Avaliação de alterações de pigmentação em açúcar amarelo

Fernando Amorim UMinho | 2024 Avaliação de alterações de pigmentação em açúcar amarelo Fernando Luís Fernandes Amorim Avaliação de alterações de pigmentação em açúcar amarelo outubro de 2024 Fernando Luís Fernandes Amorim Avaliação de alterações de pigmentação em açúcar amarelo Dissertação de Mestrado Mestrado em Biotecnologia Trabalho efetuado sob a orientação do Professor Doutor José António Teixeira e da Professora Doutora Lucília Maria Domingues outubro de 2024 ii Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Atribuição-Não-Comercial-SemDerivações CC BY-NC-ND Universidade do Minho, 25/10/2024 iii Agradecimentos Em primeiro lugar, gostaria de agradecer aos meus orientadores, Dr. José António Teixeira e Dra. Lucília Domingues, pelo apoio técnico e orientação que me proporcionaram, bem como pela oportunidade de trabalhar neste projeto. Gostaria de agradecer também à Catarina Teixeira e ao Rui Rodrigues pela orientação, ensinamentos e apoio técnico a nível de trabalho laboratorial, além de toda a paciência que tiveram comigo ao longo deste projeto. Não obstante, gostaria de deixar o meu agradecimento à Joana Dias, Aline Barros e ao Carlos Costa pelo apoio extra que proporcionaram na execução deste projeto. Um obrigado também às pessoas com quem partilhei o local de trabalho, nomeadamente a equipa do laboratório LTL. Por fim, gostaria de deixar o meu agradecimento a toda a minha família, especialmente aos meus pais, e aos amigos mais próximos que me apoiaram neste projeto, estando sempre presentes para me aturar nos piores momentos. Um muito obrigado de coração. iv DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. v Avaliação de alterações de pigmentação em açúcar amarelo Resumo O presente estudo, realizado no Centro de Engenharia Biológica da Universidade do Minho, investigou o surgimento de manchas brancas em açúcar amarelo. Os objetivos principais passaram por identificar as causas dessas alterações de pigmentação e as condições que favorecem o seu aparecimento, propondo estratégias para mitigar o problema. Entre as hipóteses estudadas, destacam-se a lixiviação ou degradação de compostos fenólicos, responsáveis pela coloração do açúcar, e a contaminação fúngica, com foco na levedura Zygosaccharomyces rouxii , uma suspeita anterior ao estudo. Foram analisadas amostras de açúcar amarelo, com e sem manchas, e submetidas a diversas condições controladas de humidade e temperatura, além de testes físico-químicos para medir teor de humidade, fenólicos totais e flavonoides, atividade antioxidante e identificar a composição das amostras. Além disso, foram realizadas análises microbiológicas para a identificação da levedura presente, através de técnicas moleculares como o PCR. Os resultados indicam que o teor de humidade e a presença de compostos fenólicos são fatores críticos alterações visuais do açúcar amarelo, mas sem evidência de influência direta na formação de manchas brancas. Além disso, os testes demonstraram uma possível degradação ou perda dos compostos pigmentados. Não só isso, mas também foi confirmada a presença de contaminação nas amostras com manchas brancas, pela levedura Zygosaccharomyces rouxii , o que requer um estudo aprofundado sobre a origem da contaminação e o metabolismo da levedura. Assim, este estudo forneceu informações importantes sobre as possíveis condições que favorecem o aparecimento das manchas brancas, surgindo a hipótese de o problema ter uma origem conjunta entre processos químicos e o surgimento da contaminação. Palavras-Chave Açúcar amarelo, compostos fenólicos, HPLC, manchas brancas, Zygosaccharomyces rouxii. vi Evaluation of colour changes in yellow sugar Abstract The present study, carried out at the Center for Biological Engineering at the University of Minho, investigated the appearance of white spots in yellow sugar. The main objectives were to identify the causes of these pigmentation changes and the conditions that favor their appearance, proposing strategies to mitigate the problem. Among the hypotheses explored were the leaching or degradation of phenolic compounds, responsible for the sugar's color, and fungal contamination, with a focus on the yeast Zygosaccharomyces rouxii , which was suspected prior to the study. Samples of yellow sugar, both with and without spots, were analyzed and subjected to various controlled conditions of humidity and temperature, as well as physicochemical tests to measure moisture content, total phenolics, flavonoids, antioxidant activity, and the composition of the samples. In addition, microbiological analyses were performed to identify the yeast present, using molecular techniques such as PCR. The results indicate that the moisture content and the presence of phenolic compounds are critical factors in the visual alterations of yellow sugar, but without evidence of a direct influence on the formation of white spots. Furthermore, tests demonstrated possible degradation or loss of pigmented compounds. Not only that, but the presence of contamination in the samples with white spots was also confirmed by the yeast Zygosaccharomyces rouxii , which requires an in-depth study on the origin of the contamination and the metabolism of the yeast. Thus, this study provided important information about the possible conditions that favor the appearance of white spots, giving rise to the hypothesis that the problem has a joint origin between chemical processes and the emergence of contamination. KEYWORDS HPLC, phenolic compounds, white spots, yellow sugar, Zygosaccharomyces rouxii . vii Índice Lista de figuras .......................................................................................................................... x Lista de tabelas ........................................................................................................................xii Lista de equações .................................................................................................................... xiii Lista de siglas e abreviaturas ................................................................................................... xiv 1. Enquadramento e objetivo de estudo .................................................................................. 1 2. Revisão literária ................................................................................................................. 1 2.1 Importância do estudo ............................................................................................. 1 2.2 Açúcar amarelo e as suas características ................................................................. 3 2.3 Produção do açúcar amarelo .................................................................................... 4 2.4 Compostos responsáveis pela cor ............................................................................ 6 2.5 Processamento e armazenamento ........................................................................... 8 2.6 Teor de humidade a Atividade da água ..................................................................... 9 2.7 Metodologias de análise físico-química ................................................................... 10 2.7.1 Espectrofotometria ........................................................................................ 10 2.7.2 Cromatografia líquida .................................................................................... 11 2.7.3 Testes colorimétricos ..................................................................................... 11 Compostos fenólicos .................................................................................................. 12 Flavonoides ................................................................................................................ 12 Atividade antioxidante ................................................................................................. 12 2.7.4 Medição de cor .............................................................................................. 13 2.8 Metodologias de análise microbiológica .................................................................. 14 2.8.1 Crescimento em meio sólido .......................................................................... 14 2.8.2 Isolamento de colónias .................................................................................. 15 2.8.3 Técnicas moleculares .................................................................................... 15 3. Materiais e Métodos ........................................................................................................ 16 3.1 Avaliação físico-química ......................................................................................... 16 3.1.1 Preparação das amostras .............................................................................. 16 3.1.2 Teor de humidade ......................................................................................... 17 3.1.3 Varrimento de absorvâncias ao longo do tempo .............................................. 17 xiv LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS # % – Percentagem 100X – Ampliação 100 vezes 40X – Ampliação 40 vezes ºC – Graus Celsius ΔE – Delta E A Abs – Absorvância ABTS – 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline6-sulfonic acid ABTS•+ – Radical catiónico ABTS AlCl3 – Cloreto de alumínio aw – Atividade da água B BSA – Bovine Serum Albumin C CaCO3 – Carbonato de cálcio CEB – Centro de Engenharia Biológica CIELab – Espaço de cor com as coordenadas L*, a* e b* definido pela Comissão Internacional de Iluminação CO2 – Dióxido de carbono D DNA – Ácido desoxirribonucleico E EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético F F – Proporção da variação entre os grupos e a variação nos grupos Fe2+ – Ião férrico Fe3+ – Ião ferroso FRAP – Ferric Reducing Antioxidant Power H H2SO4 – Ácido sulfúrico HCl – Ácido clorídrico HPLC – High-Performance Liquid Chromatography I ITS – Internal Transcribed Spacer M M – Molar min – Minutos N N – Normalidade n – Número de observações de uma amostra N2 – Molécula de nitrogénio Na2CO3 – Carbonato de sódio NaCl - Cloreto de sódio NaHCO3 – Bicarbonato de sódio NaNO2 – Nitrito de sódio NaOH – Hidróxido de sódio nm – Nanómetros O O2 – Molécula de oxigénio P p – Probabilidade de significância PCR – Polymerase Chain Reaction PDA – Potato Dextrose Agar pH – Cologaritmo da atividade de iões hidrónio xv PVP – Polivinilpirrolidona R R2 – Coeficiente de determinação REML – Máxima verossimilhança restrita RH – Relative Humidity RID – Detetor de índice de refração RM – Repeated Measures rpm – Rotações por minuto S SD – Desvio-padrão spp. – Espécies T TAE – Tampão Tris-Acetato-EDTA TEAC – Trolox Equivalent Antioxidant Capacity TPTZ – 2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine Tris – Tris(hidroximetil)aminometano Trolox – 6-hydroxy-2,5,7,8tetramethylchroman-2-carboxylic acid U UV-Vis – Ultravioleta-Visível V v/v – Percentagem em volume Z Z. rouxii – Zygosaccharomyces rouxii 1 1. ENQUADRAMENTO E OBJETIVO DE ESTUDO Este estudo surge então como uma continuação de uma parceria de uma empresa de fabrico de açúcar (Empresa X) com o Centro de Engenharia Biológica da Universidade do Minho (CEB) no âmbito do surgimento de alterações de pigmentação em embalagens de açúcar amarelo, mais especificamente o aparecimento de manchas brancas (Figura 1). Este estudo pretendeu descobrir a causa do aparecimento destas manchas, bem como no esclarecimento de quais condições são mais propensas para isto acontecer e quais as estratégias para combater ou colmatar essa questão. Figura 1 - Fotografia ilustrativa da alteração de pigmentação (manchas brancas) nas embalagens de açúcar amarelo. 2. REVISÃO LITERÁRIA 2.1 Importância do estudo Um breve estudo feito anteriormente, resultante da mesma parceria (projeto de tese), teve resultados preliminares que apontaram para a humidade e os compostos fenólicos (compostos responsáveis pela pigmentação do açúcar amarelo) como fatores a ter em conta no surgimento das manchas brancas. Surgiram então duas hipóteses iniciais, nomeadamente a possível lixiviação dos compostos fenólicos (e demais compostos pigmentados) ou uma degradação desses mesmos compostos ou do açúcar por métodos físico-químicos. No decorrer desse estudo preliminar e tendo em conta a suspeita do fator humidade ser responsável pelo aparecimento das manchas, houve um aumento dos esforços por parte da empresa em reduzir ao máximo esse teor nas suas 2 embalagens de açúcar amarelo, através do aumento da secagem do açúcar aquando do seu fabrico. A empresa relatou ainda a suspeita de uma possível contaminação fúngica em algumas partes da produção do açúcar amarelo, baseada em testes microbiológicos feitos previamente nas suas instalações. Esses testes apontavam para a levedura Zygossacharomyces rouxii. Sendo assim, contaminação microbiológica foi também tida em conta como uma hipótese das alterações de pigmentação do açúcar amarelo ao longo deste trabalho. O estudo sobre as alterações de pigmentação ou o aparecimento de manchas no açúcar amarelo é de grande importância tanto para o controlo de qualidade quanto para a inovação tecnológica. A pigmentação do açúcar amarelo resulta, em grande parte, da presença de compostos residuais da cana-de-açúcar ou da beterraba, como a melaço de cana, que confere o tom característico ao produto [1], [2], [3]. No entanto, o surgimento de manchas ou a variação inconsistente de cor pode comprometer a aparência e a aceitação do produto pelos consumidores, que associam frequentemente a cor à frescura, pureza e qualidade alimentar [4]. Para uma empresa, garantir um controlo rigoroso sobre a cor e a uniformidade do açúcar amarelo é fundamental para manter a confiança dos consumidores e preservar a reputação da marca. Alterações na pigmentação podem ocorrer devido a variações nos processos de refinação, no armazenamento ou no manuseio do produto, sendo essencial identificar os fatores que influenciam essas mudanças para minimizar os seus efeitos. A empresa investe em tecnologia avançada para monitorizar a cor e o conteúdo de impurezas, o que permite melhorar a estabilidade do produto final e assegurar a consistência de lotes. Um estudo aprofundado sobre estas alterações pode fornecer informações valiosas para otimizar os processos de produção, eliminando ou minimizando o aparecimento de manchas e garantindo uma qualidade superior. Além disso, a inovação tecnológica desempenha um papel central na indústria açucareira, como adotar novas técnicas que permitem não só melhorar a eficiência dos seus processos, mas também assegurar que o açúcar amarelo satisfaça as expectativas dos consumidores. O estudo das alterações na pigmentação e das condições que levam ao surgimento de manchas pode resultar em novos métodos de controlo e técnicas de refinação que assegurem um produto final visualmente mais homogéneo [4]. Este tipo de inovação não apenas agrega valor ao produto, mas também promove uma diferenciação face aos concorrentes num mercado cada vez mais exigente e globalizado. A perceção do consumidor é também altamente influenciada pela aparência do produto, e no caso do açúcar amarelo, a cor é um dos principais atributos sensoriais que determinam a 3 escolha de compra [5]. Estudos mostram que pequenas alterações visuais, como o aparecimento de manchas, podem gerar desconfiança quanto à pureza ou qualidade do alimento, mesmo quando essas alterações não comprometem a segurança alimentar ou as propriedades gustativas [6]. Por isso, manter uma aparência uniforme e visualmente apelativa é essencial para evitar uma perda de competitividade e assegurar a fidelidade do consumidor. Este estudo também pode ter impactos significativos na comunidade científica e industrial. Na esfera académica, a compreensão dos processos físico-químicos ou biológicos envolvidos na pigmentação do açúcar amarelo é ainda relativamente limitada. A investigação aprofundada sobre as interações entre compostos residuais, condições de armazenamento e embalamento e ainda processos de refinação pode contribuir para o avanço do conhecimento científico neste campo. Descobertas relacionadas à estabilidade de pigmentos ou ao controlo de impurezas podem ser aplicáveis a uma ampla gama de produtos alimentares e a outras áreas da indústria de processamento de alimentos [7]. O contributo para a comunidade científica pode, assim, abranger novas metodologias de análise e controlo de qualidade, além de promover um maior entendimento dos fatores que influenciam a qualidade visual dos produtos. Para a indústria alimentar, o conhecimento gerado por este estudo tem implicações práticas importantes. A identificação de variáveis críticas no processo de produção pode permitir o desenvolvimento de novas soluções tecnológicas para garantir a consistência da cor e a eliminação de defeitos visuais nos produtos alimentares. Adicionalmente, as descobertas podem levar à criação de normas de qualidade mais rigorosas para o açúcar amarelo, permitindo que a indústria em geral melhore os seus padrões de produção e ofereça produtos com melhor valor agregado. O impacto positivo estende-se a toda a cadeia de produção açucareira, promovendo avanços tecnológicos e inovações que beneficiam todo o setor. 2.2 Açúcar amarelo e as suas características Os diferentes tipos de açúcar são classificados em função do grau de refinação, desde o açúcar mascavado bruto, que contém uma elevada concentração de melaço de cana, até ao açúcar branco totalmente refinado, que é praticamente sacarose pura [8]. O açúcar amarelo destaca-se dos demais pela sua cor dourada característica e pelo seu sabor levemente caramelizado, desempenhando um papel significativo na indústria alimentar e sendo amplamente utilizado em diversas preparações culinárias, incluindo confeitaria, panificação e bebidas. Embora 4 seja menos refinado do que o açúcar branco, mantendo alguns dos compostos que lhe conferem o tom amarelado, o açúcar amarelo continua a ser preferido por muitos consumidores e indústrias pela sua cor e sabor distintos [9]. Este produto é um dos açúcares mais utilizados em produtos de confeitaria e panificação, sendo apreciado tanto pelo sabor como pela textura. A pigmentação do açúcar amarelo está diretamente relacionada ao seu processo de produção. Enquanto o açúcar branco passa por um processo de refinação mais intenso, que remove completamente as impurezas e os compostos que dão cor, o açúcar amarelo retém parte do melaço de cana residual. Esta retenção de compostos do melaço de cana contribui não apenas para a sua cor, mas também para o seu perfil de sabor [10]. A composição do açúcar amarelo inclui, além de sacarose, pequenas quantidades de glicose e frutose, além de ácidos orgânicos, sais minerais e compostos fenólicos, que contribuem para o perfil sensorial e físico-químico do produto [11]. No entanto, a cor do açúcar amarelo pode variar significativamente entre lotes, dependendo de fatores como a origem da cana-de-açúcar ou da beterraba e as condições do processo produtivo [11]. Estas variações podem impactar a perceção da qualidade do produto por parte dos consumidores e a consistência nas aplicações industriais. 2.3 Produção do açúcar amarelo A produção do açúcar amarelo em Portugal envolve um processo altamente especializado que combina várias etapas de refinação e cristalização para obter um produto com características específicas, como o teor de humidade, textura, cor e sabor. Embora o açúcar amarelo não passe por uma descoloração tão intensa como o açúcar branco refinado, o seu processamento requer atenção meticulosa para garantir a qualidade final do produto. O processo de produção de açúcar, seja branco ou amarelo, inicia-se com a cana-de-açúcar e/ou, em algumas regiões, a beterraba sacarina. Em Portugal, grande parte da matéria-prima utilizada na produção de açúcar amarelo é importada, sendo a cana-de-açúcar a principal fonte de sacarose [12]. A maior parte das empresas refinadoras não cultiva diretamente a cana-deaçúcar, mas processa a matéria-prima importada, ou seja, o açúcar bruto, que depois será refinado. Um dos primeiros passos no processo de refinação do açúcar amarelo é a afinação, que consiste na remoção das impurezas superficiais dos cristais do açúcar bruto. Este passo envolve a lavagem do açúcar com uma solução de água saturada em sacarose, que dissolve a camada 5 externa do cristal sem afetar o núcleo. Esse procedimento é crucial para eliminar resíduos de melaço e outros componentes indesejados que podem alterar a qualidade do produto final. Após a afinação, o açúcar passa pelo processo de clarificação, também conhecido como carbonatação. Nesta fase, o licor (a solução de açúcar) é misturado com uma suspensão de partículas de hidróxido de cálcio em água e dióxido de carbono (CO₂), formando carbonato de cálcio (CaCO3), que ajuda a precipitar as impurezas. Esse processo resulta num licor clarificado, que será posteriormente misturado com xarope para refinação [13]. Uma das etapas cruciais no processo de produção do açúcar amarelo é a junção do licor carbonatado com o xarope de refinação, proveniente do processo de descoloração e cristalização do açúcar branco. O xarope de refinação contém melanoidinas e outros compostos que não são removidos no processo de branqueamento completo do açúcar branco, o que confere ao açúcar amarelo as suas propriedades características de cor e sabor [14]. Este passo é importante porque é aqui que a composição final do açúcar amarelo começa a ser determinada. Durante esta fase, a quantidade de melaço residual no xarope afeta diretamente a intensidade da cor do açúcar amarelo. A quantidade controlada de melaço que permanece na superfície dos cristais de açúcar permite obter a coloração amarelada e a textura areada típicas desse tipo de açúcar [15]. De seguida, ocorre uma nova etapa crucial neste processo de produção do açúcar amarelo, a cristalização. A solução de açúcar, depois de passar pelo processo de clarificação e mistura com o xarope, é submetida a uma evaporação controlada, resultando na formação de cristais de açúcar. Este processo ocorre em evaporadores a vácuo, onde a pressão é reduzida, permitindo a cristalização a temperaturas mais baixas, o que evita o escurecimento excessivo do produto devido à caramelização. As técnicas utilizadas para produzir açúcar amarelo areado envolve um controle cuidadoso das condições de temperatura, pressão e tempo durante a cristalização. Este processo é projetado para garantir que os cristais de açúcar sejam suficientemente grandes e tenham uma distribuição uniforme de humidade e melaço, o que proporciona ao açúcar a sua textura distinta [16]. Após a cristalização, o açúcar amarelo passa por uma etapa de centrifugação, que remove o excesso de líquido residual (xarope de refinação), deixando uma fina camada de melaço sobre os cristais. Essa camada é responsável por grande parte da cor e sabor do açúcar amarelo, já que o melaço contém uma mistura de açúcares não cristalizáveis, compostos fenólicos e minerais [12], [17]. Posteriormente a este último passo, o açúcar ainda contém um certo teor de humidade, 6 que precisa ser removida para evitar o crescimento de microrganismos e preservar a qualidade do produto. Para isso, o açúcar é submetido a um processo de secagem, onde o ar quente é aplicado para reduzir a humidade a níveis seguros para o armazenamento e comercialização. É importante que essa etapa seja cuidadosamente controlada para evitar a cristalização excessiva do melaço, que pode endurecer os cristais de açúcar, alterando a sua textura [18]. Cada etapa do processo de produção do açúcar amarelo, desde a clarificação até à cristalização e secagem, influencia diretamente as suas características sensoriais e funcionais, como o sabor ligeiramente caramelizado, a cor amarelada e a textura areada. Além disso, o controle rigoroso dos processos de carbonatação, centrifugação e secagem é essencial para garantir que o açúcar tenha uma cor homogénea e estável, o que é crucial para a perceção do consumidor e para o cumprimento dos padrões de qualidade estabelecidos pela indústria de refinação e indústria alimentar em geral [8], [9], [13]. Além disso, o estudo de cada uma dessas etapas tem contribuído significativamente para o desenvolvimento de novas tecnologias de refinação e para a melhoria dos processos de controle de qualidade, promovendo uma maior consistência no produto final e uma maior durabilidade durante o armazenamento. 2.4 Compostos responsáveis pela cor A cor do açúcar amarelo é influenciada por diversos compostos e fatores, dos quais se destacam os pigmentos naturais provenientes da matéria-prima da produção do açúcar (cana-deaçúcar e/ou beterraba), melanoidinas e compostos secundários resultantes do processamento, como compostos de Maillard e ainda a caramelização [19]. As melanoidinas são compostos de elevado peso molecular formados principalmente durante a reação de Maillard , que ocorre entre açúcares redutores (como glicose ou frutose) e aminoácidos ou proteínas, presentes geralmente em pequenas quantidades com origem na matéria-prima do açúcar e que podem resistir aos processos de refinamento do açúcar amarelo. A reação de Maillard ocorre principalmente durante o aquecimento, sendo favorecida em condições de alta temperatura e baixa humidade. Os produtos intermediários desta reação (como os compostos de Amadori ) e as melanoidinas finais são responsáveis pela coloração característica do açúcar amarelo e pelo seu sabor característico. As melanoidinas são responsáveis por uma vasta gama de cores que variam de tons amarelos a castanhos, dependendo da intensidade da reação. No açúcar amarelo, a presença de melanoidinas contribui diretamente para o tom dourado 7 [20]. Além da reação de Maillard , a caramelização é um outro processo químico que influencia a cor do açúcar amarelo. A caramelização envolve a degradação térmica dos açúcares quando estes são submetidos a temperaturas elevadas, gerando compostos de sabor e cor intensos que vão desde amarelo-claro até castanho-escuro [21]. Durante a produção de açúcar amarelo, parte dos pigmentos naturais da cana, como clorofilas e compostos fenólicos, pode permanecer no produto final, contribuindo também para sua cor. Os compostos fenólicos são uma classe de metabolitos secundários de plantas amplamente encontrados em muitos alimentos, incluindo o açúcar amarelo. Esses compostos, que incluem ácidos fenólicos, flavonoides e outros antioxidantes, são derivados da cana-de-açúcar e, em menor medida, da beterraba. Os compostos fenólicos também podem conferir ao açúcar propriedades antioxidantes, o que pode ser valorizado tanto do ponto de vista nutricional quanto no contexto de preservação da qualidade durante o armazenamento [22]. Embora o seu impacto seja mais evidente em açúcares menos refinados, como o açúcar mascavado, os compostos fenólicos também estão presentes em quantidades detetáveis no açúcar amarelo, influenciando sua coloração e propriedades sensoriais [23]. Os compostos fenólicos têm uma forte capacidade de absorver luz, o que pode contribuir para o tom amarelado do açúcar. Isso ocorre porque muitos compostos fenólicos têm estruturas conjugadas que lhes conferem a capacidade de interagir com a luz visível, afetando diretamente a sua cor. Além disso, em condições de processamento térmico, como as que ocorrem durante a produção de açúcar, os compostos fenólicos podem sofrer oxidações que resultam em produtos pigmentados, como quinonas, que tendem a escurecer o açúcar [24]. Outro ponto importante é que durante o processo de refinação do açúcar os compostos fenólicos podem interagir com outros compostos, como os aminoácidos ou açúcares redutores, promovendo ou participando nas reações de Maillard e na caramelização, que são cruciais na formação da cor final. Estudos indicam que a presença destes compostos fenólicos pode aumentar a complexidade da cor resultante, uma vez que eles podem atuar como substratos para essas reações de escurecimento não enzimático [25]. A concentração de compostos fenólicos no açúcar amarelo pode variar significativamente de acordo com fatores como a variedade de cana-de-açúcar, as condições de cultivo e colheita, e os parâmetros do processamento industrial, como a temperatura e o tempo de aquecimento. Condições de processamento mais agressivas tendem a reduzir a quantidade de compostos 8 fenólicos, mas também podem acelerar reações de oxidação e caramelização, afetando a coloração [23]. Isso sugere que o controlo cuidadoso desses parâmetros pode ser uma estratégia importante para otimizar a cor e a estabilidade do açúcar amarelo ao longo do tempo. Os consumidores tendem a associar produtos com uma cor dourada mais intensa e uniforme a qualidades superiores, como frescura e naturalidade, especialmente em produtos com características mais artesanais, como o açúcar amarelo [24]. Além disso, o conhecimento crescente sobre os benefícios dos compostos fenólicos para a saúde, como a atividade antioxidante, pode contribuir para uma maior valorização desse tipo de açúcar entre os consumidores mais conscientes das suas escolhas alimentares. O estudo dos compostos fenólicos no açúcar amarelo representa um campo promissor para a ciência dos alimentos, uma vez que a sua influência na cor, sabor e qualidade antioxidante ainda não é completamente compreendida. A investigação neste domínio pode ajudar a identificar maneiras de preservar ou até otimizar a concentração de compostos fenólicos durante o processo de refinação, de modo a melhorar tanto a qualidade do produto final quanto a sua aceitação pelo consumidor. Além disso, o desenvolvimento de técnicas de processamento mais eficientes, que controlem a degradação ou oxidação dos compostos fenólicos, pode abrir novas oportunidades para a inovação na produção de açúcares especiais, com perfis de cor e sabor mais definidos [26]. 2.5 Processamento e armazenamento O processamento, armazenamento e transporte do açúcar amarelo têm um impacto significativo na qualidade do produto, especialmente na estabilidade da cor e no desenvolvimento de manchas ou variações de pigmentação. Durante o processamento, temperaturas elevadas e a presença de compostos redutores podem favorecer reações que alteram a cor do açúcar. No entanto, as condições de armazenamento, como humidade, temperatura e exposição à luz, também desempenham um papel crucial na manutenção da qualidade do produto [27]. Condições inadequadas de refinação e secagem podem resultar em variações na cor devido à formação excessiva de melanoidinas ou à caramelização não controlada. Temperaturas de refinação muito altas ou tempos de processamento longos podem acelerar essas reações [28]. O açúcar amarelo é particularmente sensível à humidade, uma vez que pode promover a aglomeração dos cristais e, eventualmente, acelerar as reações químicas que afetam a 15 permitem o crescimento de leveduras e outros fungos contaminantes. [52] Um meio amplamente utilizado para este fim é o Potato Dextrose Agar (PDA), um meio de cultura rico em nutrientes que facilita o crescimento de uma ampla gama de fungos, incluindo leveduras osmofílicas, como Zygosaccharomyces rouxii [53]. No contexto do açúcar amarelo, a contaminação por leveduras como Zygosaccharomyces rouxii é particularmente preocupante, já que esta espécie tem a capacidade de crescer em ambientes com atividade de água muito baixa (aw perto de 0,60), uma característica comum em produtos açucarados. Isso significa que mesmo com os valores reduzidos de atividade da água no açúcar amarelo, Z. rouxii pode proliferar, levando a problemas de qualidade, como fermentação indesejada, formação de gases e alterações organoléticas [54]. 2.8.2 Isolamento de colónias Após a observação de crescimento em placas, as colónias que se desenvolvem são isoladas para análises subsequentes. Este processo de isolamento envolve a transferência de colónias individuais para novas placas ou caldos de cultura, de modo a garantir a obtenção de culturas puras, sem a interferência de outros contaminantes. A correta identificação dos organismos isolados é essencial para determinar a origem da contaminação e implementar medidas de controlo adequadas [55], [56]. As leveduras osmofílicas, como Zygosaccharomyces rouxii , podem ser diferenciadas com base em características fenotípicas, como o seu padrão de crescimento em meios com elevadas concentrações de açúcar e as propriedades morfológicas das colónias, que tendem a ser circulares, convexas e de cor creme [57]. 2.8.3 Técnicas moleculares O avanço das técnicas moleculares trouxe uma maior precisão para a identificação de microrganismos contaminantes em alimentos. A reação em cadeia da polimerase (PCR) tornou-se uma ferramenta indispensável para a identificação molecular de leveduras e outros microrganismos. A técnica de PCR permite amplificar sequências específicas de DNA, facilitando a deteção de leveduras e fungos como Zygosaccharomyces rouxii ou Aspergillus de forma rápida e precisa [56]. Para a identificação de leveduras contaminantes, utiliza-se frequentemente a amplificação 16 de regiões conservadas do DNA ribossomal, como as regiões ITS ( Internal Transcribed Spacer ), que têm sido amplamente utilizadas em estudos taxonómicos de fungos. A amplificação seguida de sequenciamento do DNA dessas regiões permite a comparação com bases de dados genéticos, identificando com precisão o microrganismo em questão [58]. A região ITS, compreendendo ITS1 e ITS2, é uma região não codificadora do genoma ribossomal, flanqueada pelos genes 18S, 5.8S e 28S, e tem sido amplamente utilizada para identificar leveduras em diferentes ambientes, incluindo alimentos, por proporcionar alta resolução taxonómica [59]. Esta técnica é particularmente útil no caso de Z. rouxii , uma levedura osmofílica que pode ser difícil de distinguir de outras espécies apenas através de métodos tradicionais. Zygosaccharomyces rouxii é uma levedura conhecida por sua resistência a ambientes com baixa atividade de água e altos níveis de açúcar, o que a torna uma ameaça potencial em produtos açucarados, como o açúcar amarelo. Esta levedura é capaz de crescer em concentrações de açúcar que inibiriam a maioria dos outros microrganismos, o que pode levar a problemas significativos durante o armazenamento prolongado do produto. O seu crescimento pode resultar em fermentação indesejada, produção de dióxido de carbono e álcool, além de alterações no sabor e textura do açúcar, comprometendo a sua qualidade [57], [60]. 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Avaliação físico-química 3.1.1 Preparação das amostras Para este estudo, foram analisadas amostras de açúcar amarelo organizadas em 2 grupos de amostras diferentes, transportadas em embalagens lacradas e recebidas em diferentes tempos. Estas amostras faziam parte de um stock existente na empresa de forma a salvaguardar amostras de diferentes dias de produção. Numa primeira fase, foram recebidas nove amostras de açúcar amarelo sem manchas, todas elas produzidas com um ou dois dias de diferença. Para que houvesse uma identificação mais fácil das amostras, elas foram catalogadas com as letras de A a I, não estando necessariamente por ordem de produção. Já numa segunda fase e após melhor consideração sobre a origem das amostras, foram analisadas 10 novos exemplares de açúcar amarelo, tanto com manchas como sem e com produção a estender-se desde os primeiros dias do ano até à data dos testes (meados do ano). Esta segunda leva de amostras foi catalogada com 17 os números 1 a 6 para as amostras visualmente normais, da mais antiga para a mais recente, e com os números 7 a 10 para as amostras que continham manchas visíveis, também da mais antiga para a mais recente. Ainda neste segundo grupo, separou-se para um tubo de Falcon de 50 mL amostras das manchas brancas (zonas mais claras) das quatro embalagens que continham as mesmas e para outro tubo de Falcon amostras das zonas mais escuras (normalmente ao redor das zonas claras) também visíveis nestas embalagens. Além disso, para alguns ensaios foi também utilizada uma amostra de uma empresa concorrente. 3.1.2 Teor de humidade Um dos primeiros passos deste trabalho foi determinar o teor de humidade relativa de cada amostra e, consequentemente, o peso seco das mesmas. Este teste foi realizado nos dois grupos de amostras. Para isso, pesaram-se formas de metal sozinhas previamente secas numa estufa Thermo Heraeus T6 a 105 ºC por 3 horas e as formas de metal com uma pequena quantidade de açúcar de cada amostra (aproximadamente a mesma quantidade entre as amostras e em duplicado para cada amostra). Depois, as formas com o açúcar foram deixadas durante a noite a secar numa estufa a 105 ºC. No dia seguinte, pesaram-se as formas com o açúcar depois da secagem. Assim, foi possível determinar o teor de humidade relativa das amostras (Equação 1) e, consequentemente, o seu peso seco (Equação 2) utilizado para normalizar alguns resultados. Os valores de humidade relativa e respetivos desvios-padrão do 1º e 2º conjuntos de amostras estão representados na Tabela 1 e Tabela 2, respetivamente. 𝑡𝑒𝑜𝑟 𝑑𝑒 ℎ𝑢𝑚𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 (%)=𝑚(𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎+𝑎çú𝑐𝑎𝑟 ℎú𝑚𝑖𝑑𝑜)− 𝑚(𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎+𝑎çú𝑐𝑎𝑟 𝑠𝑒𝑐𝑜) 𝑚(𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎+𝑎çú𝑐𝑎𝑟 ℎú𝑚𝑖𝑑𝑜)− 𝑚(𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎)×100 (𝟏) Equação 1 – Cálculo do teor de humidade relativa em percentagem através do método de peso seco. 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 (%)=100 − 𝑡𝑒𝑜𝑟 𝑑𝑒 ℎ𝑢𝑚𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 (𝟐) Equação 2 – Cálculo do valor de peso seco em percentagem. 3.1.3 Varrimento de absorvâncias ao longo do tempo 18 Para avaliar a alteração de pigmentação das amostras ao longo do tempo, preparou-se, em duplicado, soluções das nove primeiras amostras de açúcar dissolvidas em água ultrapura a concentração de 1 g.mL-1. Notou-se que na 2ª semana do teste havia sinais de contaminação das amostras, o que podia interferir com a leitura da absorvância das soluções. Posto isto, recomeçouse o teste com novas soluções, contendo elas Timol (Sigma-Aldrich) a concentração de 1 g.L-1, sendo este composto um terpeno incolor natural com ação antifúngica. O teste baseou-se em leituras de varrimento semanais da absorvância das amostras no leitor de microplacas SPECTROstarnano da BMG LABTECH`s , em triplicado e em placa de 96 poços (adicionando 350 µL de solução em cada poço) de 350 a 800 nm (zona do visível). Preparou-se para utilizar como branco uma solução de Timol a 1 g.L-1 em água ultrapura, tendo-se retirado aos valores dos varrimentos o valor do branco. Os gráficos do varrimento de absorvância ao longo do tempo na zona do visível das amostras A a I encontram-se em anexo (Anexo 1). Realizou-se ainda um varrimento das absorvâncias das amostras 1 a 10 de açúcar amarelo, bem como das amostras das manchas brancas e das zonas mais escuras. Para isso, preparou-se soluções a concentração 1 g.mL-1 de cada amostra em eppendorfs . De seguida, adicionou-se 350 µL, em triplicado, de cada solução para uma placa de 96 poços e fez-se a leitura das absorvências de cada poço na zona do visível (350 a 800 nm). 3.1.4 Teor de fenólicos totais O método escolhido para a determinação do teor de fenólicos totais foi o método FolinCiocalteau, o qual foi realizado nos dois conjuntos de amostras analisadas. Para isso, foi necessário, além do reagente Folin-Ciocalteau a 1N (Sigma-Aldrich), uma solução de carbonato de sódio (Na2CO3) (Sigma-Aldrich) em água destilada a 7,5 % bem como a preparação de uma solução stock de ácido gálico (Sigma-Aldrich) a 250 mg.L-1 e nove soluções para a curva de calibração a partir da solução stock com concentrações a variar entre 0 e 200 mg.L-1. Foi ainda necessário preparar, em triplicado, soluções a concentração 100 mg.mL-1, em água ultrapura, para cada amostra. Utilizando uma microplaca de 96 poços, adicionou-se a cada posso 20 μL de cada solução a testar ou de solução standard , em triplicado, seguido de 100 μL do reagente de FolinCiocalteau e 80 μL da solução de carbonato de sódio. Aa amostras foram deixadas a reagir a 42 ºC, protegida da luz, por 30 minutos (min) e fez-se a leitura das absorvâncias de cada poço no leitor de microplacas a comprimento de onda de 750 nm. Realizada a curva de calibração (Anexo 19 2), retirou-se o valor do teor de fenólicos totais em cada amostra pela equação da reta. 3.1.5 Teor de flavonoides O teor de flavonoides foi também ele realizado nos dois grupos de amostras e foi determinado pelo método com cloreto de alumínio (AlCl3). Posto isto, preparou-se, na hotte , uma solução de cloreto de alumínio (Sigma-Aldrich) a 100 g.L-1 bem como uma solução de nitrito de sódio (NaNO2) (Merck) a 50 g.L-1, uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) (Merck Millipore) 1M e uma solução stock de catequina (Sigma-Aldrich) a 250 mg.L-1, da qual se preparou os 9 padrões para a reta de calibração, com concentrações entre 0 e 200 mg.L-1. As soluções das amostras a analisar foram as mesmas previamente preparadas para o teste do teor de fenólicos totais, a concentração de 100 mg.mL-1. O procedimento em si consistiu na adição de 25 μL de cada amostra/solução standard, em triplicado, num poço de uma microplaca de 96 poços, seguida da adição de 30 μL de NaNO2, agitando e deixando a atuar 5 min no escuro. Depois, adicionou-se 30 μL de AlCl3, novamente agitando e deixando a atuar 6 min no escuro. Por fim, adicionou-se 125 μL de NaOH, agitou-se a placa por 30 segundos e leu-se as absorvâncias a comprimento de onda de 510 nm. O gráfico da reta de calibração encontra-se em anexo (Anexo 3). 3.1.6 Atividade antioxidante Para a determinação da atividade antioxidante, a qual foi apenas realizada no primeiro grupo de amostras, realizaram-se dois testes colorimétricos por diferentes métodos, sendo eles o método ABTS ( 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ) e o método FRAP ( Ferric Reducing Antioxidant Power ). Os dois métodos utilizam o padrão Trolox ( 6-hydroxy-2,5,7,8tetramethylchroman-2-carboxylic acid ) (Sigma-Aldrich) para a curva de calibração e as soluções a analisar foram as mesmas utilizadas para os dois testes referidos anteriormente, a concentração de 100 mg.mL-1. O método ABTS requer a preparação de uma solução stock de ABTS a 7 mM (SigmaAldrich), um radical de persulfato de sódio (Sigma-Aldrich) a 148 mM, a solução concentrada de ABTS (obtida pela adição de 88 μL do radical em 5 mL da solução de ABTS, mantida no escuro e preparada 12-16h antes da realização do teste) e da solução de trabalho de ABTS (adicionando 20 0,5 mL da solução concentrada de ABTS em 44 mL de tampão de ácido acético (20 mM, ph 4,5) (Merck). Tendo isto, adicionou-se 20 μL de amostra/standard de Trolox (incluindo o branco, 20 μL de etanol 70 % (v/v)) (AGA), em triplicado, a cada poço de uma microplaca e 180 μL da solução de trabalho de ABTS. Deixou-se a reagir por 30 min, no escuro, a temperatura ambiente. Leu-se as absorvâncias a 734 nm, calculou-se a percentagem de inibição (Equação 3) e a TEAC ( TROLOX Equivalent Antioxidant Capacity ) (Equação 4). Através da curva de calibração (Anexo 4) retirou-se os resultados. %𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜(𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎)=(𝐴𝑏𝑠𝑏𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜 − 𝐴𝑏𝑠𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎) 𝐴𝑏𝑠𝑏𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜 ×100 (𝟑) Equação 3 – Cálculo da percentagem de inibição (atividade antioxidante do método ABTS) de uma amostra através da leitura de absorvância. 𝑇𝐸𝐴𝐶𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 =%𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 𝑎 ,𝑠𝑒𝑛𝑑𝑜 𝑎 𝑜 𝑑𝑒𝑐𝑙𝑖𝑣𝑒 𝑑𝑎 𝑐𝑢𝑟𝑣𝑎 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎çã𝑜 (𝟒) Equação 4 – Cálculo do valor de TEAC (TROLOX Equivalent Antioxidant Capacity) de uma amostra através da percentagem de inibição. O método FRAP requer a preparação da solução de trabalho de FRAP misturando 10 partes de tampão acetato (300 mM, ph 3,6) (Sigma-Aldrich) com 1 parte de TPTZ ( 2,4,6-Tris(2pyridyl)-s-triazine) (Sigma-Aldrich), a concentração 10 mM e em solução de ácido clorídrico (Fisher Scientific) a 40 mM) e 1 parte de cloreto de ferro (FeCl3, 20 mM) (Sigma-Aldrich). Posto isto, adicionou-se 20 μL de cada amostra/standard e 280 μL de solução de trabalho FRAP a cada poço, em triplicado. A placa ficou a incubar 30 minutos, a 37 ºC e no escuro. As absorvâncias foram depois lidas a 593 nm e retirados através da curva de calibração (Anexo 5). 3.1.7 Teste de humidade e temperatura controladas Realizou-se um teste para perceber o efeito do teor da humidade (RH) e da temperatura na pigmentação do açúcar amarelo e possível formação das manchas, o qual foi feito nos dois conjuntos de amostras. De forma a simplificar, do primeiro grupo de amostras foi apenas analisada a amostra F e do segundo grupo foi analisada a amostra 5. As condições estudadas foram temperaturas de 4 ºC (câmara fria), temperatura ambiente (bancada do laboratório), 37 ºC (sala 21 com temperatura controlada) e 50 ºC (estufa), bem como teores de humidade de 30, 50 e 70 % (para a amostra F) e 50, 70 e 100 % (para a amostra 5). Para isso, recriaram-se pequenas câmaras de controlo da humidade recorrendo a frascos de colheita de amostras de 250 mL, dentro dos quais se colocou aproximadamente 40 mL de uma solução saturada de um sal, bem como uma rede de suporte e uma forma de silicone para armazenar as amostras (Figura 3). Para manter as humidades no teor desejado utilizaram-se os sais cloreto de magnésio (30 % RH) (SigmaAldrich), nitrato de magnésio (50 % RH) (Sigma-Aldrich), cloreto de sódio (70 % RH) (Thermo Fisher Scientific) e água ultrapura (± 100 % RH). Em cada forma colocou-se entre 10 e 20 gramas de amostras. Sendo assim, armazenaram-se 3 frascos de cada teor de humidade em locais apropriados com temperatura controlada, nomeadamente a 4 ºC, temperatura ambiente, a 37 ºC a 50 ºC. De forma a analisar as alterações, foram feitas leituras de 15 em 15 dias, em triplicado, da cor das amostras recorrendo a um colorímetro CR-400 Chroma Meter , que transforma a cor num conjunto de coordenadas de 3 eixos ortogonais de uma representação cartesiana (sistema CIELab ) – L*, a* e b*. Figura 3 – Imagem representativa dos frascos de amostras que simularam uma câmara de temperatura e humidade relativa controladas. Figura criada recorrendo à ferramenta online BioRender. Recorrendo a uma ferramenta online, ColorHexa , foi possível traduzir essas coordenadas (a média das réplicas para cada amostra) para uma cor. Foi ainda determinado o Delta E de cada amostra em cada condição em relação ao tempo zero, o qual é calculado com base nas diferenças entre esses valores para duas cores e pode ser interpretado como uma representação da distância entre as cores no espaço tridimensional CIELab (Equação 5). ∆𝐸 = √(𝐿𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 ∗+ 𝐿𝑧𝑒𝑟𝑜 ∗)2+ (𝑎𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 ∗− 𝑎𝑧𝑒𝑟𝑜 ∗)2+ (𝑏𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 ∗− 𝑏𝑧𝑒𝑟𝑜 ∗)2 (𝟓) 22 Equação 5 – Cálculo do valor de Delta E de uma amostra através da leitura das coordenadas de cor do sistema CIELab (L*, a* e b*). 3.1.8 Teste do efeito do pH De forma a perceber o efeito do pH na pigmentação do açúcar amarelo, foram preparados tampões citrato (Sigma-Aldrich) a variar de pH 3 a pH 6, tampões fosfato (Sigma-Aldrich) de pH 7 e pH 8 e tampão Tris-HCl de pH 9 (Sigma-Aldrich), de unidade em unidade. Dissolveu-se, em triplicado, 1 g das amostras A, B, C e F em 1 mL de cada tampão. Adicionou-se 350 µL de cada amostra, em triplicado, numa placa de 96 poços e efetuou-se a leitura de varrimento da absorvência na zona do visível. Os gráficos do varrimento da absorvância a diferentes pHs encontram-se em anexo (Anexo 6). 3.1.9 Teste das atmosferas controladas Para analisar a interferência do tipo de atmosfera do açúcar amarelo e a sua pigmentação, recorreu-se a câmaras, as quais se deixou a humidade controlada de 70 % (solução saturada de NaCl no fundo da câmara) e a temperatura ambiente. Em cada câmara colocou-se aproximadamente 20 g de açúcar amarelo (Amostra I) e diferentes atmosferas ricas em N2, O2 ou CO2. As câmaras foram deixadas ao longo do tempo, com observação regular a olho nu de possíveis alterações nas amostras de açúcar. 3.1.10 Extração dos compostos fenólicos Fez-se um teste prévio de determinação de compostos fenólicos por HPLC, mediante uma injeção direta de uma solução de açúcar amarelo em água ultrapura a 1 g.L-1. Dada a baixa concentração dos compostos fenólicos neste tipo de açúcar, foi necessário repetir o teste tentando extrair e concentrar ao máximo estes compostos do açúcar amarelo. Para isso, foi necessário testar também o melhor meio de extração dentro de dois valores de concentração de etanol (AGA), 70 % e 85 %, e a acidificação do meio com 1,6 M de ácido clorídrico (HCl) (Fisher Scientific) ou não. O resultado foi obtido por um teste do teor de fenólicos totais nos extratos e percebeu-se que dos meios analisados o melhor seria etanol a 70 % com 1,6 M de HCl. Sendo assim, o processo de extração consistiu na lavagem, em duplicado, das amostras do primeiro conjunto de açúcares. 23 Adicionou-se então 8 mL do meio de extração a 4 g de amostra a cada tubo de centrífuga, vortexando e centrifugando, numa centrífuga de laboratório DM0636 da marca DLAB, por 5 minutos a 4000 rpm, vertendo o sobrenadante para um tubo de Falcon de 15 mL. Repetiu-se o processo para cada amostra (2ª lavagem) vertendo o meio sobrenadante da 2ª lavagem com o da 1ª. De seguida, colocou-se os meios para evaporar a 40 ºC num evaporador de azoto até que o etanol fosse completamente evaporado. Tendo as amostras, em duplicado, concentradas estas foram filtradas com recurso a seringas e filtros para seringas, com poro de 0,22 µm, para vials de HPLC de 1,5 mL. As amostras foram mantidas no frio até a sua injeção por HPLC. 3.1.11 HPLC de compostos fenólicos As fases móveis utilizadas no HPLC para análise de fenólicos foram água ultrapura, solução de ácido fórmico (Fluka) a 0,1 % e acetonitrilo (Fisher Scientific), todas filtradas a vácuo com um filtro de poro de 0,22 µm e desgaseificadas imediatamente antes da realização das injeções por aproximadamente 10-15 minutos. O aparelho de HPLC utilizado foi um da série Nexera LC-40D (Shimadzu) com um detetor SPD-M40 e com uma coluna de fase reversa Aquity UPLC BEH C18 (Waters) com 50 por 2,1 mm. A injeção foi realizada a 40 ºC e uma taxa de fluxo de 0,4 mL.min-1, com corridas de 25 minutos. O gradiente de eluição para o solvente acetonitrilo foi de 0,0 a 5,5 min a 5 %, de 5,5 a 15 min com um aumento linear de 5 a 60 %, de 17,0 a 18,5 min com um aumento linear de 60 a 100 %, sendo por fim a coluna equilibrada a 5 % por 11,5 minutos. Além das amostras, foram também injetados padrões a concentração 40 g.L-1 de compostos fenólicos suspeitos de existir no açúcar amarelo, nomeadamente ácido benzoico (Sigma-Aldrich), ácido cafeico (Sigma-Aldrich), ácido clorogénico (Sigma-Aldrich), ácido p-cumérico (Sigma-Aldrich), ácido ferrúlico (Sigma-Aldrich), ácido protocatequico (Sigma-Aldrich), ácido seringico (Sigma-Aldrich) e ácido vanílico (Alfa Aesar). Os cromatogramas obtidos foram analisados no software do próprio programa de HPLC. 3.1.12 Determinação dos oligossacáridos Para analisar a presença de oligossacarídeos no açúcar amarelo, recorreu-se à técnica de hidrólise ácida seguida de injeção em HPLC. Para a hidrólise ácida foram pesados 4 g de cada amostra (amostras 1 a 10), em duplicado, para frascos de shot de 200 mL próprios para hidrólise. 24 De seguida, adicionou-se aos frascos água ultrapura até atingir 23,96 g. Adicionou-se ainda ácido sulfúrico (H2SO4) (Merck) até 25 g de solução. Anotou-se o peso de cada frasco mais a solução e levou-se a autoclavar (Sanyo labo autoclave MLS 3020 – Gemini BV) por 20 min a 121 ºC. Deixouse arrefecer e voltou-se a pesar os frascos após a autoclavagem. Posto isto, filtrou-se uma porção de cada frasco para vials de HPLC de 1,5 mL recorrendo a seringas e filtros para seringas, com poro de 0,22 µm. O primeiro passo para a realização do HPLC, além da preparação das amostras, foi a preparação da fase móvel. Esta fase móvel consiste numa solução de H2SO4 a 5 mM num volume final de 2 L. Para isso, na hotte, misturou-se 556 μL de H2SO4 a 95-98 % (Sigma-Aldrich) com água ultrapura num balão volumétrico. A solução foi filtrada e armazenada num frasco de 2 L para imediatamente antes da realização da técnica ser desgaseificada por aproximadamente 20 minutos. Para a técnica de HPLC, recorreu-se a um aparelho LC-2060C (Shimadzu) com um detetor RID-20A e a uma coluna Aminex HPX-87h [61]. Realizaram-se corridas de 30 minutos com um caudal de 0,6 mL.min-1 a 60 ºC. Tendo-se já os padrões para estas condições, injetou-se apenas um padrão de glucose de concentração conhecida (30 g.L-1) para comprovar se as retas de calibração já guardadas se encontravam corretamente calibradas. Os cromatogramas e concentrações de açúcares obtidos foram analisados no próprio software do programa de HPLC. Os cálculos auxiliares para a determinação da concentração de oligossacarídeos foram realizados na ferramenta Exce l ( Microsoft Office ). 3.1.13 Análise proteica Para o estudo da presença de proteína no açúcar amarelo recorreu-se a um analisador elementar UNICUBE. As condições da análise e a coluna utilizada não foram partilhadas pelos fabricantes. Dito isto, foram analisadas 4 amostras diferentes de açúcar amarelo, tendo-se pesado entre 3,1 e 3,8 mg de amostra para formas de estanho. As formas foram depois fechadas e colocadas no analisador. O analisador procede à incineração das amostras e separação das cinzas através duma coluna. Um detetor no final da separação permite detetar os elementos de carbono, hidrogénio, azoto e oxigénio presentes e quantificá-los. Por fim, o software do analisador permite relacionar a quantidade de azoto de uma amostra e o seu teor de proteínas. 3.2 Análise microbiológica 31 compostos que apresentam absorção significativa na faixa do UV-Vis, uma vez que, à medida que a radiação de maior comprimento de onda (e menor energia) interage com as moléculas, a absorvância tende a diminuir. Essa queda exponencial indica que a maior parte das interações eletrônicas ocorre em comprimentos de onda mais curtos, entre 300 e 400 nm [63], [64]. Foi realizada uma correlação de Pearson para as absorvâncias das amostras no espetro analisado e o valor de r variou entre -0,8256 e -0,8534, com valores de R2 médios-altos, a variar de 0,68 a 0,73. As pequenas variações no valor de r podem estar relacionadas a pequenas diferenças na concentração de compostos cromóforos nas amostras ou a variações no procedimento de preparação, como diluições ou sensibilidade do aparelho de leitura, o que é comum em análises espectrais. A literatura indica que variações no tratamento das amostras, como o tempo de exposição ao ambiente ou pequenas mudanças nas condições físico-químicas, podem influenciar os perfis de absorvância, o que pode explicar parte da dispersão observada [63]. O teste two-way ANOVA revelou ainda que o comprimento de onda é responsável por 89,52 % da variância total, com um valor de p < 0,0001. A análise também revela que as diferenças entre as amostras contribuem para 7,977 % da variância total, o que, embora seja uma contribuição menor em comparação com o comprimento de onda, é ainda assim estatisticamente significativa (p < 0,0001). Esse resultado sugere que, apesar das amostras apresentarem perfis espectrais bastante semelhantes, há variações suficientes para justificar a existência de diferenças entre elas, que podem estar relacionadas a pequenas diferenças nas composições químicas ou nos tratamentos aplicados a cada uma. 400 500 600 700 800 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Comprimento de onda (nm) Absorvância A B C D E F G H I Figura 4 - Gráfico do varrimento inicial (tempo zero) das absorvâncias na zona do visível das amostras A a I. 32 Esses resultados indicam que o comportamento espectral das amostras é amplamente governado pelos comprimentos de onda da luz incidente, o que é consistente com os princípios de absorção molecular, onde diferentes cromóforos presentes nas amostras interagem de maneira distinta ao longo do espectro de UV-Vis [63], [64]. A correlação forte entre as amostras sugere que elas compartilham características estruturais semelhantes, possivelmente compostos químicos ou intermediários de reação, que conferem essa similaridade espectral. 4.1.3 Leitura de varrimento de absorvâncias ao longo do tempo Após a leitura inicial e de forma a avaliar o comportamento da cor das amostras de açúcar ao longo do tempo, manteve-se a leitura do varrimento das absorvâncias na zona do visível (375 a 800 nm) ao longo de 9 semanas, tendo-se retratado num gráfico (Figura 5) o comportamento dispare de duas amostras (Amostras B e E) a comprimento de onda da cor amarela (575 nm). Nas primeiras semanas (1ª e 2ª), a amostra E atinge valores de absorvância superiores a 0,6 e com um comportamento decrescente, enquanto a amostra B mantém de forma relativamente estável valores inferiores a 0,3, revelando uma diferença clara entre ambas as amostras. De igual forma, a amostra E apresenta consistentemente valores mais elevados de absorvância em comparação com a amostra B ao longo de todas as semanas, sugerindo uma maior retenção de compostos responsáveis pela tonalidade amarela na amostra E. Este comportamento pode estar relacionado com a estabilidade das moléculas responsáveis pela cor ao longo do tempo, com a amostra E possivelmente contendo compostos mais estáveis que não se degradam tão rapidamente quanto os da amostra B. À medida que o tempo passa, ambos os valores tendem a estabilizar, mas a diferença relativa entre as duas amostras persiste, o que sugere uma dinâmica diferente de degradação dos compostos responsáveis pela cor em cada uma das amostras. No teste ANOVA simples ( one-way ANOVA ), foi identificado um valor de F = 20,20 e um p < 0,0001, confirmando que há diferenças significativas entre os varrimentos das amostras A a I. Este valor indica que a variabilidade na absorvância ao longo do tempo não é aleatória e pode ser atribuída às diferenças reais no comportamento das amostras. Além disso, realizou-se um teste ANOVA de medidas repetidas, o qual reforça os resultados anteriores, com um valor de F = 21,32 e um p = 0,0002, sugerindo que as diferenças observadas entre as amostras ao longo do tempo são estatisticamente significativas. O valor R2 = 0,7272 indica que mais de 72 % da variância pode ser explicada pelas diferenças nas semanas e nas amostras, o que é uma forte evidência de que a 33 estabilidade cromática das amostras é diferente. 1ª 2ª 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª 8ª 9ª 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 Tempo (semanas) Absorvância a 575 nm (cor amarela) Amostra B Amostra E Figura 5 - Gráfico de colunas do varrimento ao longo do tempo (9 semanas com leituras semanais) das absorvâncias na zona da cor amarela (aproximadamente 575 nm) das amostras B e E (representativas do comportamento das amostras A a I), com respetivos desvios-padrão. Ao interligar esses resultados com os dados do varrimento no tempo zero anteriormente discutidos, é possível observar uma consistência na tendência de variação das absorbâncias entre as diferentes amostras. As amostras que apresentaram maior absorvância em comprimentos de onda mais curtos no estudo anterior também são aquelas que apresentam maior absorvância ao longo das semanas (como a amostra E). Esta correlação pode ser explicada pela presença de compostos mais estáveis que absorvem intensamente na faixa UV-Vis e mantêm as suas características ao longo do tempo. Estudos indicam que a estabilidade da cor em produtos alimentares ou cosméticos pode estar relacionada com a presença de compostos com poder antioxidante ou outros estabilizantes que impedem a degradação dos cromóforos ao longo do tempo [65]. 4.1.4 Teor de fenólicos totais e teor de flavonoides Os resultados da concentração de fenólicos totais, medido em mg de catequina equivalentes por 100g de amostra seca, encontram-se retratados nos gráficos A e C da Figura 6 para as amostras A a I bem como das amostras 1 a 10, incluindo "Manchas," "Zonas escuras," e "Concorrência", respetivamente. No gráfico das amostras A a I (Figura 6A), observamos que 34 as concentrações de fenólicos totais nas amostras variam entre aproximadamente 200 mg/100 g (amostra A) e 450 mg/100 g (amostra F). A variação no conteúdo de fenólicos pode estar relacionada com diferentes fatores de processamento ou tipos de matérias-primas utilizadas, sendo que estes compostos são também conhecidos pela sua sensibilidade a métodos de extração e variações de temperatura [66]. Realizou-se um teste ANOVA de medidas repetidas, o qual revelou um valor de F de 110,7 com um p < 0,0001. Dito isto, observam-se diferenças estatisticamente significativas entre as amostras. Surge ainda um valor de R2 de 0,9568, indicando que 95,68 % da variação observada pode ser explicada pelas diferenças entre as amostras, as quais não são aleatórias. A B C D E F G H I 0 100 200 300 400 500 A Amostra [Fenólicos totais] mg ácido gálico eq/100g amostra seca A B C D E F G H I 0 50 100 150 200 250 B Amostras [Flavonoides] mg Cat eq/100g amostra seca 12345678910 Manchas Zonas Escuras Concorrência 0 200 400 600 800 C Amostras [Fenólicos totais] mg ácido gálico eq/100g amostra seca 12345678910 Manchas Zonas Escuras Concorrência 0 100 200 300 400 500 D Amostras [Flavonoides] mg Cat eq/100g amostra seca Figura 6 - [A] Gráfico de colunas do teor de fenólicos totais, em mg de ácido gálico equivalentes por 100 g de amostra seca, para as amostras A a I e respetivos desvios-padrão; [B] Gráfico de colunas do teor de flavonoides, em mg de Catequina equivalentes por 100 g de amostra seca, para as amostras A a I e respetivos desvios-padrão; [C] Gráfico de colunas do teor de fenólicos totais, em mg de ácido gálico equivalentes por 100 g de amostra seca, para as amostras 1 a 10, “Manchas”, “Zonas escuras” e “Concorrência” e respetivos desvios-padrão; [D] Gráfico de colunas do teor de flavonoides, em mg de Catequina equivalentes por 100 g de amostra seca, para as amostras 1 a 10, “Manchas”, “Zonas escuras” e “Concorrência” e respetivos desvios-padrão. 35 Já o gráfico das amostras 1 a 10 (Figura 6C), assim como as categorias "Manchas," "Zonas Escuras," e "Concorrência," revela um padrão interessante, onde as amostras de "Concorrência", que visualmente não possuem alterações de pigmentação, apresentam um teor de fenólicos totais notavelmente mais elevado que as demais amostras (acima de 700 mg/100 g), o que pode refletir um processo de produção ou de conservação que favorece a retenção desses compostos e pode suscitar questões sobre o papel dos compostos fenólicos no aparecimento ou não das manchas brancas. Da mesma forma, recorreu-se a um teste ANOVA de medidas repetidas para estas amostras, o qual mostrou novamente uma significância estatística das diferenças (F = 302,3 e p < 0,0001). O valor de R2 de 0,9837 reflete uma explicação ainda maior das variações pela diferença entre as amostras. Os compostos fenólicos desempenham um papel importante na atividade antioxidante e estão amplamente presentes em produtos de origem vegetal. A concentração de fenólicos em produtos processados pode variar consideravelmente em função do método de processamento, como secagem, extração ou armazenamento, como demonstrado por diversos estudos [67]. No caso das amostras "Concorrência" e "Manchas," o teor elevado pode sugerir que no caso da concorrência, a metodologia utilizada preserva melhor os fenólicos. Por outro lado, tendo as zonas das manchas valores também elevados contraria a hipótese da degradação destes compostos nestas zonas como causa do aparecimento das manchas brancas. Em contraste, as amostras A e D, com teores mais baixos, podem ter sofrido perdas durante o processamento ou podem ter sido obtidas a partir de fontes com menor concentração de fenólicos originalmente. A diferença na concentração pode também estar ligada ao tipo de fenol presente, já que diferentes compostos fenólicos apresentam diferentes taxas de degradação dependendo do ambiente físico-químico [68]. Os gráficos B e D da Figura 6 indicam o teor de flavonoides em mg de equivalentes de catequina por 100 g de amostra seca nas amostras A a I e nas amostras 1 a 10, além das categorias de "Manchas," "Zonas Escuras," e "Concorrência." No geral, os flavonoides totais variam bastante entre as amostras, com destaque para as amostras A e G, que exibem teores relativamente altos de flavonoides em comparação com as outras. No gráfico que apresenta os resultados para as amostras A a I (Figura 6B), observa-se uma variação de aproximadamente 50 mg/100 g (amostra B) a quase 200 mg/100 g (amostra G). A elevada variabilidade nas barras de erro reflete uma grande dispersão nos dados, sugerindo que as concentrações de flavonoides são muito suscetíveis a variações nas condições experimentais ou no processamento 36 das amostras. Os flavonoides são conhecidos por sua sensibilidade a fatores como luz, calor e oxidação, o que pode explicar essa variação [69]. Os testes estatísticos revelaram que, ao contrário do teor de fenólicos totais, não há diferenças estatisticamente significativas entre as amostras quanto ao teor de flavonoides. O modelo de efeitos mistos (REML) para as amostras A a I resultou num p = 0,2438, indicando que as variações observadas entre as amostras não são suficientes para serem consideradas estatisticamente significativas. Este resultado é corroborado pelo teste de correspondência, que não mostra eficácia significativa (p = 0,4762). No gráfico das amostras 1 a 10 (Figura 6D), as concentrações de flavonoides são ligeiramente superiores, especialmente nas amostras 3 e 9, com teores que se aproximam de 400 mg/100 g. A amostra "Concorrência" apresenta um valor intermédio, mas também com grande dispersão, o que pode indicar variações no método de processamento que afetam a retenção desses compostos bioativos. Resultados semelhantes nos testes estatísticos são observados para as amostras 1 a 10, com um valor de p de 0,3987, reforçando que as variações nos teores de flavonoides entre as amostras não são estatisticamente relevantes. Estes dados sugerem que, embora as concentrações de flavonoides variem entre as amostras, essa variação pode ser atribuída ao acaso ou a fatores não controlados nas condições experimentais, como a preparação das amostras ou das soluções necessárias para o teste e leitura no espectrofotómetro. Comparando esses resultados com os dados sobre o teor de fenólicos totais, há uma diferença importante a ser destacada. Enquanto os fenólicos totais mostraram diferenças estatisticamente significativas entre as amostras, os flavonoides não seguem a mesma tendência. Esta divergência pode ser explicada pelo facto de os fenólicos incluírem uma gama mais ampla de compostos bioativos além dos flavonoides, como ácidos fenólicos e taninos, que podem contribuir mais para as diferenças observadas entre as amostras [70]. Além disso, os flavonoides tendem a ser mais sensíveis às condições de extração e processamento, o que resulta numa maior variabilidade entre amostras, como observado nos grandes desvios-padrão. Estudos sugerem que as condições de temperatura, pH e até mesmo o tipo de solvente usado na realização do teste podem ter um impacto significativo na retenção de flavonoides [71], explicando a falta de significância estatística nas amostras analisadas. No entanto, a grande variabilidade dentro de cada amostra, como mostrado pelas barras de erro elevadas dos flavonoides, sugere que são necessários novos testes para controlar melhor as condições experimentais e reduzir a dispersão nos resultados e testar de novo esta variância. 37 4.1.5 Atividade antioxidante Os compostos antioxidantes desempenham um papel essencial na neutralização de radicais livres, e o método ABTS é amplamente utilizado para avaliar o poder antioxidante total de amostras alimentares e cosméticas. No contexto das amostras analisadas, a variação no poder antioxidante pode estar relacionada à concentração de compostos fenólicos e flavonoides, que são conhecidos por suas propriedades antioxidantes [72]. O gráfico Figura 7A que apresenta o conteúdo antioxidante das amostras, medido em mg de Trolox equivalente por 100 g de amostra seca, revela uma variação notável no poder antioxidante entre as amostras A a I. A amostra A apresenta o menor valor, próximo de 0,5 mg/100 g, enquanto a amostra H apresenta o valor mais elevado, próximo de 1,5 mg/100 g. As outras amostras estão distribuídas entre esses dois extremos, com diferenças relativamente pequenas entre elas. O fato de as amostras H e I apresentarem os maiores valores pode indicar uma maior concentração desses compostos bioativos, o que é consistente com as análises anteriores de fenólicos e flavonoides, onde essas amostras também se destacaram em algumas medidas. Tendo-se realizado um teste ANOVA de medidas repetidas para os dados ABTS indicou um valor F = 5,050 com p = 0,0229, mostrando que as diferenças observadas entre as amostras são estatisticamente significativas. O valor de R2 ser 0,5025 sugere que cerca de 50 % da variância observada pode ser explicada pelas diferenças entre as amostras. Esse resultado é relevante, pois indica que as variações no poder antioxidante entre as amostras não são aleatórias, mas refletem diferenças reais na sua composição de compostos antioxidantes. No entanto, a eficácia da correspondência ( matching ) entre as amostras não foi significativa (p = 0,4589), sugerindo que a correspondência entre as variâncias nas amostras não é estatisticamente significativa. Isso pode indicar que, embora existam diferenças reais entre os grupos, há também uma grande dispersão dentro de cada amostra, possivelmente devido a flutuações no processo de medição ou preparação das amostras. 38 A B C D E F G H I 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 A Amostras mg de Trolox equivalente por 100g de amostra seca A B C D E F G H I 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 B Amostras mg de Trolox equivalente por 100 gde amostra seca Figura 7 – [A] Gráfico de colunas da atividade antioxidante, medida em mg de Trolox equivalente por 100g de amostra seca, obtido pelo método ABTS, com os respetivos desvios-padrão; [B ]Gráfico de colunas da atividade antioxidante, medida em mg de Trolox equivalente por 100g de amostra seca, obtido pelo método FRAP, com os respetivos desvios-padrão. Ao comparar esses resultados com os dados de fenólicos e flavonoides discutidos anteriormente, observa-se uma ténue relação entre o poder antioxidante e os teores de fenólicos totais. A amostra H, por exemplo, que apresenta o maior valor antioxidante, também se destacou no teor de fenólicos totais. Isso é consistente com a literatura, que aponta que compostos fenólicos, incluindo flavonoides, desempenham um papel central no poder antioxidante dos alimentos [72], [73]. Embora os flavonoides sozinhos não tenham mostrado uma correlação tão forte com o poder antioxidante, é provável que a presença de outros compostos fenólicos nas amostras tenha um impacto significativo. O gráfico do poder antioxidante medido pelo método FRAP (Figura 7B) revela que há uma variação considerável nas amostras analisadas. A amostra I apresenta o maior valor de capacidade antioxidante, com cerca de 2,0 mg de equivalentes de Trolox por 100 g de amostra seca, enquanto as amostras A e B estão no extremo inferior, com valores em torno de 1,0 mg/100 g. As amostras D, E, G, H também demonstram um bom poder antioxidante, variando entre 1,0 e 1,5 mg/100 g. O facto de a amostra I ter mostrado o maior poder antioxidante pelo método FRAP pode estar relacionado à presença de compostos bioativos mais eficazes na doação de eletrões e na redução do ferro. A maior concentração de fenólicos na amostra I, conforme mostrado em análises anteriores, pode explicar o seu desempenho superior no teste FRAP. Além disso, as amostras G e H também tiveram um desempenho antioxidante elevado, o que está alinhado com suas concentrações relativamente altas de fenólicos e flavonoides, como observado nos gráficos anteriores. O modelo de efeitos mistos (REML) utilizado para o teste FRAP indica um valor de F = 94,10 e p < 0,0001, confirmando que há diferenças estatisticamente significativas 39 no poder antioxidante entre as amostras e que as variações observadas entre as amostras não são aleatórias, mas sim devido a diferenças reais nas suas capacidades antioxidantes. Um R2 = 0,2926 indica que aproximadamente 29 % da variação pode ser explicada pelas diferenças entre as amostras. O teste de correspondência revelou que houve correspondência significativa entre as amostras (p = 0,0378), sendo que, embora haja dispersão nos resultados, a correspondência entre as variâncias é aceitável. Isso pode ser um reflexo da uniformidade relativa das amostras em termos de seu comportamento antioxidante quando testadas em diferentes condições. Os resultados do FRAP são consistentes com os obtidos pelo método ABTS. No ABTS, a amostras H e I apresentaram o maior poder antioxidante. No entanto, no FRAP, a amostra I destacou-se ainda mais em relação às outras. A amostra H, que também mostrou alta capacidade antioxidante no ABTS, permanece entre as mais elevadas no FRAP. Esta correlação entre os métodos ABTS e FRAP é esperada, já que ambos medem o poder antioxidante de compostos através da sua capacidade de doação de eletrões. Isto porque o método FRAP está mais focado na capacidade de redução do ferro, enquanto o ABTS avalia a neutralização de radicais livres [74]. A variação nos resultados entre ABTS e FRAP também destaca a importância de usar múltiplos métodos para avaliar o poder antioxidante, uma vez que diferentes métodos podem avaliar propriedades distintas dos antioxidantes [45], [46], [74]. 4.1.6 Teste de humidades e temperaturas controladas No presente estudo, duas amostras de açúcar amarelo foram expostas a condições ambientais controladas, com a amostra representada na Tabela 3 sendo submetida a essas condições por 4 semanas e as amostras da Tabela 4 por 6 semanas. As medições foram realizadas para avaliar as alterações de cor ao longo do tempo, utilizando o sistema CIELab e transformando as coordenadas em uma cor específica através da ferramenta online ColorHexa . Tabela 3 - Tabela com os valores médios das coordenadas de cor L*, a* e b* (sistema CIELab) e Delta E da amostra E em diferentes condições de temperatura e humidade relativa, ao fim de 4 semanas, com os respetivos desvios-padrão. A última coluna corresponde à cor da amostra transformada a partir das coordenadas. Condição L* ± SD a* ± SD b* ± SD ΔE Cor Tempo zero 72 ± 1 -1,2 ± 0,4 21,8 ± 0,8 - 4 ºC 30 % 69 ± 1 6,65 ± 0,08 18,1 ± 0,4 8,86 4 ºC 50 % 75,2 ± 0,7 6,91 ± 0,06 18,2 ± 0,2 9,72 4 ºC 70 % 73,1 ± 0,8 6,93 ± 0,09 18,1 ± 0,4 9,11 T.A. 30 % 70 ± 2 6,5 ± 0,2 18,1 ± 0,3 8,59 40 T.A. 50 % 72,0 ± 0,8 7,1 ± 0,2 19,1 ± 0,4 8,70 T.A. 70 % 71 ± 1 7,15 ± 0,06 17,7 ± 0,2 9,24 Condição L* ± SD a* ± SD b* ± SD ΔE Cor 37 ºC 30 % 70 ± 1 6,9 ± 0,3 19,5 ± 0,7 8,44 37 ºC 50 % 71,4 ± 0,7 7,8 ± 0,3 20,7 ± 0,6 9,04 37 ºC 70 % 70,6 ± 0,7 7,6 ± 0,2 18,5 ± 0,6 9,44 50 ºC 30 % 70 ± 1 7,4 ± 0,2 22,3 ± 0,2 8,71 50 ºC 50 % 70,9 ± 0,6 8,8 ± 0,1 22,8 ± 0,3 10,04 50 ºC 70 % 69,1 ± 0,7 7,5 ± 0,2 18,1 ± 0,5 9,60 Tabela 4 - Tabela com os valores médios das coordenadas de cor L*, a* e b* (sistema CIELab) e Delta E da amostra 5 em diferentes condições de temperatura e humidade relativa, ao fim de 6 semanas, com os respetivos desvios-padrão. A última coluna corresponde à cor da amostra transformada a partir das coordenadas. Condição L* ± SD a* ± SD b* ± SD ΔE Cor Tempo zero 71,3 ± 0,7 6,47 ± 0,02 18,9 ± 0,4 - 4 ºC 50 % 74 ± 1 6,7 ± 0,3 20,0 ± 0,8 2,86 4 ºC 70 % 72 ± 1 6,7 ± 0,2 19,6 ± 0,4 1,09 T.A. 50 % 74 ± 1 7,0 ± 0,1 20,2 ± 0,3 2.66 T.A. 70 % 67 ± 2 7,25 ± 0,07 19,8 ± 0,4 3,99 Condição L* ± SD a* ± SD b* ± SD ΔE Cor 37 ºC 50 % 68 ± 2 7,5 ± 0,1 20,0 ± 0,5 3,77 37 ºC 70 % 64 ± 2 7,2 ± 0,3 18,8 ± 0,6 6,86 50 ºC 50 % 71,1 ± 0,4 8,63 ± 0,08 21,9 ± 0,5 3,73 50 ºC 70 % 66 ± 1 7,2 ± 0,1 19,3 ± 0,5 5,74 Analisando primeiro a Tabela 3, percebe-se que houve uma leve alteração das coordenadas de cor ao fim do teste. A luminosidade (L*) diminui ligeiramente de forma geral, indicando um escurecimento das amostras. Já as coordenadas a* e b* sofreram alterações ainda mais subtis. O cálculo dos Delta E (ΔE) sugere alterações de cor acentuadas no global, possivelmente percetíveis a olho nu. A literatura sugere que valores de ΔE inferiores a 1,0 indicam que as mudanças de cor são praticamente invisíveis, enquanto valores entre 1,0 e 3,0 podem ser percetíveis apenas para observadores treinados [75]. Os valores calculados para esta amostra situam-se acima dessa faixa, o que reforça a conclusão de que as mudanças de cor foram facilmente percetíveis. Foi realizado um teste ANOVA para cada coordenada de cor, bem como para o Delta E, de forma a avaliar a significância dos valores obtidos para as diferentes condições. Sobre a coordenada L*, a análise revelou que tanto a temperatura quanto a humidade e a interação entre os dois fatores são estatisticamente significativos para a variação da coordenada L*, com valores de p < 0,0001. A variação percentual explicada pela humidade foi ligeiramente maior (29,17 %) que pela temperatura (21,95 %). A interação entre esses dois fatores explicou cerca de 22,05 % da variação total, sugerindo que as condições combinadas têm um impacto notável na 47 amarelo pode ser armazenado de forma segura em diferentes atmosferas gasosas sem que isso afete a sua integridade visual, pelo menos durante o período de teste. Seria importante repetir o teste com maior tempo de duração e com uma análise mais pormenorizada das amostras ao fim do tempo de exposição às atmosferas. 4.1.9 HPLC de compostos fenólicos A análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) realizada nas amostras de açúcar amarelo permitiu a identificação e quantificação de três compostos fenólicos: ácido protocatecuico, ácido p-cumárico e ácido benzoico. Esses compostos foram identificados através da injeção de oito padrões fenólicos diferentes, sendo detetados em concentrações variáveis (Figura 9). Figura 9 – Cromatograma da amostra A (representativa das amostras A a I) com representação dos picos dos compostos fenólicos detetados e identificados, bem como um pico não identificado (pico com t =1,664 min). O ácido protocatecuico foi o composto predominante, com uma concentração entre 133 e 166 mg/100 g de açúcar (detetado a t = 1,664 min), seguido do ácido benzoico (8-18 mg/100 g) com um tempo de retenção de 9,593 min e do ácido p-cumárico (1-3 mg/100 g) detetado a t = 8,829 min. A identificação desses compostos fenólicos no açúcar amarelo está de 48 acordo com estudos prévios que sugerem que os compostos fenólicos, originários principalmente do melaço residual presente no açúcar, podem estar presentes em quantidades variáveis em função do processamento e das condições de armazenamento [81]. O ácido protocatecuico, em particular, é um composto fenólico frequentemente encontrado em alimentos processados que contêm melaço e tem sido associado a atividades antioxidantes [82]. Apesar de ter sido possível identificar esses três compostos, a análise cromatográfica revelou a presença de um pico dominante acoplado ao pico do ácido protocatequico, com evidências de ser uma mistura de substâncias não identificadas, cuja elucidação completa não foi possível com os padrões fenólicos injetados. Este grande pico pode estar relacionado com uma mistura complexa de compostos não fenólicos, como açúcares ou ácidos orgânicos menores, que não foram alvo desta análise específica. A complexidade do perfil cromatográfico do açúcar amarelo pode ser atribuída à presença de compostos resultantes das reações de Maillard durante o processo de produção, os quais podem ter propriedades cromatográficas semelhantes aos compostos fenólicos e interferir na sua separação [85]. A utilização de técnicas adicionais, como espectrometria de massa acoplada ao HPLC (LC-MS), poderia ser uma abordagem eficaz para identificar os compostos presentes no grande pico não resolvido, uma vez que essa técnica permite a deteção de compostos em misturas complexas com maior sensibilidade [86]. Alternativamente, ajustes nas condições cromatográficas, como a mudança da fase móvel ou o uso de colunas com maior especificidade para compostos fenólicos, poderiam melhorar a resolução dos picos e facilitar a identificação de substâncias coeluídas. 4.1.10 Determinação de oligossacáridos A hidrólise ácida seguida da análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi realizada com o objetivo de identificar e quantificar oligossacarídeos presentes nas amostras de açúcar amarelo. No entanto, após a execução do método, incluindo a resolução dos cálculos auxiliares e a análise dos picos cromatográficos obtidos, verificou-se que a concentração de oligossacarídeos nas amostras foi nula. A ausência de oligossacarídeos pode ser explicada pela composição química predominante do açúcar amarelo, que consiste quase exclusivamente em sacarose, com pequenas quantidades de outros compostos corados e impurezas do melaço que contribuem para a sua cor característica [87]. Estudos anteriores indicam que oligossacarídeos, como a rafinose e a estaquiose, são geralmente encontrados em produtos vegetais específicos, 49 como leguminosas e beterraba, mas não em concentrações significativas em açúcares refinados [88]. A hidrólise ácida aplicada às amostras foi adequada para a quebra de ligações glicosídicas, o que permitiria a identificação de oligossacarídeos caso estivessem presentes. Contudo, a ausência de deteção por HPLC confirma que as amostras de açúcar amarelo, sob as condições do teste, não contêm oligossacarídeos em quantidades mensuráveis. Isto é consistente com a literatura, que relata que o processamento industrial do açúcar, especialmente a purificação e o refinamento, remove a maioria dos oligossacarídeos e outros compostos que poderiam estar presentes na matéria-prima inicial, como o melaço [15]. Assim, foi possível concluir uma nova informação sobre o perfil e composição do açúcar amarelo. 4.1.11 Análise de proteína Dada a sensibilidade do analisador elementar utilizado e tendo em conta as condições da análise e as quantidades pesadas das amostras, não foi possível detetar nenhuma quantidade de azoto. Isto leva a que não se consiga tirar uma conclusão definitiva sobre a presença de proteína no açúcar amarelo, uma vez que as concentrações destes compostos seja tão baixa que não permita a sua deteção no analisar elementar. Para todos os efeitos, assume-se que no caso de existir proteína no açúcar, a sua quantidade é muito baixa ao ponto de poder ser quase desprezada para estudos futuros. 4.1.12 Análise de Componentes Principais De forma a compreender uma possível correlação entre os diferentes fatores estudados nas amostras de açúcar amarelo, como a humidade, o teor de flavonoides, os fenólicos totais e as atividades antioxidantes (medidas pelos métodos ABTS e FRAP), procedeu-se a uma análise de componentes principais (PCA), representada pelos gráficos da Figura 10. A variabilidade explicada pelas duas componentes principais é bastante significativa, representando 71,22 % na Figura 10A e 77,88 % na Figura 10B, o que sugere que estes componentes captam uma parte substancial da variabilidade dos dados. 50 Figura 10 – [A] Gráfico da análise de componentes principais (PDA) das amostras A a I dos fatores Humidade, Absorvância inicial a 575 nm, Teor de fenólicos totais, Teor de Flavonoides, Atividade antioxidante por ABTS e FRAP; [B] Gráfico da análise de componentes principais (PDA) das amostras A a I e 1 a 10, dos fatores Humidade, Absorvância inicial a 575 nm, Teor de fenólicos totais e Teor de Flavonoides. A análise PCA revelou que a humidade das amostras está diretamente relacionada com a absorvância a 575 nm. Esta correlação sugere que o aumento da humidade nas amostras pode intensificar o processo de escurecimento ou outras reações químicas, como a reação de Maillard. Em termos de atividade antioxidante, observou-se uma forte correlação entre os fenólicos totais, FRAP e ABTS, evidenciada pela proximidade das suas setas nos gráficos PCA. Estudos anteriores A B 51 demonstram que o teor de fenólicos totais é um preditor robusto da capacidade antioxidante de amostras alimentares [72], [85], o que explica a alta correlação observada. Flavonoides, que são um subgrupo de compostos fenólicos, também apresentam uma relação positiva com a atividade antioxidante, conforme indicado pela proximidade das setas no gráfico. As amostras estão distribuídas de forma distinta nos gráficos, o que demonstra variações significativas entre as suas propriedades físico-químicas. Por exemplo, a amostra A encontra-se bastante distante das outras no gráfico A, sugerindo uma maior absorvância (cor) e teor de humidade em comparação com as restantes. Isto indica que a amostra pode estar em condições que favorecem a absorção de água e, possivelmente, a degradação dos compostos responsáveis pela cor. Em contraste, amostras como B e D mostram-se em quadrantes negativos tanto no PC1 quanto no PC2, o que sugere teores mais baixos de fenólicos e flavonoides, bem como uma menor atividade antioxidante. Estas variações podem estar relacionadas com diferentes condições de processamento ou armazenamento, fatores que afetam diretamente a qualidade e estabilidade dos compostos bioativos presentes nas amostras de açúcar amarelo [89]. A correlação positiva entre a humidade e o teor de flavonoides pode indicar que amostras com maior humidade têm uma maior preservação destes compostos bioativos como fenólicos ou flavonoides ou, alternativamente, que estes compostos são menos suscetíveis à degradação em ambientes mais húmidos. Esta observação está alinhada com achados na literatura [44], que reportaram que o teor de flavonoides em frutas frescas e secas tende a diminuir com a perda de água e que sugerem que a humidade pode ter um papel protetor. Além disso, a relação entre os fenólicos totais e as atividades antioxidantes (FRAP e ABTS) destaca a importância dos compostos fenólicos na capacidade antioxidante das amostras de açúcar amarelo. Conforme observado na literatura, os compostos fenólicos são potentes doadores de eletrões e estão diretamente envolvidos na neutralização de radicais livres, o que explica os altos valores de atividade antioxidante nas amostras com maior teor de fenólicos [90]. De forma geral, a análise PCA demonstra que os fatores relacionados à humidade, flavonoides, fenólicos totais e atividades antioxidantes estão fortemente interligados nas amostras de açúcar amarelo. Condições de armazenamento que favorecem a retenção de humidade parecem ter um impacto positivo na preservação dos compostos bioativos, enquanto o escurecimento das amostras, indicado pelo aumento da absorvância a 575 nm, pode ser exacerbado pela presença de água, possivelmente devido à aceleração de reações químicas que afetam a cor e a qualidade do produto. 52 4.2 Análise microbiológica 4.2.1 Microscopia Após o cultivo de amostras de açúcar amarelo em meio seletivo, foi possível isolar colónias que, ao serem observadas por microscopia (Figura 11), apresentaram características morfológicas típicas da levedura Zygosaccharomyces rouxii , levedura suspeita de contaminação pela empresa. Figura 11 – Imagens de microscopia das colónias isoladas após crescimento da solução mix das amostras 7 a 10 (com manchas) conseguidas através do microscópio Olympus BX51, tendo-se observado e fotografado as lâminas com as objetivas de 40X (A) e 100X (B). Esta levedura é conhecida pela sua capacidade de tolerar ambientes com alta concentração de açúcares, o que a torna um contaminante comum em produtos ricos em A B 53 sacarose, como o açúcar amarelo e o melaço [57]. A observação microscópica revelou células ovoides, frequentemente em gemulação, com tamanhos variando entre 3-5 µm, características estas que são congruentes com descrições anteriores de Zygosaccharomyces rouxii [91]. Essa espécie de levedura é bem adaptada a ambientes hiperosmóticos, suportando pressões osmóticas elevadas devido à sua habilidade em acumular compostos osmoprotetores, como o glicerol, o que pode explicar sua presença nas amostras de açúcar analisadas [91]. Embora o açúcar amarelo não seja um meio ideal para o crescimento extensivo de microrganismos devido à sua baixa atividade de água, a presença de resíduos de melaço e a eventual introdução de humidade podem criar microambientes favoráveis à proliferação de leveduras como Zygosaccharomyces . Além disso, a microscopia revelou que a estrutura celular da levedura estava em condições viáveis. Os resultados obtidos reforçam a necessidade de práticas adequadas de higiene e armazenamento no processamento de açúcar amarelo, de modo a minimizar a presença de contaminantes microbiológicos que possam comprometer a qualidade do produto final. A deteção de Z. rouxii nas amostras analisadas é uma evidência de que, embora a levedura seja comumente associada à deterioração de alimentos ricos em açúcar, a sua deteção em produtos acabados, como o açúcar amarelo, pode ser minimizada com a utilização de técnicas mais rigorosas de controle de qualidade e armazenamento. 4.2.2 Teste de caracterização Relativamente aos testes de caracterização baseados em métodos bioquímicos, as colónias isoladas, que presumivelmente pertencem à espécie Zygosaccharomyces rouxii , foram cultivadas em meio de cultura PDA (Agar Dextrose Batata) sob condições extremas de stress osmótico, com concentrações de 50 % de glucose e 20 % de NaCl (Figura 12). A espécie Z. rouxii é amplamente reconhecida pela sua capacidade de sobreviver e proliferar em ambientes com concentrações elevadas de açúcares e sais, o que a torna um dos microrganismos osmófilos mais estudados [60]. 54 Figura 12 – Fotografia ao crescimento de colónias de levedura previamente isolada, ao fim de 7 dias, em placa de meio PDA + 50 % de glucose [A] e em placa de meio PDA + 20 % NaCl [B]. Nas placas contendo 50 % de glucose (Figura 12A), observou-se um crescimento significativo das colónias, embora com um ritmo mais lento comparado às condições normais de cultivo. O crescimento observado em 50 % de glucose é consistente com a literatura, onde Zygosaccharomyces é descrita como uma das poucas leveduras capazes de resistir a pressões osmóticas tão elevadas, sendo frequentemente encontrada em produtos ricos em açúcar, como xaropes, doces e melaço [57]. Esse comportamento confere à levedura uma vantagem competitiva em nichos alimentares com alto teor de açúcar, onde outras espécies de microrganismos encontram dificuldades para sobreviver. Da mesma forma, as colónias mostraram-se capazes de crescer em meios contendo 20 % de NaCl (Figura 12B), demonstrando uma alta tolerância ao sal. Esse crescimento, embora mais lento do que nas condições com glucose, destaca a robustez osmofílicas de Z. rouxii . A presença de NaCl em concentrações tão altas cria um ambiente de stress osmótico severo, ao qual a levedura responde acumulando glicerol intracelularmente para prevenir a perda de água e manter a homeostase celular. Além disso, essa característica osmofílicas é acompanhada por mecanismos de regulação genética que aumentam a expressão de genes envolvidos na síntese de glicerol e no transporte de iões, promovendo a sobrevivência da levedura em condições de stress [92]. As colónias isoladas de açúcar amarelo foram capazes de crescer em condições extremas A B 55 de stress osmótico, tanto em meios com 50 % de glucose quanto em 20 % de NaCl, características típicas de Zygosaccharomyces rouxii . A capacidade dessa levedura de sobreviver e proliferar em tais condições reforça a hipótese de que a espécie isolada pertence a este género. 4.2.3 Extração de DNA, PCR e sequenciação Para confirmar a identidade das colónias isoladas de açúcar amarelo, suspeitas de pertencerem à espécie Z. rouxii , foi realizada a extração de DNA seguida de uma reação em cadeia da polimerase (PCR) da região ITS ( Internal Transcribed Spacer ). A sequência ITS é frequentemente utilizada para a identificação de leveduras devido à sua alta variabilidade entre diferentes espécies, sendo amplamente reconhecida como um marcador molecular eficaz para a taxonomia fúngica [93]. Após a amplificação, os produtos do PCR foram enviados para sequenciamento, e os resultados confirmaram a presença de Z. rouxii nas amostras analisadas. A confirmação molecular da sua presença nas amostras reforça a suspeita inicial baseada na morfologia e nas características de crescimento observadas nos testes de cultivo em condições extremas. A presença confirmada de Z. rouxii nas amostras de açúcar amarelo levanta preocupações acerca da qualidade microbiológica deste produto e do seu potencial para causar deterioração em alimentos processados. A levedura é conhecida por causar fermentações não desejadas em produtos de confeitaria e bebidas, além de ser um contaminante comum em ambientes de processamento com condições osmóticas desafiadoras [57], [60]. Este estudo confirma a importância da utilização de métodos moleculares como ferramenta complementar para a identificação precisa de microrganismos em alimentos. Embora os métodos tradicionais de cultivo e observação microscópica forneçam informações iniciais sobre a morfologia e o comportamento das colónias, a confirmação por sequenciamento é crucial para eliminar ambiguidades e fornecer uma identificação taxonómica inequívoca [94]. 4.2.4 Inoculação em açúcar amarelo Após o isolamento e identificação da levedura Z. rouxii , foi possível um pequeno teste de inoculação dessa levedura em amostras de açúcar amarelo sem alterações de pigmentação visíveis. Após 21 dias de incubação a 30 ºC, observou-se a formação de pequenas manchas 56 brancas nas zonas de inoculação. (Figura 13) Isto permite deduzir que possivelmente a presença da levedura esteja relacionada com a formação das manchas brancas no açúcar. Além deste teste, fez-se também um teste preliminar onde se colocou pequenas gotas de água espalhadas por uma placa de petri , posteriormente isolada, contendo açúcar amarelo. Deste teste, resultou que no período de vários meses não se observou a formação das tais manchas. Daí resulta que uma conclusão a tirar é que as manchas formam-se pela presença da levedura e não apenas pela presença de água (humidade). Contudo, seria necessário repetir este experimento com mais rigor científico, para se retirar uma conclusão mais bem fundamentada. Figura 13 - Fotografia representativa das manchas brancas que surgiram nas amostras de açúcar amarelo inoculado com gotas de uma solução da levedura Zygosaccharomyces rouxii, ao fim da incubação por 21 dias. Uma das hipóteses colocadas era que Z. rouxii poderia estar a utilizar compostos da reação de Maillard presentes no açúcar amarelo, como fonte de azoto, uma vez que não se detetou a presença de proteína no açúcar amarelo. Estes compostos, que incluem as melanoidinas, formam-se pela reação de aminoácidos da matéria-prima e os açúcares redutores a temperaturas elevadas durante o processo de fabrico do açúcar [95]. Estudos na literatura indicam que algumas leveduras, como o caso da Saccharomyces cerevisiae , são capazes de metabolizar fontes não tradicionais de azoto em condições limitadas de nutrientes [96]. Não havendo informação em específico sobre Z. rouxii , mas dada a semelhança com a espécie Saccharomyces , mantêm-se a importância de aprofundar o estudo no sentido de analisar esta hipótese explicativa para o surgimento das manchas brancas no açúcar amarelo. 63 028X-46.2.135. [34] L. R. Beuchat et al. , «Low--Water Activity Foods: Increased Concern as Vehicles of Foodborne Pathogens», J. Food Prot. , vol. 76, n.o 1, pp. 150–172, jan. 2013, doi: 10.4315/0362-028X.JFP-12-211. [35] A. López-Malo e S. M. Alzamora, «Water Activity and Microorganism Control: Past and Future», em Water Stress in Biological, Chemical, Pharmaceutical and Food Systems , G. F. Gutiérrez-López, L. Alamilla-Beltrán, M. Del Pilar Buera, J. Welti-Chanes, E. Parada-Arias, e G. V. 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Anexo 1.2 - Gráfico de varrimento de absorvância na zona do visível (375 a 800 nm) da amostra B ao longo do tempo (9 semanas). 0 0,5 1 1,5 2 2,5 370 470 570 670 770 Absorvância Comprimento de onda Amostra A 1ª leitura 2ª leitura 3ª leitura 4ª leitura 5ª leitura 6ª leitura 7ª leitura 8ª leitura 9ª leitura 0 0,5 1 1,5 2 370 470 570 670 770 Absorvância Comprimento de onda Amostra B 1ª leitura 2ª leitura 3ª leitura 4ª leitura 5ª leitura 6ª leitura 7ª leitura 8ª leitura 9ª leitura 79 Anexo 6.2 - Gráfico do varrimento de absorvância na zona do visível (375 a 800 nm) da amostra B, a diferentes valores de pH. Anexo 6.3 - Gráfico do varrimento de absorvância na zona do visível (375 a 800 nm) da amostra C, a diferentes valores de pH. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 375 475 575 675 775 Absorvância Comprimento de onda Amostra B pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 375 475 575 675 775 Absorvância Comprimento de onda Amostra C pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 80 Anexo 6.4 - Gráfico do varrimento de absorvância na zona do visível (375 a 800 nm) da amostra F, a diferentes valores de pH. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 375 475 575 675 775 Absorvância Comprimento de onda Amostra F pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9