Ensaios físico-químicos em produtos alimentares

Eliana Bea iz Magano dos San os Ensaios ísico-químicos em p odu os alimen a es ou ub o de 2019 UMinho | 2019 Eliana San os Ensaios ísico-químicos em p odu os alimen a es Uni e sidade do Minho Escola de Ciências Eliana Bea iz Magano dos San os Ensaios ísico-químicos em p odu os alimen a es Disse ação de Mes ado Mes ado em Técnicas de Ca ac e ização e Análise Química T abalho e e uado sob a o ien ação da Dou o a Alice Helena Machado F ei as dos San os e da P o esso a Dou o a Ma ia Dulce Sil a Ge aldo Uni e sidade do Minho Escola de Ciências ou ub o de 2019 ii DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Es e é um abalho académico que pode se u ilizado po e cei os desde que espei adas as eg as e boas p á icas in e nacionalmen e acei es, no que conce ne aos di ei os de au o e di ei os conexos. Assim, o p esen e abalho pode se u ilizado nos e mos p e is os na licença abaixo indicada. Caso o u ilizado necessi e de pe missão pa a pode aze um uso do abalho em condições não p e is as no licenciamen o indicado, de e á con ac a o au o , a a és do Reposi ó iUM da Uni e sidade do Minho. Licença concedida aos u ilizado es des e abalho A ibuição CC BY h ps://c ea i ecommons.o g/licenses/by/4.0/ iii Ag adecimen os Que o ag adece à Sillike Po ugal S.A. e à Uni e sidade do Minho pela possibilidade de ealiza a p esen e disse ação. A odas as pessoas da emp esa que me acolhe am ão bem, po oda a expe iência e conhecimen o ansmi ido. Ag adeço à D a. Alice San os pela simpa ia, disponibilidade e apoio p es ado. Também não pode ia deixa de ag adece a g ande opo unidade que es e es ágio me p opo cionou, jun a - me à amília Mé ieux Nu iSciences. À p o esso a D a. Dulce Ge aldo po se uma p o esso a e o ien ado a inc í el, semp e p on a a ajuda , po odo o apoio e disponibilidade. G a i ico ambém o mes ado e odos os meus colegas. A odos os meus amigos e em especial à And eia, po nunca me e deixado cai . Po úl imo, um since o e especial ob igado à minha amília e ao meu namo ado po se em o meu po o de ab igo. i DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Decla o e a uado com in eg idade na elabo ação do p esen e abalho académico e con i mo que não eco i à p á ica de plágio nem a qualque o ma de u ilização inde ida ou alsi icação de in o mações ou esul ados em nenhuma das e apas conducen e à sua elabo ação. Mais decla o que conheço e que espei ei o Código de Condu a É ica da Uni e sidade do Minho. Tí ulo Ensaios ísico-químicos em p odu os alimen a es. Resumo A p esen e disse ação oi desen ol ida no âmbi o do P oje o Indi idual do mes ado em Técnicas de Ca ac e ização e Análise Química do Depa amen o de Química da Uni e sidade do Minho na Sillike Po ugal S.A., uma emp esa independen e de p es ação de se iços analí icos e de consul ado ia nos á ios amos do se o ag oalimen a . Pa a que os labo a ó ios cump am com os equisi os da qualidade pa a ga an i a ob enção de esul ados con iá eis, a alidação de mé odos é de ex ema impo ância. Du an e o P oje o Indi idual, oi e alidado um mé odo já implemen ado no labo a ó io – De e minação do eo de hid oxip olina de aco do com a No ma NP 1987: 2002. A hid oxip olina é quan i a i amen e de e minada como medida do ma e ial colagenoso em ca ne e p odu os cá neos e a sua quan i icação é um elemen o impo an e na a aliação da qualidade da ca ne. Pa a a alidação o am ealizados es udos que pe mi i am de ini a cu a de calib ação, a alia a linea idade e o limi e de quan i icação, de e mina a p ecisão do mé odo, a pa i da epe ibilidade e da p ecisão in e média, a e acidade e ainda ob e uma es ima i a da ince eza. A alidação oi ealizada conside ando uma g ande a iedade de amos as pe encen es à ma iz do g upo das ca nes, p odu os cá neos e de i ados. Fo am ainda desempenhadas di e sas unções em análises de o ina da emp esa como os ensaios de de e minação do pH, do esíduo seco solú el, do eo de sólidos solú eis e da acidez. Pala as-cha e: Exa idão, hid oxip olina, ince eza, No ma NP 1987:2002, alidação. i Ti le Physicochemical es s on ood p oduc s. Abs ac This wo k was de eloped as pa o a cu icula in e nship p ojec o he mas e ’s deg ee in Chemical Analysis and Cha ac e iza ion Techniques o he Depa men o Chemis y o he Uni e si y o Minho a Sillike Po ugal S.A., an independen company p o iding analy ical and consul ing se ices in ag i- ood sec o . Fo labo a o ies o mee quali y equi emen s o ensu e eliable esul s, alida ing a me hod is ex emely impo an . Du ing he in e nship, a me hod al eady implemen ed in he labo a o y – De e mina ion o hyd oxyp oline con en acco ding o S anda d NP 1987:2002. Hyd oxyp oline is quan i a i ely de e mined as a measu e o collagenous ma e ial in mea and mea p oduc s and i s quan i ica ion is an impo an elemen in he e alua ion o mea quali y. Fo alida ion, s udies we e ca ied ou o de ine he calib a ion cu e, o e alua e he linea i y and he limi o quan i ica ion, o de e mine he accu acy o he me hod, based on epea abili y and in e media e p ecision, e aci y and o ob ain an es ima e o he unce ain y. Valida ion was pe o med conside ing a la ge a ie y o samples belonging o he g oup o mea , mea p oduc s and de i a i es. Se e al unc ions we e also pe o med in ou ine company analyzes in he pH de e mina ion assays, o he soluble d y esidue, soluble solids con en and acidi y. Keywo ds: Accu acy, hyd oxyp oline, S anda d NP 1987:2002, alida ion, unce ain y. ii Índice 1. In odução ................................................................................................................... 1 1.1. A emp esa .................................................................................................................... 2 1.1.1. Análises Físico-Químicas ealizadas pela Sillike Po ugal S.A. .................. 3 1.2. Obje i os do es ágio .................................................................................................... 4 1.3. Enquad amen o ge al .................................................................................................. 5 1.3.1. Impo ância da qualidade alimen a e legislação ...................................... 5 1.3.2. Ac edi ação ................................................................................................. 7 1.3.3. NP EN ISO/IEC 17025 .................................................................................. 7 1.3.4. Sis ema de Ges ão da Qualidade da emp esa ............................................ 8 2. Fundamen os eó icos ............................................................................................... 10 2.1. Espe o o ome ia ..................................................................................................... 11 2.2. Hid oxip olina ............................................................................................................ 14 2.3. Validação de mé odos ............................................................................................... 18 2.3.1. Pa âme os de a aliação indi e a ............................................................. 19 2.3.1.1. Especi icidade/sele i idade ........................................................................ 19 2.3.1.2. Quan i icação .............................................................................................. 22 2.3.1.3. Cu as de calib ação ................................................................................... 22 2.3.1.4. Limia es Analí icos ...................................................................................... 23 2.3.1.5. Sensibilidade do mé odo: ........................................................................... 24 2.3.1.6. Gama de abalho e linea idade ................................................................. 24 2.3.1.7. P ecisão ....................................................................................................... 26 2.3.1.8. Robus ez ..................................................................................................... 29 2.3.2. Pa âme os de a aliação di e a ................................................................ 29 xi Índice de igu as Figu a 1: Ins alações da Sillike Po ugal S.A. .................................................................... 3 Figu a 2: Esquema dos componen es p incipais de um espe o o óme o 15. ................... 13 Figu a 3: Es u u a química da ans-4-hid oxi-L-p olina 29. .............................................. 15 Figu a 4: Mecanismo p opos o pa a a oxidação da Hyp a pi ol 11. ................................... 16 Figu a 5: Reação pa a de e minação da Hyp 33. .............................................................. 17 Figu a 6: Pa âme os de a aliação di e a e indi e a pa a alidação de um mé odo analí ico 35. ................................................................................................................................. 19 Figu a 7: Amos as con idas no ma az com 30 mL de ácido sul ú ico 3 M p on as pa a i em 16 ho as à es u a a 105 ºC ................................................................................................ 38 Figu a 8: Re a de calib ação da abso ância (λ=558 nm) em unção da concen ação de Hyp (µg/mL). ..................................................................................................................... 42 Figu a 9: Ca a de con olo dos decli es no pe íodo es udado. ........................................ 45 x Índice de abelas Tabela 1: Relação en e o colagénio e a p o eína da ca ne em pe cen agem em di e en es ipos de ca ne picada 5. ........................................................................................................ 17 Tabela 2: Limi es máximos de ecido conjun i o pa a os ing edien es designados pelo e mo "ca ne de..." 5. ............................................................................................................ 17 Tabela 3: Tabela esumo de pa âme os que possibili am a es ima i a da exa idão: e o ela i o, Z-sco e, e o no malizado e es e 35. .............................................................. 30 Tabela 4: Reagen es u ilizados e as suas p op iedades. ................................................... 35 Tabela 5: Ma izes es udadas na alidação do mé odo: ca nes, p odu os cá neos e de i ados. ................................................................................................................................. 36 Tabela 6: Concen ação de Hyp (µg/ml) das soluções pad ão e espe i os alo es de abso ância. ............................................................................................................... 41 Tabela 7: Concen ação de e e ência do pad ão mais baixo e concen ação ob ida expe imen almen e desse pad ão, e o ela i o e acei ação. ........................................... 43 Tabela 8: Equações das e as de calib ação do pe íodo es udado. .................................... 44 Tabela 9: Valo es das linhas cen al (média), LA e LC da ca a de con olo dos decli es da e a de calib ação. ............................................................................................................. 45 Tabela 10: Limi e de de ecção, LD, limi es de quan i icação, LQ, calculados no pe íodo do P oje o Indi idual e LQ es abelecido pelo labo a ó io. .................................................... 46 Tabela 11: Valo es ob idos nas dez éplicas independen es do pad ão mais baixo e pad ão mais al o analisadas no mesmo dia pa a ealiza o es e de homogeneidade de a iâncias. 47 Tabela 12: Resul ados ob idos da aplicação do es e de homogeneidade de a iâncias. ..... 47 Tabela 13: Dados dos 43 duplicados analisados pa a e idencia o cump imen o da epe ibilidade. ............................................................................................................ 49 Tabela 14: Pa âme os ca a e ís icos da p ecisão in e média. Des io pad ão da p ecisão in e média, sPI, Limi e de p ecisão in e média ela i o, PI e coe icien e de a iação da p ecisão in e média, CVPI .......................................................................................................... 50 x i Tabela 15: Resul ados ob idos nos ensaios in e labo a o iais. ......................................... 51 Tabela 16: Dados u ilizados pa a calcula a componen e da exa idão da ince eza (μg/mL). 52 Tabela 17: Pa âme os da componen e ince eza associados à p ecisão in e média. ......... 52 Tabela 18: F ases de pe igo (H) e p ecaução (P) associados aos eagen es u ilizados. ........ 64 1 1. In odução 2 1.1. A emp esa Em julho de 1992 su giu, em Vila No a de Gaia, a Sociedade de Engenha ia e Ges ão da Qualidade, Lda. (EGI), como uma emp esa de p es ação de se iços no se o ag oalimen a , dando espos a à p e enção da qualidade e segu ança alimen a com se iços de análise e acesso ia, o nando-se líde no seu se o . A EGI in eg a desde 1993 o Sis ema Po uguês da Qualidade a a és da ac edi ação do seu labo a ó io. Depois do ano 2000 c iou-se o labo a ó io de Análise Senso ial, onde se a aliam e ca ac e izam o ganole icamen e os p odu os de consumos e a EGI oi o çada a aumen a as suas ins alações em 2005, passando a localiza -se na zona indus ial dos Te ços, na eguesia de Canelas, onde se encon a a ualmen e. Em 2008, a mul inacional no e-ame icana Sillike adqui e a emp esa dando o igem à Sillike Po ugal, S.A. passando a in eg a um dos maio es g upos mundiais na p es ação de se iços des a á ea. Ou os ma cos impo an es da emp esa são o lançamen o em 2009 do se iço de Es udos de Vida Ú il de modo a alida o pe íodo de alidade pa a os di e en es p odu os de cada clien e, e ainda a ob enção da ac edi ação dos p imei os 8 ensaios de águas de consumo humano in eg ados na o e a de se iços analí icos na á ea ambien al em no emb o de 2010 1. Em janei o de 2012, ainda na á ea ambien al, ob e e a ac edi ação das colhei as das amos as das águas de consumo e em mais dois ensaios ísico-químicos. Também em 2011, a ac edi ação expandiu pa a as análises e e iná ias, com a pesquisa de Salmonella em amos as de ma é ia ecal e ambien ais p o enien es da p odução p imá ia. Em 2013, su gi am no os se iços como o se iço de análises aos ma e iais de embalagens que en am em con ac o di e o com os alimen os, analisando odos os aspe os impo an es desde o design da embalagem, ab ico a é à u ilização inal e eliminação 2. A Sillike encon a-se, a ualmen e, em 21 países com mais de 80 labo a ó ios, com o obje i o de esponde às necessidades no que diz espei o à p e enção da qualidade e segu ança alimen a . Pe encendo à Mé ieux Nu iSciences ( igu a 1), do Ins i u o Mé ieux, a Sillike é um pa cei o de con iança no âmbi o da saúde pública po meio de análises labo a o iais, audi o ias, consul ado ia, o mação e se iços de in es igação 3. 3 A Mé ieux Nu iSciences, na á ea da indús ia alimen a , p es a se iços analí icos quali a i os e/ou quan i a i os de pesquisa de ale génios em alimen os, es udos de ida ú il e es abilidade dos alimen os, de ecção de con aminan es, mono o ização de supe ícies, a e água, se iços de apoio ao con olo da aude e au en icidade dos alimen os, audi o ias ao Sis ema de Ges ão da Qualidade e Segu ança Alimen a , análise de ma e iais em con ac o com p odu os alimen a es e alidação de o ulagem 3. 1.1.1. Análises Físico-Químicas ealizadas pela Sillike Po ugal S.A. A Sillike Po ugal, S.A. possui ês labo a ó ios: labo a ó io de Físico-Química onde são execu adas a maio ia das écnicas clássicas de análise, labo a ó io de Mé odos Ins umen ais de Análise onde são ealizadas análises po écnicas c oma og á icas e espe o o omé icas e o labo a ó io de Mic obiologia. Rela i amen e aos ensaios ísicos-químico des acam-se as análises pa a de e mina : a) Con aminan es: Me ais pesados (a sénio, cádmio, chumbo…), ale génios (glú en, su i os…) e ou os (ac ilamida, mico oxinas…); b) Pa âme os de Qualidade: Acidez, desin eg ação, dissolução, cinzas, a iação de peso e pe da po secagem; c) Nu icionais: Hid a os de ca bono ( ib a alimen a , pe il de açúca es, amidos…), p o eínas ( eo de p o eína, pe il de aminoácidos, ans-4-hid oxi-L-p olina, lípidos Figu a 1: Ins alações da Sillike Po ugal S.A. 4 (coles e ol, ma é ia go da, pe il de ácidos go dos, índice de pe óxidos…) componen es p incipais (cinzas, ib a b u a…), i aminas (hid ossolú eis e lipossolú eis) e mine ais (cálcio, e o, magnésio, zinco…). d) Adi i os: An ioxidan es (ácido ascó bico, palmi a o de asco bilo…), adoçan es (glice ol, u ose, galac ose…), conse an es (ácido acé ico, benzóico, málico, pe il de ácidos o gânicos, benzoa os, ni i o e ni a os…) e co an es. Todos os labo a ó ios do g upo Mé ieux Nu iSciences são ac edi ados po um o ganismo independen e de aco do com o e e encial ISO/IEC 17025. Es e o nece uma a aliação obje i a da compe ência écnica dos labo a ó ios e assegu a a p ecisão, exa idão e epe ibilidade dos esul ados analí icos 4. O ac o de se a a de uma no ma in e nacional é o pon o de pa ida pa a o e ece se iços ha monizados a ní el mundial. O labo a ó io em Po ugal é ac edi ado pelo IPAC (Ins i u o Po uguês de Ac edi ação, I.P.) e cump e po isso com os c i é ios de ac edi ação pa a labo a ó ios de ensaio es abelecidos na NP EN ISO/IEC 17025, econhecidos pelo IPAC (ac edi ação nº L0087) 4. Tem ambém implemen ado um sis ema de qualidade em que os elemen os des e sis ema es ão documen ados no Manual da Qualidade (MQ) que se encon a disponí el e acessí el na emp esa 2. Pelo ac o de se uma e e ência a ní el mundial no se o alimen a , o g upo Sillike necessi a de ga an i a iabilidade dos esul ados analí icos publicados. Assim, a emp esa subme e-se a audi o ias pe iódicas in e nas e ex e nas, e pa icipa a ní el nacional e in e nacional, em ci cui os de ensaios de compa ação in e labo a o ial (ECI), com o p opósi o de a alia o seu desempenho. Pa a além dis o, dia iamen e segue igo osos p ocedimen os de con olo de qualidade como o uso de DPCS (Daily P ocess Con ol Sample), análises de amos as em duplicado e análises de pad ões de con olo (em mé odos de cu a de calib ação). 1.2. Obje i os do es ágio A p esen e disse ação su ge no âmbi o do P oje o Indi idual do mes ado em Técnicas de Ca ac e ização e Análise Química do Depa amen o de Química da Uni e sidade do Minho 5 ealizado na emp esa Sillike Po ugal S.A. em Canelas, Vila No a de Gaia. O es ágio e e uma du ação de no e meses (se emb o de 2018 a junho de 2019). Em janei o de 2019, oi me ende eçado o con i e pa a in eg a a equipa do Labo a ó io de Química da emp esa. Numa ase inicial, oco eu a adap ação e in eg ação à emp esa, e p ocedeu-se à análise de documen ação ele an e, como o Manual de Qualidade da emp esa. Seguidamen e deco eu o acompanhamen o dos analis as em ensaios de o ina ac edi ados e implemen ados no Labo a ó io de Química, conhecendo e u ilizando os di e en es equipamen os do labo a ó io e so wa e, dando en âse às e amen as de con olo de qualidade implemen adas e u ilizadas dia iamen e. Depois de ealiza os mé odos de ensaio em pa alelo com os analis as p incipais, começou-se a ealiza as análises de o ma au ónoma. O p incipal obje i o consis iu em adqui i compe ências a odos os ní eis no âmbi o do abalho de o ina de um labo a ó io ac edi ado, e em especial na alidação de mé odos químicos analí icos em p odu os alimen a es com ecu so a écnicas de química clássica. Pa a além disso ealiza am-se ou os ensaios eco endo a mé odos ins umen ais de análise. Nes a disse ação ap esen a-se o es udo da e alidação de um mé odo já implemen ado na emp esa - De e minação do eo de hid oxip olina (Hyp) de aco do com a no ma NP 1987:2002. Es e mé odo analí ico oi u ilizado em condições de análise de amos as eais em di e sas ma izes de ca ne. Fo am a aliados os pa âme os de desempenho, nomeadamen e a epe ibilidade, p ecisão in e média, e acidade e ince eza do mé odo. 1.3. Enquad amen o ge al 1.3.1. Impo ância da qualidade alimen a e legislação A alimen ação a e a di e amen e a saúde, sendo o conhecimen o da in o mação nu icional e da qualidade dos alimen os inge idos dia iamen e de ex ema impo ância. A União Eu opeia (UE) lançou o Regulamen o (UE) n.º 1169/2011 que es abelece os p incípios, equisi os e esponsabilidades ge ais que egem a in o mação sob e os géne os alimen ícios e, em pa icula , sob e a o ulagem. Es e documen o legal é aplicá el a odos os géne os alimen ícios des inados ao consumido inal, incluindo os que são o necidos po 6 es abelecimen os de es au ação cole i a e os que se des inam a se o necidos a esses es abelecimen os 5. Um egulamen o é um a o legisla i o inculado, aplicá el a odos os países da UE. O egulamen o é de aplicação di e a e po isso não p ecisa de se anspos o pa a a legislação nacional, e i ando-se assim as e e idas in e p e ações di e gen es 6. O Regulamen o (CE) n.º 1881/2006 da Comissão Eu opeia, de 19 de dezemb o de 2006, ixa os eo es máximos de ce os con aminan es p esen es nos géne os alimen ícios com a inalidade de p o ege a saúde pública e man e os con aminan es em ní eis que sejam acei á eis do pon o de is a oxicológico. No caso dos con aminan es que sejam conside ados como subs âncias cance ígenas geno óxicas ou em casos em que a exposição a ual da população ou dos g upos ulne á eis da população se ap oxime ou exceda a dose admissí el, o egulamen o e e e que de em de ini -se eo es máximos a um ní el que seja ão baixo quan o azoa elmen e possí el 7. Pela exis ência de um núme o cada ez maio de alimen os p ocessados, o ulados e publici ados e de o ma a se possí el assegu a um ele ado ní el de p o eção dos consumido es e a acili a as suas escolhas, os p odu os colocados no me cado, incluindo os impo ados, de e ão se segu os e de idamen e o ulados. Um egime alimen a a iado e equilib ado é uma condição indispensá el pa a a manu enção da saúde e os p odu os conside ados indi idualmen e êm uma impo ância ela i a no con ex o do egime alimen a ge al. Po isso, o Regulamen o (CE) n.º 1924/2006 do Pa lamen o Eu opeu e do Conselho, de 20 de dezemb o de 2006, ela i o às alegações nu icionais e de saúde sob e os alimen os, p e ê uma uni o mização das o ulagens pa a os géne os alimen ícios 8. Es es egulamen os isam ainda a diminuição do isco de aude alimen a . A aude alimen a é a p odução e/ou a come cialização delibe ada de p odu os alimen a es não con o mes. Oco e quando os p odu os não es ão em con o midade legal, ou seja, quando a legislação alimen a da UE é in encionalmen e iolada pa a ob e um ganho económico ou inancei o, enganando o consumido 9. A qualidade e segu ança alimen a o nam-se undamen ais na en a i a de ga an i que os alimen os inge idos são inócuos e que es ão ap os pa a se em consumidos, ha endo a necessidade ac escida de ga an i que os p odu os alimen a es es ão de aco do com as especi icações e egulamen os de segu ança exis en es an es de chega ao consumido 10. 7 Os mé odos de análise de em ap esen a especi icidade, pois os alimen os são de cons i uição química complexa, podendo seus componen es in e e i nos esul ados 11. 1.3.2. Ac edi ação A ac edi ação se e essencialmen e pa a adqui i e ansmi i con iança na execução de de e minadas a i idades écnicas, ao con i ma a exis ência de um ní el de compe ência écnica mínimo, econhecido in e nacionalmen e. A ac edi ação é po isso uma e amen a de globalização e in e nacionalização da economia, p omo endo as expo ações nacionais. O Regulamen o (CE) n.º 765/2008 ob iga as au o idades nacionais dos Es ados-Memb os da UE a econhece em a equi alência das ac edi ações dos signa á ios do Aco do da EA (do inglês Eu opean Coope a ion o Acc edi a ion) 12. A ac edi ação consis e na demons ação e econhecimen o, a a és de uma a aliação e e uada pelo o ganismo de ac edi ação Ins i u o Po uguês de Ac edi ação, I.P. (IPAC), da compe ência écnica e de ges ão de uma o ganização, pa a es a e e ua a i idades especí icas de a aliação da con o midade de aco do com a mesma no ma. O IPAC é o o ganismo nacional de ac edi ação eque ido pelo Regulamen o (CE) n.º 765/2008 12. A ac edi ação de um labo a ó io não é uma ce i icação. Quando um labo a ó io passa a se ac edi ado, o cump imen o das exigências des a ac edi ação é um equisi o legal pa a o exe cício de uma de e minada a i idade de a aliação da con o midade, ao con á io da ce i icação que é maio i a iamen e uma opção olun á ia das emp esas. 1.3.3. NP EN ISO/IEC 17025 Um dos equisi os pa a ac edi ação de qualque labo a ó io segundo a no ma NP EN ISO/IEC 17025, é a exis ência de um sis ema de ges ão de qualidade documen ado. A no ma NP EN ISO/EC 17025 em como equisi os de ges ão a necessidade de ealização de audi o ias in e nas, ealizadas pe iodicamen e de o ma a e i ica se as a i idades ealizadas cump em com os equisi os do Sis ema de Ges ão e da p óp ia no ma. As audi o ias in e nas são uma e amen a essencial pa a iden i ica e p eca e alhas no Sis ema de Ges ão e na e i icação da e iciência da Polí ica de Qualidade 13. 14 e um de ec o . Des a o ma, ob ém-se uma análise mais ápida de á ios comp imen os de onda em simul âneo e diminuição do uído associado ao sinal medido 20. Apesa do mé odo espe o o omé ico se o mais u ilizado na quan i icação do aminoácido Hyp de ido à p ecisão, simplicidade, baixo cus o e apidez, podem se u lizadas ou as écnicas como o mé odo enzimá ico ELISA (do inglês Enzyme-Linked Immunoso ben Assay) ou a c oma og a ia líquida de al a e iciência, HPLC (do inglês: High pe o mance liquid ch oma og aphy) 11. 2.2. Hid oxip olina A hid oxip olina (Hyp) é um aminoácido não essencial que cons i ui p o eínas e de i ados da p olina. Encon a-se undamen almen e no ecido conjun i o e ósseo. A quan i icação da Hyp é um elemen o impo an e na a aliação da qualidade da ca ne, uma ez que es á elacionada di e amen e com a ma é ia-p ima cá nea 21. A de ecção e a de e minação de Hyp são um eque imen o essencial pa a a ciência e ecnologia de ca nes que p ocu a explica a e dadei a con ibuição do colagénio pa a a es u u a e qualidade da ca ne 22. Em ge al, a ca ne com ele ada p opo ção de ecido conjun i o é conside ada de baixa qualidade, de ido à edução da sua maciez e alo nu icional, es ando g ande pa e dos aminoácidos essenciais em p opo ção eduzida 23. São u ilizadas ês ca ac e ís icas pa a de ini a qualidade da ca ne: a apa ência, maciez e sabo . A qualidade da ca ne es á associada à in e ação de a o es biológicos do animal i o e p ocessos bioquímicos que oco em no pos mo em como a con e são do músculo em ca ne du an e o a mazenamen o 24. As ca nes u ilizadas pa a elabo ação de embu idos emulsionados são as ca nes indus iais da linha de aba e, e alhos e apa as p o enien es da desossa. Ap esen am ele ado eo de p o eínas não mio ib ila es, como as do ecido conjun i o 25. Com a ele ação dos cus os dos co es cá neos, algumas indús ias êm inco po ado audulen amen e ecidos in e io es ou ma é ias-p imas cá neas de baixo alo come cial, icas em ib as de ecido conjun i o, com a inalidade de ob enção de maio luc o 26. 15 Na exis ência de uma legislação que es abeleça eo es máximos de p o eína do ecido conjun i o colagenoso em ca nes e p odu os cá neos, o eo de colagénio de e se de e minado com segu ança, ha endo a necessidade de mé odos de análise de o ina que sejam simples, con iá eis e su icien emen e ápidos 11. A p olina (P o) oi sin e izada pela p imei a ez po Wills a e em 1900. Mas es e aminoácido só oi econhecido como componen e das p o eínas, quando em 1901, Fische conseguiu isolá-lo a pa i do hid olisado ácido da gela ina usando um és e 27. Já a Hyp oi descobe a mais a de ambém po Fische . Em 1905, Leuchs ob e e a Hyp a a és de uma sín ese, onde oi escla ecida a sua es u u a química ( e igu a 3) 28. É ainda possí el encon a a Hyp na pa ede celula ege al. O ecido conjun i o colagenoso ep esen a oi o ezes o eo de Hyp, ou seja, con ém 12,5 % des e aminoácido 11. O e mo colagénio é u ilizado pa a denomina uma amília de 27 p o eínas iso o mas encon adas nos ecidos conjun i os. Em e mos de quan idade, é o cons i uin e mais impo an e do ecido conjun i o e é um elemen o es u u al impo an e em o ganismos mul icelula es. O colagénio é uma p o eína ib osa encon ada em odo o eino animal, con ém cadeias pep ídicas dos aminoácidos glicina (Gly), P o, lisina (Lys), hid oxilisina (Hyl), Hyp e alanina (Ala). Essas cadeias são o ganizadas de o ma pa alela a um eixo, o mando as ib as de colagénio, que p opo cionam esis ência e elas icidade à es u u a p esen e 23. A sequência de aminoácidos no colagénio é, em ge al, uma unidade ipep ídica, glicina- X-p olina ou glicina-X-hid oxip olina, onde o X pode se qualque um dos 20 aminoácidos- pad ão. Cada molécula de colagénio pode e a é ês cadeias di e en es, que se unem na o mação do p ocolagénio 30. Uma ez que a p esença da Hyp é a a nas p o eínas, oco endo apenas em algumas ais como a elas ina (1,6 %), e ainda em meno ex ensão na p o eína do complemen o do so o, é Figu a 3: Es u u a química da ans-4-hid oxi-L-p olina 29. 16 impo an e o desen ol imen o de mé odos de quan i icação des e aminoácido, de o ma a quan i ica indi e amen e o eo de colagénio 31. A Hyp é quan i a i amen e de e minada como medida do ma e ial colagenoso em ca ne e p odu os cá neos 32. Na hid oxilação da P o em Hyp, a p o eína p olil hid oxilase econhece a P o como o seu subs a o desde que es a se encon e ao lado de uma Gly na sequência, no sen ido amino a ca boxilo, sendo en ão inse ido um g upo OH— no esíduo de P o. Na de e minação espe o o omé ica da concen ação de Hyp, a amos a é inicialmen e hid olisada com ácido sul ú ico a 105 °C pa a libe a a Hyp da ligação pep ídica e sepa a da go du a. O aminoácido li e é de e minado colo ime icamen e após oxidação a pi ol pelo eagen e clo amina T ( igu a 4) e eação com 4-dime ilaminobenzaldeído esul ando num compos o de colo ação e melho-pú pu a pela adição do eagen e 4- (dime ilamino)benzaldeído ( igu a 5) e a abso ância é medida espe o o ome icamen e a 558 nm 11. Figu a 4: Mecanismo p opos o pa a a oxidação da Hyp a pi ol 11. 17 A ní el de legislação, o egulamen o (UE) n.º 1169/2011 do pa lamen o eu opeu e do conselho de 25 de ou ub o de 2011 5, de ine a elação colagénio/p o eína da ca ne exp essa como pe cen agem de colagénio na p o eína da ca ne nos di e en es ipos de ca ne picada ( abela 1). Como já e e ido, o eo de colagénio ep esen a oi o ezes o eo de Hyp. Tabela 1: Relação en e o colagénio e a p o eína da ca ne em pe cen agem em di e en es ipos de ca ne picada 5. Colagénio/p o eína da ca ne (%) Ca ne picada mag a ≤ 12 Ca ne pu a de bo ino picada ≤ 15 Ca ne picada de suíno ≤ 18 Ca ne picada de ou as espécies ≤ 15 De ine ambém o eo o al de ecido conjun i o que não de e se excedido em di e sos ipos de ca ne ( abela 2). Quando es es limi es são ul apassados, a lis a de ing edien es do p odu o de e menciona a p esença de ecido conjun i o. Tabela 2: Limi es máximos de ecido conjun i o pa a os ing edien es designados pelo e mo "ca ne de..." 5. Espécie Colagénio/p o eína (%) Mamí e os 25 Suínos 25 A es e coelhos 10 Figu a 5: Reação pa a de e minação da Hyp 33. 18 A no ma po uguesa NP 1987:2002 – Ca nes e p odu os cá neos. De e minação do eo de hid oxip olina, em como obje i o ixa um mé odo pa a de e minação da Hyp da ca ne e p odu os cá neos eco endo a um mé odo espe o o omé ico. É aplicá el aos p odu os que con enham menos de 0,5 % (m/m) de Hyp. O eo de Hyp da ca ne e p odu os cá neos é de e minado de aco do o p ocedimen o da no ma e exp esso em pe cen agem. 2.3. Validação de mé odos Validação é um conjun o de ope ações necessá ias pa a demons a que um p ocedimen o é adequado pa a a aplicação p e endida. A alidação de um mé odo analí ico em po obje i o o conhecimen o de seu po encial aplica i o e de suas limi ações, sendo essencial pa a a co e a in e p e ação dos esul ados ob idos na aplicação do mé odo. O p ocesso de alidação em o obje i o de a alia a epe i i idade e a ep odu ibilidade do mé odo, pela in e p e ação dos pa âme os que de inem a exa idão e a p ecisão do mesmo 11. A alidação de esul ados segue o p incípio básico de que um esul ado pa a se conside ado álido em de sa is aze os equisi os de qualidade que lhe sejam exigidos 14. A alidação de um mé odo é um concei o an igo nos labo a ó ios analí icos. Desde há mui o que cien is as alidam os seus mé odos an es de os u iliza em como o ina 34. Semp e que um labo a ó io p a ica mé odos in e nos de ensaio e á que ealiza um p ocesso de alidação desses mesmos mé odos, com odos os esul ados ob idos, de o ma a assegu a que es es são p óximos o su icien e do alo e dadei o desconhecido do anali o nas amos as analisadas 35. A alidação de um mé odo é ei a u ilizando e amen as de a aliação di e a e de a aliação indi e a ( igu a 6) sendo que é necessá io adap a os pa âme os da a aliação a cada ipo de mé odo 35. 19 Quando um labo a ó io u iliza uma no ma ou um documen o no ma i o, apenas necessi a de demons a a obus ez dos esul ados que ge a. A obus ez pode se demons ada u ilizando esul ados de pa icipações em ECI’s ou de uma audi o ia in e na e podem se u ilizados egis os que demons em que é cump ido o es abelecido na no ma - nomeadamen e os c i é ios de epe ibilidade e de ep odu ibilidade 14. Quando o labo a ó io execu a uma adap ação de uma no ma ou um mé odo in e no são necessá ios mais elemen os pa a alida os esul ados, ou seja, é necessá io que o mé odo seja alidado 35. Pa a a alidação de um esul ado a aliam-se ês pa âme os essenciais pa a de e mina a qualidade des e esul ado, sendo eles a e acidade, a p ecisão e a ince eza. A alidação de um mé odo de ensaio in e no de e se ei a aquando da sua implemen ação e de e cump i de e minados equisi os. De em se de e minados os pa âme os sele i idade/especi icidade, gama de abalho, limia es analí icos, linea idade, sensibilidade, p ecisão, exa idão, obus ez e ince eza 35. 2.3.1. Pa âme os de a aliação indi e a Especi icidade/sele i idade O e mo especi icidade, mui as ezes u ilizado como sinónimo de sele i idade, de ine a capacidade do mé odo de ec a o anali o de in e esse na p esença de ou os componen es A aliação Indi e a A aliação Di e a • Sele i idade • Gama de abalho • Quan i icação • P ecisão • Robus ez • Ma e iais de Re e ência ce i icados • Ensaios in e labo ao ias • Tes es compa a i os • Exa idão • Ince eza Figu a 6: Pa âme os de a aliação di e a e indi e a pa a alidação de um mé odo analí ico 35. 20 da ma iz. Já a sele i idade e e e-se à capacidade de de ecção de um g upo es i o de subs âncias. É a capacidade do mé odo iden i ica e dis ingui um anali o numa mis u a complexa, sem in e e ências. Um mé odo especi ico em uma sele i idade pe ei a. A sele i idade de e se es ada pa a qualque in e e en e. A sele i idade de e se a aliada quando se alidam mé odos desen ol idos no labo a ó io, adap ados da li e a u a cien í ica ou no malizados mas u ilizados o a do âmbi o especi icado. Uma o ma de a alia a sele i idade de um mé odo ins umen al é a pa i de ensaios de ecupe ação ealizados em amos as da mesma ma iz, espei ando as condições de epe ibilidade e al e ando a concen ação do anali o. Quando é e i icada a ausência na ín eg a de e ei os de in e e ência, conside a-se que o mé odo é especí ico 36. Po isso, um mé odo é especí ico quando a sele i idade ap esen a esul ados de ecupe ação p óximos a 100 % 35. Al e na i amen e, pode-se a alia amos as es e con endo o anali o em es udo e quan idades conhecidas de possí eis in e e en es e compa a as espos as ob idas. Também pode-se a alia os esul ados ob idos po dois mé odos di e en es ou do mesmo mé odo aplicado em ma izes di e en es. As espos as ob idas são compa adas a a és de es es de signi icância. Usam-se es es wo- ailed (bicaudal) pa a a alia se os alo es ob idos di e em signi ica i amen e 35. 1- Tes e de médias: Es e es e aplica-se quando se p e ende compa a dois mé odos sob e a mesma amos a e não é exigido que o núme o de amos as es udadas seja igual pois usa-se a média dos alo es es udados. P imei amen e é ealizado o es e F de homogeneidade de a iâncias - F Snedeco / Fishe pa a n-1 g aus de libe dade e 95 % de ní el de con iança, a a és das exp essões 2 e 3: PG=s12 s22 ou PG=s22 s12 Exp essão 2 de modo a PG se semp e >1 e onde: Exp essão 3 21 Depois é aplicado o Tes e - compa ação de médias pa a compa a os alo es médios ob idos. Pe mi e es a se as di e enças obse adas se de em apenas a e os alea ó ios. Se as a iâncias não di e i em signi ica i amen e (comp o ado pelo es e F), en ão é aplicada a exp essão 4 pa a n1+n2-2 g aus de libe dade: Exp essão 4 Se as a iâncias di e i em signi ica i amen e, é aplicada a exp essão 5: Exp essão 5 onde o núme o de g aus de libe dade é calculado pela exp essão 6: Exp essão 6 Compa a-se o alo | |calculado com o alo abelado (ní el de con iança de 95 %). Se o | | calculado o meno que o abelado, en ão o mé odo é conside ado sele i o. 2- Tes e das di e enças (amos as empa elhadas): Es e es e é aplicado quando se p e ende compa a dois mé odos sob e amos as iguais na mesma gama de concen ação endo como base o p essupos o de que qualque e o alea ó io e/ou sis emá ico é independen e da concen ação. São compa ados dois conjun os de alo es e não se e e uam éplicas. De e mina-se a di e ença en e cada pa de esul ados, o alo médio das di e enças e o des io pad ão e calcula-se o alo de pela exp essão 7: Exp essão 7 onde 𝑥𝑑 é a média a i mé icas das di e enças, n é o núme o de amos as es udadas e Sd o des io pad ão associado à média das di e enças. 22 Compa a-se o alo | |calculado com o alo abelado pa a n-1 g aus de libe dade e ní el de con iança de 95 %. Se o | | calculado o meno que o abelado, en ão pode-se conclui que o mé odo é sele i o. Quan i icação A quan i icação eque o conhecimen o de dependência da espos a medida com a concen ação do anali o. A quan i icação de um mé odo é ei a eco endo ao cálculo dos pa âme os cu as de calib ação, limia es analí icos e sensibilidade 35. Cu as de calib ação Uma cu a de calib ação co esponde à ep esen ação g á ica de alo es da espos a em unção de alo es de concen ação. A o ma algéb ica da equação de uma e a é y = mx + b. Em elação às a iá eis x e y pode-se e duas si uações: 1- Ince ezas em y são independen es de x: Na p imei a si uação, exis e homogeneidade de a iâncias ao longo da e a e a eg essão linea é de e minada pelo mé odo dos mínimos quad ados. Associado às medições, cada alo de e minado ap esen a semp e uma ince eza associada. Assim, o decli e e a o denada na o igem ap esen am uma dispe são de alo es que é unção do mé odo e pa a a de e minação da sua ince eza é necessá io calcula o des io pad ão esidual Sy/x (des io pad ão da cu a de calib ação), que o nece a dispe são do sinal ins umen al em o no da e a de calib ação 37. Com es es alo es ambém é possí el calcula o des io pad ão associado à concen ação, des io pad ão do mé odo e o coe icien e de a iação do mé odo (que mos a a ex ensão da a iabilidade em elação à média dos dados). A calib ação analí ica pode se a aliada pelo pa âme o coe icien e de co elação ( ) com a exp essão 8 38 39. Exp essão 8 23 O alo do coe icien e de co elação pode oma alo es en e -1 e 1, ep esen ando um decli e nega i o e posi i o, espe i amen e. Em análise química as cu as de calib ação de em e alo es de iguais ou supe io es a 0,995 35. 2- Ince ezas em y dependen es de x: Nes a si uação, não exis e homogeneidade de a iâncias ao longo da e a e os pon os que êm meno des io pad ão (si) de em e maio a o de ponde ação (wi) no cálculo dos pa âme os da e a. Es e ipo de eg essão denomina-se de eg essão linea ponde ada. Os a o es de ponde ação são calculados a pa i da exp essão 9: Exp essão 9 Nes e caso, os alo es do des io pad ão da eg essão linea ponde ada e o des io pad ão associado aos alo es de concen ação de e minados são calculados conside ando os a o es de ponde ação 36. Limia es Analí icos O limi e de de ecção (LD) é a concen ação mais baixa de anali o que pode se de e ada pelo mé odo com um de e minado ní el de con iança 35 38. Co esponde à meno concen ação que pode se dis inguida do b anco e é calculado a pa i da exp essão 10: LD=3×S0 ou LD=3×S0′ Exp essão 10 onde S’0 é des io pad ão conside ando o núme o de éplicas em o ina; n o nº de éplicas e e uadas em análise de o ina e S0 o des io pad ão de m ensaios ealizados em condições de epe ibilidade. No en an o, se o mé odo en ol e uma calib ação linea , o cálculo pode se ei o da eco endo à exp essão 11: LD=[3,3 ⋅ Syx] b Exp essão 11 onde Sy/x é o des io pad ão esidual da cu a de calib ação e b é o decli e da e a 35. 30 pode se es abelecida a a és das análises ealizadas com o auxílio de ma e iais de e e ência ce i icados (MRC), a pa i de ensaios in e labo a o iais (ECI’s) ou es es de ecupe ação e compa a i os. Os ensaios in e labo a o iais são ensaios que pe mi em a alia o desempenho dos labo a ó ios, sob as mesmas condições ou condições elacionadas. Exis em di e sos ipos de ensaios in e labo a o iais consoan e os obje i os a que se des inam. Os ensaios de ap idão a aliam o desempenho dos labo a ó ios pa icipan es sendo po ezes condição pa a a ac edi ação do labo a ó io. Um ma e ial de e e ência ce i icado (MRC) é usado na alidação de um mé odo e possui um alo de concen ação e ince eza associada. Vem acompanhado com um ce i icado e de e se adqui ido a um o necedo c edí el e econhecido. A a és de um MRC é possí el a alia o desempenho do labo a ó io. O alo ob ido é compa ado com o alo ce i icado e de e mina-se o bias, a aliando assim a e acidade. Pa a a alia os esul ados ob idos da análise de um MRC, pode-se calcula o e o ela i o (% RE), o a o de desempenho (Z-sco e), o e o no malizado (En) e a pe cen agem de ecupe ação (% R), de e minados a pa i das exp essões 28, 29 e 30, espe i amen e. Podem ambém se ei os es es de hipó eses eco endo à exp essão 31 ( abela 3) 35. Tabela 3: Tabela esumo de pa âme os que possibili am a es ima i a da exa idão: e o ela i o, Z-sco e, e o no malizado e es e 35. Pa âme o Cálculo Exp essão Obse ações E o ela i o ER (%) = (Xlab−X ) X x 100 28 Xlab é o alo médio do MRC ob ido expe imen almen e; X o alo acei e como e dadei o do MRC. Z-sco e Z = (Xlab−X ) 𝑆 29 O desempenho é classi icado consoan e o alo de Z, em módulo. Se|Z| o in e io ou igual a 2, o desempenho é conside ado sa is a ó io, se |Z| ica comp eendido en e 2 e 3, o desempenho é ques ioná el e nas si uações em que |Z| é maio que 3, o desempenho é não sa is a ó io. E o no malizado En = (Xlab−X ) √𝑈2𝑙𝑎𝑏+√𝑈2𝑟𝑒𝑓 30 Ulab é a ince eza do labo a ó io no seu esul ado; U e é a ince eza do alo e dadei o Tes e de hipó ese = (Xlab−X ) x √N Sxlab 31 O alo de | | é compa ado com abelado pa a n- 1 g aus de libe dade. Quando | |≤ abelado, não há e idências signi ica i as que exis em e os sis emá icos, logo o ensaio é sa is a ó io. Se | |> abelado, há e idência signi ica i a que exis em e os sis emá icos, logo o ensaio é não sa is a ó io. 31 Ince eza Segundo o Vocabulá io In e nacional de Te mos Básicos e Gené icos em Me ologia (VIM), de ine-se como ince eza o “ esul ado de uma medição, que ca ac e iza a dispe são de alo es que pode iam se azoa elmen e a ibuídas ao mensu ado” 41. Em elação ao cálculo da ince eza, pode-se conside a a abo dagem passo-a-passo, a a és de ensaios in e labo a o iais e a a és de dados in a-labo a o iais 42. A no ma ISO 11352 conside a a es ima i a de ince eza combinando a ince eza da p ecisão in e média ( ep odu ibilidade in a-labo a o ial – u(RW, ela i o)) e jus eza do mé odo e/ou labo a ó io (quan i icado ao bias - u(bias) ela i o) 43. A ince eza associada aos e os alea ó ios pode se quan i icada a a és do ecu so a amos as de con olo (DPCS). A componen e de ince eza de p ecisão in e média (u(RW, ela i o)) pode se a aliada a a és do des io pad ão de amos as de con olo (Rw). Po sua ez o RW, ela i o e o u(RW, ela i o) são calculados a a és das exp essões 32 e 33: RW, ela i o=Rw x Exp essão 32 Exp essão 33 O bias (des io) é uma es ima i a dos e os sis emá icos que pode se es imado eco endo a ensaios in e labo a o iais a a és da exp essão 34 44. u(bias) ela i o=√RMSbias, ela i o 2+u(CRe ) ela i o 2 Exp essão 34 em que o RMSbias, ela i o 2 o 𝑢(CRe )𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 são calculados pelas exp essões 35 e 36 45: Exp essão 35 u(CRe ) ela i o=1,253×sR, ela i o √P Exp essão 36 A pa i das ince ezas ela i as, ob ém-se a ince eza combinada ela i a a a és da exp essão 37 46: u(RW, ela i o)=√∑(u(RW, ela i o))2 ni=1 nRW RMSbias, ela i o=√∑ (bias ela i o)2 ni=1 nPT 32 u ela i o=√u(RW, ela i o)2+u(bias) ela i o 2 Exp essão 37 A ince eza expandida co esponde ao in e alo no qual se espe a que haja uma g ande ação da dis ibuição dos alo es que podem se a ibuídos à mensu anda. Pa a es ima a ince eza expandida mul iplica-se o alo da ince eza combinada po um a o de expansão, k, pa a um dado ní el de con iança (pa a 95 %, k = 2; exp essão 38) 46: U ela i o=k×u ela i e Exp essão 38 2.3.3. Tes e de ejeição de alo es An es de inicia qualque a amen o de esul ados, de e-se e i ica o a as amen o ou esul ados disc epan es das medições, sendo necessá io u iliza o es e de G ubbs, de aco do com a exp essão 39: Gcalculado = |xs - x| s Exp essão 39 onde xs é o alo suspei o, o alo médio é 𝑥 e s é o des io-pad ão. Pa a um dado núme o de obse ações e pa a um ní el de con iança (90 %), o Gcalculado de e se meno do que o G abelado pa a que o alo suspei o não seja conside ado abe an e em elação ao conjun o de dados conside ados 38. 33 3. Pa e Expe imen al 34 Pa a a alidação do mé odo NP 1987:2002 - De e minação do eo de Hyp em ca nes e p odu os cá neos, o am analisadas soluções pad ões, amos as de con olo, amos as eais de ca nes, p odu os cá neos e de i ados. Du an e a alidação o am ealizados ensaios pa a a alia os seguin es pa âme os de desempenho: limi e de quan i icação, linea idade, gama de abalho, p ecisão ( epe ibilidade e p ecisão in e média), e acidade e ince eza. 3.1. Ma e iais e Reagen es: • Balança analí ica, S a o ius, ± 0,1 mg (gama: 0 a 220 g). • Balança ele ónica de p ecisão, S a o ius, ± 1 mg (gama: 0 a 620 g). • Equipamen o mecânico Re sch GM 200, pa a homogeneização a amos a. • Banho de água com e mós a o Julabo SW 22, egulá el a 60 ± 0,5 ºC (gama: 0 a 99,9 ºC). • Es u a de secagem egulá el Ven icell, a 105 ± 0,5 ºC. • Papel de il o, Wha man de po osidade 150 mm. • Espe o o óme o Shimadzu UV-1800 ± 0,00001 unidade de A, com lâmpada de halogénio e ilamen o de ungs énio (gama: 190 a 1100 nm). • Células desca á eis. • Ma azes de olume ap oximado 50 mL. • Balões olumé icos classe A de 250 ± 0,15 mL. • Vid os de elógio de diâme o 60 mm. • Tubos de plás ico de olume ap oximado 10 mL e olhas. • Desionizado de água de lei o mis o, água do ipo 2, o necedo ATS. • Pipe as olumé icas classe A. As ca ac e ís icas dos eagen es u ilizados encon am-se desc i as na abela 4. 35 Tabela 4: Reagen es u ilizados e as suas p op iedades. Os esíduos de em se eliminados num ecipien e p óp io pa a não halogenados. 3.2. P epa ação das amos as A quan idade de amos a não de e á se in e io a 200 g semp e que possí el. A amos a é p epa ada de aco do com o ipo de ca ne, e qualque exsudado, gela ina ou go du a de e se incluído na homogeneização 47. 4.2.1. Fiamb e in ei o ou em pedaços: Co a uma a ia de 1 cm de espessu a na pa e mais la ga do iamb e, i ando uma i a de 3 cm de al u a (ou o máximo possí el) da camada de go du a, incluindo o cou a o. 4.2.2 Enchidos e ensacados de ca ne: Re i a qualque ipa e/ou película, que es eja a e es i o p odu o. 4.2.3 P odu os umados: Re i a oda a camada ex e io umada, incluindo os cou a os e go du a adjacen e. 4.2.4 Ca ne de animais de sangue quen e, ígado e ins: Remo e os ossos, endões, ecido conjun i o e go du a isí el. Não co a o im, mas sim homogeneizá-lo odo. Reagen e Fó mula Pu eza (%) Massa mola (g/mol) Densidade (g/cm³) Ma ca Ace a o de sódio anid o CH3COONa 99,9 82,03 1,53 Me ck 4-(dime illamino)benzaldeido C9H11NO 100 149,19 1,22 Me ck Ácido cí ico monohid a ado C6H8O7.H2O 99,5 210,14 1,54 Pan eac Hid óxido de sódio NaOH 99,4 40,00 2,13 Me ck T ans-4-hid oxi-L-p olina C5H9NO3 100,1 131,13 610 Al a Aesa Ácido sul ú ico 3 M H2SO4 96 98,08 1840 Honey well 1 P opanol (CH3)2CHOH 99,9 60,09 803 VWR 2 P opanol (CH3)2CHOH 100 60,1 786 VWR Ácido pe cló ico HClO4 61 100,46 1,67 VWR Clo amina T ihid a ada C7H7ClNaNO2S.3H2O 99,3 281,69 540 - 680 Me ck 36 Depois de de idamen e p epa ada, a amos a de e se homogeneizada no moinho g anulado , ans e ida pa a copo de plás ico que de e se comple amen e cheio. A amos a de e á se analisada nas 24 ho as subsequen es se o e ige ada, ou congelada a é à da a da análise. Rela i amen e aos p odu os c us, a amos a de e se colocada no congelado de modo a que se a inja uma empe a u a abaixo de 0 ºC. De e se co ada ia, em pequenos cubos. De e depois se colocada em ascos de id o echados e aquecidos num banho de água de modo a man e a empe a u a de, pelo menos, 70 ºC, du an e 30 minu os. Só depois de a e ece de e se homogeneizada e a mazenada como desc i o an e io men e 46. 3.3. Ma izes alimen a es es udadas No p esen e abalho o am u ilizadas di e sas ma izes pa a alida o mé odo es udado. Es as ma izes encon am-se no g upo das ca nes, p odu os cá neos e de i ados e es ão ep esen adas na abela 5. Tabela 5: Ma izes es udadas na alidação do mé odo: ca nes, p odu os cá neos e de i ados. 3.4. P ocedimen o 3.4.1. P epa ação de soluções • Solução de ácido sul ú ico, (H2SO4) – 3 mol/L: Ma izes Exemplos Ca ne Ti as de ango, bacon, oucinho e pei o de pe ú Ca ne p ocessada Fiamb e, mo adela e salsicha Ca ne picada Ca ne picada Enchidos, p odu os cá neos e de i ados Chou iço, paio, alhei a, mo cela, pa é e p a os cozinhados 37 Medi 750 mL de água pa a um balão olumé ico de 2000 mL. Adiciona de aga , agi ando semp e, 330 mL de ácido sul ú ico. A e ece à empe a u a ambien e e comple a o olume com água. • Solução- ampão, pH 6,8: Es a solução é p epa ada a pa i de 26,0 g de ácido cí ico monohid a ado (C6H8O7.H2O), 14,0 g de hid óxido de sódio (NaOH) e 78,0 g de ace a o de sódio anid o (NaCH3CO2). Dissol e os eagen es indicados em 500 mL de água e ans e i quan i a i amen e pa a um balão olumé ico de 1000 mL. Adiciona 250 mL de 1-p opanol e comple a o olume com água. Es a solução é es á el du an e á ias semanas, quando p ese ada a 4 ºC no escu o. • Reagen e de clo amina T: Dissol e 1,41 g de clo amina T ihid a ada em 100 mL de solução ampão. P epa a es a solução e usá-la imedia amen e. • Reagen e de co : Dissol e 10,0 g de 4-dime ilaminobenzaldeído em 35 mL de solução de ácido pe cló ico (60 %) e adiciona len amen e 65 mL de 2-p opanol. P epa a es a solução no p óp io dia da u ilização. • Soluções pad ão de ans-4-hid oxi-L-p olina: P epa a uma solução mãe po dissolução de 50 mg de ans-4-hid oxi-L-p olina em água, num balão olumé ico de 100 mL. Adiciona 1 go a de solução de ácido sul ú ico e comple a o olume com água. Es a solução é es á el du an e pelo menos um mês a 4 ºC. No dia da u ilização, ans e i 5 mL da solução mãe pa a um balão olumé ico de 500 mL e comple a o olume com água. P epa a 6 soluções-pad ão, medindo com pipe a de p ecisão 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mL des a solução pa a balões de 100 mL. P e aze os olumes com água e homogeneiza . Es as soluções pad ão êm espe i amen e 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 µg/mL de Hyp. 3.4.2. Análise das soluções pad ão • T ans e i 4,00 mL da solução pa a um ubo de ensaio de plás ico e adiciona 2,00 mL de eagen e de clo amina T. Agi a e deixa 20 min ± 1 min em epouso à empe a u a ambien e. 38 • Adiciona 2,00 mL do eagen e de co a cada um dos ubos, agi a igo osamen e e apa com olha de plás ico. • Le a apidamen e os ubos a um banho de água a 60 ± 0,5 ºC du an e 20 min. • A e ece os ubos sob água co en e du an e pelo menos 3 min e man e à empe a u a ambien e du an e 30 min. • Medi a abso ância a 558 nm numa célula de id o con a água, usando o espe o o óme o. • Sub ai a abso ância medida pa a o b anco e le a concen ação em Hyp, a pa i da cu a da calib ação ob ida. 3.4.3. Análise da amos a • Pesa , com a ap oximação de 0,001 g, ce ca de 4 g de amos a pa a um ma az de 50 mL, ga an indo que não ica amos a ade en e às pa edes do ma az. • Adiciona 30 mL ± 1 mL de solução de ácido sul ú ico 3 M à amos a con ida no ma az. Cob i com um id o de elógio e coloca na es u a du an e 16 h a 105 ± 0,5 ºC ( igu a 7). • Fil a o hid olisado a a és de papel de il o pa a um balão olumé ico de 250 mL. La a o balão e o papel de il o 3 ezes com 10 mL de solução de ácido sul ú ico 3 M Figu a 7: Amos as con idas no ma az com 30 mL de ácido sul ú ico 3 M p on as pa a i em 16 ho as à es u a a 105 ºC 39 aquecida e adiciona o líquido das la agens ao il ado do hid olisado. Comple a o olume com água e homogeneiza . • Medi pa a um balão olumé ico de 250 mL um olume (V) do hid olisado (en e 5 e 25 mL, dependendo da quan idade de ecido conjun i o da amos a), al que depois de comple ado o olume com água a concen ação em Hyp es eja comp eendida en e 0,25 µg/mL e 2,5 µg/mL. • T ans e i 4,00 mL des a solução pa a um ubo de ensaio de plás ico e p ossegui como desc i o nas soluções pad ão. Ensaio em b anco: Execu a o p ocedimen o desc i o subs i uindo o hid olisado diluído po 4,00 mL de cada uma das qua o soluções-pad ão diluídas de Hyp. O alo de abso ância de e se in e io a 0,040, pois es e é o c i é io de acei ação do b anco de inido na no ma 44. 3.5. Ap esen ação de esul ados Os esul ados de em se ap esen ados com a edondamen o às cen ésimas em oda a gama de abalho. 46 con e e esse alo em unidades de concen ação (em g/100 g) eco endo à equação 40 (conside ando a massa u ilizada de 4 g assim como o olume máximo de 25 mL). O LQ oi de e minado semp e que se açou uma no a e a de calib ação e oi moni o izado numa ca a de con olo. O alo acei e pelo labo a ó io, pa a es e limi e oi de inido a pa i do alo ob ido u ilizando o pad ão de quan i icação, que nes es casos é o pad ão meno concen ação (0,25 μg/mL conside ando o alo es imado pa a olume de il ado 25 mL e massa da oma, 4 g). O LQ ob ido pelo mé odo g á ico é calculado semp e que ealizada uma cu a de calib ação, como o ma de con olo e pa a con i ma que é in e io ao es abelecido pelo labo a ó io. Na abela 10 são ap esen ados os limi es de de ecção e quan i icação de e minados, assim como o limi e de quan i icação de inido pelo labo a ó io. Es es limi es são egis ados e con olados dia iamen e. Tabela 10: Limi e de de ecção, LD, limi es de quan i icação, LQ, calculados no pe íodo do P oje o Indi idual e LQ es abelecido pelo labo a ó io. Da a LD (g/100 g) LQ (g/100 g) LQ es abelecido pelo labo a ó io (g/100 g) 24-07-2019 0,00644 0,01951 0,0200 30-07-2019 0,00409 0,00124 05-08-2019 0,00397 0,01204 13-08-2019 0,00572 0,01732 19-08-2019 0,00463 0,01404 26-08-2019 0,00269 0,00816 04-09-2019 0,00616 0,01866 09-09-2019 0,00459 0,01391 16-09-2019 0,00151 0,00459 21-09-2019 0,00577 0,01749 Média 0,00456 0,01270 Pode e i ica -se que odos os LQ se encon am abaixo do limi e es abelecido pelo labo a ó io. 4.1.5. Gama de abalho No labo a ó io, a gama de abalho é a ualizada anualmen e e é ealizado um es udo de odo o his ó ico das amos as, onde se encon a egis ada a meno concen ação de Hyp 47 quan i icada e ambém a maio . As concen ações no ano de 2019 encon am-se comp eendidas en e 0,02 g/100 g (limi e de quan i icação) e 1,00 g/100 g. Foi ealizado um es e de homogeneidade de a iâncias ( abelas 11 e 12) pa a con i ma o ajus e da gama de abalho. Fo am analisadas dez éplicas independen es, no mesmo dia, do pad ão mais baixo e do mais al o, com a concen ação do b anco co igida e oi ealizado um es e F de Snedeco /Fishe pa a 95 % de p obabilidade. Tabela 11: Valo es ob idos nas dez éplicas independen es do pad ão mais baixo e pad ão mais al o analisadas no mesmo dia pa a ealiza o es e de homogeneidade de a iâncias. Da a Pad ão meno co igido com o b anco (0,25 μg/mL) Pad ão maio co igido com o b anco (2,5 μg/mL) 16-09-2019 0,1217 2,270 16-09-2019 0,1290 2,382 16-09-2019 0,1120 2,318 16-09-2019 0,1190 2,330 16-09-2019 0,1279 2,340 16-09-2019 0,1108 2,356 16-09-2019 0,1117 2,351 16-09-2019 0,1280 2,266 16-09-2019 0,1091 2,248 16-09-2019 0,1216 2,256 Tabela 12: Resul ados ob idos da aplicação do es e de homogeneidade de a iâncias. Pa âme os Pad ão meno (0,25 μg/mL) Pad ão maio (2,5 μg/mL) Média (μg/mL) 0,1191 2,312 Va iância (μg/mL)2 0,000060 0,0023 Des io pad ão (μg/mL) 0,0078 0,048 Va iância ela i a (%) 0,051 0,099 Des io pad ão ela i o (%) 6,5 2,1 PGcal 1,96 F ab 3,18 A pa i da análise da abela 12 pode-se obse a que como o alo do PG é meno que o alo de F abelado, pode-se conclui que a gama de abalho se encon a bem ajus ada. 48 4.1.6. P ecisão Pa a a de e minação da p ecisão o am ealizados es udos ao ní el da epe ibilidade e da p ecisão in e média em di e sas soluções pad ão, amos as de con olo e amos as eais, ealizados no mesmo dia e em dias di e en es. Repe ibilidade Como já oi e e ido, a epe ibilidade co esponde à p ecisão de um mé odo analí ico, quando e e uado sob e uma mesma amos a e em condições idên icas, nomeadamen e no mesmo labo a ó io, pelo mesmo analis a, no mesmo equipamen o e em cu os in e alos de empo. Pa a a alia a epe ibilidade, de e mina-se o limi e de epe ibilidade pa a cada ipo de amos a, que co esponde ao alo abaixo do qual se de e si ua a di e ença en e dois esul ados. No en an o, nes e mé odo, o c i é io de acei ação pa a a epe ibilidade já é de inido pela no ma NP 1987:2002 a pa i da exp essão 43: 𝑟=0,0131+0,0322 𝜔 Exp essão 43 Assim, o alo absolu o da di e ença en e dois esul ados independen es em condições de epe ibilidade não de e se supe io ao alo ob ido nessa exp essão, em que 𝜔 é a média das duas éplicas. Os alo es ob idos en e o pe íodo 12-11-2018 e 24-07-2019 es ão ap esen ados na abela 13. Com base nos esul ados ap esen ados, pode-se conclui que na ma iz ca ne picada o c i é io de epe ibilidade é 0,022 é semp e mui o supe io à di e ença en e éplicas (0,012), ce ca de 1,8 ezes. Pa a a ma iz ca ne p ocessada e i ica-se que a di e ença en e éplicas é mui o in e io (mais de 2 ezes). Já na ma iz ca ne, a a iação ainda é supe io (ce ca de 2,8) e na ma iz enchidos o alo médio do c i é io de epe ibilidade (0,026) é igualmen e supe io à di e ença média en e éplicas (0,014) co espondendo a 1,8 ezes. Ve i ica-se que, pa a a ma iz enchidos, o c i é io de epe ibilidade em um alo supe io em elação às es an es ma izes, uma ez que nes e ipo de p odu os, o alo de Hyp é maio e po consequência, a média en e éplicas é ambém mais ele ada. 49 Tabela 13: Dados dos 43 duplicados analisados pa a e idencia o cump imen o da epe ibilidade. Ma iz Da a Média eplicados (g/100 g) C i é io de epe ibilidade (g/100 g) |R1-R2| (g/100 g) Acei ação |R1-R2| ≤ Ca ne picada 13-12-2018 0,44 0,03 0,02 OK 08-01-2019 0,34 0,02 0,02 OK 17-01-2019 0,30 0,02 0,00 OK 23-01-2019 0,33 0,02 0,02 OK 12-02-2019 0,43 0,03 0,01 OK 18-02-2019 0,18 0,02 0,02 OK 27-03-2019 0,24 0,02 0,02 OK 29-03-2019 0,23 0,02 0,00 OK 08-04-2019 0,34 0,02 0,01 OK 26-06-2019 0,20 0,02 0,02 OK 03-07-2019 0,27 0,02 0,01 OK 03-07-2019 0,24 0,02 0,01 OK 05-07-2019 0,21 0,02 0,01 OK 10-07-2019 0,28 0,02 0,01 OK 10-07-2019 0,20 0,02 0,01 OK 15-07-2019 0,27 0,02 0,01 OK Ca ne p ocessada ( iamb e, mo adela e salsicha) 12-11-2018 0,16 0,02 0,01 OK 19-11-2018 0,15 0,02 0,01 OK 19-11-2018 0,19 0,02 0,02 OK 07-02-2019 0,28 0,02 0,00 OK 11-03-2019 0,43 0,03 0,01 OK 20-03-2019 0,11 0,02 0,01 OK 08-04-2019 0,35 0,02 0,01 OK 01-04-2019 0,08 0,02 0,01 OK 17-04-2019 0,16 0,02 0,00 OK 24-06-2019 0,34 0,02 0,02 OK 26-06-2019 0,18 0,02 0,01 OK 24-07-2019 0,09 0,02 0,01 OK Ca ne ( i as de ango, bacon, oucinho e pei o de pe ú) 26-02-2019 0,12 0,02 0,00 OK 06-05-2019 0,25 0,02 0,01 OK 24-06-2019 0,31 0,02 0,01 OK 26-06-2019 0,07 0,02 0,00 OK 12-07-2019 0,49 0,03 0,02 OK Enchidos (chou iço, paio, alhei a e mo cela) e p odu os cá neos (pa é e p a os cozinhados) 15-05-2019 0,13 0,02 0,00 OK 15-05-2019 0,73 0,04 0,01 OK 15-05-2019 0,22 0,02 0,01 OK 19-05-2019 0,11 0,02 0,01 OK 19-05-2019 0,51 0,03 0,02 OK 18-06-2019 0,13 0,02 0,02 OK 03-07-2019 0,94 0,04 0,02 OK 05-07-2019 0,29 0,02 0,02 OK 10-07-2019 0,29 0,02 0,01 OK 15-07-2019 0,65 0,03 0,02 OK 50 Assim, obse a-se que independen emen e da ma iz es udada o cump imen o do c i é io de epe ibilidade é semp e e i icado, ou seja, num cu o espaço de empo, a di e ença en e dois duplicados é semp e in e io ao alo do c i é io de epe ibilidade de inido pela no ma. P ecisão In e média Pa a o cálculo da p ecisão in e média o am analisados 43 duplicados de amos as de di e en es ma izes. Com os ensaios de cada amos a em duplicado ealizados em dias di e en es é possí el a alia a p ecisão em condições de p ecisão in e média a pa i da de e minação do des io pad ão dos esul ados ob idos e ainda exp imi o esul ado a pa i do coe icien e de a iação. A abela 14 ap esen a es es alo es espe i amen e. Tabela 14: Pa âme os ca a e ís icos da p ecisão in e média. Des io pad ão da p ecisão in e média, sPI, Limi e de p ecisão in e média ela i o, PI e coe icien e de a iação da p ecisão in e média, CVPI. A a és dos dados dos duplicados, oi possí el ob e o alo do des io pad ão da p ecisão in e média (0,0091). Po sua ez, o alo de limi e de p ecisão in e média ob ido oi 9 %, o que signi ica que a di e ença en e dois alo es ob idos de e á se in e io a 9 % independen emen e do empo que deco e en e os ensaios. Pode-se conclui que o mé odo é p eciso, em condições de p ecisão in e média, uma ez que o CVPI em um alo baixo (3 %). 4.1.7. Ve acidade A e acidade pode se demos ada com base nos esul ados ob idos das ma izes analisadas e nos esul ados dos ensaios de compa ação in e labo a o ial. Nes e caso o am u ilizadas amos as de ci cui os das emp esas LGC, Deu sche Re e enzbü o ü Ring e suche & Re e enzma e ialien (DRRR) e Food Analysis Pe o mance Assessmen Scheme (FAPAS) ( abela Nº de amos as sPI (μg/mL) PI (%) CVPI (%) 43 0,0091 9 3 51 15). Es es ensaios se em pa a a alia o desempenho dos labo a ó ios, sob as mesmas condições ou condições elacionadas. Tabela 15: Resul ados ob idos nos ensaios in e labo a o iais. Da a Ci cui o Ma iz Xlab (μg/mL) X e (μg/mL) Nº lab. pa icipan es S (μg/mL) Bias (%) Z- sco e 03-2017 LGC Ca ne 0,30 0,26 32 0,025 15,4 1,60 03-2017 LGC Ca ne 0,29 0,26 32 0,025 11,5 1,20 03-2017 LGC Ca ne 0,42 0,38 18 0,025 10,5 1,60 03-2017 LGC Ca ne 0,40 0,38 18 0,025 5,3 0,80 12-2017 DRRR linguiça cozida 0,20 0,24 10 0,036 17,0 1,11 12-2017 DRRR linguiça cozida 0,26 0,28 11 0,022 7,3 0,91 10-2018 FAPAS Ca ne enla ada 1,26 1,29 42 0,084 2,3 0,36 10-2018 FAPAS Ca ne enla ada 1,22 1,29 42 0,084 5,4 0,83 10-2018 FAPAS Ca ne enla ada 1,14 1,29 42 0,084 11,6 1,79 04-2019 LGC Ca ne 0,34 0,32 27 0,025 6,3 0,80 A acei ação é ei a a a és do alo de desempenho Z-sco e. Quando es e é igual ou in e io a 2, o desempenho é conside ado sa is a ó io. Apesa de alguns alo es de bias não se em sa is a ó ios, os alo es do Z-sco e são odos acei á eis. Po isso, com base nes es esul ados, demons a-se que os alo es de e acidade ob idos cump em os c i é ios es abelecidos pa a as ma izes es udadas e que o mé odo pode se conside ado jus o. 4.1.8. Ince eza A ince eza de medição associada ao mé odo oi calculada ambém a a és de ensaios in e labo a o iais. Pa a a componen e de ince eza de medição associado ao bias ( e acidade) do mé odo e do labo a ó io, ub o am calculados os pa âme os ep esen ados na abela 16. 52 O alo de ub oi calculado a a és da exp essão 34 e do Uc e ela i o, ob endo-se um alo de 7,1 %. Es e alo é conside ado baixo, uma ez que se encon a abaixo do c i é io de acei ação de inido pelo labo a ó io (10 %). Tabela 16: Dados u ilizados pa a calcula a componen e da exa idão da ince eza (μg/mL). Ci cui o Ma iz Xlab (μg/mL) X e (μg/mL) Bias ela i o Des io Pad ão (μg/mL) Média população uc e ela i o (μg/mL) LGC Ca ne 0,40 0,38 5,263 0,025 30,333 1,588 DRRR Linguiça cozida 0,26 0,28 -7,273 0,020 FAPAS Ca ne enla ada 1,26 1,29 -2,326 0,080 FAPAS Ca ne enla ada 1,22 1,29 -5,426 0,080 FAPAS Ca ne enla ada 1,14 1,29 -11,628 0,080 LGC Ca ne 0,34 0,32 6,250 0,030 Em elação à componen e associada à p ecisão in e média ou ep odu ibilidade in alabo a o ial do labo a ó io, o am u ilizados as médias dos alo es dos DPCS ao longo do ano e os alo es e pa âme os calculados encon am-se na abela 17. Tabela 17: Pa âme os da componen e ince eza associados à p ecisão in e média. 𝐑𝐖, 𝐫𝐞𝐥𝐚𝐭𝐢𝐯𝐨 𝐮(𝐑𝐖, 𝐫𝐞𝐥𝐚𝐭𝐢𝐯𝐨, 𝐜) 3,329 5,7 3,317 7,149 7,512 Como o alo do ub (7,1 %) é baixo, assim como o alo da es ima i a da ince eza associada à p ecisão uRw, ela i o (5,7 %), po an o a abo dagem mos ou se adequada pa a a es ima i a da ince eza. A pa i das ince ezas ela i as, oi ob ida a ince eza combinada ela i a segundo a exp essão 37, endo-se ob ido o alo de 9,1 %. A ince eza combinada ela i a, mul iplicada pelo a o de expansão, k = 2 (exp essão 38), pe mi e es ima o alo da ince eza expandida que ep esen a um alo inal da ince eza do mé odo de 18 %. Embo a o mé odo u ilizado não ap esen e um alo e e en e a es a g andeza, conside a-se que es e alo é acei á el uma ez que cada uma das componen es da ince eza são baixas. 53 4.2. Ou os a i idades ealizadas Pa a além da alidação do mé odo ap esen ado oi ambém possí el desen ol e ou as a i idades du an e o P oje o Indi idual enquan o analis a do labo a ó io de ísico-química. Acompanhei as analis as p incipais nos di e sos mé odos analí icos do labo a ó io, ajudando na localização das amos as, p epa ação de ma e ial, soluções e eagen es. Fo am ealizadas análises de o ina no labo a ó io na ma iz sumos de u os e p odu os ho ícolas sendo de e minado o esíduo seco solú el segundo o p ocedimen o PAFQ.211 e a no ma NP 785, o eo de sólidos solú eis segundo o p ocedimen o in e no PAFQ.065 e no ma NP EN 12143 e de e minação da acidez o al segundo o p ocedimen o PAFQ.197, no ma NP 1421 e no ma NP EN 12147. Semanalmen e es es ês pa âme os o am analisados em média ce ca de 25 amos as. Rela i amen e à de e minação do pH, as análises o am ealizadas segundo o p ocedimen o PAFQ.129, no ma NP 3441 (ma iz ca ne), no ma IS0 7238 (ma iz man eiga) e NP EN 1132 (sumos de u os e p odu os ho ícolas). Dia iamen e o am analisadas em média 20 amos as. 54 5. Conclusões 55 A ualmen e, numa sociedade em que a aude alimen a e a p eocupação com a qualidade e segu ança alimen a são cada ez maio es, os consumido es p eocupam-se cada ez mais com a in o mação nu icional dos alimen os, e a necessidade de exis ência de mé odos analí icos ápidos e segu os capazes de esponde a es es desa ios é inques ioná el. O p esen e abalho ap esen a a alidação de uma me odologia analí ica pa a a de e minação do eo de Hyp de aco do com a no ma NP 1987:2002, em ma izes de ca ne, p odu os cá neos e de i ados a a és da écnica de espe o o ome ia. O p ocesso de alidação do mé odo es udado iniciou-se com a cons ução de e as de calib ação. Pela análise de decli es oi possí el comp o a a sensibilidade do mé odo. Foi possí el ambém e i ica e conclui que a gama de abalho es a a bem ajus ada (en e 0,02 g/100 g e 1,00 g/100 g), endo-se ob ido uma boa linea idade (0,9998), pe mi indo con i ma que o ajus e linea é adequado ao uso p e endido. A pa i do es udo da de e minação do limi e de quan i icação (0,02 g/100 g) oi possí el conclui que es e é ap op iado pa a análise de o ina. Os ensaios e e uados pa a a alia a p ecisão a a és de duplicados em condições de epe ibilidade pe mi i am e i ica o cump imen o do c i é io de inido e em condições de p ecisão in e média (CVPI de 3 %) pe mi i am demons a que os esul ados são sa is a ó ios po se encon a em den o dos c i é ios es ipulados (< 10 %). Foi possí el a e igua ainda que odos os duplicados analisados cump i am o c i é io de epe ibilidade de inido pela no ma NP 1987:2002 ( =0,0131+0,0322 𝜔). Os esul ados de ensaios in e labo a o iais em que o labo a ó io ob e e esul ados sa is a ó ios pe mi i am conclui ace ca da e acidade demos ando que o mé odo é jus o conside ando os alo es de Z-sco e ob idos. Foi ainda possí el ob e a es ima i a de ince eza que demons ou se adequada (18 %), pa a o mé odo es udado, dado que os alo es de ub, e de uRw es ão abaixo do alo máximo de inido pa a o c i é io de acei ação do labo a ó io (10 %). O abalho desen ol ido oi mui o ele an e pa a a Sillike dado que a e alidação des e mé odo possibili ou a ealização de ajus es à no ma de modo a elabo a um p ocedimen o in e no e pode subme e pos e io men e o mé odo ao p ocesso de ac edi ação. No pe íodo de es ágio, os conhecimen os adqui idos no p imei o ano do mes ado o am consolidados e as di e sas écnicas es udadas o am colocadas em p á ica, 62 [40] Ins i u o Nacional de Me ologia, No malização e Qualidade Indus ial (2007). O ien ação sob e alidação de mé odos de ensaios químicos. [41] Ins i u o Po uguês da Qualidade (IPQ) (2012). Vocabulá io In e nacional de Me ologia, ISBN 978-972-763-00-6. [42] IUPAC (2002). Ha monized Guidelines o Single-Labo a o y Valida ion o Me hods o Analysis. Pu e Applied Chemical. ol. 74: 835-855. [43] No d es TR 569 (2011). In e nal Quali y Con ol. 4 h Edi ion. Handbook o Chemical Labo a o ies. No way. ISSN 0283-7234. [44] No d es TR 537 (2012). Handbook o Calcula ion o Measu emen Unce ain y in En i onmen al Labo a o ies. 3ª Edição. [45] ISO 11352 (2012). Wa e Quali y - Es ima ion o Measu emen Unce ain y Based on Valida ion and Quali y Con ol Da a. 1ª edição. [46] Fi ield F.; Kealey D. (2008). P inciples and P ac ice o Analy ical Chemis y. Blackwell. USA. [47] Sillike , P ocedimen o de Análise Físico-Química.044, Mé odos de p epa ação das amos as pa a análise. 63 7. Anexos 64 Anexo A - F ases de pe igo (H) e p ecaução (P) dos eagen es u ilizados ao longo do es udo da alidação do mé odo. Tabela 18: F ases de pe igo (H) e p ecaução (P) associados aos eagen es u ilizados. Reagen e F ases de pe igo (H) e p ecaução (P) Ace a o de sódio anid o H303, H316, H320, H333 P264, P305 + P351 + P338, P312, P332 + P313, P337 + P313 4-(dime illamino)benzaldeido H317, H319, H411 P273, P280, P302 + P352, P305 + P351 + P338 Ácido cí ico monohid a ado H319 P305+P351+P338 Hid óxido de sódio H290, H314 P233, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P310 T ans-4-hid oxi-L-p olina - Ácido sul ú ico 3 M H290, H314 P280, P301+P330+P331, P305+P351+P338, P309+P310 1 P opanol H225, H318, H336 P210, P233, P280, P305+P351+P338, P310 2 P opanol Ácido pe cló ico H271, H290, H314 P220, P260, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P310 Clo amina T ihid a ada H302, H314, H334 P280, P301 + P330 + P331, P305 + P351 + P338, P304 + P340, P308 + P310