Comparação de métodos de identificação de imunoglobulinas para diagnóstico de toxoplasmose

ii DIREITOS DE AUTOR E CONDIC ! O " ES DE UTILIZAC ! A " O DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licenc!a abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condic!ões não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição CC BY iii Agradecimentos Ao Cristo , que os seus ensinamentos sejam usados para distribuir a paz e o amor. Que aqueles que utilizam seus ensinamentos para justificar barbáries, preconceitos e intolerâncias recebam o Espírito Santo. Fazei de mim um instrumento de vossa paz. A Dilza , companheira de todas as horas e grande mulher que com sabedoria se aloja no meu coração. Ser marido e pai é uma missão maravilhosa, com muitos desafios, mas que nos fazem crescer muito. Amo nossa família. Vocês são a razão de viver e dá sentido à minha existência. Te amo! Maria Alice , estrela singular. “Não sei se o mundo é bom, mas ele ficou melhor quando você chegou” e “tudo ficou mais lindo”. O Raman e o FTIR, às vezes, se confundiam com a casa das bonecas. Você me ensinou um amor incondicional. Percebi que amor se dá sem se pedir nada em troca. Com você tenho me redescoberto, tenho aprendido a viver. Te amo! Gabriel , o sorriso dos céus. Sua chegada completou nossas vidas com mais alegria e amor e deu-me a ideia de que era possível aumentar o amor que já existia e de repente senti como se a minha vida já não me pertencesse. Senti a alma cheia de amor e o meu coração fora de mim. Te amo! Mainha , minha Lady Laura. Foram inúmeras as vezes que parei esta tese para lembrar de ti, agradecendo de forma silenciosa tudo que me ensinou. Você partiu para outro mundo, mas deixou em mim um universo de amor e nos momentos mais felizes sinto a tristeza da sua ausência. Um dia nos abraçaremos de novo. Painho , levarei sempre comigo sua determinação e coragem para enfrentar os obstáculos da vida. Sei que posso contar contigo em todas as situações, nos momentos fáceis e nos difíceis. Christianne e Trébia , uma irmã também é metade de nós, sem vocês não sou nada e com vocês sou tudo. A vida entre irmãos é construir diariamente uma amizade verdadeira e eterna. Vinícius , você não é meu filho, mas é um sobrinho tão especial para mim que mais parece irmão de Maria Alice e Gabriel. Te amo. Aos que já partiram: tia Marlene, tio José Reis, vovó Zefa, Vovô Antônio Alexandre, vovô Damião, vovó Nega e tia Maria Neuza . A lembrança de vocês continua viva. Minha saudade é um sentimento que não partiu e ocupa muito espaço em meu coração, parecendo que ele fala pelos meus olhos. Aos primos e amigos , peças fundamentais para a conclusão deste trabalho. Os melhores amigos não precisam demonstrar sua amizade, porque a ligação está à vista de todo mundo. A professora Mariana Henriques , orientadora que soube ensinar, cativar e motivar. Uma boa professora é aquela que inspira seus alunos a aprender e os ensina a pensarem por si. Ao amigo Vimaranense , Felipe Felix : esta tese deu resultados antes de ser produzida. Sua amizade ficará eterna e sempre que retornar a Guimarães iremos gritar para incentivar o poderoso Vitória. Ao IFRN , Instituição que investe e aposta em seus servidores. Local de trabalho que tenho grande satisfação em lecionar. Ministro as aulas como se fosse para meus filhos. Aos meus alunos , também dedico este trabalho. O conhecimento produzido aqui será amplamente utilizado por vocês. iv DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plagio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. v Comparação de métodos de identificação de imunoglobulinas para diagnóstico de toxoplasmose Resumo O Toxoplasma gondii é um protozoário de grande abrangência, causador da toxoplasmose. Possui grande impacto na saúde pública, pois é preocupante em pacientes Imunodeprimidos, com distúrbios psiquiátricos e principalmente em gestantes, podendo causar sequelas irreversíveis para o feto ou causar aborto. A epidemiologia da toxoplasmose apresenta seroprevalências diversificadas, dependendo de hábitos alimentares e da qualidade da água. A interpretação da sorologia é importante para que os possíveis danos da infecção sejam sanados. Os diferentes métodos de diagnóstico da toxoplasmose existentes no mercado possuem sensibilidade e especificidade variáveis, sendo da responsabilidade dos profissionais de saúde a escolha do melhor método. No entanto, a busca por métodos mais eficazes e com melhor resposta, sendo também economicamente mais viáveis. Assim, esta pesquisa teve como objetivo principal a utilização de duas técnicas espectroscópicas (Raman e FTIR - Fourier Transform infrared) para a detecção de anticorpos antitoxoplasmose no sangue de pacientes, por comparação com o método tradicional de ECLIA ( eletroquimioluminescência) . Além da comparação dos métodos foi também efetuado um perfil epidemiológico da população de modo a identificar os fatores que são responsáveis pela distribuição da doença na região estudada. Foi também realizado um estudo económico de comparação dos testes. Um total de 400 amostras foram coletadas em um laboratório de análises clínicas da cidade de Natal (Brasil) e estas foram preparadas para posterior análise nos aparelhos e o resultado dicotômico (ausência/presença das imunoglobulinas) foi analisado por estatística multivariada. Nestas metodologias foram obtidos espectros específicos, baseados em mudanças nas bandas através da transformação das moléculas para ambos os anticorpos (IgG/IgM). Foram utilizados métodos estatísticos para avaliar a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo, índice Kappa, curva ROC, regressão logística binária e verossimilhança positiva e negativa, além da relação custo - efetividade dos métodos espectrofotométricos testados, por comparação com o ECLIA. Analisando os resultados da epidemiologia verificou-se que as variáveis faixa etária, sexo e conhecimento da doença são fatores de risco para a presença de IgG. A curva ROC estimada para o modelo foi de 0,614, indicando que o modelo prediz corretamente o resultado para IgG em 61,4% dos casos. O perfil sorológico, pela medição do ECLIA, dos pacientes analisados permitiu identificar suscetibilidade ao T. gondii de 35%. As amostras detentoras da IgG obtiveram a frequência de 65%. A partir dos resultados dos espectros produzidos por Raman e FTIR, gerou-se um resultado dicotômico (Positivo/Negativo) para as amostras onde foram realizadas as análises estatísticas. Encontraram diferenças espectrais em faixas específicas, evidenciando mudanças estruturais nas moléculas presentes nas amostras, utilizando ambos os métodos. Com relação a detecção de IgG, o Raman apresentou resultado satisfatório em todas as variáveis estatísticas (IC 95%). O desempenho na detecção de IgM apresentou bom resultado na variável especificidade e Valor Preditivo Negativo (VPN). O FTIR apresentou desempenho abaixo do Raman tanto na detecção de IgG, quanto na de IgM. A avaliação econômica das técnicas identificou o Raman como a técnica de melhor custo efetividade, por conta de sua sensibilidade na detecção de IgG e IgM e melhor custo minimização, ou seja, o custo sem levar em consideração o valor efetivo da técnica (custos e detecção de IgG/IgM). De um modo global, os resultados demonstram que a espectroscopia Raman tem maior potencial de ser aplicado in vitro para classificar as imunoglobulinas de interesse, possuindo vantagens em relação ao FTIR. O Raman pode ser usado para complementar ou substituir o teste ECLIA, tornando-se uma ferramenta clínica importante e mais económica que permite atuar na triagem sorológica da população com relação a toxoplasmose. Palavras-chave: Epidemiologia. Espectrofotometria. Imunoglobulinas. Toxoplasma. vi Comparison of identification methods of immunoglobulins for diagnosis toxoplasmose Abstract Toxoplasma gondii is a large protozoan, which causes toxoplasmosis. It has a great impact on public health, specially in immunosuppressed patients, patients with psychiatric disorders, and in pregnant women that may cause irreversible sequelae to the fetus or cause abortion. The epidemiology of toxoplasmosis presents diverse seroprevalences, depending, for instances, on dietary habits and water quality. Interpretation of serology is important, so that possible damage from infection is remedied. The different methods of diagnosis of toxoplasmosis in the market have variable sensitivity and specificity, and health professionals are responsible for choosing the most appropriate method. However, the search for more effective methods, with better response, being also economically viable. Thus, the main objective of this research was the use of two spectroscopic techniques (Raman and FTIR - Fourier transform infrared) for the detection of antitoxoplasmosis antibodies in the blood of patients, by comparison with the traditional method of ECLIA (electrochemiluminescence). In addition to the comparison of the methods, an epidemiological profile of the population was also carried out in order to identify the factors that are responsible for the distribution of the disease in the studied region. An economic study comparing the tests was also carried out. A total of 400 samples were collected in a clinical laboratory in the city of Natal, Brazil, and these were prepared for later analysis by the different methods and the dichotomous result (absence / presence of immunoglobulins) was analyzed by multivariate statistics. In these methodologies specific spectra were obtained, based on changes in the bands through the transformation of the molecules for both antibodies (IgG/IgM). Statistical methods were used to evaluate the sensitivity, specificity, positive and negative predictive value, Kappa index, ROC curve, binary logistic regression and positive and negative likelihood, as well as the cost - effectiveness of the spectrophotometric methods tested, in comparison with ECLIA. Analyzing the results of epidemiology, it was verified that the variables age, sex and knowledge of the disease are risk factors for the presence of IgG. The estimated ROC curve for the model was 0.614, indicating that the model correctly predicts the IgG result in 61.4% of the cases. The serological profile, through the ECLIA measurement, of the patients analyzed allowed the identification of susceptibility to T. gondii of 35%. IgG samples had a frequency of 65%. From the results of the spectra produced by Raman and FTIR, a dichotomous result (Positive / Negative) was generated for the samples where the statistical analyzes were performed. It were found spectral differences in specific bands, evidencing structural changes in the molecules present in the samples, using both methods. Regarding IgG detection, Raman presented satisfactory results in all statistical variables (95% CI). The performance in the detection of IgM showed good results in the variable specificity and Negative Predictive Value (NPV). FTIR presented lower performance in compared to Raman in the detection of both IgG and IgM. The economic evaluation of the techniques identified Raman as the most cost-effective technique, due to its sensitivity in the detection of IgG and IgM and better cost minimization, that is, the cost without taking into account the effective value of the technique (costs and detection IgG / IgM). In conclusion, the results demonstrate that Raman spectroscopy has a greater potential to be applied in vitro to classify the immunoglobulins of interest, having advantages over FTIR. Raman can be used to supplement or replace the ECLIA test, making it an important and cost-effective clinical tool that allows the population to perform serological screening for toxoplasmosis. Keywords : Epidemiology. Immunoglobulins. Spectrophotometry. Toxoplasmosis. vii Indice Agradecimentos ................................................................................................................. iii ! Resumo .............................................................................................................................v ! Abstract ............................................................................................................................ vi ! Lista de abreviações ........................................................................................................... ix ! Lista de equações ............................................................................................................... x ! Lista de figuras ................................................................................................................... x ! Lista de tabelas .................................................................................................................. xi ! Capítulo 1 – Estado da arte ............................................................................................... 14 ! 1.1!Introdução ..................................................................................................................... 15! 1.2!Agente etiológico ........................................................................................................... 15! 1.3!Ciclo de vida e morfologia .............................................................................................. 16! 1.4!Diversidade genética do T. gondii ................................................................................... 21! 1.5!Epidemiologia ................................................................................................................ 22! 1.5.1!Brasil ................................................................................................................ 23! 1.5.2!Portugal ............................................................................................................ 24! 1.5.3!Outros países .................................................................................................... 26! 1.6!Transmissão .................................................................................................................. 31! 1.7!Quadro clínico ............................................................................................................... 33! 1.7.1!Toxoplasmose em imunocompetentes ............................................................... 33! 1.7.2!Toxoplasmose em imunodeprimdos ................................................................... 35! 1.7.3!Toxoplasmose congênita ................................................................................... 35! 1.8!Prevenção e tratamento ................................................................................................. 36! 1.9!Interação com o hospedeiro........................................................................................... 38! 1.9.1!Resposta imune do hospedeiro .......................................................................... 38! 1.9.2!Estrutura e algumas propriedades de classes e subclasses de imunoglobulinas IgG e IgM .............................................................................................................. 40! 1.10!Métodos de diagnóstico da toxoplasmose ....................................................................... 43! 1.10.1!Reação em cadeia da polimerase ...................................................................... 48! 1.10.2!Reação de Aglutinação por Imunoabsorção ........................................................ 48! 1.10.3!Hemaglutinação Indireta.................................................................................... 49! 1.10.4!Reação de Sabin e Feldman .............................................................................. 49! 1.10.5!Ensaios imunoenzimáticos ................................................................................ 49! 1.10.6!Ensaios de quimiluminescência ......................................................................... 50! 1.10.7!Imunofluorescência indireta ............................................................................... 50! 1.10.8!Teste de aglutinação em látex ............................................................................ 50! viii 1.10.9!Teste de avidez de IgG no soro .......................................................................... 50! 1.10.10 Western blot ..................................................................................................... 51! 1.10.11 Método de Eletroquimioluminescência .............................................................. 51! 1.10.12 Avaliação econômica das técnicas .................................................................... 52! 1.11!Métodos espectrofotométricos de diagnóstico ............................................................... 54! 1.11.1!Espectroscopia Raman ...................................................................................... 58! 1.11.2!Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) ................. 65! Capítulo 2 – Objetivos e estrutura da tese ........................................................................... 70 ! 2.1!Objetivo geral ................................................................................................................ 71! 2.2!Objetivos específicos ..................................................................................................... 72! Capítulo 3 – Materiais e métodos ....................................................................................... 73 ! 3.1!Teste de ECLIA .............................................................................................................. 74! 3.2!Espectroscopia FTIR ...................................................................................................... 75! 3.3!Espectroscopia Raman .................................................................................................. 75! 3.4!Bioestatística associada aos exames diagnósticos .......................................................... 75! 3.5!Avaliação econômica dos métodos diagnósticos ............................................................. 81! Capítulo 4 – Resultados e discussão .................................................................................. 83 ! 4.1!Perfil epidemiológico...................................................................................................... 84! 4.2!Avaliação dos métodos alternativos de diagnóstico ......................................................... 89! 4.2.1!Análise dos espectros de FTIR ........................................................................... 89! 4.2.2!Análise dos espectros de Raman ....................................................................... 91! 4.2.3!Comparação estatística dos métodos de diagnóstico .......................................... 93! 4.3!Avaliação económica dos métodos de diagnóstico ........................................................ 101! Capítulo 5 – Conclusões ................................................................................................. 103 ! 5.1!Propostas de trabalho futuro ........................................................................................ 107! Referencias ................................................................................................................... 109 ! Anexo ........................................................................................................................... 143 ! Anexo 1 – Aprovação CEP ................................................................................................... 144! Apêndices ..................................................................................................................... 147 ! Apêndice 1 – Termo de consentimento livre e esclarecido – TCLE ....................................... 148! Apêndice 2 – Termo de confidencialidade ........................................................................... 152! Capítulo 1 – Estado da arte 15 1.1 Introdução A toxoplasmose é uma zoonose que se caracteriza por ser uma doença de ampla diversidade geográfica e de hospedeiros, incluindo várias espécies de mamíferos e aves (Tenter et al., 2000), causada pelo Toxoplasma gondii. Estudos de prevalência apontam para um elevado número de infectados, tanto em humanos como em animais, contudo, a fase grave desta doença não se apresenta na mesma proporção (Dubey & Beattie, 1988). Na maioria dos casos, a toxoplasmose é assintomática e em outros, pode causar danos graves ao indivíduo, principalmente em recém-nascidos e em indivíduos imunossuprimidos. Esta parasitose pode ser adquirida por fonte direta ou indireta isto é, pela aquisição do patógeno sem interferência de veículo de transmissão ou pela transferência do agente etiológico através de propagadores animados ou inanimados (Simões et al., 2015). 1.2 Agente etiológico O T. gondii é um parasita intracelular obrigatório do reino Protoctista, sub-reino Protozoa, Filo Apicomplexa, classe Sporozoea, família Toxoplasmatinae, ordem Coccidia, ciclo de vida heteroxeno (seu desenvolvimento acontece em dois hospedeiros de espécies diferentes) e eurixeno (vivem em diferentes hospedeiros). Este parasita é responsável por um alto índice de infecção, atingindo cerca de um terço da população mundial (Meroni & Genco, 2008), e alcançando de 10 a 50% de prevalência em alguns países. Esta zoonose é considerada de grande distribuição (Silva et al., 2003), podendo o parasita ser encontrado em diferentes exsudados de animais infectados (Dubey et al., 1995). Os parasitas do filo Apicomplexa desencadeiam várias patologias humanas importantes. Como eucariontes, eles compartilham uma série de características e caminhos celulares com suas respectivas células hospedeiras (Latr et al., 2017). Estudos feitos em roedores, por Nicolle e Manceaux em 1909 (Nicolle & Manceaux, 1909), na África do Sul, foram determinantes para o estudo da biologia do parasita, que foi inicialmente denominado de Leishmania gondii , recebendo posteriormente a nomenclatura atual. Simultaneamente, no Brasil, Splendore, em 1908, identificou o parasita em um coelho no estado de São Paulo (Splendore, 1908). Apesar do isolamento do agente ter ocorrido no início do século, apenas na década de 70 foram descritas a sua natureza coccidiana, bem como seus hospedeiros definitivos e intermediários (Frenkel et al., 1970). Em 1923, foi relatado um caso de infecção de retina, numa criança com hidrocefalia e microftalmia, com T. gondii (Janku, 1923). Mas a associação entre hidrocefalia e toxoplasmose só ocorreu cinco anos após, com os trabalhos de Levaditi (1928). Em 1937, um caso de toxoplasmose Capítulo 1 – Estado da arte 16 infantil foi relatado em associação a encefalite granulomatosa, afirmando que o T. gondii era o agente causador da doença (Dubey, 2009b). O primeiro caso de toxoplasmose contraída por um jovem adulto foi descrito por Pinkerton e Weinman (1940). Somente em 1948, 40 anos depois da observação de Splendore sobre o protozoário que desencadeia a toxoplasmose, foi obtido o teste sorológico mais específico para toxoplasmose humana, o “dye test” (Tenter et al., 2000). Os avanços nos estudos sobre o T. gondii foram intensificados entre 1983 e 2008, quando se descobriu a biologia parasitária do protozoário (Ferguson, 2009). Os avanços nos estudos da genética dos parasitas proporcionaram aos cientistas o conhecimento necessário para entender o comportamento do T. gondii (Soete et al., 1993), suas manifestações clínicas (Dubey, 2009a) e o seu diagnóstico laboratorial (Boothroyd, 2009). A descrição sobre a infecção congênita ocorreu nos Estados Unidos da América por Wolf & Cowen (1937), ao relatar a existência do T. gondii em lesão do sistema nervoso central de uma criança falecida com um mês de vida. 1.3 Ciclo de vida e morfologia A Figura 1 ilustra, de forma resumida, o ciclo da doença. A fase sexuada ocorre no epitélio do intestino de felídeos que excretam oocistos em suas fezes (esporozoítos infectantes) (Hutchison, 1965). Os felídeos são infectados ao ingerir o hospedeiro intermediário (roedores e outros animais) com Toxoplasma e isso faz com que eles eliminem oocistos imaturos nas suas fezes. A fase assexuada ocorre fora do intestino e acomete animais homeotérmicos (Dubey, 1994; Luzon et al., 1997). A alta infectividade do parasita decorre da sua inespecificidade, já que pode se propagar em qualquer célula nucleada, multiplicando-se por cissiparidade (bipartição) e endodiogenia sob as formas de taquizoítos (forma de multiplicação rápida) e bradizoítos (forma de multiplicação lenta), estes últimos no interior dos cistos tecidulares (Luzon et al., 1997; Meireles, 2001). As organelas são típicas de outros grupos Apicomplexa: conóide, anel polar, microtúbulos subpeliculares, roptrias, micronemas e grânulos densos (Neves et al., 2011). Capítulo 1 – Estado da arte 17 Figura 1 - Ciclo biológico do T. gondii (Neves et al., 2011) O T. gondii apresenta uma diferenciação em sua morfologia e esta depende do habitat e do estágio evolutivo em que o parasito se encontra, possuindo três estágios: taquizoítos (Figura 2), bradizoítos (Figura 3), contidos em cistos tecidulares, e esporozoítos localizados em oocistos esporulados, todas infectantes, seja no hospedeiro intermediário ou definitivo (Acha & Szyfres, 1987; Dubey, 1986, 1998). Capítulo 1 – Estado da arte 18 Figura 2 - Imagem de taquizoítos de T. gondii - é possível distinguir núcleo e citoplasma e o microrganismo lembra um plasmócito em miniatura, sendo o núcleo excêntrico (Retirado de UFRGS, 2018) Através da circulação sanguínea/linfática, os taquizoítos podem albergar células nucleadas presentes no organismo (Wong & Remington, 1993), sendo responsáveis pelos sinais clínicos característicos da doença (fase aguda). Os taquizóitos possuem forma arqueada, onde uma extremidade é afilada e outra é arredondada. Esta é a forma mais sensível do parasita, sendo vulnerável às condições ambientais como: suco gástrico, temperatura e osmose (Neves, 2016), mas é a forma que possui mais importância epidemiológica, por ser transmitida verticalmente (na gestação). A fase crônica da doença é caracterizada pela formação de bradizoítos (Figura 3) envolvidos por uma parede cística, sendo a formação característica localizada principalmente no cérebro, músculos e retina (Dubey et al., 1970). Os bradizoítos são formas resistentes a algumas intempéries, como: resfriamento a 4°C por 30 dias e a ação de enzimas proteolíticas. Contudo, quando submetidas a congelamento de -20°C, aquecimento a mais de 65°C e radiação ionizante, são inteiramente destruídos (Amato-Neto, 1995; Dubey, 1986; Kotula et al., 1991; Neves, 2016). Capítulo 1 – Estado da arte 19 Figura 3 - Imagem de cisto tecidual contendo bradizoítos de T. gondii (Retirado de UFRGS, 2018) Dentro do cisto, os bradizoítos são imunologicamente inertes e não são eliminados pelo sistema imune do hospedeiro. Esses cistos se formam com o início da resposta imune do hospedeiro, sendo uma forma de proteção do parasito. Têm alta afinidade pelo tecido muscular, especialmente músculo cardíaco, sistema nervoso central e retina, pois, nestes locais, o acesso dos anticorpos é restrito, podendo ser encontrados cistos em outros órgãos e tecidos dos hospedeiros, como fígado, pulmões e rins (Dubey, 1998; Hartley & Munday, 1974; Norsworthy, 2018). A localização e número de cistos nos animais vai depender do hospedeiro e da cepa de T. gondii . Na maioria dos mamíferos (bovinos, gatos, ovinos e cabras), os cistos se localizam preferencialmente no tecido muscular e menos frequentemente no cérebro (Dubey, 1998). As transformações morfológicas do T. gondii e reativação de cistos teciduais têm merecido destaque, já que a mudança de taquizoíto para bradizoítos e vice-versa é a chave para o sucesso da infecção (Bohne et al., 1995; Gross et al., 1996). Os oocistos (Figura 4), são as formas de resistência encontradas nas fezes do hospedeiro definitivo (Dubey et al., 1970). O protozoário secreta uma parede resistente (parede cística) que o Capítulo 1 – Estado da arte 20 protegerá quando estiver em meio impróprio ou em fase de latência. Os oocistos não esporulados são esféricos ou subesféricos e os esporulados são subesféricos ou elípticos (Dubey & Frenkel, 1998). O período de incubação (exposição de um animal a um organismo patogénico e a manifestação dos primeiros sintomas da doença) varia de 10 a 23 dias após a ingestão de carne malcozida e de 5 a 20 dias após ingestão de oocistos (Jones et al., 2001). A hipersensibilidade ou à ação do próprio parasita causa intensa destruição de tecidos do hospedeiro. Figura 4 - Oocistos de T. gondii , forma excretada nas fezes de felinos (Dubey et al., 1998) Apesar do ciclo do T. gondii ser conhecido desde a década de 1960, ainda existem aspectos que devem ser esclarecidos (Bastien, 2002; Freyre et al., 1999), como a compreensão molecular do crescimento do parasita, dos mecanismos de saída da célula hospedeira e o conhecimento da manipulação do hospedeiro pelo parasita. Capítulo 1 – Estado da arte 21 1.4 Diversidade genética do T. gondii Inicialmente acreditava-se que o T. gondii fosse um organismo de estrutura genética clonal, por conta da não obrigatoriedade de reprodução sexuada, dificultando sua variabilidade genética, do curto período de produção de gametócitos nos felídeos e pela resposta imune eficiente de seus hospedeiros. Dados indicam que a América do Sul pode ter sido o berço do T. gondii , pois tem a maior diversidade de cepas de qualquer região já examinada (Lehmann et al., 2006). Uma análise da variabilidade genética de T. gondii , no Brasil, possibilitou a identificação de 48 genótipos, ocorrendo maior diversidade genética neste país do que ocorre na América do Norte e Europa (Pena et al., 2008). Várias técnicas moleculares têm sido utilizadas objetivando o estudo dessa diversidade genética entre diferentes isolados de T. gondii como a análise isoenzimática (Cristina et al., 1995; Dardé, 1996), amplificação aleatória do ADN polimórfico (RAPD) (Ferreira et al., 2004; Guo & Johnson, 1995, 1996), análise de microssatélites (Ajzenberg et al., 2002; Ajzenberg et al., 2005; Ferreira et al., 2004) e polimorfismo por tamanho de restrição (RFLP) (Carneiro, 2011; Cavalcante et al., 2007; Cristina et al., 1995; A. de M. Ferreira, Vitor, Gazzinelli, & Melo, 2006; Howe & Sibley, 1995). Os estudos genotípicos de T. gondii foram baseados na análise de isoenzimas e em marcadores de genotipagem de comprimento de fragmentação de restrição de PCR (RFLP), sendo posteriormente adicionada novos marcadores para ser uma melhor ferramenta para estudos filogenéticos (Demar et al., 2007). Estudos realizados na década de 80 permitiram identificar cepas do T. gondii em virulentas e baixa virulência (Johnson, 1997). As três linhagens genéticas do T. gondii encontradas na Europa e América do Norte foram resultado de cruzamentos gênicos entre indivíduos altamente similares, dando origem a progênie clonal (Boyle et al., 2006). Não é raro encontrar cepas diferentes no mesmo continente ou em continentes diferentes, pois a expansão de genótipos idênticos pode ser explicada pela ação do homem (migração e emigração) e por outros reservatórios do parasita - aves migratórias, por exemplo (Mercier et al., 2010). Dados recentes mostraram que cepas africanas e americanas compartilham um antepassado, apoiando a hipótese da migração de T. gondii em navios junto com gatos e roedores durante o tráfico de escravos nos séculos 18 e 19 (Mercier et al., 2010). Curiosamente, os isolados sul-americanos são diferentes dos isolados norte-americanos, ocorrendo a diversidade alélica estimada em 10 milhões de anos (Mercier et al., 2010). O T. gondii possui genoma nuclear e organelar. Seu ADN nuclear contém aproximadamente 65 Mb (mega pares de bases de nucleotídeos) e o mitocondrial conta com peso molecular de apenas 6 kb (Sibley & Ajioka, 2008). Seus 14 cromossomos variam em tamanho de aproximadamente 2 Mb a mais Capítulo 1 – Estado da arte 22 de 6 Mb com frequência de recombinação baixa, mantendo um genoma nuclear conservado, apesar da grande variedade de hospedeiros e do ciclo sexuado não obrigatório (Ferreira & Vitor, 2014). O conhecimento da estrutura populacional de T. gondii é de grande importância na saúde pública e na clínica médica, pois há correlação entre o genótipo do parasita e a manifestação da doença (produção de marcadores de definam o prognóstico da toxoplasmose), levando a um tratamento adequado aos pacientes. O curso clínico da toxoplasmose congênita difere em países da Europa e nos Estados Unidos, quando comparados com a América do Sul (Ferreira & Vitor, 2014). A história evolutiva das linhagens do T. gondii ainda está sendo escrita, pois precisará de mais amostragens de diferentes continentes, e notavelmente na Ásia e Oriente Médio, local de nascimento dos felídeos. 1.5 Epidemiologia Levantamentos sorológicos mostram prevalências entre 0 e 100% em várias populações e de 4 a 100% em mulheres em idade fértil. Ao todo, foi estimado que um terço da população mundial foi exposta ao parasita (Tenter et al., 2000). As variações ocorrem pela disponibilidade de oocistos presentes no solo ou água contaminados pelas fezes de gatos e cistos existentes na carne de animais infectados (Cook et al., 2000). Estima-se que 30 a 90% da população de diferentes países tiveram contato com o protozoário. Sua epidemiologia é potencializada pela ausência, em alguns casos, de sintomas, fazendo com que seu hospedeiro espalhe os cistos. Em saúde pública os cuidados são redobrados, pois em gestantes pode causar má formação fetal. Suas altas taxas de prevalência estão distribuídas por diversas partes do mundo (Dubey, 2010), obedecendo a critérios culturais, educacionais e sanitários. Em crianças, a soroprevalência é relativamente baixa, aumentando de acordo com a idade e com a exposição a mais fatores de risco durante o transcorrer da vida (Desmonts & Couvreur, 1974; Kompalic-Cristo et al., 2005; Wong & Remington, 1994). Países da Europa, África, Caribe e América do Sul apresentam grande prevalência de infecção de T. gondii (Petersen, 2007; Zuber & Jacquier, 1995). Inquéritos sorológicos realizados entre 1999 e 2004 mostraram que 10,8% dos norte-americanos foram infectado pelo T. gondii (Jones et al., 2007). A população suscetível à infecção é variável, chegando aos 86%, sendo estimada em 1,1 milhão de casos de toxoplasmose nos Estados Unidos (Jones & Holland, 2010), obtendo óbito de 327 pacientes e 4.428 internações em decorrência do T. gondii (Scallan et al., 2011), sendo encontrada prevalência de 15,8% em outros grupos (Costa et al., 2008). Capítulo 1 – Estado da arte 23 A soroprevalência pode variar entre países, entre regiões de mesmo país e entre grupos étnicos (Ertug et al., 2005). Não há variação na prevalência entre os sexos, exceto se os hábitos culturais forem diferentes (hábitos alimentares ou dogmas religiosos) e causem diferenças significativas. A distribuição da infecção pelo T. gondii é generalizada, ocorrendo variação em alguns países. Uma baixa soroprevalência foi observada na América do Norte, Sudeste da Ásia e Norte da Europa, contrastando com países da América do Sul e África. No Sul da Europa e Norte da África ocorrem taxas moderadas em torno de 30% a 50% (Bouratbine et al., 2001; Montoya & Liesenfeld, 2004; Robert-Gangneux & Dardé, 2012). As prevalências podem ser estimadas a partir dos métodos sorológicos utilizados e existem variações ao longo do tempo (Ertug et al., 2005; Holland, 2003; Montoya & Liesenfeld, 2004). Os programas de rastreio, principalmente na Europa, têm demonstrado eficiência na diminuição de casos de infecção. Em alguns países pode ser observada uma soroprevalência de 15% a 85% na população humana (Cristo, 2005). 1.5.1 Brasil O Brasil possui áreas endêmicas com alta prevalência de soropositividade para T. gondii na população em geral e nas gestantes, com números que variam de 50 a 80% (Bahia-Oliveira et al., 2003) e alguns levantamentos evidenciaram alta prevalência de toxoplasmose congênita, toxoplasmose ocular ou títulos sorológicos de imunoglobulinas (Amendoeira et al., 2003; Andrade et al., 2001; Bahia-Oliveira et al., 2001; Borges et al., 1997; Glasner et al., 1992; Neto, 2000; Rey & Ramalho, 1999; Ricciardi et al., 1978; Souza et al., 1987). A soroprevalência encontrada no Brasil varia de acordo com a região estudada, tornando a infecção pelo T. gondii amplamente prevalente em humanos, sendo que 50% das crianças e 80% das mulheres em idade fértil têm anticorpos para esse protozoário (Dubey et al., 2012). Dados relativos a soroprevalência afirmam que 0,3 a 1,96/1.000 nados vivos possuem toxoplasmose congênita. As taxas de soroprevalência de IgG em mulheres grávidas também é variável, obtendo índices de 32,4% no Rio de Janeiro a 91,6% em Mato Grosso do Sul (Figura 5) (Figueiró-filho et al., 2010). Os estudos sobre toxoplasmose na América Latina são escassos, concentrando-se em sua maioria no Brasil. No ano de 2006 foi encontrada uma prevalência de 67,7% e no ano anterior a prevalência foi de 58,8% (Beck et al., 2010). Na cidade de Recife (Brasil), foi encontrada uma prevalência de 75% de soroprevalentes de IgG em doadores de sangue, não havendo diferença significativa entre homens e mulheres e aumentando a prevalência de imunoglobulina G com o aumento da idade (Coêlho et al., 2003). Capítulo 1 – Estado da arte 24 Figura 5 - Taxas de mulheres grávidas soroprevalentes em quatro regiões do Brasil (Beck et al., 2010) A toxoplasmose é mais frequente em climas quentes e em baixas altitude, pois o parasita encontra as condições ideais que favorecem a esporulação e a sobrevivência de oocistos. As análises de soroprevalência no Brasil, quando analisadas conjuntamente, indicam taxas variadas e relativamente altas, possivelmente por conta do solo, água ou alimentação (Jones & Dubey, 2014). 1.5.2 Portugal Os primeiros estudos sorológicos foram realizados em 1979-1980, mostrando uma prevalência de 47% (Gargaté et al., 2016). Portugal é um dos países da União Europeia onde é preconizado realizar o diagnóstico laboratorial sistemático da toxoplasmose a todas as mulheres grávidas (Vilares et al., 2015). Assim, os inquéritos sorológicos nacionais deixaram de ser realizados, sendo feitos, basicamente, por estudos pontuais (Angelo, 2003; Lopes et al., 2012). A partir de 2011 foram criadas as orientações para a triagem e vigilância de gravidez, tornando uma doença de notificação obrigatória. O rastreio faz-se por rotina sorológica, quer na preconcepção, quer como parte dos cuidados pré-natais. Mulheres com imunidade documentada não necessitam repetir o rastreio sorológico da toxoplasmose, contudo, as mulheres sem histórico de rastreio devem realizar todos os exames de rotina. Todo o diagnóstico, pré e pós-natal da toxoplasmose, incluindo sorologia, PCR e inoculação no camundongo, é realizado no INSA (Instituto Nacional de Saúde). As análises dos casos de toxoplasmose adquirida são realizadas em todo o país. Outros centros realizam o rastreio em Capítulo 1 – Estado da arte 31 Tabela 3 - Casos confirmados de toxoplasmose congênita: números e taxa por 100.000 nascidos vivos, por país e ano, EU/EEA, 2011–2015 (European Centre for Disease Prevention and Control, 2018) Fonte: Relatórios de país. Legenda: S = sim, · = nenhum dado informado, ASR: taxa padronizada por idade, - = nenhuma taxa de notificação calculada , N (número), t (taxa), CC (casos confirmados), CN (cobertura Nacional), CR (casos relatados). 1.6 Transmissão De acordo com a Organização Mundial de Saúde, o T. gondii é a quarta protozoose mais importante quando o veículo de transmissão são os alimentos. No contexto europeu, a toxoplasmose é a segunda em transmissão via alimentos contaminados (Tefera et al., 2018). A contaminação de reservatórios por fezes de felinos infectados pode levar a surtos ou epidemias, envolvendo uma cidade ou mesmo uma região (FUNASA, 2002). Os materiais de transmissão como carnes e leite, são veículos importantes na epidemiologia da doença (Dubey, 1980; Dubey et al., 2009; Powell et al., 2001; Riemann et al., 1975; Skinner et al., Capítulo 1 – Estado da arte 32 1990). O alto consumo da carne (suína, caprina e de coelhos), a viabilidade dos cistos na musculatura destes animais por mais de 150 dias (Dubey et al., 1984) e a sobrevivência do T. gondii nestes cistos (Hill & Dubey, 2002), torna o consumo deste alimento, cru ou malcozido, um importante vetor de transmissão ao homem (Cademartori, 2007; Koski, 1990; Xiao et al., 2010). Estudos mostram que 30% a 63% das infecções em diferentes cidades da Europa foram atribuídos ao consumo de produtos à base de carne mal cozidas e 6% a 17% ao contato do solo (Cook et al., 2000). Além disso, os taquizoítos podem ser encontrados no leite de hospedeiros (cabras, ovelhas e vacas). O leite não pasteurizado de cabras está associado ao quadro agudo da toxoplasmose (Bonametti et al., 1997). Algumas pesquisas sugerem que a carne é mais importante do que os gatos na transmissão do parasita (Dubey & Beattie, 1988), sendo a prevalência maior da doença em trabalhadores que lidam com carnes potencialmente infectantes (Jones & Dubey, 2014). A água pode ser considerada uma importante via de transmissão para a toxoplasmose, atuando como um disseminador de oocistos para a população que venha a utilizá-la (Dias et al., 2011; Lopes et al., 2009). Trabalhadores expostos a frutas e vegetais crus não lavados sugerem que o manuseio desses produtos parece não ser um risco ocupacional importante para a infecção por T. gondii (Liesenfeld et al., 2011). O T. gondii utiliza mecanismos para potencializar sua transmissão aos felídeos: o parasita remove o medo instintivo de um rato por odores de gato e, em vez disso, gera uma atração (Berdoy et al., 2000; House et al., 2011). Acredita-se que essa mudança seja uma manipulação parasitária do comportamento do hospedeiro, devido ao requisito obrigatório para o intestino do gato na reprodução sexual do parasita. É possível que os mecanismos empregados pelo T. gondii para reduzir o medo possam fornecer uma ferramenta heurística para o manejo clínico do medo excessivo. A presença destes animais e a ingestão de salada crua aumenta em 2,6 a 3,4 vezes, respectivamente, as chances de infecção de imunossuprimidos com HIV-SIDA (Síndrome da Imunodeficiência Humana Adquirida) (Oliveira, 2016). De fato, os felinos são importantes hospedeiros do T. gondii , onde metade desta população apresenta anticorpos anti – T. gondii (Veronesi, 1991). Nos gatos, a toxoplasmose (doença) não é muito frequente quando comparada a taxa de infecção verificada nestes animais através de levantamentos sorológicos (Germano, 1985). Porém, alguns felinos podem desenvolver doença aguda. Nestes casos os sinais mais frequentemente observados incluem febre, tosse, dispneia, letargia, anorexia, vômito, diarreia e icterícia, além de alterações miocárdicas, hiperestesia muscular, alterações neurológicas e oculares Capítulo 1 – Estado da arte 33 (Lucas et al., 1998). O quadro clínico pode evoluir para a morte, principalmente se o animal não for convenientemente tratado (Germano, 1985). Há a possibilidade do ciclo do T. gondii ocorrer na ausência de felinos. Quando gatos jovens se alimentam com um hospedeiro intermediário que apresente toxoplasmose aguda ou crônica, começam a aparecer oocistos imaturos em suas fezes. O mesmo acontece se o felino se contaminar através da ingestão de oocistos esporulados. Também podem ocorrer surtos por transmissão de cistos teciduais, contidos em alimentos compostos por carne crua ou pouco cozida (Bonametti et al., 1997), sendo este alimento, o principal fator de risco para infecção com toxoplasma. A transmissão vertical da toxoplasmose é desempenhada pelos taquizoítos, no entanto, sua fragilidade às condições ambientais (temperatura, umidade e disponibilidade de alimento) o torna um parasita inócuo no que se refere a transmissão horizontal (Tenter et al., 2000). O transplante de órgãos de pacientes infectados para pacientes sem o parasita tem sido relatado como fonte de infecção (Tenter et al., 2000) já que a presença dos taquizoítos no sangue ou tecido do doador podem resultar em rompimento dos cistos presentes, contaminando as células do receptor do órgão (Cosme AlvaradoEsquivel et al., 2018; Derouin & Pelloux, 2008). A transmissão da toxoplasmose congênita ocorre por via hematogênica, sendo obrigatória a via placentária que ocorre em dias, podendo chegar à semanas até a infecção fetal (Bichara, Andrade, & Lago, 2014; Cortina-Borja et al., 2010; Wallon et al., 2013). Outras formas de transmissão, de baixo valor epidemiológico e com baixo risco de contaminação, é a falta de cuidados com a manipulação de material infectado ou acidentes laboratoriais (Barbosa et al., 2014). A capacidade de conversão de estágio agudo proliferativo causador da doença, através de taquizoítos, a um estágio crônico adormecido, na forma de bradizoítos, confere um fator crítico de transmissão e na patogênese do T. gondii (Jeffers et al., 2018). 1.7 Quadro clínico 1.7.1 Toxoplasmose em imunocompetentes A toxoplasmose adquirida é, geralmente, assintomática em 80% a 90% nos indivíduos que possuem sistema imune íntegro. A infecção no homem saudável e mulheres que não estejam grávidas não representa grandes riscos de doença. Nesses grupos os sintomas podem ser confundidos com outras doenças, apresentando febre, cefaleias e dores musculares (Mitsuka-Breganó et al., 2010). As Capítulo 1 – Estado da arte 34 manifestações clínicas da toxoplasmose podem se apresentar na forma linfoglandular, meningoencefalite, coriorretinite, pneumonite, miocardite, hepatite, miosite e erupção cutânea. Apresar da meningoencefalite estar associada aos indivíduos imunocomprometidos, já foram relatados casos em indivíduos imunocompetentes. Os distúrbios do comportamento e nível de consciência são as principais manifestações (Carvalho & Farhat, 1999). O T. gondii é associado a mudanças de comportamento humano, personalidade e outros traços fenotípicos têm sido estudados com maior profundidade, muitas vezes no contexto da teoria da manipulação, sugerindo que muitos parasitas modificam o fenótipo do hospedeiro para aumentar suas chances de transmissão, sendo considerado um modelo preferido para parasitologistas evolutivos, biólogos e também psiquiatras (Flegr, 2013). Doenças psiquiátricas, como: esquizofrenia (Al-Hussainy et al., 2015; Dickerson et al., 2014; Ebrahimzadeh, Shahraki, & Mohammadi, 2018; Fond et al., 2013; Hamidinejat et al., 2010; Kannan & Pletnikov, 2012; Mortensen et al., 2007; Torrey & Yolken, 2003), transtorno obsessivo-compulsivo (Fond et al., 2013; Miman et al., 2010), distúrbio explosivo intermitente (Coccaro et al., 2016), surtos psicóticos (Lindgren et al., 2018), depressão, bipolaridade e humor (AlHussainy et al., 2015; Duffy, 2013; Halaris & Yolken, 2018), transtorno de depressão maior (Al-Hussainy et al., 2015), agressividade e impulsividade em adultos saudáveis (Cook et al., 2015), comportamento suicidas (Coccaro et al., 2016; Lester, 2010; Ling et al., 2012; Pedersen et al., 2012) e distúrbio de ansiedade generalizada (Markovitz et al., 2015; Suvisaari et al., 2017). A afinidade do T. gondii com o sistema nervoso e sua capacidade de gerar distúrbios nervosos é uma nova frente de pesquisas para estabelecer relações entre o parasita e hospedeiro, estabelecendo uma relação que pode levar a novas matrizes preventivas e terapêuticas (Al-Hussainy et al., 2015). Outros estudos, como: provável relação com a doença de Parkinson´s (Fallahi et al., 2017; Miman et al., 2010) (Miman et al., 2010), epilepsia criptogênica (Yazar et al., 2003), correlação positiva entre anticorpos antiToxoplasma e incidências de câncer cerebral (Thirugnanam et al., 2013), doenças hepáticas (Liesenfeld et al., 2011) e associação a hérnia abdominal (Alvarado-Esquivel., 2011). As manifestações psiquiátricas podem ser explicadas através da liberação de componentes do parasita que infectam as células cerebrais e podem ter efeitos nas células circundantes e impactar o modo ou comportamento do hospedeiro (Carruthers & Suzuki, 2007; Kochanowsky & Koshy, 2018). Alguns estudos, ainda em desenvolvimento, tem associado a presença do T. gondii a esclerose múltipla (Saberi et al., 2018). As manifestações clínicas no recém-nascido representam apenas 10% das anormalidades ao exame físico, podendo apresentar um quadro generalizado. Dois terços dos fetos que apresentam Capítulo 1 – Estado da arte 35 sintomas que são localizados no sistema nervoso central e nos olhos, com microcefalia ou hidrocefalia, convulsões, microftalmia e catarata (Levi, 2014). 1.7.2 Toxoplasmose em imunodeprimdos O quadro clínico da toxoplasmose em indivíduos imunocomprometidos pode variar conforme a intensidade da imunossupressão (Avelino-Silva & Kallás, 2014). Os indivíduos imunossuprimidos, portadores de HIV ou doença debilitante, por seus mecanismos de defesas estarem comprometidos, podem sofrer danos maiores tais como, cegueira e lesões cerebrais, podendo às vezes, em casos extremos, evoluir para a morte (Kodym et al., 2015). Em indivíduos imunossuprimidos, 10% a 20% dos adultos infectados apresentam, na fase aguda da doença, as seguintes formas clínicas: linfoglandular (mais frequente), meningoencefalite, pneumonite, hepatite, miosite, erupção cutânea e retinocoroidite (Avelino-Silva & Kallás, 2014). A linfadenopatia, acompanhada de mialgia, mal-estar e febre, é a manifestação clínica mais frequente. Essas manifestações podem ser de rápida duração ou persistirem por meses. A encefalite, a miocardite e a pneumonite são manifestações típicas em imunocomprometidos. A toxoplasmose é uma doença de risco para pacientes com SIDA, ocorrendo cerca de 10% de óbitos nos EUA e até 30% na Europa (Hill & Dubey, 2002). A tabela 4 mostra as principais manifestações clínicas da encefalite por toxoplasma. Tabela 4 - Principais manifestações clínicas da encefalite por toxoplasma em pacientes imunocomprometidos (extraído de Souza & Belfort Jr, 2014) Manifestações clínicas Frequência de apresentação Cefaleia 49% - 63% Febre 41% - 68% Déficits focais 22% - 80% Convulsões 19% - 29% Confusão mental 15% - 52% Ataxia 15% - 25% Letargia 12% - 44% Alterações de pares cranianos 12% - 19% Alterações visuais 8% - 15% 1.7.3 Toxoplasmose congênita As manifestações clínicas da toxoplasmose atingem maior severidade quando adquirida de forma congênita (Beverley, 1973; Daffos et al., 1988). Existem variáveis que podem ser citadas para aumentar Capítulo 1 – Estado da arte 36 o risco de infecção, como: idade gestacional, virulência da cepa do parasita, resposta imune da mãe, permeabilidade da placenta e o tratamento pré-natal (Chaudhry et al., 2014; Dunn et al., 1999). Sua taxa de óbitos varia de 40 a 50% e os neonatos sobreviventes podem adquirir sequelas irreversíveis, como: convulsões, espasticidade, microcefalia, hidrocefalia, meningoencefalomielite, retardamento mental, coriorretinite, hepatoesplenomegalia, icterícia e erupções cutâneas (Prusa et al., 2012; Remington et al., 2006). De entre as mulheres que foram infectadas pelo T. gondii durante a gravidez, 39% vão transmitir a doença ao feto, 26% das crianças vão apresentar infecção subclínica e 13% vão desenvolver uma infecção clínica (7% de forma grave e 6% de forma moderada) (Mandai et al., 2007). A virulência do protozoário no feto é desencadeada de acordo com o período em que aconteceu a infecção. Nos três primeiros meses, a infecção pode levar a morte fetal. No segundo trimestre o feto apresenta hidrocefalia, com macro ou microcefalia (em 50% dos casos), retinocoroidite (em 90% dos pacientes com infecção), calcificações cerebrais (em 69%) e retardo mental ou perturbações neurológicas (em 60% dos casos); o recém-nascido também pode apresentar lesões iniciais como nódulos miliares disseminados por todo o encéfalo, ou em torno de focos necróticos; os ventrículos cerebrais podem estar dilatados e as lesões cerebrais podem se calcificar. Podem também ocorrer alterações, como: graus variáveis de degeneração e edema de retina, lesões vasculares da coroide, neurite óptica, microftalmo, nistagmo e estrabismo são possibilidades que podem acometer pacientes (Galván-Ramíraz & MondragónFlores, 2017). A toxoplasmose ocular congênita provoca principalmente malformação congênita, anótalos, aniridia congênita, catoratografia congênita, neurite óptica, estrabismo, ambliopia, nistagmo, atrofia óptica, defeitos do campo visual, etc. As lesões oculares originadas por infecções adquiridas ocorrem após o parto, o que resultou em destruição de tecidos e respostas inflamatórias (Zhou et al., 2011). Essas lesões, juntamente com as lesões intracranianas, são frequentes, sendo observadas em 20 a 30% dos casos aos três anos de idade. Em alguns casos sintomáticos podem ocorrer febre, cefaleia, fadiga e miocardite (Tenter et al., 2000). A sobrevivência de crianças a toxoplasmose pode gerar, na maioria das vezes, deficiência mental (Galván-Ramíraz & Mondragón-Flores, 2017). Os danos neurológicos e o comprometimento visual associados a toxoplasmose congênita são referenciados em 3% dos recém-nascidos com toxoplasmose congênita (Cook et al., 2000; Guerina et al., 1994; Lebech et al., 1999). 1.8 Prevenção e tratamento Medidas que possam diminuir a eliminação de oocistos por gatos domésticos são importantes para reduzir a transmissão da infecção para os seres humanos e outros animais (Frenkel, 1971). Para Capítulo 1 – Estado da arte 37 evitar esta transmissão propõe-se manter os gatos domésticos no interior de residências com o mínimo de contato com o meio externo, com a alimentação controlada, com a oferta de ração ou alimentos que sofreram tratamento térmico adequado (acima de 67°C) (Dubey, 1996; Tenter et al., 2000), não devendo alimentá-los com carne não cozida, vísceras ou ossos, evitando que se alimentem de animais vetores, como o rato. A viabilidade dos cistos de T. gondii em carne suína e ovina, mesmo no interior da geladeira, é um importante mecanismo de transmissão. Entretanto, tornam-se inviáveis em temperaturas abaixo de -12°C ou em temperaturas superiores da 67°C (Dubey et al., 1996). Neste sentido torna-se necessário cozinhar adequadamente estas carnes. Além disso, as mãos devem ser higienizadas após o manuseio de carnes cruas, pois os cistos poderão estar ativados. Materiais como sabão, água, álcool e desinfetantes são bons materiais para inativar estes cistos (Dubey & Foreyt, 2000). A utilização de luvas ao manusear o solo também é um fator de prevenção, já que a mesma pode estar contaminada com fezes de gatos (Kapperud et al., 1996). As estratégias preventivas devem visar reduzir prevalência de infecção na carne, expor em embalagens os métodos de cultivo e processamento e intensificar as campanhas de informações a respeito da doença em mulheres grávidas (Cook et al., 2000). Vegetais devem ser bem lavados antes da ingestão, pois podem ser infectados pelo solo contaminado com fezes de gatos. Outro método de prevenção, a triagem sorológica é um importante instrumento na profilaxia da toxoplasmose congênita, pois a partir do levantamento da sorologia, podem-se adotar medidas preventivas e terapêuticas, a fim de diminuir possíveis transmissões ao feto (Castilho-Pelloso et al., 2005). A realização de sorologias deve ser frequente, preferencialmente uma vez a cada trimestre. O primeiro trimestre da gestação é fundamental, pois pode-se identificar os casos agudos e iniciar imediatamente a administração medicamentosa com antimicrobianos. Se a infecção materna ocorrer antes da décima quinta semana de gestação, o feto possui 5% de chances de adquirir a doença ou adquiri doença menos grave. Se a infecção ocorrer no final da gravidez, o feto adquire o protozoário, não apresentando sintomas ou apresentando doença menos grave. O tratamento da toxoplasmose não tem sido modificado desde a década de 90, tendo foco em alterar o metabolismo de nucleotídeos do parasita. O mecanismo farmacológico do tratamento se dá pela combinação de fármacos que bloqueiam a síntese de ADN do parasita, pois inibem a síntese de ácido fólico nos taquizoítos do T. gondii . A terapêutica é fundamentada em uma combinação sinérgica de pirimetamina e sulfadiazina, medicamentos que promovem o bloqueio da síntese e diminuição dos Capítulo 1 – Estado da arte 38 níveis de ácido fólico nos taquizoítos (Souza, 2017) e, portanto, é um fármaco tóxico para a medula, devendo a paciente receber ácido folínico (nunca ácido fólico, que anula a ação terapêutica da pirimetamina) para prevenir alterações como neutropenia, trombocitopenia e anemia. Nos casos em que a infecção fetal não for confirmada, o tratamento com espiramicina poderá ser continuado durante toda a gestação. O tratamento específico nem sempre é indicado nos casos em que o hospedeiro é imunocompetente, exceto em infecção inicial durante a gestação ou na vigência de comprometimento de outros órgãos, como coriorretinite e miocardite. Recomenda-se o tratamento em gestantes, recémnascidos e pacientes imunodeprimidos. 1.9 Interação com o hospedeiro A função primordial do sistema imunológico humano é a defesa contra antígenos, mesmo substâncias não infecciosas podem causar processos inflamatórios. As células responsáveis por esta defesa também podem desencadear processos que causem danos teciduais em algumas situações. Todo o repertório imunológico deve trabalhar de forma conjunta e harmoniosa para que os processos de defesa obtenham sucesso. As moléculas que atuam na defesa do organismo são diversificadas e específicas, dentre elas estão as imunoglobulinas. As imunoglobulinas são moléculas de glicoproteína que são produzidas pelos plasmócitos em resposta a um imunógeno e que funcionam como anticorpos. As imunoglobulinas derivam seu nome da descoberta de que elas migram com as proteínas globulares quando soro contendo anticorpos é colocado em um campo elétrico. Na toxoplasmose, como em outras infecções por parasitas intracelulares, a proteção é assegurada principalmente pela imunidade celular, cabendo aos anticorpos um papel secundário. 1.9.1 Resposta imune do hospedeiro Os mecanismos de infecção do T. gondii acontecem em meio intracelular e podem ter tempos de permanência elevados, já que, evolutivamente, estes adquiriram a capacidade de combater as agressões desencadeadas pelo sistema imune. O sistema imunitário humano suprime grande parte das ações desenvolvidas pelos protozoários, ou seja, serão infectados apenas uma parcela de indivíduos. A permanência dos protozoários nos tecidos não causa, necessariamente, uma infecção, a não ser que o equilíbrio “resposta imune” versus “parasita” seja perdido (declínio do sistema imune ou resposta imunitária exacerbada) (Machado et al., 2004). O T. gondii expressa os antígenos de superfície (SAG), importantes nos mecanismos imunológicos (imunidade humoral), patogênicos e de invasão do parasita (Aubert et al., 2000; Capítulo 1 – Estado da arte 39 Dzierszinski et al., 2000; Alexander & Hunter, 1998; Aliberti, 2005; Denkers & Marshall, 1998)). As imunoglobulinas que participam da defesa imunológica do T. gondii são importantes na fixação de fragmentos do complemento no parasita permitindo a fusão dos lisossomos aos vacúolos parasitóforos onde estão contidos, reduzindo sua inacessibilidade dentro dos macrófagos infectados (Wyler, 1990; Hegab & Al-Mutawa, 2003). Embora com papel secundário, a imunidade humoral também colabora no controle da infecção pelo T. gondii , facilitando os mecanismos de destruição do parasita (Alexander & Hunter, 1998; Aliberti, 2005; Denkers & Marshall, 1998; Dupont et al., 2014). A ação das imunoglobulinas é dirigida especialmente ao taquizoíto, aderindo à sua membrana e dificultando sua adesão aos receptores da célula hospedeira (Hegab & Al-Mutawa, 2003). As células T atuam na mediação da resposta imunológica da toxoplasmose, induzindo, assim, a produção de células apropriadas, como as células TCD4 e TCD8. Além das células T, as células B e as imunoglobulinas IgG, IgM e IgE atuam na vigilância epidemiológica e proteção do organismo contra o parasita (Joiner & Dubremetz, 1993). Na fase inicial da infecção, a imunidade inata tem papel importante na resistência ao T. gondii . Esta resposta não específica inibe também a coinfecção do hospedeiro por microrganismos como Listeria monocytogenes , Schistosoma mansoni e certos vírus, e limita o desenvolvimento de alguns tumores. Nesta fase o parasita ativa algumas células como macrófagos, células NK, células dendríticas e neutrófilos. Essa ativação tem duas principais consequências: limita a replicação dos taquizoítos e dirige o desenvolvimento dos linfócitos Th1, ao iniciar a liberação de citocinas pró-inflamatórias, como IL-12, IFN-γ e TNF-α (Aliberti, 2005; Denkers & Marshall, 1998). A IL-12, citocina importante no desenvolvimento da resposta imune adaptativa, ativa os macrófagos e suas funções microbicidas, aumenta a produção de IFN-γ pelas células NK e dirige a proliferação dos linfócitos T CD4+ e CD8+, que produzem mais IFN-g, assumindo o perfil Th1 característico. O IFN-γ tem grande importância no controle da infecção pelo T. gondii , tanto na fase aguda como na crônica. Sua produção pelos CD4+ estimulados pela IL-12 ocorre já a partir do quinto dia de infecção (Alexander & Hunter, 1998; Aliberti, 2005). As respostas associadas às citocinas pró-inflamatórias podem ser altamente tóxicas para o hospedeiro, mas ao mesmo tempo o T. gondii estimula mecanismos de controle que modulam a resposta imunológica, diminuindo os danos e prevenindo a morte do hospedeiro, através da produção de citocinas anti-inflamatórias (como IL-10, IL-4 e TGF-β) e substâncias como óxido nítrico.. Apesar de serem de certa forma protetores, estes mecanismos subvertem a resposta imune e permitem a evolução da infecção para a fase crônica, que predispõe a reativações e serve como reservatório para eventual transmissão a outros hospedeiros. As citocinas anti-inflamatórias podem também predispor à encefalite toxoplásmica Capítulo 1 – Estado da arte 40 por diminuir o papel protetor do IFN-γ, que tem grande importância na manutenção da fase latente. Em sinergia com o TNF-α, o IFN-γ media a morte dos taquizoítos e promove sua transformação em bradizoítos, tendo também papel protetor sobre a ruptura dos cistos. Tanto os linfócitos CD8+ como os CD4+ são importantes na manutenção da latência da infecção toxoplásmica, atuando sinergicamente (Hegab & Al-Mutawa, 2003). Nas gestantes, a resposta imunológica é essencial para a manutenção da gravidez. A secreção de hormônios pela placenta (citocininas e quimiocininas) atua na tolerância materna frente ao feto e sua participação ativa na regulação da resposta imune sistêmica. O aumento da produção de alguns hormônios na circulação da gestante influencia a modulação da resposta imune: a progesterona inibe a produção de IL-12, FNT-α e NO pelo macrófagos, aumenta a produção de IL-10, reduz a atividade das células NK, inibe a resposta do tipo Th1 e estimula a Th2 (Pfaff et al., 2007). 1.9.2 Estrutura e algumas propriedades de classes e subclasses de imunoglobulinas IgG e IgM A alta afinidade que possui o anticorpo e o antígeno é determinada precisamente pela formação de pontes de hidrogênio, interações eletrostáticas, forças de Van der Waals e interações hidrofóbicas. Os domínios, na metade carboxiterminal, chamados de domínios C (constantes), são típicos de cada espécie e participam na regulação da resposta imunológica, representando cerca de 90% da massa total do anticorpo. Esta divisão é que determina o papel bifuncional dos anticorpos: uma fração da molécula intervém na união específica com o antígeno, enquanto que a outra é responsável pela união dos tecidos e moléculas do hospedeiro, incluindo diversas células do sistema imunológico (Nunes, 2005). A ativação de distintas funções biológicas depende das diferentes cadeias pesadas que possuem as imunoglobulinas, o que lhes confere uma classificação segundo a estrutura dessas cadeias. A fase aguda em indivíduos imunocompetentes é caracterizada pela produção de IgM e, posteriormente, ocorre a produção de IgG. Se a infecção for adquirida pela via oral, a imunoglobulina produzida será a IgA (mais comum em secreções, decai mais rapidamente que o IgM e o IgG e na maioria das vezes não é possível sua detecção). Dependendo da técnica utilizada para quantificar essas imunoglobulinas, os anticorpos IgM podem ser dosados entre uma e duas semanas após o início da infecção, ocorrendo alta produção em até oito semanas, quando decrescem. Títulos baixos podem persistir por mais de doze meses. O anticorpo IgG persiste por toda a vida na maioria dos pacientes (Cantos et al., 2000), sendo uma marcador sorológico de fase crônica, ou seja, pode ser detectado a qualquer tempo, e sua alta quantidade no plasma sanguíneo facilita a identificação em testes diagnósticos. O IgM é a principal imunoglobulina de resposta primária aos antígenos, sendo utilizado Capítulo 1 – Estado da arte 47 Os diagnósticos in vitro , mais danosos aos pacientes, como a biopsia, podem detectar a presença de taquizoítos (Hill & Dubey, 2002), indicando uma infecção ativa, ou cistos teciduais, no caso de infecção latente. No caso de autopsias, o parasita, por depender do mecanismo celular do hospedeiro, pode não ser encontrado, já que o tecido do parasitado está em degeneração (Dubey, 2010). Outra forma de diagnosticar a toxoplasmose pode ser a associação, aos exames sorológicos, com o diagnóstico molecular, o qual busca detectar o ADN do T. gondii em amostras biológicas. Como exemplo, pode ser associada à sorologia a técnica de reação em cadeia da polimerase – PCR (Carneiro, 2011), pois o ADN do agente parasita é a prova concreta de sua presença no hospedeiro (Singh, 1997). O bioensaio em animais susceptíveis à doença é uma alternativa para indicar a viabilidade do parasita (Silveira, 2009). O desenvolvimento de novos instrumentos com bases científicas, bem como a eficácia, a qualidade e o custo-benefício dessas técnicas, torna-se necessário para a melhoria da qualidade de vida da população. As técnicas verificadas neste estudo buscam atender a comunidade médica que anseia por instrumentos que atestem uma grande sensibilidade/especificidade e afastem os resultados falso positivos e falso negativos. A toxoplasmose possui baixa parasitemia durante a infecção, mesmo na fase aguda, permitindo aos testes sorológicos identificar a imunidade do indivíduo (fator mais evidente). Os testes disponíveis não obedecem a protocolos únicos para a detecção de estágio da doença (aguda/crônica), forma infectante (taquizoíto, cisto e bradizoítos) e o tipo de cepa (I, II e III e/ou recombinantes). A junção de protocolos possibilitaria o acompanhamento e tratamento mais adequados para cada indivíduo. As cepas do T. gondii podem gerar respostas específicas, causando diferença na cinética da infecção e sintomatologia. Essas informações são especialmente importantes quando o indivíduo infectado faz parte de um dos grupos de riscos para a toxoplasmose (gestantes e/ou portadores do HIV) (Lopes et al., 2016). Cepas tipo I têm sido encontradas em pacientes com doenças congênitas; as cepas tipo II tem sido isoladas de pacientes imunocomprometidos com reativação da infecção crônica; as cepas do tipo III, em sua maioria, têm sido isoladas de animais. O uso de antígenos totais de T. gondii compromete a especificidade dos testes, pois o protozoário possui epítopos comuns com organismos filogeneticamente relacionados. Desta forma, estudos utilizando alvos antigênicos mais específicos têm sido uma tônica de trabalho na área, incluindo aí antígenos purificados, recombinantes ou sintéticos (Lopes et al., 2016). Em indivíduos imunocomprometidos os testes diagnósticos possuem parâmetros diferencias, como: aparecimento de linfoma primário do sistema nervoso central, abscessos bacterianos, tumores primários e metastáticos e doenças vasculares (Pereira-Chioccola et al., 2009). A produção de antígenos excretórios/secretórios pelos taquizoítas e as bandas oligoclonais de IgG no líquido cefalorraquidiano Capítulo 1 – Estado da arte 48 também podem ser utilizados para indicar a reativação da doença, obtendo sensibilidade e especificidade variável (Avelino-Silva & Kallás, 2014). Algumas técnicas de detecção de imunoglobulinas entraram em desuso, seja pela baixa sensibilidade, por não estarem mais disponíveis comercialmente ou restrições de uso. As novas tecnologias devem ser empregadas com cuidado e com bom senso para que a sociedade possa usufruir de todas as benesses geradas pelas técnicas de diagnóstico (Granato & Paulini Júnior, 2014). 1.10.1 Reação em cadeia da polimerase A reação em cadeia de polimerase (PCR) é um método com elevada precisão e a sensibilidade. No entanto, esta técnica não pode ser a única, não devendo substituir os métodos tradicionais (Su et al., 2016). Por ser uma doença de fase crônica e aguda, o diagnóstico da toxoplasmose deve ser associado a dois ou mais métodos de diagnóstico, indicando o real estágio da infecção (Kompalic-Cristo et al., 2005). A vantagem desta técnica é a detecção do T. gondii mesmo em quantidades reduzidas ou lisadas, sendo o protozoário identificado pelos segmentos característicos de seu ADN (amplificado pelo PCR) e conclusão do exame em menos de 48 horas. Esta técnica é eficiente quando os títulos de anticorpos anti - T. gondii , em pacientes imunocomprometidos, são baixos ou ausentes ou em pacientes com gamaglobulinopatias, cujos títulos de anticorpos para T.gondii forem muito altos, mas que podem não estar causando tal condição clínica (Ho-Yen et al., 1992). As desvantagens deste método molecular são o alto custo e falta de padronização quanto aos procedimentos de extração dos ácidos nucléicos ou aos segmentos ampliados, com resultados por vezes heterogêneos entre laboratórios diferentes (Pelloux et al., 1998). 1.10.2 Reação de Aglutinação por Imunoabsorção O método de reação de aglutinação por imunoabsorção (ISAGA) é utilizado para identificação de anticorpos no diagnóstico de infecção aguda. Os antígenos adicionados constituem-se em uma suspensão de toxoplasmas que se aglutinam na presença de IgM, IgA e IgE específica (Remington et al., 2011; Sáfadi & Farhat, 1999). Alguns autores ressaltam a sensibilidade deste exame no diagnóstico de infecção aguda em gestantes e em recém-nascidos com infecção congênita. A detecção de precocidade da doença também é uma característica deste exame (Remington et al., 2011). A ocorrência da persistência de reatividade ISAGA é indicativo de uma avaliação sorológica complementar para comprovar possíveis riscos de toxoplasmose congênita (Duffy et al., 1989). Capítulo 1 – Estado da arte 49 1.10.3 Hemaglutinação Indireta O teste de Hemaglutinação Indireta (IHA) detecta a presença de IgM. No entanto, a sua desvantagem se dá pela detecção de IgM e aglutininas não específicas de toxoplasmose, confundindo, também, com as IgM naturais, gerando os falso-negativos. É um teste prático e de baixo custo, não exigindo equipamento sofisticado e métodos de triagem mais específicos (Camargo et al., 1989). O teste é compatível com a imunofluorescência indireta. É útil para indicar prevalência, mas não para o diagnóstico de infecção neonatal ou quadro recente em gestante, pois pode confundir IgM e IgG. Detecta anticorpos mais tardiamente que a imunofluorescência e que os testes imunoenzimáticos. 1.10.4 Reação de Sabin e Feldman O teste de reação de Sabina e Feldman utiliza taquizoítos vivos e o tipo de anticorpo/antígeno testado é o IgG, IgM e IgA (Sabin & Feldman, 1948). Foi a partir deste teste que se popularizou a criação de inquéritos epidemiológicos (Amato-Neto, 1995). Ainda é considerado um teste padrão-ouro por pesquisadores na obtenção de prevalências de parasitoses (Bahia-Oliveira et al., 2001). Possui alta sensibilidade e especificidade, mas é utilizado apenas em laboratórios de referência (Beazley & Egerman, 1998). É um método para detecção da fase aguda ou crônica. É especifico e não cruza com outras doenças, porém não é usada rotineiramente devido a necessidade de manipular o parasita na sua forma infectante (Neves, 2016). 1.10.5 Ensaios imunoenzimáticos Os ensaio imuoenzimáticos (ELISA) possui positividade de 80% , sendo muito importante na infecção congênita (Silveira, 1997; Thalhammer, 1962; Wilson et al., 1980). A detecção de IgM com toxoplasmose recentemente adquirida e que eram negativas, demonstrou que o ELISA é simples, rápido e acurado no diagnóstico de toxoplasmose aguda em adultos e na forma congênita. Esta maior sensibilidade ao IgM pode ser atribuída pelo fato de que há eliminação da inibição da demonstração de imunoglobulinas IgM em presença de IgG sérico (Naot et al., 1981; Sáfadi & Farhat, 1999). A desvantagem do método se dá pelo uso de proteínas que contém vários antígenos de T. gondii , fator este, que aumenta a reatividade cruzada, gerando falsos positivos (Conde de Felipe et al., 2007). Os testes de ELISA possuem alta sensibilidade e especificidade, em contrapartida são caros e necessitam de laboratórios e mão de obra especializados (Liu et al., 2015). Capítulo 1 – Estado da arte 50 1.10.6 Ensaios de quimiluminescência O exame de quimioluminescência (CLIA) é um método imunológico que se baseia na emissão de energia luminosa a partir de uma reação química. Este teste possui características quantitativas na detecção de antígenos e anticorpos, atuando também na identificação de hormônios, marcadores tumorais e proteínas séricas. Possui elevada sensibilidade e especificidade, é automatizado e pode analisar várias moléculas simultaneamente. A técnica é baseada na ligação antígeno-anticorpo. O anticorpo específico é revestido de poliestireno. Um dos dois agentes é conjugado a uma substância que, quando ativada, emite luz. A emissão desta luz é proporcional ao reagente pesquisado. Este princípio se assemelha ao eletroquimioluminescente (ECLIA), diferenciando-se no uso de energia química ao invés de energia elétrica (Vaz, 2006). 1.10.7 Imunofluorescência indireta O teste de Imunofluorescência indireta (RIFI) possui boa sensibilidade e especificidade. Seus bons resultados na detecção do antígeno específico vêm da amplificação do sinal fluorescente. Neste método o T. gondii é preservado e fixado em lâminas de microscopia. Este teste identifica as imunoglobulinas de acordo com as suas classes, facilitando a identificação das fases aguda e crônica, de modo semelhante ao método de imunofluorescência indireta e o teste de aglutinação. Devido a possibilidade de resultados falso-positivos é aconselhável a repetição da sorologia em 3 semanas e a sua confirmação com um outro método mais específico. 1.10.8 Teste de aglutinação em látex O princípio do teste de aglutinação em látex (LAT) é decorrente da formação de agregados originados da interação antígeno-anticorpo. A aglutinação pode ser detectada sem o auxílio de aparelhos especiais. É eficaz na detecção de vírus, bactérias, protozoários e fungos. Esta metodologia utiliza como antígeno as partículas de látex de tamanho uniforme, que são sensibilizadas com antígenos depurados de T. gondii . Este teste é simples e rápido, não necessitando de diluições prévias da amostra. A presença de fatores reumatóides é um fator limitante do teste (Chandramukhi, 2004). 1.10.9 Teste de avidez de IgG no soro Este teste se baseia na ligação antígeno-anticorpo através do teste de quimioluminescência. Em fase aguda, as imunoglobulinas (IgG) se ligam fracamente ao antígeno (baixa avidez), enquanto que na Capítulo 1 – Estado da arte 51 fase crônica, essas imunoglobulinas se ligam fortemente ao antígeno (alta avidez). A alta avidez demonstra uma infecção que ocorreu há mais de três meses (Iqbal & Khalid, 2007; J. S. Remington & Klein, 2011). A persistência dos anticorpos de baixa avidez pode mascarar o exame, como, por exemplo, tratamento antiparasitário pode manter baixa a avidez por mais de quatro meses (Pardini, 2002). Mulheres grávidas com IgG+/IgM+ são as pacientes mais indicadas para realizar este teste. A avidez de IgG é um importante marcador imunológico para distinguir infecção recente e determinar a presença de IgM residual (Araújo and Ferreira 2008). Mesmo uma baixa avidez não pode ser interpretada como infecção recente, pois o IgG pode persistir por mais de cinco meses. Esta técnica associada ao PCR no líquido amniótico é útil para identificar gravidez de alto risco e toxoplasmose congênita (Yamada et al., 2011). A medição de avidez também se mostrou eficaz na detecção de toxoplasmose ocular (Tanyuksel et al., 2004) e na distinção entre a fase crônica e aguda da doença (Candolfi et al., 2007). A descoberta da avidez de anticorpos específicos como medida de afinidade com o antígeno, resultou em aplicação diagnóstica importante para uma série de doenças infecciosas, dentre elas, as virais e a toxoplasmose (Bobic et al., 2009), tornando-se uma importante ferramenta para diagnóstico. 1.10.10 Western blot A técnica de western blot (WB), é um método capaz de detectar proteínas em um homogenato ou extrato de tecido biológico. Neste teste são utilizados antígenos lisados de taquizoítos e antígenos recombinantes (Rilling et al., 2003). A separação das proteínas de interesse é efetuada através da eletroforese e transferidas, através de transferência eletroforética, para um suporte sólido com membranas de nitrocelulose, PVDF ( Polyvinylidene difluoride ) ou de catiônicas de nylon. Um anticorpo específico vai reagir com um epítopo da proteína para que seja visualizada a proteína de interesse. A membrana é incubada com outro anticorpo, no caso anti-IgG, que reconhece a imunoglobulina responsável pela ligação ao antígeno. Esta técnica permite a distinção entre a toxoplasmose aguda e crônica (Cañete, 2010; Deshpande et al., 2013). A detecção de toxoplasmose congênita com esta técnica mostrou ser uma ferramenta eficaz com boa sensibilidade para IgG e IgM (Machado et al., 2010; Magi & Migliorini, 2011). 1.10.11 Método de Eletroquimioluminescência A eletroquimioluminescência é produzida a partir de reações eletroquímicas em soluções. Na solução em estudo, os anticorpos são marcados e ligados ao antígeno (complexo sanduiche). Esse Capítulo 1 – Estado da arte 52 conjugado é aspirado para uma célula de leitura onde e fixados magneticamente a um eletrodo. São fornecidas partículas de TPA (triptofano) que a partir de estímulos elétricos fornecerá cargas elétricas, emitindo um sinal luminoso detectado por um fotomultiplicador. O sinal luminescente gerado é equivalente a concentração dos antígenos presentes na amostra. Apesar das suas vantagens por ser um método muito especifico e fácil, possui alto custo, aparelho com pouca mobilidade, reagentes específicos, disponibilidade de espaço e reatividade cruzada com algumas fármacos esteroides cruzadas (Zita et al., 2014). 1.10.12 Avaliação econômica das técnicas Estudos econômicos em saúde fornecem informações aos tomadores de decisão para o uso eficiente dos recursos disponíveis para maximizar os benefícios à saúde. A avaliação econômica é uma parte da economia da saúde, e é uma ferramenta para comparar custos e consequências de diferentes intervenções. A avaliação de tecnologias em saúde é uma técnica de avaliação econômica bem adaptada por países desenvolvidos. As avaliações econômicas de tecnologias em saúde surgiram na década de 60 para sistematizar e comparar as alternativas tecnológicas em relação aos seus benefícios em saúde e aos custos que uma tomada de decisão pode trazer aos pacientes (da Silva et al., 2014). O estudo do aprimoramento de tecnologias em saúde tornou-se um grande aliado ao bem-estar da sociedade, fazendo das pesquisas na área biomédica uma contínua produção de alternativas que auxiliam a comunidade médica no diagnóstico e prevenção de patologias. Um fator que está intimamente ligado ao desenvolvimento dessas tecnologias é o custo, já que as restrições orçamentárias podem limitar o acesso de muitos pacientes a métodos mais eficientes. O modelo adotado, seja público ou privado, depara-se com um crescente custo e, consequentemente, aumento do volume de recursos, seja absoluto ou relativo. O aumento da participação dos gastos em saúde, aloca recursos de outras áreas, trazendo questionamentos aos gestores para equilibrar as contas para atender as demandas da sociedade como um todo (Ministério da Saúde, 2009b). Em outras áreas, os mecanismos de detecção de patologias tendem a ocupar o espaço de tecnologias já existentes, o que pode não acontecer na saúde, pois os novos procedimentos e novas técnicas são incorporadas pelos profissionais, não ocorrendo, em algumas situações, a substituição dos métodos, e sim uma acumulação. A decisão para guiar a escolha das intervenções que provavelmente poderão oferecer maiores benefícios para a população é, muitas vezes, inadequado e sujeito a pressões diversas, incluindo-se nelas as indústrias de insumos de saúde (Ministério da Saúde, 2009b). Essas avaliações são holísticas, compreendendo disciplinas como epidemiologia, pesquisa clínica e economia. Capítulo 1 – Estado da arte 53 Nem sempre as avaliações das tecnologias empregadas na saúde possuem viés econômico, pois as técnicas comprovadamente mais eficientes do que a técnica padrão podem apresentar custos globais mais elevados. As técnicas com efetividade similar e com custos mais elevados são dispensáveis. Além dos custos adicionais, as novas tecnologias trazem efeitos adicionais, tornando-as mais caras e mais efetivas em relação à tecnologia padrão usada, exigindo então que estas diferenças sejam analisadas por meio de outros métodos de avaliação econômica, como os estudos de custo-efetividade, muito utilizados na área da saúde e que têm sido discutidos e aperfeiçoados desde a década de 1970 (Weinstein & Stason, 1977). A valorização da avaliação econômica na gestão pública, porém, é, no mundo todo, um fenômeno mais recente na saúde. Fala-se em ética ou moral a imposição de valores sobre a vida do paciente, já que a mesma não possui preço. A geração dessa imposição, em várias ocasiões, ignora os benefícios que a saúde traz por considerar apenas os custos. Os custos jamais devem ser alocados à frente do bem-estar do indivíduo. Países como a Austrália já possuem estudos econômicos para a área de tecnologia em saúde, exigindo que as decisões de incorporação de novas tecnologias sejam baseadas na relação custoefetividade (Taylor, 2004). Em países da Europa e América do Norte adotam modelos similares ao modelo australiano. Tomando o Canadá como exemplo, existe a orientação, por meio de suas agências, da necessidade de inclusão de estudos econômicos quando da submissão de processos para incorporação de novas tecnologias. Na Europa a política de uso de estudos econômicos para tomada de decisão de inclusão de novas tecnologias é marcante na Inglaterra. Em outros países, Bélgica, Finlândia, Noruega, Portugal, Suécia e Hungria, essa avaliação econômica é solicitada pelas agências de saúde (Taylor, 2004). No Brasil o processo de avaliação econômica das novas metodologias é recente e raramente aplicado. A criação, pela Secretaria de Ciência e Tecnologia e Insumos Estratégicos (SCTIE), de uma área específica para avaliação de tecnologias em saúde aconteceu somente em 2003, através de portaria nº 1.418, de 24/07/2003, instituindo o Conselho de Ciência, Tecnologia e Inovação do Ministério da Saúde para subsidiar a tomada de decisões do Sistema Único de Saúde (SUS) em relação a incorporação, alocação e utilização de tecnologias, além da criação da comissão de Incorporação de Tecnologias pelo Ministério da Saúde. Os custos crescentes na área da saúde, desperdício de recursos, garantia de direitos constitucionais e a intervenção do Poder Judiciário faz com que o poder público busque meios mais formais de aprimoramento do processo de decisão quanto à incorporação e ao uso das tecnologias em saúde (Ministério da Saúde, 2009a). Capítulo 1 – Estado da arte 54 Em Portugal existe o Sistema Nacional de Avaliação de Tecnologias de Saúde (SiNATS), que integra todas as entidades públicas e privadas na área da saúde com o objetivo de obter ganhos em saúde, harmonizado com outros sistemas europeus que procuram atingir o mesmo objetivo. O SiNATS pode materializar -se em recomendações gerais para a sua utilização no sistema de saúde, como em condições de utilização e aquisição para as instituições e serviços do Serviço Nacional de Saúde (SNS), baseando-se no conhecimento técnico do INFARMED (Autoridade Nacional do Medicamento e Produtos de Saúde) e no acervo de informações estruturadas para determinar as condições de utilização (Ministério da Saúde, 2015). O decreto Lei n° 97/2015 explicita que a qualidade, economia, eficiência e eficácia de tecnologias sejam variáveis importantes na tomada de decisões de introdução de novas tecnologias no mercado e que os recursos públicos, destinados à prestação de cuidados de saúde, sejam utilizados para implementar métodos tecnológicos que tragam benefícios aos cidadãos portugueses. Posteriormente à criação do Decreto-Lei n° 97/2015, estabeleceu-se um regime específico de comparticipação (diferença que existe entre o preço de um serviço e o valor do mesmo coberto por um plano de saúde) de dispositivos médicos, causando mudança no modo de utilização e aquisição das tecnologias de saúde. O Decreto-Lei n° 195/2006 estabelece que os medicamentos novos devem ser avaliados e que demonstrem um valor terapêutico acrescentado e a respectiva vantagem econômica. Gastos em saúde pelo governo português somam 8,9% do PIB do país (2017), tendo chegado a 9,9% em 2009 (PORDATA, 2017), gastos esses que incluem a aquisição de bens e encargos com instalações. Em comparação os Estados Unidos gastam 15,3% do seu PIB em saúde (Pereira, 2009) e o Brasil com 9,1% (IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística., 2017). 1.11 Métodos espectrofotométricos de diagnóstico As aplicações da espectroscopia na área biomédica são baseadas na Espectroscopia de absorção UV, espectroscopia de infravermelho próximo (NIR) e espectroscopia Raman. A Figura 11 ilustra as áreas em que a espectroscopia atua e o percentual de atividade de cada uma. Na área biomédica a espectroscopia já é utilizada na análise de macromoléculas biológicas (ácidos nucléicos, proteínas e lipídios), patologias sanguíneas (anemias, leucemias e talassemias), diagnóstico de câncer (cérebro, mama, cervical, cólon, etc), processos químicos em células sanguíneas (malária, reações a medicamentos), ADN em cromossomos e pigmentos em granulócitos (hemácias e hepatócitos), imunoensaios, ensaios citológicos (organelas, células, microrganismos) e análise de tecidos diversos (Truong et al., 2016). Capítulo 1 – Estado da arte 55 Figura 11 - Ramos que a bioespectroscopia atua Dentre os métodos sorológicos mais utilizados, o teste de ELISA apresenta boa sensibilidade na detecção de IgG e IgM. Outros métodos, como: o ECLIA e o RIFI também apresentam boa especificidade. A desvantagem destes métodos está na preparação das amostras (lavagem, diluição e incubação). A existência de múltiplos antígenos de T. gondii é um obstáculo, aumentando a reatividade cruzada inespecífica, gerando os falsos positivos. Assim, outras técnicas de diagnóstico, tais como espectroscopia de FTIR e de Raman poderão permitir uma elevada sensibilidade para a detecção molecular de um modo rápido e mais barato. Uma vez que são testes não destrutivos, não há necessidade para uma preparação de amostras e, portanto, podem ser automatizados. Estudos com sangue de gatos, utilizando técnicas espectrofotométricas, já conseguem identificar a presença de IgG e IgM nestes felinos (Duarte et al., 2013). A tabela 5 mostra um comparativo entre as técnicas Espectrofotométricas de FTIR e Raman. A espectroscopia vibracional tem o potencial de fornecer informações sobre materiais biológicos e realizar análises de desordem celular. No entanto pode algumas dificuldades podem resultar pelo fato das amostras possuírem grandes quantidades de moléculas, podendo influenciar no diagnóstico de patologias. Pode-se coletar dados e submetê-los a uma análise multivariada (estatística), permitindo ao pesquisador a identificação de tendências espectrais difíceis de serem percebidas visualmente. A espectroscopia é uma técnica já utilizada na detecção de outros componentes biológicos, pois suas propriedades de analisar a constituição bioquímica de fluidos e tecidos auxilia na diferenciação de Capítulo 1 – Estado da arte 56 compostos. A espectroscopia de FTIR e o Raman podem fornecer informações estruturais e quantificação de moléculas bioquímicas e fosforiladas em amostras biológicas. Assim, estas técnicas podem ser utilizadas para diagnóstico precoce de doenças, de forma não invasiva e com resposta satisfatória, já que as mudanças moleculares em células, tecidos ou biofluídos, que são a causa ou o efeito de doenças, podem ser detectadas e quantificadas por estas técnicas, obtendo a chamada biópsia óptica, onde analisa amostras biológica, sendo minimamente invasivas (Bitar, 2009). Tabela 5 - Comparativo entre a espectroscopia FTIR e Raman FTIR Raman Faixa espectral 13300 - 3300 4000 - 50 Análise de: Gases Não Sim Líquidos Sim Sim Sólidos Sim Sim Sistemas aquosos Difícil Sim Amostra macroscópica Sim Sim Amostra microscópica Não Sim Sinal Forte Fraco Amostragem Fácil Fácil Quantitativa Sim Sim Não-invasivo Sim Sim Interface de fibra ótica Sim Sim Conteúdo informativo Baixo. Limitado a O-H, N-H e C-H Alta Monitoramento de reação e modelagem Requer quimiometria Sim A espectroscopia de FTIR e o Raman são métodos capazes de identificar desorganização celular para identificação de câncer em diferentes tecidos (Gajjar et al., 2013a; Harris et al., 2009; Martin et al., 2010). As doenças levam a mudanças na composição molecular dos tecidos afetados, essas mudanças podem ser refletidas nos espectros. Se essas alterações forem específicas o suficiente para modificar o espectro, pode-se identificar a patologia a partir desses marcadores espectrais (Choo-Smith et al., 2002). A espectroscopia vibracional inclui diferentes técnicas, como o infravermelho e a espectroscopia Raman. Podem ser usados para estudar uma ampla gama de tipos de amostras para análises qualitativas e análises quantitativas (Flannery, 2014). O desenvolvimento das técnicas espectroscópicas (FTIR e Raman) aliadas às técnicas de computação trouxeram significativas contribuições acerca da estrutura das moléculas presentes em amostras líquidas ou sólidas. As patologias existentes levam a mudanças estruturais e químicas que alteram os espectros vibracionais das moléculas e que podem ser usadas Capítulo 1 – Estado da arte 63 FATOR DE INTERESSE FONTE Diagnóstico de displasia de esôfago (Mads Sylvest Bergholt et al., 2014) Medição das concentrações de substâncias químicas no soro sanguíneo, como: glicose, ureia, proteínas, colesterol e triglicerídeos (Rohleder et al., 2004) Análise de soro sanguíneo para diagnosticar a asma e monitorar a resposta ao tratamento (Sahu et al., 2013) Medição e quantificação da concentração de proteína C-reativa (PCR) no plasma sanguíneo como biomarcador de resposta inflamatória (Bergholt & Hassing, 2009) Diagnóstico sorológico de malária - Plasmodium falciparum - em eritrócitos (Bilal et al., 2015; Bonifacio et al., 2008; Chen et al., 2016) Detecção de lesões pré neoplásicas (Short et al, 2011) Verificação de danos isquêmicos em soro sanguíneo (Baranov, Vlasova, & Saletsky, 2004) Detecção de açúcar na urina de diabéticos (Zou et al., 2016) Detecção de diabetes tipo II em soro sanguíneo medição (Birech et al., 2017) Da concentração de fibrinogênio no plasma sanguíneo para detectar fatores coagulantes e anticoagulantes (Poon et al., 2012) Diagnóstico da doença de Alzheimer e outros tipos de demência (Ryzhikova et al., 2015) Monitoramento da oxigenação sanguínea (Brazhe et al., 2018) Detecção de câncer de mama (Haka et al., 2005; Marro et al., 2014) Detecção de marcadores séricos para identificação de câncer colorretal (Feng et al., 2015; J. Wang et al., 2014) Diagnóstico de câncer de laringe (Lin et al., 2012) Medição de fosfolipídios e identificação e avaliação de lesões ateroscleróticas humanas (Silveira et al., 2018) Detecção de rejeição aguda após o transplante renal (Tu & Chang, 2012) A tabela 9 mostra os modos vibracionais, associados a amostras sanguíneas e que substâncias podem ser identificadas pelo Raman. O diagnóstico de câncer tem impulsionado as pesquisas com o Raman, pois uma das hipóteses é que esta técnica pode detectar alterações moleculares em células, tecidos e biofluidos, principal causa/efeito deste grupo de doenças (Kong et al, 2015). A espectroscopia Raman não é influenciada pela presença da água, já que esta substância pode funcionar como um dispersor, permitindo que as amostras analisadas com o Raman sejam biofluídas (Ellis & Goodacre, Capítulo 1 – Estado da arte 64 2006). Em geral proporciona mais detalhes espectrais e seus picos apresentam menor desordem de picos. Tabela 9 - Principais modos vibracionais e assinaturas de moléculas do sangue humano por Espectroscopia Raman Faixa (cm-1) Sangue humano Assinatura molecular Referências 510-1200 Soro Lipídeos (HDL e LDL) (Espinosa-Mansilla et al., 2005) 510-1320 Sangue e soro Glicose (Espinosa-Mansilla et al., 2005; Levy et al., 2005) 510-1800 Sangue e soro Triglicérides (Espinosa-Mansilla et al., 2005; Levy et al., 1995) 550-1800 Soro Creatinina (Espinosa-Mansilla et al., 2005) 565-1746 Soro Colesterol (Levy et al., 1995) 720-1602 Sangue e soro Albumina (Espinosa-Mansilla et al., 2005; Levy et al., 1995) 744/760/1342/48 Sangue e soro Triptofano (Krone & Nägele, 1988; Papadakis et al., 1999) 829-851 Soro Tirosina (Hadda et al., 2007; Papadakis et al., 1999) 1000/1003 Sangue e soro Fenilalanina (Krone & Nägele, 1988; Papadakis et al., 1999) 1000-1800 Soro Globulina (Espinosa-Mansilla et al., 2005) 940-1320 Plasma Amida IIIα hélix (Papadakis et al., 1999) 960 Plasma Amida IIIrandom coil (Papadakis et al., 1999) 990/1240 Plasma Amida IIIβ sheet (Papadakis et al., 1999) 1230-1309 Plasma e soro Amida III (Steiner & Urowitz, 2009) 1542/1620 Sangue e soro Hemoglobina (Krone & Nägele, 1988) 1645-1680 Plasma Amida I (Steiner & Urowitz, 2009) 1654 Soro Amida I (Seven et al., 2008) Capítulo 1 – Estado da arte 65 1.11.2 Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) A espectroscopia de FTIR foi aplicada em pesquisas biomédicas por muitos anos e a literatura vem se expandindo a cada ano, sendo aplicado à detecção de marcadores de doenças em fluídos corporais, como urina e sangue. A técnica de espectroscopia no infravermelho atua na absorção de luz que se encontra na região do infravermelho do espectro eletromagnético. Como já foi referido, as técnicas espectroscópicas podem identificar diferentes compostos bioquímicos presentes em uma amostra sanguínea (BenezzeddineBoussaidi et al., 2009), além de bioflúidos (Oliver, 2015). Esses compostos bioquímicos possuem ligações que vibram de forma específica (níveis de energia), já que essas moléculas possuem energia potencial, geometria molecular e massas, também, específicas. A medida fundamental obtida na espectroscopia por infravermelho é o espectro infravermelho, caracterizado por um gráfico que ilustra a medida da intensidade da luz infravermelha versus o comprimento de onda (cm-1). O mais prevalente tipo de espectrômetro é chamado de Espectrometria no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR). A espectroscopia de FTIR é primariamente utilizado para detecção de grupos funcionais químicos na amostra. Os picos produzidos no espectro infravermelho são proporcionais a concentração dos analitos presentes na amostra, ou seja, esta técnica também pode ser eficiente para medir concentrações (Smith, 1998). Grande parte das pesquisas utiliza a região de 4000 a 900 cm-1 para análise no FTIR, pelo fato desta região apresentar bandas com informações referentes aos compostos orgânicos. A espectroscopia no infravermelho permite analisar simultaneamente aminoácidos, ácidos graxos, proteínas e polissacarídeos, bem como possui diferenciais significativos, por fornecer uma análise rápida, prática e reprodutível, sem haver necessidade do uso de reagentes químicos e de grande quantidade de amostra (Kaderbhai et al., 2003). A espectroscopia de FTIR é uma técnica que utiliza um interferômetro ao invés de um monocromador, permitindo que a leitura de um espectro seja mais rápida, já que as frequências são colhidas simultaneamente (múltiplas leituras de uma amostra, tirando a média e aumentando a sensibilidade delas). Os espectrofotômetros FTIR mais modernos já são equipados com esse sistema de monocromador. A espectroscopia de infravermelho é utilizada para diagnóstico de várias patologias, como descrito na tabela 10. Capítulo 1 – Estado da arte 66 Tabela 10 - Fatores de interesse que são detectados pela espectroscopia FTIR FATOR DE INTERESSE FONTE Identificar tipos sanguíneos de espécies diferentes (Mistek & Lednev, 2015; Zhang et al., 2016) Monitoramento da oxigenação tecidual (A. Lima & Bakker, 2011) Identificação de biomoléculas para diagnóstico de esôfago de Barret (Wang et al., 2007) Identificação de grupos sanguíneos (Ushasree & Ahmad, 2017) Análise de multicomponentes de lipídios no sangue (Bazar, Eles, Kovacs, Romvari, & Szabo, 2016) Detecção e tipagem de arbovírus (dengue, Zika e Chikungunya) (Santos, 2018) Análise óssea para diagnóstico da osteoporose (Boskey & Mendelsohn, 2005) Detecção de aneurisma (Bonnier et al., 2006) Monitoramento de glicose no sangue (Shen et al., 2003; Yadav et al., 2015) Medição dos efeitos das alterações intra e extracraniana da pressão arterial transitória (Minati, Kress, Visani, Medford, & Critchley, 2011) Avaliação da qualidade dos oócitos e na detecção de biomarcadores em líquido sinovial (Ellis & Goodacre, 2006) Avaliação da qualidade dos oócitos e na detecção de biomarcadores em sangue (Lechowicz et al., 2016) Diagnóstico de artrite, detecção de LDL – lipoproteínas de baixa densidade – para pacientes com dislipidemia (Sato et al., 2010) Medição de TSH (hormônio trófico estimulante) em soro de sangue (Mello et al., 2011) Medição de oxigênio em tecidos do fígado (Schulz et al., 2002) Identificação de albumina glicada (Chesne et al., 2006) Detecção de colite ulcerosa e doença de Crohn (Titus et al., 2017) Detecção de insuficiência renal (Khanmohammadi et al, 2015) Diagnóstico de câncer Câncer cervical e melanoma (Mordechai et al., 2004) Câncer pulmonar (Hang et al., 2018; Lewis et al., 2010; Wang et al., 2014) Próstata (Baker et al., 2008; Siqueira & Lima, 2016) Ovário (Gajjar et al., 2013) Melanoma (Srisayam et al, 2014) Sarcoma de Ewing (Chaber et al., 2017) Leucemia (Mostaço-Guidolin & Bachmann, 2011; Rahim et al., 2016) Cólon (Rigas et al., 1990) Capítulo 1 – Estado da arte 67 FATOR DE INTERESSE FONTE Esofágico (Wang et al., 2003) Gástrico (Colagar et al., 2011; Liu et al, 2017) Bexiga urinária (Li et al., 2015; Ollesch et al., 2014) Cérebro (Gajjar et al., 2013; Hands et al., 2016) Linfoma (Ghimire et al., 2017) Alterações na pele devido ao carcinoma (C. A. Lima, Goulart, Côrrea, Pereira, & Zezell, 2015) A tabela 11 identifica os modos de vibração de moléculas encontradas em sangue humano, obtidas a partir da análise espectral por espectroscopia FTIR. Os trabalhos listados identificam as composições bioquímicas de diferentes constituintes, tanto do plasma, como do sangue. Tabela 11 - Modos vibracionais e atribuições de compostos presentes no sangue por espectroscopia FTIR POSIÇÃO PICO (cm-1) AMOSTRA ATRIBUIÇÃO MODOS VIBRACIONAIS REFERÊNCIAS 565-1746 Sangue Colesterol, triglicérides e proteína (Berger et al., 1999) 720-1602 Sangue Glicose e albumina (Berger et al., 1999) 900-1300 Plasma Glicose, sacarídeos, lactato e glicerol ν (C-O) (Déleris & Petibois 2003) 900-1300 Plasma Glicose e lactato ν (C-O) (Petibois, Cazorla, Cassaigne, & Déléris, 2001) 925-1250 Soro Fosfolipídeos de proteínas νas (C-O-C) (Sankari et al., 2010) 1137-1150 Plasma Imunoglobulina A (BenezzeddineBoussaidi et al., 2009) 1464-1560 Plasma Imunoglobulina G (BenezzeddineBoussaidi et al., 2009) 1289-1420 Plasma Imunoglobulina M (BenezzeddineBoussaidi et al., 2009) 950-1100 Soro Colesterol (Budínová et al., 1997) 950-1185 Soro Glicose (Budínová et al, 1997) 1430-1480 Plasma Ácidos graxos, fosfolipídeos e triglicérides δas (CH3), δas (CH2), δs (CH3), (Déléris & Petibois, 2003) Capítulo 1 – Estado da arte 68 POSIÇÃO PICO (cm-1) AMOSTRA ATRIBUIÇÃO MODOS VIBRACIONAIS REFERÊNCIAS δs (CH2) 1360-1430 Plasma Aminoácidos ν (C-OO-) (Déléris & Petibois, 2003) 2950-2990 Plasma Ésteres de colesterol e triglicérides ν as (CH3) (Déléris & Petibois, 2003) 1732-1739 Plasma Lipídeos, ésteres de colesterol e triglicérides ν (C=O) (Déléris & Petibois, 2003) 1592 Soro Amida I e II δ (NH2) (Erukhimovitch et al., 2006) 1056 Soro Carboidratos (Erukhimovitch et al., 2006) 3303 Soro Amida A ν (N-H) (Gunasekaran & Uthra, 2008) 3068 Soro Amida B (Gunasekaran & Uthra, 2008) 1403, 1455 Soro Grupo metil (Gunasekaran & Uthra, 2008) 1151-1599 Plasma Ácido úrico (Heise et al., 1994) 1351-1700 Plasma Proteínas totais (Heise et al., 1994) 1130-1801 Plasma Ureia (Heise et al., 1994) 1739 Soro Fosfolipídeos (HDL) ν (C=O) Liu et al., 2002 1220-1330 Soro Amida III (Petibois et al., 2001) 1107-1163 Soro Lactato ν (C-O) (Petibois et al., 2001) 1405-1411 Plasma IgG, IgA e IgM (Petibois et al., 2001) 1480-1600 Plasma Proteínas δ (N-H) (Petibois et al., 2001) 1200-1400 Soro Proteínas (metil e metileno) δ (C-H) (Sankari et al., 2010) O uso da técnica espectrofotométrica FTIR em conjunto com a regressão de mínimos quadrados parciais ( Partial Least-Squares - PLS) faz com que este método possua sensibilidade, especificidade e acurácia satisfatórios (Riley et al., 2007). Um espectro biológico infravermelho com atribuições moleculares é mostrado na Figura 13. Capítulo 1 – Estado da arte 69 Figura 13 - Espectro biológico de carcinoma humano com as absorbâncias de pico biomolecular de 3.000-800 cm-1 (Extraído de Baker et al., 2015) 70 Capítulo 2 – Objetivos e estrutura da tese Capítulo 2 – Objetivos e estrutura da tese 71 A descoberta do causador da toxoplasmose instigou pesquisadores de todo o mundo a investigarem o comportamento do T. gondii . Esse parasita é conhecido como um importante patógeno oportunista de fetos, recém-nascidos e pacientes com uma variedade de imunodeficiências primárias genéticas e adquiridas. A detecção do parasita é dificultada pela existência de epítopos diferentes, sendo necessária a utilização de alvos antigênicos específicos (antígenos purificados, recombinantes ou sintéticos), além da baixa sensibilidade dos métodos parasitológicos onde existe uma carga parasitológica mínima. A detecção do T. gondii , diferentemente de outras parasitoses, não é por pesquisa de ovos, mas através da presença de imunoglobulinas específicas que precisam de um imunodiagnóstico. A variedade de testes padronizados e disponíveis no mercado não é suficiente para que se produza um consenso global sobre quais métodos laboratoriais que devem ser utilizados para determinar o estágio da infecção (aguda/crônica), forma infectante (taquizoíto, cisto ou oocisto) e genótipo da cepa. A identificação destes parâmetros facilita um tratamento mais adequado ao paciente, principalmente em indivíduos dos grupos de risco (gestantes e portadores de VHI). A produção do conhecimento científico que possa fornecer parâmetros de controle através da saúde pública é uma medida eficaz na própria prevenção da doença. O rastreio da toxoplasmose é imprescindível para que seus males não se perpetuem na sociedade. Esta tese está dividida em seis capítulos. O capítulo I abrange uma revisão sistemática sobre a biologia do patógeno, distribuição geográfica, epidemiologia e aspectos gerais da doença e descrição de métodos utilizados para detectar os anticorpos específicos. O capítulo II compreende os objetivos, geral e específico, e estruturação da tese. O capitulo III descreve os aparelhos utilizados na tese e as variáveis estatísticas utilizadas para embasamento matemático dos resultados produzidos pelas técnicas. O capítulo IV apresenta os resultados obtidos com relação ao perfil epidemiológico, avaliação econômica das técnicas e análise dos espectros do Raman e FTIR. O Capítulo V oferece as principais conclusões da tese, enquanto o capítulo VI apresenta as sugestões para trabalhos futuros 2.1 Objetivo geral Verificar a presença de anticorpos antitoxoplasmose no sangue de usuários utilizando o espectrofotômetro Raman e FTIR, a fim de implementar um rastreio sorológico em escala maciça, utilizando métodos mais rentáveis e utilizando baixas quantidades de soro. Capítulo 2 – Objetivos e estrutura da tese 72 2.2 Objetivos específicos • Identificar anticorpos IgM e IgG no sangue de voluntários utilizando a técnica da espectrofotometria Raman e FTIR; • Identificar os espetros produzidos pelo IgM e IgG em soro sanguíneo; • Comparar as análises do espectrofotômetro com o teste imunoenzimático (tradicional) para verificar a confiabilidade do diagnóstico, utilizando uma Análise Estatística Multivariada; • Comparar o custo/benefício das técnicas utilizadas na tese com a técnica utilizada padrão ouro; • Contribuir com a epidemiologia da toxoplasmose; • Verificar a reprodutibilidade (repetitividade) e a validade (acurácia) entre os dois métodos. Capítulo 3 – Materiais e métodos 79 particular. A leitura das curvas ROC permite quantificar a relação entre sensibilidade e especificidade de um teste diagnóstico, já que esta medida é de difícil conciliação, observando o delineamento gerado pela comparação com uma curva em diagonal e a área sob a curva, gerando medidas diretamente proporcionais: quanto maior a área, melhor o teste. Na representação da curva ROC, a área sob a curva define a probabilidade do teste em detectar os verdadeiro-positivos e os verdadeiro-negativos, ou seja, expressa a acurácia do teste. Quando mais perto do canto superior esquerdo estiver a curva, melhor é o teste. A curva gerada demonstra se a sensibilidade vem em detrimento da especificidade e vice-versa. Quanto maior a área definida pela curva, melhor será o teste. A curva ROC e traçada colocando-se no eixo das abscissas (x) as probabilidades de ocorrência de resultados falso-positivos, que também pode ser expresso como 1-especificidade. No eixo das ordenadas (y) colocamos as probabilidades de ocorrência de resultados verdadeiro-positivos que também podem ser expressos como a sensibilidade do teste para aquele valor. • Verossimilhança – Esta análise descreve o desempenho de um teste diagnóstico. É utilizada para calcular a probabilidade de doença depois de um teste positivo ou negativo. A razão de verossimilhança ou razão de probabilidades é dada em chances (razão de duas probabilidades) e é definida como a probabilidade de um resultado do teste em pessoas com a doença, dividida pela probabilidade do resultado do teste em pessoas sem a doença. Seus resultados mostram quantas vezes mais provável, ou menos, encontramos um resultado de um teste em pessoas doentes comparadas com as não doentes. Os resultados dicotomizados, que nessa pesquisa se adotou como sendo “positivo” e “negativo”, associam-se a um teste positivo e o outro a um teste negativo. Este dado estatístico é menos susceptível a mudanças de prevalência da doença. Verossimilhança positiva – Chance de um resultado positivo ser verdadeiro positivo. Quanto maior a razão de verossimilhança, melhor será o teste. Equação 7 - Equação para determinação do valor de Verossimilhança positiva Verossimilhança negativa – Chance de um resultado negativo ser verdadeiro negativo. Quanto menor a razão de verossimilhança negativa, melhor será o teste. Capítulo 3 – Materiais e métodos 80 Equação 8 - Equação para determinação do valor de Verossimilhança negativa Os estudos de comparação de testes diagnósticos devem obedecer aos critérios de aleatorização. É necessário verificar se os testes atendem aos princípios estatísticos quando comparados aos pacientes sadios e doentes. Além disso, os testes em estudo devem ser aplicados nas mesmas condições da clínica média e ter a capacidade de detectar tanto pacientes graves, quanto portadores da doença com sintomas semelhantes a outras doenças. • Coeficiente de correlação de Pearson : Medição da correlação entre duas variáveis que se associam a partir da distribuição das frequências ou pelo compartilhamento de variância (Paranhos et al., 2014). Equação 9 - Equação da correlação de Pearson Tendo como base a tabela 13 abaixo, pode-se atribuir valores (entre 0 e 1) para correlacionar variáveis. Quando a relação é positiva “r” tomará o valor 1 quando a relação é perfeita. Quando a relação é negativa “r” tomará o valor -1 quando a relação é perfeita (contrária). Quando a relação é difusa ou não linear “r” será igual a 0. Tabela 13 - Coeficiente de correlação de Pearson Coeficiente de correlação de Pearson Variação Correlação 0 Nula 0,01 – 0,35 Fraca 0,36 - 0,65 Média 0,66 – 0,95 Forte 0,96 – 0,99 Muito forte 1 Perfeita Capítulo 3 – Materiais e métodos 81 • Perfil epidemiológico – O perfil epidemiológico é um importante indicador de condições de vida de uma população. As variáveis utilizadas servem para traçar um perfil de uma comunidade, se comprometendo a expor uma análise verdadeira das condições de saúde da população, construindo o desenvolvimento de um sistema de saúde (Rouquayrol, 2013). Essa variável é fundamentada em outras variáveis inseridas no contexto social (faixa etária, renda, escolaridade, saneamento básico, conhecimento sobre a doença, presença de cães e gatos, consome carne e vegetais crus ou mal passado e hábitos de higiene) e na avaliação das condições de vida e saúde de uma população. As variáveis descritas foram analisadas neste estudo para traçar o perfil populacional e associá-las às condições relacionadas a presença das imunoglobulinas. • Método Stepwise Forward – Os métodos de seleção e exclusão de variáveis são baseados em cálculos que verificam a importância de cada variável para serem inseridas nos modelos. Essa importância é definida de acordo com a significância estatística do coeficiente associado à variável. Em cada passo do procedimento a variável mais importante, em termos estatísticos, é aquela que produz a maior mudança no logaritmo da verossimilhança em relação ao modelo que não contém a variável. • Estatística de Wald – Este teste é obtido a partir da comparação entre a estimativa de máxima verossimilhança e a estimativa de seu erro padrão. Esta estatística teste tem distribuição Normal, sendo seu valor comparado com valores tabulados de acordo com o nível de significância definido. 3.5 Avaliação econômica dos métodos diagnósticos Os métodos em estudo foram submetidos a uma avaliação econômica. Os custos de maquinário e insumos foram comparados para designar o melhor teste, seja no custo minimização ou no custo efetividade. O custo minimização foi calculado a partir de dos custos da técnica padrão menos os custos da técnica em estudo, como descrito na fórmula abaixo: Equação 10 - Fórmula custo minimização. CRaman/FTIR = Custo Raman/FTIR - CECLIA = Custo ECLIA Esse tipo de análise econômica possui praticidade, pois necessita apenas mensurar custos. Para o cálculo do custo efetividade, utilizou a seguinte fórmula para análise: RICE - Rácio Incremental; Cs – Custo nova tecnologia; Cc – Custo tecnologia atual; Efetividade tecnologia atual. Equação 11 - Rácio incremental custo-efetividade de IgG (extraído de Pereira, 2009) Capítulo 3 – Materiais e métodos 82 A efetividade das técnicas é baseada no número de amostras positivas que as mesmas conseguem detectar, sendo uma avaliação que utiliza desfechos concretos da prática clínica. 83 Capítulo 4 – Resultados e discussão Capítulo 4 – Resultados e discussão 84 Dentre as 400 amostras analisadas, 363 pacientes eram do sexo feminino (90,75%) e 37 eram do sexo masculino (9,25%). As amostras foram caracterizadas, numa primeira fase, quanto ao perfil epidemiológico da distribuição da doença na população, tendo como base os resultados do métodos padrão - ECLIA. Posteriormente as amostras foram avaliadas por dois métodos alternativos de identificação de IgG e IgM, a espectroscopia Raman e FTIR. Esta avaliação foi feita por observação dos espectros e por análise estatística. Foi também efetuada uma análise de custos às 3 técnicas indicadas. 4.1 Perfil epidemiológico O perfil epidemiológico foi feito para identificar o quadro de saúde da população e os fatores que são responsáveis pela distribuição da doença na região estudada. Com o levantamento do perfil epidemiológico, os gestores podem avaliar a doença e identificar os pontos críticos que precisam de solução imediata (saneamento básico, tratamento das doenças, campanhas de prevenção e controle). Dessa forma, as ações serão voltadas aos problemas de forma pontual, facilitando o trabalho dos profissionais e contribuindo para a melhoria da saúde da população. As amostras com imunoglobulina G, ou seja, pacientes já expostos ao parasita, apresentaram frequência de 65% (IC95% [60,2%, 69,6%]) (Tabela 14). Tabela 14 - Frequência de IgG em plasma sanguíneo Count Column N % 95,0% Lower CL 95,0% Upper CL Sorologia IgG Negativo 140 35,0% 30,4% 39,8% Positivo 260 65,0% 60,2% 69,6% Total 400 100,0% . . A distribuição das imunoglobulinas de acordo com as variáveis estudadas (sexo, faixa etária, escolaridade, renda, conhecimento da doença, saneamento básico, animais (Cães e gatos), consumo de carne crua ou mal passada, consumo de vegetais crus e hábitos de higiene) conduziu aos resultados reportados na tabela 15. Capítulo 4 – Resultados e discussão 85 Tabela 15 - Distribuição das variáveis segundo a sorologia IgG Positivo N nP % pvalue Sexo Feminino 363 240 66,1% <0,001 Masculino 37 20 54,1% 0,642 Faixa etária 18 - 22 52 32 61,5% 0,031 23 - 27 111 78 70,3% <0,001 28 - 32 106 72 67,9% <0,001 33 - 37 69 43 62,3% 0,006 38 - 42 50 31 62,0% 0,028 43 - 50 12 4 33,3% 0,221 Escolaridade Ens. fund inc ou sem escolaridade 42 26 61,9% 0,049 Ens. fund comp 91 63 69,2% <0,001 Ens. médio inc. 98 66 67,3% <0,001 Ens. médio comp. 108 68 63,0% <0,001 Ens sup inc 33 19 57,6% 0,325 Ens sup comp ou pósgraduação 28 18 64,3% 0,061 Renda Um salário 220 151 68,6% <0,001 Entre um e dois 152 90 59,2% 0,002 Entre dois e três 22 16 72,7% 0,007 Acima de quatro 6 3 50,0% 1,000 Conhecimento sobre a doença Não 132 95 72,0% <0,001 Sim 268 165 61,6% <0,001 Saneamento básico Não 266 167 62,8% <0,001 Sim 134 93 69,4% <0,001 Animais (cães e gatos) Não 339 217 64,0% <0,001 Sim 61 43 70,5% <0,001 Consome carne crua ou malpassada Não 256 168 65,6% <0,001 Sim 144 92 63,9% <0,001 Consome vegetais crus Não 24 13 54,2% 0,773 Sim 376 247 65,7% <0,001 Hábitos de higiene Não 30 20 66,7% 0,020 Sim 370 240 64,9% <0,001 A partir dos resultados obtidos na tabela 15, é possível inferir que a variável "faixa etária" tem uma probabilidade de soropositividade de 1,48 vezes maior, principalmente nas faixas etárias entre 23 e 37 anos. A variável "sexo" apresentou significância estatística para o sexo feminino, atingindo maior Capítulo 4 – Resultados e discussão 86 probabilidade de soropositividade do que o sexo masculino. O grau de significância das variáveis foi medido e avaliado em separado. As variáveis mais significativas (idade, sexo e conhecimento da doença) segundo Hosmer & Lemeshow (Hosmer & Lemeshow, 2000) (pE> 0,15 <0,20) foram agrupadas para a construção da tabela 16. De seguida utilizando o método Stepwise Forward, onde a cada etapa é incorporada uma variável, que seja mais relevante de acordo com pE=0,15 e pR=0,20, de forma a construir o modelo mais estável numericamente, minimizando o número de variáveis, já que quanto mais variáveis incluídas no modelo mais ele se torna dependente dos dados, foram incluídas, no modelo final as variáveis: sexo, faixa etária e conhecimento da doença para a previsão da presença de anticorpos IgG contra toxoplasmose (Braga & Carneiro, 2016). Neste estudo foram verificados os fatores de risco sociodemográficos no desenvolvimento da doença utilizando o modelo de regressão logística. Os fatores de risco sociodemográficos utilizados foram a faixa etária, sexo e conhecimento da doença. O modelo de regressão logística binária foi utilizado para observar se há correlação entre as variáveis e a presença da imunoglobulina G. Em cada etapa foi incorporada uma variável mais relevante para que o modelo apresente números mais estáveis. Foram incorporados oito passos. Utilizando a seleção automática de variáveis, foi incluído, na construção do modelo, apenas os fatores de risco que contribuíram significativamente para a análise. Ocorreu associação estatística significante, em nível de significância de 95%, entre as variáveis: sexo, faixa etária e conhecimento da doença e a presença de anticorpos IgG contra toxoplasmose (p<0,005). Capítulo 4 – Resultados e discussão 87 Tabela 16 - Resultado da aplicação da técnica Stepwise forward para seleção das variáveis dependentes B S.E Wald df p Exp(B) 95% IC para EXP(B) LI LS Faixa Etária 8,311 5 0,140 Faixa Etária(1) 0,389 0,357 1,188 1 0,276 1,475 0,733 2,969 Faixa Etária(2) 0,366 0,360 1,037 1 0,309 1,442 0,713 2,919 Faixa Etária(3) 0,077 0,384 0,041 1 0,840 1,080 0,509 2,291 Faixa Etária(4) -0,061 0,413 0,021 1 0,883 0,941 0,419 2,116 Faixa Etária(5) -1,268 0,682 3,455 1 0,063 0,281 0,074 1,072 Sexo -0,619 0,361 2,940 1 0,086 0,538 0,265 1,093 Conhecimento sobre a doença -0,489 0,237 4,269 1 0,039 0,613 0,386 0,975 Constante 1,470 0,514 8,169 1 0,004 4,348 B, estimativas para os coeficientes declive do modelo de regressão logística binária contendo a variável; S.E., erro padrão estimado para o coeficiente estimado; Wald, Estatística de Wald; df, graus de liberdade; valor p, valor associado ao teste de coeficiente estatístico; exp (B), odds ratio estimado; IC, intervalo de confiança de 95% para odds ratio; LI, limite inferior; LS, limite superior. Um odds ratio de 0,613 para a variável conhecimento da doença significa que o conhecimento da doença diminui o risco de uma IgG positiva de 0,613 vezes, o que pode ser visto como um fator contribuinte para a não ocorrência de IgG positiva. O odds ratio de 0,538 para o sexo indica que a ocorrência de IgG positivo está mais associada ao sexo feminino do que ao sexo masculino. Assim a partir deste modelo, por exemplo um individuo do sexo feminino, na faixa etária dos 28-32, e sem conhecimento da doença, tem uma probabilidade de ter IgG positivo igual a 0,7715. As variáveis sexo feminino e o conhecimento da doença estão relacionadas, já que esta zoonose é amplamente difundida por médicos ginecologistas e/ou obstetras para a mulher grávida, permitindo a este grupo uma melhor compreensão da doença. A validação interna do modelo foi realizada utilizando a metodologia através da curva ROC (Figura 14). A área estimada para a curva ROC empírica para o modelo é de 0,614 (IC 95% [0,556, 0,672]), o que indica que a capacidade de discriminação deste modelo para o resultado de IgG é aceitável. Capítulo 4 – Resultados e discussão 88 Figura 14 - Curva ROC empírica para o modelo O valor da estatística de Wald (constante 34,872) atesta que o valores encontrados são significativamente diferentes de zero. As três variáveis categóricas acima (sexo, faixa etária e conhecimento da doença), em comparação com os grupos de referência, são significativas. A maior significância estatística obtida foi atribuída à idade. A maior prevalência nessa variável (faixa etária) pode ser explicada pelo maior tempo de exposição dos pacientes aos fatores de risco relacionados a essa infecção. O conhecimento da doença foi estatisticamente significativo, pois acreditase que um maior número de consultas e maior acesso à informação na mídia podem influenciar positivamente os indivíduos na prevenção da doença, obtendo um efeito protetor para a soropositividade. As taxas de soroprevalência da toxoplasmose foram maiores na população entre 28 e 32 anos, indicando contato prévio com o parasita, e corroborando outros estudos que descrevem que a prevalência de toxoplasmose aumenta em indivíduos adultos e longevos. A busca por anticorpos antiT. gondii na população é um importante mecanismo de prevenção, principalmente em mulheres suscetíveis em idade fértil (16 a 49 anos). Esse rastreamento de anticorpos varia dependendo da política de saúde de cada país. No Brasil, a triagem é realizada semanalmente para que a detecção e o consequente tratamento sejam mais rápidos, tanto para a gestante como para a criança. O maior número de mulheres Capítulo 4 – Resultados e discussão 95 Tabela 18 - Tabulação cruzada entre as espectroscopias Raman e FTIR para descrição de falsos positivos e negativos (FP e FN), verdadeiros positivos e verdadeiros negativos (VP e VN), utilizando o ECLIA como padrãoouro na detecção de IgG. A tabela estima a precisão diagnóstica de um resultado de teste quantitativo dicotômico ou dicotomizado IgG IgM ECLIA Total ECLIA Total Negativo Positivo Negativo Positivo Raman Negativo 134 9 143 Raman Negativo 395 1 396 Positivo 6 251 257 Positivo 2 2 4 Total 140 260 400 Total 397 3 400 ECLIA Total ECLIA Total Negativo Positivo Negativo Positivo FTIR Negativo 100 96 196 FTIR Negativo 385 2 387 Positivo 40 164 204 Positivo 12 1 13 Total 140 260 400 Total 397 3 400 A tabulação cruzada demonstrou que houve maior concordância entre Raman e ECLIA, tanto para o valor “negativo” quanto para o valor “positivo”. O Raman concordou com 134 amostras negativas (verdadeiros negativos) e 251 amostras foram concordantes para a positividade em ambos os testes, totalizando 96,25% de similaridade entre os resultados (verdadeiros positivos). Das 400 amostras analisadas, o Raman discordou de 15 resultados gerados pelo ECLIA, totalizando 3,75% de discordância (Tabela 18). Relativamente ao espectrofotômetro FTIR, os seus resultados discordaram do ECLIA em 136 amostras (34%), concordando em 254 (66%), como mostra a tabela 18. Esses dados mostram que o espectrofotômetro FTIR possui maior probabilidade de gerar resultados falso positivos e falso negativos do que o Raman. Os testes com alta especificidade devem ser utilizados para confirmar um diagnóstico com menor especificidade, pois um resultado falso positivo pode ser extremamente danoso ao paciente e que acarrete mudanças nos hábitos de vida do indivíduo. Já os testes de alta sensibilidade devem ser utilizados para afastar a doença de sua fase inicial e onde o rápido tratamento pode dar sobrevida ao paciente ou no rastreio de enfermidades para instruir as medidas profiláticas e de segurança cabíveis. É importante destacar que numa doença com baixa prevalência, o valor discriminatório de um teste diagnóstico para rastreamento, mesmo que com alta sensibilidade e especificidade, é pequeno. Assim um teste ideal deveria ter uma sensibilidade e especificidade 100%, mas o valor destas variáveis depende dos resultados dos testes nos pacientes com e sem as imunoglobulinas. Um teste com alta especificidade deve ser usado quando a prevalência da doença é relativamente baixa (doença rara), mesmo que o teste tenha relativamente baixa sensibilidade. Um teste com alta sensibilidade deve ser usado quando a Capítulo 4 – Resultados e discussão 96 prevalência da doença é alta (doença comum), mesmo que o teste tenha relativamente baixa especificidade. A tabela 19 representa as análises estatísticas multivariadas com posterior comparação com o padrão-ouro. Os dados produzidos podem ser utilizados como comparação entre as espectrofotômetros Raman, FTIR e o ECLIA. Observando ainda a tabela 19, pode-se verificar que o método de Raman possui 22,53 vezes mais chances de encontrar um resultado positivo em pessoas doentes quando comparado com pessoas não doentes (quanto mais distante de zero, melhor será o teste). O espectrofotômetro FTIR obteve apenas 2,21 vezes mais chances de encontrar o resultado positivo nos exames de pacientes doentes. Relativamente à RVN do Raman esta atingiu um valor de 0,04, ou seja, expressa uma baixa probabilidade de encontrar um resultado negativo em pessoas doentes quando comparado com pessoas não doentes (valores mais próximos de zero definem o melhor teste). Para o espectrofotômetro FTIR, a RVN foi de 0,52, ou seja, possui maior chance, do que o Raman, de encontrar um resultado negativo em pessoas sadias. Assim, pode-se confirmar que o método Raman apresenta valores de RVP e RVN melhores do que os obtidos com a técnica de FTIR. Os valores preditivos positivos (VPP) e valores preditivos negativos (VPN), medem a probabilidade da doença, caso o resultado seja positivo ou negativo. De acordo com a tabela 19, o Raman obteve, na detecção de IgG, 96,67% de chances de o paciente realmente ser doente, quando o resultado for positivo, contra 3,33% de não ter doença, apesar do resultado também ser positivo. O FTIR obteve 80,39% para paciente doente e 19,61% de ser sadio, mesmo o exame apresentando resultado positivo. Esses dados demonstram uma confiabilidade maior no espectrofotômetro Raman, pois suas probabilidades de acertos são maiores do que as do espectrofotômetro FTIR. Considerando a IgM O VPP do Raman foi de 50%, resultado pouco satisfatório, contra 7,69% do espectrofotômetro FTIR. Para o VPN, o Raman obteve 99,75% do paciente realmente possuir o IgM quando o resultado for positivo e 0,25% de indivíduos sem IgM, mesmo o resultado demonstrando sua presença. O espectrofotômetro FTIR produziu um VPN de 99,48% e 0,52%. Os valores preditivos são influenciados pela prevalência da doença na população em estudo. Uma alta prevalência acarreta maior valor de VPP e menor VPN, não influenciando a sensibilidade e a especificidade do teste (Dercksen et al., 2000). Capítulo 4 – Resultados e discussão 97 Tabela 19 - Análises estatísticas da espectroscopia Raman e FTIR na comparação com o ECLIA com os respectivos IC a 95% na detecção da imunoglobulina G e M Capítulo 4 – Resultados e discussão 98 A acurácia dos testes diagnósticos em estudo demonstrou que o Raman possui melhor validade na detecção de IgG e IgM quando comparado ao espectrofotômetro FTIR. O desempenho diagnóstico de acurácia do espectrofotômetro FTIR frente a detecção de IgM foi similar ao Raman. A medida de acurácia dos testes permitiu identificar o Raman como o teste que pode ser utilizado, tanto para medidas de triagem (prevalência baixa) ou clínica médica (prevalência alta). O espectrofotômetro FTIR pode ser utilizado como teste de triagem na detecção de IgM. A verificação do nível de concordância e nível de consistência (fiabilidade) das técnicas estudas em comparação ao teste padrão-ouro (ECLIA) foi obtida com o cálculo do Índice Kappa (k). Sua distribuição e os respectivos níveis de interpretação estão apresentadas na tabela 12. O valor de k depende da prevalência da patologia em estudo, ou seja, a comparação entre observadores pode ser influenciada pela diferença entre as prevalências, como ocorre entre as medidas estatísticas entre IgG e IgM anti – T. gondii , devendo, portanto, utilizar outras medidas estatísticas para comprovar a confiabilidade do método em estudo. Nesse contexto, o valor numérico mínimo adotado para aceitação do Índice Kappa foi o nível de consenso maior que 0,61, considerado nível bom (Tabela 12). Tabela 20 - Taxa de concordância (%) e valores de k dos métodos diagnósticos comparados com o ECLIA. O índice de confiança (IC) foi de 95% e o erro padrão Método diagnóstico IgG IgM ECLIA x Raman ECLIA x FTIR ECLIA x Raman ECLIA x FTIR Concordância (%) 96,25 66 99,25 96,5 Kappa 0,918[0.8710,965] 0,316 [0,2690,363] 0,568 [0.5580,578] 0,114 [0,0970,131] Observando a tabela 20 é possível verificar que no método de Raman o índice K teve um valor de 0,918 (ótimo) para verificação de imunoglobulina G e valor 0,568 (regular) para verificação de imunoglobulina M. Por outro lado, o valor de k obtido para o método espectrofotômetrico FTIR apresentou valores de 0,16 (fraco) e 0,114 (fraco) para IgG e IgM, respectivamente. Deste modo, os valores encontrados nesta variável estatística mostram que existe maior concordância entre o Raman e o ECLIA quando verificadas as tabelas de tabulação cruzada, corroborando os resultados estatísticos anteriores. Na representação da figura 18 a linha traçada em diagonal, a 45 graus, expressa a acurácia de 50% e significa que o teste é tão bom quanto qualquer escolha ao acaso. Capítulo 4 – Resultados e discussão 99 Figura 18 - Curva ROC para comparação de ECLIA/Raman e ECLIA/FTIR para detecção de IgG (A) e IgM (B). A visualização da curva ROC do Raman com uma Área de curva de 0,961 e área de curva do FTIR de 0,673 (detecção de IgG) e área de curva de 0,831 e área de curva e área de curva do FTIR de 0,652 (detecção de IgM) Capítulo 4 – Resultados e discussão 100 Os valores obtidos, tanto para o IgG quanto para o IgM, e que ficam acima da linha de referência e mais à esquerda representam corretamente os resultados preditivos. Os valores para baixo e mais à direita representam os resultados incorretos de diagnóstico. Na linha que representa a detecção de IgG pelo espectrofotômetro FTIR (Figura 18 A) encontrase uma acurácia de 67,3%(IC 95%; 0,617 – 0,728), que significa que em 67,3% das vezes em que for utilizado, o teste discriminará os verdadeiro-positivos e os verdadeiro negativos. A sensibilidade do teste foi de 63,1% e produção de resultados falsos positivos foi de 28,6% (1 – especificidade = 0,286). A acurácia do espectrofotômetro FTIR na detecção de IgM (Figura 18 B) foi de 65,2% (IC 95%; 0,279 – 1,000), sensibilidade de 33% e produção de falso positivo de 3%. Relativamente ao Raman na detecção de IgG foi encontrada uma acurácia de 96,1% (IC 95%; 0,938 – 0,985), onde em 3,9% das amostras poderão apresentar resultados incoerentes. A sensibilidade do método foi de 96,5% e falsos positivos (1 – especificidade) de 4,3%. A acurácia do Raman na detecção de IgM foi de 83,1% (IC 95%; 0,504 – 1,000) com desempenho de produção de falsos positivos de 0,5% e sensibilidade de 66,7%. Todos os resultados, tanto do espectrofotômetro FTIR como o Raman, foram baseados na determinação do ponto de corte de 0,5 de acordo com as coordenadas produzidas pela curva ROC (Tabela 21). Tabela 21 - Área sob a curva na detecção de IgG e IgM pelos espectrofotômetros FTIR e Raman Método Área Erro Padrãoa Sig. assintóticab Intervalo de Confiança 95% Assintótico Limite inferior Limite superior FTIR (IgM) 0,652 0,19 0,366 0,279 1 FTIR (IgG) 0,673 0,028 0 0,617 0,728 Raman (IgM) 0,831 0,167 0,048 0,504 1 Raman (IgG) 0,961 0,012 0 0,938 0,985 A determinação do ponto de corte ( cutoff point ) de um teste diagnóstico discrimina as duas classes do estudo (doente / não doente). Como a escolha do ponto de corte influência nas características do teste, é necessário que haja uma combinação tanto da sensibilidade quanto da especificidade. Capítulo 4 – Resultados e discussão 101 4.3 Avaliação económica dos métodos de diagnóstico No que se refere a avaliação econômica, existem quatro tipos de análises de custos: análise de minimização de custos e análise de custo-efetividade. A minimização de custos avalia a consequência e os custos de uma técnica, caso haja equivalência de resultados, aquela que apresentar menores encargos será a mais eficiente. O Raman possui custo por amostra igual ao espectrofotômetro FTIR, mas efetividade superior. O valor divergente entre os reagentes do Raman/FTIR e o ECLIA se deve ao fato de que as marcas são diferentes. O valor das amostras se deu pelo cálculo da soma dos reagentes e a vidraria (R$ 600 / € 138,38) divididos pelo número de amostras analisadas (400). A tabela 22 demonstra o custo obtido com cada técnica. Os dados clínicos e econômicos foram coletados simultaneamente e as estimativas de custo-efetividade foram obtidas a partir de dados combinados com a epidemiologia e custo. Tabela 22 - Custo das amostras por cada técnica Materiais FTIR Raman ECLIA Reagentes R$ 490 (€ 113,01) R$ 490 (€ 113,01) R$ 1.200 (€ 276,75) Vidraria (tubos de ensaio) R$ 110 (€ 25,37) R$ 110 (€ 25,37) R$ 110 (€ 25,37) Total R$ 600 (€ 138,38) R$ 600 (€ 138,38) R$ 1.310 (€ 302,12) Preço por amostra - sem impostos (+15,5%) R$ 1,5 (€ 0,35) R$ 1,5 (€ 0,35) R$ 3,27 (€ 0,75) Preço por amostra - com impostos (+15,5%) R$ 1,73 (€ 0,40) R$ 1,73 (€ 0,40) R$ 3,76 (€ 0,87) A análise de custo-efetividade pode ser definida como um método de pesquisa para avaliar e quantificar os custos e as consequências clínicas da utilização de uma tecnologia ou programa de saúde, de forma a estimar critérios de eficiência económica sobre o uso alternativo dos recursos para atingir um determinado objetivo. Esta metodologia assume que os recursos disponíveis para gastar em saúde são limitados, quer na perspectiva da sociedade, da organização ou do doente (Muennig, 2002), ou seja, preocupa-se em encontrar a alternativa do programa que maximiza os benefícios ou minimiza os custos. A relação custo-efetividade (Tabela 23) gera resultados sobre tecnologias que possuem maiores custos e menos eficiência, maiores custos e maior eficiência, menores custos e menos eficiência e menores custos e maiores eficiências. O Raman obteve melhor custo efetividade em relação ao Capítulo 4 – Resultados e discussão 102 espectrofotômetro FTIR, tanto na detecção de IgG, quanto de IgM. A efetividade (RICE) de uma técnica se dá pelo custo dividido pelo número de amostras positivas. Tabela 23 - Custo efetividade de IgG e IgM pelas técnicas testadas Método Custos (R$) Efetividade (detecção de IgG) RICE IgG(R$) (total ÷ efetividade) Efetividad e (detecção de IgM) RICE IgM(R$) (total ÷ efetividade) Aparelho Reagentes + Vidraria Total ECLIA 300.000,00 (€ 71.041,22) 1.310,00 (€ 310,21) 301.310 (€ 71.351,43) 384 784,66 3 100.4 Raman 210.000,00 (€ 49.728,85 600,00 (€ 142,08) 210.600 (€ 49.870,93) 251 839,04 2 105.3 FTIR 140.505,00 (€33.272,15 600,00 (€ 142,08) 141.105 (€ 33.414,23) 164 860,39 1 141.10 Os custos do ECLIA foram calculados, assim como na espectroscopia Raman e FTIR, a partir dos valores de insumos (materiais de laboratório e reagentes). Outros custos não foram mensurados, já que foram realizados pelo pesquisador. No ECLIA ainda existem os custos de funcionários, impostos municipais, estaduais e federais, lucro e outros gastos fixos (água, eletricidade, telefone, treino de pessoal e custos administrativos) e que não foram utilizados neste estudo. A comparação econômica das técnicas utilizou apenas as despesas fixas para houvesse uniformidade de dados. Capítulo 5 – Conclusões Capítulo 5 – Conclusões 104 O desenvolvimento de técnicas que permitem a identificação de analitos de interesse em amostras biológicas, incluindo o sangue, é um desafio científico que pode auxiliar na detecção de doenças importantes. Os recursos tecnológicos empregados na melhoria do diagnóstico ou rastreamento de pacientes acometidos por alguma moléstia devem estar associados as propriedades dos instrumentos de avaliação, ou seja, as características dos testes devem contribuir para que a equipe de saúde tenha mais subsídios para o tratamento (Goulart & Chiari, 2007). O sucesso destes recursos tecnológicos se deve a escolha correta do melhor método (conduta terapêutica, recursos financeiros empregados, riscos e aceite do método), permitindo que a qualidade de vida do paciente seja preservada. Os diagnósticos errados trazem consequências como perda financeira e humana (Souf, 2016). Os métodos estatísticos para diagnóstico são de grande importância na escolha do melhor tratamento para pacientes, uma vez que permitem ter uma ideia precisa da confiabilidade da técnica em questão. Os testes diagnósticos geram processos probabilísticos que classificam os pacientes em grupos específicos para que sejam gerados o tratamento e o prognóstico (Soares et al., 2017). Por isso a necessidade de avaliar e reconhecer se uma evidência estatística apoia, realmente, uma conclusão apresentada. A avaliação da exatidão de qualquer teste diagnóstico dependente da comparação dos resultados a partir dele obtidos com o verdadeiro estado de cada indivíduo. Assim, para determinar o verdadeiro diagnóstico é preciso que exista um teste, ou conjunto de testes, que atestem uma grande certeza sobre o mesmo. Ao teste que, em determinado momento, tem a maior exatidão na determinação de um diagnóstico dá-se o nome de padrão-ouro, sendo o ECLIA este padrão de referência da determinação da toxoplasmose, foi selecionado para comparação com as técnicas em estudo (Pinho, 2006; Soares et al., 2017). Em países desenvolvidos, a avaliação tecnológica em saúde funciona em consonância com as diretrizes traçadas para o paciente. No Brasil, a criação de novas tecnologias se baseia em critérios econômicos, explicando a falta de investimentos no setor e a baixa efetividade, eficiência e qualidade dos serviços de saúde no país (Krauss-Silva, 2004). Os crescentes gastos com os serviços de saúde não se refletem, necessariamente, em benefícios que melhorem o atendimento, gestão e tecnologias empregadas. Os gestores em saúde, particularmente no Brasil, têm dificuldades em adotar novas tecnologias, pois as mesmas não estão em consonância com a realidade de algumas localidades. Além disso, falta corpo técnico com habilidades específicas para implementar políticas de avaliação de tecnologias. As avaliações das tecnologias em saúde (ATS) são processos que consideram aspectos de segurança, custo, eficácia, reprodutibilidade, equidade, éticos e culturais, além de uma perspectiva holística de análise, envolvendo a epidemiologia, estatística, física, química, biologia, economia, engenharia e medicina. Referencias 111 Universidade Federal de Minas Gerais. Revista Médica de Minas Gerais , 1 , 202–207. Retrieved from http://pesquisa.bvsalud.org/portal/resource/pt/bbo-36240 Angelo, M. H. (2003). Legal dispositions and preventive strategies in congenital toxoplasmosis in Portugal. Legal Dispositions and Preventive Strategies in Congenital Toxoplasmosis in Portugal , 10 Suppl 1 , 25–6. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12802963 Aspock, H., & Pollak, A. (1992). Prevention of prenatal toxoplasmosis by serological screening of pregnant women in Austria. 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In SBOC - Sociedade Brasileira de Oncologia (pp. 83–90). 143 Anexo Anexo 144 Anexo 1 – Aprovação CEP HOSPITAL UNIVERSITÁRIO ONOFRE LOPES-HUOL/UFRN PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP DADOS DO PROJETO DE PESQUISA Título da Pesquisa: Detecção de Anticorpos IgG e IgM utilizando espectroscopia Pesquisador: Carlos Henrique Bezerra de Oliveira Área Temática: Equipamentos e dispositivos terapêuticos, novos ou não registrados no País; Versão: 3 CAAE: 34801814.0.0000.5292 Instituição Proponente: INSTITUTO FEDERAL DE EDUCACAO, CIENCIA E TECNOLOGIA DO RIO Patrocinador Principal: Financiamento Próprio DADOS DO PARECER Número do Parecer: 1.085.950 Data da Relatoria: 22/05/2015 Apresentação do Projeto: Trata-se de uma emenda no projeto solicitando alterações de grupo de inclusão e exclusão do estudo sobre a prevalência sorológica de anticorpos presentes em grupo amostral da população de Natal. Os testes serão realizados em um laboratório particular deste município, onde amostras sanguíneas serão coletadas e analisadas por espectrofotômetro. Objetivo da Pesquisa: Primário Verificar a presença de anticorpos anti-toxoplasmose no sangue de usuários utilizando o espectrofotômetro; Objetivo Secundário: •Identificar anticorpos IgM e IgG no sangue de voluntários utilizando a técnica da espectrofotometria. • Identificar a absorbância dos IgM e IgG no plasma sanguíneo. • Comparar as análises do espectrofotômetro com o teste imunoenzimático (tradicional) para verificar a confiabilidade do diagnóstico, utilizando uma Análise Estatística Multivariada. Anexo 145 HOSPITAL UNIVERSITÁRIO ONOFRE LOPES-HUOL/UFRN Avaliação dos Riscos e Benefícios: Riscos: Como toda pesquisa que envolve seres vivos, o trabalho necessitará de técnicas invasivas (introdução de agulhas) nos pacientes participantes. Estes procedimentos serão feitos por profissionais do laboratório participante e treinados para a função. Todos os materiais utilizados seguem norma técnica (seringas descartáveis e luvas utilizadas pelos profissionais). O material sanguíneo é isolado e colocado em recipientes adequados. O contato com o material sanguíneo requer cuidados. Durante a coleta deste material, todos os participantes utilizarão os EPI´s apropriados para a tarefa. Benefícios: A população terá acesso ao procedimento, mesmo após o término do estudo, os resultados serão divulgados a comunidade e as instituições de saúde, além da divulgação nos meios específicos. Inovação no diagnóstico da toxoplasmose, utilizando um método inovador e menos invasivo. Comentários e Considerações sobre a Pesquisa: Trata-se de um estudo de relevância social e acadêmica, com estrutura bem delineada. Considerações sobre os Termos de apresentação obrigatória: Todos foram devidamente apresentados. Recomendações: Conclusões ou Pendências e Lista de Inadequações: O CEP/HUOL TOMA CIÊNCIA E APROVA AS MODIFICAÇÕES. Situação do Parecer: Aprovado Necessita Apreciação da CONEP: Não Considerações Finais a critério do CEP: Apresentar relatório parcial da pesquisa, semestralmente, a contar do início da mesma. Apresentar relatório final da pesquisa até 30 dias após o término da mesma. O CEP HUOL deverá ser informado de todos os efeitos adversos ou fatos relevantes que alterem o curso normal do estudo. Quaisquer documentações encaminhadas ao CEP HUOL deverão conter junto uma Carta de Encaminhamento, em que conste o objetivo e justificativa do que esteja sendo apresentado. Anexo 146 Caso a pesquisa seja suspensa ou encerrada antes do previsto, o CEP HUOL deverá ser comunicado, estando os motivos expressos no relatório final a ser apresentado. O TCLE deverá ser obtido em duas vias, uma ficará com o pesquisador e a outra com o sujeito de pesquisa. Em conformidade com a Carta Circular nº. 003/2011CONEP/CNS, faz-se obrigatório a rubrica em todas as páginas do TCLE pelo sujeito de pesquisa ou seu responsável e pelo pesquisador. Natal, 29 de maio de 2015 Assinado por: HELIO ROBERTO HEKIS (Coordenador) Apêndices Apêndices 148 Apêndice 1 – Termo de consentimento livre e esclarecido – TCLE “O TCLE não é apenas um texto jurídico com a assinatura do sujeito da pesquisa afixada. É um instrumento que se usa para facilitar a comunicação entre pesquisador e sujeito da pesquisa no intuito de firmar parceria entre pessoas humanas autônomas” (Martin, Caderno de Ética em Pesquisa, julho/02). Essa comunicação somente será possível quando o pesquisador entender que a maioria dos participantes não está familiarizada com o universo linguístico do saber científico e/ou uma linguagem elaborada. Portanto, ao se elaborar um TCLE, alguns cuidados devem ser observados, como utilizar na estrutura do texto uma linguagem compreensível para o nível de escolaridade do final do ensino fundamental. Também constitui um cuidado muito importante evitar, ao redigir o texto, frases e parágrafos muito longos (Franciscone, FC e Goldim, JR, 2003). Um TCLE bem elaborado é um aspecto ético de grande mérito, visto que ele auxilia o participante a uma melhor consciência e tomada de decisão. Outrossim, o TCLE bem elaborado cumpre os três aspectos legais exigidos para esse documento, a saber: 1. proteção e garantia dos direitos dos participantes da pesquisa; 2. possibilitar escolhas autônomas e 3. promover a ação responsável dos profissionais na execução das pesquisas. Apêndices 149 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO – TCLE Esclarecimentos Este é um convite para você participar da pesquisa: Comparação de métodos de Identificação de imunoglobulinas para diagnóstico de toxoplasmose , que tem como pesquisador responsável Professora Dra. Mariana Henriques. Esta pesquisa pretende verificar a presença de anticorpos antitoxoplasmose no sangue de usuários utilizando o espectrofotômetro. O motivo que nos leva a fazer este estudo é criar um método mais eficiente e rápido na detecção de anticorpos anti-toxoplasmose. A presença destes anticorpos no sangue é importante para um diagnóstico futuro da toxoplasmose. Caso você decida participar, você deverá realizar o exame para detecção dos anticorpos em seu sangue. O procedimento será realizado normalmente pelo laboratório DNA Center. Após a retirada do material sanguíneo, o mesmo será levado a um aparelho chamado espectrofotômetro e analisado. Após essa análise, seu material sanguíneo será devolvido ao laboratório para descarte. Durante a realização da retirada de material a previsão de riscos é mínima, ou seja, o risco que você corre é semelhante àquele sentido num exame físico ou psicológico de rotina. Pode acontecer um desconforto, uma pequena perfuração ocasionada pela seringa, que será minimizado com a utilização de algodão e curativos adesivos e você terá como benefício um exame com maior precisão e mais rápido. Em caso de algum problema que você possa ter relacionado com a pesquisa, você terá direito a assistência gratuita que será prestada pelo laboratório, através de profissionais treinados para a ocasião. Durante todo o período da pesquisa você poderá tirar suas dúvidas ligando para a Dra. Mariana Henriques no telefone 8855-0325 (celular) ou Carlos Henrique Bezerra de Oliveira no telefone 9912-3793 (celular). Poderá, também, solicitar esclarecimentos pessoalmente no endereço Rua Dr. Nilo Bezerra Ramalho, 1692, Tirol (ao lado da Unicat). Se preferir, o contato pode ser por email, carlos.bezerr[email protected]r ou [email protected] Apêndices 150 Você tem o direito de se recusar a participar ou retirar seu consentimento, em qualquer fase da pesquisa, sem nenhum prejuízo para você. Os dados que você irá nos fornecer serão confidenciais e serão divulgados apenas em congressos ou publicações científicas, não havendo divulgação de nenhum dado que possa lhe identificar. Esses dados serão guardados pelo pesquisador responsável por essa pesquisa em local seguro e por um período de 5 anos. Se você tiver algum gasto pela sua participação nessa pesquisa, ele será assumido pelo pesquisador e reembolsado para você. Se você sofrer algum dano comprovadamente decorrente desta pesquisa, você será indenizado. Qualquer dúvida sobre a ética dessa pesquisa você deverá ligar para o Comitê de Ética em Pesquisa do HUOL 3342 – 5003, endereço: Av. Nilo Peçanha, 620, Petrópolis, CEP 59.012-300 Nata/RN. Este documento foi impresso em duas vias. Uma ficará com você e a outra com o pesquisador responsável, Dra. Mariana Henriques. Consentimento Livre e Esclarecido Após ter sido esclarecido sobre os objetivos, importância e o modo como os dados serão coletados nessa pesquisa, além de conhecer os riscos, desconfortos e benefícios que ela trará para mim e ter ficado ciente de todos os meus direitos, concordo em participar da pesquisa Comparação de métodos de Identificação de imunoglobulinas para diagnóstico de toxoplasmose, e autorizo a divulgação das informações por mim fornecidas em congressos e/ou publicações científicas desde que nenhum dado possa me identificar. Natal, ________ de _________________ de__________ Assinatura do participante da pesquisa Declaração do pesquisador responsável Impressão datiloscópica do participante Apêndices 151 Como pesquisador responsável pelo estudo Detecção de Anticorpos IgG e IgM utilizando espectroscopia, declaro que assumo a inteira responsabilidade de cumprir fielmente os procedimentos metodologicamente e direitos que foram esclarecidos e assegurados ao participante desse estudo, assim como manter sigilo e confidencialidade sobre a identidade do mesmo. Declaro ainda estar ciente que na inobservância do compromisso ora assumido estarei infringindo as normas e diretrizes propostas pela Resolução 466/12 do Conselho Nacional de Saúde – CNS, que regulamenta as pesquisas envolvendo o ser humano. Natal, ________ de _________________ de________ Assinatura do pesquisador responsável Atenção: quando o instrumento da pesquisa for questionários, formulário ou entrevistas, o TCLE deve assegurar ao participante o direito de se recusar a responder as perguntas que lhes cause constrangimento de qualquer natureza. Annex A6 – paper 3 – (2016) 152 Apêndice 2 – Termo de confidencialidade Título do Projeto: Comparação de métodos de Identificação de imunoglobulinas para diagnóstico de toxoplasmose. Pesquisadores responsáveis: Prof. Dra. Mariana Contente Rangel Henriques e Carlos Henrique Bezerra de Oliveira Instituição/Departamento: Universidade do Minho, Portugal. Doutoramento em Engenharia biomédica Os pesquisadores abaixo assinados assumem o compromisso de manter confidencialidade e sigilo sobre todas as informações técnicas e outras relacionadas ao projeto intitulado: “Comparação de métodos de Identificação de imunoglobulinas para diagnóstico de toxoplasmose”. Por este Termo de Confidencialidade compromete-se: • a não utilizar as informações confidenciais a que tiver acesso, para gerar benefício próprio exclusivo e/ou unilateral, presente ou futuro, ou para uso de terceiros; • a não efetuar nenhuma gravação ou cópia da documentação confidencial a que tiver acesso relacionada a tecnologia acima mencionada; • a não apropriar-se para si ou para outrem de material confidencial e/ou sigiloso que venha a ser disponível através da tecnologia ora mencionada; • a não repassar o conhecimento das informações confidenciais, responsabilizando-se por todas as pessoas que vierem a ter acesso às informações, por seu intermédio, e obrigando-se, assim, a ressarcir a ocorrência de qualquer dano e/ou prejuízo oriundo de uma eventual quebra de sigilo das informações fornecidas. Concorda, igualmente, que essas informações serão utilizadas única e exclusivamente para execução do presente projeto. _______________________________ _____________________________________ Mariana Contente Rangel Henriques Carlos Henrique Bezerra de Oliveira