Pesquisa de técnicas alternativas para análises de rotina de controlo de qualidade na Imperial: teste e viabilidade de aplicação

UMinho | 2021 Mariana Sofia Oliveira Costa Pesquisa de técnicas alternativas para análises de rotina de controlo de qualidade na Imperial Universidade do Minho Escola de Engenharia Mariana Sofia Oliveira Costa Pesquisa de técnicas alternativas para análises de rotina de controlo de qualidade na Imperial: teste e viabilidade de aplicação setembro de 2021 i Universidade do Minho Escola de Engenharia Mariana Sofia Oliveira Costa Pesquisa de técnicas alternativas para análises de rotina de controlo de qualidade na Imperial: teste e viabilidade de aplicação Dissertação de Mestrado Mestrado Integrado em Engenharia Biológica Trabalho efetuado sob orientação do Professor Doutor José António Couto Teixeira e da Engenheira Raquel dos Santos Amorim setembro de 2021 i Direitos de autor e condições de utilização do trabalho por terceiros Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição-NãoComercial CC BY-NC https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ ii Agradecimentos Em primeiro lugar, agradeço à Imperial – Produtos Alimentares, S.A. pela oportunidade de estágio curricular concedida. Agradeço a todos os colaboradores com quem interagi durante estes seis meses de estágio, que de alguma forma me ajudaram, ensinaram e motivaram. Devo um agradecimento especial à Engª Sofia Vieira da Silva pela oportunidade que me deu e que me permitiu aumentar a minha experiência profissional e agradeço à minha orientadora, a Engª Raquel Amorim, pelo tempo e apoio demonstrados, o que permitiu complementar e enriquecer esta tese de dissertação. Mais ainda, agradeço à Ana Lúcia Reis, Mariana Peneda Cubal e Patrícia Macedo pela forma acolhedora como me receberam e à Mafalda Moreira por toda a ajuda e paciência que teve comigo. Em segundo lugar, agradeço à Universidade do Minho por me ter proporcionado este estágio curricular que me fez crescer tanto profissionalmente, como pessoalmente. Ao Prof. José António Teixeira agradeço todo o tempo que dedicou a esclarecer as minhas dúvidas e por todos os conselhos que deu para que eu pudesse realizar o melhor trabalho possível. Agradeço também à minha companheira de viagens e colega de curso, Joana Lisboa Gomes, pela ajuda e paciência nos momentos mais difíceis. Por último, mas não menos importante, devo um especial agradecimento à minha família, em particular à minha mãe e ao meu pai, por todo o apoio dado e por me terem dado todas as condições possíveis para que eu realizasse este estágio curricular, tão longe de casa. Aos meus amigos, agradeço a compreensão pela ausência muitas vezes sentida e por sempre acreditarem em mim. iii Declaração de integridade Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. iv Pesquisa de técnicas alternativas para as análises de rotina do controlo de qualidade da Imperial: teste e viabilidade de aplicação Resumo Esta dissertação foi realizada durante o estágio curricular na empresa Imperial – Produtos Alimentares, S.A., no âmbito do último ano do Mestrado Integrado em Engenharia Biológica e teve como principal objetivo a pesquisa de técnicas alternativas para a realização de análises de rotina de controlo de qualidade na Imperial. Atualmente, a empresa realiza análises microbiológicas (contagem total de microrganismos, contagem de bolores e leveduras, e pesquisa de bactérias coliformes), análises físicoquímicas (determinação do teor de gordura e humidade), análises químicas (micotoxinas) e análises nutricionais (presença de alergénios e açúcares). Em relação às análises microbiológicas, foi realizada uma atualização de procedimentos e uma consequente avaliação dos custos dos diferentes meios de cultura existentes no mercado. Uma vez que a preparação dos meios de cultura é um procedimento muito demorado, foi proposta como alternativa a utilização de meios de cultura prontos a usar que, no entanto, apresentam um custo elevado. Quanto às análises físico-químicas, verificou-se que, quer o método de determinação de humidade, quer o método de determinação de gordura são procedimentos demorados. Como alternativa, foram propostos equipamentos automáticos, que apresentam os resultados mais rapidamente, embora com custos de investimento inicial muito elevados. Para além disso, propôs-se um método adicional de determinação do teor de ácidos gordos livres, usado para avaliar a manteiga de cacau, que consequentemente afeta a qualidade do chocolate. Relativamente às análises químicas de determinação de micotoxinas, estas são realizadas em laboratórios externos, através do método HPLC, pelo que o tempo de obtenção de resultados é demorado. Existem no mercado kits rápidos de deteção de micotoxinas, que foram propostos como alternativa. Finalmente, em relação às análises nutricionais, a Imperial recorre também a laboratórios externos para realizar a determinação de alergénios e açúcares em alguns dos seus produtos. No caso dos alergénios, os métodos ELISA ou PCR utilizados são caros e demorados, o que faz com que a alternativa proposta de utilização de kits rápidos seja muito vantajosa. No caso dos açúcares, como a sacarose, a D-glicose e a D-frutose, o método HPLC utilizado também é muito demorado e uma das poucas alternativas existentes é a utilização de um dispositivo automático e um detetor RFID, que apesar de caro, determina a quantidade de açúcares muito mais rapidamente. Palavras-chave: controlo de qualidade; pesquisa de alternativas; teste e viabilidade. v Alternative techniques research for routine quality control analysis at Imperial: test and feasibility of application Abstract This dissertation was carried out during the curricular internship at the company Imperial – Produtos Alimentares, SA, within the last year of the Integrated Master in Biological Engineering and had as its main objective the research of alternative techniques for carrying out routine quality control analyses in Imperial. Currently, the company performs microbiological analyzes (total microorganism count, mold and yeast count, and research for coliform bacteria), physicochemical analyzes (determination of fat and moisture content), chemical analyzes (mycotoxins) and nutritional analyzes (presence of allergens and sugars). Regarding microbiological analyses, an update of procedures was carried out and a consequent evaluation of the costs of the different culture media on the market was carried out. Since the preparation of culture media is a very time-consuming procedure, it was proposed as an alternative the use of readyto-use culture media, which, however, have a high cost. As for the physicochemical analyses, it was found that both the moisture determination method and the fat determination method are time-consuming procedures. As an alternative, automatic equipment has been proposed, which show results more quickly, although with very high initial investment costs. Furthermore, an additional method of determining the free fatty acid content was proposed, used to evaluate cocoa butter, which consequently affects the quality of chocolate. Regarding chemical analyzes for the determination of mycotoxins, these are carried out in external laboratories, using the HPLC method, which means that the time taken to obtain results is lengthy. There are quick mycotoxin detection kits on the market, which have been proposed as an alternative. Finally, in relation to nutritional analyses, Imperial also uses external laboratories to carry out the determination of allergens and sugars in some of its products. In the case of allergens, the ELISA or PCR methods used are expensive and time-consuming, which makes the proposed alternative of using rapid kits very advantageous. In the case of sugars, such as sucrose, D-glucose, and D-fructose, the HPLC method used is also very time-consuming and one of the few alternatives available is the use of an automatic device and an RFID detector, which, despite being expensive, determines the amount of sugar much more quickly. Keywords: quality control; alternative research; testing and feasibility. vi Índice Índice de figuras ................................................................................................................................. ix Índice de tabelas ................................................................................................................................. x Lista de abreviaturas, acrónimos e siglas ............................................................................................ xi Capítulo 1. Introdução ........................................................................................................................ 1 1.1. Enquadramento ...................................................................................................................... 1 1.2. Objetivos ................................................................................................................................. 1 1.3. A empresa: Imperial ................................................................................................................ 2 1.4. Metodologia de investigação .................................................................................................... 4 1.5. Estrutura da dissertação .......................................................................................................... 4 Capítulo 2. Revisão bibliográfica .......................................................................................................... 6 2.1. A História do chocolate ............................................................................................................ 6 2.2. Processo de produção de chocolate ......................................................................................... 8 2.2.1. Transformação dos grãos de cacau .................................................................................. 9 2.2.2. Produção de pasta de cacau, manteiga de cacau e cacau em pó .................................... 11 2.2.3. Produção de chocolate ................................................................................................... 14 2.3. Controlo de qualidade na produção de chocolate ................................................................... 20 2.3.1. Importância do controlo de qualidade ............................................................................. 20 2.3.2. Procedimentos usados no controlo de qualidade na produção de chocolate .................... 23 2.3.2.1. Avaliação das matérias-primas e dos materiais de embalagem ................................ 23 2.3.2.2. Controlo do processo de fabrico .............................................................................. 24 2.3.2.3. Inspeção do produto acabado ................................................................................. 26 Capítulo 3. Pesquisa de técnicas alternativas às análises de rotina .................................................... 28 3.1 Análises de rotina: situação atual ............................................................................................ 28 3.1.1. Análises microbiológicas ................................................................................................ 28 3.1.1.1. Contagem total de microrganismos ......................................................................... 28 3.1.1.2. Contagem de bolores e leveduras ........................................................................... 30 3.1.1.3. Pesquisa de bactérias coliformes ............................................................................ 31 3.1.1.4. Contagem de E. coli, pesquisa de Salmonella e outras análises ............................... 32 3.1.2. Análises físico-químicas .................................................................................................. 32 3.1.2.1. Determinação do teor de gordura ............................................................................ 32 3.1.2.2. Determinação do teor de humidade ........................................................................ 34 3.1.3. Análises químicas e nutricionais ..................................................................................... 35 3.1.3.1. Determinação de micotoxinas ................................................................................. 35 3.1.3.2. Determinação de alergénios .................................................................................... 37 2 Assim, o principal objetivo desta dissertação é a pesquisa de técnicas alternativas para a realização de análises de rotina de controlo de qualidade na Imperial. Atualmente, a empresa realiza análises microbiológicas: contagem total de microrganismos, contagem de bolores e leveduras e pesquisa de bactérias coliformes; análises físico-químicas: determinação do teor de gordura e humidade; análises químicas: micotoxinas; e análises nutricionais: presença de alergénios e açúcares. As alternativas devem ser mais rápidas e fáceis de executar, sendo por isso necessário testar e avaliar a viabilidade da sua aplicação. 1.3. A empresa: Imperial A Imperial posiciona-se atualmente como o maior fabricante nacional de chocolates e é detentora das principais marcas do mercado. Para além disso, a empresa tem uma forte aposta internacional através da introdução e comercialização das suas marcas em diferentes mercados, estando presente em mais de 45 países, distribuídos por quase todos os continentes (Imperial, 2021). Esta empresa foi fundada em 1932 em Vila do Conde, por Manuel Dias da Silva que regressou do Brasil com uma nova fórmula de chocolate concretizando o sonho de criar uma fábrica de chocolates em Portugal com o apoio do seu irmão e de um amigo. Porém, só a partir de 1973, com a compra da Imperial - Produtos Alimentares, S.A. pelo Grupo RAR, é que a empresa começou uma fase crescente de sucesso. Os investimentos realizados levaram a um aumento da capacidade produtiva e à criação de marcas que atingiram um elevado nível de notoriedade no mercado português de chocolates, como é o caso da Pintarolas, da Fantasias e da Jubileu, lançadas no início da década de 80 (Imperial, 2021). Por volta de 1985, o mercado de chocolates português era dominado por duas empresas: a Regina, a Sul e a Imperial, a Norte. A empresa Regina, com o aparecimento das cadeias de distribuição modernas e de multinacionais em Portugal, começou a perder a sua capacidade competitiva, resultando numa queda de vendas (Imagens de Marca, 2011). Pelo contrário, a empresa Imperial cresceu em 1993, com a criação da Imperial - Comércio e Distribuição de Produtos Alimentares, S.A., como resposta à evolução do sector e para garantir uma maior flexibilização e especialização, autonomizando-se a atividade industrial da comercialização e distribuição dos produtos (Imperial, 2021). Desta forma, e apesar do declínio da empresa Regina, a Imperial decide em 2000, adquirir esta marca ao reconhecer o seu grande potencial e depois de vários estudos de mercado realizados. Assim, a Imperial relança a marca Regina na Páscoa de 2002, com uma nova geração de produtos, como as amêndoas e avelãs cobertas com chocolate, que rapidamente conquistaram a liderança do mercado 3 (Imagens de Marca, 2011). Ainda no ano 2002, a Imperial foi certificada no Sistema de Gestão da Qualidade segundo a norma ISO 9001:2000 (Imperial, 2021). Em 2004, houve a fusão das duas empresas existentes, por incorporação da Imperial – Comércio e Distribuição de Produtos Alimentares, S.A. na Imperial – Produtos Alimentares, S.A. e devido ao contínuo crescimento, a Imperial inaugurou em 2007 uma nova unidade industrial de moldação e embalagem de tabletes e bombons. Este investimento providenciou à empresa meios tecnológicos que lhe permitiram não só aumentar a sua capacidade de produção como também desenvolver novos produtos diferenciadores. Consequentemente, em 2008, a Imperial reforça a sua presença no mercado ao aumentar o seu portfólio de produtos como tabletes, frutos secos com chocolate e bombons e ainda rejuvenesceu as suas marcas emblemáticas, Regina e Jubileu. Para além disso, em 2009 a empresa realizou um investimento numa nova linha de fabrico de massas de chocolate que entrou em funcionamento em 2010 (Imperial, 2021). Em 2015, a Imperial foi adquirida pelo fundo Vallis Sustainable Investments I , levando em 2017 a um investimento numa nova unidade industrial de drageias de chocolate com a mais avançada tecnologia, como comemoração dos 85 anos. Nos últimos anos, tendo a inovação como prioridade estratégica, a Imperial adaptou os seus produtos a requisitos muito específicos, o que permitiu o seu lançamento em segmentos especiais, como chocolates sem açúcar ou com redução de açúcar, vegan, + proteína, sem glúten, Kosher e Halal (Imperial, 2021). Já em 2020, a Imperial registou uma quebra de mais de 50 % na procura dos seus produtos direcionados para a Páscoa, devido à pandemia de covid-19, uma vez que o chocolate não é considerado um bem essencial (Jornal Renovação, 2020). De facto, o confinamento provocado pela pandemia veio alterar os hábitos de consumo dos apreciadores de chocolate a nível mundial e este ano, a Imperial registou uma maior procura por tabletes de chocolate e produtos de culinária, em vez dos bombons e frutos secos cobertos de chocolate, segmento que mais cresceu em 2019 (Castro, 2020). Apesar de tudo, a Imperial investiu 3 000 000 € numa nova unidade de moldação e embalamento, o que permitirá aumentar 30 % da sua capacidade produtiva daquele que é o maior segmento do mercado de chocolates a nível mundial, as tabletes de chocolate (Castro, 2020; Imperial, 2021). Na Figura 1, é possível observar alguns dos produtos da vasta gama da Imperial. 4 Figura 1 - Exemplos de marcas Imperial: Pintarolas, Regina e Pantagruel (Adaptado de Imperial, 2021) . 1.4. Metodologia de investigação De modo a atingir os objetivos definidos anteriormente, a metodologia de trabalho desenvolvida passou pelas seguintes fases: 1. Análise dos métodos atualmente utilizados pela empresa a. Observar e acompanhar os métodos atualmente utilizados pela empresa para a realização de análises microbiológicas de rotina, para garantir o controlo de qualidade. b. Registar eventuais limitações que os métodos atualmente utilizados possam apresentar. 2. Pesquisa de métodos alternativos a. Pesquisar métodos alternativos em fontes bibliográficas fidedignas; b. Comparar a documentação existente e recolhida nos laboratórios sobre os métodos atualmente utilizados com a documentação recolhida de métodos alternativos; c. Analisar se as alternativas propostas implicam alterações nos materiais e equipamentos disponíveis na empresa; d. Avaliar o custo do material atual em comparação com o custo do material alternativo. e. Por último, selecionar um método alternativo para cada tipo de análise de rotina necessária. 3. Teste e viabilidade dos métodos alternativos a. Testar métodos alternativos escolhidos em diversos produtos acabados e matérias-primas; b. Concluir se os métodos alternativos são ou não viáveis para implementação no laboratório da empresa. 1.5. Estrutura da dissertação Esta dissertação encontra-se estruturada em cinco capítulos principais, que por sua vez se dividem em subcapítulos. Neste primeiro capítulo, é feito um enquadramento geral sobre o trabalho desenvolvido, nomeadamente a apresentação do tema, incluindo os principais objetivos definidos e ainda uma descrição sobre a empresa. 5 No segundo capítulo, intitulado por “Revisão bibliográfica”, apresenta-se todo o contexto teórico subjacente ao assunto da dissertação, nomeadamente, a história do chocolate, o processo de produção do chocolate e a forma como se realiza o controlo de qualidade na produção de chocolate. No terceiro capítulo, designado por “Pesquisa de técnicas alternativas às análises de rotina”, são apresentadas todas as análises de rotina atualmente utilizadas no controlo de qualidade da Imperial, sendo posteriormente exposto um conjunto de técnicas alternativas para essas análises de rotina. No quarto capítulo, cujo nome é “Teste e viabilidade das alternativas propostas”, realiza-se uma apresentação dos resultados dos testes efetuados às alternativas propostas no capítulo anterior, e é feita uma comparação entre o método atual e a alternativa proposta, de forma a perceber qual a mais adequada e qual a viabilidade de aplicação da alternativa proposta. Por fim, no quinto capítulo, apresenta-se as principais conclusões obtidas no trabalho desenvolvido, bem como algumas recomendações futuras, nomeadamente, no que diz respeito ao teste de algumas das alternativas propostas. 6 Capítulo 2. Revisão bibliográfica Neste capítulo são apresentados os tópicos mais relevantes para compreender o tema desta dissertação, nomeadamente: A História do chocolate, Processo de produção de chocolate e, por último, Controlo de qualidade do chocolate. Com esta pesquisa bibliográfica, pretende-se facultar um enquadramento sobre como surgiu e como se produz chocolate, bem como a importância do controlo de qualidade dos alimentos em geral, e do chocolate, em particular. 2.1. A História do chocolate O chocolate é um produto alimentar produzido a partir da planta do cacau (cacaueiro), que se encontra em estado sólido à temperatura ambiente normal, mas que se derrete facilmente na boca (Beckett, 2008). Este é conhecido mundialmente pelo seu sabor doce e prazeroso, fazendo com que quase todas as pessoas, principalmente as crianças, o adorem (Verna, 2013). Por este motivo, o chocolate está muitas vezes associado a determinadas festividades, como por exemplo o Dia dos Namorados ou a Páscoa. Em relação à origem do cacau, acredita-se que este exista há cerca de 3 000 ou 4 000 anos (Cook, 1982) e que as primeiras plantações conhecidas tenham sido estabelecidas pelo povo maia nas planícies do Sul de Yucatan, no México, por volta de 600 d.C. (Beckett, 2008). Apesar de não ser possível saber verdadeiramente onde e quando cresceu o cacaueiro pela primeira vez, é importante referir que a planta que se conhece hoje é o resultado da seleção e cruzamento que começou há milhares de anos (Verna, 2013). Em 1 200 d.C., com o domínio asteca sobre os maias, os grãos de cacau passaram a ter grande valor: eram utilizados não só como alimento, mas também como moeda de troca. De acordo com alguns registos antigos, os astecas acreditavam que o cacaueiro tinha origem divina, através do deus Quetzalcoatl que o tinha trazido à Terra. Assim, aprenderam a torrar e a moer os grãos, de forma a obter uma pasta nutritiva e solúvel em água. Com a adição de especiarias, como a canela e a pimenta, que realçavam o sabor forte e amargo, surgiu a bebida “xocolatl” (Verna, 2013). Esta bebida foi particularmente apreciada pelo imperador Montezuma, que supostamente consumia dezenas de xícaras por dia, mais pelos seus efeitos revigorantes e estimulantes do que propriamente pelo seu sabor (Beckett, 2008). Assim, o chocolate começou por ser uma bebida amarga, gordurosa e fria, devido à forma como o cacau era produzido, muito diferente das dos dias de hoje. Em 1502, reza a história que Cristóvão Colombo teve o primeiro contacto com o cacau e até comprou alguns grãos para levar para a Europa, mas só quando os espanhóis conquistaram o México é que Don 7 Cortez trouxe a bebida para o Velho Continente em 1520 (Afoakwa, 2010; Beckett, 2008). No início, os espanhóis seguiram a receita dos astecas, com adição de pimenta e especiarias picantes, mas o sabor amargo e adstringente da “xocolatl” fez com que nem todos a apreciassem. Mesmo com a adição de açúcar para tornar o sabor doce e macio, esta bebida permaneceu praticamente desconhecida no resto da Europa por quase cem anos (Beckett, 2008; Verna, 2013). A partir de 1660, o chocolate quente doce começou a espalhar-se por vários países da Europa como remédio, mas como esta bebida era muito cara, a sua difusão deu-se por meio das relações entre famílias poderosas (Beckett, 2008). Contudo, só a partir do século XVIII, com a Revolução Industrial, é que o consumo de chocolate se tornou amplamente alargado, desde a Inglaterra à Itália, apesar das muitas diferenças culturais e políticas. Esta crescente procura por grãos de cacau levou à introdução da planta nas colónias portuguesas, britânicas e holandesas em África e na Ásia, provocando uma queda do preço do cacau (Afoakwa, 2010; Cidell & Alberts, 2006). De facto, a Revolução Industrial trouxe mudanças importantes para a indústria do chocolate, que influenciaram fortemente a produção e o consumo de chocolate. Primeiro, Joseph Fry, na Inglaterra, usou uma máquina a vapor para moer grãos de cacau, fazendo com que este produto fosse processado em grande quantidade e se tornasse mais acessível. Mais importante, porém, foi a aplicação de métodos de produção industrial que incluíssem o uso do que antes era considerado desperdício (Cidell & Alberts, 2006). Em 1828, o químico holandês van Houten inventou uma prensa hidráulica que separava a gordura em excesso (manteiga de cacau) da pasta de cacau, formando a torta de cacau que podia depois ser transformada em pó com 23 % de cacau (Afoakwa, 2010; Minifie, 2012). Apesar deste processo ter melhorado a qualidade do chocolate consumido, também provocou uma perda de cerca de 30 % da pasta de cacau na forma de manteiga de cacau (Dand, 2011a). Simultaneamente, Joseph Fry e os filhos estavam a tentar produzir chocolate na sua forma sólida e acabaram por descobrir que a manteiga de cacau extraída afinal possuía valor. Ao ser adicionada à pasta de cacau e açúcar, a manteiga de cacau permite que a mistura alcance a consistência e o sabor certos para fazer chocolate sólido (Afoakwa, 2010; Cidell & Alberts, 2006). Mais ainda, em 1876, Daniel Peter formulou a primeira receita comercial de chocolate de leite, utilizando a invenção de leite em pó de Henry Nestlé, cuja fábrica de laticínios ficava ao lado da sua (Afoakwa, 2010; Minifie, 2012). Para além do sabor mais suave, o chocolate de leite trouxe a vantagem de ser mais barato, pois menos quantidade da matéria-prima mais cara – o cacau – é necessário. Vários outros seguiram o exemplo de fazer este chocolate de sabor mais suave e, atualmente, este constitui a maior parte do consumo de cacau (Dand, 2011a). 8 Finalmente, em 1879, Rodolphe Lindt apresentou a última grande técnica de fabrico para produzir o chocolate "moderno": a conchagem. Este processo, que consiste numa mistura da pasta de cacau com a manteiga de cacau, a temperaturas elevadas, permite produzir uma massa de chocolate mais lisa e fina e melhorar o sabor do chocolate, removendo alguns ácidos voláteis (Dand, 2011a). Só a partir de 1900, com a queda de preço dos dois principais ingredientes, o cacau e o açúcar, é que o chocolate se tornou acessível à classe média. Nas décadas seguintes, matérias-primas mais baratas e processos de produção mais eficientes surgiram na vanguarda da inovação com tecnologias de fabrico rápidas e novas técnicas de marketing, democratizando o consumo de chocolate (Afoakwa, 2010). Nos últimos anos, vários produtores de chocolate transmitiram a ideia de que quanto maior a percentagem de pasta de cacau e, consequentemente, menor a quantidade de açúcar e leite, “melhor” é o chocolate. Contudo, os testes aos consumidores mostram uma preferência de 50 a 60 % de pasta de cacau (Cidell & Alberts, 2006). Assim, apesar da produção de chocolate sólido só ter começado em 1847, este tornou-se muito popular e superou o chocolate líquido em termos de vendas no início do século XX, mantendo-se até aos dias de hoje. Esta mudança também levou à formação de dois tipos de fabricantes: os que convertem os grãos de cacau em pasta de cacau, manteiga de cacau ou cacau em pó, e os que realmente fazem o chocolate e, embora, não muito bem definida, esta distinção ainda existe (Dand, 2011a). 2.2. Processo de produção de chocolate Após um enquadramento histórico sobre o chocolate e a forma como este era antes consumido, é agora necessário conhecer as matérias-primas e as operações unitárias envolvidas na produção de chocolate em grande escala. A forma como o chocolate é feito determina o sabor e a textura finais do chocolate (Talbot, 2009). Na Figura 2 encontra-se o fluxograma do processo de produção de chocolate, na sua forma mais simplificada possível. Em seguida, serão apresentadas todas as etapas do processamento de chocolate, desde os grãos do cacaueiro até ao embalamento do chocolate. Porém, tal como já foi dito, há uma distinção entre as empresas produtoras de manteiga e pasta de cacau e as produtoras de chocolate, como é o caso da Imperial. 9 Figura 2 - Fluxograma do processo de produção de chocolate. 2.2.1. Transformação dos grãos de cacau Cerca de 90 % do cacau mundial é cultivado por pequenos proprietários. Apesar do cacau ter surgido no norte da América do Sul e na América Central, atualmente a planta do cacau é cultivada em várias zonas do globo, maioritariamente na África, sendo que 40 % é proveniente da Costa do Marfim (Talbot, 2009). Quanto à planta do cacau, de nome científico Theobroma cacao , existem quatro tipos: Criollo, Forastero, Trinitario e Nacional. Atualmente, a subespécie Forastero é a mais conhecida e representa grande parte da produção mundial de cacau devido à sua grande resistência a doenças, sendo por isso facilmente cultivada. Contrariamente, a subespécie Criollo possui uma baixa representatividade da produção mundial devido à sua predisposição a doenças, tornando assim difícil o seu cultivo (Caligiani, Marseglia, & Palla, 2016). 10 Em relação à variedade de cacau Trinitario, esta surgiu como resultado da hibridização entre as subespécies Crioulo e Forastero e não pode ser encontrada na natureza. Já a subespécie Nacional, é conhecida por produzir os grãos com sabor “arriba” que possui simultaneamente notas de sabor floral e picante (Beckett, 2009). Apesar das diferenças existentes, todos estes tipos de cacau crescem em áreas de alta pluviosidade, preferindo grandes percentagens de humidade, normalmente entre 70 e 80 % e as temperaturas médias devem estar entre os 18 ºC e os 32 ºC (Talbot, 2009). Por outro lado, a maioria dos cacaueiros possuem períodos de floração bem definidos (duas vezes ao ano), mas existem algumas plantas que florescem quase continuamente. Assim, os frutos dos cacaueiros desenvolvem-se, normalmente, após cinco a seis meses e são colhidos manualmente dos troncos e galhos. Posteriormente, é necessário abrir o fruto ou vagem de maneira a soltar os grãos, tal como se pode verificar na Figura 3 (Talbot, 2009). Figura 3 - Grãos de cacau no fruto ou vagem (Cook, 2021) . Por norma, existem cerca de 30 a 45 grãos na vagem, cobertos por uma polpa branca que se encontra presa a um núcleo central. Neste momento, os grãos não contêm os produtos químicos que dão os sabores conhecidos. Estes sabores formam-se e desenvolvem-se durante as etapas seguintes, que são a fermentação e secagem (Talbot, 2009). Na etapa de fermentação, vários métodos podem ser usados, dependendo do agricultor, da área ou país, por exemplo. Assim, os grãos frescos podem ser colocados em caixas de madeira, cestos ou até em pilhas cobertas com folhas de bananeira, como acontece na África Ocidental (Giacometti, Jolić, & Josić, 2015). Nesta fase, ocorrem reações químicas, porque a polpa branca contém leveduras e bactérias naturais que causam a quebra dos açúcares e da mucilagem, havendo mudança de cor e formação de alguns dos precursores de sabores (Talbot, 2009). 11 De seguida, como os grãos fermentados possuem um teor de humidade de cerca de 55 %, é necessário reduzir os níveis de humidade para os 7 % a 8 %, para que seja possível realizar um adequado armazenamento e transporte (Giacometti et al., 2015). Assim, os grãos são expostos ao sol durante 12 a 20 dias em locais onde o clima é suficientemente ensolarado. Caso contrário, é necessário recorrer a métodos de secagem artificiais, utilizando ar quente com uma temperatura máxima de cerca de 60 ºC (Caligiani et al., 2016). Para além de evitar a consequente formação de bolores, esta etapa é de extrema importância para manter o sabor e a textura dos grãos. Se a humidade for muito elevada, os grãos irão ficar mofados, dando um sabor desagradável e se a humidade estiver abaixo dos 6 %, estes ficam muito quebradiços, sendo difícil o seu posterior processamento (Talbot, 2009). Por fim, os grãos são separados por tamanho e qualidade e armazenados em sacos para depois serem vendidos ou utilizados noutro local (Caligiani et al., 2016). Assim, é importante referir que a qualidade do grão depende de vários fatores, não só do tipo de cacau e de solo, como também das condições climatéricas. Além destes fatores, as etapas de fermentação e secagem também influenciam diretamente o sabor final do grão (Talbot, 2009). 2.2.2. Produção de pasta de cacau, manteiga de cacau e cacau em pó Os grãos de cacau chegam à fábrica em sacos e devem ser imediatamente utilizados ou então armazenados em boas condições. Se forem armazenados, estes devem ser colocados em salas frias, secas e bem ventiladas, para que os grãos não sejam expostos a odores e humidade elevada e deve-se garantir a proteção dos sacos contra infestações. Assim, os grãos de cacau passam primeiro por uma máquina de limpeza, em que são removidos materiais estranhos, como paus, pedras, metais e fibras do próprio saco de transporte que podem provocar problemas nas máquinas seguintes (Cook, 1982). De seguida, os grãos são torrados, usando tanques de agitação a uma temperatura inferior a 150 ºC, durante 30 a 120 min (Caligiani et al., 2016). Esta etapa serve principalmente para desenvolvimento do aroma que denominamos de chocolate, eliminação de ácidos voláteis, escurecimento da cor do grão para um castanho mais profundo e eliminação do excesso de humidade (Cook, 1982). Consequentemente, é necessário remover as cascas dos grãos que ficaram mais soltas com a torrefação. Esta etapa de descasque recorre à aspiração (joeiramento), sendo necessário controlar o volume e a velocidade do ar para que resultem os nibs , como se observa na Figura 4 (Talbot, 2009). 18 Tal como se pode constatar na Figura 10, o chocolate é primeiro aquecido até aos 50 ºC, para garantir o derretimento completo da gordura. De seguida, sofre um arrefecimento até aos 32 ºC e é misturado de forma a induzir a cristalização. Na terceira etapa, o chocolate é novamente arrefecido até aos 27 ºC, correspondendo à cristalização propriamente dita e por fim, para que haja a conversão de quaisquer cristais instáveis, o chocolate é aquecido até aos 30 ºC (Afoakwa, 2010). No entanto, é de notar que as temperaturas precisas podem variar dependendo da receita, do equipamento de temperagem e até mesmo da finalidade para a qual o chocolate será usado (Beckett, 2009). Este processo ainda pode ser realizado manualmente para produzir pequenas quantidades de chocolate, colocando o chocolate numa tábua de mármore e misturando com uma espátula até começar a engrossar, mas as máquinas de temperagem automática são agora amplamente utilizadas (Beckett, 2009). Assim, é fundamental temperar o chocolate para que este tenha uma forma polimórfica adequada, que influencia as características de qualidade final, como cor, dureza, manuseio e acabamento (Afoakwa, 2010). Depois da temperagem, o chocolate é colocado em depósitos que possuem filtros capazes de eliminar alguns contaminantes e depois, dependendo do tipo de produto que se pretende produzir, é possível realizar a moldação, o revestimento ou o drageamento. Em relação à moldação, este processo é utilizado maioritariamente para produzir tabletes, mas também pode ser usado para produzir figuras de chocolate. No equipamento representado na Figura 11 são depositadas porções volumetricamente medidas de chocolate para os moldes e opcionalmente pedaços de amêndoas, avelãs ou cereais (Cook, 1982). Imediatamente a seguir, os moldes são agitados para remover as bolhas de ar presas que podem estragar a aparência do chocolate ou até causar variações de peso (Beckett, 2009). Figura 11 - Equipamento de moldação para tabletes de chocolate (Directindustry, 2021) . 19 Os moldes são atualmente feitos de plástico e podem apresentar qualquer tipo de design, mas é importante que estes sejam construídos de forma a permitir a libertação imediata da peça de chocolate. Para tal, devem ser evitados moldes profundos ou com saliências nos cantos. Independentemente do tipo de molde usado, o produto passa de seguida num túnel de refrigeração, é depois desmoldado e, por último, é encaminhado para a secção de embalamento (Talbot, 2009). Em relação ao revestimento, este método consiste no uso sortidos de confeitaria, onde se verte chocolate para produzir uma cobertura (Beckett, 2009). Apesar da existência de revestimento manual, este está associado a produtos caríssimos e exclusivos. Assim, de forma automática, os sortidos são colocados numa passadeira rolante em rede de arame e passam por uma cortina contínua de chocolate, havendo cobertura de todas as superfícies, tal como representado na Figura 12 (Minifie, 2012). Figura 12 - Equipamento de revestimento em operação (Potrowl, 2019) . De seguida, os sortidos são submetidos a sopros de ventiladores e à vibração da rede, ambos reguláveis, que servem para controlar a quantidade de chocolate coberto em todas as superfícies. Para completar este processo, os sortidos passam por um túnel de refrigeração, de forma a endurecer a cobertura e facilitar o seu embalamento (Minifie, 2012). Em relação ao drageamento, este é um processo único de revestimento de um centro com sucessivas camadas de chocolate, através da utilização de panelas giratórias feitas de cobre ou aço inoxidável, designadas drageadoras, como a representada na Figura 13. Atualmente, existem equipamentos mais modernos, em que todo o processo é automático, mas as panelas giratórias são ideais para lotes de pouca quantidade. Em relação aos centros, estes são normalmente amêndoas, avelãs, amendoins e cereais, mas também podem ser nozes, passas, cranberries ou nougat, desde que apresentem alguma consistência (Minifie, 2012). 20 Figura 13 - Equipamento utilizado para drageados. Assim, as drageadoras podem ser operadas em diferentes velocidades e possuem um duto que aplica ar nos centros, com temperatura e humidade específica, enquanto estes giram. Para pequenas quantidades, o chocolate é adicionado manualmente durante a rotação, mas nas grandes instalações atuais esta etapa é automatizada (Minifie, 2012). Após a formação de várias camadas de chocolate em torno do centro e quando a superfície do drageado estiver lisa, adiciona-se um verniz, pois não há nada mais atraente para o cliente do que um doce de chocolate bem polido e brilhante (Beckett, 2009). Por último, na secção de embalamento, o produto de chocolate é envolvido por uma película de alumínio e depois por um embrulho final que possui as indicações sobre o produto. Esta etapa é automatizada com controlo de peso e detetor de metais incluídos, de forma a garantir a qualidade e segurança do produto. Contrariamente, a fase seguinte necessita de grande mão-de-obra, pois o produto final deve ser colocado em caixas e posteriormente em paletes, para que possa ser transportado. Finalmente, o produto de chocolate é armazenado nas devidas condições e posteriormente expedido. 2.3. Controlo de qualidade na produção de chocolate 2.3.1. Importância do controlo de qualidade A qualidade de um produto está, não só relacionada com a segurança desse produto para o ser humano, como também com os requisitos que o consumidor considera importantes. De facto, a segurança dos alimentos é de extrema importância, uma vez que este conceito está associado à não existência de perigos que possam afetar a saúde do ser humano (Certif, 2021). 21 O ser humano vive, desde sempre, rodeado de perigos que o possam afetar negativamente ou até provocar a morte. No entanto, o desenvolvimento de novas técnicas de produção e distribuição de alimentos, associados a novas formas de estar e a novos hábitos de consumo da humanidade, fez com que os perigos, já existentes, se tornassem mais resistentes e levou ao aparecimento de novos perigos. Consequentemente, tornou-se indispensável o controlo eficaz de toda a cadeia de produção e distribuição dos alimentos, através da criação de medidas específicas que promovam a obtenção de produtos com um grande nível de confiança, do ponto de vista da segurança alimentar (Certif, 2021). Assim, surgiram várias entidades de certificação credíveis que, de forma independente e imparcial, garantem que as organizações produzam e distribuam produtos de forma segura e conforme as exigências definidas pelas suas normas (Certif, 2021). Porém, como a segurança dos alimentos é de extrema importância, é normal que algumas entidades públicas publiquem um conjunto de diplomas legislativos que promovam a vigilância do mercado (ASAE, 2017). O programa de gestão da segurança dos alimentos mais conhecido e mais importante é o sistema HACCP ( Hazard Analysis and Critical Control Point ). Este foi desenvolvido no final da década de 60 pela companhia americana Pillsbury, em conjunto com a NASA e o U.S. Army Laboratories em Natick, de forma a desenvolver técnicas seguras para o fornecimento de alimentos para os astronautas. Apesar de ter sido criado pelo setor privado, em 1980, a OMS e a FAO recomendam, a sua aplicação às pequenas e médias empresas, através do Codex Alimentarius e em 1993, o HACCP começa a fazer parte da regulamentação europeia, através da Diretiva 93/43/CE. Por sua vez, esta diretiva é revogada pelo Regulamento (CE) nº 852/2004 (Parlamento Europeu & Conselho da União Europeia, 2004), que estabelece as regras que todos os operadores do setor alimentar devem cumprir (ASAE, 2017). Assim, esta análise de perigos e de pontos críticos de controlo tem como objetivo evitar potenciais perigos que possam causar danos aos consumidores, através da sua redução ou eliminação. Para tal, baseia-se na aplicação de 7 princípios e 12 etapas, como se pode observar na Figura 14. As primeiras cinco etapas são essenciais para que as etapas seguintes sejam facilitadas e para tal é necessário que uma equipa de pessoas, devidamente selecionada, desenvolva um fluxograma do processo de produção e que conheça bem esse produto. A partir da sexta etapa, correspondente ao primeiro princípio, começa-se por identificar todos os possíveis perigos associados ao processo de produção do alimento. De seguida, é necessário realizar uma avaliação de risco que mede a probabilidade e severidade de cada perigo acontecer, permitindo definir se os perigos são ou não significativos (ASAE, 2017; Parlamento Europeu & Conselho da União Europeia, 2004). 22 Figura 14 - Etapas e princípios da metodologia HACCP. Tal como já foi dito, estes perigos podem provocar graves danos à saúde do ser humano, podendo ser de natureza biológica, química ou física. Em relação aos perigos biológicos, estes incluem bactérias, fungos, vírus, parasitas, insetos e animais (pragas). Quanto aos perigos químicos, estes estão relacionados com contaminações de origem natural (ex. toxinas) ou não natural (ex. produtos de limpeza e desinfeção). Por último os perigos físicos representam objetos estranhos no alimento que podem ser intrínsecos (ex. espinhas ou cascas) ou extrínsecos (ex. vidros, madeira, metais, plásticos, objetos de uso pessoal, entre outros) (ASAE, 2017). Há quem também considere outra categoria, os perigos nutricionais, como que é o caso da presença de alergénios e açúcar em excesso (Beckett, 2009). Após a identificação e análise dos possíveis perigos, é preciso identificar os pontos críticos de controlo (PCC’s), isto é, as últimas etapas onde não é possível posteriormente eliminar ou reduzir esse perigo até a um nível aceitável. De seguida, é necessário estabelecer limites críticos concretos e validados, mensuráveis e objetivos, como por exemplo, medições de pH, temperatura e humidade. Finalmente, deve-se estabelecer um procedimento de monitorização desses PCC’s e um plano de ações a adotar, caso esses limites sejam ultrapassados. Para além disso, é necessário implementar um sistema de verificação do funcionamento do plano HACCP e um sistema de registo de todos os testes efetuados, sendo necessário um controlo constante (Parlamento Europeu & Conselho da União Europeia, 2004). No entanto, este plano só é eficiente se antes se assegurarem alguns pré-requisitos que incluem o que é comumente referido como boas práticas de fabrico (Beckett, 2009). Assim, as estruturas e 23 equipamentos da unidade fabril, o plano de higienização, o controlo de pragas, o abastecimento de água, a recolha de resíduos, os materiais em contacto com alimentos, a higiene pessoal e a formação são considerados pré-requisitos. Assim, a implementação de pré-requisitos e do sistema HACCP permite, respetivamente, controlar os perigos associados ao meio envolvente ao processo de produção e os perigos associados ao próprio processo de produção do alimento (ASAE, 2017). 2.3.2. Procedimentos usados no controlo de qualidade na produção de chocolate Primeiramente, é importante perceber que a responsabilidade de fabricar um produto que esteja de acordo com o padrão da qualidade não pertence só ao departamento do controlo de qualidade, mas também ao departamento de produção. É um dever do departamento de produção pensar também na qualidade e não só na quantidade do produto, devendo assim existir uma ligação com o departamento do controlo de qualidade (Minifie, 2012). Desta forma, e em conformidade com os princípios do plano HACCP, existem três esferas de operação do departamento do controlo de qualidade: a avaliação das matérias-primas, o controlo do processo de fabrico e a inspeção do produto acabado, que serão aprofundadas nos tópicos seguintes, tendo por base o fabrico de chocolate. 2.3.2.1. Avaliação das matérias-primas e dos materiais de embalagem Aquando da receção das matérias-primas e em articulação com o respetivo responsável, o departamento do controlo de qualidade deve realizar uma avaliação do produto recebido. Para tal, é necessário efetuar uma inspeção visual, retirar uma amostra representativa e realizar análises químicas que comprovem a conformidade do produto recebido. A amostragem é a etapa mais importante da inspeção da matéria-prima, porque uma amostra deve ser representativa do volume, de forma a não comprometer as análises subsequentes (Minifie, 2012). No entanto, o nível de inspeção da matéria-prima depende de dois fatores: o tipo de matéria-prima e a confiança no fornecedor. Em relação ao tipo de matéria-prima, é possível constatar na Tabela 2 o método de inspeção usado para algumas matérias-primas, como açúcar, cacau em pó, leite e derivados, manteiga de cacau e pasta de cacau, havendo diferenças no nível de inspeção de cada uma. Em relação ao teor de humidade, este é um dos parâmetros mais importantes na indústria alimentar, uma vez que pode afetar tanto a forma como um produto é usado e processado, como a sua qualidade e tempo de vida útil. Por sua vez, estes fatores influenciam o custo económico desse produto, quer devido a custos de transporte e armazenamento, quer por custos de perda do produto por contaminação. Em relação ao teor de gordura e ácidos gordos livres, estes são extrema importância em matérias-primas como a pasta de cacau, a manteiga de cacau e o leite e derivados, uma vez que afetam a qualidade do 24 chocolate que será produzido. Por último e tal como já foi dito, os contaminantes biológicos são um dos perigos mais graves para o ser humano, daí a sua importante determinação. Tabela 2 - Métodos de avaliação necessário para cada tipo de matéria-prima Matéria-prima Métodos Inspeção visual Prova Análises / Avaliação do fornecedor Açúcar Aspeto e impurezas Sabor Teor de humidade e contaminantes biológicos Cacau em pó Teor de humidade e gordura, pH e contaminantes biológicos Leite e derivados Teor de humidade e gordura e contaminantes biológicos Manteiga de cacau Sabor & Odor Ácidos gordos livres e contaminantes biológicos Pasta de cacau Teor de humidade e gordura, pH e contaminantes biológicos Por outro lado, conhecer o fornecedor, o seu método de produção e o seu controlo de qualidade influencia o grau de avaliação das matérias-primas, aquando da sua receção. De facto, o envio por parte do fornecedor de um certificado de análises correspondente a cada lote entregue simplifica a tarefa do recetor e reduz a inspeção ao mínimo (Minifie, 2012). Finalmente, é fundamental realizar uma avaliação aos materiais de embalagem. Em relação ao rótulo, é importante verificar se o texto, as cores, a qualidade de impressão, o código de barras e a dimensão estão em conformidade com o estipulado com a gráfica. Contudo, atualmente, o aspeto mais importante a ter em conta é o texto que inclui os ingredientes do produto, mais concretamente os alergénios, dado que é um dos perigos mais frequente. Assim, toda a informação deve ser revista à priori para aquando da receção do material de embalagem, este esteja de acordo com a legislação e não tenha erros. Além disso, caso o material entre em contacto direto com o produto final, como por exemplo o alumínio, deve ser pedido ao fornecedor um certificado que demonstre que este está de acordo com a legislação europeia e que pode ser utilizado. No caso das cartolinas, utilizadas nas tabletes de chocolate, pode ser necessário realizar ensaios de flexão, para perceber a forma como o material se dobra durante embalamento. Caso as dobras não sejam bem feitas, a tablete de chocolate não será embalada de forma adequada, podendo levar à sua posterior contaminação. 2.3.2.2. Controlo do processo de fabrico Durante todo o processo de fabrico, existem parâmetros fundamentais para a produção de chocolate, que também influenciam a qualidade do produto final. Com base em todo o processo de produção de chocolate apresentado e aprofundado na secção anterior, é possível reunir todos os parâmetros que devem ser controlados em cada uma das etapas. Excluindo a colheita, a fermentação e a secagem dos 25 grãos de cacau, encontram-se apresentados na Tabela 3, os parâmetros que devem ser controlados, quer na produção de pasta de cacau, manteiga de cacau e cacau em pó, quer na produção de chocolate propriamente dita. Tabela 3 - Parâmetros a controlar em cada etapa do processo de produção de chocolate Etapa Parâmetros Produção de pasta e manteiga de cacau de cacau em pó Limpeza Grau de pureza Torrefação Temperatura, tempo e velocidade de agitação Descasque Volume e velocidade de ar Moagem Temperatura e granulometria das partículas Alcalinização Temperatura e solução alcalina Prensagem Tempo e teor de gordura inicial e final Trituração e Pulverização Granulometria das partículas Filtração e Desodorização Teor de gordura Produção de chocolate Mistura Temperatura, tempo e velocidade de agitação Refinação Granulometria das partículas Conchagem Temperatura, tempo e velocidade de agitação Temperagem Temperatura e granulometria das partículas Acabamento Moldação Deposição do chocolate e agitação dos moldes Revestimento Vibração da rede, volume e velocidade de ar e temperatura de refrigeração Drageamento Velocidade de agitação e temperatura e humidade de ar Embalamento Calibração do detetor de metais e da balança Armazenamento Temperatura e humidade Apesar da necessidade de controlo em todas as etapas do processo de fabrico de chocolate, o departamento do controlo de qualidade não pode estar sempre a inspecionar se todos os parâmetros estão a ser cumpridos e por isso, deve existir uma comunicação com o departamento de produção e de manutenção das máquinas. Por outro lado, a implementação do plano HACCP permite-nos identificar as etapas cujo perigo associado não é possível eliminar ou reduzir à posteriori (PCC’s) (Minifie, 2012). Desta forma, é possível concluir que o embalamento é um PCC pelo simples facto desta etapa incorporar um detetor de metais. Os metais e os alumínios são um dos perigos físicos mais severos, pois podem causar lesões ou mesmo constituir um risco à vida do consumidor e estão associados a defeitos de fabrico ou degradação dos equipamentos ou até a práticas de fabrico incorretas. Assim, a presença do detetor de metais no fim da linha de produção é a única forma de impedir a existência destes 26 contaminantes no chocolate e o departamento do controlo de qualidade deve realizar uma avaliação ao produto descartado, de forma a perceber se alguma peça ou equipamento se está a desfazer. Por outro lado, a etapa de embalamento ainda inclui uma balança que permite verificar se o chocolate possui o peso pretendido. Se o produto tiver excesso de peso, então haverá uma redução dos lucros e se o produto estiver abaixo do peso, o cliente estará a ser enganado, o que constitui um delito legal (Minifie, 2012). As variações de peso no produto estão normalmente relacionadas com pequenas falhas durante a moldação de tabletes ou com falhas humanas na programação do equipamento de enchimento de drageias. Assim, o departamento do controlo de qualidade deve realizar uma análise organolética e eventualmente uma análise microbiológica a uma amostra do chocolate abaixo do peso pretendido, para que este possa ser mais tarde ser reaproveitado. 2.3.2.3. Inspeção do produto acabado Se a avaliação das matérias-primas e dos materiais de embalagem e o controlo do processo de fabrico foi realizado corretamente, então nenhuma inspeção deveria ser necessária. Porém, esta situação de não inspeção é uma utopia, pois mesmo nas melhores empresas há falhas ocasionalmente, sendo necessário inspecionar o produto acabado. O problema é decidir qual o nível mínimo de inspeção, pois no final da linha de produção podem ser embaladas centenas de peças por minuto. Assim, as verificações mais importantes durante a inspeção do produto acabado são a aparência, o sabor, o peso e a marcação da validade e do lote na embalagem (Minifie, 2012). Em relação à aparência e sabor, a equipa do departamento do controlo de qualidade que realiza a inspeção deve conhecer exatamente o produto que foi aprovado pelo departamento de marketing, de maneira a facilitar a verificação do produto em questão. Quanto ao peso e tal como já foi dito, deve existir um controlo exigente, para que não haja prejuízo para a própria empresa, nem para o cliente. Por último, a marcação da validade e do lote na embalagem não pode ter erros, porque o cliente deve estar devidamente informado sobre qual o prazo de validade do produto e porque o lote permite identificar o momento de fabrico do produto e consequentemente quais as matérias-primas usadas. Apesar de não ser prioritária, uma vez que existiu um controlo durante todo o processo de fabrico de chocolate, a análise microbiológica deve ser realizada de forma aleatória ou caso se suspeite de uma contaminação. É de notar que o produto final pode estar contaminado, mesmo que o sabor e aparência estejam satisfatórias, pois ao contrário da carne, peixe e outros alimentos perecíveis, os microrganismos na maioria dos produtos de confeitaria permanecem dormentes à temperatura ambiente, como resultado da baixa atividade da água (Minifie, 2012) 27 Finalmente, o departamento do controlo de qualidade deve resolver todas as reclamações que possam surgir por parte do cliente. Por norma, as queixas estão relacionadas com sabores estranhos, como o ranço, sendo necessário realizar análises às amostras existentes do lote da reclamação, para determinar a real causa do problema. Uma das causas mais comuns é o não correto acondicionamento do produto durante o transporte, após saída da fábrica, fazendo com que este se deteriore. 34 Após o tempo de extração, desmonta-se o equipamento, remove-se e descarta-se o cartucho de extração, volta-se a fazer a montagem e espera-se que o éter de petróleo suba para a alonga de Soxhlet. Desmonta-se novamente o equipamento, para que seja possível retirar e armazenar a maior parte deste solvente, podendo ser necessário repetir este procedimento vários vezes. Por fim, o balão de Soxhlet é colocado na estufa a (102 ± 1) ºC por períodos sucessivos de 1 h, arrefecendo 30 min em exsicador e depois é pesado, até à obtenção de um peso igual ou superior ao imediatamente anterior. Quanto ao teor de gordura total do produto, este é expresso em percentagem com uma aproximação às décimas e é calculado através da Equação (2). 𝑀𝐺/%=𝑝−𝑝1 𝑚∙100 (2) onde 𝑚 é a massa, em g, da amostra, 𝑝 é o menor peso, em g, do balão com matéria gorda após as secagens sucessivas e 𝑝1 é o peso, em g, do balão. 3.1.2.2. Determinação do teor de humidade Na Imperial, o método de determinação de humidade baseia-se no método gravimétrico e é utilizado maioritariamente para confirmar se as matérias-primas estão de acordo com as especificações dadas pelo fornecedor e para determinar o teor de humidade dos chocolates produzidos. Na Figura 19 encontram-se as etapas genéricas deste método, que será posteriormente explicitado em pormenor. Figura 19 - Etapas genéricas do método de determinação do teor de humidade. Para a determinação do teor de humidade de matérias-primas, exceto o cacau e seus derivados, a amostra começa por ser homogeneizada com uma vareta de vidro e guardada num recipiente hermético. De seguida, é necessário secar uma placa de Petri, com a tampa ao lado, numa estufa a (102 ± 1) ºC durante 1 h e deixá-la arrefecer em exsicador durante 30 min. Posteriormente, a placa de Petri é pesada (𝑚0) e, sem tarar, introduzem-se cerca de 3 g de amostra que se pretende analisar (𝑚1), numa balança com uma precisão de ± 0,0001 g. Após esta pesagem, a placa de Petri com amostra é colocada novamente na estufa a (102 ± 1) ºC, com a tampa ao lado, mas desta vez durante 2 h, é também arrefecida em exsicador durante 30 min e volta a ser pesada. Por fim, a placa é novamente colocada na 35 estufa por períodos sucessivos de 1 h, arrefecendo 30 min em exsicador e depois é pesada, até que a diferença entre duas pesagens sucessivas não exceda 0,0005 g ou até que a massa aumente, considerando-se 𝑚2 como a massa da penúltima pesagem. Para a determinação do teor de humidade do cacau e seus derivados, a preparação da amostra é igual à do método de determinação da gordura. Caso a amostra se encontre no estado sólido (ex. pasta de cacau), esta deve ser desagregada por raspagem, através do uso de uma faca e uma tábua de corte, e guardada num recipiente hermético. Caso a amostra seja um pó (ex. cacau ou chocolate em pó), basta apenas que esta seja homogeneizada com uma vareta de vidro e guardada num recipiente hermético. De seguida, seca-se uma placa de Petri, com a tampa ao lado, numa estufa a (103 ± 2) ºC durante 1 h e depois esta deve arrefecer em exsicador durante 30 min. Posteriormente, a placa de Petri é pesada (𝑚0) e, sem tarar, introduzem-se cerca de 5 g de amostra que se pretende analisar (𝑚1), numa balança com precisão de ± 0,0001 g. O conteúdo da placa é homogeneizado com uma vareta de vidro e a placa de Petri é colocada novamente na estufa a (103 ± 2) ºC, com a tampa ao lado. Após 4 h de secagem, é necessário arrefecer em exsicador durante 30 min e volta-se a pesar. Por fim, a placa é novamente colocada na estufa por períodos sucessivos de 1 h, arrefecendo 30 min em exsicador e depois é pesada, até que a diferença entre duas pesagens sucessivas não exceda 0,002 g, considerando-se 𝑚2 como a massa da penúltima pesagem. Independentemente do tipo de amostra que se pretende analisar, o teor de humidade, expresso em percentagem com uma aproximação às décimas, é calculado através da Equação (3). 𝐻/%=𝑚1−𝑚2 𝑚1−𝑚0∙100 (3) onde 𝑚0 é a massa, em g, da placa de Petri e respetiva tampa, 𝑚1 é a massa, em g, da placa de Petri e respetiva tampa, com a amostra que se pretende analisar e 𝑚2 é a massa, em g, da placa de Petri e respetiva tampa, com a amostra após secagem. Apesar do teor de humidade depender do tipo de chocolate que se está a analisar, os resultados esperados encontram-se entre os 2 % e os 3 %. Se a amostra que se estiver a analisar for uma matériaprima, o resultado expectável encontra-se nas fichas técnicas cedidas pelos fornecedores. 3.1.3. Análises químicas e nutricionais 3.1.3.1. Determinação de micotoxinas As micotoxinas são metabolitos secundários produzidos por fungos, que incluem bolores, leveduras e cogumelos e são consideradas um perigo químico devido aos seus graves efeitos na saúde humana. 36 Como o chocolate não possui água suficiente para suportar o crescimento microbiano, a proliferação de fungos e a produção de micotoxinas só pode ocorrer durante o processamento dos grãos cacau, como a fermentação e secagem. Posteriormente, estes são submetidos a etapas de torra, consideradas suficientes para eliminar microrganismos, mas sabe-se que algumas micotoxinas, como as aflatoxinas e a ocratoxina A, mantêm uma certa estabilidade durante a maioria das etapas de processamento térmico de alimentos (Copetti et al., 2012). Desta forma, a Imperial recorre a laboratórios externos para realizar esta análise a micotoxinas, que utilizam a técnica HPLC ( High Performance Liquid Chromatography ) que é um processo de separação em que os componentes da amostra migram através de uma coluna a velocidades diferentes devido à sua solubilidade, tamanho, carga, afinidade e polaridade, fazendo com que eluam do sistema em tempos diferentes. Estes componentes interagem entre a fase estacionária, a própria amostra e a fase móvel (Gika, Kaklamanos, Manesiotis, & Theodoridis, 2015). Um sistema HPLC é principalmente constituído por uma bomba, um sistema de injeção, uma coluna e um detetor (espetrofotómetro ou refratómetro), mas na Figura 20 é possível encontrar uma representação esquemática do sistema de todos os seus componentes. Figura 20 - Representação esquemática de um HPLC, onde: (a) compartimento do solvente; (b) bomba; (c) porta de injeção da amostra; (d) coluna; (e) detetor; (f) registo e processamento de dados e (g) desperdício (Gika et al., 2015) . Assim, o eluente (fase móvel) é aspirado por uma bomba a partir de um compartimento, fazendo-o circular por todo o sistema a uma pressão relativamente elevada. De seguida, a amostra que se pretende analisar é introduzida por uma seringa no sistema de injeção e é arrastada pelo eluente através da coluna cromatográfica que contém a fase estacionária. No final, cada composto irá eluir com um tempo de retenção característico, apresentando um pico, com maior ou menor largura de base. A área desse pico é proporcional à concentração do composto injetado e o tempo de retenção servirá para a sua identificação (Gika et al., 2015). 37 3.1.3.2. Determinação de alergénios Em relação aos alergénios, estes são ingredientes ou produtos utilizados na produção de géneros alimentícios que podem provocar alergias ou intolerâncias nalgumas pessoas, constituindo um perigo para a saúde das mesmas, como por exemplo produtos à base de amendoins e/ou leite (Parlamento Europeu & Conselho da União Europeia, 2011). Assim, é necessário garantir que os chocolates cuja rotulagem não indica a presença de quaisquer alergénios, não possuam de facto nenhum vestígio e, por isso, a Imperial recorre a laboratórios externos para realizar estas análises específicas. O método mais utilizado para deteção qualitativa e quantitativa de alergénios é o ELISA ( EnzymeLinked Immunosorbent Assay ), pois este possui um alto nível de sensibilidade e facilidade de uso. Este usa anticorpos monoclonais ou policlonais gerados em mamíferos que reconhecem proteínas selecionadas de alimentos como marcadores da presença de um alimento alergénico. O método ELISA divide-se em dois formatos, sanduíche (s-ELISA) ou competitivo (c-ELISA), dependendo de vários fatores, como a matriz alimentar, a sensibilidade desejada e as características do anticorpo selecionado e do analito alvo. Para além disso, estes dois formatos podem ser diretos ou indiretos, dependendo se o anticorpo detetor é ou não, respetivamente, marcado com uma enzima (Sharma, Khuda, Parker, Eischeid, & Pereira, 2016). Na Figura 21 é possível observar a diferença entre estes dois métodos. Figura 21 - Diferença entre os diferentes métodos ELISA disponíveis (Adaptado de HHUB, 2021) . De uma maneira geral, o método ELISA começa com a imobilização do antigene ou do anticorpo de captura numa placa de 96 poços. De seguida, lava-se a placa e adiciona-se um tampão para bloquear locais livres nos poços. A partir desta etapa e dependendo do método que se está a usar, é necessário adicionar o anticorpo de deteção primário e/ou conjugado com a enzima, lavando a placa entre as várias etapas. Por fim, adiciona-se uma solução de substrato e incuba-se a placa. Caso a cor se desenvolva, o resultado do teste é positivo, o que significa que ocorreu reação entre o antigene e o anticorpo, havendo a presença da enzima em questão. Para além da sua deteção, é possível quantificar a sua presença e para isso basta adicionar uma solução stop para interromper a reação, quando a cor estiver suficientemente desenvolvida, e medir a absorvância a 450 nm, num espectrofotómetro. Esta medição 38 permite, posteriormente, calcular a concentração da enzima presente na amostra testada, através de uma curva de calibração (Sharma et al., 2016). Para além deste, alguns laboratórios também utilizam o método PCR ( Polymerase Chain Reaction ), um método utilizado para amplificar, isto é, copiar pequenas quantidades de DNA muitas vezes. Para tal, utiliza-se um equipamento designado termociclador que permite a programação de três modos, para que ocorram as etapas de desnaturação, anelamento e extensão. Na Figura 22 encontram-se as três etapas principais do método PCR. Figura 22 - Etapas do método PCR. De forma simplificada, o método PCR começa com a homogeneização, pesagem e diluição da amostra que se pretende analisar. Depois, durante a etapa de extração do DNA, realiza-se a lise celular, adicionando um tampão à amostra que é depois colocada em incubação. Ajusta-se as condições e só depois se realizam as etapas de ligação, lavagem e eluição, cujos protocolos dependem do objetivo da análise. Por fim, realiza-se o procedimento PCR propriamente dito, que envolve a combinação da amostra de DNA com uma mistura de primers (DNA específico para o gene que se quer estudar), desoxinucleotídeos trifosfatos (dNTPs) e a enzima DNA-polimerase num tampão (Hoy, 2013). Esta última etapa divide-se em três passos: desnaturação, anelamento e elongação. A desnaturação corresponde à etapa em que se coloca a mistura no termociclador, a uma temperatura de cerca de 94 ºC durante 20 s, havendo separação das duas cadeias de DNA. De seguida, diminui-se a temperatura para cerca de 55 ºC que é mantida por mais 20 s, ocorrendo o anelamento, em que um par de primers se liga à sua zona complementar, em cada uma das duas cadeias separadas. Em terceiro lugar, ocorre a elongação, isto é, a DNA-polimerase vai adicionando as bases complementares (dNTPs), formando uma nova tira. Este processo dá-se a uma temperatura de 72 ºC durante 30 s (Hoy, 2013). Finalmente, repete-se este procedimento cerca de 35 a 45 vezes, até que o DNA tenha sido amplificado vezes suficientes para que seja possível detetar uma sequência específica. Atualmente já foram feitas várias modificações a este método PCR e o mais conhecido é o PCR em tempo real, em que 39 se usam termocicladores de deteção de fluorescência, que amplificam sequências específicas e medem a sua concentração simultaneamente (Hoy, 2013). 3.1.3.3. Determinação de açúcares Outra análise que pode ser necessária efetuar é a determinação da quantidade de açúcares em produtos de chocolate. Nos últimos anos, têm surgido cada vez mais chocolates com elevadas percentagens de cacau, cuja adição de açúcar é quase nula. Porém, como na mesma unidade fabril podem ser produzidas vários tipos de chocolate, é fundamental realizar análises que garantam que foi realizada uma limpeza adequada entre os diferentes produtos, não existindo por isso resíduos de açúcar. Assim, a Imperial recorre a laboratórios externos para determinar a quantidade de açúcares presentes em chocolate cuja quantidade deve ser quase nula. Alguns dos açúcares analisados são a sacarose, a D-glicose e a D-frutose, mas geralmente pretende-se analisar a quantidade de açúcares totais, sem diferenciação. Para esta análise, os laboratórios externos utilizam o método HPLC, tal como na determinação de micotoxinas. 3.2. Propostas alternativas às análises de rotina Depois de todas as análises de rotina terem sido detalhadas, são agora apresentadas todas as alternativas encontradas. Numa fase inicial do estágio, foi necessário estudar em pormenor todas as análises de rotina, de forma a perceber quais as suas principais limitações. De um modo geral, as análises atualmente usadas requerem muito tempo de preparação e execução e a apresentação dos resultados também é demorada. Consequentemente, pretende-se que as alternativas sejam mais rápidas e, se possível, que não sejam mais caras que os métodos atuais, sendo também necessário incluir possíveis custos de investimento nas propostas alternativas. 3.2.1. Alternativas propostas: análises microbiológicas 3.2.1.1. Técnica de espalhamento da superfície O controlo de qualidade da Imperial, tal como já foi apresentado, baseia-se na norma ISO 4833:1991 para a contagem total de microrganismos e baseia-se na norma ISO 7954:1987 para contagem de bolores e leveduras. No entanto, estas normas já foram substituídas por outras mais recentes, sendo por isso importante conhecer quais os motivos para as atualizações efetuadas. A norma ISO 4833:1991 foi substituída pela norma ISO 4833:2003, mas ambas expõem o método de contagem total de microrganismos, através da técnica de incorporação. Por sua vez, esta também foi substituída pelas mais recentes normas ISO 4833-1:2013, que apresenta o método através da técnica 40 de incorporação e ISO 4833-2:2013, que se refere ao método através da técnica de espalhamento da superfície. Assim, apenas passou a existir uma nova norma cujo método utiliza a técnica de espalhamento da superfície, sendo na mesma possível usar qualquer uma das técnicas. O mesmo não acontece com a norma ISO 7954:1987 que foi substituída pelas mais recentes normas ISO 21527-1:2008 e ISO 21527-2:2008, que se diferenciam pelo tipo de produto que se pretende analisar. A norma ISO 21527-1:2008 expõe o método de contagem de colónias em produtos com atividade de água (𝑎w) superior a 0,95, enquanto a norma ISO 21527-2:2008 expõe o método para produtos com atividade de água (𝑎w) menor ou igual a 0,95. Porém, estas duas partes da norma ISO 21527:2008 passam a apresentar o método utilizando a técnica de espalhamento da superfície e não a técnica de incorporação utilizada na norma ISO 7954:1987. Assim, como o chocolate possui um valor 𝑎w entre 0,5 e 0,6 (Talbot, 2009), é necessário estudar a norma ISO 21527-2:2008 (International Organization for Standardization, 2008). Na Figura 23 são apresentadas as etapas genéricas deste método de contagem de bolores e leveduras que utiliza a técnica de espalhamento da superfície, que será agora apresentado em detalhe. Figura 23 - Etapas genéricas do método atualizado de contagem de bolores e leveduras. Em primeiro lugar, é necessário preparar os meios de diluição e cultura usados neste procedimento. O meio de diluição pode continuar a ser o mesmo, o BPW que é dissolvido em água destilada, numa proporção de 20 g para 1 000 mL que é de seguida, distribuído por frascos, numa quantidade de 90 mL cada e que são posteriormente esterilizados no autoclave durante 15 min a 121 ºC. Em relação ao meio de cultura, a norma ISO 21527-2:2008 indica que se deve utilizar o DG18 ( Dichloran 18 % glycerol agar ) que é então dissolvido em água destilada, sendo necessário aquecer a solução até ao ponto de ebulição para que ocorra dissolução completa. Por fim, é colocado em frascos que são também esterilizados no autoclave durante 15 min a 121 ºC. De seguida, o produto que se pretende analisar é diluído apenas uma vez, porque não haverá muito crescimento de bolores e leveduras nas placas. Esta etapa é realizada à chama, para que o ambiente envolvente esteja esterilizado e todos os utensílios necessários são desinfetados com álcool 70 %. Assim, 41 a amostra que se pretende analisar é cortada ou partida em pedaços mais pequenos com a ajuda de uma faca ou de uma colher e um conjunto almofariz-pilão, de maneira a facilitar a diluição e logo de seguida, pesam-se 10 g desse produto para um dos frascos com 90 mL de BPW, correspondendo à única diluição realizada (1/10). Posteriormente, com todo o ambiente envolvente esterilizado por uma chama, coloca-se com uma pipeta estéril cerca de 15 mL de DG18 em duas placas de Petri também estéreis (duplicado) e deixa-se o meio solidificar numa superfície horizontal fria. Depois, com uma pipeta estéril, coloca-se 1 mL da amostra correspondente à única diluição feita em cada uma das duas placas e espalha-se o líquido sobre a superfície da placa com um espalhador estéril, até que este seja completamente absorvido pelo meio. Por último, incuba-se as placas na sua posição correta numa estufa a 25 ºC durante 5 dias. Por fim, os resultados são apresentados e calculados com recurso à ISO 7218:2007, mas nada foi alterado. Assim, considerando apenas um número de colónias obtidas inferior a 150 em cada placa, é necessário calcular o resultado obtido, considerando que a contagem de UFC é normalizada para 1 g de amostra analisada. Caso as duas placas correspondentes à única diluição feita não apresentem uma única colónia, o resultado deve ser apresentado da seguinte forma: <10. Caso as duas placas contenham menos de 150 colónias, então o resultado obtido é dado pela Equação (1) já apresentada anteriormente, mas 𝑛2 é considerado nulo. 3.2.1.2. Placas Compact Dry Como alternativa aos métodos apresentados para contagem total de microrganismos e de bolores e leveduras e para pesquisa de bactérias coliformes, existem as placas Compact Dry. Estas podem também ser uma boa alternativa para a contagem de E. coli e pesquisa de Salmonella , uma vez que a Imperial realiza estas análises através de laboratórios externos. Assim, as placas Compact Dry são um método de teste pronto, uma vez que o meio nutritivo necessário para o crescimento microbiano já se encontra preparado numa placa de Petri. Este método pode ser utilizado tanto para testar matérias-primas e produtos acabados, como para monitorização de superfícies, especialmente em áreas de difícil acesso (Ambifood, 2021a). Desta forma, começa-se por selecionar a placa adequada à análise que se pretende realizar e logo de seguida, coloca-se 1 mL da amostra que se pretende analisar na placa e espera-se que todo o líquido se espalhe sozinho por toda a placa, tal como se pode observar na Figura 24. 42 Figura 24 - Etapas do procedimento de utilização de uma placa Compact. Por fim, coloca-se a placa fechada numa estufa para incubação, cujas condições dependem do tipo de análise que se está a realizar. Após o tempo de incubação, basta contar o número de colónias obtidas na placa e calcular o respetivo resultado, no caso da análise de contagem total de microrganismos e de bolores e leveduras. No caso da pesquisa de bactérias coliformes basta verificar se ocorreu crescimento destas colónias, que se distinguem das demais na placa através de uma coloração azul e no caso da pesquisa de Salmonella , as colónias apresentam uma coloração verde ou preta, dependendo do tipo de Salmonella presente. 3.2.2. Alternativas propostas: determinação do teor de gordura 3.2.2.1. Equipamento de Soxhlet automático Uma das poucas alternativas de determinação de gordura encontrada no mercado é o equipamento de Soxhlet automático, que funciona de forma totalmente automática e que pode ser operado sem supervisão. De facto, este dispositivo pode estar ligado a um computador com um software específico que permite um controlo remoto de todo o processo de extração (Ambifood, 2021b). Em relação ao procedimento associado a este método, começa-se igualmente com a preparação da amostra que se pretende analisar, tal como no método tradicional, dependendo se a amostra são grãos de cacau, se é um pó, se é fundível ou se é dura. Em segundo lugar, pesa-se 3 a 5 g da amostra (m) diretamente para um filtro de pregas e também se pesa um copo de extração que acompanha o equipamento (𝑝1), previamente seco na estufa a (105 ± 2) ºC e arrefecido em exsicador, numa balança com precisão de ± 0,0001 g. De seguida, o filtro de pregas é introduzido num cartucho de extração que por sua vez é colocado no copo de extração. O copo de extração é inserido no dispositivo de extração e inicia-se a extração com o 43 ligar do aquecimento e da água de arrefecimento. Na Figura 25 é possível encontrar as etapas automáticas que o equipamento realiza, não sendo necessário qualquer tipo de mão-de-obra. Figura 25 - Etapas do processo de extração com o equipamento de Soxhlet automático (Adaptado de Gerhardt, 2021) . Automaticamente, a amostra começa por ser imersa em solvente fervente (Etapa 1). O nível de solvente é reduzido abaixo do cartucho de extração, por evaporação, havendo uma recuperação do solvente num tanque de armazenamento (Etapa 2). Assim, a gordura é extraída pelo solvente condensado e é recolhida na parte de baixo do copo de extração (Etapa 3). O solvente, por sua vez, sofre uma destilação no tanque de armazenamento para que seja reaproveitado (Etapa 4). Por último, os copos de extração são levantados automaticamente da placa de aquecimento (Etapa 5) e desliga-se a água de arrefecimento e o aquecimento. No fim, tal como no método tradicional atual, começa-se por remover e descartar o cartucho de extração e colocar o copo de extração na estufa a (102 ± 1) ºC por períodos sucessivos de 1 h, arrefecendo 30 min em exsicador e depois é pesado, até à obtenção de um peso igual ou superior ao imediatamente anterior. Por fim, o teor de gordura total do produto, expresso em percentagem com uma aproximação às décimas, é calculado através da Equação (2) apresentada anteriormente. 3.2.2.2. Determinação do teor de ácidos gordos livres Como a manteiga de cacau é a gordura proveniente dos grãos de cacau, é importante testar o seu teor de ácidos gordos livres, geralmente medido pela quantidade de ácido oleico. Este parâmetro deve ser analisado, porque o nível de ácidos gordos livres presentes na manteiga de cacau altera a qualidade desta matéria-prima. De facto, níveis elevados de ácidos gordos ocorrem nos grãos de cacau que são armazenados incorretamente por um longo tempo, ou seja, num local muito quente e com alta humidade, ou como resultado da atividade microbiológica. Em particular, a enzima lipase que existe naturalmente nos grãos de cacau e que atua na quebra do triglicerídeo, separando os seus grupos de ácidos gordos e 50 Capítulo 4: Teste e viabilidade das alternativas propostas Depois de conhecidas as alternativas propostas às análises de rotina, torna-se fundamental testar e perceber se estas são alternativas viáveis para o controlo de qualidade da Imperial. Assim, este capítulo divide-se em Teste e viabilidade: análises microbiológicas, Teste e viabilidade: determinação do teor de gordura, Teste e viabilidade: determinação do teor de humidade e, por último, Teste e viabilidade: análises químicas e nutricionais, onde são apresentados os resultados dos testes dos métodos alternativos que foi possível realizar e onde é feita uma comparação entre os métodos atuais e as alternativas propostas, para perceber qual a mais adequada. 4.1. Teste e viabilidade: análises microbiológicas 4.1.1. Teste e viabilidade da técnica de espalhamento da superfície No caso da análise de contagem de bolores e leveduras, a norma ISO 21527:2008 que substituiu a norma ISO 7954:1987, passa a utilizar a técnica de espalhamento da superfície, por esta ser mais adequada do que a técnica de incorporação. A norma permite na mesma que se use a técnica de incorporação, mas neste caso a equivalência dos resultados deve ser validada em relação à inoculação na superfície, não sendo admitida a discriminação e diferenciação de bolores e leveduras. Assim, apesar da técnica de espalhamento da superfície poder fornecer enumerações mais altas, esta facilita a exposição máxima das células ao oxigénio atmosférico e evita qualquer risco de inativação térmica dos propágulos fúngicos (International Organization for Standardization, 2008). Para além da alteração na técnica utilizada, é também necessário alterar o meio de cultura atualmente utilizado pela Imperial. Porém, o meio de cultura, DG18, do atual fornecedor não é comercializado pronto a usar, isto é, não basta apenas diluir o meio de cultura em pó, é necessário adicionar dois dos seus componentes: o cloranfenicol e o glicerol; o que faz aumentar o tempo de preparação deste meio de cultura. Assim, a Imperial aceitou que se testasse a técnica alternativa de espalhamento com o intuito de ser implementada, mas pediu que se realizasse um estudo para perceber se existe no mercado algum meio de cultura DG18 que se encontre pronto a usar. Em primeiro lugar, foi realizado um estudo para perceber se existem alternativas ao meio de cultura DG18 apresentado pelo fornecedor atual da Imperial e, por isso, na Tabela 7 são apresentados os diferentes tipos de meios de cultura DG18 encontrados no mercado. De salientar que o custo associado apresentado se refere ao custo total necessário para preparar uma placa de Petri com este meio de cultura, para os diferentes fornecedores, e cujo cálculo se encontra no Anexo I. 51 Tabela 7 - Comparação dos vários meios de cultura DG18 disponíveis no mercado, em relação ao seu modo de preparação e aos seus custos associados Fornecedor Modo de preparação do meio de cultura Custo (Ver Anexo I) Fornecedor atual 1) Dissolver 15 g em 500 mL de água destilada, levando à ebulição com agitação frequente; 2) Adicionar 110 g de glicerol por 500 mL de meio de cultura; 3) Dissolver o conteúdo de um frasco de cloranfenicol com 3 ml de uma solução de etanol e água destilada (1:1) e adicioná-la ao meio; 4) Esterilizar no autoclave a 121 ºC por 15 min, arrefecer até 45-50 ºC, agitar bem e colocar em placas de Petri estéreis. 2,33 €/placa Fornecedor alternativo 1 1) Dissolver 15,8 g em 500 ml de água destilada, aquecendo para dissolver completamente; 2) Adicionar 110g de glicerol por 500 mL de meio de cultura; 3) Aquecer suavemente a solução completa, para auxiliar na dissolução do glicerol; 4) Esterilizar no autoclave a 121 ºC por 15 min, arrefecer até 50 ºC, agitar bem e colocar em placas de Petri estéreis. 2,46 €/placa Fornecedor alternativo 2 1) Deixar que os frascos de 100 mL atinjam a temperatura ambiente (se necessário); 2) Desapertar a tampa dos frascos e colocá-los em banho-maria para que atinjam aproximadamente os 50 ºC; 3) Aumentar a temperatura para 100 ºC e deixar o ágar derreter cerca de 20-30 min. 4) Apertar a tampa novamente, usando luvas de proteção e misturar; 5) Deixar os frascos à temperatura ambiente por pelo menos 15 s antes de transferi-los para um banho-maria para que atinjam os 44-47 ºC; 6) Colocar em placas de Petri estéreis. 2,66 €/placa Sabendo que o modo de preparação do meio de cultura atual utilizado pela Imperial demora cerca de 2 h, então, considerou-se que o modo de preparação do meio de cultura DG18 do fornecedor atual pode demorar cerca de 2 h 30 min, por possuir mais duas etapas, a adição de glicerol e cloranfenicol. Quanto ao meio de cultura DG18 do fornecedor alternativo 1, considerou-se que este pode demorar cerca de 2 h 15 min, porque aparenta ser um pouco mais rápido do que o anterior, uma vez que não é necessário adicionar o componente cloranfenicol. Relativamente ao meio de cultura DG18 do fornecedor alternativo 2, como o seu modo de preparação se resume ao seu derretimento, então considerou-se que este pode demorar apenas 1 h. Apesar do tempo de preparação ser cada vez menor, o que consequentemente diminui os custos associados à mão-de-obra necessária, os custos associados aos consumíveis necessários para a 52 preparação dos meios de cultura é cada vez maior. Isto é, mesmo que o meio de cultura DG18 do fornecedor alternativo 2 seja o mais rápido de preparar, o facto de este ser comprado já pronto faz com que seja mais caro preparar uma única placa de Petri. Resumindo, tendo em conta os custos associados e pressupondo que existe disponibilidade efetiva de mão-de-obra, o meio de cultura DG18 do fornecedor atual é o mais vantajoso. Porém, se existirem dificuldades de disponibilidade da mão-de-obra, ainda que em pequenos períodos, deve-se considerar a hipótese de utilização dos outros dois meios de cultura alternativos. Com base nestes pressupostos e depois de apresentado este estudo, a Imperial ficou de decidir qual a alternativa que pretende implementar. Em segundo lugar, testou-se a técnica alternativa de espalhamento, comparando-a em simultâneo com a técnica de incorporação, em relação aos resultados obtidos. Assim, numa das análises semanais programadas foram selecionados quatro produtos diferentes e realizou-se, para cada um deles, a técnica de espalhamento e a técnica de incorporação, no que diz respeito à contagem de bolores e leveduras. Na Tabela 8 é possível encontrar os resultados obtidos que permitem comparar estas duas técnicas e no Anexo II encontra-se o respetivo suporte fotográfico. Tabela 8 - Comparação dos resultados obtidos utilizando a técnica de incorporação e a técnica de espalhamento, em relação ao método de contagem de bolores e leveduras Produto acabado analisado Contagem de bolores e leveduras (g -1) Técnica de incorporação Técnica de espalhamento Produto A 0 1 Produto B 0 0 Produto C 38 45 Produto D 0 0 Antes demais, é importante referir que, para ambas as técnicas, o tempo de execução foi idêntico, o que facilita a possível implementação da técnica de espalhamento. No entanto, foi necessário comprar alguns espalhadores estéreis descartáveis, que custam cerca de 0,09 € cada um. Quanto aos resultados obtidos na Tabela 8, verifica-se que nos produtos A e C, os resultados obtidos pela técnica de espalhamento são um pouco superiores aos resultados obtidos pela técnica de incorporação. No entanto, independentemente destes resultados, a técnica de espalhamento foi proposta à Imperial por ser a recomendada pela norma ISO 21527-2:2008 (International Organization for Standardization, 2008). Assim, apesar do custo ter aumentado, a Imperial decidiu aceitar este método que utiliza a técnica de espalhamento, pelo facto de não ter existido alterações no tempo de execução. 53 4.1.2. Teste e viabilidade das placas Compact Dry As placas Compact Dry, apresentadas como uma alternativa às análises microbiológicas, foram testadas no laboratório do controlo de qualidade da Imperial, para verificar se não existem muitas diferenças nos resultados obtidos e para avaliar a sua facilidade de utilização. Assim, as placas Compact Dry relativas à contagem total de microrganismos foram testadas, em comparação com as placas preparadas manualmente, para os mesmos quatro produtos selecionados. Na Tabela 9 encontram-se os resultados obtidos e no Anexo III encontra-se o respetivo suporte fotográfico. Tabela 9 - Comparação dos resultados obtidos utilizando as placas preparadas manualmente e as placas Compact Dry, em relação ao método de contagem total de microrganismos Produto acabado analisado Contagem total de microrganismos (g -1) Placas preparadas manualmente Placas Compact Dry 1ª diluição 2ª diluição 1ª diluição 2ª diluição Produto A 1 0 1 0 Produto B 11 0 10 0 Produto C 62 14 65 16 Produto D 2 1 5 1 Em relação aos resultados obtidos pela técnica de incorporação, verifica-se que estes são muito semelhantes aos resultados obtidos pelas placas Compact Dry, não havendo diferenças significativas. No entanto, este não é o único critério que permite comparar os dois métodos e, por isso, na Tabela 10 é possível observar as diferenças existentes entre o método atual e as placas Compact Dry. Tabela 10 - Comparação entre o método atual e o método alternativo para contagem total de microrganismos, contagem de bolores e leveduras e pesquisa de bactérias coliformes Método Critérios Método atual: Preparação manual das placas de Petri com meio de cultura Método alternativo: Utilização das placas Compact Dry (Ambifood, 2021a) Tempo de preparação ≈ 2 h Prontas a usar Dimensão da placa de Petri Grandes dimensões Pequenas dimensões Condições de armazenamento 3 meses a 5 ºC 24 meses à temperatura ambiente Leitura dos resultados Fácil contagem Fácil contagem, mas com melhor distinção das colónias Custos associados ≈ 0,37 €/placa (Ver Anexo IV) ≈ 1,25 €/placa 54 Uma das principais diferenças notadas durante o uso das placas Compact Dry, é o facto de estas placas serem mais pequenas, o que faz com que sejam mais fáceis de armazenar e incubar, pois não ocupam tanto espaço. Outro fator importante é o facto de o tempo de armazenamento destas placas ser muito superior ao das placas preparadas manualmente, pois o meio encontra-se desidratado. Por outro lado, as colónias que crescem nas placas Compact Dry apresentam uma cor vermelha, distinguindo-as perfeitamente do meio de cultura, o que não acontece com as placas preparadas manualmente. Apesar de todas estas vantagens, a mais importante é o facto destas placas já se encontrarem prontas a usar, não sendo necessário 2 h de mão-de-obra para a sua preparação. Contudo, cada placa Compact Dry custa cerca de 1,25 €, enquanto a preparação manual das placas de Petri com meio de cultura custa cerca de 0,37 €, cujo cálculo se encontra detalhado no Anexo IV. Assim, tendo em conta os custos associados e pressupondo que existe disponibilidade efetiva de mão- -de-obra, as placas Compact Dry não são uma boa alternativa, porque são 3,38 vezes mais caras do que o método atual. Com base nestes pressupostos, a Imperial decidiu não implementar esta alternativa, mas deve-se considerar a sua utilização caso existam dificuldades de disponibilidade da mão-de-obra, ainda que em pequenos períodos. Como teste complementar, decidiu-se avaliar a utilização destas placas alternativas para a contagem de E. coli e pesquisa de Salmonella , para perceber se esta seria mais vantajosa do que o envio de amostras para laboratório externo. Na Tabela 11, é possível encontrar as diferenças entre o método atual de envio de amostras para laboratório externo e o método alternativo de utilização das placas Compact Dry e respetivas normas, em relação ao tempo de preparação e obtenção dos resultados e os custos associados a cada um dos métodos. Tabela 11 - Comparação entre o método atual e o método alternativo para contagem de E. coli e pesquisa de Salmonella Método Critérios Método atual: Envio de amostras para laboratório externo Método alternativo: Utilização das placas Compact Dry (Ambifood, 2021a) e respetivas normas Tempo de preparação ≈ 5 dias ≈ 1h 30 min Tempo de obtenção dos resultados ≈ 21 h (contagem de E. coli ) ≈ 24 h (pesquisa de Salmonella ) Custos associados ≈ 5 €/amostra (4 €/amostra para a contagem de E. coli e 6 €/amostra para a pesquisa de Salmonella ) ≈ 4,49 €/amostra (contagem de E. coli e pesquisa de Salmonella) (ver Anexo V) 55 No que diz respeito ao tempo de preparação e de obtenção de resultados, contata-se que a alternativa proposta é um procedimento muito mais rápido do que o envio dos resultados por parte dos laboratórios externos. No entanto, o critério mais importante é o custo associado a esta alternativa proposta, cuja análise se encontra detalhada no Anexo V. Não tendo havido distinção entre o método de contagem de E. coli e a pesquisa de Salmonella , então verifica-se que o método alternativo proposto é 0,51 € mais barato do que o método atual de envio de amostras para laboratório externo. Assim, o método alternativo proposto de utilização das Placas Compact Dry e respetivas normas é mais vantajoso do que o método atual, não tanto pelo custo associado, mas sim por causa do tempo de obtenção de resultados mais rápido. Porém, a Imperial não pretende voltar a realizar estas análises internamente, devido ao risco de contaminação, não tendo sido possível realizar a sua implementação. 4.2. Teste e viabilidade: determinação do teor de gordura 4.2.1. Viabilidade do equipamento de Soxhlet automático O equipamento de Soxhlet automático apresenta o melhor desempenho de todos os sistemas de extração de laboratório disponíveis no mercado. É rápido, muito versátil, pode ser atualizado facilmente a qualquer momento e fornece os melhores resultados de análise de forma confiável e consistente (Ambifood, 2021b). Infelizmente, não foi possível testar este equipamento, mas realizou-se um estudo para comparar o tempo de preparação e obtenção dos resultados e os custos associados a cada um dos métodos de determinação da gordura, tal como se pode observar na Tabela 12. Tabela 12 - Comparação entre o método atual e o método alternativo de determinação do teor de gordura Método Critérios Método atual: Soxhlet tradicional Método alternativo: equipamento de Soxhlet automático (Ambifood, 2021b) Tempo de preparação ≈ 30 min ≈ 10 min Tempo de obtenção dos resultados ≈ 40 h ≈ 8 h Custos associados ≈ 81 € por análise (ver Anexo VI) ≈ 1 000 € de investimento inicial + 44 € por análise (Anexo VI) Note-se que o método alternativo apresentado é muitíssimo vantajoso, no que diz respeito ao tempo de preparação e de obtenção de resultados, mas principalmente no que se refere aos custos associados à respetiva análise. Em primeiro lugar, o tempo de preparação gasto com o equipamento alternativo proposto é muito menor do que o tempo gasto com o equipamento tradicional, para além de este ser mais rápido a realizar a extração de uma amostra, devido ao seu automatismo. 56 Em segundo lugar, é importante ter em conta o custo associado a cada um dos métodos, o que inclui os custos dos consumíveis e de mão-de-obra necessários, e cuja análise detalhada se encontra disponível no Anexo VI. Assim, o custo de uma análise com o equipamento alternativo proposto é cerca de 2 vezes inferior ao custo da análise utilizando o equipamento tradicional. No entanto, o investimento inicial associado a esta alternativa é muito elevado, apesar deste ser compensado a longo prazo pelo curto tempo de preparação, baixos custos associados e rapidez na obtenção dos resultados. Para além disso, acredita-se que esta alternativa apresente custos menores de manutenção, uma vez que a probabilidade de partir algum dos materiais de vidro necessários é quase nula, ao contrário do método tradicional. Desta forma, tendo em conta todos os critérios apresentados, o método que utiliza o equipamento de Soxhlet automático é muito mais vantajoso. Contudo, a Imperial ainda se encontra a decidir se pretende ou não implementar este equipamento de Soxhlet automático. 4.2.2. Teste e viabilidade do método de determinação do teor de ácidos gordos livres Após apresentação de um novo método de determinação de gordura, mais especificamente para a determinação do teor ácidos gordos livres na manteiga de cacau, este foi testado no laboratório do controlo de qualidade da Imperial que já possuía todos os materiais necessários. Caso não possuísse os materiais necessários, o custo mínimo associado a este investimento seria de 150 €, tal como foi calculado detalhadamente no Anexo VII. Na Tabela 13 encontram-se os resultados obtidos para três lotes de manteiga de cacau, testados em triplicado, tendo em conta que se usou, em cada teste, 50 mL da mistura de solventes e 6 gotas de fenolftaleína (cerca de 200 μL). Tabela 13 - Resultados obtidos nos testes realizados para determinação de ácidos gordos livres Manteiga de cacau Massa da amostra (g) Volume de hidróxido de sódio (mL) Teor de ácidos gordos livres (%) Lote 1 Amostra A1 20,0172 9,50 1,36 1,30 Amostra B1 20,0102 9,10 1,30 Amostra C1 19,9879 8,60 1,23 Lote 2 Amostra A2 20,0000 9,40 1,34 1,30 Amostra B2 20,0389 9,10 1,30 Amostra C2 20,0156 8,90 1,27 Lote 3 Amostra A3 20,0148 9,60 1,37 1,35 Amostra B3 20,0102 9,20 1,31 Amostra C3 20,0217 9,50 1,36 57 Com estes testes realizados, foi possível saber quanto tempo é necessário para executar este método de determinação de ácidos gordos livres e qual o volume de hidróxido de sódio gasto, em média, para que posteriormente seja possível realizar uma avaliação dos custos associados a este método. Assim, o tempo máximo gasto com um único ensaio foi de 45 min, sendo que mais de metade deste tempo foi gasto na preparação da solução de hidróxido de sódio 0,1 M, cujo volume será aproximadamente de 0,1 L. Tendo em conta estes gastos e considerando o custo da mão-de-obra necessária, então cada análise de determinação realizada por este método custa cerca de 4 €, tal como foi calculado detalhadamente no Anexo VII. Em relação aos resultados obtidos, verificou-se que os três lotes testados apresentam um teor de ácidos gordos livres de 1,30 % ou 1,35 %, o que se encontra dentro do esperado, uma vez que segundo a Diretiva 2000/36/CE, a manteiga de cacau obtida a partir dos grãos de cacau não pode apresentar um teor de ácidos gordos livres (expresso em ácido oleico) acima de 1,75 %. Para além disso, estes resultados obtidos foram comparados com os valores apresentados no certificado de análises dado pelos respetivos fornecedores, referentes aos lotes estudados. Verificou-se que o teor de ácidos gordos livres apresentados pelo fornecedor é de cerca de 1,60 %, o que se traduz numa diferença de 0,30 %. Esta diferença deve ser analisada com mais testes, sendo, por isso, um fator importante para a decisão de implementação deste método nas análises de rotina da Imperial, como forma de validação dos resultados apresentados pelo fornecedor. Assim, este foi aceite e implementado na Imperial, devido à sua facilidade de execução e baixo custo, mas principalmente devido à sua importância. No entanto, esta será efetuada apenas quando se achar necessário, porque à priori, os fornecedores realizam esta análise. 4.3. Teste e viabilidade: determinação do teor de humidade 4.3.1. Viabilidade do analisador de humidade automático A alternativa apresentada para o método de determinação do teor de humidade, o analisador automático, reduz significativamente o risco de erros, possivelmente gerados por manuseio e cálculos incorretos. Além de fornecer um alto desempenho de pesagem, estes analisadores de humidade automáticos simplificam o procedimento de análise de determinação de humidade. Apesar de não ter sido possível testar este analisador de humidade, a Tabela 14 reúne toda a informação recolhida e que compara este método com o atual, em relação ao tempo de execução, manuseio, utilização de múltiplas amostras ao mesmo tempo, precisão ou probabilidade de erro, a forma como é realizado o cálculo dos resultados e os respetivos custos associados. 58 Tabela 14 - Comparação entre o método atual e método alternativo de determinação do teor de humidade Método Critérios Método atual: Secagem por estufa Método alternativo: Analisador de humidade automático (Mettler Toledo, 2021) Tempo de execução 4 h a 8 h 3 min a 15 min Manuseio Muitas etapas / Pesagem diferencial Uma etapa / Medição direta Possibilidade de testar múltiplas amostras ao mesmo tempo Sim Não Precisão / Probabilidade de erro Maior probabilidade de erro Alta precisão Cálculo dos resultados Manual Automática Custos associados ≈ 6 € por análise (ver Anexo VIII) ≈ 2 500 € de investimento inicial + 1,14 € por análise (ver Anexo VIII) Observando a Tabela 14, é possível constatar que existem muitas vantagens associadas ao método alternativo que utiliza o analisador de humidade automático. Em primeiro lugar, este apresenta um tempo de execução muito menor do que o método atual de secagem por estufa, sendo apenas necessário uma etapa de medição. Em segundo lugar, este método apresenta uma alta precisão de medição, não havendo tanta probabilidade de erro como no método atual. Mais ainda, o cálculo dos resultados é realizado automaticamente pelo equipamento, não sendo necessário mão-de-obra para o fazer. Quanto às desvantagens apresentadas por este método, verifica-se que não há a possibilidade de testar mais do que uma amostra ao mesmo tempo e que este não é considerado um método de referência, sendo necessário validar a equivalência dos resultados. Contudo, o facto de não ser possível testar mais do que uma amostra ao mesmo tempo é compensado no reduzido tempo de obtenção de resultados e, apesar de este não ser um método de referência, acredita-se que o fornecedor do equipamento tenha realizado testes de equivalência dos resultados, o que viabiliza a sua implementação. Por fim, em relação à avaliação de custos realizada e que se encontra em detalhe no Anexo VIII, verifica-se que o custo por análise do analisador de humidade automático é 5,26 vezes inferior ao método atual de secagem por estufa. Por outro lado, o custo de investimento inicial associado a este equipamento automático é muito elevado, mas este acaba por ser compensado a longo prazo pelo menor custo por análise, menor tempo de execução e pela maior precisão de resultados que apresenta. Assim, este método alternativo é muitíssimo vantajoso, mas, até ao momento, não foi possível, implementá-lo na Imperial, devido ao seu custo de investimento inicial. Porém, foi realizada uma proposta interna acompanhada por vários orçamentos, para que mais tarde, caso haja oportunidade, se possa investir neste analisador de humidade automático. 59 4.4. Teste e viabilidade: análises químicas e nutricionais 4.4.1. Viabilidade dos kits rápidos para deteção de micotoxinas As aflatoxinas são das micotoxinas mais perigosas para o ser humano, o que torna a sua determinação muitíssimo importante. Contudo, não tendo sido possível testar os kits rápidos para detetar a presença de aflatoxinas em algumas amostras de chocolate, como alternativa ao envio de amostras para laboratório externo, realizou-se um estudo que compara estes dois métodos. Tendo em conta as etapas necessárias, estima-se que o tempo de preparação seja significativamente maior do que o apresentado pelo fornecedor dos kits rápidos de deteção da presença de aflatoxinas. Porém, apenas testando é que se saberá o seu tempo efetivo de preparação. Através da Tabela 15 é possível comparar o método atual de envio de amostras com o método alternativo de utilização de um kit rápido, no que diz respeito ao tempo de preparação e obtenção dos resultados e os custos associados. Tabela 15 - Comparação entre o método atual e o método alternativo para deteção de micotoxinas Método Critérios Método atual: Envio de amostras para laboratório externo Método alternativo: Utilização de kits rápidos (R-Biopharm, 2021a) Tempo de preparação ≈ 5 dias 20 min Tempo de obtenção dos resultados 10 min Custos associados ≈ 65 €/amostra ≈ 20 €/ kit (amostra) Constata-se que este kit rápido de deteção de aflatoxinas totais é muito mais vantajoso em relação ao tempo de preparação e obtenção dos resultados e, principalmente, em relação aos custos associados. Assim, esta proposta alternativa foi apresentada e a Imperial encontra-se internamente a decidir se pretende implementá-la. 4.4.2. Teste e viabilidade dos kits rápidos para deteção de alergénios Tendo sido dada a possibilidade de testar estes kits rápidos de deteção de alergénios, optou-se por determinar a presença do amendoim, por ser um dos alergénios mais críticos. A principal vantagem destes kits é o facto de poder ser utilizado em superfícies, uma vez que se se quisesse analisar o estado das superfícies dos equipamentos através de laboratórios externos, estes teriam de se deslocar à Imperial para realizar a amostragem, o que seria muito dispendioso. Verificou-se, experimentalmente, que os kits são muito fáceis de usar, não sendo necessária especialização técnica e que o teste é muito rápido a apresentar resultados, sendo preciso esperar apenas 10 min. No caso da análise a amostras de chocolate, este método é um pouco mais demorado, 66 da gordura . Instituto Português da Qualidade. (1983). NP-2164 Microbiologia alimentar — Regras gerais para pesquisa de bactérias coliformes . International Organization for Standardization. (1987). ISO 7954:1987 Microbiology — General guidance for enumeration of yeasts and moulds — Colony count technique at 25 degrees C . International Organization for Standardization. (1991). ISO 4833:1991 Microbiology — General guidance for the enumeration of micro-organisms — Colony count technique at 30 degrees C . International Organization for Standardization. (2008). ISO 21527-2:2008 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 2: Colony count technique in products with water activity less than or equal to 0,95 . International Organization for Standardization. (2020). ISO 660:2020 Animal and vegetable fats and oils — Determination of acid value and acidity . Jornal Renovação. (2020). Fábrica de Chocolates Imperial de Vila do Conde com quebra de mais de 50% nas vendas da Páscoa. Obtido 15 de Março de 2021, de http://jornalrenovacao.pt/2020/04/fabrica-chocolates-imperial-vila-do-conde-quebra-50-nas-vendas-dapascoa/ Machine Sale. (2020). Cocoa Butter Press 12 Pots. Obtido 15 de Agosto de 2021, de http://machinesale.nl/2_Cocoa_Processing_Machinery.htm Mettler Toledo. (2021). HE53 modelo 230V. Obtido 15 de Agosto de 2021, de https://www.mt.com/br/pt/home/products/Laboratory_Weighing_Solutions/moistureanalyzer/entry_moistureanalyzer/HE53_230V.html Minifie, B. W. (2012). Chocolate, Cocoa and Confectionery: Science and Technology (Third Edition) (Third Edit). https://doi.org/10.1002/food.19810250618 Parlamento Europeu, & Conselho da União Europeia. (2000). Diretiva 2000/36/CE de 23 de Junho de 2000 relativa aos produtos de cacau e de chocolate destinados à alimentação humana. Jornal Oficial da União Europeia . Parlamento Europeu, & Conselho da União Europeia. (2004). Regulamento (CE) No 852/2004 de 29 de Abril de 2004 relativo à higiene dos géneros alimentícios. Jornal Oficial da União Europeia . Parlamento Europeu, & Conselho da União Europeia. (2011). Regulamento (UE) No 1169/2011 de 25 de Outubro de 2011 relativo à prestação de informação aos consumidores sobre os géneros alimentícios. Jornal Oficial da União Europeia . Potrowl, P. (2019). Camille Bloch chocolate museum in Courtelary. Obtido 15 de Agosto de 2021, de 67 Wikimedia Commons website: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Courtelary__Machine_à_enrober_le_chocolat_au_musée_de_la_chocolaterie_Camille_Bloch_-_2.jpg R-Biopharm. (2021a). Aflacard total. Obtido 15 de Agosto de 2021, de https://food.rbiopharm.com/products/aflacard-total/ R-Biopharm. (2021b). RIDA®CUBE Sucrose / D-Glucose / D-Fructose. Obtido 15 de Agosto de 2021, de https://food.r-biopharm.com/products/ridacube-sucrose-d-glucose-d-fructose/ Romer Labs. (2021). Kits de análises rápidos e confiáveis para detecção de alergênicos alimentares. Obtido 15 de Agosto de 2021, de https://www.romerlabs.com/pt/produtos/kits-deanalises/alergenicos-alimentares/ Sharma, G. M., Khuda, S. E., Parker, C. H., Eischeid, A. C., & Pereira, M. (2016). Detection of allergen markers in food: Analytical methods. Food Safety: Innovative Analytical Tools for Safety Assessment , 65–121. https://doi.org/10.1002/9781119160588.ch4 Talbot, G. (2009). Science and Technology of Enrobed and Filled Chocolate, Confectionery and Bakery Products . https://doi.org/10.1533/9781845696436 Verna, R. (2013). The history and science of chocolate. Malaysian Journal of Pathology , 35 (2), 111– 121. 68 Anexos Anexo I – Custos associados aos diferentes meios de cultura DG18 existentes no mercado Dependendo do fornecedor, o modo de preparação do meio de cultura DG18 é diferente e consequentemente, o custo associado também será diferente. No caso do fornecedor atual, é necessário dissolver o meio de cultura em água destilada, adicionar glicerol e uma solução de cloranfenicol diluído em etanol e água destilada. No caso do fornecedor alternativo 1, basta apenas dissolver o meio de cultura em água destilada e adicionar glicerol e, por último, no caso do fornecedor alternativo 2, o meio de cultura já se encontra pronto a utilizar, sendo necessário derretê-lo duas vezes em banho-maria e depois colocá-lo em placas de Petri.. I.1. Custos associados ao meio de cultura DG18 do fornecedor atual Primeiramente, é necessário calcular os custos associados aos consumíveis necessários para a preparação deste meio de cultura. Sabe-se que para diluir 15 g do meio de cultura DG18 é necessário 0,5 L de água destilada. Como 500 g de meio de cultura custam 45 €, então 15 g custam 1,35 € e se 0,5 L de água destilada custam 1,5 €, então o custo da diluição do meio de cultura em água destilada é de cerca de 2,85 €/0,5 L. De seguida, aos 15 g de meio de cultura diluído é preciso adicionar 1 vial de cloranfenicol também diluído. Para diluir 1 vial (0,05 g) de cloranfenicol, que custa 4 €, é necessário preparar uma solução de 3 mL de etanol com água destilada (1:1), isto é, em 3 mL da solução, metade será etanol e a outra metade será água destilada. O custo do etanol é de 20 €/L, então o custo da solução de diluição (𝐶𝑑) é dado pela Equação (5). 𝐶𝑑 =0,0015 L×(1,5 €+10 € 0,5 L )=0,03 €/0,5 L (5) Desta forma, o custo de preparação do cloranfenicol diluído é de cerca de 4,03 €/0,5 L. Por último, apenas é necessário adicionar 110 mL de glicerol, que custam cerca de 44 €. Assim, por 0,5 L, o custo total associado aos consumíveis deste modo de preparação é de cerca de 50,88 €, o que corresponde a cerca de 102 €/L. Considerando que cada placa de Petri leva 0,02 L de meio de cultura diluído, então para 1 L de meio de cultura diluído é possível preparar 50 placas de Petri com meio de cultura, o que faz com que o custo do meio de cultura diluído por placa seja 2,04 €. Relativamente ao custo da mão-de-obra, considera-se que apenas é necessária 1 pessoa que recebe um salário mensal de 700 € e que num mês trabalha cerca de 160 h (considerando que num mês 69 existem 4 semanas e que por semana se trabalham 40 h), então o custo da mão-de-obra é de aproximadamente 4,38 €/h. Considerando que para preparar as 50 placas se demora 2 h 30 min, então o custo da mão-de-obra para preparar 50 placas é de aproximadamente 11 €, o que corresponde a 0,22 €/placa. Assim, o custo total associado à preparação do meio de cultura DG18 do fornecedor atual corresponde à soma do custo do meio de cultura apresentado (2,04 €), do custo de uma placa de Petri (0,07 €) e do custo de mão-de-obra para preparar uma placa (0,22 €), o que equivale a 2,33 €/placa. I.2. Custos associados ao meio de cultura DG18 do fornecedor alternativo 1 Em relação ao fornecedor alternativo 1, começa-se por diluir 15,8 g de meio de cultura DG18 que já possui o cloranfenicol em 0,5 L de água destilada. Como 500 g custam 290 €, então os 15,8 g de meio de cultura necessários custam 9,16 g, o que faz com que o custo da diluição do meio de cultura em água destilada seja de cerca de 10,66 €/0,5 L, uma vez que 0,5 L de água destilada também custam 1,5 €. Em segundo lugar, basta apenas adicionar 110 mL, que também custam cerca de 44 €, fazendo com que o custo associado a este modo de preparação seja de cerca de 54,66 €/0,5L, o que corresponde a total de cerca de 109 €/L. Considerando que cada placa de Petri leva 0,02 L de meio de cultura diluído, então para 1 L de meio de cultura diluído é possível preparar 50 placas de Petri com meio de cultura, o que faz com que o custo do meio de cultura diluído seja de 2,19 €/placa. Relativamente ao custo da mão-de-obra, considera-se, novamente, que apenas é necessária 1 pessoa que recebe um salário mensal de 700 € e que num mês trabalha cerca de 160 h (considerando que num mês existem 4 semanas e que por semana se trabalham 40 h), então o custo da mão-de-obra é de aproximadamente 4,38 €/h. Considerando que para preparar as 50 placas se demora 2 h 15 min, então o custo da mão-de-obra para preparar 50 placas é de 9,84 €, o que corresponde a 0,20 €/placa. Assim, o custo total associado à preparação do meio de cultura DG18 do fornecedor atual corresponde à soma do custo do meio de cultura apresentado (2,19 €), do custo de uma placa de Petri (0,07 €) e do custo de mão-de-obra para preparar uma placa (0,20 €), o que equivale a 2,46 €/placa. I.3. Custos associados ao meio de cultura DG18 do fornecedor alternativo 2 Por fim, o fornecedor alternativo 2 já possui o meio de cultura DG18 pronto a ser usado, cujo custo é de 75 €/0,6 L, o que corresponde a cerca de 125 €/L. Considerando que cada placa de Petri leva 0,02 L de meio de cultura diluído, então para 1 L de meio de cultura diluído é possível preparar 50 placas de Petri com meio de cultura, o que faz com que o custo do meio de cultura diluído seja de 2,50 €/placa. 70 Relativamente ao custo da mão-de-obra, considera-se, mais uma vez, que apenas é necessária 1 pessoa que recebe um salário mensal de 700 € e que num mês trabalha cerca de 160 h (considerando que num mês existem 4 semanas e que por semana se trabalham 40 h), então o custo da mão-de-obra é de aproximadamente 4,38 €/h. Considerando que para preparar as 50 placas se demora 1 h, então o custo da mão-de-obra para preparar 50 placas é de 2,19 €, o que corresponde a 0,04 €/placa. Assim, o custo total associado à preparação do meio de cultura DG18 do fornecedor atual corresponde à soma do custo do meio de cultura apresentado (2,50 €), do custo de uma placa de Petri (0,07 €) e do custo de mão-de-obra para preparar uma placa (0,09 €), o que equivale a 2,66 €/placa. 71 Anexo II – Suporte fotográfico: comparação entre a técnica de incorporação e a técnica de espalhamento para contagem de bolores e leveduras Relativamente aos testes realizados que comparam a técnica de incorporação com a técnica de espalhamento, é possível observar na Figura os resultados obtidos. Figura I.1 - Suporte fotográfico relativo aos resultados obtidos no teste que compara a técnica de incorporação e espalhamento, relativo à contagem de bolores e leveduras. 72 Anexo III – Suporte fotográfico: comparação entre a técnica de incorporação e as placas Compact Dry para contagem total de microrganismos Relativamente ao testes realizados que comparam as placas preparadas manualmente e as placas Compact Dry, é possível observar na os resultados obtidos. Figura II.1 - Suporte fotográfico relativo aos resultados obtidos no teste que compara as placas preparadas manualmente e as placas Compact Dry, relativo à contagem total de microrganismos. 73 Anexo IV – Custos associados à preparação manual das placas de Petri com meio de cultura Considere-se que, para a preparação dos meios de cultura utilizados para realizar as análises microbiológicas, é necessário ter em conta o custo dos consumíveis (placa de Petri, meio de cultura em pó e água destilada), o custo do uso do autoclave também em consumíveis (água e energia) e o custo da mão-de-obra necessária. Assim, o custo total de 0,37 € corresponde à soma destes três parâmetros, que são agora explicados ao pormenor. IV.1. Custos associados aos consumíveis Os consumíveis são as placas de Petri descartáveis, os meios de cultura em pó e a água destilada. Assim, sabe-se que 720 placas de Petri custam cerca de 50 €, que a água destilada custa cerca de 3 €/L e que, dependendo do meio, 500 g custam cerca de 40 €. Para cada preparação, é necessário 25 g de meio de cultura em pó e 1 L de água destilada e, portanto, 25 g custam cerca de 2 €. Considerando que cada placa de Petri leva 0,02 L de meio de cultura diluído, então para 1 L de meio de cultura diluído é possível preparar 50 placas de Petri com meio de cultura. Assim, na Equação (6) é apresentado o custo total de todos os consumíveis necessários por placa (𝐶𝑡𝑐). 𝐶𝑡𝑐 = 50 € 720 + 2 € + 3 € 50 =0,17 € (6) IV.2. Custos associados ao uso do autoclave Os custos associados ao uso do autoclave são basicamente os custos associados à água e eletricidade gasta. O preço da água da companhia é de cerca de 0,0018 €/L e o preço da eletricidade é de cerca de 0,2 €/kWh. Todo o meio de cultura diluído terá de ser esterilizado, pelo que é necessário considerar sempre uma utilização do autoclave. Sabendo que para uma utilização, o autoclave permanece ligado durante cerca de 1 h e considerando que este gasta 6,6 kWh durante esse tempo, então o custo da energia elétrica gasta por cada utilização é de cerca de 1,20 €/50 placas. No que concerne à água necessária para o funcionamento do autoclave, sabe-se que o seu volume gasto corresponde ao volume de uma parte do autoclave. Esta parte tem a forma de um cilindro que possui 5 dm3 de diâmetro e 3 dm3 de altura. Assim, na Equação (7) encontra-se o cálculo do volume de água necessária para que o autoclave funcione (𝑉w). 74 𝑉w= π 4∙52∙ 3 dm3=58,9 L (7) Assim, o custo de 58,9 L de água necessária para o funcionamento do autoclave é de 0,11 €/50 placas. Desta forma, o custo total associado ao uso do autoclave é de 1,31 €/50 placas, o que corresponde a cerca de 0,03 €/placa. IV.3. Custos associados à mão-de-obra necessária Para todo este procedimento de preparação dos meios de cultura em placas de Petri, é apenas necessária 1 pessoa. Considerando que esta pessoa recebe um salário mensal de 700 € e que num mês trabalha cerca de 160 h (considerando que num mês existem 4 semanas e que por semana se trabalham 40 h), então o custo da mão-de-obra é de aproximadamente 4,38 €/h. Para a preparação de 50 placas de Petri com meio de cultura, a pessoa gasta cerca de 2 h de trabalho (1 h de controlo do autoclave e 1 h para o restante procedimento), então o custo de mão-de-obra para preparar 50 placas é de 8,75 €, o que corresponde a 0,18 €/placa. 75 Anexo V – Custos associados à utilização das placas Compact Dry e respetivas normas para a contagem de E. coli e pesquisa de Salmonella Considere-se que, para a análise contagem de E. coli ou pesquisa de Salmonella utilizando as placas Compact Dry prontas a usar é necessário considerar os custos associados às próprias placas Compact Dry, aos restantes consumíveis para a preparação do meio de diluição (meio de diluição em pó e água destilada), ao uso do autoclave também em consumíveis e ainda é o custo da mão-de-obra implícita a todo este método. Assim, o custo total de 4,49 € corresponde à soma destes três parâmetros, que são agora explicados ao pormenor. V.1. Custos associados aos consumíveis Os consumíveis são a placa Compact Dry pronta a usar, o meio de diluição em pó e a água destilada. Assim, sabe-se que cada placa Compact Dry custa 1,5 €, que a água destilada custa cerca de 3 €/L e que 500 g de meio de diluição custam cerca de 25 €. Para cada preparação, é necessário 20 g de meio de cultura em pó e 1 L de água destilada e, portanto, 20 g custam 1 €. Considerando que para diluir uma vez a amostra que se pretende analisar é necessário 0,09 L de meio de diluição, então o custo do meio de diluição por amostra (𝐶𝑚𝑑) necessário para analisar uma amostra é dado pela Equação (8). 𝐶𝑚𝑑 = 2 € + 3 € 1 L ×0,09 L=0,36 € (8) Assim, o custo total de todos os consumíveis necessários é igual a 1,86 €, o que corresponde à soma do custo de uma placa Compact Dry pronta a usar (1,5 €) e o custo de 90 mL de meio de diluição líquido (0,36 €). V.2. Custos associados ao uso do autoclave Os custos associados ao uso do autoclave são basicamente os custos associados à água e eletricidade gasta. O preço da água da companhia é de cerca de 0,0018 €/L e o preço da eletricidade é de cerca de 0,2 €/kWh. Todo o meio de diluição líquido terá de ser esterilizado, pelo que é necessário considerar sempre uma utilização do autoclave. Todos estes cálculos são iguais ao cálculo na secção IV.2 do Anexo IV e, por isso, o custo associado ao uso do autoclave é de 1,31 € para a preparação de 1 L de meio de diluição líquido. Assim, como só é necessário 1 frasco com 0,09 L de meio de diluição líquido, então o custo associado à sua esterilização é de 0,12 €. 82 e que o custo da energia elétrica é de 0,2 €/kWh, então o valor total associado ao preço da energia elétrica gasta por análise é de 0,05 €. Em relação ao custo da mão-de-obra, considera-se que apenas é necessária 1 pessoa que recebe um salário mensal de 700 € e que num mês trabalha cerca de 160 h (considerando que num mês existem 4 semanas e que por semana se trabalham 40 h), então o custo da mão-de-obra é de aproximadamente 4,38 €/h. Considerando que o tempo de mão-de-obra necessária é igual ao tempo de realização de uma análise, então em 15 min, o custo da mão-de-obra é de cerca de 1,09 €/análise. Assim, o custo associado à determinação de uma análise é de aproximadamente 1,14 €, o que corresponde à soma do custo de energia consumida pelo analisador automático de humidade e do custo da mão-de-obra necessária.