Otimização dos processos de tratamento enzimático de materiais celulósicos com amílases e celulases

Universidade do Minho Escola de Engenharia Otimização dos processos de tratamento enzimático de materiais celulósicos com amilases e celulases Otimização dos processos de tratamento enzimático de materiais celulósicos com amilases e celulases dezembro, 2021 Isabel Maria Maia Alaminos Otimização dos processos de tratamento enzimático de materiais celulósicos com amílases e celulases. Dissertação de Mestrado Mestrado em Química Têxtil Trabalho efetuado sob a orientação do Professor Doutor Jorge Gomes Santos ii Despacho RT - 31 /2019 - Anexo 3 DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição CC BY https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ iii AGRADECIMENTOS Agradeço em primeiro lugar ao meu orientador, Professor Doutor Jorge Gomes Santos pelo apoio, esclarecimento, disponibilidade e paciência demonstrados durante todo o desenvolvimento da presente dissertação. Agradeço à minha família, em especial ao meu namorado e aos meus pais por todo o apoio, amor e ajuda demonstrados ao longo destes anos incertos que a pandemia nos proporcionou. Agradeço ao Eng.º Jorge Faria da empresa AQUITEX por me ter aberto as portas à família AQUITEX, disponibilizando a sua empresa, laboratório e trabalhadores para que me ajudassem na conclusão de mais uma etapa da minha vida profissional e académica. Agradeço à Eng.ª Matilde Faria pelo acompanhamento, apoio e por ter exposto o que queria melhorar na empresa, de forma que o tema escolhido para esta dissertação pudesse ajudar a AQUITEX. Agradeço a todas as técnicas do laboratório têxtil, em especial à Eng.ª Soraia Alves e Andreia Marques que estiveram sempre disponíveis para me ajudar em tudo o que eu precisei e que foram sem dúvida um grande apoio em todo este processo. Por fim, agradeço a todos os professores e técnicos que se cruzaram no meu percurso académico. iv Despacho RT - 31 /2019 - Anexo 4 DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. v OTIMIZAÇÃO DOS PROCESSOS DE TRATAMENTO ENZIMÁTICO DE MATERIAIS CELULÓSICOS COM AMÍLASES E CELULASES RESUMO A otimização dos processos de tratamento têxtil é fundamental, tendo em vista a redução dos tempos de processamento, consumo de reagentes, energia e água, melhorando dessa forma a sua sustentabilidade económica e ambiental. Para se proceder à otimização dos processos de tratamento enzimático torna-se imprescindível o desenvolvimento de métodos precisos, rápidos e de fácil implementação que permitam determinar a atividade enzimática nas mais variadas condições de processamento, situação que não se verifica na atualidade. Neste contexto, procedeu-se no âmbito do presente trabalho ao desenvolvimento de um método para a determinação da atividade enzimática das celulases e de outro para a determinação da atividade enzimática das amílases que cumprem os requisitos inicialmente definidos, criando dessa forma as condições necessárias para que se possa proceder à otimização dos processos de tratamento com estas duas enzimas. Palavras-Chave: Amílases; Atividade Enzimática; Celulases; Métodos; vi OPTIMIZATION OF ENZYMATIC TREATMENT PROCESSES OF CELLULOSIC MATERIALS WITH AMYLASES AND CELLULASES ABSTRACT The optimisation of textile treatment processes is fundamental in order to reduce processing times, reagent, energy and water consumption, thus improving their economic and environmental sustainability. To optimise enzymatic treatment processes, it is essential to develop precise, fast, and easy-toimplement methods for determining enzyme activity in a wide range of processing conditions, which is currently not the case. In this context, this work aimed at developing a method for determining the enzymatic activity of cellulases and another for determining the enzymatic activity of amylases which meet the requirements initially defined, thereby creating the necessary conditions for the optimisation of treatment processes with these two enzymes. Keywords: Amylases; Cellulases; Enzymatic Activity; Methods; Textile Industry. vii ÍNDICE AGRADECIMENTOS .................................................................................................................................... iii RESUMO…………………………………………………………………………………………………………………………. v ABSTRACT ................................................................................................................................................... vi LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .......................................................................................................... ix ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................................................................... x ÍNDICE DE TABELAS ................................................................................................................................... xi CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 1 1.1. OBJETIVO ................................................................................................................................... 1 1.2. ENQUADRAMENTO E MOTIVAÇÃO DO TRABALHO .................................................................. 1 1.3. ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO ................................................................................................. 2 CAPÍTULO 2: ESTADO DA ARTE .................................................................................................................. 3 2.1. UTILIZAÇÃO DE ENZIMAS NO PROCESSAMENTO TÊXTIL ...................................................... 3 2.2. CELULASES ................................................................................................................................ 4 2.3. AMILASES ................................................................................................................................... 5 2.4. MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA AMILASE ...................... 6 2.5. MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA CELULASE .................... 7 CAPÍTULO 3: MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................................... 11 3.1. MATERIAIS ............................................................................................................................... 11 3.2. MÉTODOS ................................................................................................................................. 12 3.2.1. TINGIMENTO DE TECIDO 100% ALGODÃO E 100% VISCOSE COM CORANTES REATIVOS ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..12 3.2.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE CORANTE NOS TECIDOS DE ALGODÃO E VISCOSE TINGIDOS ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..12 3.2.3. TRATAMENTO DOS TECIDOS DE ALGODÃO E VISCOSE COM CELULASES .......................... 13 3.2.4. ANÁLISE DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DAS CELULASES ....................................................... 15 3.2.4.1. ANÁLISE DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DAS CELULASES POR AVALIAÇÃO DA DIFERENÇA DE PESO ..….……………………………………………………………………………………………………………………………………………..15 viii 3.2.4.2. QUANTIFICAÇÃO DA ATIVIDADE DA CELULASE ATRAVÉS DA DETERMINAÇÃO DA PERCENTAGEM DE CORANTE REMOVIDA NO DECORRER DO TRATAMENTO ...................................... 15 3.2.4.3. QUANTIFICAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA CELULASE ATRAVÉS DA UTILIZAÇÃO DO KIT DA MEGAZYME ................................................................................................................................... 16 3.2.5. QUANTIFICAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA AMILASE ................................................ 17 CAPÍTULO 4: APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS .......................................................... 18 4.1.1. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE CORANTE NOS TECIDOS DE ALGODÃO E VISCOSE……………………………………………………………………………………………………………………………..………………..18 4.1.2. ANÁLISE DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DAS CELULASES POR AVALIAÇÃO DA PERCENTAGEM DE PESO PERDIDO NO TRATAMENTO ……………………………………………………….………………………. 19 4.1.3. ANÁLISE DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DAS CELULASES ATRAVÉS DA DETERMINAÇÃO DA PERCENTAGEM DE CORANTE REMOVIDO DURANTE O TRATAMENTO ……………………………………..24 4.1.4. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DAS CELULASES ATRAVÉS DA APLICAÇÃO DO KIT DA MEGAZYME – “ CELLULASE ASSAY KIT (CELLG5 METHOD)” .......................................................... 27 4.2. RESULTADOS OBTIDOS NO TRATAMENTO ENZIMÁTICO COM A AMILASE ........................ 29 4.2.1. AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DA COR DO COMPLEXO AMIDO-IODO ................................. 29 4.2.2. MODELO MATEMÁTICO QUE ESTABELECE A RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO DE AMIDO NO MATERIAL E O VALOR DE K/S DA AMOSTRA TESTADA ....................................................... 31 CAPÍTULO 5: CONCLUSÕES E PERSPETIVAS FUTURAS ......................................................................... 34 5.1. CONCLUSÕES ........................................................................................................................... 34 5.2. PERSPETIVAS FUTURAS ………………………………………………………………………………..……………..…35 BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................................ 36 ANEXOS ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..38 4 2.2. CELULASES A celulose é o componente mais abundante da parede celular das plantas tratando-se também do hidrato de carbono mais comum e uma das mais importantes fontes de carbono presentes na biosfera (Zhang YH, 2006). As celulases pertencem a um grupo de enzimas que degradam a celulose em oligossacarídeos menores e por fim em glicose. A atividade enzimática das celulases tem por base um sistema multi-componente consistindo em três tipos de celulases, entre elas as Exoglucanases/Cellobiohidrolases, Endo-β-1,4-glucanases, e β-Glucosidases/Celobiases. (Tian Shuangqi, 2011). As celulases são muito usadas na indústria têxtil no tratamento de materiais celulósicos. A sua aplicação no processamento têxtil começou na década de 1980 no acabamento de materiais Denim , de forma a obter o aspeto “ fashionable stonewash ” dando origem ao processo de Biostoning . Para além do processo Biostoning, são também utilizadas no tratamento anti-pilling , ou seja, na eliminação das fibras soltas existentes na superfície dos materiais que estão na origem da formação do pilling. As celulases são habitualmente aplicadas em máquinas que promovem uma elevada agitação mecânica, tais como jets, permitindo que a ação de hidrólise promovida pelas celulases, juntamente com a elevada ação mecânica exercida pelas máquinas contribuam para melhorar o tratamento anti-pilling (A. Cavaco-Paulo, 2003). Na indústria dos detergentes as celulases são também utilizadas na sua formulação com o objetivo de conferir maior brilho aos materiais tratados. (Polaina J., 2007). Para além da utilização nos setores têxteis e de detergentes, as celulases são também aplicadas nas indústrias alimentares (incluindo também a de alimentos para animais), e de papel. Uma elevada variedade de bactérias e fungos produzem diversos tipos de celulases das mais variadas características, tais como os fungos Trichoderma reesei que produz uma celulase que se caracteriza por proporcionar uma baixa perda de resistência das fibras e reduzido backstaining , Thielavia terrestris , cuja celulase proporciona uma aparência extremamente polida às fibras ( biopolishing ) e permite obter um tratamento anti-pilling de média intensidade e o Chrysosporium lucknowense , que se caracteriza por permitir um tratamento anti-pilling de alta intensidade e por prevenir a redeposição de corante removido ( backstaining ), entre outras (Polaina J., 2007). 5 2.3. AMÍLASES O amido é aplicado sobre os fios da teia antes do processo de tecelagem para proteger a integridade dos fios, atuando também como lubrificante. A utilização de encolantes naturais, tais como o amido e seus derivados permite que estes possam ser degradados posteriormente por enzimas. O processo de desencolagem enzimática, que consiste na remoção do amido após a tecelagem, recorre à utilização de amílases, sendo o processo enzimático mais antigo utilizado na indústria têxtil. O amido é também muito utilizado como espessante em pastas de estamparia e na produção de colas (A. Cavaco-Paulo, 2003). O amido é composto por 2 tipos de polissacarídeos, a amilose e a amilopectina. A amilose é composta por uma cadeia linear composta por moléculas de glucose ligadas entre si através de ligações α -1,4 glicosídicas, tal como acontece no dissacarídeo maltose. A maltose é um dímero, normalmente derivado da amilose através de hidrólise. A amilose é solúvel em água e constitui cerca de 20% do amido total. A amilopectina é constituída por uma cadeia ramificada de moléculas de α-D-glucose. A ramificação ocorre entre o radical glicosídico -OH de uma cadeia e o sexto carbono de outra molécula de glucose, formando uma ligação α-1,6 glicosídica. A amilopectina é insolúvel em água. A hidrolise parcial do amido origina a formação de moléculas de glucose, maltose e dextrinas, que são secções ramificadas da amilopectina, que corresponde a 70-80% do amido total (Liu, 2017). As enzimas envolvidas na degradação do amido são as α - Amílases, β - Amílases e Glucoamilases. As α – Amílases e Glucoamilases são as mais utilizadas na indústria têxtil já que degradam aleatoriamente as ligações de glucose tornando a sua ação muito mais eficaz quando comparadas às β – Amílases que apenas conseguem degradar o amido em unidades de maltose, perdendo assim o seu interesse para uso industrial (A. Cavaco-Paulo, 2003). As α - amílases são usadas no processo de desencolagem há quase 100 anos. As amílases mais utilizadas são de origem maioritariamente bacteriana, obtidas por exemplo através da bactéria Bacillus subtilis . 6 2.4. MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA AMILASE A atividade enzimática da β-amilase pode ser medida através do método de p-nitrophenylα -Dmaltopentaoside , monitorizando a libertação de p-nitrofenil. Tal como é referido por Erkkilä (1998) a atividade da β-amílase pode também ser medida através do Kit β-amílase da Megazyme que muito se assemelha ao Kit cuja utilização será avaliada nesta dissertação. Relativamente à atividade da Glucoamilase, esta pode também ser determinada pela libertação de p-nitrofenol da p-nitrofenil-α-D-glucose. No entanto, ambos os métodos citados para quantificação da atividade enzimática da amílase são de difícil aplicação na indústria têxtil, uma vez que são morosos e desenvolvidos para outras indústrias, tais como a indústria alimentar. Acresce o facto de não ser possível utilizar materiais têxteis com amido no decorrer da análise, nem tão pouco simular as condições reais em que as mesmas são aplicadas. Quanto à atividade enzimática da α – amílase, esta pode ser medida utilizando amido como substrato e monitorizando a formação de açucares reduzidos, utilizando a maltose como padrão. Técnicas mais avançadas de medição da atividade da alfa e beta amílases utilizam oligossacarídeos e monitorizam a produção de cadeias mais curtas de açucares através de métodos cromatográficos (A. Cavaco-Paulo, 2003). O método mais comum para a quantificação da atividade enzimática da α –amílase, com aplicação têxtil nos processos de desencolagem enzimática, consiste em utilizar a escala TEGEWA e uma solução de iodo/iodeto de potássio. A escala TEGEWA (Figura 1) é composta por uma gama de cores que vão desde o azul-violeta ao branco, correspondendo a cada uma delas uma determinada percentagem residual de amido no substrato testado. FIGURA 1-ESCALA TEGEWA (TAVARES, 2017) 7 Quando um tecido de algodão com amido entra em contacto com a solução de iodo/iodeto de potássio forma-se um complexo de cor azul-violeta, sendo a cor tão mais intensa quanto maior for a concentração de amido no substrato. A comparação posterior da cor obtida com as cores representadas na escala TEGEWA permite classificar o material quanto ao teor de amido residual nele presente. Este método permite detetar e quantificar a presença de amido residual no material, sendo, no entanto, essa avaliação feita de forma subjetiva, através da comparação visual entre a cor obtida e as cores representadas na escala TEGEWA. A reduzida precisão e a elevada subjetividade da análise efetuada impossibilitam a obtenção de dados fiáveis que permitam avaliar de forma precisa a atividade enzimática em diferentes condições de processamento e dessa forma contribuir com informação essencial para a otimização dos processos de desencolagem e para a avaliação do impacto dos auxiliares utilizados no rendimento do processo. Torna-se também difícil comparar o desempenho entre diversas soluções comerciais de α –amílase existentes no mercado. Este é atualmente o método mais utilizado, pretendendo-se com esta dissertação tornálo mais objetivo e preciso, fazendo com que não dependa somente da avaliação sensitiva do “olho humano”. 2.5. MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA CELULASE Existem muitos métodos descritos na literatura para determinar a atividade enzimática da celulase ainda por consolidar, devido às diversas dificuldades associadas ao processo, tais como: dificuldade em padronizar os processos de determinação da atividade enzimática, dificuldade em analisar as características finais do substrato, dificuldade em comparar os resultados no caso de diferentes origens das celulases e da celulose (T. Shuangqi, 2011), elevado tempo de realização dos ensaios e os custos inerentes. A atividade da celulase pode ser medida utilizando como substrato a celulose insolúvel na forma de filtro de papel, ou celulose microcristalina embebida em ácido fosfórico. A libertação de açucares reduzidos que se formam devido à ação exercida pelas celulases pode ser monitorizada através do Método Ácido 3,5 dinitro-salicílico (DNS) (Ghose, 1987). Este método baseia-se no facto de após a hidrólise enzimática da celulose, os açucares reduzidos resultantes, tais como a glucose, terem a capacidade de reduzir o grupo nitro do composto DNS. Isto acontece porque o DNS reage 8 apenas com açucares redutores, que por consequência vão gerar compostos, de cor avermelhada e acastanhada (T. Shuangqi, 2011). Através deste método poderemos obter uma correlação entre a quantidade de açúcar reduzido e a cor do produto obtido, podendo a análise ser realizada através de métodos espectrofotométricos (T. Shuangqi, 2011). Caso pretendamos analisar uma mistura comercial de celulases através deste método, obtém-se uma taxa de hidrólise final resultante das atividades sinergéticas das endoglucanases e das celobiohidrolases (A. Cavaco-Paulo, 2003). A atividade das endoglucanases pode ser quantificada utilizando a carboximetilcelulose (CMC) como substrato, monitorizando ou a libertação de açucares reduzidos ou a diminuição da viscosidade das soluções de CMC. Caso essas preparações comerciais não contenham endoglucanases, as soluções de CMC não mostrarão qualquer tipo de alteração (A. Cavaco-Paulo, 2003). De acordo com Zhou, et al. (2004) toda a atividade enzimática das celulases é usualmente quantificada pelo método do filtro de papel, atividade essa que inclui ações sinergéticas das endoglucanases, celobiohidrolases e B-glucosidases. A atividade das endoglucanases é normalmente quantificada juntamente com a atividade das carboximetilcelulases, sendo que tal se deve ao facto das endoglucanases serem as únicas celulases capazes de atuar dentro das cadeias de CMC, resultando numa maior atividade. T. Shuangqi (2011) propõe uma alteração ao método do filtro de papel, centrando no seu colapso o foco do estudo. Assim, o método consiste em utilizar um filtro de papel como substrato e adicionar-lhe uma solução de celulases pré-incubada a 50°C, durante 30 min, a pH 5, medindo de seguida o tempo de colapso do filtro de papel. O colapso do filtro de papel ocorre quando já não há quaisquer fragmentos do mesmo presentes no meio reacional, sendo que após o “colapso” a mistura da reação é filtrada novamente com um filtro de papel e os açucares reduzidos são medidos através do método DNS anteriormente descrito. Assim, são avaliados o tempo de atuação das enzimas (o tempo que demora a “colapsar” o filtro de papel) e a quantidade de açucares reduzidos formados no final da reação, conseguindo-se assim comparar a sua eficácia e a respetiva atividade enzimática. Um outro método utilizado na determinação da atividade enzimática das celulases é o método espectrofotométrico proposto por T. Shuangqi (2011), segundo o qual, no seguimento de uma reação entre produtos de uma reação enzimática e agentes cromogénicos, é possível a partir da medição da absorvância da solução determinar a atividade enzimática. Este método permite 9 reduzir significativamente o tempo consumido na determinação da atividade enzimática das celulases e tem uma elevada exatidão, sendo por isso um dos métodos mais utilizados neste contexto. Relativamente ainda ao método espectrofotométrico referido no parágrafo anterior, Coleman (2007) demonstrou que utilizando o substrato resorufin-b-D-cellobioside (Res-CB), quando este é hidrolisado pelas celulases é formado o composto Resorufin (fluoróforo vermelho fluorescente), como produto da reação que emite radiação ao comprimento de onda de 585nm, que pode ser quantificada espectrofotometricamente. O autor comparou este método com diversos outros métodos que utilizam substratos cromogénicos e concluiu que, ao contrário deste, os mesmos não permitiam a contínua quantificação da atividade enzimática, tornando por isso este método mais vantajoso, mas algo complexo de implementar à escala industrial. Como último exemplo de um método a ter em consideração para a determinação da atividade enzimática da celulase, T. Shuangqi (2011), refere que se usarmos p-Nitrophenol-D-cellobioside (PNPC) como substrato, e a formação de nitrobenzeno como escala, conseguir-se-á avaliar a atividade enzimática das celulases. Este método reflete maioritariamente a atividade da exoglucanase. Quando o substrato é o Avicel® (Celulose Microcristalina - MCC), sabemos que a endoglucanase tem elevada capacidade de o hidrolisar, sendo por essa razão o substrato mais indicado para a quantificação da atividade enzimática nesse contexto. Após uma análise dos diversos métodos de quantificação enzimática descritos na literatura, pretende-se ainda abordar os kits existentes no mercado que permitem a quantificação “rápida” da atividade enzimática. São de facto métodos que permitem uma obtenção de resultados mais rápida, mais precisos e com uma relação custo vs tempo bastante apelativa. No entanto, são também pouco versáteis, ou seja, apenas funcionam para um determinado substrato e não se podem misturar enzimas com outros reagentes que não os presentes no kit, pelo que não permitem avaliar por exemplo a influência de outros auxiliares utilizados no processamento enzimático. No âmbito do trabalho realizado para esta dissertação foi selecionado um kit da empresa Megazyme, denominado de Cellulase Assay Kit (CellG5 Method). Este kit permite comparar várias soluções comerciais de celulases e determinar a sua eficácia com base na quantificação da sua atividade enzimática. Para isso, o kit vem equipado com uma solução “pura” de endocelulase que servirá de padrão na comparação com as restantes amostras de celulases. 10 Os reagentes integrados no KIT CellG5 que permitirá a medição da atividade da endocelulase ( endo-1,4β -glucanase ) são o 4,6-O-(3-Ketobutylidene)-4-nitrophenylβ -D-cellopentaoside (BPNPG5) bloqueado e a β-glucosidase termoestável. O grupo cetona bloqueado do BPNPG5 ( 3ketobutylidene-Gx ) impede qualquer ação hidrolítica pela β-glucosidase sobre o composto BPNPG5. A incubação com a endocelulase gera um composto oligossacaridico ( 4-nitrophenylβ -Dcellooligosaccharide ) corado não bloqueado que é rapidamente hidrolisado pela β-glucosidase em 4-nitrofenol e D-Glucose. A taxa de formação do composto 4-nitrofenol é diretamente proporcional à hidrólise do composto BPNPG5 pela endocelulase. Quando a reação termina, a cor amarela do ião fenolato aparece aquando da adição da solução tampão Tris (pH 9) (Figura 2). A posterior medição da absorvância das soluções permite quantificar a atividade enzimática. Este kit representa um grande avanço quando comparado com a metodologia existente que, tradicionalmente, recorre à utilização de substratos como o CMC, Avicel, Filtro de Papel, entre outros. No entanto, o facto de apenas se poder utilizar um único tipo de substrato pode tornar-se uma desvantagem uma vez que não é o substrato comummente utilizado na indústria têxtil. Acresce ainda o facto de não se poder tirar conclusões sobre a influência dos auxiliares (agentes sequestrantes, molhantes, etc.) na atividade enzimática, uma vez que este kit não permite a inclusão desses reagentes no processo de análise (Anon., s.d.). 3-Ketobutylidene-G5-β-PNP Endo-1,4-β-glucanase G(5-X)-β-PNP + 3-Ketobutylidene-GX PNP + D-Glucose Β-glucosidase termoestável Solução tampão Tris (pH 9 - alcalina) Ião fenolato (cor amarela) FIGURA 2-REAÇÃO QUÍMICA DESENVOLVIDA NO DECORRER DO PROCESSO DE ANÁLISE COM O KIT DA MEGAZYME 11 CAPÍTULO 3: MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. MATERIAIS Acetato de sódio, cloreto de cálcio, iodeto de potássio, etanol, amido, ácido acético glacial, acetato de sódio, carbonato de sódio e ácido clorídrico foram fornecidos por RNM - Produtos Químicos ; Ácido acético e hidróxido de sódio foram fornecidos por Sameca Produtos Químicos, S.A. ; Newcell CR, Newcell Sp. Conc. CR, Base Newcell foram fornecidas por New Enzymes, Lda . Malha Jersey 100 % CO Branqueado com 170,7 g/m2, tecido 100% Viscose pronto a tingir com 386,7 g/m2, Toxal JET/SO (Detergente), Toxome WET (Molhante), Toxal 17N (Sequestrante), Toxome WET (formulação de molhante, sequestrante e detergente), Toxal TAC (regulador de pH) e Tecido padrão 100% CO crú com 82,6 g/m2 foram fornecidos por AQUITEX; Corante reativo Azul Brilhante Sumifix R Especial foi fornecido por DyStar Anilinas Texteis, Lda; Ácido sulfúrico a 75% foi fornecido por Universidade do Minho; Ortofosfato di-hidrogénio sódico, Sodium Azide e B-TRI5500 foram fornecidos por FEUP; Kit para análise da atividade enzimática da celulase fornecido por MEGAZYME 12 3.2. MÉTODOS 3.2.1. TINGIMENTO DE TECIDO 100% ALGODÃO E 100% VISCOSE COM CORANTES REATIVOS O tingimento dos materiais utilizados na determinação da atividade enzimática das celulases foi efetuado nas condições indicadas na tabela 1. O processo de tingimento conduzido numa máquina de tingir AHIBA IR, seguiu as indicações fornecidas na figura 3. Após o processo de tingimento, os materiais foram lavados a 40 °C durante 10 min, neutralizados a 50 °C com Toxal TAC durante 10 min, ensaboados a 100 °C com 1g/L de Toxal TEX durante 15 min e posteriormente lavados com água corrente à temperatura ambiente. TABELA 1-COMPOSIÇÃO DAS SOLUÇÕES DE TINGIMENTO COM CORANTES REATIVOS Substrato Algodão Viscose Corante (%) 1 1 Cloreto de sódio (g/L) 40 30 Carbonato de Sódio (g/L) 10 10 Hidróxido de sódio (g/L) 10 10 Toxal TAC (g/L) 1 1 TOXAL TEX (g/L) 1 1 TOXOME WET (g/L) 1 1 Razão de banho 1:20 1:20 Toxal TEX Toxome WET Corante Cloreto de sódio Carbonato de sódio Hidróxido de sódio 15 min 60 min 60 °C Vaza FIGURA 3-PROCESSO DE TINGIMENTO COM CORANTES REATIVOS 13 3.2.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE CORANTE NOS TECIDOS DE ALGODÃO E VISCOSE TINGIDOS Para determinação da concentração de corante nos dois substratos tingidos, determinou-se a curva de calibração do corante Azul Brilhante Sumifix R Especial em Ácido Sulfúrico a 75%. Para tal prepararam-se soluções padrão com a concentração de 0,005 g/L, 0,01 g/L, 0,02 g/L, 0,03 g/L, 0,04 g/L, 0,05 g/L de corante dissolvido em ácido sulfúrico a 75%. As soluções foram posteriormente analisadas num espectrofotómetro Shimadzu UV-2101PC, medindo as respetivas absorvâncias ao comprimento de onda de 509 nm. Por fim, com base nos dados obtidos foi determinado o modelo de regressão linear que melhor descreve a relação existente entre a concentração de corante dissolvido nas soluções de ácido sulfúrico a 75% e os respetivos valores de absorvância. Para determinar a concentração de corante no material tingido, cortaram-se amostras de cada um dos substratos com a massa de 1g, procedendo-se de seguida à sua dissolução em ácido sulfúrico a 75%, ajustando por fim o volume da solução para os 100mL. As soluções assim obtidas foram por fim analisadas no mesmo espectrofotómetro, medindo a respetiva absorvância ao comprimento de onda de 509nm. Com base nos valores obtidos e na curva de calibração do corante em H2SO4 a 75% determinou-se a concentração de corante em solução e a partir deste valor a concentração de corante no material tingido. 3.2.3. TRATAMENTO DOS TECIDOS DE ALGODÃO E VISCOSE COM CELULASES O tratamento dos tecidos de algodão e viscose com as diferentes celulases testadas no âmbito do estudo foi efetuado nas condições indicadas na tabela 2. O processo de tratamento conduzido numa máquina de tingir AHIBA IR, seguiu as indicações fornecidas na figura 4. Todos os ensaios foram realizados em duplicado. 20 corresponde à enzima Newcell CR. Nota-se no entanto a ocorrência de uma perda de peso no ensaio em branco muito próxima dos resultados obtidos nos ensaios realizados com a enzima Newcell CR no caso do tratamento do algodão e Newcell CR e Newcell Sp CR Conc no caso da viscose, facto que não seria à partida expectável, no ensaio em branco, uma vez que a solução de tratamento não incluía nenhum tipo de enzima. Estes resultados devem-se provavelmente a erros associados ao método utilizado, o qual revela fragilidades no que se refere à exatidão dos resultados fornecidos, em especial quando as amostras não são adequadamente acondicionadas em atmosfera padronizada antes de cada uma das pesagens realizadas. Numa segunda etapa realizaram-se novos ensaios nas condições descritas na secção 3.2.3., avaliando-se agora a atividade enzimática na presença de agentes molhantes e sequestrantes, cujos resultados se apresentam nas tabelas 6 e 7. TABELA 6-AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DAS CELULASES NO TRATAMENTO DO ALGODÃO NA PRESENÇA DE MOLHANTES E AGENTES SEQUESTRANTES Resultados peso (gramas) - Algodão Amostras Peso inicial (g) Peso final (g) %peso perdido % peso médio perdido Newcell Sp. CR Conc 1 5,004 4,959 0,90% 1,19% 2 5,006 4,932 1,48% Newcell CR 3 5,003 4,994 0,18% 0,36% 4 5,004 4,977 0,54% Base Newcell 5 5,001 4,92 1,62% 1,67% 6 5,004 4,918 1,72% Newcell CR + Toxome WET 7 5,002 4,99 0,24% 0,14% 8 5,001 4,999 0,04% Newcell CR + Toxal 17N 9 5,004 5,021 -0,34% -0,14% 10 5,007 5,004 0,06% Newcell Sp. CR Conc + Toxome WET 11 5,006 4,955 1,02% 0,98% 12 5,006 4,959 0,94% Newcell Sp. CR Conc + Toxal 17N 13 5,008 4,94 1,36% 1,35% 14 5,006 4,939 1,34% Base Newcell + Toxome WET 15 5,004 4,942 1,24% 1,25% 16 5,006 4,943 1,26% Base Newcell + Toxal 17N 17 5,008 4,914 1,88% 1,70% 18 5,006 4,93 1,52% Branco 19 4,998 5,004 -0,12% -0,06% 20 4,998 4,998 0,00% Toxome WET 21 4,999 4,999 0,00% 0,07% 22 4,999 4,992 0,14% Toxal 17N 23 5,001 4,989 0,24% 0,16% 24 5,003 4,999 0,08% 21 Tal como se verificou na aplicação isolada das enzimas, também os resultados apresentados na tabela 6 demonstram coerência entre a percentagem de peso médio perdido e as concentrações das enzimas utilizadas. No entanto, no conjunto de ensaios cujos resultados se apresentam na tabela 6, procedeu-se também à avaliação da influência de mais duas variáveis, o molhante TOXOME WET e o sequestrante TOXAL 17N, na atividade enzimática das celulases em estudo. Assim, no que se refere ao tratamento do algodão, verifica-se que a enzima Newcell CR na presença do molhante TOXOME WET e do sequestrante TOXAL 17N diminui a sua atividade enzimática, uma vez que apresenta uma menor percentagem de peso médio perdido comparativamente com o resultado obtido na ausência do sequestrante e do molhante. É também possível observar que a amostra tratada com a Newcell CR, na presença do sequestrante TOXAL 17N apresenta uma massa final superior á massa inicial, sendo que esta situação apenas se pode justificar pelo facto de a taxa de humidade residual no material ser diferente nas duas pesagens influenciando assim o seu peso final o que mais uma vez demonstra a reduzida fiabilidade deste método de análise. Verifica-se também que a atividade enzimática das enzimas Newcell Sp. CR Conc e Base Newcell, diminui na presença do molhante TOXOME WET, uma vez que se observa uma diminuição da percentagem de peso médio perdido comparativamente com a amostra tratada na ausência do molhante. No entanto, ambas as enzimas exibem uma maior atividade quando aplicadas presença do sequestrante, TOXAL 17N uma vez que se regista nessas condições um aumento da percentagem de peso médio perdido. Foram também realizados ensaios apenas com o sequestrante e com o molhante, para servir de controlo, tendo-se observado que por si só o molhante TOXOME WET não induz praticamente nenhuma alteração no peso do material quando aplicado sozinho. Este resultado deveria ser semelhante ao obtido no caso do tratamento apenas com o sequestrante TOXAL 17N, tendo-se, no entanto, registado neste caso uma ligeira perda de peso do material tratado, provavelmente devido às diferentes taxas de humidade que o material apresentava nos dois momentos em que as amostras foram pesadas. Por fim, o ensaio em branco apresentou um ganho de peso de reduzida dimensão, facto que não seria expectável, uma vez que a ação abrasiva exercida pelas esferas, por si só já deveria provocar uma ligeira redução de peso da amostra. Não tendo sido isso aquilo que se observou, somos levados a concluir que as amostras apresentavam taxas de humidade diferentes nos dois momentos em que foram pesadas, o que mais uma vez evidencia a reduzida fiabilidade deste método. 22 No que se refere ao tratamento da viscose, os resultados apresentados na tabela 7 demonstram também coerência entre a percentagem de peso médio perdido e as concentrações das enzimas utilizadas. As enzimas Newcell CR e Newcell Sp. CR Conc., quando aplicadas na presença do molhante TOXOME WET e do sequestrante TOXAL 17N, manifestam um aumento da sua atividade enzimática uma vez que se regista uma maior percentagem de peso médio perdido comparativamente com as amostras que foram tratadas na ausência do sequestrante e do molhante. Já no que se refere à atividade enzimática da enzima Base Newcell, verifica-se que a mesma diminui ligeiramente na presença do molhante TOXOME WET e aumenta também ligeiramente na presença do sequestrante TOXAL 17N, uma vez que se regista um aumento da percentagem de peso médio perdido quando comparado com a amostra tratada na ausência de sequestrante e molhante. Relativamente aos resultados obtidos nos ensaios realizados apenas com TOXAL 17N e TOXOME WET, seria expectável não observar grande influência na perda de peso médio da fibra, dado que os ensaios foram realizados com somente molhante e sequestrante, sem aplicação de enzima. No entanto observaram-se perdas de peso das amostras tratadas de magnitude semelhante à obtida nos ensaios realizados com enzimas, o que leva a concluir que essas diferenças de peso se possam dever às diferentes taxas de humidade que as amostras apresentavam nos dois momentos em que foram pesadas. É também importante realçar que as diferenças detetadas entre a maioria dos tratamentos realizados é de reduzida magnitude, o que face à margem de erro associado ao método utilizado poderá fazer com que as mesmas não tenham significância estatística. Com base nos resultados obtidos é assim possível concluir que a utilização deste método de avaliação da atividade enzimática das celulases apresenta sérias fragilidades que colocam em causa a sua utilidade no estudo da otimização dos processos de tratamento. De forma a reduzir os erros associados, as amostras deveriam ser armazenadas durante pelo menos 24h em atmosfera padronizada, antes de se proceder a cada uma das pesagens realizadas no decorrer do processo. Esta necessidade levanta, no entanto, problemas de ordem logística e torna o processo bastante moroso, o que coloca em causa a sua aplicabilidade na prática industrial. Relativamente aos resultados obtidos no que diz respeito à influência de agentes sequestrantes e molhantes na atividade enzimática das celulases, estes vão de encontro ao que está descrito na literatura. Miyano (1985) afirma que agentes sequestrantes podem ativar algumas enzimas, especialmente as celulases, ao sequestrar os iões metálicos inibidores presentes na solução de 23 tratamento, no entanto os mecanismos que provocam essa interferência na ação enzimática das enzimas ainda não estão bem explicados (de Cassia Pereira, 2017). Relativamente à ação dos agentes molhantes, está descrito na literatura que os mesmos podem atuar como inibidores de reações bioquímicas, nomeadamente de reações enzimáticas (A. Cavaco-Paulo, 2003). TABELA 7-AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DAS CELULASES NO TRATAMENTO DA VISCOSE NA PRESENÇA DE MOLHANTES E AGENTES SEQUESTRANTES. Resultados peso (gramas) - Viscose Amostras Peso inicial (g) Peso final (g) % peso perdido % peso médio perdido Newcell Sp. CR Conc 1 5,005 4,819 3,72% 3,56% 2 5,002 4,832 3,40% Newcell CR 3 4,994 4,808 3,72% 3,44% 4 4,999 4,841 3,16% Base Newcell 5 5,007 4,796 4,21% 4,23% 6 5,004 4,792 4,24% Newcell CR + Toxome WET 7 5,005 4,823 3,64% 3,87% 8 5,006 4,801 4,10% Newcell CR + Toxal 17N 9 5,005 4,829 3,52% 3,64% 10 5,006 4,818 3,76% Newcell Sp. CR Conc + Toxome WET 11 5,001 4,825 3,52% 3,69% 12 4,998 4,805 3,86% Newcell Sp. CR Conc + Toxal 17N 13 5,001 4,821 3,60% 3,57% 14 5,002 4,825 3,54% Base Newcell + Toxome WET 15 5,002 4,798 4,08% 4,17% 16 5,002 4,789 4,26% Base Newcell + Toxal 17N 17 5,004 4,796 4,16% 4,34% 18 5,002 4,776 4,52% Branco 19 5,000 4,814 3,72% 3,72% 20 4,985 4,800 3,71% Toxome WET 21 5,006 4,826 3,60% 3,49% 22 5,003 4,834 3,38% Toxal 17N 23 5,005 4,842 3,26% 3,28% 24 5,002 4,837 3,30% 24 4.1.3. ANÁLISE DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DAS CELULASES ATRAVÉS DA DETERMINAÇÃO DA PERCENTAGEM DE CORANTE REMOVIDO DURANTE O TRATAMENTO Neste método de análise da atividade enzimática das celulases através da avaliação da percentagem de corante removido durante o tratamento, recorreu-se à utilização da curva de calibração apresentada na secção 4.1.1. e à leitura da absorvância das soluções obtidas através do método descrito na secção 3.2.4.2. Numa primeira etapa foram realizados os ensaios descritos na secção 3.2.3. testando as 3 enzimas, na ausência de molhantes e de sequestrantes, tendo-se obtido os resultados apresentados nas tabelas 8 e 9. TABELA 8-AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DAS CELULASES NO TRATAMENTO DO ALGODÃO, ATRAVÉS DA AVALIAÇÃO DA PERCENTAGEM DE CORANTE REMOVIDO NO TRATAMENTO TABELA 9-AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DAS CELULASES NO TRATAMENTO DA VISCOSE, ATRAVÉS DA AVALIAÇÃO DA PERCENTAGEM DE CORANTE REMOVIDO NO TRATAMENTO Os resultados obtidos através da utilização deste método são coerentes com as concentrações das enzimas utilizadas para ambas as fibras, ou seja, a percentagem de corante removido pela enzima Newcell CR é menor que a percentagem removida pela enzima Newcell Sp CR Conc e pela Base Newcell. O ensaio em branco foi aquele que removeu uma menor percentagem de corante das fibras, tal como seria expectável, uma vez que não foi utilizada qualquer enzima nesse ensaio. Enzimas Abs lida Concentração de corante em solução (mg/L) Massa de corante removido (mg) Percentagem corante removido (%) Newcell Sp. CR Conc 0,0436 11,379 1,138 1,75 Newcell CR 0,0388 10,169 1,017 1,56 Base Newcell 0,0506 13,153 1,315 2,02 Sem enzima (Branco) 0,0267 7,105 0,710 1,09 Enzimas Abs lida Concentração de corante em solução (mg/L) Massa de corante removido (mg) Percentagem corante removido (%) Newcell Sp. CR Conc 0,0289 7,669 0,767 1,25 Newcell CR 0,0155 4,282 0,428 0,70 Base Newcell 0,0545 14,121 1,412 2,31 Sem enzima (Branco) 0,0056 1,782 0,178 0,29 25 Na 2ª etapa foram realizados os ensaios descritos na secção 3.2.3., tendo-se obtido os resultados apresentados nas tabelas 10 e 11. Nesta 2ª etapa a atividade enzimática foi também avaliada na presença do molhante TOXOME WET e do sequestrante TOXAL 17N, dois auxiliares que são normalmente utilizados juntamente com as celulases nos processos industriais, de forma a avaliar a sua influência na atividade enzimática. TABELA 10-AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DAS CELULASES NO TRATAMENTO DO ALGODÃO, NA PRESENÇA DE MOLHANTES E SEQUESTRANTES, ATRAVÉS DA AVALIAÇÃO DA PERCENTAGEM DE CORANTE REMOVIDO NO TRATAMENTO. Enzimas Abs lida Concentração de corante em solução (mg/L) Massa de corante removido (mg) Percentagem corante removido (%) Newcell Sp. CR Conc 0,0382 10,008 1,001 1,540 Newcell CR 0,0298 7,911 0,791 1,217 Base Newcell 0,0404 10,573 1,057 1,627 Newcell CR + Toxome WET 0,0199 5,411 0,541 0,833 Newcell CR + Toxal 17N 0,0206 5,573 0,557 0,857 Newcell Sp. CR Conc + Toxome WET 0,0417 10,895 1,090 1,676 Newcell Sp. CR Conc + Toxal 17 N 0,0445 11,621 1,162 1,788 Base Newcell + Toxome WET 0,0439 11,460 1,146 1,763 Base Newcell + Toxal 17N 0,0458 11,944 1,194 1,837 Branco 0,0241 6,460 0,646 0,994 Toxome WET 0,0267 7,105 0,710 1,093 Toxal 17N 0,0308 8,153 0,815 1,254 De acordo com os resultados da tabela 10, verificou-se que a celulase Newcell CR tem uma menor atividade enzimática que a Newcell Sp. CR Conc e que esta tem uma menor atividade enzimática quando comparada com a Base Newcell, sendo estes resultados coincidentes com as respetivas concentrações enzimáticas de cada celulase. O TOXOME WET e o TOXAL 17N quando aplicados juntamente com a Newcell CR influenciam negativamente a sua atividade, tal como se pode verificar pela menor percentagem de corante removido nessas condições. Relativamente às enzimas Newcell Sp. CR Conc e Base Newcell verificouse o contrário, uma vez que quando aplicadas juntamente com o TOXOME WET e o TOXAL 17N a sua atividade enzimática é potenciada, tal como se comprova pelo incremento da percentagem de corante removido nestas condições quando comparada com os ensaios em que só são aplicadas as enzimas. 26 O ensaio em branco caracteriza-se por ser um ensaio em que não foi adicionada nenhuma enzima e que depende exclusivamente da ação mecânica das esferas, que por si só já remove algum do corante presente no material. Relativamente aos resultados obtidos nos ensaios realizados com apenas TOXAL 17N e TOXOME WET, observou-se uma situação semelhante ao ensaio em branco, ou seja, a percentagem de corante removido deveu-se apenas à ação mecânica das esferas, dado que os ensaios foram realizados com somente molhante e sequestrante, sem aplicação de enzima. TABELA 11-AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DAS CELULASES NO TRATAMENTO DA VISCOSE, NA PRESENÇA DE MOLHANTES E SEQUESTRANTES, ATRAVÉS DA AVALIAÇÃO DA PERCENTAGEM DE CORANTE REMOVIDO NO TRATAMENTO. Enzimas Abs lida Concentração de corante em solução (mg/L) Massa de corante removido (mg) Percentagem corante removido (%) Newcell Sp. CR Conc 0,0267 7,105 0,710 1,161 Newcell CR 0,0142 3,960 0,396 0,647 Base Newcell 0,0461 12,024 1,202 1,965 Newcell CR + Toxome WET 0,0135 3,798 0,380 0,621 Newcell CR + Toxal 17N 0,0206 5,573 0,557 0,911 Newcell Sp. CR Conc + Toxome WET 0,0302 7,992 0,799 1,306 Newcell Sp. CR Conc + Toxal 17 N 0,0279 7,427 0,743 1,214 Base Newcell + Toxome WET 0,0378 9,927 0,993 1,622 Base Newcell + Toxal 17N 0,0656 16,944 1,694 2,769 Branco 0,0078 2,347 0,235 0,383 Toxome WET 0,0084 2,508 0,251 0,410 Toxal 17N 0,0104 2,992 0,299 0,489 Os resultados obtidos no tratamento da viscose com celulases estão representados na tabela 11. Tal como no algodão, a percentagem de corante removido no decorrer do tratamento é proporcional à concentração de cada enzima em estudo. No entanto, no caso da viscose verifica-se que a Newcell CR e a Base Newcell quando aplicadas juntamente com o molhante TOXOME WET diminuem a sua atividade enzimática, ou seja, a percentagem de corante removido diminui, no entanto quando aplicadas juntamente com o TOXAL 17N, a sua atividade enzimática é potenciada, dado que a percentagem de corante removido aumenta, isto quando comparado à performance das enzimas quando aplicadas sozinhas. Por sua vez, a atividade da enzima Newcell Sp CR Conc é sempre potenciada quando aplicada juntamente com o TOXOME WET e o TOXAL 17N. O ensaio em branco apresenta a menor percentagem de remoção de corante, tal como seria de esperar, uma vez que não foi, neste caso, utilizada qualquer enzima. Relativamente aos ensaios realizados com TOXOME WET ou TOXAL 17N verifica-se que a percentagem de corante removido é da mesma ordem de grandeza 27 da obtida no ensaio em branco, sendo este resultado expectável, dado o facto de não existir nenhuma enzima na solução de tratamento, pelo que a percentagem de corante removido resulta apenas da ação abrasiva das esferas colocadas em cada uma das soluções de tratamento. Relativamente aos resultados obtidos no que diz respeito à influência de agentes sequestrantes e molhantes na atividade enzimática das celulases, estes vão de encontro ao que está descrito na literatura. O autor Miyano, 1985, afirma que agentes sequestrantes podem ativar algumas enzimas, especialmente as celulases, ao sequestrar os iões metálicos inibidores presentes no sistema aquoso, no entanto relativamente à ação dos agentes molhantes, está descrito na literatura que os mesmos podem ser inibidores de ações bioquímicas, nomeadamente de ações enzimáticas (A. Cavaco-Paulo, 2003). 4.1.4. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DAS CELULASES ATRAVÉS DA APLICAÇÃO DO KIT DA MEGAZYME – “ CELLULASE ASSAY KIT (CELLG5 METHOD)” TABELA 12-RESULTADOS OBTIDOS NA APLICAÇÃO DO KIT DA MEGAZYME Enzimas Abs Atividade enzimática Média (Unidades CellG5/mL) Newcell CR (B) 0,068 6,011 Newcell CR (1) 0,599 52,952 52,2 Newcell CR (2) 0,582 51,449 Newcell Sp. CR Conc (B) 0,068 6,011 Newcell Sp. CR Conc (1) 1,933 170,877 173,087 Newcell Sp. CR Conc (2) 1,983 175,297 Base Newcell (B) 0,067 5,923 Base Newcell (1) 2,138 188,999 187,187 Base Newcell (2) 2,097 185,375 Padrão (B) 0,067 5,923 Padrão (1) 1,555 137,462 137,418 Padrão (2) 1,554 137,374 Foi implementado o método para quantificação da atividade enzimática da celulase através da aplicação do kit da Megazyme – “Cellulase assay kit” e os resultados obtidos encontram-se representados na tabela 12. As leituras das absorvâncias foram feitas ao comprimento de onda de 400nm. 28 A aplicação deste método foi realizada na avaliação da atividade enzimática das enzimas Newcell CR, Newcell Sp. CR Conc., Base Newcell e enzima padrão que veio com o kit. Foram também realizados ensaios em branco identificados na tabela 12 pela letra B, tendo os ensaios que integravam enzimas na solução de tratamento sido realizados em duplicado. Pela análise dos resultados apresentados concluiu-se que quanto maior a concentração da celulase, maior será a sua atividade enzimática, podendo as enzimas ser ordenadas por ordem crescente de atividade da seguinte forma: Newcell CR < Newcell Sp. CR Conc < Base Newcell. É de realçar que neste caso não se avaliou a atividade enzimática na presença de molhantes e sequestrantes, uma vez que o kit utilizado não permite que nas soluções preparadas para análise sejam integrados outros reagentes para além da enzima a testar. Esta restrição constitui um dos pontos fracos deste tipo de kits que impossibilita a sua utilização em estudos de otimização de processos que envolvem a utilização de outros tipos de reagentes que não apenas as enzimas. Tal como explicado previamente, 1 unidade de atividade enzimática caracteriza-se, quando na presença de excesso de β-glucosidase no meio, pela quantidade de enzima necessária para libertar 1 µmol de 4-nitrophenol do kit CellG5 em 1 minuto. Ora, isto significa que no caso da Newcell Cr obteve-se uma atividade enzimática de 52 unidades de CellG5/mL, libertando para o meio 52 µmol de 4-nitrophenol de CellG5 em 1 minuto, apresentando uma menor atividade enzimática que a Newcell Sp. CR Conc que obteve uma atividade enzimática de 173 unidades de CellG5/mL libertando para o meio 173 µmol de 4-nitrophenol de CellG5 em 1 minuto que, por sua vez, apresentou uma atividade enzimática inferior à enzima Base Newcell que exibiu uma atividade enzimática de 187 unidades de CellG5/mL, libertando para o meio 187 µmol de 4nitrophenol de CellG5 em 1 minuto. Resumindo, quanto maior a atividade enzimática, mais nitrofenol se vai libertar em 1 minuto e mais intensa será a coloração final da solução, apresentando por isso uma absorvância maior. A enzima padrão demonstra que o kit se encontra funcional. 29 4.2. RESULTADOS OBTIDOS NO TRATAMENTO ENZIMÁTICO COM A AMILASE 4.2.1. AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DA COR DO COMPLEXO AMIDO-IODO No decorrer da avaliação do teor de amido presente nos substratos verificou-se que a cor do complexo amido-iodo que se formava após a deposição da gota da solução de iodo/iodeto de potássio diminuía progressivamente de intensidade à medida que o tempo passava. Para avaliar este comportamento, monitorizou-se numa amostra com 3% de amido, a evolução do respetivo espectro K/S ao longo do tempo, com intervalos de tempo de 30 segundos, durante um período de 10 minutos, tendo-se obtido os resultados apresentados na figura 6, confirmando-se pela análise dos mesmos que a intensidade da cor diminui de forma rápida e progressiva, razão pela qual a análise deve ser realizada no mais curto espaço de tempo possível. Uma análise mais detalhada da evolução dos valores K/S obtidos ao comprimento de onda de 580 nm, permitiu detetar a existência de uma correlação linear entre a intensidade coloristica e o tempo de ensaio decorrido, tal como se pode constatar pela análise dos dados apresentados na figura 7. De forma a generalizar estes resultados para outras situações nas quais a concentração de amido no material seja diferente da existente na amostra testada, determinou-se para o mesmo comprimento de onda de 580 nm a percentagem de redução do valor K/S em função do tempo, tendo-se obtido os resultados apresentados na figura 8, que comprovam que também neste caso a redução percentual da intensidade coloristica em função do tempo pode ser descrita através de um modelo de regressão linear. A determinação deste modelo permite corrigir leituras do valor de K/S ao comprimento de onda de 580 nm, quando as mesmas são realizadas não imediatamente após a execução do ensaio, mas com um desfasamento de até 10 minutos, utilizando a equação 3. Onde: K/S corrigido = K/S obtido ÷ (1,4273-0,0416t) (Equação 3) K/S obtido = K/S lido decorridos t segundos após realização do teste K/S corrigido = K/S obtido imediatamente após a realização do teste t = tempo decorrido em segundos entre a realização do teste e a leitura do valor K/S 36 BIBLIOGRAFIA A. Cavaco-Paulo, G. G., 2003. Textile Processing with Enzymes. England: Woodhead Publishing Ltd. Anon., s.d. Megazyme. [Online] Available at: https://www.megazyme.com/cellulose-assay-kit-cellg5-method [Acedido em 22 maio 2021]. Araki, H. et al., 2017. Materials and Device Designs for an Epidermal UV Colorimetric Dosimeter with Near Field Communication Capabilities. Advanced Funcional Materials, 12 January, 27(2), pp. 1-9. Bahtiyari, M. 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Adicionar 200mL da solução tampão C concentrada a um volume de 750mL de água destilada. 2. Ajustar o pH até 6 com HCL e perfazer o volume até 1L com água destilada. 3. Adicionar 0.2g de sodium azide e dissolver. PREPARAÇÃO DO REAGENTE PARAGEM 4. Dissolver 20 g de B-TRIS500 em 900 mL de água destilada. 5. Ajustar o pH até 10 com NaOH e perfazer o volume até 1L com água destilada. PROCEDIMENTO DE EXTRAÇÃO E DILUIÇÃO DAS CELULASES A TESTAR 39 1. Adicionar 1mL da celulase a 49mL da solução tampão D e misture bem. Esta solução denominar-se-á de Extrato Original. 2. Diluir o extrato original, ou seja, adicionar 1mL do extrato original a 9mL da solução tampão D. 3. Fazer o passo 1 para as 3 enzimas a testar (Newcell CR, Newcell Sp. Conc. CR, Base Newcell). PREPARAÇÃO REAGENTE CELLG5 (substrato) 1. Transferir 100 µL de solução do frasco 2 para o frasco 1 e misturar bem. PREPARAÇÃO DILUIÇÃO CELULASE STANDARD 1. Dispensar 0.5mL da solução presente no frasco 3 para 9.5mL de solução tampão B e misturar bem. PROCEDIMENTO ENSAIO CELULASE 1. Dispensar 0.10mL da CellG5 diretamente para todos os tubos de vidro de 13mL do ensaio e pré-incubar a 40ºC durante aprox. 3 min. 2. Ao mesmo tempo, pré-incubar as soluções de celulase diluída, quer a standard quer as celulases a testar, a 40ºC durante 3 min. 3. A cada tubo que contem a CellG5 adicionar 0.1mL de solução de celulase e incubar 10 min a 40ºC. 4. Transcorridos os 10 min adicionar 3.0 mL do reagente de paragem e misturar. 5. Ler a absorvância de cada tubo a um comprimento de onda de 400nm. PROCEDIMENTO ENSAIO EM BRANCO 1. Dispensar 0.10mL da CellG5 diretamente para os tubos de vidro de 13mL do ensaio. 2. Adicionar 3.0 mL do reagente de paragem e misturar. 3. Adicionar 0.1mL de solução de celulase diluída. 4. Ler a absorvância de cada tubo a um comprimento de onda de 400nm. CÁLCULO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA 40 1 unidade de atividade é definida pela quantidade de enzima existente na presença da quantidade necessária de β-glucosidase termoestável para libertar 1 µLmol de 4-nitrophenol de CellG5 em 1 minuto, denominando-se de 1 unidade de CellG5. CellG5 Unidades/mL da preparação enzimática original: Onde: • ΔA400 = Ansorvância (reação) – Absorvância (branco) • Tempo de incubação = 10 min • Volume total na célula = 3.2 mL • Aliquot = 0.1 mL • εmM (4-nitrophenol) = 18.1 (a 400 nm) em 2% Tris buffer (pH 10) • Volume de extração = 50 mL por 1.0 mL da preparação enzimática original • Diluição do extrato original Sendo: CellG5 Unidades/mL da preparação enzimática original: