Biomateriales nanoporosos ordenados y su funcionalidad como matriz biomimética administradora de iones terapéuticos para aplicación en regeneración tisular

Biomateriales nanoporosos ordenados y su funcionalidad como matriz biomimética administradora de iones terapéuticos para aplicación en regeneración tisular Memoria Presentada por: Lilian Beatriz Romero Sánchez Para optar al grado de: Doctor en Química Dirigida por: Dra. María Aránzazu Díaz Cuenca Tutor: Dr. Alfonso Caballero Martínez Departamento de Química Inorgánica Universidad de Sevilla Instituto de Ciencia de Materiales CSIC-US Sevilla, 2017 AGRADECIMIENTOS Durante estos 4 años son muchas las personas e instituciones que han participado en este trabajo y a quienes quiero expresar mi gratitud por el apoyo que me han prestado de forma desinteresada. En primer lugar quiero agradecer a mi Directora de Tesis, la Dra. Aránzazu Díaz Cuenca, por haber confiado en mí, por su enorme contribución a mi crecimiento personal y profesional, por su paciencia ante mis inconsistencias, por su valiosa e indispensable dirección para seguir este arduo camino de la Tesis y llegar a la conclusión del mismo. Tu dedicación, determinación y excelencia profesional han sido fuente inagotable de motivación durante este tiempo. Debo un reconocimiento especial al Instituto de Ciencia de Materiales de Sevilla por su acogida y el apoyo recibido durante los largos y fructíferos períodos que he desarrollado en ellos mi labor investigadora. Muchas gracias al Profesor Dr. Alfonso Caballero por haber aceptado ser el tutor de esta Tesis Doctoral y por la amabilidad con la siempre me ha tratado. Extiendo el agradecimiento al Departamento de Química Inorgánica de la Universidad de Sevilla por aceptarme en el Programa de Doctorado de Ciencia y Tecnología de Nuevos Materiales, así como a sus servicios técnicos (CITIUS). También quiero agradecer el apoyo y medios recibidos durante mi estancia en el Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología y al Departamento de Biología Molecular y Bioquímica de la Universidad de Málaga. Gracias a todo el equipo y especialmente al Dr. Manuel Marí Beffa, por su infinita disposición, enseñanzas y aportaciones, al Profesor Dr. Miguel Ángel Medina y a la Lic. Paloma Carrillo Fernández por su importante colaboración, que sin duda contribuyeron a la realización de este trabajo de Tesis. Asimismo, mi más profundo agradecimiento al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la ayuda económica brindada durante todo el proceso de formación doctoral y por hacer posible esta experiencia de vida. Quiero extender mi agradecimiento a mis compañeras de laboratorio con las cuales he compartido incontables horas de trabajo y buenos ratos, que no tienen precio. Gracias Lourdes y Sara, por sus consejos y disposición a ayudarme en los aspectos intelectuales, por el respaldo y la amistad que siempre he recibido de ustedes. Muchas gracias por las constantes palabras de ánimo e incontables muestras de apoyo. Su entrega y dedicación en el trabajo siempre ha sido una inspiración. También me complace extender este agradecimiento a Mari Carmen, su persona tiene la capacidad de armonizar las responsabilidades laborales y el buen humor, gracias por aguantarme y escucharme. A José Carlos, por su eficiencia y amabilidad. Gracias por ayudarme a la resolución de problemas informáticos entre otros. No quiero dejar de agradecer a mis compañeros de la caracola. A Vicky y Nuria, gracias por su ejemplo de continuo esfuerzo y coraje. Y a Mariana, por el buen ánimo que siempre le acompaña y por compartir conmigo alegrías y tristezas. También quiero agradecer a esas amistades que han ido floreciendo con el paso de los días en los pasillos del instituto, aunque no aparecen aquí con nombres y apellidos, les agradezco a todos que siempre tuvieran una palabra de aliento y una sonrisa para mí. Muchas gracias a mi queridísima familia, mis hermanos Arturo y Abigail y especialmente a mi madre Ana, que aunque nos separan miles de kilómetros ha sabido hacerse presente en los buenos y en los malos momentos. Mamá, muchas gracias por tu incondicionalidad conmigo, por apoyar cada sueño, cada locura, por animarme a seguir siempre a adelante, por tu comprensión y por la ternura con la que siempre me has cobijado. Te quiero y te agradezco que me hayas enseñado a esforzarme por ser mejor persona, tú eres sin duda la mejor que conozco. A mi padre también quiero agradecer, que aun en su muerte sigue siendo un referente personal. Espero, de igual forma, transmitir tu legado: sencillez, esfuerzo y coherencia. Gracias familia, esto también es vuestro trabajo. También quiero agradecer a mí otra familia, mis amigos que han sabido disculpar mis ausencias y siempre han tenido una palabra de ánimo. Ruth y Lady, cómplices de otros tiempos, otras curas, otros ritmos y lugares. Gracias Ruth, por tu constante cuidado y por creer en mí. A Lady por su inmensa ilusión en que este trabajo saliese adelante, por todas las aventuras compartidas y por todas las muestras de cariño que has tenido conmigo. A María, Miguel, Doña Andrea, Youssef, Laura y José Luis, se merecen muchas y buenas palabras, sin excepción. A mis queridísimas amigas Andrea y Miriam, porque han hecho de mi estancia en Sevilla una vivencia inolvidable. Gracias por abrirme las puertas de sus hogares y de su vida, por compartirme a su propia familia y amigos. Con todos ustedes he vivido un encuentro de amistad permanente, su cercanía, sincera amistad, y los simpáticos e inolvidables momentos que vivimos me hacen sentirme muy afortunada. Gracias por cada cerveza en el Puma después de un día intenso de trabajo, por los apapachos, por las parrandas, por cada viaje, por los consejos y cada una de las carcajadas compartidas. Reconozco públicamente, todas las lecciones que me impartís de forma gratuita y sin condiciones. Os reconozco uno por uno y gracias. En particular, quiero expresarle mi gratitud a Javi, por hacer que la escritura de esta Tesis haya sido mucho más llevadera en estos últimos meses tan cargadísimos de actividades y compromisos. No alcanzan las palabras para agradecer tu compañía irremplazable, tus palabras de consuelo y por compartir conmigo cada esfuerzo. Admiro tu constancia, tu carácter y la forma en que enfrentas el día a día. Muchas gracias por hacerme sentir querida y por recordarme cada día lo privilegiada que soy. Eres lo más bonito que me ha pasado en la vida. A todos vosotros, mi mayor reconocimiento y gratitud. No acaba aquí la historia. Esto es solo una pequeña pausa para que descansemos… Entreacto, Ángel González ÍNDICE Capítulo 1. Introducción general 1. Antecedentes.…………………………………………………………………… 1 1.1. Evolución histórica de los biomateriales…………………………….. 2 1.2. Requerimientos de los biomateriales………………………………… 3 1.3. Clasificación de los biomateriales……………………………………. 4 1.3.1. Materiales metálicos……………………………………….. 5 1.3.2. Materiales poliméricos…………………………………….. 5 1.3.3. Materiales cerámicos………………………………………. 6 1.4. Vidrios bioactivos (BG)……………………………………………… 7 1.5. Concepto de bioactividad…………………………………………… 10 2. Vidrios bioactivos nanoporosos ordenados (MBG)…………………………… 12 2.1. Rango composicional y respuesta bioactiva de material MBG en el sistema SiO2-CaO-P2O5………………………………………………… 15 3. Motivación, objetivos y estructura del Trabajo de Tesis……………………… 19 4. Referencias…………………………………………………………………….. 22 Capítulo 2. Estructuras matriz biomiméticas 1. Introducción…………………………………………………………………….29 1.1. Tejido óseo…………………………………………………………...30 1.2. Remodelación ósea…………………………………………………. 36 1.3. Mecanismos de regeneración ósea………………………………….. 38 1.4. Terapias para la reparación de defectos óseos……………………… 40 1.5. Ingeniería tisular……………………………………………………. 42 Capítulo 1 2 adecuados para aplicación médica eran aquellos materiales considerados inertes que cumplían con unos requisitos mínimos de compatibilidad biológica. En la actualidad los biomateriales son diseñados, sintetizados y procesados para que tengan una respuesta específica una vez en contacto con un tejido u órgano. Esto implica una intensa colaboración multidisciplinar entre investigadores en Ciencia de Materiales, Bioingeniería, Biotecnología, Medicina Clínica y otras disciplinas de ciencias básicas como la Química, Física y Biología. 1.1. Evolución histórica de los biomateriales La evolución de los biomateriales durante las últimas décadas se ha descrito en base a tres “generaciones” atendiendo al tipo de propiedades y funcionalidad conseguida. La primera generación de biomateriales para su implantación en sistemas vivos se refiere a los materiales desarrollados en los años 60 y 70. El objetivo de los primeros biomateriales era “alcanzar una combinación adecuada de propiedades físicas para reemplazar las del tejido sustituido con una respuesta tóxica mínima del receptor”4. Para esto se buscaba que los materiales fueran inertes al ser implantados en el cuerpo con el fin de reducir la respuesta inmune y/o reacciones a cuerpo extraño. En este sentido, los biomateriales de primera generación se caracterizaban por ser bioinertes, es decir, que la respuesta del material en contacto con el tejido vivo era casi nula. Como consecuencia de ello, se formaba una capa de tejido fibroso que comprometía la interacción y fijación implante-tejido. En los años setenta surgieron materiales que interactuaban de manera activa en el entorno biológico favoreciendo la integración del biomaterial y creando una Introducción general 3 interfaz continúa implante-tejido, así como la propiedad de experimentar fenómenos de degradación progresiva en presencia de fluidos corporales, mientras el nuevo tejido se regeneraba y cicatrizaba. Estos materiales son considerados bioactivos y bioreabsorbibles5. Para la tercera generación se consideran aquellos materiales que buscan favorecer la regeneración de tejido, mediante estímulos a nivel celular y molecular, y mientras se combinan las propiedades de bioreabsorbabilidad y bioactividad4. 1.2. Requerimientos de los biomateriales Cualquier biomaterial, para poder ser implantado en el cuerpo humano, debe cumplir unos requisitos generales que se engloban en el concepto de biocompatibilidad. En este concepto se aúna la capacidad de un biomaterial para realizar la función deseada con respecto a una terapia médica, sin provocar ningún efecto local o sistémico indeseable en el receptor, al mismo tiempo que se genera una respuesta celular o tisular adecuada que mejore la patología específica6. En este sentido, el biomaterial debe cumplir unos requisitos que se pueden resumir en los siguientes puntos: 1) Ser biocompatible, aceptado por el organismo receptor, y no provocar que éste desarrolle mecanismos de rechazo ante la presencia del biomaterial. 2) No ser tóxico ni cancerígeno. 3) Ser químicamente estable o biodegradable en productos no tóxicos. 4) Mantener sus propiedades mecánicas y estructura físico-química en el entorno biológico durante el tiempo que deba permanecer íntegro en el organismo. 5) Su diseño, tamaño y forma como implante deben ser los adecuados según la terapia a la que se destine su uso. Capítulo 1 4 Sin embargo, los requisitos específicos de los biomateriales dependerán de la función que deba desempeñar, así como de la aplicación terapéutica concreta para el que va a ser introducido en el organismo. Teniendo en cuenta la complejidad de las reacciones tisulares y del entorno fisiológico, la diversidad de biomateriales, y la gran variedad de sus aplicaciones, la biocompatibilidad de los materiales debe evaluarse de forma particular y concreta para la función para la que hayan sido concebidos y diseñados. 1.3. Clasificación de los biomateriales La materiales de uso biomédico pueden tener un origen artificial (sintéticos) o natural (biológicos). La Figura 1.1. presenta un esquema con una clasificación de los tipos de materiales para uso biomédico. Figura 1.1. Esquema de la clasificación y aplicación de los biomateriales según su origen y naturaleza. BIOMATERIALES Naturales Biopolímeros Tejidos blandos Colágeno, celulosa, quitosano Cerámicos Tejidos duros Carbonato cálcico, cáscara de huevo Sintéticos Metales Tejidos duros Aceros, aleaciones de titanio Polímeros Tejidos blandos y duros Poliéster, Polipropileno, Polietileno Cerámicos Tejidos duros Alúminas, zirconia, hidroxiapatita, biovidrios Introducción general 5 1.3.1. Materiales metálicos Los metales son sólidos inorgánicos particularmente útiles en aplicaciones estructurales o de carga. Como biomateriales destaca su uso con dos propósitos: fabricación de prótesis para reemplazar una parte del cuerpo (articulaciones, placas craneales, clavos), o implantes utilizados en la estabilización y ayuda al proceso normal de reparación de un tejido (por ejemplo, unión de huesos rotos). Como características generales, presentan buenas conductividades térmicas y eléctricas, alta resistencia mecánica, elevada rigidez, ductilidad y conformabilidad5,7. Una limitación de estos materiales es su reactividad superficial en medios húmedos con concentración de sales que puedan dar lugar a procesos de corrosión y lixiviación de iones de los metales de su composición, problema general de los metales cuando se encuentra en un ambiente fisiologico. Como consecuencia, el material se deteriora y el implante se debilita. Además, durante la corrosión se liberan productos que pueden producir efectos no deseados o incluso resultar tóxicos para los tejidos circundantes8. Se utilizan aceros inoxidables, aleaciones base cobalto-cromo, titanio y otras aleaciones titanio-aluminio-vanadio, tántalio y metales nobles como platino y oro5. 1.3.2. Materiales poliméricos Los polímeros sintéticos son materiales orgánicos, sólidos, no metálicos que se obtienen a partir del petróleo y se caracterizan por su poca resistencia a la temperatura. Las propiedades físicas y estabilidad química de estos materiales dependen de su composición química y de su grado de entrecruzamiento9. Los biomateriales poliméricos son ampliamente utilizados en clínica, por las enormes posibilidades que presentan, tanto en variedad de compuestos como en la posibilidad de fabricarlos y conformarlos fácilmente en fibras, tejidos, películas o Capítulo 1 6 bloques de diferentes tamaños y formas con características bien determinadas (textura, rigidez, densidad, flexibilidad). Además, se encuentran formulaciones bioestables (con carácter permanente y particularmente útiles para sustituir de forma parcial o total tejidos u órganos) o biodegradables (con carácter temporal, con una funcionalidad especifica durante un tiempo limitado), lo que amplía su aplicación en biomedicina. También son materiales ideales para el transporte y liberación de fármacos porque son capaces de incorporar grandes cantidades y liberarlos posteriormente10. Existe una gran diversidad de polímeros naturales y sintéticos disponibles. Dentro de los sintéticos el ácido poliláctico (PLA, por Polylactic acid) y el ácido poliglicólico (PGA, por Polyglycolic acid) son muy utilizados por poseer buenas propiedades mecánicas. Entre los biopolímeros destacan el colágeno tipo I y ácido hialurónico por ser materiales componentes del organismo humano y por tanto presentar una gran biocompatibilidad y favorecer el reconocimiento celular11. 1.3.3. Materiales cerámicos Las cerámicas engloban un grupo de compuestos inorgánicos compuestos por elementos metálicos y no metálicos que son estables químicamente frente al oxígeno, los medios ácidos, alcalinos y salinos, y los disolventes orgánicos. Son muy resistentes al desgaste y generalmente se comportan como buenos aislantes térmicos y eléctricos. Existe una gran variedad de biocerámicas, entre ellas se encuentran cerámicas que son bioinertes (alúmina y el zirconia), reabsorbibles (fosfato tricálcico (TCP, por Tricalcium phosphate)), bioactivas y porosas que favorecen el crecimiento del tejido circundante (hidroxiapatito de calcio (HA, por Hydroxyapatite) y vidrios Introducción general 7 bioactivos (BG, por Bioactive glasses)). En general, la mayor desventaja que presentan las cerámicas es su fragilidad y pobres propiedades mecánicas. Sin embargo, las excelentes propiedades para la integración con el tejido vivo han permitido un gran desarrollo de estos materiales para su aplicación en terapias de reparación tisular donde se busca la regeneración del tejido12. En este sentido, los materiales cerámicos más estudiados, son el HA sintético y los BG, por su aplicación en regeneración ósea dada su capacidad de unirse al tejido vivo formando lo que se conoce como fijación bioactiva13, además de tener una similitud química y estructural con la fase mineral natural del hueso que forma su matriz extracelular (ECM, por Extracellular matrix). 1.4. Vidrios bioactivos (BG) En los años 60 el Prof L.L. Hench inició una investigación que dio lugar a un vidrio que mostró la capacidad de unirse con el tejido vivo13. El vidrio sintetizado por el método de fusion contenía un 45 % de peso de SiO2 y un 6 % de peso de P2O5, en el sistema 45SiO2-24.5Na2O-24.5CaO-6P2O5, y se patentó en 1969 con el nombre de Bioglass® 45S5. Se observó que este BG formaba en su superficie una capa biológicamente activa de HA carbonatada al entrar en contacto con los fluidos biológicos de cuerpo, a través de la cual se establecía la unión de tejidos4,12,14. Años después, Li y col15, incorporaron la tecnología sol-gel como un método alternativo para sintetizar BG de elevada pureza y homogeneidad, a temperatura ambiente. Además, este método de síntesis amplió el rango composicional de los vidrios, permitiendo un elevado contenido de Si (hasta un 90%), cuando los vidrios convencionales obtenidos por fusión permiten como máximo un 60 % de sílice. Esto ha permitido la exploración y síntesis de una gran variación en la composición Capítulo 1 8 de los BG con respecto a la propuesta original de Hench en el sistema SiO2-Na2O- CaO-P2O5. Una de las principales diferencias entre los vidrios sintetizados por sol-gel y por fusión es el área superficial y la porosidad que tiene una gran influencia en su reactividad. Para los vidrios obtenidos por sol-gel el área superficial puede llegar a 300 m2·g-1, mientras que los vidrios creados por fusión presentan un área superficial inferior a 1 m2·g-1 para partículas sin tratar y alrededor de 2 m2·g-1 para partículas micrométricas16. Los vidrios obtenidos por fusión que se someten a altas temperaturas (>1000 ºC), no presentan porosidad y su área superficial depende únicamente del tamaño de partícula disgregado. Sin embargo, las propiedades texturales de los vidrios sol-gel altamente porosos tienen una gran influencia en la cinética de formación de HA en comparación con los BG convencionales17–19. En general, el proceso sol-gel involucra la transición de un sistema líquido coloidal llamado sol a un gel. Los precursores más comúnmente utilizados son los alcóxidos que, reaccionan con agua mediante las reacciones de hidrólisis y condensación, que generalmente ocurren simultáneamente20. La vidrios de sílice se preparan a partir de la policondensación de un alcóxido de Si, comúnmente, el tetraetilortosilicato (TEOS, C8H20O4Si). La reacción de hidrólisis ocurre cuando el TEOS y el agua se mezclan en un solvente común, generalmente etanol, en presencia de un catalizador acido o básico. La reacción de hidrólisis conduce a la formación de grupos silanol (≡Si–OH), mientras que la condensación produce enlaces siloxanos (≡Si–O–Si≡), resultando como productos de la reacción agua y alcohol, como se observa en la Figura 1.2. Figu r Durante e sí y con l o a un incr e porosa e sometido elevada p r En este s lugar a B las altas r a 1.2. Etapa s e l proceso d e o s iones pre s e mento en v interconect a a un tratami e r oporción y q entido, la f a G con prop i áreas super f s de reacció n a e gelificació n s entes, en el v iscosidad y a da. Para s u e nto térmic o q ue produce a bricación d e i edades inte r f iciales que n , hidrólisis y a lcóxido TE O n las partíc u caso de sist e permite la f u transform a o que va eli m la progresi v e vidrios de r esantes par a exhiben es t y policonde n O S. u las de sílice e mas multic o f ormación d a ción en vi d m inando el a g v a densificac i sílice usan d a aplicacion e t os BG, fa v Intro d n sación, del p coloidales s o mponentes, e una red t r d rio el gel t i g ua que cont i i ón del mis m d o tecnologí a e s médicas. v orece direc t d ucción gener a 9 p recursor s e unen entr e que da lug a r idimension a t iene que se i ene el gel e n m o21. a sol-gel di o Por un lad o t amente a l a a l 9 e r a l r n o o , a Capítulo 1 10 cinética de reactividad superficial (bioactividad). Por otro lado, el proceso sol-gel proporciona materiales porosos que ofrecen la posibilidad de funcionar como matrices para albergar una variedad de compuestos orgánicos e inorgánicos y moléculas biológicas22,23. 1.5. Concepto de bioactividad De acuerdo a los descubrimientos del Prof. Hench, la bioactividad de los materiales cerámicos está directamente relacionada con su proceso de biodegradación. Así, la respuesta bioactiva de los materiales comienza con la redisolución de la superficie del material cuando ésta entra en contacto con los fluidos fisiológicos. Los mecanismos de bioactividad han sido ampliamente estudiados a principios de los años 7024. Los estudios apuntan a que la propiedad de estos materiales cerámicos para formar enlace con el hueso, consecuencia de su reactividad química en contacto con los fluidos corporales, produce la formación de una capa de HA carbonatada sobre la superficie. Debido a que el HA es similar al componente mineral del hueso, se forma una interfaz biomimética con el tejido natural que es reconocida como tal por el entorno biológico y celular. Se ha establecido que la unión del material Bioglass® 45S5 con el hueso se produce a través de una secuencia de reacciones superficiales que se engloba en el “proceso bioactivo", tal y como se detallan a continuación12: 1. Intercambio iónico entre el fluido y la matriz vítrea. 2. Disolución de la red vítrea. 3. Lixiviación de los cationes Na+1 y Ca+2 a los fluidos circundantes. 4. Formación de silanoles (Si-OH) en la superficie del vidrio. Introducción general 11 5. Formación de una capa de gel de sílice que incorpora Ca y P de la solución, formando una capa de fosfato de calcio (CaP) amorfo. 6. Finalmente, la cristalización de la película de CaP amorfa con la incorporación de carbonatos de la disolución, se forma la capa de HA carbonatado cristalino. Esta serie de eventos fisicoquímicos en la superficie del material se acompaña de la adsorción e incorporación de moléculas biológicas y la adhesión de células en el entorno. La formación inicial de la capa superficial de CaP amorfo facilita la incorporación de estructuras orgánicas y de la adhesión y proliferación celular. En el mecanismo de unión biológica, la interfaz superficie material-tejido vivo se crea por la inserción de fibras de colágeno en el biomaterial 25. Tanto la cristalización de CaP en la capa gelatinosa de sílice como la formación de HA como resultado de la actividad celular ocurre simultáneamente dando lugar a un enlace biomaterialtejido robusto que imita la disposición natural del hueso, en la que nanocristales de HA son embebidos en una matriz de colágeno. Los estudios comparativos in vitro e in vivo de materiales BG derivados del proceso sol-gel, muestran mayor velocidad en la formación de HA superficial, de fijación de la unión así como mejores propiedades de degradación y bioresorción, con respecto al material Bioglass® 45S5 obtenido por fusión15,26. Esto se debe, como se mencionó anteriormente, a que los materiales BG sol-gel presentan altas áreas superficiales que favorece el intercambio iónico con fluidos biológicos y, por lo tanto, su cinética de reacción. Además, los estudios in vivo indican que la nueva composición BG sol-gel tienen muy alta capacidad para inducir los procesos de adhesión, proliferación y diferenciación celular, sin los inconvenientes del alto Capítulo 1 18 Los vidrios que contienen únicamente SiO2, con todos los átomos de oxígeno enlazados, tienen valores Y iguales a 4. Por el contrario, los estudios en BG de diferentes composiciones indican que aquellos vidrios cuyo Y < 2.3 exhiben bioactividad in vitro41. En consecuencia, los modificadores de red al producir más NBO aumentan la reactividad del vidrio y, por tanto, favorecen la respuesta bioactiva42. Además, el Ca es fundamental para desencadenar el proceso bioactivo, ya que durante las primeras etapas, el vidrio administra concentraciones de cationes Ca+2 al fluido circundante que, aparte de aumentar el pH, induce la nucleación y cristalización de apatita en la superficie del vidrio43. Sin embargo, un exceso de CaO en la composición del MBG puede causar toxicidad durante la biodegradación del biomaterial44. Por otro lado, la incorporación de pequeñas concentraciones de P2O5, al igual que el CaO es determinante en el compartimiento bioactivo y en la estructura mesoporosa del vidrio44. Esto se debe a que el P2O5, en presencia de CaO, conduce la formación de agregados de fosfato de calcio amorfo en la superficie. Este fenómeno químico se ha demostrado mediante microscopia electrónica de alta resolución (HRTEM, por High-resolution transmission electron microscopy) y por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN, por Nuclear magnetic resonance spectroscopy) y se ha correlacionado con dos aspectos muy importantes. Por un lado, durante la formación de CaP amorfo se consume iones Ca+2, que en consecuencia ayuda a conservar la estabilidad de la red vítrea al disminuir la disponibilidad de cationes modificadores de red. Por otro lado, la presencia de núcleos nanocristalinos de ortofosfatos promueve una microestructura con regiones donde la conexión química de la estructura de vidrio es más débil. Estos defectos, Introducción general 19 influyen en la biodegradabilidad del vidrio y actúan como sitios preferenciales para la deposición de HA35,45. No obstante, se debe considerar que altas concentraciones (mayores a 10 % mol) de P2O5 en la composición del MBG conlleva una a mayor segregación superficial de agregados de CaP. En consecuencia, estos agregados no solubles inhibirían el crecimiento de HA cristalina, debido a que impiden el intercambio iónico que desencadena el proceso bioactivo35. En general, la bibliografía sugiere que el material MBG en el sistema 80SiO2-CaO- P2O5 con 80-85 % de Si, con Ca y P en su composición, son los que presentan una mayoyr bioactividad en términos de cinética y de la cantidad de HA que crece en su superficie. Para estas composiciones, ≈ 4 h son suficiente, para la nucleación de la HA, en condiciones in vitro. Esto se puede atribuir principalmente a su composición, ya que como se observa en la Tabla 1.1, no hay cambios drásticos en sus propiedades texturales. En este sentido, estos materiales exhiben una bioactividad excelente debido a la cantidad y la accesibilidad de los cationes Ca+2 al fluido circundante, la presencia de agregados de fosfato de calcio y las propiedades texturales inherentes a su estructura nanoporosa ordenada. 3. Motivación, objetivos y estructura del presente trabajo de Tesis Los MBG presentados constituyen unos materiales muy prometedores para su aplicación en el campo de loa ingeniería tisular de hueso. Por un lado pueden sintetizarse con una composición en el rango en que se han demostrado bioactivos. Por otro lado, sus propiedades texturales les confieren unas características notables que promueven esta bioactividad además de aportar otras ventajas adicionales como las de ser materiales con capacidad para adsorber biomoléculas o agentes terapéuticos. Capítulo 1 20 Sin embargo, la síntesis sol-gel da lugar a la obtención de biomateriales en forma de micropartículas lo que dificulta su utilización como implantes o soportes celulares para ingeniería tisular. Por ello, un reto importante para su implementación en estas aplicaciones es el de procesarlos o conformarlos en estructuras estables que puedan ser manipuladas como implantes o como matrices soporte para ingeniería tisular. En este sentido, el primer objetivo en este trabajo de Tesis ha sido el desarrollo de estructuras macroporosas con unas propiedades mecánicas mejoradas mientras se preservaran las características texturales de los materiales MBG. Otro aspecto muy interesante en el estudio de los materiales MBG es su potencialidad como matrices administradoras de los iones que lo componen como productos de su biodegradación. Los estudios, tanto in vitro como in vivo, sobre las propiedades biológicas de los productos de la disolución iónica de los materiales MBG se han centrado en los iones de su composición base, Si, Ca y P, y señalan que estos iones pueden modificar la expresión génica en células del tipo osteoblasto, así como inferir en otros aspectos relacionados con las procesos de regeneración tisular, como la angiogénesis, la respuesta inflamatoria y la actividad bactericida43. En este sentido, los MBG son sistemas versátiles que pueden incorpora otros elementos químicos con funcionalidad terapéutica. El estudio de la aplicación de los MBG como materiales administradores de iones con capacidad terapéutica es el segundo objetivo de esta Tesis. Introducción general 21 Por tanto, el objetivo general este trabajo de Tesis Doctoral es el estudio de materiales MBG para su aplicación en ingeniería de tejidos como matriz biomimética administradora de iones terapéuticos. Para alcanzar este objetivo general, esta Tesis Doctoral se ha estructurado en varios capítulos con los subobjetivos específicos, que se indican a continuación. Capítulo 2. Considerando que para terapias de regeneración ósea se precisan de estructuras que mimeticen la ECM, el objetivo específico de este capítulo es el desarrollo de matrices biomiméticas de materiales MBG con estructuras macroporosas que permitan la migración celular y vascularización mientras se preservan las características de nanoporosidad ordenada del material MBG precursor. Para ello, primero se desarrollaran nuevas estructuras tridimensionales basadas en biocerámicas que, posteriormente, se optimizaron con el revestimiento de un biopolímero. En este capítulo se estudia la influencia de las distintas variables del procesado sobre las propiedades físico-químicas, mecánicas y bioactividad de las estructuras finales. Capítulo 3. Este capítulo se desarrolló con el objetivo de evaluar la funcionalidad del MBG como matriz administradora de iones terapéuticos. La primera tarea fue ensayar nuevas síntesis químicas para obtener MBG en sistema SiO2-CaO-P2O5 con incorporación de Cu en su composición así como de su posterior caracterización físico-química. Se ensayaron dos rutas de síntesis y diferentes composiciones para evaluar la influencia de estos parámetros sobre sus propiedades texturales y su mecanismo de biodegradación. Este capítulo también incluye diferentes estudios de Capítulo 1 22 degradación in vitro de los biomateriales obtenidos para la evaluación de su capacidad como matriz administradora de los iones constituyentes. Capítulo 4. En este capítulo se evalúa la funcionalidad angiogénica de los biomateriales MBG y MBG con Cu y el efecto de cada uno de los iones administrados durante su degradación. Para ello, se llevaron a cabo ensayos in vitro de viabilidad y migración celular, así como ensayos in vivo en el modelo pez cebra. 4. Referencias (1) Williams, D. F. Definition in Biomaterials; 1987. (2) Williams, D. F. The Biomaterials Conundrum in Tissue Engineering. Tissue Eng. Part A 2014, 20 (7-8), 1129–1131. (3) Williams, D. F. The William Dictionary of Biomaterials; 1999. (4) Hench, L. L.; Polak, J. M. Third-Generation Biomedical Materials. Science (80-. ). 2002, 295 (5557), 1014–1017. (5) Navarro, M.; Michiardi, A.; Castaño, O.; Planell, J. A. Biomaterials in Orthopaedics. J R Soc Interface 2008, 5, 1137–1158. (6) Williams, D. F. On the Mechanisms of Biocompatibility. Biomaterials 2008, 29 (20), 2941–2953. (7) Kokubo, T.; Kim, H. M.; Kawashita, M.; Nakamura, T. Bioactive Metals: Preparation and Properties. J. Mater. Sci. Mater. Med. 2004, 15 (2), 99– 107. (8) Singh, R.; Dahotre, N. B. Corrosion Degradation and Prevention by Surface Modification of Biometallic Materials. J. 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Propiedades Medidas Hueso cortical Hueso trabecular Módulo de Young (GPa) 14-20 0.05-0.5 Límite de tracción (MPa) 50-150 10-20 Límite de compresión (MPa) 170-193 7-10 Resistencia a la fractura (MPa m1/2) 2-12 0.1 Rotura a tracción 1-3 5-7 Densidad (g·cm3) 18-22 0.1-1 Densidad aparente (g·cm3) 1.8-2 0.1-1 Volumen superficie/hueso (mm2·mm3) 2.5 20 Volumen total del hueso (mm3) 1.4-106 0.35-106 Superficie interna total 3.5-106 7-106 Figura 2 Hues o esponj o M de c .1. Esquema o o so M olécula c olá g eno de la estruc t H u co m Tropocolágeno tri p le hélice t ura del hue s 201414) u eso mp acto HA nanocrist a E s s o (Figura m o Oste 100 a les s tructuras mat r o dificada de o nes µm Canales Havers r iz biomimétic a 3 5 West y col. s 5 Capítulo 2 36 En el caso del tejido óseo esponjoso tiene una superficie mayor, pero es menos denso y menos resistente mecánicamente. Por lo general se produce en los extremos de los huesos largos, en las proximidades de las articulaciones y en el interior de las vértebras. Está formado por laminillas óseas que forman una red tridimensional, permitiendo el paso de las fibras de colágeno de una laminilla a otra. Los huecos que quedan entre las laminillas están ocupados por la médula ósea. Como se puede observar en la Figura 2.1, el hueso tiene una arquitectura compleja, presenta varios niveles de unidades estructurales jerárquicas, diseñadas elegantemente en varias escalas, de macro a nano, para cumplir múltiples funciones. Esta estructura altamente compleja del hueso es la responsable de su comportamiento mecánico particular: anisótropo, heterogéneo, no-lineal, viscoelástico. 1.2. Remodelación ósea El hueso es un tejido dinámico y metabólicamente activo que sufre un continuo proceso de remodelado, lo que confiere al esqueleto su capacidad regenerativa y de adaptación funcional. La formación y resorción ósea son procesos paralelos que están activados a lo largo de toda la vida, remodelando continuamente el esqueleto a fin de mantener su integridad y la homeostasis mineral. El proceso de remodelación ocurre secuencialmente, es decir, de manera cíclica (Ver Figura 2.2). Las principales fases son activación, reabsorción y formación.  Estructuras matriz biomiméticas 37 Figura 2.2. Esquema de las diferentes fases del remodelado óseo (Figura modificada de Fernandez y col. 200615). Retracción de las células de revestimiento OSTEOCLASTOS Matriz ostoide OSTEOBLASTOS Unidad ósea estructural Tejido óseo neoformado mineralizado Quiescente Activación Reabsorción Formación Mineralización Quiescente OSTEOCITOS (Células de revestimiento asociados a la superficie ósea) HUESO MINERALIZADO Capítulo 2 38 La resorción comienza cuando los osteocitos que se encuentran revistiendo la superficie mineralizada en estado quiescente migran, dejando la superficie de hueso libre para que los osteoclastos reabsorban pequeñas porciones óseas. Este proceso es una respuesta de los osteocitos a un estímulo mecánico (microfracturas o falta de carga mecánica) o a señales endocrinas que actuarían directa o indirectamente sobre los mismos. La terminación de la resorción osteoclástica, da lugar a la fase de formación, donde los osteoblastos sintetizan y depositan la matriz osteoide que posteriormente se mineralizará. El proceso de remodelación ósea dura entre 2-3 meses en humanos, y al final de este proceso, el balance del remodelado (la diferencia entre el hueso formado y eliminado) es neutro6. 1.3. Mecanismos de regeneración ósea La eficacia de la selección de los biomateriales para su utilización en terapias de regeneración ósea debe fundamentarse, tanto en el conocimiento de los principios histológicos y fisiológicos del hueso, como en los mecanismos biológicos básicos de neoformación del hueso, que se describen brevemente a continuación16,17: Osteogénesis: Proceso de formación y desarrollo de hueso por crecimiento o por reparación debido a la actividad de los osteosblastos. Un biomaterial con propiedades osteogénicas contiene células viables con la capacidad de formar hueso (células osteoprogenitoras) o el potencial para diferenciarse en células formadoras de hueso (células inductibles precursoras osteogénicas). Osteinducción: Un biomaterial osteoinductivo contribuye a la formación ósea durante el proceso de remodelación. Esta propiedad hace referencia a la capacidad de los biomateriales para inducir la diferenciación de células Estructuras matriz biomiméticas 39 mesenquimatosas en células óseas maduras. Este proceso está típicamente relacionado con la presencia de moléculas reguladoras del metabolismo óseo. Osteoconducción: Proceso mediante el cual se dirige el hueso para conformarse en la superficie de un material. Se trata de la propiedad física del biomaterial de servir como soporte para el crecimiento de hueso en su superficie. Además, permite el desarrollo de una neovascularización así como la infiltración de células osteogénicas. Osteointegración: Este término hace referencia a la conexión firme, estable y duradera entre un implante y el hueso que lo rodea, sin la formación de tejido fibroso entre hueso-implante y sin la presencia de síntomas severos de inflamación. El éxito de la conexión interfase hueso-implante está sujeta a diversos factores como la respuesta inmune del paciente, el procedimiento de implantación quirúrgica, las características fisiológicas del hueso receptor, los factores mecánicos del implante y su superficie y la acción de cargas mecánicas sobre el hueso y el implante. La osteointegración no es un fenómeno aislado, sino que es el resultado de la osteoinducción previa y de la osteoconducción16. En este sentido, los diferentes biomateriales utilizados para terapias de regeneración ósea pueden actuar por al menos uno de los tres mecanismos que se han descrito anteriormente y que esquematizan en la Figura 2.3. Capítulo 2 40 Figura 2. 3 cuando se 1.4. Terapi a Los huesos patologías ó propiedades en las cual e tejido daña d no tiene la c Actualment e tanto la uti l reparación empleados p fuesen cap a Básicament e OSTEO G BIOMATERIAL 3 . Esquema d implanta un a s para la r e son suscep t ó seas. Si b auto-regen e e s estas pro p d o, como la o apacidad de e , las técni c l ización de i ósea. Los m p ara la repar a a ces de re s e se siguen G ENÉSIS HUESO d e los meca n biomaterial e paración d e t ibles a sufr b ien es cie r e rativas, el p p iedades no o currencia d e seguir los p r as utilizada s i njerto com o m etales y a a ción de de f s tablecer el empleando OS T BIOMATERIAL HUESO n ismos de re g en el cuerp o 201318). e defectos ó s r i r daños im p r to que los p roceso es l e son suficie n e fracturas d r ocesos de r e s para tera p o la de sust i a leaciones f u f ectos óseos l funciona m como mate r TEOINDUCC I g eneración ó o (Figura mo d s eos p ortantes c a huesos h u e nto. Adem á n tes para lo g d e gran tama ñ e paración no p ias de rege n i tutos sintét i u eron los p en la impla n m iento mec á r iales estruc t I ÓN O HUESO ó sea que tien e d ificada de M a usados por u manos tien á s, existen c o r ar la resta u ñ o, en dond e r males. n eración ós e i cos para pr p rimeros bi o n tación de p r á nico de l o t urales en d i STEOCOND U BIOMATERI A e n lugar M oraleda traumas o n en ciertas o ndiciones u ración del e el cuerpo e a abarcan r omover la o materiales r ótesis que o s huesos. ispositivos U CCIÓN A L Estructuras matriz biomiméticas 41 para la fijación de fracturas y en sustitución total o parcial de articulaciones, por sus propiedades mecánicas y su resistencia a la corrosión en el organismo humano. Sin embargo, los implantes metálicos no son enteramente satisfactorios, ya que con el tiempo, estos biomateriales presentan fallos en su aplicación como desgaste, fractura, liberación de especies químicas al organismo, perdida de la unión con los tejidos circundante y daños a los tejidos óseos próximos al implante por las fuerzas de roce presentes durante el movimiento del paciente19,20. En la búsqueda de terapias alternativas, que solventen las limitaciones asociadas al uso de prótesis metálicas, surgió el uso de injertos para el tratamiento de defectos óseos. Evidentemente, el mejor sustituto óseo es el propio hueso, ya sea proveniente del propio paciente (autoinjerto), o de un donante de la misma especie (aloinjerto) o de diferente especie (xenoinjerto). El hueso autólogo es el mejor candidato por presentar propiedades osteoindutoras, osteocondutoras y osteogénicas óptimas, por no generar respuestas inmunes y por su integración con el tejido circundante, favoreciendo la regeneración del mismo. Sin embargo, presenta serias limitaciones, especialmente la poca disponibilidad para cubrir defectos de gran tamaño, así como la alta morbilidad a la que se expone la región donadora. Todas las otras formas de injerto óseo tienen desventajas en comparación con el autoinjerto y, como tal, su uso es sub-óptimo21. Las limitaciones que presentan las procedimientos antes señalados, han llevado al desarrollo de tecnologías alternativas que permitan la síntesis de biomateriales sustitutos de injertos óseos que permitan recuperar la funcionalidad del área afectada mediante la inducción y conducción de la regeneración del hueso22. Capítulo 2 42 1.5. Ingeniería tisular En este contexto, la ingeniería tisular nace como respuesta a los problemas que presentan las terapias de reparación y/o regeneración de tejidos óseos que se utilizan actualmente. La ingeniería de tejidos es un área científica multidisciplinar cuyo fundamento es el uso de células vivas y moléculas bioactivas, así como la creación de sustitutos biológicos para su posterior implantación en el cuerpo23. El objetivo de esta disciplina es la reparación de tejidos, reproduciendo los mecanismos de regeneración ósea (osteogénesis, osteoinducción y osteoconducción). Como las células son los componentes fundamentales del tejido y las encargadas de modular dichos mecanismos, es importante considerar el proceso natural de formación de tejido. Las células se agrupan y forman sus propias estructuras de soporte, llamada ECM. Esta matriz, aparte de dar soporte a las células, actúa como una estación repetidora para varias moléculas de señalización que determinarán la proliferación y diferenciación celular. Finalmente, esto da lugar a la constitución de un tejido biológico con una función fisiológica específica24,25. Desde un punto de vista teórico, podemos considerar que cualquier tejido biológico tiene las siguientes componentes: a) Células que pueden poseer cualquier grado de diferenciación. b) Una matriz que de soporte a las células. c) Biomoléculas señalizadoras que actúan como receptores intercelulares, para mediar las respuestas celulares. En este sentido, la ingeniería tisular parte del principio de que la regeneración de nuevo tejido puede ser guiada a través de la combinación de uno, dos o tres de los componentes mencionados previamente. La Figura 2.4 representa mediante un gráfico estos fundamentos denominado la tríada de la ingeniería de tejidos26. Específic a ingenierí a formació n denomin a embargo, para indi c Figura compo n 2. Estru c Para las t e biomateri generand o regenerac a mente, en a de tejidos e n de tejido. E a estructuras en este tra b c ar la necesi d 2.4. Tríada d n ente molec u de regenera c c turas mat r e rapias de r e ales para r o es esta fo r ión del hues Cé l terapias de e s el desarro l E n la biblio g andamios o b ajo se ha e l d ad de su ap r d e la ingenie u lar son nece s c ión de tejid o r iz en tera p e generación r eproducir u r ma un ento o . R e E s l ulas regeneraci ó l lo de un co n grafía a la m o soporte, e l egido el tér m r oximación a e ría de tisula r sarios para l a o s (Figura m p ias de re g ósea, la ing e u na estruct u o rno fisicoq u e generación d tejidos s tructuras matr i biomimética E s ó n ósea, el n structo arti f m atriz sopor t quivalente a m ino estruc t a la funcion a r . Una estru c a creación d e m odificada d e eneración ó e niería de te j u ra capaz d u ímico, esen c d e i z Molécul a s tructuras mat r p rincipal o b f icial, capaz t e para las c a l inglés “s c t uras matriz l idad de la E tura matriz, e constructo s e Barreto 20 0 ó sea j idos puede d e mimetiz a c ial para la a s bioactivas r iz biomimétic a 4 3 b jetivo de l a de inducir l a c élulas se le c affolds”, si n biomimétic a E CM. células y un s para terapi a 0 922). hacer uso d e ar la EC M reparación y s 3 a a s n a a e M , y Capítulo 2 50 último, la estructura debe ser biodegradable y tener una superficie químicamente adecuada para el reconocimiento celular. En este sentido, se ha demostrado que las estructuras macroporosas interconectadas basadas en BG procesados por la técnica de réplica presentan buenas propiedades para su aplicación en tratamientos de defectos óseos41,42. El BG Bioglass® 45S5 ha sido particularmente investigado para la fabricación de estructuras matriz para tejido óseo, especialmente el Bioglass® 45S5. Como se ha mencionado antes, la característica principal de estos biomateriales es su reactividad superficial, ya que al entrar en contacto con los fluidos biológicos forma en su superficie una fase tipo sílice hidratada donde se depositan iones Ca y P. La posterior cristalización de esta capa conlleva a la formación de HA en la superficie del material, la cual promueve la formación de una fijación bioactiva entre la superficie del material y del tejido circundante43. Además, los productos de su redisolución, especialmente concentraciones críticas de iones solubles de Si y Ca, y de otros iones metálicos incorporados, pueden regular funciones celulares. Ensayos in vitro e in vivo 44,45 indican que estos iones favorecen la expresión de genes que controlan la osteogénesis, ya que están involucrados en los mecanismos de proliferación, diferenciación y la expresión génica de osteoblastos46. Como se ha introducido en el Capítulo 1, la incorporación del método sol-gel y el uso de surfactantes en la síntesis de BG dieron lugar a una generación de vidrios que exhiben mejores propiedades para su utilización en ingeniería tisular y que se denominan MBG. La combinación del proceso sol-gel y surfactantes da lugar a una Estructuras matriz biomiméticas 51 estructura nanoporosa ordenada e interconectada a través del vidrio, que proporciona mayores valores de superficie específica47. Por lo tanto, los MBG solgel tienen una mejor capacidad de reabsorción, bioactividad y uniones óseas in vivo48. Además, investigaciones recientes sugieren que la nanoporosidad ordenada es esencial para la adhesión, proliferación y migración celular, especialmente de los osteoblastos. En ensayos de regeneración ósea se ha encontrado que el proceso de vascularización se ve afectado por la presencia de estos nanoporos influyendo de manera constatable en la progresión de la osteogénesis49. Otra ventaja importante del proceso sol-gel es que se puede combinar con las etapas de procesado de una estructura matriz, mediante la técnica de réplica, que permite obtener estructuras matriz con una porosidad dual. Así, se genera una red macroporosa interconectada proveniente de la réplica de una plantilla a la vez que un material nanoestructurado (nanoporoso) en las paredes de estos marcoporos. Estos nanoporos aportan a la estructura muy alta superficie que va aumentar la reactividad superficial50. El método consiste en impregnar una espuma generalmente de poliuretano, en una suspensión sol precursora del material biocerámico, con o sin aglutinante. Posteriormente se remueve el exceso de suspensión de la espuma y se secan a temperatura ambiente. Una vez la estructura esta homogéneamente recubierta y seca se procede a la eliminación de los precursores orgánicos, mediante un tratamiento térmico. La eliminación de los compuestos orgánicos debe realizarse muy lentamente, para evitar la formación de grietas y fracturas debido a la eliminación de gases por la combustión de los agentes orgánicos40. Sin embargo, las estructuras obtenidas mediante esta técnica presentan baja resistencia mecánica para los requerimientos quirúrgicos. En la Tabla 2.2 se Capítulo 2 52 muestran la resistencia a la compresión para estructuras obtenidas mediante la técnica de réplica de una plantilla polimérica. Se observan valores de resistencia a la compresión en el rango de 0.27-0.45 MPa para estructuras híbridas biopolímeros-cerámicos y hasta 0.55 MPa para estructuras que incorporan aglutinantes en la síntesis para optimizar sus propiedades mecánicas. Tabla 2.2. Propiedades mecánicas y texturales de estructuras matriz fabricadas mediante la técnica de réplica de una plantilla polimérica. *Alcohol polvinílico (PVA, por Polyvinyl alcohol) **Ácido polihidroxibutírico (PHB, por Polyhydroxybutyrate) ***Policaprolactona (PLC, por Poly(ε-caprolactona)) Biomaterial Porosidad Aglutinante Resistencia a la compresión (MPa) Área superficial (m2·g-1) Referencias BG (15Na2O:40CaO:45P2O5) (reforzado con HA) 85-97 % -- 0.01-0.17 -- 51 Bioglass® 45S5 (Totalmente cerámico) 89-92% PVA* 0.27-0.42 -- 52 BG (50SiO2:2.6CaO:5.9Na2O: 4P2O5:12K2O:5.3MgO:0.2B2O3) 61-68 % PVA/PLA 0.45-0.55 -- 53 MBG-Zr (80SiO2:15CaO:5P2O5: (x-15CaO)Zr) 89-91% -- 0.05-0.21 220-320 54 MBG (80SiO2:15CaO:5P2O5) 94% -- 0.06-0.25 -- 55 Bioglass® 45S5 (Parcialmente cerámico) 80-85 % PHB** 0.15-0.30 -- 56 Bioglass® 45S5 (Parcialmente cerámico) 79-85 % PLA 0.20-0.45 -- 57,58 Bioglass® 45S5 -- PLC***/ quitosano 0.20 -- 59 Bioglass® 45S5 90-92 % PVA/ celulosa 0.01-0.06 0.10 -- 60 61 MBG/SBA-15 86-95 % -- 0.01-0.08 19-203 40 Estructuras matriz biomiméticas 53 3.1. Estrategias para la optimización de estructuras macroporosas obtenidas por el método de réplica de una plantilla polimérica Un desafío importante para el desarrollo de estructuras basadas en biocerámicas con éxito clínico es superar su carácter frágil y baja resistencia a la fractura. Para alcanzar esto, una estrategia prometedora es revestir o infiltrar la estructura con un polímero biodegradable (aglutinante), proveyendo así a la fase inorgánica (biocerámica) de una fase orgánica que aumente la tenacidad y conseguir así propiedades más parecidas a las del hueso62. Entre los polímeros sintéticos, disponibles para este fin, se encuentra el PLA53, PLC63, PVA64 y los polímeros naturales como el alginato65, celulosa60, gelatina66 o colágeno67. El revestimiento y la infiltración de una estructura biomimética altamente porosa con un polímero bioresorbible, para reforzar sus propiedades mecánicas, es especialmente ventajosa debido a su simplicidad en el procesamiento y la versatilidad de biopolímeros sintéticos y naturales disponibles. 3.1.1. Incorporación de PVA como agente aglutinante Entre los polímeros sintéticos, el PVA es uno de los pocos polímeros vinílicos solubles en agua con características de gran interés para aplicaciones médicas. Actualmente es utilizado en áreas como la química de los alimentos, los productos farmacéuticos, en la industria cosmética, del papel y textil, entre otras. Entre sus aplicaciones más interesantes, para el área biotecnológica, se encuentran su utilización como agente estabilizante como sustrato para formar películas y recubrimientos. Además, su alta flexibilidad de cadena se traduce en la posibilidad de preparar soluciones altamente concentradas68–70. Capítulo 2 54 En el campo de la biomedicina, el PVA se utiliza en la preparación de hidrogeles y membranas para el desarrollo de lentes de contactos70, piel y páncreas artificial71,72, hemodiálisis73, así como para materiales médicos implantables para reemplazar el cartílago y el menisco74,75. En el procesado de materiales cerámicos el PVA aporta a las mezclas precursoras una propiedades de mayor plasticidad que se traduce en una mejores propiedades mecanicas64,76. Bertolla y col.61 sintetizaron y caracterizaron unas estructuras híbridas basadas en BG e recubiertas con PVA y celulosa por la técnica de réplica de espuma, encontrándolas 10 veces más resistentes a la tracción en comparación con las no recubiertas. La mejora en las propiedades mecánicas fue de 0.01 a 0.10 MPa. 3.1.2. Recubrimiento de biopolímero colágeno Actualmente, el colágeno constituye un biomaterial predominante en aplicaciones biomédicas, incluyendo reparación y regeneración ósea77. El colágeno tipo I se destaca por su biocompatibilidad debido a sus propiedades hidrofílicas, hemostáticas, baja respuesta inflamatoria (inmunogénica) del huésped y por su estructura fibrilar nanoestructurada que le aporta alta resistencia y estabilidad. Además, a diferencia de otros biopolímeros naturales, los colágenos fibrilares muestran características moleculares adicionales que son esenciales para la adecuada mineralización de la matriz y para el reconocimiento celular que regula las interacciones celulares en la superficie del biomaterial77–80. El colágeno, como muchas otras proteínas, se distingue por tener varios niveles de orden estructural. Jerárquicamente, parte de una estructura primaria formada por la unión de secuencias de aminoácidos a lo largo de una cadena llamada Estructuras matriz biomiméticas 55 polipeptídica. La unión de los aminoácidos se da mediante un enlace covalente (C- N) entre el grupo amino (NH2) de un aminoácido y el grupo carboxilo (COOH) de otro. Los principales aminoácidos del colágeno son la glicina (Gly), la prolina (Pro) y la hidroxiprolina (Hyp), que representan más del cincuenta por ciento del total de aminoácidos constituyentes81. La estructura secundaria del colágeno es producto de la configuración espacial de la cadena polipeptídica que resulta de la formación de puentes de hidrógeno entre péptidos, dando lugar a la denominada hélice alfa (cadena α). Mientras que la unión de 3 cadenas α-polipeptídicas conforman la estructura terciaria que recibe el nombre de tropocolágeno. En el colágeno tipo I, dos de las cadenas son denominadas como α1 con una composición de aminoácidos idéntica y una cadena α2 con una composición distinta. La abundancia de la glicina tiene un papel fundamental en la triple configuración gly-pro-hyp, que determina la configuración de la cadena debido a la alta rigidez de sus residuos con estructuras en forma de anillo78,82. Finalmente, la estructura cuaternaria se caracteriza por la repetición de la unidad estructural supramolecular, compuesta por muchos paquetes de triples hélices en un entramado específico que constituyen las fibrillas de colágeno (Ver Figura 2.9). Estas comprenden un ensamblaje de moléculas de tropocolágeno organizadas periódicamente a lo largo de la dirección axial, formando escalones desfasados ≈ 67 nm (distancia D) entre sí. Esto genera un patrón característico de zonas de hueco con 35 nm de longitud y zonas de superposición con 32 nm de longitud dentro de la fibrilla83,84. En el hueso, los cristales de HA se ordenan en los espacios entre las moléculas de colágeno a lo largo de las fibrillas nanoestructuradas78,85,86. Capítulo 2 56 F i Además, di f celular al glicina–glut a integrinas, p La principa l partir de lo cerdo89. En relacionada puede obte n por un proc e α1 α1 α2 C a F i gura 2.9. E s f erentes estu poseer se c a mato–argi n p roteínas qu e l fuente de e s residuos d su uso com o directament e n er sintética m e so denomin N- y C- termi n a denas polieptí d F ibra de coláge n s quema de l a d ios sugiere n c uencias G F n ina), las c u e median el r e e xtracción d e d e especies o biomateria l e con su fu n m ente en el l a a do fibrilog é n al d icas n o a disposición n que el col á F OGER (g l u ales son re e conocimie n e colágeno t bovinas y d l la macro y n ción y sus p aboratorio a é nesis90. jerárquica d á geno tipo I l icina–fenila l conocidas p n to celula r 87, 8 t ipo I ha si d d e la piel, h y microestru c p ropiedades. partir molé c Tripl Fibril l D = d el colágeno. promueve l a l anina–hidr o p rincipalmen t 8 8. d o hasta el m h uesos y ca r c tura del col á El nivel je r c ulas de tro p e hélice a de colágeno 67 n m a adhesión o xiprolina– n te por las m omento a r tílagos de ágeno está r árquico se p ocolágeno Estructuras matriz biomiméticas 57 La fibrilogénesis es el proceso con el que se obtienen las fibrillas de colágeno con su particular organización (distancia D). Para ello se deben controlar una serie de parámetros, como la concentración de monómero de colágeno, la composición y concentración de las sales, la temperatura de incubación, el tiempo y el pH91–94. El presente capítulo tiene como objetivo desarrollar nuevas estructuras matriz híbridas cerámico-biopolímero con porosidad dual, macro-nano. Se pretende obtener estructuras matriz biomiméticas con mejores propiedades texturales y mecánicas que las estructuras previamente publicadas40. Para ello se va a investigar la utilización de PVA como agente aglutinante de la fase cerámica. Además, una vez obtenida la estructura cerámica se va a incorporar un recubrimiento de colágeno fibrilar nanoestructurado. 4. Fabricación de matrices biomiméticas hibridas cerámico-biopolímero 4.1. Procedimiento experimental La metodología desarrollada por nuestro grupo de investigación para la obtención de estructuras macroporosas consiste en impregnar una esponja de poliuretano en una suspensión del precursor particulado SBA-15 en un sol MBG40. Esta estrategia utiliza el sol MBG como agente aglutinante para consolidar las partículas de SBA-15 y mejorar la bioactividad del material al incorporar los elementos Ca y P en la composición. Además, a diferencia de los BG, tanto la SBA-15 como el MBG le confieren a la estructura altos valores de superficie, que presenta poros ordenados en la escala nanométrica. Capítulo 2 58 4.1.1. Síntesis del precursor de sílice tipo SBA-15 La síntesis de la SBA-15 se llevó a cabo mediante un tratamiento hidrotérmico, de acuerdo al método propuesto por Zhao y col95. Se pesan 1.92 g del copolímero de bloque (HO[CH2CH2O]20-[CH2CH(CH3)O]70-[CH2CH2O]20H), comercializado con el nombre de Pluronic® (P123, 435465 Sigma-Aldrich) y se disuelve en un matraz bola con una mezcla de 45 mL agua desionizada (DIH2O) y 30 mL de ácido clorhídrico (HCl, 37 % en peso, 131020 Panreac, PA-ACS-ISO) 4M. La mezcla se mantiene en un baño termostático a 40 °C ± 1 ºC con agitación a 1000 rpm durante 2 h. Una vez completa la disolución del copolímero, se reduce la velocidad de agitación a 600 rpm y se añaden 4.25 mL de TEOS (14082, Alfa-Aesar). Se mantiene durante 24 h con temperatura y agitación constante. Posteriormente, el precipitado resultante se transfiere a un reactor de vidrio pyrex que se deposita en una estufa a 80 °C y se deja envejecer durante 24 h. Una vez finalizada esta etapa, el precipitado se filtra, se lava con 250 mL de DIH2O y se coloca en un crisol para proceder a secarlo en una estufa manteniendo las condiciones anteriores, 80 °C durante 24 h. Finalmente, se somete a un tratamiento térmico a 500 °C durante 6 h, utilizando una rampa de velocidad de 1 °C·min-1. 4.1.2. Síntesis del sol MBG La síntesis del sol MBG, en el sistema composicional 80SiO2-15CaO-5P2O5, se realizó sobre la base del protocolo planteado por Yan y col. 96. La síntesis consiste en disolver 4 g del polímero director de estructura P123 en 60 mL de etanol absoluto (AnalaR Normapur) y 1 mL de HCl 0.5 M durante 1 h. Una vez completada la disolución del P123, se procede a la adición de 1.4 g de nitrato de calcio tetrahidratado (Ca(NO3)2.4H2O, C4955 Sigma-Aldrich), 685 μL de trietil fosfato (TEP, (C2H5O)3PO, 538728 Sigma-Aldrich) y 7.125 mL de TEOS. Los reactivos se añaden de forma consecutiva con intervalos de 1 h para la adición de Estructuras matriz biomiméticas 59 cada reactivo y se mantienen en agitación constante a 500 rpm durante 6 h a temperatura ambiente. 4.1.3. Procesado de las estructuras macroporosas híbridas biopolímero-cerámico El procesado de la estructura se realizó usando la técnica de réplica a partir una espuma de poliuretano (BULPREN® S28133) como plantilla. La suspensión precursora se llevó a cabo mezclando partículas de sílice tipo SBA-15 en un sol MBG en una proporción de 8 y 92 % volumen, respectivamente, como se ha publicado anteriormente por nuestro grupo40. En este trabajo, se incorporó como novedad, una solución acuosa de PVA al 2 % (Mw 89.000 - 98.000; 99 +% de hidrolizado, Sigma-Aldrich), que se llevó a cabo calentando 100 mL de DIH2O a 120 °C y añadiendo 2 g de PVA. La disolución se mantiene bajo vigorosa agitación (1200 rpm) y transcurridas 24 h se deja enfriar. Las piezas de espuma de 7 mm de espesor y 12 mm de diámetro, se lavaron en DIH2O y se secaron antes de su uso. Una vez secas, se sumergieron durante 5 minutos en la solución de PVA y se exprimieron para eliminar el exceso de líquido. A continuación, las piezas se sumergieron durante 5 min en la suspensión de mezcla biocerámica preparada con anticipación. El exceso de la mezcla se eliminó oprimiendo la espuma y la capa aplicada se dejó evaporar a 50 °C durante 24 h. Se repitió el mismo procedimiento tres veces. Después del secado, las piezas se trataron térmicamente dos veces usando una velocidad de calentamiento de 1ºC·min-1 con dos etapas térmicas: 400 ºC y 800 ºC. El tiempo de retención a 400 °C fue de 1 h, y a 800 °C fue de 2 h para el primer tratamiento y de 6 h para el segundo. Las piezas finales de cerámica se denominaron SP8PVA. Capítulo 2 66 Después del proceso de fibrilogénesis, se observa que el pico a 3340 cm-1, correspondiente a la vibración de estiramiento de N-H (Amida A), se ensancha y se desplaza a una frecuencia menor de 3315 cm-1. En general, los cambios espectrales que se observan después de la formación de fibrillas son una mejor definición de todos los picos, especialmente, las vibraciones de estiramiento correspondientes a N-H (Amida B) a 3083 cm-1 y C-H, CH2- y CH3- a 2980 y 2850 cm-1, son claramente más intensas para el colágeno fibrilar. Particularmente, la banda que se presenta a 1660 cm-1 y que corresponde a la Amida II, está estrechamente relacionada con el proceso de autoensamblaje de colágeno. Después de la fibrilogénesis, en el espectro FT-IR, se observa un incremento en la relación de intensidades de las absorbancias 1660 cm-1/1630 cm-1. Esto se ha demostrado previamente en experimentos in vitro de autoensamblaje térmico para el monómero de colágeno tipo I102. Además, en el espectro del colágeno monomérico después de la fibrilogénesis, ocurre un desplazamiento de la banda asignada a la amida II de 1550 cm-1 a 1555 cm-1. Todos estos eventos se asocian con el aumento de interacciones intermoleculares de colágeno que resultan como consecuencia de la estructura nanofibrilar que adopta el colágeno102,103. Los resultados de ambas técnicas nos indican que el proceso de fibrilogénesis realizado en el laboratorio ha sido efectivo. Los monómeros de colágeno son capaces de organizarse in vitro en una estructura ordenada característica de las fibrillas nativas, a partir del protocolo utilizado. Además, es importante considerar que, en este trabajo, el precursor soluble de atelocolágeno purificado y el método utilizado para reticular el colágeno, reduce las posibilidades de presentar problemas de inmunogenicidad, ventaja añadida que se relaciona con la biocompatibiliad del material y su posterior traducción clínica. Por un lado, estudios previos señalan que un precursor soluble de colágeno purificado y tratado enzimáticamente reduce la Estructuras matriz biomiméticas 67 inmunogenicidad, en comparación con precursores de colágeno biológico no purificado104. Además, el método de reticulado DHT utilizado en nuestro protocolo evita el uso de reactivos químicos de entrecruzamiento tales como aldehídos, isocianatos y carbodiimidas, que pueden producir toxicidad y respuestas inflamatorias105. Continuando con la caracterización de las estructuras obtenidas, la Figura 2.15 se muestran los análisis XRD. Los picos agudos correspondientes a la reflexión (100) que se obtiene por SAXRD, se detectan para las tres muestras. Esta reflexión es característica de la SBA-1595 y de los materiales que presentan nanoporos ordenados en su estructura, sin embargo, para los materiales revestidos con colágeno se observa que este pico es menos intenso y presenta un cambio de posición y un ligero ensanchamiento, en comparación con la estructura no revestida. En los diagramas de XRD se observa una banda difusa a 2Ө ≈ 22 que indica el carácter vítreo de las estructuras fabricadas y la ausencia de eventos de cristalización hasta los 800 °C106, resultado que se confirmó durante el análisis térmico (Ver Figura 2.12). Los análisis de FT-IR de las estructuras procesadas en este trabajo muestran las bandas características de un BG de silicato (Ver Figura 2.16). Se observan los principales modos vibracionales de tensión Si-O-Si en el rango 1000-1300 cm-1, compuesto por dos modos ópticos tranversales, una más intenso centrado a 1100 cm-1 y un hombro localizado a 1240 cm-1107,108. Las vibraciones de flexión simétrica de los enlaces Si-O-Si alrededor de los 800 cm-1, característica de la formación de anillos en la matriz vítrea, y las vibraciones de flexión asimétrica Si-O-Si a los 460 cm-1, están claramente identificados. Capítulo 2 68 12345 (100) Intensidad normalizada 2 Theta (grados) SP8PVA SP8PVA-CFD SP8PVA-CRT 10 20 30 40 50 60 70 80 SP8PVA-CRT SP8PVA-CFD SP8PVA 2 Theta (grados) Intensidad (normalizada) Figura 2.15. Difractogramas (a) SAXRD y (b) XRD para las matrices biomiméticas procesadas. (a) (b) Estructuras matriz biomiméticas 69 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 Número de onda (cm-1) Si-O-Si Si-O-Si Si-O-Si CH3 SP8PVA-CRT SP8PVA-CFD SP8PVA Absorbancia normalizada C-H (Amida I) N-H (Amida II) Si-O-Si Figura 2.16. Análisis FT-IR para las matrices biomiméticas ensayadas. Los espectros de las estructuras matriz finales indican que no existen residuos orgánicos de la espuma de poliuretano o del PVA, confirmando su eliminación completa después del tratamiento térmico. En los espectros FT-IR de las estructuras infiltradas con colágeno se observa la presencia de nuevas bandas correspondientes a la Amida I a 1659 cm-1, Amida II a 1550 cm-1 y las bandas de absorción a 1452 y 1403 cm-1, atribuido a la vibración de flexión de CH3-109,110. Capítulo 2 70 Las morfologías de las estructuras no revestidas (SP8PVA) y revestidas con colágeno (SP8PVA-CFD y SP8PVA-CRT) se observaron mediante SEM (Figura 2.17). Todas las estructuras exhiben una red macroporosa interconectada que indica que el revestimiento de colágeno aplicado no afecta significativamente ni el tamaño de los macroporos ni la interconectividad de estos, como se ha mencionado anteriormente. El análisis de imágenes de las micrografías obtenidas de SP8PVA, SP8PVA-CFD y SP8PVA-CRT indica un tamaño de macroporos promedio de 297, 312 y 310 μm y un grosor de pared de poro de 49, 50 y 50 μm, respectivamente. Un mayor aumento de las secciones transversales sugiere que el revestimiento se distribuye homogéneamente y que el colágeno se adhiere firmemente a la superficie de la estructura. Además, no se observan residuos o indicaciones de que el revestimiento se haya desgarrado durante el corte transversal de las estructuras procesadas. Las micrografías con mayor aumento muestran la existencia de una película similar al tejido sobre la superficie de las estructuras recubiertas, que se acompaña de algunos efectos de carga evidentes en el contraste que se observa en las imágenes. Estructuras matriz biomiméticas 71 Figura 2.17. Micrografías SEM de red macroporosa y la microestructura de las paredes de los poros a diferentes magnificaciones. En la Figura 2.18 se muestran micrografías SEM a altas magnificaciones que permiten comparar el sustrato superficial de las estructuras revestidas de colágeno con el SP8PVA (sin revestimiento). Se observa como el colágeno forma láminas delgadas que cubren la superficie rugosa de la estructura (flechas en las micrografías), sin embargo, existen diferencias significativas en la textura entre los materiales recubiertos por colágeno congelado-liofilizado y colágeno secado a temperatura ambiente. Es evidente una mayor porosidad y textura para la muestra recubierta de colágeno congelado-liofilizado, donde las nanofibras de colágeno forman una red visible para el SP8PVA-CFD. 200 µ m 500 µ m 1 mm SP8PVA SP8PVA-CFD SP8PVA-CRT Capítulo 2 72 En general, las micrografías SEM sugieren una fuerte adhesión del biopolímero al sustrato cerámico. Esto puede ser consecuencia de presentar puntos isoeléctricos (pI) opuestos. Al incorporar la suspensión de fibrillas de colágeno (pH ≈ 7), cuyas moléculas de colágeno presentan una carga positiva (pI ≈ 7.5) 111, en un sustrato cerámico cuyo pI esta alrededor de 395, puede generarse una interacción electrostática fuerte entre las moléculas de colágeno y el sustrato durante el proceso de adsorción. En la Figura 2.19 a se muestran las isotermas de adsorción y desorción de N2 correspondientes a las estructuras procesadas SP8PVA, SP8PVA-CFD y SP8PVA- CRT, respectivamente. Todas las isotermas obtenidas por fisisorción de N2 son tipo IV y exhiben un ciclo de histéresis tipo I característico de la condensación capilar que ocurren en materiales mesoporosos. Las distribuciones de diámetro de poro determinadas por el método BJH que se muestran en la Figura 2.19 b indican distribuciones monodispersas con un diámetro medio de poro entre 4 y 5 nm. También se observa una disminución del volumen de poro para las estructuras revestidas de colágeno, especialmente para la estructura SP8PVA-CRT. Estructuras matriz biomiméticas 73 Figura 2.18. Micrografías SEM a altas magnificaciones de las superficies de las tres estructuras procesadas. La superficie rugosa de la estructura sin revestimiento SP8PVA. Flechas en las micrografías SP8PVA-CFD y SP8PVA-CRT indican las nanofibrillas de colágeno y los puntos donde estas se han adherido a la superficie de la estructura matriz. 50 µm SP8PVA-CRT 50 µm SP8PVA-CFD SP8PVA Capítulo 2 74 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 SP8PVA SP8PVA-CFD SP8PVA-CRT Presión relativa (P/P0) Volumen adsorbido (cm3.g-1 STP) 2345678910 0.00 0.01 0.02 Diámetro de poro (nm) Volumen de poro (cm3.g-1) SP8PVA SP8PVA-CFD SP8PVA-CRT Figura 2.19. Fisisorción de N2 para las estructuras procesadas. (a) Isotermas y (b) distribución BJH de diámetro de poro, respectivamente. (a) (b) Estructuras matriz biomiméticas 75 La Tabla 2.3 presenta la superficie específica calculada por el método BET (SBET), el volumen total y diámetro de nanoporos, obtenidos por análisis de fisisorción de N2, para las tres estructuras procesadas. Tabla 2.3. Parámetros texturales de las estructuras procesadas. Si bien, se mencionó antes que la incorporación de PVA no afectaba los valores de densidad y porosidad total con respecto a las estructuras libres de tensioactivo, si se observan modificaciones en otros parámetros texturales nanoscópicos, como el área superficial y el volumen de nanoporos. Estos parámetros se ven significativamente afectados mostrando una drástica disminución de más del 50 % con respecto a las estructuras libres de PVA, que presentaban una SBET de 130 m2·g-1. Sin embargo, el área superficial que presenta el SP8PVA, 42 m2·g-1, sigue siendo excepcional con respecto las estructuras macroporosas basadas en BG convencionales sintetizados por el método de fusión41,52. Publicaciones anteriores que informan sobre estructuras macroporosas a base de BG y MBG fabricados mediante la técnica de réplica, con o sin aglutinante, se recogen en la Tabla 2.2. Sin embargo, aunque en la bibliografía no se han encontrado datos específicos sobre el área superficial de estas estructuras, se puede inferir valores de superficie específica bajos. Por un lado, el valor de área superficial para el Bioglass® 45S5 particulado, vidrio que se sintetiza Matriz biomimética Área superficial especifica (m2·g-1) Volumen total de nanoporo (cm3·g-1) Diámetro de poro (nm) SP8PVA 42 0.06 4.3 SP8PVA-CFD 32 0.04 4.4 SP8PVA-CRT 25 0.03 3.8 Capítulo 2 82 Figura 2.23. Comparación de micrografías SEM la de superficie de las estructuras, después de 24 y 72 h de tratamiento con SBF, mostrando una reducción del tamaño de macroporos creciente con el tiempo, debido a la deposición en fase mineral. SP8PVA-CRT SP8PVA-CFD SP8PVA 500 µ m 500 µ m 24 h 72h Estructuras matriz biomiméticas 83 La Figura 2.24 muestra micrografías de SEM a alta magnificación de las superficies de las estructuras después de 168 h de tratamiento en SBF, donde se observa que la superficie de la estructura sin revestimiento, SP8PVA, exhibe morfologías de coliflor típicas de la cristalización del CaP. En el caso de las estructuras revestidos con colágeno, las partículas de HA cristalina no forman agregados redondos, sino que en su lugar, decoran las nanofibras de colágeno. Por otro lado, el análisis EDX de dichas superficies indica relaciones de intensidad de señal P/Si y Ca/Si mayores para las estructuras revestidos con colágeno en comparación con la SP8PVA, lo que sugiere una formación de capa de CaP más gruesa y homogénea sobre los materiales revestidos con colágeno (Ver Figura 2.25). La disposición de cristales de CaP a lo largo de las fibras de colágeno, en lugar de una formación de agregados más grande, como se muestra para el SP8PVA, sugiere que el colágeno sirve de plantilla para la nucleación de HA. Ensayos previos de bioactividad in vitro utilizando cerámica revestida de colágeno han señalado conclusiones similares120. Esta es una propiedad particular del colágeno, ya que la bibliografía sugiere que el uso de biopolímeros alternativos como la celulosa60 y la gelatina121, retardan ligeramente la formación de HA en ensayos de bioactividad similares al descrito en este apartado. Capítulo 2 84 Figura 2.24. Micrografías SEM a diferentes magnificaciones de las superficies de las estructuras ensayadas después de 168 h de tratamiento en SBF. Las flechas en la imagen SP8PVA de alta magnificación indican las morfologías típicas de agregados de CaP cristalino. Las flechas en las micrografías para SP8PVA-CFD y SP8PVA-CRT a baja magnificación señalan las nanofibras del colágeno, respectivamente. A mayores aumentos, a la derecha, las fibras de colágeno aparecen completamente decoradas con cristales de CaP. SP8PVA-CRT SP8PVA-CFD SP8PVA 20 µm 5 µm Estructuras matriz biomiméticas 85 Figura 2.25. Análisis EDX para la superficies de las estructuras (a) SP8PVA, (b) SP8PVA-CFD y (c) SP8PVA-CRT, respectivamente, antes y después de 168 h de tratamiento en SBF. Dentro de cada gráfico se presentan las relaciones de intensidades P/Si y Ca/Si, antes (negro) y después (rojo), del tratamiento en SBF, para cada una de las estructuras ensayas. 12345 0 200 400 600 800 1000 1200 Cuentas Si PCa Energía (keV) P/Si: 0.000 Ca/Si: 0.015 P/Si: 0.055 Ca/Si: 0.050 Antes SBF Después SBF 12345 0 200 400 600 800 1000 Antes SBF Después SBF P/Si: 0.145 Ca/Si: 0.135 P/Si: 0.000 Ca/Si: 0.030 Energía (keV) Ca P Si Cuentas 12345 0 200 400 600 800 Antes SBF Después SBF P/Si: 0.098 Ca/Si: 0.085 P/Si: 0.000 Ca/Si: 0.035 Si PCa Energía (keV) Cuentas (a) (b) (c) Capítulo 2 86 Las estructuras ensayadas también se analizaron por FT-IR y XRD después de 24, 72 y 168 h de tratamiento en SBF para evaluar su bioactividad in vitro. La Figura 2.26 muestra los resultados de los análisis de FT-IR, mientras que en la Figura 18 se pueden observar los resultados de los análisis XRD. En los espectros FT-IR solo se destacan las nuevas bandas detectadas en comparación con los espectros de las estructuras no tratados con SBF. El pico a 1630 cm-1, asignado a la vibración de los enlaces O-H, indica la presencia de agua retenida dentro de las muestras después del tratamiento de inmersión. El pico a 1070 cm-1 corresponde al modo de tensión asimétrico del enlace P-O, mientras que las bandas a 563 y 602 cm-1 son características del fosfato cristalino122–124. La formación de especies de fosfato en la superficie de los tres tipos de estructuras ensayadas es detectada por FT-IR después de 24 h de inmersión en SBF. Cuando se aumenta el tiempo de tratamiento a 168 h, se observa la definición definitiva de los picos distintivos a 563 y 602 cm-1, indicador de la naturaleza cristalina de las fases de fosfato presente. Los difractogramas de XRD confirman la deposición de partículas de HA cristalina en la superficie de las estructuras después del tratamiento en SBF (Ver Figura 2.27). Después de las 72 h de inmersión en SBF, las estructuras revestidas de colágeno muestran en su difractograma los picos característicos del HA (ficha JCPDS 9-432). Con el aumento en el tratamiento de inmersión, los cristales de HA crecen en todas las muestras, incluyendo el material sin revestimiento de colágeno, SP8PVA. Estructuras matriz biomiméticas 87 Figura 2.26. Análisis FT-IR de las estructuras estudiadas después de 24, 72 y 168 h de tratamiento en SBF. 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 SP8PVA 24 h SP8PVA-CRT SP8PVA-CFD Número de onda (cm-1) Absorbancia normalizada PO4 -3 H-O-H 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 72 h Absorbancia normalizada Número de onda (cm-1) SP8PVA-CRT SP8PVA-CFD SP8PVA H-O-H PO4 -3 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 PO4 -3 Número de onda (cm-1) 168 h Absorbancia normalizada SP8PVA-CRT SP8PVA-CFD SP8PVA H-O-H PO4 -3 Capítulo 2 88 Figura 2.27. Análisis XRD de las estructuras estudiadas después de 24, 72 y 168 h de tratamiento en SBF. 10 20 30 40 50 60 70 80 SP8PVA-CRT SP8PVA-CFD SP8PVA 24 h Absorbancia normalizada 2 Theta (grados) 10 20 30 40 50 60 70 80 2 Theta (grados) (300) (112) (211) Absorbancia normalizada 72 h SP8PVA-CRT SP8PVA-CFD SP8PVA 10 20 30 40 50 60 70 80 (002) 168 h Absorbancia normalizada 2 Theta (grados) (211) (112) (300) SP8PVA-CRT SP8PVA-CFD SP8PVA Estructuras matriz biomiméticas 89 Como puede observarse, el recubrimiento de colágeno fibrilar nanoestructurado no sólo no inhibe la respuesta bioactiva de las estructuras reticuladas sino que también promueve la mineralización de HA en la superficie del material. Tanto los resultados de SEM como XRD indican que, después de las primeras 72 h de tratamiento en SBF, el HA empieza a depositarse en la superficie de las estructuras revestidas con colágeno. Por un lado, en los difractogramas se detectan picos incipientes que corresponden al HA cristalina y, por otro lado, en las micrografías se observa un espesamiento de la pared de la estructura. Este no es un comportamiento inesperado para el colágeno tipo I estructurado, que puede servir como una plantilla para controlar la nucleación y el crecimiento de HA cristales, como sugieren las micrografías de SEM que se muestran en la Figura 2.24 125,126. De hecho, algunos autores sugieren que el colágeno tiene la capacidad de secuestrar de grandes cantidades de iones de calcio, fosfato y carbonato, que precipitan espontáneamente en cristales de HA125. Si bien es cierto que en la bibliografía hay numerosas estructuras matriz con diferentes composiciones y técnicas para su uso en ingeniería tisular, no se ha encontrado ningún trabajo previo con la composición, técnica de procesamiento y de optimización que se indican en este trabajo de Tesis. Además, las nuevas estructuras híbridas altamente porosas desarrolladas en este trabajo presentan propiedades muy interesantes para aplicaciones en ingeniería de tejidos óseos. La formulación química inorgánica que favorece el proceso de osteogénesis127, las propiedades texturales que proporcionan mayor reactividad128, la mejora significativa en la resistencia a la compresión y la mineralización de HA en la superficie del material, producto del revestimiento de colágeno. Capítulo 2 90 5. Conclusiones Se han procesado estructuras matriz macroporosas nanoestructuradas mediante la técnica de réplica a base de una mezcla de partículas de sílice tipo SBA-15 y un sol MBG, optimizadas con la incorporación de PVA.  Las matrices biomiméticas obtenidas son tridimensionales, con alta superficie específica, formada por macroporos abiertos e interconectados y con una nanoporosidad ordenada bien definida.  Las estructuras obtenidas han sido revestidas con una pequeña capa de colágeno fibrilar (0.73 % de colágeno en peso respecto al contenido total). La incorporacion de colágeno produce una mejora de la resistencia a la compresión de hasta 0.3 MPa, a la vez que mantiene relevantes propiedades texturales. El ensayo de bioactividad in vitro indica que el revestimiento de colágeno fibrilar nanoestructurado activa la cinética de la mineralización de HA.  En base a los resultados presentado podemos afirmar que, en este trabajo se han obtenido estructuras matriz con porosidad dual macro-nano que mimetizan la estructura ósea, consistente en una organización jerárquica que se forma por la combinación ordenada de HA y colágeno. Los resultados de este capítulo se han publicado en un artículo que lleva por título “High Surface Area Biopolymeric-Ceramic Scaffolds for Hard Tissue Engineering”. El artículo se puede encontrar en la sección de Anexos (Anexo 3) y corresponde a la siguiente referencia: Romero- Sánchez, L. B, S. Borrego-González, and Díaz-Cuenca A. 2017. “High Surface Area Biopolymeric-Ceramic Scaffolds for Hard Tissue Engineering.” Biomedical Physics & Engineering Express 3 (3). IOP Publishing: 035012. doi:10.1088/2057-1976/aa7001. Estructuras matriz biomiméticas 91 7. 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Zhao1 sintetizaron en el 2004 los primeros MBG, combinando la química sol-gel del sistema multicomponente SiO2- CaO-P2O5 con las bases de la química supramolecular de surfactantes. Esto dio lugar a una nueva generación de MBG altamente ordenados que exhiben comportamiento y bioactividad mejoradas, aumento de la cinética de mineralización y capacidad para albergar agentes activos que contribuyen a los procesos de reparación del tejido. Así, esta reciente inclusión de mesoporosidad ordenada en los BG ha supuesto un avance significativo en estos materiales. Por un lado, los altos valores de área específica suponen una mayor reactividad que favorece el proceso biactivo. Por otra parte, los MBG tienen un tamaño de partícula micrométrico que presentan en Capítulo 3 114 salud general del organismo. Estudios en animales y humanos han demostrado que el Cu está implicado en la función de varias enzimas y han demostrado que es necesario para el crecimiento infantil, mecanismos de defensa, resistencia ósea, maduración de las células rojas y blancas, transporte de hierro, metabolismo del colesterol y glucosa, contractilidad miocárdica y el desarrollo del cerebro53,54. La naturaleza esencial del Cu para los seres humanos se demostró por primera vez durante la década de los 60 en los niños malnutridos de Perú55. Las manifestaciones clínicas más constantes de la deficiencia de Cu adquirida son anemia, neutropenia y anomalías óseas. El papel del Cu en la formación e integridad ósea y mineralización esquelética es fundamental. El Cu desempeña una función catalítica clave como cofactor para la lisil oxidasa, una amina oxidasa extracelular dependiente de Cu que es importante en la primera etapa de la maduración (reticulación) del colágeno para formar fibrillas estables56,57. Estudios en animales experimentales han demostrado que la deficiencia de Cu puede reducir en gran medida la actividad de lisil oxidasa en el hueso58 y perjudicar la reticulación del colágeno en la matriz ósea orgánica conduciendo a una menor resistencia a la tracción59–61. Además estudios utilizando tanto el Cu en forma de sal soluble como de material nanoparticulado han mostrado evidencias de las propiedades antimicrobianas62, osteogénicas63 y angiogénicas64,65. Recientemente se ha explorado la actividad del Cu en las terapias de regeneración tisular al incorporarlo a los biomateriales por diferentes rutas. En 1998, Kim y col.66 sintetizaron un HA al que le incorporaron Cu (HA-Cu), no encontrando actividad antibacteriana evidente66. Sin embargo, en el 2009, Yang y col.67 Materiales MBG con funcionallidad para la administración local de iones terapéuticos 115 sintetizaron un HA que contenía una mezcla de Cu y Ag, encontrando que estos iones exhibían actividad antibacteriana 67. Del mismo modo, otros investigadores publicaron la síntesis de TCP con Cu, observando actividad bacteriana mejorada en comparación con el TCP libre de Cu68. El mismo año, Zhao y col.69, ensayaron la actividad antibacteriana de nanocomposites de polieturano recubiertas por una HA modificada con Cu (HA-Cu) en Escherichia coli y Staphylococcus aureus, encontrando un incremento en el efecto bactericida que atribuyeron a la presencia de Cu69. Más recientemente, Shanmugam y Gopal, sintentizaron HA-Cu, por el método de co-precipitación, en el que Cu sustituyó una parte de Ca en el compuesto. Los resultados mostraron que el material reducía las colonias de Escherichia coli y Staphylococcus aureus en más del 80 %, y al aumentaba la actividad antibacteriana contra cepas Gram-positivas y Gram-negativas70. Por otro lado, se sintetizaron y estudiaron fibras de vidrio a base de fosfato con iones de Cu para aplicaciones en cicatrización de heridas, concluyendo que el Cu tiene una fuerte y excelente propiedad antibacteriana. De igual forma, Hsieh y col.71 sintetizaron una película fina de Ta a la que le incorporaron de nanopartículas de Cu, encontrando que aparte de favorecer sus propiedades mecánicas mostraba buena biocompatibilidad y propiedades antibacterianas, lo que sugirió una excelente opción para revestir implantes metálicos para aplicaciones médicas72. Los mismos resultados fueron observados al hacer recubrimientos en aleaciones de Ti con Cu y HA-Cu. Además de encontrar que la actividad antibacteriana in vitro era eficazmente alta frente a la colonización bacteriana de la Escherichia coli, los ensayos in vitro e in vivo indicaron que los materiales recubiertos por Cu estimulaban la diferenciación osteogénica y la expresión de genes involucrados en el proceso angiogénico73–79. Capítulo 3 116 Por otro lado, Giavaresi y col.80 mezclaron partículas óseas alogénicas con ácido hialurónico enriquecido con Cu y las implantaron en ratas. Un mes después, el grupo expuesto al biomaterial con Cu, presentaba una densidad vascular más alta alrededor del implante, comparada con el grupo no expuesto a Cu. Ellos concluyeron que el Cu era un ion que tenía efectos angiogénicos al estimular la vascularización tisular y que sería adecuado como recurso en transplantes de aloinjertos80. También se incorporó Cu en matrices de polipropileno, para formar una película porosa delgada, que mostró una buena y rápida propiedad antibacteriana frente a Staphylococcu aureus, organismo que es resistente a la meticilina 81,82. Mientras que Gosau y col. añadieron Cu a un material de silicona para implantes mamarios y encontraron que tenían anti-adherencia y efecto antibacteriano contra Staphyolcoccus epidermidis83,84. En el 2011, se incorporó Cu al acero inoxidable de grado médico 317L recientemente desarrollado para aplicación ortopédica, obteniendo un nuevo material, el 317L-Cu, con fuerte actividad antimicrobiana y biocompatibilidad in vitro e in vivo que sugería ser un biomaterial apto para reducir las infecciones relacionadas con implantes85. También encontraron que el 317L-Cu favorecía la diferenciación osteogénica mediante el aumento de la proliferación y adherencia de los osteoblastos, mejorando la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP, por Alkaline phosphatase) y potenciando la expresión de genes relacionadas con el proceso osteogénico. Además, en los ensayos in vivo, observaron que el 317L-Cu aumentaba la formación de tejido óseo alrededor del implante y un incremento en el volumen y densidad mineral ósea, con respecto al 317L86. Dadas las excelentes propiedades antibacterianas y osteogénicas observadas en los biomateriales que contenían Cu, se ha continuado investigando. Así, el grupo de Materiales MBG con funcionallidad para la administración local de iones terapéuticos 117 investigación de Ren y col.87, han ensayado la incorporación de Cu en implantes metálicos. Diseñaron y desarrollaron un acero inoxidable, 316L un material comúnmente utilizado para la fabricación de stents coronarios, que contenía Cu (316L-Cu). Encontraron que el 316L-Cu favorecía la adhesión de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC, por Human umbilical vein endothelial cells) en la superficie del biomaterial, y que la migración y el crecimiento celular de co-cultivos, después de 24 y 72 h, eran más evidentes en comparación con el 316L. Estos autores concluyeron que el Cu contenido en estos aceros inoxidables mejora su bioadaptación con el tejido vascular y que estimulan el proceso angiogénico87. En la misma línea, añadieron Cu en acero inoxidable 304 con aplicación en ortodoncia. En comparación con el acero inoxidable 304 convencional, el 304-Cu fue capaz de matar eficazmente la Porphyromonas gingivalis, que se reconoce generalmente como las bacterias principales que causan periimplantitis88. Barralet y col.89 sintetizaron y estudiaron una estructura matriz biocerámica TCP. La estructura macroporosa se funcionalizó con sulfato de Cu (CuSO4)89. Los resultados de los ensayos in vivo, sugieren que el CuSO4 a bajas concentraciones conduce a la formación de microvasos orientados a lo largo del eje de los macroporos (angiogenésis), favoreciendo así, la cicatrización de heridas. Por otro lado, Kong y col.44 desarrollaron una biocerámica de silicato cálcico (CS, por Calcium silicate) que contenía Cu (CS-Cu), para su aplicación en ingeniería de tejidos. Encontraron que los iones de Cu en los extractos aumentaron los túbulos formados por HUVEC y mejoraron la expresión de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por Vascular endothelial growth factor). Resultados similares fueron reportados por Tian y col. para una cerámica análoga90. Capítulo 3 118 En el contexto de los BG existen algunas investigaciones donde se ha ensayado incorporar iones Cu con el fin de potencializar su actividad en términos de regeneración de tejidos. El primer acercamiento esta reportado por Erol y col.91, que fabricaron y caracterizaron un estructura matriz basada en vidrios de borosilicato, funcionalizada con Cu, con la finalidad de promover el potencial angiogénico91. Wang y col.92,93 fabricaron el mismo tipo de estructura e hicieron ensayos in vivo. Encontraron que el Cu estimulaba el aumento de la actividad de la ALP en células madre humanas mesenquimales (HBMSC, por Human bone marrow derived stem cells), que, a su vez, favorece la formación de vasos sanguíneos. De esta forma, corroboraron el efecto angiogénico de los iones Cu administrados localmente durante la degradación de la estructura. En esta misma línea, Zhao y col.94 fabricaron microfibras de vidrio de borato con Cu, que mostraron una capacidad prometedora para estimular la angiogénesis y curar defectos de la piel, tanto in vitro como in vivo. El mismo año, D'Mello y col.95 investigaron in vivo el efecto de un estructura de quitosano funcionalizada con Cu en regeneración ósea, y encontraron un aumento significativo en el volumen óseo de los defectos tratados con dichas estructuras de quitosano-Cu. Por su parte, Theodorou y col.96, sintetizaron y caracterizaron una estructura matriz biomimética vitrocerámica, basada en un BG de silicato que, además, contenía Mg y Cu. Encontraron que este biomaterial favorece la adherencia y proliferación a largo plazo de células madre de pulpa dental (DPSC, por Dental pulp stem cells) y bioactividad in vitro. Mientras tanto, Bejarano y col.97 fabricaron otra estructura de PLA mezclado con partículas de BG (60SiO2-25CaO-11Na2O-4P2O5), al cual le incorporaron Cu, encontrando que estas estructuras presentaban actividad antibacterial y favorecían la expresión de marcadores angiogénicos. Materiales MBG con funcionallidad para la administración local de iones terapéuticos 119 Con respecto a la incorporación de Cu en los MBG, la única aproximación publicada es una trabajo de Wu y col. (Ver Tabla 3.1)34. Ellos fabricaron una estructura matriz de MBG con Cu en su composición, y encontraron que la administración local de iones Cu aumenta las expresiones génicas relacionadas con el osteogénesis, la actividad de ALP, la secreción del factor inducible por hipoxia (HIF, por Hypoxia-inducible factors) y VEGF en células HBMSC. 4. El proceso de angiogénesis El término angiogénesis se refiere al proceso que conduce a la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de la vasculatura pre-existente98,99. El proceso de pasos múltiples de la angiogénesis incluye la migración y proliferación de células endoteliales, la formación y organización de grupos celulares en estructuras tubulares que eventualmente se unirán, para finalmente madurar en vasos sanguíneos estables. La angiogénesis es de vital importancia en eventos fisiológicos como el desarrollo embrionario, la regeneración endometrial y el crecimiento de la vasculatura y también en procesos patológicos como la metátesis o la diseminación del cáncer, ya que supone la construcción de nuevas vías para proveer de manera adecuada el oxígeno y los nutrientes98,100. Por tanto, la angiogénesis tiene un papel fundamental en el desarrollo y mantenimiento del esqueleto y en la reparación de fracturas, así como para cualquier proceso de regeneración tisular101. Con el avance de las técnicas en biología molecular y celular se han podido caracterizar las moléculas y situaciones que afectan a este proceso (llamadas factores angiogénicos), lo cual constituye un acercamiento a entender su papel en el tejido óseo102. Probablemente, el más importante de ellos, porque desencadena la respuesta angiogénica, es la Capítulo 3 120 hipoxia, definida como la deficiencia de oxígeno necesario para el normal funcionamiento del metabolismo celular aeróbico103,104. Durante la hipoxia se activa una cascada señalizadora que promueve la inducción o represión de la transcripción de una multitud de genes implicados en eventos tales como la angiogénesis, metabolismo de la glucosa y supervivencia/muerte celular, etc. La clave de esta respuesta a la hipoxia se encuentra en un factor de transcripción, el HIF que es un factor de transcripción α/β-heterodimérico que regula la adaptación celular a la falta de oxígeno105,106. El HIF funciona como un heterodímero que comprende una subunidad β expresada constitutivamente y una subunidad α lábil, cuya expresión esta enormemente regulada. La síntesis del HIF- 1α está regulada por mecanismos independientes del oxígeno, mientras que la regulación de su degradación es dependiente de la concentración de oxígeno. Bajo condiciones de normoxia el HIF-1α es hidroxilado mediante la acción de enzimas con dominios prolina-4-hidroxilasas denominado dominio polihidroxilasas (PHD, por Polyl-hydroxylase domain) y se une a la proteína supresora de tumores von Hippel-Lindau (pVHL, por von Hippel-lindau tumor supresor protein). La proteína VHL es necesaria para unir la ubiquitina y así, el complejo ubiquitina-HIF-1α es reconocido por el proteosoma y degradado (Ver Figura 3.2)107,108. Mientras que en condiciones de hipoxia, que se desencadena cuando la presión parcial de oxígeno está por debajo del 6 %, la degradación de HIF-1α queda bloqueada por déficit de oxígeno, el HIF-1α se acumula y se trasloca dentro del núcleo de la célula donde se dimeriza con el HIF-1β e interactúa con otros cofactores para el ensamblaje del complejo de transcripción del HIF-1. Este factor de transcripción es crucial para la regular la expresión del VEGF109. Además del VEGF, existen distintas moléculas implicadas en la regulación positiva de la Materiales MBG con funcionallidad para la administración local de iones terapéuticos 121 angiogénesis, incluyendo diversos factores de crecimiento, citoquinas y hormonas104. Pero actualmente se reconoce al sistema que incluye al VEGF y sus receptores como el principal regulador de las células endoteliales vasculares y de la formación de vasos sanguíneos. Figura 3.2. Esquema del mecanismos de regulación del HIF-1α bajo condiciones de normoxia e hipoxia (Figura modificada de Rahimi, 2012110). La angiogénesis también está regulada por metales exógenos, derivados del ambiente, incluyendo al Cd, Ni, V y As y metales endógenos como el Cu, Fe, Zn, que regulan la actividad de proteínas esenciales111. En los años 80, se reconoce al Cu como un factor modulador de la angiogénesis y se concluye que es imprescindible para la formación de nuevos vasos sanguíneos112. McAuslen y Reilly113,114 fueron los primeros en desarrollar la hipótesis de que la actividad angiogénica del Cu se debe a su capacidad para inducir la migración de células endoteliales. Ellos observaron que el Cu inducia la migración de las células endoteliales de aorta bovina (BAEC, por Bovine aortic endothelial cells), mientras que otros iones de metales de transición como el Zn, a las mismas Capítulo 3 122 concentraciones, no tenían ningún efecto de motilidad celular113. A partir de estos primeros resultados, se empezaron a desarrollar más ensayos para determinar cuál era el rol del Cu en el proceso de angiogénesis. 4.1. Propiedades angiogénicas del Cu El Cu es un metal de transición esencial en el cuerpo humano cuya química de coordinación y propiedades redox lo convierte en un elemento fundamental para numerosas funciones de transporte y reacciones catalíticas en las células vivas y sus organelos, particularmente en la mitocondria, así como en órganos con alta actividad metabólica como el hígado, el riñón, el cerebro y el corazón115. El Cu se incorpora a partir de la dieta y la absorción tiene lugar en las células epiteliales del intestino delgado a través de difusión facilitada116–118. El Cu extracelular es reducido a Cu+1 por enzimas reductasas que se encuentran en la membrana plasmática para luego ser captados por la proteína CTR1 hacia el citoplasma 119. En condiciones de homeostasis celular los niveles estimados de Cu libre en el citoplasma se encuentra en concentraciones por debajo de 1 x 10-18 M120. Luego de atravesar la membrana plasmática, los iones Cu+1 son trasportados al aparato de Golgi, a la mitocondria, y a las cuproenzimas citosólicas por medio de diversos chaperones que actúan como escoltas quelando al Cu para protegerlos de los mecanismos de destoxificación celular y cuya función es distribuir y transferir el Cu a blancos celulares específicos, que se describen a continuación120–122 (Ver Figura 3.3): • La metaloproteínas de Cu para la superóxido dismutasa (CCS, por Copper chaperone for superoxide dismutase) le ceden los iones Cu a la enzima reductora dismutasa Cu/Zn que tiene actividad peroxidasa (SOD1, por Superoxide dismutase), que degrada el radical libre Materiales MBG con funcionallidad para la administración local de iones terapéuticos 123 conocido como superóxido123,124. Ya que el Cu puede cambiar su estado de oxidación aceptando o donando electrones, y tanto el Cu+1 como el Cu+2 son igualmente activos y pueden participar en reacciones que generan radicales superóxidos (O2-) y peróxido de hidrógeno (H2O2) que comprometen las funciones celulares y contribuye a la actividad redox incontrolada de Cu, esta enzima cataliza la dismutación del O2- a H2O2 y O2. Mediante la eliminación del radical O2-, la CuZnSOD disminuye el riesgo de formación de radical hidroxilo (-OH) a través de la reacción de Haber-Weiss. • La metalchaperona de Cu proteína antioxidante 1 (ATOX 1, por Antioxidant protein 1) transfiere estos iones metálicos hacia las enzimas de trifosfato de adenosina (ATP, por Adenosine triphosphate) encargadas del transporte de Cu, ATP7A y ATP7B, que lo exportan al aparato de Golgi125,126. La ATP7A sirve de almacenamiento transitorio hasta su cesión al transportador ATP7B, que lo vehiculiza desde el citoplasma al interior del aparato de Golgi donde cede a cada molécula de apoceruloplasmina seis átomos de cobre y la transforma en holoceruloplasmina y, en esta forma, pasa al plasma. En cambio, cuando el Cu está en exceso en el interior del citoplasma, el transportador ATP7B modifica su situación y se coloca en una zona post-Golgi donde facilita la eliminación de vesículas con alto contenido de Cu al canalículo biliar. • La chaperona de Cu para la citocromo c oxidasa subunidad 17 (COX 17, por Cytochrome c oxidase) es una proteína ubicada en el citoplasma y en el espacio intermembranal que transporta los iones Cu desde el citoplasma a las proteínas de membrana que sintetizan para el Capítulo 3 130 que se van adminitrando en el ambiente conforme ocurre la degradación del biomaterial152. Recientemente, en un sistema más sencillo, se evaluó la capacidad angiogénica del ion Si administrado durante la degradación de cerámicas de CS42–44,156–158. Li y col.43 investigaron los efectos de los iones resultantes de la degradación de CS sobre el VEGF y sobre la proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2, por Bone Morphogenetic Protein) en co-cultivos de células HUVEC y de células HBMSC, encontrando que el Si regula la expresión del VEGF y que estimula la diferenciación osteogénica de las HBMSC y la vascularización en HUVEC. El mismo año, este mismo grupo sintetizó un CS-Cu con la intención de mejorar las propiedades angiogénicas que ya habían observado anteriormente en el CS. Concluyeron que existe una contribución sinérgica entre Cu y el Si, que aumenta la expresión de los factores angiogénicos y estimula la neovascularización, sugiriendo que el CS-Cu en un material notablemente adecuado para la regeneración de vasos sanguíneos en ingeniería tisular44. Así, hay evidencia reciente en la literatura que el Si, producto de la redisolución de las biocerámicas y BG, es un ion que estimula la regeneración del hueso al actuar como un factor angiogénico que regula e induce la neovascularización158, sin embargo, es importante hacer notar los escasos estudios de las propiedades angiogénicas de los MBG en el sistema SiO2-CaO-P2O5. Como se mencionó antes, estos MBG son típicamente utilizados como matrices para funcionalizarlos con factores pro-angiogénicos y/o con iones terapéuticos que promueven la angiogénesis15,147,159. Y aunque en la bibliografía se indica que estos MBG altamente ordenados pueden favorecer la angiogénesis, principalmente por el efecto del Si, es evidente la falta de ensayos significativos en el que evalúen las Materiales MBG con funcionallidad para la administración local de iones terapéuticos 131 propiedades angiogénicas propias del MBG en el sistema SiO2-CaO-P2O5 y de los productos de su redisolución. Por todo ello, la incorporación de Cu a materiales MBG se presenta como una opción muy interesante y prometedora para mejorar las propiedades de estos biomateriales. 5. Matrices MBG incluyendo Cu en su composición En los puntos anteriores se ha explicado el interés de los MBG como una matriz administradora de iones terapéuticos en el proceso de su biodegradación. Asimismo, se ha detallado la importancia del Cu como un oligoelemento con numerosas propiedades de interés en las terapias de regeneración tisular. La ruta de síntesis más utilizada para incorporar iones terapéuticos en la composición de los MBG en la propia síntesis sol-gel. Como se mencionó antes, esta técnica es particularmente útil porque permite la síntesis directa de materiales multicomponentes. Los precursores se mezclan a nivel molecular y se integran durante la formación de la red vítrea160. El proceso de impregnación, es otro método para incorporar metales dentro de un material poroso. Este método consiste en el llenado de los poros de la superficie del material con una solución del precursor metálico (normalmente una sal), en el que el volumen generalmente es el necesario para llenar el volumen de poros. Posteriormente el material impregnado se somete a un tratamiento térmico para eliminar determinados componentes de los precursores, mientras el ion metalico permanece en el interior de los poros del material. La impregnación es el método clásico de preparación de catalizadores a nivel industrial, sin embargo, es útil para cualquier material que presente una superficie porosa161. Como los materiales MBG derivados del proceso sol-gel se caracterizan por presentar micro/nano poros Capítulo 3 132 y alta área superficial, son candidatos oportunos para incorporar iones en su composición mediante el método de impregnación162. En este capítulo se abordará la incorporación de Cu en el sistema 80SiO2-15CaO- 5P2O5 por dos rutas de síntesis diferentes. Por un lado, se sintetizará el material MBG-Cu en una única etapa en el proceso sol-gel. Por otro lado, se ensayará la incorporación de Cu en el material MBG utilizando una segunda etapa de impregnación. Considerando que las condiciones de síntesis influyen directamente en las propiedades físico-químicas del material, se caracterizará la microestructura de los biomateriales sintetizados en este capítulo con el fin de esclarecer el mecanismo en el que los iones metálicos, en este caso el Cu, se incorporan en la matriz vítrea o en los poros del material. También se evaluará el mecanismo de degradación del MBG, bioactividad y liberación de los iones que lo componen en función del método de síntesis. 5.1. Procedimiento experimental 5.1.1. Síntesis del material MBG libre de Cu La síntesis del sol MBG se puede consultar en el Capítulo 2. La síntesis se apoya en el método sol-gel, la química supramolecular utilizando surfactantes y el proceso EISA. El sol se transfiere a un cristalizador y mantiene 72 h a temperatura ambiente para que se lleve a cabo el proceso EISA, que dará lugar a la formación de un gel. Posteriormente, el gel se somete a un proceso de envejecimiento en una estufa a 80 ° C durante 72 h para eliminar el agua. Finalmente, para eliminar los nitratos del reactivo de calcio y del tensoactivo, el gel recibe un tratamiento térmico a 700 °C durante 2 h, usando una rampa de velocidad de 1 °C·min-1. Materiales MBG con funcionallidad para la administración local de iones terapéuticos 133 5.1.2. Síntesis de materiales MBG incluyendo Cu en una única etapa En la ruta sol-gel se sigue el mismo procedimiento utilizado para la síntesis del MBG, con la variación de que se incorporan diferentes cantidades nitrato de cobre (Cu(NO3)2·3H2O, 61194 Sigma-Aldrich) directamente en el sol (Ver Figura 3.4). Los nitratos, de Ca y de Cu, se añaden al mismo tiempo, respetando las condiciones de síntesis indicadas en el procedimiento para la síntesis del MBG (Ver Capítulo 2). El resultado es un material particulado color oscuro. En la Tabla 3.2 se observan las composiciones teóricas de los materiales sintetizados y las cantidades de reactivos añadidos para cada caso. Tabla 3.2. Nomenclatura, composición teórica y proporción de precursores para cada uno de los materiales sintetizados por el método sol-gel. Nomenclatura Composición (mol) TEOS (mL) TEP (µL) Ca(NO3)2·4H2O (g) Cu(NO3)2·3H2O (g) SG-MBG- 0.5Cu 80SiO2:14.5CaO:5P2O5:0.5CuO 7.125 685 1.3696 0.0483 SG-MBG- 2.5Cu 80SiO2:12.5CaO:5P2O5:2.5CuO 7.125 685 1.1807 0.2416 SG-MBG-5Cu 80SiO2:10CaO:5P2O5:5CuO 7.125 685 0.9446 0.4832 5.1.3. Síntesis de materiales MBG incluyendo Cu utilizando una segunda etapa de impregnación En esta ruta de síntesis se parte del material particulado MBG 80SiO2:15CaO:5P2O5 sintetizado anteriormente por la ruta sol-gel, como se indica en la sección 2.1, el cual se impregnará con una solución acuosa de Cu(NO3)2·3H2O (Ver Figura 3.4). La solución para impregnar se obtiene disolviendo en 3 mL de DIH2O, diferentes cantidades de Cu(NO3)2·3H2O necesarias para una composición teórica de 0.5, 2.5 y 5 % mol (Ver Tabla 3.3) y se Capítulo 3 134 añade por goteo, con ayuda de una bureta, en 2 g de MBG particulado. El material impregnado adquiere un color azul claro durante la impregnación. Después se seca en estufa a 80 °C durante 24 h y posteriormente es calcinado 700 °C durante 2 h, con una rampa de velocidad de 1 °C·min-1, resultando un material particulado de color negro. Tabla 3.3. Nomenclatura, composición teórica y proporción de precursores para cada uno de los materiales sintetizados por el método de impregnación. Nomenclatura Composición (mol) Cu(NO3)2·3H2O (g) disuelto en DIH2O I-MBG-0.5Cu 80SiO2:14.5CaO:5P2O5:0.5CuO 0.0377 I-MBG-2.5Cu 80SiO2:12.5CaO:5P2O5:2.5CuO 0.1899 I-MBG-5Cu 80SiO2:10CaO:5P2O5:5CuO 0.3798 La nomenclatura empleada indica con un SG y/o I el método de síntesis del material, que corresponden a los métodos de sol-gel e impregnación, respectivamente. El porcentaje molar de Cu incorporado se indica justamente antes del metal. 5.1.4. Caracterización de los materiales Para comprender la estructura de los MBG y su potencialidad como matriz para la administración de iones terapéuticos es necesario un conocimiento profundo de sus propiedades físico-químicas, las cuales están determinadas en gran medida por el método que se haya seguido para su preparación. En este trabajo se emplearan las siguientes técnicas para la caracterización física y química de los materiales: XRF, XRD, SAXRD, fisisorción de N2, espectroscopia FT-IR, R asimismo Figur a Materiales M R AMAN y S se indican l a a 3.4. Esque m M BG con funci o S EM. Estas t a s condicio n m a de las dis i onallidad para t écnicas se n es utilizada s s tintas etapa s la administra c describen e n s . s de las rutas c ión local de io n n la secció n de síntesis u n es terapéutic o 13 5 n de Anexo s u tilizadas. s 5 s , Capítulo 3 136 5.1.5. Ensayos de biodegradabilidad y bioactividad Los ensayos de biodegradación y bioactividad se acompañaron de un seguimiento de los iones liberados al medio en el proceso de degradación de los materiales. Se realizaron diferentes experimentos in vitro, tomando como referencia el MBG libre de Cu. Se comparan ambos tipos de MBG-Cu entre sí para evaluar la influencia del método de síntesis en la potencialidad del MBG como matriz administradora de iones. Los detalles de cada uno de los ensayos se describen más adelante. Se midió la cantidad de sílice disuelta mediante espectrofotometría de ultravioleta visible (UV-Vis), y en algunos casos también por espectrometría de masas de plasma de acomplamiento inducido (ICP-MS, por Inductively coupled plasmmass spectrometry). La bioactividad se evaluó mediante análisis de EDX. Las condiciones de medidas y protocolos experimentales de los métodos se detallan en la sección de Anexos. 5.2. Resultados y discusión En la caracterización de los materiales, para todos los casos, se tomó como referencia el MBG en el sistema 80SiO2-15CaO-5P2O5, para contrastar y evaluar los resultados obtenidos de los MBG-Cu, en sus diferentes composiciones y métodos de síntesis. 5.2.1. Caracterización físico-química de los materiales El análisis químico de la composición elemental de los materiales se realizó usando fluorescencia de rayos X (XRF, X-ray fluorescence), y se presentan en la Tabla 3.4, expresados como óxidos. En los resultados encontramos una buena relación entre la composición nominal, calculada a partir de los reactivos precursores de la síntesis, y la composición molar real. También se observa que la retención de fosforo en el material ha sido poco efectivo durante el proceso de síntesis utilizado. Materiales MBG con funcionallidad para la administración local de iones terapéuticos 137 Tabla 3.4. Composición química de los materiales sintetizados, cuantificados mediante XRF. Muestra Composición nominal Composición real SiO2 CaO P2O5 CuO SiO2 CaO P2O5 CuO MBG 80 15.0 5 -- 86.3 12.5 1.2 -- SG-MBG-0.5Cu 80 14.5 5 0.5 85.6 12.8 0.8 0.8 SG-MBG-2.5Cu 80 12.5 5 2.5 82.8 13.5 0.9 2.8 SG-MBG-5Cu 80 10.0 5 5.0 79.5 13.3 0.9 6.4 I-MBG-0.5Cu 80 14.5 5 0.5 84.6 13.0 1.1 1.3 I-MBG-2.5Cu 80 12.5 5 2.5 82.1 13.8 1.0 3.1 I-MBG-5Cu 80 10.0 5 5.0 77 14.7 1.1 6.7 El MBG presenta difractogramas característicos de los materiales vítreos con mesoporosidad ordenada (Ver Figura 3.5). El SAXRD nos indica que los poros del material están ordenados, es decir, que existe una periodicidad en la distribución de sus canales, ya que se puede observar un pico principal bien definido a 2Ө = 1.18° asociado al plano de reflexión (100), correspondiente a una simetría 2D-hexagonal con un grupo espacial p6mm5,163. Para este tipo de estructura normalmente se pueden observar tres picos de Bragg a lo largo del intervalo 2Ө que son indexados como (100), (110), (200). El hecho de que no se observen todos los picos de difracción indica menor grado de orden que otros materiales como la SBA-15. Para los ángulos convencionales, únicamente se aprecia la señal del halo amorfo, una zona de reflexión difusa centrado en 2Ө ≈ 23° característico de los materiales vítreos, que indica que no existen planos cristalográficos pero si la evidencia de un cierto orden de moléculas a corto alcance, en el rango de los tetraedros del silicio. Capítulo 3 138 En la Figura 3.5, también se observan los diagramas de SAXRD y XRD de las diferentes composiciones de los MBG-Cu sintetizados por el método sol-gel en comparación con el vidrio de referencia. Los patrones de SAXRD de las muestras modificadas con Cu indican que los materiales conservan la formación de la estructura hexagonal ordenada, sin embargo, el orden de los poros se ve afectado ya que la intensidad del pico principal en el plano (100) es menor conforme aumenta la cantidad de Cu. Este comportamiento puede atribuirse a una reducción en la periodicidad164. También se observa un pequeño desplazamiento del plano (100), lo cual sugiere una modificación en los parámetros de la celda. En el diagrama de XRD a alto ángulo se observa el efecto del incremento en el contenido de Cu con la aparición de nuevas señales de difracción, correspondientes al CuO. En el patrón de difracción que corresponde a la muestra SG-MBG-0.5Cu no se observa ninguna fase atribuida a este metal y el patrón es análogo al MBG de referencia (0 % mol Cu). Este último indica, por tanto que, bajo las condiciones de medición utilizadas y el límite de detección del instrumento, estas fases no se detectan. Para el SG-MBG-2.5Cu se pueden intuir unos pequeños picos anchos que corresponderían a fases de Cu, sin embargo no están definidos, lo cual sugiere que las especies de Cu están poco ordenadas o se trata de partículas muy pequeñas bien dispersas en la matriz vítrea del material. Sin embargo, que para el SG-MBG-5Cu es evidente la presencia de especies cristalinas en el material. Los principales picos de difracción que se observan en el diagrama para el MBG-5Cu, corresponden a la fase cristalina del CuO que son a 2Ө= 35° y 40°, indexados como (002) y (111), respectivamente, (PDF entry: 48–1548)165. Esto nos sugiere que al aumentar la cantidad de Cu por encima del 5 % mol, este cristaliza, anulando su carácter amorfo e interfiriendo en el orden estructural del material. Materiales MBG con funcionallidad para la administración local de iones terapéuticos 139 Figura 3.5. Difractogramas de (a) SAXRD y (b) XRD para SG-MBG-Cu, en todas sus composiciones, en comparación con el MBG. (a) (b) 12345 MBG SG-MBG-0.5Cu SG-MBG-2.5Cu SG-MBG-5Cu Intensidad normalizada (100) 2 Theta (grados) 10 20 30 40 50 60 70 80 (111) (002) SG-MBG-5Cu SG-MBG-2.5Cu SG-MBG-0.5Cu MBG Intensidad normalizada 2 Theta (grados) Capítulo 4 242 Figura 4. 1 microin y 1 4. Imágene s y ectados a l o dis p s representat i o s 5 días de t p ersiones uti l i vas de los v t ratamiento e l izadas en el v asos subinte e n cada una d ensayo tipo stinales de l o d e las soluci o 2. o s peces o nes y Evaluación de la funcionalidad angiogénica de materiales MBG 243 Figura 4.15. Gráfica de distribución del grosor de los vasos subintestinales de los peces a los 5 días de tratamiento en cada una de las soluciones y dispersiones utilizadas en el ensayo de microinyección en vitelo de embriones (Ensayo tipo 2). 1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8 8-9 9-10 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Control Grosor de vasos (m) Número de vasos 1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8 8-9 9-10 0 2 4 6 8 10 12 14 16 300 mg·L-1 SG-MBG-5Cu Número de vasos Grosor de vasos (m) 1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8 8-9 9-10 0 2 4 6 8 10 12 14 16 3000 mg·L-1 MBG Grosor de vasos (m) Número de vasos 1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8 8-9 9-10 0 2 4 6 8 10 12 14 16 300 mg·L-1 MBG Número de vasos Grosor de vasos (m) 1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8 8-9 9-10 0 2 4 6 8 10 12 14 3000 mg·L-1 SG-MBG-5Cu Número de vasos Grosor de vasos (m) 1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8 8-9 9-10 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0.05 mg·L-1 CuCl2 Número de vasos Grosor de vasos (m) Capítulo 4 244 Figura 4.16. Imagen representativa de un pez cebra que presentaba cifosis. 0 10 20 30 40 50 60 70 300 mg·mL-1 MBG MBG 3000 mg·mL-1 SG-MBG-5Cu 300 mg·mL-1 SG-MBG-5Cu 3000 mg·mL-1 CuCl2 0.05 mg·mL-1 Control Porcentaje de peces que presentan cifosis Figura 4.17. Porcentaje de peces que presentan cifosis. Los resultados obtenidos sugieren que utilizando concentraciones de 3000 mg·mL-1 tiene un impacto más severo en el pez cuando se introduce directamente en su organismo. 100 µm Evaluación de la funcionalidad angiogénica de materiales MBG 245 Como se ha mencionado antes, el Cu es un ion que favorece el proceso de angiogénesis pero también es un elemento muy reactivo que a altas concentraciones es tóxico y se manifiesta alterando el metabolismo de transporte electrónico en las mitocondrias, produciendo necrosis celular y estrés oxidativo. Para el caso de los peces microinyectados con la dispersión 3000 mg·L-1 SG-MBG- 5Cu, ese efecto pro-angiogénico desaparece y las malformaciones en la morfología del pez son evidentes, por lo que podemos deducir que esta concentración está por encima de la conveniente. Como una perspectiva futura, habría que considerar concentraciones intermedias para poder determinar la dosis adecuada a inyectar. En ambos tipos de ensayo se observa un efecto proangiogénico de todos los administrados localmente por la degradación del material. Para el caso del ion Si, este efecto había sido observado anteriormente por otros autores en ensayos anteriores58. Se ha encontrado que los productos de redisolución de Bioglass® 45S5 y de CS estimulan la secreción de factores de crecimiento angiogénicos en células HBMSC y HUVEC y lo correlacionan especialmente por la presencia de iones Si59–61. Sin embargo, no está dilucido el mecanismo por el que el Si genera el aumento de la expresión de factores y receptores angiogénicos. Anteriormente se mencionó que el grupo de Li y col.62 han realizado estudiados sobre el rol del Si en la angiogénesis, a partir de la degradación de CS. Ellos sugieren que el Si, al igual que otros cationes como el Co, Cu y Ni, puede interaccionar con los factores HIF-1 y la PDH e inhibir la degradación del HIF-1α, bajo condiciones de normoxia56,59,63. Aunque, como ellos mismos insisten en que hacen falta más estudios para comprobar esta hipótesis. En el caso del Cu, existe evidencia, tanto in vitro como in vivo de que un exceso de Cu produce alteraciones en los mecanismos que regulan el Cu dentro de la Capítulo 4 246 celula64,65. Al igual que Si, algunos autores afirman que el Cu puede estabilizar la HIF-1 en condiciones de normoxia66, pero también hay evidencia de que el Cu induce a una hipoxia local al interferir en la actividad normal de la mitocondria, incrementando el consumo de oxígeno y la producción de NOs y ROS, que terminaría desencadenando el proceso de angiogénesis57,66,67. Por lo que, independientemente del mecanismo, se conoce que el Cu tiene efectos en sistemas vivos, inclusive a bajas concentraciones. 4. Conclusiones El modelo de pez cebra combina la estabilidad de un sistema in vitro con la relevancia de un modelo vertebrado in vivo, y es efectivo para evaluar en breves tiempos las propiedades biológicas de los materiales particulados, como fármacos y nanopartículas. En estos ensayos se ha utilizado este modelo para evaluar la funcionalidad angiogénica de los materiales particulados MBG y SG-MBG-5Cu y el efecto los iones Si, Ca, P y Cu administrados al medio durante su degradación en el proceso angiogénico. Para ello se han analizado los cambios en la vasculatura de los vasos subintestinales del pez cebra. En el ensayo tipo 1 se han incorporado los materiales particulados en el medio en el que se desarrolla el pez, mientras que en el ensayo tipo 2, los peces fueron microinyectados con las dispersiones preparadas, utilizando dos concentraciones, 300 y 3000 mg·L-1 de los materiales. Los resultados obtenidos durante estos ensayos nos permiten extraer las siguientes conclusiones: Evaluación de la funcionalidad angiogénica de materiales MBG 247  El modelo in vivo y el criterio utilizado son eficaces para evaluar las propiedades angiogénicas para este tipo de biomateriales microparticulados.  Ambos ensayos nos permiten afirmar que ambos biomateriales promueven el proceso de angiogénesis, siendo este efecto más evidente para el SG-MBG-5Cu. El MBG por sí solo tiene un efecto proangiogénico que se observa en el aumento en cantidad y grosor los vasos subintestinales de los peces expuestos al material, mientras que para el SG-MBG-5Cu el mismo efecto es observado pero en un porcentaje mayor.  Los análisis ICP-MS permite correlacionar los efectos observados con la concentración de los productos de redisolución de los materiales en el medio y el análisis de multivarianza indica que la presencia de los iones es la responsable de los efectos observados.  Los resultados nos indican que el efecto es más severo cuando el material se incorpora al pez mediante la microinyección, y que por lo mismo, las concentraciones utilizadas (3000 mg·L-1) durante el ensayo de microinyección podrían ser excesivas y cercanas a una concentración letal.  Ambos tipos de ensayo sugieren que la dispersión de SG-MBG-5Cu a 3000 mg·L-1 tiene efectos más severos que el MBG a la misma concentración, posiblemente debido a la presencia de Cu. Por un lado, el Cu iónico y particulado interfiere en la actividad de la ZEH1, retrasando los tiempos de eclosión de los embriones. Y en el ensayo de microinyección observamos que esa concentración inyectada en el pez provoca malformaciones en la morfología habitual del pez orientadas a las cabeza-vitelo-dorso. Capítulo 4 248  Todas las observaciones nos permiten afirmar que el sistema SiO2- CaO-P2O5 es pro-angiogénico y que, cuando se incorpora Cu, el efecto se potencia. De igual forma, se observa que la contribución del Cu es pronunciada y evidente aun a bajas concentraciones. Lo que nos lleva a suponer que el Cu administrado durante la degradación de SG-MBG- 5Cu particulado genera una hipoxia local que a concentraciones bajas favorece la expresión de los genes involucrados en el proceso de angiogénesis.  Además, de los ensayos in vitro podemos concluir que los materiales MBG y SG-MBG-5Cu a concentraciones 100 y 300 mg·L-1 no inhiben la supervivencia ni la migración in vitro de las células BAEC. Además, el material SG-MBG-5Cu a bajas concentración favorece el crecimiento celular, mientras que el MBG a bajas concentraciones estimula la migración celular. Este trabajo representa un afianzamiento del modelo pez cebra para evaluar la funcionalidad angiogénica de biomateriales y una motivación para ampliar la utilización y desarrollo de estudios de angiogénesis de materiales MBG. 6. Referencias (1) Carmeliet, P.; Jain, R. K. Angiogenesis in Cancer and Other Diseases. Nature 2000, 407, 249–257. (2) Brewer, G. J. 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Conclusiones generales 260  La incorporación de Cu en los materiales MBG se puede llevar a cabo mediante una única etapa en el proceso sol-gel (SG-MBG-Cu) ó utilizando una ruta que integre una segunda etapa de impregnación (I-MBG-Cu). Ambos métodos han permitido la incorporación de Cu en la composición del MBG sin afectar drásticamente sus propiedades físico-químicas. Sin embargo, la ruta en una etapa sol-gel se destaca por incorporar el Cu más homogéneamente en la matriz de la sílice del MBG sin afectar su carácter amorfo y sus propiedades texturales. El ensayo de biodegradabilidad in vitro nos indica que el perfil de degradación de los materiales MBG-Cu es análogo al MBG.  La viabilidad y migración celular se comprobó mediante ensayos in vitro en células BAEC encontrando que los materiales MBG y SG-MBG-5Cu no inhiben ninguno de los dos procesos celulares a concentraciones de 100 y 300 mg de material por L de medio de cultivo. Se encontró mayor crecimiento y migración celular para los cultivos con medios conteniendo materiales a bajas concentraciones.  Durante el estudio de la funcionalidad angiogénica in vivo de los materiales MBG y SG-MBG-5Cu en el modelo del pez cebra se encontró que los iones Si, Ca, P y Cu, productos de la redisolución de los materiales influían en el proceso de angiogénesis. El mayor efecto pro-angiogénico fue observado para el SG-MBG-5Cu a bajas concentraciones (300 mg·L-1) mientras que a altas concentraciones los efectos se revierten.  Por último, se puede concluir que los resultados presentados en este trabajo de Tesis han mostrado la posibilidad de obtener materiales con funcionalidad de matrices biomiméticas y/o matrices administradora de iones terapéuticos, para su posterior desarrollo y optimización en aplicaciones de regeneración ósea. Título de la publicación 263 Anexo 1. Acrónimos y abreviaturas A α: Alfa Ag: Plata ADN: ácido desoxirribonucleico ALP: Alkaline Phosphatase, fosfatasa alcalina ANG: Angiopoyetina ANOVA: Analysis of variance, análisis de varianza As: Arsénico ATOX 1: Antioxidant protein 1, proteína antioxidante 1 ATP: Adenosine triphosphate, trifosfato de adenosina B β: Beta B: Boro Anexos 264 BAEC: Bovine aortic endothelial cells, células endoteliales de aorta bovina BG: Bioactive glasses, vidrios bioactivos BJH: Barrett-Joyner-Hallenda BMP-2: Bone Morphogenetic Proteins, proteína morfogenética ósea 2 C °C: Grado Celsius Ca: Calcio CAM: Chick chorioallantoic membrane, membrana corioalantoidea de embrión de pollo CaP: Fosfato de calcio CCS: Copper chaperone for superoxide dismutase, metaloproteína superóxido dismutasa del Cu Cd: Cadmio Ce: Cerio C-H: Enlace carbono-hidrógeno cm: Centímetro C-N: Enlace carbono-nitrógeno Co: Cobalto col.: Colaboradores COX 17: Cytochrome c oxidase, citocromo c oxidasa subunidad 17 CS: Calcium silicate, silicato cálcico Cu: Cobre D d50: percentil 50 DHT: Dehydrothermal treatment, tratamiento dehidrotermal Acrónimos y abreviaturas 265 DIH2O: Agua desionizada DPSC: Dental pulp stem cells, células madre de pulpa dental DSC: Differential scanning calorimetry, calorimetría diferencial de barrido E E3: Medio embrionario ECM: Extracellular matrix, matriz extracelular EDX: Energy-dispersive X-ray spectroscopy, espectroscopia de dispersión de energía por rayos X EGF: Epidermal growth factor, factor de crecimiento epidérmico EISA: Evaporation induced self assembly, autoensamblaje inducido por evaporación etc.: Etcétera Eu: Europio F Fe: Hierro FGF: Fibroblast growth factor, factor de crecimiento de fibroblastos FT-IR: Fourier transform infrared spectroscopy, espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier G g: Gramo Ga: Galio GCSF: Granulocyte colony-stimulating factor, factor estimulante de colonias de granulocitos Gly: Glicina Anexos 266 GFOGER: Secuencia de aminoácido glicina–fenilalanina–hidroxiprolina–glicina– glutamato–arginina GPa: Gigapascales H h: hora HA: Hydroxiapatite, hidroxiapatita HCl: Ácido clorhídrico HBMSC: Human bone marrow derived stem cells, células madre humanas mesenquimales HGF: Hepatocyte growth factor, factor de crecimiento de hepatocitos HIF: Hypoxia-inducible factors, factor inducible por hipoxia His: Histidina HMVEC: Human dermal microvascular endothelial cells, células endoteliales dérmicas micro vasculares humanas hPa: Hectopascal hpf: Hours post-fertilization, horas post-fertilización HRTEM, High-resolution transmission electron microscopy, microscopia electrónica de alta resolución HUVEC: Human umbilical vein endothelial cells, células endoteliales de vena umbilical humana Hyp: Hidroxiprolina I I: Impregnación ICP-MS: Inductively coupled plasm-mass spectrometry, espectrometría de masas de plasma de acomplamiento inducido Acrónimos y abreviaturas 267 IGF-1: Insuline-like growth factor 1, factor de crecimiento similar a insulina K K: Potasio L λ: Longitud de onda L: Litro LC50: Lethal concentration, concentración letal media LO: Óptica longitudinal Lys: Licina M m: Metro M: Molar MBG: Mesoporous bioactive glasses, Vidrios bioactivos nanoporosos ordenados DMEM: Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium, medio de cultivo eagle modificado de dulbecco mg: Miligramo Mg: Magnesio min: Minuto µL: Microlitro mL: Mililitro µm: Micrometro mm: Milimetro mM: Milimolar MMP: Matrix metalloproteinases, metaloproteinasas de la matriz Anexos 274 los difractogramas de SAXRD se registraran en el rango 2ϴ de 0.5 a 5º, con un paso de 0.01º y un tiempo de exposición de 1 segundo. Durante la incidencia de rayos X se puede dar lugar a interferencias constructivas entre los rayos dispersados. El resultado es la difracción, que da lugar a un patrón de intensidades que puede interpretarse según la ubicación de los átomos en el cristal, por medio de la ley de Bragg: nλ = 2dhkl sen Ө donde n es un número entero; λ la longitud de onda; dhkl la distancia entre planos adyacentes y ϴ el ángulo de difracción1. Las fases cristalinas presentes se identificaron usando patrones de difracción estándar de JCPDS (Joint committee for powder diffraction studies). 2.2. Fisisorción de N2 Las medidas de fisisorción de N2 se realizaron en un analizador automático de gases Micromeritics Tristar 3020, después de desgasificar 100 mg de muestra (partículas o estructuras procesadas) a 250 ºC durante 2 h en corriente de nitrógeno. En el caso de las estructuras procesadas revestidas de colágeno, la desgasificación se llevó a cabo a 150 ºC durante 48 h, para evitar su degradación y para que la desgasificación fuera completa. A partir de las isotermas de adsorción y desorción obtenidas se evaluó la porosidad de los materiales. El área específica se determinó utilizando el método Brunauer– Emmett–Teller (BET)2 que consiste en determinar la cantidad (moléculas) de gas adsorbido necesario para formar una monocapa. Para calcular el valor de SBET se Métodos y técnicas de caracterización 275 utilizaron los valores de la isoterma de adsorción en el intervalo de presión relativa de 0.05 a 0.2, donde es válida dicho modelo. Para el volumen total de poro, se estimó a partir de la cantidad de gas nitrógeno adsorbido a una presión relativa de ≈ 0.99. Mientras que la distribución de tamaño de poro se calculó utilizando la rama de adsorción de la isoterma de adsorcióndesorción de nitrógeno y aplicando la ecuación de Barrett-Joyner-Hallenda (BJH)3,4. 2.3. Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FT-IR) y Raman FT-IR es una técnica donde se analizan las vibraciones moleculares. Estas vibraciones corresponden a los cambios energéticos producidos por las transiciones entre distintos estados vibracionales y rotacionales que han sido inducidas por la irradiación de luz infrarroja. Las medidas se llevaran a cabo en un espectrofotómetro FT/IR-6200 (Jasco Inc., Easton, PA, USA) en el rango del infrarojo medio de 380 a 4000 cm-1 en modo transmisión. Los espectros obtenidos se registraron con las siguientes condiciones: 64 barridos con una resolución de 4 cm-1. La preparación de las muestras consiste en mezclar y moler 99.5 mg de bromuro potásico (KBr, 60090, Fluka) y 0.5 mg de la muestra a analizar. Posteriormente la mezcla se coloca en una matriz para su compresión mediante el uso de una prensa hidráulica (7 toneladas) para la obtención de pastillas transparentes. Como blanco se tomó una pastilla constituida únicamente por KBr. Para ampliar la información estructural del material también se analizara en un espectrofotómetro Raman dispersivo, modelo LabRam HR800 de la casa de Horiba Anexos 276 Jobin Yvon, con microscopio confocal y, como fuente de excitación, un láser verde de argón con longitud de onda de 514 nm. La adquisición de espectros consistió en 10 acumulaciones de 30 segundos y ventanas de medida comprendidas entre 200 y 1800 cm-1. La muestra no recibe ningún tipo de preparación. 2.4. Fluorescencia de Rayos X (XRF) A través de esta técnica se determinó la composición real de las muestras. La medida se realizara en espectrómetro secuencial de fluorescencia de rayos X por dispersión de longitud de onda (WDXRF, por wavelength dispersive X-ray fluorescence), de la marca PANalytical, modelo AXIOS. La preparación de la muestra consiste en la mezcla de 100 mg de muestra con 6 mg de cera que se molerán y homogenizaran en un mortero de ágata. Posteriormente la mezcla se coloca en el centro de un soporte de ácido bórico, preparado con anticipación, y se prensa a 160 MPa. 2.5. Microscopia electrónica de barrido (SEM), SEM en modo transmisión (STEM) y dispersión de energías de rayos X (EDX) Está técnica nos provee información morfológica y topográfica de la superficie de las muestras. Se utilizó un microscopio modelo HITACHI S-4800 de alta resolución dotado con un cañón de emisión de campo (FEG-SEM, por field emission gun scanning electron microscope). Además, el equipo cuenta con un detector para electrones transmitidos con un sistema de microanálisis químico por EDX, Bruker X Flash Detector 4010, con una resolución de 133 eV, que nos permite un acercamiento a la composición estructural. Las micrografías se realizaron a un potencial de 2 kV, mientras que el análisis químico mediante EDX, el haz electrónico incidió sobre las muestras a un potencial de 10 kV durante 5 min. Métodos y técnicas de caracterización 277 Para los análisis las muestras se colocaron directamente sobre una cinta adhesiva de doble cara de carbono para fijarlos en el portamuestra del equipo. Para el caso de los materiales que contenían material orgánico, además de la fijación física, se recubrieron con una capa de carbono, para disminuir la carga eléctrica que se genera. La capa se realizó con un evaporador de carbono EMITECH K950 usando 60 A de voltaje, repitiendo el proceso por triplicado. Para las observaciones STEM las muestras se depositaron en una rejilla de cobre, que contiene un recubrimiento de colodión y de carbono, y se dejó secar a temperatura ambiente. Posteriormente la muestra se fija y se tiñe como se indicó en el Capítulo 2. 2.6. Espectrocospía de Emisión Atómica por Plasma de Acoplamiento Inducido (ICP-MS) La ICP-MS se fundamenta en el análisis de la radiación UV-Vis característica de cada elemento químico, emitida durante su relajación tras haber sido excitado en un plasma, gas ionizado altamente energético. La temperatura de atomización característica del atomizador ICP es (4000-6000) ºC. Esta técnica se emplea fundamentalmente en el análisis de elementos metálicos. Para el trabajo de esta Tesis Doctoral los análisis se llevaron a cabo en el equipo Horiba Jobin Yvon, modelo última 2, equipado con un generador de estado sólido de 40.68 MHz, un monocromador Czerny-Turner y un detector con tubo fotomultiplicador. La entrada de la muestra (líquida) a través de una bomba peristáltica fue de 1 mL·min-1, el potencial del plasma fue de 1000 w y el flujo de Argón fue de 12 L·min-1. El volumen de muestra requerido para realizar la medida fue de 5 mL. Anexos 278 2.7. Análisis termogravimétrico (TGA) y calorimetría diferencial de barrido (DSC) Los análisis térmicos TGA y DSC se llevaron a cabo simultáneamente utilizando un sistema automático de análisis térmico TA Instruments SDT Q600 (TA Instruments, Crawley, UK), que está conectado a un sistema de flujo de aire de 100 cm3· min-1. Se trabajó en atmosfera de aire y la velocidad de calentamiento fue de 10 ºC·min-1 en un soporte de platino con 0.6 cm de diámetro. El intervalo de temperatura de medida estuvo comprendido entre 25 y 1000 °C. 2.8. Distribución de tamaño de partícula El tamaño medio de partícula (dv50) y la distribución del tamaño de partícula de los polvos se obtuvieron empleando un analizador de pulso láser de Malvern, modelo Mastersizer S (Reino Unido). Este equipo utiliza una longitud de haz activa de 2,4 mm y una lente de 300-RF y evalúa tamaños medios de partícula comprendidos entre 0,20–880 µm. 2.9. Análisis de ultravioleta visible (UV-Vis) Para cada estado electrónico, la molécula puede encontrase en diferentes estados vibracionales y rotacionales próximos en energía. En muestras líquidas o en disolución (como las tratadas en este trabajo) se pierde la estructura fina asociada a vibraciones y rotaciones debido a la solvatación y a la interacción con moléculas vecinas. Por lo que, se obtienen bandas anchas centradas en torno a la longitud de onda correspondiente a la transición electrónica. En este trabajo se utiliza la espectroscopia de absorción UV-Vis para realizar análisis cuantitativos de las muestras estudiadas, para estimar la concentración de Si en solución. Para ello se aplica la ley de Lambert-Beer5: Métodos y técnicas de caracterización 279 A = ε λ c donde A es la absorbancia, ε es el coeficiente de extinción molar, λ es la longitud del medio que es atravesada por la luz y c es la concentración de Si. Los espectros se registraron entre 190 y 800 nm en un espectrofotómetro SHIMADZU UV-2101 PC. 2.10. Ensayos de compresión Los ensayos de compresión de las estructuras macroporosas tridimensionales procesadas en el Capítulo 2 se llevaron a cabo en un Scratch MicroTest modelo MTR3/50-50/NI con una célula de carga de 500 N a una velocidad de 0,5 mm min- 1. Las estructuras poseen una geometría cilíndrica, con dimensiones de 9.2 mm de diámetro x 5.4 mm en altura. Para determinar los valores de resistencia a la compresión se ensayaron 5 estructuras y se han expresado en MegaPascales (MPa), teniendo en cuenta el área expuesta de cada uno de las estructuras ensayadas6. 2.11. Análisis de porosidad y densidad Los valores de densidad y porosidad de las estructuras macroporosas tridimensionales se estimaron a partir del porcentaje molar teórico de cada uno de los óxidos que lo constituyen y sus respectivas densidades. Para ello, se consideró la densidad del SiO2 (ρSiO2: 2.2 g·cm-3)7, del CaO (ρCaO:3.35 g·cm-3)8 y del P2O5 (ρP2O5:2.3 g·cm-3)8. Los valores de densidad se determinaron a partir de las dimensiones finales de cada estructura procesada, mediante el cociente de su masa y volumen. Mientras que la porosidad total, P, se calculó a partir de la siguiente ecuación: Anexos 280 P1 ó 1  2.12. Preparación de fluido fisiológico simulado (SBF) El SBF es una solución que contiene concentraciones de iones análogas a las del plasma sanguíneo humano, su formulación ha sido reportada y optimizada por Kokubo y col9,10. la cual se emplea como medio de cultivo para la conservación celular, por lo que permite predecir la bioactividad de un material. La solución SBF se formuló a partir de los reactivos y las cantidades siguientes, y en el orden en que se indica a continuación: 1. Cloruro de sodio (NaCl, S7653 Sigma-Aldrich), 8.035 g 2. Bicarbonato sódico (NaHCO3, 31437 Sigma-Aldrich), 0.355 g 3. Cloruro de sodio (KCl, 60129 Fluka), 0.225 g 4. Fosfato potásico dibásico trihidratado (K2HPO4·H2O, P5504 Sigma- Aldrich), 0.231 g 5. Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2·6H2O, M2670 Sigma- Aldrich), 0.311 g 6. HCl 1 M, 39 mL 7. Cloruro de calcio (CaCl2, 12095 Riedel-de Haën), 0.292 g 8. Sulfato de sodio (Na2SO4, 23859-7 Sigma-Aldrich), 0.072 g La solución SBF se preparó en un recipiente de plástico, disolviendo las cantidades de cada uno de los reactivos en agua Milli-Q, añadiéndolos uno por uno, en el orden indicado anteriormente, hasta que cada reactivo se disolvió completamente. Dado que la solución SBF es una solución supersaturada, cualquier método de preparación inapropiado puede generar una precipitación en la solución. Por tal Métodos y técnicas de caracterización 281 razón, en todo momento durante la preparación se debe distinguir una solución transparente, libre de cualquier indicio de precipitación. Para preparar 1 L de solución, primeramente los reactivos se disolvieron en 700 mL de agua Milli-Q, la cual se ajusta previamente a 36.5 ± 1.5 °C en una placa calefactora, baño de aceite y con agitación constante a 500 rpm. Después de añadir todos los reactivos se añade 200 mL de agua Milli-Q se añade 6.118 g de tris- (hidroximetil)-aminometano (TRIS, C4H11NO3, T87602 Sigma-Aldrich). La adición se hace poco a poco esperando a que se disolviera completamente y observando el aumento gradual de pH en la solución. Una vez que alcanza un valor de pH = 7.45, se le añade HCl 1M hasta bajar el pH a 7.42, repitiendo la operación hasta que se termine de añadir el TRIS. Posteriormente, se estabiliza la temperatura en 36.5 ± 0.02 °C y se ajusta el pH a 7.42 ± 0.01. Finalmente, la solución se transfiere a un matraz de vidrio aforado de 1 L, se espera el tiempo necesario para que alcance la temperatura ambiente, se afora y se guarda a 5-10 °C en el frigorífico. La solución se puede conservar ≤ 30 días. 2.13. Preparación de tampón de fosfato salino (PBS) El PBS constituye una solución amortiguadora de pH comúnmente empleada para procedimientos bioquímicos. Su osmolaridad y concentración de iones (Cl- , Na+ y K+ ) es muy semejante a la del líquido extracelular de los mamíferos. Además, es una solucion isotónica y no-tóxica11. Para preparar 1 L de PBS se deben añadir los siguientes reactivos y cantidad, en el orden que se indica: 1. NaCl, 8.06 g 2. KCl, 0.22 g 3. NH2PO4, 1.15 g Anexos 282 4. KH2PO4, 0.20 g La preparación se realizó en un recipiente de vidrio con 800 mL de dH2O y se añaden los reactivos uno a uno hasta su completa disolución con agitación constante a 500 rpm. Después de la adición y disolución de los reactivos se ajusta el pH a 7.4 con 1 M HCl o 10 M hidróxido de sodio (NaOH, 30620 Riedel-de Haën) según sea el caso, añadiéndolas gota a gota mientras se monitorea el pH. Finalmente, la solución se transfiere a un matraz volumétrico de 1 L y se afora con dH20. La solución debe conservarse entre 5-10 °C en el frigorífico por un periodo menor a 30 días. 2.14. Referencias (1) Klug, H. P.; Alexander, L. E. X-Ray Diffraction Procedures for Polycrystal- Line and Amorphous Materials. Acta Metall. 1956, 4 (1), 102. (2) Sing, K. S. W. Reporting Physisorption Data for Gas/solid Systems with Special Reference to the Determination of Surface Area and Porosity. Pure Appl. Chem. 1985, 57 (4), 603–619. (3) Barrett, E. P.; Joyner, L. G.; Halenda, P. P. The Determination of Pore Volume and Area Distributions in Porous Substances. I. Computations from Nitrogen Isotherms. J. Am. Chem. Soc. 1951, 73 (1), 373–380. (4) Kruk, M.; Jaroniec, M.; Sayari, a. Application of Large Pore MCM-41 Molecular Sieves To Improve Pore Size Analysis Using Nitrogen Adsorption Measurements. Langmuir 1997, 13 (23), 6267–6273. (5) Ricci, R. W.; Ditzler, M.; Nestor, L. P. Discovering the Beer-Lambert Law. J. Chem. Educ. 1994, 71 (11), 983. (6) Athanasiou, K. A.; Zhu, C.; Lanctot, D. R.; Agrawal, C. M.; Wang, X. Fundamentals of Biomechanics in Tissue Engineering of Bone. Tissue Eng. 2000, 6 (4), 361–381. Métodos y técnicas de caracterización 283 (7) Roshi, A.; Barjami, S.; Iannacchione, G. S.; Paterson, D.; McNulty, I. Structure and Dynamics of a Nanocolloidal Silica Gel Dispersion. Phys. Rev. E - Stat. Nonlinear, Soft Matter Phys. 2006, 74 (3), 1–8. (8) Lide, D. R. Hardness of Minerals and Ceramics. CRC Handb. Chem. Phys. 2005, 2313–2314. (9) Oyane, A.; Kim, H.; Furuya, T.; Kokubo, T.; Miyazaki, T.; Nakamura, T. Preparation and Assessment of Revised Simulated Body Fluids. J Biomed Mater Res 2003, 65, 188–195. (10) Kokubo, T.; Takadama, H. How Useful Is SBF in Predicting in Vivo Bone Bioactivity? Biomaterials 2006, 27 (15), 2907–2915. (11) Dulbecco, R.; Vogt, M. Plaque Formation and Isolation of Pure Lines with Poliomyelitis Viruses. J. Exp. Med. 1954, 99 (2), 167–182. formation, the NH-stretching (Amide A)vibration at 3430 cm −1 is widened and the maximum intensity peak is shifted to a lower frequency of 3315 cm −1 . Other spectra changes observed after fibrillogenesis are a general sharpening and definition of all the peaks. In particular, N–H(Amide B)at 3083 cm −1 , and C–H, CH 2 − and CH 3 − stretching vibrations in the 2980–2850 cm −1 range are clearly more intense in the fibrillar collagen sample. Particularly related to the collagen self-assembly process is the sharpening of the 1660 cm −1 contribution band and the 1660 cm −1 / 1630 cm −1 absorbance ratio increase. This has been demonstrated for monomeric type I collagen thermal self-assembly experiments carried out in vitro [24]. Likewise, the amide II is shifted from 1550 cm −1 in the monomeric collagen spectrum to 1555 cm −1 in the fibrillar material. The total collagen amount incorporated per scaffold, 0.73 wt%, is small enough not to affect the macroscopic appearance of the pieces, while preserving the open porosity and interconnectivity of the ceramic structure. XRD analysis of the scaffolds is shown in figure 4. The sharp peaks corresponding to the (100)typical SBA-15 reflection measured by SAXRD are detected for the three samples. This confirms the presence of ordered nanopores. When compared to the uncoated scaffold, less intensity and a peak position shift and broadening very small is observed for the collagen coated materials. In agreement with the thermal analysis, which did not show any crystallization events up to 800 °C(figure 5(a)), WAXRD patterns display a very broad signal indicating the vitreous character of the scaffolds. FT-IR analysis of the scaffolds exhibits the typical features of a BG. The main vibrational modes of the Si–O–Si groups as the Si–O–Si stretching vibration in the 1000–1300 cm −1 range are composed of the two Figure 3. FT-IR spectra: (a)freeze-dried monomeric collagen precursor material and; (b)collagen suspension after the fibrillogenesis treatment used for scaffold coating. Figure 4. (a)SAXRD; and (b)WAXRD diffractograms of the studied scaffolds. 4 Biomed. Phys. Eng. Express 3(2017)035012 L B Romero-Sánchez et al transversal optical modes, a more intense centered at 1100 cm −1 and a shoulder located at 1240 cm −1 [25,26]. The Si–O–Si bending vibrations near 800 cm −1 , characteristic of ring structures in the glass matrix stretching vibrations, and the Si–O–Si rocking vibrations at 460 cm −1 are also clearly identified [25]. No other signals corresponding to organic residues from the polyurethane foam or the PVA binding agent are detected in the final scaffolds, indicating its complete removal after the heating treatment. With the addition of collagen, new bands corresponding to the Amide I peak at 1659 cm −1 , the Amide II at 1550 cm −1 [27,28]and the absorption bands at 1452 and 1403 cm −1 , attributed to the δ(CH 3 ), are observed in the spectra [27]. Morphologies of the uncoated and coated scaffolds were observed by FEG-SEM (figure 6). All scaffolds exhibit an interconnected macroporous network indicating that the applied collagen coating does not significantly affect the macropore size and interconnectivity. Image analysis of the micrographs obtained from SP8PVA, SP8PVA-CFD and SP8PVA- CRT indicate an average macropore size of 297, 312 and 310 μm and a pore wall thickness of 49, 50 and 50 μm respectively. Higher magnification of cross sections of the scaffolds indicates that the coating is homogeneously distributed and the collagen firmly adheres to the strut. In this respect, no residues or indications of the coating peel off was observed during scaffolds cutting. Higher magnification of the surface shows the existence of a tissue-like film over the coated scaffolds that are accompanied by some charging effects on imaging contrast. High magnification FEG-SEM images showing a comparison of the bare ceramic surface substrate of SP8PVA scaffold and the two type coated samples are displayed in figure 7. Thin sheets of biopolymer cover the rough ceramic surface but a significant difference in texture is observed between the two different type coated materials. A higher porosity and texture is apparent for the freeze-dried collagen sample where collagen nanofibers forming a net became visible. N 2 adsorption-desorption isotherms of the scaffolds (figure 8(a)) show hysteresis loops characteristic of the capillary condensation occurring in mesoporous materials. The BJH pore size distributions displayed in figure 8(b)indicate ordered nanopore size distributions with an average pore diameter between 4 and 5 nanometers. Application of the collagen coating on the scaffolds decrease the nanopore volume accessibility as measured by N 2 adsorption-desorption, particularly for the SP8PVA-CRT scaffold. Table 1 present the specific surface area S BET and the total nanopore volume for the three studied scaffolds. 3.2. Compressive strenght characterization The mechanical performance of uncoated and collagen coated scaffolds was assayed by the uniaxial compressive strength test. As displayed by the typical compressive stress-strain curves of these scaffolds (figure 9), the compressive strength of the collagencoated scaffolds was significantly higher than that of uncoated scaffolds. Besides, the coating effect on the strengthening is more important in the SP8PVA-CRT scaffold. It is worth pointing out that the compressive strength value measured for the SP8PVA uncoated scaffold material (0.09 MPa)is superior to the same inorganic precursor formulation prepared without PVA (0.04 MPa)as previously reported by our group [6,29]. Also, it is interesting to note that the uncoated scaffold was completely broken and disaggregated into little pieces (particles)during compressive strength test, while the collagen coated scaffolds were able to maintain somehow piece integrity (compaction) despite being compressed (figure 10). 3.3. Assessment of in vitro bioactivity The FEG-SEM observations of the three type studied scaffolds after 24 h of treatment did show features characteristic of calcium phosphate nucleation over the material surfaces for the three studied scaffolds. Figure 5. (a)TG/DSC curves for the SP8PVA final scaffold (after heating treatment at 800 °C); and (b)FT-IR analysis of the studied scaffolds. 5 Biomed. Phys. Eng. Express 3(2017)035012 L B Romero-Sánchez et al Distinctively, more homogeneous morphologies over the surface showing very fine grain particle sizes morphologies were observed on the freeze-dried collagen coated scaffold. Abundant particulate aggregate morphologies were also observed over the collagen-coated scaffold dried at room temperature. Figure 11 shows how the increase in time treatment from 24 to 72 h produces a visible macropore size reduction as result of calcium phosphate growth on the scaffold walls, being particularly evident for the SP8PVA-CFD scaffold. Figure 12 shows FEG-SEM high magnification images and EDX analysis of the surfaces after 168 h SBF treatment. Images of the bare ceramic SP8PVA scaffold exhibit typical cauliflower shape morphologies of calcium phosphate crystallization. In the case of the collagen coated materials fine crystal particle morphologies are not forming round aggregates but decorating the collagen nanofibers instead. EDX analysis of the surfaces indicates higher P/Si and Ca/Si signal intensity ratios for the collagen coated scaffolds in comparison with the full ceramic SP8PVA which might suggest a thicker and homogeneous calcium phosphate layer formation on the collagen coated materials. The combined FT-IR and XRD analysis of the scaffolds carried out after 24, 72 and 168 h is displayed in figure 13. Only the new specific bands detected when compared to the SBF non-treated scaffolds spectra are highlighted in the FT-IR spectra (figure 13(a)). The vibrational peak at 1630 cm −1 assigned to O–H bonds indicates water trapped inside the samples after soaking treatment. Peak at 1070 cm −1 corresponds to the asymmetric stretching mode of P–O bond [30,31]. Bands at 563 and 602 cm −1 are characteristic of phosphate in a crystalline environment [32]. The formation of phosphate species on the scaffolds surface of the three types of scaffolds is detected by FT-IR after 24 h soaking. When increasing the time of treatment to 168 h, a crystalline growing nature of the phosphate phases is assessed after the 563 and 602 cm −1 distinctive peaks definition. The XRD difractograms confirm the crystallization of calcium HAP particles. This starts earlier in the collagen coated scaffolds that shows characteristic HAP peaks (JCPDS card 9-432)after 72 h. With the increase in soaking treatment, the HAP crystals grow in all samples including the non-collagen coated SP8PVA material. 4. Discussion Previous papers reporting on 3D open cell macropore biopolymeric-ceramic scaffolds lack of nanostructural features useful for induction of biological responses [8]. Table 2compiles preceding work on bone tissue engineering scaffolds using conventional (low surface area)BGs and collagen. Figure 6. FEG-SEM micrographs of the macroporous network and pore walls microstructure at different magnifications. 6 Biomed. Phys. Eng. Express 3(2017)035012 L B Romero-Sánchez et al Figure 7. FEG-SEM high magnification micrographs showing the three studied scaffold material surfaces. SP8PVA bare ceramic material exhibits a rough porous surface. Arrow drawings in SP8PVA-CFD material images indicate collagen nanofibrils. Arrows in SP8PVA-CRT images point well adhered collagen tissue-like features and fibers. Figure 8. N 2 adsorption–desorption characterization of the scaffolds. (a)Isotherms of the scaffolds. (b)Adsorption branch BJH pore size distributions. 7 Biomed. Phys. Eng. Express 3(2017)035012 L B Romero-Sánchez et al In this report, a hybrid scaffold with defined nanoporosity and nanostructured collagen fibbers over the surface as well as improved mechanical properties when compared to a bare ceramic is presented. The PVA surfactant and binding agent [13,36]has been added to the processing protocol of the scaffold-reti- culated structures. The characterization data assessed for the uncoated (full-ceramic)scaffold, SP8PVA, indicate that density and total porosity values are not modified with respect to the PVA free materials [6]. Nevertheless, other textural and nanoscopic parameters, such as the surface area and nanopore volume, are significantly affected showing a drastic decrease of more than 50%. Although, the important decay observed in the textural parameters for PVA processed materials, the surface area of 42 m 2 g −1 of the final scaffold material is still outstanding respect to conventional melt BG-based scaffolds [5,7]. Even though no specific surface area data of the final processed melt BG-based scaffolds have been found in the literature, an estimation bellow 2.7 m 2 g −1 can be inferred from the surface area values measured for the 45S5 bioglass precursor powders. Hence, depending on the particle size fraction used ranging between 4 and 248 μm, a maximum surface area of 2.7 m 2 g −1 has been measured for this precursor material type [37]. On the other side, the decrease in the textural properties observed for the PVA processed scaffolds are compensated by an important increase of 40% in the compressive strength values when compared with the same structures processed without PVA. In addition to this, the comparison of the strength values (0.09 MPa)of the new PVA prepared nanostructures with data from conventional BG reticulated scaffolds (0.04 MPa)in the literature supports these new materials properties. To our best knowledge, previous reported work on mechanical properties of this type of BG-based reticulated scaffolds using melt-derived glass precursor powder, mainly 45S5 Bioglass in the particulate form and mean particle size of 5 μm [7,38], possess very inferior textural properties. Based on this progress, another strategy to improve the scaffolds properties is the coating of the structures using biodegradable polymers. Polymer coating can fill microcracks and voids of the scaffold turning weak and brittle ceramic strut into a stronger and tougher composite. This significantly improves the final scaffold mechanical stability [8]. Synthetic polymers, as polyesters, polylactides or polyglycolides, and their co-polymers and polyhydroxyalkanoates [9– 11]are used. However, their application to bone regeneration has shown several drawbacks such as low bioactivity [39], release of acidic degradation products [40]and the lack of important surface biological cues, very important for cell recognition. As a promising alternative, polymers of natural origin such as alginate [11], chitosan [41], silk [42], cellulose [12,41], gelatin [13,43]or collagen [44]have been used. With regards to the mechanical performance, 45S5 BG-based scaffold, coated with cellulose nanowiskers, improved the Table 1. Textural parameters of the scaffolds measured using physisorption analysis. Scaffold S BETa (m 2 g −1 )V tb (cm 3 g −1 ) SP8PVA 42 0.06 SP8PVA-CFD 32 0.04 SP8PVA-CRT 25 0.03 a Specific surface area calculated by the BET method. b Total pore volume estimated from the nitrogen amount adsorbed at 0.99 relative pressure. Figure 9. Compressive strength test of the scaffolds. (a)Stress–strain plots. (b)Average values and standard deviation. 8 Biomed. Phys. Eng. Express 3(2017)035012 L B Romero-Sánchez et al compressive strength of the scaffolds from 0.02 to 0.06 MPa [12]. Similar BG-derived scaffolds, infiltrated with a 5% w/v gelatin solution, results in a higher compressive strength of 0.3–0.8 MPa [13]or 1.04 MPa for 5% w/v gelatin-genipin solution [38].In this work, the collagen coating of the high surface area reticulated scaffold provides values up to 7-fold higher compressive strength. It is worth pointing out the significant strengthening effect produced using a very small amount (0. 73 wt%)of fibrillar collagen per scaffold. The rational behind the development of a collagen coated scaffold is that under the influence of mechanical loading the fibrillar biopolymer bridges the cracks developing in the ceramic structure, thus increasing the overall resistance to crack propagation [8]. Hence, the bare ceramic (non-coated)scaffold fails by successive brittle fracture of struts in layers near testing load pieces producing a completely breakout of the scaffold in very small pieces and particles, figure 10(a). In contrasts, the collagen coated scaffolds presents higher ductile deformation behavior and somehow densification of the structure, as can be appreciated in figures 10(b)and (c). In this respect, collagen coated scaffolds intended to mimic the Figure 10. Digital photographs of the uncoated (a)SP8PVA; and the collagen coated (b)SP8PVA-CFD and (c)SP8PVA-CRT scaffolds after the compressive strength test. Figure 11. Comparison of FEG-SEM micrographs of scaffold surfaces after 24 and 72 h of SBF treatment showing increasing reduction of the macropore size with time due to mineral phase deposition. 9 Biomed. Phys. Eng. Express 3(2017)035012 L B Romero-Sánchez et al composite structure of bone consisting of a hierarchical combination of HAP and collagen [17]. The FEG-SEM micrographs in figure 7indicate a robust biopolymer adhesion to the ceramic substrate. The incorporation of the collagen fibrils suspension (pH≈7)will ensure overall collagen molecules (pI≈7.5)[45]positive charge, which is opposite to the scaffold ceramic substrate surface charge (pI≈3) [6], facilitating a complementary electrostatic interaction then strong collagen molecule-ceramic substrate adsorption process. Fibrillogenesis of the monomeric collagen precursors has been assessed by STEM and FT-IR characterization. The comparison of the infrared spectrum of the collagen thermally driven fibrillogenesis and that of the precursor monomeric product showed a shift to lower wave number of the amide A peak, a band broadening and sharpened of the highest frequency at 1660 cm −1 of amide I, band shifted from 1559 to 1555 cm −1 of amide II and intensity increase of amide III at 1239 cm −1 . All these are events associated with increased intermolecular interactions of collagen [24,46]. It is also worth to mention other interesting biocompatibility property of the presented scaffolds. An important property of the purified soluble collagen monomers used to prepare the coating suspension precursor, is that they are able to reform in vitro into the ordered fibrillar structures found in native fibrils. This fibril forming process occurs even though the telopeptides have been removed. Another advantage of this process is the use of the soluble purified material pepsin treated that eliminates the telopeptide lineal chains, which present potential immunogenicity problems [47]. Besides, the fibrillar collagen coating not only does not inhibit the scaffolds bioactive response but also promotes the HAP mineralization on the material surface. XRD data in figure 13 indicates that, after the first 72 h of SBF treatment, incipient HAP peaks are only detected on the coated samples. As the time immersion increase to 168 h, the XRD pattern of the uncoated scaffold becomes similar to that of collagen-coated structures. This mineralization boosting effect of the collagen coating is also supported by FEG-SEM observations of the structures after 72 h of SBF soaking that show more clear open cell wall thickening on coated scaffolds. This is not an unexpected behavior as structured type I collagen may serve as a template to control both nucleation and growing of HAP crystals [48,49]. In fact, sequestration of large quantities of calcium, phosphate and carbonate ions by collagen, which Figure 12. FEG-SEM micrographs at different magnifications and corresponding EDX analysis presenting the P/Si and Ca/Si intensity ratios of the three type scaffold surfaces after 168 h of SBF treatment. Arrow drawings in high magnification SP8PVA image indicate typical calcium phosphate crystallite aggregate morphologies. Arrows in low magnification SP8PVA-CFD and SP8PVA-CRT images points out collagen nanofibers and tissue-like sheets features respectively. At higher magnifications, on the right, these collagen features appear fully decorated by calcium phosphate crystals. 10 Biomed. Phys. Eng. Express 3(2017)035012 L B Romero-Sánchez et al precipitate spontaneously in apatite crystals, has been proposed [48]. FEG-SEM observations in figure 12 show the formation of fine HAP particles copiously and homogenously distributed along the collagen both in the case of the more textured freeze-dried material or the sheet tissue-like of SP8PVA-CRT. This observed calcium phosphate crystals disposition, instead of bigger crystal aggregates formation as shown for the full ceramic scaffold, will support a collagen template nucleation mechanism. Precedent in vitro bioactivity essays using collagen coated ceramics have pointed out similar conclusions [33]. On the other side, previously reported SBF bioactivity essays on ceramic reticulated structures coated using alternative biopolymers, such as cellulose [12]or gelatin [38], have suggested that these polymer materials may slightly retard the formation of HAP. The properties of the presented new collagen coated scaffolds are interesting for bone tissue engineering applications. In addition to inorganic suitable osteogenic and angiogenic compositional formulation [1,4], the textural properties provide controlled drug delivery potential [6,29]and the implemented collagen coating significantly improves the compressive strength and the HAP surface mineralization. The collagen coated SP8PVA-CRT scaffold shows the higher compressive strength performance. Although it presents a specific surface area and nanoporosity reduction compared with SP8PVA-CFD, a similar bioactivity response was found for both materials. It is worth to highlight the important effect on the compressive strength values produced by such very small amount of collagen, 0.73 wt%. These results encourage future research to study how increasing Figure 13. (a)FT-IR; and (b)XRD analysis of the studied scaffolds after 24, 72 and 168 h of SBF treatment. 11 Biomed. Phys. Eng. Express 3(2017)035012 L B Romero-Sánchez et al Table 2. Preceding work on bone tissue engineering scaffolds using conventional melt (low surface area)BG a and collagen. Material composition Processing technique Collagen type Collagen content (wt%)Surface area (m 2 g −1 )Compressive strength (MPa)References 45S5 BG (Full ceramic)PFRT b —— — 0.3 Chen et al 2006 [7] 45S5 BG & collagen PFRT Rat tail type I 0.35 0.8 —Chen et al 2008 [33] 45S5 BG & collagen Plastic compression Rat tail type I 3.5–5.7 —0.6–0.8 Marelli et al 2010 [34] 45S5 BG & collagen Freeze drying Bovine tendon 28 —1.5–2.0 Xu et al 2011 [35] a BG: Bioactive glass. b PFRT: Polyuretane foam replica technique. 12 Biomed. Phys. Eng. Express 3(2017)035012 L B Romero-Sánchez et al collagen content could improve the compressive strength and other mechanical parameters further. In relation with further clinical translation, other interesting aspect of the presented scaffolds and the purified and enzymatically treated soluble atelocollagen precursor used for the preparation of the coating collagen fibril suspension is that could show an immunogenicity reduction [47]when compared with nonpurified biological extract derived collagen materials. Also, the vacuum thermal crosslinking (DHT)used in our protocol prevents the use of chemical cross-link- ing reagents such as aldehydes, isocyanates and carbodiimides substances, which can produce toxicity and inflammatory responses [50]. 5. Conclusions A nanostructured fibrillar collagen coating has been applied to a 3D open cell macropore ceramic structure exhibiting well-defined nanoporosity. The application of a small amount of 0.73 wt% total collagen content produces a 7-fold compressive strength increase respect to the uncoated material while preserving scaffold high surface area and nanopore accessibility. The collagen-coated scaffold dried following the protocol using room temperature under atmosphere showed the higher compressive strength performance. Although it presents some specific surface area and nanoporosity reduction with respect to the freezedried material, a similar bioactivity response is found for both scaffolds. The in vitro bioactivity assay indicates that the fibrillar collagen coating promotes early HAP mineralization. Acknowledgments The authors gratefully acknowledge the financial support provided by the Andalusian Ministry of Economy, Science and Innovation (Proyecto Excelencia CTS-6681). LBRS acknowledges the CONACYT- Mexico Fellowship PhD Program. Conflicts of interest The authors declare no conflict of interest. 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