Diseño de consorcios bacterianos potenciadores de la nodulación para la recuperación de estuarios degradados por estreses abióticos utilizando Medicago sativa

Diseño de consorcios bacterianos potenciadores de la nodulación para la recuperación de estuarios degradados por estreses abióticos utilizando Medicago sativa Noris Jarleny Flores Duarte Sevilla, 2023 TESIS DOCTORAL “Si supiera que el mundo se acaba mañana, yo, hoy, todavía plantaría un árbol” Martin Luther King Departamento de Microbiología y Parasitología Facultad de Farmacia Diseño de consorcios bacterianos potenciadores de la nodulación para la recuperación de estuarios degradados por estreses abióticos utilizando Medicago sativa Noris Jarleny Flores Duarte Sevilla, 2023 Departamento de Microbiología y Parasitología Facultad de Farmacia La Tesis Doctoral titulada “Diseño de consorcios bacterianos potenciadores de la nodulación para la recuperación de estuarios degradados por estreses abióticos utilizando Medicago sativa”, realizada por la Licenciada en Microbiología/Biología Dña. Noris Jarleny Flores Duarte para optar al grado de Doctor en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica por la Universidad de Sevilla, se presenta bajo la modalidad de “Tesis por compendio de publicaciones”, con la aprobación de los Directores y el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad de Sevilla. Noris. J. Flores-Duarte iv Enrique. Otra de las personas a las que estoy muy agradecida. Por sacar tiempo para llevarnos a las Marismas en busca de muestras para realizar esta tesis, por medir y analizar los parámetros fotosintéticos de mis plantas, por hacer agradables los viajes para recolectar plantas e inoculaciones de fresas. Sé que Enrique es capaz de entrar a las profundidades del mar para encontrar las muestras ja ja. Susana. Por organizar los viajes de trabajo, por el aporte en las publicaciones. Enrique y Susana otra vez. A ambos quiero dar gracias por el aporte ecológico y por el aporte económico por medio de sus proyectos que han hecho posible seguir y poder terminar esta tesis. Julia y Sara. Por sus aportaciones en los experimentos y artículos de esta tesis. Elena, Pedro, Yanina, José Antonio, Jesús y Jenny. Por la colaboración en trabajos para presentaciones en congresos. Jesús Valentín, José María y Pilar. Por su ayuda en el invernadero. Modesto, Chus, los de microscopía y el resto del equipo del Citius I y II que me ayudaron. Eva. Por su amabilidad. El resto de los integrantes de recepción del Citius II. El resto de los miembros de los laboratorios. Por ayudarme con los pequeños detalles, materiales, métodos, necesarios para llevar a cabo los experimentos. En general los grupos fusión BIO-181 y RNM-035 por creer y confiar en mi trabajo y por haber contribuido en parte a mi aprendizaje, principalmente por ser un gran equipo de trabajo con los que me he sentido tan bien desde el primer día. Los proyectos de investigación “Mejora de la sostenibilidad del cultivo de fresa mediante bioherramientas” Feder US-1262036, financiado por la convocatoria de Ayudas a Proyectos de I+D+i en el Marco del Programa Operativo FEDER Andalucía 2014-2020, de la Consejería de Economía, Conocimiento, Empresas y Universidad de la Junta de Andalucía, “Prueba de concepto, con los usuarios finales, de una bioherramienta para la mejora de prácticas agrícolas intensivas (BIOFERSA), PDC2021-120951-I00”. Financiado por MCIN/AEI/10.13039/501100011033 y por la Unión Europea Next Generation EU/ PRTR, Plan de Recuperación, Transformación y Resiliencia, MESEMBOLOMA: Valorización de la halófita de las costas andaluzas Mesembryanthemum crystallinum como fuente de bioproductos de interés farmacéutico y nutracéutico. P20_00682. Junta de Andalucía, PAIDI: Proyectos I+D+i, PAIDI2020. David, de Labotaq. Por proporcionarnos rápidamente los insumos para el laboratorio y resolvernos los problemas. Gracias. La Fundación Biodiversidad Alimentaria de Chile. Por permitirme utilizar su catálogo de imágenes tan representativas de la biodiversidad de semillas y plantas. Antonio. Por la experiencia aportada, conocimiento, por ayudarme a corregir errores, ayudarme con los dibujos, y por ser mi primer espectador para las presentaciones a congresos mientras aprendía sobre plantas y bacterias y dejaba de un lado los circuitos electrónicos y Pasapalabra. Agradecimientos v Mis cuñados. Josué, por inscribirme al programa de becas, por hacerme algunos dibujos. Juan, por salvarme del hotel Transilvania, traerme para empezar las clases del máster, por su ayuda en mi segundo congreso. Mis hermanas. Riccy, por recibirme con los brazos abiertos y enseñarme mucho a pesar de ser mi hermana menor. Wendy, por su paciencia, consejos y ayuda, Yaneida, por ser una hermana mayor que está pendiente de la familia y por ayudarme cuando lo he necesitado. Gracias al resto de hermanas y hermanos, que son muchos, por su apoyo. No los menciono a todos porque tendría que escribir varias páginas de agradecimientos y esta es una de las partes que se me hacen más difíciles de escribir. El resto de mi familia y amigos. Mi psicólogo. Félix V. D. Gracias por ayudarme, también eres parte de este momento importante de mi vida. Mis padres. Por la compresión, el apoyo, la motivación en todo momento y por estar orgullosos de mí. Gracias a todos los que han contribuido a mi vida científica. Si he omitido a alguien en estos agradecimientos, pido sinceras disculpas por ello. Noris. J. Flores-Duarte vi Agradecimientos .......................................................................................................................... i Publicaciones y Aportaciones a Congresos ............................................................................ vii Abreviaturas… ......................................................................................................................... xv I. Resumen … ............................................................................................................................ 1 II. Introducción .......................................................................................................................... 5 1. Problemática ambiental ......................................................................................................... 7 1.1 Suelos con deficiencia nutricional ...................................................... 8 2. Los ríos Tintos, Odiel y Piedras .......................................................................................... 10 2.1 Demarcación Hidrográfica ................................................................ 10 2.2 Importancia de los estuarios de los ríos Tinto, Odiel y Piedras ........ 11 2.3 Problemáticas de las marismas del río Piedras y Odiel..................... 11 3. Técnicas para la recuperación de suelos contaminados ...................................................... 15 3.1 Tratamientos físico-químicos ............................................................ 15 3.2 Tratamientos biológicos o biorremediación ...................................... 16 4. Mecanismos de bacterias rizosféricas y endófitas para la recuperación de los suelos degradados mediante la promoción del crecimiento vegetal .................................................. 19 4.1 Propiedades promotoras del crecimiento vegetal .............................. 19 4.1.1 Mecanismos directos ............................................................. 20 4.1.2. Mecanismos indirectos. ......................................................... 21 4.2 Mecanismos de tolerancia a metales pesados ...................................... 23 5. Las plantas leguminosas: Medicago sativa y su utilidad en la regeneración de suelos. ………………………………………………………………………………………………..26 5.1 Rizobios ............................................................................................ 27 5.2 Rizobacterias y endófitos no rizobios ............................................... 29 6. Leguminosas en fitorremediación ....................................................................................... 32 7. Fitorremediación e interacciones planta-bacteria en los estuarios de los ríos Tinto, Odiel y Piedras. ………………………………………………………………………………………33 III. Objetivos ………………………………………………………………………………….35 IV. Resultados .......................................................................................................................... 38 V. Discusión ..………………………………………………………………………...............106 1. Problemática medioambiental ........................................................................................... 108 2. Rizobacterias y endófitos potenciadores de la nodulación ............................................... 108 3. Efecto potenciador de las bacterias sobre el desarrollo y crecimiento de M. sativa en condiciones de estrés abióticos. ............................................................................................ 110 4. Inoculación con consorcios frente a bacterias individuales .............................................. 114 VI. Conclusiones ..................................................................................................................... 116 VII. Perspectivas de Futuro .................................................................................................. 120 Bibliografía …. ....................................................................................................................... 123 Contenido Publicaciones y Aportaciones a Congresos vii Publicaciones y Aportaciones a Congresos Variedad de guisantes/arvejas en sus vainas y sus flores coloridas: Fundación Biodiversidad Alimentaria Noris. J. Flores-Duarte viii Publicaciones y Aportaciones a Congresos ix Publicaciones Navarro-Torre, S., Bessadok, K., Flores-Duarte, N. J., Rodríguez-Llorente, I. D., Caviedes, M. A., and Pajuelo, E. (2020). “Helping legumes under stress situations: inoculation with beneficial microorganisms,” in Legume crops. Hasanuzzaman, M. (editor). (London, UK: Intech Open), 1–10. Flores-Duarte, N. J., Pérez-Pérez, J., Navarro-Torre, S., Mateos-Naranjo, E., RedondoGómez, S., Pajuelo, E., y Rodríguez-Llorente, I. D. (2022). Improved Medicago sativa nodulation under stress assisted by Variovorax sp. endophytes. Plants. 11, 1091. Flores-Duarte, N.J., Mateos-Naranjo, E., Redondo-Gómez, S., Pajuelo, E., RodriguezLlorente, I.D., Navarro-Torre, S. (2022). Role of nodulation-enhancing rhizobacteria in the promotion of Medicago sativa development in nutrient-poor soils. Plants 11, 1164. Flores-Duarte, N.J., Caballero-Delgado, S., Pajuelo, E., Mateos-Naranjo, E., RedondoGómez, S., Navarro-Torre, S., Rodríguez-Llorente, I.D. (2022). Enhanced legume growth and adaptation to degraded estuarine soils using Pseudomonas sp. nodule endophytes. Front Microbiol. 13, 1005458. Pajuelo, E., Navarro-Torre, S., Caviedes, MA., Carrasco, J.A., Flores-Duarte, N.J., Gordillo, I., Torres-García, A.M., Rodríguez-Llorente, I.D. (2022). Grupo fitomicrobiomas como herramientas biotecnológicas. SánchezAngulo M (editor). SEM@foro. 73, 29-30. Valle-Romero, P., García-López, J. V., Redondo-Gómez, S., Flores-Duarte, N.J., Rodríguez-Llorente, I.D., Idaszkin, Y.L., Pajuelo, E., y Mateos-Naranjo, E. (2023). Biofertilization with PGP bacteria improve strawberry plant performance under suboptimum phosphorus fertilization. Agronomy 13, 335. Aportaciones en congresos Flores-Duarte, N.J., Pajuelo, E., Rodríguez-Llorente, I.D., Navarro-Torre, S. Inoculación de Medicago sativa con bacterias rizosféricas que ayudan a la nodulación en suelos degradados. En: IX Reunión del grupo Microbiología de Plantas (virtual). Del 16 al 17 de febrero del 2021, España. Presentación Oral. Flores-Duarte, N.J., Caballero-Delgado, S., Pajuelo, E., Mateos-Naranjo, E., RodríguezLlorente, I.D., Navarro-Torre, S. Mejora de la nodulación de Medicago sativa en suelos contaminados con metales pesados mediante la inoculación con PGPE. En: XXVIII Congreso Nacional de Microbiología de la SEM (virtual). Del 28 de junio al 02 de julio del 2021, España. Presentación Oral. Flores-Duarte, N.J., Pérez-Pérez, J., Mateos-Naranjo, E., Redondo-Gómez, S., Pajuelo, E., Rodríguez-Llorente, I.D., Navarro-Torre, S. Especies de Variovorax asociadas al nódulo que mejoran el crecimiento y la nodulación de Medicago sativa en situaciones de estrés. En: I Congreso Universitario en Innovación y Sostenibilidad Agroalimentaria (virtual). Del 16 al 17 de septiembre del 2021, España. Presentación Oral. ISBN: 978-8418177-16-3. Noris. J. Flores-Duarte x Romano, E., García-López, J.V., Flores-Duarte, N.J., Merino, S., Mesa-Marín, J., Rodríguez-Llorente, I.D., Redondo-Gómez, S., Pajuelo, E., Mateos-Naranjo, E. Mejora de la sostenibilidad del cultivo de fresa: mecanismos fisiológicos desencadenados por bacterias PGP bajo condiciones subóptimas de fertilización. En: I Congreso Universitario en Innovación y Sostenibilidad Agroalimentaria (virtual). Del 16 al 17 de septiembre del 2021, España. Presentación Oral. ISBN: 978-84-18177-16-3. García-López, J.V., Flores-Duarte, N.J., Romano, E., Mesa-Marín, J., RodríguezLlorente, I.D., Redondo-Gómez, S., Pajuelo E., Mateos-Naranjo, E. Biofertilizantes: herramientas para optimizar la producción de fresa con reducciones de riego y fertilización química. En: I Congreso Universitario en Innovación y Sostenibilidad Agroalimentaria (virtual). Del 16 al 17 de septiembre del 2021, España. Presentación de póster. ISBN: 978-84-18177-16-3. Flores-Duarte, N.J., Caballero-Delgado, S., Pajuelo, E., Mateos-Naranjo, E., RodríguezLlorente, I.D., Navarro-Torre, S. Improvement of the nodulation of Medicago sativa in soils contaminated with heavy metals by inoculation with PGPE. En: 14th European Nitrogen Fixation Conference. Del 22 de septiembre al 22 de octubre del 2021, Dinamarca. Presentación de póster. Mesa-Marín, J., Redondo-Gómez, S., Flores-Duarte, N.J., Pajuelo, E., RodríguezLlorente, I.D., Mateos-Naranjo, E. Bioherramientas para el cultivo sostenible de la fresa. En: Noche Europea de los Investigadores. El 24 de septiembre del 2021, Sevilla, España. Participación en ponencia. García-López, J.V., Flores-Duarte, N.J., Romano, E., Mesa-Marín, J., RodríguezLlorente, I.D., Redondo-Gómez, S., Pajuelo E., Mateos-Naranjo, E. Biofertilizers: tools to optimize strawberry production with reduced irrigation and chemical fertilization (virtual). En: XV Portuguese-Spanish Symposium on Plant Water Relations. Del 26 de enero al 28 d febrero del 2022, Portugal. Presentación de póster. Flores-Duarte, N.J., Rodríguez-Llorente, I.D., Pajuelo, E., Mateos-Naranjo, E., RedondoGómez, S., Navarro-Torre, S. Optimizando la nodulación de leguminosas en situaciones de estrés ambiental: inoculantes mixtos con endófitos multirresistentes. En: XV Reunión Nacional del Metabolismo del Nitrógeno. Del 02 al 04 de febrero del 2022, Córdoba, España. Presentación oral. Flores-Duarte, N.J., Rodríguez-Llorente, I.D., Pajuelo, E., Mateos-Naranjo, E, RedondoGómez, S., Navarro-Torre S. Especies de Variovorax asociadas al nódulo que mejoran la germinación, biomasa y la nodulación de Medicago sativa en situaciones de estrés ambiental. En: XIV Congreso Internacional de SEAE “Soberanía AlimentariaEmergencia Climática”. Del 25 al 27 de abril del 2022. Palma de Mallorca, España. Presentación oral. Flores-Duarte, N.J., García-López, J.V., Romano-Rodríguez, E., Mesa-Marín, J., PérezRomero, J.A., Rodríguez-Llorente, I.D., Redondo-Gómez, S., Pajuelo, E., MateosNaranjo, E. Development of biotools to improve the use of water resources in strawberry explotations. En: XIV Congreso Internacional de SEAE “Soberanía AlimentariaEmergencia Climática”. Del 25 al 27 de abril del 2022. Palma de Mallorca, España. Presentación de póster. Publicaciones y Aportaciones a Congresos xi Flores-Duarte, N.J. XXª Feria de la Ciencia. Importancia de los corales. Los días 12 y 14 de mayo del 2022, Sevilla, España. Participación como colaborador. Flores-Duarte N.J., Pérez-Pérez J., Rodríguez-Llorente, I.D., Pajuelo E., Mateos-Naranjo E., Redondo-Gómez, S., Navarro-Torre, S. Nodule-Associated Variovorax species that improve germination, biomass and nodulation of Medicago sativa in metal polluted soils. En: International workshop: Agrobiotechnology for the Biorremediation of Soils Polluted by Metals (BIOREMET). Del 25 al 26 de mayo del 2022, Marrakech, Marruecos. Presentación oral. Pajuelo, E., Flores-Duarte, N.J., Carrasco-López J.A., Navarro-Torre, S., RodriguezLlorente, I.D. “Circular agronomy” and culturomics: Two sides of the same coin in the design of tailored low cost biofertilizers for bioremediation of metal polluted soils. En: International workshop: Agrobiotechnology for the Biorremediation of Soils Polluted by Metals (BIOREMET). Del 25 al 26 de mayo del 2022, Marrakech, Marruecos. Presentación oral. Flores-Duarte N.J., Pajuelo E., Mateos-Naranjo, E., Redondo-Gómez, S., Navarro-Torre, S. Rodríguez-Llorente, I.D. Optimizing legume nodulation in situations of environmental stress: inoculants with multiresistant endophytes. En: XVIII Congress on Beneficial Plant Microbe Interaction (BeMiPlant). Del 17 al 19 de octubre del 2022, Oeiras, Portugal. Presentación de póster. Flores-Duarte N.J., Caballero-Delgado, S., Pajuelo, E., Mateos-Naranjo, E., RedondoGómez, S., Navarro-Torre, S., Rodríguez-Llorente, I.D. Enhanced legume growth and adaptation to degraded estuarine soils using Pseudomonas sp. nodule endophytes. En: XVIII Congress on Beneficial Plant Microbe Interaction (BeMiPlant). Del 17 al 19 de octubre del 2022, Oeiras, Portugal. Presentación oral. Carrasco-López J.A., Flores-Duarte, N.J., Navarro-Torre, S., RodriguezLlorente, I.D., Pajuelo, E. “Circular agronomy” and culturomics: Two sides of the same coin in the design of tailored low cost biofertilizers to promote plant growth under stresses. XVIII Congress on Beneficial Plant Microbe Interaction (BeMiPlant). Del 17 al 19 de octubre del 2022, Oeiras, Portugal. Presentación oral. Mesa-Marín, J., Valle-Romero, P., García-López, J.V, Flores-Duarte, N.J., Romano, E., Redondo-Gómez, S., RodriguezLlorente, I.D., Pajuelo, E., Mateos-Naranjo, E. Effect of bacterial inoculation on the physiological response of strawberry under phosphorus deficit. En: XVIII Congress on Beneficial Plant Microbe Interaction (BeMiPlant). Del 17 al 19 de octubre del 2022, Oeiras, Portugal. Presentación póster. Flores-Duarte, N.J., Mateos-Naranjo, E., Pajuelo, E., Carrasco-López, J.A., RedondoGómez, S., Rodríguez-Llorente, I.D., Navarro-Torre, S. Nodulación de leguminosas en situaciones de estrés abiótico: inoculantes con endófitos resistentes a sequía y altas temperaturas como alternativa sostenible. En: X Reunión Grupo Especializado Microbiología de plantas. Del 25 al 27 de enero del 2023, Málaga, España. Presentación oral. Romano-Rodríguez, E., Flores-Duarte, N.J., García-López, J.V., Mesa-Marín, J., PérezRomero, J.A., Rodríguez-Llorente, I.D., Redondo-Gómez, S., Pajuelo, E., MateosNaranjo, E. Bioherramientas para la mejora de la eficiencia del uso de fertilización Noris. J. Flores-Duarte xii química y recursos hídricos en explotaciones fresera. En: X Reunión Grupo Especializado Microbiología de plantas. Del 25 al 27 de enero del 2023, Málaga, España. Presentación oral. Valle-Romero, P., García-López, J.V., Redondo-Gómez, S., Flores-Duarte, N.J., Rodríguez-Llorente, Idaszkin, Y.L., Pajuelo, E., Mateos-Naranjo, E. Effect of bacterial inoculation on the physiological response of strawberry under phosphorus deficit conditions. En: X Reunión Grupo Especializado Microbiología de plantas. Del 25 al 27 de enero del 2023, Málaga, España. Presentación oral. Abreviaturas xv Abreviaturas Variedad de fríjoles/alubias/arvejas/guisantes/porotos en vainas: Fundación Biodiversidad Alimentaria Noris. J. Flores-Duarte 4 (Pseudomonas sp. N4 y Pseudomonas sp. N8) y dos rizobios autóctonos (Ensifer sp. N10 y Ensifer sp. N12; CSN). Estas inoculaciones mejoraron la germinación, la nodulación y el crecimiento de las plantas en experimentos in vitro. En condiciones de invernadero con suelos de los estuarios mejoraron la nodulación, el estado fisiológico de la planta, los parámetros fotosintéticos, el contenido de clorofila y nitrógeno, la respuesta al estrés de la planta, además de mejorar la acumulación de metales en las raíces M. sativa en suelos degradados con niveles de moderados a altos de contaminación. Partiendo de la mencionada propuesta, en esta Tesis Doctoral se ha demostrado que las inoculaciones de M. sativa con los consorcios bacterianos compuestos por rizobios y endófitos resistentes a metales o rizobacterias con propiedades PGP son herramientas útiles para la fitoestabilización de metales/oides y para promover el crecimiento de leguminosas en suelos con distintos tipos de estrés abiótico, contribuyendo a la recuperación de estos ecosistemas. Con esta estrategia se garantiza, además, una mínima translocación de metales a la parte aérea de las plantas, por lo que podrían utilizarse, además de en estrategias de fitoestabilización de metales, como plantas forrajeras. Introducción 5 II. Introducción Variedad de semillas de leguminosas: Fundación Biodiversidad Alimentaria Noris. J. Flores-Duarte 6 Introducción 7 1. Problemática ambiental Los ecosistemas de los estuarios tienen gran importancia por su flora y fauna silvestre, autóctona y alóctona. Estos ecosistemas dan refugio a una gran variedad de aves migratorias, peces y crustáceos, entre otros, y proporcionan un hábitat a plantas autóctonas de interés biotecnológico, ornamental, económico y científico. Además, ofrecen beneficios económicos, culturales y científicos. A todo ello se suma el aporte de recursos genéticos en la rizosfera y en las propias plantas, que contienen microorganismos que ayudan al intercambio de nutrientes (Barbier et al., 2017). Actualmente existe una creciente preocupación por la salud de los estuarios, que se ven sometidos a múltiples factores disruptivos, que ponen en peligro los beneficios anteriormente citados. Cabe citar, entre otros, la contaminación, la excesiva explotación de los recursos naturales, la mala calidad del agua debido a la contaminación por compuestos tóxicos (Booi et al., 2022), y el cambio climático que provoca sequía. Todos estos factores causan una gran pérdida de microorganismos autóctonos del suelo, provocando alteraciones en la adaptación y el crecimiento de las plantas silvestres y una peor respuesta a los diferentes tipos de estrés (García-Martí et al., 2019; Du et al., 2021). Aunque la mayoría de los problemas son causados por actividades antropogénicas, también los hay de origen natural, como la degradación de los suelos por la pérdida de sus nutrientes y por la presencia de componentes minerales que pueden ser tóxicos en determinadas concentraciones. A esto se suma que la cantidad de contaminante de origen humano aumenta constantemente debido al continuo desarrollo agroquímico e industrial (FAO e ITPS, 2015; Alsharif et al., 2020). Las actividades industriales y mineras liberan al ambiente metales/loides tóxicos, como As, Cd, Cu y Pb, todos ellos muy perjudiciales para la salud humana y la mayoría de los seres vivos (FAO e ITPS, 2015). Esto a su vez ha provocado la degradación de los suelos, ya sea por la modificación del pH o por originar una disminución en el número de tierras cultivables causando un problema a nivel social, económico y ambiental (Singh et al., 2010; Chen et al., 2013). Los metales pesados son peligrosos por no ser degradables ni química ni biológicamente, pudiendo permanecer en el medio ambiente durante cientos o miles de años (Herrera-Marcano, 2011). El Pb y el As pueden tardar de 100 a 300 años en dispersarse por el suelo (Alloway, 1995), mientras que la vida media del Cd, Cu y Pb en el suelo puede ser de 15 a 1100, de 310 a 1500 y de 740 a 5900 años, respectivamente. (Alloway y Ayres,1993). Sus concentraciones dependen del tipo de suelo, el clima y sus características fisicoquímicas (Alloway y Ayres, 1993; Mapanda et al., 2005). Estos metales también vienen reprimiendo la actividad enzimática de los suelos, provocando una disminución en el crecimiento y respiración de las poblaciones de microorganismos, alterando así la diversidad presente en la rizosfera (Abdu et al., 2017; Aponte et al., 2020). Estos problemas limitan la seguridad alimentaria al reducir el rendimiento de los suelos debido a los niveles tóxicos de contaminantes y todo esto desemboca en cultivos peligrosos para el consumo animal y humano, por lo que las autoridades de todo el mundo han puesto el foco en este problema de seguridad alimentaria y ambiental. Proponen Noris. J. Flores-Duarte 8 lograr un desarrollo sostenible y enfrentarse al cambio climático (FAO, 2015; FAO, 2016; FAO, 2019; OMS, 2021). 1.1 Suelos con deficiencia nutricional Las actividades naturales y humanas han causado efectos negativos sobre los suelos, aumentando continuamente el número de suelos degradados, que se caracterizan por una mala calidad, una disminución de la fertilidad y los nutrientes y un aumento de los estreses abióticos como la salinidad, el contenido de metales pesados o la sequía. La biodiversidad vegetal se reduce por la presencia de estrés abiótico y crea un desequilibrio de nutrientes en los suelos, constituyendo el mayor reto en materia de alimentación (Vanlauwe et al., 2015; Zhu et al., 2020a). En los estuarios, la deficiencia nutricional de los suelos produce una pérdida de fertilidad y biodiversidad microbiana e impiden el crecimiento y desarrollo de las plantas, disminuyendo su valor e impacto ecológico (Paul y Lade, 2014; Chodak et al., 2015). Las plantas necesitan un balance de nutrientes correcto para un mejor desarrollo. Cuando las plantas sufren una deficiencia de nutrientes lo muestran fácilmente en la parte aérea, mostrando necrosis en el meristemo y en los bordes de las hojas, clorosis en toda la hoja, clorosis entre las nervaduras de las hojas y coloraciones rojas de las hojas, entre otros efectos (Asad et al., 2022) (Fig. 1). Existen nutrientes que son necesarios para las plantas, que se pueden dividir en micronutrientes y en macronutrientes. Los primeros son necesarios en pequeñas cantidades e incluyen el Fe, Mn, Zn, Cl, y Cu, entre otros. En cambio, los macronutrientes son elementos que se necesitan en cantidades relativamente grandes. Entre ellos se incluyen el N, K, S, Ca, Mg y P. La carencia o exceso de estos Figura 1. Representación de la deficiencia de algunos macro y micronutrientes esenciales para las plantas. Los síntomas de falta de nutrientes en las plantas se observan en forma de un desarrollo lento y una pérdida de coloración o cambios fisiológicos. (Elaboración propia). Introducción 9 nutrientes provoca daños a las plantas, por lo que es importante estudiar la falta de micronutrientes y macronutrientes en suelos agrícolas y estuarinos (Shrivastav et al., 2020). En la mayoría de los cultivos, las necesidades de las plantas son superiores a las reservas existentes en forma asimilable de los elementos nutricionales en el suelo. En la Fig. 2 se pueden observar los nutrientes que han de estar en forma asimilable para el correcto desarrollo y crecimiento de las plantas. El nitrógeno y el fósforo son los nutrientes más limitantes en muchos de los ecosistemas (Feller et al., 2002; Feller et al., 2003; Lovelock et al., 2007; Reef et al., 2010). Los manglares marinos tienden a tener una limitación de nitrógeno, en cambio, los Figura 2. Representación esquemática de los micro y macro nutrientes presentes en el suelo importantes para el desarrollo de las plantas. (Elaboración propia). Noris. J. Flores-Duarte 10 manglares estuarinos tienden a tener una limitación de fósforo con una posible colimación de ambos nutrientes en la zona de transición (Feller et al., 2002; Feller et al., 2003). Todo esto coincide con Vitousek (1984), que define los ecosistemas tropicales terrestres como áreas principalmente limitadas por fósforo. Por otro lado, los ecosistemas marinos están principalmente limitados por nitrógeno (Howarth y Marino, 2006). 2. Los ríos Tintos, Odiel y Piedras 2.1 Demarcación Hidrográfica En el Real Decreto 357/2009 en su artículo 3, se determina la Demarcación Hidrográfica de los estuarios de los ríos Tinto, Odiel y Piedras en Andalucía (España). Estas marismas comprenden el territorio de las cuencas hidrográficas de los ríos Tinto, Odiel y Piedras y las intercuencas con vertidos directos al océano Atlántico en el extremo occidental de Andalucía (Fig. 3) (Junta de Andalucía, 2012). En esta demarcación hidrográfica, las aguas costeras comprendidas en los tres ríos abarcan geográficamente unos 4729 km2 en la provincia de Huelva (España) y una pequeña parte pertenecen a los municipios sevillanos de El Madroño y El Castillo de las Guardas, con solo 94 km2 de extensión (BOJA, 2009). Figura 3. Representación del ámbito territorial de la demarcación hidrográfica de los Ríos Tinto, Odiel y Piedras (Modificado de Junta de Andalucía, 2012b). Introducción 11 2.2 Importancia de los estuarios de los ríos Tinto, Odiel y Piedras Los estuarios de los ríos Tinto, Odiel y Piedras son parajes naturales con gran importancia ecológica, económica, histórica y cultural, por la diversidad que presentan en su flora y fauna silvestre y por brindar refugio a especies migratorias. En el año 1989, el estuario del río Piedras fue declarado Paraje Natural (BOJA, 1989). En 1983, el estuario del río Odiel fue declarado Reserva de la Biosfera y, en 1984, fue declarado Paraje Natural de Interés Nacional (BOE, 1984). A pesar de la gran importancia ecológica que presentan estas marismas, se han visto expuestas a un sinfín de problemas ambientales, como la contaminación por metales pesados. Este tipo de contaminación ha afectado a todos los suelos agrícolas y estuarinos que se encuentran en la zona sur de España, dejando como resultado suelos menos fértiles. 2.3 Problemáticas de las marismas del río Piedras y Odiel Se han realizado estudios sobre la importancia y la problemática que enfrentan los estuarios de los ríos Tinto, Odiel y Piedras (Mesa et al., 2015a; Navarro-Torre et al., 2017). En trabajos previos realizados sobre las marismas del río Piedras en Huelva, España (Fig. 4) se ha comprobado que sus suelos están compuestos por un 66% de arena, con niveles muy bajos de nutrientes como el hierro (12,669 mg·kg-1), el zinc (71 mg·kg-1) y Figura 4. Paraje Natural Marismas del Río Piedras y Flecha del Rompido. (A-B) Sendero señalizado de las Marismas del río Piedras, (C) dunas del río Piedras, con una particular formación de arena y (D) vista panorámica del sendero del río Piedras (Fotografías de Juanma Brioso; Junta de Andalucía, 2012a). A B C D Noris. J. Flores-Duarte 12 el nitrógeno (0,23%) caracterizándolo como un sustrato pobre en nutrientes (Garrido Valero, 1993; FAO, 2015; Paredes-Páliz et al., 2016). Por otro lado, las marismas de los estuarios de los ríos son particularmente sensibles a la contaminación por metales pesados por deposición de estos. Un ejemplo de este tipo de contaminación son los niveles de metales pesados presentes en los estuarios de los ríos Tinto y Odiel (Fig. 5 y Fig. 6), zona conocida como una de las regiones más contaminadas del mundo (Hudson-Edwards et al., 1999). Se han registrado en la última década niveles de elementos tóxicos de hasta 565,9 ppm de As, 1200,3 ppm de Cu, 275 ppm de Pb o 2425,7 ppm de Zn en las marismas del río Odiel, y de 2 a 3 veces estos niveles en las marismas del río Tinto (Mesa et al., 2015a; Navarro-Torre et al., 2017). Estos niveles superan los permitidos por la legislación autonómica y estatal en parques naturales, suelos Figura 5. Marismas de río Tinto, Huelva. (A) Marisma de río Tinto (Foto: Junta de Andalucía), (B) mina Corta Atalaya, el mayor yacimiento minero y el más antiguo de Europa, ubicado en el municipio de Minas de Río Tinto, (C) mina Peña de Hierro, minas de Riotinto y (D) mina arcoíris, Peña de Hierro, considerado uno de los parajes más bellos de la zona y a su vez un paisaje protegido (Fotos B-D: Tripadvisor). A B D C Introducción 13 agrícolas e industriales, para los que se han establecido límites de 100 ppm de As, 500 ppm de Cu y 1000 ppm de Pb y Zn (Junta de Andalucía, 1999). Influye en esta contaminación la explotación minera y las aguas ácidas que drenan en los ríos, que por éstos llegan a los estuarios (Nelson y Lamothe, 1993; Leblanc et al., 2000; Galán et al., 2003; Sainz y Ruiz, 2006). A todo esto se suma la Faja Pirítica Ibérica, que es la zona con el mayor número de depósitos de sulfuros metálicos de la tierra, y que forma una faja de 250 km de largo y alrededor de 50 km de ancho, y se extiende desde Sevilla en España, hasta la zona de Alcácer do Sal en Portugal (Fernández-Caliani et al., 1997; Nieto et al., 2007). Estos sulfuros, en su mayoría sulfuro ferroso o pirita, se separan en el agua por la acción del oxígeno atmosférico y la capacidad metabólica de los microorganismos presentes. Como consecuencia de esto, se genera ácido sulfúrico que provoca acidez en las aguas y, por otro lado, el ión ferroso original de la pirita (Fe2+) se oxida a su forma férrica (Fe3+) que a pH ácido torna a color rojo. A su vez, se liberan una gran variedad de metales pesados en forma de cationes en el agua, entre los que se pueden incluir As, Cd, Co, Cu, Ni, Pb, Zn y Ti, entre otros. Estos efectos son especialmente notables en el río Tinto, cuyas inmediaciones y desembocadura poseen elevadas concentraciones de estos metales, dándole su color rojo característico (Fig. 5) (FernándezRemolar et al., 2005; Amils et al., 2007). Por otra parte, el río Odiel (Fig. 6) está catalogado como uno de los más contaminados del mundo por la alta concentración de metales, en su mayoría As, Cu, Pb y Zn, que se encuentran presentes en sus sedimentos (Nelson y Lamothe, 1993; Sáinz et al., 2004; Mesa et al., 2015a). Las aguas del río Odiel soportan todos los tóxicos que ha dejado la actividad minera y la industrialización, con más de 427 de los 1149 km de la cuenca contaminados. Estos residuos se drenan en las aguas hasta convertir a los ríos en ácidos, dejando como resultado la afectación de la flora y la fauna (Davis et al., 2000; Leblanc et al., 2000; Nelson y Lamothe, 1993). Para todos estos problemas se deben buscar alternativas que sean respetuosas con el medio ambiente y que tengan la capacidad de frenar los daños ocasionados a este. Noris. J. Flores-Duarte 20 plantas (Raza et al., 2019; Fasusi et al., 2021). Tanto las bacterias rizosféricas como las endófitas pueden presentar propiedades que promueven el crecimiento de la planta (PGP), mediante mecanismos directos e indirectos (Fig. 10). 4.1.1 Mecanismos directos: se encargan de facilitar la adquisición de nutrientes: Este mecanismo es muy importante en suelos agrícolas o estuarinos con deficiencia nutricional entre ellos se encuentran: (i) La fijación de nitrógeno atmosférico: el factor más limitante para las plantas es el nitrógeno. Este es necesario para todos los organismos, que lo utilizan en la síntesis de proteínas y ácidos nucleicos. El nitrógeno atmosférico (N2) no es asimilable para la mayoría de los seres vivos. A pesar de ello, existen algunas bacterias (llamadas diazotrofas) que fijan nitrógeno atmosférico. Dentro de este grupo de bacterias se encuentran los rizobios, un grupo de αproteobacteria que pueden formar nódulos en la raíz y fijar nitrógeno en simbiosis con leguminosas como sus plantas hospedantes que incluye varios géneros, entre ellos Bradyrhizobium, Ensifer, Mesorhizobium, Rhizobium y Sinorhizobium (Lindström y Mousavi, 2020). También β-proteobacterias como Burkholderia y Ralstonia (Lindström and Mousavi, 2020; Op den Camp et al., 2011). Existen algunas bacterias fijadoras de nitrógeno en simbiosis con plantas no leguminosas entre los géneros Frankia y las cianobacterias Nostoc y Anabaena (Op den Camp et al., 2011). Otras bacterias fijadoras en vida entre ellas anaerobias estrictas, como Clostridium, y facultativas, como Klebsiela, aunque también se encuentran bacterias aerobias como Azotobacter, Beijerinckia y Azospirilum, arqueobacterias entre ellas Methanosarcinay Methanococcus, bacterias fotosintéticas como Rhodospirillum y Chromatium y cianobacterias como Nostoc y Anabaena (Mortenson y Thorneley, 1979; Op den Camp et al., 2011; Inomura et al., 2017; Lindström y Mousavi, 2020). Los rizobios entran en las células de la raíz de la planta y forman nódulos, y dentro de estos nódulos se produce la fijación de nitrógeno (Udvardi y Poole, 2013). Estas bacterias captan el nitrógeno atmosférico y lo transforman en amoniaco (NH3 o en iones de amonio NH4+), en nitratos (NO3-) o en nitritos (NO2-). Todas estas formas son biodisponibles en el suelo y asimilables para las plantas (Olivares et al., 2013; Roy et al., 2020). La fijación biológica de nitrógeno se realiza gracias a la enzima nitrogenasa, y una gran variedad de microorganismos presentan genes de la nitrogenasa (nifKDH) (Zehr et al., 2003). (ii) Movilización/solubilización de fosfato: la disponibilidad de P en el suelo es un factor limitante para el crecimiento y desarrollo de las plantas (Timofeeva et al., 2022). Las bacterias podrían proporcionar fósforo a través de la solubilización de fosfato mediante la secreción de fitasas, fosfatasas y ácidos orgánicos en el suelo (Alori et al., 2017), aumentando la disponibilidad de iones fosfatos en el suelo y facilitando su captación por las plantas (Mei et al., 2021; Zhang et al., 2022). En las leguminosas, el fósforo ayuda en el proceso Introducción 21 de nodulación, síntesis de aminoácidos y proteínas (Wang et al., 2020; Etesami et al., 2021). (iii) Producción de sideróforos: el hierro es uno de los elementos más importantes y esenciales para las plantas y uno de los más abundantes en el suelo, pero no todo el hierro se encuentra de forma biodisponible para las plantas. La solubilidad del hierro es baja en condiciones aeróbicas, dado que este predomina en forma de ion ferroso (Fe3+), y en esta forma el hierro es insoluble (Kramer et al., 2020). Las bacterias, en condiciones limitantes de hierro, producen compuestos quelantes de alta afinidad con el hierro llamados sideróforos, que mejoran las condiciones de captación de hierro por las plantas (Flores-Felix et al., 2015). La producción de sideróforos también está relacionada con el control biológico, debido a la competencia por Fe con fitopatógenos (Babalola, 2010). (iv) Síntesis y producción de fitohormonas: son hormonas vegetales relacionadas con el ciclo celular, el crecimiento y desarrollo de plantas y la elongación de raíces. Entre ellas podemos incluir etileno, citoquininas, giberelinas, ácido abscísico y auxinas (principalmente ácido indol-3-acético, AIA) (Davière y Achard, 2013; Raza et al., 2019). • Las auxinas actúan estimulando la elongación de las raíces y la formación de pelos radiculares y raíces laterales y, en consecuencia, mejorando la adquisición de nutrientes (Turan et al., 2016). Además, el AIA también se encuentra involucrado en la formación del nódulo, porque interviene en la relación entre rizobios y leguminosas. La funcionalidad del nódulo se prolonga al retrasar la senescencia del nódulo (Alemneh et al., 2020). • Etileno. El nivel de estrés en las plantas también puede ser modulado por el etileno. Las plantas tienen la capacidad de sintetizar 1aminociclopropano-1-carboxilato (ACC), un precursor del etileno (Glick, 2012; Navarro-Torre et al., 2020). Existen bacterias que presentan la enzima ACC desaminasa, capaz de romper el precursor del etileno ACC, alterando la percepción del estrés de la planta (Penrose y Glick, 2003; Chandwani y Amaresan, 2022). Además, la ACC desaminasa es una enzima involucrada en la nodulación de leguminosas mediante la inducción y la función de nódulos en condiciones normales y frente a distintos estreses (Alemneh et al., 2020). 4.1.2. Mecanismos indirectos: mediante la producción de biopelículas, antibióticos, enzimas líticas o mediante la estimulación de la respuesta sistémica de las plantas (García-Fraile et al., 2015). (i) Producción de biopelículas (biofilms): las biopelículas las forman un conjunto de células microbianas que se adhieren a superficies, y se encuentran en un íntimo contacto entre sí, encapsuladas en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares que ellas mismas producen para protegerse contra Noris. J. Flores-Duarte 22 patógenos (Beauregard et al., 2013). Tienen la capacidad de comunicarse químicamente entre sí a través de la detección de quorum, que funciona como una sola unidad. En la rizosfera, las bacterias que forman estas biopelículas se adhieren mejor a la raíz de las plantas y, a la vez, mantienen una mejor comunicación intercelular. Esto facilita a la planta la absorción de nutrientes, la adaptación a estreses bióticos y abióticos y la defensa contra patógenos (Seneviratne et al., 2010), además de la inmovilización de elementos tóxicos como los metales pesados (Das et al., 2012). (ii) Competición y defensa contra patógenos: las bacterias con propiedades estimulantes del desarrollo de las plantas se encuentran en mayor cantidad que las bacterias patógenas, proporcionando los nutrientes necesarios para la planta y empleando mecanismos de defensa contra patógenos, mediante la presencia de enzimas como las quitinasas, lipasas o glucanasas (Arora et al., 2008; Kumar et al., 2010; Wang y Dai, 2010; Glick, 2012). Introducción 23 Los microorganismos juegan un papel muy importante en la desintoxicación de contaminantes y la resistencia al estrés de las plantas por metales pesados (Barra Caracciolo y Terenzi, 2021). Estos microorganismos han desarrollado diferentes mecanismos de defensa y resistencia para proteger a las plantas. 4.2 Mecanismos de tolerancia a metales pesados Es importante conocer los mecanismos moleculares de defensas que presentan las plantas frente a los metales pesados. Existen plantas hiperacumuladoras de iones metálicos que en pequeñas dosis presentan toxicidad para todos los organismos. Estas ventajas que presentan algunas plantas se pueden aprovechar para regenerar y limpiar Figura. 10. Mecanismos directos e indirectos para la recuperación de los suelos degradados mediante la promoción del crecimiento de la planta (PGP), que presentan tanto bacterias rizosféricas como endófitas. (Adaptada de Innoplant, 2021). Noris. J. Flores-Duarte 24 suelos contaminados con metales pesados. El papel de las plantas en la absorción de metales es muy importante, al igual que la de los microorganismos. Las plantas presentan mecanismos moleculares en defensa de los metales y son capaces de acumular metales en sus raíces o en la parte aérea (Fig. 11). Los mecanismos involucrados en la acumulación de metales de transición en plantas (Clemens et al., 2002) (Fig. 11): Movilización en el suelo, absorción y secuestro de los metales, transporte de metales en el xilema, carga y distribución en los tejidos de la planta y, por último, el tráfico y secuestro intercelular. • Movilización en el suelo: en este proceso de acumulación, los iones metálicos se movilizan por secreción de compuestos quelantes y a la vez que acidifican la rizosfera. • Absorción y secuestro: la capacidad de los compuestos de quelatos metálicos está regulada por sistemas de captación de metales que se encuentran ubicados en la membrana plasmática. Estos metales son quelados cuando se encuentran dentro de las células y al presentar una acumulación o exceso, son secuestrados mediante el transporte a la vacuola. • Transporte en el xilema: los metales que han cambiado a quelatos desde las raíces son transportados a la parte aérea a través del xilema. Los restos de mayor tamaño llegan al xilema a través del simplasto de la raíz. El transporte apoplásico puede darse en la punta de a raíz. Los metales se encuentran como complejos de quelatos metálicos, dentro del xilema. • Carga y distribución en los tejidos: una vez que los metales llegan al apoplasto de la hoja, son capturados por distintos tipos de células de la hoja y se transportan de una célula a otra a través de los plasmodesmos. Es probable que el almacenamiento de los metales ocurra en los tricomas. • Tráfico y secuestro intercelular: en las células de las hojas se desencadena la absorción, este proceso que se desarrolla en las células de las hojas es catalizada nuevamente por distintos transportadores. Las metalochaperonas y los transportadores específicos que se encuentran en la endomembrana, son las encargadas de la distribución intracelular de metales de transición esenciales. La afinidad y la concentración de las moléculas quelantes al igual que la selectividad y presencia de los mecanismos de transporte, dañan a las tasas de acumulación de metales en todos los niveles (Clemens et al., 2002). Introducción 25 Aunque las plantas son capaces de acumular grandes cantidades de metales, los microorganismos (bacterias y hongos) que colonizan raíces, ayudan de una u otra forma en la disponibilidad de metales pesados para que la planta pueda absorber mejor los metales. Figura. 11. Mecanismos moleculares de las plantas para la acumulación de metales pesados. (a) Movilización de los metales en el suelo, (b) absorción y secuestro de los metales, (c) transporte de metales al xilema, (d) distribución y carga de metales en los tejidos y (e) tráfico y secuestro intercelular. M: Metálico, círculos de colores: quelantes, óvalos rellenos: transportadores, estructuras en forma de alubia: metalo-chaperones, PC: pared celular. (Adaptado de Clemens et al., 2002). Noris. J. Flores-Duarte 26 Con todo esto, los microorganismos modifican la rizosfera para lograr una mejor acumulación de compuestos metálicos y también ayudan a la absorción de nutrientes esenciales para la planta. (Whiting et al., 2001; Clemens et al., 2002). Los microorganismos presentan numerosas respuestas a los iones metálicos en las que se incluyen la biosorción de metales en los que utilizan microorganismos o subproductos agrícolas e industriales como biosorbentes (Iram et al., 2015), la bioacumulación, la modificación del estado químico de los metales (metilación) o la producción de compuestos quelantes, en particular sideróforos y biosurfactantes, que provocan una disminución de la disponibilidad y el contenido de metales en las plantas (Verma y Kuila, 2019; Barra Caracciolo y Terenzi, 2021) (Fig. 12). Para llevar a cabo una mejor respuesta a los iones metálicos por parte de los microorganismos es importante aislar, seleccionar e identificar microorganismos como bacterias y hongos de ecosistemas contaminados por metales pesados, para poder utilizarlos como inoculantes para la recuperación de los suelos. Con todo esto se evitaría la translocación de los metales pesados a la parte aérea, que en el consumo animal y humano pueden ser perjudiciales en la salud (Saeed et al., 2021). 5. Las plantas leguminosas: Medicago sativa y su utilidad en regeneración de suelos. Los problemas medioambientales mencionados anteriormente han llevado a la búsqueda de soluciones ecológicas y económicas, y una de ellas sería la implementación Figura 12. Mecanismos fisiológicos y bioquímico que presentan los microorganismos para tolerar metales pesados en los suelos, dentro de ellos se puede incluir la biosorción, la biotransformación, bioacumulación y la biomineralización de los metales por parte de los microorganismos. (Elaboración propia). Introducción 27 de cultivos respetuosos con el medio ambiente que puedan regenerar los suelos y mejorar su rendimiento. Es aconsejable que en estos cultivos se incluyan las plantas leguminosas (pertenecientes a la familia Fabaceae), debido a los grandes beneficios que presentan. En primer lugar, estas plantas son un producto muy importante en la industria alimentaria para el consumo humano y animal a nivel mundial. El mayor consumo se da en los países subdesarrollados, ya que es un alimento muy rico en proteína, fibra, vitaminas, minerales y tiene un bajo costo (Tharanathan y Mahadevamma, 2003; Stagnari et al., 2017; Ferreira et al., 2021). En segundo lugar, las leguminosas juegan un papel muy importante en la agricultura, controlando la erosión, mejorando la fertilidad del suelo, aumentando el rendimiento de los cultivos, ayudando al movimiento constante de los nutrientes y liberando materia orgánica en el suelo (Stagnari et al., 2017; Ferreira et al., 2021). La Unión Europea, con la nueva Política Agracia Común, propone implementar el uso de cultivos verdes y se incluye en esta política el cultivo de leguminosas para la rotación de los cultivos (como cultivos de cobertura) con el objetivo de mantener superficies de interés ecológico (BOE, 2022). Los cultivos de cobertura presentan efectos que favorecen a los ecosistemas en la reducción de la erosión del suelo, el aumento de la infiltración de agua y el mantenimiento de la humedad (Kocira et al., 2020). En 2013, la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO), declaró el 10 de febrero como día internacional de las legumbres (FAO, 2016; FAO, 2021), y el 2016 como el año internacional de las legumbres, todo esto por su importancia alimentaria y su papel en las mejoras del medio ambiente (FAO, 2013). En tercer lugar, las leguminosas pueden adaptarse a suelos degradados afectados por factores bióticos y abióticos, jugando un papel importante en la regeneración de suelos degradados por metales pesados debido a su capacidad de acumular metales en las raíces sin afectar el crecimiento y desarrollo de las plantas (Pajuelo et al., 2007). Por último, las leguminosas son capaces de aportar nitrógeno al suelo que puede ser utilizado por otras plantas. Una gran parte de las necesidades de nitrógeno de los cultivos se genera a través de la simbiosis que forman las leguminosas con los rizobios. Los rizobios comprenden un gran número de géneros de bacterias (α y β-proteobacterias) que incluye, entre otros, los géneros Bradyrhizobium, Ensifer, Mesorhizobium, Rhizobium y Sinorhizobium (Lindström y Mousavi, 2019; Hassen et al., 2020). En la simbiosis rizobio-leguminosa, las plantas ofrecen tanto un nicho como una fuente de carbono a las bacterias y proporcionan NH4+ por su capacidad de reducir el N2 atmosférico dentro de los nódulos (Markmann y Parniske, 2009). Por esta razón, las leguminosas se utilizan tradicionalmente como planta de transición en cultivos intercalados para recuperar la calidad del suelo después de cada cultivo (Raza et al., 2020; Matamoros y Becana, 2021). Cabe destacar que la efectividad de la fijación, al igual que la nodulación, puede verse afectada por los estreses abióticos (Sharma et al., 2020; Alemneh et al., 2020), que también condicionan las poblaciones de rizobios presentes en los suelos (Alemneh et al., 2020). 5.1 Rizobios Noris. J. Flores-Duarte 28 Los rizobios son bacterias Gram negativas que pertenecen al grupo de las α y βproteobacterias y al orden Rhizobiales (Lindström y Mousavi, 2019; Hassen et al., 2020). Estas bacterias ingresan en las raíces de las leguminosas a través de los pelos radiculares, formando los nódulos. Los rizobios colonizan el citoplasma del nódulo y se forman los bacteroides, que utilizan la enzima nitrogenasa para llevar a cabo la fijación biológica de nitrógeno (Poole et al., 2018). El proceso de fijación tiene lugar tras un intercambio de señales moleculares entre las plantas leguminosas y los rizobios (Ibáñez et al., 2017). Las raíces de las plantas secretan sustancias que atraen a los rizobios como son los flavonoides (Peters y Verma 1990; Clúa et al., 2018). Cuando los rizobios perciben estas sustancias producen factores de nodulación, los llamados factores Nod (Lerouge et al., 1990; Spaink et al., 1991; Hassan and Mathesius, 2012; Wang et al., 2012). Los nódulos formados por los rizobios presentan un pigmento de color rosado-rojo por la presencia de una proteína perteneciente al grupo hemo, llamada leghemoglobina. Esta proteína contiene hierro y se encarga del transporte de oxígeno para que los bacteroides puedan realizar la respiración celular evitando que la enzima nitrogenasa entre en contacto con el oxígeno, ya que es sensible al oxígeno. De esta forma, la leghemoglobina proporciona un mejor funcionamiento de la enzima nitrogenasa en el proceso de la fijación del nitrógeno (Wagner, 2011). Sin embargo, durante la senescencia de los nódulos, se forma un color verde en los nódulos, esto podría estar relacionado con las ROS (Navascués et al., 2012). Estas proteínas están involucradas en la tolerancia a estreses entre ellos el estrés hídrico, por metales, sequía, entre otros. También regulan el exceso de H2O2 que es una ROS (Navascués et al., 2012) y el óxido nitrico, ya que es una molécula altamente reactiva, capaz de provocar daño a las células (Farnese et al., 2016), las leghemoglobinas también tienen importancia en la señalización de procesos biológicos en niveles bajos (Navascués et al., 2012). La relación simbiótica entre los rizobios y las leguminosas presentan una serie de fases en las que se desarrollan los nódulos por las vías dependientes de los factores Nod. (D’Haeze y Holsters 2002; Clúa et al., 2018). Dentro de cada una de estas fases simbióticas intervienen diferentes moléculas sintetizadas por el microsimbionte (Gage, 2004; Ibáñez et al., 2017; Clúa et al., 2018) (Fig. 13): (i) Especificidad: En esta primera fase se da la interacción a nivel molecular, las raíces de las plantas secretan los flavonoides los cuales atraen a los rizobios. Los rizobios son rodeados por los pelos radiculares de las raíces, estos se curvan para poder atrapar a los rizobios. Los flavonoides provocan la deformación de los pelos radiculares y es aquí en donde se forma el primordio nodular. En este proceso también las lectinas actúan como receptores de superficie de células vegetales. (ii) Infectividad: Las bacterias en esta etapa penetran el tejido radical de las leguminosas. Es aquí donde se forma por completo el canal de infección. (iii) Efectividad: Por último, los rizobios viajan por el canal de infección y se transforman en bacteroides al ser liberados en el primordio nodular, realizando su ciclo de desarrollo y dando como resultado la formación de un nódulo funcional, en el que se realiza la fijación biológica de nitrógeno. Introducción 29 Los nódulos formados después de estas etapas pueden ser determinados o indeterminados, dependiendo de cada especie de planta leguminosa. (Ibáñez et al., 2017). Sin embargo, los rizobios no se encuentran solos dentro del nódulo, están acompañados de otras bacterias que son llamadas endófitos del nódulo o endófitos no rizobios, aunque sí se ha demostrado que son las únicas en formar los nódulos (Rajendran et al., 2012; Velázquez et al., 2013; De Meyer et al., 2015; Leite et al., 2017; Martínez-Hidalgo y Hirsch, 2017). Los endófitos ejercen funciones importantes implicadas en el desarrollo, el crecimiento y en el aumento del número de nódulos, entre otras funciones (White et al., 2019). 5.2 Rizobacterias y endófitos no rizobios En la adaptación de las plantas a los estreses bióticos y abióticos juegan un papel relevante las bacterias asociadas a ellas (Fig. 14), que pueden ayudar a lidiar con los contaminantes, como los metales pesados, o a mejorar el crecimiento y el desarrollo de la planta en suelos con deficiencia de nutrientes. Entre otros factores, cabe destacar que diversos estudios demuestran que la biodisponibilidad de los metales está influenciada por los metabolitos excretados por las bacterias (Tak et al., 2013; Langella et al., 2014). Aunque existe una gran concentración de microorganismos en las distintas partes de la planta, la mayor concentración se observa alrededor de las raíces, debido a los exudados que excretan las plantas que son utilizadas por las bacterias como fuente de nutrientes (Fig. 14 A-B) (Babalola, 2010; Navarro-Torre et al., 2020). Estas bacterias colonizan la raíz de la planta y muchos de ellos contribuyen a ayudar a la planta a tolerar el estrés abiótico (Yang et al., 2009). En los suelos contaminados estas bacterias tienen un papel crucial en ayudar a la planta contra el estrés producido por los metales pesados (Gamalero et al., 2009). Las bacterias rizosféricas conocidas como rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) poseen propiedades que ayudan al desarrollo de las plantas. Entre las PGPR, hay un grupo que, además de su actividad promotora del crecimiento de las plantas, mejora la relación simbiótica entre las leguminosas y los rizobios. Estas bacterias se conocen como Figura 13. Representación esquemática de una simbiosis rizobio-leguminosa efectiva de las etapas del proceso de infección y desarrollo del nódulo mediante la vía dependiente de factores Nod. (Adaptada de Oldroyd, 2013). Noris. J. Flores-Duarte 36 Objetivos 37 Esta Tesis Doctoral tiene como objetivo principal utilizar la interacción entre las leguminosas y sus bacterias asociadas como una herramienta sostenible para la recuperación de estuarios andaluces con bajo contenido en nutrientes, estrés por salinidad y/o contaminación por metales pesados. Para lograr este propósito, se plantean los siguientes objetivos específicos: ▪ Aislar y caracterizar bacterias de la rizosfera de plantas de Medicago spp. que crecen en el estuario del río Piedras en suelos con bajo contenido en nutrientes, seleccionar las mejores en base a las propiedades promotoras del crecimiento vegetal (PGP) y determinar su capacidad para mejorar la adaptación y el crecimiento de plantas de Medicago sativa en suelos pobres en nutrientes. ▪ Determinar la habilidad de dos cepas tipo pertenecientes al género Variovorax (V. paradoxus S110T y V. gossypii JM-310T) que se comportan como endófitos de raíces y presentan propiedades PGP, actividades enzimáticas y tolerancia a metales, para mejorar el crecimiento y la nodulación de plantas de M. sativa en suelos contaminados con metales pesados. ▪ Aislar y caracterizar bacterias endófitas autóctonas a partir de nódulos de plantas de Medicago spp. crecidas en las marismas altas del río Odiel, seleccionar las mejores en base a las propiedades PGP, las actividades enzimáticas y la tolerancia a metales pesados, y evaluar su efecto en la mejora en el desarrollo de plantas de M. sativa en suelos contaminados con metales pesados y/o afectados por la salinidad. Noris. J. Flores-Duarte 38 IV. Resultados Vaina de alubia/poroto/fríjol después de ser polinizada: Fundación Biodiversidad Alimentaria Resultados 39 Noris. J. Flores-Duarte 40 Resultados 41 Noris. J. Flores-Duarte 42 Resultados 43 Noris. J. Flores-Duarte 44 Resultados 45 Noris. J. Flores-Duarte 52 Resultados 53 Noris. J. Flores-Duarte 54 Resultados 55 Noris. J. Flores-Duarte 56 Resultados 57 Noris. J. Flores-Duarte 58 Resultados 59 Noris. J. Flores-Duarte 60 Resultados 61 Noris. J. Flores-Duarte 68 Resultados 69 Noris. J. Flores-Duarte 70 Resultados 71 Noris. J. Flores-Duarte 72 Resultados 73 Noris. J. Flores-Duarte 74 Resultados 75 Noris. J. Flores-Duarte 76 Resultados 77 Noris. J. Flores-Duarte 84 Resultados 85 Noris. J. Flores-Duarte 86 Resultados 87 Noris. J. Flores-Duarte 88 Resultados 89 Noris. J. Flores-Duarte 90 Resultados 91 Noris. J. Flores-Duarte 92 Resultados 93 Noris. J. Flores-Duarte 100 Resultados 101 Noris. J. Flores-Duarte 102 Resultados 103 Noris. J. Flores-Duarte 104 Resultados 105 Noris. J. Flores-Duarte 106 V. Discusión Alubias/porotos/fríjoles de diversos colores: Fundación Biodiversidad Alimentaria Discusión 107 Noris. J. Flores-Duarte 108 1. Problemática medioambiental Como se ha comentado en la introducción, las actividades naturales y humanas han causado efectos negativos en los suelos, dando lugar a suelos degradados que se caracterizan por una escasa fertilidad y un aumento de los estreses abióticos, como la escasez de nutrientes, la salinidad, el contenido de metales pesados o la sequía. La presencia de estas características en los suelos reduce notablemente la biodiversidad vegetal y crea un desequilibrio nutricional (Zhu et al., 2020b), que provoca una mayor pérdida de microorganismos autóctonos e impide el crecimiento y desarrollo de las plantas, creando un impacto ecológico negativo en los suelos afectados (Paul et al., 2014; Chodak et al., 2015). Los estuarios de los ríos Odiel y Piedras (Huelva, España) son dos grandes parajes naturales con gran importancia económica, histórico-cultural y ecológica, por la diversidad en su flora y fauna silvestre, también por dar refugio a especies migratorias. A pesar de la gran importancia ecológica que presentan estas dos marismas, se encuentran expuestas a problemas ambientales como la contaminación por metales pesados, que pueden tener origen tanto en procesos naturales como por la manipulación humana (Davis et al., 2000; Olías y Nieto, 2015), y la pérdida de los nutrientes en los suelos por diversos estreses abióticos a los que están expuestos sus suelos. El suelo rizosférico recolectado del estuario del río Piedras estuvo compuesto principalmente de arena, convirtiéndolo en un suelo ligero. Además, este suelo contenía menos del 1% de materia orgánica y una baja cantidad de nutrientes (Flores-Duarte et al 2022a). Estas características corresponden a la definición de suelos pobres en nutrientes (Garrido-Valero et al., 1993; FAO, 2015), por lo que el estuario del río Piedras podría considerarse como un suelo degradado, con niveles por debajo de los adecuados para cultivos. En cambio, los suelos de las marismas del río Odiel presentan niveles nutriciones adecuados, pero con un gran problema de contaminación por metales (entre otros, 566 ppm As, 1200 ppm Cu y 2425 ppm Zn), duplicando los niveles permitidos para sedimentos de suelos de estuarios (Junta de Andalucía, 1999), por lo que se clasifican como suelos que requieren una actuación de mejora urgente. 2. Rizobacterias y endófitos potenciadores de la nodulación Las plantas leguminosas son una excelente opción para la recuperación de estuarios contaminados y presentan una variedad de ventajas. La presencia de plantas leguminosas en los estuarios andaluces es escasa, limitándose a algunas especies arbustivas y algunas especies de Medicago spp. Por esa razón uno de los objetivos de esta Tesis Doctoral es la mejora de la adaptación, la nodulación y el desarrollo de leguminosas, utilizando M. sativa como modelo, en suelos pobres en nutrientes o contaminados por los metales y metaloides presentes en los estuarios. Estos cultivos de plantas leguminosas se pueden promover utilizando rizobacterias o endófítos autóctonos como inoculantes para mejorar el rendimiento de los suelos y aumentar la biomasa de las plantas (Monteoliva et al., 2022). Durante esta Tesis Doctoral, se aislaron rizobacterias de suelos con bajo contenido en nutrientes de las marismas del río Piedras. En la población microbiana de este suelo Discusión 109 degradado se trataba de aislar y caracterizar PGPR y NER capaces de promover el crecimiento de leguminosas crecidas en suelos con deficiencia de nutrientes. Se aislaron 71 bacterias cultivables y, debido al bajo nivel de fósforo en el suelo, se realizó un primer cribado seleccionando aquellas bacterias capaces de solubilizar fosfato, reduciendo la selección de aislamientos a 14 (Flores-Duarte et al., 2022a). Uno de los factores más limitantes para el desarrollo de las plantas es el fósforo, y las bacterias solubilizadoras de fosfato hacen que este macronutriente esté disponible para las plantas a través de la secreción de fosfatasas, fitasas, y ácidos orgánicos al suelo (Alori et al., 2017). La diversidad de bacterias asociadas a la raíz depende principalmente del entorno y su nivel de estrés (Ochoa-Hueso et al., 2018; Hartman y Tringe, 2019), mostrando un menor número de taxones de microorganismos y menos interacciones entre taxones los suelos erosionados (Araújo et al., 2014; Qiu et al., 2021). Esta baja diversidad se observó también en la rizosfera de Medicago spp. del estuario del río Piedras, siendo el género Pseudomonas la bacteria cultivable más representativa. Este resultado no es una sorpresa ya que el género Pseudomonas es ubicuo en el suelo y tiene características genéticas, ambientales y fisiológicas bien conocidas. También presenta una mayor adaptabilidad para sobrevivir en cualquier entorno (Sah y Singh, 2016). Estas bacterias de la rizosfera pertenecientes al género Pseudomonas también se han aislado de otras leguminosas como soja, cacahuete y haba (Jia et al., 2020; Wang et al., 2021). El resto de los géneros de rizobacterias aislados, como Bacillus, Chryseobacterium, Priestia y Buttiauxella se han descrito anteriormente como bacterias asociadas a leguminosas por otros autores (De Meyer et al., 2015; Zhang et al., 2021). Además de la solubilización de fosfato, se analizaron el resto de las propiedades promotoras del crecimiento vegetal (ACC desaminasa, producción de auxinas y sideróforos, fijación de nitrógeno y formación de biopelículas). Las bacterias aisladas mostraron individualmente varias propiedades PGP, y actividades líticas como pectinasa, proteasa, celulasa y quitinasa estuvieron presentes en al menos una de las cepas (FloresDuarte et al., 2022a). De todas las cepas aisladas, se seleccionaron Pseudomonas sp. L1, Chryseobacterium soli L2 y Priestia megaterium L3, que mostraron cinco de las seis propiedades PGP probadas con valores altos individualmente y todas las propiedades de PGP en conjunto, para su uso como inoculantes individuales o en consorcio en los ensayos con plantas. Aun teniendo en cuenta los beneficios conocidos de las bacterias rizosféricas, las bacterias endofíticas que habitan en el interior de nódulos de plantas leguminosas podrían tener ciertas ventajas sobre las bacterias rizosféricas, ya que la interacción es más cercana con su planta hospedadora y hay menos competencia por los nutrientes disponibles (Santoyo et al., 2016). Por ello, a partir de nódulos de plantas de Medicago spp. crecidas en el estuario del río Odiel, se aislaron y caracterizaron 33 bacterias endófitas pertenecientes a géneros previamente descritos como endófitos de nódulos: Bacillus, Achromobacter, Enterobacter, Lelliottia, Pantoea, Pseudomonas o Priestia (Aserse et al., 2013; Martínez-Hidalgo y Hirsch, 2017). Entre los NRE, Pseudomonas fue el género más representado y solo dos aislados se identificaron como rizobios inductores de nódulos del género Ensifer, el simbionte de Medicago más común y aislado con frecuencia de leguminosas silvestres que crecen en suelos áridos (Mnasri et al., 2007; León-Barrios et al., 2009; Bessadok et al., 2020). En este caso, las cepas seleccionadas fueron dos Pseudomonas (Pseudomonas sp. N4 y Pseudomonas sp. N8) y dos rizobios (Ensifer sp. N10 y Ensifer sp. N12). Noris. J. Flores-Duarte 116 VI. Conclusiones El maravilloso mundo de las leguminosas: Fundación Biodiversidad Alimentaria Conclusiones 117 Noris. J. Flores-Duarte 118 1. Los estuarios de los ríos Odiel y Piedras se han mostrado como fuentes de bacterias rizosféricas y endofíticas de nódulos de leguminosas con propiedades PGP, que podrían ser utilizadas como biofertilizantes en suelos pobres en nutrientes y/o contaminados con metales pesados. 2. Entre los endófitos autóctonos aislados de nódulos de Medicago spp. que crecen de en las marismas altas del río Odiel, se encontró una diversidad de no rizobios muy superior a la de rizobios. 3. La presencia de la actividad ACC desaminasa, la producción AIA y las actividades celulasa, pectinasa y amilasa, presentes en algunas de las cepas seleccionadas, parecen jugar un papel esencial durante la germinación de las semillas de M. sativa, destacando la actividad ACC desaminasa en aquellas semillas germinadas en presencia de arsénico y mezcla de metales pesados. 4. Las rizobacterias Pseudomonas sp. L1, Chryseobacterium soli L2 y Priestia megaterium L3, aisladas de la rizosfera de plantas de Medicago spp. que crecen en suelos con deficiencias nutricionales en las marismas del río Piedras, potencian el desarrollo de las plantas de M. sativa en estos suelos, mejorando la biomasa, la fotosíntesis y el contenido en nitrógeno, gracias a sus propiedades PGP y enzimas líticas. 5. Las plantas inoculadas con las rizobacterias seleccionadas mostraron un mayor número de nódulos, por lo que las tres cepas pueden ser consideradas como rizobacterias potenciadoras de la nodulación. 6. Los efectos beneficiosos observados en las plantas de M. sativa tras la inoculación con las bacterias rizosféricas Pseudomonas sp. L1, Chryseobacterium soli L2 y Priestia megaterium L3 sugieren que la inoculación con estas bacterias podría contribuir a la mejora del mantenimiento del balance nutricional de este estuario. 7. Tanto las cepas de colección V. paradoxus S110T, y V. gossypii JM-310T, como los endófitos autóctonos Pseudomonas sp. N4, Pseudomonas sp. N8 aislados de nódulos de plantas de Medicago spp. recolectadas en las marismas del río Odiel, se comportaron como endosimbiontes de nódulos de M. sativa, ya que se observaron dentro de los mismos mediante el marcaje con una proteína fluorescente. 8. Las plantas de M. sativa inoculadas con los endófitos de Variovorax y Pseudomonas mostraron un mayor número de nódulos, por lo que las cuatro cepas pueden ser consideradas como endófitos potenciadores de la nodulación. 9. Las cepas del género Variovorax mostraron efectos positivos en el crecimiento de plantas de M. sativa en suelos degradados por falta de nutrientes, por lo que podrían utilizarse como biofertilizantes en suelos pobres en nutrientes, para mejorar el potencial de adaptación de las plantas y la recuperación de suelos con esas características. Conclusiones 119 10. El consorcio bacteriano denominado CSV se podría utilizar de forma segura para la recuperación de estuarios contaminados con metales utilizando plantas de Medicago spp., ya que los niveles de metal en parte aérea se encontraron por debajo de los valores de referencia permitidos para la alimentación humana y animal. 11. La inoculación con endófitos de Pseudomonas sp. no solo mejoró el desarrollo de las plantas de M. sativa en condiciones de contaminación con metales pesados, sino que también promovió la acumulación en raíces de metales como As, Cd, Cu y Zn, sin translocarlos a la parte aérea, por lo que podrían utilizarse como herramientas seguras de rizoestabilización para la recuperación de estuarios contaminados. 12. Las inoculaciones con las bacterias seleccionadas mostraron un aumento en las actividades de las enzimas implicadas en la respuesta antioxidativa de las plantas, activando esta vía para la eliminación de las ROS generadas por la presencia de estrés abiótico y disminuyendo así el estrés producido en las plantas, pudiendo ser este uno de los mecanismos para promover el crecimiento de M. sativa en condiciones de estrés. Noris. J. Flores-Duarte 120 VII. Perspectivas de Futuro Maravilla de la naturaleza reflejado en las leguminosas: Fundación Biodiversidad Alimentaria Perspectivas de Futuro 121 Noris. J. Flores-Duarte 122 Los próximos experimentos podrían centrarse en la verificación in situ de estos resultados, comprobando en campo la capacidad de esta interacción plantamicroorganismos para fijar nitrógeno en plantas leguminosas utilizando consorcios bacterianos, ya que en todos los trabajos realizados en esta tesis se ha demostrado que las plantas inoculadas con consorcios bacterianos incrementan significativamente todos los resultados analizados en comparación con el resto de las inoculaciones. Otras líneas de investigación que se están desarrollando a partir de los resultados obtenidos son: ▪ Aprovechar la simbiosis entre las plantas leguminosas y los rizobios por la capacidad que presentan para adaptarse y mejorar el desarrollo de otras leguminosas de consumo humano en suelos agrícolas con baja disponibilidad de nutrientes y/o degradados por el uso de fertilizantes químicos con el fin de recuperar estos suelos. ▪ Poner a prueba estas bacterias con otro tipo de cultivos de uso para la alimentación humana y animal, por sus propiedades promotoras del crecimiento vegetal y la tolerancia a estreses abióticos. ▪ Localizar los genes implicados en las diferentes propiedades PGP en las cepas seleccionadas y delecionar esos genes para conocer los mecanismos de acción sobre la planta de cada una de las propiedades y qué propiedades están más implicadas en cada tipo de estrés. Bibliografía 123 VIII. Bibliografía Diversidad de judías/fríjoles/porotos y su raíz (Phaseolus sp.). Fundación Biodiversidad Alimentaria Noris. J. Flores-Duarte 124 Bibliografía 125 Abdu, N., Abdullahi, A. A., Abdulkadir, A. (2017). Heavy metals and soil microbes. Environ. Chem. Lett. 15, 65–84. Adeleke, B. S., y Babalola, O. O. (2021). The endosphere microbial communities, a great promise in agriculture. Int. Microbiol. 24, 1–17. Agri, U., Chaudhary, P., Sharma, A., Kukreti, B. (2022). Physiological response of maize plants and its rhizospheric microbiome under the influence of potential bioinoculants and nanochitosan. Plant Soil 474, 451–468. Alemneh, A. A., Zhou, Y., Ryder, M. H., Denton, M. D., Denton, M., Zhou, Y. (2020). Mechanisms in plant growth-promoting rhizobacteria that enhance legume-rhizobial symbioses. J. Appl. Microbiol. 129, 1133–1156. Alloway, B.J. (1995) Heavy Metals in Soils. Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall (Edit), London, 368 p. Alloway, B.J., Ayres, D.C. (1993). Chemical principles of environmental pollution. 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