Implicación de las caspasas-3 y -8 en el trastorno del espectro autista y la enfermedad de Parkinson

UNIVERSIDAD DE SEVILLA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Farmacia C / Profesor García González, 2. 41012 Sevilla (España) Teléfono: 954 55 67 55 Fax: 954 55 67 52 JOSÉ LUIS VENERO RECIO, CATEDRÁTICO DE UNIVERSIDAD Y DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Y ROCÍO MARTÍNEZ DE PABLOS, PROFESORA CONTRATADA DOCTOR DEL MISMO DEPARTAMENTO INFORMAN: Que Dña. Irene García Domínguez ha realizado el trabajo experimental que ha llevado a la redacción de la presente memoria de Tesis Doctoral bajo la supervisión del Dr. José Luis Venero Recio y la Dra. Rocío Martínez de Pablos Para que conste y surta los efectos oportunos, firmo en Sevilla a 19 de Septiembre de 2019. Fdo: José Luis Venero Recio Fdo: Rocío Martínez de Pablos UNIVERSIDAD DE SEVILLA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Farmacia C / Profesor García González, 2. 41012 Sevilla (España) Teléfono: 954 55 67 55 Fax: 954 55 67 52 JOSÉ LUIS VENERO RECIO, CATEDRÁTICO DE UNIVERSIDAD Y DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Y ROCÍO MARTÍNEZ DE PABLOS, PROFESORA CONTRATADA DOCTOR DEL MISMO DEPARTAMENTO INFORMAN: Que Dña. Irene García Domínguez ha realizado bajo nuestra dirección el trabajo experimental que ha llevado a la redacción de la presente memoria de Tesis Doctoral titulada IMPLICACIÓN DE LAS CASPASAS-3 Y -8 EN EL TRASTORNO DEL ESPECTRO AUTISTA Y LA ENFERMEDAD DE PARKINSON. Considerando que constituye el trabajo de tesis doctoral, autorizamos su presentación para optar al grado de Doctor. Para que conste y surta los efectos oportunos, firmo en Sevilla a 19 de Septiembre de 2019. Fdo: José Luis Venero Recio Fdo: Rocío Martínez de Pablos Memoria presentada por la Graduada Irene García Domínguez para optar al título de doctora por la Universidad de Sevilla. A mi familia, que me ha enseñado a querer mucho y a querer bien “Ahora no queda sino suplicar al benévolo lector que al formular su fallo inapelable, mire, antes que a lo mezquino del resultado, al esfuerzo y tiempo que ha requerido el conseguirlo, y sobre todo, a la intención por demás sana y patriótica que ha guiado al autor” Santiago Ramón y Cajal. “Textura del sistema nervioso del hombre y de los vertebrados”, 1899. Que la curiosidad sea más grande que el miedo (A.P) César, tú no eres de este laboratorio, pero estás en el mundillo jaja. Diría que entre tú y yo sobran las palabras, pero nunca sobran, te lo he dicho muchas veces, pero gracias por tanto, es un año difícil pero estoy segura de que todo te va a salir como te mereces, gracias por haber sido uno de mis pilares incondicionales durante toda esta etapa, siempre con tanta luz, tan alegre y tan bueno, una persona maravillosa, no te pierdas nunca. Por último, las personas que me han acompañado toda mi vida: Mis padres, sin los que, por supuesto nunca habría llegado hasta aquí, siempre conmigo, en todas las circunstancias de mi vida, animándome a andar hacia adelante sin mirar atrás y confiando en mí, en mis decisiones…no he podido tener más suerte; Mª Jesús, apoyo incondicional desde que apareció en mi vida; Mi Antoñito, un pilar de los de verdad, de los que sabes que no se van; Mis abuelos, toda la vida acompañándome; Mis tíos Marta y José Mari, entiendo que son la definición de familia con mayúsculas; mis primos Ion y Jose Mari, personas con corazón noble de verdad… Todos mis amigos, todos los que han aportado algo bueno, sigan en mi vida o no. Podría seguir así y escribir una tesis mucho más larga que la que viene a continuación sobre todas estas personas y muchas más que no nombro aquí, pero me van a echar por pesada… Os quiero ABREVIATURAS 6-OHDA: 6-hidroxidopamina ABA: Applied behaviour analysis ACh: Acetilcolina ADNc: ADN complementario AIM2: Absent in melanoma 2 Apa-f: Apoptosis protease-activating factor-1 Apo2L: Apoptosis-inducing ligand 2 Apo3L: Tumor necrosis factor ligand superfamily member 12 ARNm: ARN mensajero ATV: Área tegmental ventral Bak: Bcl-2 homologous antagonist/killer BAX: BCL2 associated X protein Bcl2: B-cell lymphoma 2 BSA: Bovine serum albumin BTBR: Cepa transgénica BTBR T+Itpr3tf/J C3KO: Floxeado/Delecionado en caspasa-3 Cre+ C57BL: Cepa C57 black 6 C8KO: Floxeado/Delecionado en caspasa-8 Cre+ CA1: Cornu Ammonis 1 CARD: Caspase activation and recruitment domains CD14: Cluster of differentiation 14 c-IAP1: Inhibitor of apoptosis 1 Clec7a: C-type lectin domain family 7 member A or Dectin-1 CNTNAP2: Contactin-associated protein-like 2 gene COMT: Catecol-O-Metiltransferasa CPP32-/-: 32-kDa putative cysteine protease Cpu: Caudado-putamen CX3CR1: CX3C Chemokine receptor 1 or fractalkine receptor DA: Dopamina DAB: 3,3´-Diaminobencidina DAérgico: Dopaminérgico DAM: Disease-associated microglia DAT: Transportador de recaptación de DA dATP: Deoxyadenosine triphosphate DD: Death domain DED: Death-effector domain DENVER: Early start Denver model DISCs: Death-inducing signaling complexes DOPA: Dihidroxifenilalanina DOPAC: Ácido 3,4-dihidroxifenilacético DR3: Death Receptor 3 DR4: Death Receptor 4 DR5: Death Receptor 5 EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético EP: Enfermedad de Parkinson FADD: Fas-associated death domain FasL: Fas Ligand FasR: Fas Receptor FDA: Food and Drug Administration FLIPL: FLICE-Like inhibitory protein long Flox/Del: Floxeado/Delecionado Cre- (Hemidelecionado) Flox/Flox: Doble floxeados en caspasa GABA: Ácido γ-aminobutírico GABAérgicas: Gabaérgicas Gal3: Galectina 3 GB: Ganglios basales GP: Globo pálido GPe: Globo pálido externo GPi: Globo pálido interno GPL: Globo pálido lateral GPM: Globo pálido medial GR: Glucocorticoid receptor GWAS Genome-wide association study HLA: Human leukocyte antigen HPLC: High performance liquid chromatography HPLC-ED: High performance liquid chromatography-electrochemical detector HVA: Ácido homovalínico i.p.: Intraperitoneal Iba1: Ionized calcium binding adaptor molecule 1 ICE: Interleukin-1 converting enzyme (caspasa-1) IL-18: Interleuquina-18 IL-1β: Interleuquina-1β IMAO-B: Inhibidores de la MAO-B iNOS: Inducible nitric oxide synthase IP: Ioduro de propidio KO: Knock-out L-DOPA: Levodopa LPS: Lipopolisacárido bacteriano LSD: Least significant difference LTD: Long term depression LTP: Long term potentiation MAO B: Monoamino oxidasa B MCP: Muerte celular programada MHC II: Major histocompatibility complex class II MPDP+: 1-metil-4-fenil-2,3-dihidropiridina MPP+: 1-metil-4-fenilpiridinium MPPP: 1-metil-4-fenil-4-propionpiperidina MPTP: 1-metil-4-fenil,6-tetrahidropiridina Nacc: Núcleo accumbens NADPHox: NADPH oxidasa NEM: Neuronas espinosas medianas NF-Κb: Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NLR: Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors NST: Núcleo subtalámico O2-: Ión superóxido PARP: Poly (ADP-ribose) Polymerase pb: Pares de bases PBS: Phosphate buffered saline PBS-T1%: PBS-Tritón al 1% PCR: Polymerase chain reaction PECS: Picture exchange communication system PET: Positron emission tomography PSD: Postsinaptic density PSD95: Postsynaptic density protein 95 PV: Pálido ventral RIP: Receptor-interacting protein RIP-1 kinasa: Receptor-interacting protein kinase 1 RLOs: Radicales libres de oxígeno RRF: Formación reticular retrorrubral RT-PCR: Real time PCR s.c.: Subcutánea SN: Substantia nigra SNc: Substantia nigra compacta SNr: Substantia nigra reticulada TAE: Tris base/ácido acético/EDTA TEA: Trastorno del espectro autista TEACCH: Treatment and education of autistic related communication handicapped children TH: Tyrosine hydroxylase TH-IRES: Tyrosine hydroxylase-internal ribosomal entry sequence TNF: Tumor necrosis factor TNFR1: Tumor necrosis factor receptor 1 TOC: Trastorno obsesivo-compulsivo TRADD: Tumor necrosis factor receptor type 1-associated DEATH domain protein TRAF2: TNF receptor-associated factor 2 TRAILR1 y TRAILR2: TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 1 y 2 TREM2: Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 U.A: Unidades arbitrarias VMAT2: Vesicular monoamine transporter 2 WT: Wild type Z-DEVD-FMK: Z-D(OMe)E(Ome)VD(OMe)-FMK α-sin: Alfa-sinucleina https://www.flickr.com/photos/erre3/2048871965l RESUMEN / ABSTRACT https://www.flickr.com/photos/erre3/2048871965l RESUMEN 1 El trastorno del espectro autista (TEA) y la enfermedad de Parkinson (EP) son dos desórdenes neurológicos que presentan elevada prevalencia con un coste socioeconómico importante y una fuerte carga para los pacientes y sus familiares, por lo que sus causas son un importante objeto de estudio. Estos dos desórdenes tienen en común la implicación del sistema dopaminérgico (DAérgico). Se ha demostrado que las caspasas asesinas, entre ellas caspasa-3 y caspasa-8, tienen otras muchas funciones aparte de su conocida participación en fenómenos de apoptosis. Así, por ejemplo, nuestro grupo es el primero en demostrar que a nivel neuronal las caspasas asesinas juegan un importante papel en el neurodesarrollo y en la homeostasis neuronal del sistema DAérgico. Con estos antecedentes, en el presente trabajo se han estudiado dos modelos animales delecionados en caspasa-3 o caspasa-8 en el linaje catecolaminérgico; Caspasa 3f/d TH-IRESCre (Caspasa 3 floxeado/delecionado Tyrosine hydroxylase-internal ribosomal entry sequence) y Caspasa 8f/d TH-IRES-Cre, para así dilucidar el papel de estas caspasas en la funcionalidad y desarrollo del sistema DAérgico, así como su posible implicación en el TEA y la EP. Nuestro estudio muestra importantes alteraciones en las vías DAérgicas para ambos modelos animales, principalmente en la vía nigro-estriada, aunque se presumen posibles cambios en las vías mesolímbica y mesocortical. Además, los animales carentes de caspasa3 y caspasa-8 presentan rasgos fenotípicos muy acordes con el TEA, principalmente a nivel conductual, así como aspectos bioquímicos de este desorden que, de hecho, podrían justificar sus síntomas principales. Por ello, concluimos que la carencia de caspasa-3 o caspasa-8 en el linaje catecolaminérgico podría dar lugar a un modelo animal que mimetice algunas características biomoleculares y conductuales de esta enfermedad, completando los estudios existentes hasta ahora en cuanto a modelos animales para el TEA. Por otro lado, la muerte de las neuronas DAérgicas es la principal característica neuropatológica de la EP y la principal causante de sus síntomas. Además, existen evidencias de apoptosis extrínseca e intrínseca y de la implicación de las caspasas-3 y -8 durante la enfermedad. Para nuestro estudio se utilizó un modelo animal sub-agudo de EP por tratamiento con la neurotoxina 1-metil-4-fenil,6-tetrahidropiridina (MPTP), que induce la muerte apoptótica DAérgica. Teniendo en cuenta la participación de las caspasas asesinas en la apoptosis de las neuronas DAérgicas que acontece a la EP y en la regulación de fenómenos RESUMEN 2 de muerte celular, se postuló que la ausencia de las caspasas-3 y -8 en el linaje catecolaminérgico, podría proteger frente a la muerte neuronal DAérgica tras el tratamiento. Nuestro estudio muestra cómo la ausencia de caspasa-3 o caspasa-8 no protege frente a la depleción DAérgica tras el tratamiento, ya que los fenómenos de muerte celular continúan desarrollándose. De hecho, la ausencia de caspasa-3 parece ser especialmente perjudicial, ya que la muerte neuronal en estas condiciones se desvía a necrosis, con fenómenos inflamatorios asociados importantes, junto a una mayor degeneración neuronal DAérgica. La ausencia de caspasa-8 sin embargo, no produce cambios en la degeneración, ya que se desarrollan fenómenos de apoptosis intrínseca, normales en el modelo, evitando la respuesta inflamatoria. ABSTRACT 3 Autism spectrum disorder (ASD) and Parkinson's disease (PD) are two neurological disorders that produce an important socioeconomic impact and a heavy burden for both patients and their families. These two disorders have in common the involvement of the DAergic system. It has been shown that killer caspases, including caspase-3 and caspase-8, have many other functions apart from their involvement in apoptosis phenomena. For example, our study is the first one to address that killer caspases play an important role in the development and the homeostasis of the DAergic system. Considering this background, we studied two knock-out (KO) animal models in the catecholaminergic lineage (Caspase 3f/d TH-IRES-Cre and Caspase 8f/d TH-IRES-Cre) to elucidate the role of these enzymes in the functionality of the DAergic system and their possible implication in ASD and PD. Our study shows important alterations in DAergic pathways in both animal models, mainly in the nigro-striatal pathway, although possible changes in the mesolimbic and mesocortical pathways are presumed. In addition, animals lacking caspase-3 and caspase-8 showed robust phenotypic features congruent with ASD, mainly behavioural, although we also observed biochemical aspects of this disorder that could justify their main symptoms. Therefore, we conclude that caspase-3 or caspase-8 depletion in the catecholaminergic lineage could lead to an animal model that mimics biomolecular and behavioural aspects of the disease. On the other hand, the death of DAergic neurons is the main neuropathological characteristic of PD and the main cause of its motor symptoms. Likewise, there is evidence of extrinsic and intrinsic apoptosis with the involvement of caspase-3 and -8 during the disease. For our study, we used a sub-acute MPTP model of PD in strains lacking caspase-3 and -8, which caused permanent symptoms of the disease by inducing death of DAergic neurons in the SN. Taking into account the involvement of killer caspases in the apoptosis phenomena and in the regulation of cell death, it was postulated that the absence of either caspase-3 or - 8 in the catecholaminergic lineage could protect against DAergic depletion. However, our study shows that absence of caspase-3 or caspase-8 does not protect against DAergic depletion after MPTP treatment, due to other cell death phenomena continue in development. In fact, the absence of caspase-3 seems to be especially detrimental, since in these conditions neuronal death switch to necrosis, with important associated inflammatory phenomena along with greater DAergic degeneration. On the contrary, caspase-8 absence does not produce changes 4 ABSTRACT in neuronal degeneration, since an intrinsic apoptotic occurs, although avoiding the inflammatory response. Santiago Ramón y Cajal INTRODUCCIÓN Santiago Ramón y Cajal INTRODUCCIÓN 5 1. LAS CASPASAS 1.1 LAS CASPASAS Y LA VÍA APOPTÓTICA Las caspasas son un grupo de enzimas homólogas entre sí, pertenecientes al grupo de las cisteina-proteasas. El término caspasa (cisteinil-aspartato-proteasas) hace referencia a sus propiedades catalíticas, es decir, presentan el mecanismo de proteinasa de la cisteína, y fragmentan específicamente residuos de ácido aspártico. Históricamente, las caspasas han sido estudiadas principalmente por sus propiedades proapoptóticas. El proceso fisiológico denominado apoptosis se define como un tipo de muerte celular programada que tiene como fin controlar el desarrollo y crecimiento celular. Además, también se desencadena por reacciones inmunes o daño celular (Norbury y Hickson, 2001). Ciertos componentes de la apoptosis fueron descritos muchos años atrás (Kerr et al., 1972; Paweletz, 2001; Kerr, 2002), pero no fue hasta el estudio de la “muerte celular programada” durante el desarrollo del nematodo Caenorhabditis elegans, que se comprendieron los mecanismos del proceso biológico (Horvitz, 1999). La apoptosis, al ser irreversible, es un proceso muy regulado que puede comenzar de dos formas: “Vía receptores de muerte o extrínseca” o “vía mitocondrial o intrínseca”. En la vía extrínseca la señal de muerte viene del exterior de la célula, a través de ligandos que interaccionan con receptores de muerte como TNFR1 (Tumor necrosis factor receptor 1) o FasR (Fas Receptor) (Yamada et al., 2017). En la vía intrínseca la señal de muerte proviene del interior de la célula. La mayoría de tipos de estrés celular, como daños en el ADN, estrés en el retículo endoplásmico etc, desencadenan una apoptosis intrínseca cuando el daño es irreversible (Green y Llambi, 2015). Vía extrínseca: En la vía extrínseca de inicio de apoptosis participan receptores transmembrana que interaccionan con ligandos provenientes del exterior celular. Estos receptores de muerte pertenecen a la familia TNF (Tumor necrosis factor) (Locksley et al., 2001) y comparten un dominio extracelular rico en cisteína y uno citoplasmático llamado “dominio de muerte” (DD, del inglés Death domain) (Ashkenazi y Dixit, 1998). Este dominio juega un papel fundamental en la transmisión de la señal de muerte desde la superficie celular a la vía intracelular. Los ligandos y receptores de muerte mejor caracterizados son: FasL (Fas Ligand)/FasR, TNF /TNFR1, Apo3L (Tumor necrosis factor ligand superfamily member 12)/DR3 (Death receptor 3), Apo2L (Apoptosis-inducing ligand 2)/DR4 (Death receptor 4) y Apo2L/DR5 (Death receptor 5). DR4 y DR5 también son conocidos como TRAILR1 y TRAILR2 (TNF-related INTRODUCCIÓN 12 al., 1998), Apaf-1 (Cecconi et al., 2008) y citrocromo c (Hao et al., 2005) también muestran el fenotipo cerebral deficiente descrito anteriormente, con sobre-expansión de la corteza o mesencéfalo y oclusión ventricular en embriones. La severidad del fenotipo es variable, lo que sugiere que se pueden estar activando otras vías de muerte independientes de caspasas (Clarke, 1990; Zaidi et al., 2001). En contextos no apoptóticos, Fernando et al. (2005) sugieren que la caspasa-3 presenta un papel importante en la diferenciación de células madre neurales. Los autores muestran mediante la generación de neuroesferas clonadas del estriado de embriones murinos E14.5, que la actividad de la caspasa-3 en progenitores neuronales facilita la neurogénesis. Sorprendentemente, a pesar de la actividad de caspasa-3 no se observa la activación de la Poli ADP ribosa polimerasa (PARP, del inglés, Poly (ADP-ribose) Polymerase), sustrato de caspasa-3 durante la apoptosis. Además, también se observa que la inhibición de la caspasa3 altera proteínas asociadas con la diferenciación de las neuroesferas y la retrasa. Fernando et al. (2005) también demuestran que la inhibición de caspasa-3 altera la morfología de las neuroesferas. La diferenciación va seguida normalmente de la extensión de neuritas, proceso que mimetiza la ramificación de axones y dendritas in vivo. La inhibición de caspasa-3 reduce la extensión de neuritas sugiriendo su participación en los cambios morfológicos que tienen lugar durante la neurogénesis. En este contexto, Williams et al. (2006) y Kuo et al. (2006) han estudiado el pruning en la arborización dendrítica de neuronas en Drosophila demostrando la participación de caspasas. Los autores demuestran que su actividad se restringe a compartimentos dendríticos específicos durante el pruning de las neuronas y está ausente en el soma o axones. 1.4.1.2 LA CASPASA-3 Y LA NEUROPLASTICIDAD Santiago Ramón y Cajal (1894) fue el primero en aventurar que la fuerza en las conexiones sinápticas era la base del aprendizaje. “El ejercicio mental facilita un mayor desarrollo de las estructuras nerviosas en las partes del cerebro en uso. Así, conexiones preexistentes entre grupos de células podrían verse reforzadas por la multiplicación de terminales nerviosos” (Conferencia de Ramón y Cajal en The Royal Society 1894). Estos cambios en la fuerza sináptica es lo que conocemos como plasticidad neuronal. Las sinapsis químicas no son estructuras fijas, de tal forma que puede variar el número de receptores y canales, el número de vesículas o la forma de la superficie de membrana del contacto sináptico, todo ello en función de la actividad de dicha sinapsis. Esta capacidad de cambio se denomina plasticidad INTRODUCCIÓN 13 neuronal. El cambio (o cambios) que potencian o debilitan la comunicación sináptica en función de la actividad neuronal y que se mantiene en el tiempo se denomina potenciación a largo plazo (LTP) del inglés Long term potentiation, o depresión a largo plazo (LTD) del inglés Long term depression. Estos cambios probablemente son la base para la formación de recuerdos o el almacén de información (memoria). La idea del papel no apoptótico de la caspasa-3 relacionado con la plasticidad sináptica está apoyado por dos sucesos: 1) Muchas proteínas fundamentales en la plasticidad sináptica son sustratos de la caspasa3 (Chan y Mattson, 1999). 2) Hallazgos in vivo e in vitro indican su participación en procesos de aprendizaje y memoria (Dash et al., 2000). Por ahora, todos los estudios publicados se han realizado mediante el inhibidor específico de caspasa-3 Z-DEVD-FMK, pero no mediante aproximaciones genéticas. Bravarenko et al. (2006) mostraron que el bloqueo de la actividad caspasa-3 en el organismo Helix lucorum mediante su inhibidor, prevenía el desarrollo de la LTP, indicando un papel importante de la caspasa-3 en la plasticidad a largo plazo. Huesmann y Clayton (2006) sin embargo, mostraron por primera vez la presencia de caspasa-3 activada in vivo en terminales post-sinápticos de neuronas de la región auditiva cerebral del zebra finch, y usando el inhibidor de esta proteasa, demostraron que su actividad era necesaria para la habituación a largo plazo a una canción. Por otra parte, los efectos de la inhibición de caspasa-3 en diferentes tipos de aprendizaje y memoria también han sido estudiados en ratas adultas tras la administración del inhibidor (Stepanichev et al., 2005). Así, se ha demostrado que dicho tratamiento disminuye el número de evitaciones en test de comportamientos de aprendizaje por evitación, o disminuye la reacción por sobresalto acústico. A nivel electrofisiológico, Gulyaeva et al. (2003) demostraron que la caspasa-3 activada era necesaria para la LTP en la región CA1 (Cornu Ammonis 1) de hipocampo de rata. 2. LAS SINAPSIS Las sinapsis son estructuras mediante las cuales las neuronas intercambian información. Suelen clasificarse en dos tipos según la transmisión del impulso: sinapsis eléctrica y sinapsis química. Se calcula que cada neurona puede recibir en torno a 10000 sinapsis y enviar información a través de unas 1000. INTRODUCCIÓN 14 Dentro del grupo de las sinapsis químicas (mediadas por neurotransmisor), la sinapsis que se establece entre un terminal axónico y una estructura dendrítica es la más común, esta sinapsis puede ocurrir bien sobre la propia dendrita o bien sobre una espina dendrítica. A este tipo de sinapsis se les llama axo-dendríticas o axo-espinosas, respectivamente. La nomenclatura habitual es nombrar en primer lugar el elemento presináptico seguido del postsináptico. Así, existen sinapsis axo-axónicas, axo-somáticas y dendro-dendríticas. No se tiene constancia de la existencia de somato-axónicas. También existe la posibilidad de que algunas neuronas puedan hacer sinapsis consigo mismas, es decir, pueden formar una sinapsis a través de su terminal axónico y una de sus dendritas. A este tipo de sinapsis se les llama autapsis (Figura 4). Figura 4. Representación de diferentes tipos de sinapsis química. Adaptado de (Megías, 2018). También existe una clasificación basada en las características morfológicas de las sinapsis químicas, atendiendo a las diferencias en el espesor de la densidad postsináptica (PSD, del inglés Postsinaptic density), comprendiendo por una parte las asimétricas (mayor espesor, en su mayoría excitatorias) y las simétricas (menor espesor, en su mayoría inhibitorias) (Colonnier, 1968; Garner y Kindler, 1996). 2.1 ELEMENTOS SINÁPTICOS Durante las sinapsis químicas, existen dos regiones de especial actividad, por una parte, la región PSD, donde las proteínas involucradas participan en el tráfico y anclaje de receptores INTRODUCCIÓN 15 de neurotransmisores y en la modulación de la actividad de los mismos (Garner y Kindler, 1996). Y por otra parte “la zona activa”, que es el complejo de proteínas o estructura que media el acoplamiento y fusión de las vesículas presinápticas. (Landis, 1988; Hell y Ehlers, 2008). La zona activa está caracterizada por la presencia de una red de finos filamentos, fundamentalmente de actina y sinapsina (Greengard et al., 1994), que se extienden en la cara citosólica de la membrana presináptica. Tales filamentos interaccionan con las vesículas sinápticas y parecen estar implicados en guiarlas a los lugares determinados para que se produzca la fusión vesicular (Doussau y Augustine, 2000). El citoesqueleto de los filamentos de actina interacciona con varias proteínas implicadas en el anclaje de las vesículas sinápticas organizándolas así en la zona activa, y agrupando los canales de calcio voltaje-dependientes y la maquinaria de exocitosis celular (Doussau y Augustine, 2000). Entre ellas destacan Mun13, Mun18, Piccolo, Bassoon y Rim (Cases-Langhoff et al., 1996; Wang et al., 1997; Betz et al., 1998; Dieck et al., 1998; Garner y Nash, 2001) Otro elemento característico de la zona activa son los canales de calcio voltaje dependientes, que están ordenados en la proximidad de los sitios de fusión vesicular. El número de canales presentes puede determinar la fuerza y plasticidad de las sinapsis de la zona activa (Sheng et al., 2012). La liberación de neurotransmisores depende principalmente de la actividad de los canales de tipo P/Q y de tipo N (Dunlap et al., 1995; Turner y Dunlap, 1995). Por otra parte, la sinaptofisina es considerada la principal proteína de las vesículas presinápticas (constituye el 10% del total de proteínas) (Takamori et al., 2006). En la región PSD encontramos dos proteínas de interés: una de ellas es PSD95 (Postsynaptic density protein 95), que está localizada casi exclusivamente en esta región (Hunt et al., 1996) y participa en el andamiaje de proteínas sinápticas en las sinapsis excitatorias, destacando la interacción con el receptor NMDA, los receptores AMPA y los canales de potasio (Sheng y Sala, 2001). Además, PSD95 presenta un papel fundamental en la plasticidad sináptica y en la regulación del LTP (Meyer et al., 2014). La otra proteína de interés de la región PSD es la gefirina con función análoga a PSD95, pero formando parte, en cambio, de la red proteica postsináptica inhibitoria. Además, es considerada la mayor proteína de andamiaje en este tipo de sinapsis y parece estar implicada en el agrupamiento de los receptores glicina y su homólogo, el receptor GABA-A en la región postsináptica controlando el número, densidad y ratio de ambos (Alvarez, 2017). INTRODUCCIÓN 16 2.2 ESPINAS DENDRÍTICAS Las espinas son protuberancias del citoplasma de las dendritas de las células nerviosas. Su denominación fue impuesta originalmente por Santiago Ramón y Cajal en un artículo breve titulado “Estructura de los centros nerviosos de las aves”. El estudio se realizó usando el método de tinción desarrollado por el italiano Camilo Golgi y fue publicado el 1 de mayo de 1888 en el primer volumen de la Revista trimestral de Histología normal y patológica, escrita en español, y editada y financiada por el propio Santiago. La cita textual decía: “También, la superficie de las dendritas de las células de Purkinje aparece erizada con puntas o espinas cortas, las cuales en su ramificación terminal están representadas por ligeras asperezas” (Ramón y Cajal, 1888) (Figura 5). Hasta el desarrollo de la microscopía confocal en tejido vivo, se consideraba que las espinas se formaban durante el desarrollo embrionario y que permanecían estables después del nacimiento. Sin embargo, se ha podido demostrar que, de hecho, tienen una estructura dinámica que se renueva (Bonhoeffer y Yuste, 2002). Es decir, las espinas dendríticas son plásticas (Bonhoeffer y Yuste, 2002; Alvarez y Sabatini, 2007), pueden cambiar significativamente de forma, volumen e incluso desaparecer en periodos cortos de tiempo. Su mantenimiento y plasticidad depende de diversos factores, entre ellos la actividad de las sinapsis que contienen (González-Burgos et al., 2005). Figura 5. Dibujo de Santiago Ramón y Cajal de las neuronas del cerebelo de una paloma. Célula de Purkinje con multitud de espinas (A). INTRODUCCIÓN 17 La estructura de las espinas dendríticas clásicas consiste en una cabeza conectada con el eje dendrítico por un cuello estrecho. En la cabeza se encuentra la zona PSD que presenta receptores, canales y sistemas de señalización involucrados en la transmisión sináptica además de proteínas involucradas en la plasticidad sináptica (Kennedy, 2000). En los años ochenta, Harris y Stevens (1989) describieron tres formas fundamentales de espinas dendríticas con formas geométricas precisas: las llamadas espinas delgadas, cortas y en hongo. Ahora se conoce que cada una de ellas presenta un papel diferente en la transmisión del impulso sináptico en base a sus características geométricas. Aunque estos tres tipos de espinas son las más habituales y numerosas, se han ido describiendo otras con el paso de los años, como las dobles, las anchas y las ramificadas o perforadas (Gipson y Olive, 2017) (Figura 6). Las espinas con forma delgada y pequeña son más plásticas e inmaduras, y están relacionadas con procesos de aprendizaje, mientras que las espinas de mayor tamaño, como por ejemplo con forma de hongo, son más estables y menos plásticas y están relacionadas con la memoria (Kasai et al., 2003; Gipson y Olive, 2017). Estas últimas se ha visto que disminuyen de forma natural durante el envejecimiento o procesos de deterioro cognitivo. Mientras que las dendritas son elementos estables, encontramos espinas que según su vida media pueden clasificarse en transitorias, cuya duración es menor a cuatro días (espinas delgadas), o espinas persistentes, cuya duración es de 8 días o más pudiendo llegar a meses o años (espinas de mayor tamaño). El porcentaje de espinas persistentes va creciendo durante el desarrollo hasta la vida adulta (Holtmaat et al., 2005). Figura 6. Diagrama de diferentes tipos de espinas descritos en la literatura. Espina primordial (A), espina delgada (B), espina corta (C), espina en hongo (D), espina ancha (E), espina doble (F), espina ramificada o perforada (G). Adaptado de (González-Burgos, 2008). INTRODUCCIÓN 18 3. LOS GANGLIOS BASALES 3.1 DESCRIPCIÓN GENERAL En 1664, un anatomista inglés llamado Thomas Willis realizó una identificación detallada de las distintas estructuras subcorticales. Así, lo que ahora conocemos como ganglios basales (GB) entonces se denominaba corpus striatum. Se describió en una posición central, conectado con diferentes fibras corticales y al tronco cerebral, que en aquel tiempo se conocía como “sensorium commune” ya definido por Aristóteles. En aquel tiempo, se pensaba que esta estructura recibía todas las modalidades sensoriales e iniciaba todos los actos motores. De hecho, esta idea estaba reforzada por su posición anatómicamente ventral y por los sistemas de fibras ascendentes y descendentes (Parent y Hazrati, 1995). Pero hubo dos hechos que relevaron al corpus striatum a una posición más oscura y menos definida: la organización histológica de la corteza, y la posibilidad de localizar funciones superiores en la misma, por lo que muchos de los neurólogos de los siglos XVIII y XIX, pasaron a su estudio. Aquellos que continuaron estudiando el corpus striatum, fueron descubriendo que muchas de las funciones que se le habían asignado a esta estructura eran, de hecho, funciones de otras rutas corticoespinales vecinas. Como describió Wilson en 1914, “el corpus striatum se ha depreciado en su significación fisiológica”. Sin embargo, a principios del siglo XX volvieron a tener lugar serios intentos de proporcionar una descripción detallada de la estructura (Ramón y Cajal, 1911; Wilson, 1914). Finalmente, el corpus striatum recuperó su importancia, ya que se descubrió que las lesiones en estas áreas, desencadenaban desórdenes de las funciones motoras, y pasó a convertirse en el componente principal del sistema motor extrapiramidal. Este término, aunque de forma un tanto indefinida, agrupaba al corpus striatum con otra serie de núcleos del tronco cerebral, y presuponía que esta agrupación constituía una unidad motora completa e independiente. El término “ganglios basales” se ha utilizado generalmente para referirse a los núcleos anatómicos telencefálicos subcorticales localizados en la base del cerebro anterior agrupando al corpus striatum con la SN y el núcleo subtalámico (NST). INTRODUCCIÓN 19 Aunque en sentido estricto, los GB agrupan a los núcleos telencefálicos subcorticales, el cuerpo estriado y el núcleo amigdaloide, la SN junto al NST e importantes partes del tálamo, como la formación reticular, se consideran parte del sistema, ya que operan en estrecha asociación con ellos (Gerfen, 1992a). Figura 7. Distribución anatómica de los GB en el cerebro humano. Sin embargo, el concepto de GB no está definido con total claridad. Desde la primera descripción neuroanatómica hecha por Thomas Willis en 1664 (Parent, 1986), el concepto se ha modificado incluyendo nuevas estructuras, o redefiniendo y modificando los términos empleados en cada momento. Por ello, actualmente coexisten diversos modelos anatómicos y diversas taxonomías descriptivas (Sarikcioglu et al., 2008). Como el presente trabajo se centra en el estudio de la vía nigro-estriada y sus componentes, se va a tomar en consideración la clasificación de los GB que agrupa los núcleos caudado, putamen, globo pálido (GP), núcleo accumbens (Nacc), el NST, la SN y el área tegmental ventral (ATV) (Figura 7), aunque muchos autores consideran que el sistema canónico de GB englobaría también todas las áreas corticales que conectan con ellos (Gerfen, 2010). El caudado y el putamen provienen de la misma estructura telencefálica, por lo que están formados por el mismo tipo de células, fusionándose además por la parte anterior; al conjunto se le conoce como cuerpo estriado. El GP se divide en dos segmentos, el externo (GPe) y el INTRODUCCIÓN 20 interno (GPi). En los años 70, Hemier descubrió que el Nacc y la región que lo rodeaba, eran en realidad parte del estriado, y al conjunto lo denominó estriado ventral. Además, identificó células localizadas ventralmente a la estructura, de naturaleza palidal. Estas células son referidas como pálido ventral (PV) (Heimer, 1978) (Figura 8). Algunos autores establecen que el cuerpo estriado se puede diferenciar en estriado dorsal (caudado y putamen), estriado central (GP) y estriado ventromedial (Nacc) (Kreitzer y Malenka, 2008; Van den Bos, 2015; Grillner y Robertson, 2016). Figura 8. Distribución anatómica de los GB. La SN, aunque se encuentra en una situación más caudal, está incluida dentro de las estructuras de los GB por su estrecha relación anatómica y funcional. Es un núcleo mesencefálico que juega un papel central en el control del movimiento, y actúa como principal centro de salida y entrada a los GB (Parent et al., 1983; Fink y smith, 1990). El término “substantia nigra” se debe a la presencia de neuromelanina, un pigmento negro contenido en las neuronas de la parte compacta. La neuromelanina es un polímero, producto de la polimerización de quinonas del catecol presente en la dihidroxifenilalanina (DOPA), precursor de la dopamina (DA). La SN se divide en dos zonas: la parte reticulada (SNr), que citológicamente se parece al GP, y la parte compacta (SNc), que se encuentra más pigmentada, lo que da nombre a esta región (Parent y Hazrati, 1995). En roedores el sistema de GB incluye la corteza, el estriado, el globo pálido lateral (GPL), el NST, el globo pálido medial (GPM), equivalente al GPi en humanos, y la SN. El caudado y el INTRODUCCIÓN 21 putamen forman un núcleo único dando lugar al caudado putamen (CPu), que junto al Nacc constituyen el estriado (Figura 9). En este trabajo se van a hacer distinciones entre la neuroanatomía humana y murina en las estructuras donde los cambios sean relevantes, ya que la experimentación se ha realizado en ratones. INTRODUCCIÓN 28 compartimentos de mayor tamaño), y como cuerpos estriatales, estriosomas o parches (los compartimentos pequeños). La matriz ocupa el 80% del volumen del estriado y se diferencia químicamente de los estriosomas en sus concentraciones de neurotransmisores, neuropéptidos, y receptores (Prensa et al., 1999). Aún se desconoce mucho acerca de esta organización compartimental, pero se sabe que ambos territorios, además de ser neuroquímicamente distintos, presentan una conectividad diferente en cuanto a sus aferencias y eferencias (Eblen y Graybiel, 1995; Fujiyama et al., 2011). Además, muchos de los estriosomas o parches son químicamente heterogéneos, mostrando un núcleo y una periferia (Prensa et al., 1999). Por otra parte, gracias a estudios realizados en roedores se ha postulado que las interneuronas podrían actuar como unión de matriz y parches (Gerfen, 1984; Gerfen, 1985). En el caso de roedores, como se ha establecido anteriormente, el estriado está formado por el núcleo Cpu y el Nacc y principalmente por las NEMs que constituyen el 95% de su población neuronal (Kemp y Powell, 1971). Estas neuronas, se encuentran tan homogéneamente distribuidas, que el estriado no presenta una organización citoarquitectónica ordenada en contraste con otras estructuras como por ejemplo la corteza (Figura 14). Las demás neuronas estriatales son interneuronas (Bishop et al., 1982) que no proyectan fuera del estriado, pero que distribuyen sus axones por el mismo haciendo sinapsis con las NEMs. A pesar de ser relativamente infrecuentes (5%) (Roberts et al., 1996), las interneuronas del estriado de roedores son morfológica y neuroquímicamente variadas, (Kawaguchi y Kubota, 1993) y su clasificación es muy similar a la expuesta anteriormente. Sin embargo, habría que eliminar de esta clasificación las neuronas gigantes no espinosas inmunopositivas para calretinina, ya que no se han observado en roedores (Bennett y Bolam, 1993). En la Figura 15, se encuentra representado un diagrama de algunas de las interneuronas estriatales. En roedores, también encontramos la organización del estriado como un sistema de parches y matrices (Gerfen et al., 1987a; Gerfen et al., 1987b). Los primeros indicios de este tipo de organización compartimental provienen de estudios del desarrollo en los que se revela que las primeras proyecciones postnatales al estriado se distribuyen en parches, y que durante el desarrollo de la estructura se completa la matriz, revelando un desarrollo secuencial de este núcleo (Olson et al., 1972). INTRODUCCIÓN 29 Figura 14. A) Proyección de NEMs en estriado de ratón. A`) Proyección de una única neurona espinosa mediana. Adaptado de (Gerfen, 2004). INTRODUCCIÓN 30 Figura 15. Interneuronas estriatales en ratón. En el diagrama se muestran las principales interneuronas del estriado. A) Neuronas sin espinas de gran tamaño (Wilson et al., 1990). B) Distribución de cuerpos celulares (puntos negros) de neuronas colinérgicas. C) Imagen de neuronas inmunoreactivas a la colina acetiltransferasa. D) Neuronas sin espinas de tamaño medio. E) Distribución de cuerpos celulares parvalbúmina-positivos (puntos negros) y somatostatina-positivos (puntos blancos). Estos tipos de interneuronas estriatales se distribuyen de forma inversa, las neuronas de parvalbúmina son más numerosas dorsolateralmente y las de somatostatina ventralmente. F) Imagen neuronas inmunoreactivas a la parvalbúmina. G) Imagen de neuronas inmunoreactivas a la somatostatina. Adaptado de (Gerfen, 2004). 3.4.1.1 PROYECCIONES DEL ESTRIADO Eferencias desde el estriado Las NEMs del estriado dirigen fibras inhibitorias (GABérgicas) hacia la SN, (en su mayoría a la SNr) (Grofová, 1975; Lynd-Balta y Haber, 1994) y hacia ambos segmentos del GP. De forma clásica se han definido dos tipos de NEMs: 1) las estriadonigrales, que presentan una alta expresión de receptores de DA D1 y sustancia P y proyectan directamente al GPi y a la SNr (vía directa), y 2) las estriatopalidales, que presentan una alta expresión de receptores de DA D2 y encefalina y proyectan al GPe (vía indirecta) (Gerfen et al., 1992). El modelo clásico también propone que los parches proyectan a la SNc, mientras que la matriz proyecta a la SNr (Gerfen, 1992a; Gerfen, 1992b). Sin embargo, pese a la concreción que manifiestan estas proyecciones, se han cuestionado en numerosas ocasiones y su definición ha estado sujeta a cambios importantes. Según este modelo clásico, en las neuronas de proyección estriatales de la llamada vía directa de los GB, la información fluye desde el estriado a los núcleos de salida (GPi y SNr) y de allí al tálamo para volver a la corteza cerebral. En cambio, en las neuronas de proyección que forman la vía indirecta, la información pasa por el GPe y el NST antes de llegar a los núcleos de salida (DeLong, 1990). Aunque han ido apareciendo aportaciones que ponían en entredicho este modelo, como por ejemplo el descubrimiento de receptores D1 y D2 en la misma neurona de proyección (Aizman et al., 2000), no ha sido hasta el estudio de Lévesque y Parent (2005), cuando se ha empezado a comprender la complejidad del núcleo estriado. Lévesque y Parent realizaron un meticuloso estudio anatómico sobre la dirección que siguen los axones de las neuronas de proyección estriatales en primates, observando la matriz del núcleo caudado y del putamen, y el compartimento estriosomal del INTRODUCCIÓN 31 núcleo caudado. Gracias a este estudio se ha podido concluir: 1) no hay ninguna proyección del estriado que se dirija exclusivamente hacia el GPi o la SNr imposibilitando la existencia de las vías directa e indirecta (Bernácer María, 2006). 2) las neuronas de los parches proyectan a las dos regiones de la SN y al GP, no solo a la SNc (Bernácer María, 2006), y 3) el núcleo caudado, que como se describirá más adelante forma parte del estriado asociativo, proyecta en gran parte a la SN mientras que el putamen lo hace al GP; por tanto, la SN podría ser considerada un núcleo asociativo y el GP un núcleo sensiromotor (Bernácer María, 2006), confirmando el estudio de Wichmann y Kliem (2004), que establece la participación de la SN en procesos de memoria, atención y preparación del movimiento y la implicación del GP en procesos motores más básicos. En roedores al igual que en el humano, la base de la organización del estriado en el sistema de matrices y parches es la proyección de las NEMs a diferentes partes de la SN y del GPM. De hecho, se conoce que del 30-50% de las NEMs presentes en el núcleo Cpu proyectan a la SN (Bunney y Aghajanian, 1976). El modelo clásico también establece que las NEMs de los parches proyectan a las neuronas DAérgicas de la zona ventral de la SNc, mientras que las neuronas de la matriz proyectan a las neuronas GABAérgicas de la SNr (Gerfen et al., 1985; Gerfen, 1992a) (Figura 16). Sin embargo, en roedores también se ha puesto en duda este modelo, ya que Tokuno et al. (2002) han comprobado que las proyecciones de los parches llegan a ambas porciones de la SN y al GP. Figura 16. Organización del sistema de parches y matriz del estriado de ratón. Proyecciones estriado-SN. Adaptado (Gerfen, 2004). INTRODUCCIÓN 32 Aferencias al estriado Por otra parte, el estriado recibe aferencias excitatorias externas provenientes de otras estructuras, principalmente de la corteza o el tálamo (glutamatérgicas) (Smith y Bolam, 1990). La corteza cerebral prácticamente en su totalidad, proyecta al estriado, aunque la corteza sensorimotora es la que tiene mayor representación y la visual la que tiene menos (Parent 1990; Giménez-Amaya, 1991; Haber, 2003). Entre las cortezas de proyección podemos encontrar las cortezas asociativas, sensorimotoras y límbicas que proyectan de forma topográficamente ordenada al estriado, dividiéndolo así en territorios funcionalmente distintos (Kemp y Powell, 1970; Parent, 1990; Mai y Paxinos, 2011). Las sinapsis son en su mayoría asimétricas sobre las NEMs, preferentemente sobre la cabeza de las espinas dendríticas, (Hattori et al., 1979) y las proyecciones se dirigen tanto a los parches como a la matriz, de hecho, las proyecciones corticoestriatales son las que están más relacionadas con la compartimentación química del estriado. El tálamo es la segunda estructura con más aferencias al estriado después de la corteza, pero sus fibras no presentan un origen tan amplio, sino que este es específico de núcleos concretos. En este caso las proyecciones provenientes del tálamo, se dirigen a las NEMs y a las interneuronas colinérgicas, nitrérgicas, y GABAérgicas con parvalbúmina (Lapper y Bolam, 1992; Kawaguchi et al., 1995; Sidibe y Smith, 1999). Sus terminales proyectan sobre las NEMs formando sinapsis asimétricas más frecuentemente, sobre la propia dendrita. Las interneuronas, por otra parte, establecen contactos sinápticos en toda su superficie. En general, las terminales talámicas se organizan formando los parches en el estriado (Royce, 1978; Beckstead, 1984; Takada et al., 1985; de las Heras et al., 1998a; 1998b; McFarland y Haber, 2001; Avendaño et al., 2005). Las proyecciones nigro-estriatales también proyectan a las NEMs con sus terminales DAérgicos, pero, aunque sus conexiones no son tan numerosas, las capacidades modeladoras de la DA los hacen indispensables para el control del funcionamiento de las neuronas de proyección del estriado. Las fibras DAérgicas pueden inervar neuronas que están recibiendo aferencias de la corteza o el tálamo, a diferencia de las proyecciones corticales y talámicas mencionadas (Bouyer et al., 1984; Freund et al., 1984). También, a diferencia de las fibras coricoestriatales que presentan efectos localizados, una única fibra DAérgica puede establecer diferentes contactos en una misma dendrita y en diversas neuronas estriatales a la vez, pudiendo indicar que su especificidad modulatoria, es más fuerte en la dimensión temporal INTRODUCCIÓN 33 que en la espacial (Groves et al., 1994; Schultz, 2002). Se ha postulado que esta organización sináptica, puede ser el motivo por el que el estriado es capaz de procesar información del valor de una recompensa durante pruebas de comportamiento que conllevan la realización de tareas. Las NEMs podrían asociar señales del sistema DAérgico con claves ambientales procedentes de aferencias corticoestriatales (Schultz et al., 1993). A nivel neuronal, los terminales DAérgicos contactan con neuronas de proyección e interneuronas colinérgicas, nitrérgicas y GABAérgicas formando sinapsis simétricas (Kubota et al., 1987a; Kubota et al., 1987b; Pickel et al., 1992; Kawaguchi et al., 1995; Fujiyama y Masuko, 1996). El contacto sináptico con las interneuronas suele producirse en toda su superficie, sin embargo, con las NEMs se produce en el cuello de las espinas dendríticas mientras que la cabeza está recibiendo una proyección cortical (Bouyer et al., 1984; Freund et al., 1984). Por último, es interesante señalar que las terminales excitatorias (corticales y talámicas) suelan estar presentes en la parte distal del árbol dendrítico, pero que, sin embargo, las terminales inhibitorias y moduladoras (interneuronas y SN) están presentes cerca del soma. Este hecho sin duda facilita la regulación sobre las proyecciones excitatorias glutamatérgicas por parte de las proyecciones moduladoras DAérgicas e inhibitorias GABAérgicas (Bernácer María, 2006). En este caso se ha dado una explicación general sobre las aferencias al estriado y no se van a referir distinciones con roedores dado que no se conocen diferencias que vayan a afectar a nuestra experimentación. 3.4.2 LA SN La SN fue identificada por Vicq D`Azyr en 1786 quien la describió como la “tache noire”, aunque su asociación con la EP no se produjo hasta el siglo XIX (Brissaud, 1895; Bremer, 1920; Finger, 2001). La conexión entre el neurotransmisor DA y ésta estructura, se debe a Ehringer y Hornykeiwicz quienes descubrieron la depleción de DA en pacientes con Parkinson en 1960 (Ehringer y Hornykiewicz, 1960). La SN está constituida principalmente por neuronas DAérgicas aunque existen también neuronas GABAérgicas. Como fue referido con anterioridad, la estructura se divide citoarquitectónicamente en dos partes diferentes: 1) la SNc, formada por una capa horizontal empaquetada de células largas y medias que ocupan 1/3 del dorsal; y 2) la SNr, una división INTRODUCCIÓN 34 más difusa y pobre en células, que contiene neuronas medias y pequeñas dispuestas entre las SNc y el pedúnculo cerebral. Las neuronas de la SNr son principalmente GABAérgicas, en cambio, las neuronas de la SNc son principalmente DAérgicas, más grandes que las de la SNr con dendritas largas y pobres en espinas comparadas con otras regiones cerebrales, por ejemplo, con el hipocampo (Jang et al., 2015). Presentan sinapsis principalmente en sus dendritas, aunque también pueden tener lugar en los somas o las espinas (Jang et al., 2015), y es de las pocas estructuras en presentar sinapsis dendrodendríticas (Shepherd, 2009). Las neuronas DAérgicas en la SN han sido difíciles de clasificar en base a su morfología ya que no hay diferencias claras entre ellas (Yelnik et al., 1987), sin embargo, la distribución de sus dendritas presenta un interés particular ya que se relaciona con la organización de las aferencias (François et al., 1987). La distribución de dendritas (Tepper et al., 1987) revela dos poblaciones de células, la primera población situada en la zona dorsal de la SNc con dendritas que se extienden en el mismo plano, y la segunda población situada en la zona ventral de la SNc y en la SNr, con dendritas distribuidas hacia la SNr (Gerfen, 2004). Además de la DA y del GABA, se han encontrado otras sustancias activas en las células de la SN. La colecistoquinina, que ha sido propuesta como modulador de la liberación de diferentes neurotransmisores (Crawley, 1991; Wu y Wang, 1994; You et al., 1996), se expresa en una parte significativa de las células DAérgicas (Fallon et al., 1983; Hökfelt et al., 1984; Seroogy et al., 1989). La Calbindina D28k, la Calretinina y la Parvoalbúmina, se unen a Ca2+ intracelular (Heizmann, 1984; Baimbridge et al., 1992; Heizmann y Braun, 1992) y han sido relacionadas con la neuroprotección (Iacopino et al., 1990; Iacopino et al., 1992; Geloso et al., 1998) y con algunas propiedades fisiológicas de las neuronas (Carr et al., 1989). La calbindina se expresa en las neuronas DAérgicas de la parte dorsal de la SNc (Gerfen, 1992a). La calretinina se encuentra presente aproximadamente en el 50% de las neuronas DAérgicas de la SNc, y en una pequeña proporción en la SNr (Liang et al., 1996; McRitchie y Halliday, 1995). La parvalbúmina, por el contrario, sólo está presente en las neuronas GABAérgicas de la SNr (Reiner y Anderson, 1990; Rajakumar et al., 1994). 3.4.2.1 ORGANIZACIÓN DE NEURONAS DE LA SN Como se ha establecido, de acuerdo con su neurotransmisor, las neuronas nigrales se clasifican en DAérgicas y GABAérgicas (Dahlström y Fuxe, 1964; Hökfelt et al., 1984; Mugnaini, 1985), ambas involucradas en los diferentes desórdenes fisiopatológicos de los GB (Albin et al., 1989). Las neuronas GABAérgicas constituyen uno de los puntos de salida más INTRODUCCIÓN 35 importantes de los GB y proyectan al colículo superior, o al tálamo (Grofová et al., 1982; Appell y Behan, 1990; Moriizumi y Hattori, 1992; Redgrave et al., 1992). Las neuronas DAérgicas en cambio, tienen como blanco principal el estriado (Lindvall y Björklund, 1978; Fallon et al., 1983; Gerfen et al., 1985). Las neuronas DAérgicas de la SN corresponden al grupo de células de la zona A9 de Dahlström y Fuxe (1964) y debido a su disposición cerca del mesencéfalo, la formación reticular retrorrubral (RRF) y el ATV, se identificaron como A8 y A10 respectivamente. Esta clasificación se establece de acuerdo a su localización regional, y de alguna manera de acuerdo a su lugar de proyección (Björklund y Lindvall, 1984). La mayoría de las neuronas DAérgicas se localizan en la SNc, ATV, RRF y algunas en la SNr, (Hökfelt et al., 1984; Mugnaini, 1985; Smith et al., 1987; German y Manaye, 1993; Nelson et al., 1996). Sin embargo, la mayoría de las neuronas GABAérgicas se localizan en la SNr (Oertel et al., 1982). En humanos o primates, las neuronas DAérgicas de la SN se dividen en tres grupos en función de su localización, su inmunoreactividad a la calbindina y la orientación de sus dendritas (Figura 17): 1) Grupo de neuronas del nivel dorsal. 2) Grupo de neuronas del área densocelular 3) Grupo de neuronas del nivel ventral o grupo en columnas (Poirier et al., 1983; Halliday y Törk, 1986). Las neuronas del área dorsal están dispuestas de manera holgada y se extienden dorsolateralmente eludiendo las estructuras circundantes, se disponen orientadas horizontalmente de forma dorsal a la zona densocelular con las dendritas extendidas evitando el área ventral de la SNc. Estas neuronas además se mezclan con las células del área adyacente (ATV) y forman una banda de células con inmunoreactividad positiva para la calbindina. En cambio, las neuronas del nivel ventral (grupo densocelular y zona en columnas) presentan inmunoreactividad negativa para la calbindina (Lavoie y Parent, 1991; Haber et al., 1995; McRitchie y Halliday, 1995) y extienden sus dendritas ventralmente hacia la SNr. Además, expresan niveles altos de neuromelanina, D2 y del transportador de recaptación de DA (DAT), y presentan más vulnerabilidad frente a la neurotoxina MPTP (Lavoie y Parent, 1991; Parent y Lavoie, 1993; Haber et al., 1995). INTRODUCCIÓN 36 Figura 17. Esquema de la localización de neuronas DAérgicas en primates a nivel dorsal y ventral. Adaptada de (Haber, 2014). En roedores, la organización es similar, aunque el total de neuronas DAérgicas se puede dividir en 2 grupos, distribuyéndose también en función de su localización, inmunoreactividad a la calbindina y orientación de sus dendritas (Figura 18): 1) Grupo de neuronas de la zona dorsal. Este grupo incluye aquellas neuronas DAérgicas localizadas en el ATV, SNc dorsal y el RRF. Además, estas neuronas presentan otras características que las distinguen como su inmunoreactividad positiva para la calbindina o la distribución de toda la extensión de sus dendritas dentro del plano de la SNc distinguiéndose de aquellas situadas a nivel ventral. 2) Grupo de neuronas de la zona ventral. Las neuronas de este grupo están situadas en la zona ventral de la SNc y en los grupos de células de la SNr. A diferencia del grupo anterior estas neuronas no presentan inmunoreactividad positiva para la calbindina y se distinguen por presentar toda la extensión de sus dendritas dirigida ventralmente hacia la SNr (Gerfen, 2004). INTRODUCCIÓN 37 Figura 18. Distribución de neuronas DAérgicas en secciones coronales de ratón, a nivel rostral, (A) medio (B) y caudal (C). Las secciones adyacentes presentan subgrupos de neuronas DAérgicas inmunoreactivas a la calbindina (A`B`C`). El ATV y el área dorsal de la SNc es calbindina positiva. Mientras que el área ventral de la SNc es calbindina negativa. Nomenclatura: SNCD, área dorsal de la SNc; SNCV, área ventral de la SNc; VTA, área tegmental ventral; RRF, formación reticular retrorrubral. Adaptado de (Gerfen, 2004). 3.4.2.2 PROYECCIONES DE LA SN Eferencias desde la SN Como se ha establecido, el principal objetivo de las neuronas DAérgicas es el estriado (Lindvall y Björklund, 1978), concretamente las NEMs (Kung et al., 1998) y algunas interneuronas. Esta proyección nigro-estriada es principalmente ipsilateral, donde sólo un 5% de sus fibras cruzan al lado contralateral (Parent et al., 1983). Las aferencias y eferencias de la SNc al estriado presentan una topografía dorsoventral inversa, es decir, la SNc ventral proyecta sobre el área dorsal del estriado y viceversa (Haber, 2014). Así la SNc/ATV dorsal proyectan al estriado ventromedial (límbico), la zona densocelular INTRODUCCIÓN 44 problemas al estar de pie o al caminar, o disminución del equilibrio y la coordinación (Dauer y Przedborski, 2003). El síntoma motor inicial más frecuente (50% de los casos) es el temblor en reposo, que afecta unilateralmente a una extremidad. A este le sigue en frecuencia la alteración de la marcha, que afecta inicialmente a una pierna. Con menos frecuencia, el primer síntoma es la bradiquinesia. El síndrome es normalmente asimétrico, con patología de los GB en el hemisferio contralateral. Hay 4 manifestaciones típicas de la enfermedad que pueden resumirse usando el acrónimo TRAP (en inglés, trampa), y que muestra el hecho de que cuando estos síntomas aparecen claramente el paciente se encuentra ya atrapado por el curso inexorable de la enfermedad: temblor, rigidez, aquinesia y postura inestable. Estas se acompañan con frecuencia de alteraciones de la marcha y caídas. La rigidez parkinsoniana es de tipo “plástico”, es decir, el movimiento brusco no encuentra habitualmente resistencia a partir de los reflejos de estiramiento; los músculos, tanto antagonistas como sinergistas, permanecen contraídos fuertemente a lo largo del movimiento. Por tanto, se cree que la rigidez que caracteriza a esta enfermedad es el resultado, en gran parte, de un exceso de impulsos transmitidos por el sistema corticoespinal. Habitualmente se produce temblor; con una frecuencia normal que oscila de cuatro a seis ciclos por segundo. Por ejemplo, un tratamiento para el temblor en reposo en enfermos de EP es la destrucción quirúrgica del núcleo ventrolateral del tálamo. Esta es una de las vías de retroalimentación desde los GB hacia la corteza motora, por lo que se deduce que la pérdida de la influencia inhibidora de la DA en los GB, lleva al estímulo del circuito de retroalimentación corticobasal ganglionar-talámico-cortical, provocando una oscilación que produce el temblor muscular (Forno, 1981). Tanto la rigidez muscular como el temblor son angustiantes para los pacientes con EP, pero, sin duda, la acinesia que se produce en los estadios finales de la enfermedad es mucho más seria. Para poder realizar movimientos simples, la persona debe adoptar el mayor grado de concentración, y el esfuerzo mental necesario para realizar el “arranque” del movimiento está por encima, en muchas ocasiones, de la fuerza de voluntad del paciente. La acinesia parece estar motivada por la falta de liberación de DA por las fibras nigro-estriadas, en el núcleo caudado y putamen, lo que provoca una actividad excesiva de las neuronas productoras de ACh. El funcionamiento normal de los GB requiere un equilibrio correcto entre las actividades INTRODUCCIÓN 45 inhibitorias y excitatorias, y la pérdida de este equilibrio da lugar a un sistema de GB no funcional. Además de los síntomas clásicos, la enfermedad se manifiesta también con hipofonía (bajo volumen de voz), hipomimia (falta de expresión facial) entre otros. Estos síntomas pueden ir acompañados por alteraciones no motoras como desórdenes neuropsiquiátricos y del sueño, déficits olfativos, disfunción eréctil, etc (Chaudhuri et al., 2006). El comienzo es gradual; muchas de estas alteraciones comienzan años antes que las alteraciones motoras, y pueden preceder a la diagnosis basada en las mismas (Tolosa et al., 2009), aunque pueden ser mal interpretadas o pasar desapercibidas. Por ejemplo, la disfunción olfativa es un factor de riesgo de la enfermedad y aparece mucho antes que las alteraciones motoras. Esta fase clínica premotora podría extenderse durante más de 20 años. 4.2 CARACTERÍSTICAS NEUROPATOLÓGICAS En la EP se produce una patología severa de los GB, con especial afectación de la zona ventrolateral de la SNc (Tretiakoff, 1919; Brissaud, 1895; Dauer y Przedborski, 2003). Estas neuronas contienen bastante cantidad de neuromelanina y su pérdida produce la clásica despigmentación de la SNc (Marsden, 1983) (Figura 22). Por tanto, la característica neuropatológica fundamental en la EP es el “blanqueo” de la franja de la SN, normalmente negra o gris, como consecuencia de la muerte de las neuronas DAérgicas mielinizadas (Marsden, 1983). Ya que la enfermedad muestra una predilección especial por la zona ventrolateral de la SNc, es en esta región donde comienza la lesión, progresando después a la zona dorsal de esta estructura. Los cuerpos neuronales de la SNc, proyectan sus axones al putamen, por lo que la pérdida de neuronas DAérgicas en la SNc también se traduce en una depleción DAérgica del mismo. Para la manifestación de los síntomas clínicos, se requiere la muerte de al menos el 60-70% de las neuronas de la SNc y la depleción del 80% de la DA del putamen, lo cual refleja la alta plasticidad del sistema DAérgico nigro-estriado (Dauer y Przedborski, 2003). El patrón de pérdida celular parece ser paralelo a los niveles de expresión del transportador de DA, DAT (Uhl et al., 1994) y es consecuente debido a que la depleción de DA es más pronunciada en el putamen dorsolateral (Bernheimer et al., 1973), el principal lugar de proyección de la SNc ventrolateral. El grado de pérdida de terminales en el estriado parece ser mayor que la magnitud de pérdida de neuronas en la SNc, sugiriendo que los terminales INTRODUCCIÓN 46 DAérgicos del estriado son el primer objetivo del proceso neurodegenerativo y que la muerte neuronal podría ser resultado de una muerte “retrógrada” desde el estriado (Herkenham et al., 1991; Cheng et al., 2010). Figura 22. (A) Representación esquemática de la vía nigro-estriatal normal (en rojo). Los cuerpos celulares de la SNc proyectan (líneas sólidas) al estriado (núcleo caudado y putamen). La fotografía demuestra la pigmentación oscura normal de la SN debido a las neuronas DAérgicas mielinizadas. (B) Representación esquemática de la vía nigro-estriatal enferma (en rojo). Hay una pérdida marcada de neuronas DAérgicas que proyecta al putamen (línea discontínua) y una pérdida menor de neuronas DAérgicas que proyectan al caudado (línea fina). La fotografía muestra una despigmentación de la SNc por una marcada pérdida de neuronas DAérgicas. Adaptado de (Dauer y Przedborski., 2003). Además de la distribución especial de pérdida de neuronas pigmentadas en la SNc, otra de las características neuropatológicas de la enfermedad es la presencia de inclusiones eosinófilas, llamadas cuerpos de Lewy, presentes en las neuronas supervivientes (Forno, 1981). En clínica, el diagnóstico definitivo de la enfermedad requiere la identificación de ambas características neuropatológicas: cuerpos de Lewy y pérdida de neuronas DAérgicas de la SNc (Gibb y Lees, 1988). Estas inclusiones no son específicas en EP, también pueden ser encontradas en pacientes con Enfermedad de Alzheimer, en la demencia por cuerpos de Lewy, o de manera fortuita en personas de avanzada edad de forma incluso más frecuente que en personas con EP (Gibb y Lees, 1988). INTRODUCCIÓN 47 La primera descripción del depósito neuronal anormal con cuerpos de inclusión fue realizada por Fritz Heinrich Lewy en 1912 (Lewy, 1912), hallazgos que se publicaron en “Handbook of Neurology” de forma inicial; con posterior aparición en la revista alemana “Tonus and Bewegund” en 1923 (Lewy, 1923). Pero no fue hasta 1919, que C. Tretiakoff estableció la denominación formal, y a quien se debe la nomenclatura utilizada hoy día de “cuerpos de Lewy” (Tretiakoff, 1919). Años después, en 1961, Okazaki describió pacientes con demencia que presentaban cuerpos de Lewy en el neocortex (Okazaki et al., 1961); sin embargo, no fue hasta mediados de la década de los ochenta cuando, a través de métodos inmunohistoquímicos, se hizo una mejor identificación de los mismos. Ya en el año 1990, el grupo de trabajo de Hansen (Hansen et al., 1990), propone una entidad nosológica diferente a la demencia tipo Alzheimer; siendo en 1995 cuando se establece el término de “demencia por cuerpos de Lewy”, con una posterior revisión de criterios clínicos en 1999 y 2005 por el grupo liderado por McKeith (McKeith et al., 1999; 2000; 2005). Los cuerpos de Lewy son agregados proteicos citoplasmáticos que contienen fundamentalmente formas filamentosas, presentan además un centro denso con filamentos que se orientan radialmente. Su formación, parece ser debida a una acumulación anormal de proteínas del citoesqueleto dentro de la neurona, principalmente de α-sinucleina (α-sin), así como de ubiquitina (Brück et al., 2016) (Figura 23). El papel de los cuerpos de Lewy en la muerte neuronal está sujeto a controversia ya que existe un debate sobre si causan muerte neuronal directamente o si preservan la viabilidad neuronal aislando pequeños agregados tóxicos celulares (Goldberg y Lansbury, 2000). Existen también algunas teorías que indican que las inclusiones, son un mecanismo para compartimentalizar las proteínas defectuosas acumuladas e impedir que obstaculicen el funcionamiento normal de la célula. INTRODUCCIÓN 48 Figura 23. Marcaje inmunohistoquímico de inclusiones intraneuronales llamadas cuerpos de Lewy. El marcaje inmunohistoquímico con un anticuerpo contra la α-sin revela un cuerpo de Lewy con una intensa zona inmunoreactiva central. Por el contrario, el marcaje inmunohistoquímico contra la ubiquitina revela una zona más difusa de inmunoreactividad. Adaptado de (Dauer y Przedborski, 2003). Aunque la pérdida neuronal se localiza de forma inicial en la SN, posteriormente y a medida que la enfermedad avanza, la patología progresa a otras áreas de los GB y el tronco cerebral. Sin embargo, existen teorías que sugieren que la neurodegeneración comienza en la corteza entorrinal, de manera que la muerte celular se inicia en esta área y continúa con la degeneración de la SN (Braak et al., 1996). Pero, teniendo en cuenta los numerosos estudios en los que se muestran los importantes cambios patológicos que ocurren en la SN, esta parece ser la primera región cerebral afectada por el proceso degenerativo. La neurodegeneración se extiende mucho más allá. Se ha encontrado degeneración y formación de cuerpos de Lewy en el núcleo periamigdaloide, el locus coeruleus (noradrenérgico), el núcleo motor dorsal del vago (colinérgico), en los núcleos del rafe (serotoninérgico), el hipotálamo y la corteza (especialmente la corteza entorrinal) (Dauer y Przedborski, 2003), entendiéndose así la variedad sintomática que presenta la enfermedad. Pero, es la pérdida de DA en los GB la que produce, al parecer, los signos neurológicos más severos (Patt et al., 1991). 4.3 DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD El diagnóstico de la EP se basa de forma general en los datos clínicos expuestos con anterioridad. Sin embargo, existen nuevas técnicas de imagen (PET), que pueden tener un papel importante en la diferenciación entre los distintos síndromes parkinsonianos o en el diagnóstico preclínico de la enfermedad (Forno, 1981). Clínicamente cualquier enfermedad que produzca deficiencia de DA estriatal o daño estriatal conduce a síndromes parkinsonianos. Este síndrome produce los mismos síntomas que la EP, pero no debe confundirse con la misma porque, aunque la EP es la causa más común de parkinsonismo, no todos los parkinsonismos son producidos por la EP. El tratamiento médico existente para la EP suele ser eficaz y debe continuarse durante el resto de la vida del paciente. En cada caso, el grado de mejoría alcanzado con los diversos fármacos empleados es variable. Dichos tratamientos, hoy día no son curativos, sólo paliativos y no consiguen frenar el curso de la enfermedad. En general, se fundamenta en las medidas siguientes: INTRODUCCIÓN 49 A) Medicamentos basados en la DA: L-DOPA (levodopa), precursor de la DA. Se suele añadir a la levodopa un inhibidor periférico de DA, para aumentar la eficacia y disminuir los efectos secundarios de los mismos. Los pacientes reciben un importante beneficio con el tratamiento de levodopa durante unos 5-7 años, pero luego aparecen complicaciones motoras derivadas del tratamiento. B) Agonistas DAérgicos: Son fármacos que estimulan los receptores DAérgicos. Estos fármacos aparte de estimular estos receptores, tienen actividad sobre otros sistemas neuroquímicos, principales responsables de sus efectos secundarios o de la mejoría de síntomas no motores, como la depresión. Los efectos secundarios de los agonistas DAérgicos son similares a los de la levodopa pero más frecuentes. C) Inhibidores de la MAO: IMAO-B. Inhiben la MAO-B, enzima que degrada la DA, por lo que la mantienen activa más tiempo en el cerebro. Son fármacos bien tolerados, con mínimos efectos secundarios. D) Anticolinérgicos: En la EP las vías colinérgicas se encuentran excesivamente activas debido a la ausencia de DA, produciendo algunos de los síntomas motores asociados a la enfermedad. Estos fármacos son efectivos sobre el temblor, menos sobre la rigidez, y poco sobre la bradicinesia. Los numerosos efectos secundarios los hacen poco atractivos para las personas mayores. Sin embargo, aunque para la mayoría de los pacientes estas medidas son suficientes para mantener una buena calidad de vida, debe considerarse el tratamiento quirúrgico cuando la enfermedad progresa o cuando estos medicamentos no mejoran la movilidad o producen efectos adversos significativos. El tratamiento quirúrgico puede ser irreversible, lesionando núcleos que funcionan de forma exagerada (palidotomía y talamotomía) o reversible estimulando eléctricamente núcleos cerebrales (estimulación cerebral profunda). La mayoría de pacientes de EP sufren deficiencias motoras importantes tras 5-10 años de enfermedad, aunque hayan sido tratados sintomáticamente (Dauer y Przedborski, 2003). 4.4 MECANISMOS DE MUERTE NEURONAL EN LA EP ¿Cómo mueren las neuronas DAérgicas? ¿Existe en mecanismo de muerte celular común en todos los pacientes con EP? En este apartado se tratarán los distintos mecanismos de muerte neuronal que se han relacionado con la EP. INTRODUCCIÓN 50 Se ha observado que existen una gran variedad de mecanismos de muerte neuronal relacionados con la EP, entre ellos, mecanismos de muerte celular programada (MCP), mecanismos de muerte celular no programada o accidental (necrosis) y mecanismos de muerte celular regulada. Dentro de los mecanismos de muerte celular regulada se encuentran los dependientes de caspasas (anoikis, catástrofe mitótica y piroptosis) y los independientes de caspasas (ferroptosis). La MCP es crucial durante el desarrollo como mecanismo homeostático, pero se conoce que el descontrol de estas vías en el cerebro puede contribuir a la neurodegeneración. Podemos definir dos tipos de MCP, la dependiente de caspasas (apoptosis); y la independiente de caspasas (necroptosis y autofagia). Muchos investigadores han buscado características morfológicas de estas vías en neuronas de pacientes con EP, pero debido a diversas dificultades como por ejemplo la rápida desaparición de las mismas tras el proceso de muerte (Raff et al., 1993) se han generado resultados contradictorios (Vila y Przedborski, 2003). Sin embargo, los estudios moleculares son mucho más fiables que los morfológicos, pero solo pueden realizarse en un único punto temporal, de forma que no se puede probar si los resultados son fruto de una regulación anormal de la MCP, o de la decisión conveniente de “suicidio” de las células dañadas por los procesos de estrés oxidativo o disfunción mitocondrial (discutidos en próximos apartados). A continuación, se van a enumerar algunas evidencias de MCP en la EP. - Se ha encontrado un mayor número de neuronas Bax-postivas en la SNc de pacientes con EP sugiriendo la existencia de mecanismos de apoptosis intrínseca (Hartmann et al., 2001a). - También ha sido descrita una mayor expresión de la molécula antiapoptótica Bcl-Xl (Hartmann et al., 2002) y niveles elevados de la caspasa-3 efectora activada en las células DAérgicas de la SNc de pacientes con EP (Hartmann et al., 2000). - La MCP en pacientes con EP revela también evidencias de autofagia (Anglade et al., 1997). - A su vez han sido descritos otros marcadores moleculares de la apoptosis alterados en pacientes de EP incluyendo la activación de caspasa-8 (Hartmann et al., 2001b) y caspasa-9 (Viswanath et al., 2001). - Es de destacar el hecho de que diversos estudios postmortem realizados en cerebros de pacientes afectados de EP sugieren la implicación de FAS (Ferrer et al., 2000, Mogi et al., 1996), FADD (con dominio de muerte asociado a Fas y proteína adaptadora de caspasa-8) y la propia caspasa-8 (Hartmann y Hirsch, 2001) en la muerte neuronal DAérgica de la enfermedad. INTRODUCCIÓN 51 - La activación de caspasa-8 excluye la necroptosis en todos los casos, sin embargo, se ha observado que la inhibición de la necroptosis protege de la pérdida de neuronas DAérgicas en diversos modelos de EP (Iannielli et al., 2018). - También se han observado marcadores apoptóticos elevados en el modelo de EP consistente en la inyección de la neurotoxina MPTP (Viswanath et al., 2001) y generación elevada de vacuolas autofágicas (Zhu et al., 2007). En cuanto a los mecanismos de muerte celular regulada en la EP, se ha establecido la posible existencia de muerte neuronal por anoikis en cultivos neuronales en presencia de αsin, tras comprobar su desprendimiento de la superficie de cultivo (Saha et al., 2000). Por otro lado, se han observado mediadores comunes en la muerte por ferroptosis y en la muerte de neuronas DAérgicas durante la EP. Por ejemplo, la acumulación de hierro es una característica significativa de la SN durante la EP (Dexter et al., 1989; 1991; Ayton y Lei, 2014) y se conoce que produce radicales hidroxilo y la oxidación de la DA (Linert et al., 1996) lo que contribuye al ambiente oxidativo y a la muerte de las neuronas DAérgicas (Jenner et al., 1992). También, alteraciones del metabolismo del hierro o mutaciones de proteínas relacionadas con el mismo, a menudo causan parkinsonismos o están relacionadas con una mayor susceptibilidad a la EP (Borie et al., 2002; Miyajima, 2003; Costello et al., 2004; Rhodes et al., 2014). De hecho, ya existen aproximaciones terapéuticas que tienen como objetivo la inhibición de la ferroptosis, con resultados positivos (Devos et al., 2014). Además, se ha sugerido que las neuronas DAérgicas podrían ser más susceptibles a la catástrofe mitótica (Shirvan et al., 1997), pero se requiere más información para poder determinar si contribuye a la neurodegeneración en la EP (Guiney et al., 2017). Por último, se han estudiado numerosas relaciones entre inflamación, α-sin y EP que podrían implicar a la piroptosis como vía de muerte contribuyente a la neurodegeneración (Ferrari et al., 2006; Koprich et al., 2008; Codolo et al., 2013), por ejemplo, se han registrado niveles altos de TNFR1 y actividad elevada de caspasa-1 en SNc, caudado, putamen y cerebelo de pacientes (Mogi et al., 2000). En cuanto a la muerte celular no programada o accidental (necrosis) los datos son limitados tanto para tejido humano afectado como para modelos animales de EP (Guiney et al., 2017). INTRODUCCIÓN 52 5. MODELOS DE NEURODEGENERACIÓN Las enfermedades neurodegenerativas son patologías muy complejas que presentan características comunes que las definen. El carácter progresivo de los síntomas o la degeneración paulatina de una parte o partes del sistema nervioso, desembocando habitualmente en una incapacidad física y psíquica, son algunas de las características más destacadas. Actualmente, existen técnicas de naturaleza muy distinta para el estudio de estas enfermedades. Uno de los principales avances ha sido la generación de modelos animales, esto nos ha permitido conocer mecanismos involucrados en el desarrollo de dichas enfermedades, así como identificar dianas terapéuticas. Además, representan la reproducción más fiel de la enfermedad y son óptimos para el estudio global de las patologías. También existe la posibilidad de generar modelos animales inducidos químicamente en aquellos casos en los que la causa de la enfermedad no tenga un origen genético o no se conozca. Los animales más habituales hasta hace poco en los laboratorios eran los roedores. Sin embargo, cada vez aparecen más modelos animales generados en mamíferos superiores cuyo sistema nervioso es más parecido al humano. Tradicionalmente, un modelo animal relevante que pretenda mimetizar una afección en humanos, debe presentar 3 cualidades (Sztainberg y Zoghbi, 2016). 1) Construct validity: El modelo debe mimetizar el estado genético, farmacológico o ambiental que cause la afección. 2) Face validity: Los síntomas del modelo animal deben ser parecidos a los causados por la afección correspondiente. 3) Predictive validity: El modelo animal y los pacientes humanos, deben responder de forma parecida a distintos tratamientos farmacológicos. 5.1 MODELOS ANIMALES BASADOS EN LA INYECCIÓN DE NEUROTOXINAS Una de las características principales en todos los modelos animales para la EP inducidos por toxinas es la degeneración de las neuronas DAérgicas de la SNc. Cada modelo tiene sus propias particularidades que varían en función de las especies involucradas y la toxina utilizada. Sin embargo, aunque el mecanismo de acción varíe entre ellos, la muerte de las neuronas DAérgicas es común en todos los casos. INTRODUCCIÓN 53 La EP se puede modelar en niveles histológicos, moleculares, y conductuales. Cuando el objetivo de la investigación es el estudio de las consecuencias de la muerte de células DAérgicas o para probar estrategias de tratamiento de los síntomas, como miméticos de DA, el mecanismo de acción de la neurotoxina es irrelevante. Sin embargo, este no es el caso si el objetivo es desarrollar estrategias neuroprotectoras o el estudio de las rutas moleculares implicadas en la muerte neuronal. Para ambas circunstancias, la validación del modelo animal utilizado se basa en la posible aplicación clínica para el tratamiento de los pacientes con EP. Respecto al primer caso, este tipo de modelos han hecho posible que fármacos dirigidos a los síntomas de la EP, como la L-DOPA, se puedan desarrollar como opción terapéutica. En el segundo caso, los modelos han ayudado a revelar algunos aspectos de la patogénesis de la EP, tales como el papel del estrés oxidativo, la disfunción mitocondrial, la apoptosis, la inflamación y la α-sin (Dauer y Przedborski, 2003; Bové y Perier, 2012). 5.1.1 ESTRÉS OXIDATIVO La teoría más importante sobre neurodegeneración señala al estrés oxidativo como causa del daño a las neuronas del SNc. Este estrés oxidativo podría estar originado por un incremento de los niveles de radicales libres de oxígeno (RLOs) o bien por una disminución de los mecanismos de defensa frente a ellos. Existen muchos marcadores oxidativos elevados en la SNc de pacientes con EP (Zhou, et al., 2008), por ejemplo, la NADPH oxidasa (NADPHox) (Wu et al., 2003), la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS, del inglés Inducible nitric oxide synthase) (Hunot et al., 1996) o el NO, que se conoce que produce la nitración de la α-sin presente en cuerpos de Lewy (Shavali et al., 2006). Además, los niveles del antioxidante glutatión se encuentran reducidos en la SNc de estos pacientes (Sian et al., 1994). Las neuronas DAérgicas también pueden ser un ambiente particularmente fértil para la generación de RLOs, ya que el metabolismo de la DA produce peróxido de hidrógeno y radicales superóxido, y la autooxidación de DA produce DA-quinona, una molécula dañina para las proteínas ya que reacciona con los residuos de cisteína (Graham, 1978). El modelo animal de EP por estrés oxidativo más importante es el basado en el uso de la 6-hidroxidopamina (6OHDA) como toxina DAérgica específica. La 6-OHDA no atraviesa la barrera hematoencefálica, así que tiene que ser administrada mediante inyecciones estereotáxicas en SN o estriado para que alcance la vía nigro-estriada (Javoy et al., 1976). Las neuronas DAérgicas comienzan a degenerar 24 horas después de la administración mediante un mecanismo mediado por INTRODUCCIÓN 60 Lewis y Przedborski, 2007). El régimen agudo produce una muerte celular no-apoptótica (Gao et al., 2003) que contrasta con el régimen sub-agudo establecido por Tatton y Kish que produce una muerte celular apoptótica junto con una neurodegeneración más progresiva (Tatton y Kish, 1997; Viswanath et al., 2001). El régimen sub-agudo implica una inyección i.p. de 30 mg/kg de MPTP al día durante cinco días consecutivos, y provoca una pérdida de células del 30-40% y una depleción del 40-50% de la DA estriatal (Perier et al., 2007). En este caso, la lesión DAérgica se estabiliza a los 21 días de la administración (Gao et al., 2003). Además, hay que señalar que el régimen agudo se ha utilizado principalmente para el estudio del papel de la inflamación asociada a neurodegeneración, mientras que el régimen sub-agudo se ha utilizado para estudiar las vías moleculares de muerte celular (Vila et al., 2001; Przedborski y Vila, 2003; Perier et al., 2007). El hecho de que estos regímenes sean los más populares no significa que sean los mejores. Otros regímenes que traten de imitar mejor la naturaleza progresiva de la EP deben ser considerados (Gao et al., 2003). 5.2.3.1 METABOLISMO DEL MPTP Cuando se administra sistemáticamente MPTP, éste cruza la barrera hematoencefálica fácilmente, en cuestión de segundos (Markey et al., 1984), debido a su carácter lipófilo (Riachi et al., 1989). Una vez llega al cerebro, se oxida rápidamente a MPP+ en dos pasos: primero el MPTP se somete a una oxidación de dos electrones catalizada por la MAO-B (Figura 24), produciendo un intermediario denominado 1-metil-4-fenil-2,3-dihidropiridina (MPDP+) (Chiba et al., 1984), esto ocurre en las células gliales y serotoninérgicas ya que son las únicas que presentan esta enzima. Segundo, el MPDP+, que es una molécula inestable, probablemente experimenta una oxidación espontánea a MPP+ (Figura 25) (Chiba et al., 1985; Peterson et al., 1985). Después, el MPP+ se libera al espacio extracelular y accede a las neuronas DAérgicas vía DAT, por el cual tiene una gran afinidad (Javitch et al., 1985; Mayer et al., 1986). La importancia de este paso está demostrada por el hecho de que la inhibición farmacológica de DAT o su ablación genética previenen completamente la neurotoxicidad del MPTP (Javitch et al., 1985; Bezard et al., 1999). Sin embargo, la recaptación de la neurotoxina por DAT no explica del todo la selectividad por el sistema nigro-estriatal DAérgico ya que las diferencias en la recaptación de DA entre ratones y ratas o entre diferentes cepas de ratones no se corresponden con sus diferencias en la susceptibilidad al MPTP (Giovanni et al., 1991;1994). INTRODUCCIÓN 61 Figura 24. Representación esquemática del metabolismo del MPTP. Después de la administración sistémica, el MPTP atraviesa la barrera hematoencefálica y es metabolizado por la MAO-B (células gliales) a MPDP+, después posiblemente por oxidación espontánea se transforma en MPP+. Tras ello el MPP+ es liberado de nuevo por un mecanismo desconocido al espacio extracelular. El MPP+ se concentra en neuronas DAérgicas por su alta afinidad con el transportador DAT. Adaptado de (Dauer y Przedborski, 2003). Figura 25. Oxidación del MPTP catalizada por la MAO. INTRODUCCIÓN 62 Una vez en el citoplasma de las células DAérgicas el MPP+ puede seguir 3 rutas: 1) Por medio de transporte pasivo, puede acumularse en la matriz mitocondrial (Davey et al., 1992; Hoppel et al., 1987) y una vez en la mitocondria inhibir el complejo I (Nicklas et al., 1985) (Figura 26). Esto desencadenaría una inhibición transitoria en los niveles de ATP mesencefálicos (en torno al 20% in vivo) especialmente en el estriado y el mesencéfalo ventral (Chan et al., 1991) y un aumento en la producción de RLOs (Rossetti et al., 1988; Hasegawa et al., 1990), lo que se traduciría en una disminución del consumo de oxígeno, una alteración de la homeostasis de iones (Vyas et al., 1986; Gluck et al., 1994), y una posterior muerte de células neuronales. 2) Se puede unir al VMAT2 (vesicular monoamine transporter 2) que produciría la translocación de MPP+ en vesículas sinaptosomales. El secuestro de MPP+ en vesículas protegería a las células de la neurodegeneración impidiéndoles el acceso a la mitocondria (Liu et al., 1992) (Figura 26). 3) Puede permanecer en el citosol e interaccionar con enzimas citosólicas (Klaidman et al., 1993) (Figura 26). Figura 26. Representación esquemática de las vías intracelulares del MPP+. 1) Concentración en la mitocondria e inhibición del complejo I, mecanismo tóxico 2) Secuestro en vesículas sinápticas (VMAT), mecanismo protector. 3) Interacción con enzimas citosólicas, mecanismo tóxico. Adaptada de (Dauer y Przedborski, 2003). INTRODUCCIÓN 63 Por otro lado, existen estudios que sugieren que la neurotoxicidad de MPP+ está mediada parcialmente, a través de una producción excesiva de NO (Schulz et al., 1995; Przedborski et al., 1996). Esto confirma que, en la actualidad, quedan por conocer muchos de los detalles moleculares subyacentes al mecanismo de acción del MPTP. 6. TRASTORNO DEL ESPECTRO AUTISTA 6.1 HISTORIA Y CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS La palabra “autismo” fue utilizada por primera vez en 1912 por el psiquiatra Eugene Bleuler para referirse a uno de los síntomas de la esquizofrenia (Bleuler, 1912). Posteriormente, en 1938, Hans Asperger utilizó esta terminología para describir a niños que no se comportaban con “cortesía” y “respeto” y que presentaban movimientos y hábitos estereotipados, denominando al cuadro “psicopatía autística”. En 1944, elaboró un artículo para ahondar en este síndrome, aunque sus trabajos pasaron desapercibidos durante décadas (Asperger, 1944). Pero el uso médico moderno del término “autismo” lo propició el estudio de Leo Kanner, publicado en 1943 “Autistic Disturbances of Affective Contact” (Kanner, 1943). Kanner estudió un grupo de tres niñas y ocho niños para los que constató que tenían “una falta de habilidad innata para lograr el usual y biológicamente natural contacto afectivo con la gente” e introdujo el término de “autismo infantil temprano”. Hans Asperger y Leo Kanner son considerados los pioneros del estudio moderno del autismo (Park et al., 2016), aunque sus diferentes interpretaciones llevaron a la psiquiatra Lorna Wing a diferenciar el término “síndrome de Asperger” del “autismo de Kanner” (Wing, 1981). Sin embargo, y a pesar de la contribución esencial de Leo Kanner a la descripción del autismo, no todas sus teorías fueron acertadas. Durante un tiempo postuló que el autismo tenía un origen psicogenético (Artigas-Pallarès y Paula, 2012), es decir, que estaba provocado por una relación afectiva inadecuada entre el niño y sus padres, generando la hipótesis de la “madre nevera” y dando lugar a uno de los episodios más oscuros de la historia del autismo, pues se comenzaron a separar a los niños de sus padres, internándolos en instituciones (Artigas-Pallarès y Paula, 2012). Kanner apoyaba su teoría en que todos sus pacientes provenían de familias acomodadas: hijos de médicos, periodistas, científicos, escritores. Es decir, padres y madres ocupados, sin tiempo suficiente para relacionarse con sus hijos. INTRODUCCIÓN 64 Tuvieron que pasar casi 30 años para que Kanner en 1971, desistiera para siempre de este oscuro mito. Finalmente, en el año 1979, Lorna Wing y Judith Gould sugirieron una nueva percepción del autismo, ya que observaron que no se podían establecer unos límites categóricos entre los distintos pacientes, acuñando el concepto de “espectro autista’’, y originando una revolución en el modo de entender y afrontar la enfermedad (Wing y Gould, 1979; Wing, 1993; 1996). Esta denominación reconoce la sintomatología autista común a todos los individuos en un amplio abanico de fenotipos. Hoy en día los expertos señalan al TEA como un trastorno heterogéneo del neuro-desarrollo de alta prevalencia. Los trastornos del neuro-desarrollo tienen su origen en el periodo de gestación. El TEA se da aproximadamente en 16,8 de cada 1000 individuos (American Psychiatric Association, 2013; Baio et al., 2018), (1% del total de la población) con riesgo más alto en hombres (relación 4:1). Afecta tanto a la población infantil como a la adulta, ya que se mantiene durante todo el ciclo vital. Se establecen dos síntomas principales (American Psychiatric Association, 2013; Baio et al., 2018): 1) Deficiencias persistentes en la comunicación y en la interacción social. 2) Patrones restrictivos y repetitivos de comportamiento, intereses o actividades. Además, se pueden dar otros síntomas en más del 70% de los casos, como ansiedad, deficiencia intelectual, epilepsia (20-25%), hipersensibilidad, problemas de insomnio, trastornos digestivos, hiperactividad (infancia), hipoactividad (adolescencia y edad adulta), autoagresividad, heteroagresividad (menos frecuente que la autoagresividad), impulsividad, baja tolerancia a la frustración etc (Lai et al., 2014; Sztainberg y Zoghbi, 2016; Fundación Congost Autismo). 6.2 ETIOLOGÍA Se definen dos tipos de autismo, el “autismo idiopático”, para el que no se conoce prácticamente su etiología, aunque se reconocen componentes genéticos (Sandin et al., 2014), y el “autismo sindrómico” referente a condiciones en las que el autismo se presenta como consecuencia a una afección de etiología conocida. Por ejemplo, se han establecido relaciones causales con el síndrome del X frágil (Verkerk et al., 1991), con el síndrome de Rett (Amir et al., 1999) o con la esclerosis tuberosa (Fryer et al., 1987) entre otros. INTRODUCCIÓN 65 Se sabe que el TEA es un trastorno altamente heredable, siendo calificado como uno de los desórdenes neurológicos con mayor influencia genética (Abrahams y Geschwind, 2008). Así, se ha demostrado que mutaciones o variaciones en ciertos genes aumentan de forma importante el riesgo a padecer TEA. También, se conoce que el riesgo relativo de un niño de ser diagnosticado con autismo, aumenta un 25% cuando el hermano está afectado (Jorde et al., 1991). Por último, estudios realizados en gemelos establecen que la prevalencia del TEA en gemelos monocigóticos aumenta en un 70-90% si uno de ellos está afectado, en el caso de los dicigóticos este aumento es del 10% (Steffenburg et al., 1989; Jorde et al., 1991). También se ha discutido que podrían existir factores ambientales de riesgo, críticos durante la embriogénesis, con consecuencias importantes en la etiología del TEA, por ejemplo, infecciones durante el embarazo, complicaciones obstétricas (hipoxia, cesárea, estrés durante el nacimiento) (Steffenburg et al., 1989; Hultman et al., 2002; Kolevzon et al., 2007) y exposición a etanol o a fármacos anti-epilépticos (Arndt et al., 2005). De hecho, se ha demostrado que la exposición a ácido valproico durante el embarazo aumenta significativamente la probabilidad de desarrollar TEA (Bromley et al., 2008). 6.3 TEORÍAS EXPLICATIVAS Existen multitud de teorías que intentan explicar la fisiopatología del TEA. Las teorías más reconocidas son las siguientes: - Teoría de la mente - Teoría de la disfunción ejecutiva - Teoría de la coherencia central débil - Teoría de la empatía-sistematización Además de estas teorías principales, existen muchas otras centradas en explicar las posibles causas biomoleculares a la diversa sintomatología observada en el TEA (Kuo y Liu, 2018). En este caso nos vamos a centrar en la teoría de la “desregulación de la transmisión de las monoaminas”, concretamente de las catecolaminas, dado que es la teoría más acorde a los temas tratados en el presente trabajo. Las primeras evidencias que apuntan a una disfunción de las catecolaminas en el TEA se basan en el hallazgo de pacientes con niveles de norepinefrina superiores al normal en plasma, y niveles de actividad de DA-β-hidroxilasa inferiores al normal en plasma (enzima que metaboliza la DA a norepinefrina) (Lake et al., 1977). Asimismo, se ha establecido la presencia INTRODUCCIÓN 66 de mutaciones genéticas en reguladores de la neurotransmisión DAérgica (Nguyen et al., 2014), entre los que se encuentran los receptores D1 (Hettinger et al., 2008), D2 (Hettinger et al., 2012), D3 (de Krom et al., 2009; Staal et al., 2015), D4 (Gadow et al., 2010) y DAT (Hamilton et al., 2013), afirmando la implicación DAérgica en la patología. También, se conoce que las vías DAérgicas mesolímbica y mesocortical participan en circuitos de recompensa asociados con la motivación e interacción social (Dichter et al., 2012; Gunaydin y Deisseroth, 2014), por lo que, los niveles reducidos de DA encontrados en la corteza prefrontal de pacientes con TEA no tratados, sugieren que la hipofunción o las alteraciones del sistema de recompensa DAérgico podrían estar implicadas en los déficits sociales y comunicativos de los pacientes (Ernst et al., 1997). Por otro lado, como se ha mencionado en apartados anteriores, la vía nigro-estriada controla principalmente el movimiento, y su degeneración es un signo importante de la EP. Sorprendentemente la afección de esta vía ha sido relacionada con el comportamiento repetitivo característico en el TEA. Esta afirmación se basa en el hecho de que los cambios inducidos por algunos fármacos, resultan en comportamientos estereotípicos y repetitivos en rata (Iwamoto et al., 1976), incluso se ha observado que la administración de antagonistas D1 intraestriatales, reducen significativamente estas estereotipias en ratón (Presti et al., 2003). Debido a la importancia de la vía nigro-estriada para la predicción de una recompensa, el control motivacional o la toma de decisiones (Matsumoto y Hikosaka, 2009; Ilango et al., 2014; Lerner et al., 2015), parece muy probable que estos cambios patológicos en los sistemas DAérgicos estén relacionados con la patogénesis del TEA. Finalmente, cabe destacar que esta hipótesis cubriría las características principales de la patología, pero no sería suficiente para explicar el espectro completo, ya que este incluye una gran cantidad de comorbilidades donde probablemente ocurran distintas anomalías neuro-biológicas al mismo tiempo, dando lugar a una extrema heterogeneidad. 6.4 DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL TEA Los criterios diagnósticos del TEA se basan en los estándares recogidos en el “Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders”, 5th edition (American Psychiatric Association, 2013). El tratamiento más efectivo existente se compone de un conjunto de terapias psicológicas, (Bhat et al., 2014), o de tratamientos conductuales (Fundación Congost Autismo): INTRODUCCIÓN 67 -ABA (Applied behaviour analysis): Su principal objetivo es mejorar la conducta social de las personas con TEA. -DENVER (Early start Denver model): Es una intervención integral conductual para los niños con autismo de 12 a 48 meses de edad. -PECS (Picture exchange communication system): Es un sistema que, mediante el intercambio de imágenes, respalda el aprendizaje del habla. -TEACCH (Treatment and education of autistic related communication handicapped children): Sistema que adapta los diferentes entornos estructurando el tiempo y el espacio para que las personas con TEA las perciban comprensibles. En cuanto al tratamiento farmacológico, existen pocos fármacos aprobados por la Food and Drug Administration (FDA), pero dos ejemplos clásicos son la risperidona y el aripripazol, ambos utilizados para el tratamiento de la esquizofrenia y pertenecientes al grupo de medicamentos conocidos como antipsicóticos. Los fármacos disponibles no suponen un tratamiento efectivo para el TEA, sino que están destinados a paliar los síntomas más difíciles, como la agitación, las conductas agresivas o el comportamiento hiperactivo (Food and Drug Administration 2009;2007). 6.5 MODELOS ANIMALES Teniendo en cuenta las 3 características ya mencionadas que deben reunir los modelos animales de relevancia que pretendan mimetizar alguna afección humana (apartado 5): 1) Construct validity: El modelo debe mimetizar el estado genético, farmacológico o ambiental que cause la afección. 2) Face validity: Los síntomas del modelo animal deben ser parecidos a los causados por la afección correspondiente. 3) Predictive validity: El modelo animal y los pacientes humanos, deben responder de forma parecida a distintos tratamientos farmacológicos. Hay que aceptar que, en la mayoría de los casos, no es posible alcanzar el modelo perfecto, incluso si se llegan a cumplir las 3 condiciones expuestas (Sztainberg y Zoghbi, 2016). Por ejemplo, si la etiología de la enfermedad es desconocida, como en el caso del autismo idiopático o la EP, sería imposible cumplir el punto 1 en su totalidad, también, si no existe medicación disponible o si la medicación es básicamente paliativa, como en el caso del TEA o de la EP, sería difícil cumplir el punto 3 de forma satisfactoria (Sztainberg y Zoghbi, 2016). De INTRODUCCIÓN 68 hecho, para la mayoría de modelos animales, especialmente los que presentan cierta heterogeneidad, solo se pueden reunir algunos aspectos de la enfermedad. Sin embargo, aunque el modelo solo mimetice ciertas características, todas pueden ser de utilidad para entender mejor la patología de estudio. En la actualidad, existen diversos modelos animales para el TEA de distintas características. Muchos, presentan modificaciones en genes que controlan la adhesión de neuronas pre y postsinápticas o en las proteínas de andamiaje sináptico (Neuroligina 3, Neuroligina 4, Neurexina 1, Neurexina 3, SHANK3). En el artículo de Martina Zatkova et al. (2016) se recoge una tabla resumen con los modelos propuestos y las distintas alteraciones en el comportamiento para cada genotipo, todos en relación al punto 2 de relevancia de modelos animales. Asimismo, hay propuestos otros modelos como el ratón BTBR T+Itpr3tf/J (BTBR), o el Cntnap2(-/-) (contactin-associated protein-like 2 gene). Por una parte, el BTBR es un modelo de autismo idiopático y presenta comportamientos repetitivos, como un exceso de acicalamiento y enterramiento de canicas (Amodeo et al., 2016; 2017), interacciones sociales reducidas, bajo comportamiento exploratorio, y comportamiento de naturaleza ansiosa comparado con otras cepas (Moy et al., 2007; McFarlane et al., 2008; Scattoni et al., 2008). En este caso, las características del modelo también irían en relación al punto 2 de relevancia de modelos animales y los efectos fenotípicos serían muy parecidos a los discutidos para la cepa Caspasa 3f/d TH-IRES-Cre. En el caso del modelo Cntnap2(-/-), carente del gen CNTNAP2, los resultados son similares (Peñagarikano et al., 2011). Por otro lado, Belzung et al. (2005) proponen que para que un modelo animal sea validado como modelo de autismo, debe cumplir al menos dos aspectos de la sintomatología: 1) Déficits en comportamiento social. 2) Presencia de estereotipias motoras. Además, este artículo contiene una revisión de los test de comportamiento necesarios para realizar esta distinción y evalúa muchos de los modelos propuestos, valorando así la validez de cada uno de ellos en cuanto al punto 2 de relevancia mencionado con anterioridad. https://es.jesus.net/suena-2/ OBJETIVOS / AIMS AIMS 74 of MPTP in transgenic animals lacking caspase-3 and -8 in catecholaminergic cells will be used. a) The strains Caspase 3f/d TH-IRES-Cre and Caspase 8f/d TH-IRES-Cre, lacking caspase-3 and caspase-8 in the catecholaminergic lineage, will be treated with subacute doses of MPTP, mainly to study the molecular pathways of cell death. b) Histological, biomolecular and neurochemical techniques will be combined to determine the implication of these proteases in neurodegeneration. https://sp.depositphotos.com/5492875/stock-photo-funny-rat.html MATERIALES Y MÉTODOS https://sp.depositphotos.com/5492875/stock-photo-funny-rat.html MATERIALES Y MÉTODOS 75 1. EXPERIMENTACIÓN ANIMAL Todos los experimentos realizados se llevaron a cabo de acuerdo con el documento “Guidelines of the European Union Council” (86/609/EU), siguiendo la normativa española (BOE 34/11370-421, 2013) para el uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el comité ético científico de la Universidad de Sevilla. Los animales se mantuvieron en grupos de 4-6, a temperatura constante de 22±1 oC y a una humedad relativa del 60%, con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y libre acceso a comida y agua. Para este trabajo se utilizaron siete grupos de ratones de distinto genotipo, de 20-25 g y 3 meses de edad. Para la caracterización de las cepas de animales, los ratones se subdividieron en dos grupos tal y como se expone en la figura 27. 1) C57BL/6 Wild type, WT (Control en ambas cepas). 2) Doble floxeados en caspasa (Flox/Flox) 3 (Control). 3) Doble floxeados en caspasa (Flox/Flox) 8 (Control). 4) Caspasa 3f/d TH-IRES-Cre Floxeado/Delecionado (Flox/Del), Cre- (Hemidelecionado). 5) Caspasa 8f/d TH-IRES-Cre Floxeado/Delecionado (Flox/Del), Cre- (Hemidelecionado). 6) Caspasa 3f/d TH-IRES-Cre Floxeado/Delecionado (Flox/Del), Cre+ (C3KO). 7) Caspasa 8f/d TH-IRES-Cre Floxeado/Delecionado (Flox/Del), Cre+ (C8KO). WT (Control) N=4 WT (Control) N=4 Caspasa 3 Flox/Flox (Control) N=4 Caspasa 8 Flox/Flox (Control) N=4 Caspasa 3 Flox/Del Cre- (Control) N=4 Caspasa 8 Flox/Del Cre- (Control) N=4 Caspasa 3 KO (Experimental) N=4 Caspasa 8 KO (Experimental) N=4 Figura 27. Subdivisión de grupos para la caracterización de ambas cepas de estudio Caspasa 3f/d TH-IRES-Cre y Caspasa 8f/d TH-IRES-Cre. Para generar los modelos animales se empleó el sistema de recombinación Cre/loxP. El sistema Cre-loxP es la estrategia más común en la mutagénesis dirigida específica de tejido. La colocación y orientación de loxP en el genoma (que se introduce en la secuencia de ADN a recombinar) determina la secuencia genómica a escindir, mientras que la disponibilidad de la MATERIALES Y MÉTODOS 76 recombinasa Cre en el tiempo y/o el espacio, dictará cuándo y dónde se produce la recombinación. Los sitios loxP se ubican en parejas flanqueando el segmento de ADN a eliminar. Cuando Cre se expresa, la recombinasa Cre se une a los sitios loxP, cortándolos por la mitad, después une las dos mitades restantes tras haber eliminado el ADN situado entre ambos. Los ratones experimentales, Caspasa 3f/d TH-IRES-Cre y Caspasa 8f/d TH-IRES-Cre, presentan el sistema de recombinación Cre asociado al gen de la TH. Es decir, son delecionados en caspasa-3 y -8 cuando se expresa Cre en el linaje de las células catecolaminérgicas. Todos los animales generados son hemidelecionados (Flox/Del), es decir tienen un alelo floxeado y el otro delecionado para caspasa. Según esto, un animal (Flox/Del) negativo en Cre, será hemidelecionado en células catecolaminérgicas, mientras que un animal (Flox/Del) positivo en Cre será delecionado total o KO en células catecolaminérgicas (Figura 28). Se eligieron estas cepas transgénicas porque presentan una deleción selectiva de ambas caspasas en las neuronas DAérgicas de la SN, pudiéndose demostrar así la implicación genética de las mismas en la degeneración del sistema nigro-estriado. Este ratón, además tiene la peculiaridad de expresar Cre, no sólo en las células catecolaminérgicas, sino también en las células germinales, por lo que la deleción se transmite a su descendencia (Lindeberg et al., 2004). MATERIALES Y MÉTODOS 77 Figura 28. Estrategia de cruce para la generación de las cepas experimentales Caspasa 3f/d TH-IRES-Cre y Caspasa 8f/d TH-IRES-Cre. 1.1 TRATAMIENTO CON MPTP Para el modelo de EP por inyección de MPTP los animales se distribuyeron en 6 grupos de acuerdo a dos variables: genotipo y tratamiento (Figura 29). Se administró el régimen subagudo establecido por Tatton y Kish que produce una neurodegeneración más progresiva con muerte celular apoptótica (Tatton y Kish, 1997; Viswanath et al., 2001). El régimen sub-agudo implica una inyección i.p. de 30 mg/kg de MPTP al día durante cinco días consecutivos, y provoca un agotamiento del 40-50% de la DA estriatal y una pérdida de células del 30-40% (Perier et al., 2007). El régimen sub-agudo utiliza principalmente para estudiar las vías moleculares de muerte celular (Vila et al., 2001; Przedborski y Vila, 2003; Perier y et al., 2007). Los grupos tratados se sacrificaron a día 9 con el objetivo de estudiar la muerte neuronal y la inflamación. También se les inyectó Ioduro de Propidio (IP) 20 mg/kg i.p. 1 hora antes del sacrificio, para comprobar la existencia de muerte celular necrótica. El IP se une al ADN y es necesaria una mayor permeabilidad de membrana o su rotura para el marcaje. Figura 29. Distribución de animales de experimentación en distintos grupos según genotipo y tratamiento. MATERIALES Y MÉTODOS 78 2. GENOTIPADO Los ratones con 2 semanas de edad se enumeraron mediante el corte con tijera de sus falanges (Figura 30). Sus biopsias se almacenaron en microtubos de 0,2 ml para su posterior procesamiento. Figura 30. Sistema de enumeración e identificación de ratones. 2.1 EXTRACCIÓN DE ADN Se añadieron 50 μl del kit de extracción de ADN QuickExtract™ DNA Extraction solution 1.0 a cada microtubo con biopsia y se siguió el protocolo establecido por el fabricante. El protocolo consistió en una incubación de 15 minutos a 65 oC, una agitación con vortex de 15 segundos y una última incubación de 2 minutos a 98 oC. Las incubaciones se llevaron a cabo en el termociclador PTC-100 Thermal Cycler. Una vez extraído, el ADN se congeló a -80 oC. 2.2 PCR CONVENCIONAL El genotipado de los animales de estudio se realizó mediante PCR (Polymerase chain reaction) del ADN extraído de las falanges. Se utilizó para ello el kit de PCR MyTaq™ Red DNA Polymerase y los cebadores correspondientes (Tabla 1) a una concentración de 10 μΜ. Se siguió el protocolo establecido por el fabricante, generando una mezcla de reacción que contuvo 10 μl de 5x MyTaq Red Reaction Buffer, 0,5 μl de MyTaq Red ADN polymerase, 1 μl de ADN extraído, 2 μl/cebador a 10 μΜ y 32,5 μl de agua para biología molecular (cantidad MATERIALES Y MÉTODOS 79 suficiente para 50 μl de mezcla total). Para realizar la PCR se utilizó el termociclador PTC-100 Thermal Cycler siguiendo el protocolo descrito. Este protocolo comenzó con un paso inicial de 1 minuto a 94 oC y luego, 35 ciclos de una primera fase de desnaturalización de 15 segundos a 95 oC, una segunda fase de hibridación de 15 segundos a 58 oC y una tercera y última fase de extensión de 10 minutos a 72 oC. Las muestras de ADN tras la PCR se cargaron en los pocillos de un gel de agarosa al 2%, en tampón TAE, compuesto por tris base/ácido acético/EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). A la agarosa se le añadió un intercalante del ADN, RedSafe™ Nucleic Acid Staining Solution, que permite visualizar por fluorescencia las diferentes bandas de ADN. El gel se situó en una cubeta de electroforesis también con tampón TAE, conectada a una fuente de corriente de baja tensión. El ADN por su carga negativa, migra al polo positivo y se va separando según su peso molecular o pares de bases (pb) atravesando los fragmentos pequeños con mayor facilidad. En uno de los pocillos del gel, se cargó el marcador de peso molecular DNA Gtp-Ladder, que ayudó a identificar las distintas bandas de ADN. El gel se colocó en un lector de geles Lector FLA5100, donde se identificaron las siguientes bandas:  La presencia o ausencia de banda a 400 pb que correspondía al ADN amplificado por los cebadores Cre general. (La presencia de banda indica la existencia de Cre en el genoma).  La presencia de banda a 300pb (deleción) y a 260 pb (floxeado) para caspasa-3.  La presencia de banda a 400pb (deleción) y a 300 pb (floxeado) para caspasa-8. En nuestro caso, como se ha explicado anteriormente, los cruces de ratones estaban preparados para que nacieran animales hemidelecionados en caspasa-3 o caspasa-8, la única variable era la presencia o ausencia de Cre en el genoma que determinaría el genotipo en los lugares donde se expresa la TH. Así, los ratones delecionados en caspasa-3 o caspasa-8 en el linaje catecolaminérgico denominados C3KO o C8KO, fueron positivos para Cre, y presentaron una banda a 400 pb además de otras dos bandas; una a 300 pb y a 260 pb para el animal C3KO o a 400 pb y 300 pb para el animal C8KO. MATERIALES Y MÉTODOS 80 Tabla 1. Cebadores para PCR NOMBRE Secuencia 5´-3´ Casa comercial Caspasa 3 FLOX A GAGCCTTCATAGGGGTGCAA Sigma-Aldrich Caspasa 3 FLOX B GGGGAGCAGAGGGAATAAAG Sigma-Aldrich Caspasa 3 FLOX C CATAGAATCCCAAGCCAGGA Sigma-Aldrich Caspasa 8 Sentido ATAATTCCCCCAAATCCTCGCATC Sigma-Aldrich Caspasa 8 Antisentido GGCTCACTCCCAGGGCTTCCT Sigma-Aldrich Caspasa 8 Deleción GCTACAGTGATGGTTTGTACATGG Sigma-Aldrich Cre general Sentido CGTTGATGCCGGTGAACGTG Sigma-Aldrich Cre general Antisentido AGCTGGCTGGTGGCAGATGG Sigma-Aldrich 3. PRUEBAS CONDUCTUALES La habitación donde se realizaron las pruebas de conducta estuvo aislada de ruido y se mantuvo con iluminación homogénea. Además, todo el equipo, así como los objetos usados durante las pruebas fueron limpiados entre sesiones y animales con etanol al 70%, para evitar que la interferencia de olores influyera en la conducta. El serrín de las jaulas no se cambió durante la realización de los paradigmas comportamentales. Las pruebas de comportamiento se realizaron durante la fase de luz estándar, normalmente entre las 9:00-15:00 h. Los animales fueron transportados al lugar de las pruebas al menos 30 min antes de comenzarlas. Los análisis, tanto en directo durante la prueba, como mediante vídeos grabados fueron llevados a cabo sin conocer el genotipo de los animales. Se evaluaron al menos 6 animales por genotipo. El orden de pruebas fue elegido de forma que los animales estuvieran expuestos al menor estrés posible. 3.1 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD MOTORA, COORDINACIÓN Y EQUILIBRIO 3.1.1 ACTIVIDAD LOCOMOTORA Y ESTEREOTIPIAS MOTORAS La actividad espontánea de los animales se evaluó durante 30 min. Se colocaron en arenas cuadradas (45 x 45 cm), con altura de 35 cm y paredes opacas. La prueba se llevó a cabo en una habitación con luz tenue y con ruido de fondo constante. Todas las sesiones se grabaron y evaluaron usando el programa SMART 3.0 video tracking system (Panlab). Los datos de actividad en unidades arbitrarias (U.A) se recopilaron en intervalos de 5 min y en el tiempo total de prueba. 3.1.2 ROTAROD La coordinación motora y el equilibrio fueron evaluados en un equipo rotarod (Panlab). Los animales se colocaron en el rotarod a velocidad constante (5 rpm) durante 5 min, y a velocidad acelerada (4-40 rpm en 5 min) durante otros 5 minutos. Se cuantificó el número de caídas a MATERIALES Y MÉTODOS 81 velocidad constante y la latencia al caer en aceleración. Se llevaron a cabo 3 ensayos con 15 minutos de descanso entre ellos. El aprendizaje motor se evaluó también en aceleración (440 rpm en 5 min). En este caso se realizaron 5 ensayos en total, el último al día siguiente, donde se evaluó el aprendizaje. 3.2 EVALUACIÓN DE LA ANSIEDAD 3.2.1 TEST EN CAMPO ABIERTO La prueba de actividad en campo abierto se llevó a cabo en una superficie de 2,025 cm2 durante 10 minutos. El centro de la arena fue definido como un cuadrado que ocupó el 50% del área total. El tiempo que pasó cada animal en el área central se monitorizó utilizando el programa SMART 3.0 video tracking system (Panlab). La tigmotaxis se expresó como Log de la ratio (tiempomargen/tiempocentro). Además, se analizó manualmente el número de fecal boli como medida complementaria de ansiedad. 3.2.2 TEST DE LAS CANICAS Los animales se colocaron en una jaula estándar (40 x 24 x 18 cm) sin tapa, pero con un filtro superior, para que no pudieran trepar o escapar. En cada jaula se colocaron 20 canicas de cristal en posiciones equidistantes (5 filas con 4 canicas por fila) sobre 4,5 cm de serrín (Figura 31). Tras 30 min se cuantificó el número de canicas enterradas (se consideró enterrada >2/3 de su superficie cubierta). Figura 31. Imagen ejemplo del test de las canicas, antes y después de los 30 min de prueba. MATERIALES Y MÉTODOS 88 Tabla 2. Cebadores para RT-PCR NOMBRE Secuencia sentido (S) Secuencia antisentido (A) Casa comercial β-Actin S:5´- GGCTATGCTCTCCCTCACG A:5´- CTTCTCTTTGATGTCACGCACG Sigma-Aldrich GAPDH S:5´- GTGTTTCCTCGTCCCGTAGA A:5´- AATCTCCACTTTGCCACTG Sigma-Aldrich TH S:5´- CTGAAGGGCCTCTATGCTAC A:5´- CCACAGTACCGTTCCAGAAG Sigma-Aldrich DAT S:5´- GACACCAGTGGAGGTTCAAG A:5´- GTAGCACAGGTAGGGAAACC Sigma-Aldrich Bassoon S:5´- CAGCCAGAGAACAACTTCTC A:5´- GTCGGAGGTCTTGCATATTG Sigma-Aldrich P/Q S:5´- AGTGAAGACAACGTGGTGAG A:5’- CCTGTTAGCACGACAAA Sigma-Aldrich Gefirina S:5´- TGCAGAAGACCGCAGTGGGAT A:5’- TCGTGGTGCAAACCCCGTTCC Sigma-Aldrich Sinaptofisin a S:5´- CAGTTCCGGGTGGTCAAGG A:5’- ACTCTCCGTCTTGTTGGCAC Sigma-Aldrich PSD95 S:5´- TGAGATCAGTCATAGCAGCTACT A:5’- CTTCCTCCCCTAGCAGGTCC Sigma-Aldrich Clec7a S:5´-CTGGTATGGAAGTAAGAGACACTGC A:5’- CGG TGA GAC GAT GTT TGG C Sigma-Aldrich CX3CR1 S:5´-GCCTCCACAATGCCATGTGC A:5’- GCTGCACTGTCCGGTTGTTC Sigma-Aldrich CD68 S:5´-GCCCAAGGAACAGAGGAAG A:5’- GGCTGTAGGTGTCATCGTG Sigma-Aldrich Gal3 S:5´-GATCACAATCATGGGCACAG A:5’- GTGGAAGGCAACATCATTCC Sigma-Aldrich TREM2 S:5´- GTTTCTTGCAGCCAGCATCC A:5’- GGGTCCAGTGAGGATCTGAAG Sigma-Aldrich 6. INMUNOHISTOQUÍMICA Esta técnica basada en la especificidad antígeno-anticuerpo, se llevó a cabo para estudiar morfología, localización o expresión de antígenos. Para ello realizamos los protocolos descritos a continuación para cortes flotantes en agitación. 6.1 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS Se realizaron cortes coronales de un grosor de 30 µm, del cerebro completo de los ratones de experimentación destinados a esta prueba, utilizando el criostato Leica CM 1850 UV a -20 oC. Las dos regiones de estudio fueron la SN y el núcleo estriado. Los cortes se almacenaron en solución anticongelante (20% agua destilada, 20% PBS 2x, 30% etilenglicol, 30% glicerina) en placas de 24 pocillos a -40 oC. 6.2 INMUNOHISTOQUÍMICA Los cortes se lavaron 3 veces durante 10 minutos con PBS para eliminar la solución anticongelante y después, se incubaron 30 minutos a 80 oC con citrato al 0,024% para permeabilizar el tejido. Posteriormente, se lavaron de nuevo 3 veces con PBS y se les inactivó la peroxidasa endógena con una solución de H2O2 al 1% en metanol durante 15 minutos. Luego, se incubaron durante 1 hora con PBS-Tritón al 1% (PBS-T1%) y se realizó el bloqueo con BSA (Bovine serum albumin) al 5% (p/v) en PBS-T1% durante 2 horas. Después, las secciones se incubaron, primero durante 30 minutos a temperatura ambiente y después durante 12 horas a 4 oC con los anticuerpos primarios (Tabla 3) diluidos en una solución de MATERIALES Y MÉTODOS 89 BSA al 1% (p/v) en PBS-T1%. Al día siguiente, se incubaron de nuevo durante 30 minutos a temperatura ambiente para seguir con 6 lavados de 10 minutos con PBS-T0,1%. Tras ello, los cortes se incubaron durante 1 hora con los anticuerpos secundarios biotinilados (Tabla 4) diluidos en PBS-T0,1% con BSA al 1% (p/v) y se lavaron 6 veces durante 10 minutos con PBST0,1%. El siguiente paso fue la incubación con el kit VECTASTAIN ABC HRP Kit durante 1 hora, que daría lugar a la formación del complejo enzimático en la zona biotinilada, precedente a la reacción colorimétrica. Por último, se lavaron los cortes 6 veces con PBS-T0,1% y se añadió la diaminobencidina (DAB) necesaria para cubrir los cortes, junto a H2O2 (2 µl de H2O2 en 2 ml de DAB). La adición de la DAB dispara la reacción colorimétrica, dando lugar a un precipitado coloreado en la zona de marcaje. Posteriormente se procedió a la eliminación e inactivación de la DAB y se lavaron las secciones con PBS. Las secciones se montaron en los portaobjetos y se dejaron secar durante 48 horas a temperatura ambiente. Luego, se realizaron 3 lavados de 1 minuto con agua destilada. Las secciones se deshidrataron a través de una serie de lavados de 2 minutos con una concentración creciente de etanol (70%, 96% (x2) y 99% (x3)) y 5 minutos con xileno al 100% (x3). Tras el último paso, se eliminaron los restos de xileno y se montaron los cubreobjetos usando medio de montaje DPX. Se almacenaron a temperatura ambiente hasta observación en el microscopio Olympus BX61. Todo el proceso fue realizado a temperatura ambiente (exceptuando indicaciones) y en agitación por shaker. 6.3 INMUNOFLUORESCENCIA Los cortes se lavaron 3 veces con PBS durante 10 minutos para eliminar la solución anticongelante y después, se incubaron durante 30 minutos a 80 oC con citrato al 0,024% para permeabilizar el tejido. Posteriormente, se lavaron de nuevo 3 veces con PBS y se incubaron durante 1 hora en PBS-Tritón al 1% (PBS-T1%). Se realizó el bloqueo con BSA al 5% (p/v) en PBS-T1% durante 2 horas y tras ello se incubaron, primero durante 30 minutos a temperatura ambiente y después durante 12 horas a 4 oC con los anticuerpos primarios (Tabla 3) diluidos en una solución de BSA al 1% (p/v) en PBS-T1%. Al día siguiente, se incubaron de nuevo durante 30 minutos a temperatura ambiente, para seguir con 6 lavados de 10 minutos con PBS-T0,1%. Luego, se incubaron 1 hora con los anticuerpos secundarios (Tabla 4) diluidos en una solución de BSA al 1% (p/v) en PBS-T0,1% y se lavaron 6 veces durante 10 minutos con PBS-T0,1%. MATERIALES Y MÉTODOS 90 Finalmente, los cortes se montaron en portaobjetos con medio de montaje para fluorescencia Fluorescence Mounting Medium, se colocaron los cubreobjetos y se mantuvieron en oscuridad a 4 oC hasta su observación en el microscopio confocal ZEISS LSM 7 DUO. Todo el proceso fue realizado a temperatura ambiente (exceptuando indicaciones) y en agitación por shaker. Tabla 3. Anticuerpos primarios NOMBRE NOMBRE ESPECÍFICO Origen COMPAÑÍA REFERENCIA DILUCIÓN Galectina-3 Goat Anti-Galectin-3 Goat R&D Systems AF1197 1:250 PSD95 Mouse Anti-PSD95 Mouse Sigma MAB1596 1:250 Syp Mouse Anti-syp Mouse Abcam AB94580 1:100 Syp Rabbit Anti-syp Rabbit Abcam AB32127 1:500 Gefirina Rabbit Anti-Gefirina Rabbit Abcam AB32206 1:250 TH Sheep Anti-TH Sheep NOVUS (Biomol) NB300-110 1:1000 TH Rabbit Anti-TH Rabbit Sigma T8700 1:500 TREM2 Rabbit Anti-TREM2 Rabbit Abcam AB185337 1:500 Iba1 Goat Anti-Iba1 Goat Abcam AB5076 1:1000 Caspasa-3 Rabbit Anti-Caspasa-3 Rabbit Cell Signaling 9662S 1:250 Tabla 4. Anticuerpos secundarios NOMBRE NOMBRE ESPECÍFICO ORIGEN COMPAÑÍA REFERENCIA DILUCIÓN Anti-Mouse Alexa-488 Donkey Anti-Mouse Alexa 488 conjugated Donkey Thermo Fisher Scientific A-11055 1:500 Anti-Rabbit Alexa-546 Donkey Anti-Rabbit Alexa 546 conjugated Donkey Thermo Fisher Scientific A-10040 1:500 Anti-Sheep Alexa-647 Donkey Anti-Sheep Alexa 647 conjugated Donkey Thermo Fisher Scientific A-21448 1:500 Anti-Rabbit Alexa-488 Donkey Anti-Rabbit Alexa 488 conjugated Donkey Thermo Fisher Scientific A-21206 1:500 Anti-Mouse Alexa-546 Donkey Anti-Mouse Alexa 546 conjugated Donkey Thermo Fisher Scientific A-10036 1:500 AntiRabbit Donkey Anti-Rabbit Biotin conjugated Donkey Jackson InmunoResearch 715-066152 1:500 6.4 CAPTURA Y ANÁLISIS DE IMAGEN 6.4.1 CUANTIFICACIÓN DEL BALANCE EXCITACIÓN/INHIBICIÓN EN LA SN Y EL NÚCLEO ESTRIADO MEDIANTE MARCADORES ESPECÍFICOS PARA ELEMENTOS DE LAS SINAPSIS. POSTSINÁPTICOS (PSD95 Y GEFIRINA) Y PRESINÁPTICOS (SINAPTOFISINA) El análisis se llevó a cabo en 3 animales de cada genotipo (N=4). Se trabajó con una sección de cada animal por estructura (SN y núcleo estriado), analizando 5 regiones de las mismas, comparándolas siempre a la misma altura. MATERIALES Y MÉTODOS 91 La colocalización sinaptofisina-PSD95 mostró las sinapsis excitatorias en las neuronas DAérgicas de la SNc y el núcleo estriado mientras que la colocalización sinaptofisina-gefirina mostró las sinapsis inhibitorias. Se utilizó el equipo confocal ZEISS LSM 7 DUO para la toma de imágenes mediante el objetivo de 63x con aceite de inmersión. El análisis cuantitativo se realizó en el programa ZEN, que permitió cuantificar la colocalización entre marcadores pre y postsinápticos mediante la herramienta “COLOCALIZACIÓN”, fijando el umbral de intensidad válido para cada marcaje con la herramienta “THRESHOLD”. El contaje se expresó como número de contactos sinápticos por área (contactos sinápticos/µm2). Todas las imágenes se capturaron en la misma sesión, manteniendo los mismos parámetros de potencia de láser y ganancia. 6.4.2 ANÁLISIS INFLAMATORIO MEDIANTE CUANTIFICACIÓN DE INMUNOREACTIVIDAD PARA IBA1 El análisis de la inmunoreactividad para Iba1 (Ionized calcium binding adaptor molecule 1) se llevó a cabo en 4 animales de cada genotipo (N=4). El contaje se realizó en tres secciones diferentes de cada animal (SN), tomando dos imágenes por sección comparables entre sí. Se utilizó el equipo confocal ZEISS LSM 7 DUO para la toma de imágenes mediante el objetivo de 63x con aceite de inmersión. El análisis cuantitativo se realizó utilizando el programa FijiImageJ software® (W. Rasband, National Institutes of Health), usando uno de sus programas específicos “cell counter”, que permitió cuantificar el número de microglías. También se realizó un análisis del tipo de microglía por grupo, clasificándola en 5 categorías según su morfología: 1) Microglía quiescente (A), presenta pequeños cuerpos celulares, ramificaciones citoplasmáticas finas. 2) Microglía de activación temprana (B), caracterizada por una mayor ramificación citoplasmática y tamaño celular, además de un marcaje Iba1 más pronunciado. 3) Microglía tipo (C), engrosamiento de ramificaciones citoplasmáticas y retracción de ramificaciones finas, cuerpo celular aún más aumentado junto con una mayor expresión de Iba1. 4) Microglía tipo (D), se presenta en estados inflamatorios cercanos al pico de enfermedad, se pueden observar formas ameboides demostrando una retracción completa de ramificaciones citoplasmáticas con niveles de expresión de Iba1 altos mantenidos. MATERIALES Y MÉTODOS 92 Todas las imágenes se capturaron en la misma sesión, manteniendo los mismos parámetros de potencia de láser y ganancia. 6.4.3 ANÁLISIS DE MUERTE CELULAR MEDIANTE CUANTIFICACIÓN DE INMUNOREACTIVIDAD PARA IP El análisis se llevó a cabo en 4 animales de cada genotipo (N=4). El contaje se realizó en tres secciones de SN diferentes de cada animal, comparables entre sí, tomando dos imágenes por sección. Para la toma de imágenes, se utilizó el equipo confocal ZEISS LSM 7 DUO mediante el objetivo de 63x con aceite de inmersión. El análisis cuantitativo se realizó utilizando el programa FijiImageJ software® (W. Rasband, National Institutes of Health), en las zonas con marcaje TH positivo e Iba1 positivo. Se llevaron a cabo medidas de intensidad del marcaje específico de IP, que presenta una λ de excitación máxima a 535 nm y una emisión de fluorescencia máxima a 617 nm. 6.4.4 CUANTIFICACIÓN DE NEURONAS POSITIVAS PARA TH EN SN. ANÁLISIS ESTEREOLÓGICO. El número de neuronas DAérgicas en la SN se estimó utilizando los principios estereológicos descritos en Gundersen et al. (1988). Para ello se utilizó el programa NewCastTM (Visiopharm) instalado en un microscopio Olympus BX61. Los recuentos se hicieron utilizando el objetivo 40x. La utilización de los principios estereológicos para la estimación no sesgada de parámetros tan diversos como el número de neuronas, la longitud de sus axones o el volumen que ocupa una estructura cerebral dada, implica la aplicación de dos criterios: i) cuantificar aproximadamente 200 elementos por animal; ii) llevar a cabo un muestreo sistemático de la estructura estudiada, con un origen al azar. El principio de Cavalieri permite estimar el volumen de un objeto tridimensional irregular (como la SN) de una forma sencilla; inicialmente, la estructura debe cortarse completamente en secciones de igual grosor; después, se seleccionan algunas secciones repartidas sistemáticamente a lo largo del eje de corte y se calcula la superficie de estas secciones superponiendo a las mismas una rejilla de puntos espaciados regularmente. Para calcular el volumen, solo es necesario contar el número de puntos (P) dentro de nuestra región de interés (ROI), multiplicar este valor por el área asociada al punto (a/p) y finalmente por la distancia entre las secciones (T) a las que se ha medido el área (V= P x a/p x T). MATERIALES Y MÉTODOS 93 El programa NewCastTM permite calcular fácilmente el volumen total de la SN y el volumen en el que se realiza la estimación del número de neuronas. En nuestro caso, se utilizaron 7 secciones en cada animal, con origen al azar, equidistantes entre sí 180 µm. El programa permite delimitar la ROI en cada sección y lanzar sistemáticamente sobre ésta una serie de puntos (a los que denominamos puntos Cavalieri) con un área asociada (a/p) conocida. Además, el programa sitúa un disector óptico tridimensional de tamaño conocido sobre cada punto Cavalieri que cae dentro de las ROI. Para estimar el número total de neuronas TH positivas en la SN se contó el número de neuronas en cada disector (alrededor de 200 en cada animal, lo que denominamos n); finalmente, el número total de neuronas de la estructura se obtuvo de la fórmula N = n x Voltotal/Voldis, siendo Voltotal el volumen de toda la SN y Voldis el sumatorio del volumen de los disectores utilizados para el recuento de neuronas. 6.4.5 ESTUDIO DE LA DENSIDAD ÓPTICA EN NÚCLEOS DOPAMINÉRGICOS. La densidad óptica de la expresión de TH fue calculada después de delimitar la región de interés manualmente. Se cuantificó la intensidad media, restándole el ruido de fondo por sección. Se cuantificaron de 4-6 secciones por núcleo, excepto para el Cpu, para el que se cuantificaron 10 secciones. El análisis se realizó empleando el programa FijiImageJ software® (W. Rasband, National Institutes of Health) para análisis de imagen. 7. CUANTIFICACIÓN DE DA Y DOPAC 7.1 CUANTIFICACIÓN DE METABOLITOS MEDIANTE HPLC El tejido del núcleo estriado de los animales destinados a este estudio, se pesó y homogeneizó por sonicación sobre hielo en 0,1 M de ácido perclórico (30 μl de ácido perclórico por mg de tejido fresco) con ayuda de un procesador ultrasónico Hielscher UP100H (Teltow). Las muestras se centrifugaron a 3000 g, a 4 oC, durante 15 minutos y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de nylon de 0,22 μm (Spin-X, Corning Incorporated). Las muestras se inyectaron a través de una válvula de inyección de alta presión (Rheodyne), empleando un loop de 10 μl. Los niveles de DA y sus metabolitos se analizaron en un horno termostatizado a una temperatura de 30 oC, por medio de cromatografía líquida de alta resolución unida a un detector electroquímico (HPLC-ED). Se utilizó un electrodo de carbón vítreo (DECADE II, ANTEC LEYDEN) que se mantuvo a un potencial de oxidación de +650 mV y una bomba Merck MATERIALES Y MÉTODOS 94 L-6200 en modo isocrático. La columna analítica utilizada fue una Lichrocart (125 mm x 4 mm) de Merck de fase reversa, con relleno Lichrospher C18 y 5 μm de diámetro de poro. La fase móvil consistió en una mezcla de 0,05 M de acetato de sodio (Carlo Erba Reagenti), 0,4 mM de ácido 1-octanosulfónico (Janssen Chimica), 0,3 mM de Na2EDTA (Sigma) y 120 ml de metanol (Merck), en un volumen final de 2 litros, ajustándose el pH a 4,1 con ácido acético glacial. El agua utilizada fue desionizada (Milli-Q Reference, Millipore). La fase móvil se filtró a través de filtros de nylon de 0,45 μm, y se desgasificó por ultrasonido, con el fin de eliminar las burbujas de aire que pudieran interferir con la detección electroquímica. Todos los reactivos fueron de grado HPLC. El flujo de la bomba de HPLC fue de 1,0 ml/min. La concentración de DA, ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC) y ácido homovalínico (HVA) se calculó mediante la inyección en el HPLC de un patrón puro, el cual se preparó en una solución de ácido fórmico al 0,05% con EDTA, y se conservó a 4 oC hasta su utilización (máximo una semana). Los niveles intray extracelulares de DA, DOPAC y HVA del tejido estriado se identificaron y cuantificaron comparando el tiempo de retención y área de sus picos con los de los patrones puros de concentración conocida. Los niveles de DA y sus metabolitos se calcularon con ayuda del programa eDAQ PowerChrom 280. 7.2 CUANTIFICACIÓN DE METABOLITOS EXTRACELULARES MEDIANTE MICRODIÁLISIS 7.2.1 CONSTRUCCIÓN DE LA CÁNULA DE MICRODIÁLISIS Las cánulas utilizadas en este estudio fueron en forma de ‘I’-shaped (Santiago y Westerink, 1990). Están constituidas por un tubo de polietileno PE20 (d.i., 0,38 mm; d.e., 1,09 mm) de 1,5 cm de longitud, al cual se le practicó una fisura por la que se introdujo un tubo capilar de sílice (d.i., 74 μm; d.e., 140 μm) de 2,5 cm de longitud. Este capilar se recubrió por un extremo con un tubo metálico de 25 ga de 1 cm de longitud y, por el otro, con la membrana de diálisis tubular semipermeable de éster de celulosa saponificado (diámetro de poro 10000 dalton) de 5 mm, sellada en su extremo distal con epoxy. La unión del tubo PE20 con la membrana de diálisis y con el tubo metálico se realizó con cianocrilato y epoxy, respectivamente. La longitud de la membrana de diálisis libre (2,5 mm para las cánulas implantadas en el núcleo estriado) se determinó obturando el resto de la membrana con silicona. MATERIALES Y MÉTODOS 95 7.2.2 PROCEDIMIENTO QUIRÚRGICO Los animales se pesaron y anestesiaron con ketamina (Ketamidor® 50 mg/kg) y medetomidina (Domtor® 10mg/kg) por vía i.p. Se utilizó un aparato estereotáxico de David Kopf-6000 para roedores. Las coordenadas para la implantación estereotáxica de las cánulas, según el atlas de Franklin y Paxinos (2008) fueron: anterior +0,5 mm, lateral ± 2,0 mm, ventral 4,0 mm, desde el punto bregma y la duramadre, para ambos núcleos estriados. Una vez abierta la piel con un bisturí y colocadas las pinzas hemostáticas, se procedió a la localización del punto bregma. La cánula, sostenida en un brazo del estereotáxico, se situó justo en el punto bregma. Se tomaron las coordenadas citadas anteriormente y se señalaron sobre el cráneo los puntos para que, con ayuda de una fresa de corona esférica, conectada a un motor portafresas, se abrieran dos orificios para la colocación de tornillos de fijación Micro57 y para la implantación de las cánulas. A continuación, el extremo inferior de la cánula se situó sobre la duramadre que quedó expuesta tras realizar el orificio. A partir de este punto, se introdujo la cánula a la profundidad debida según su implantación en el núcleo estriado. El implante se fijó con cemento dental, englobando a los tornillos de fijación. Una vez fraguada la pasta, se retiraron las pinzas hemostáticas y se procedió a la sutura de la piel. Después de la operación los ratones fueron alojados en jaulas de plástico de dimensiones 35 x 35 x 40 cm (Figura 34). Los experimentos se llevaron siempre a cabo 24-48 horas después de la implantación de la cánula. No es recomendable proseguir en los días posteriores por la aparición de gliosis alrededor de la cánula que disminuye su eficiencia. Figura 34. Imagen del proceso quirúrgico de implantación de la cánula de microdiálisis y mantenimiento del animal durante el protocolo experimental. MATERIALES Y MÉTODOS 96 7.2.3 PROCEDIMIENTO DE PERFUSIÓN INTRACEREBRAL. MICRODIÁLISIS La perfusión intracerebral se realizó en el animal despierto, con libertad de movimiento, mediante un sistema on-line totalmente automático (Westerink et al., 1987). La entrada de la cánula de diálisis se conectó a una bomba de perfusión (Harvard apparatus, mod. 22) y la salida a la válvula de inyección (Rheodyne 7000). Estas conexiones se hicieron con dos tubos de polietileno PE10 (d.i., 0,28 mm; d.e., 0,61 mm) de 20 cm de longitud. Las perfusiones se realizaron usando una solución Ringer a un flujo de 3 µl/min (Figura 35). La composición de la solución Ringer fue: NaCl, 140 mM; KCl, 4,0 mM; CaCl2, 1,2 mM; y MgCl2, 1,0 mM. Desde que el potasio 60 mM fue incluido en la solución Ringer, hasta que la primera muestra con potasio 60 mM se inyectó en la columna hubo un tiempo de retraso de unos 30 minutos. Los datos presentados en esta tesis se corrigieron teniendo en cuenta este tiempo de retraso. Mediante un temporizador electrónico, la válvula de inyección se mantiene en la posición de carga durante 15 minutos en los que el loop de 40 µl se llena con el dializado. Entonces, la válvula cambia automáticamente a la posición de inyección durante 15 segundos. Este proceso se repite cada 15 minutos, que es el tiempo necesario para llevar a cabo un cromatograma completo. El protocolo experimental consistió en la perfusión de la solución de Ringer durante más de 1 hora a través de la cánula implantada hasta lograr conseguir cuatro muestras de dializado estables (valores basales), es decir, la diferencia de los valores de DA y sus metabolitos obtenidos en las muestras no debe ser mayor de 10%. Más tarde se pasó a perfundir una solución de Ringer con una alta concentración de potasio (60 mM) durante 30 minutos. Una vez pasado ese tiempo, se volvió a perfundir la solución de Ringer con una concentración de potasio baja durante 2 horas y media. MATERIALES Y MÉTODOS 97 Los niveles de DA y sus metabolitos fueron analizados por HPLC-ED del mismo modo propuesto en el apartado 7.2. Figura 35. Protocolo experimental representativo del procedimiento de perfusión intracerebral. (Microdiálisis). 8. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA Los cortes coronales (50 µm) del cerebro de los animales destinados al estudio se realizaron utilizando el vibratomo Leica 1000S. Estos cortes se recolectaron en PBS, para posteriormente incubarlos durante 10 minutos a temperatura ambiente en PBS-T0,025%. Las secciones se sumergieron en una solución de bloqueo durante 1 hora (BSA al 10% (p/v) en PBS) y se incubaron toda la noche con el anticuerpo primario anti-TH diluido en una solución de BSA al 5% (p/v) en PBS sin tritón. Al día siguiente, tras varios lavados con PBS, las secciones se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo secundario biotinilado anti-rabbit (Tabla 4) y durante otra hora con el kit VECTASTAIN ABC HRP (Vector). El conjugado se reveló por la adición de una solución al 3% de DAB y 0,04% de sulfato de níquel en PB. Tras varios lavados en PB, se comprobó el marcaje en el núcleo caudado y se seleccionaron las secciones a utilizar. Las secciones seleccionadas se postfijaron en OsO4 al 1% en tampón cacodilato 0,1M (pH 7,4) y posteriormente se procedió a su marcaje con acetato de uranilo al 1% en etanol 70% a 4 oC. Las secciones se deshidrataron con un gradiente ascendiente de etanoles y acetona a temperatura ambiente y se embebieron en DurcupanTM ACM (Fluka®). Tras ello se procedió al corte semifino 1,5 µm y ultrafino 60–70 nm del bloque de resina ya con el tejido incorporado, RESULTADOS 102 1.3 ESTEREOLOGÍA DE LAS NEURONAS DOPAMINÉRGICAS DE LA SN. EFECTO DE LA DELECIÓN DE CASPASA-3 Una vez visto que el sistema DAérgico nigro-estriado parece estar afectado en el ratón C3KO, nos propusimos demostrar estas alteraciones a través de técnicas de estereología, utilizando para ello 4 grupos experimentales. Se utilizaron técnicas de inmunohistoquímica frente a la enzima TH, enzima limitante en la síntesis de DA, y por tanto excelente marcador de neuronas DAérgicas. El análisis estereológico del animal C3KO, se llevó a cabo comparando los resultados obtenidos en todo momento con sus grupos controles: grupo WT, grupo Flox/Flox y grupo Flox/Del (hemidelecionado). Sorprendentemente, la SN de los animales experimentales C3KO (Figura 39, B y D), mostró un número de neuronas TH positivas significativamente superior, con un aumento del 145,5% con respecto al grupo WT (Figura 39, C y D), de un 96,2% con respecto al grupo Flox/Flox y de un 78,6% con respecto al grupo Flox/Del (***p<0,001) (Figura 39, E). El estudio del volumen de la SN concluyó resultados similares, ya que los valores obtenidos para el grupo C3KO también resultaron significativamente superiores. Se observó en este caso, un aumento de un 54% del volumen en el grupo C3KO con respecto al grupo WT, de un 58% con respecto al grupo Flox/Flox y de un 42% con respecto al grupo Flox/Del. (***p<0,001) (Figura 39, F). Los análisis del número de células TH positivas por mm3, resultaron en la misma línea. En el grupo C3KO en este caso, los valores se elevaron significativamente un 62% con respecto al grupo WT, un 24% con respecto al grupo Flox/Flox y un 27% con respecto al grupo Flox/Del (*p<0,05) (Figura 39, G). Muchas de las diferencias estructurales apreciadas durante el análisis estereológico, se pudieron observar a simple vista comparando secciones de animales C3KO y controles teñidas y cortadas al mismo nivel (Figura 39, A-D). RESULTADOS 103 RESULTADOS 104 Figura 39. Efecto de la deleción de la caspasa-3 en la SN. Las secciones coronales muestran la inmunoreactividad para TH en animales C3KO (B y D) y WT (A y C). Obsérvese la mayor inmunoreactividad frente a TH y el mayor número de fibras en el animal C3KO. Barra de escala A y B 250 µm; C y D 100 µm. La deleción total o parcial de caspasa-3, generó diferencias en el número de células TH positivas (E), en el volumen de la SN (F) y en el número de células TH positivas/mm3 (G) en los distintos grupos animales (WT, Flox/Flox, Flox/Del, C3KO). Los resultados se representan como media ± EEM de 4 experimentos independientes. La significación estadística se realizó mediante un ANOVA de una vía seguido de una prueba de múltiples rangos utilizando el test de diferencia mínima significativa LSD de Fisher *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001. 1.4 EXPRESIÓN DE MARCADORES DOPAMINÉRGICOS EN SN. EFECTO DE LA DELECIÓN DE CASPASA-3 Puesto que los valores obtenidos en los 3 grupos controles fueron similares, se trabajó a partir de ahora con dos grupos experimentales (C3KO y WT) en la SN y estriado. Dadas las importantes diferencias observadas en el sistema nigro-estriado en el modelo animal objeto de estudio, se realizó un análisis de expresión génica de los marcadores DAérgicos: TH y DAT, por medio de la técnica de RT-PCR de ARNm en SN (Figura 40). Los resultados obtenidos para las muestras de SN revelaron una inducción significativa de la expresión de TH en los animales C3KO, de un 40% con respecto al grupo WT (*p<0,05) (Figura 40, A). Los resultados para este marcador, se presentaron acordes a los descritos en el apartado 1.2 con respecto a la expresión de TH en la SN. En el caso de DAT, la expresión génica también fue significativamente superior en los animales C3KO (47%) comparados con el grupo WT (*p<0,05) (Figura 40, B). RESULTADOS 105 Figura 40. Efecto de la deleción de caspasa-3 en la expresión de marcadores DAérgicos en la SN. Niveles de expresión de ARNm de TH (A) y DAT (B) en los distintos grupos animales (WT y C3KO) obtenidos mediante RT-PCR. Los resultados se representan como media ± EEM de 4 experimentos independientes, expresados como porcentaje con respecto al WT. La significación estadística se analizó mediante el test t de student de dos colas *p<0,05. * TH (A) * DAT (B) RESULTADOS 106 1.5 ANÁLISIS NEUROQUÍMICO DE LA DA Y SUS METABOLITOS EN EL NÚCLEO ESTRIADO. EFECTO DE LA DELECIÓN DE CASPASA-3 1.5.1 DA INTRACELULAR (HPLC) Para valorar los efectos de la ausencia de caspasa-3 en células DAérgicas, se estudió mediante HPLC el contenido de DA intracelular y de sus metabolitos DOPAC y HVA en el núcleo estriado de los animales C3KO y WT. Los resultados confirmaron cambios en los niveles de DA y DOPAC. En el caso de la DA, los niveles fueron significativamente superiores en el grupo C3KO (138%) con respecto al grupo WT (**p<0,01) (Figura 41, A). En el caso de DOPAC, los niveles fueron significativamente inferiores en el grupo C3KO (56%) (**p<0,01) (Figura 41, B). Estos datos confirman por tanto la existencia de alteraciones en el metabolismo de la DA, derivadas de la ausencia de caspasa-3. La medida de los niveles de HVA no mostró diferencias significativas entre los diferentes grupos (Figura 41, C). Figura 41. Efecto de la deleción de caspasa-3 en núcleo estriado. Cuantificación de la cantidad de DA intracelular (A) y de sus metabolitos DOPAC (B) y HVA (C) en el núcleo estriado de los animales de los distintos grupos de estudio (C3KO y WT). Los resultados están expresados como ng/g de tejido húmedo y están representados como la media ± EEM de 4 experimentos independientes. La significación estadística se analizó mediante el test t de student de dos colas **p<0.01. RESULTADOS 107 1.5.2 DA EXTRACELULAR (MICRODIÁLISIS) Para valorar las consecuencias de la deleción de caspasa-3 y llevar a cabo un estudio completo del metabolismo DAérgico, se utilizó la técnica de microdiálisis in vivo para valorar la liberación de DA por parte de las neuronas DAérgicas del núcleo estriado. El estudio se llevó a cabo mediante la perfusión de potasio 60 mM durante 30 minutos, que produjo la despolarización neuronal induciendo la liberación de DA. Esto permitió estudiar de forma más clara las diferencias existentes en el comportamiento de la DA, y de sus metabolitos (DOPAC y HVA) entre el grupo C3KO y el grupo control (WT). La liberación de DA (expresada en fmoles/min) fue, durante todo el procedimiento experimental, significativamente superior en el grupo WT, incluso sin la presencia de potasio 60 mM, liberando de media, un 180,2% más que el grupo C3KO (*p<0,05; **p<0,01) (Figura 42, A). Durante la perfusión de potasio 60 mM, se produjeron también diferencias significativas en el incremento de la liberación de DA entre ambos grupos y con respecto a sus respectivos valores basales, definiendo así perfiles de liberación diferentes. En la primera medida, estos incrementos fueron del orden de 114,3 fmoles/min en el grupo C3KO y de 238,8 fmoles/min en el grupo WT (*p<0,05; #p<0,05). Este aumento con respecto a los valores basales no se mantuvo en el tiempo, pero sí las diferencias entre los dos grupos. Por otra parte, el grupo WT también presentó niveles significativamente superiores en cuanto a los metabolitos DOPAC y HVA, manteniéndose la significación en casi todos los tiempos de ensayo. Los niveles de estos metabolitos fueron, de media, un 81,6% (DOPAC) (Figura 42, B) y un 81,7% (HVA) (Figura 42, C) superiores en el grupo WT con respecto al grupo experimental (C3KO) (*p<0,05). Los perfiles fueron similares durante todo el ensayo. RESULTADOS 108 RESULTADOS 109 Figura 42. Efecto de la deleción de caspasa-3 en el núcleo estriado. Análisis del efecto de la perfusión de potasio 60 mM durante 30 minutos sobre los niveles extracelulares de DA (A), DOPAC (B) y HVA (C) en el núcleo estriado de animales C3KO y WT. Los resultados representan los fmoles/min liberados de cada metabolito, y están expresados como media ± EEM de 4 experimentos independientes. Las diferencias intragrupo entre los cuatro primeros valores basales y los valores durante y después de la perfusión de potasio 60 mM se analizaron mediante un ANOVA de una vía seguido de una prueba de múltiples rangos utilizando el test de diferencia mínima significativa LSD de Fisher #p<0,05. La significación estadística de las diferencias entre grupos (C3KO y WT) a cada tiempo, se analizó mediante el test t de student de dos colas *p<0,05. 2. ESTUDIOS SINÁPTICOS 2.1 ESTUDIO SINÁPTICO Y BALANCE EXCITACIÓN/INHIBICIÓN EN LA SN Y EL NÚCLEO ESTRIADO. EFECTO DE LA DELECIÓN DE CASPASA-3 EN LA FORMACIÓN SINÁPTICA Debido a las importantes diferencias observadas en el sistema nigro-estriado de los animales delecionados sujetos a estudio, parecía obvio que la conectividad sináptica de los mismos pudiera estar alterada en ambas estructuras. Por tanto, se llevó a cabo un análisis sináptico en animales C3KO con respecto a animales control (WT) realizando una inmunofluorescencia doble contra proteínas de andamiaje postsináptico: PSD95 (sinapsis excitadoras) o gefirina (sinapsis inhibitorias) y contra una proteína presente en vesículas presinápticas (sinaptofisina). El análisis del número de sinapsis excitatorias/inhibitorias (medidas por colocalización entre PSD95-sinaptofisina o gefirina-sinaptofisina respectivamente), en SN, reveló un número superior de contactos sinápticos excitatorios e inhibitorios en el grupo C3KO con respecto al grupo WT, de un 132,2% y un 368% respectivamente (*p<0,05) (Figura 43, N y M). Por otra parte, en el núcleo estriado no se encontraron diferencias significativas de ambos marcajes entre los grupos (datos no mostrados). RESULTADOS 110 RESULTADOS 111 Figura 43. Efecto de la deleción de caspasa-3 en la formación sináptica. Análisis de la formación sináptica sinaptofisina-PSD95 (excitatoria) y sinaptofisina-gefirina (inhibitoria) mediante estudios de inmunofluorescencia en la SN de los grupos animales C3KO y WT. Se muestra el patrón de expresión, sinaptofisina (verde) – gefirina (rojo) (A,B,C,D,E,F) y sinaptofisina (verde) – PSD95 (rojo) (G,H,I,J,K,L). Las imágenes confirman que el número de contactos sinápticos tanto excitatorios como inhibitorios es superior en el grupo C3KO con respecto al grupo WT (C,F,I,L). Representación gráfica del número de contactos sinápticos por µm2 en cada genotipo, para la colocalización inhibitoria (sinaptofisina-gefirina) (M), y para la colocalización excitatoria (sinaptofisina-PSD95) (N).. Los resultados están representados como la media ± EEM de 4 experimentos independientes. La significación estadística se analizó mediante el test t de student de dos colas *p<0,05. Barra de escala 20 µm. SYP=sinaptofisina. 2.2 ESTUDIO ANATÓMICO DE LAS SINAPSIS EN EL NÚCLEO ESTRIADO. EFECTO DE LA DELECIÓN DE CASPASA-3 EN LA FORMACIÓN SINÁPTICA Para profundizar en las diferencias observadas en la formación sináptica entre los grupos C3KO y WT, se llevó a cabo un estudio ultraestructural de los componentes sinápticos en ambos, mediante observación por microscopía electrónica (Figura 44). Se realizaron microfotografías en mosaico del núcleo caudado dorsal para estudiar las sinapsis TH negativas (A-C) y TH positivas (D-E) y se distinguieron distintos tipos, clasificadas en sinapsis axosomáticas (flechas, A y D) y axodendríticas (flecha, B), todas ellas consideradas a su vez no axoespinosas (nAS) (analizadas en el gráfico I y J). Junto a estas, se estudiaron también dos tipos de sinapsis axoespinosas; por una parte, las sinapsis maculares fueron las más abundantes y sus terminales presinápticos (asteriscos, A-C) se presentaron enfrentados 205 BIBLIOGRAFÍA Tait, S. W., Ichim, G., & Green, D. R. (2014). Die another way–non-apoptotic mechanisms of cell death. J Cell Sci, 127(10), 2135-2144. Takada, M., Itoh, K., Sugimoto, T., & Mizuno, N. (1985). Topographical projections from the thalamus to the putamen in the cat. Neuroscience letters, 54(2-3), 207-212. Takahashi, H., Komatsu, S., Nakahachi, T., Ogino, K., & Kamio, Y. (2016). Relationship of the acoustic startle response and its modulation to emotional and behavioral problems in typical development children and those with autism spectrum disorders. Journal of autism and developmental disorders, 46(2), 534-543. Takamori, S., Holt, M., Stenius, K., Lemke, E. A., Grønborg, M., Riedel, D., ... & Müller, S. A. (2006). Molecular anatomy of a trafficking organelle. 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