Dietas artificiales basadas en restricciones selectivas de aminoácidos para el tratamiento de cánceres metastásicos

Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Departamento de Farmacología DIETAS ARTIFICIALES BASADAS EN RESTRICCIONES SELECTIVAS DE AMINOÁCIDOS PARA EL TRATAMIENTO DE CÁNCERES METASTÁSICOS Memoria presentada por Julio José Jiménez Alonso para aspirar al Doctorado Internacional Dirigida por Dr. Miguel López Lázaro Sevilla, 2023 1 1. ÍNDICE 2 3 1. ÍNDICE ………………………………………………………………………………… 1 2. RESUMEN / ABSTRACT ……………………………………………………………. 6 3. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………….………… 16 3.1. Aspectos generales del cáncer …………………………………………………… 18 3.2. Incidencia y mortalidad del cáncer ……………………………………………… 23 3.3. Tratamientos anticancerosos ……………………………………………………... 26 3.3.1. Fármacos quimioterápicos …………………………………………………. 27 3.3.2. Terapia hormonal contra el cáncer ………………………………………... 28 3.3.3. Terapias dirigidas …………………………………………………………… 29 3.3.4. Inmunoterapias ……………………………………………………………… 29 3.3.5. Inconvenientes de las terapias dirigidas e inmunoterapias …………...... 30 3.3.6. Necesidad de mejores tratamientos anticancerosos ...…………………… 30 3.4. Metabolismo del cáncer …………………………………………………………... 31 3.4.1. Metabolismo energético y de la glucosa en cáncer ……………………… 32 3.4.2. Síntesis de ácidos nucleicos de las células cancerosas …………………... 35 3.4.3. Estrés oxidativo en las células cancerosas ………………………………... 35 3.4.4. Metabolismo de lípidos en cáncer ………………………………………… 38 3.4.5. Metabolismo de aminoácidos en cáncer ………………………………...... 39 Dietary Manipulation of Amino Acids for Cancer Therapy …………………. 46 3.5. Evaluación preclínica de tratamientos anticancerosos ……………………...... 100 3.5.1. Modelos in vitro …………………………………………………………...... 100 3.5.2. Modelos in vivo ……………………………………………………………... 101 3.5.3. Evaluación preclínica orientada a pacientes ……………………………... 103 4. OBJETIVOS / AIMS ………………………………………………………………...... 107 5. MATERIALES Y MÉTODOS ……………………………...………………………... 112 5.1. Reactivos y fungibles……………………………………………………………… 114 5.2. Líneas celulares y condiciones de cultivo celular ……………………………... 114 5.3. Evaluación de la citotoxicidad in vitro ………………………………………….. 116 5.3.1. Evaluación de la viabilidad celular mediante el ensayo MTT ………...... 117 5.3.2. Evaluación de la viabilidad celular mediante el ensayo resazurina …… 117 5.4. Animales ……………………………………………………………………………. 118 5.4.1. Preparación de las líneas celulares ………………………………………... 118 4 5.4.2. Inoculación de las células cancerosas ……………………………………... 119 5.4.3. Evaluación de los tratamientos en los ratones …………………………… 120 5.4.4. Modelos in vivo de cáncer metastásico …………………………………… 120 5.4.4.1. Modelo de cáncer colon con diseminación peritoneal ……..…... 122 5.4.4.2. Modelo de cáncer de colon con metástasis pulmonar …...……... 122 5.4.4.3. Modelo de cáncer renal con diseminación peritoneal ……...…... 122 5.4.4.4. Modelo de cáncer de mama con metástasis pulmonar ...………. 123 5.4.4.5. Modelo de cáncer de ovario con diseminación peritoneal …...... 123 5.4.4.6. Modelo de cáncer de pulmón con metástasis pulmonar ………. 123 5.4.4.7. Modelo de melanoma con metástasis pulmonar ……………...... 123 5.5. Dietas artificiales: preparación y composición ………………………………... 124 5.6. Análisis estadístico ………………………………………………………………... 131 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN: ……………………………………………………. 133 6.1. Capítulo I …………………………………………………………………………... 135 Artificial Diets Based on Selective Amino Acid Restriction versus Capecitabine in Mice with Colon Cancer ……………………………………………………………... 139 6.2. Capítulo II ………………………………………………………………………...... 164 Manipulation of Amino Acid Levels with Artificial Diets Induces a Marked Anticancer Activity in Mice with Renal Cell Carcinoma …………………………… 168 6.3. Capítulo III …………………………………………………………………………. 200 Artificial Diets with Selective Restriction of Amino Acids and Very Low Levels of Lipids Induce Anticancer Activity in Mice with Metastatic Triple-Negative breast Cancer ………………………………………………………………………………... 204 6.4. Capítulo IV …………………………………………………………………………. 245 Artificial Diets with Altered Levels of Sulfur Amino Acids Induces Anticancer Activity in Mice with Metastatic Colon Cancer, Renal Cell Carcinoma and Ovarian Cancer……………………………………………………………………………….... 248 6.5. Discusión general ………………………………………………………………...... 265 7. CONCLUSIONES / CONCLUSIONS ……………………………………………... 276 8. BIBLIOGRAFÍA ………………………………………………………………………. 283 9. ANEXOS ……………………………………………………………………………...... 312 9.1. Anexo I: Abreviaturas …………………………………………………………… 314 9.2. Anexo II: Producción científica ………………………………………………… 317 10. AGRADECIMIENTOS ………………………………………………………………. 320 5 6 2. RESUMEN / ABSTRACT 7 14 This dietary strategy was also evaluated in preclinical models of triple-negative breast cancer [13]. After confirming that amino acid restriction achieved anticancer selectivity in vitro against breast cancer cell lines, animal experiments were performed. To do so, an in vivo model of metastatic triple-negative breast cancer (4T1 cells intravenously inoculated) was used. The restriction of 10 non-essential amino acids in the diet moderately improved the survival of mice when lipid levels were normal. The reduction of lipid levels to 1% improved the anticancer response of artificial diets with amino acids manipulated levels. This non-pharmacologic treatment showed better anticancer activity than doxorubicin and capecitabine. Furthermore, the TB3 diet (restricted in 10 non-essential amino acids, with reduced levels of essential amino acids, and 1% lipids) not only improved survival in mice with triple negative breast cancer, but also in other types of metastatic cancers. These results confirm that manipulating amino acid and lipid levels in the diet has anticancer potential against metastatic cancers. Finally, it was confirmed that the TC5 diet, deficient in methionine and cysteine, which previously showed anticancer activity in colon and renal cancer models [11,12], was also active in a disseminated ovarian cancer model [14]. Methionine restriction is already known to achieve anticancer activity in vivo [6]. However, the role of cysteine and taurine (two amino acids synthesized from methionine) in the activity of methionine-restricted diets is poorly understood. Consequently, the in vivo anticancer activity of 6 methioninerestricted diets supplemented with cystine and/or taurine was evaluated. Diets B1 (6% casein, 2.5% leucine, 0.2% cystine) and B2B (6% casein, 5% glutamine, 2.5% leucine, 0.2% taurine) showed the highest anticancer activity against ovarian cancer. Additionally, both diets also showed activity against metastatic renal and colon cancer. In fact, the anticancer activity of diet B1 in metastatic colon cancer was comparable to that previously achieved by diet TC5. These results indicate that manipulating the levels of sulphur amino acids in the diet may be useful for the treatment of metastatic cancers. In conclusion, the results shown in this thesis in animal models of metastatic cancers indicate that it is possible to improve the efficacy of standard anticancer drugs simply by replacing the standard diet with an artificial diet in which the levels of amino acids and other nutrients are manipulated. Thanks to these promising results, a clinical trial with metastatic cancer patients has recently started. 15 16 3. INTRODUCCIÓN 17 18 3.1. ASPECTOS GENERALES DEL CÁNCER El cáncer es un conjunto de enfermedades que tienen un denominador común: una división celular descontrolada que pone en riesgo la vida del paciente [15]. Cuando una célula comienza a proliferar de forma descontrolada se acaba formando un tumor. Los tumores pueden ser de dos tipos: tumores benignos y tumores malignos. Los tumores benignos suelen crecer de forma poco agresiva y no se diseminan. Normalmente, un tumor benigno no compromete las funciones vitales de un paciente, salvo que este se encuentre en un órgano vital. En cambio, los tumores malignos crecen de forma más agresiva, invadiendo tejidos adyacentes y tienen la capacidad de diseminarse a órganos lejanos, a través de la sangre y la linfa. La metástasis es la diseminación de células cancerosas desde un tumor primario hasta órganos distantes, formando tumores metastásicos [16,17]. Por lo general, las células cancerosas de los tumores metastásicos tienen las mismas características que las del tumor primario original. Existen más de 100 tipos de cáncer, que suelen llevar el nombre del tejido u órgano en el que se ha originado [17]. De forma general, los distintos tipos de cáncer se clasifican en: • Carcinoma: cáncer originado en el tejido epitelial de la piel y órganos internos. A su vez hay varios subtipos de carcinoma, incluyendo el adenocarcinoma (originado en células glandulares), el carcinoma de células basales (originado en células de capa basal de la epidermis, la más profunda de la piel), el carcinoma de células escamosas (originado en las células epiteliales escamosas que revisten los órganos y tejidos), y el carcinoma de células de transición (originado en las células con capacidad de variar su tamaño y que recubren órganos internos). • Sarcoma: cáncer originado en el hueso y en los tejidos blandos como los músculos, grasa, vasos sanguíneos y linfáticos y tejido fibroso. • Leucemia: cáncer que originado en las células que dan lugar a las células sanguíneas. No forma tumores sólidos. Pueden ser agudas o crónicas según su evolución. A su vez pueden ser leucemias linfoblásticas (en las células linfoblásticas) o leucemias mieloides (originados en células mieloides). • Linfoma: cáncer que se origina en los linfocitos B y T. • Mieloma: cáncer originado en las células plasmáticas. • Melanoma: cáncer originado en los melanocitos. • Cánceres del encéfalo y médula espinal: cánceres originados en células del sistema nervioso. Todos los cánceres tienen en común que se originan por la transformación de una célula sana en una célula cancerosa. A este proceso se le llama carcinogénesis. A pesar de su elevada importancia, no hay un consenso científico definitivo sobre la carcinogénesis. La teoría más aceptada hoy en día es la teoría de las mutaciones somáticas. Esta teoría sostiene que la carcinogénesis se origina por la mutación de los oncogenes y los genes supresores de tumores [18]. Por un lado, la mutación de un protooncogén crea un oncogén que es capaz de activar la proliferación celular. Por otro lado, la mutación de un gen supresor de tumores inhibiría la muerte celular o la detención del ciclo celular. Por lo tanto, el cáncer se 19 originaría por la acumulación de mutaciones en oncogenes y genes supresores de tumores, que irían aumentando la proliferación celular [19]. Sin embargo, la teoría de la carcinogénesis de las mutaciones somáticas no consigue explicar aspectos muy importantes como la existencia de cánceres sin mutaciones [20], los agentes cancerígenos no mutagénicos [21–23], la diferente incidencia de cada tipo de cáncer, y la incidencia respecto a la edad de algunos tipos de cánceres [15,24]. Como alternativa, se ha propuesto la teoría de carcinogénesis por las divisiones de las células madres [15]. Esta teoría sostiene que la acumulación de divisiones en las células madre es el principal factor implicado en la carcinogénesis. Las divisiones celulares son esenciales para el correcto crecimiento, mantenimiento y funcionamiento de los tejidos. Pero cada vez que una célula se divide se pueden producir mutaciones y alteraciones en su ADN. Además, el ADN en división también es más vulnerable a la acción de carcinógenos mutagénicos. Una de las principales evidencias a favor de esta teoría es que el riesgo de cáncer en un tejido se correlaciona con el número de divisiones celulares que acumulan sus células madre [25–27]. Además, esta teoría explica de forma más satisfactoria los puntos flacos de la teoría de las mutaciones somáticas [15]. Además, la carcinogénesis puede ser facilitada por un gran número de factores tanto internos como externos. Los factores internos dependen de cada individuo, destacándose la predisposición genética. Un ejemplo típico son las mutaciones en genes de reparación del ADN, que si están presentes en la genética de un individuo se favorece la acumulación de mutaciones en el ADN que facilitarían la carcinogénesis. Por otro lado, también están los factores externos, los llamados carcinógenos. Los carcinógenos pueden ser físicos, como los rayos X; químicos, como el tabaco; y biológicos, como la bacteria Helicobacter pylori. Los carcinógenos por lo general son evitables y es fundamental minimizar su exposición para reducir todo lo posible el riesgo de cáncer. Independientemente de cómo se haya producido la carcinogénesis, las células cancerosas tienen una serie de características diferenciales respecto a las células normales. Estas diferencias a menudo han sido llamadas como “las huellas del cáncer” [28–30], y tienen una importante influencia en el desarrollo de la enfermedad y la sensibilidad a los tratamientos anticancerosos. Estas características no siempre aparecen, pero son muy frecuentes entre los distintos tipos de cáncer. A continuación, se enumeran las características más frecuentes de las células cancerosas que las diferencian de las células normales (Figura 1) [28–30]: 1. Proliferación independiente de factores de crecimiento Las células normales pueden activar o inactivar su proliferación gracias a los factores de crecimiento. En cambio, las células cancerosas proliferan en ausencia de factores de crecimiento porque son capaces de activar estas señales de forma autónoma. Se sabe que muchos oncogenes activan las vías de señalización de los factores de crecimiento. Además, las células cancerosas también pueden sobreexpresar los receptores de los factores de crecimiento, por lo que tienen mayor sensibilidad a las señales proliferativas de estos factores. 20 2. Evasión de las señales antiproliferativas Las células normales pueden recibir señales externas que inhiben su proliferación celular, entrando en quiescencia. Sin embargo, las células cancerosas pueden tener una menor expresión de los receptores para estas señales antiproliferativas o tener receptores disfuncionales, por lo que pueden multiplicarse de forma descontrolada. 3. Resistencia a la apoptosis La apoptosis es un mecanismo celular que se encarga de matar a una célula cuando esta está dañada. Las células cancerosas a menudo tienen un ADN muy dañado que sería suficiente para activar la apoptosis. Sin embargo, las células cancerosas son capaces de evadir la apoptosis por tener mutados los genes implicados en este mecanismo celular. El ejemplo más típico es la mutación del gen p53. El gen p53 es un gen supresor de tumores que entre otras funciones tiene la de activar la apoptosis. Este gen está mutado o ausente en el 50% de los cánceres humanos [31]. 4. Activación de la angiogénesis La angiogénesis es un proceso que permite la formación de nuevos vasos sanguíneos, siendo esencial en el crecimiento de tejidos y en la cicatrización de heridas. Sin embargo, el cáncer también puede usarlo a su favor, permitiendo la formación de nuevos vasos sanguíneos que aporten nutrientes y oxígeno, así como eliminar desechos, asegurando así la supervivencia y crecimiento de las células cancerosas dentro de los tumores. 5. Capacidad de proliferación ilimitada Las células normales tienen un número limitado de divisiones celulares posibles. Esto se debe a que en cada división celular se acortan los extremos de los cromosomas, los llamados telómeros. Cuando ya se han acumulado muchas divisiones celulares se pierden los telómeros, y las células normales entran en senescencia por no poder continuar dividiéndose. Sin embargo, las células cancerosas expresan la enzima telomerasa, la cual es capaz de mantener la integridad de los telómeros. Por lo tanto, las células cancerosas son capaces de conservar sus telómeros y proliferar de forma ilimitada. 6. Capacidad invasiva y metastásica Cuando las células cancerosas se originan y crecen en un tejido, se comienza a formar el llamado tumor primario. Sin embargo, las células cancerosas son capaces de expandirse a los tejidos anexos, en lo que se conoce como capacidad invasiva. Además, también pueden tener capacidad metastásica. La metástasis se produce cuando las células cancerosas de un tumor primario migran a través del torrente sanguíneo y la linfa, formando tumores metastásicos en cualquier parte del organismo. Se estima que el 90% de las defunciones por cáncer son causadas directamente por las metástasis [16]. 21 7. Evasión de la respuesta inmune El sistema inmune tiene los mecanismos celulares para rastrear y eliminar células cancerosas. Sin embargo, las células cancerosas son capaces de evadir la respuesta anticancerosa del sistema inmune. La evasión del sistema inmune puede conseguirse evitando que se reconozcan como extraños los antígenos del cáncer o generando un microambiente tumoral inmunosupresor. La reactivación de del sistema inmune es el mecanismo de acción de las inmunoterapias. 8. Inflamación tumoral Se cree que esto se debe a que el sistema inmune intenta atacar sin éxito a las células cancerosas, infiltrándose gran cantidad de células inmunes en los tumores. Esto causa la inflamación asociada a los tumores que, además de empeorar los síntomas de los pacientes, contribuye a la progresión de la enfermedad. 9. Mutaciones e inestabilidad genómica Las células cancerosas adquieren gran cantidad de alteraciones en su genoma, pasando desde alteraciones epigenéticas, mutaciones puntuales, deleción/duplicación de genes, y llegando incluso a alterar la estructura y número de cromosomas. Esto se debe fundamentalmente a la gran cantidad de divisiones celulares que acumulan las células cancerosas, y también a las alteraciones en genes implicados en la reparación del ADN. 10. Alteración del metabolismo celular Las células cancerosas, para mantener su elevado ritmo proliferativo y supervivencia, reprograman su metabolismo celular [3,4]. Por ejemplo, las células normales obtienen la mayor parte de su energía con la fosforilación oxidativa. En cambio, las células cancerosas obtienen su energía principalmente mediante la glicólisis, incluso en presencia de oxígeno a pesar de ser menos eficiente para obtener ATP. Esta particularidad metabólica es llamada glicólisis aeróbica o “efecto Warburg” [32]. Además, las células cancerosas también tienen alteraciones en el metabolismo de lípidos y aminoácidos (AAs). También muestran una mayor síntesis de ácidos nucleicos y un mayor estrés oxidativo. Debido a las alteraciones en el metabolismo de AAs [5–7], las células cancerosas con frecuencia no son capaces de sintetizar algunos AAs no esenciales de forma endógena, por lo que dependen del aporte exógeno de algunos de estos AAs no esenciales. El metabolismo del cáncer y en especial el metabolismo de AAs serán explicados en profundidad más adelante. 22 Figura 1. Características diferenciales de las células cancerosas. Figura adaptada del artículo “Hallmarks of Cancer: New Dimensions” [28]. El cáncer es una enfermedad grave, pero no todos los cánceres causan la muerte. En el Reino Unido, se estima que el 50% de los pacientes diagnosticados con cáncer siguen con vida 10 años después del diagnóstico [33]. La supervivencia de los pacientes con cáncer está mejorando en los últimos años, y es especialmente alta cuando el cáncer está en fases poco avanzadas. Sin embargo, cuando el cáncer invade un órgano vital, la vida del paciente sí que pasa a estar en riesgo. A continuación, se comentan algunas de las posibles causas por las que el cáncer puede provocar la muerte de un paciente, las cuales dependen fundamentalmente de la localización de los tumores [33]: • Aparato digestivo: El tumor puede bloquear el tubo digestivo, impidiendo la correcta nutrición e hidratación, comprometiendo la vida del paciente. Además, la desnutrición hace a los pacientes más vulnerables frente a infecciones. • Pulmones: El tumor puede bloquear el flujo de aire en los pulmones, limitando la respiración. Además, estos pacientes son mucho más vulnerables a infecciones de las vías respiratorias. • Huesos: Las células cancerosas en los huesos pueden liberar grandes cantidades de calcio al torrente sanguíneo. Niveles de calcio altos en sangre pueden provocar fallos potencialmente letales en el sistema nervioso y cardiaco. • Médula ósea: Las células cancerosas pueden impedir la formación de glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas en la médula ósea. Por lo que se puede producir el fallecimiento por anemia, inmunosupresión o hemorragias. • Hígado: El hígado se encarga de mantener el metabolismo y detoxificar compuestos. Un tumor en el hígado puede impedir la correcta función de este órgano y poner en riesgo la vida del paciente. • Vasos sanguíneos: El cáncer puede crecer bloqueando o dañando vasos sanguíneos, lo que puede causar hemorragias o coágulos, los cuales serían especialmente graves si afectan al cerebro. ALTERACIÓN DEL METABOLISMO CELULAR PROLIFERACIÓN INDEPENDIENTE DE FACTORES DE CRECIMIENTO EVASIÓN DE LAS SEÑALES ANTIPROLIFERATIVAS EVASIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE CAPACIDAD DE PROLIFERACIÓN ILIMITADA RESISTENCIA A LA APOPTOSIS INESTABILIDAD Y MUTACIÓN DEL GENOMA ACTIVACIÓN DE LA ANGIOGÉNESIS INFLAMACIÓN TUMORAL CAPACIDAD INVASIVA Y METASTÁSICA 23 3.2. INCIDENCIA Y MORTALIDAD DEL CÁNCER El cáncer es uno de los principales problemas de salud a nivel mundial. Tal como se ha comentado antes, la carcinogénesis es un proceso que puede durar años. Por esa razón, el cáncer suele ser una enfermedad asociada a la edad, siendo más frecuente en personas adultas y ancianas que en personas jóvenes. Este hecho, unido al envejecimiento de la población, es la causa por la que la incidencia del cáncer está aumentando a nivel mundial [34]. Según el informe “Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN” se estima que en todo el mundo se diagnosticaron 19,3 millones de nuevos casos de cáncer y casi 10 millones de personas fallecieron por cáncer durante el año 2020 [34]. Cabe destacar que el cáncer es la principal causa de muerte en las personas menores de 70 años en los países desarrollados, por lo que es la principal causa de muerte prematura en estos países [34]. En España los datos son similares a los de otros países desarrollados. Durante el año 2021 se diagnosticaron casi 280.000 casos de cáncer, de los cuales 160.000 fueron en hombres y 120.000 en mujeres [35]. Por un lado, en hombres los tres cánceres más frecuentes fueron el cáncer de próstata, el cáncer colorrectal y el cáncer de pulmón. Por otro lado, en mujeres los cánceres más frecuentes fueron el cáncer de mama, el cáncer colorrectal y el cáncer de pulmón [35]. Los datos de incidencia de cáncer se detallan en la Tabla 1. Tipo de cáncer Incidencia hombres Incidencia mujeres Número % Número % Cavidad oral y faringe 5.725 3,6 2.463 2,1 Cérvix uterino - - 1.942 1,7 Colorrectal 25.678 16,2 17.903 15,3 Cuerpo uterino - - 6.923 5,9 Encéfalo y sistema nervioso 2.306 1,5 2.089 1,8 Esófago 1.895 1,2 473 0,4 Estómago 4.506 2,8 2.807 2,4 Hígado 5.039 3,2 1.551 1,3 Laringe 2.710 1,7 399 0,3 Leucemias 3.491 2,2 2.577 2,2 Linfoma de Hodgkin 866 0,5 661 0,6 Linfomas no Hodgkin 4.897 3,1 4.158 3,5 Mama - - 33.375 28,4 Melanoma de piel 2.430 1,5 3.678 3,1 Mieloma 1.849 1,2 1.316 1,1 Ovario - - 3.659 3,1 Páncreas 4.571 2,9 4.126 3,5 Próstata 35.764 22,5 - - Pulmón 21.578 13,6 7.971 6,8 Riñón 5.003 3,1 2.177 1,9 Testículo 1.329 0,8 - - Tiroides 1.154 0,7 4.277 3,6 Vejiga urinaria 16.578 10,4 4.035 3,4 Vesícula biliar 1.533 1,0 1.475 1,3 Otros 9.966 6,3 7.337 6,3 Todos excepto piel no melanoma 158.867 100,0 117.372 100,0 30 3.3.5. Inconvenientes de las terapias dirigidas e inmunoterapias Las terapias dirigidas y las inmunoterapias han supuesto una auténtica revolución en la forma de tratar muchos cánceres. Dos de los mejores ejemplos son el tratamiento del melanoma y del cáncer renal, dos cánceres que eran especialmente resistentes a las quimioterapias convencionales. La supervivencia a los 5 años de los pacientes con cáncer de renal metastásico pasó de ser un 7% en 2005 a un 24% en 2017 [41]. La supervivencia a los 5 años de los pacientes con melanoma metastásico pasó de ser un 15% en 2004 a un 30% en 2017 [1]. Sin embargo, estos tratamientos también presentan importantes inconvenientes que deben ser mencionados. En primer lugar, las terapias dirigidas y las inmunoterapias, a pesar de haber sido diseñadas contra alteraciones específicas de las células cancerosas, no están exentas de reacciones adversas. Por ejemplo, los inhibidores de la angiogénesis pueden presentar trastornos relacionados con la circulación sanguínea como hipertensión, trombosis venosa, hemorragias y problemas de cicatrización [42]. Los inhibidores de los receptores de factores de crecimiento también tienen reacciones adversas importantes a nivel dermatológico, intestinal y hepático [43]. Las inmunoterapias también pueden causar efectos adversos graves de tipo autoinmunitario como son colitis, artritis o hepatitis [44]. En general, estos nuevos fármacos son más seguros que las tradicionales quimioterapias, pero sus efectos adversos son en muchos casos limitantes y obligan a suspender el tratamiento o liminar las dosis en muchos pacientes. Además, las terapias dirigidas y las inmunoterapias no siempre son eficaces y normalmente terminan en fracaso terapéutico. Las terapias dirigidas tienen como diana terapéutica pequeños cambios en las células cancerosas. Esto tiene algunos importantes inconvenientes. Por un lado, no todos los pacientes oncológicos tienen un cáncer con la característica a la que van dirigidos estos fármacos. Por ejemplo, el fármaco trastuzumab, un anticuerpo dirigido contra la proteína HER2, se utiliza en el tratamiento del cáncer de mama HER2+, por lo que sólo es eficaz en el 15-20% de los pacientes que tienen cáncer de mama que expresan esa proteína. Además, debido a la plasticidad y heterogeneidad interna de las células cancerosas, en la mayoría de los casos, se acaba desarrollando resistencia al tratamiento, que lleva a su vez al fracaso terapéutico [45]. En cuanto a las inmunoterapias, la mayoría de cánceres aún no son sensibles a las inmunoterapias, presentando tasas de respuesta muy bajas en algunos tumores muy frecuentes (por ejemplo el cáncer de mama, próstata y páncreas) [46,47]. Además, dentro de cánceres que mejor responden a las inmunoterapias, como el melanoma, algunos pacientes responden bien, pero la mayoría no obtienen respuesta anticancerosa [46]. En definitiva, es necesario desarrollar mejores tratamientos anticancerosos, que tengan una alta respuesta anticancerosa y efectos adversos tolerables para los pacientes. 3.3.6. Necesidad de mejores tratamientos anticancerosos Cuando el cáncer se encuentra localizado, la cirugía y radioterapia tienen una alta eficacia eliminando todas las células cancerosas del paciente. Sin embargo, cuando el cáncer se ha 31 diseminado, la farmacoterapia pasa a ser la principal forma de tratamiento. Los fármacos disponibles consiguen prolongar la vida de los pacientes, reduciendo el avance del cáncer y paliando los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, llegados a este punto, los tratamientos disponibles son insuficientes para controlar la enfermedad en la gran mayoría de los pacientes, lo cual se traduce en las bajas tasas de supervivencia de estos pacientes [2]. La supervivencia a los 5 años de los pacientes con metástasis es 6% en cáncer de pulmón, 15% en cáncer colorrectal, 3% en cáncer de páncreas, 29% en cáncer de mama, 31% en cáncer de próstata, 30% en cáncer de ovario, 14% en cáncer renal, 30% en melanoma, 5% en cáncer de esófago, 3% en cáncer de hígado, y 6% en cáncer de vejiga [1]. Para desarrollar nuevos tratamientos anticancerosos eficaces en primer lugar hay que entender en que fallan los tratamientos disponibles. Una de las principales razones por las que fallan los tratamientos anticancerosos es por su limitada selectividad contra las células cancerosas [48]. Las dosis necesarias para eliminar todas las células cancerosas de los fármacos quimioterápicos e incluso muchas de las nuevas terapias dirigidas son tan altas que resultarían letales para el paciente. Por lo tanto, los pacientes reciben la dosis máxima tolerada de los fármacos, que no serían suficientes para eliminar a todas las células cancerosas [2]. Además, otras posibles explicaciones del fracaso terapéutico son el desarrollo de resistencias al tratamiento y la elevada heterogeneidad de las células cancerosas [45,49]. En definitiva, para conseguir tratamientos anticancerosos eficaces es importante encontrar dianas terapéuticas que sean selectivas contra un amplio espectro de células cancerosas [2]. Las alteraciones metabólicas de las células cancerosas son una potencial diana para desarrollar tratamientos anticancerosos selectivos. Las alteraciones en el metabolismo son necesarias para la carcinogénesis, proliferación y supervivencia del cáncer, por lo que están ampliamente extendidas entre las células cancerosas [3]. En los últimos años, se han comenzado a desarrollar una gran variedad de tratamientos anticancerosos dirigidos contra el metabolismo del cáncer [3,6,50]. En esta tesis, se estudia una estrategia anticancerosa que consiste en dietas artificiales basadas en restricciones selectivas de AAs. Estas dietas están restringidas en varios AAs y van dirigidas contra las alteraciones en el metabolismo de AAs presentes en las células cancerosas. 3.4. METABOLISMO DEL CÁNCER Una de las “huellas del cáncer” son las alteraciones metabólicas de las células cancerosas [30], también denominadas “reprogramación metabólica” de las células cancerosas. La reprogramación metabólica es de elevada importancia para el cáncer, debido a que contribuye a la carcinogénesis y a la progresión de la enfermedad [4]. Las células cancerosas modifican sus procesos metabólicos para cubrir sus altas demandas energéticas, producir más biomasa y combatir el estrés oxidativo, lo que les permite mantener su elevada proliferación y supervivencia [3]. 32 Las alteraciones metabólicas de las células cancerosas son muy variadas. Se destacan las alteraciones en el metabolismo de la glucosa [32,51], la elevada la síntesis de nucleótidos [52], el aumento del estrés oxidativo [53,54], los cambios en el metabolismo de lípidos [55] y las alteraciones en el metabolismo de AAs [6,56]. Desde hace décadas, se utilizan en pacientes fármacos anticancerosos que tienen como diana las alteraciones en el metabolismo de las células cancerosas [57], como por ejemplo el metotrexato, el 5- fluorouracilo (5-FU) o la L-asparaginasa. Además, en las últimas dos décadas, se ha profundizado en el conocimiento del metabolismo del cáncer, lo cual está siendo empleado para desarrollar nuevos tratamientos anticancerosos que han mostrado actividad anticancerosa en modelos preclínicos, y que están siendo evaluados en ensayos clínicos [57]. A continuación, se explican las principales alteraciones metabólicas del cáncer y sus utilidades terapéuticas. 3.4.1. Metabolismo energético y de la glucosa en cáncer A mediados del siglo XX, el premio Nobel de Medicina Otto Warburg descubrió la primera de las alteraciones metabólicas del cáncer. Observó que las células cancerosas, a diferencia de las células normales, consumían una gran cantidad de glucosa, alrededor de 10-100 veces más de lo normal, y generaban lactato en presencia de oxígeno [58]. A este fenómeno se le llamó glicólisis aeróbica o “efecto Warburg”. La forma de obtener energía de las células cancerosas y las células sanas es diferente (Figura 5). Las células sanas obtienen energía de la glucosa de dos formas según la cantidad de oxígeno que tengan disponible [32,59]. En presencia de oxígeno, las células sanas metabolizan la glucosa hasta piruvato en la glicólisis, el piruvato se oxida por completo en el ciclo de Krebs y, realizando la fosforilación oxidativa, se obtienen 36 unidades de ATP por cada molécula de glucosa. Cuando las células sanas no tienen suficiente oxígeno, no se puede llevar a cabo la fosforilación oxidativa, por lo que el piruvato obtenido de la glicólisis se transforma a lactato, obteniendo sólo 2 unidades de ATP por cada glucosa, en un proceso llamado glicólisis anaeróbica. Por el contrario, las células cancerosas realizan la glicólisis aeróbica, que consiste en la metabolización de la glucosa hasta piruvato y posteriormente, independientemente de la cantidad de oxígeno, la mayor parte del piruvato se transforma a lactato. Muy poco piruvato entra en el ciclo de Krebs de las células cancerosas, por lo que en conjunto las células cancerosas obtienen ATP de la glucosa de una forma mucho menos eficiente que las células no cancerosas [32,59]. 33 Figura 5. Representación esquemática del efecto Warburg. Por un lado, las células normales realizan la fosforilación oxidativa en presencia de oxígeno, y la glicólisis anaeróbica en ausencia de oxígeno. Por otro lado, las células cancerosas realizan la glicólisis aeróbica (efecto Warburg) indistintamente de la presencia o ausencia de oxígeno. Fuente original: “Understanding the Warburg effect: The metabolic requirements of cell proliferation” [59]. El efecto Warburg se ha observado tanto en células cancerosas humanas como murinas [3]. También se ha observado que algunas células no cancerosas con alta proliferación llevan a cabo el efecto Warburg [59], como es el caso de los linfocitos en proliferación. La principal ventaja que obtienen las células cancerosas con el efecto Warburg es que los metabolitos intermedios de la glicólisis se utilizan como precursores de nucleótidos, lípidos y algunos AAs, que serán los ladrillos para la síntesis de macromoléculas necesarias para la proliferación celular [4,59,60]. La activación del efecto Warburg en las células cancerosas podría desencadenarse por un aumento del estrés oxidativo, que limitaría el oxígeno disponible para realizar la fosforilación oxidativa [60]. Además, los oncogenes y genes supresores de tumores también pueden “encender” el efecto Warburg [3]. La activación del oncogén MYC, presente en la mayoría de los tumores, aumenta la expresión de la enzima lactato deshidrogenasa. La mutación en el gen p53 también activa el efecto Warburg en las células cancerosas [32]. Asimismo, las proteínas AKT, mTOR y los factores inducibles de hipoxia, que están desregulados en muchos cánceres, también pueden activar la glicólisis y aumentar la captación de glucosa [3]. Una importante utilidad clínica del efecto Warburg es su uso en la detección del cáncer. Dado que las células cancerosas captan mucha más glucosa que las células normales, al administrar 18-fluorodesoxiglucosa, un análogo de la glucosa, este compuesto se acumula en las células cancerosas. Esta molécula es radiactiva y se puede detectar mediante la tomografía por emisión de positrones (PET), una técnica de imagen que permite detectar con precisión el tamaño y localización de los tumores [59]. En cuanto al tratamiento, se han 34 evaluado varios inhibidores de la glicólisis, como la 2-desoxiglucosa. Sin embargo, hasta el momento, el éxito de estos fármacos en modelos preclínicos y en ensayos clínicos ha sido limitado, presentando importantes efectos adversos [57,61]. El ciclo de Krebs también es relevante en las células cancerosas. El oncogén MYC, que activa el efecto Warburg, también activa la glutaminolisis [62], que transforma el AA glutamina (Gln) hasta α-cetoglutarato, por lo que la Gln pasa a ser la principal fuente de carbonos que permite la perpetuación del ciclo de Krebs. Sin embargo, las células cancerosas, en lugar de usar el ciclo de Krebs para obtener NADH para la fosforilación oxidativa, utilizan los metabolitos intermedios del ciclo de Krebs como precursores de otras biomoléculas [3]. Por ejemplo, a partir del oxalacetato las células cancerosas obtienen el AA aspartato (Asp) [63–65], que usarán tanto para la síntesis proteica como para la síntesis de nucleótidos. Por lo tanto, las células cancerosas usan el ciclo de Krebs principalmente con fines biosintéticos (en lugar de usarla con fines energéticos). En los últimos años se han estudiado diversas estrategias dietéticas dirigidas al metabolismo de la glucosa en las células cancerosas. Por ejemplo, la fructosa es un monosacárido que también es metabolizado en la glicólisis, pero lo hace sin ser regulada por la insulina. Se observó en ratones con cáncer que una dieta suplementada en fructosa incrementaba la glicólisis, la síntesis de ácidos grasos y aceleraba el crecimiento tumoral [66]. Por el contrario, la manosa es otro monosacárido que compite con la glucosa en su captación y, una vez dentro de la célula, reduce la actividad glicolítica. Se observó que la suplementación con manosa reducía el crecimiento tumoral en ratones con cáncer y mejoraba la actividad anticancerosa de fármacos quimioterápicos [67]. Otra estrategia que ha sido bastante estudiada en los últimos años son las dietas cetogénicas [6,68]. Las dietas cetogénicas son un tipo de dietas en las que el porcentaje de carbohidratos es mucho menor que el de una dieta estándar, teniendo a su vez un contenido muy alto de lípidos y proteínas. Con esta dieta el organismo no puede mantener unos niveles adecuados de glucosa en sangre, por lo que el hígado fabrica y libera los cuerpos cetónicos que serán empleados como fuente de energía para el organismo [6]. Las dietas cetogénicas probablemente inducen un ambiente metabólico desfavorable para algunos tipos de células cancerosas [68]. Estudios preclínicos y algunos clínicos indican que estas dietas pueden mejorar la actividad anticancerosa de fármacos anticancerosos y de la radioterapia [6,68], aunque más estudios clínicos son necesarios para confirmar su utilidad como tratamiento adyuvante en pacientes [68]. Por último, también se ha estudiado la restricción calórica y el ayuno intermitente en el tratamiento del cáncer. Estas dos estrategias dietéticas inducen una bajada en los niveles de insulina, glucosa e IGF-1, lo cual podría inducir respuesta anticancerosa [69–71]. Además, las células normales, ante situaciones de ayuno o restricción calórica, activan mecanismos de defensa como la detención del ciclo celular y la autofagia [69], lo cual podría proteger a las células normales de los efectos adversos de las quimioterapias. La restricción calórica en combinación con tratamientos anticancerosos ha demostrado ser segura en un ensayo clínico en fase I en pacientes oncológicos [72]. 35 3.4.2. Síntesis de nucleótidos de las células cancerosas Las células cancerosas incrementan la síntesis de nucleótidos necesarios para la replicación del ADN y, de esta manera, sostener el ritmo proliferativo de las células cancerosas [57]. Esto ha dado lugar a algunos fármacos anticancerosos muy empleados en terapéutica. En 1947, Sidney Faber observó que el ácido fólico aceleraba la progresión de la leucemia infantil. En respuesta a ello, y en colaboración con el químico Yellapragada Subbarow, desarrolló el antifolato aminopterina, el cual resultó ser un éxito al inducir la remisión de la leucemia linfocítica aguda en niños [73]. La aminopterina fue el primer fármaco eficaz contra el cáncer y, gracias a este descubrimiento, Faber es considerado como el padre de la quimioterapia [8]. Posteriormente, a partir de la aminopterina se desarrollaron dos fármacos ampliamente utilizados contra muchos cánceres: el metotrexato y el pemetrexed [57]. Estos fármacos actúan como análogos del ácido fólico, inhibiendo la enzima dihidrofolato reductasa, interrumpiendo así el ciclo del folato. El ciclo del folato forma parte del metabolismo del carbono y es imprescindible para la síntesis de nucleótidos. Los fármacos 6-tioguanina y 6-mercaptopurina inhiben la síntesis de novo de purinas, siendo empleadas en el tratamiento de muchas leucemias infantiles. Otros fármacos estrella que van dirigidos a la síntesis de nucleótidos son el 5-FU y su profármaco capecitabina, los cuales inhiben la timidilato sintasa, bloqueando la síntesis de timidina [57]. El 5-FU y la capecitabina se emplean en muchos cánceres, incluyendo el cáncer colorrectal, el cáncer hepático y el cáncer de mama. El mayor inconveniente de este grupo de fármacos es que muchas células no cancerosas, incluyendo las células de la médula ósea, los enterocitos intestinales o las células de los folículos pilosos, también tienen una elevada proliferación y tienen una alta síntesis de nucleótidos [57]. Por lo tanto, estos fármacos tienen importantes efectos adversos (supresión de la médula ósea y toxicidad intestinal) que limitan la dosis del fármaco [57]. Es decir, estos fármacos tienen una limitada selectividad anticancerosa. En los últimos años, se están diseñado nuevos fármacos contra esta diana terapéutica con una mayor selectividad anticancerosa. Por ejemplo, en el ciclo del ácido fólico y en el metabolismo del carbono hay unas enzimas que las células cancerosas suelen sobreexpresar, como las enzimas SHMT2 y MTHFD1/2 [74–76]. Inhibidores de estas enzimas están en desarrollo, mostrando resultados prometedores en modelos preclínicos [77–79]. Por último, varios AAs participan de forma directa en el metabolismo del carbono y en la síntesis de nucleótidos, como son la serina, la glicina y el aspartato. Las funciones y el potencial terapéutico de estos AAs serán explicados detalladamente más adelante. 3.4.3. Estrés oxidativo en las células cancerosas Los radicales libres son moléculas que tienen un electrón desapareado, siendo moléculas muy inestables y que reaccionan con extrema facilidad con otras moléculas de su entorno para estabilizarse. En el organismo también se producen radicales libres, incluyendo especies reactivas de oxígeno (EROs) y especies reactivas de nitrógeno. Los EROs más importantes en el organismo son el radical superóxido (O2.−), el radical hidroxilo (HO.) y el peróxido de hidrógeno (H2O2) [53]. 36 Las EROs pueden formarse en las células por fuentes exógenas o endógenas. Como fuentes exógenas de EROs encontramos la radiación, el humo del tabaco, o la contaminación ambiental. Las fuentes endógenas de EROs derivan del metabolismo celular, incluyendo los procesos que se dan en las mitocondrias, en los peroxisomas y en el retículo endoplásmico [54]. Las mitocondrias son la principal fuente de EROs, debido a que en la fosforilación oxidativa aproximadamente el 2% del oxígeno se transforma en el radical superóxido [54]. Las EROs son beneficiosas o negativas para las células según las condiciones [54]. Por un lado, son beneficiosas para las células porque participan en la proliferación y diferenciación celular, así como en la activación de mecanismos de respuesta al estrés celular [54]. Esto es así debido a que las EROs interactúan directa o indirectamente con las proteínas de vías de señalización y con algunas enzimas que regulan estos procesos. Además, las células inflamatorias también producen EROs para eliminar agentes patógenos como bacterias y virus. Pero, por otro lado, las EROs en altas cantidades también son negativas para las células. En altas concentraciones, las EROs producen daños en el ADN, alteraciones en la membrana mitocondrial, peroxidación lipídica, y daño estructural y funcional de las proteínas [80]. El desbalance del estrés oxidativo participa en muchas enfermedades, incluyendo la aterosclerosis, la inflamación, el envejecimiento y el cáncer. Por lo tanto, las células deben tener mecanismos de defensa antioxidante que les permitan mantener un balance en el nivel de EROs. Las células tienen varios mecanismos de defensa antioxidante, incluyendo sistemas enzimáticos y procesos no enzimáticos [54]. Los sistemas enzimáticos antioxidantes más importantes son las enzimas superóxido dismutasa (SOD; encargadas de eliminar el radical superóxido), la catalasa (encargada de eliminar el peróxido de hidrógeno) y las peroxidasas (encargadas de eliminar el peróxido de hidrógeno con el glutatión). Por otra parte, algunos de los antioxidantes no enzimáticos más importantes son el glutatión (GSH), las tiorredoxinas, la vitamina C (ácido ascórbico) y la vitamina E (α-tocoferol). El GSH es el más relevante de los antioxidantes no enzimáticos. El GSH es un tripéptido (formado por glutamato, cisteína y glicina) que se sintetiza en el citoplasma y se encarga de inactivar directamente con su grupo tiol los radicales libres, y también actúa como cofactor de las peroxidasas [54]. Si las células pierden estas defensas antioxidantes, y se descontrola el estrés oxidativo, se produciría daño en las macromoléculas de la célula y por consiguiente se desencadenaría la muerte celular. Las células cancerosas, en comparación con las células normales, tienen unos niveles de EROs muy altos y, de forma compensatoria, también tienen mayor defensa antioxidante [54]. Se cree que durante la carcinogénesis se produce un aumento de las EROs, lo cual aumenta la proliferación y acelera la transformación de las células cancerosas. Las alteraciones genéticas y metabólicas que se producen durante la carcinogénesis aumentan la formación de EROs, lo cual a su vez genera más alteraciones en el ADN y produce un metabolismo disfuncional [60]. Fruto de esta retroalimentación se refuerza el desarrollo del cáncer. Entre las alteraciones del ADN que aumentan la formación de EROs en las células 37 tumorales se destacan la activación del oncogén MYC [81] y la pérdida del gen p53 [82], dos de las alteraciones más frecuentes en las células cancerosas. Además, el aumento de EROs proporciona ventajas a las células cancerosas aumentando la proliferación celular, la angiogénesis, la invasión y la metástasis [54]. Para que este excesivo nivel de EROs no sea letal, las células cancerosas aumentan los sistemas de defensa antioxidante, incluyendo mayores niveles de la enzima antioxidante SOD y del tripéptido GSH, así como la reprogramación su metabolismo celular para poder hacer frente al alto estrés oxidativo [54]. Sin esta defensa antioxidante se produciría la muerte de la célula cancerosa. El estrés oxidativo es un “arma de doble filo” que puede ser aprovechado a nuestro favor según la situación. Por un lado, el uso de antioxidantes puede ser usado para prevenir la carcinogénesis, puesto que el aumento del estrés oxidativo parece estar detrás de los primeros pasos del desarrollo del cáncer [53]. Evitar los agentes externos que aumentan el estrés oxidativo, como la radiación o el tabaco, es una estrategia clave para reducir el riesgo de cáncer. Por otro lado, una vez el cáncer se ha desarrollado, los tratamientos prooxidantes podrían ser útiles para dañar y eliminar selectivamente a las células cancerosas. Se ha visto que el uso de antioxidantes acelera el cáncer en estadios avanzados [53,83]. Tal como he comentado previamente, las células cancerosas tienen un alto estrés oxidativo, con altas concentraciones de EROs y, de forma compensatoria, mayores niveles de defensas antioxidantes. Por lo tanto, las células cancerosas son más sensibles a los tratamientos prooxidantes, ya sea con tratamientos que aumentan los niveles de EROs o tratamientos que bloquean los mecanismos antioxidantes [84]. Las células normales, con sus menores niveles de EROs, son menos sensibles a los tratamientos prooxidantes [84]. Esto explicaría su selectividad anticancerosa. Varios fármacos anticancerosos utilizados en clínica presentan cierta actividad prooxidante. Por ejemplo, los taxanos (paclitaxel, docetaxel), los alcaloides de la vinca (vinblastina, vinorelbina) y los antimetabolitos (5-FU, fludarabina) promueven la liberación de citocromo C de la mitocondria, produciendo radicales libres y causando la muerte celular [80,85]. Los altos niveles de defensas antioxidantes de las células cancerosas también pueden interferir con la eficacia de los tratamientos anticancerosos. Por ejemplo, el aumento de los niveles de GSH confieren resistencia a los complejos de platino, antraciclinas y agentes alquilantes [54]. También hay bastantes fármacos prooxidantes que están siendo evaluados en cáncer [53,54]. Por ejemplo, la auranofina (inhibidor de las tioredoxinas), la butionina sulfoximina (inhibidor de la síntesis de GSH), el trióxido de arsénico (prooxidante), la erastina (inhibidor de la GPX4), el ascorbato a altas dosis (prooxidante), entre otros [53]. Por último, algunos AAs son especialmente relevantes en la defensa antioxidante, destacándose la cisteína (Cys), que es el nutriente limitante en la síntesis de GSH. Más adelante se explicará en detalle la importancia de la Cys en la defensa antioxidante y los tratamientos farmacológicos y dietéticos que se están evaluando con la Cys como diana. 38 3.4.4. Metabolismo de lípidos en cáncer El metabolismo alterado de lípidos es una de las alteraciones metabólicas más destacables de las células cancerosas [55]. Los lípidos son un grupo muy heterogéneo de compuestos, los cuales tienen en común su naturaleza hidrofóbica. Son esenciales para todas las células debido a su función estructural en las membranas celulares. También son una importante fuente de energía. Además, a partir de algunos lípidos se sintetizan moléculas mensajeras. Las células cancerosas muestran una elevada captación exógena de ácidos grasos, que les permite mantener el rápido ritmo proliferativo, así como proporcionar energía en condiciones de estrés metabólico [86]. Muchas células cancerosas expresan altos niveles de CD36, también conocido como translocasa de ácidos grasos. Esta proteína permite la captación de ácidos grasos exógenos, y su sobreexpresión se correlaciona con una peor evolución de la enfermedad en varios tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, ovario, estómago y próstata [87,88]. También se ha observado que las células cancerosas de algunos tipos de cáncer, como el cáncer renal, estómago, mama y colon, crecen preferiblemente en tejidos con muchos adipocitos [89]. La captación de ácidos grasos permite proliferar a las células cancerosas, especialmente en condiciones de hipoxia, donde la síntesis de ácidos grasos y la conversión de los ácidos grasos saturados en monoinsaturados está limitada [86]. Por otro lado, la lipogénesis es el proceso de síntesis de ácidos grasos a partir de carbohidratos o AAs. En los tejidos sanos, la lipogénesis principalmente se realiza en los hepatocitos, adipocitos, células del sistema nervioso y en las glándulas mamarias. Sin embargo, algunas células cancerosas también activan la lipogénesis incluso en presencia de fuentes exógenas de lípidos [86]. Las enzimas más importantes en la síntesis de ácidos grasos en las células cancerosas son la enzima ácido graso sintasa (FASN), que sintetiza el ácido palmítico, y la estearil-coenzima A desaturasa (SCD), que se encarga de crear ácidos grasos monoinsaturados a partir de ácidos grasos saturados. Se está evaluando la actividad anticancerosa de fármacos inhibidores de la síntesis de ácidos grasos, incluyendo inhibidores de las enzimas SCD y FASN [86], como por ejemplo el fármaco orlistat aprobado para el tratamiento de la obesidad [90]. La lipogénesis permite a las células cancerosas obtener una mayor cantidad de ácidos grasos saturados y monoinsaturados, que son más estables a la peroxidación lipídica que los ácidos grasos poliinsaturados [86,91]. De esta forma, las células cancerosas que presentan lipogénesis son más resistentes a la peroxidación lipídica que producen algunos fármacos anticancerosos prooxidantes [86,91]. La peroxidación lipídica puede ser una estrategia eficaz para acatar al cáncer. La ferroptosis es un tipo de muerte celular mediada por hierro en el que se produce la peroxidación lipídica [92]. Numerosos investigadores están estudiando la ferroptosis para desarrollar nuevos tratamientos anticancerosos y para revertir la resistencia a fármacos ya existentes [92]. Entre las distintas estrategias para inducir la ferroptosis se encuentran la restricción enzimática del AA cistina (CysS; dímero de Cys), el bloqueo de la absorción de CysS, los 39 inhibidores de la síntesis de GSH y los inhibidores de la GPX4 [92]. Estas estrategias dejan a las células cancerosas sin defensas antioxidantes y son susceptibles de sufrir peroxidación lipídica y ferroptosis. El papel de la Cys en la peroxidación lipídica y su potencial terapéutico serán discutidos en el apartado de metabolismo de AAs. El colesterol tiene un papel importante en las células cancerosas. Por un lado, es fundamental para la formación de las membranas lipídicas de las nuevas células cancerosas. De hecho, se ha observado que las estatinas, que disminuyen la síntesis de colesterol, también disminuyen el riesgo de cáncer [93]. Por otro lado, el colesterol es capaz de modular la estabilidad y fluidez de las membranas. Las células cancerosas con mucha fluidez de membrana pueden cambiar de forma fácilmente y tienen una mayor capacidad metastásica [86]. El colesterol aumenta la rigidez de las membranas, por lo que niveles altos de colesterol en la membrana celular dificultarían la metástasis. En este sentido, se ha observado que los cánceres con mayor capacidad metastática sobreexpresan el transportador ABCA1 [94], que es capaz de expulsar colesterol, haciendo que las membranas de las células cancerosas ganen fluidez y, por lo tanto, aumenten su capacidad metastática [86]. Por último, los ácidos grasos poliinsaturados también participan en la síntesis de moléculas de señalización como son las prostaglandinas. Se ha estudiado la influencia en el cáncer de los ácidos grasos poliinsaturados omega-3 y omega-6 [86], cuyo consumo en la dieta es esencial para el ser humano. Los ácidos grasos omega-3, incluyendo el ácido eicosapentaenoico (EPA) y el ácido docosahexaenoico (DHA), tienen actividad antiinflamatoria por competir con el ácido araquidónico por su unión con la enzima COX2, produciendo la prostaglandina PGE3 en lugar de la PGE2 [95]. En cambio, los omega-6, como el ácido linoleico y el ácido araquidónico, son precursores de los eicosanoides proinflamatorios [96]. Muchas células cancerosas utilizan la PGE2 como señal proliferativa, y se ha observado que las dietas ricas en omega-3 reducen el riesgo de cáncer de mama, colorrectal y próstata [95,97]. Además, la PGE2 también estimula el crecimiento tumoral, promueve la angiogénesis, y suprime la inmunidad antitumoral, contribuyendo de esa forma a la progresión del cáncer [98]. En resumen, estas evidencias confirman la influencia de los lípidos en el desarrollo y progresión del cáncer. 3.4.5. Metabolismo de aminoácidos en cáncer Las alteraciones en el metabolismo de AAs son muy relevantes en el cáncer. En las últimas dos décadas, se han realizado importantes avances en cuanto al conocimiento de las alteraciones en el metabolismo de AAs de las células cancerosas [5,7,99–102]. Las células cancerosas tienen mayores requerimientos de algunos AAs para poder mantener sus elevadas necesidades bioenergéticas y biosintéticas [5]. Además, muchas células cancerosas pierden la capacidad de sintetizar algunos AAs no esenciales (AANEs) [7], por lo que dependen del aporte exógeno de estos AANEs para poder mantener sus funciones vitales. Estas limitaciones metabólicas pueden emplearse para desarrollar tratamientos anticancerosos selectivos contra las células cancerosas. 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 94 95 96 97 98 99 100 3.5. EVALUACIÓN PRECLÍNICA DE TRATAMIENTOS ANTICANCEROSOS Muchos pacientes son diagnosticados con cáncer metastático, y a pesar de los importantes avances en los últimos años, la mayoría de ellos no consiguen superar la enfermedad. Esto hace necesario el desarrollo de tratamientos anticancerosos más eficaces contra el cáncer. Sin embargo, la inmensa mayoría de los tratamientos anticancerosos que muestran actividad en modelos preclínicos fracasan en los ensayos clínicos. De hecho, los fármacos anticancerosos tienen una menor tasa de éxito en ensayos clínicos en comparación con los tratamientos para otras enfermedades [245]. Normalmente se culpa a la complejidad del cáncer y a su difícil abordaje terapéutico. Sin embargo, los métodos preclínicos de evaluación de tratamientos anticancerosos pueden ser los responsables de esta baja tasa de éxito, siendo poco fiables para predecir la eficacia anticancerosa en pacientes [9]. A continuación, se describen los principales modelos in vitro e in vivo de evaluación de tratamientos anticancerosos, y se muestra una estrategia de evaluación preclínica que permite detectar tratamientos con eficacia relevante para los pacientes oncológicos [9,10]. 3.5.1. Modelos in vitro La evaluación de la citotoxicidad celular in vitro en líneas celulares es la forma más frecuente de evaluar el potencial anticanceroso de un nuevo tratamiento. Sin embargo, en la gran mayoría de los estudios científicos el único parámetro que se mide es la citotoxicidad contra las células cancerosas [246,247]. En estos estudios el compuesto con mayor potencial terapéutico sería el que daña a las células cancerosas a la dosis más baja. Esto podría llevar a seleccionar erróneamente un compuesto con un peor potencial terapéutico en pacientes, porque no se tiene en cuenta su efecto con las células sanas. Lo ideal sería seleccionar un compuesto que dañe a las células cancerosas sin afectar a las células sanas, es decir, seleccionar un compuesto con una alta selectividad contra el cáncer. La selectividad se define como la capacidad de un tratamiento para dañar a las células cancerosas sin dañar a las células sanas [10]. Una de las principales causas por las que los tratamientos anticancerosos disponibles suelen fallar es precisamente por su baja selectividad. Al tener una baja selectividad, para eliminar a todas las células cancerosas también estaríamos dañando a las células sanas, produciendo efectos tóxicos que pondrían en riesgo la vida del paciente. Por lo tanto, como única alternativa, se usa la dosis máxima tolerada, que produce efectos adversos tolerables pero que no es suficiente para eliminar a todas las células cancerosas [10]. Un compuesto con alta selectividad podría eliminar muchas células cancerosas sin producir efectos adversos limitantes, y esto se traduciría en una mejora de la supervivencia de los pacientes. En cambio, un fármaco con una citotoxicidad potente pero poco selectivo produciría efectos adversos a las dosis a las que comienza a tener actividad anticancerosa, siendo por lo tanto inútil. En esta tesis, se han evaluado tratamientos anticancerosos en un panel de líneas celulares, incluyendo líneas cancerosas y líneas no cancerosas, teniendo como prioridad encontrar el tratamiento con la mayor selectividad anticancerosa in vitro. 101 Sin embargo, también hay que comentar que los ensayos in vitro tienen algunas limitaciones importantes. Los medios de cultivo tienen condiciones artificiales en las que muchos parámetros están distanciados de lo que ocurre dentro del microambiente tumoral. En primer lugar, en condiciones in vitro hay mucho más O2 que en condiciones in vivo. En condiciones de cultivo celular estándar, la cantidad de O2 es similar a la del aire que respiramos (21%). En cambio, los niveles de O2 son menores en los tejidos, estando en el rango de 2-9% según el grado de vascularización del tejido [248]. Esto se traduce en que las células en los medios de cultivo tienen unos niveles de estrés oxidativo mucho mayores, lo cual produce una mayor inestabilidad genómica [248]. Como compensación, las células en condiciones in vitro necesitan aumentar su defensa antioxidante, lo cual puede sobreestimar a los tratamientos anticancerosos con actividad prooxidante. Además, las condiciones metabólicas no son idénticas a las que se producen en los tejidos. Los medios de cultivo celular clásicos (DMEM, MEM, RPMI 1640, BME) tienen unas concentraciones de glucosa, AAs, vitaminas y sales que en gran parte difieren con las que encontramos en el plasma humano [249]. Esto hace que las células en medios de cultivo cambien su metabolismo, y distorsionan la actividad citotóxica de algunos fármacos anticancerosos [249]. Además, en medios de cultivo no se pueden conocer las interacciones metabólicas que se producen entre los distintos tipos de células y tejidos. Por ejemplo, en el microambiente tumoral las células asociadas a los tumores a menudo aportan nutrientes a las células cancerosas [224]. Además, la proteólisis en otros tejidos, como el músculo o el hígado, podría liberar AAs al plasma sanguíneo durante el tratamiento con una dieta en la que se restringen AAs, amortiguando el descenso en los niveles de los AAs que se están restringiendo con la dieta [2]. Estas limitaciones de los cultivos celulares hay que tenerlas en cuenta a la hora de valorar los resultados in vitro, especialmente en tratamientos dirigidos a las alteraciones metabólicas de las células cancerosas. 3.5.2. Modelos in vivo Los modelos animales en los que probar un compuesto o tratamiento anticanceroso son una valiosa herramienta para predecir el potencial real de un tratamiento en ensayos clínicos. Existen una enorme variedad de modelos de cáncer en animales, siendo la inmensa mayoría de ellos en ratones. También existen distintas formas de clasificar los modelos in vivo de cáncer. Nos vamos a centrar en el tipo más frecuente de modelo de cáncer, los modelos de inoculación o trasplante de células en ratones. En este tipo de modelo de cáncer se inoculan en ratones células cancerosas (previamente mantenida en cultivo celular). Por un lado, según el tipo de trasplante pueden ser de dos tipos: • Modelos xenograft: Se inocula una célula cancerosa humana en un ratón inmunodeprimido (xenotrasplante). No se produce rechazo inmunitario porque el ratón huésped no tiene sistema inmunitario funcional. Son los más habituales. • Modelos alograft: Se inocula una célula cancerosa de ratón en un ratón inmunocompetente (alotrasplante). No se produce rechazo inmunitario porque la célula cancerosa se aisló de un tumor originado en un ratón de la misma cepa a la del ratón huésped. Son menos frecuentes, aunque su uso está popularizándose. 102 Los modelos xenograft tienen varios inconvenientes que limitan su relevancia clínica en comparación a los modelos alograft. En primer lugar, se realizan en ratones inmunodeprimidos, que es una condición artificial. Además, por ser un xenotrasplante se podrían producir errores experimentales a causa de la diferente sensibilidad interespecie al compuesto evaluado (células cancerosas humanas vs células normales murinas) [9]. Por ejemplo, al evaluar el compuesto bufalina en un modelo xenograft se observó una marcada actividad anticancerosa [246], sin embargo, esto fue un error experimental debido a que las células humanas (cancerosas o no) son aproximadamente 1000 veces más sensibles que las células de ratón a la citotoxicidad de la bufalina [250,251]. Esto no se hubiera producido si se hubiera testeado en un modelos alograft, donde no hay diferencia interespecie (células cancerosas de ratón vs células normales de ratón) [9]. Además, en los modelos alograft la presencia de un sistema inmune funcional permite detectar compuestos con actividad anticancerosa mediada por el sistema inmune, y de hecho las inmunoterapias que se están empezando a emplear en pacientes se desarrollaron en modelos de cáncer alograft. Por otro lado, según la localización del tumor, los modelos también se pueden clasificar en: • Modelos subcutáneos: Se inoculan las células cancerosas mediante inyección subcutánea. Tras unos días-semanas de latencia, crecerá un tumor subcutáneo localizado. Son los más habituales debido a su sencilla puesta a punto. • Modelos ortotópicos: Se inoculan las células cancerosas en el órgano/tejido original del tumor (por ejemplo, células de cáncer de mama inoculadas directamente en la glándula mamaria). • Modelos metastásicos: Se inoculan las células cancerosas por vía intravenosa (diseminación por la sangre, formando tumores metastásicos principalmente en el pulmón) o por vía intraperitoneal (diseminación peritoneal, formando tumores metastásicos en la cavidad peritoneal). Los modelos subcutáneos, a pesar de ser los modelos in vivo más empleados por su sencillez, tienen importantes inconvenientes. En primer lugar, no se ajustan a la realidad de los pacientes puesto que los tumores subcutáneos son tumores localizados y los pacientes a los que irán dirigidos los tratamientos son pacientes con cáncer metastásico, con múltiples tumores diseminados por distintos órganos. Además, el tumor se desarrolla a nivel subcutáneo, por lo que no se refleja de manera real las interacciones de las células cancerosas con el tejido de su alrededor [252]. Los tumores subcutáneos tienen una baja vascularización comparado con otros modelos y, además, no simulan correctamente el microambiente tumoral. La disponibilidad de nutrientes en el microambiente tumoral pueden modificar la sensibilidad a los tratamientos y el comportamiento metabólico de las células cancerosas [253]. Por lo tanto, los modelos subcutáneos no son la mejor opción para evaluar tratamientos anticancerosos. Los modelos ortotópicos sí son realistas, puesto que el tumor se desarrolla en el mismo tejido donde se originó y las células cancerosas crecen en un microambiente similar al de los pacientes con un cáncer localizado. Las células esta vez sí tienen un microambiente realista, están bien vascularizadas, e incluso tienen capacidad metastásica espontánea. Este 103 modelo es ideal para estudiar fármacos dirigidos a pacientes aún con tumores localizados (por ejemplo, pacientes recibiendo quimioterapia adyuvante previa a la cirugía para prevenir las metástasis). Sin embargo, tal como he comentado previamente, los pacientes con cáncer metastásico son los que necesitan nuevos tratamientos anticancerosos de forma más urgente. Los modelos metastásicos son los que mayor similitud tienen con los pacientes con cáncer metastásico. En estos modelos, los ratones son inoculados con células cancerosas con capacidad metastásica por vía intravenosa o intraperitoneal. La vía intravenosa formará tumores principalmente en el pulmón, que es precisamente el lugar más habitual de metástasis para casi todos los cánceres. La vía intraperitoneal formará tumores diseminados en la cavidad peritoneal, un lugar muy frecuente de diseminación en cánceres originados en órganos abdominales como el cáncer de colon, ovario, renal y páncreas. Además, los tumores metastásicos tienen un microambiente tumoral diferente al de los tumores primarios, e incluso hay diferencias metabólicas entre los tumores metastásicos y los tumores primarios [168,254,255]. Estos modelos son más difíciles de tratar con éxito que los modelos de cáncer localizado, por lo que suponen un verdadero reto para los tratamientos experimentales. Debido a que la mayoría de pacientes que requieren fármacos anticancerosos tienen metástasis, seleccionar modelos animales de metástasis debería ser prioritario en la mayoría de casos [9]. 3.5.3. Evaluación preclínica orientada a pacientes En esta tesis se ha aplicado un algoritmo de evaluación preclínica para predecir si el tratamiento en evaluación mejora la actividad anticancerosa de los tratamientos estándar usados en pacientes con cáncer metastásico. En los modelos in vitro se debe saber si el tratamiento consigue mejorar la selectividad anticancerosa in vitro conseguida por los fármacos de elección en pacientes [9,10]. Para ello, se deben evaluar los tratamientos en un panel de líneas celulares cancerosas, y líneas celulares no cancerosas. Se evalúa la citotoxicidad de cada tratamiento en cada línea celular, y la selectividad se calcula comparando la citotoxicidad conseguida en las células cancerosas y las células normales. Lo ideal será que el tratamiento sea selectivo (mayor citotoxicidad contra las células cancerosas que contra las células normales), y que esta selectividad sea superior a la conseguida por los fármacos de elección [10]. Hay que tener en cuenta que las condiciones in vitro son artificiales. Además, a la hora de evaluar restricciones de AAs, estos resultados deben ser tomados con cautela, debido a que el elevado estrés oxidativo, las cantidades de nutrientes, y la intensidad de la restricción, puede que no sean las reales. Algunos tratamientos estándar tampoco se evaluarían correctamente (ej: inhibidores de la angiogénesis o inmunoterapias). Por lo tanto, aunque tengamos un tratamiento selectivo in vitro, evaluar los tratamientos en modelos in vivo es imprescindible. En cuanto a los modelos in vivo, es fundamental evaluar los tratamientos en condiciones lo más similares a las que se dan en pacientes con cáncer metastásico. Por lo tanto, lo ideal 110 AIMS Metastatic cancer is the leading cause of cancer death because the available anticancer drugs have a limited ability to selectively damage cancer cells. Cancer cells have metabolic vulnerabilities that can be exploited to develop new selective anticancer treatments. The main aim of this thesis has been the preclinical evaluation of artificial diets based on selective amino acid restriction for the treatment of metastatic cancers. First, this strategy was evaluated in vitro, evaluating whether selective restriction of amino acids was able to selectively kill cancer cells without harming normal cells. Then, artificial diets based on selective amino acid restrictions were evaluated in murine models of metastatic cancer, comparing anticancer activity with the standard anticancer drugs used for each cancer. 111 112 5. MATERIALES Y MÉTODOS 113 114 5.1. REACTIVOS Y FUNGIBLES MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5,-difenil tetrazolio, A22310005) and SDS (dodecilsulfato sódico, 1423631209) se compraron en Panreac Applichem. El fármaco anticanceroso 5-FU y la resazurina se obtuvieron de Sigma. Los fármacos cisplatino y sunitinib malato (462640010), la colina bitartrato (450225000), la terbutilhidroquinona (TBHQ, 150822500), la taurina (166541000) y la caseína (aislada de leche bovina, 276070010) se compraron en Thermo Scientific Acros Organics. También se usó el fármaco doxorrubicina (50 mg polvo para solución, Farmiblastina, Pfizer, 958314.9), la capecitabina (500 mg/comprimido, Normon), anticuerpo anti-PD-1 (anti-PD-1 murino (CD279), clon RMP1-14, BE0146, Bioxcell), tinta china (Superblack India Ink, Speedball, 33X089A), y suero fisiológico estéril para diluir los fármacos inyectables (Kin laboratory, 160407.1). En las dietas se utilizó como fuente de minerales el preparado Mineral Mix (AIN-93M-MX, 960401), y como fuente de vitaminas el Vitamin Mix (AIN Vitamin Mixture 76, 905454) que se adquirieron en MP Biomedicals. El azúcar se compró en un mercado local. La celulosa y el almidón de maíz se obtuvieron en Farmusal (farmacia local). También se utilizaron como componentes lipídicos de las dietas el aceite de oliva virgen extra (aceite de oliva comercial de distribuido por Supermercados Día, España, 112529), aceite de salmón (aceite comercial desarrollado por Pets Purest, Inglaterra, B06WWFTRXM) y aceite de coco (aceite desarrollado por Supermercados Mercadona, España, 848000041937). Los AAs L-alanina (Ala, A1688), L-arginina (Arg, A3675), L-asparagina-monohidrato (Asn, A1668), ácido L-aspártico (Asp, A3715), L-cisteína (Cys, A3694), L-cistina (CysS, A1703), ácido L-glutámico (Glu, A1704), glicina (Gly, A3707), L-leucina (Leu, A1426), L-metionina (Met, A1340), L-prolina (Pro, A1707), L-serina (Ser, A1708) and L-tirosina (Tyr, A3437) se compraron de diferentes fuentes, incluyendo Across Organics y Panreac Applichem. También se utilizaron el premix de AAEs, AAEs ramificados (Leu, Ile, Val) y Gln que se obtuvieron en Myprotein. Los materiales de cultivo celular se compraron en en Biowest y Thermo Fisher Scientific, salvo que se indique de otra manera. 5.2. LÍNEAS CELULARES Y CONDICIONES DE CULTIVO CELULAR Para la ejecución de esta tesis se ha trabajado con las líneas celulares recogidas en la Tabla 2. En esta tabla se recoge el nombre de cada línea celular, el tipo de célula (tipo de tejido y especie), el medio de cultivo empleado para su mantenimiento y la fuente de la que se obtuvieron. Todos los medios de cultivo celular empleados se suplementaron con 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 10% de suero fetal bovino. Como única excepción el medio de cultivo empleado para las células ID8 Trp53 -/- fue suplementado con 0.11 g/L de piruvato sódico, 4% de suero fetal bovino y 1% de insulina-transferrina- selenio. Todas las líneas celulares fueron mantenidas a 37ºC, en una atmósfera de un 5% de CO2 y humedad en niveles controlados por un incubador. 115 Nombre línea celular Tipo de célula (especie y tipo de tejido/cáncer) Medio de cultivo Procedencia HaCaT Humanas de queratinocitos no malignos [256] DMEM alto en glucosa CLS HT29 Humanas de adenocarcinoma colorrectal DMEM alto en glucosa Dr. Helleday 786-O Humanas de adenocarcinoma de células renales RPMI 1640 ATCC MDA-MB-231 Humanas de adenocarcinoma de mama triple negativo (ER-; PR-; HER-2-) DMEM alto en glucosa ATCC BT-474 Humanas de carcinoma de mama luminal tipo B (ER+; PR+; HER -2+) DMEM alto en glucosa CLS T-47D Humanas de carcinoma de mama luminal tipo B (ER+; PR+; HER-2+) RPMI 1640 CLS SK-BR-3 Humanas de adenocarcinoma de mama (ER-; PR-; HER-2+) DMEM alto en glucosa CLS A549 Humanas de adenocarcinoma de pulmón DMEM alto en glucosa CLS Calu-1 Humanas de carcinoma epidermoide de pulmón RPMI 1640 CLS MeWo Humanas de melanoma BRAF WT DMEM alto en glucosa CLS UACC-62 Humanas de melanoma BRAF mutado RPMI 1640 NCI NIH:OVCAR-3 Humanas de carcinoma de ovario RPMI 1640 CLS SK-OV-3 Humanas de carcinoma de ovario DMEM alto en glucosa CLS CT26.WT Murinas de carcinoma de colon RPMI 1640 ATCC Renca Murinas de adenocarcinoma de células renales RPMI 1640 ATCC 4T1 Murinas de adenocarcinoma de mama triple negativo (ER-; PR-; HER-2-) RPMI 1640 ATCC LL/2 Murinas de carcinoma de pulmón DMEM alto en glucosa ATCC B16-F10 Murinas de melanoma DMEM alto en glucosa ATCC ID8 Trp53-/- Murinas de carcinoma de ovario p53 -/- con CRISPR/cas9 [257] DMEM alto en glucosa Dr. Iain A. McNeish Tabla 2. Líneas celulares empleadas en esta tesis. CLS (Cell Line Service, Alemania); NCI (National Cancer Institute, Roxkville, Estados Unidos); ATCC (American Type Culture Collection); ER (receptor estrogénico); PR (receptor progesterona); HER-2 (receptor-2 del factor de crecimiento epidérmico humano); WT (“wild type”, no mutado). 116 5.3. EVALUACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD IN VITRO La citotoxicidad es la capacidad de un agente de inducir efectos tóxicos sobre las células, mediante la inhibición de la proliferación celular o induciendo la muerte celular. Para evaluar la actividad anticancerosa de las restricciones selectivas de AAs in vitro, se prepararon varios medios de cultivo celular artificiales en nuestro laboratorio usando medio DMEM en polvo sin AAs (D9800-13; US Biological). Los medios se completaron con glucosa (141341.1211; Panreac), bicarbonato sódico (141638.1211; Panreac) y las cantidades de cada uno de los AAs. Para añadir cada AA, previamente se disolvían en PBS y se esterilizaba cada solución de AA mediante microfiltración. Todos los medios fueron completados con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina/estreptomicina. En la Tabla 3 se detallan la composición de los medios utilizados en esta tesis. AMINOÁCIDOS (g/L) M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 Leucina (Leu) 0.528 0.528 0.528 0.705 0.705 0.705 0.705 0.528 Isoleucina (Ile) 0.096 0.096 0.096 0.096 0.096 0.096 0.096 0.096 Lisina (Lys) 0.24 0.24 0.24 0.24 0.24 0.24 0.24 0.24 Valina (Val) 0.24 0.24 0.24 0.24 0.24 0.24 0.24 0.24 Fenilalanina (Phe) 0.192 0.192 0.192 0.192 0.192 0.192 0.192 0.192 Treonina (Thr) 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 Histidina (His) 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 Metionina (Met) 0.048 0.048 0.048 0.133 0.133 0.133 0.133 0.048 Triptófano (Trp) 0.016 0.016 0.016 0.016 0.016 0.016 0.016 0.016 Glutamina (Gln) 1 1 1 1 1 1 1 1 Glicina (Gly) 0.2 - 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 Aspartato (Asp) 0.02 - 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 - Alanina (Ala) 0.02 - 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 - Arginina (Arg) 0.1 - 0.1 - - - - - Serina (Ser) 0.04 - - 0.04 0.04 - - - Cisteína (Cys) 0.06 - - - 0.06 0.06 - - Asparagina (Asn) 0.05 - - - - - - - Prolina (Pro) 0.02 - - - - - - - Glutamato (Glu) 0.02 - - - - - - - Tirosina (Tyr) 0.1 - - - - - - - Tabla 3. Composición del medio M0 (medio completo) y los medios M1-M7 (medios con restricciones selectivas de AAs) en g/L. Para evaluar los tratamientos se sembraron las células en crecimiento exponencial en placas de 96 pocillos a una densidad de entre 3.000 y 10.000 células/pocillo (según la velocidad de crecimiento de cada línea celular y la duración del experimento). Posteriormente, se incubaron las células en medio DMEM completo durante 24 horas para permitir su adaptación. Para tratar a las células, se retiró el medio y se sustituyó por medio DMEM 117 completo (M0), medios con niveles manipulados de AAs (M1-M7), o con varias concentraciones de fármacos anticancerosos (5-FU, doxorrubicina, sunitinib) en medio completo. Tras el periodo de tratamiento, la viabilidad celular se midió con los ensayos MTT y resazurina, dos ensayos ampliamente empleados para determinar la viabilidad celular. Ambas técnicas se basan en la capacidad que tienen las células de metabolizar estos compuestos (MTT y resazurina), permitiendo cuantificar la viabilidad celular mediante espectrofotometría. Ambas técnicas se complementaron con la observación visual directa de los cultivos celulares mediante microscopio óptico. 5.3.1. Evaluación de la viabilidad celular mediante el ensayo MTT El ensayo MTT es una de las técnicas in vitro más utilizadas para estimar la viabilidad celular. Esta técnica se basa en la capacidad que tienen las células vivas (metabólicamente viables) de transformar el compuesto amarillo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,5,-difenil tetrazolio) a un compuesto insoluble de color violeta (formazan-MTT). Este compuesto coloreado forma cristales que rompen las células, que deben ser solubilizados con SDS. La formación de formazan-MTT se cuantifica mediante absorbancia. Cuantas más células viables hay, mayor cantidad de formazan-MTT se produce, y por lo tanto, la absorbancia suele ser proporcional a la cantidad de células vivas existentes [258]. Tras sembrar 3.000-10.000 células por pocillo y esperar 24 horas de incubación en medio completo DMEM, las células se trataron con los medios artificiales (Tabla 3) o con distintas concentraciones de fármacos anticancerosos. Las células se visualizaron diariamente en el microscopio y se fotografiaron (20X aumentos) en los días 3 y 7 de tratamiento usando la cámara Leica de un Huawei P9 Lite adaptada a un microscopio óptico. Tras el periodo de tratamiento, se retiraron los medios y se añadió en todos los pocillos 125 µL de MTT diluido en medio (1 mg/mL). Las placas se incubaron durante 2-4 horas a 37ºC y 5% CO2. Posteriormente, se añadieron 80 µL de 20% de SDS en 0.02 M de HCl para disolver los cristales de formazan-MTT formados, y se incubaron las placas durante la noche en un incubador a 37ºC 5% de CO2. Por último, la lectura de las placas se realizó en un espectrofotómetro lector de placas a 540 nm. El porcentaje de viabilidad celular se calculó siempre respecto a los pocillos de células control no tratados (medio DMEM completo). Todos los resultados se obtuvieron de al menos 3 experimentos independientes y se expresaron como la media ± el error estándar de la media (SEM). 5.3.2. Evaluación de la viabilidad celular mediante el ensayo resazurina El ensayo resazurina es otra técnica muy empleada para cuantificar la viabilidad celular. Esta técnica es muy parecida en su fundamento al ensayo MTT. Se basa en la capacidad que tienen las células vivas (metabólicamente viables) de reducir el compuesto de color azul (resazurina) a un compuesto rosa y soluble en agua (resorufina). Cuantas más células viables hay, mayor es la cantidad de resorufina que se produce. A diferencia de la técnica MTT, las células no mueren durante este ensayo, por lo que se puede volver medir la viabilidad celular a distintos tiempos. Además, no hay que utilizar SDS y se puede cuantificar mediante fluorescencia como mediante absorbancia. 118 Tras sembrar 3.000-10.000 células por pocillo y esperar 24 horas de incubación en medio completo DMEM, se trataron a las células con los medios artificiales (Tabla 3) durante 7 días. Después de los 7 días de tratamiento se dejaron recuperar a las células en medio estándar durante 3 días. Tras los periodos de tratamiento y recuperación, se retiró el medio de todos los pocillos, se añadieron 150 µL de solución de resazurina (20 µg/mL en medio), y se dejó incubar las placas durante 5-7 horas (dependiendo de la línea celular) a 37ºC 5% de CO2. Se midió la formación de resorufina midiendo la absorbancia a 540 nm 620 nm en un espectrofotómetro lector de placas. El porcentaje de viabilidad celular se calculó siempre respecto a los pocillos de células control no tratadas (medio DMEM completo). Todos los resultados se obtuvieron de al menos 3 experimentos independientes y se expresaron como la media ± el error estándar de la media (SEM). 5.4. ANIMALES Se utilizaron ratones hembra/macho de las cepas BALB/cAnNRj y C57BL/6JRj (según el modelo de cáncer) de 12 semanas o más de edad. Se obtuvieron de Janvier Labs® (Francia). Los ratones se alojaron durante al menos 2 semanas de antelación al inicio de los experimentos en las instalaciones del animalario de la Facultad de Farmacia, permitiendo así su adecuada adaptación. Los ratones se mantuvieron en condiciones estándar: ciclo diurno de 12 horas de luz / 12 horas de oscuridad, humedad controlada 70-75%, temperatura de 23-24ºC, y acceso libre a comida y agua (ad libitum). Los ratones recibieron como comida una dieta estándar (dieta ssniff R/M-Z E/R/S; V1724-000, ssniff Spezialdiäten). Todos los ratones tenían al menos 12 semanas de edad al comienzo de los experimentos. Todos los experimentos con animales llevados a cabo en esta tesis fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla (CEEA-US2018- 6/2 y CEEA-US2019-20) y la Junta de Andalucía (15/05/2018/090 y 13/11/2020/131). Por lo tanto, se desarrollaron siguiendo las recomendaciones de la Unión europea de experimentación animal (Directive of the European Counsel 2010/630/EU). En esta tesis se utilizaron varios modelos de cáncer metastásico en ratones. En todos los modelos de cáncer se utilizaron ratones con sistema inmune funcional a los cuales se les inocularon células cancerosas de ratón por vía intravenosa o intraperitoneal (según el tipo de cáncer). Por lo tanto, todos los modelos de cáncer eran modelos alograft metastásico. El protocolo seguido fue muy similar en todos los modelos de cáncer. 5.4.1. Preparación de las líneas celulares Antes de inocular las células cancerosas a los ratones, las células (con 5-7 pases) se subcultivaron en flasks de 75-cm2. El día de la inoculación de las células los flasks deben estar al 60-75% de confluencia. A continuación, se les retiró el medio y las células fueron lavadas dos veces con PBS estéril. Justo después, se trataron a las células con tripsina- EDTA durante aproximadamente 1-3 minutos a 37ºC para permitir que las células adquirieran forma redondeada, pero sin despegarse de la superficie del flask. A 119 continuación, la solución tripsina-EDTA se aspiró, y las células se resuspendieron en 5 mL de PBS estéril, agitando para conseguir disgregar los agregados de células. En ese momento, se añadió medio de cultivo suplementado con 2,5% FBS hasta conseguir una suspensión de células de 5x105 – 25x106 células/mL según el modelo de cáncer. Posteriormente, se centrifugaron las células a 250G y temperatura ambiente durante 5 minutos. Se desechó el sobrenadante y se resuspendieron a las células con PBS estéril filtrado, contando de nuevo las células para tener la densidad de células deseada (5x105 – 25x106 células/mL). Por último, se prepararon jeringuillas de 1 mL (jeringuillas de insulina con aguja de 29-G x 1/2”) cargando cada jeringuilla con 0,2 mL de la suspensión de células. Finalmente, las células se inocularon en los ratones siguiendo el proceso que se describe a continuación. 5.4.2. Inoculación de las células cancerosas La cantidad de células y el tipo de inoculación depende del tipo de cáncer evaluado. El número de células inoculadas era siempre el necesario para asegurar que el 100% de los ratones no tratados desarrollaban el cáncer. Según el modelo de cáncer, las células cancerosas fueron inoculadas a los ratones mediante dos técnicas que permiten la formación de tumores metastásicos: 1. Inoculación intravenosa Se inocularon las células cancerosas en la vena de la cola, formando tumores metastásicos principalmente a nivel pulmonar. Esta técnica se utilizó en los modelos de cáncer que suelen metastatizar por la sangre, como son el cáncer de colon, mama, pulmón y melanoma. Para ello, los ratones fueron colocados junto a un calefactor para forzar la vasodilatación de la vena de la cola de los ratones y facilitar la inoculación. A continuación, se metió a los ratones uno a uno en un cepo (Sodispan Research) para inmovilizar al ratón. La cola de los ratones fue limpiada con etanol 70% y se localizó una de las dos venas de la cola (localizadas a ambos lados de la línea central de la cola del ratón). Se introdujo la jeringuilla con minucioso cuidado y se inocularon 200 µL de la solución de células. Si la inoculación se estaba realizando correctamente el émbolo de la jeringuilla debería bajar sin necesidad de aplicar una presión excesiva. Por último, se retiró la aguja, se presionó la zona punzada y se volvió a aplicar etanol 70% para desinfectar la zona. 2. Inoculación intraperitoneal Se inocularon las células cancerosas en el abdomen, formando tumores metastáticos en la cavidad peritoneal. Esta técnica se utilizó en los modelos de cáncer que suelen diseminarse dentro de la cavidad peritoneal, como son el cáncer de colon, renal y ovario. Para ello, se procedió cogiendo con la mano a los ratones, asegurándonos que estuvieran inmovilizados. A continuación, se insertó la jeringa en el cuadrante inferior derecho del abdomen y en un ángulo de aproximadamente 45º. Esta técnica debía realizarse con precaución para no punzar órganos como el intestino, la vejiga o las glándulas mamarias. 126 DIETAS TC1 TC2 TC3 TC4 TC5 TC6 TC7 TC8 Caseína - - - - 6 6 6 6 Glutamina (Gln) 2 2 2 2 5 - 5 5 Leucina (Leu) 3 3 0.6 3 2.5 - 5 2.5 Metionina (Met) 0.18 0.18 0.18 0.15 - - - - Fenilalanina (Phe) 0.6 0.6 0.6 0.6 - - - - Histidina (His) 0.2 0.2 0.2 0.2 - - - - Lisina (Lys) 0.5 0.5 0.5 0.5 - - - - Treonina (Thr) 0.25 0.25 0.25 0.25 - - - - Isoleucina (Ile) 0.3 0.3 0.3 0.3 - - - - Valina (Val) 0.35 0.35 0.35 0.35 - - - - Triptófano (Trp) 0.07 0.07 0.07 0.07 - - - - Cistina (CysS) - 0.2 0.2 0.2 - - - 0.2 Arginina (Arg) - - - - - - - - Glicina (Gly) - - - - - - - - Serina (Ser) - - - - - - - - Tirosina (Tyr) - - - - - - - - Alanina (Ala) - - - - - - - - Aspartato (Asp) - - - - - - - - Prolina (Pro) - - - - - - - - Asparagina (Asn) - - - - - - - - Glutamato (Glu) - - - - - - - - Aceite de salmón 1 1 1 1 1 1 1 1 Colina 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 Terbutilhidroquinona 0.0008 0.0008 0.0008 0.0008 0.0008 0.0008 0.0008 0.0008 Vitamin Mix 1 1 1 1 1 1 1 1 Mineral Mix 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 Azúcar 15 15 15 15 15 15 15 15 Celulosa 5 5 5 5 5 5 5 5 Almidón de maíz 66.80 66.60 69.00 66.63 60.75 68.25 58.25 60.75 Total 100 100 100 100 100 100 100 100 Tabla 5. Composición detallada de las dietas del Capítulo I: “Artificial Diets Based on Selective Amino Acid Restriction versus Capecitabine in Mice with Metastatic Colon Cancer”. Cuando se añadió la Cys fue en forma de CysS (dímero de Cys). Las dietas TC5, TC6 y TC7 aparecen a veces en otras tablas de dietas con otro nombre (indicado entre paréntesis). La dieta TC5 aparece en la Tabla 7 (T18) y en la Tabla 9 (TC5). La dieta TC6 aparece en la Tabla 7 (T13). La dieta TC7 aparece en la Tabla 8 (TB5). La dieta TC8 aparece en la Tabla 9 (B2). 127 DIETAS T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 Caseína - - - - - - - - - - Glutamina (Gln) 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 Leucina (Leu) 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 Metionina (Met) 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 Fenilalanina (Phe) 2.16 2.16 2.16 2.16 2.16 2.16 2.16 2.16 2.16 2.16 Histidina (His) 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 Lisina (Lys) 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 Treonina (Thr) 1.80 1.80 1.80 1.80 1.80 1.80 1.80 1.80 1.80 1.80 Isoleucina (Ile) 1.07 1.07 1.07 1.07 1.07 1.07 1.07 1.07 1.07 1.07 Valina (Val) 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 Triptófano (Trp) 0.24 0.24 0.24 0.24 0.24 0.24 0.24 0.24 0.24 0.24 Cistina (CysS) - - - - - - - - - 1.00 Arginina (Arg) - 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 Glicina (Gly) - 1.00 1.00 - 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 Serina (Ser) - - - - - - - - 1.50 - Tirosina (Tyr) - - - - - - 1.00 - - - Alanina (Ala) - 1.00 - 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 Aspartato (Asp) - 2.00 - 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 Prolina (Pro) - - - - - 1.50 - - - - Asparagina (Asn) - - - - 1.50 - - - - - Glutamato (Glu) - - - - - - - 2.00 - - Aceite de oliva 14.00 14.00 14.00 14.00 14.00 14.00 14.00 14.00 14.00 14.00 Aceite de salmón - - - - - - - - - - Colina 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 Vitamin Mix 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 Mineral Mix 3.50 3.50 3.50 3.50 3.50 3.50 3.50 3.50 3.50 3.50 Azúcar 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 Celulosa 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 Almidón de maíz 37.25 31.75 34.75 32.75 30.25 30.25 30.75 29.75 30.25 30.75 Total 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Tabla 6. Composición detallada de las dietas del Capítulo II (1ª parte): “Manipulation of Amino Acid Levels with Artificial Diets Induces a Marked Anticancer Activity in Mice with Renal Cell Carcinoma”. Cuando se añadió la Cys fue en forma de CysS (dímero de Cys). La dieta T1 aparece en la Tabla 8 con otro nombre (TB1). 128 DIETAS T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18 Caseína - - 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 Glutamina (Gln) 6.00 6.00 - - - - - 5.00 Leucina (Leu) 6.00 6.00 - - - - 2.50 2.50 Metionina (Met) 0.60 0.60 - - 0.50 0.50 - - Fenilalanina (Phe) 2.16 2.16 - - - - - - Histidina (His) 0.85 0.85 - - - - - - Lisina (Lys) 2.64 2.64 - - - - - - Treonina (Thr) 1.80 1.80 - - - - - - Isoleucina (Ile) 1.07 1.07 - - - - - - Valina (Val) 2.64 2.64 - - - - - - Triptófano (Trp) 0.24 0.24 - - - - - - Cistina (CysS) - - - 0.50 - 0.50 - - Arginina (Arg) 1.50 1.50 - - - - - - Glicina (Gly) 1.00 1.00 - - - - - - Serina (Ser) - - - - - - - - Tirosina (Tyr) - - - - - - - - Alanina (Ala) 1.00 1.00 - - - - - - Aspartato (Asp) 2.00 2.00 - - - - - - Prolina (Pro) - - - - - - - - Asparagina (Asn) - - - - - - - - Glutamato (Glu) - - - - - - - - Aceite de oliva 5.00 25.00 - - - - - - Aceite de salmón - - 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 Colina 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 Vitamin Mix 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 Mineral Mix 3.50 3.50 3.50 3.50 3.50 3.50 3.50 3.50 Azúcar 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 Celulosa 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 Almidón de maíz 40.75 20.75 68.25 67.75 67.75 67.25 65.75 60.75 Total 100 100 100 100 100 100 100 100 Tabla 7. Composición detallada de las dietas del Capítulo II (2ª parte): “Manipulation of Amino Acid Levels with Artificial Diets Induces a Marked Anticancer Activity in Mice with Renal Cell Carcinoma”. Cuando se añadió la Cys fue en forma de CysS (dímero de Cys). En las dietas T13 a T18 se añadió 0.0008% de terbutilhidroquinona como antioxidante. Las dietas T13 y T18 aparecen en otras tablas de dietas con otro nombre. La dieta T13 aparece en la Tabla 5 (TC6). La dieta T18 aparece en la Tabla 5 (TC5) y en la Tabla 9 (TC5). 129 DIETAS TB1 TB2 TB3 TB4 TB5 Caseína - - - 6.00 6 Glutamina (Gln) 6.00 6.00 6.00 5.00 5 Leucina (Leu) 6.00 6.00 6.00 - 5 Metionina (Met) 0.60 0.60 0.17 - - Fenilalanina (Phe) 2.16 2.16 0.61 - - Histidina (His) 0.85 0.85 0.24 - - Lisina (Lys) 2.64 2.64 0.72 - - Treonina (Thr) 1.80 1.80 0.56 - - Isoleucina (Ile) 1.07 1.07 0.30 - - Valina (Val) 2.64 2.64 0.72 - - Triptófano (Trp) 0.24 0.24 0.07 - - Cistina (CysS) - - - - - Arginina (Arg) - - - - - Glicina (Gly) - - - - - Serina (Ser) - - - - - Tirosina (Tyr) - - - - - Alanina (Ala) - - - - - Aspartato (Asp) - - - - - Prolina (Pro) - - - - - Asparagina (Asn) - - - - - Glutamato (Glu) - - - - - Aceite de oliva 14.00 1.00 - - - Aceite de coco - - 1.00 1.00 - Aceite de salmón - - - - 1.00 Colina 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 Vitamin Mix 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 Mineral Mix 3.50 3.50 3.50 3.50 3.50 Azúcar 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 Celulosa 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 Almidón de maíz 37.25 50.25 58.86 63.25 58.25 Total 100 100 100 100 100 Tabla 8. Composición detallada de las dietas del Capítulo III: “Artificial Diets with Selective Restriction of Amino Acids and Very Low Levels of Lipids Induce Anticancer Activity in Mice with Metastatic Triple-Negative Breast Cancer”. Cuando se añadió la Cys fue en forma de CysS (dímero de Cys). En las dietas TB2 a TB5 se añadió 0.0008% de terbutilhidroquinona como antioxidante. Las dietas TB1 y TB5 aparecen en otras tablas de dietas con otro nombre. La dieta TB1 aparece en la Tabla 6 (T1). La dieta TB5 aparece en la Tabla 5 (TC7). 130 DIETAS TC5 B1 B1A B1B B2 B2A B2B B1+Met B2B+Met Caseína 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 Glutamina (Gln) 5.0 - - - 5.0 5.0 5.0 - 5.0 Leucina (Leu) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 Cistina (CysS) - 0.2 0.2 - 0.2 0.2 - 0.2 - Taurina (Tau) - - 0.2 0.2 - 0.2 0.2 - 0.2 Metionina (Met) - - - - - - - 0.5 0.5 Aceite de salmón 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Colina 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 Vitamin Mix 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Mineral Mix 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 Azúcar 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 Celulosa 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 Almidón de maíz 65.55 64.95 60.55 60.05 60.75 65.55 64.95 60.55 60.05 Terbutilhidroquinona 0.0008 0.0008 0.0008 0.0008 0.0008 0.0008 0.0008 0.0008 0.0008 Total 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Tabla 9. Composición detallada de las dietas del Capítulo IV: “Artificial Diets with Altered Levels of Sulfur Amino Acids Induces Anticancer Activity in Mice with Metastatic Colon Cancer, Renal Cell Carcinoma and Ovarian Cancer”. Cuando se añadió la Cys fue en forma de CysS (dímero de Cys). La dieta TC5 aparece en las Tabla 5 (TC5) y en la Tabla 7 (T18). La dieta TC8 aparece en la Tabla 9 (B2). Por último, la dieta estándar usada como dieta control en todos los experimentos fue la misma que la usada por la empresa proveedora de los ratones (ssniff diet SM R/M-S E, 10 mm; V1724-000). Los ingredientes de esta dieta son trigo y derivados, soja y harina de soja, cebada, minerales, aceite de soja, gluten de maíz, levadura de cerveza y AAs. La composición de la dieta ssniff (para 100 g) es 21% de proteínas, 7.0% de grasas, 33.3% de almidón, 4.6% de azúcar, 4.0% de fibra, calcio 1.10%, fósforo 0.80 g, sodio 0.25 g, manganeso 0.20 g, potasio 0.94 g, hierro 17.6 mg, manganeso 6.4 mg, zinc 8.9 mg, cobre 1.6 mg, yodo 0.22 mg, selenio 0.03 mg, vitamina A 2,500 UI, vitamina D3 150 UI, vitamina E 13.5 mg, vitamina K 8 mg, tiamina 8.5 mg, riboflavina 3.2 mg, piridoxina 3.1 mg, cobalamina 0.015 mg, ácido nicotínico 14 mg, ácido pantoténico 5.9 mg, ácido fólico 1 mg, biotina 0.069 mg, colina cloruro 0.337 mg. La cantidad en de AAs en g (para 100 g) fue de: Gln + Glu: 4.38, Leu: 1.57, Met: 0.91, Phe: 0.99, His: 0.51, Lys: 1.66, Thr: 0.76, Ile: 0.89, Val: 0.98, Trp: 0.26, Cys/CysS: 0.38, Arg: 1.27, Gly: 0.88, Ser: 1.09, Try: 0.70, Ala: 0.37, Asp + Asn: 1.99, y Pro: 1.41. 131 5.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los resultados obtenidos en los experimentos in vitro se expresaron como la media de al menos tres experimentos independientes ± error estándar de la media (SEM). Para la determinación de la significación estadística in vitro, se utilizó la prueba de la t de Student (pareada, dos colas de distribución), la cual se calculó mediante el software Microsoft Excel. En algunos experimentos in vitro se realizó el análisis estadístico mediante la prueba no paramétrica Mann-Whitney U, la cual también se calculó mediante el software Microsoft Excel. Para los resultados en experimentos in vivo también se calculó la media ± SEM de los grupos de ratones. Los resultados de los experimentos in vivo se representaron mediante el programa GraphPad Prism versión 7.0. Las gráficas de supervivencia fueron representadas mediante las curvas de supervivencia Kaplan-Meier. El análisis estadístico de las gráficas Kaplan-Meier fue realizado calculando los valores de la prueba Gehan-Breslow-Wilcoxon (GBW test). El objetivo de estos análisis es calcular del valor P que permite determinar si la diferencia entre dos grupos de datos es estadísticamente significativa o no. Un valor de P > 0,05 no es considerado estadísticamente significativo y no se representa por ningún símbolo. Un valor de P < 0,05 es considerado estadísticamente significativo. Los valores entre 0,05-0,01 se representan con un asterisco (*), los valores entre 0,01-0,001 se representan con dos asteriscos (**), y los valores < 0,001 se representan con tres asteriscos (***). 132 133 6. RESULTADOS 134 135 6.1. CAPÍTULO I Dietas artificiales basadas en restricciones selectivas de aminoácidos versus capecitabina en ratones con cáncer de colon El cáncer de colon es uno de los cánceres más frecuentes [265]. Cuando el cáncer de colon está localizado en el tumor primario y no se ha diseminado las posibilidades de curación son altas. Sin embargo, aproximadamente el 20,9 % de los pacientes se diagnostican con cáncer de colon metastásico [266]. Cuando el cáncer de colon está diseminado la supervivencia de los pacientes cae dramáticamente, siendo la supervivencia a los 5 años de los pacientes con cáncer de colon en estadio IV de apenas un 14,7 % [267]. La farmacoterapia es la principal forma de tratamiento del cáncer de colon metastásico, incluyendo fármacos quimioterápicos como el 5-FU, la capecitabina, el oxaliplatino y el irinotecán. Además, en los últimos años se han añadido inhibidores del EGFR y de la angiogénesis. La inmunoterapia también se está usando con éxito en algunos subtipos de cáncer de colon con inestabilidad genómica [268]. Estos fármacos han mejorado la supervivencia de los pacientes, pero rara vez consiguen curar a los pacientes con enfermedad metastásica. La principal limitación de los fármacos anticancerosos disponibles es su limitada selectividad contra las células cancerosas. Es decir, las dosis necesarias para eliminar a las células cancerosas también dañan a las células normales. Es fundamental encontrar diferencias entre las células cancerosas y las células normales que puedan ser aprovechadas para desarrollar tratamientos más selectivos [9]. Las alteraciones en el metabolismo de AAs de las células de cáncer de colon pueden ser utilizadas para desarrollar tratamientos selectivos. La restricción dietética y farmacológica de los AAs azufrados Met y Cys han mostrado tener actividad antitumoral en cáncer de colon [143,147,190,269,270]. La restricción de Ser y Gly, que participan en la síntesis de nucleótidos, también ha mostrado actividad en cánceres intestinales [208,212,214–216,219]. Además, la modulación de la Arg ha mostrado efectos anticancerosos en modelos de cáncer de colon [171,173,243]. En general, la restricción dietética de AAs es una estrategia prometedora para tratar el cáncer de colon. A continuación, se comenta y adjunta el artículo titulado “Artificial Diets Based on Selective Amino Acid Restriction versus Capecitabine in Mice with Metastatic Colon Cancer”, el cual se encuentra publicado en la revista Nutrients (2022) [11]. En este trabajo, en lugar de restringir un AA en particular, lo que se hizo fue crear cambios importantes en los niveles y ratios de AAs, restringiendo algunos AAs mientras que otros AAs se mantenían o suplementaban. De esta forma se crearía un ambiente metabólico desfavorable para las células cancerosas [2]. Esta estrategia se evaluó en modelos preclínicos de cáncer de colon, siguiendo una estrategia orientada a pacientes. Primero, se determinó la selectividad in vitro, y después se evaluó la supervivencia in vivo, comparándose en ambos casos con el tratamiento estándar en el cáncer de colon [9]. En primer lugar, se demostró que un medio de cultivo restringido en 10 AANEs tenía una mayor selectividad que el fármaco 5-FU en modelos in vitro. Para ello, se utilizaron células 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 270 También se evaluaron 6 dietas artificiales (dietas T13-T18), todas ellas formuladas con un 6% de caseína para limitar especialmente los AAs azufrados Cys y Met. Además, también se limitó la cantidad de lípidos en la dieta, usando un 1% de aceite de salmón para asegurar la ingesta adecuada de ácidos grasos esenciales. A estas dietas se les añadieron distintos niveles de Cys, Met y Leu, para comprobar el efecto de estos AAs en la progresión del cáncer renal. Las dietas T14, T17 y T18 mostraron actividad anticancerosa. En los resultados se observó que la suplementación de las dietas con 0,5% de Met (dietas T15 y T16) bloqueó por completo la actividad anticancerosa, lo cual sugiere que la restricción de Met es fundamental en el modelo de cáncer renal. La Met es un AAE importante para el cáncer al regular el ciclo celular, la epigenética y participar en la síntesis de poliaminas [124]. Sin embargo, únicamente la restricción de Met no era suficiente para la actividad, porque la dieta T13 (deficiente en Met) mostró escasa actividad anticancerosa. La dieta T14 (6% de caseína con 0,5% Cys) tenía mayor actividad anticancerosa que la dieta T13 (6% caseína, sin suplementar Cys), lo cual sugiere que la suplementación en Cys mejoraría la actividad anticancerosa de las dietas formuladas con un 6% de caseína contra el cáncer renal (al contrario de lo que pasaba con la dieta T2). Además, la suplementación con el Leu también mejoraba la actividad de las dietas, debido a que la dieta T17 (6% caseína con 2,5% Leu) mostró mayor actividad anticancerosa que la dieta T13 (6% caseína, sin suplementar Leu), algo similar a lo que se observó en el modelo de cáncer de colon [11]. La Leu es capaz de activar mTORC1 [233] e inhibir la autofagia y proteólisis [233,271,272], lo cual podría reforzar la restricción de AAs creada por la dieta artificial. Por último, también se evaluó la dieta T18, que previamente mostró actividad en ratones con cáncer de colon metastásico (dieta TC5; 6% caseína, 2,5% Leu, 5% Gln) [11], consiguiendo también actividad anticancerosa en el modelo de cáncer renal. Es importante señalar que algunas de las dietas activas tenían composiciones nutricionales muy diferentes. Por ejemplo, la dieta T2, la más activa contra el cáncer renal, estaba restringida en 6 AANEs (incluyendo la Cys), contenía niveles altos de AAEs (incluyendo la Met), y presentaba niveles altos de lípidos. En cambio, la dieta T14, que también fue activa en cáncer renal, presentaba niveles bajos de Met, no estaba restringida en Cys y tenía niveles muy bajos de lípidos. Ambas dietas, T2 y T14, fueron eficaces contra el cáncer renal, pero la muy diferente composición de estas dos dietas sugiere que sus actividades anticancerosas no estarían causadas por el mismo mecanismo de acción. En el Capítulo III se muestran los resultados en cáncer de mama, publicados en el artículo “Artificial Diets with Selective Restriction of Amino Acids and Very Low Levels of Lipids Induce Anticancer Activity in Mice with Metastatic Triple-Negative Breast Cancer” [13]. En primer lugar, se confirmó que el medio M1 (restringido en 10 AANEs; el mismo que en los Capítulos I y II) inducía citotoxicidad selectiva contra las células de cáncer de mama TN humanas y murinas. Posteriormente, se evaluó la dieta TB1 (deficiente en 10 AANEs, equivalente al medio M1) en un modelo de cáncer de mama TN metastásico, mostrando una moderada actividad anticancerosa. Otros estudios previos han demostrado actividad anticancerosa contra el cáncer de mama mediante la restricción dietética o enzimática de algunos AANEs, incluyendo Cys [193], Arg [172,297], Asn [65,168,296], Ser y Gly [211]. En 271 cambio, en lugar de restringir un único AANE para atacar un determinado defecto metabólico del cáncer, la dieta TB1 estaba restringida simultáneamente en 10 AANEs. Las alteraciones en el metabolismo lipídico del cáncer de mama podrían utilizarse para mejorar la actividad anticancerosa de las dietas artificiales. Se ha demostrado que las dietas altas en grasa aceleran la progresión del cáncer de mama en ratones [304–307] y pacientes [308,309]. Por esa razón, se redujo el nivel de lípidos en la dieta desde el 14% de la dieta TB1 al 1% en la dieta TB2, consiguiendo mejorar notablemente la supervivencia de varios ratones. Se ha demostrado que limitar los niveles de algunos AAEs reduce el crecimiento del cáncer de mama en ratones [113], en particular la restricción de Met ha mostrado actividad anticancerosa en modelos animales de cáncer de mama TN [128,139,142,299]. En consecuencia, se creó la dieta TB3, equivalente a la dieta TB2, pero con menores niveles de todos los AAEs (excepto Leu). Mantener los niveles de Leu altos podría prevenir la proteólisis [2,339]. Además, la dieta TB3 se formuló con un 1% de aceite de coco, reduciendo todo lo posible los niveles de ácidos grasos monoinsaturados, que podrían prevenir la muerte de las células cancerosas por ferroptosis [340]. La dieta TB3 consiguió una marcada supervivencia en ratones con cáncer de mama TN metastásico, superando el efecto anticanceroso del fármaco capecitabina. Además, esta dieta consiguió una actividad anticancerosa de amplio espectro, no limitándose únicamente contra el cáncer de mama, al mostrar actividad en ratones con cáncer de colon, pulmón, melanoma y ovario. En definitiva, estos resultados indican que la manipulación de AAs y los niveles de lípidos en la dieta puede ser una estrategia útil contra el cáncer de mama TN metastásico y otros tipos de cánceres diseminados. Por último, en el Capítulo IV se continuó explorando la actividad anticancerosa de dietas deficientes en Met en varios modelos animales de cánceres metastásicos, mostrados en el artículo en fase de revisión titulado “Artificial Diets with Altered Levels of Sulfur Amino Acids Induces Anticancer Activity in Mice with Metastatic Colon Cancer, Renal Cell Carcinoma and Ovarian Cancer” [14]. Se comenzó evaluando en un modelo de cáncer de ovario diseminado la dieta TC5 (6% caseína, 4% Gln, 2,5% Leu, 1% aceite de salmón), que previamente había mostrado actividad anticancerosa en modelos animales de cáncer de colon (dieta TC5) y cáncer renal metastásicos (dieta T18) [11,12]. La dieta TC5 mostró actividad anticancerosa en ratones con cáncer de ovario sin inducir una pérdida de peso significativa en los ratones. Estos resultados confirman que la dieta TC5 presenta una actividad anticancerosa contra varios tipos de cáncer. La restricción en Met induce actividad anticancerosa in vivo [11,12,143–146,148,321]. Se sabe que la Met es precursora de los AAs Cys y Tau, pero no está claro el papel de estos AAs en la actividad anticancerosa de las dietas restringidas en Met. La restricción en Met reduciría los niveles de Cys y Tau, lo cual podría inducir efectos positivos en la actividad anticancerosa de las dietas restringidas en Met, como la reducción en los niveles de GSH y la generación de niveles citotóxicos de EROs en las células cancerosas. Sin embargo, la Cys y Tau también tienen funciones biológicas importantes. Por ejemplo, el H2S y la Tau, dos 272 moléculas derivadas del metabolismo de la Met y Cys, son necesarias para la correcta función de las células del sistema inmune [341,342], y se ha observado que la restricción en Cys reduce en los niveles de H2S y bloquea la correcta inmunidad antitumoral en ratones con cáncer [343]. Si la Met es directamente responsable de la acción anticancerosa de las dietas deficientes en Met, la restricción en Cys y Tau podrían estar limitando la actividad de estas dietas, por ejemplo, induciendo citotoxicidad no selectiva o alterando la respuesta antitumoral del sistema inmune. Por esa razón, se realizó un screening con 6 dietas deficientes en Met basadas en la dieta TC5, pero suplementadas con Cys y/o Tau. Este screening reveló que todas estas dietas deficientes en Met presentaban actividad anticancerosa en un modelo de cáncer de ovario diseminado. Las dietas B1 (6% caseína, 2,5% leu, 0,2% Cys) y B2B (6% caseína, 5% Gln, 2,5% Leu, 0,2% Tau) fueron las que mostraron mayor actividad anticancerosa. Sorprendentemente, la suplementación de Met a la dieta B2B redujo ligeramente pero no bloqueó la actividad de la dieta B2B, indicando que la restricción en Met parece no ser necesaria para la actividad anticancerosa de estas dietas artificiales. La actividad de estas dietas artificiales en este modelo animal podría deberse a la baja cantidad de proteína (6% caseína) o lípidos (1% aceite de salmón) presentes en estas dietas. Un experimento con un mayor número de ratones confirmó que las dietas B1 y B2B inducían una significativa actividad anticancerosa contra el cáncer de ovario en ratones. La actividad de las dietas B1 y B2B fue evaluada en otros modelos de cáncer. Las dietas B1 y B2B mostraron una moderada actividad anticancerosa en el modelo de cáncer renal diseminado. Sin embargo, ambas dietas fueron menos activas que el fármaco sunitinib, uno de los fármacos de primera elección en el tratamiento del cáncer renal [279], y también fueron menos efectivas que otras dietas artificiales con niveles alterados de AAs evaluadas previamente en el Capítulo II de esta tesis [12]. Las dietas B1 y B2B también mejoraron la supervivencia de los ratones en dos modelos de cáncer de colon metastásico. La actividad de la dieta B1 fue superior a la B2B en ambos modelos de cáncer de colon. En el modelo de cáncer de colon con metástasis pulmonar la dieta B1 tuvo una actividad similar al fármaco capecitabina. En el modelo de cáncer de colon con diseminación pulmonar la dieta B1 mejoró significativamente la supervivencia de los ratones, superando al fármaco capecitabina. Además, un ratón tratado con la dieta B1 en cada uno de los dos modelos de cáncer de colon metastásico no desarrolló signos de cáncer. Ambas dietas, B1 y B2B, fueron bien toleradas por los ratones e indujeron una menor pérdida de peso que los ratones tratados con capecitabina. Adicionalmente, la suplementación en Met bloqueó la actividad anticancerosa de las dietas B1 y B2B contra el cáncer de colon, indicando que la restricción en Met es imprescindible para la actividad anticancerosa de estas dietas contra el cáncer de colon. En definitiva, la dieta B1 mostró actividad anticancerosa contra ambos modelos de cáncer de colon metastásico, siendo comparable su actividad a la previamente conseguida por la dieta TC5 en este cáncer [11]. Se ha intentado averiguar el mecanismo de acción por cual estas dietas consiguen actividad anticancerosa. Nuestros experimentos in vitro mostraron que los medios sin Cys eran eficaces, mientras que los medios con Cys eran menos potentes y selectivos [12]. Esto 273 indicaría que la restricción en Cys es fundamental para conseguir la citotoxicidad selectiva in vitro. Se sabe que la Cys es el nutriente limitante para la síntesis de GSH [186,187], el cual es la molécula antioxidante más importante de las células, neutralizando directamente con su grupo tiol las EROs [54]. Por lo tanto, restringir Cys aumenta los niveles de EROs, consiguiendo de esta forma eliminar selectivamente a las células cancerosas [188]. Sin embargo, estos resultados in vitro podrían ser un artefacto experimental debido principalmente a dos motivos: La primera razón es que en condiciones in vitro las células están expuestas a niveles mucho mayores de oxígeno (21%) y EROs que las células en un organismo vivo [248]. La segunda razón es que la ausencia completa de los AAs restringidos (ej: Cys) que se simulaba con nuestros medios artificiales no se podrían conseguir in vivo (la proteólisis muscular y hepática liberara AAs impidiendo que los niveles plasmáticos de AAs bajen bruscamente, mientras que en nuestros medios artificiales los niveles de algunos AAs son cercanos a 0 mg/L). Por lo tanto, dado que el ambiente metabólico de las células en condiciones in vitro e in vivo es muy diferente, se realizaron experimentos in vivo para tratar de encontrar el mecanismo de acción de nuestras dietas. En experimentos in vivo se observó que la suplementación en Cys reducía la actividad de la dieta T2 (restringida en 6 AANEs), la dieta más activa contra el cáncer renal, lo que apoyaba el mecanismo de acción propuesto en los modelos in vitro. Sin embargo, también se comprobó que la presencia de Cys no inactivaba la actividad anticancerosa de algunas dietas activas formuladas con un 6% de caseína. De hecho, se demostró que la suplementación en Cys era necesaria para la actividad de algunas dietas artificiales contra el cáncer renal [12]. Se prepararon numerosas dietas encaminadas a entender su mecanismo de acción, en las que se iban añadiendo o eliminando distintos AAs. Estos experimentos revelaron que la presencia o ausencia de un AA particular podía tener un efecto positivo o negativo en la actividad de la dieta dependiendo de la presencia de otros AAs y de otros componentes como los lípidos [11–13]. Esta conclusión sobre el mecanismo de acción es muy importante, porque previamente se había considerado que la presencia o ausencia de un AA es lo que explicaba la actividad anticancerosa de las intervenciones dietéticas contra el cáncer. Sin embargo, estos resultados indican que lo importante para conseguir actividad anticancerosa es la composición global de la dieta, y no los niveles de un AA particular, como siempre se ha considerado hasta ahora. El mecanismo molecular por el que estas dietas con composiciones muy distintas inducen una actividad anticancerosa similar en animales con cánceres metastásicos es desconocido y será difícil de entender por los siguientes motivos. La primera razón es porque esta estrategia terapéutica no utiliza ningún fármaco. Cuando se investiga el mecanismo de acción de un fármaco, lo habitual es estudiar la interacción química o física entre el fármaco y su potencial diana terapéutica. Sin embargo, dado que estas terapias no utilizan ningún fármaco, no es posible evaluar esta interacción con la posible diana terapéutica [12]. Además, esta estrategia anticancerosa está basada en la alteración de los niveles de muchos nutrientes simultáneamente, lo cual dificultaría entender el mecanismo de acción. Se podrían haber tomado muestras de sangre, realizado análisis proteómicos y metabolómicos 274 de muestras de tumores y tejidos sanos, para así obtener información relevante sobre los cambios biológicos inducidos por determinadas dietas artificiales. Al comparar los cambios inducidos en muestras de tejidos sanos y tumores se podría haber averiguado porque esta estrategia terapéutica consigue actividad anticancerosa sin causar toxicidad en los tejidos sanos [12]. Sin embargo, es muy importante tener en cuenta que se obtuvo actividad anticancerosa con dietas de muy diferente composición nutricional. Por ejemplo, dos dietas de muy diferente composición consiguieron actividad en ratones con cáncer renal metastásico: la dieta T2 (restringida en Cys, con niveles altos de AAEs incluyendo Met y niveles altos de lípidos) y la dieta T14 (suplementada en Cys, con niveles bajos de AAEs incluyendo Met y niveles bajos de lípidos) [12]. Las diferentes composiciones nutricionales de estas dietas producirían diferentes cambios metabólicos y proteómicos en las muestras de tejidos. Esto significaría que la actividad anticancerosa de esta estrategia terapéutica no puede ser atribuida a un particular cambio biológico. Encontrar cambios biológicos comunes inducidos por dietas artificiales con composiciones muy diferentes, y explicar cómo esos cambios afectan al crecimiento tumoral sin afectar a los tejidos normales, sería una tarea de elevada complejidad y que requería años para realizarse. Una vez se observó que esta estrategia anticancerosa presentaba potencial terapéutico suficiente para evaluarse en pacientes con cáncer metastásico, y tras decidir llevar a cabo un ensayo clínico piloto en pacientes oncológicos, se consideró que era mejor estudiar los efectos de las dietas en pacientes. En personas se pueden obtener mayores muestras sanguíneas, permitiendo determinar un mayor número de parámetros metabólicos, estas muestras se pueden tomar en diferentes momentos, y además se obtendrá una información mucho más relevante. Ahora mismo varios pacientes con cánceres metastásicos avanzados han sido tratados con una de nuestras dietas artificiales en monoterapia. En los pacientes, además de realizar técnicas de imagen (PET-TAC) y medir marcadores tumorales específicos para detectar la evolución de los tumores, también se les están realizando los análisis de sangre estándar y análisis específicos para poder elucidar los cambios metabólicos inducidos por nuestras dietas artificiales. 275 276 7. CONCLUSIONES / CONCLUSIONS 277 278 CONCLUSIONES 1. Se realizó un análisis bibliográfico recopilando la evidencia científica sobre la manipulación de AAs en la dieta buscando conseguir actividad anticancerosa. La restricción, limitación o suplementación en la dieta de ciertos AAs ha mostrado actividad anticancerosa en modelos animales de cáncer. Sin embargo, esta revisión bibliográfica mostró que no había estudios sobre restricción de AAs que consiguiesen aumentar la supervivencia en animales con cánceres metastásicos y superar la eficacia conseguida con los tratamientos empleados en pacientes con cánceres metastásicos. 2. Se evaluó las restricciones selectivas de AAs en ensayos in vitro, y en dos modelos in vivo de cáncer de colon metastásico. Las dietas TC1 (restringida en 10 AANEs) y TC5 (6% de caseína, 5% de Gln y 2,5% Leu) mejoraron la supervivencia de los ratones en ambos modelos, y varios ratones sobrevivieron el tratamiento. La dieta TC5 incluso superó la actividad anticancerosa del fármaco capecitabina. La suplementación en Cys bloqueaba la actividad de las dietas TC1 y TC5, pero controlar los niveles de Leu y Gln también era necesario para conseguir la actividad anticancerosa. Estos resultados sugieren que las dietas artificiales basadas en restricciones selectivas de AAs tienen potencial terapéutico en cáncer de colon. 3. Se estudió la manipulación de los niveles de AAs en cáncer renal. Tras observar selectividad anticancerosa in vitro, se evaluaron 18 dietas artificiales en un modelo de cáncer renal diseminado. La sustitución de la dieta estándar por algunas de nuestras dietas artificiales mejoró la supervivencia de los ratones. La dieta T2 (restringida en 6 AANEs) mostró una mayor actividad anticancerosa que los fármacos sunitinib y anti-PD-1, e incluso varios ratones tuvieron supervivencias largas o fueron curados. Controlar los niveles de varios AAs (ej: Cys, Met, Leu) y lípidos es importante para la actividad anticancerosa de las dietas. Además, la dieta T18 (idéntica a la TC5) también mostró actividad anticancerosa en cáncer renal. 4. Esta estrategia anticancerosa también se evaluó en modelos in vitro y en un modelo animal de cáncer de mama TN metastásico. La manipulación de los niveles de AAs mejoró moderadamente la supervivencia de los ratones cuando los niveles de lípidos eran normales. Reducir los niveles de lípidos al 1% mejoraba la actividad anticancerosa de las dietas con niveles manipulados de AAs. Varias dietas artificiales mostraron una mayor actividad anticancerosa que los fármacos doxorrubicina y capecitabina. La dieta TB3 (restringida en 10 AANEs, con niveles bajos de AAEs y 1% de lípidos) mejoró la supervivencia de los ratones con cáncer de mama TN y otros tipos de cánceres metastásicos. La manipulación de los niveles de AAs y lípidos tiene potencial terapéutico contra el cáncer metastásico. 279 5. La actividad anticancerosa de la dieta TC5 (6% caseína, 5% Gln, 2,5% Leu) también se confirmó en un modelo de cáncer de ovario diseminado. Se realizó un estudio in vivo para evaluar la actividad anticancerosa de varias dietas restringidas en Met suplementadas con Cys y/o Tau. Las dietas B1 (6% caseína, 2,5% Leu, 0,2% Cys) y B2B (6% caseína, 5% Gln, 2,5% Leu, 0,2% Tau) fueron las dietas más activas en el modelo de cáncer de ovario. Además, las dietas B1 y B2B también mostraron actividad anticancerosa en el modelo de cáncer renal diseminado y en los dos modelos de cáncer de colon metastásico. La actividad de la dieta B1 en cáncer de colon metastásico fue comparable a la conseguida por la dieta TC5. Estos resultados indican que la manipulación de los niveles de AAs azufrados en la dieta puede ser estrategia útil para el tratamiento del cáncer metastásico. 6. Las conclusiones anteriores sugieren que es posible superar la eficacia de los tratamientos empleados en pacientes con cánceres metastásicos mediante dietas artificiales en las que se han manipulado los niveles de AAs y otros nutrientes. Estas dietas artificiales conseguirían crear un ambiente metabólico en el que la proliferación y supervivencia de las células cancerosas se ve comprometida. En definitiva, estos resultados apoyan la evaluación de esta novedosa estrategia terapéutica en ensayos clínicos. 286 15. López-Lázaro, M. The Stem Cell Division Theory of Cancer. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2018, 123, 95–113, doi:10.1016/j.critrevonc.2018.01.010. 16. Guan, X. Cancer Metastases: Challenges and Opportunities. Acta Pharm. Sin. B 2015, 5, 402–418, doi:10.1016/j.apsb.2015.07.005. 17. National Cancer Institute What Is Cancer? Available online: https://www.cancer.gov/about-cancer/understanding/what-is-cancer (accessed on 31 October 2022). 18. Vogelstein, B.; Kinzler, K.W. The Path to Cancer — Three Strikes and You’re Out. N. Engl. J. Med. 2015, 373, 1895–1898, doi:10.1056/nejmp1508811. 19. Vogelstein, B.; Kinzler, K.W. Cancer Genes and the Pathways They Control. Nat. Med. 2004, 10, 789–799, doi:10.1038/nm1087. 20. 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