Abordagens bioquímicas e moleculares para compreender o efeito do cálcio na qualidade do bago da uva ( L.) e na sua comunidade microbiana
Abstract
Os suplementos à base de cálcio têm sido amplamente utilizados para o aumento da firmeza dos frutos e da sua resistência ao stresse abiótico. No entanto, estudos de metabolómica revelaram que o cálcio modifica a composição da película do bago de uva e o perfil volátil do vinho, sugerindo um efeito na microbiota nativa. O objetivo da presente dissertação consistiu em caracterizar o efeito do cálcio na comunidade microbiana cultivável de bagos de uva maduros das castas Loureiro e Vinhão da região DOC Vinhos Verdes, relacionando os resultados com as propriedades bioquímicas e moleculares dos frutos. Foi ainda avaliado o efeito de diversos fatores de stresse abiótico nos diferentes isolados da população microbiana, bem como o perfil de crescimento de espécies de levedura isoladas. Os resultados mostraram que a aplicação de cálcio inibiu a acumulação de antocianinas nos bagos maduros da casta Vinhão, consistente com a repressão da expressão de genes codificantes da chalcona sintase (CHS3) e da dihidroflavonol redutase (DFR), sem afetar o conteúdo em fenólicos totais e açúcares redutores. Verificou-se que Aureobasidium pullulans e Hanseniaspora uvarum predominam na superfície de bagos de uva de ambas as castas e que o tratamento com cálcio reduziu a abundância total da microbiota cultivável, afetando a sua diversidade de forma dependente da casta. Ensaios de crescimento das leveduras isoladas mostraram que A. pullulans é muito susceptível ao stresse osmótico, ao cálcio e ao cobre, enquanto Wickerhamomyces anomalus é a mais tolerante ao etanol, apresentado um metabolismo fermentativo com produção de etanol e de ácido acético. Estes estudos, complementados com abordagens de sequenciação high throughput, revestem-se de uma elevada importância científica e aplicada uma vez que abrem caminho, por exemplo, à produção de vinhos com um terroir específico, produzidos por fermentação com estirpes nativas, ou à identificação de leveduras com atividade antagonista sobre o crescimento de fungos filamentosos patogénicos, permitindo a sua otimização em estratégias de biocontrolo.
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Luís Carlos Moreira CostaAbordagens bioquímicas e moleculares para compreender o efeito do cálcio na qualidade do bago da uva ( L.) e na sua comunidade microbiana Universidade do MinhoEscola de Ciênciasdezembro de 2021 Luís Carlos Moreira Costa Abordagens bioquímicas e moleculares para compreender o efeito do cálciona qualidade do bago da uva ( L.) e na sua comunidade microbiana Minho | 2021U Vitis vinifera Vitis vinifera
Luís Carlos Moreira CostaAbordagens bioquímicas e moleculares paracompreender o efeito do cálcio na qualidadedo bago da uva ( L.) e na sua comunidade microbianaUniversidade do MinhoEscola de Ciênciasdezembro de 2021Dissertação de MestradoMestrado em Genética MolecularTrabalho efetuado sob a orientação deDoutora Viviana Maria Varajão MartinsDoutor António da Costa Teixeira Vitis vinifera
ii DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição-NãoComercial-CompartilhaIgual CC BY-NC-SA https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/
iii Parte deste trabalho originou a seguinte publicação: Martins V, Costa L*, Soares R*, Ayogu P, Teixeira A, Gerós H (2021) A catalogue of cultivable yeasts from the microbiota of grape berries cv. Vinhão and Loureiro. PLOS One (em revisão). *estes autores contribuíram de forma equivalente para este trabalho Este trabalho foi apoiado pelo “Contrato-Programa” UIDB/04050/2020 financiado por fundos nacionais através da Fundação para a Ciência e a Tecnologia, FCT I.P. O trabalho contou ainda com o apoio da FCT, CCDR-N (Comissão de Coordenação e Desenvolvimento Regional do Norte de Portugal) e Fundos Europeus (FEDER/POCI/COMPETE2020) através dos projetos GrapeMicrobiota (PTDC /BAA-AGR/2691/2020), AgriFood XXI (NORTE -01-0145-FEDER000041), BerryPlastid (PTDC/BIA-FBT/28165/2017 e POCI-01-0145-FEDER-028165) e MitiVineDrought (PTDC /BIA-FBT/30341/2017 e POCI-01-0145-FEDER-030341). Este trabalho beneficiou das atividades em rede do laboratório colaborativo CoLAB VINES & WINES e do projeto Fleurs locales (SOE4/P5/F1011).
iv AGRADECIMENTOS Se quero ir longe, tenho de estar acompanhado. A muitos devo um caloroso agradecimento, pela ajuda na conclusão de mais um ciclo desta caminhada terrena. À Doutora Viviana Martins e ao Doutor António Teixeira, orientadores desta dissertação, além da atenção, disponibilidade e carinho, um grande obrigado por me acolher e guiar os meus primeiros passos, quiçá, de um futuro investigador. Ao Professor Doutor Hernâni Gerós, um agradecimento especial pela dedicação e ajuda ao longo da realização deste trabalho, bem como a todos os membros do Laboratório de Biologia Vegetal. A todos os Professores que cruzaram comigo no decorrer do meu percurso académico. Ao Diogo Silva, aos antigos e aos novos amigos, pelo incentivo e apoio ao longo destes anos. Por fim, e não menos importante, um agradecimento a toda a minha família, em especial aos meus pais, por todo o amor. A todos, um afetuoso obrigado.
v DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho.
vi Abordagens bioquímicas e moleculares para compreender o efeito do cálcio na qualidade do bago da uva ( Vitis vinifera L.) e na sua comunidade microbiana RESUMO Os suplementos à base de cálcio têm sido amplamente utilizados para o aumento da firmeza dos frutos e da sua resistência ao stresse abiótico. No entanto, estudos de metabolómica revelaram que o cálcio modifica a composição da película do bago de uva e o perfil volátil do vinho, sugerindo um efeito na microbiota nativa. O objetivo da presente dissertação consistiu em caracterizar o efeito do cálcio na comunidade microbiana cultivável de bagos de uva maduros das castas Loureiro e Vinhão da região DOC Vinhos Verdes, relacionando os resultados com as propriedades bioquímicas e moleculares dos frutos. Foi ainda avaliado o efeito de diversos fatores de stresse abiótico nos diferentes isolados da população microbiana, bem como o perfil de crescimento de espécies de levedura isoladas. Os resultados mostraram que a aplicação de cálcio inibiu a acumulação de antocianinas nos bagos maduros da casta Vinhão, consistente com a repressão da expressão de genes codificantes da chalcona sintase ( CHS3 ) e da dihidroflavonol redutase ( DFR ), sem afetar o conteúdo em fenólicos totais e açúcares redutores. Verificou-se que Aureobasidium pullulans e Hanseniaspora uvarum predominam na superfície de bagos de uva de ambas as castas e que o tratamento com cálcio reduziu a abundância total da microbiota cultivável, afetando a sua diversidade de forma dependente da casta. Ensaios de crescimento das leveduras isoladas mostraram que A. pullulans é muito susceptível ao stresse osmótico, ao cálcio e ao cobre, enquanto Wickerhamomyces anomalus é a mais tolerante ao etanol, apresentado um metabolismo fermentativo com produção de etanol e de ácido acético. Estes estudos, complementados com abordagens de sequenciação high throughput , revestem-se de uma elevada importância científica e aplicada uma vez que abrem caminho, por exemplo, à produção de vinhos com um terroir específico, produzidos por fermentação com estirpes nativas, ou à identificação de leveduras com atividade antagonista sobre o crescimento de fungos filamentosos patogénicos, permitindo a sua otimização em estratégias de biocontrolo. Palavras-chave: Bago de uva, Cálcio, Microbiota cultivável, Stresse osmótico, Vitis vinifera L.
vii Biochemical and molecular approaches to understand the effect of calcium on the quality of the grape berry ( Vitis vinifera L . ) and of its microbial community ABSTRACT Calcium-based supplements have been widely used to increase fruit firmness and resistance to abiotic stress. However, metabolomics studies revealed that calcium modifies the composition of the grape berry skin and the volatile profile of wine, suggesting an effect on the native microbiota. The aim of this dissertation was to characterize the effect of calcium on the cultivable microbial community of mature grape berries of the Loureiro and Vinhão varieties from the DOC region Vinhos Verdes, relating the results to the biochemical and molecular properties of the fruits. The effect of different abiotic stress factors on different isolates from the microbial population was also evaluated, as well as the growth profile of isolated yeast species. The results showed that the application of calcium inhibited the accumulation of anthocyanins in the mature berries of the Vinhão variety, consistent with the repression of the expression of genes encoding chalcone synthase ( CHS3 ) and dihydroflavonol 4-reductase ( DFR ), without affecting the content of total phenolics and reducing sugars. It was observed that Aureobasidium pullulans and Hanseniaspora uvarum predominate on the surface of grape berries of both varieties and that the calcium treatment reduced the total abundance of the cultivable microbiota, affecting its diversity in a variety-dependent manner. Growth assays of isolated yeasts showed that A. pullulans is very susceptible to osmotic stress, calcium and copper, while Wickerhamomyces anomalus is the most tolerant to ethanol, presenting a fermentative metabolism with ethanol and acetic acid production. These studies, complemented with high-throughput sequencing approaches, are of high scientific and applied relevance as they pave the way, for example, to the production of wines with a specific terroir, produced by fermentation with native strains, or the identification of yeasts with antagonistic activity on the growth of pathogenic filamentous fungi, allowing their optimization in biocontrol strategies. Keywords: Calcium, Cultivable microbiota, Grape berry, Osmotic stress, Vitis vinifera L.
xiv para 2 réplicas biológicas; na escala de cores, o rácio 1,0 refere-se a crescimento idêntico ao verificado na condição controlo (sem tratamento)…………………………………………………………….31 Figura 18. Efeito do etanol no crescimento das 5 espécies de levedura mais abundantes nos bagos de uva das castas Loureiro e Vinhão. Para cada espécie, foi calculado o rácio entre a D.O.600nm na presença do fator de stresse e na sua ausência (controlo), após 14 h de incubação. Os resultados foram representados sob a forma de heat map utilizando a média dos valores obtidos para 2 réplicas biológicas; na escala de cores, o rácio 1,0 refere-se a crescimento idêntico ao verificado na condição controlo (sem tratamento)…………………………………………………………….32 Figura 19. Efeito do cobre no crescimento das 5 espécies de levedura mais abundantes nos bagos de uva das castas Loureiro e Vinhão. Para cada espécie, foi calculado o rácio entre a D.O.600nm na presença do fator de stresse e na sua ausência (controlo), após 14 h de incubação. Os resultados foram representados sob a forma de heat map utilizando a média dos valores obtidos para 2 réplicas biológicas; na escala de cores, o rácio 1,0 refere-se a crescimento idêntico ao verificado na condição controlo (sem tratamento)…………………………………………………………….33 Figura 20. Efeito do PEG6000 no crescimento das 5 espécies de levedura mais abundantes nos bagos de uva das castas Loureiro e Vinhão. Para cada espécie, foi calculado o rácio entre a D.O.600nm na presença do fator de stresse e na sua ausência (controlo), após 14 h de incubação. Os resultados foram representados sob a forma de heat map utilizando a média dos valores obtidos para 2 réplicas biológicas; na escala de cores, o rácio 1,0 refere-se a crescimento idêntico ao verificado na condição controlo (sem tratamento)…………………………………………………………….34 Figura 21. Avaliação do crescimento celular, consumo de glicose, produção de etanol e de ácido acético de R. glutinis, W. anomalus e S. cerevisiae , a 24 °C em meio mineral suplementado com 2% de glicose como fonte única de carbono, e pH 4,5. Os resultados representam a média ± DP de valores obtidos para 2 réplicas biológicas……………………………………………………………………35
xv LISTA DE TABELAS Tabela 1. Evolução da microbiota da superfície do bago de uva ao longo do seu desenvolvimento. Adaptado de Renouf et al. (2005)………………………………………………………………………………….13 Tabela 2. Genes e respetivos conjuntos de primers usados em qPCR…………………………………18 Tabela 3. Ciclos de PCR usados para amplificação da região ITS, segundo o método de Stringini et al . (2008)……………………………………………………………………………………………………………..19 Tabela 4. Espécies identificadas por Blast das sequências ITS amplificadas, no programa BLASTN do NCBI……………………………………………………………………….……………………………..27
1 1. INTRODUÇÃO 1.1. O cultivo da videira e a produção de vinho num contexto de alterações climáticas Pela sua relevância na indústria do vinho, a videira ( Vitis vinifera L.) é das espécies frutícolas mais importantes ao nível mundial. Atualmente, ocupa mais de 7,5 milhões de ha de área de cultivo global, produzindo 77,8 milhões de t de uvas, 57% das quais usadas para vinificação, 36% para consumo fresco (uvas de mesa) e 7% para a produção de uvas passas (OIV, 2016). A domesticação da videira terá ocorrido há cerca de 6000 anos na região do Cáucaso e do mar Cáspio (Kunkee e Goswell, 1996; revisto por Conde et al. , 2007), a partir do seu ancestral selvagem Vitis vinifera ssp. sylvestris (Terral et al. , 2010; Ramos et al. , 2014). Na Península Ibérica terá sido introduzida pelos romanos há cerca de 2800 anos, o que conduziu à expansão da vitivinicultura para a europa ocidental (Arroyo-Garcia et al. , 2006; Veloso et al. , 2010; Castro et al. , 2013). Apesar de existirem diferentes espécies com o género Vitis, Vitis vinifera é a espécie usada globalmente para produzir vinho . Em Portugal estão descritas diversas castas autóctones, contemplando um total de 240 (Mamaot, 2012; Cunha et al. , 2016). Segundo dados de 2016 da Organização Internacional da Vinha e do Vinho (OIV), a área total de plantação de vinha em Portugal é de 195 284 ha, correspondente a uma produção de uva fresca de 800 738 t e a uma produção de vinho de 6 010 milhões de hl. As principais regiões vitivinícolas portuguesas estão apresentadas na Fig. 1. Fig. 1. Mapa das principais regiões vitivinícolas de Portugal. Adaptado de Infovini (2020).
2 No contexto das alterações climáticas em curso, o cultivo sustentável da videira e a produção de vinho enfrentam importantes desafios. Com efeito, fatores de stresse abiótico, como ondas de calor ou seca, e biótico, como doenças ou pragas, limitam seriamente a produtividade e a qualidade do fruto e do vinho, revestindo-se também de dimensões preocupantes ao nível ambiental porque requerem a aplicação de quantidades crescentes de agroquímicos. (Easterling et al. , 2000; Chuine et al. , 2004; Cohen et al. , 2012). Por exemplo, estes fatores ambientais influenciam o desenvolvimento e composição química do bago de uva, nomeadamente ao nível do metabolismo dos compostos fenólicos (Jones et al. , 2005; White et al. , 2006; revisto por Teixeira et al. , 2013). Nesse sentido, têm sido testadas com sucesso práticas agrícolas inovadoras baseadas em estudos científicos, como a irrigação sustentável (irrigação deficitária) (Keller, 2004; Costa et al. , 2016), métodos de poda ou de desfolha que possam, por exemplo, reduzir a área foliar sem comprometer a produtividade (Gatti et al. , 2015), aplicação de cobertos vegetais nas entrelinhas (Steinmaus et al. , 2008), bem como a aplicação exógena de compostos bioativos, incluindo suplementos à base de cálcio (Conde et al. , 2018; Martins et al. , 2020ab). Com efeito, a aplicação exógena de suplementos à base de cálcio constitui uma abordagem promissora e ecologicamente sustentável, em alternativa aos fungicidas de síntese, proporcionando maior segurança aos consumidores e ao meio ambiente (Martins et al. , 2020a). 1.2. Desenvolvimento e maturação do bago de uva O bago de uva é formado por três tecidos principais, a saber, a película, a polpa e a semente (Fig. 2). Durante o seu desenvolvimento este sofre modificações no tamanho, composição, cor, textura, sabor e suscetibilidade a agentes patogénicos (revisto por Conde et al. , 2007). O crescimento do bago de uva, como o de muitos frutos drupáceos, é descrito por uma curva duplasigmóide (Fig. 3) (Coombe e Hale, 1973).
3 Fig. 2. Estrutura de um bago de uva maduro. Adaptado de Coxhead (2015). A primeira fase de crescimento ocorre desde a frutificação à custa de um crescimento celular rápido durante ca. 1,5 meses e precede uma fase de latência (revisto por Conde et al. , 2007). No final da fase de latência ocorre o pintor (ou veraison em francês), marcado pela mudança de cor, acidez, textura e concentração de açúcares do bago, antecipando a maior mudança do seu desenvolvimento com o início da fase de maturação, durante a qual o bago cresce essencialmente por expansão celular (Coombe e Hale, 1973). Durante o amadurecimento, os bagos tornam-se pulposos, menos ácidos e mais doces, e fortemente aromáticos.
4 Fig. 3. Curva dupla-sigmóide de crescimento do bago de uva. Do setting até à fase de pintor ( veraison ), o volume dos bagos aumenta derivado da divisão celular no pericarpo durante as primeiras três semanas, sendo o malato o principal soluto acumulado. Da fase pintor ( veraison ) até ao final do amadurecimento, os frutos perdem rigidez e aumentam de volume, devido à acumulação de água, de açúcares, de antocianinas e de compostos aromáticos. Adaptado de Coombe e McCarthy (2000). Do ponto de vista bioquímico, vários solutos são formados em fases específicas de crescimento da uva. Na primeira fase de crescimento, os ácidos tartárico e málico são os compostos dominantes: o ácido tartárico é acumulado nas zonas mais periféricas dos bagos; em contrapartida, a acumulação do ácido málico ocorre no endocarpo e mesocarpo. Estes ácidos são responsáveis pela acidez do fruto, que é essencial para a qualidade do vinho. Os ácidos hidroxicinámicos, também são acumulados neste período inicial, distribuindo-se pela polpa e cutícula, sendo os precursores de fenólicos voláteis (Romeyer et al. , 1983). Os taninos presentes na cutícula e nos tecidos das sementes, também são produzidos nesta fase, onde ocorre também a acumulação de muitos outros solutos, incluindo minerais e aminoácidos, e outros compostos aromáticos detalhados posteriormente. (revisto por Conde et al. , 2007). Foi demonstrado que os
5 taninos são afetados pelo ensombramento dos frutos, portanto pela redução da exposição à luz ou pela exposição a temperaturas mais baixas que os frutos expostos (Downey et al. , 2004; Cortell e Kennedy, 2006; Kennedy et al. , 2007; Nicholas et al. , 2011). O decréscimo da concentração de ácido tartárico observado na segunda fase de crescimento é atribuído ao efeito de diluição, uma vez que o volume dos bagos aumenta devido à elevada acumulação de água. Por outro lado, a redução da concentração de ácido málico após o pintor resulta do seu metabolismo e degradação enzimática, muito dependente da temperatura ambiente. Em geral, frutos amadurecidos a temperaturas mais baixas (como na região dos vinhos verdes) apresentam uma acidez total superior a frutos amadurecidos a temperaturas superiores (como na região do Douro ou Alentejo), essencialmente resultante de variações na quantidade de ácido málico (Dokoozlian, 2000). Para suportar o seu desenvolvimento, os bagos de uva dependem de recursos energéticos disponíveis em hidratos de carbono, principalmente sacarose que é importada dos tecidos fotossintéticos e convertida em glicose e frutose no fruto (revisto por Conde et al. , 2007). Em comparação com outros frutos, o bago de uva acumula elevadas concentrações de açúcares durante o amadurecimento (ca. 25% do peso fresco (PF) do bago de uva) (Dokoozlian, 2000). O teor em açúcar é um indicador usado frequentemente para avaliar a época ideal da colheita, porque permite prever o teor alcoólico do vinho. Além dos açúcares, outros constituintes influenciam fortemente a qualidade do vinho, como os compostos fenólicos. Os compostos fenólicos do bago, são constituídos por um anel fenólico como estrutura principal com um grupo hidroxilo, ou com variados grupos de substituição (revisto por Conde et al. , 2007). Estes compostos constituem um dos parâmetros de qualidade mais importantes dos vinhos, uma vez que contribuem para as características organoléticas do vinho, como a cor, adstringência, amargor e aroma (revisto por Monagas et al. , 2005). São eles os responsáveis pelos benefícios do consumo de uvas e de vinho para a saúde, em quantidades moderadas, atuando, por exemplo, como agentes antioxidantes (Teissedre et al. , 1996; Dokoozlian, 2000). Num estudo recente publicado na Nature Metabolism foi reportado que o flavonóide procianidina C1 presente em extratos de semente do bago aumenta o tempo de vida de ratos através da sua ação sobre células senescentes (Xu et al. , 2021). Os compostos fenólicos do bago de uva são classificados como não flavonóides (com um esqueleto C6 simples; incluem ácidos hidroxibenzóicos, ácidos hidroxicinâmicos, fenóis voláteis e estilbenos) e flavonóides (incluem flavonas, flavonóis, flavanonas, flavano-3-óis e antocianinas). A
6 biossíntese de fenólicos solúveis (Fig. 4) é iniciada com o aminoácido aromático fenilalanina, um produto da via do chiquimato que ocorre no cloroplasto (revisto por Teixeira et al. , 2013). Fig. 4. Vias de biossíntese de compostos secundários do bago de uva. Fenilalanina amónia liase (PAL), cinamato4-hidroxilase (C4H), 4-coumaroil: CoA-ligase (4CL), estilbeno sintase (STS), chalcona sintase (CHS), chalcona isomerase (CHI), flavonóide 3′-hidroxilase (F3′H), flavonóide 3′, 5′-hidroxilase (F3′5′H), flavanona-3-hidroxilase (F3H), flavonol sintase (FLS), dihidroflavonol redutase (DFR), leucoantocianidina redutase (LAR), antocianidina redutase (ANR), leucoantocianidina dioxigenase (LDOX), dihidroflavonol 4-redutase (DFR), flavonóide glucosiltransferase (UFGT), O-metiltransferase (OMT). Adaptado de Teixeira et al. (2013). O teor de estilbenos do bago, como o resveratrol, varia entre castas (Gatto et al. , 2008) e normalmente a sua síntese aumenta com a infeção por patógenos e em resposta ao stresse abiótico (Bavaresco et al. , 2015). Os flavano-3-óis são a classe mais abundante de fenólicos no bago de uva (Singleton, 1992), possuindo uma estrutura monomérica (catequina) ou polimérica, conhecida como proantocianidinas ou taninos condensados. Os flavonóis, como a quercetina, caracterizam-se pela hidroxilação do anel B nas posições C-3′ e C-4′ e são abundantes nas células dérmicas do bago. A quercetina comporta-se como protetor UV e desempenha um papel na co-
7 pigmentação do fruto, juntamente com as antocianinas (Aherne et al. , 2002; Braidot et al. , 2008). As antocianinas são flavonóides que se caracterizam como glicosídeos e acilglicosídeos de antocianidinas. A malvidina-3O -glucosídeo é geralmente a mais abundante antocianina do bago, juntamente com as suas formas aciladas (revisto por Teixeira et al. , 2013). 1.3. Aplicação exógena do cálcio na vinha O cálcio é um elemento essencial que regula vários processos celulares básicos nos tecidos do bago de uva, como principal mensageiro secundário da célula, incluindo a divisão celular e o crescimento dos meristemas, atuando também em sistema de antiporte de aniões orgânicos e inorgânicos ao nível da membrana do vacúolo (Tuteja e Mahajan, 2007). Além disso, o cálcio desempenha um papel central na integridade das paredes celulares, uma vez que medeia ligações cruzadas entre as moléculas de pectina. Este elemento desempenha então um papel central na resposta das plantas ao stresse biótico e abiótico (incluindo ataque de patógenos e intensidade luminosa) , crescimento e remodelação da parede celular e desenvolvimento de tecidos vegetais (Hocking et al. , 2016 ; Martins et al. , 2020b). Durante o seu amadurecimento o bago de uva tornase pulposo. Este fenómeno deve-se à degradação da parede celular por enzimas hidrolíticas, incluindo pectato liases (PLs), poligalacturonases (PGs) e pectina metilesterases (PMEs) (Draye e Van Cutsem, 2008). Alguns microrganismos envolvidos na degradação da parede celular das plantas, como fungos e bactérias patogénicas, expressam PMEs que removem grupos metilo das pectinas para facilitar a invasão (Videcoq et al. , 2011). 1.3.1. Efeito da aplicação de cálcio na firmeza dos frutos Fatores de stresse abiótico, como chuvas intensas na altura da vindima, são particularmente críticos em castas cujo bago de uva possui uma película fina. O aumento do teor em água causa o rachamento da película e conduz à diluição de compostos, como os aromas. Em paralelo, a rutura da película torna o bago mais propenso à infeção por fungos, antes e após a colheita, traduzindo-se em perdas económicas significativas (Martins et al. , 2018). Com efeito, dada a crescente necessidade de preservação da qualidade de produtos frescos, o cálcio tem sido utilizado como suplemento pós-colheita, a fim de prolongar o seu tempo de vida em prateleira e aumentar o seu valor nutricional. O efeito de aplicações exógenas de cálcio no período de précolheita foi testado em mamão, cereja, maçã, morango, kiwi e uvas de mesa, tendo sido obtidos resultados distintos em termos de aumento de firmeza dos frutos (Siddiqui e Bangerth, 1995;
8 Wójcik e Lewandowski, 2003; Antunes et al. , 2004; Bonomelli e Ruiz, 2010; Wójcik e Borowik, 2013; Madani et al. , 2016). Estudos recentes debruçaram-se sobre o efeito da aplicação exógena de cálcio e de enzimas PME na qualidade do fruto e na organização das pectinas das paredes celulares em jujuba (Zhang et al. , 2019). As PMEs catalisam a desesterificação de ésteres metílicos de pectina ao promoverem a combinação de Ca2+ com o carbono 6 não esterificado em resíduos de ácido galacturónico, aumentando a estabilidade da pectina (Anesi al. , 2017). Recorrendo a microscopia de força atómica (AFM), foi possível observar que as moléculas de pectina solúvel em água (WSP) se encontram agregadas, formando grandes polímeros ou blocos, sendo que foram observadas apenas algumas cadeias lineares (Fig. 5A). Em frutos tratados com cálcio, PMEs ou Ca+PMEs, foram observadas cadeias lineares longas com estruturas ramificadas (Fig. 5C-E). Estes resultados sugerem que as moléculas de pectina despolimerizaram durante o amadurecimento. No entanto, as amostras tratadas com cálcio + PMEs, previnem a despolimerização da pectina. Fig. 5. Imagens de microscopia de força atómica (AFM) de pectina solúvel em água (WSP). (A) corte transversal de frutos frescos de jujuba (Controlo); (B) frutos submetidos a impregnação a vácuo (VI) com uma solução isotónica de sacarose (56 dias); (C) jujubas submetidas a VI, tratadas com CaCl2 (56 dias); (D) frutos sujeitos a VI, tratadas com PMEs (56 dias); (E) jujubas subordinadas a VI, com CaCl2 e PMEs (56 dias); Área de varrimento: 5.000μm×5.000μm. Lc: longas cadeias retas; Sc: cadeias curtas; Br: cadeias ramificadas; P: estrutura do polímero. Adaptado de Zhang et al. (2019).
15 anteriores que também existe uma correlação negativa entre concentração de cobre da superfície do bago e a densidade das comunidades bacterianas (Martins et al. , 2012). Embora no passado as leveduras nãoSaccharomyces (NS) tenham sido consideradas de importância secundária ou indesejáveis, atualmente é amplamente aceite que o perfil geral de um vinho pode ser melhorado recorrendo a culturas selecionadas de leveduras NS em associação com S. cerevisiae (Comitini et al. , 2017). Com efeito, além da sua contribuição para a complexidade do aroma do vinho, as leveduras NS podem contribuir positivamente para se obviarem alguns desafios da vinificação moderna, incluindo a redução do volume de etanol do vinho e controlo da sua deterioração (Padilla et al. , 2016; Padilla et al. , 2018). 1.5. Efeito do cálcio na microbiota do bago de uva Além das alterações acima descritas ao nível da fermentação espontânea observadas em mostos produzidos a partir de uvas de videiras tratadas com cálcio, estudos de microscopia eletrónica demonstraram que o tratamento com cálcio produziu alterações na superfície do fruto (Martins et al. , 2020b). Os resultados mostraram que enquanto os bagos controlo apresentam uma superfície rugosa que, possivelmente, favorece a colonização por fungos filamentosos, os bagos de videiras tratadas com cálcio apresentam uma superfície lisa e um menor grau de colonização por fungos filamentosos (Fig. 9). Estes resultados sugerem que a aplicação exógena de cálcio induz alterações na microbiota do fruto. Fig. 9. Microscopia eletrónica da superfície de bagos de uva maduros de plantas controlo (- Ca) ou tratadas com cálcio (+ Ca). Adaptado de Martins et al. (2020b).
16 Estudos muito recentes demonstraram ainda que o tratamento com cálcio nas vinhas modifica o perfil de ceras cuticulares do bago, favorecendo o crescimento de Basidiomicetos (Martins et al., 2021b). 1.6. Hipóteses e objetivos Os resultados acima descritos sobre o efeito do cálcio na firmeza do bago de uva e na redução das microfissuras da película, bem como no perfil fenólico do bago e no perfil volátil de vinhos, abriram caminho a novos projetos de investigação relacionados com o estudo do microbioma do fruto em resposta à aplicação exógena de agroquímicos, bem como ao estudo da diversidade do microbioma em diferentes castas da mesma região vitivinícola (projeto GrapeMicrobiota, FCT PTDC/BAA-AGR/2691/2020). Em particular, no presente trabalho pretendemos validar duas hipóteses: i) além de afetar a composição química do fruto, a aplicação exógena de cálcio modifica a microbiota cultivável do bago de uva e ii) diferentes fatores de stresse abiótico como o cobre, o etanol e o stresse osmótico afetam de forma distinta as espécies cultiváveis isoladas da microflora do fruto. O objetivo do presente trabalho foi, portanto, caracterizar o efeito do Ca na comunidade microbiana cultivável do bago de uva das castas Loureiro e Vinhão da região DOC Vinhos Verdes, relacionando os resultados com as propriedades bioquímicas e moleculares dos frutos, bem como avaliar o efeito de diversos fatores de stresse abiótico nos diferentes isolados da população microbiana. Como referido acima, a identificação de espécies de levedura que colonizam o bago pode conduzir à otimização de inóculos específicos que exponenciem o terroir do vinho, bem como ao desenho de estratégias de biocontrolo de doenças, pelo que o presente trabalho, reveste-se de uma dimensão biotecnológica, para além da sua dimensão científica inovadora.
17 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Tratamentos da vinha e recolha dos bagos de uva Tendo por base o método otimizado por Martins et al . (2020ª,b,c), os ensaios de campo foram realizados em videiras das castas Vinhão e Loureiro localizadas numa vinha comercial da região DOC portuguesa dos “Vinhos Verdes” (coordenadas: latitude N41o28’28’’, longitude W8o34’59’’, 165 m de altitude), no período de frutificação de 2020. Desta forma, a aplicação de cálcio nas videiras foi realizada previamente ao início oficial deste trabalho, em que, uma parcela das vinhas foi pulverizada com uma solução de CaCl2 a 2% (m/v) e Silwet L-77 a 0,1% (v/v), usado como surfactante, e outra parcela foi pulverizada apenas com Silwet L-77 (controlo). No total, foram realizadas 3 aplicações ao longo da fase de frutificação (julho a setembro de 2020), a primeira na fase de bago verde (bago de ervilha, E-L 33; Coombe, 1995), a segunda na fase de pintor (E-L 35) e a última na fase madura (E-L 38), uma semana antes da colheita. Os bagos na fase madura foram colhidos aleatoriamente de 6 videiras de cada casta e tratamento. 2.2. Quantificação de parâmetros bioquímicos-chave do bago de uva: açúcares redutores, compostos fenólicos e antocianinas Os parâmetros bioquímicos foram quantificados em triplicado após maceração dos bagos em azoto líquido e posterior armazenamento a -80 °C até à realização da experiência. A concentração de açúcares redutores foi determinada através do reagente ácido 3,5-dinitrosalicílico, pelo método de Miller (1959), com as modificações descritas em Martins et al . (2021ª), após a extração do conteúdo solúvel de 200 mg de PF em 1,5 mL de água ultrapura. Da mesma forma, os compostos fenólicos totais, foram extraídos de 200 mg de PF com 1 mL de metanol a 100% e quantificados posteriormente pelo protocolo de colorimetria Folin-Ciocalteu (Waterhouse, 2002; Martins et al ., 2018, 2020ª, 2021ª). As antocianinas totais foram quantificadas pelo método do pH diferencial, utilizando o mesmo método de extração descrito para os fenólicos totais (Nicoue et al ., 2007; Martins et al ., 2020ª, 2021ª). Os resultados foram expressos em g kg-1 de PF e analisados estatisticamente com o t-test de Student no Prism®8 (GraphPad Software, Inc.). Nos gráficos de barras, as diferenças significativas foram assinaladas com asteriscos para denotar o nível de significância em comparação com o controlo (sem tratamento): ***, P ≤ 0,001.
18 2.3. Estudo da expressão de genes do metabolismo secundário por PCR em tempo real (qPCR) As reações quantitativas por qPCR foram realizadas em quadriplicado conforme descrito por Martins et al . (2018; 2020a e 2021a), utilizando cDNA previamente preparado através do RNA isolado e purificado dos bagos de uva de plantas controlo ou tratadas com cálcio. A mistura de reação consistiu em 5 μL de Xpert Fast SYBR Master Mix (Grisp Research Solutions), 0,3 µM de cada primer, 1 μL de cDNA e água livre de nucleases, para um volume final de 10 μL. As condições de PCR foram as seguintes: 15 min a 95 °C e 45 ciclos de 15 s a 95 °C, 30 s a 55 °C e 30 s a 72 °C. Foi quantificada a expressão de genes-alvo selecionados de acordo com as diferenças significativas obtidas da análise estatística dos parâmetros bioquímicos-chave do bago de uva, nomeadamente ao nível do metabolismo secundário, utilizando primers específicos: Tabela 2: Genes e respetivos conjuntos de primers usados em qPCR. Abreviação do gene Codificante da: Primers ( forward / reverse ) Autor PAL1 Fenilalanina amónia-liase CCGAACCGAATCAAGGACTG/ GTTCCAGCCACTGAGACAAT Boubakri et al. , 2013 CHS3 Chalcona sintase TCGCATCACAAATAGCGAAC/ CAGGGAAGCTGCCATGTATT Ageorges et al. , 2006 DFR Dihidroflavonol redutase GGCTTTCTAGCGAGAGCGTA/ ACTCTCATTTCCGGCACATT Bogs et al. , 2006 UFGT UDP-Glicose:flavonóide-3O - glucosiltransferase TGCAGGGCCTAACTCACTCT/ GCAGTCGCCTTAGGTAGCAC Conde et al. , 2016 ANS Leucoantocianidina dioxigenase CAACAATGCTAGTGGACAGCTTGAG/ TGGAACGTAGTCGCTTGGTGTCTTA Tavares et al. , 2013 A especificidade das reações de PCR foi confirmada através de curvas de dissociação no final de cada reação qPCR, pelo aquecimento dos produtos de PCR de 65 a 95 °C, em intervalos de 0,5 °C durante 5 s. A expressão dos genes-alvo foi normalizada pela expressão do gene de referência GAPDH codificante da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase ( forward – TTCCGTGTTCCTACTGTTG e reverse – CCTCTGACTCCTCCTTGAT; Gainza-Cortés et al. , 2012), usando o método ΔΔCq no CFX Manager Software 3.1 (Bio-Rad laboratories, Inc.). Os dados foram analisados estatisticamente pelo t-test de Student no Prism®8 (GraphPad Software, Inc.). Nos
19 gráficos de barras, as diferenças significativas foram marcadas com asteriscos para denotar o nível de significância em comparação com o controlo: *, P ≤ 0,05; **, P ≤ 0,01. 2.4. Isolamento da microbiota do bago de uva A recolha da biomassa microbiana foi realizada em três réplicas biológicas constituídas por 20 bagos frescos de plantas controlo ou tratadas com cálcio. Os bagos de uva foram lavados com 100 mL de uma solução isotónica (NaCl 0,9% (m/v)) durante 3 h, com uma agitação de 150 rpm (Mezzasalma et al ., 2017). Foram depois plaqueados 40 µL da solução de lavagem em meio de cultura diferencial Wallerstein (WL) agarizado, suplementado com cloranfenicol a 0,005% (m/v) para inibição do crescimento de bactérias e bifenil 0,02% (v/v) para inibição do crescimento de fungos filamentosos. As placas foram incubadas durante 5 dias à temperatura ambiente. Posteriormente, tipos únicos de colónias de cada condição foram repicados para meio WL fresco, segundo o método de Pallmann et al . (2001). 2.5. Identificação de leveduras Os isolados foram identificados após amplificação por PCR de regiões não conservadas dos internal transcribed spacer (ITS), usando os primers forward ITS1 : 5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'; e reverse ITS4 : 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3' (Stringini et al ., 2008). Para um volume total de 30 µL, as reações de PCR foram realizadas com 15 µL de Master Mix 2x (NZYTech, Lda), 0,45 µL de cada primer (stock a 10 µM) e 14,1 µL de água ultrapura, utilizando cada colónia como molde de DNA. Os ciclos de tempo/temperatura usados no termociclador estão descritos na Tabela 3. Tabela 3: Ciclos de PCR usados para amplificação da região ITS, segundo o método de Stringini et al . (2008). 95 oC 94 oC 55,5 oC 72 oC 72 oC 15 min 30 s 30 s 1 min 10 min X 35 Ativação Desnaturação Annealing Extensão Extensão final
20 As amostras foram posteriormente submetidas a uma eletroforese em gel de agarose 1% (m/v) para confirmar a amplificação da região pretendida. Os produtos de PCR foram purificados, juntando-se 80 µL de isopropanol a 75% (v/v) a 20 µL de produto de PCR, seguido de uma incubação à temperatura ambiente de 15 min. De seguida, as amostras foram centrifugadas a 4500 rpm durante 30 min. Após descartar o sobrenadante, o pellet foi lavado duas vezes com 150 µL de isopropanol a 75% (v/v). Por fim, deixou-se secar o pellet ao ar durante 30 min, à temperatura ambiente. O pellet de DNA foi então ressuspendido em 10 µL de água ultrapura. A concentração de DNA foi estimada através da medição da absorbância a 260 nm, utilizando um NanoDrop . As amostras foram enviadas para sequenciação de Sanger numa empresa especializada, com o primer reverse ITS4 . As espécies de leveduras foram identificadas após fazer Blast das sequências ITS obtidas no programa BLASTN do NCBI e seleção do organismo com melhor ranking (melhor grau de homologia baseado nos valores de query coverage , percentage identity e E value ). 2.6. Efeito de fatores de stresse no crescimento das leveduras O estudo da influência de fatores de stresse no crescimento das leveduras focou-se nas 5 espécies mais abundantes em ambas as castas. Em ensaios independentes, as leveduras foram inoculadas em meio líquido YPD suplementado com cloranfenicol a 0,005% (m/v) e com diferentes concentrações dos seguintes compostos (marca Sigma-Aldrich): 1) CaCl2.2H2O: 0,2; 2; 10; 20 e 40 g L-1, estando o primeiro valor na ordem de grandeza das concentrações de cálcio encontradas nos mostos e vinhos (Martins et al ., 2020c) e o penúltimo correspondendo à concentração da solução de cálcio pulverizada nas vinhas (Martins et al ., 2020a,b,c); 2) etanol (C2H5OH): 3, 6 e 10%, sendo a última percentagem o valor máximo obtido em vinhos da casta Vinhão (Martins et al ., 2020c); 3) CuSO4.5H2O: 250, 500, e 1000 mg L-1, sendo o primeiro valor oito vezes superior ao encontrado em mostos de bagos de uva tratados com calda bordalesa e o último valor vinte vezes inferior ao encontrado na formulação da calda bordalesa (Martins et al ., 2015); 4) PEG6000: 5 , 10 e 20%, correspondente à gama de valores utilizada por Silambarasan et al . (2019) para avaliar stresse osmótico em levedura. Como controlo, as leveduras foram inoculadas também em meio YPD sem suplementação. As culturas foram preparadas em duplicado e a sua D.O.600nm inicial foi ajustada para 0,1. O crescimento foi avaliado através da densidade ótica após incubação durante 14 h a 24 °C, e agitação constante de 200 rpm.
21 Os resultados foram apresentados sob a forma de heat maps , em que, para cada espécie foi calculado o rácio entre a densidade celular (D.O.) na presença do fator de stresse e no controlo. 2.7. Curvas de crescimento em glicose e avaliação da produção de etanol e ácido acético Conforme o método descrito por Silva et al. (2004), as espécies Rhodotorula glutinis , Wickerhamomyces anomalus e Saccharomyces cerevisiae foram cultivadas em frascos Erlenmeyer de 500 mL com 100 mL de meio mineral sintético contendo (NH4)2SO4 0,5% (m/v), KH2PO4 0,5% (m/v), MgSO4.7H2O 0.05% (m/v), CaCl2.2H2O 0,013% (w/v) (meio basal), vitaminas, micronutrientes e glicose 2%. A solução de vitaminas consistiu em biotina 0,001% (m/v), pantotenato de cálcio 0,08% (m/v), inositol 4% (m/v), niacina 0,16% (m/v), piridoxina HCl 0,16% (m/v) e tiamina HCl 0,16% (m/v). A solução de micronutrientes consistiu em H3BO3 0,1% (m/v), KI 0,02% (m/v) e NaMoO4.2H2O 0,04%, CuSO4.5H2O 0,008% (m/v), FeCl3.6H2O 0,04 %, MnSO4.4H2O 0,08% (m/v), ZnSO4.7H2O 0,08% (m/v) e HCl 0,001. As vitaminas e os micronutrientes foram adicionados na proporção de 0,5 mL L-1 de meio. Todas as curvas de crescimento foram realizadas em duplicado, com pH inicial de 4,5, a 24 °C e agitação mecânica a 200 rpm. O crescimento foi monitorizado através de medidas de absorbância a 600 nm (num espectrofotómetro Thermo Sprectronic Genesys 20) para a determinação das taxas especificas de crescimento e dos tempos de duplicação. As concentrações de glicose, etanol e ácido acético no meio de cultura foram quantificadas por HPLC após realizar a desproteinização das amostras com ácido perclórico a 60%, numa proporção de 3:1. O aparelho utilizado foi um cromatógrafo LaChrom Elite -DEMO (Hitachi) com coluna Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%) da Phenomex, mantida a 40 ° C, com 2,5 mM de H2SO4 como fase móvel, a uma taxa de fluxo de 0,5 mL min-1. A concentração de glicose, etanol e ácido acético nas amostras foi determinada através da análise do tempo de retenção e área do respetivo pico dos cromatogramas, por comparação com os cromatogramas de soluções-padrão de glicose (5, 10, 15 e 20 g L-1), etanol (1, 3, 6 e 10% (v/v)) e ácido acético (1, 3, 6 e 10% (v/v)).
22 3. RESULTADOS 3.1. Efeito do cálcio no teor de açúcares redutores, compostos fenólicos e antocianinas totais no bago de uva A análise dos parâmetros bioquímicos mostrou que os bagos de uva da casta Loureiro possuem um maior teor em açúcares redutores do que os bagos da casta Vinhão (239,11 µg mg-1 de PF e 187,55 µg mg-1 de PF, respetivamente). Em contrapartida, os bagos da casta Loureiro apresentaram um menor teor em compostos fenólicos (4,21 µg mg-1 PF) do que os bagos da casta Vinhão (8,76 µg mg-1 PF), não tendo sido detetadas antocianinas na casta branca pelo método de quantificação utilizado (Fig. 10). O tratamento com cálcio nas vinhas durante o desenvolvimento do fruto não afetou significativamente os níveis de açúcares redutores nos bagos de ambas as castas, apesar de ter sido verificado um decréscimo aparente de 15,6% em Loureiro. De igual forma, os fenólicos totais presentes nos bagos de uva não foram significativamente afetados pelo tratamento com cálcio em ambas as castas. O tratamento com cálcio reduziu em 26,7% a concentração de antocianinas totais nos bagos cv. Vinhão.
23 Fig. 10. Parâmetros bioquímicos em bagos de uva maduros de videiras das castas Loureiro e Vinhão pulverizadas com cálcio ou sem tratamento (controlo) durante toda a fase de frutificação. Os resultados indicam a média ± desvio padrão (DP) e as diferenças estatisticamente significativas entre as amostras controlo e tratadas com cálcio estão indicadas com asteriscos: ***, P ≤ 0.001 ( n = 3). Valores abaixo do limite de deteção estão assinalados com n.d. 3.2. Efeito do cálcio na expressão de genes-chave da via de biossíntese das antocianinas Tendo em consideração as diferenças estatisticamente significativas encontradas no teor de antocianinas totais dos bagos de uva cv. Vinhão foi avaliada a expressão de genes chave da via do metabolismo secundário. Os resultados mostraram que, genericamente, o tratamento com cálcio conduziu a uma repressão dos genes estudados, desde o PAL1 , envolvido no primeiro passo do metabolismo secundário até ao UFGT , envolvido no passo limitante da síntese de antocianinas, embora em alguns casos as diferenças não tenham sido estatisticamente significativas (Fig. 11).
24 O gene CHS3 que codifica a enzima chalcona sintase e o DFR codificante da dihidroflavonol redutase foram os mais afetados, sendo a sua expressão reduzida em 15,6 e 23%, respetivamente. Fig. 11. Expressão de genes do metabolismo secundário em bagos de uva maduros de videiras cv. Vinhão pulverizadas com cálcio ou sem tratamento (controlo), durante toda a fase de frutificação. Os níveis de transcritos foram avaliados para os genes codificantes das enzimas fenilalanina amónia-liase ( PAL1 ), chalcona sintase ( CHS3 ), dihidroflavonol redutase ( DFR ), leucoantocianidina dioxigenase ( ANS ) e UDP-glicose: flavonóide-3-O-glucosiltransferase ( UFGT) . A expressão foi normalizada pelos níveis de transcrição do gene de referência GAPDH codificante da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. Os resultados indicam a média ± DP e os asteriscos denotam as diferenças estatisticamente significativas entre as amostras controlo e tratadas com cálcio: *, P ≤ 0.05; **, P ≤ 0.01 ( n = 4). 3.3. Efeito do cálcio na comunidade microbiana cultivável do bago de uva O crescimento da microbiota que coloniza a superfície dos bagos de uva foi analisado após 5 dias de incubação em meio de cultura diferencial WL (Fig. 12). A análise visual das placas mostrou maior abundância de leveduras nos bagos controlo da casta Loureiro do que nos bagos da casta Vinhão. Com efeito, a contagem das colónias confirmou que os bagos controlo da casta Loureiro apresentaram um número de colónias 2,6 vezes superior ao medido em bagos da casta Vinhão (Fig. 13). Observou-se ainda que, em ambas as castas, o tratamento com cálcio diminuiu visivelmente a quantidade de leveduras.
31 3.4. Avaliação do efeito de fatores de stresse no crescimento de diferentes espécies de levedura Foi realizada uma análise in vitro para averiguar o efeito isolado de quatro fatores de stresse no crescimento das 5 espécies de levedura mais abundantes nos bagos de uva das castas Loureiro e Vinhão. Como mostrado na Fig. 17, foram observadas diferenças no grau de tolerância das diferentes espécies a concentrações crescentes de CaCl2, após 14 h de exposição. As espécies W. anomalus e Z. meyerae revelaram ser as mais tolerantes, não sendo o seu crescimento afetado por concentrações de cálcio até 20 g L-1. Para as restantes espécies, verificou-se uma inibição do crescimento de forma dependente da concentração de cálcio, sendo A. pullulans a mais sensível, seguida de H. uvarum e R. glutinis. Na presença de 40 g L-1 de cálcio o crescimento de todas as espécies de levedura foi seriamente comprometido . Fig. 17. Efeito do cálcio no crescimento das 5 espécies de levedura mais abundantes nos bagos de uva das castas Loureiro e Vinhão. Para cada espécie, foi calculado o rácio entre a D.O.600nm na presença do fator de stresse e na sua ausência (controlo), após 14 h de incubação. Os resultados foram representados sob a forma de heat map utilizando a média dos valores obtidos para 2 réplicas biológicas; na escala de cores, o rácio 1,0 refere-se a crescimento idêntico ao verificado na condição controlo (sem tratamento). Relativamente à tolerância das leveduras isoladas ao etanol, os resultados mostraram uma inibição de 66,1 a 92,4% do crescimento das espécies A. pullulans , R. glutinis , Z. meyerae e H. uvarum na presença de 3% de etanol, ocorrendo uma inibição total do crescimento das primeiras
32 três na presença de 6% de etanol (Fig. 18). W. anomalus revelou ser a espécie mais tolerante ao etanol. A concentração de etanol de 10% (valor máximo obtido em vinhos da casta Vinhão; Martins et al ., 2020c) revelou-se como condição extrema para todas espécies selecionadas. Fig. 18. Efeito do etanol no crescimento das 5 espécies de levedura mais abundantes nos bagos de uva das castas Loureiro e Vinhão. Para cada espécie, foi calculado o rácio entre a D.O.600nm na presença do fator de stresse e na sua ausência (controlo), após 14 h de incubação. Os resultados foram representados sob a forma de heat map utilizando a média dos valores obtidos para 2 réplicas biológicas; na escala de cores, o rácio 1,0 refere-se a crescimento idêntico ao verificado na condição controlo (sem tratamento). O efeito do CuSO4 no crescimento de 5 espécies de levedura isoladas do bago é apresentado na Fig. 19. Os resultados mostraram que o crescimento da maioria das espécies não é afetado de forma negativa por concentrações de cobre até 500 mg L-1 (Fig. 19). Ao contrário do crescimento de R. glutinis e Z. meyerae , o crescimento de W. anomalus não foi afetado por concentrações de cobre até 1 g L-1 (valor 20x inferior ao encontrado na formulação da calda bordalesa). A espécie mais sensível ao cobre foi A. pullulans , cujo crescimento foi inibido em 49% nesta concentração, relativamente ao controlo. Ao contrário, o crescimento de H. uvarum foi estimulado na presença de cobre, em qualquer das concentrações testadas.
33 Fig. 19. Efeito do cobre no crescimento das 5 espécies de levedura mais abundantes nos bagos de uva das castas Loureiro e Vinhão. Para cada espécie, foi calculado o rácio entre a D.O.600nm na presença do fator de stresse e na sua ausência (controlo), após 14 h de incubação. Os resultados foram representados sob a forma de heat map utilizando a média dos valores obtidos para 2 réplicas biológicas; na escala de cores, o rácio 1,0 refere-se a crescimento idêntico ao verificado na condição controlo (sem tratamento). A Fig. 20 mostra o efeito do PEG6000 no crescimento das leveduras isoladas do bago, onde se pretendeu estudar o efeito do stresse osmótico. Os resultados mostraram uma forte inibição do crescimento de A. pullulans em concentrações de PEG a partir de 5% (redução em 75,8%). Em contrapartida, o crescimento da espécie R. glutinis não foi afetado pelo PEG. As restantes taxa estudadas exibiram uma diminuição gradual no crescimento com o aumento da pressão osmótica do meio de cultura.
34 Fig. 20. Efeito do PEG6000 no crescimento das 5 espécies de levedura mais abundantes nos bagos de uva das castas Loureiro e Vinhão. Para cada espécie, foi calculado o rácio entre a D.O.600nm na presença do fator de stresse e na sua ausência (controlo), após 14 h de incubação. Os resultados foram representados sob a forma de heat map utilizando a média dos valores obtidos para 2 réplicas biológicas; na escala de cores, o rácio 1,0 refere-se a crescimento idêntico ao verificado na condição controlo (sem tratamento). 3.5. Perfil de crescimento de espécies de levedura selecionadas O perfil de crescimento das espécies R. glutinis e W. anomalus foi avaliado em detalhe com vista a aferir o seu potencial biotecnológico. Para efeitos comparativos, foi também estudado o perfil de crescimento de S. cerevisiae (isolada de bagos de uva em estudos anteriores), por ser um modelo biológico de eleição em estudos de fermentação alcoólica (Fig. 21). O padrão de crescimento celular de R. glutinis e W. anomalus em meio mineral com glicose foi semelhante. As espécies apresentaram taxas específicas de crescimento (µ) de 0,561 e 0,629 h-1, respetivamente, e tempos de duplicação (Td) de 1,236 e 1,102 h, respetivamente. A levedura S. cerevisiae apresentou um valor de µ substancialmente mais baixo (0,332 h-1) e um Td de 2,088 h.
35 A capacidade fermentativa de W. anomalus foi comparada com a de S. cerevisiae , pela quantificação de etanol e de ácido acético no meio de cultura. S. cerevisiae exibiu maior capacidade fermentativa, tendo-se observado um pico máximo de etanol às 23 h após inoculação. A concentração de etanol produzida por W. anomalus foi inferior à concentração produzida por S. cerevisiae . Em paralelo, foi observada a produção de ácido acético durante o crescimento de W. anomalus , com um valor máximo de 0,041% observado às 39 h. Fig. 21. Avaliação do crescimento celular, consumo de glicose, produção de etanol e de ácido acético de R. glutinis, W. anomalus e S. cerevisiae , a 24 °C em meio mineral suplementado com 2% de glicose como fonte única de carbono, e pH 4,5. Os resultados representam a média ± DP de valores obtidos para 2 réplicas biológicas.
36 4. DISCUSSÃO 4.1. O cálcio diminui a acumulação de antocianinas no bago de uva, sem afetar níveis de açúcares e fenólicos totais Como já mencionado ao longo desta dissertação, o cálcio é um mensageiro secundário intracelular, desempenhando papéis importantes na regulação de vários processos celulares essenciais (Tuteja e Mahajan, 2007). Desta forma, foram esperadas modificações metabólicas que afetam a qualidade do fruto com a suplementação de cálcio. Neste estudo foram detetadas antocianinas nos bagos cv. Vinhão, mas não nos bagos cv. Loureiro, estando em conformidade com estudos anteriores que relataram a ausência destes pigmentos em variedades brancas (Boss et al ., 1996). No entanto, estudos recentes de Martins et al . (2021b) reportaram a deteção de antocianinas em bagos cv. Loureiro, através do método de quantificação de elevada sensibilidade UPLC-MS. O estudo revelou ainda que a diversidade destes pigmentos é semelhante tanto nas variedades de uvas brancas como nas tintas. Em outros estudos também recorrendo a métodos cromatográficos de elevada sensibilidade, foram detetados níveis residuais de antocianinas em uvas de castas brancas, incluindo “Chardonnay”, “Sauvignon Blanc”, “Riesling”, “Pinot Blanc” e “Muscat Blanc” (Arapitsas et al ., 2015; Niu et al ., 2017). O efeito inibitório do cálcio sobre os níveis de antocianinas observado no presente trabalho em bagos da casta Vinhão corrobora estudos anteriores e é consistente com a regulação negativa dos genes ANS e UFGT (Martins et al ., 2020a, 2021b). Com efeito, em suspensões celulares de bago de uva, níveis elevados de cálcio no meio de cultura induziram repressão das vias de biossíntese das antocianinas, tanto a nível da transcrição como ao nível da atividade de enzimas chave (Martins et al ., 2018). Um estudo recente conduzido no nosso grupo de investigação (Martins et al . 2020a), mostrou ainda que o efeito do cálcio nos níveis totais de compostos fenólicos pode variar de acordo com o ano de colheita, estando os resultados do presente trabalho de acordo com o observado no ano de 2018 em vinhas da casta Vinhão. Os resultados referentes ao teor de açúcares mostraram que a aplicação de suplementos de cálcio não afetou significativamente a acumulação destes solutos, corroborando resultados anteriores em bagos cv. Vinhão (Martins et al . 2020a). No entanto, a tendência de decréscimo observada em bagos cv. Loureiro está de acordo com uma pesquisa recente nesta variedade, em que foi demonstrado que o cálcio atrasa o processo de maturação dos frutos, diminuindo o conteúdo em açúcares e o tamanho dos frutos na fase madura (Martins et al ., 2021b). No presente
37 trabalho, a maior concentração de açúcares redutores medida nos bagos da casta Loureiro do que nos bagos da casta Vinhão pode explicar a maior abundância de microbiota na primeira casta, discutida nas secções seguintes. 4.2. As espécies H. uvarum e A. pullulans prevalecem na comunidade microbiana cultivável dos bagos de uva Loureiro e Vinhão, enquanto que S. cerevisiae não é detetável Para o presente estudo foi adotada uma metodologia de identificação de leveduras cultiváveis baseada na sequenciação de Sanger, que se revelou útil dada a possibilidade de preservar em laboratório várias espécies relevantes do ponto de vista enológico e de melhor estudar o seu fenótipo. Em contrapartida, este método apresenta limitações, visto que apenas permite o estudo de espécies cultiváveis in vitro , que representam uma pequena percentagem da microbiota total do bago. Com efeito, as técnicas de NGS – next generation sequencing – permitem a caracterização extensiva das comunidades microbianas a partir da extração do DNA da microbiota total dos bagos de uva (Mezzasalma et al ., 2017). Estes estudos incluem a construção de duas bibliotecas de DNA, uma para fungos e outra para bactérias, e a sequenciação das regiões ITS e 16S, respetivamente. Este método permite obter uma lista de todas as espécies presentes, incluindo as menos abundantes e as que não são cultiváveis. No entanto, no contexto do presente trabalho, o estudo das espécies cultiváveis foi prioritário, uma vez que permitiu contribuir para a construção de um catálogo das estirpes de cada casta com potencial utilização na produção de vinhos regionais, em linha com os objetivos do projeto GrapeMicrobiota (FCT - PTDC/BAAAGR/2691/2020). No presente trabalho, verificou-se que a espécie Hanseniaspora uvarum é a taxa dominante nos bagos de uva da casta Loureiro (90%) e a terceira mais abundante em bagos da casta Vinhão, em linha com estudos anteriores (Fleet 2003; Kántor et al ., 2017). No entanto, estes estudos mostraram que o género Metschnikowia sp . é dos isolados mais comuns, representando até 38% da microbiota cultivável, o que não se verificou no presente estudo, visto que este género apenas está presente nos bagos de uva cv. Loureiro em percentagens muito menores (1,2%). Os resultados mostraram ainda que Aureobasidium pullulans constituiu a taxa dominante nos bagos da casta Vinhão, expostos ao mesmo microclima, juntamente com Rhodotorula glutinis . A. pullulans detém uma posição dominante na maioria dos terroirs de videira estudados, sendo classificada como uma espécie facilmente controlável, sem capacidade de deteriorar o vinho,
38 quando boas práticas de produção são aplicadas (Barata et al. , 2012; Bozoudi e Tsaltas, 2018), ostentado assim uma notável significância tecnológica. Apesar da possibilidade do seu isolamento em bagos de uva maduras, esta taxa é predominante, nas primeiras fases de maturação, juntamente com as espécies: Rhodotorula , Cryptococcus e Candida (Fleet, 2003). No seu conjunto, os resultados do presente estudo confirmam que a casta tem uma influência considerável na microbiota cultivável do bago de uva. As interações entre os microrganismos que colonizam os bagos de uva ainda estão muito pouco estudadas, no entanto, vários fatores podem afetar a composição da microbiota do bago e, consequente, a abundância relativa de cada espécie, incluindo a região geográfica, as condições edafoclimáticas, o grau de maturação dos frutos e os tratamentos fitossanitários (Fleet, 2003; Barata et al . 2012). Entre as leveduras menos abundantes no fruto, identificadas no presente estudo, encontram-se W. anomalus , T. coremiiforme e Z. meyerae , sendo esta última também a menos abundante em estudos anteriores (Cabañas et al . 2020). Ainda a respeito de Metschnikowia sp., no presente trabalho não foi possível fazer uma identificação ao nível da espécie, uma vez que foram obtidos valores invulgares de E value na sua identificação por Blast , sugerindo que a sequência ITS da espécie isolada não está ainda anotada no NCBI . Neste contexto a sequenciação de outra região do genoma desta estirpe poderá ser útil. Desde os trabalhos de Pasteur (1872), em finais do século XIX, uma grande quantidade de informação foi recolhida sobre a disseminação das leveduras em ambientes associados ao vinho, mas a evolução da microbiota do bago para o vinho ainda não foi totalmente compreendida (Vaughan-Martini e Martini, 1995). O foco principal tem sido S. cerevisiae dada a sua relevância na fermentação alcoólica. No presente trabalho, foi observado que Saccharomyces spp. não incorpora o conjunto de taxas detetáveis na superfície dos bagos de uva, o que está de acordo com estudos anteriores focados na microbiota cultivável (Barata et al ., 2012) e na microbiota total pelo método de NGS (Martins et al . 2021c). Foi ainda estimado que S. cerevisiae apenas é detetável em cerca de um em mil bagos de uva. A possibilidade de correntes de ar transportarem gotículas de espuma rica em S. cerevisiae do topo dos fermentadores das adegas vinícolas é diminuta (Mortimer e Polsinelli, 1999). No entanto, práticas vitivinícolas como a aplicação de borras de vinho nas vinhas como método fertilizante podem ser uma das formas de disseminação desta levedura (Clavijo et al ., 2010). Tendo sido concluído que esta taxa não é um contaminante do ar, estudos apontam que esta espécie necessite de um vetor para colonizar os bagos de uva, incluindo insetos disseminadores no ambiente vitivinícola, como abelhas ( Apis sp.), vespas
39 ( Vespa sp.) e moscas ( Drosophila sp.) (Stević, 1963; Lachance et al ., 1995). Por outro lado, a possibilidade de S. cerevisiae estar presente em equipamentos vinícolas como trituradores, bombas, tubos ou tanques de fermentação pode explicar a sua incorporação na flora de fermentação (Mortimer e Polsinelli, 1999). Dependendo dos procedimentos de limpeza aplicados nos locais onde ocorrem os processos de vinificação, leveduras fermentativas como a S. cerevisiae poderão ser encontradas ainda nas paredes das adegas (Martini, 1993; Martini et al ., 1996). Outros estudos sugerem que algumas espécies de levedura como Metschnikowia pulcherrima competem com S. cerevisiae , inibindo o seu crescimento (Nguyen e Panon, 1998), o que pode explicar a dificuldade de deteção deste taxa nos bagos de uva. 4.3. O cálcio diminui a abundância de leveduras na superfície do bago de uva, afetando diferentes espécies de forma dependente da casta No presente estudo, a aplicação de CaCl2 nas vinhas ao longo da época de frutificação resultou na diminuição da quantidade total de leveduras na superfície dos bagos de uva de ambas as castas. Estudos de microscopia eletrónica de varrimento (Martins et al. , 2020b), mostraram que o tratamento com cálcio inibe a colonização da superfície do bago por fungos filamentosos. Estes resultados indicam que o cálcio poderá ter potencial aplicabilidade como fungicida, de acordo com estudos preliminares (Romanazzi et al . 2012; Martins et al ., 2021b). No presente trabalho, verificou-se que o tratamento com cálcio afeta fortemente as espécies mais abundantes nos bagos: a abundância relativa de H. uvarum diminuiu substancialmente nos bagos cv. Loureiro, sendo substituída por A. pullulans . O efeito inverso foi observado em bagos cv. Vinhão. Estes resultados evidenciam um claro efeito antagonista entre as espécies A. pullulans e H. uvarum . O efeito diferencial do tratamento com cálcio dependente da casta foi também observado ao nível de outras espécies como R. glutinis , consistente com a existência de relações estreitas entre as diferentes espécies da microbiota do bago que deverão ser alvo de investigação em estudos futuros. Como já referido em secções anteriores, a composição da comunidade de leveduras do bago de uva depende de fatores como temperatura, tipo de solo, precipitação, presença de insetos, tratamentos fitossanitários, entre outros (Kántor et al ., 2017). Por exemplo, foi observado que Aureobasidium spp. e H. uvarum evidenciavam uma abundância relativa equivalente, embora as suas proporções variassem dependendo do sistema de cultivo e da localização/zonas climáticas de origem (Cachón et al ., 2019). Uma vez que todo o material biológico recolhido no presente trabalho foi exposto ao mesmo microclima, este fenómeno apenas poderá ser explicado pela
40 diferença na composição dos bagos cv. Vinhão e Loureiro. Com efeito, estudos recentes do nosso grupo de investigação reportaram que o tratamento com cálcio afeta de forma diferencial o perfil metabólico das ceras presentes na cutícula dos bagos de cada casta (Martins et al . 2021b), podendo este efeito estar relacionado com a diferente composição da microbiota superficial, uma vez que muitos dos compostos das ceras são substratos das leveduras. Ao nível molecular, foi observado que o cálcio inibe a expressão dos genes CER9 e CYP15 que regulam a formação de ceras e a biossíntese da cutícula do bago de uva (Martins et al ., 2020b), o que pode afetar diretamente a síntese de cutina, a composição das ceras e a supressão da transpiração, conforme descrito em mutantes de Arabidopsis (Lü et al ., 2012; Martins et al ., 2021c). Adicionalmente, modificações dos níveis de compostos polifenólicos e das propriedades antioxidantes dos frutos podem também explicar as diferenças observadas pelo tratamento com cálcio (Martins et al . 2021a). Por exemplo, foi reportado que o cálcio induz a expressão do gene STS em ambas as castas, resultando, no entanto, na acumulação preferencial de diferentes estilbenóides em cada casta, sendo o Eresveratrol mais acumulado em bagos cv. Vinhão e E - piceid em bagos cv. Loureiro (Martins et al ., 2020a, 2021b). Outras diferenças ao nível da composição química do bago podem também explicar os resultados observados e deverão ser exploradas em estudos futuros. Nos ensaios realizados no presente estudo com as espécies isoladas sujeitas a fatores de stresse específicos, foi possível concluir que H. uvarum e A. pullulans são as mais sensíveis ao tratamento com cálcio, reforçando que a conjugação de outros fatores in vivo determina a abundância relativa de cada espécie. Estes resultados são relevantes do ponto de vista enológico, visto que A. pullulans contribui para o perfil aromático do vinho com aromas típicos associados ao ácido 2-metilbutírico, ao 3-metil-1-butanol e ao octanoato (Bozoudi e Tsaltas, 2018; Verginer et al. , 2010). Por outro lado, as espécies ascomicetas oxidativas, fracamente fermentativas ou fermentativas ( Candida spp., Metschnikowia sp., Pichia spp.), incluindo a H. uvarum , estão presentes nas etapas de pré-fermentação ou início de fermentação, mas são consideradas contaminantes ou deterioradoras (Barata et al ., 2012). Os resultados do presente estudo podem também ter relevância ao nível biotecnológico, uma vez que já foi confirmada a eficácia de A. pullulans como agente de biocontrolo contra podridões pós-colheita (Schena et al. , 2003). A atividade antagonista de H. uvarum face ao fungo Botrytis cinerea torna-a um ótimo agente de biocontrolo para a doença da podridão cinzenta (Qin et al ., 2015). Estas e outras doenças póscolheita são tipicamente controladas por aplicações rotineiras de fungicidas químicos sintéticos
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