas tasas de recurrencia y mayor gravedad de la infección meningocócica.(42-43). La relación entre los genotipos de Fcγ-RIIa y la enfermedad neumocócica también se ha estudiado, pero continúa siendo objeto de controversia. Aunque los niños homocigotos para FcγRIIa-R131 parecen presentar una mayor susceptibilidad a la infección por S. pneumoniae (44-45), su papel en adultos es menos claro (46-47). Además, la asociación entre Fcγ-RIIa y NAC causada por otros microorganisms diferentes de S. pneumoniae no ha sido documentada. 1.4.2 Polimorfismos implicados en la respuesta inflamatoria. Al unirse los PMAP a los RRP se inicia una cascada de señalización intracelular y comienza una serie de procesos antimicrobianos y funciones defensivas. En el caso de los TLR, esta señalización se produce a través de proteínas adaptadoras –distintas según los diferentes TLRde las que se han descrito cinco hasta el momento actual. Una de las más estudiadas es el factor 88 de diferenciación mieloide (MyD88), que se une intracelularmente con una cinasa asociada al receptor de la interleucina (IL)-1 (IRAK); esto induce, a su vez, la activación del factor 6 asociado al receptor del factor de necrosis tumoral (TRAF-6), que da lugar a que el factor de transcripción nuclear NF-κB se transloque al núcleo celular y active los promotores de genes que codifican una extensa gama de mediadores proinflamatorios [factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), IL-1β, IL-6 e IFN-γ] y antiinflamatorios [IL-10 y el factor de crecimiento transformante-β (TGF)]. La reacción inflamatoria es un componente esencial de los mecanismos de defensa del organismo; es el precio que hay que pagar para resolver la infección. En el hombre, la mayoría de los genes de las citocinas son polimórficos, y existe una evidencia creciente de que la producción de citocinas del paciente 20 Tesis Doctoral tienen un mayor riesgo de desarrollar shock séptico y muerte en ciertas infecciones (83-85). Otro SNP, esta vez en el gen del inhibidor de la fibrinólisis activable por trombina (TAFI Thr325Ile), también se ha relacionado con mala evolución en algunas infecciones (86). Como hemos visto hasta ahora, son varios los estudios que han investigado polimorfismos de un solo nucleótido en genes candidatos asociados con susceptibilidad, gravedad o pronóstico en pacientes con NAC. Sin embargo, los resultados obtenidos han sido contradictorios y con frecuencia no se han podido reproducir los resultados iniciales. Resultados discrepantes han sido publicados para el TNF-α (G-308A), TNF-α (G-238A), y LTA (A+252G), que han sido asociados a la gravedad de la enfermedad y al pronóstico en algunos estudios (87-89) pero no en otros. (61,74,90). Asimismo, existe controversia acerca del papel que representan los SNP del gen TNFRSF1B +676 y el de la IL1RN VNTR86pb (57,64,74). Varios problemas metodológicos pueden explicar muchas de estas discrepancias, incluyendo el limitado poder estadístico, el estudio de poblaciones heterogéneas con factores de confusión no reconocidos, la definición inapropiada del fenotipo a estudio, la presencia de desequilibrio de ligamiento y la estratificación de la población (17-18). 21 Tesis Doctoral El objetivo de la presente Tesis Doctoral es estudiar, en una amplia y étnicamente homogénea cohorte de pacientes con NAC, si los polimorfismos en los genes que codifican moléculas inflamatorias o antiinflamatorias [(TNF -238 y -308, LTA +252, IL6 -174, IL1RN 86bp número variable de repeticiones en tandem y TNFRSF1B +676 (TNFR2 M196Re)] se asocian a la susceptibilidad, gravedad o pronóstico de la enfermedad. 2.- HIPÓTESIS 22 Tesis Doctoral 3.1 Establecer si los polimorfismos localizados en los genes que codifican moléculas inflamatorias (TNF-α -238, TNF-α -308, LT-α +252) o antiinflamatorias (IL-1 RN 86 pb VNRT , TNFRSF 1B+676 (TNF R2 M196R) se asocian a una mayor susceptibilidad a la NAC. . 3.2 Determinar si los polimorfismos de los genes TNF-α -238, TNF-α -308, LT-α +252, IL-1 RN 86 pb VNRT o TNFRSF 1B+676 (TNF R2 M196R) se asocian a una mayor gravedad de la NAC. 3.3 Evaluar si los polimorfismos de los genes TNF-α -238, TNF-α -308, LT-α +252, IL1 RN 86 pb VNRT o TNFRSF 1B+676 (TNF R2 M196R) se asocian a peor pronóstico de la NAC. 3.- OBJETIVOS 23 Tesis Doctoral 4.1 TIPO DE ESTUDIO. Estudio prospectivo realizado desde Enero de 2002 hasta Septiembre de 2007 en los siguientes hospitales españoles: Hospital Universitario de Gran Canaria “Dr. Negrín” de Las Palmas de Gran Canaria, Hospital Clínico y Universitario de Valencia y Hospital Universitario de La Princesa de Madrid. Se estudiaron todos los pacientes ingresados de forma consecutiva con el diagnóstico de NAC. 4.2 POBLACIÓN . 4.2.1. Criterios de inclusión. Se incluyeron todos los pacientes adultos que ingresaron en los diferentes hospitales con el diagnóstico de NAC. Este diagnóstico se estableció si el paciente presentaba signos y síntomas de infección de las vías aéreas inferiores, junto con la existencia de un infiltrado radiológico de nueva aparición, y en ausencia de diagnósticos alternativos durante el seguimiento. Para cumplir el requisito de NAC, los pacientes no debían haber estado hospitalizados en los los diez días previos al episodio actual. 4.2.2. Criterios de exclusión. Se excluyeron todos los pacientes con inmunodepresión grave, tales como inmunodeficiencias primarias, neutropenia significativa (<1,0 x 10 9 /L), o portadores del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), trasplantados de médula ósea o de órgano sólido, o tratados con esteroides 4.- MATERIAL Y MÉTODO 24 Tesis Doctoral sistémicos a dosis superiores a 20 mg de prednisona al día o su equivalente durante dos o más semanas. Los pacientes con NAC como episodio terminal de una enfermedad crónica y progresiva, tuberculosis, o neumonía obstructiva por neoplasia también fueron excluidos. 4.2.3. Grupo control. El grupo control estaba constituído por donantes de sangre y/o médula ósea no relacionados genéticamente, procedentes de cada uno de los hospitales participantes en el estudio y que pertenecían al mismo grupo étnico. 4.3 DEFINICIONES. La etiología de la neumonía se consideró de presunción si en una muestra de esputo válida se observaba una bacteria predominante. Se consideró definitiva cuando se obtenía un hemocultivo positivo para una bacteria u hongo patógenos sin otro foco aparente de infección; cuando se recuperaba un patógeno de muestras obtenidas con punción transtorácica o en líquido pleural; cuando se producía una seroconversión con aumento de al menos cuatro veces el título inicial de IgG para Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Legionella pneumophila, Coxiella burnetii y virus respiratorios; cuando se obtenía un título inicial de IgM > 1:32 para C. pneumoniae, 1:80 para C. burnetii, y cualquier título para M pneumoniae; un antígeno urinario positivo para Legionella pneumophila o para S pneumoniae; recuentos > 10 3 unidades formadoras de colonias (ufc)/ml en muestras de catéter telescopado o biopsia pulmonar y de > 10 4 ufc/ml en lavado broncoalveolar (LBA). El diagnóstico de neumonía neumocócica no bacteriémica se basó en los resultados negativos de los hemocultivos extraídos antes de recibir tratamiento antibiótico en el hospital y al menos uno 25 Tesis Doctoral de los siguientes criterios: 1) Claro predominio de cocos lanceolados Gram positivos agrupados en cadenas o en parejas, sin otros microorganismos en muestras de esputo o aspirados traqueobronquiales, que contuvieran más de 20 neutrófilos y menos de 10 células epiteliales escamosas por campo de bajo aumento; crecimiento significativo de S pneumoniae en el cultivo, sin otros patógenos probables; 2) líquido pleural con aislamiento de S pneumoniae; 3) antígeno urinario positivo para S pneumoniae; 4) crecimiento bacteriano de > 10 3 ufc/ml de S pneumoniae en especímenes de catéter telescopado, o biopsia pulmonar, y/o > 10 4 ufc/ml en LBA. La neumonía neumocócica bacteriémica se definió como tal cuando hubiera al menos un hemocultivo positivo para S pneumoniae. El diagnóstico de NAC grave se estableció cuando se cumplieran al menos dos de los siguientes criterios menores de la American Thoracic Society (ATS): Frecuencia respiratoria mayor de 30/minuto; insuficiencia respiratoria grave (PaO2/FiO2 < 250); afectación bilateral o afectación multilobular en la radiografía de tórax; presión arterial sistólica menor de 90 mm Hg; presión arterial diastólica menor de 60 mmHg; o al menos uno de los siguientes criterios mayores: necesidad de ventilación mecánica; incremento del tamaño de los infiltrados radiológicos sin respuesta clínica; necesidad de drogas vasoactivas durante más de 4 horas; creatinina sérica mayor de 2 mg/dl o incremento de más de 2 mg/dl en un paciente con enfermedad renal previa o fracaso renal agudo con necesidad de diálisis (3). Además, los pacientes fueron clasificados en función de su gravedad (sepsis, sepsis severa, shock séptico, fracaso multiorgánico) (91) 4.4 RECOGIDA DE DATOS Los datos demográficos, clínicos y de laboratorio de pacientes y de controles fueron 26 Tesis Doctoral recogidos, bien por entrevista directa con el paciente o mediante revisión de la historia clínica, usando una hoja de recogida de datos previamente diseñada a tal efecto. Se estableció la presencia o ausencia de los siguientes factores: lugar de residencia (asilo, domicilio o sin hogar), tabaquismo (paquetes/año), consumo de alcohol (g/día) u otras drogas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma, bronquiectasias, enfermedad cardiovascular, diabetes mellitus, enfermedad renal o hepática crónicas, enfermedad neurológica, sospecha de aspiración, disfunciones deglutorias, uso previo de betalactámicos, uso de glucocorticoides u otras drogas inmunosupresoras, infección por el VIH, enfermedad autoinmune, esplenectomía, neumonía o infecciones respiratorias previas, y hospitalizaciones en los últimos tres meses. También se registraron las complicaciones que aparecieron en los siguientes 30 días de la presentación de la NAC. Estas incluyeron cualquier empeoramiento de las enfermedades de base del paciente y/o la presencia de shock (presión arterial sistólica menor de 90 mm Hg no corregida por líquidos intravenosos, o que requería medicación vasopresora); coagulación intravascular diseminada(CID); insuficiencia renal (creatinina sérica mayor de 1,5 mg/dl y/o urea mayor de 40 mg/dl en pacientes con función renal previa normal); insuficiencia respiratoria aguda grave (PaO 2 /FiO 2 < 300 mm Hg, o < 200 mm Hg cuando se trataba de pacientes con EPOC); y metástasis sépticas (meningitis, empiema, artritis séptica, endocarditis, pericarditis purulenta, otitis). También se registró la necesidad de traslado del paciente a la UCI, la necesidad de ventilación mecánica y la mortalidad hospitalaria y atribuible. La duración del tratamiento antibiótico (oral e intravenoso), su adecuación de acuerdo a las recomendaciones de la Sociedad Española de Neumología y Cirugía Torácica (92) y la duración de la estancia hospitalaria también fueron recogidas. La gravedad de la NAC en el momento de su presentación se evaluó mediante la regla de predicción de mortalidad a los 30 días desarrollada por Pneumonia Outcomes Research Team 27 Tesis Doctoral (PORT) (9). En los pacientes con NAC grave y en los controles ingresados en UMI, se registró el Acute Physiology and Chronic Health Evaluation (APACHE-II) Score (93) a su ingreso. Al alta hospitalaria, se registraron tanto los días de estancia (hospitalaria y/o UCI) como la supervivencia o éxitus (relacionado o no con la neumonía). Se consideró enfermedad fatal a corto plazo a aquellos casos de enfermedad crónica grave o con mala calidad de vida previa en los que la neumonía formaba parte de un proceso terminal, siguiendo los criterios de McCabe y Jackson, (fallecimiento probable durante su estancia en el hospital) (94). 4.5 ESTUDIO GENÉTICO. 4.5.1. Determinaciones genéticas. La extracción de ADN así como el tipaje de los genes TNF-α, LT-α, IL-1 RN y TNF R2 se realizaron en la Unidad de Inmunología del Hospital Universitario Dr. Negrín de Las Palmas de Gran Canaria. 4.5.2. Extracción de ADN genómico. De cada individuo a estudio se obtuvo una muestra de entre 5 y 10 ml de sangre periférica, que se procesó según protocolo el protocolo estándar de extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN) por fenol-cloroformo (modificado de Blin y Stafford) (95). Para el aislamiento y lavado de los leucocitos, a la sangre total de cada individuo se le añadieron 50 mL de tampón de lisis de células rojas (SLR), y se centrifugó a 1.800 revoluciones por miuto (rpm) durante 10 minutos. A continuación se decantó el sobrenadante y se repitió el lavado 28 Tesis Doctoral dos veces más. Los leucocitos se lisaron resuspendiendo el precipitado resultante en 4 ml de solución de lisis e incubando en agitación a 42ºC hasta el día siguiente. Tras este paso, se añadieron 4 ml de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y se puso en agitación 10 minutos a temperatura ambiente, centrifugándose a continuación 10 minutos a 3000 rpm. La fase superior resultante se pasó a otro tubo y se repitió el proceso, desechándose la fase inferior. Para el siguiente paso, se añadieron 4 ml de cloroformo-isoamílico a la fase superior y se puso en agitación a temperatura ambiente durante 7 minutos, tras lo cual se centrifugó 5 minutos a 2500 rpm. De nuevo se rescató la fase superior y se repitió el proceso. Se añadieron 200 ml de NaCl 3M y 4 ml de isopropanol, mezclando suavemente por inversión hasta la aparición del precipitado. Dicho precipitado se extrajo a otro tubo y se lavó durante 30 minutos en etanol al 70% frío, tras lo cual se dejó secar a temperatura ambiente hasta el día siguiente. Una vez seco, se añadieron 500 ml de té 1/0.1 y se puso a rotar en agitador orbital en días sucesivos hasta su resuspensión. A los ADN así resuspendidos se les midió tanto su concentración como su pureza mediante espectrofotometría, ajustándose la concentración a 100 ng/L mediante adición de tampón TE (TRIS/EDTA) 1/0.1. 4.5.3 Genotipado . Para la determinación de las variantes de los genes TNF -238 (rs 361525), TNF -308 (rs 1800629) y LTA +252 (rs909253) se realizó mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real según metodología previamente publicada (96). El genotipado para el TNFRSF1B +676 (M196R; rs1061622), y el VNTR de 86 pares de bases en el intrón 2 de IL1RN, se 29 Tesis Doctoral realizó llevando a cabo modificaciones menores de procedimientos descritos con anteriorodad (9799). La exactitud del genotipado de los diferentes SNPs se confirmó mediante secuenciación directa en un secuenciador ABI Prism 310 (Applied Biosystems). Los alelos de el VNTR 86bp se denominan según la frecuencias observadas en sujetos sanos. Los alelos 1, 2, 3, 4 y 5 presentan cuatro repeticiones, dos repeticiones, cinco repeticiones, tres repeticiones y seis repeticiones de un fragmento de 86 pares de bases (pb). La amplificación se realizó en un termociclador 9600 (Perkin Elmer) según el siguiente protocolo: 2 minutos de desnaturalización inicial a 95ºC; 36 ciclos de 60s a 95ºC, 60s a 63ºC y 60s a 72ºC; 15 minutos de extensión final a 72ºC. Para la identificación de las secuencias amplificadas, el volumen total de amplificado fue sometido a electroforesis en gel de agarosa al 2%, junto con un marcador de peso molecular, y teñido con bromuro de etidio. Las bandas resultantes se visualizaron con luz ultravioleta. 4.6 ASPECTOS ÉTICOS. El presente estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica. Se obtuvo el consentimiento informado del paciente o de sus familiares. Los datos obtenidos en este estudio se adhieren a los principios enunciados en la Declaración de Helsinki. 4.7 TAMAÑO MUESTRAL. El cálculo del tamaño muestral necesario para detectar diferencias significativas entre el 36 Tesis Doctoral Tabla 4. Datos demográficos y clínicos de pacientes con NAC. Características n (%) Insuficiencia renal aguda No 874 (75,3) Sí 288 (24,7) Insuficiencia respiratoria aguda No 394 (33,9) Sí 768 (66,1) SDRA No 1115 (96,0) Sí 47 (4,0) Bacteriemia No 1055 (90,8) Sí 107 (9,2) SEPSIS Sepsis no grave 8 37 (72,0) Sepsis grave 160 (13,8) Shock séptico 165 (14,2) SDMO No 1021 (87,9) Sí 141 (12,1) Mortalidad 28 días No 1104 (95,0) Sí 58 (5,0) Mortalidad a 90 días No 1082 (93,1) Sí 80 (6,9) NAC: Neumonía Adquirida en la Comunidad ; SDRA: Síndrome de Distres Respiratorio Agudo; SDMO: Síndrome de Disfunción Multiorgánica; Sepsis no graves: pacientes sin sepsis grave ni shock séptico. 37 Tesis Doctoral 5.3 ESTRATIFICACIÓN POR GRAVEDAD. 5.3.1 Escala de Gravedad de la Neumonía [Pneumonia Severity Score (PSI)]. La gravedad de la NAC al ingreso, evaluada según la puntuación PSI se muestra en la Tabla 5. La puntuación media de los pacientes era de 97,3 puntos, con un rango de 19 a 218 puntos. Tabla 5.- Distribución de los pacientes con NAC según los rangos del Índice de Gravedad de la Neumonía, al ingreso hospitalario. RANGO PSI* NÚMERO 1 72 (6,3%) 2 179 (15,8%) 3 263 (23,2%) 4 422 (37,2%) 5 199 (17,6%) Los valores son expresados en número y porcentaje (%) de individuos. * PSI: Pneumonia Severity Score. Clase 1 y Clase 2: ≤ 70 puntos. Clase 3: 71-90 puntos. Clase 4: 91-130 puntos. Clase 5: > 130 puntos. 38 Tesis Doctoral 5.3.2 Escala APACHE II. La puntuación APACHE II en los 265 pacientes que fueron ingresados en UCI, ofreció una media de 21.6 puntos y un rango de 8 a 42 puntos. 5.3.3 Estratificación de la sepsis. Del total de 1.162 pacientes con NAC, 837 (72,2 %) no presentaban signos de sepsis grave, 160 (13,8%) presentaban sepsis grave y , 165 (14,2%) presentaron shock séptico. 5.4 SUSCEPTIBILIDAD. Para evaluar la posible susceptibilidad al desarrollo de NAC, se compararon las frecuencias genotípicas y alélicas observadas en los pacientes con NAC con aquéllas observadas en el Grupo Control. Para determinar el correcto análisis de las poblaciones se determinó que las poblaciones se encontraran en equilibrio según la ley de Hardy-Weinberg. No se encontraron diferencias significativas entre las frecuencias alélicas ni genotípicas entre el grupo de pacientes y de controles (Tablas 1 y 2). 5.5 COMPLICACIONES. 5.5.1 Sepsis, sepsis grave y shock séptico. Se compararon las frecuencias genotípicas y alélicas entre el grupo de pacientes que desarrollaron estas complicaciones frente a los que no las desarrollaron. No se observaron diferencias significativas en lo concerniente a los polimorfismos TNF-α-238, TNF-α-308, LT-α +252, IL-1 RN 86 pb VNRT o TNFRSF 1B+676 (TNF R2 M196R) (Tablas 6 y 7). 39 Tesis Doctoral 5.5.2 Insuficiencia renal aguda. No se observaron diferencias significativas en cuanto a las frecuencias genotípicas o alélicas entre los pacientes que desarrollaron insuficiencia renal y los que no la desarrollaron (Tablas 8 y 9). 5.5.3 Síndrome de distrés respiratorio agudo. Al comparar las frecuencias genotípicas y alélicas entre el grupo de pacientes que desarrolló SDRA frente a los que no lo desarrollaron, no se apreciaron diferencias significativas (Tablas 8 y 9). Sin embargo, se observó que los pacientes portadores del alelo G del TNFRSF1B +676 presentaban mayor riesgo de desarrollar SDRA, aunque las diferencias no alcanzaron significación estadística ( p = 0,085, OR = 1,68, IC 95% 0,88-3,21). 5.5.4 Bacteriemia. No se observaron diferencias significativas en la distribución de los genotipos o alelos de los pacientes que presentaron bacteriemia, en comparación con los que no presentaron esta complicación (Tablas 8 y 9). 5.5.5 Fracaso multiorgánico. La distribución de frecuencias genotípicas y alélicas en el grupo de pacientes que presentó Fracaso Multiorgánico no fue significativamente diferente de las observadas en los pacientes que no desarrollaron esta complicación (Tablas 8 y 9). Sin embargo, se observó que los individuos 40 Tesis Doctoral homocigotos para el alelo LTA +252A tenían una tendencia a presentar mayor riesgo de disfunción multiorgánica (p = 0,048, OR= 1,44, IC 95% 0,99-2,12 ). Asimismo los pacientes portadores del alelo G del TNFRSF1B +676 presentaban mayor riesgo de desarrollar disfunción multiorgáni ca(tabla 9), aunque la diferencia no alcanzó significación estadística (p = 0,048, OR = 1,43, IC 95% 0,98-2,07). 5.5.6 Mortalidad. Se comparó la distribución de frecuencias genotípicas y alélicas entre el grupo de pacientes supervivientes y fallecidos. No se observaron diferencias significativas para los polimorfismos TNF-α -238, TNF-α -308, LT-α + 252, e IL-1 RN 86 pb VNRT (Tabla 8). Al analizar el SNP TNFRSF1B +676 con respecto a la mortalidad a los 28 días, se observó una diferencia estadísticamente significativa en la distribución de los genotipos del TNFRSF1B +676 G/T (p = 0,0129 en el análisis 3 x 2 ). Sin embargo, se apreció un efecto protector frente a un desenlace fatal del genotipo heterocigoto en comparación con el homocigoto para los alelos T y G (p = 0,006, OR = 0,39, IC 95% 0,17-0,8) y p = 0,026, OR = 0,55. IC 95% 0,30-0,95 para la morta lidad a 28 y 90 días respectivamente. Se realizó un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier se cuencial a los 15, 28 y 90 días en toda la población de pacientes con NAC, teniendo en cuenta los tres diferentes genotipos del TNFRSF1B +676 (figura 1). El análisis de regresión de Cox ajustado por edad, sexo, hospital de procedencia y comorbilidad mostró que los pacientes con genotipo GT tenían menor mortalidad en comparación con aquellos pacientes con genotipo GG+TT (p = 0,02; HR 0,53; 95% IC 0,31-0,90 para la supervivencia a los 90 días; p = 0,01; HR 0,41; IC 95% 0,210,81 para la supervivencia a los 28 días y p = 0,049; HR 0,48; IC 95% 0,23-0,997 para la supervivencia a los 15 días) (Fig. 2). 41 Tesis Doctoral Tabla 6.- Asociación entre genotipo y gravedad de la enfermedad. SEPSIS Sepsis no grave Sepsis grave Shock séptico TNF -238 (N = 1135) G/G 694 (85) 138 (86,25) 144 (90) G/A 117 (14,4) 20 (12,5) 14 (8,75) A/A 4 (0,5) 2 (1,25) 2 (1,25) TNF -308 (N = 1136) G/G 610 (77,6) 124 (77,5) 122 (76,2) G/A 188 (23,9) 35 (21,8) 35 (21,8) A/A 18 (2,2) 1 (0,6) 3 (1,8) LTA +252 (N = 1120) A/A 400 (49,7) 79 (50,3) 87 (54,7) A/G 343 (42,6) 64 (40,7) 64 (40,2) G/G 61 (7,5) 14 (8,9) 8 (5,0) TNFRSF1B +676 ( N = 1107) T/T 478 (60,8) 104 (65,0) 95 (59,0) T/G 272 (34,6) 50 (31,2) 57 (35,4) G/G 36 (4,5) 6 (3,7) 9 (5,5) IL1RN VNTR 86pb (N = 1152) 1/1 423 (51,0) 72 (45,0) 81 (49,3) 1/2 300 (36,2) 61 (38,1) 55 (33,5) 1/3 14 (1,6) 11 (6,8) 6 (3,6) 1/4 3 (0,3) 1 (0,6) 2 (1,2) 1/5 2 (0,2) 0 (0) 0 (0) 2/2 77 (9,2) 13 (8,1) 17 (10,3) 2/3 5 (0,6) 1 (0,6) 3 (1,8) 2/4 2 (0,2) 1 (0,6) 0 (0) 3/3 2 (0,2) 0 (0) 0 (0) Número y porcentaje de pacientes. N: pacientes con datos disponibles. TNF: Factor de Necrosis Tumoral-α; LTA: Linfotoxina-α; TNFRSF1B: Receptor-2 del Factor de Necrosis Tumoral-α; IL1RN VNTR: Número Variable de Repeticiones en Tandem en el Antagonista del Receptor de la IL-1. 42 Tesis Doctoral Tabla 7.- Asociación entre alelos y gravedad de la enfermedad. SEPSIS Sepsis no grave Sepsis grave Shock séptico TNF -238 (N= 2270) G 1515 (93,49) 296 (92,5) 302 (100,6) A 125 (7,66) 24 (7,5) 18 (6) TNF -308 (N= 2272) G 1408 (98,32) 283 (88,4) 179 (55,93) A 224 (15,64) 37 (11,56) 41 (12,81) LTA +252 (N= 2240) A 1143 (71,08) 222 (70,7) 238 (74,84) G 465 (28,92) 92 (29,29) 80 (25,15) TNFRSF1B +676 (N= 2214) T 1228 (78,11) 258 (80,62) 247 (76,7) G 344 (22,51) 62 (19,37) 75 (23,29) IL1RN VNTR 86pb (N= 2304) 1 1165 (70,35) 217 (67,81) 225 (68,62) 2 161 (97,28) 89 (27,81) 92 (28,04) 3 23 (1,38) 12 (3,75) 9 (2,75) 4 5 (0,3) 2 (0,62) 2 (0,6) 5 2 (0,12) 0 (0) 0 (0) Los datos representan número y porcentaje de pacientes. N : número de pacientes con datos disponibles. Nomenclatura de genes: TNF: Factor de Necrosis Tumoral-α; LTA: Linfotoxinaα; TNFRSF1B: Receptor-2 del Factor de Necrosis Tumoral-α; IL1RN VNTR: Número Variable de Repeticiones en Tandem en el Antagonista del Receptor de la IL-1. 43 Tesis Doctoral Tabla 8.- Asociación entre genotipo y complicaciones de la NAC. IRnA SDMO SDRA Bacteriemia No Sí No Sí No Sí No Sí TNF -238 (N = 1135) G/G 736 (86,5) 237 (84,6) 857 (85,9) 119 (86,2) 880 (86,4) 39 (84,8) 888 (86,2) 84 (83,2) G/A 111 (13) 39 (13,9) 134 (13,4) 17 (12,3) 132 (13) 6 (13) 134 (13) 17 (16.8) A/A 4 (0,5) 4 (1,4) 6 (0,6) 2 (1,4) 7 (0,7) 1 (2,2) 8 (0,8) 0 (0) TNF -308 (N = 1136) G/G 632 (74,3) 223 (79,4) 747 (74,8) 109 (78,9) 769 (75,4) 40 (87) 780 (75,7) 74 (73,3) G/A 192 (23,4) 56 (19,9) 230 (23,0) 28 (20,2) 231 (22,6) 6 (13) 229 (22,2) 27 (26,7) A/A 20 (2,4) 2 (0,7) 21 (2,1) 1 (0,7) 20 (2) 0 (0) 22 (2,1) 0 (0) LTA +252 (N = 1120) A/A 42 (50,1) 145 (52,5) 487 (49,4) 79 (58,5)* 508 (50,5) 27 (58,7) 518 (50,9) 46 (46,5) A/G 355 (42,3) 112 (40,6)/ 421 (42,7) 50 (37,0) 423 (42) 18 (39,1) 421 (41,4) 49 (49,5) G/G 64 (7,6) 19 (6,9) 77 (7,8) 6 (4,4) 75 (7,5) 1 (2,2) 78 (7,7) 4 (4) TNFRSF1B +676 (N = 1107) T/T 502 (61,1) 174 (61,9) 602 (62,2) 75 (53,5) 621 (62,6) 22 (48,9) 613 (61,2) 62 (60,8) T/G 281 (34,2) 95 (33,8) 322 (33,2) 57 (40,7) † 328 (33,1) 20 (44,4) 344 (34,4) 33 (32,4) G/G 39 (4,7) 12 (4,3) 43 (4,4) 8 (5,7) † 43 (4,3) 3 (6,7) 44 (4,4) 7 (6,9) IL1RN VNTR 86pb (N = 1152 ) 1/1 444 (51,4) 130 (45,8) 504 (49,8) 72 (51,0) 517 (50) 19 (40,4) 522 (50) 52 (50) ½ 306 (35,4) 108 (38) 366 (36,2) 50 (35,4) 372 (35,9) 19 (40,4) 374 (35,.8) 40 (38,5) 1/3 21 (2,4) 10 (3,5) 26 (2,2) 5 (3,5) 27 (2,6) 4 (8,5) 27 (2,6) 4 (3,8) ¼ 4 (0,5) 2 (0,7) 5 (2,5) 1 (0,7) 4 (0,4) 1 (2,1) 6 (0,6) 0 (0) 1/5 2 (0,2) 0 (0) 2 (0,1) 0 (0) 2 (0,2) 0 (0) 2 (0,2) 0 (0) 2/2 77 (8,9) 30 (10,6) 97 (9,5) 10 (7,08) 100 (9,7) 3 (6,4) 99 (9,5) 8 (7,7) 2/3 5 (0,6) 4 (1,4) 6 (0,5) 3 (2,1) 9 (0,9) 0 (0) 9 (0,9) 0 (0) 2/4 3 (0,3) 0 (0) 3 (0,2) 0 (0) 2 (0,2) 1 (2,1) 3 (0,3) 0 (0) 3/3 2 (0,2) 0 (0) 2 (0,1) 0 (0) 2 (0,2) 0 (0) 3 (0,2) 0 (0) Nº de pacientes y porcentajes; IRnA: Insuficiencia Renal Aguda; SDMO: Síndrome de Disfunción Multiorgánica; SDRA: Síndrome de Distrés Respiratorio Agudo; TNF: Factor de Necrosis Tumoral-α; LTA: Linfotoxina-α; TNFRSF1B: Receptor 2 de TNF-α; IL1RN VNTR: Nº de Repeticiones en Tandem en el Antagonista del Receptor de IL-1. * A/A vs A/G + G/G; p = 0,048, OR= 1,44, IC 95% 0,99-2,12. 44 Tesis Doctoral Tabla 9.- Asociación entre alelos y complicaciones de la NAC. IRnA SDMO SDRA Bacteriemia No Sí No Sí No Sí No Sí TNF -238 (N= 2270) G 1583 (93) 313 (55,8) 1848 (92,67) 255 (92,39) 1892 (93,02) 84 (91,19) 1810 (87,86) 185 (91,73) A 119 (6,99) 47 (8,39) 146 (7,32) 21 (7) 146 (7,16) 8 (8,69) 150 (7,8) 17 (8,41) TNF -308 (N= 2272) G 1463 (85,95) 502 (89,32) 1724 (86,42) 246 (89,13) 1769 (86,71) 86 (94,11) 1789 (86,76) 175 (86,63) A 239 (14,04) 60 (1 0,67) 272 (13,61) 30 (10,86) 271 (13,28) 6 (6,52) 273 (13,23) 27 (13,36) LTA +252 (N= 2240) A 1197 (71,25) 402 (72,82) 1395 (70,3) 208 (77) 1439 (7,.52) 72 (78,25) 1457 (71,.63) 141 (71,21) G 483 (28,81) 150 (27,17) 575 (29,19) 62 (26,6) 573 (28,47) 20 (21,73) 577 (28,36) 57 (28,84) TNFRSF1B +676 (N= 2214) T 1285 (78,16) 443 (78,82) 1526 (78,9) 207 (73,92) 1570 (79,13) 64 (71,11) 1570 (78,42) 157 (76,9) G 359 (21,83) 119 (21,34) 408 (21,09) 73* (26,07) 414 (20,86) 26 (28,88) 432 (21,57) 47 (23) IL1RNVNTR (N = 2304) 1 1211 (74,39) 380 (66,91) 1407 (7,27 ) 200 (70,92) 1439 (7.1) 62 (65,95) 1453 (69,58) 148 (71,17) 2 468 (28,8) 172 (30,28) 569 (28,14) 73 (25,87) 583 (28,11) 26 (26,67) 584 (28,49) 56 (26,92) 3 30 (21,84 14 (2,5 ) 36 (1,78 ) 8 (2,83 ) 40 (1,93) 4 (4,25) 40 (1,91) 4 (1,92) 4 7 (0,4) 2 (0,35) 8 (0,39 ) 1 (0,35) 6 (0,28) 2 (2,12) 9 (0,43) 0 (0) 5 2 (0,2) 0 (0 ) 2 (0,09) 0 (0 ) 2 (0,09) 0 (0) 2 (0,09) 0 (0) Datos representan número de pacientes y porcentajes. N : número de pacientes con datos disponibles. IRnA: Insuficiencia Renal Aguda; SDMO: Síndrome de Disfunción Multiorgánica; SDRA: Síndrome de Distrés Respiratorio Agudo; TNF: Factor Necrosis Tumoral-α; LTA: Linfotoxina-α; TNFRSF1B: Receptor 2 de TNF-α; IL1RN VNTR: Número Variable de Repeticiones en Tandem en el Antagonista del Receptor de IL-1 * p = 0,048, OR = 1,43, IC 95% 0,98-2,07 45 Tesis Doctoral Tabla 10.- Asociación entre genotipo y mortalidad. Mortalidad 28 días Mortalidad 90 días No Sí No Sí TNF -238 (N = 1135) G/G 927 (85,9) 49 (85,9) 908 (85,9) 68 (86,0) G/A 144 (13,3) 7 (12,2) 142 (13,5) 9 (11,3) A/A 7 (0,6) 1 (1,7) 6 (0,5) 2 (2,5) TNF -308 (N = 1136) G/G 812 (75,2) 44 (77,1) 794 (75,1) 6 (78,4) G/A 245 (22,7) 13 (22,8) 24 1(22,8) 17 (21,) A/A 22 (2,0) 0 (0) 22 (2,0) 0 (0) LTA +252 (N = 1120) A/A 539 (50,7) 27 (47,3) 527 (50,6) 39 (49,3) A/G 446 (41,9) 25 (43,8) 436 (41,8) 35 (44,3) G/G 78 (7,3) 5 (8,7) 78 (7,4) 5 (6,3) TNFRSF1B +676 (N = 1107) T/T 635 (60,4) 42 (73,6) 622 (60,5) 55 (69,6) T/G 369 (35,1) 10 (17,5) 361 (35,1) 18 (22,7) G/G 4 (4,3) 5(8,7) 45 (4,3) 6 (7,5) IL1RN VNTR 86pb (N = 1152) 1/1 545 (49,8) 31 (53,4) 537 (50,0) 39 (48,7) ½ 393 (35,9) 23 (39,6) 381 (35,5) 35 (43,7) 1/3 30 (2,7) 1 (1,7) 29 (2,7) 2 (2,5) 2/4 5 (0,4) 1 (1,7) 5 (0,4) 1 (1,2) 1/5 2 (0,4) 0 (0) 2 (0,1) 0 (0) 2/2 105 (9,5) 2 (3,4) 104 (9,7) 3 (3,7) 2/3 9 (0,8) 0 (0) 9 (0,8) 0 (0) 2/4 3 (0,2) 0 (0) 3 (0,2) 0 (0) 3/3 2 (0,1) 0 (0) 2 (0,1) 0 (0) Los datos expresan número de pacientes y porcentajes . N : número de pacientes con datos disponibles. Nomenclatura de genes: TNF: Factor de Necrosis Tumoral-α; LTA: Linfotoxinaα; TNFRSF1B: Receptor2 del Factor de Necrosis Tumoral-α; IL1RN VNTR: Número Variable de Repeticiones en Tandem en Antagonista del Receptor de Interleukina-1 *‡ T/G vs T/T + G/G; p = 0,006, OR = 0,39, IC 95% 0,17-0.8 y p = 0,026, OR = 0,55, IC 95% 0,30-0,95 para mortalidad a los 28 días y a los 90 días respectivamente. 52 Tesis Doctoral heterocigoto de TNFRSF1B +676 en lo concerniente al pronóstico de la sepsis podría, por tanto ser debido a un efecto balanceado de las consecuencias deletéreas de una excesiva o defectuosa activación NF-κB conferidas respectivamente por el genotipo homocigoto de los alelos salvajes o mutantes (105). Hasta la fecha, solo un estudio (74) ha investigado el papel del polimorfismo del receptor TNFR2 (+676 y +1663). Este estudio fue realizado en 213 pacientes con sepsis grave. Los autores encontraron una correlación positiva entre los niveles incrementados de TNFR1 y TNFR2 soluble y la disfunción orgánica, pero no se observó ninguna influencia entre el polimorfismo TNFRSF1B y los niveles de TNFR2 soluble, ni tampoco en la susceptibilidad o pronóstico de la sepsis. Posibles razones para explicar esta discrepancia con los datos de Gordon y col.(74), son el estudio de un fenotipo diferente en ambos estudios y el pequeño tamaño muestral en el estudio de Gordon. A pesar de los puntos fuertes que presenta nuestro estudio, y que ya han sido mencionados anteriormente, hay que reconocer que tiene algunas limitaciones. Primero, aunque en este estudio se han seguido las recommendaciones establecidas para el tratamiento de la sepsis y shock séptico, no se ha seguido un protocolo específico. Segundo, se determinaron sólo cinco polimorfismos de cuatro mediadores. La importancia funcional de muchos de estos polimorfismos aún queda por dilucidar y muchos SNP pueden representar simplemente marcadores genómicos de otras variantes genéticas más relevantes desde el punto de vista funcional, y que se encuentran en desequilibrio de ligamiento con el polimorfismo estudiado. Tercero, nuestro estudio podría carecer de la suficiente potencia estadística para detectar diferencias significativas para los fenotipos y genotipos menos frecuentes, particularmente en pequeños subgrupos de pacientes. Sin embargo, se debe hacer notar que un número substancial de pacientes (325: 28%) desarrollaron formas graves de sepsis. Ello nos permite tener un tamaño muestral suficiente para detectar odds ratios de 1,49, 1,38, 1,29 y 1,28 para 53 Tesis Doctoral los alelos del TNF -238A, TNF -308A, LTA +25 G e IL1RN * 2 respectivamente, con un umbral de significación de 0,05 y con un poder estadístico del 80%. Estos son los alelos que han sido involucrados en la gravedad de la sepsis, en general con OR superiores a los descritos en este estudio. Además, cuando analizamos la asociación entre el genotipo TNFRSF1B +676 G/T con la mortalidad a los 28 días, el poder estadístico para el OR observado, con un umbral de significación del 5%, fue del 93%. Aún con estas limitaciones, este estudio es único en el hecho de tener una población étnicamente homogénea de pacientes ingresados en el hospital por NAC y en el que se evalúan los factores asociados a la gravedad y al pronóstico, desde el mismo momento del ingreso en el hospital. En conclusión, nuestro estudio no apoya la existencia de un papel importante de los controvertidos polimorfismos del TNF, LTA, e IL1RN en la NAC y en la sepsis, al menos en nuestra población. Sin embargo, sugiere un importante papel del SNP TNFRSF1B +676 en el pronóstico de la NAC, que ayudaría potencialmente identificar a un subgrupo de pacientes que podrían beneficiarse de nuevas estrategias terapéuticas. Los hallazgos de este estudio sientan las bases para generar nuevas hipótesis en futuros estudios en los que pueden ser consideradas nuevas intervenciones como el tratamiento inmunomodulador frente al TNF-α y LT-α. 54 Tesis Doctoral 7.1 Los polimorfismos de los genes TNF-α -238, TNF-α -308, LT-α +252, IL-1 RN 86 pb VNRT o TNFRSF 1B+676 (TNF R2 M196R) se asocian a una mayor susceptibilidad a la NAC. 7.2 Los polimorfismos de los genes TNF-α -238, TNF-α -308, LT-α +252, IL-1 RN 86 pb VNRT o TNFRSF 1B+676 (TNF R2 M196R) se asocian a una mayor gravedad de la NAC. 7.3 Los polimorfismos de los genes TNF-α -238, TNF-α -308, LT-α +252, e IL-1 RN 86 pb VNRT no se asocian a un peor pronóstico de la NAC. 7.4 Los polimorfismos del gen TNFRSF 1B+676 (TNF R2 M196R) se asocia a un peor pronóstico de la NAC. El genotipo TNFRSF1B +676 G/T se asocia con una mayor mortalidad a los 28 días. El reconocimiento del polimorfismo TNFRSF1B +676 G/T ayudaría a identificar un subgrupo de pacientes que podrían beneficiarse potencialmente de tratamiento inmunomodulador frente al TNFα y LT-α . 7.- CONCLUSIONES 55 Tesis Doctoral 1.- Rello J. Demographics, guidelines and clinical experience in severe community-acquired pneumonia. Critical Care 2008, 12(Suppl 6): S2:1-9 2.- Mandell LA. Epidemiology and etiology of CAP. Inf. Dis Clin North Am 2004; 18:761-776. 3.- Mandell LA, Wunderink RG, Anzueto A et al. Infectious Diseases Society of America/American Thoracic Society consensus guidelines on the management of communityacquired pneumonia in adults. Clin Infect Dis 2007; 44(Suppl 2):S27-72. 4.- Pachón J., Alcántara Ballón JD, Cordero Matía E, Camacho Espejo A, Lama Herrera C, Rivero Román A, et al. Estudio y tratamiento de las neumonías de adquisición comunitaria en adultos. Med Clin. 2009; 133(2):63-73 5.- Dremsizov T, Clermont G, Kellum JA, Kalassian KG, Fine MJ, Angus DC. Severe sepsis in CAP: when does it happen, and do systemic inflammatory response syndrome criteria help predict course? Chest 2006; 129:968-978 6.- Spindler C, Ortqvist A. Prognostic score systems and community-acquired bacteriemic pneumococcal pneumonia. Eur Respir J 2006; 28:816-828 7.- Rello J, Rodríguez A, Lisboa T, Gallego M, Lujan M, Wunderink R. PIRO score for community-acquired pneumonia: A new prediction rule for assessment of severity in intensive care unit patients with community-acquired pneumonia. Crit Care Med 2009; 37:456-462 8.- Charles PG, Wolfe R, Whitby M, et al. SMART-COP: a tool for predicting the need of intensive respiratory or vasopressor support for community-acquired pneumonia. Clin Infect dis 2008, 47:375-384. 9.- Fine MJ, Auble TE, Yealy DM, et al. A prediction rule to identify low-risk patients with community-acquired pneumonia. N Engl J Med 1997; 336:243-250. 8.- BIBLIOGRAFÍA 56 Tesis Doctoral 10.- Angus DC, Marrie TJ, Obrosky DS, et al. Severe community-acquired pneumonia: use of intensive care services and evaluation of American and British Thoracic Society Diagnostic criteria. Am J Respir Crit Care Med. 2002; 166:717-23. 11.- Ewig S, Ruiz M, Mensa J, et al. Severe community-acquiered pneumonia. Assesment of severity criteria. Am J Resp Crit Care Med 1998; 158:1102-1108. 12.- Felkin DR, Schuchat A, Kolczak M, et al. Mortality from invasive pneumococal pneumonia in the era of antibiotic resistance: 1995-1997. Am J Public Health 2000; 90:223-9 13.- Menéndez R, Torres A. Treatment failure in community-acquired pneumonia. Chest 2007; 132:1348-55 14.- Segal S, Hill A. Genetic susceptibility to infectious disease. TRENDS in microbiology 2003; 11:445-448 15.- Sorensen TI, Nielsen GG, Anderson PK, et al. Genetic and environmental influences on premature death in adults adoptees. N Engl J Med 1988; 318:727-732 16.- Lin MT, Albertson TE. Genomic polymorphisms in sepsis. Crit Care Med 2004; 32:569-579. 17.- Papathanassoglou E, Giannakopoulou M, Bozas E. Genomic variations and susceptibility to sepsis. AACN Adv Crit Care 2008; 17(4):394-422 18.- Holmes Ch., Russell J., Walley K. Genetic polimophisms in sepsis and septic shock. Chest 2003; 124:1103-1115 19.- Yende S; Kammerer C; Angus D. Bench-to-bedside review: Genetics and proteomics. Deciphering gene association studies in critical illness. Critical Care 2008; 10:227 20.- Alcaïs A, Abel L, Casanova JL. Human genetics of infectious diseases: between proof of priciple and paradigm. Journal of Clinical Investigation 2009; 119:2506. 21.- Casanova JL, Abel L. Primary immunodeficiencies: a field in its infancy. Science 2007; 317:617-619. 22.- Dahlman I, Eaves I, Kosoy R, Morrison VA, et al. Parameters for reliable results in genetic association studies in common diseases. Nat Genet 2002; 30:149-50 57 Tesis Doctoral 23.- Clark MF, Baudouin SV. A systematic review of the quality of genetic association studies in human sepsis. Intensive Care Med 2006; 32:1706-1712 24.- Bohrer H, Qiu F, Zimmermann T, et al. Role of NF-κB in the mortality of sepsis. J Clin Invest 1997; 100:972-985. 25.- Schumann RR, Leogs R, Flaggs GW, et al. Structure and function of lipopolysaccharide binding protein. Science 1990; 249:1429-1431 26.- Tobias PS, Soldau K, Iovine NM et al. Lipopolysaccharide(LPS)-binding proteins BPI and LBP from different complex types with LPS. J Biol Chem 1997; 272:18682-18685 27.- Weiss J, Muello K, Victor M, et al. The role of lipopolysaccharides in the action of the bactericidal/permeability-increasing neutrophil protein on the bacterial envelope. J Immunol 1984; 132:3109-3115 28.- Elsbach P, Weiss J. Role of bactericidal/permeability-increasing protein in host defense. Curr Opin Immunol 1998; 10:45-49 29.- Hubacek JA, Stuber F, Frohlich D et al. Gene variants of the bactericidal/permeabilityincreasing protein and lipopolysaccharide-binding protein in septic patients: gender-specific predisposition to sepsis. Crit Care Med 2001; 29:684-5 30.- Barber RC, O´Keefe GE. Characterization of a single nucleotide polymorphism in the lipopolysaccharide-binding protein and its association with sepsis. Am J Respir Crit Care Med 2003; 167:1316-20 31.- Sutherland A, Walley K, Russell J. Polymorphisms in CD-14, mannose-binding lectin, and toll-like receptor-2 are associated with increased prevalence of infection in critically ill adults. Crit Care Med 2005; 33:638-644 32.- Gibot S, Cariou A, Drouet L ,et al. Association between a genomic polymorphism within CD14 locus and septic shock susceptibility and mortality rate. Crit Care Med 2002; 30:969-973. 58 Tesis Doctoral 33.- Hubacek JA, Stuber F, Frohlich D, et al. The common C(-159)T polymorphism within the promoter region of the lipopolyssacaride receptor CD14 is not associated with sepsis development or mortality. Genes Immun 2000; 1:405-407 34.-Albiger B, Dahlberg S, Normak-Enriques B, Normak S. Role of the immune system in host defense against bacterial infections: focus on the Toll-like receptors. J. Int Med 2007; 261:511-528 35.- Lien E, Ingalls RR. Toll-like receptors. Crit Care Med 2002; 30:S1-11 36.- Hawn TR, Verbon A, Lettinga KD, et al. A common dominant TLR 5 stop codon polymorphism abolishes flagelling signaling and is associated to leggionnaires´ disease. J Exp Med 2003; 198:1563-1572 37.- Wunderink RG, Waterer GW. Genetics of community-acquired pneumonia. Semin Respir Crit Care Med 2005; 25:553-562. 38.- Waterer GW, Wunderink RG. Genetic susceptibity to pneumonia. Clinics in Chest Medicine 2005; 26:29-38 39.- Garred P, Strom J, Quist L, Taaning E, Madsen HO. Association of mannose-binding lectin polymorphisms with sepsis and fatal outcome in patients with SIRS. J Inf Dis 2003; 188:1394-1403 40.- Gordon AC, Waheed U, Hansen TK et al. Manose-binding lectin polymorphisms in severe sepsis: relationship to levels, incidence and outcome. Shock 2006; 25: 88-93 41.- Garcia-Laorden MI, Sole-Violan J, Rodriguez de Castro F et al. Mannose-binding lectin and mannose-binding lectin-associated serine protease 2 in susceptibility, severity and outcome of pneumonia in adults. J Allergy Clin Immunol. 2008; Aug, 122(2):368-74. Epub 2008 Jun 25. 42.- Van der Pol W, van der Winkel JG. IgG receptor polymorphisms. Risk factors for disease. Immunogenetics 1998; 48:222-232 43.- Van der Sorge NM, van der Pol WL, van der Winkel JGJ. Fc [gamma]R polimorphisms: Implications for function, disease susceptibility and immunotherapy. Tissue antigens 2003; 61(3):189-202 59 Tesis Doctoral 44.- Sanders LAM, van der Winkel JG, Rijkers GT, et al. Fcγ receptor IIa (CD32) heterogeinity in patients with recurrent bacterial respiratorytract infections. J Infect Dis 1994; 170:854-61 45.- Yuan FF, Wong M, Pererva N, et al. Fc gamma RIIA polymorphism in S. pneumonia infection. Immun Cell Biol 2003; 81:192-5. 46.- Yee AM, Phan HM, Zuniga R, Salmon JE, Musher DM. Association between FcgammaRIIaR131 allotype and bacteremic pneumococcal pneumonia. Clin Infect Dis 2000; 30:25-28 47.- Moens L, Van Hoeyweld E, Verhaegen J, De Boeck K, Peetermans WE, Bossuyt X. Fcreceptor IIA genotype and invasive pneumococcal infection. Clin Immunol 2006; 118:20-23 48.- Appoloni O, Dupont E, Vandercryus M, et al. Association of TNF-2 allele with plasma TNF alfa levels and mortality from septic shock. Am J Med 2001; 110:486-488 49.- O´Keefe GE, Hybki D, Munford RS. The G/A single nucleotide polymorphism and the – 308 position in the TNF alfa promoter increases the risk for severe sepsis after trauma. J Trauma 2002; 52: 817-825 50.- Stuber F, Udalova IA, Book M, et al. (-)308 TNF polymorphism is not associated with survival in sepsis and is unrelated to lipopolysaccharide inducibility of the human TNF promoter. J Inflamm. 1995; 46:42-50. 51.- Waterer GW, Quasney MW, Cantor RA, et al. Increased risk of death from communityacquired pneumonia (CAP) associated with the A allele of the TNFα-238 polymorphism. Am J Respir Crit Care Med 2001; 163:A380 52.- Waterer GW, Quasney MW, Cantor RM, et al. Septic shock and respiratory failure in CAP have different TNF polymorphism associations. Am J Resp Crit Care Med 2001; 163:1599-604 53.- Basu S, Sivastrava PK. Heat shock proteins. The fountainhead of innate and adaptative responses. Cell Stress Chaperones 2000; 5:443-51 60 Tesis Doctoral 54.- Waterer GW, El Bahlawan L, Quasney MW, et al. Heat shock protein 70-2+1267 AA homozigotes have an increased risk of septic shock in adults with CAP. Crit Care Med 2003; 31:1367-71 55.- Dinarello CA, Wolff SM. The role of IL-1 in disease NEJM 1993; 328:106-113 56.- Read RC, Camp NJ, Di Giovine FS, et al. An IL-1 genotype is associated with fatal outcome of meningococcal disease. J nfect Dis 2000; 182:1557-60 57.- Ma P, Chen D, Pan J, Du B. Genomic PGs in IL-1 gene family cytokins influences outcome of septic patients. Crit Care Med 2002; 30:1046-50 58.- Hack CE, De Groot ER, Felt-Bersma RJ, et al. Increased plasma levels of IL-6 in sepsis. Blood 1989; 74:1704-10 59.- Balding J, Healy CM, Livingstone WJ, et al. Genomic polymorphic profiles in an Irish population with meningococcaemia: is it possible to predict severity and outcome of disease? Genes Immun 2003; 4:533-540 60.- Martín-Loeches Carrondo I. Polimorfismo de IL-6 en neumonía adquirida en la comunidad. Asociación pronóstica y mortalidad. Tesis Doctoral de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria 2007 61.- Reid CL, Perrey C, Pravica V, et al. Genetic variation in proinflammatory and antiinflammatory cytokine production in multiple organ dysfunction syndrome. Crit Care Med. 2002; 30:2216-21 62.- Gallagher PM, Lowe G, Fitzgerald T, et al. Association of IL-10 polymorphism with severity of illness in community-acquired pneumonia. Thorax 2003; 58:154-6 63.- Stuber F. Another definite candidate gene for genetic predisposition of sepsis: Interleukin-10. Crit Care Med 2003; 31:314-315 64.- Arnalich F, López-Maderuelo D, Codoceo R, et al. Interleukin-1 receptor antagonist gene polymorphism and mortality in patients with severe sepsis. Clin Exp Immunol 2002; 127:331-336 61 Tesis Doctoral 65.- Fang XM, Schröder S, Hoeft A, Stüber F. Comparison of two polymorphisms of the interleu kin-1 gene family: interleukin-1 receptor antagonist polymorphism contributes to susceptibility to severe sepsis. Crit Care Med 1999; 27:1330-4 66.- Bradley JR. TNF-mediated inflammatory disease. J Pathol 2008; 214:149-60 67.- Till A, Rosenstiel P, Krippner-Heidenreich A, et al. The Met-196 -> Arg variation of human tumor necrosis factor receptor-2 (TNFR2) affects TNF-alpha-induced apoptosis by impaired NF-κB signaling and target gene expression. J Biol Chem 2005; 280:5994-6004 68.- Horiuchi T, Kiyohara C, Tsukamoto H, et al. A functional M196R polymorphism of tumour necrosis factor receptor type 2 is associated with systemic lupus erythematosus: a case-control study and a meta-analysis. Ann Rheum Dis 2007; 66:320-4 69.- Glossop JR, Dawes PT, Nixon NB, Mattey DL. Polymorphism in the tumour necrosis factor receptor II gene is associated with circulating levels of soluble tumour necrosis factor receptors in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 2005; 7:R1227-34 70.- Waschke KA, Villani AC, Vermeire S et al. Tumor necrosis factor receptor gene polymor phisms in Crohn's disease: association with clinical phenotypes. Am J Gastroenterol 2005; 100: 1126-33 71.- Rooryck C, Barnetche T, Richez C, Laleye A, Arveiler B, Schaeverbeke T . Influence of FCGR3A-V212F and TNFRSF1B-M196R genotypes in patients with rheumatoid arthritis treated with infliximab therapy. Clin Exp Rheumatol 2008; 26:340-2 72.- Slowik MR, De Luca LG, Fiers W, Pober JS. Tumour necrosis factor activates human endothelial cells through the p55 tumour necrosis factor receptor but the p75 receptor contributes to activation at low tumour necrosis factor concentration. Am J Pathol 1993; 143:1724-30 73.- Herman C, Chernajovsky Y. Mutation of proline 211 reduces shedding of the human p75 TNF receptor. J Immunol 1998; 160:2478-87