Correlación y validación de criterios diagnósticos y escala de severidad en la insuficiencia limbar asistida con microscopia confocal

TESIS DOCTORAL CORRELACIÓN Y VALIDACIÓN DE CRITERIOS DIAGNÓSTICOS Y ESCALA DE SEVERIDAD EN LA INSUFICIENCIA LIMBAR ASISTIDA CON MICROSCOPÍA CONFOCAL DOCTORANDO: Manuel Caro Magdaleno DIRECTOR: Dr. D. Jesús Montero Iruzubieta CODIRECTORES: Dr.D. Enrique Rodríguez de la Rúa Franch Dr. D. Eduardo Esteban González UNIVERSIDAD DE SEVILLA DEPARTAMENTO DE CIRUGÍA SEVILLA, 2015! “Las cosas bien hechas, Dios las bendice” Antonio Caro Silva A mi “Yaya”, por toda su sapiencia e ilusión, espero que te sientas orgulloso de mi, estés donde estés. Q.e.p.d. AGRADECIMIENTOS El orden de los factores no altera el producto, eso me decían en la escuela de la que nunca saldré. Dicho ésto, no puedo más que empezar por los que estructuraron con amor y sudor mi “corazón”, mis valores y mi propia alma, como son mis queridos Padres -en mayúsculasy a las dueñas de él, mis dos niñas, mi mujer, Anabel y mi hija Daniela. A “ellas” les debo disculpas por tanto tiempo robado, que no perdido, y que han soportado estoicamente con paciencia. Esta tesis, me ha servido, para cosas tan importantes como para marcarme la senda que quiero recorrer en mi vida profesional, ya que mi amor por la córnea, la superficie ocular y la investigación, tras este esfuerzo ha sido el acicate que faltaba. Además, ha ordenado esta “cabecita mía” en el bonito y difícil arte de investigar, en la medida de mis capacidades para empezar a dar mis primeros pasos de lo que espero, sea un largo camino, ya que tengo lo que más hace falta, pasión por ellas. A Jesús Montero le debo tanto que no sé si sabré explicarlo. La primera cosa que le debo y al hilo de lo comentado anteriormente, es que me ha inculcado ese amor que tiene él por la córnea y aunque mi empeño ya era grande, lo ha “hipertrofiado”. Cuando le dije que si me ayudaba con la tesis no sabía realmente como era, tampoco lo conocía tanto. Es de esas personas que saben como eres a los tres minutos de hablar contigo, que saben exprimirte para que lo des todo y si ven entrega también lo entregan todo. Me ha abierto, literalmente las puertas de su casa, nunca ha dejado de trabajar a mi lado y cuando en varios momentos el cielo se puso oscuro sobre la tesis supo encender un faro, siempre con un pragmatismo que me dejaba boquiabierto. ¡Ay, el primer día que pude localizar, ver y fotografiar una cripta limbar! Casi se me saltan las lágrimas. Una cosa que me sorprendió sobremanera, es que a pesar de ese “nervio” que le caracteriza, inquietud en estado puro, ha sido capaz de escucharme día tras día, las miles de dudas que me surgían, con entrega y paciencia a pesar de que eran las ocho y media de la tarde y se había pegado todo el día currando al cien por ciento. En esta tesis no he perdido nada como dije, pero si he ganado mucho, y lo más importante, un amigo y un maestro. Gracias por todo eso y más. A Enrique Rodríguez de la Rúa, le debo el entusiasmo que le imprime a las personas, te hace creer que eres capaz de todo, te ilusiona, “te pone en el candelero” y esa es una virtud insólita y generosa. Lo peor de todo, es que cree en ti de verdad y te pone en el aprieto de darlo todo para no defraudarlo. El apoyo que he sentido es inconmensurable, y como un tutor a un naranjo, me iba dirigiendo para que “no me diluyera”. Muchas gracias, Enrique. A Eduardo, le debo la alegría y ser un luchador, además de un buen “sevillista” de pro. Generoso como ninguno, “gadita” bueno, que lleva la bandera del buen humor y la concordia como lema. La verdad es que he tenido tanta suerte con mis directores que no me la merezco. A Ana Fernández, mi estadística de cabecera, porque es una madre incluso para los que no somos sus hijos, es cariñosa, generosa y cumplidora a la par. Nunca te falla. A ella le debo parte de este trabajo. A Ignacio Montero y Rafael Márquez le debo la ilusión por seguir los pasos hasta terminar la tesis y llenarme de ilusión por hacerla, que no es poco. Ignacio me ha guiado desde que era residente por el mundo oftalmológico, y con acierto. Aunque se que su ayuda es totalmente desinteresada, tengo claro que será una ayuda que jamás podré devolver. Gracias Ignacio por estar siempre ahí. A Asun, por su gran ayuda, colaboración y facilitarme las cosas, incluso cuando estaba “muy embarazada”. A Manu Castillo por su esfuerzo. A mis compañeros y amigos por apoyarme, darme ánimos, facilitarme la ardua tarea, en especial, Ana Muñoz, Beatriz Mataix y Juan Ramón del Trigo. Ana, mi residente mayor, la persona más pragmática y lista que conocí, una suerte de amiga, que me ha animado, ayudado, sine die. Juan Ramón un maestro de los que extraje y seguiré haciéndolo, sabios consejos en mi vida profesional, buena persona sin igual y aunque sea un poco “verderón”, se lo perdono. Beatriz, una gran compañera, que siempre que la llamé ahí estuvo, animándome, fiel compañera de “fatiguitas”. Para mis compañeros de la Unidad de Superficie Ocular de Sevilla(USOS), mil gracias por vuestros ánimos. Se abre un mundo de posibilidades y de retos en este tiempo, en el cual mejorar nuestros conocimientos y nuestras prácticas en pro de nuestros pacientes, esos que nos rondan la cabeza intempestivamente, en la continua búsqueda de la excelencia corneal. No se me ocurre nada mejor que hacerlo con vosotros, compañeros y amigos. A mi querido equipo de Cartujavisión, Ángela, Eli, Candela y Lola, me habéis facilitado tanto el trabajo que casi ni me daba cuenta que estaba encerrado contando células en pleno agosto. Sois cariñosas y eficientes a la par. Cada vez que llego sólo hay sonrisas y abrazos, así da gusto Al Ingeniero Carlos Rueda, amigo mío, que en un momento de atasco “vital” con la tesis, me hizo la luz con su esfuerzo y sacrificio, prestando su mano cuando más lo necesité. A mi administrativa de cabecera que de forma desinteresada me ha ayudado a localizar a tantos pacientes y tantas citas, Pilarcita. Al equipo de San Lázaro que son las mejores, Julia, Joaqui, Loli y Pilar, que haría yo sin vosotras, mis manos y mis pies. Gracias. A mis queridos residentes que tanto me han apoyado y animado. Por su ayuda en esta tesis a Consu, Agua, Ainhoa, Sybe, Rafa, Ana y Belén. Tengo que dar un especial agradecimiento por su ayuda a Consu, siempre de buen ánimo y además, agradecer sus magníficas ilustraciones. A Manolo Ales, por su desinteresada ayuda en la edición de esta tesis y su prestancia sin igual, un amigo que he ganado. ¡Viva la Pastora! A mis jefes, Beatriz Ponte y Enrique, por apoyarme y ayudarme en tantas gestiones que sin ellas hubiera sido imposible culminar varios puntos de esta tesis. De mis maestros del Hospital Virgen del Rocío, Javier Arriaga, Juan Ramón del Trigo, Trini Rueda, Antonio Medina, Emilia García Robles, Aurora del Estad, Amparo Toro, Fernanda Aranda, Rafa Luchena, Norberto Seva, y tantos otros, debo parte del amor que siento por mi profesión y el empeño en mejorar día tras día. A mis compañeros del Macarena, por mi aprendizaje real “en campo abierto” en esta bonita profesión, por su ayuda, su buen hacer y su ánimo para realizar esta tesis. A mis amigos, por compartir tan grandes momentos y ser un buen hombro donde apoyarse. En especial, a Salva por darme ideas tan buenas y ayudarme en esta tesis. Un “Grande” de la medicina. ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1.- Densidad celular del epitelio corneal en personas sanas………………………….53 Tabla 2.-Densidad celular del epitelio corneal y nervios del plexo subasal en pacientes con IL……………………………………………………………………………………………54 Tabla 3.- Densidad de nervios del plexo subasal en sanos………………………………….54 Tabla 4.- Valores de Q (asfericidad)………………………………………………………..78 Tabla 5.- Causas de insuficiencia del limbo y su frecuencia relativa………………………90 Tabla 6.- Estadiaje preoperatorio de Schwartz-Holland……………………………………90 Tabla 7.- Clasificación de la insuficiencia de limbo………………………………………..92 Tabla 8.- Clasificación de los procedimientos quirúrgicos para la rehabilitación de la superficie ocular (“Cornea Society”)……………………………………………………….99 Tabla 9.- Clasificación de los procedimientos quirúrgicos para la rehabilitación de la superficie ocular basados en ingeniería titular (“Cornea Society”)……………………..…100 Tabla 10.- Criterios de subdivisión de pannus para analizar el comportamiento de las variables estudiadas………………………………………………………………………..150 Tabla 11.- Valores de referencia del índice de concordancia Kappa y el coeficiente de correlación intraclase………………………………………………………………………152 Tabla 12.-Causas de insuficiencia de limbo en nuestro estudio expresadas en porcentajes.161 Tabla 13.- Descriptiva general de nuestra muestra………………………………..………163 16 Tabla 14.- Resultados de la encuesta de VFQ 25 y OSDI autocumplimentado en nuestra muestra……………………………………………………………………………………162 Tabla 15.- Porcentaje de pacientes en cada estadio según las diferentes clasificaciones…164 Tabla 16.- Densidad de nervios del plexo subasal, densidad celular corneal y otras variables de interés con su significación estadística(p) entre grupos divididos según diferentes estadios de avance del pannus………………………………………………………………………166 Tabla 17.- Variables con diferencia estadísticamente significativa entre grupos divididos según diferentes estadios de avance del pannus…………………………………………..167 Tabla 18.- Índice Kappa de concordancia entre las distintas clasificaciones basadas en signos y síntomas con respecto a la clasificación confocal de Deng……………………………..169 Tabla 19.- Comparativa de medias de densidad de nervios del plexo nervioso subasal corneal de los pacientes con IL de nuestra muestra con respecto a valores de referencia de personas sanas y nuestros controles……………………………………………………….171 Tabla 20.- Comparativa de medias de densidades celulares de nuestra muestra de los casos de IL con los datos de referencia en sanos y nuestros controles…………………………..171 Tabla 21.- Clasificación confocal de Deng modificada…………………………….……..173 Tabla 22.- Variables con diferencias estadísticamente significativas entre los grupos con(grupo A) /sin(grupo B) visualización del plexo nervioso…………………………….174 17 18 I.INTRODUCCIÓN I. INTRODUCCIÓN I.1. DEFINICIONES, HALLAZGOS HISTÓRICOS Y ANATOMÍA DEL LIMBO ESCLEROCORNEAL Y LAS CÉLULAS MADRE LIMBARES I.2. HISTOLOGÍA Y MARCADORES INMUNOHISTOQUÍMICOS DEL LIMBO ESCLEROCORNEAL I.3. SÍNTOMAS Y SIGNOS CLÍNICOS DE LA INSUFICIENCIA LIMBAR I.4. CRITERIOS Y PRUEBAS DIAGNÓSTICAS DE LA INSUFICIENCIA LIMBAR I.4.1. BIOPSIA EXCISIONAL I.4.2. CITOLOGÍA DE IMPRESIÓN I.4.3. RT-PCR MUC5AC (LIMBOKIT®) I.5. MICROSCOPÍA CONFOCAL IN VIVO (IVCM) I.5.1. INTRODUCCIÓN E HISTORIA I.5.2. COMPONENTES DE UN MICROSCOPIO CONFOCAL I.5.3. TIPOS DE MICROSCOPIOS CONFOCALES I.5.4. MANEJO DEL HRT-II CON EL MÓDULO DE CÓRNEA ROSTOCK I.5.5. APLICABILIDAD I.5.6. LA SUPERFICIE CORNEAL VISTA DESDE UN MICROSCOPIO CONFOCAL I.5.7. NERVIOS CORNEALES:UN NUEVO MUNDO POR DESCUBRIR. I.5.8. TECNOLOGÍA 3D CONFOCAL MICROSCOPY THROUGH-FOCUSING (CMTF) I.5.9. OTRAS APLICACIONES EN OFTALMOLOGÍA I.5.10. USOS NO OFTALMOLÓGICOS DE LA MICROSCOPÍA CONFOCAL I.6. PENTACAM I.6.1. APLICACIÓN DEL PENTACAM® EN PATOLOGÍA CORNEAL I.7. KERATOGRAPH 5M I.8. CLASIFICACIONES DE LA INSUFICIENCIA DE LIMBO I.9. TRATAMIENTO DE LA INSUFICIENCIA DE LIMBO I.9.1. TRATAMIENTO MÉDICO Y CONSIDERACIONES PREVIAS AL TRATAMIENTO QUIRÚRGICO 19 I.INTRODUCCIÓN I.9.1.1. PRINCIPIOS GENERALES I.9.1.2. SUERO AUTÓLOGO I.9.1.3. MEMBRANA AMNIÓTICA I.9.2. TRATAMIENTO QUIRÚRGICO I.9.2.1. HISTORIA DEL TRASPLANTE LIMBAR I.9.2.2. ESQUEMA GENERAL DEL TRATAMIENTO QUIRÚRGICO I.9.2.3. EPITELIECTOMÍA SECTORIAL CONJUNTIVAL SECUENCIAL I.9.2.4. AUTOTRASPLANTE LIMBAR Y TRASPLANTE LIMBAR DE DONANTE VIVO HISTOCOMPATIBLE I.9.2.5. ALOTRASPLANTE LIMBAR DE DONANTE CADÁVER I.9.3. CULTIVO CELULAR EX VIVO PARA TRASPLANTE EN INSUFICIENCIA DE LIMBO I.9.3.1. CULTIVO EX VIVO DE CÉLULAS LIMBARES I.9.3.2. CULTIVO EX VIVO DE CÉLULAS EPITELIALES DE LA MUCOSA ORAL AUTÓLOGA I.9.3.3. CULTIVO EX VIVO DE CÉLULAS CONJUNTIVALES AUTÓLOGAS I.9.3.4. CULTIVO EX VIVO DE CÉLULAS MESENQUIMALES I.10. SITUACIÓN ACTUAL 20 I.INTRODUCCIÓN I.1. DEFINICIONES, HALLAZGOS HISTÓRICOS Y ANATOMÍA DEL LIMBO ESCLEROCORNEAL Y LAS CÉLULAS MADRE LIMBARES La Insuficiencia limbar (IL), o su término en inglés, limbal stem cell deficiency (LSCD), ha sido definida como la incapacidad de las células madre limbares de mantener la integridad del epitelio corneal(1). Esto puede ocurrir por: •Microambiente estromal insuficiente para mantener la homeostasis de dichas células que lleva a la disfunción y destrucción progresiva de estas células. •Ausencia de nicho donde se alojen, nutran y protejan las células madre limbares de agentes mecánicos, radiaciones, etc. Esto ocurre v.g., en la aniridia. •Factores externos que destruyan las células madre de forma parcial o total: agresiones químicas o térmicas, radiaciones ultravioletas o ionizantes, enfermedades mucosinequiantes, cirugías, crioterapia, fármacos, lentes de contacto o infecciones, entre otros. La Insuficiencia se denomina a veces como “limbar” y otras, como “límbica”. De igual manera, este adjetivo hace mención sólo a la localización, que no es sino el limbo esclerocorneal. Tras consultar con la Real Academia Española, contestan que se puede denominar de igual forma con estos dos adjetivos. Al respecto de este tema la RAE refiere y con ello introducimos sus definiciones: “En relación con su consulta, le remitimos la siguiente información: 21 I.INTRODUCCIÓN Se trata de voces técnicas, del ámbito de la anatomía. El DRAE solo recoge las más usuales, pues se considera que han pasado al léxico general de los hablantes. Sí las trae el Diccionario de términos médicos de la Real Academia Nacional de Medicina: limbo esclerocorneal [ingl. corneoscleral junction] 1 [TA: limbus corneae] Zona circular de superposición entre la córnea y la esclerótica y, también, entre la córnea y la conjuntiva ocular, definida sobre la superficie del globo ocular por el surco esclerocorneal. SIN.: limbo corneal, limbo corneoescleral. OBS.: Con frecuencia abreviado a "limbo". limbar [ingl. limbic] 1 adj. Del limbo esclerocorneal o relacionado con él. SIN.: límbico. límbico, -ca 1 adj. = limbar. 2 [ingl. limbic] adj. Del sistema límbico o relacionado con él.” Estas células troncales, madre, primordiales o germinales derivan del término anglosajón “Stem Cell”(SC). El término “stem” proviene de la botánica, denominando con este nombre a las células localizadas en el inicio de los brotes de las plantas(2). Las stem cell se definen como células indiferenciadas o poco diferenciadas que tienen la capacidad de autorregenerarse y diferenciarse en uno o más tipos celulares (“stemness”). La primera evidencia científica de la existencia de las stem cell se encontró en las células madre hematopoyéticas de la médula ósea de los ratones en 1960. En MeSH (Medical Subject Headings) se introdujo el término de “células madre hematopoyéticas” en 1972 y el de “stem cell” en 1984(3). Aun hoy, “limbal stem cell deficiency” no aparece en MeSH. 22 I.INTRODUCCIÓN Se pueden extraer stem cells hematopoyéticas y mesenquimales del cordón umbilical y de la placenta con métodos no invasivos, libres de consideraciones éticas relacionadas con la obtención de tejidos embrionarios y de fácil obtención. De estas células se pueden obtener osteoblastos, condroblastos, adipolastos, precursores de músculo esquelético y neurales con baja capacidad antigénica y menor posibilidad de rechazo. Las stem cells embrionarias expresan bajos niveles de antígenos de histocompatibilidad MHC clase I y generalmente no expresan los de clase II (3). Existe la posibilidad de rechazo por proteínas relacionadas con las mitocondrias, pero el número de éstas son relativamente bajos como para producir una respuesta inmunológica importante. El limbo esclerocorneal es una estructura que se sitúa entre la córnea transparente y la esclera blanca siendo una transición y a la vez, barrera física, entre dos epitelios con características bioquímicas y fenotípicas diferentes (4). Algunos la delimitan anteriormente en el final de la capa de Bowman (5). Éste mide aproximadamente unos dos milímetros de ancho aproximadamente y en él se disponen unas crestas dispuestas de forma radial al centro corneal por donde discurren vasos sanguíneos, fibras nerviosas y a las que se denominan empalizadas de Vogt (6)(figura 1). Las empalizadas de Vogt fueron descritas por primera vez por Manz en cerdos en 1859 y postuló que tenían una función glandular (7, 8). Más tarde fueron denominadas “radial stripes” en 1914 por Streiff, “radial pseudocysts” por Koeppe en 1917, “palisades” por Vogt en 1921 y “trabeculae” por Graves en 1934(7, 8). Fue el nombre acuñado por Vogt el que perduró hasta nuestros días (6). Aurell y Kornerup en 1949, las consideraron glándulas lagrimales accesorias (9). Sin embargo, años después, en 1958, Sir Stewart Duke-Elder describió que las empalizadas de Vogt eran en el hombre, vestigios de las glándulas descritas por Manz en cerdos, y sin función alguna (7). Davanger et al., en 1971 describen la 23 I.INTRODUCCIÓN verdadera función de estas estructuras en su artículo “Role of Pericorneal Papillary Structure in Renewal of Corneal Epithelium”(7). Las empalizadas de Vogt son unos enclaves privilegiados de nutrientes, protección y neurotrofismo. Entre éstas, como describía Shortt, “encerradas entre las empalizadas de Vogt”, se encuentran las criptas limbares y en la zona basal de éstas están las células madre limbares (10). De hecho según diferentes autores se han descrito con diferentes términos y localizaciones limbal epithelial crypts (LEC, por Dua en 2005) (11), limbal crypts (LCs, por Shortt en 2007) y focal stromal projections (FSPs, por Shortt en 2007) (5). Las empalizadas de Vogt se ven como hiperpigmentaciones lineales de forma radial de 1 mm de longitud en el limbo esclerocorneal. Las empalizadas de Vogt se visualizan mejor en la zona superior e 24 FIGURA 1. FOTO DE UNA QUERATOPATÍA COLUMNAR TRAS AUTOTRASPLANTE LIMBAR. I.INTRODUCCIÓN inferior limbar y es, en dichas zonas, donde hay mayor concentración de células limbares (12). De hecho, Shortt et al. demostraron que las las LCs y FSPs se encuentran mayoritariamente en la zona superior e inferior limbar, extendiéndose de forma variable hacia temporal y nasal, estando ausentes en el meridiano horizontal. No obstante, en el 20% de los pacientes no se pueden identificar en lámpara de hendidura las empalizadas de Vogt (13). Hasta que no surgió el concepto de célula madre no se empezó a relacionar la localización de estas células madre del epitelio corneal con las criptas limbares que estaban en el limbo esclerocorneal. Dicha localización se postuló por primera vez por Schermer en 1986 debido a que las células que encontró en dicha zona no expresaban una proteína de 64 kiloDalton (KDa) que si expresaban otras células epiteliales corneales(14). Posteriormente en 1989, el dermatólogo George Cotsarelis y colaboradores, describieron que estas células tenían un ciclo largo mediante timidina tritiada, características propias de células madre(15). Anteriormente a estos autores se habían encontrado hallazgos en similar dirección por Potten, Hanna y Davanger (7, 16-19). En conejos si se ha podido demostrar la localización de las células madre limbares en el limbo esclerocorneal (20), aunque en humanos esto aún no se ha podido confirmar. No obstante lo anterior, tanto Dua (21) como Shortt(5) han descrito numerosos hallazgos clínicos y científicos que evidencian dicha localización. No sólo eso, sino que ambos autores proponen un lugar donde residen dichas células madre limbares dentro del limbo y muestran varias evidencias al respecto. Dua y colaboradores en 2005, describen las limbal epithelial crypts (LEC) como localización de dichas células madre limbares y aunque descubre marcadores propios de las células madre en esta localización como el ATP-Binding cassette G2(ABCG2), no aportó 25 I.INTRODUCCIÓN 32 FIGURA 2. LIMBO ESCLEROCORNEAL E HIPÓTESIS DE THOFT. I.INTRODUCCIÓN citoplasma y ricas en tonofilamentos de queratina(50). La capa de células superficiales, aún con menos citoplasma, está formada por dos a cuatro capas de células y en su zona más anterior contienen microvilli que contactan con la lágrima(51) (figura 2). En el epitelio corneal no existen células de Langerhans ni melanocitos como si ocurre en el epitelio limbar, además al no tener vasos sanguíneos goza de un privilegio inmunológico que lo hace imprescindible en los trasplantes corneales. Las células epiteliales corneales obtienen la glucosa, los aminoácidos y las vitaminas del humor acuoso y el oxígeno por difusión a través de la lágrima. Cuando se cierran los párpados la presión parcial de oxígeno en la lágrima cae y entonces se obtiene desde los vasos conjuntivales. La inervación sensitiva corneal proviene de la división oftálmica del nervio trigémino que a través de ramas de los nervios ciliares largos entran por las zonas nasales y temporales corneales mediante fibras amielínicas formando el plexo nervioso subepitelial o subasal que penetra hacia las células epiteliales formando botones dendríticos (49)(figura 3). Los receptores sensitivos corneales son de tres tipos: mecanorreceptores(estímulos mecánicos), termorreceptores(frío) y receptores polimodales nociceptivos que responden a estímulos térmicos (temperaturas extremas), mecánicos y químicos (ácidos, acetilcolina, NaCl y PGE2), principalmente irritantes y mediadores inflamatorios endógenos. Estos receptores han sido estudiados con el estesiómetro de Belmonte(52, 53). La reproducibilidad de este estesiómetro ha sido estudiada por Tesón y colaboradores, siendo más alta para los estímulos mecánicos y el calor frente al frío y estímulos químicos(53). Las principales ventajas del estesiómetro de Belmonte frente al clásico Cochet-Bonnet(54), es la condición de no contacto (separación de 5 mm con el tip) y la exploración de todos los receptores sensitivos corneales que realiza. 33 I.INTRODUCCIÓN Los neurotransmisores segregados por estas terminaciones nerviosas condicionan la diferenciación, proliferación de las células epiteliales de la córnea. Un ejemplo dramático de este hecho es la queratopatía neurotrófica, consecuencia de la denervación corneal producida entre otros fenómenos por la disminución de neurotrofismo corneal (49). El epitelio conjuntival es un epitelio columnar estratificado no queratinizado. Es similar al corneal salvo que el conjuntival a diferencia de aquel está ricamente vascularizado, se agrupa de una forma menos homogénea, sus uniones intercelulares son menos frecuentes que en la cornea y su interdigitación es incompleta, dejando mayores 34 FIGURA 3. EPITELIO CORNEAL Y PLEXO NERVIOSO SUBASAL. I.INTRODUCCIÓN espacios intercelulares que permite el paso con mayor facilidad de anticuerpos, células inflamatorias y fármacos. Este hecho es el causante de la tinción tardía persistente con fluoresceína, fenómeno definitorio de la conjuntivalización sobre la córnea característica de la IL. Por otro lado, a diferencia del epitelio corneal, el epitelio conjuntival dispone además de otras células, secretoras de mucina, denominadas caliciformes o con el término anglosajón “goblet cell”(50). Estas células expresan el gen MUC5AC, el cual es muy interesante desde el punto de vista diagnóstico como marcador del tejido conjuntival cuando éste invade la córnea(55). Aunque existen varias publicaciones donde se menciona la citoqueratina 19 como específica de epitelio conjuntival, otras más recientemente informan que las citoqueratinas 7 y 13 junto con las mucinas MUC1 y MUC5AC son más específicas(56). Sus células madre se encuentran en zonas pigmentadas y de mayor grosor siendo el fórnix una de las estructuras ricas en estas células, aunque este es un tema aun un poco controvertido(57). Las células madre conjuntivales son bipotenciales, es decir se pueden dividir en células epiteliales o en células caliciformes(58). También el limbo esclerocorneal puede ser una localización de células madre conjuntivales(57). Pueden permanecer estacionarias y activarse en función de la necesidad de regeneración (59). Las células basales de la córnea expresan queratina 5/14 al igual que las células basales de la epidermis. Sin embargo, la queratina 3/12 (64 kiloDalton) es específica del epitelio corneal al no encontrarse ni en epidermis ni en conjuntiva (14). Las células de la córnea mueren por apoptosis y se descaman en la zona central corneal en un periodo que dura aproximadamente 7 días. Los mecanismos de regulación no están claros, aunque el microambiente que rodea a estas células limbares está fuertemente ligado a dicha regulación(1). Dicha renovación sigue la hipótesis del movimiento de las células epiteliales corneales en los ejes XYZ descrita por Thoft en 1983(60). Thoft describió 35 I.INTRODUCCIÓN un movimiento de renovación epitelial en los ejes X,Y y Z desde el limbo hasta el centro de la córnea: el X sería la proliferación de células basales; el Y, la proliferación y migración centrípeta celular y el Z, la descamación de células corneales (figura 2). El mantenimiento del epitelio corneal depende del equilibrio en la ecuación X+Y=Z, que representa el balance entre la pérdida celular y el reemplazo(61). El componente X e Y ocurre en estado basal, sin agresión externa, por lo que no hay que confundirlo con un desplazamiento de células periféricas en respuesta a un defecto central agudo, fenómeno aditivo a la renovación normal (movimiento X e Y) (62). El epitelio limbar es una transición gradual desde el epitelio conjuntival al corneal. Está compuesto por siete a diez capas de células siendo la zona basal donde residen las células madre limbares o “limbal stem cell”. Las proliferación de las células madre limbares ocurre por dos vías y con funciones diferentes(49): •Por un movimiento centrípeto y diferenciación hacia células amplificadoras transitorias (CAT) que forman parte de la capa basal del epitelio corneal. Las CAT luego se transforman en células postmitóticas suprabasales(CPM), que son las células alares del epitelio corneal. Cumple la función de renovación epitelial continua. •En dirección anterior, actuando como barrera entre los dos epitelios, el conjuntival y el corneal, en una proliferación de avance hacia la superficie. Estas células madre limbares componen sólo el 0,1-10 % de la población total de células basales(19). Las células madre se encuentran en todos los tejidos que se renuevan como el sistema hematopoyético, intestino y epidermis, en los cuales se ha demostrado su presencia. 36 I.INTRODUCCIÓN Las células madre limbares provienen del ectodermo neural, siendo una característica que lo confirma la presencia de receptores a neurotransmisores como GABA, dopamina o serotonina(63). Las células madre tienen alta tasa de proliferación con baja diferenciación, una vida larga, ciclos lentos de replicación, potencialidad, plasticidad, están alojadas en un “nicho” influenciadas por un “microambiente” y presentan una división asimétrica(18). Las células madre tienen el potencial de producir diferentes linajes de células. Existen según ese potencial diferentes tipos. Las células del zigoto que pueden dar lugar a todo tipo de células, del embrión y de la placenta, se llaman totipotenciales. Las células de las tres capas germinales, embrionaria u hojas blastodérmicas como son el ectodermo, mesodermo y endodermo, son pluripotenciales. Dan lugar a toda una estirpe celular dentro de una capa germinal. La mayoría de células madre o stem cell del organismo, son multipotenciales, pueden dar lugar a varios tipos celulares. Las células madre limbares y las de la epidermis son unipotenciales, sólo dan lugar a una única estirpe celular específica(64). Otra característica es la plasticidad, es decir, la capacidad de producir células de otra estirpe al situar dichas células en otra localización distinta, donde al cambiar el “microambiente”, factores de crecimiento, citoquinas y distintas sustancias, también cambian la estirpe celular que producen(65). Por esta característica, se están usando tejidos de otra localización como de la mucosa oral para el reemplazo limbar(66). El nicho da protección y nutrición a las stem cell(48). De hecho, Dua en 2005 y Shortt en 2007, situaron dicho nicho en las criptas limbares epiteliales, aunque las células madre del epitelio corneal también se han encontrado en otras localizaciones (42, 43), como hemos mencionado anteriormente. 37 I.INTRODUCCIÓN La división asimétrica consiste en la capacidad de que cada célula madre limbar se divida en dos tipos celulares por cada división, produciendo otra célula madre limbar, reponiendo así el pool de células madre y por otro lado, una célula amplificada transitoria (CAT) destinada a formar parte del epitelio corneal. Esta división puede producirse también en el sentido de que una célula madre limbar produzca dos CAT y otra célula madre limbar produzca dos células madre limbares(67), siendo la paridad la misma. Las CAT seguirán la ruta centrípeta descrita en la hipótesis de Thoft, en un proceso por el cual se irán diferenciando, primero en células postmitóticas o alares y luego en células totalmente diferenciadas. Las células madre limbares y las CAT son el compartimento proliferativo de la superficie corneal. Aunque las CAT tiene un potencial proliferativo mas limitado, se dividen con más frecuencia y dan lugar a células ya en proceso de diferenciación que ya no son capaces de dividirse: las células postmitóticas o alares. En cierto momento y a medida que se alejan del nicho, las CAT cesan sus mitosis, dejando de proliferar y pasando a la diferenciación celular terminal. Conforme las CAT se mueven centrípetamente van adquiriendo marcadores de diferenciación celular corneal, como las citoqueratinas (CK) 3/12, dejando atrás su fenotipo más similar a células madre limbares. Por otro lado, la capa basal del epitelio limbar contiene tanto células madre como CAT así como precursores tempranos entre ambos tipos celulares. Las CAT se encuentran en la capa basal del epitelio corneal formando la capa de células basales. El epitelio corneal periférico contiene CAT con capacidad de múltiples divisiones. En el epitelio central, estas CAT sólo tiene capacidad de dividirse una sola vez. Este hecho coincide con el hecho de que las colonias provenientes del epitelio central de la córnea no pueden ser cultivadas más de dos veces(59). Además de la vía centrípeta, también pueden migrar en su proceso de diferenciación hacia la superficie del limbo. Éste proceso parece ser muy importante para ejercer de barrera 38 I.INTRODUCCIÓN entre los dos epitelios, el conjuntival y el corneal (68) (figura 2). No se conoce claramente el mecanismo por el que se regula que una célula madre limbar se divida en una célula amplificada transitoria o en otra célula madre para su repoblación, y tampoco si después de dividirse en una célula transitoria amplificada, va hacia la superficie limbar o hacia el centro corneal(50). Se ha postulado que una CAT puede pasar de nuevo al estado de célula madre limbar en determinadas condiciones(31). En el proceso de cicatrización, el epitelio corneal utiliza tres estrategias para aumentar el reclutamiento celular y así repoblar la zona de agresión. Una sería el reclutamiento de células madre para producir mas CAT. Otro, el aumento de replicación de las CAT. Por último, el aumento de eficacia de la replicación de las CAT reduciendo el ciclo celular(69). 39 I.INTRODUCCIÓN I.3. SÍNTOMAS Y SIGNOS CLÍNICOS DE LA INSUFICIENCIA LIMBAR La insuficiencia limbar (IL) se define como una incapacidad por parte de las células madre limbares de regenerar el epitelio corneal y por tanto, significa el fracaso de la renovación del epitelio corneal y sus consecuencias. El paciente manifiesta hiperemia, molestias, dolor punzante, fotofobia, e incluso déficit visual. En lámpara de hendidura podemos explorar las empalizadas de Vogt donde son más numerosas, en la zona superior e inferior limbar, aunque no son fáciles de encontrar en todos los pacientes, incluso un 20 % de personas sanas no las presentan. Son más fáciles de localizar en pacientes jóvenes y de alta pigmentación. Por otra parte, la tinción tardía y persistente con fluoresceína del epitelio conjuntival invasor es frecuente (24). A este fenómeno se le denomina conjuntivalización, por la cual la superficie corneal es invadida desde la periferia por un epitelio de características conjuntivales, más friable, opaco, irregular y permeable que el epitelio corneal sano. La conjuntivalización es el signo distintivo de la IL ya que pone de manifiesto el fracaso de la barrera limbar con respecto al epitelio conjuntival que invade la córnea(70): “The hallmark of limbal stem cell deficiency is ‘conjunctivalisation’ of the cornea and the most significant clinical manifestation is a persistent corneal epithelial defect” 2 Algunos autores consideran la conjuntivalización, la vascularización corneal y la lenta reparación epitelial con erosiones epiteliales recurrentes una triada de signos patognomómicos de la IL(59). Esto es debido a que en la conjuntivalización, ese epitelio anómalo tiene menos adhesión, se desprende más fácilmente, la visión está comprometida y ocurre la difusión de la tinción a capas profundas por hiperpermeabilidad. Esta se traduce en En este texto Harminder S. Dua describe sobremanera, el signo y el síntoma principales de la IL 2 40 I.INTRODUCCIÓN la posibilidad de paso de leucocitos al estroma corneal iniciando la cascada inflamatoria y sus conocidas consecuencias(68). Posteriormente, y debido a esta inflamación persistente, sobreviene una queratitis punctata superficial y los defectos epiteliales recurrentes que pueden llegar a la ulceración corneal, neovascularización y desarrollo de pannus. Si el pannus llega a nivel central, se producirá deterioro visual, cicatrización estromal con leucomas e incluso, “melting” y perforación. La neovascularización es frecuente debido a que estas células conjuntivales no tienen capacidad de segregar factores antiangiogénicos como si lo hace el epitelio corneal sano (71). A finales de los años 70 y principios de los 80 se describieron casos de reepitelización corneal normal tras una conjuntivalización(72). Se postuló que las células madre corneales estaban en esa conjuntiva invasora existiendo una transdiferenciación de células conjuntivales a corneales(73). Más tarde se desbancó esta teoría por otra donde la causa de la espontánea recuperación se debía probablemente a células madre limbares remanentes en casos de insuficiencia limbar parcial(50). Dua et al. exponen los signos encontrados en la IL desde leve a más severa en este orden(70): 1. Pérdida de anatomía limbar. Se pierden las empalizadas de Vogt y la red vascular limbar. 2. Epitelio anómalo que invade córnea, siendo fino e irregular (conjuntivalización). Cuando la IL sea parcial se verá una zona cuneiforme de este epitelio anómalo de base limbar. 41 I.INTRODUCCIÓN ello se consigue, por un lado, un aumento en la resolución y por otro, la obtención de imágenes de secciones ópticas extremadamente finas, eliminando así la interferencia que produce la luz que llega de los diferentes campos ópticos de todo el grosor de la muestra a estudio, consiguiendo así que el enfoque se realice sobre un único plano (confocal). Por ello, y debido a que las imágenes obtenidas son imágenes digitales, se pueden obtener aumentos superiores a la microscopía óptica(81). El tipo de muestra que se puede analizar con un microscopio confocal es muy variado. Los más usuales son cortes de tejidos animales y vegetales, células en cultivo y superficie de metales. En cambio, en el campo de la oftalmología la exploración se realiza directamente sobre el ojo, existiendo un contacto mínimo con la córnea. Goldmann en 1939 fue el primero en describir el microscopio confocal(82). Marvin Minsky fue la primera persona que patentó el microscopio confocal en 1957 (figura 5; US 3013467A; fecha de presentación 1957, fecha de publicación 1961)(83), pero hasta la década siguiente no se construyó un dispositivo mecánico con estas características por Eggar y Petran. Con la llegada de los ordenadores, el láser y el procesamiento digital de las imágenes fue cuando realmente empezó a utilizarse para análisis de muestras biológicas en laboratorios. En 1968 salió el primer Microscopio confocal de barrido láser(84). Éste, a través de numerosas mejoras, consiguió obtener imágenes microscópicas in vivo muy similares a las de un corte histológico pero mediante una técnica mínimamente invasiva, sin necesidad de fijación ni tinciones y con un relativo bajo coste en fungibles. Ya en 1990 salen los primeros artículos analizando la córnea con los trabajos de Master BR y del grupo de Cavanagh HD y Jester JV (85). 48 I.INTRODUCCIÓN 49 FIGURA 5.PATENTE 3013467 DEL MICROSCOPIO CONFOCAL. MINSKY 1961 I.INTRODUCCIÓN I.5.2. COMPONENTES DE UN MICROSCOPIO CONFOCAL Los principales componentes de un microscopio confocal son (86): 1. El láser, como fuente luminosa temporal, que focaliza el haz de luz en un solo punto de la muestra, de modo que barre la muestra plano a plano, creando multitud de imágenes bidimensionales que un ordenador interpreta, generando finalmente una imagen tridimensional del objeto a estudio. 2. Diafragmas que limitan la accesibilidad del haz. Se encuentran situados antes y después de la lente, permitiendo enfocar la iluminación en un único punto. •Un diafragma de iluminación localizado tras la fuente luminosa denominado “pinhole de excitación”, cuya utilidad es eliminar la luz proveniente de planos superiores e inferiores al plano focal, aumentando con ello la claridad y resolución de la imagen. •Un diafragma de detección, de tamaño variable situado entre la lente y el fotodetector, denominado “pinhole de emisión”. 3. Software que permite mejorar la calidad de la imagen por disminución de la sensibilidad de los fotodetectores a intensidades bajas de fluorescencia, con lo que se reduce el ruido de fondo. Algunos factores, como la apertura variable del pinhole, la precisión, número y velocidad del barrido pueden influir en la obtención de una buena imagen(87). I.5.3. TIPOS DE MICROSCOPIOS CONFOCALES Actualmente existen tres sistemas de microscopía confocal (88-91): 50 I.INTRODUCCIÓN •Tandem Scanning Confocal Microscope (TSCM). Tiene una resolución de 24µm. Ya no está disponible comercialmente. En este microscopio el pinhole de detección es sustituido por un disco giratorio Nipkow con cientos de aperturas agrupadas en pares, lo que disminuye la interferencia de luz entre ellos mediante el principio de la espiral de Arquímedes y así barrer la muestra con múltiples puntos de luz simultáneamente(92). •Slit Scanning Confocal Microscope (SSCM). Llegan a una resolución de 9µm. Se emplea un haz de láser fijo y la preparación se rastrea mediante la utilización de una platina motorizada en el microscopio. Entre éstos están el ConfoScan P4 (Tomey Corporation, Cambridge, MA, USA), el ConfoScan 4 (Nidek Technologies, Gamagori, Japón) y Microphthal (Helmut Hund, Wetzlar, Alemania). •Laser Scanning Confocal Microscope (LSCM). Alcanzan una resolución de 7,6 µm. En este caso el barrido se realiza moviendo el haz de láser, gracias a unos espejos galvanométricos que permiten modificar el punto de incidencia del haz de láser en el ojo. Sólo existe disponible comercialmente un LSCM, el Heidelberg Retina Tomograph III (Heidelberg Engineering GmbH, Heidelberg, Alemania), aunque la versión II es la que se ha usado para este trabajo. Para estudiar la córnea y conjuntiva se debe incorporar e este microscopio el módulo Rostock Corneal Module (RCM)(figura 6). La ventaja del Confoscan 4 es que no tiene que aplanar la córnea mientras que el HRT II y III con el RCM si. Como desventaja, el Confoscan 4 tiene dificultad a la hora de visualizar estructuras fuera del centro corneal. El HRT tiene mayor resolución, mide profundidad con mayor exactitud y puede penetrar mejor en tejidos más opacos como la conjuntiva debido a su luz de longitud de onda infrarroja (670nm, láser clase 1)(93). 51 I.INTRODUCCIÓN La precisión en la medida del espesor de la córnea está limitada por su movimiento durante la exploración. El contacto entre la córnea y las lentes del objetivo del Tandem Scanning estabiliza la córnea para que las diferencias en medidas consecutivas sean inferiores a 25 µm(85, 90). Otros microscopios, como el ConfoScan (z-CS4), han introducido sistemas para reducir el movimiento entre la córnea y el objetivo. Estos microscopios debido a sus diferencias también obtienen medidas diferentes. En la tablas 1, 2 y 3 se muestran los distintos resultados de densidades celulares del epitelio 52 FIGURA 6. MICROSCOPIO CONFOCAL LASER SCANNING HRT CON MÓDULO DE CÓRNEA ROSTOCK I.INTRODUCCIÓN corneal y de los nervios del plexo nervioso subasal corneal. Los microscopios confocales LSCM tiene mayor contraste que los SSCM y además estos últimos, en los bordes de la imagen obtenida pierden más contraste aun por lo que los datos de densidad de nervios son mayores en LSCM que en SSCM(87). 53 Tabla 1. Densidad celular del epitelio corneal en personas sanas DENSIDADES CELULARES Mustonen 1998 Vanathi 2003 Benítez del Castillo 2004 Eckardt, Stave & Guthoff 2006 Niederer 2007 Deng 2012 Lagali 2013 C.Superficiales (zona central, cels/ mm2) 1213 (370) 1529 (341, <60años) 1523 (294, ≥60años) 840 (295) C. Alares (zona central, cels/ mm2) 5070 (1150) C. Basales (zona central, cels/mm2) 5699 (604) 3601 (408) 5783 (841, <60años) 5615(624, ≥60años) 8996 (1532) 6000 (1080) 9373 (483) 5467 (403) C. Basales (zona periférica, cels/mm2) 10139 (1479) Ojos 58 74 41 92 85 12 18 Microscopio confocal SSCM SSCM SSCM LSCM LSCM LSCM LSCM Se expresan datos en media y en paréntesis, su desviación estándar I.INTRODUCCIÓN 54 Tabla 3. Densidad de nervios del PNSB en µm/mm2 en sanos Grupcheva 2002 Benítez del Castillo 2004 Erie 2005 Patel 2005 Niederer 2007 Parissi 2013 Lagali 2013 Nervios (µm/mm2) 632 (287,jóvene s) 582 (327, ancianos) 769 (88, <60 años) 624 (86, ≥60 años) 8404 (2012)µm/ mm2 21668 (1411) 20300 (6500) 19000 (4500) 18300 (3700) Ojos 50 41 65 3 85 207 58 Microscopio Confocal SSCM SSCM TSCM LSCM LSCM LSCM LSCM Se expresan datos en media y en paréntesis, su desviación estándar Tabla 2. Densidad de células del epitelio corneal y de nervios del plexo subasal en paientes con IL. DENSIDADES CELULARES Miri, Nubile & Dua 2012 Deng 2012 Lagali 2013 (Aniridia) C.Superficiales (zona central, cels/mm2) 2245(248, total) C. Alares (zona central, cels/mm2) 3830(347) C. Basales (zona central, cels/mm2) 6329(539;parcial)- 3785(410; total) 5029(2323) 4344(749) Nervios del plexo nervioso subasal corneal 4260(total)-9700(parcial) µm/mm2 31,9 nervios/mm2 9100(8100) µm/mm2 Ojos 17 (total) 6(parcial) 27 40 Microscopio Confocal LSCM LSCM LSCM Se expresan datos en media y en paréntesis, su desviación estándar I.INTRODUCCIÓN I.5.4. MANEJO DEL HRT II CON EL MÓDULO PARA CÓRNEA ROSTOCK El módulo Rostock desarrollado en la Universidad de Rostock en Alemania en 2002 permitió usar el HRT inicialmente destinado para analizar la retina y las fibras nerviosas oculares utilizarlo para analizar la córnea acoplándolo por delante del HRT. El poder de magnificación es de 800 veces. También puede tomar imágenes en tres dimensiones tomando series de 46 imágenes secuenciales de dos dimensiones y después la reconstruye. El tiempo de toma de imágenes es de 0,024 segundos para imágenes en dos dimensiones y 4 segundos en la tridimensionales. La resolución óptica verticalmente es de 2 µm y la horizontalmente de 4 µm, siendo la digital de 1 µm/pixel tanto vertical como horizontalmente. Además nos aporta la profundidad de la imagen obtenida en micras para poder situar mejor el objeto analizado. Tiene una cámara que nos indica donde estamos tomando la imagen con una cámara CCD (480 por 460 pixeles, RGB, 15 imágenes por segundo) que se sitúa en el lateral de la cabeza del paciente. El rango máximo de enfoque del módulo Rostock es de 1.500 µm. En los modelos actuales se pueden utilizar lentes adicionales con las cuales el campo de visión varía de 250x250 µm a 400x400 µm o bien 500x500 µm, dependiendo de la lente que se utilice. El software permite determinar densidades ya sean celulares, de depósitos, nerviosas, etc. en cada capa corneal, mediante conteo manual, o bien elegir diferentes formatos de impresión. Se ensambla el módulo de córnea en el HRT II para posteriormente colocar el TomoCap (fungible de un sólo uso de plástico que se coloca anterior a la lente del módulo Rostock a modo de protección) con lágrima artificial en gel Viscotears® para mantener la interfase óptica tanto en zona interior como exterior. Al paciente se le instila colirio con anestésico tópico y la misma lágrima artificial en gel Viscotears® en ambos ojos. Luego, se le coloca un blefarostato y se aproxima el paciente a la mentonera para comenzar la prueba. 55 I.INTRODUCCIÓN I.5.5. APLICABILIDAD El HRT se ha usado para analizar la retina, el nervio óptico y las fibras nerviosas oculares. Desde la salida del módulo corneal Rostock se pudo usar para estudiar la córnea, conjuntiva, párpados y por supuesto, el limbo esclerocorneal. En limbo ha sido usada tanto para estudiar la anatomía normal como las empalizadas de Vogt y las criptas limbares (figura 7), como para describir nuevas estructuras como la “limbal lacuna” del grupo de Deng(45), como para la patología limbar. Deng incluso ha propuesto una novedosa clasificación con confocal de la IL(78). Una de las ventajas de esta técnica que el grupo de Iker García nos refiere con respecto a la RT-PCR del ARN de la MUC5AC (Limbokit®), es la posibilidad de diferenciar entre IL parcial y total, aunque también comenta sus inconvenientes, como el alto coste del aparato y la necesidad de personal experto para su manejo. De hecho refiere que la RT-PCR es mejor para el diagnóstico precoz de la IL por su 56 FIGURA 7. CRIPTAS LIMBARES Y EMPALIZADAS DE VOGT. A la izquierda, observamos empalizadas de Vogt y criptas limbares de aspecto normal. A la derecha se observan empalizadas de Vogt desestructuradas, más fibrosadas, sin criptas limbares y menos celularidad, en paciente con IL tras quimioterapia sistémica I.INTRODUCCIÓN alta sensibilidad, en referencia a que en estos estadios precoces no hay cambios citológicos detectables según ellos por la microscopía confocal(77). I.5.6. LA SUPERFICIE OCULAR VISTA DESDE UN MICROSCOPIO CONFOCAL Las distintas capas del epitelio corneal son claramente visibles con el Microscopio confocal (figura 8). Las células superficiales se ven como células poligonales de bordes brillantes y núcleo oscuro totalmente distinguible del citoplasma. Tienen una densidad de aproximadamente 850 células/mm2. Las células alares o intermedias se observan con bordes brillantes y citoplasma oscuro siendo muy difícil distinguir su núcleo. Son más homogéneas, de menor tamaño que las células superficiales y están más compactadas con una densidad de aproximadamente 5000 células/mm2 en ápex corneal. Las células basales del epitelio corneal presentan bordes brillantes y el núcleo no es visible. Al igual que las alares son muy homogéneas en tamaño y no tanto en el brillo de su citoplasma que puede variar de unas a otras. Su densidad en el ápex corneal es aproximadamente de 9000 células/ mm2 (tabla 1). La relación entre estas tres densidades celulares en córneas sanas es de 1:5:10 en el orden descrito. El plexo neural subasal es visible con la microscopía confocal, se sitúa debajo de la Bowman y la atraviesa para irradiarse por las distintas capas epiteliales corneales. Estas fibras nerviosas, amielínicas de entre 0,2-10 micras, son ramas del nervio oftálmico, nervio sensorial dependiente del trigémino. Marlen Parissi describió en 2013, una densidad de nervios del plexo nervioso subasal corneal en personas sanas de 19000 (4500) µm/mm2 en una muestra de 207 ojos en 106 3 personas sanas. Esta autora puntualiza que la densidad de nervios en µm/mm2 o mm/mm2, definida como longitud total de nervio de todos los nervios subasales visibles en imágenes Media (Desviación estándar) 3 57 I.INTRODUCCIÓN La densidad de nervios se define como el número de fibras nerviosas por mm2, aunque otros autores lo han definido como número de fibras en una imagen y otros como longitud de todos los nervios en una imagen(91, 99, 101, 124). Este último se aplica en este trabajo cuando se habla de densidad de de nervios. Para cuantificar la densidad de longitud de nervios por unidad de área, se calcula la longitud total de las fibras nerviosas en una imagen y como conocemos de antemano el área de dicha imagen que en el HRT II con RCM es de 384x384 pixeles o 400x400 µm, obtenemos mediante una fórmula matemática dicha densidad en mm/mm2 o µm/mm2 según los diferentes autores. Para medir esa longitud, se usa, no sin un tutorial previo, el programa Image J con el plugin Neuron J (125). En diabetes, como hemos mencionado antes, la densidad de nervios se correlaciona negativamente con la HbA1c, y por tanto, positivamente, con el buen control de los niveles de glucemia, no así, la longitud de nervios por sí sola (91). La disminución de la densidad de de nervios corneales con la edad es controvertida (99, 101). Recientes trabajos, con buenos tamaños muestrales, parecen inclinar la balanza claramente hacia el hecho de que con la edad se disminuye la densidad del plexo nervioso subasal corneal (Parissi, 207 ojos y Niederer, 85 pacientes)(94, 97). Parissi et al observaron una disminución de densidad del plexo nervioso subasal corneal de 0,25-0,30% por año y el equipo de Niederer, 0,9% por año. De hecho, Niederer et al. observaron que los queratocitos en el estroma también disminuían con la edad, pero no así, la densidad de células basales del epitelio corneal(97). Ésto es coherente con el hecho de que con la edad se ha observado que la sensibilidad corneal disminuye y el retraso en la curación de úlceras corneales aumenta(126-128). Según Niederer, si la densidad del plexo nervioso subasal corneal disminuye con la edad coherentemente junto con la sensibilidad corneal y la densidad de 64 I.INTRODUCCIÓN células basales no lo hace, se puede decir que la disminución de la densidad de nervios corneales puede explicar el retraso en la curación de heridas corneales con la edad (97). Respecto a la tortuosidad, es un fenómeno observado en modelos animales cuando existe regeneración nerviosa(129). En humanos, se ha descrito un incremento de ésta asociada a procesos patológicos como el queratocono, síndrome de Sjögren, síndrome de pseudoexfoliación, artritis reumatoide, severidad de la neuropatía periférica diabética y tras queratoplastia penetrante (91). Incluso, Edwards et al. crearon una escala basada en un proceso semiautomático que analiza este parámetro, designando el valor 0 a mínima tortuosidad y 1 sería la máxima (121). Con este trabajo, afirmaron que en pacientes diabéticos, la tortuosidad de los nervios corneales tenía mayor valor predictivo que la longitud de nervios. Ya se ha descrito un método automático para esta tarea que analiza los giros de estos nervios, por Scarpa et al. (130). Este método ha demostrado una buena correlación con la sensibilidad corneal obtenida con el estesiómetro de Cochet-Bonnet. Asimismo, la sensibilidad corneal se ha correlacionado de forma inversa con la densidad de nervios del plexo nervioso subasal corneal (117). De hecho, al menos en pacientes con diabetes, la densidad de nervios ha demostrado ser más sensible y repetible que la medida de la tortuosidad y las ramificaciones nerviosas ya que estas últimas carecen de reproducibilidad (131). Asimismo, Rosenberg y cols. han relacionado la disminución de la densidad de los nervios corneales con el aumento de erosiones corneales y el retraso de su cicatrización en pacientes diabéticos (132). De hecho la disminución de nervios corneales ya ocurre en la polineuropatía diabética leve y moderada, no así la disminución de la sensibilidad mecánica corneal que se ve afectada sólo en grados severos de polineuropatía diabética (132). Esto nos hace suponer que la sensibilidad corneal, al menos, la mecánica, se ve afectada de forma tardía. Es sorprendente 65 I.INTRODUCCIÓN que en el trabajo de Misra et al., se detectarán en el 50 % de los pacientes densidades anormales de plexo nervioso subasal corneal estando clasificados dichos pacientes tanto clínica como electrofisiológicamente como sanos, con respecto a la neuropatía diabética. Por ello, este trabajo postuló la densidad del plexo nervioso subasal corneal como el marcador más sensible para la neuropatía diabética(117). De hecho, 5 años antes, Tavakoli y colaboradores describieron ésta, como marcador para diagnóstico precoz y para estratificar la neuropatía diabética (133). El mismo equipo, en 2011, informó de la mejoría en la morfología nerviosa corneal cuando el control glucémico mejoraba. Este mismo hecho se ha observado en neuropatía idiopática de fibra fina en la que también se observó disminución de la densidad del plexo nervioso subasal corneal(134). En cuanto a la retinopatía diabética y su relación con la densidad nerviosa del plexo nervioso subasal corneal hay controversia. Existen autores que confirman dicha correlación(135) mientras otros la rechazan(117, 120), aunque habría que revisar los criterios de inclusión para analizar mejor esta relación ya que para estudiar el daño neural se excluyen normalmente los pacientes que han sido tratados con fotocoagulación, siendo este un posible sesgo. La espiral que realizan los nervios del plexo nervioso subasal corneal en la zona inferocentral corneal también ha sido estudiada por microscopía confocal (figura 9). Petropoulos et al. analizaron esta espiral de nervios inferocentral corneal que forma como una red capilar, obteniendo que la densidad neural en esta zona con el HRT, era de 31,5 mm/ mm2 (DE=7,7) o 31500 µm/mm2. Mucho mayor que la densidad normal analizada en el centro de la córnea (19000-20000 µm/mm2). En este estudio se vio que en pacientes diabéticos la densidad en la zona de la espiral está disminuida(122). Se ha observado que daños corneales lejanos a este vórtice o espiral, también la afectan y de forma precoz, 66 I.INTRODUCCIÓN observándose primero daño en las terminaciones que están dentro de esta espiral que las fibras de fuera. Patel et al. descubrieron que el plexo nervioso subasal corneal no está estático, sino en un migración centrípeta continua (136). De hecho, este grupo de trabajo fueron los primeros en describir imágenes reconstruidas de campo amplio formando una sola imagen de la distribución nerviosa del plexo nervioso subasal corneal de toda la córnea(96). Posteriormente otros grupos de trabajo se han incorporado con distintos sistemas de fijación en la mayoría proyectados en monitores a distintas distancias entre los 70 cm a 1 metro y medio(137-139). La última novedad, descrita por Turuwhenua, es un software que ensambla las imágenes cual puzzle, conllevando dicho dicho procesamiento de las imágenes unas 3 horas(140). Recientemente Allgeier y colaboradores, han descrito una pantalla pequeña usada para fijación en frente del ojo no explorado de 640 por 480 pixeles en donde un punto blanco era mostrado para ir dirigiendo la mirada del paciente(141). Es en este modelo donde nos basamos para crear nuestro propia pantalla de fijación. Por otro lado existe una relación ya descrita entre la neovascularización y la inervación corneal sensitiva. No es casualidad que siendo la córnea sana el tejido del organismo más densamente inervado del organismo también sea avascular. Se ha demostrado experimentalmente en ratones que cuando hay una denervación (electrolisis estereotáctica trigeminal, con ausencia demostrada por confocal de nervios corneales) los neovasos aparecen sólo 7 días después. Incluso se comprobó, que si se estimula la neovascularización (con dispositivos de FGF intracorneales) en una determinada zona, el plexo nervioso corneal desaparece en esa zona, no así en las zonas corneales donde no hay dichos neovasos(108). Esto nos lleva a pensar en la relación, posiblemente, a través de mediadores químicos que llevan a estas reacciones. De hecho, Ferrari y colaboradores en este estudio observaron que la inhibición mutua entre nervios y vasos era mediada por una 67 I.INTRODUCCIÓN alteración en los angiostáticos PEDF y VEGFR3. Existía una disminución estadísticamente significativa en los niveles de estos dos angiostáticos en las córneas denervadas. No obstante, ya se había descrito anteriormente la relación entre la deprivación neural y la angiogénesis en el ojo en modelos experimentales, pero no con los nervios sensoriales corneales. Steinle y col. demostraron la aparición de neovascularización en retina y coroides en ratas en las que se les había realizado una simpatectomía(142). Basu et al. demostraron un aumento de vascularización en tumores malignos en ratones en los que se les había ablacionado los nervios periféricos dopaminérgicos(143). Conocer más sobre dichos mediadores abre una puerta hacia el tratamiento de la neovascularización corneal y por ende, a la patología corneal de origen neurotrófico. Entre los factores angiogénicos se conocen Angiogenina, FGF(fibroblast growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), VEGF(vascular endothelial growth factor), entre muchos otros. Entre los angióstaticos: Angiostatina, endostatina, receptores VEGF, PEDF(pigment epithelium-derived factor), trombospondina 1 y 2, etc(108). Por otro lado, se ha descrito recientemente de forma experimental en modelos animales, que la avascularidad corneal depende de la alta expresión del receptor soluble de VEGF, s-VEGFR-1 o sFlt-1(fms-like tyrosine kinase 1). Cuando hay una herida corneal o aparece una vascularización corneal de novo disminuyen los niveles de sVEGFR-1 en la córnea. De otro lado, la ausencia de tejido linfático en la córnea (“alymphaticity”) es mediada por la presencia de SVEGFR-2 y sVEGFR-3(144). No hay que olvidar que la córnea al estar tan ricamente inervada, ser avascular, externa y accesible a métodos diagnósticos como la microscopía confocal nos permite estudiar la relación entre los nervios y los vasos de forma poco invasiva, siendo el limbo la zona crítica de separación entre la zona corneal avascular y la zona vascular(conjuntiva). Es 68 I.INTRODUCCIÓN bien conocido el hecho de que el estado avascular de la córnea es debido al suministro constante de sustancias angiostáticas producidas por el epitelio corneal y a que el limbo junto con la particular ultraestructura del colágeno corneal impiden la neovascularización (108). Por otra parte, se sabe que mientras algunos nervios periféricos segregan angiogénicos como el NGF (nerve growth factor)(145), otros segregan angiostáticos como el PEDF(146). En cuanto a la relación entre la densidad de células dendríticas y los nervios corneales también se ha visto su correlación inversa en queratitis infecciosas. A medida que aumenta la densidad de células dendríticas disminuyó de forma estadísticamente significativa y con respecto a controles tanto la densidad de nervios, ramificaciones, troncos nerviosos y número de nervios totales. Hubo un claro aumento de células dendríticas en queratitis infecciosas con respecto a los controles, de mayor a menor, en queratitis por acanthamoeba, por hongos y por último, por bacterias(147). A pesar se esa pérdida en el plexo nervioso corneal tras queratitis infecciosas, se ha demostrado que durante los 6 meses siguientes a las fase aguda de la infección, existe una regeneración nerviosa que nunca llegará a valores de normalidad (148). I.5.8. TECNOLOGÍA 3D CONFOCAL MICROSCOPY THROUGH-FOCUSING (CMTF) Esta técnica se desarrolló para los microscopios confocales SSCM por Jester et al. para recoger y cuantificar información 3D de la córnea. Esta técnica está basada en la diferente intensidad de reflectancia de las distintas capas corneales. Se obtienen imágenes a velocidad constante desde epitelio al endotelio. Debido a que se requiere una velocidad constante hacía imposible realizarlo con el microscopio confocal HRT que usa un tornillo que regula de forma manual el enfoque de imágenes. Recientemente se ha solucionado este 69 I.INTRODUCCIÓN problema con modificaciones tanto del hardware como del software. El tornillo regulador se ha sustituido por una pieza motorizada Newport TRA25CC Motorized Actuator con DC Servo Motor. El anterior software sólo permitía realizar secuencias de 100 imágenes. El actual software alcanza un máximo de 14.525 imágenes. Dichas imágenes junto con la información sobre la distancia a la que se tomado (distancia = velocidad x tiempo) es compactada en un archivo “.vol”. El programa CMTF nos da una curva característica con tres picos: epitelio, capa de Bowman y endotelio. Además nos da imágenes de cortes en dos dimensiones y reconstrucciones en 3D(91). I.5.9. OTRAS APLICACIONES EN OFTALMOLOGÍA En córneas normales se han analizado tanto la morfología y densidades celulares del epitelio, estroma y endotelio corneales, como densidad de nervios del plexo nervioso subasal corneal. La capa de Bowman es difícilmente reconocible salvo si se ven las estructuras “k”, que son estructuras polimórficas de material fibrilar. Además de lo mencionado, se pueden distinguir leucocitos, eritrocitos y células dendríticas o de Langerhans. En infecciones bacterianas no se puede diferenciar el patógeno pero si células inflamatorias. Las infecciones víricas se distinguen por un patrón aberrante del plexo nervioso y abundantes células dendríticas. En la infección por acanthamoeba, la microscopía confocal ha demostrado una correlación con la PCR del 77%(112) y una sensibilidad del 100% y una especificidad del 84%(113), aunque en nuestra experiencia estos valores son más bajos y dependientes del estado de evolución y de los tratamientos previos. En las queratitis fúngicas, sobre todo en los hongos que presentan hifas como el Fusarium solani o pseudofilamentos, como la candida, consigue una sensibilidad del 94% y una especificidad de 78 %(113). Teniendo en cuenta que las queratitis fúngicas tienen poco rendimiento -de un 70 I.INTRODUCCIÓN 25 % aproximadamente de resultados positivos en la segunda semanatanto en cultivos de raspado corneal, como en PCR, la microscopía confocal se presenta como una ayuda para la orientación diagnóstica y por lo tanto, el comienzo del tratamiento adecuado en estas infecciones(149). La microscopía confocal ha sido ampliamente utilizada en el estudio de la toxicidad de los conservantes usados en los tratamientos oculares tópicos (150) y además, en el estudio de los efectos nocivos de la mitomicina C al 0,02% en la cirugía del pterigium(151). Se han estudiado ampliamente las córneas de los portadores de lentes de contacto observándose entre otros hallazgos, cambios morfológicos de todas las capas epiteliales y aumento de células dendríticas en córnea central y periférica(109, 152, 153). En el cross-linking se ha observado el efecto fotopolimerizador(154), la disminución de queratocitos en fases precoces, queratocitos activados y repoblación de éstos a los seis meses(155). No se observaron cambios en el endotelio ni cuantitativa ni cualitativamente (149, 156). En cirugía refractiva se han estudiado los cambios en la córnea producidos tras PRK y LASIK. Se ha observado disminución de queratocitos en la zona del lentículo hasta tres años después de la cirugía(149). La reinervación corneal central total ocurre hasta dos años después de la cirugía, aunque comienza entre primer y el sexto mes(149, 157). La ampolla de filtración en la cirugía filtrante del glaucoma también ha sido objeto de estudio por parte de la microscopía confocal(158). 71 I.INTRODUCCIÓN I.5.10. USOS NO OFTALMOLÓGICOS DE LA MICROSCOPÍA CONFOCAL Su uso también se ha extendido fuera de la oftalmología, y debido a que su límite en la profundidad del tejido a estudiar es de 500 micras, se ha usado en dermatología, la cavidad oral, cérvix uterino y tracto gastrointestinal(149). Uno de los usos más extendidos fuera de la oftalmología es en el campo de la dermatología, usándose para ésta indicación un tipo de microscopio especial para dermatología denominado Vivascope 3000 (Caliber, rochester, New York; USA, distribuido en Europa por MAVIG GmbH, Munich, Alemania)(159). Podemos ver la epidermis hasta una profundidad de 200 µm como una capa avascular de epitelio escamoso con inervaciones mielinizadas y no mielinizadas con características terminaciones que penetran en epitelio aportando la sensibilidad cutánea denominadas telodendras(109). Este mismo microscopio para uso dermatológico se ha usado en tumores de conjuntiva y del borde parpebral, aunque el microscopio confocal usado en oftalmología es el que se ha utilizado clásicamente para dichos tumores (160). En cavidad oral y lengua su uso principal es en el diagnóstico diferencial de lesiones precancerosas. Se han detectado criterios de malignidad en su epitelio: núcleos alargados, aumento de tamaño celular con polimorfismos, aumento del ratio núcleo/citoplasma, agrupaciones celulares, pérdida de la arquitectura normal y de las uniones celulares que se detectan al no visualizarse la membrana celular(109). También se está usando para detectar problemas dentales en el esmalte, desmineralización dental y problemas gingivales(109). 72 I.INTRODUCCIÓN Dentro de la aplicaciones experimentales de la microscopía confocal, se encuentra los estudios animales, realizados en conejos ratas y ratones, y la reconstrucción en 3D de la córnea (91, 149). La innovadora tecnología multifotón nos abre las puertas a un nuevo campo en el que evita algunas de las limitaciones de la microscopía confocal por lo que será una nueva línea de investigación (149, 161). 73 I.INTRODUCCIÓN Las aberraciones de bajo orden, como el desenfoque y el astigmatismo, son las que más afectan a la imagen retiniana final. Por otro lado, las de alto orden, tales como la aberración esférica y el coma, también afectan a dicha imagen. Estas últimas fueron descritas por primera vez por Smirnov en 1961 mediante un test psicofísico, aunque la primera vez que se midieron objetivamente fue con un sensor de Hatmann-Shack en 1994. Estas aberraciones de alto orden, relacionadas con el astigmatismo irregular, fueron motivo de estudio debido al deseo de corregirlas sobretodo en el auge de la cirugía refractiva(163). Una de las aplicaciones devenida de medir las aberraciones de alto orden ha sido clasificar la severidad de los queratoconos en la clasificación de McMahon, denominada Keratoconus Severity Score (KSS) (164). 80 I.INTRODUCCIÓN I.7. KERATOGRAPH 5M El Keratograph 5M (K5M, Oculus, Wetslar, Alemania) utiliza un disco de Plácido y también un queratómetro integrado en la medición de la topografía de la superficie anterior corneal. El disco descrito por el oftalmólogo portugués Antonio Plácido da Costa en 1880(165), consta de un hemisferio retroiluminado con miras alternantes blancas y negras. El paciente mira dentro de este hemisferio a un punto de fijación iluminado dentro de los anillos concéntricos. Este patrón de anillos concéntricos se proyecta sobre la película lagrimal de la superficie anterior de la córnea. La córnea actúa como un espejo y refleja el patrón proyectado hacia una cámara, que está situada en el centro del dispositivo y recoge imágenes de dicha proyección. Además, el queratómetro integrado realiza una medición automática que garantiza reproducibilidad muy alta en los resultados. El software del que dispone, calcula la topografía de la córnea basándose en los datos medidos. Además dispone de luces tipo led de distinto color para analizar distintas magnitudes(figura 13). Dentro de las aplicaciones de la que consta están: 1. Topografía corneal con discos de Plácido. 2. Análisis de Fourier, Zernike y clasificación de queratocono(Amsler-Muckenhirn). 3. Adaptación de Lentes de contacto con fluorograma y el software Oximap©. 3.1. Adaptación de lentes de contacto: 81 FIGURA 12. KERATOGRAPH 5M I.INTRODUCCIÓN 3.1.1. Selecciona automáticamente la mejor adaptación matemática de lentes de contacto (el K5M contiene una “librería” de todas las lentes de contacto, constantes, adaptaciones y mapas de oxigenación). 3.1.2. Calcula la excentricidad y la curvatura sagital. 3.1.3. Nos aporta la fluo-imagen. 3.1.4. La potencia de la lente de contacto se calculará basándose en la expectativa de refracción. 3.2. Oximap©. Visualización de la transmisibilidad de oxígeno de las lentes de contacto blandas. La transmisibilidad o la permeabilidad del oxígeno dependen de: 3.2.1. El material (esto es una constante [Dk]). 3.2.2. El espesor de la lente [t]. 3.2.3. La posición de la lente de contacto. 4. Oculus TF-Scan. 4.1. Altura del menisco lagrimal (tear meniscum height, TMH). La altura del menisco lagrimal se puede medir con precisión con ayuda de la regla de medición integrada y de diversas opciones de ampliación, además de poder valorarse cómo discurre a lo largo del borde del párpado inferior. Así, se puede analizar la ptosis parpebral inferior, lagoftalmos, síndrome del párpado flácido o floppy parpebral y la conjuntivochalasis. El resultado se almacena en el archivo del paciente, por lo que aporta la ventaja de ser una prueba documentable. Valores por debajo de 0,2 mm se consideran sospechosos. Entre 0,2-0,4 mm se considera normal. Aunque estos valores son aportados por la casa comercial 82 I.INTRODUCCIÓN (Oculus), Tung et al. informan de un menisco lagrimal normal de 0,35(DE 0,18) mm (166). 4.2. NIKBUT (Non Invasive Keratograph Break-Up Time). Es el tiempo de ruptura lagrimal pero realizado de forma no invasiva y objetiva según el análisis de la disrupción del reflejo de los anillos de plácido en la película lagrimal. El keratograph 5M® nos aporta varias medidas de este parámetro: NIKBUT primero, NIKBUT medio y el nivel de ojo seco según el NIKBUT. Los valores de referencia son: •Estable: NIKBUT primero ≥10 segundos; NIKBUT medio ≥14 segundos. •Sospechoso: NIKBUT primero: entre 6 y 9 segundos; NIKBUT medio: entre 8 a 13 segundos. •Anormal: NIKBUT primero ≤5 segundos; NIKBUT medio: ≤7 segundos. •Si es ≤ 1,5 segundos se declara como “tiempo demasiado corto”. El TBUT(tear break-up time) sigue siendo el test más usado para determinar la estabilidad lagrimal (167, 168) ya que es útil tanto en diagnóstico como en el manejo del tratamiento del ojo seco (169, 170). El TBUT o tiempo de ruptura lagrimal mide lo mismo que el NIKBUT pero de formas diferentes. Ambos miden la estabilidad del film lagrimal. El TBUT fue originariamente descrito por Norn en 1969 y posteriormente Lemp y Holly lo definieron y usaron para evaluar la estabilidad y la calidad de la lágrima(171), mediante la observación de la lágrima asistida por colirio de fluoresceína y luz azul. Por su parte, el NIKBUT, no es más que el NIBUT (no invasive break up time) 83 I.INTRODUCCIÓN realizado por el Keratograph 5M®. El NIBUT es el tiempo de ruptura lagrimal de forma no invasiva y se realiza sin fluoresceína. Primariamente se midió con el Tearscope®(172). El Tearscope® mide la ruptura de la lágrima observando la distorsión de una imagen proyectada en la córnea cuantificando el tiempo que tarda en romperse tras un parpadeo. Un TBUT por debajo de 10 segundos es anormal (173), y por debajo de 5 es un ojo seco, mientras que entre 5-10 es marginal o sospechoso(174). Según Goto et al., el TBUT tiene una sensibilidad y especificidad para ojo seco del 75% y 60% respectivamente(175). Por otro lado, es conocida su baja reproducibilidad, ya que esta prueba se ve influida por la experiencia del explorador, parpadeos parciales, tipo de iluminación de la lámpara de hendidura e incluso por las características del colirio de fluoresceína: volumen instilado, pH, concentración, conservantes, fluoresceína en tiras o en colirio,…(176-178). De ahí, los intentos por medir la estabilidad lagrimal de forma objetiva, reproducible y no invasiva(179). La primera vez que se usó un topógrafo para el NIBUT en vez de un queratómetro fue con el TMS-1 (Tomey Technology, Cambridge, Massachussets, USA) en 1999 y se implementó cuando Goto en 2003 lanzó el software Tear Film Stability Analysis System (180, 181). Posteriormente Gumus et al. describió por primera vez el uso del Keratograph® de Oculus (Wetzlar, Alemania) con el software “Tear Film Scan”(TF-Scan) para este menester (182). Hong y Best obtuvieron valores del NIKBUT mas cortos que con el TBUT clásico y con el Tearscope®, respectivamente (183, 184). Se postula que por ser un método más objetivo y sensible capta antes cualquier ruptura en la lágrima más precozmente que un observador en la lámpara de hendidura (184). Recordemos que 84 I.INTRODUCCIÓN el Tearscope® es un método subjetivo por el que un observador en la lámpara de hendidura observa cualquier disrupción en la lágrima de la imagen proyectada por el aparato(179). 4.3. TF-lipid layer (capa lipídica de la película lagrimal). Mediante interferometría, los colores interferenciales de la capa lipídica y su estructura se vuelven visibles, lo cual permite registrarlos. A partir de su estructura y color se estima el espesor de la capa lipídica. 4.4. TF-dynamic (dinámica de la película lagrimal). Valoración del comportamiento de flujo de las partículas de la película lagrimal mediante la grabación en vídeo, a una velocidad de hasta 32 imágenes por segundo. Esto permite inferir la viscosidad de la película lagrimal y su movilidad. 5. OCULUS Meibo-Scan. Valoración de las glándulas de Meibomio tras una fotografía con luz infrarroja donde el explorador selecciona un polígono y se calcula el área de glándulas desestructuradas o desaparecidas. Si el área afectada es menor a 1/3 de la superficie analizada se le denominará grado 1. Si es mayor de 2/3, grado 3. Entre ambos caso, grado 2. 5.1. Meibografía de los párpados superior e inferior 5.2. Visualización 3D de las glándulas de Meibomio 6. OCULUS R-Scan. Hasta ahora el enrojecimiento conjuntival se valoraba de forma subjetiva y dependiente del oftalmólogo mediante diferentes escalas. Existen, en nuestro conocimiento, varias escalas, todas según comparativas con fotografías que sirven de modelo. Una es la de McMonnies y Chapman-Davies(M-CD) que clasifica de 0 a 5. Otra escala es la del Brien Holden Vision Institute, denominada primeramente 85 I.INTRODUCCIÓN como IER(Institute for Eye Research) y luego, es más conocida como CCLRU (Cornea and contact Lens Research Unit) y va del 1 al 4. La de Efron es muy parecida a la anterior. La Validated Bulbar Redness (VBR) System usa un sistema de 100 puntos, siendo fiable, repetible y menos influida por el observador ni por la experiencia de éste. Además, es la única validada de las escalas basadas en imágenes modelo. De ésta hay dos versiones comerciales, la VBR-5 o la VBR-10 dependiendo del número de imágenes que tiene para comparar. Actualmente debido a la mejora en los sistema de captura, análisis y procesamiento de imágenes, junto con la digitalización y las potentes computadoras informáticas existen varios sistemas de análisis de hiperemia automatizados(185). Recientemente un nuevo sistema de clasificación ha sido propuesto, el Ocular Redness Index (ORI), que va de 0 a 100 puntos porcentuales y parece el más versátil y objetivo hasta la fecha(186). Con el módulo R-Scan del Keratograph 5M, el K5M es el primer aparato de venta comercial que documenta y clasifica de forma automática y objetiva el grado de hiperemia conjuntival y límbica (187). R-Scan detecta los vasos de la conjuntiva y limbo, y evalúa el grado de hiperemia. Con esta objetividad abre un nuevo campo en la investigación y valoración de la hiperemia ocular como signo crítico en la oftalmología, sobretodo en el segmento anterior. Mide el enrojecimiento -así se denomina en el K5M la hiperemia, aunque se va a corregir en próximas mejoraslimbar temporal y nasal, enrojecimiento bulbar nasal y temporal, enrojecimiento medio bulbar y el área analizada. Está basada en la escala ORI pero transformado a escala decimal y llegando como máximo a 4 (40 % en ORI), por lo que va del 0 al 4 en escala decimal (187). 7. Imagen y video de alta resolución con luz blanca y luz azul para exploración con fluoresceína. 86 I.INTRODUCCIÓN 8. OSDI del K5M entrevistado. El cuestionario Ocular Surface Disease Index (OSDI) fue desarrollado por el grupo de investigación Outcomes Group Allergan Inc. (Irvine, California, U.S.A.), descrito en 1997 por Walt JG et al.(188) y validado por Rhett Schiffman et al. en 2000 (189) para diagnosticar cualquier tipo de ojo seco y graduar su severidad. Tuvo buenas correlaciones con las pruebas para ojo seco como el test de Schirmer, tiempo de ruptura lagrimal (TBUT) y los cuestionarios como el NEIVFQ 25, McMonnies y el Short Form-12 Health Status. Aunque su diseño fue originariamente creado para el síndrome de ojo seco usándose ampliamente para ello (190-192), también se ha utilizado para valorar el efecto sobre la superficie ocular (SO) del tratamiento antiglaucomatoso(193, 194), lentes de contacto(195, 196), enfermedad distiroidea con afectación ocular (197, 198), disfunción de glándulas de meibomio(199, 200), incluso para valorar el efecto en la SO de la polución ambiental(201) y el Síndrome de apnea obstructiva del sueño (202) entre muchas otras patologías. En cuanto al síndrome de ojo seco, se ha descrito una escala de severidad basada en el OSDI, siendo normales valores inferiores o iguales a 12 puntos, de 13 a 22 grado leve, de 23 a 32 grado moderado y mayores de 33 puntos, grado severo(203). Las ventajas que aporta el K5M en la exploración de la superficie corneal son: •Resultados más objetivos y repetibles (puramente objetivos: NIKBUT y enrojecimiento). •Clasificación automática de NIKBUT, OSDI y enrojecimiento. •No invasiva. •Rápida. 87 I.INTRODUCCIÓN •Control y documentación de la evolución(pruebas documentables y por tanto comparables). •Mejor comunicación con el paciente y comprensión por parte de éste con el nuevo informe JENVIS, por el cual en un sólo informe se informa en una escalas de colores verde, amarillo y rojo, el estado de las principales pruebas. 88 FIGURA 13. KERATOGRAPH 5M: DIFERENTES LUCES TIPO LED Y SUS APLICACIONES. I.INTRODUCCIÓN I.8. CLASIFICACIONES DE INSUFICIENCIA LIMBAR Mackman introdujo la primera clasificación para los distintos grados de IL en aniridia en 1979 (204). Tras ésta, se han realizado numerosas clasificaciones, diferenciándose en tres grupos, uno según la etiología (205-207), otro según la gravedad a través de los síntomas y signos clínicos(78, 208, 209) y otra híbrida, para pronóstico quirúrgico combinando afectación limbar, estado de la conjuntiva y etiología(210). Según la etiología, pueden ser lesiones directas sobre el limbo, de las propias células limbares o alteración del microambiente limbar o su nicho. En la tabla adjunta se expone la clasificación según etiología y su frecuencia relativa (207) (tabla 5). Como comentamos, Schwartz y cols. introdujo en 2002 una clasificación híbrida en la que por una lado valoraba el estado inflamatorio de la conjuntiva y la afectación del limbo, y por otra la etiología(211). Esta clasificación tiene carácter pronóstico en el momento prequirúrgico. De tal forma que estar en un estadio inferior v.g., IA, tendrá mejor pronóstico que estar en un IIC. El estado de la conjuntiva se valora en “A” si la conjuntiva está normal, estadio “B” si se trata de una conjuntiva que ha estado inflamada previamente pero ahora no o estadio “C” si la conjuntiva está actualmente inflamada. Con respecto al limbo, lo valora en I, si la afectación es menor al cincuenta por ciento o II, si está afectado en mayor medida. Dentro de cada estadio sitúa las posibles etiologías según su mejor o peor pronóstico (tabla 6). Las clasificaciones de signos y síntomas se exponen en la tabla 7: López-García(208) (2006), Paolo Rama (2010)(209), y Sophie Deng (2012)(78) (tabla 7). Esta última además ha desarrollado una clasificación según la microscopía confocal(78). La microscopía 89 I.INTRODUCCIÓN matriz estromal. Esta última capa se divide a su vez en un estrato compacto, una capa de fibroblastos y una capa esponjosa. La membrana amniótica tiene un efecto protector mecánico y otro biológico derivado de los factores de crecimiento segregados por su epitelio. Favorece la migración celular, la adhesión de células epiteliales, la proliferación de las células madre limbares y su diferenciación en células epiteliales corneales y además, previene la apoptosis. Por otro lado, la matriz estromal reduce la formación de tejido de granulación y cicatrización, disminuyendo la neovascularización y la inflamación a través de antiproteasas. No sólo eso, sino que realiza un efecto barrera contra mediadores proinflamatorios contenidos en la lágrima y contra agentes externos traumáticos, infecciosos y proinflamatorios. Existen numerosos casos en la literatura donde se ha usado de forma satisfactoria la membrana amniótica, como en queratopatía bullosa(217), insuficiencia limbar en aniridia(218), cirugías de pterigium recidivado(219), quemaduras químicas y térmicas oculares(220, 221), penfigoide cicatricial ocular (222) y síndrome de StevensJohnson(223). Además como veremos más adelante se ha usado como transporte y soporte en el cultivo y transposición de células limbares, conjuntivales y mesenquimales (224, 225). El trasplante de membrana amniótica tiene un papel importante como coadyuvante en cualquier tratamiento quirúrgico limbar debido al aporte de factores de crecimiento, al efecto protector, el efecto estimulador de la proliferación y la migración epitelial. En especial en IL parciales, ya que estimula a las células madre limbares supervivientes a reepitelizar la totalidad de la córnea, siempre asociándolo a epiteliectomía del epitelio anómalo invasor. 96 I.INTRODUCCIÓN I.9.2. TRATAMIENTO QUIRÚRGICO I.9.2.1. HISTORIA DEL TRASPLANTE LIMBAR En 1989, Kenyon y Tseng (226), demostraron la utilidad del trasplante de limbo en casos de insuficiencia límbica completa secundaria a causticaciones térmicas o químicas. Estos hallazgos confirmaron la utilidad del epitelio limbar como fuente de células madre en la regeneración de esta población celular destruida(227). Mediante este procedimiento se trasplantan células madre viables procedentes del propio individuo (autotrasplante límbico) o de un donante (alotrasplante límbico) en casos de afectación bilateral, basándose en la localización de las células madre limbocorneales en las empalizadas de Vogt del limbo corneal. La técnica descrita por ellos consistía en el trasplante de dos fragmentos limbocorneales grandes, de 6-7 mm de arco de limbo, extirpados del ojo sano. Previamente, prepararon el ojo receptor extirpando el tejido fibrovascular anómalo asociado a la insuficiencia límbica. La recuperación del fenotipo epitelial corneal fue confirmada con la ausencia de células caliciformes en la citología de impresión. El trasplante de limbo no debe hacerse en la fase aguda tras la causticación debido a la alta posibilidad de fracaso asociada a la gran inflamación, debiéndose esperar varios meses para llevar a cabo tal tratamiento(228). Esta técnica del autotrasplante de limbo está indicada como primer tratamiento quirúrgico en causticación química o térmica unilateral de la córnea, tras la cual puede llevarse a cabo la queratoplastia en los casos de opacidad estromal para conseguir la recuperación visual(229). El autotrasplante de limbo también ha demostrado ser útil en el tratamiento de otras patologías como pterigium recurrentes(230) o amiloidosis subepitelial (231). 97 I.INTRODUCCIÓN Posteriormente se estudió tanto en humanos como en animales con insuficiencia límbica completa, la capacidad que tenía el trasplante de limbo de producir una regeneración del fenotipo epitelial corneal, disminuir la vascularización corneal y mejorar la superficie epitelial (232-235). El uso adicional de membrana amniótica parece contribuir a una mayor tasa de éxito y menores complicaciones según algunos autores (236) pero no para otros (235), según los cuales el trasplante adicional de membrana amniótica no mejora el beneficio del tratamiento con autotrasplante de limbo. La principal desventaja del autotrasplante es la pérdida limbocorneal que implica la creación de dos explantes limbares en el ojo sano, ya que supone un riesgo de desarrollar insuficiencia límbica en el ojo sano. De hecho, este hecho conlleva las reticencias y frecuentemente el rechazo por parte del paciente de intervenirse su “ojo único”, que es el único sano y el que les ayuda a realizar toda su vida con más o menos normalidad. Este gran impedimento ha inducido a los investigadores a desarrollar otras vías con menos riesgos. Éstas son las técnicas de cultivo ex vivo que a través de la expansión en cultivos de la células limbares provenientes de explantes limbares sanos más pequeños y por otro lado, el uso de otros tipos celulares: mucosa oral, conjuntivales, mesenquimales,… Respecto al tratamiento quirúrgico existen múltiples tratamientos con diversas siglas usadas en la literatura y que usan diferentes tejidos. Se expone en la tablas adjuntas la nomenclatura más reciente, propuesta por la Cornea Society y publicada en 2011(237)(tabla 8 y 9). 98 I.INTRODUCCIÓN Tabla 8.Clasificación de los procedimientos quirúrgicos para la rehabilitación de la superficie ocular (“Cornea Society”) Procedimiento Abreviatura Donante Tejido transplantado Transplante conjuntival Conjunctival autograft CAU Ojo adelfo Conjuntiva Cadaveric conjunctival allograft c-CAL Cadáver Conjuntiva Living related conjunctival allograft lr-CAL Vivo familiar Conjuntiva Living non related conjunctival allograft lnr-CAL Vivo no familiar Conjuntiva Transplante limbar Conjunctival limbal autograft CLAU Ojo adelfo Limbo y Conjuntiva Cadaveric conjunctival limbal allograft c-CLAL Cadáver Limbo y Conjuntiva Living related conjunctival limbal allograft lr-CLAL Vivo familiar Limbo y Conjuntiva Living non related conjunctival limbal allograft lnr-CLAL Vivo no familiar Limbo y Conjuntiva Keratolimbal autograft KLAU Ojo adelfo Limbo y córnea Keratolimbal allograft KLAL Cadáver Limbo y córnea Transplante de mucosas Oral mucosa autograft OMAU Receptor Mucosa oral Nasal mucosa autograft NMAU Receptor Mucosa nasal Intestine mucosa autograft IMAU Receptor Mucosa intestinal Peritoneal mucosa autograft PMAU Receptor Peritoneo 99 I.INTRODUCCIÓN Tabla 9.Clasificación de procedimientos quirúrgicos para la rehabilitación de la superficie ocular basados en ingeniería tisular (“Cornea Society”). Procedimiento Abreviatura Donante Tejido transplantado Transplante de células conjuntivales cultivadas Ex vivo Ex vivo cultivated conjunctival autograft EV-CAU Ojo receptor Conjuntiva Ex vivo cultivated cadaveric conjunctival allograft EVc-CAL Cadáver Conjuntiva Ex vivo cultivated living-related conjunctival allograft EV lr-CAL Familiar vivo Conjuntiva Ex vivo cultivated living non-related conjunctival allograft EV lnr-CAL Vivo No familiar Conjuntiva Transplante de células limbares cultivadas Ex vivo Ex vivo cultivated limbal autograft EV LAU Ojo receptor Limbo/córnea Ex vivo cultivated cadaveric limbal allograft EV c-LAL Cadáver Limbo/córnea Ex vivo cultivated living-related limbal allograft EV lr-LAL Familiar vivo Limbo/córnea Ex vivo cultivated living non-related limbal allograft EV lnr-LAL Vivo No familiar Limbo/córnea Transplante de células de mucosa oral cultivadas Ex vivo Ex vivo cultivated oral mucosa autograft EV OMAU Receptor Mucosa oral 100 I.INTRODUCCIÓN I.9.2.2. ESQUEMA GENERAL DEL TRATAMIENTO QUIRÚRGICO Dentro del tratamiento quirúrgico de la insuficiencia limbar hay que diferenciar primero si está en fase aguda o ya está el ojo “tranquilo”. Segundo, si la afectación es bilateral o unilateral, cerciorándose si es posible con los métodos diagnósticos antes comentados y con pruebas documentables. Tercero, si la insuficiencia es parcial o total. Cada una de estas disquisiciones nos marcará la ruta terapéutica y los objetivos a conseguir (Figura 14). En las insuficiencias limbares parciales que no afecten a eje visual deberíamos sólo realizar tratamiento conservador médico incluyendo lágrimas artificiales, hemoderivados incluso lentes de contacto. En insuficiencia limbares parciales que afecten eje visual, la epiteliectomía secuencia conjuntival sectorial denominada en inglés Sequential Sectoral Conjunctival Epitheliectomy (SSCE) es de elección, incluso varias veces hasta que el limbo sano pueda suplir la función de la zonas dañadas y que la córnea se recubra de epitelio corneal normal. En las IL totales unilaterales, en las que se ha demostrado que el ojo adelfo está sano, una opción muy buena es el autoinjerto limbar. En el caso de las IL totales bilaterales si es posible el alotrasplante de donante vivo histocompatible (DVH), normalmente familiar del paciente, será de elección, buscando el mayor ajuste posible de histocompatibilidad. Como última opción, por mayor tasa de fracaso, el alotrasplante de donante cadáver (DC)(238). La ventaja del autoinjerto y del donante histocompatible es la frescura, ya que el tiempo desde que se extraen los explantes limbares hasta que se transplantan es mínimo. En el de donante cadáver mínimo 24-48h pasarán antes de transplantarse. Además en cuanto al problema de histocompatibilidad será menor en el autoinjerto y luego en DVH con buen ajuste de histocompatibilidad, que en el de donante cadáver. Por otro lado se evitan en el 101 I.INTRODUCCIÓN 102 FIGURA 14. ALGORITMO DEL TRATAMIENTO QUIRÚRGICO DE LA INSUFICIENCIA LIMBAR IL: Insuficiencia de limbo; MA:Membrana amniótica; SA: Suero autólogo; CML: Células madre limbares; DVH: Donante vivo histocompatible; SSCE: Epiteliectomía conjuntival I.INTRODUCCIÓN caso del autoinjerto, el problema de posibles contagios infecciosos. I.9.2.3. EPITELIECTOMÍA CONJUNTIVAL SECTORIAL SECUENCIAL Esta técnica fue descrita por Dua como Sequential Sectorial Conjunctival Epitheliectomy (SSCE) para tratamiento de las IL parciales con afectación del eje visual para “ayudar” a que las células madre limbares que quedan intactas regeneren la superficie epitelial corneal(239). Se requiere desbridar y retirar el tejido conjuntivalizado que recubre de forma anómala la córnea. De esta forma, se consigue que el epitelio sano proveniente de zonas limbares funcionales, pueda crecer y recubrir la córnea, con epitelio corneal normal. Se retira con cuchillete tipo Crescent o hemosteta seca haciendo especial énfasis en no dejar nada de epitelio anómalo ya que debido a la inhibición por contacto no permitiría que el epitelio sano recubriera toda la córnea. Normalmente son necesarias repetidas desepitelizaciones cada 24-48 h hasta que el epitelio corneal sano restablece la superficie corneal. Tras cada SSCE se colocará lente de contacto terapéutica, se instilarán colirios antibióticos y lágrimas artificiales sin conservantes. Por otro lado, si observamos que la afectación corneal y limbar es total, no debemos realizar SSCE, sino dejar que la conjuntivalización sea completa y esperar a que la inflamación disminuya durante varios meses para plantear un procedimiento quirúrgico. Dua plantea que es mejor un epitelio malo que no tener ningún epitelio (240). I.9.2.4. AUTOTRASPLANTE LIMBAR Y TRASPLANTE LIMBAR DE DONANTE VIVO HISTOCOMPATIBLE Ambos tienen unas características comunes que los hacen mucho más efectivos y duraderos en el tiempo. Entre estas características está su frescura. El tiempo que pasa desde que se extrae hasta que se implantan es mínimo y mucho menor que los alotrasplantes de 103 I.INTRODUCCIÓN cadáver, garantizando la viabilidad de las células madre limbares allí ubicadas. Con respecto a la inmunohistocompatibilidad, los alotrasplantes de cadáver, tienen más rechazo y por tanto mayor posibilidad de complicaciones a largo plazo que en los autotrasplantes y los alotrasplantes de donante vivo histocompatible (DVH). En éstos últimos, dependerá de cuan parecidos sean los HLA de los sujetos. Reinhard y cols. analizaron la compatibilidad de HLA clase I y II en alotrasplantes DVH, describiendo una tasa de éxito en éstos del 65 % cuando estos desajustes eran 0 ó 1, del 41 % cuando eran de 2 a 6 y una tasa de éxito del 14 % si no se correlacionaba ninguno (241). Además esto se refrenda en otros estudios(238) y con la observación de este mismo hecho en queratoplastias penetrantes (242, 243). En estos procedimientos se usará anestesia general normalmente con relajantes musculares. Con suturas de seda de 4-0 se fijarán los músculos rectos superior e inferior para poder mover el ojo sin que nos afecte al campo quirúrgico. Se toman dos segmentos horarios limbares del ojo donante normalmente a las 6 y las 12 horas, con límite posterior de unos 3 mm de conjuntiva y anteriormente justo por delante de las arcadas vasculares limbares siempre menos de un milímetro de córnea periférica (figura 15, donante, ilustración 1). La profundidad la podemos marcar en laterales y anteriormente con cuchillete precalibrado de diamante a unas 200 micras o con cuchillete de acero con tope de 250 micras -no existen inferiores a 250 micras- (Atomic Edge 250 micras, Beaver-Visitec). Se comienza disecando conjuntiva y separándola de la cápsula de Tenon, avanzando anteriormente y desde los laterales con un cuchillete tipo Crescent hasta el límite anterior que se habrá marcado con ese mismo cuchillete. Para completar el colgajo a nivel anterior se usarán unas tijeras Vannas. Se coloca el colgajo en una esponja húmeda con la cara epitelial hacia arriba y se cubre, humedeciéndolo de forma intermitente con BSS. Se sutura con nailon 10-0 la conjuntiva en cada ángulo del lecho que se ha tomado recubriendo con 104 I.INTRODUCCIÓN 105 FIGURA 15. DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA DE AUTOTRASPLANTE LIMBAR I.INTRODUCCIÓN En cualquier tipo de trasplante limbar habrá que realizar SSCE si observamos epitelio conjuntival invadiendo córnea salvo en la opción en la que ponemos una segunda capa de membrana amniótica en la cual puede retirarse a los 7-10 días como describimos. 112 I.INTRODUCCIÓN I.9.3. CULTIVO CELULAR EX VIVO PARA INSUFICIENCIA DE LIMBO Como se ha descrito previamente, la regeneración de la población limbocorneal es necesaria para la recuperación de la visión y de la superficie corneal normal. La posibilidad de recuperar la función limbar comenzó con el trasplante de limbo, descrito por Kenyon y Tseng, luego se implementó con la posibilidad del cultivo ex vivo de dichas células madre provenientes de distintos tejidos y actualmente se está investigando en nichos artificiales y distintas poblaciones celulares como las células mesenquimales. Aunque queda mucho camino por recorrer creemos que la evolución en el campo de la biotecnología permitirá salvar muchos de los escollos que teníamos hasta ahora, principalmente el de no disponer de tantas células madre autólogas como se requeriría. I.9.3.1. CULTIVO EX VIVO DE CÉLULAS LIMBARES Una forma de minimizar el daño del ojo donante es la expansión in vitro de células epiteliales limbares para su posterior implante. Esta técnica consiste en extirpar una pequeña muestra de tejido limbocorneal para expandir las células en el laboratorio. El cultivo se lleva a cabo sobre un soporte, que habitualmente se trata de membrana amniótica, debido a la similitud de su membrana basal con la del epitelio corneal. La duración del cultivo varía entre 2 y 4 semanas, manteniendo el cultivo con cambios periódicos del medio (figura 17). Los cultivos y el crecimiento celular se monitorizan mediante el análisis de las células por inmunohistoquímica con anticuerpos específicos de células epiteliales y células CAT (células progenitoras). Llegado el momento óptimo del cultivo celular, se procede al trasplante de la membrana amniótica como soporte de dicho cultivo. Para preparar el lecho receptor, se extirpa el tejido 113 I.INTRODUCCIÓN fibrovascular asociado a la insuficiencia límbica. Posteriormente se trasplanta el injerto de membrana amniótica suturándolo a córnea y a conjuntiva. Diversos autores han demostrado como las células madre limbocorneales expandidas ex vivo pueden reconstruir con éxito la superficie corneal en casos de insuficiencia límbica completa unilateral (261-266). 114 FIGURA 17. DIVERSAS ETAPAS DEL CULTIVO EX VIVO DE CÉLULAS LIMBARES I.INTRODUCCIÓN Esta técnica además permite confirmar histológicamente la existencia de epitelio corneal normal y la viabilidad de las células epiteliales previamente al trasplante (247, 259, 267, 268) (figura 18). Pellegrini y cols. fueron los primeros en demostrar que estas células madre limbocorneales cultivadas y expandidas “in vitro” pueden ser trasplantadas con éxito en ojos dañados permitiendo la regeneración de la superficie corneal y la recuperación de la visión (269). Sin embargo, los casos de insuficiencia límbica completa secundarios a patologías inflamatorias crónicas de origen inmune (síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide cicatricial, etc.) presentan una tasa de éxito menor (270). Durante la expansión ex vivo sobre membrana amniótica se preservan la tasa de replicación, la cinética del ciclo celular y las características fenotípicas de las células progenitoras del epitelio limbar y conjuntival (261, 271, 272). Las células madre del epitelio limbocorneal son expandidas y preservadas en el cultivo sobre membrana amniótica, dando lugar a un epitelio estratificado de fenotipo indiferenciado similar al epitelio limbar in vivo (261, 273)(figura 19). 115 FIGURA 18. CÉLULAS CULTIVADAS CON MORFOLOGÍA EPITELIAL I.INTRODUCCIÓN I.9.3.2. CULTIVO EX VIVO DE CÉLULAS EPITELIALES DE MUCOSA ORAL AUTÓLOGA Desde hace ya unos años, debido a los inconvenientes del trasplante alogénico en casos de insuficiencia límbica bilateral -en los que no hay disponibilidad de células madre limbares autólogas-, tales como el rechazo o los asociados a la inmunosupresión farmacológica, se está investigando en nuevas técnicas que eviten dichos problemas. Nakamura y cols. desarrollaron el trasplante de células epiteliales cultivadas de mucosa oral autóloga, cuya principal ventaja consiste en la ausencia de la necesidad de tratamiento inmunosupresor postoperatorio(274). Al tratarse de un trasplante autólogo, permite reducir y acortar el tratamiento con corticoides tópicos postoperatorios. El trasplante de células epiteliales de la mucosa oral, cultivadas sobre membrana amniótica denudada, permite obtener epitelio estratificado de características similares al epitelio corneal (275). El trasplante de láminas de epitelio sobre membrana amniótica consigue una epitelización rápida así como una regeneración de la superficie corneal, disminuyendo tanto el riesgo de 116 FIGURA 19. CULTIVO SOBRE MEMBRANA AMNIÓTICA DENUDADA. I.INTRODUCCIÓN rechazo como las complicaciones asociadas al tratamiento inmunosupresor (276). La rápida epitelización que consigue, disminuye la inflamación epitelial y el defecto epitelial persistente. Además, el trasplante de cultivo de mucosa oral, con membrana amniótica como soporte, parece prevenir la cicatrización corneal y el depósito de lípidos, que ocurren con frecuencia en el estroma adyacente incluso después de un período postoperatorio de varios años. Nishida y cols. comprobaron la reepitelización corneal de cuatro pacientes con síndrome de Stevens Johnson y penfigoide ocular cicatricial estudiados en el plazo de una semana (277). La técnica descrita por estos autores permite la obtención de láminas de epitelio de la mucosa oral cultivadas sobre plástico modificando la temperatura a lo largo del cultivo, sin utilizar ningún soporte ni sutura para su implante. Dichas láminas, van con un soporte periférico de plástico, que retiran una vez situadas en el ojo para luego aplicar una lente de contacto a modo de apósito. Se han comparado los resultados clínicos del trasplante de láminas de cultivo de células epiteliales de la mucosa oral sin soporte y con membrana amniótica como soporte siendo la tasa de supervivencia del injerto y la agudeza visual postoperatoria, significativamente mejores en los casos sin soporte, además de una menor incidencia de neovascularización postoperatoria (278). Otra ventaja del trasplante sin soporte es la técnica quirúrgica, que resulta mucho más sencilla al no ser necesarias las suturas ni la fijación del donante. Inatomi y cols. llevaron a cabo dicha técnica en quince ojos de doce pacientes con insuficiencia límbica completa y ceguera corneal, en los que observaron una rápida epitelización a pesar de una cierta neovascularización corneal periférica, en un seguimiento a medio plazo (279). Los casos tratados corresponden a enfermedades de la superficie ocular bilaterales con alto riesgo de rechazo epitelial y de desarrollar complicaciones, en particular 117 I.INTRODUCCIÓN pacientes jóvenes. Estos autores consideran que se trata de una técnica segura y útil, especialmente en pacientes jóvenes con afectación de la superficie ocular severa. Nakamura y cols. también habían demostrado previamente la utilidad del trasplante de células autólogas de mucosa oral en conejos aunque se trata de un seguimiento corto (274, 280). Utilizando membrana amniótica humana como soporte, trasplantaron el cultivo de células procedentes de mucosa oral de conejo en ojos con insuficiencia límbica completa. Observaron que las células cultivadas adquirían un tamaño y apariencia similar a las células epiteliales corneales y consiguieron la regeneración corneal en un seguimiento a corto plazo. La técnica que llevaron a cabo consistió en la toma de una biopsia de mucosa oral de entre dos y tres mm2, que cultivaron con un medio enriquecido con fibroblastos 3T3 sobre membrana amniótica denudada durante dos ó tres semanas. Con esta técnica se consiguen láminas de tejido epitelial sobre membrana amniótica a partir de una pequeña biopsia. Las características de las láminas de células de la mucosa oral cultivadas ex vivo son similares al epitelio corneal humano, formado por un epitelio estratificado de 3 a 5 capas celulares, células basales redondeadas y de pequeño tamaño, células superficiales aplanadas, microvellosidades apicales y buena transparencia. Las células epiteliales de la mucosa oral se encuentran en un estadio de diferenciación menor que los queratinocitos epidérmicos y pueden prolongarse en cultivo durante largos periodos sin que ocurra la queratinización. Además, estas células epiteliales de la mucosa oral in vivo son positivas para la citoqueratina 3, marcador de diferenciación corneal. Esto hace suponer que las células epiteliales de la mucosa oral, cultivadas sobre membrana amniótica, pueden diferenciarse en células epiteliales corneales, lo que justifica por la plasticidad de dichas células. 118 I.INTRODUCCIÓN Sin embargo, en otros estudios, el patrón de citoqueratinas mantiene características del epitelio de la mucosa oral (281). Nakamura y cols. después del éxito con modelos animales descrito un año antes, llevaron a cabo esta misma técnica también en pacientes con insuficiencia límbica completa, consiguiendo la estabilidad del epitelio corneal durante un seguimiento de casi catorce meses (282). Posteriormente, este mismo grupo llevó a cabo un estudio con una muestra mayor y un seguimiento más extenso (283). Encontraron mejora visual en el 95% de los ojos 6 meses tras la cirugía. A los 30 meses, el porcentaje de mejoría visual disminuyó al 53%. Según sus resultados, el trasplante de láminas de células epiteliales de la mucosa oral autólogas cultivadas resulta un tratamiento efectivo en la reconstrucción de la superficie ocular en la fase cicatricial de alteraciones graves de la superficie ocular. Otros estudios a largo plazo también concluyen que el trasplante de láminas de células epiteliales de la mucosa oral cultivadas ofrece una alternativa viable y segura en la reconstrucción de la superficie ocular (66). Sin embargo, el pronóstico para conseguir esa estabilidad de la superficie corneal está negativamente determinado por la existencia de defectos epiteliales preoperatorios. Entre las complicaciones postoperatorias se encuentra melting estromal o la perforación tras defectos epiteliales persistentes, queratitis infecciosas, glaucoma y neovascularización. Se han llevado a cabo estudios retrospectivos en 40 pacientes con insuficiencia límbica completa tratada con trasplante de láminas de células epiteliales de mucosa oral cultivadas, concluyendo que este tratamiento consigue una mejoría visual a largo plazo, incluso en pacientes con déficit lagrimal severo (284). El simbléfaron y la neovascularización demostraron ser factores pronósticos negativos en la mejoría visual. 119 I.INTRODUCCIÓN El tratamiento agresivo pre y postoperatorio de los factores pronósticos que afectan al estado de la superficie ocular tras la cirugía es fundamental para conseguir un mejor pronóstico clínico tras los tratamientos reconstructivos de la superficie ocular. Principalmente, la hidratación de la superficie ocular y un ambiente no inflamatorio, que ayudan a mantener la estabilidad del epitelio de la superficie ocular(252). I.9.3.3. CULTIVO EX VIVO DE CÉLULAS CONJUNTIVALES AUTÓLOGAS Otra alternativa estudiada en casos de insuficiencia límbica completa es el cultivo de células conjuntivales autólogas. En estudios con conejos se ha demostrado la formación de un epitelio escamoso estratificado morfológicamente similar al epitelio corneal y cuyas células basales expresan los marcadores de inmadurez p63 y ABCG2 (285). El epitelio resultante también expresa citoqueratinas de diferenciación corneal (citoqueratina 3/12). Estos hallazgos sugieren al trasplante de células conjuntivales cultivadas sobre membrana amniótica como alternativa para regenerar el epitelio corneal. Sin embargo, el seguimiento de estos estudios es muy corto, por los que son necesarios estudios a más largo plazo para confirmar estos resultados. Posteriormente se ha estudiado la viabilidad de cultivar células epiteliales conjuntivales de pacientes con insuficiencia límbica completa, analizando las citoqueratinas (CK3, CK19) (286), el marcador de proliferación Ki-67 y los marcadores de células Stem ABCG2 y p63 (287). De estos estudios se concluye que es posible cultivar células epiteliales conjuntivales ex vivo en pacientes con alteraciones oculares severas. 120 I.INTRODUCCIÓN I.9.3.4. CULTIVO EX VIVO DE CÉLULAS MESENQUIMALES Las células mesenquimales también se han encontrado en el nicho limbar marcadas por CD-90 y CD-105, y se han analizado con el microscopio confocal HRT III, resultando en una morfología diferente a las células epiteliales, queratocitos, neuronas y células dendríticas (288). Se sabe que las células mesenquimales aportan por vía paracrina una serie de sustancias que modulan la inflamación a través del TSG6 (TNF∝ stimulated gene/protein6) y además reparan o regeneran el tejidos (289). El cultivo de células mesenquimales (MSC) nos aporta una serie de ventajas con respecto al trasplante de limbo tradicional (225, 290) (289): •Son autólogas, pero evitan cirugía en el ojo donante del mismo paciente o de un donante vivo histocompatible. •Por tanto, no requieren inmunosupresión. Presentan bajos niveles de MHC-I (complejo de histocompatibilidad) y negativos para MHC-II, CD-40, CD-80 y CD-86. Por lo que pueden usarse también células mesenquimales alogénicas sin necesidad de inmunosupresión. •Además de lo anterior, presentan capacidad inmunomoduladora por lo que controlan la inflamación y evitan el rechazo. •No hay lista de espera, comparado con el trasplante alogénico cadavérico. •No hay problema de contaminación ni de contagio infeccioso. 121 II.JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS II.1. JUSTIFICACIÓN Existen diferentes escalas de severidad y criterios diagnósticos para la Insuficiencia Limbar, pero todos regidos por la observación y exploración clínica que por definición es subjetiva. Es necesario crear criterios diagnósticos fiables y una escala de severidad basada en parámetros objetivos. La microscopía confocal nos aporta las características mencionadas, permitiéndonos además, el acceso a gran aumento de la anatomía celular y estructural de la córnea, conjuntiva y limbo, de forma no invasiva y sin tener que realizar biopsias, las cuales podrían desencadenar fenómenos inflamatorios y/o cicatriciales que es mejor evitar si es posible en la mayoría de estos pacientes. Nuestro objetivo, por tanto, es conseguir un diagnóstico de forma objetiva y cuantificar mucho mejor la severidad de cada caso, y ésto, a su vez, nos llevaría a poder tratar mejor a nuestros pacientes con una escala terapéutica acorde a su severidad. Otra cosa que nos aportaría la microscopía confocal en la insuficiencia limbar es poder diagnosticar dicha enfermedad en estadios precoces donde los síntomas y los signos son escasos, más en oftalmólogos no familiarizados con esta patología. La microscopía confocal supone un método que aunque relativamente costoso en cuanto a su tecnología, resulta económico en cuanto al costo de cada prueba. Además, una clasificación más objetiva hará más reproducibles futuros estudios y ensayos clínicos en pacientes afectos de IL. 128 II.JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS II. 2.HIPÓTESIS El análisis de la densidad celular y del plexo nervioso subasal del epitelio corneal mediante la microscopía confocal ayuda al diagnóstico precoz y a clasificar la insuficiencia limbar basándonos en pruebas documentables y de forma no invasiva. II.3. OBJETIVOS 1. Objetivo principal: 1.1. Analizar y relacionar la presencia de conjuntivalización o pannus (resultado final de la IL) en sus distintos estadios con las demás variables de la exploración. En especial, con la densidad celular del epitelio corneal y de los nervios del plexo nervioso subasal corneal. 2. Objetivos secundarios: 2.1. Analizar la concordancia entre el estadiaje de la insuficiencia limbar basado en los hallazgos de la microscopía confocal y los estadiajes basados en la escalas de signos y síntomas. 2.2. Comparar los datos obtenidos con sus respectivas medias de la densidad celular (superficiales, alares, basales centrales y basales periféricas) y densidad de nervios de plexo nervioso subasal de personas sanas, con los datos de referencia que se encuentran en la literatura y los valores de nuestros controles. 2.3. Obtener una escala basada en la clasificación confocal de Deng (78), pero aclarando los hallazgos determinantes de cada estadio y añadiendo a dicha 129 II.JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS clasificación la presencia o ausencia de plexo nervioso subasal corneal como factor pronóstico. 2.4. Analizar la correlación entre el estadiaje de la insuficiencia limbar basado en los hallazgos de la microscopía confocal, en especial si la presencia de plexo nervioso se relaciona con la variables de las exploraciones clínicas, cuestionario OSDI, VFQ-25, test de Schirmer I, osmolaridad, datos obtenidos con Pentacam® y Keratograph 5M. 2.5. Comparar concordancia de OSDI en formato papel que se le entrega al paciente para autocumplimentación (variable “OSDI papel”) y OSDI entrevistado por un explorador entrenado en el Keratograph 5M (“OSDI K5M”). 2.6. Comparar concordancia de TBUT (“BUT segundos”) con NIKBUT primero del K5M. 2.7. Comprobar si existe relación entre los resultados del test de Schirmer I con la altura de menisco lagrimal del K5M. 2.8. Comprobar si existe relación entre el “enrojecimiento bulbar medio” del K5M y el OSDI. 2.9. Comprobar si existe relación entre la altura del menisco lagrimal, NIKBUT primero, meibografía, OSDI del K5M, “enrojecimiento limbar y temporal” y osmolaridad con respecto al estadiaje confocal de Deng. 2.10. Explorar futuras líneas de investigación a partir de los resultados de esta tesis. 130 II.JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 131 III.PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS III. PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS III.1. FUENTES DE INFORMACIÓN III.2. TIPO DE ESTUDIO Y PACIENTES III.2.1. CRITERIOS DE INCLUSIÓN III.2.2. CRITERIOS DE EXCLUSIÓN III.3. VARIABLES Y METODOLOGÍA III.3.1. DATOS EPIDEMIOLÓGICOS III.3.2. VARIABLES DE SEGUIMIENTO CLÍNICO III.3.2.1. VISITA 1 III.3.2.2. VISITA 2 III.3.2.3. VISITA 3 III.4. TAMAÑO MUESTRAL III.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO III.5.1. DESCRIPTIVA GENERAL DE LA MUESTRA Y PRINCIPIOS GENERALES DEL ANÁLISIS REALIZADO III.5.2. ANÁLISIS DE LA RELACIÓN DE LA PRESENCIA DE PANNUS CON LAS DEMÁS VARIABLES, EN ESPECIAL CON LA DENSIDAD CELULAR DEL EPITELIO CORNEAL Y NERVIOSA DEL PNSB III.5.3. CONCORDANCIA DE ESCALAS DE ESTADIAJE III.5.4. COMPARACIÓN DE MEDIAS DE DENSIDADES CELULARES Y NERVIOS DEL PLEXO SUBASAL CON LAS REFERIDAS EN LA LITERATURA COMO VALORES NORMALES III.5.5.ANÁLISIS DE LA RELACIÓN DE LA PRESENCIA DE PLEXO NERVIOSO SUBEPITELIAL CON EL RESTO DE VARIABLES III.5.6. CORRELACIÓN ENTRE OSDI DE AUTOCUMPLIMENTACIÓN Y OSDI DEL K5M INTERROGADO POR EL EXPLORADOR III.5.7.CONCORDANCIA ENTRE TBUT Y NIKBUT PRIMERO DEL K5M III.5.8. DESCRIBIR LA RELACIÓN ENTRE SCHIRMER I Y ALTURA DEL MENISCO LAGRIMAL ANALIZADO CON EL K5M III.5.9. ANALIZAR LA RELACIÓN ENTRE ENROJECIMIENTO BULBAR MEDIO DEL K5M Y OSDI PARA AUTOCUMPLIMENTACIÓN III.5.10.RELACIÓN ENTRE ALTURA DEL MENISCO LAGRIMAL, ENROJECIMIENTO LIMBAR TEMPORAL Y NASAL, NIKBUT PRIMERO, MEIBOGRAFÍA, OSDI DEL KERATOGRAPH 5M, OSMOLARIDAD CON RESPECTO AL ESTADIAJE CONFOCAL DE DENG III.6. LIMITACIONES DEL ESTUDIO III.7. ASPECTOS ÉTICOS 132 III.PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS III.1.FUENTES DE INFORMACIÓN Los datos serán recogidos mediante un cuestionario que se presenta en el Anexo 1 que constará de anamnesis, exploración clínica y una batería de pruebas complementarias realizada a los pacientes, garantizando la protección de los datos personales de los enfermos, según la Ley 15/1999, de 13 de diciembre de Protección de Datos Personales. El ámbito del proyecto es la Unidad de gestión Clínica de Oftalmología del Hospital Universitario Macarena y Virgen del Rocío (Sevilla), salvo para la realización de la microscopía confocal que se realizó en la Clínica Cartujavisión en Sevilla debido a que en ningún hospital público de Sevilla se dispone de esta tecnología. III.2.TIPO DE ESTUDIO Y PACIENTES Estudio de concordancia de pruebas complementarias y evaluación de escalas diagnósticas. III.2.1. CRITERIOS DE INCLUSIÓN - Sujetos mayores de 18 años. - Pacientes con síntomas y signos compatibles con síndrome de insuficiencia limbar según los criterios clínicos de Dua (21). - Firma del consentimiento informado . III.2.2.CRITERIOS DE EXCLUSIÓN -No tener los requisitos legales para participar en dicho estudio -No poder completar la anamnesis y la exploración clínica básica. 133 III.PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS III.3.VARIABLES Y METODOLOGÍA III.3.1.DATOS EPIDEMIOLÓGICOS DEL PACIENTE -Edad. -Sexo. -Etiología de la insuficiencia limbar según la clasificación del Dr. Gris y Dr. Pérez Santoja (207). III.3.2.VARIABLES DE SEGUIMIENTO CLÍNICO Los pacientes fueron citados tres veces debido a la ubicación de las distintas pruebas que se les realizó. Entre las variables de exploración clínica y sintomatología se incluyeron las mismas variables que incluían las distintas clasificaciones siendo los más fieles posibles a las mismas para luego, poder compararlas. III.3.2.1.VISITA 1 A. Información y consentimiento. Se le explica al paciente en que consiste el estudio, se le informa de todos los detalles y se le interroga si tiene dudas o preguntas al respecto. Se le explica y entrega el consentimiento informado y hoja de información, entregándonos copia firmada del consentimiento (ver anexos). B. Anamnesis 134 III.PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS 1. Interrogar al paciente acerca de la etiología de la IL (causticaciones, pterigium recidivado, intervenciones repetidas, porte prolongado de LC, aniridia, penfigoide ocular cicatricial,…) según clasificación de Gris et al(207). 2. Valorar los síntomas detallados en la escala de López-García(208): a) Se le interroga al paciente sobre episodios de erosión corneal o úlceras recurrentes en los últimos 6 meses. b) Se le interroga al paciente sobre si sufre fotofobia y se le pide que lo gradúe cada ojo por separado: leve, moderada, grave. c) Se le interroga al paciente sobre si sufre epífora y se le pide que lo gradúe cada ojo por separado: leve, moderada y grave C. Exploración clínica: 1. Agudeza visual mediante optotipo ETDRS a 4 metros según método validado en el estudio ETDRS (295-297) que siguieron las indicaciones de Bailey y Lovie (298). En el ETDRS, la agudeza visual mejor corregida fue medida con optotipos de agudeza visual logarítmica a una distancia de 4 metros, y a 1 metro si la agudeza visual era peor que 20/100. El protocolo especifica que los examinadores de agudeza visual deben ser entrenados y que sigan los procedimientos estándar para alentar a los pacientes a hacer un esfuerzo máximo para leer tantas letras como sea posible con cada ojo. Las tablas de agudeza visual utilizadas en el ETDRS tenían 14 filas de cinco letras cada uno, que corresponde a la agudeza visual de 20/10 a 20/200 cuando se ve a una distancia de 4 metros. Cuando se leen 20 o más letras correctamente a 4 metros (que corresponde a la agudeza visual de 20/100 o mejor), la puntuación de la agudeza 135 III.PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS visual será el resultante de las letras correctamente leídas más 30 (el número total de letras en las seis primeras líneas de la carta, que se usarán a una distancia de 1 metro para la medición en pacientes con baja agudeza visual). Cuando se lean menos de 20 letras correctamente a 4 metros, sólo el número de letras leídas correctamente a 4 metros se añadirá a las leídas correctamente de las 6 filas a 1 metro de distancia. Una puntuación perfecta de agudeza visual será de 100, que corresponde a la agudeza visual de 20/10. Si no hay letras leídas correctamente a 1 metro, se registra la presencia o ausencia de percepción de luz, movimientos de manos o cuenta dedos. Se debe poner la mejor graduación obtenida para la toma de agudeza visual, la fecha , nombre del paciente y nombre del examinador. 2. Presión intraocular mediante tonómetro Perkins calibrado(299). 3. Exploración ocular en lámpara de hendidura y fotografía del segmento anterior: a) Epitelio: Grados de pannus y alcance corneal del mismo. Principalmente buscando los datos para poder clasificar a cada paciente en una grado u otro de la escala de Schwartz(92), López-García(208), Paolo Rama(209) y clasificación clínica de Deng(78). (1) Si hay o no pannus. (2) Cuadrantes horarios corneales afectados. (3) Grado de invasión corneal por el pannus hacia el ápex corneal en milímetros. Según esto se podía clasificar en invasión corneal menor de 1 milímetro, mayor de 1 milímetro y afectación menor de 180 grados, y por 136 III.PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS último, mayor de 1 mm y afectación mayor de 180 grados de la circunferencia limbar. (4) Si la superficie corneal tiene brillo apagado. (5) Afectación de córnea central. b) Valoración con tinción corneal con colirio de fluoresceína (Colircusí Fluoresceína, 20 mg/ml, colirio en solución, Alcon-Cusí, El Masnou, Barcelona, España) c) Escala de Oxford (con colirio de fluoresceína 20 mg/ml mediante fotografías) (300). Esta escala va de 0 a 15 en total, asignando de 0 a 5 puntos en cada área: córnea, conjuntiva bulbar temporal y nasal. d) TBUT(Tear Break Up Time). Se trata del tiempo de ruptura lagrimal (valor numérico) y se ha realizado según técnica de Abelson(301). Se instila en fórnix inferior colirio de fluoresceína al 2% y se espera 10 a 30 segundos. Valores menores o iguales a 10 segundos son patológicos. 4. OSDI y VFQ 25. Se le entregan al paciente dichos cuestionarios y se le instruye para rellenarlo. Principalmente se leen unas breves instrucciones que acompañan al cuestionario VFQ-25 de autocumplimentación como por ejemplo, que debe contestar a las preguntas asumiendo la mejor visión posible con ambos ojos y con corrección. En este tiempo se produce lavado de tinción de fluoresceína, que osciló entre 35-45 minutos (Ver anexos). a) Ocular Surface Disease Index (OSDI)(189). 137 III.PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS Existen tres modos para la adquisición de imágenes: (1) Secciones: Imágenes individuales bidimensionales. (2) Volúmenes o z-scan: 40 imágenes bidimensionales tomadas en un rango de 80 µm de profundidad (una imagen cada 2 µm), que pueden ser visualizadas como fotogramas individuales o como secuencia de fotogramas (vídeo). El tiempo de adquisición de cada serie es de 6 seg (cada imagen individual en 0,024 seg). (3) Secuencia: 30 imágenes en un mismo plano a la misma profundidad corneal. Las imágenes pueden ser también visualizadas como vídeo o como imágenes individuales. De éstos, se usó principalmente el modo sección, y de la zona central, inferior y superior uno o varios volúmenes. Si existía vascularización corneal se tomaban secuencias para analizar si existía circulación y visualizar mejor los vasos. Prosiguiendo con la prueba, se le coloca al paciente un blefarostato para evitar el parpadeo y se le instruye al paciente para fijar en un punto. El paciente mantiene la fijación en un punto externo, lo que permite centrar el ojo y el módulo gracias al reflejo del haz del láser. El mismo aparato tiene un proyector de luz para fijación externa, está anclado en el brazo de apoyo de la cabeza para que con dicha luz dirija la mirada. Esta fijación es válida para explorar córnea central, pero no es muy útil cuando queremos explorar zonas más periféricas como el limbo. Por ello, se desarrolló una presentación para una tableta digital que mediante diferentes secuencias de puntos centelleantes en fondo negro y en diferentes posiciones se dirigía la mirada del ojo contralateral al explorado y así facilitarnos la exploración. 144 III.PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS La colocación en el aparato fue con un brazo articulado. La presentación mediante una aplicación era ejecutable y administrable desde otro dispositivo digital por lo que se podía controlar externamente. Al realizar unas primeras pruebas vimos que al estar tan cerca del ojo, el esfuerzo acomodativo implicaba una sinergia de convergencia ocular que implicaba la incorrecta alineación del ojo por lo que tuvimos que recurrir a instruir al paciente a mirar en puntos más lejanos de la habitación, en la pared que había frente al paciente, para poder explorar el limbo. Por último, tras visualizar lo que denominamos “punto blanco”, que aparece en la zona central de la pantalla y nos indica que está en posición neutra, se acerca el aparato hasta que el TomoCap® contacte con el vértice corneal. La lente objetivo contacta con la córnea ya anestesiada a través del gel de Viscotears®. Una vez contacta, en el monitor del ordenador se muestran imágenes en tiempo real. Se sitúa el objetivo totalmente perpendicular a la córnea consiguiéndose una imagen completa en el monitor. Si la orientación no es totalmente perpendicular, parte de la imagen no aparece, se observa un corte perpendicular u oblicuo del epitelio corneal. Mediante el ajuste antero-posterior se localiza el plano focal correspondiente a la capa de células que se desea medir, empezando desde la superficie. Se debe tener cuidado de no ejercer excesiva presión para evitar la formación de pliegues y mantener la integridad corneal, aunque es inevitable aplanarla ligeramente. Siendo una prueba de contacto y con alta magnificación, la colaboración del paciente es imprescindible. B. Estadiaje (según Deng SX)(78). Tras el análisis con microscopía confocal se realiza análisis de las imágenes que conlleva: 145 III.PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS 1. Análisis de las células según los parámetros marcados en el artículo de Deng(78). 2. Contaje de células basales centrales y periféricas, alares y superficiales con el mismo software que proporciona el Microscopio Confocal HRT II. 3. Recuento de plexo nervioso subasal tras exportar imágenes de confocal en formato “jpg” y usando el software Image J junto con el plugin Neuron J. Se debe instalar el software image J -es gratuitodesde la página http:// rsb.info.nih.gov/ij/download.html (313, 314). Luego el plugin Neuron J http:// www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ (315, 316). Se reinicia el programa, para que el plugin funcione con el programa Image J. Existen tutoriales del Image J, pero el único que encontramos del neuron J es muy básico y por supuesto no informa de como medir la densidad de nervios. Por ello, se solicitó ayuda de un Ingeniero Industrial que nos explicó su manejo. Se corta la imagen para descartar la etiqueta con los datos del paciente y se deja sólo la imagen con un tamaño conocido de 400 por 400 micras. Se señalan los tramos nerviosos que se distinguen por su morfología, de color blanco sobre fondo gris oscuro, luego se analiza y mediante un proceso matemático nos da el valor en µm de longitud de nervios por área (mm2) que es como aparecen en la mayoría de las publicaciones. También se puede valorar su estructura, uniones, ramificaciones, morfología y dirección. 4. Exploración de las empalizadas y criptas limbares en cuatro puntos: superior, inferior, nasal y temporal, junto con el búsqueda de células caliciformes en la superficie corneal. 146 III.PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS III.4. TAMAÑO MUESTRAL. El tamaño muestral ha sido determinado según los diferentes objetivos. Para la comparación de medias en dos muestras independientes (muestras provenientes de la subdivisión realizada por el criterio de pannus mayor de 180º limbares y más de 1 mm de avance corneal), se usó el método “test de Satterthwaite para varianzas y tamaños muestrales desiguales” del programa para “Cálculo de Tamaño Muestral” nQuery Advisor Release 7.0 (Statistical Solutions, Broadway, Saugus, Massachussetts, U.S.A., 2002), y la información proporcionada por muestras pilotos. Dado la complejidad de obtener pacientes que cumplieran la condición de pannus mayor de 180º limbares y más de 1 mm de avance corneal, ya que se trata del estadio más avanzado, planificamos la determinación del tamaño de muestra para el estudio de la variable densidad de nervios del plexo subasal mediante confocal con tamaños de grupos desiguales. Para detectar una diferencia de al menos 3000 µm/mm2 de la variable densidad de nervios del plexo subasal mediante confocal entre pacientes con pannus mayor de 180º limbares y más de 1 mm de avance corneal o menor que esta afectación, desviaciones típicas de 1100 y 6500 µm/mm2 en sendos grupos (obtenidas de un estudio piloto realizado por nosotros), un error α del 5% y un error β del 20% (potencia del 80%) necesitamos 15 y 42 ojos, respectivamente. El tamaño muestral fue determinado también con el fin de estimar el coeficiente de correlación intraclase, como una medida de la fiabilidad entre mediciones realizadas por diferentes métodos a los mismos sujetos. Para el cálculo de dicho tamaño asumimos un valor esperado del coeficiente de correlación intraclase de 0,6 en la situación más desfavorable (obtenido de una experiencia previa), un nivel de confianza del 95%, una 147 III.PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS precisión o amplitud del intervalo de 0,15 y la realización de 2 métodos de medidas. Con toda esta información necesitamos al menos 71 ojos. Para el estudio de las relaciones entre pruebas que medían magnitudes diferentes en unidades distintas, como fue en la comparativa entre OSDI y enrojecimiento bulbar, y entre la altura del menisco lagrimal y Schirmer I, determinamos los coeficientes de correlación lineal de Pearson para lo cual determinamos el tamaño muestral necesario usando el valor esperado 0,47 de este coeficiente obtenido a partir de un estudio previo, un valor de α del 5% y una potencia 1-β del 80%. Con estos datos resultó un tamaño mínimo para ejecutar el estudio de 30 ojos. Para el cálculo del tamaño muestral se ha utilizado el programa nQuery Advisor Release 7.0 (Statistical Solutions, Broadway, Saugus, Massachussetts, U.S.A., 2002). 148 III.PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS III.5. ANALISIS ESTADÍSTICO III.5.1. DESCRIPTIVA GENERAL DE LA MUESTRA Y PRINCIPIOS GENERALES DEL ANÁLISIS REALIZADO El análisis de los datos se realizó con el paquete estadístico IBM SPSS Statistics 22.0 para Windows. Se realizó dicho análisis en el Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública de la Universidad de Sevilla. El análisis descriptivo de los datos se realizó mediante porcentajes para las variables cualitativas. En cuanto a las variables cuantitativas se resumieron con medias y desviaciones típicas, o bien con medianas y percentiles P25 y P75 en caso de distribuciones marcadamente asimétricas. Para relacionar dos variables cualitativas se realizó tablas de contingencia y se utilizó la prueba Chi-Cuadrado o bien, los métodos no asintóticos de Montecarlo y prueba Exacta. Para la comparación de variables numéricas entre los dos grupos se aplicó la prueba paramétrica de la t-Student para muestras independientes, o en su defecto la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney en caso de distribuciones no normales. En el caso que se obtuvieron diferencias significativas, se hallaron intervalos de confianza al 95% para diferencias de medias o medianas (estimación de intervalos de confianza de HodgesLehman). III.5.2. ANÁLISIS DE LA RELACIÓN DE LA PRESENCIA DE PANNUS CON LAS DEMÁS VARIABLES, EN ESPECIAL CON LA DENSIDAD CELULAR DEL EPITELIO CORNEAL Y DENSIDAD DEL PLEXO NERVIOSO SUBASAL Para ello se dividió la muestra mediante tres criterios según afectación en sectores horarios e invasión hacia el centro corneal en diferentes grupos. Con esto queríamos estudiar 149 III.PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS el efecto que tenía sobre las variables de estudio, grados crecientes de pannus, desde la mínima presencia de pannus hasta afectación mayor de 180º y más un milímetro de invasión corneal (tabla 10). El primer criterio utilizado para la división en dos grupos fue la presencia de pannus (dicotómica, si o no). Tomando esta variable como dependiente se analizaron las demás variables independientes a fin de valorar su relación. El procedimiento seguido para buscar la relación entre dos variables cualitativas fue primero, crear unas tablas de contingencia y se utilizó posteriormente, la prueba Chi-Cuadrado o bien, los métodos no asintóticos de Montecarlo y prueba Exacta. La Chi cuadrado de Pearson se usó si el porcentaje de casillas que tienen un recuento menor que 5 es menor del 25% y el recuento mínimo esperado es mayor o igual a uno. Si esto no se cumple en alguno de estos dos criterios se usó el Método de Monte Carlo. Para la comparación de variables numéricas entre los dos grupos (variable cualitatita dicotómica) se aplicará la prueba paramétrica de la t-Student para muestras 150 Tabla 10.Criterios de subdivisión de pannus para analizar el comportamiento de las variables estudiadas GRADO DE PANNUS GRUPO 1 GRUPO 2 PANNUS PANNUS NO PANNUS CUADRANTE <3H PANNUS ≥3H PANNUS MEDIA CÓRNEA Y <1MM >1MM Y <180º <1 MM Y ≥180º III.PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS independientes, o en su defecto la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney en caso de distribuciones no normales (tabla 10). El segundo criterio, dividió la población en pannus con afectación de menos de 3 sectores horarios y el resto, mayor o igual a 3 sectores horarios. Se analizó de la misma forma que el punto anterior, la relación entre las variables (tabla 10). Mediante el tercer y último criterio se compararon un grupo que cumplía tener pannus mayor de 1 mm de invasión corneal y afectación mayor o igual a 180 grados de la circunferencia limbar, con el otro grupo, con menor afectación tanto en grados de afectación limbar como en avance de invasión corneal (tabla 10). Con el objetivo de estudiar la influencia de la densidad de células basales centrales y la densidad del plexo nervioso subasal corneal, que consideramos potencialmente como predictoras de pannus en estadio avanzado, que consideramos afectación mayor o igual a 180 grados limbares y mayor de 1 mm de avance corneal, realizamos un modelo de regresión logística binaria. El modelo se construyó mediante un método de introducción directa de variables no automatizado. Para las variables incluidas en el modelo, el método calcula sus odds ratio individuales y sus respectivos intervalos de confianza al 95%. El grado de fiabilidad del modelo se midió con el índice de Hosmer-Lemeshow. III.5.3. CONCORDANCIA DE ESCALAS DE ESTADIAJE La concordancia de los estadiajes clínico de Deng, López-García y Paolo Rama comparados con el de Confocal de Deng se hizo con el índice kappa. Este se trata de un coeficiente de concordancia, en el cual la significación menor de 0,05 indica que el coeficiente es distinto de cero en la población. Ahora bien, el coeficiente kappa mide el grado de concordancia, y no es suficiente que este coeficiente sea distinto de cero para que 151 Figura 22 y 23. Gráficos de Bland-Atlman mostrando la relación entre OSDI III.PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS se pueda hablar de concordancia entre técnicas, observadores, etc. Por ello, Landis y Koch propusieron unos márgenes para valorar el grado de acuerdo en función del índice kappa y los grados de acuerdo aumentan de 0, ningún acuerdo hasta 1, máximo acuerdo (tabla 11). III.5.4. COMPARACIÓN DE LAS MEDIAS DE DENSIDADES CELULARES Y NERVIOS DEL PLEXO SUBASAL CON LAS REFERIDAS EN LA LITERATURA COMO VALORES NORMALES Y CONTROLES SANOS Analizamos la diferencia de las medias o medianas de nuestra muestra de pacientes con IL con respecto a los datos descritos sobre densidad celular epitelial corneal y de nervios del plexo nervioso subasal corneal en población sana. Por otro lado, también se comparó con los datos obtenidos de los controles de nuestra muestra. 152 Tabla 11.Índice de concordancia Kappa. KAPPA GRADO DE ACUERDO <0 SIN ACUERDO 0-0,2 INSIGNIFICANTE 0,2-0,4 BAJO 0,4-0,6 MODERADO 0,6-0,8 BUENO 0,8-1 MUY BUENO III.PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS Para este fin, se procedió primero a realizar un test de normalidad para las densidades celulares y para la de nervios del plexo subasal corneal de nuestra muestra. Para las variables que fueron normales se usó la media y se analizó mediante t de student de una sola muestra comparándose con el valor medio aportado por la literatura de referencia en pacientes sanos. Por el contrario, las densidades en las que su distribución no fue normal estadísticamente, se usó la mediana y se aplicó un test no paramétrico de Wilcoxon. Se realizó cada prueba por cada densidad celular o de nervios expresada en la literatura por separado. Entre los trabajos que se usaron para comparar, se utilizó el primer trabajo que informa sobre las densidades celulares y el de mayor tamaño muestral, en nuestro conocimiento. El primer caso describía densidades celulares obtenidas con un tipo de microscopio confocal (microscopio confocal slit-scanning) distinto al usado en nuestro trabajo (microscopio confocal laser-scanning) por lo que los comparamos para ver densidades obtenidas con distintos microscopios (Mustonen 1998)(103). Por otro lado, el de mayor tamaño muestral usó el mismo tipo de microscopio confocal que en nuestro trabajo (Eckard 2006) (102). En el caso de la densidad de nervios del plexo subasal, debido a los distintos criterios para medir los nervios y la gran diferencia según los distintos microscopios confocales se eligieron los últimos trabajos sobre densidades de nervios (Niederer y Lagali en 2013). Además el trabajo de Niederer et al. ha sido el de mayor tamaño muestral (207) en sujetos sanos hasta la fecha y en nuestro conocimiento. III.5.5. ANÁLISIS DE LA RELACIÓN DE LA PRESENCIA DE PLEXO NERVIOSO SUBEPITELIAL CON EL RESTO DE VARIABLES Para ello se creó un estadiaje a partir del estadiaje confocal de Deng que contiene tres estadios, I, II, y III, y se le añadió una nueva variable: tener o no plexo nervioso subasal 153 XI. ANEXOS 256 XI. ANEXOS 257 XI. ANEXOS XI.ANEXO 6. APROBACIÓN POR EL COMITÉ DE ÉTICA INTERHOSPITALARIO. 258 DICTAMEN ÚNICO EN LA COMUNIDAD AUTÓNOMA DE ANDALUCÍA D/Dª: Jose Salas Turrents como secretario/a del CEI de los hospitales universitarios Vírgen Macarena-Virgen del Rocío CERTIFICA Que este Comité refrendará de oficio en la reunión celebrada en el día 30/01/2015 la propuesta de (No hay promotor/a asociado/a) para realizar el estudio de investigación titulado: Título del estudio: CORRELACIÓN DE CRITERIOS DIAGNÓSTICOS Y ESCALA DE SEVERIDAD EN LA INSUFICENCIA LIMBAR ASISTIDA CON MICROSCOPÍA CONFOCAL ,( Estadiaje insuficiencia limbar ) Protocolo, Versión: versión 1 HIP, Versión: versión 1 CI, Versión: versión 1 Y que considera que: Se cumplen los requisitos necesarios de idoneidad del protocolo en relación con los objetivos del estudio y se ajusta a los principios éticos aplicables a este tipo de estudios. La capacidad del/de la investigador/a y los medios disponibles son apropiados para llevar a cabo el estudio. Están justificados los riesgos y molestias previsibles para los participantes. Que los aspectos económicos involucrados en el proyecto, no interfieren con respecto a los postulados éticos. Y que este Comité considera, que dicho estudio puede ser realizado en los Centros de la Comunidad Autónoma de Andalucía que se relacionan, para lo cual corresponde a la Dirección del Centro correspondiente determinar si la capacidad y los medios disponibles son apropiados para llevar a cabo el estudio. Lo que firmo en a 13/02/2015 D/Dª. Jose Salas Turrents , como Secretario/a del CEI de los hospitales universitarios Vírgen Macarena-Virgen del Rocío XI. ANEXOS XI. ANEXO 7. VFQ 25 CASTELLANO 259 1" " ! CUESTIONARIO!SOBRE! FUNCIÓN!VISUAL! NEI1VFQ25(VERSIÓN!2000)! (APÉNDICE!ADJUNTO!PARA!NEI1VFQ39!pág.!9112)! ! NOMBRE!DEL!PACIENTE:! ! ! NOMBRE!DEL!ENTREVISTADOR:! ! FECHA:! ______/______/_______! En"primer"lugar","me"gustaría"agradecerle"su"ayuda"en"este"estudio." Este"cuestionario"evalúa"problemas"relacionados"con"su"vista"o"sentimientos"que"usted" tiene"acerca"de"la"condición"de"su"vista." Lea"las"preguntas"de"este"cuestionario"y"escoja"para"cada"pregunta"la"respuesta"que" mejor"describa""su"situación,"rodeándola"el"número"de"la"respuesta"con"un"círculo." Si" usted" lleva" gafas" o" lentes" de" contacto" habitualmente" o" para" alguna" actividad" concreta,"responda"todas"las"preguntas"como"si"las"llevara"puestas,"con"uno"o"los"dos" ojos"abiertos,"como!vea!mejor." Es"importante"que"realice"el"cuestionario"sin"prisas"y"con"respuestas"sinceras,"para"que" el"resultado"sea"representativo."Todas"sus"respuestas"son"confidenciales" ! XI. ANEXOS ! 260 XI. ANEXOS ! 261 XI. ANEXOS ! 262 XI. ANEXOS ! 263 XI. ANEXOS ! 264 XI. ANEXOS ! 265