Influencia de la recolección del espárrago en su perfil fitoquímico y farmacológico

1 UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA INFLUENCIA DE LA RECOLECCIÓN DEL ESPARRAGO EN SU PERFIL FITOQUÍMICO Y FARMACOLÓGICO JOSÉ ANTONIO GARCÍA MÁRQUEZ 2 3 UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA TRABAJO FIN DE GRADO - GRADO EN FARMACIA. PROYECTO DE CARÁCTER EXPERIMENTAL: INFLUENCIA DE LA RECOLECCIÓN DEL ESPARRAGO EN SU PERFIL FITOQUÍMICO Y FARMACOLÓGICO Autor: José Antonio García Márquez Tutores:  María Dolores García Gimenez (Departamento de Farmacología)  Pedro Cermeño Sacristán (Centro IFAPA “Las Torres-Tomejil”, Departamento de Horticultura) Área: Farmacología Fecha: 19 de Septiembre (10:00 AM) Lugar: Aula 0.4 4 5  RESUMEN El objeto de nuestro proyecto ha sido un estudio sobre los espárragos pertenecientes a la especie Asparagus officinalis var. `grande´, que forma parte de la familia Asparagaceae. Los espárragos se recolectan naturalmente en nuestra zona geográfica entre marzo y abril, pudiendo ampliarse a mayo en función de las condiciones climatológicas y edafológicas de cada año. En el centro I.F.A.P.A. (Instituto de Formación Agraria y Pesquera de Andalucía) “Las Torres-Tomejil” situado en Alcalá del Río, Sevilla, se ha desarrollado un método de recolección cuyo propósito es prolongar la época natural de recolección, con el objetivo de comercializar y consumir espárragos frescos durante más tiempo sin tener que recurrir a la congelación. Dicho método de recolección se realizó en los años 2009 y 2012, y con él se ha demostrado que, efectivamente, es posible seguir recolectando espárragos de manera natural durante algunos meses más, pudiendo mantener la recolección concretamente hasta el mes de Octubre en el caso del año 2012. Lo que queremos comprobar con este trabajo es si estos espárragos recolectados varios meses después de su fecha de recolección natural tienen unas propiedades y calidad comparables a los recogidos en su época supuestamente óptima. Para ello mediremos la humedad y las proteínas totales presentes en cada una de las 1383 muestras de espárragos, 550 recolectadas en 2009 y 833 en 2012, teniendo en cuenta su fecha de recolección y su proximidad al río Guadalquivir para diferenciar las muestras. Por otra parte, se ha comparado la cantidad de fenoles presentes en muestras frescas y en muestras descongeladas, para comprobar si el espárrago pierde o no parte de este componente que otorga al alimento la capacidad antioxidante tan característica de este alimento, y con ello comprobaremos si un método de conservación como la congelación es eficiente para mantener las propiedades del espárrago. PALABRAS CLAVE: Espárragos, recolección, Fenoles, Humedad, Proteínas 6  ÍNDICE Página I. INTRODUCCIÓN 7 I.1 Origen 9 I.2 Importancia económica y distribución geográfica 10 I.3 Descripción botánica 11 I.4 Composición química y actividad farmacológica 13 II. OBJETIVOS 16 III. MATERIALES UTILIZADOS III.1 Material vegetal 17 III.2 Materiales para los análisis III.2.1 Humedad 17 III.2.2 Proteínas totales 17 III.2.3 Fenoles 18 IV. METODOLOGÍA IV.1 Humedad 18 IV.2 Proteínas totales: Método Kjeldahl 19 IV.3 Determinación de fenoles: método de Folin-Ciocalteu 21 V. RESULTADOS 24 VI. DISCUSIÓN 33 VII. CONCLUSIONES 35 VIII. BIBLIOGRAFÍA 36 7 I. INTRODUCCIÓN El cultivo del espárrago consta de tres fases: fase vegetativa, fase de producción (o recolección) y fase de parada invernal. En la fase vegetativa, la planta se va desarrollando, sus tallos van creciendo y la planta realiza la fotosíntesis de modo natural. En la fase de producción, que suele durar unos tres meses como máximo (marzo, abril y mayo), la planta se recolecta al completo, interrumpiendo así su fase vegetativa. Se recolectarán todos los turiones de más de 23 cm de longitud. En la fase de parada invernal (diciembre, enero y febrero) se siega completamente la parte aérea de la planta, dejando así sólo la parte subterránea para que se desarrolle de nuevo cuando la temperatura ambiental se lo permita. El centro IFAPA “LAS Torres - Tomejil” desarrolló en 2009 un método de recolección de espárragos que volvió a poner en práctica en el año 2012, en el que se combinaban las fases vegetativa y de producción (Figura 1). Para ello se separó la plantación en cuatro bloques, y en cada bloque se realizaron cuatro tratamientos diferenciales dispuestos al azar, compuesto cada uno de ellos por tres parcelas dentro de cada bloque. Tenemos así doce parcelas en cada bloque, cada una de ellas con varias plantas. Lo que llamamos “tratamiento diferencial” no es otra cosa que especificar a la hora de recolectar cada parcela cuántos de los tallos madre que haya en cada planta de esa parcela deben dejarse sin recolectar. Esto quiere decir que la planta no se recolecta al completo, pudiendo volver a desarrollarse nuevos turiones gracias a esos tallos madre que se han dejado tras la siega. Cabe destacar que absolutamente todas las plantas pertenecían a la misma especie, Asparagus officinalis L. var. `grande´, (familia Asparagaceae), y que todas las plantas fueron abonadas y regadas del mismo modo para que el único tratamiento diferencial se diese en la fase de recolección. Entrando en detalles, se dejaron concretamente cero, uno, tres y cinco tallos madre según se hubiera definido cada bloque aleatoriamente. Como era de esperar, en el primer tratamiento, en el que se recolecta absolutamente toda la planta, no se prolongaba el tiempo de recolección, terminando 8 la producción de espárragos frescos en la primera quincena de Mayo, tanto en 2009 como en 2012. En el caso de las plantas a las que se dejaba con un tallo madre, siguieron proporcionando turiones frescos hasta Junio tanto en 2009 como en 2012 ya que seguía en plena fase vegetativa en algunos casos. En los casos en los que se dejaron tres tallos madre, la recolección se pudo realizar hasta Julio en 2009 pero se optimizó en 2012, llegándose a producir turiones en algunos casos aislados hasta el mes de Octubre. Dejando cinco tallos madre también se alcanzó el mes de Octubre en numerosas plantas, demostrando que el método era muy eficaz para duplicar fácilmente la producción, lo que evitaría a los consumidores tener que adquirir el producto procedente de otros países, con el aumento de precio y la disminución de calidad que ello conlleva. Se comprobó además que las propiedades organolépticas de los turiones eran mejores, ya que estaban más sombreados y menos lignificados, por tanto su sabor también era más preciado. Sin embargo podrían plantearse algunas preguntas sobre el método. ¿Conservarían sus propiedades estos espárragos recolectados hasta cinco meses más tarde de su fecha natural? Esa es la pregunta que se ha intentado resolver con este proyecto, no sin antes hablar sobre la planta que nos atañe, la esparraguera. Figura 1: Centro IFAPA “Las Torres – Tomejil”. ( www.dronevisión.es) 9 I.1 Origen Los primeros vestigios de espárragos aparecieron en forma de pinturas en los monumentos egipcios (3.000 a.C.), eran dibujados atados en manojos en dos o tres ligaduras (Figura 2); en este caso parecían ser utilizados como ofrenda a los dioses (Espejo y cols, 2000). Fue una hortaliza apreciada por los griegos, pero serían los romanos quienes introdujeran este cultivo en Europa septentrional. Tras las invasiones bárbaras, su cultivo solo se conservó en España hasta el final de la Edad Media, en que volvieron a cultivarse en el norte y centro de Europa. Las actuales variedades parece ser que tienen su procedencia en selecciones llevadas a cabo en Holanda en el siglo XVIII. Figura 2: Manojo tradicional de espárragos 16 II. OBJETIVOS Este estudio consta de tres objetivos:  El principal objetivo es comprobar la viabilidad de este método, con el que prolongamos la recolección hasta cinco meses más de lo habitual, manteniendo la calidad organoléptica en la especie vegetal.  Por otra parte también comprobaremos si existen diferencias en el porcentaje de agua y proteínas totales que posee cada muestra en función a su proximidad o lejanía al río.  El último objetivo pretende demostrar la diferencia entre muestras recién recolectadas y muestras de la misma planta que habían permanecido congeladas a una temperatura de -40ºC. 17 III. MATERIALES UTILIZADOS III.1 Material Vegetal Las 1383 muestras analizadas eran turiones de Asparagus officinalis var. `grande´, que pertenece a la familia Asparagaceae, cultivados en la vega del Guadalquivir dentro del centro IFAPA “LAS TORRES – Tomejil” en una zona cercana a la orilla, y recolectadas a lo largo de dos periodos separados en el tiempo, comprendidos entre Abril y Julio de 2009 y entre Marzo y Octubre de 2012. III.2 Materiales y reactivos para los análisis o III.2.1 determinación de humedad  Balanza de precisión (0.0001 g)  Estufa 70ºC  Sobres o III.2.2 Determinación de Proteínas totales  Ácido sulfúrico puro con dosificador  Agua destilada  Autoanalizador  Balanza de precisión (0.0001 g)  Catalizador de Kjeldahl  Cuchara con espátula  Estufa 70ºC  Frascos de 50 ml con tapón de rosca  Papel fino para empaquetar las muestras (libre de Nitrógeno)  Sobres para cada muestra individual  Tubos digestores específicos para nuestro aparato  Vaso de precipitados  Viales de 10 ml con tapón 18 o III.2.3 Determinación de fenoles  Ácido gálico  Agua destilada  Carbonato de sodio  Espectrofotómetro  Reactivo de Folin Ciocalteu  Vórtex IV. METODOLOGÍA En todos los casos se utilizaron procedimientos oficiales de análisis de la AOAC International, reconocidos mundialmente como los óptimos para dichas determinaciones. IV.1 Determinación de humedad El método se basa en la determinación gravimétrica de la pérdida de masa que experimenta la muestra desecada hasta masa constante en estufa de aire. Todas las muestras se analizaron por triplicado. El procedimiento consiste en introducir una muestra en un sobre y anotar el peso (previamente se deberá haber anotado el peso del sobre vacío). Introducir en la estufa de aire a 70ºC al menos 48 horas para conseguir peso constante. Una vez comprobado que el peso es constante anotamos el nuevo valor. La humedad del producto expresada en porcentaje, es igual a: m2 - m3 % Humedad = ---------------- x 100 m2 - m1 Donde: m1: masa del sobre vacío, en gramos. m2: masa del sobre con la muestra antes del secado, en gramos. m3: masa del sobre más la muestra desecada, en gramos. Promediar los valores obtenidos y expresar el resultado con dos decimales. 19 La diferencia de los resultados no debe ser superior al 5% del Promedio para considerarlos válidos. (AOAC International, 1990) IV.2 Determinación de proteínas totales por el Método Kjeldahl El contenido proteínico de los alimentos puede determinarse por medio de diversos métodos. La forma más habitual es su cuantificación de forma indirecta y aproximada, bien a partir del contenido en nitrógeno de la muestra, o bien deduciendo su cantidad a partir del contenido de uno o dos aminoácidos particulares que conforman la proteína, fáciles de identificar y de cuantificar por su reactividad química específica. En el caso que nos ocupa, el aminoácido principal es la Asparagina. Este segundo procedimiento conlleva una mayor inexactitud. Desde hace más de 100 años se está utilizando el método Kjeldahl para la determinación del nitrógeno en una amplia gama de muestras (alimentos y bebidas, piensos, forrajes, fertilizantes) para el cálculo del contenido en proteína. También se utiliza el método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno en aguas residuales y suelos. Es un método oficial descrito en múltiples normativas: AOAC, USEPA, ISO, farmacopeas y distintas Directivas Comunitarias. La convención general, sobreentendida, es que la totalidad del nitrógeno de la muestra está en forma proteica, aún cuando la realidad es que, según la naturaleza del producto, una fracción considerable del nitrógeno procede de otros compuestos nitrogenados (bases púricas y pirimidínicas, creatina y creatinina, urea, amoniaco, etc.), por ello se denomina “proteína bruta” o “proteína total” a la obtenida por este método (García-Martínez y Fernández-Segovia, 2013). El método Kjeldahl mide el contenido en nitrógeno de una muestra. El contenido en proteína se puede calcular seguidamente, presuponiendo una proporción entre la proteína y el nitrógeno para el alimento específico que está siendo analizando, en nuestro caso, los turiones de la variedad `grande´ de la especie Asparagus officinalis, cuyo factor de conversión es de 6,25 (Nielsen, 2003). Este método puede ser dividido, básicamente en 3 etapas: digestión o mineralización, destilación y valoración. El procedimiento a seguir es diferente en función de si en la etapa de destilación el nitrógeno liberado es recogido sobre un 20 exceso conocido de ácido clorhídrico o sulfúrico patrón o sobre una disolución de ácido bórico. Ello condicionará la forma de realizar la siguiente etapa de valoración, así como los reactivos empleados. En nuestro caso se empleó el ácido sulfúrico en exceso. (a) Etapa de digestión: un tratamiento con ácido sulfúrico concentrado, en presencia de un catalizador y ebullición convierte el nitrógeno orgánico en ión amonio, según la siguiente ecuación: (Catalizadores/ calor) n - C -NH2 + H2SO4 -----------------------> CO2 + (NH4) 2 SO4 + SO2 Procedimiento: Se introduce 1 g de muestra previamente desecada durante al menos 48 horas y homogeneizada en un tubo de mineralización. Dicha muestra se introduce empaquetada en un papel fino libre de nitrógeno. Se añaden 3 g de catalizador, que suele estar constituido por una mezcla de sales de cobre, óxido de titanio o/y óxido de selenio. De forma habitual se utiliza como catalizador una mezcla de K2SO4 : CuSO4 : Se (10:1:0,1 en peso). Después se adicionan 7 ml de H2SO4 concentrado. Posteriormente se digiere a 370 ºC durante un mínimo de 5 horas. Se sabe que la digestión ha terminado porque la disolución adquiere un color amarillento-verdoso característico (AOAC Internacional, 2000). La cantidad de H2SO4 concentrado añadida se fue optimizando en función a la actuación de los tubos durante la digestión, ya que en un principio se producían proyecciones de la muestra hacia la parte alta del tubo, dificultando el trabajo posterior y pudiendo provocar pérdidas, empezando con el procedimiento añadiendo 10 ml hasta dar con la cantidad adecuada, 7 ml. El nitrógeno proteico es transformado en sulfato de amonio por acción del ácido sulfúrico en caliente. Este proceso se realizó en un digestor Gerhardt Kjeldatherm Block Digestion, con capacidad para 40 tubos de 100 ml sin estrangulamiento, específicos para nuestro modelo del digestor. 21 (b) Etapa de destilación: se alcaliniza la muestra digerida y el nitrógeno se desprende en forma de amoniaco: (NH2)SO4 + 2 NaOH → 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O El amoniaco destilado se recoge sobre un exceso conocido de ácido sulfúrico: NH3 + HCl (exceso) → NH4+ + Cl- + HCl (sobrante) (c) Etapa de valoración: La cuantificación del nitrógeno amoniacal se realiza por medio de una volumetría ácido-base usando como indicador una disolución alcohólica de una mezcla de rojo de metilo y azul de metileno. Se valora el ácido sulfúrico o clorhídrico sobrante con una disolución de hidróxido sódico valorada (Skoog y West, 1989). H2SO4 (sobrante) + NaOH → Na2SO4 + H2O HCl (sobrante) + NaOH → NaCl + H2O Si bien, en el laboratorio disponíamos de un autoanalizador calibrado para el nitrógeno que realizaba las etapas (b) y (c) facilitando y economizando por tanto el trabajo, ya que sólo requería una disolución del líquido obtenido tras la digestión aforando a 50 ml con agua destilada. IV.3 Determinación de Fenoles Totales por el método Folin-Ciocalteu Los métodos usados comúnmente para determinar y cuantificar fenoles totales en alimentos y vegetales son el ensayo de la vainillina y el de Folin-Ciocalteu, que fue el que utilizamos para el presente trabajo. El método de Folin-Ciocalteu se basa en la capacidad de los fenoles para reaccionar con agentes oxidantes. El reactivo de Folin-Ciocalteu contiene molibdato y tungstato sódico, que reaccionan con cualquier tipo de fenol, formando complejos fosfomolíbdico-fosfotúngstico (Peterson, 1979). La transferencia de electrones a pH 22 básico reduce los complejos fosfomolíbdico-fosfotúngstico en óxidos, cromógenos de color azul intenso, de tungsteno (W8O23) y molibdeno (Mo8O23), siendo proporcional este color al número de grupos hidroxilo de la molécula (Julkunen-Tiito, 1985) Se pesaron 10 g del material seco y pulverizado de cada planta, se pusieron a macerar en metanol acuoso al 80% en un frasco ámbar a temperatura ambiente durante 24 h agitándolo de vez en cuando, enseguida se filtró y el residuo de esta filtración se extrajo dos veces más de la misma manera. A continuación se reunieron los extractos y se evaporó la mayor parte del disolvente sin calentar más allá de 40 °C. El producto de la evaporación completamente seco se pesó y se guardó en refrigeración hasta su uso para los siguientes análisis. Los fenoles totales se determinan mediante el método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu usando el ácido gálico como material de referencia. Se preparó una disolución patrón de ácido gálico de 0,1 g/L, para lo cual se pesaron 25 mg de ácido gálico, se colocaron en un matraz aforado de 25 ml y se llevaron a volumen con agua destilada, enseguida se preparó una dilución 1:10 con agua destilada (siempre se utiliza una solución recién preparada). De la misma manera se preparó una disolución de carbonato de sodio al 20 % pesando 5 g de carbonato de sodio en un matraz aforado de 25 ml, inicialmente se disolvió en 15 ml de agua grado HPLC y se llevó hasta su completa disolución, finalmente se llevó a su volumen de aforo con agua. Por otro lado se preparó una disolución 1N del reactivo de Folin Ciocalteu, por medio de una dilución 1:2 del reactivo comercial (2N) en agua destilada; el reactivo se protegió de la luz y se colocó en refrigeración hasta su uso. Los reactivos se deben adicionar en el orden indicado en el procedimiento que se encuentra debajo de la tabla I: 23 N o Tubo Sol. Ác. Gálico (µL) Agua destilada (µL) Reactivo de F-C (µL) Carbonato de Sodio (µL) Blanco 0 250 125 625 1 20 230 125 625 2 40 210 125 625 3 60 190 125 625 4 80 170 125 625 5 100 150 125 625 6 120 130 125 625 7 140 110 125 625 8 160 90 125 625 Tabla I: Cantidades totales de cada reactivo en su tubo correspondiente Procedimiento:  Rotular los tubos como se indica en la tabla anterior  Adicionar a cada tubo la cantidad indicada de ácido gálico  Adicionar a cada tubo la cantidad correspondiente de agua destilada  Adicionar a cada tubo la cantidad correspondiente de Reactivo de Folin- Ciocalteu  Agitar en vórtex  Añadir a cada tubo los 625 µL de la solución de Carbonato de Sodio  Dejar reposar durante dos horas en oscuridad.  Rellenar la microplaca y proceder a la determinación de la Absorbancia a 750 nm en el espectrofotómetro (Prior y cols., 2005). 24 V. RESULTADOS V.1 HUMEDAD En primer lugar vamos a observar las gráficas que representan la humedad determinada en cada muestra según el número de tallos madre que se dejaron sin recolectar, diferenciándolas a su vez en función de la cercanía al río. El análisis estadístico no mostró diferencias significativas en ninguno de los casos. V.1.1 Cero tallos madre En la tabla II representamos los resultados de humedad obtenidos en los turiones recolectados con el primer tratamiento, en el que se recolectaba la totalidad de las plantas que alcanzaran tamaño comercial (esto es, turiones de 23 cm al menos): Tabla II: comparación entre la humedad determinada para el primer tratamiento en los turiones de plantas adyacentes al río (en color azul) y los turiones de plantas más alejadas del rio (en color rojo), pudiéndose observar en ordenadas el % de agua y en abscisas la quincena en la que se recolectó. V.1.2 Un tallo madre La humedad determinada en los turiones recolectados con el segundo tratamiento, en el que se dejaba crecer uno de los tallos madre de cada planta, en función de la época de recolección se representa en la tabla III: 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 humedad rio humedad interior 25 Tabla III: comparación entre la humedad determinada para el segundo tratamiento en los turiones de plantas adyacentes al río (en color azul) y los turiones de plantas más alejadas del rio (en color rojo), pudiéndose observar en ordenadas el % de agua y en abscisas la quincena en la que se recolectó. V.1.3 Tres tallos madre En la tabla IV vemos el porcentaje de agua en los turiones recolectados siguiendo el tercer tratamiento, en el que se dejan 3 tallos madre en cada planta para su crecimiento vegetativo: Tabla IV: comparación entre la humedad determinada en el caso de los turiones de plantas adyacentes al río (en color azul) y los turiones de plantas más alejadas del rio (en color rojo), pudiéndose observar en ordenadas el % de agua y en abscisas la quincena en la que se recolectó siguiendo con el protocolo del tercer tratamiento. 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 humedad rio humedad interior 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 humedad rio humedad int 32 Figura 9: Análisis de varianza realizado con un nivel de confianza del 95% para la humedad y las proteínas en función del tratamiento y de la quincena. En el caso de la humedad no existe diferencia significativa, y en el caso de las proteínas se observa un aumento con respecto a las proteínas en los dos últimos tratamientos (3 y 5 tallos madre) pero sin poder considerarse significativo ya que no supera su LSD (mínima diferencia significativa, cuyo valor en este caso es de 1,974). 33 VI. DISCUSIÓN En los análisis estadísticos realizados en las distintas muestras no hemos encontrado diferencias significativas con respecto a su contenido en agua o proteínas en ninguno de los casos. Veamos datos concretos: V.1 Humedad y proteínas: La media de humedad en el primer tratamiento en 2009 fue de 94,15 ± 0,66 % y la de proteínas, 1,29 ± 0,30 % y en 2012, la humedad media fue de 94,14 ± 1,45 % y la cantidad de proteínas, 1,75 ± 0,54 %. En el segundo tratamiento, la humedad media total fue en 2009 de 93,38 ± 1,24 y las proteínas, 1,62 ± 0,45 %. En 2012 tenemos una humedad de 94,55 ± 1,21 y un porcentaje de proteínas de 1,53 ± 0,41 %. En el tercer tratamiento, las medias son para 2009 de 93,03 ± 1,49 % de humedad y 1,98 ± 0,65 % de proteínas, y para 2012 tenemos los valores de 94,29 ± 1,72 % de humedad y de 1,71 ± 0,63 % de proteínas. Para finalizar, en el último caso tenemos unos porcentajes en 2009 de humedad de 93,44 ± 1,95 % y de proteínas 1,94 ± 0,53 %. En 2012 calculamos los valores de 94,33 ± 1,26 % de humedad y de 1,75 ± 0,48 % de proteínas. Se realizó un análisis estadístico con un nivel de confianza del 95% para comprobar si existían diferencias significativas. Para ello, el valor de P debía ser menor a 0,05) y en todos los casos se superaba dicho valor. También se compararon los valores de humedad y proteínas entre los meses primeros y últimos de recolección, siendo la diferencia entre ellos no significativa en ninguno de los casos. Por otra parte, también se realizaron análisis estadísticos entre la humedad y las proteínas de las muestras que habían sido cultivadas en la zona más cercana a la orilla del río con respecto a las muestras más alejadas, sin haberse encontrado tampoco ninguna diferencia significativa que nos llevara a la conclusión de que la distancia al río pudiera influir en el porcentaje de agua o de proteínas en nuestras muestras. 34 V.2 Fenoles: En cuanto a los fenoles, se puede observar en base a los datos de la tabla XI cómo la media de equivalentes de ácido gálico por cada gramo de muestra seca en muestras con una concentración de 20 µL de muestra en 100 µL de la disolución (el equivalente al volumen del pocillo) es de 628,92 ± 323,33 mientras que la media en las muestras frescas es de 1144,58 ± 139,31. En las muestras concentradas (los 100 µL de muestra en el pocillo de la microplaca no se encuentran diluidos y pertenecen a la muestra pura) se observa tras realizar un análisis estadístico que el promedio es de 2657,07 ± 797,39 equivalentes de ácido Cítrico en las muestras descongeladas, mientras que en las frescas es de 4670,31 ± 260,60 equivalentes. Simplemente observando el error estándar ya se puede comprobar que los datos en las muestras descongeladas son especialmente erráticos, pero lo más llamativo es que los valores detectados en las muestras frescas prácticamente duplican los valores calculados en las muestras que se congelaron, pudiéndose observar en algunos casos concretos una pérdida de hasta seis veces la cantidad que cabía esperar de haber conservado sus cualidades iniciales. Estos resultados nos llevaron inevitablemente a la conclusión de que no debíamos analizar los fenoles en las muestras congeladas de 2009 y 2012 para compararlos al igual que se hizo con humedad y proteínas, ya que la pérdida era considerable y los resultados no serían para nada fiables. 35 VII. CONCLUSIONES 1. Después de haber comparado las proteínas y la humedad presentes en 1383 muestras de Asparagus officinalis var. `grande´, 550 de ellas recolectadas en 2009 y 833 en 2012, se ha demostrado que no hay diferencias significativas entre las muestras recolectadas dentro de su época natural (desde febrero hasta mayo) y las muestras recolectadas fuera de esa fecha (ampliándose hasta julio en 2009 y octubre en 2012 gracias a nuestro método), por tanto el método empleado se puede considerar como beneficioso para la recolección de esta especie, ya que ampliamos la fecha de recolección y comercialización (limitada a la primavera principalmente) sin la pérdida de sus cualidades. 2. Tampoco se encontraron diferencias significativas entre la humedad y cantidad de proteínas totales de las muestras en función de su proximidad al rio, por tanto demostramos que el método de cultivo y regadío había sido eficiente y que el suelo tenía una composición homogénea. 3. Por otra parte, al comparar los fenoles determinados en muestras frescas con los presentes en muestras descongeladas podemos afirmar que la pérdida es considerable. 4. Teniendo en cuenta todas las conclusiones anteriores, volvemos a reforzar nuestra idea de que el método de recolección empleado en el Centro IFAPA “Las Torres-Tomejil” es adecuado para mantener la calidad, ya que gracias a él es posible consumir espárragos recién recolectados y por tanto frescos durante el verano e incluso en otoño, aumentando sus cualidades organolépticas y reduciendo el precio con respecto a los productos importados o congelados. 36 VIII. BIBLIOGRAFÍA  Amaro MA, Moreno R, Zurera G, García RM. 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