Mechanism of transcription termination: Role of chromatin and R-loops
Maraver-Cárdenas, Pablo
- Published
- 2025-03-02
- Language
- en
Abstract
La transcripción llevada a cabo por la ARN polimerasa II (RNAPII) es un proceso fuertemente regulado que se compone de tres fases: iniciación, elongación y terminación. De todas ellas, la terminación es la etapa menos estudiada y comprendida, sin embargo, de ella dependen procesos esenciales como la expresión génica, el reciclaje de las polimerasas o la prevención de la interferencia génica. Esta tesis explora los mecanismos por los cuales los híbridos de ARN:ADN (R-loops) y la dinámica de la cromatina influyen en la terminación de la transcripción en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Históricamente asociados con la inestabilidad genómica, los R-loops desempeñan un papel como reguladores de la terminación de la transcripción. En este estudio, hemos utilizado un novedoso sistema basado en NPL3 con secuencias propensas a formar R-loops insertadas tras el sitio de poliadenilación (PAS) canónico demostrando que estos híbridos son capaces de cambiar el patrón del procesamiento en el 3’ del ARN en circunstancias donde existen sitios de poliadenilación alternativos. Además, demostramos que la exonucleasa Rat1 desempeña un papel en la resolución de bloqueos transcripcionales causados por R-loops a nivel genómico, mediando la terminación prematura de la RNAPII. Por otra parte, se ha llevado a cabo un escrutinio para la búsqueda de nuevos factores relacionados con el metabolismo de la cromatina implicados en el proceso de terminación de la transcripción. Esta búsqueda nos ha permitido identificar al complejo remodelador de cromatina SWI/SNF como un actor importante en la terminación de la transcripción de un conjunto de genes de S. cerevisiae. Más allá de su rol establecido como un complejo remodelador dependiente de ATP, SWI/SNF parece promover la terminación al interactuar con la maquinaria de corte y poliadenilación, subrayando un mecanismo único entre los remodeladores de cromatina mediante el cual SWI/SNF contribuye a la disociación de la RNAPII. En conjunto, este estudio analiza el posible papel de los R-loops y la cromatina en la terminación de la transcripción, ampliando nuestra comprensión de los mecanismos de terminación en levaduras y desvelando posibles implicaciones en otros procesos como la desregulación transcripcional en enfermedades como el cáncer, donde los R-loops y los defectos de terminación son prominentes. Al integrar enfoques genéticos, bioquímicos y genómicos, esta tesis subraya la importancia del equilibrio entre la elongación y la terminación para mantener la fidelidad transcripcional.
Full text
Mechanism of transcription termination: Role of chromatin and R-loops Pablo Maraver Cárdenas
Agradecimientos
Index
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Resumen
Resumen
Abstract
Abstract
1.3. Transcription termination
1.3.1. Polyadenylation-dependent transcription termination
1.3.2. Polyadenylation-independent transcription termination
1.3.3. Alternative Polyadenylation-independent transcription termination mechanisms
1.3.4. Defects in transcription termination: Causes and consequences α
2. Genome is compacted into chromatin
2.3. Chromatin influences transcription termination
3. R-loops: Transcriptional byproducts
‐ 3.1. R-loops affect transcription
Objectives
Objectives
3.4. Deletion of alternative polyadenylation sequence fails to suppress formation of novel polyadenylated transcript
3.5. Canonical polyadenylation site usage is significantly increased with the addition of Sμ350
3.6. Sμ350 does not improve transcription termination at NPL3
3.7. Rat1 depletion causes RNAPII accumulation at R-loop forming sequences in the Saccharomyces cerevisiae genome.
β β β
β β β β β β 4.3. Screening of chromatin mutants involved in transcription termination
β β β β β
β β β
β β β β β β β
β β β β β
4.4. The SWI/SNF complex and Hda1 are required for transcription termination.
T
4.5. SWI/SNF RTi calculation from polyadenylated transcripts confirms its role in transcription termination β- β
4.9. Transcription termination of endogenous genes is affected in SNF2 Knockout
4.10. Slowing down RNAPII speed suppresses readthrough in ENT3
4.11. SNF2 knockout reduces recruitment of cleavage and polyadenylation factors Rna14 and Cft1 to the PAS.
4.12. Cleavage efficiency at ERP3 and RBG1 PAS is significantly reduced in SNF2 knockout
4.13. Presence of the catalytic dead snf2-K798R mutant is enough to restore normal transcription termination
4.14. Analysis of RNA-seq published data in snf2∆ and snf5∆ strains
Discussion 1. R-loops facilitate 3’ pre-mRNA processing in yeast
′ ′ ′
‐ ′
2. SWI/SNF recruits cleavage and polyadenylation machinery and promotes transcription termination
′
′
′
3. Hda1 restricts open chromatin formation around PAS
Methods
Methods 1. Growth cultures and materials 1.1. Yeast Strains Name Description Source
1.2. Bacterial strains
• α • 1.3. Yeast culture and growth conditions • • • • • • 1.4. Bacterial Culture Media and Growth Conditions •
1.5. Plasmids Name Description Source
1.6. Oligos
2.4. RNA extraction 2.5. RNA Purification Using Magnetic Beads with Oligo d(T)
2.6. RNA reverse transcription 2.7. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
2.8. Quantitative PCR reaction ₂ 2.9. Northern Blot
2.10. β-Galactosidase activity assay ₆₆₀ ₆₆₀ β ₆₆₀ β ₄₂₀ β ₄₂₀ ₆₆₀ 𝛽 − 𝑔𝑎𝑙𝑎𝑐𝑡𝑜𝑠𝑖𝑑𝑎𝑠𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑦 = 𝑂𝐷420𝑆𝑙𝑜𝑝𝑒 0.1 𝑚𝐿 ×𝑂𝐷660 2.11. Statistical analysis 3. Genome-wide data analysis
3.1. Rat1 and Rpb1 ChIP-seq 3.2. DRIPc-seq 3.3. WT and H3WT MNase-seq
3.4. WT Snf2 ChIP-seq and MNase-seq 3.5. MNase-seq AID-Snf2 3.6. Gene classification using MNase-seq data
3.7. WT, snf2Δ and snf5Δ RNA-seq
3.8. H3ac and H4ac ChIP-seq 3.9. NET-seq
3.10. Heatmaps and plots 3.11. Computational analyses
