Variación del perfil polifenólico de diatomeas Phaeodactylum tricornutum cultivadas en agua de mar enriquecida en cobre (II)

VARIACIÓN DEL PERFIL POLIFENÓLICO DE DIATOMEAS Phaeodactylum tricornutum CULTIVADAS EN AGUA DE MAR ENRIQUECIDA EN COBRE (II) Aroa López, Milagros Rico, Aridane González, Magdalena Santana, Melchor González y Norma Pérez. Departamento de Química, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Campus de Tafira, 35017 Las Palmas de Gran Canaria, Canary Islands, Spain. e-mail: [email protected] TABLA DE CONTENIDOS • Introducción • Técnicas • Cultivo • SPEHPLC • DPPH • Resultados y discusión • Crecimiento • Concentración de polifenoles • Conclusiones INTRODUCCIÓN -Phaeodactylum tricornutumPertenecenalaclasediatomeas,quesonalgas unicelulares presentes en abundancia en el fitoplancton. Las diatomeas se caracterizan por poseer una pared celular impregnada en sílice. Phaeodactylum tricornutum es la única especie que compone el género Phaeodactylum.Seencuentraen distintas zonas costeras alrededor del mundo, con grandes variaciones de salinidad. Debido a que fue de las primeras diatomeas en la que se describió la secuencia genómica completa ha sido sometida a multitud de ensayos. INTRODUCCIÓN -Phaeodactylum tricornutumP. Tricornutum puede existir en diferentes morfologías. Las condiciones ambientales influyen en los cambios en la morfología y el tamaño de estas algas (Martino et al., 2007). Se pueden producir esos cambios en condiciones de altas concentraciones de cobre (Markina y Aizdaicher, 2006 ). * (1) De Martino et al., (2007) Journal of Phycology. 43:992-1009. (2) Markina et al., (2006) Russian Journal of Plant Physiology. 53-3: 343-347. TRIRRADIADA FUSIFORME OVALADA INTRODUCCIÓN -COBREEl cobre es un metal que aparece en bajas concentraciones en el océano y que interviene en algunos procesos biológicos. La contaminación por parte del hombre de tierras de cultivo y de los ecosistemas acuáticos, hace que se incremente en el medio la cantidad de este metal. Este exceso en la concentración de cobre produce una disminución del crecimiento de microalgas, llegando a inhibirlo. (Franklin et al., 2002) * (1) Franklin et al. (2002) Environmental Toxicology and Chemistry. 21/11: 2412-2422. INTRODUCCIÓN -COBRECuando los organismos se encuentran en esas condiciones de toxicidad por elevadas concentraciones de metales desarrollan mecanismos de defensa frente a esta toxicidad. **(1) Jung et al (2003) Plant and Soil 252:301-312. (2) Kovacik and Klejdus (2008) Plant Cell Rep., 27, 605–615. (3) Quideau et al. (2011) Angewandte Chemie. 50/3: 586-621. A nivel extracelular Liberación de polifenoles (Jung et al., 2003) A nivel de pared celular Polifenoles asociados (Kovacik et al., 2008; Jung et al., 2003). A nivel intracelular Inhibición de radicales libres y quelacion de metales (Quideau et al., 2011). INTRODUCCIÓN -POLIFENOLESPOLIFENOLES SIMPLES FENILPROPANOIDES FENOL ÁCIDO GÁLICO ÁCIDO CINAMICO ÁCIDO SINAPICO FLAVONOIDES FLAVONAS FLAVONOLES FLAVANOLES OH COOH OH OHHO COOH COOH OH OMeMeO O O O O OH O OH INTRODUCCIÓN -POLIFENOLESLos organismos producen estos compuestos en respuesta a los distintos tipos de estrés que sufren. La principal característica de estos compuestos es su capacidad antioxidante.* –INHIBEN RADICALES Y ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO (ERO).* –AGENTES QUELANTES DE IONES DE METALES PESADOS.** *(1)Rivero et al.(2001) Plant Science 160: 315-321.(2) Treutter D (2006) Environmental Chemistry Letters.4/3:147-157 **(1) Bentes et al. (2011) Molecules. 16/2:1749-1760.. (2) Neudörffer et al. (2006) J. Agric. Food Chem. 54:1898-1905 Transferencia de hidrogeno: RADICAL· + POLIFENOL-H → RADICAL-H + POLIFENOL· Transferencia de electrones: RADICAL·++ POLIFENOL → RADICAL + POLIFENOL·+ Metal++ POLIFENOL → [POLIFENOL-Metal ] MÉTODOS PRECONCENTRACIÓN Preparamos la muestra (0.1g/5mL HCl) Columna SPE Cromabond Easy Eluciones sucesivas 2mL (2%NaOH) Concentrar hasta 0.5 mL MÉTODOS PRECONCENTRACIÓN 2.5L Agua de mar con exudados 3 Columnas SPE Cromabond Easy Eluciones en metanol Concentrar hasta 0.5 mL MÉTODOS ANÁLISIS MÉTODOS ANÁLISIS 60μL MUESTRA COLUMNA HPLC C18 ISOCRÁTICO: MeOH / H2O (1% Ac. Fórmico) DETECTOR UV – DIODO DE ARRAY MÉTODOS -DPPHCapacidad del antioxidante para neutralizar el radical DPPH. 1 mL de la disolución de DPPH 0.1 mM + 0.2 mL del extracto de alga. Se calcula el porcentaje de inhibición. (1Absext/AbsDPPH)×100 RESULTADOS Y DISCUSIÓN -CRECIMIENTOLa densidad inicial de P.Tricornutum 1·104células·mL-1 Existe una relación entre [Cu] y el descenso en el número de células. El parámetro de inhibición del crecimiento en biomasa, EC50,se alcanza a una concentración de 35ug/mL (Moreno-Garrido et al., 2000) 3 Cultivos -0 ug / L Cobre (Blanco) -20 ug / L Cobre -50 ug / L Cobre * Moreno-Garrido et al.(2000) Ecotoxicology and Environmental Safety. 47:112-116. RESULTADOS Y DISCUSIÓN -CRECIMIENTO52% 78% 100% 0 50 100 Blanco Cobre 20 Cobre 50 % Crecimiento RESULTADOS Y DISCUSIÓN -CRECIMIENTO471% 52% 78% 100% 0 100 200 300 400 500 Blanco Cobre 20 Cobre 50 Hierro 50 % Crecimiento RESULTADOS Y DISCUSIÓN -CONCENTRACIÓN DE POLIFENOLESBLANCO [Cu] 20μg L-1 [Cu] 50μg L-1 [Fe] 50μg L-1 Gentísico* 21.3 ± 0.7 27 ± 1 42 ± 2 11.5 ± 0.8 Miricetina* 17.9 ± 0.2 38 ± 3 43 ± 2 66 ± 3 Sinápico* 72 ± 1.1 71.7 ± 3.1 136.9 ± 10.7 60 ± 4 Quercitrina* 74.7 ± 1.2 81.7 ± 1.4 148.8 ± 3.7 70 ± 2 Kaempferol* 61.6 ± 2.5 75.5 ± 2.44 121.6 ± 1.5 64 ± 2 Apigenina* 63.0 ± 0.8 77.9 ± 1.8 128.8 ± 1.9 61 ± 2 * (μg·celulas-1)·10 10 FILTROS RESULTADOS Y DISCUSIÓN -CONCENTRACIÓN DE POLIFENOLES- (μg·celulas-1)·10 10 0 20 40 60 80 100 120 140 160 SINAPICO QUERCITRINA KAEMPFEROL APIGENINA AC. GENTISICO MIRICETINA Blanco [Cu]=20ug [Cu]=50ug [Fe]=50ug FILTROS VARIACIÓN DEL PERFIL POLIFENÓLICO DE DIATOMEAS Phaeodactylum tricornutum CULTIVADAS EN AGUA DE MAR ENRIQUECIDA EN COBRE (II) Aroa López, Milagros Rico, Aridane González, Magdalena Santana, Melchor González y Norma Pérez. Departamento de Química, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Campus de Tafira, 35017 Las Palmas de Gran Canaria, Canary Islands, Spain. e-mail: [email protected] MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN