Utilidad clínica de los estudios genéticos y técnicas de secuenciación masiva en los pacientes con diabetes mellitus. Estudio retrospectivo en área sanitaria sur de Sevilla

2 3 AGRADECIMIENTOS Gracias a Estrella por estar siempre a mi lado, por su sonrisa y su paciencia infinita en los buenos tiempos y también en los malos. Su luz siempre me ha dado fuerza para seguir adelante en los momentos en los que aparecieron dudas. Sin ella esto y las demás cosas importantes en mi vida no serían posible. Gracias a mis directores de tesis María Victoria Cózar y Juan Miguel Guerrero por su consejo, sapiencia y dedicación para llevar este proyecto a cabo. Gracias a mis padres por su inspiración y ejemplo profesional y personal. Su trayectoria ha sido mi guía y un referente a lo largo de la vida. Gracias a mi abuelo Carlos, médico que siempre tuvo una fe infinita en mis posibilidades. Sé que desde algún sitio te alegras por este proyecto Gracias al servicio de laboratorio del hospital de Valme y especialmente a Joaquín Bobillo y María del Mar Viloria por su trabajo en la determinación e interpretación de las pruebas de laboratorio y la vehiculización de los estudios genéticos. Gracias al servicio de laboratorio del hospital Virgen del Rocío y a Raúl García del servicio de Inmunología por escuchar nuestras demandas clínicas e iniciar los estudios géneticos en diabetes. Gracias a Carmen Almeida por asesorarnos en la metodología y el análisis estadístico. Su labor ha permitido reconducir y llevar el proyecto a buen puerto en momentos de incertidumbre. Gracias a mis compañeros del servicio de endocrinología del Hospital de Valme. Sin su dedicación y trato excepcional a los pacientes con diabetes mellitus no se podrían haber recogido los datos de este estudio. Los resultados del mismo se deben a ellos. 4 5 ABREVIATURAS A Adenina ABCC8 ATP Binding Cassette Subfamily C Member 8 ABCC9 ATP Binding Cassette Subfamily C Member 9 ABO Alpha 1-3-N-acetylgalactosaminyltransferase y alpha 1-3-galactosyltransferase Ac Anticuerpo aCGH Array de hibridación genómica ACMG American College of Medical Genetics and Genomics AD Autosómica dominante ADA American Diabetes Association ADCY5 Adenylate cyclase 5 ADN Ácido desoxirribonucleico AF Antecedentes familiares aGLP1 Análogos del receptor del péptido-1 similar al glucagón AGPAT2 1-Acylglycerol-3-Phosphate O-Acyltransferase 2 AGSS Area de Gestion Sanitaria Sur de Sevilla AKT Alpha serine/threonine-protein kinase (también llamada PKB) AKT2 Alpha serine/threonine-protein kinase 2 AMP Association for Molecular Pathology APPL1 Adaptor protein, phosphotyrosine interacting with PH domain and leucine zipper 1 AR Autosómica recesiva ARN Ácido ribonucleico ATP Adenosina Trifosfato BAD BCL2 associated Agonist of cell Death BLK B-lymphoid tyrosine kinase BSCL2 Berardinelli-Seip congenital lipodystrophy 2 C Citosina c. Codon CAV1 Caveolina-1 CBL Casitas B-lineage Lymphoma CCND2 Cyclin D2 CD69 Cluster of Differentiation 69 CEL Carboxyl Ester Lipase 6 CIR Crecimiento intrauterino retardado CLEC16A C-Type Lectin Domain Containing 16A CNV Copy Number Variation CP Ceruloplasmina Cr Creatinina CTSH Cathepsin H Dco Diagnóstico del Deleción DEND Developmental delay Epilepsy and Neonatal Diabetes DG Diabetes gestacional DIDMOAD Diabetes Insípida, Diabetes Mellitus, Optic Atrophy y Deafness DM Diabetes Mellitus DM1 Diabetes Mellitus tipo 1 DM2 Diabetes Mellitus tipo 2 DMN Diabetes mellitus neonatal DMNP Diabetes Mellitus Neonatal Permanente DMNT Diabetes Mellitus Neonatal Transitoria EASD European Association for the Study of Diabetes EIF2AK3 Eukaryotic Translation Initiation Factor 2 Alpha Kinase 3 ERAD Endoplasmic-reticulum-associated protein degradation ERBB3 Erb-B2 Receptor Tyrosine Kinase 3 ERC Enfermedad renal crónica FG Filtrado glomerular FOX Forkhead box FOXP3 Forkhead box P3 G Guanina G4 Grado 4 GAB1 GRB2 Associated Binding Protein 1 GAD Glutamic Acid Decarboxylase GAD65 Glutamic Acid Decarboxylase 65 GC Guanina y citosina GCK Glucoquinasa GH Growth Hormone GLUT4 Glucose transporter type 4 GRB2 Growth factor receptor-bound protein 2 7 GWAS Genome-Wide Association Study H Hombre HbA1c Hemoglobina glicosilada HDL High density lipoprotein HGMD Human Gene Mutation Database HLA Human Leukocyte Antigen HNF1A Hepatic Transcription Factor 1 Alfa HNF1B Hepatic Transcription Factor 1 Beta HNF4A Hepatic Transcription Factor 4 Alfa IA2 Islet Antigen 2 IC Intervalo de confianza ICA Islet Cell Antibodies iDPP4 Inhibidores de la DiPeptidil Peptidasa-4 IGF1 Insulin-like growth factor-1 IGF1R Insulin-like growth factor-1 Receptor IGF2 Insulin-like growth factor-2 IGF2BP2 Insulin Like Growth Factor 2 mRNA Binding Protein 2 IL27 Interleucina 27 IMC Índice de Masa Corporal INS Insulina INSR Insulin Receptor IPEX Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X-linked IPF Insulin Promoter Factor IRE1 Inositol-requiring enzyme 1 IRS Insulin Receptor Substrate ISPAD International Society for Pediatric and Adolescent Diabetes KCNJ11 Potassium Inwardly Rectifying Channel Subfamily J Member 11 KLF11 Kruppel Like Factor 11 LADA Latent Autoimmune Diabetes in Adults LDFG Lipodistrofias familiar generalizada LDFP Lipodistrofias familiar parcial LIPE Lipase E LMNA Lamin A/C M Mujer MDEP Monogenic Diabetes Expert Panel 8 MIDD Maternally Inherited Diabetes and Deafness MODY Maturity Onset diabetes of the Young MRP Multidrug resistance-associated protein MTNR1B Melatonin receptor 1B mTORC1 Mammalian Target Of Rapamycin Complex 1 NEUROD1 Neuronal Differentiation 1 NGS Next-Generation Sequencing OMIM Online Mendelian Inheritance in Man OMS Organización Mundial de la Salud OR Odds Ratio PAM Peptidylglycine Alpha-Amidating Monooxygenase PAX 4 Paired Box 4 PDK1 Phosphoinositide-dependent kinase-1 PDX1 Pancreatic and Duodenal homeoboX 1 PEG Pequeño para la edad gestacional PERK PKR-like ER kinase PI3K Fosfatidilinositol, 3 kinasa PKB Protein kinase B (también llamada AKT) PLIN1 Perilipin 1 PNDM Permanent neonatal diabetes PPARG Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma PQAR Poliquistosis autosómica recesiva PRKCQ Protein Kinase C theta PTRF Polymerase I and transcript release factor RCAD Renal Cysts And Diabetes RE Retículo Endoplasmático RFX6 Regulatory Factor X6 RR Riesgo relativo SD Síndrome de Donohue SEEDO Sociedad Española de Obesidad SH2 Src Homology 2 SHC Src homology 2 domain containing SHP2 SH2 Domain-Containing Protein Tyrosine Phosphatase 2 SLC2A4 Solute Carrier Family 2 Member 4 SLC30A8 Solute Carrier Family 30 Member 8 9 SNP Polimorfismo de nucleótido único SOS Son Of Sevenless SRC SRC Proto-Oncogene SRM Síndrome de Rabson-Mendenhall SUR Sulfonylurea receptor T Timina TCF7L2 Transcription factor 7-like 2 TNDM Transient neonatal diabetes TSC2 Tuberous Sclerosis Complex 2 UNESCO The United Nations Educational, Scientific and Cultural Organization Vs Versus VSI Variante de significado incierto WES Secuenciación del exoma completo WFS1 Wolframin ER Transmembrane Glycoprotein WGS Secuenciación del genoma completo YIPF5 Yip1 Domain Family Member 5 ZFP57 Zinc finger protein 57 homolog ZnT8 Zinc Transporter 8 16 10. Discusión………………………………………………………….………….. 146-152 11. Conclusiones…………….………………...………………………..…........... 154-155 12. Bibliografía………………………………………………………..………….. 157-178 13. Anexo………………………………………………………………................ . a. Otros genes asociados a la diabetes monogénica ……………………… 180-195 b. Documento de consentimiento informado ……………………………. 196-203 17 18 1. INTRODUCCIÓN a. Prólogo La diabetes se ha convertido en uno de los problemas sanitarios más graves de nuestro tiempo. Sus proporciones son epidémicas estimándose más de 500 millones de personas afectadas en todo el planeta (1). El termino diabetes mellitus (DM) engloba un grupo de enfermedades metabólicas caracterizadas por hiperglucemia derivada de un defecto en la secreción de insulina, en la acción de la misma o en ambos mecanismos. La hiperglucemia crónica se asocia con deterioro a largo plazo, disfunción y fallo de diferentes órganos, especialmente a nivel renal, visual, sistema nervioso y sistema cardiovascular. Es una enfermedad crónica compleja que requiere cuidados sanitarios continuados y estrategias multifactoriales de reducción de riesgo que van más allá del control glucémico (2). Distintos procesos patogénicos se han relacionado clásicamente con su aparición, desde la destrucción autoinmune de las células beta del páncreas causantes de deficiencia insulínica secundaria a los trastornos que desencadenan resistencia a la acción de la insulina. Dichos defectos frecuentemente coexisten en un mismo paciente. Una acción insulínica defectuosa en los tejidos diana produce alteraciones en el metabolismo de los hidratos de carbono, grasas y proteínas. Los síntomas de hiperglucemia severa incluyen poliuria, polidipsia, pérdida de peso y en ocasiones polifagia y visión borrosa. Los defectos en el crecimiento y la susceptibilidad para contraer ciertas infecciones suelen acompañar también a la hiperglucemia crónica mientras que la cetoacidosis diabética y el síndrome hiperosmolar no cetósico son manifestaciones agudas asociadas a riesgo vital. Las complicaciones crónicas de la diabetes mellitus incluyen retinopatía, nefropatía, neuropatía periférica, neuropatía autonómica con manifestaciones genitourinarias, gastrointestinales, síntomas cardiovasculares y disfunción sexual. Los pacientes tienen una incidencia aumentada de ateroesclerosis, enfermedad arterial periférica y enfermedad isquémica cerebro-vascular (3). La mayoria de los casos de diabetes mellitus se agrupan tradicionalmente y de forma simplificada en dos vias etiopatogénicas. En una de ellas, causante de diabetes tipo 1, existe un déficit insulínico absoluto. Los sujetos con riesgo de este tipo de diabetes pueden ser frecuentemente identificados por 19 la presencia de marcadores serológicos de un proceso autoinmune que afecta a los islotes de las células beta pancreáticas y otros marcadores genéticos. En la diabetes mellitus tipo 2, mucho más prevalente, la causa es la combinación de la resistencia a la insulina y una inadecuada secreción insulínica compensatoria. En esta variante el grado de hiperglucemia es suficiente para causar cambios funcionales y patológicos no sintomáticos años antes del diagnóstico de diabetes. Durante este periodo asintomático se puede confirmar la anormalidad en el metabolismo de los hidratos de carbono mediante la determinación de la HbA1c, de la glucemia plasmática en ayunas o tras una sobrecarga oral de glucosa (3). En su clasificación de 2021 la Organización Mundial de la Salud (OMS) reconoce sin embargo a heterogeneidad y la dificultad en la clasificación de la DM añadiendo nuevas posibilidades diagnósticas como las formas híbridas de diabetes mellitus y las DM no clasificadas (4). Diabetes mellitus tipo 1 Diabetes mellitus tipo 2 Formas híbridas de diabetes mellitus Diabetes del adulto de origen autoinmune lentamente progresiva Diabetes tipo 2 con tendencia a la cetosis Otros tipos específicos Diabetes monogénica -Diabetes monogénica con alteración en la función de la célula beta -Diabetes monogénica con alteración en la acción de la insulina Enfermedades del páncreas exocrino Enfermedades endocrinas Inducida por fármacos u otros químicos Infecciones Formas poco comunes de DM de origen inmune Otros síndromes genéticos ocasionalmente asociados a diabetes Diabetes no clasificada Hiperglucemia detectada en gestación Diabetes mellitus pregestacional Diabetes mellitus gestacional Clasificación de la DM. Adaptado de la clasificación de la OMS de 2021 (4). 20 El diagnóstico correcto es crucial para aplicar tratamientos adecuados pero supone un reto incluso para los clínicos más expertos. Un estudio reflejó que en Inglaterra hasta el 15% de los pacientes diabéticos estaba incorrectamente diagnosticado en atención primaria, tanto en la DM tipo 1 como en la tipo 2 (5). En otro estudio en una cohorte pediátrica el seguimiento durante 11 años mostró errores en la clasificación de los diabéticos hasta en un 20% de los casos (6). La medicina de precisión intenta ajustar el tratamiento a las características moleculares y celulares específicas de distintos grupos de pacientes. Éstas pueden estar afectadas por factores ambientales y relacionados con el estilo de vida. Esta área médica está en constante desarrollo, en gran medida por la evolución de técnicas genéticas y moleculares como la secuenciación masiva (Next-Generation Sequencing-NGS) (7). Tras la descripción de las características de los distintos tipos de diabetes mellitus desarrollaremos ampliamente el subgrupo de diabetes monogénicas, las cuales suponen un paradigma en la aplicación de la medicina de precisión y en las técnicas genéticas de diagnóstico molecular. 21 b. Diabetes mellitus clásicas b.1 Diabetes mellitus tipo 1 b.1.1 Fisiopatología A primera vista la fisiopatología de la diabetes mellitus tipo 1 puede parecer sencilla. Sin embargo cuanto más avanzamos en el estudio de la enfermedad menos parecemos conocer realmente acerca de ella. Lo que inicialmente parecía únicamente un proceso autoinmune que activaba los linfocitos T y destruía las células beta del páncreas productoras de insulina hoy en día es reconocido como una compleja interacción entre factores ambientales, microbiota, factores genéticos, factores metabólicos y el sistema inmunológico que varían de forma individual en cada paciente. A pesar de que están descritos factores genéticos la mayoría de las personas diagnosticadas de diabetes mellitus tipo 1 no tienen familiares afectados ni la combinación de alelos HLA de mayor riesgo para el desarrollo de la enfermedad, lo cual dificulta la prevención primaria de la misma (8). En 1984 George Eisenbarth desarrolló el modelo conceptual de la patogénesis de la diabetes mellitus tipo 1 en la que un factor precipitante ambiental actúa sobre sobre un paciente con un factor predisponente genético causando autoinmunidad específica contra los islotes pancreáticos , reducción de la masa de células beta, disminución de la producción de insulina y finalmente la hiperglucemia definitoria de diabetes mellitus. La fase 1 sería preclínica con la detección de 2-3 autoanticuerpos específicos mientras que en las fases 2 y 3 existiría progresión de las alteraciones metabólicas abarcando desde la glucemia anormal hasta la diabetes establecida (9). El periodo de latencia en la DM1 puede definirse como el intervalo de tiempo en el cual la destrucción de la célula beta ha comenzado pero aún preservando la secreción de insulina para evitar la hiperglucemia franca. Este periodo es clínicamente silente y se caracteriza por el estrés y destrucción de la célula beta, insulitis y autoinmunidad. Durante esta etapa de la DM1 preclínica hay una reducción en la función de la célula beta medida por la sensibilidad a la glucosa durante los test de 22 tolerancia oral. La duración de este periodo es impredecible, en ocasiones con una duración de sólo unos meses y en otras de muchos años (10-13). Pese a que se reconoce la utilidad de este modelo, actualmente es criticado por simplificar en exceso la etiopatogenia de la enfermedad , la cual parece tener una heterogeneidad aún no conocida adecuadamente en todas sus fases y sin un único desarrollo lineal como se ha postulado tradicionalmente (8). b.1.2 Diagnóstico El diagnóstico de diabetes mellitus tipo 1 se basa en la presencia de cifras de glucemia repetidas en ayunas mayores de 126 mg/dl, una glucemia al azar mayor de 200 mg/dl con clínica cardinal diabética o un resultado anormal en una prueba de tolerancia a la glucosa. La HbA1c mayor de 6.5% también se considera diagnóstica de diabetes mellitus (3) aunque este parámetro puede ser menos sensible en la DM tipo 1 por la posible progresión rápida de la hiperglucemia no detectable con este parámetro. La presentación de la enfermedad en niños suele asociar poliuria, polidipsia, pérdida de peso y cetoacidosis diabética hasta en un tercio de los casos. En adultos suele ser más variable y con frecuencia no presentan los síntomas clásicos (3). Tradicionalmente la diabetes mellitus tipo 1 se clasifica como juvenil. Sin embargo en el 50% de los casos se diagnostica en edad adulta lo cual facilita la clasificación incorrecta como DM tipo 2. Otros factores que dificultan la clasificación son la epidemia de obesidad en gente joven y la posibilidad de diagnóstico de diabetes monogénica en edades tempranas (4). Aunque los niveles de péptido C bajos 3 años después de la presentación puede ser un marcador de diabetes mellitus tipo 1 hay que recalcar que no hay ningún parámetro clínico o bioquímico que de forma aislada pueda confirmar el diagnóstico. La clasificación correcta de diabetes mellitus tipo 1 vs tipo no 1 depende de la integración de las características clínicas ( por ejemplo edad de diagnóstico, IMC) con otros biomarcadores (autoinmunidad diabética, péptido C, resistencia a la insulina, análisis genéticos…etc) (8). 23 b.1.3 Factores genéticos La diabetes mellitus tipo 1 es una enfermedad poligénica con una concordancia del 30-70% en gemelos idénticos, del 6-7% en hermanos y con un riesgo de aparición en hijos de padres diabéticos del 1-9%. El riesgo de aparición a lo largo de la vida se encuentra en torno a 1/250 personas aunque es variable en los distintos países y regiones geográficas. Existe un ligero predominio masculino tanto en edad juvenil como en edad adulta (14). b.1.3.1 HLA Los genes HLA (Human Leukocyte Antigen) se relacionan con el complejo mayor de histocompatibilidad humano, siendo responsables de la respuesta celular inmune y con un papel importante en la autoinmunidad. Se les atribuye un 50% del riesgo de heredabilidad de la DM1 (15). Algunos polimorfismos HLA-DR y HLA-DQ ( en particular HLA-DR3 y DR4 en el locus DRB1) se asocian a un riesgo aumentado de desarrollo de diabetes tipo 1. Los niños heterocigotos para el genotipo de alto riesgo DR3/DR4 tienen un riesgo de 1/20 de desarrollar DM1 a los 15 años . Al mismo tiempo HLA-DR2 confiere protección para la aparición de DM1 y se asocia al haplotipo común en raza caucásica DR-DQ (14). b.1.3.2 No HLA Actualmente 58 regiones genómicas y unos 50 genes se asocian al desarrollo de la diabetes mellitus tipo 1. Sin embargo en muchos de estos genes la asociación parece casual mientras que para otros (entre ellos IL27, BAD, CD69, PRKCQ, CLEC16A, ERBB3 y CTSH ) son necesarios más estudios y pruebas confirmatorias (16). El gen IL27 codifica la citoquina interleucina 27. Este grupo de citoquinas modula la diferenciación y la actividad de varios subtipos de células T(17,18). Los estudios en ratones con DM tipo 1 apoyan su asociación a la aparición de la DM tipo 1 aunque son necesarios estudios confirmatorios en humanos (19). La proteína codificada por el gen BAD es un regulador fundamental de la vía apoptótica mitocondrial. Este efecto pro-apoptótico se ha relacionado con la disfunción de la célula beta inducida por citoquinas (20,21). Cuando BAD es fosforilada en la célula beta parece intervenir en la expansión de la célula beta mediada por nutrientes y en la secreción de insulina glucoestimulada (22). 24 La proteína codificada por el gen CD69 parece ser un factor importante en la modulación de la respuesta inflamatoria. Está implicada en la regulación de distintos procesos autoinmunes e inflamatorios como la artritis reumatoide, el lupus eritematoso sistémico, la esclerosis múltiple y la enfermedad tiroidea autoinmune. Sin embargo su papel en la DM tipo 1 aún no está bien definido (23). PRCKQ codifica la proteína quinasa C theta, la cual interviene en la interacción entre las células T y las células presentadoras de antígenos, lo cual afecta a la secreción de citoquinas por las células citotóxicas T. Hasta el momento se han intentado utilizar inhibidores de PRCKQ en la psoriasis, pero su utilidad en la modulación de la autoinmunidad de la diabetes mellitus tipo 1 aún no está clara. Los genes CLEC16A, ERBB3 y CTSH se expresan en las células del sistema inmune y en las células beta y podrían intervenir en la patogénesis de la DM1(24–27). CLEC16A se expresa en distintas células del Sistema inmune como las Natural Killers, las células B, las células dendríticas y en menor grado en las células T. También se ha descrito su papel en la regulación de la mitofagia en la célula beta (28). No obstante otros estudios sugieren que CLEC16A no está implicada en la coestimulación de la célula T por lo que habría profundizar en otras vías autoinmunes implicadas (26,29). Estudios previos sugerían que ERBB3 podría contribuir al riesgo de desarrollar DM1 al modular a las células presentadoras de antígeno y la autoinmunidad. Sin embargo su implicación parece relacionarse con la regulación de la apoptosis de la célula beta (16). CTSH interviene en la degradación proteica de los lisososomas en muchos tipos celulares pero en la célula beta parece tener un papel fundamental tanto en la apoptosis inducida por citoquinas como en la síntesis de insulina (24). La DM1 es una enfermedad compleja y heterogénea y es improbable que un biomarcador aislado o incluso un perfil molecular específico pueda capturar las dinámicas interdependientes en las vías moleculares de desarrollo y progresión (30). La posibilidad de que un factor ambiental aislado pueda estimular de forma independiente a individuos GAD positivos o con HLA-DR4-DQ8 confirma la complejidad de la enfermedad. El papel del genoma de la célula beta y las variantes genéticas de sus elementos reguladores, incluyendo ARNs no codificantes debería valorarse en las fases 1-3 de la patogénesis. Son necesarios en todo caso más estudios confirmatorios (16). 25 b.1.4 Autoinmunidad Los autoanticuerpos contra los islotes de células pancreáticas (ICAs) fueron descritos aproximadamente hace 40 años mediante técnicas de inmunofluorescencia, respaldando la hipótesis de la insulitis de origen inmune. El hallazgo de títulos variables de anticuerpos supuso por primera vez la integración de factores humorales en la DM1 (31). Se han utilizado distintos paneles de anticuerpos para identificar personas con riesgo de desarrollo de DM1 o para confirmar su diagnóstico. Éstos incluyen los anticuerpos contra insulina (IAAs), contra la descarboxilasa del ácido glutámico (GAD), contra el antígeno 2 de la fosfatasa-like del insulinoma (IA2) y contra el epítopo C-terminal de IA2 (ICA512). En el momento del debut de DM1 se han descrito los siguientes datos de positividad : ICA 70-80%, IAA 60%, IA2 60% y GAD 70-80% (32–34). El cribaje de autoanticuerpos en familiares de primer grado de pacientes con DM1 puede ayudar a detectar individuos en riesgo de desarrollo de la enfermedad. De forma aislada los ICA predicen un mayor riesgo de progresión acelerada de la DM tipo 1 que los antiGAD o antiIA2 por sí solos (35). El autoanticuerpo contra el transportador de Zinc 8 (ZnT8) fue descrito en 2007, puede detectarse en prediabetes y persistir en DM1 de larga evolución(36). Aunque los niveles son positivos en el 63% de los pacientes que debutan con DM1 su combinación en un panel con IAA, IA2 y GAD amplía la positividad a alguno de los autoanticuerpos al 98% (32). Es interesante conocer que el título y la prevalencia de ZnT8 aumentan con la edad lo cual puede ser útil en estrategias de reclasificación de DM1 (37). En individuos con autoanticuerpos positivos es importante conocer el título de los mismos y si hay distintos tipos implicados. En el caso de ICA, GAD 65 e IA2, al utilizarlos como herramienta de screening de DM1 en población sana, su determinación positiva con otro anticuerpo específico previamente positivo aumenta considerablemente el riesgo de desarrollo de DM1 y la velocidad a la que se instaura (33). Sin embargo pese a la importancia de estos parámetros en el diagnóstico de DM1 aún existe una alta variabilidad entre los distintos laboratorios y las técnicas utilizadas para su determinación. Por este motivo distintas iniciativas , entre ellas el Diabetes Antibody Standardization Program Workshop, se han desarrollado para verificar el correcto funcionamiento de los distintos laboratorios, 32 c.DM monogénica c.1. Definición y clasificación La diabetes monogénica es un término que engloba grupo heterogéneo de causas de diabetes que afectan a la función de la célula beta, al desarrollo del páncreas endocrino o a la acción de la insulina. Se producen por una variante mutacional en determinados genes habitualmente heredados de forma autosómica dominante. La diabetes mitocondrial o la Maturity-onset diabetes of the young (MODY) son algunos de los subtipos de diabetes monogénica. Se caracterizan por una mayor sensibilidad a terapias concretas como las sulfonilureas y a una mayor perdurabilidad de la reserva de insulina en comparación con la DM tipo 1. Los genes principalmente implicados en la diabetes tipo MODY son HNF4A (MODY 1), GCK(MODY 2), HNF1A (MODY 3), PDX1/IPF (MODY 4), HNF1B (MODY 5), NEUROD1 (MODY 6), CEL (MODY 8), INS (MODY 10) ABCC8 (MODY 12) y KCNJ11 (MODY 13). BLK, PAX 4 y KLF11, pese a estar clasificadas como MODY 11,9 y 7 respectivamente no se incluyen en las clasificaciones recientes como causantes de MODY por haberse objetivado relaciones genenfermedad conflictivas (82) .Por otro lado variantes mutacionales detectadas en el gen APPL1 se han propuesto como causantes de MODY 14 por los hallazgos en dos familias, con evidencia aún limitada (83). RFX6 todavía no tiene número MODY en OMIM pero se incluye en las clasificaciones porque variantes con pérdida de función de este gen se han asociado a fenotipos muy similares a otros MODY pero con menor penetrancia (84). 33 PRINCIPALES GENES ASOCIADOS A DIABETES MONOGÉNICA GCK HNF1A HNF4A HNF1B mtDNA 3243 KCNJ11 6q24 ABCC8 NEUROD1 CEL INS RFX6 INS WFS1 FOXP3 EIF2AK3 INSR LMNA PPARG AGPAT2 BSCL2 Adaptado de la clasificación de la OMS 2021 y Zhang et al “Monogenic diabetes: a gateway to precision medicine in diabetes (2021)” (4,82). 34 c.2 DM monogénicas más frecuentes en el adulto (tipo MODY) DM asociadas a HNF1A y HNF4A La proteína codificada por el gen HNF1A es un factor de transcripción esencial para la expresión de muchos genes hepáticos. Funciona como un homodímero y se une al palíndromo invertido 5'- GTTAATNATTAAC-3'. Las alteraciones en este gen son causa de MODY 3 al intervenir en la regulación del desarrollo de la célula beta y se asocian a la aparición de adenomas hepáticos. La proteína codificada por el gen HNF4A también es un factor de transcripción nuclear que se une al ADN como un homodímero. Controla la expresión de distintos genes, entre ellos el factor hepatocitario nuclear tipo 1 (HNFA1), el cual es un factor de transcripción que regula la expresión de mútiples genes hepáticos. Este gen tiene un papel esencial en el desarrollo hepático, renal y del aparato digestivo. Las mutaciones de este gen se han asociado con la diabetes MODY no dependiente de insulina tipo 1 y el síndrome de Fanconi renotubular tipo 4. La DM asociada a la variante HNF1A es la DM MODY más frecuente con más de 400 variantes descritas. Los pacientes con mutación HNF1A y HNF4A tienen elevada sensibilidad a las sulfonilureas incluso a dosis bajas, apareciendo hipoglucemias con las dosis habituales en la DM2 (85-88). Las sulfonilureas se unen a la subunidad específica del canal de potasio KATP despolarizando la célula beta y estimulando la liberación de insulina. El mejor control con sulfonilureas en estos pacientes ha sido contrastado al compararlo con el tratamiento con metformina(89). Los aGLP1 en monoterapia y las sulfonilureas en combinación con iDPP4 también han demostrado buen control glucémico en HNF1A (90,91). Localización genómica del gen HNF1A (86) Último ensamblaje chr12:120,977,683-121,002,512 (GRCh38/hg38) Tamaño: 24,830 bases Orientación: Cadena positiva 35 Símbolo proteico P20823-HNF1A_HUMAN Nombre recomendado Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Localización genómica del gen HNF4A (86) Último ensamblaje chr20:44,355,699-44,434,596 (GRCh38/hg38) Tamaño 78,898 bases Orientación: Cadena positiva Símbolo proteico: P41235-HNF4A_HUMAN Nombre recomendado: Hepatocyte nuclear factor 4-alpha DM asociada a GCK El gen GCK codifica una proteína de la familia de las hexoquinasas. Las hexoquinasas fosforilan la glucosa para producir glucosa-6-fosfato, primer paso de la mayoría de vías del metabolismo de la glucosa. En contraste con otras formas de hexoquinasa esta enzima no se inhibe por el producto glucosa-6-fosfato y persiste activo en abundancia de la glucosa. El uso de múltiples promotores y el splicing alternativo producen distintas isoformas proteicas con expresión específica en tejido pancreático y hepático. En el páncreas la enzima desempeña una importante función en la secreción de insulina estimulada por la glucosa mientras que en el hígado interviene en la captación de la glucosa y su transformación en glucógeno. Las mutaciones de este gen se ha asociado con distintos tipos de DM e hipoglucemia hiperinsulinémica. La enzima cataliza la fosforilación de hexosas (D-glucosa, D-fructosa y D-manosa a hexosas 6-fos- fatoàD-glucosa 6-fosfato, D-fructosa 6-fosfato y D-manosa 6-fosfato). Comparado con otras 36 hexoquinasas tiene baja afinidad por la D-glucosa por lo que sólo se activa cuando la glucosa es abundante (86). GCK actúa como un sensor de glucosa en la célula beta y tiene un papel relevante en la modulación de la secreción insulínica(92-94). En el Reino Unido la prevalencia de hiperglucemia asociada a variante GCK se estimó en un 0.1% en europeos blancos. Esto supondría una mayor prevalencia que la DM HNF1A; la infraestimación posiblemente se debe a que la ausencia de síntomas hace que muchos pacientes no soliciten atención médica. En el registro americano de 2019 las variantes patogénicas de GCK representaban la causa más frecuente de MODY, con un 57% de los casos, siendo concordante con lo descrito en otros países. España registra un 25-80% de los casos según las fuentes (95-97).El fenotipo en portadores de la variante es poco heterogéneo con HbA1c que raramente supera el 7.5% (93,94). Los niveles de glucosa suelen ser bastante resistentes al uso de hipoglucemiantes orales e insulina y habitualmente no se asocian al desarrollo de complicaciones vasculares crónicas (98-101). La medicación hipoglucemiante no es necesaria salvo en la gestación en la que el feto no es portador de mutación GCK por el riesgo de macrosomía secundaria a la hiperglucemia. En el caso de madre y feto portadores de una variante GCK está contraindicado el tratamiento por el riesgo de bajo peso fetal (102). Se recomienda la monitorización estrecha del feto mediante ecografía y si está disponible el estudio de variante GCK mediante análisis de ADN fetal (103). Localización genómica del gen GCK (86) Último ensamblaje chr7:44,143,213-44,198,170 (GRCh38/hg38) Tamaño: 54,958 bases Orientación: Cadena negativa Símbolo proteico: P35557-HXK4_HUMAN Nombre recomendado: Hexokinase-4 37 DM asociada a HNF1B El gen HNF1B codifica una proteína que forma parte de la super familia de factores de transcripción portadoras de un homeodominio .Esta proteína se une al ADN como un homodímero o como un heterodímero junto a HNF1A. Parece relacionarse con el desarrollo de las nefronas y del páncreas embrionario. Las mutaciones en el gen producen el síndrome de DM no dependiente de insulina y quistes renales. También parecen relacionarse con la aparición de algunos tipos de cáncer (86). Las variantes asociadas a HNF1b suponen menos de un 1% de los casos de MODY. Pueden desarrollar sólo DM o asociar afectación pancreática, quistes renales, quistes hepáticos, alteraciones en desarrollo cognitivo e hipomagnesemia. Estas características sindrómicas en ocasiones aparecen sin diabetes (104,105). El descenso del FG es más significativo en las variantes sin deleción que en las que la tienen (106).Algunos pacientes responden inicialmente a sulfonilureas pero a largo plazo suelen necesitar insulina (107). Localización genómica del gen HNF1B (86) Último ensamblaje chr17:37,686,431-37,745,059 (GRCh38/hg38) Tamaño: 58,629 bases Orientación: Cadena negativa Símbolo proteico: P35680-HNF1B_HUMAN Nombre recomendado: Hepatocyte nuclear factor 1-beta 38 c.3 Diabetes mellitus neonatal La Diabetes neonatal es aquella diagnosticada en los primeros 6 meses de vida, pudiendo ser permanente (Diabetes Mellitus Neonatal Permanente o DMNP) o transitoria (Diabetes Mellitus Neonatal Transitoria o DMNT). Sus rasgos clínicos incluyen el crecimiento intrauterino retardado (CIR), el fallo de medro, la poliuria y la deshidratación severa (108,109). Dependiendo del gen implicado algunos pacientes pueden tener alteraciones congénitas y patología de la esfera neurológica (110). Afecta a 1/90000-260000 nacidos vivos, 50% de los cuales serán DMNP (111,112). El 60-70% de los casos de DMNT están causados por la sobreexpresión de genes con imprinting paterno en 6q24 (DMNT 6q24) (113). El resto de los casos se asocian a mutaciones KCNJ11 (114) y ABCC8 (115). Con menos frecuencia se atribuye la causa de DMN a variantes en el gen INS (codificante del precursor de la insulina preproinsulina), en HNF1B y en otros genes(115–117). Aún hay que aclarar por qué algunas DMN reaparecen años más tarde aunque hay teorías que lo asocian a la resistencia a la insulina propia de la pubertad (118). Algunos de los genes implicados en la DMNT como ABCC8, KCNJ11 e INS tienen variantes que también causan DMNP. También puede producirla el gen GCK en situación de homocigosis o heterocigosis compuesta inactivante(100). La DMNP puede formar parte del complejo IPEX (alteración del sistema inmune, poliendocrinopatía, enteropatía, ligada al X), causada por variantes en el gen FOXP3 o como parte del síndrome de Wolcott-Rallison por variantes del gen EIF2AK3 y otros genes . En todo caso la causa genética de la DMN ha sido encontrada en el 83% de los casos por lo que aún hay que seguir investigando; los estudios recientes del exoma implican YIPF5 en la aparición de la DMN con microcefalia AR (116,117,119-123). Se recomienda que los pacientes diagnosticados de diabetes en los primeros 6 meses de vida realicen estudio genético para identificar su subtipo ya que la DM tipo 1 es extremadamente rara en esta edad. Aproximadamente el 80-85% de los casos de DMN tienen causas genéticas identificables, siendo la mitad de ellas diabetes asociadas a KATP causadas por variantes ABCC8 y KCNJ11. La manera en la que estas mutaciones patogénicas activantes causan la enfermedad se debe que reducen por distintas vías el efecto del ATP para cerrar los canales de potasio (122). El desarrollo de DMNP o DMNT depende de la severidad de la mutación y del gen implicado, estando KCNJ11 más asociado a DMNP y ABCC8 más a DMNT (112,124). Sin embargo se han descrito en la misma familia portadores de la misma mutación con manifestaciones clínicas totalmente distintas por lo que se cree que otros factores deben estar implicados en la evolución de la diabetes mellitus. 39 La pérdida de función en ambos genes en homocigosis o heterocigosis compuesta puede aumentar la secreción de insulina y presentarse como un hiperinsulinismo congénito. También puede aparecer en heterocigosis si la pérdida de función es dominante (125-129). Las manifestaciones no diabéticas de las variantes asociadas a KATP incluyen debilidad muscular,retrasos en el desarrollo y epilepsia de aparición temprana (síndrome DEND). Es controvertido si el tratamiento de las variantes ABCC8 o KCNJ11 con sulfonilureas a dosis altas mejora las manifestaciones neurológicas, aunque son fármacos seguros en este contexto (130-133). En función de la severidad y la duración de la diabetes el 90% de los pacientes tratados con insulina pueden sustituirla por sulfonilureas (134-139). En aquellos en los que no se puede hacer la transición completa el uso combinado de insulina y sulfonilureas tiene buenos resultados (140). Localización genómica del gen ABCC8 (86) Último ensamblaje: chr11:17,392,498-17,476,894 (GRCh38/hg38) Tamaño: 84,397 bases Orientación: Cadena negativa Símbolo proteico: Q09428-ABCC8_HUMAN Nombre recomendado: ATP-binding cassette sub-family C member 8 El gen ABCC8 codifica una proteína que forma parte de la superfamilia ABC de transportadores dependientes de ATP. Las proteínas ABC transportan diversas moléculas a través de las membranas intra y extracelulares. Los genes ABC se dividen en 7 subfamilias distintas (ABC1, MDR/TAP, MRP, ALD, OABP, GCN20, White). En concreto la proteína del gen ABCC8 forma parte de la subfamilia MRP, asociada la resistencia a múltiples sustancias o fármacos. Su función consiste en modular los canales de potasio ATP dependientes y la secreción de insulina (86). Localización genómica del gen KCNJ11 (86) 40 Último ensamblaje chr11:17,365,172-17,389,346 (GRCh38/hg38) Tamaño: 24,175 bases Orientación: Cadena negativa Símbolo proteico: Q14654-KCJ11_HUMAN Nombre recomendado: ATP-sensitive inward rectifier potassium channel 11 Las mayoría de las células de los mamíferos tienen canales de potasio que participan en diversos procesos fisiológicos. El producto del gen KCNJ11 es una proteína integral de membrana y canal de potasio inward-rectifier (que rectifica hacia el interior). La proteína codificada favorece el flujo de potasio hacia el interior de la célula, siendo controlada por proteínas G. El potasio extracelular produce el viraje a voltajes positivos y la activación del canal. Puede formar canales KATP con ABCC9 en músculo liso y cardiaco. KCNJ11 forma el poro del canal y ABCC9 modula su activación y regulación. Se asocia al receptor de sulfonilureas SUR. La familia de los canales de potasio inward-rectifier (también llamados canales 2-TM) incluye el canal Kir2.x, el canal activado por proteína G Kir3.x y el canal sensible a ATP Kir.x. Todos ellos se relacionan con los receptores de sulfonilureas (86). 41 c.4. Causas sindrómicas DM asociada a Síndrome de Wolfram El síndrome de Wolfram tipo 1 se asocia a mutación WFS1. Sus rasgos clínicos incluyen diabetes insípida, atrofia óptica y sordera por lo que también se conoce por el acrónimo DIDMOAD (Diabetes Insípida, Diabetes Mellitus, Optic Atrophy y Deafness). También pueden causar sordera AD tipo 6, también conocida como DFNA14 o DFNA38. Es una enfermedad AR poco frecuente causada por alteraciones en la proteína transmembrana del RE llamada wolframina aunque también se han comunicado casos severos AD (141). Algunos pacientes WFS1 sólo desarrollan diabetes mellitus, dependiendo de la penetrancia de la variante afectada (141-143). El síndrome de Wolfram tipo 2 no se asocia a mutación WFS1. Sí parecen estar implicadas variantes mutacionales que modifican el dominio de puentes de sulfuro tipo 2 (CISD2). Las manifestaciones clínicas son parecidas a las del tipo 1 pero sin diabetes insípida y presentando úlceras pépticas hemorrágicas y alteraciones en la agregación plaquetaria (144). Localización genómica del gen WFS1 (86). Último ensamblaje: chr4:6,260,368-6,303,265 (GRCh38/hg38) Tamaño: 42,898 bases Orientación: Cadena positiva Símbolo proteico: O76024-WFS1_HUMAN Nombre recomendado: Wolframin El gen WFS1 codifica una proteína transmembrana (wolframina)que se localiza principalmente en el retículo endoplasmático (RE) y que se expresa con niveles especialmente elevados en cerebro, páncreas e islotes de células beta y corazón. Interviene en la regulación de la homeostasis del calcio celular al modular el contenido de los depósitos del RE. Regula negativamente el estrés del RE y de 48 d.La diabetes monogénica como ejemplo de medicina de precisión d.1 El diagnóstico de la diabetes monogénica Estudios poblaciones han determinado que hasta un 6.5 % de los niños con DM y autoinmunidad negativa tienen variantes funcionales en genes asociados a diabetes monogénica, aunque definir los grupos de riesgo en adultos es más complejo. Uno de los avances más importantes de los últimos años ha sido la implementación de las técnicas de secuenciación masiva o “de nueva generación”, las cuales han tenido una influencia crucial tanto en nuestra comprensión de la variabilidad genética en diabetes mellitus. Actualmente no podemos trazar una frontera genética rígida entre la diabetes monogénica y la diabetes tipo 1 y 2 ya que determinadas mutaciones asocian fenotipos diabéticos “sutiles” o intermedios. Al mismo tiempo la importancia del diagnóstico de la diabetes monogénica es cada vez más aceptada entre los clínicos por su potencial para realizar cambios terapeúticos relevantes. Actualmente las guías de práctica clínica para la detección de la diabetes monogénicas tienen limitaciones. La sociedad internacional de diabetes pediátrica y adolescente (ISPAD) ha recomendado realizar estudio genético en todos los pacientes con diabetes con diagnóstico antes de los 6 meses de edad y también en todos los pacientes con diagnóstico antes de los 12 meses de edad y autoinmunidad pancreática negativa. Esto no sólo mejora de forma individual el tratamiento y el seguimiento de los pacientes con diabetes KATP sino que también ha demostrado ser coste efectivo en este grupo poblacional. Sin embargo el diagnóstico de diabetes monogénica en población adulta y pediátrica diagnosticada como DM1 y DM2 supone un reto más complejo, sobre todo para los médicos con experiencia limitada en esta área (157). Se necesitan herramientas de screening avanzadas basadas en la edad de diagnóstico,la historia familiar,la secreción endógena de insulina,la ausencia de obesidad y la negatividad de los anticuerpos pancreáticos para alcanzar un mejor coste efectividad de los estudios y un equilibrio en la sensibilidad y la especificidad(158–160). Siguiendo la tendencia de la ISPAD la ADA en 2022 contempla algunos escenarios en los que está indicada la solicitud de estudio genético para detectar diabetes monogénica (3,161), aunque es necesaria la evolución y el desarrollo de esta área. El protocolo utilizado en 2012 en el estudio del grupo británico de Thanabalasingham y colaboradores sigue sirviendo de referencia en el cribaje de la diabetes monogénica (194). 49 Los biomarcadores y los sistemas de Score derivados de su aplicación minimizan el sesgo del juicio clínico y los puntos de corte arbitrarios, permitiendo además su evaluación cuantitativa, lo cual facilita su validación y su replicación. El estudio Swedish Better Diabetes Diagnosis describió que la negatividad de los anticuerpos contra la decarboxilasa del ácido glutámico (GAD), el antígeno de islotes tipo 2(IA-2), el transportador de Zinc tipo 8(ZnT8) y la insulina pueden ser un buen discriminador en el diagnóstico ya que en este estudio la diabetes MODY sólo se identificó en el 15% de los pacientes incluidos en el grupo con anticuerpos negativos (160). Sin embargo otros estudios muestran que el 1-2% de pacientes diagnosticados con MODY son antiGAD positivos, reduciendo por tanto la sensibilidad de los anticuerpos como screening (162). Además el tipo de anticuerpo medido puede cambiar en los distintos centros sanitarios por lo que es pertinente su estandarización si queremos usar la autoinmunidad como método de screening. Otros biomarcadores utilizados e incluidos en algoritmos de cribaje son los niveles de péptido C plasmáticos detectables 3 años después del diagnóstico en ayunas o estimulados. También se han propuesto como biomarcadores la proteína C reactiva de alta sensibilidad, el 5-anhidroglucitol, el HDL, el cociente péptido C/Cr en orina y el glicano GP30 (82). Además de los biomarcadores Shields et al desarrollaron en 2011 una calculadora de predicción de diagnóstico para diabetes mellitus tipo MODY. Para la configuración y el diseño de su algoritmo diagnóstico se estudió una cohorte de europeos de raza blanca con diagnóstico de DM antes de los 35 años de edad. Se estableció el punto de corte de probabilidad del 40% con una sensibilidad del 96% y una especificidad del 91% para diferenciar MODY de DM tipo 2; en este punto de corte se calculó una sensibilidad del 87% y una especificidad del 88% para diferenciar MODY de DM tipo 1 (163). Pese a estos resultados prometedores esta calculadora requiere validación en otras cohortes de distinta procedencia étnica (82). d.2 Selección de la técnica y de los genes a analizar Los primeros genes MODY fueron identificados en los 1990s utilizando técnicas de linkage o ligamiento en familias con MODY clínico diagnosticado. En los años 2000 la disponibilidad de la técnica Sanger permitió el estudio individual de uno o varios genes relacionados con la función de la célula beta en función de la sospecha clínica. El algoritmo diagnóstico consistía en iniciar el estudio del gen más frecuentemente mutado asociado a la enfermedad y en caso de detectar la variante patogénica confirmar el diagnóstico. Si no era así se continuaba con la secuenciación de los diferentes genes candidatos hasta detectar o no la mutación causante de la enfermedad (164). Este procedimiento es 50 poco eficiente cuando se aplica a una patología genéticamente heterogénea en la que no existe un gen candidato, sino varios (165). Aunque es altamente precisa y tiene una sensibilidad del 99,9%, tiene una limitada capacidad para generar otros datos en comparación con otras opciones tecnológicas de análisis de ADN, especialmente la NGS. Por ello, el estudio de una extensión amplia del genoma es un proceso caro y laborioso. Sin embargo esta tecnología sigue siendo de referencia para el análisis de regiones conocidas del genoma y de extensión moderada, como pueden ser las enfermedades monogénicas o las provocadas por un número pequeño de genes. Con el desarrollo de la secuenciación masiva o Next Generation Sequencing (NGS) todos los genes conocidos causantes de diabetes monogénica o incluso el exoma completo de un sujeto puede ser analizado de forma simultánea. La mayoría de paneles incluyen todos los genes MODY o al menos los más comunes así como los genes causantes de DMN y de las formas sindrómicas de DM. Existen ventajas e inconvenientes en el uso de paneles NGS. Su bajo precio permite la secuenciación paralela de genes asociados a formas sindrómicas de diabetes. Esto es útil porque estos tipos de DM habitualmente no se analizarían en ausencia de un fenotipo sindrómico evidente. Por otra parte, la interpretación de las alteraciones que se descubren es más sencilla y se minimizan los hallazgos accidentales (166). La aplicación de paneles de secuenciación masiva al diagnóstico genético requiere del estudio de los genes asociados a la patología, del diseño bioinformático del panel y de su validación, que permita evaluar los parámetros de calidad del panel, como la reproducibilidad, cobertura media, sensibilidad, especificidad, detección de deleciones e indels (“inserción o deleción”), previa a su aplicación en el diagnóstico de enfermedades genéticas (167,168). Una de las principales limitaciones de los paneles de genes es la dificultad para detectar determinadas alteraciones, especialmente las variaciones en el número de copias (CNVs, Copy Number Variation), o alteraciones en regiones con número insuficiente de lecturas o con menor cobertura. Esta cobertura menor al 100% ocurre sobre todo en los primeros exones de genes con regiones ricas en G y C (169). Por otra parte, de acuerdo con las recomendaciones del Colegio Americano de Genética y Genómica Médica (ACMG, American College of Medical Genetics and Genomics), solo aquellos genes que han sido científicamente asociados con una enfermedad deben ser incluidos en el panel de genes (168). Por ello, el resultado para un paciente concreto puede no ser concluyente, y requerir de otro panel de genes, otro método adicional como los arrays de hibridación genómica comparada (aCGH, Comparative Genomic Hybridization) para la detección de CNVs o el análisis genético mediante WES o WGS. Dada la rapidez con la que se identifican nuevos genes asociados a una enfermedad, es necesaria la actualización de los paneles, especialmente en aquellas enfermedades en las que las bases moleculares no están del todo definidas. Incluir nuevos genes en el “pool” que va a amplificarse mediante NGS evitaría tener que secuenciar todos los genes conocidos mediante WES o WGS (170). 51 Sin embargo es importante que los paneles no incluyan genes con asociación débil o discutible con la diabetes monogénica; en caso de estar incluidos por supervisión o calibración se recomienda no informarlos. Los paneles no sólo facilitan el diagnóstico molecular; además permiten detectar nuevas variantes que servirán de base para futuros estudios. Sin embargo en ocasiones la confirmación por Sanger es necesaria para el estudio adecuado de regiones complejas del genoma. En ocasiones es necesario ampliar el estudio genético mediante WES o WGS. El 85% de los genes causantes de enfemedad se encuentran en el exoma, lo cual corresponde a un 2 % del genoma total. (171). El análisis del exoma completo no solo incluye los exones de aquellos genes asociados al fenotipo en estudio, sino que también permite la identificación de nuevos genes en enfermedades con base molecular desconocida. Pueden plantearse dos opciones diferenciadas. La técnica llamada exoma dirigido limita el análisis a los genes de interés, pudiendo ampliarse más adelante si es preciso. Se indica cuando se pretende estudiar el mayor número de genes asociados a un fenotipo concreto, en enfermedades de una heterogeneidad media o alta y en aquellas con diagnóstico diferencial complicado o con características clínicas solapantes. Por otro lado existen los exomas comerciales o “exomas clínicos” que suelen incluir unos 5000 genes, aproximadamente un 20% del completo. Estos exomas “parciales” pueden ampliarse si es preciso durante el estudio de la enfermedad (172). Un paso más sería la secuenciación del genoma completo (WGS). La identificación de variantes a lo largo de todo el genoma permite detectar variantes no exónicas, mejorar la detección de las CNVs y un mayor rendimiento sobre WES (169,173,174). Independientemente de la metodología cada vez está más extendida la observación de que el análisis aislado de los exones puede obviar el diagnóstico de diabetes monogénica en las regiones intrónicas no codificantes (por ejemplo la región 5′- y 3′-UTRs) (175,176). La búsqueda de diabetes monogénica mediante la secuenciación de exomas o genomas permite descubrir nuevos variantes pero estos hallazgos requieren precaución (177,178). La cobertura del exoma puede ser incompleta, lo cual es causa de falsos negativos. Además se pueden detectar variantes con implicación en la salud o la reproducción que no están relacionadas con la indicación de estudio genético y que deben ser informadas según las recomendaciones del American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) (179). Con estas limitaciones estas herramientas diagnósticas pueden ser muy efectivas en la detección de genes asociados a la diabetes monogénica en las que las pruebas anteriores en genes conocidos han sido negativas (180). 52 d.3 Clasificación de las variantes En 2015 la ACMG y la Association for Molecular Pathology (AMP) publicó de forma conjunta recomendaciones de consenso para la interpretación de las variantes descritas en los estudios genéticos. El documento sugería que las variantes podían clasificarse mediante un sistema de 5 ramas: (a) patogénica, (b) probablemente patogénica, (c) de significado incierto, (d) probablemente benigna, o (e) benigna. Desde su publicación la clasificación ha sido implementada para aumentar su rigor incluyendo recomendaciones para evaluar la evidencia de la pérdida de función, criterios para realizar estudios funcionales y la aplicación de un sistema de puntuación cuantitativa bayesiano (181–183). El panel de expertos en diabetes monogénica Monogenic Diabetes Expert Panel (MDEP) formado en 2017 aporta información para adaptar la ACMG/AMP a los informes de diagnóstico molecular de diabetes monogénica aumentando la fiabilidad en la clasificación de las variantes y por tanto mejorando la precisión en el diagnóstico de diabetes monogénica (184). d.4 La medicina de precisión Las pruebas de diagnóstico de diabetes monogénica cumplen casi todos los criterios que exige la medicina de precisión al definir a un subgrupo concreto de pacientes al que se le aporta información relevante acerca de su etiología, pronóstico y respuesta específica a un tratamiento (119,185). Posiblemente el mejor ejemplo de medicina de precisión en diabetes es la respuesta efectiva a sulfonilureas a largo plazo que tienen los pacientes con diabetes neonatal asociada a variantes mutacionales que afectan a los canales de potasio (112,122,132,184,185). Otros ejemplos son la DMGCK, en la cual está establecido que los paciente no requieren medicación (97,188) o los diagnósticos de MODY HNF1A y HNF4A, también muy sensibles a las sulfonilureas (88,189). Sin embargo la mayoría de casos de diabetes monogénica no son diagnosticados y si el diagnóstico no es preciso estos beneficios terapéuticos se pierden. Por las evidentes ventajas del diagnóstico de precisión es importante acabar con las barreras que dificultan su implementación en la diabetes monogénica. El coste de los test genéticos es elevado y el cribado universal no es coste efectivo. Por ello es necesario limitar los estudios genéticos a aquellos sujetos que puedan tener un diagnóstico más probable. Al mismo tiempo es necesario implementar los protocolos de identificación de posibles candidatos con un pre-screening exhaustivo basado en características clínicas (por ejemplo historia 53 familiar, edad al diagnóstico de DM o identificación de fenotipos con rasgos sindrómicos). Igualmente necesarias son las pruebas de laboratorio no genéticas, que incluyen entre otras la determinación de autoanticuerpos de islotes pancreáticos y el péptido C como marcador de la reserva pancreática de insulina . Se consideran ejemplos de la correcta aplicación de la medicina de precisión en la diabetes monogénica 1) realizar estudio genético a todos los niños diagnosticados con diabetes mellitus en los primeros 6 meses de edad ya que el 80% de las diabetes neonatales tienen una causa monogénica, 2) utilizar una calculadora MODY para identificar a aquellos sujetos con alta probabilidad de tener diabetes monogénica (www.diabetesgenes.org/mody-probability-calculator) y 3) estudiar a todos las personas con diagnóstico de diabetes en edad pediátrica si al menos 3 autoanticuerpos anti-islotes son negativos (190,163). El uso adecuado de de estos criterios de selección pregenéticos debería aumentar de forma considerable la probabilidad de diagnosticar correctamente la diabetes monogénica evitando screening de coste muy elevado. Los diagnósticos genéticos moleculares también tienen limitaciones pese a analizar el ADN en línea germinal que previsiblemente permanecerá inalterable a lo largo de la vida. Uno de los principales problemas es la interpretación errónea de la información genética, lo cual lleva a la indentificación incorrecta de variantes mutacionales tanto en la práctica clínica diaria como en los estudios de investigación (166). La caracterización y verificación correcta de las variantes patogénicas se está realizando por parte de grupos de consenso internacionales. El desarrollo de los avances tecnológicos permite actualmente mediante técnicas de nueva generación de secuenciación masiva la detección de múltiples causas de diabetes monogénicas. Esto supone un gran avance ya que podemos identificar variantes sindrómicas en pacientes sólo afectados por diabetes mellitus, lo cual permitirá diagnosticar y tratar otros rasgos del síndrome, incluso antes de su manifestación clínica. Entre los ejemplos que corroboran lo anterior están la diabetes neonatal, la DM monogénica HNF1B, el síndrome de Wolfram y la diabetes mitocondrial (122,191–193). Para estos pacientes el diagnóstico genético de diabetes tendrá implicaciones más allá del tratamiento de las alteraciones del metabolismo hidrocarbonado detectando precozmente alteraciones en el desarrollo, enfermedad renal progresiva, enfermedad neurológica, fallo hepático , sordera o cardiomiopatía, entre otras alteraciones (190). El diagnóstico molecular tiene importantes implicaciones en el tratamiento de la diabetes precisando 54 cada mutación un manejo y un seguimiento específico.(190) . Por este motivo,con este trabajo se pretende determinar la utilidad clínica del estudio genético y las técnicas de secuenciación masiva en el diagnóstico y tratamiento de los pacientes con diabetes mellitus. 55 56 2. JUSTIFICACIÓN Según el estudio epidemiológico di@bet la prevalencia de diabetes en la población adulta de Andalucía (18 años o más) es del 15.3%, siendo estos datos similares a los registrados en otras zonas de España(1). La mayoría de casos de diabetes mellitus se agrupan tradicionalmente y de forma muy simplificada en dos vías etiopatogénicas. En una de ellas, causante de diabetes tipo 1, existe un déficit insulínico absoluto. Los sujetos con riesgo de este tipo de diabetes pueden ser frecuentemente identificados por la presencia de marcadores serológicos de un proceso patológico autoinmune que afecta a los islotes de las células beta pancreáticas y otros marcadores genéticos. En la diabetes tipo 2, mucho más prevalente, la causa es la combinación de la resistencia a la insulina y una inadecuada secreción insulínica compensatoria . En esta variante el grado de hiperglucemia es suficiente para causar cambios funcionales y patológicos no sintomáticos años antes del diagnóstico de diabetes. Durante este periodo asintomático se puede confirmar la anormalidad en el metabolismo de los hidratos de carbono mediante la determinación de la HbA1c, de la glucemia plasmática en ayunas o tras una sobrecarga oral de glucosa.(3) La diabetes monogénica tipo MODY (Maturity-Onset Diabetes of the Young) es un subtipo de diabetes con herencia autosómica dominante, diagnóstico en la juventud (entre la segunda y cuarta década) y preservación de la secreción endógena de insulina a largo plazo. Las causas más frecuentes son mutaciones en los genes responsables de la transcripción de los factores nucleares hepatocitarios 1 alfa (HNF1A) y 4 alfa (HNF4A) y de la enzima glucokinasa (GCK). El diagnóstico correcto es crucial para aplicar tratamientos adecuados pero supone un reto incluso para los clínicos más expertos. Un estudio reflejó que en Inglaterra hasta el 15% de los pacientes diabéticos estaba incorrectamente diagnosticado, tanto tipo 1 como tipo 2 (194) En otro estudio el seguimiento durante 11 años de una cohorte pediátrica de sujetos diabéticos mostró errores en la clasificación hasta en un 20% de los casos. La medicina de precisión intenta ajustar el tratamiento a las características moleculares y celulares específicas de distintos grupos de pacientes. Éstas pueden estar afectadas por factores ambientales y relacionados con el estilo de vida. Esta área médica está en constante desarrollo, fundamentalmente por la evolución de las técnicas genéticas y moleculares(7) 57 El desarrollo en los últimos años de la secuenciación masiva o ensayos de nueva generación (Next Generation Sequencing-NGS) ha permitido el análisis simultáneo de múltiples genes y la identificación de nuevas mutaciones asociados al desarrollo de diabetes tipo monogénica.(195) Este diagnóstico molecular tiene importantes implicaciones en el tratamiento de la diabetes precisando cada mutación un manejo y un seguimiento específico.(190). Por este motivo,con este trabajo se pretende determinar la utilidad clínica del estudio genético y las técnicas de secuenciación masiva en el diagnóstico y tratamiento de los pacientes con diabetes mellitus. 64 a. VSI (variante de significado incierto) b. probablemente patogénica c. patogénica -Variable independiente cualitativa politómica 16. VARLAB C -Tipo de variante (mutación C, tercera mutación detectada, se correlaciona con variante descrita C) informada por el laboratorio referente para el estudio genético. a. VSI (variante de significado incierto) b. probablemente patogénica c. patogénica -Variable independiente cualitativa politómica 17. VARLAB D -Tipo de variante (mutación D, cuarta mutación detectada, se correlaciona con variante descrita D) informada por el laboratorio. a. VSI (variante de significado incierto) b. probablemente patogénica c. patogénica -Variable independiente cualitativa politómica 18. VARAGRUPLAB -Diagnóstico molecular realizado por el laboratorio referente en genética a. VSI: El paciente sólo es portador de variantes de significado incierto b. El paciente es portador de variantes patogénicas o probablemente patogénicas c. No se detecta variante por parte del laboratorio -Variable dependiente cualitativa politómica 65 19. VARIANTE MOD -Diagnóstico clínico propuesto por el endocrinólogo tras integrar la información molecular o genética con parámetros clínicos a. VSI: El endocrinólogo mantiene la categorización de la variantes como de significado incierto b. El endocrinólogo sospecha que el paciente es portador de variantes patogénicas o probablemente patogénicas c. No se detecta variante por parte del laboratorio. El endocrinólogo no conoce la existencia de variante mutacional -Variable dependiente cualitativa politómica 20. DESCRITA A -La variable o mutación A está descrita en la literatura o en las bases de datos consultadas en el momento en el que el laboratorio realiza el informe molecular -Variable independiente cualitativa dicotómica Sí/No 21. DESCRITA B -La variable o mutación B está descrita en la literatura o en las bases de datos consultadas en el momento en el que el laboratorio realiza el informe molecular -Variable independiente cualitativa dicotómica Sí/No 22. DESCRITA C -La variable o mutación C está descrita en la literatura o en las bases de datos consultadas en el momento en el que el laboratorio realiza el informe molecular -Variable independiente cualitativa dicotómica Sí/No 23. DESCRITA D -La variable o mutación D está descrita en la literatura o en las bases de datos consultadas en el momento en el que el laboratorio realiza el informe molecular -Variable independiente cualitativa dicotómica Sí/No 66 24. IMC DCO -Índice de masa corporal extraído de la fórmula (Peso/Talla2 ) expresado en kg/m2. Se agrupa en menor de 25 kg/m2 (peso normal o bajo peso) o mayor o igual a 25 kg/m2 (sobrepeso u obesidad) según clasificación de la SEEDO. -Variable independiente cualitativa dicotómica Sí/No d.2. VARIABLES CUANTITATIVAS 1. EDAD PANEL -Edad en el momento en que se solicita el estudio genético, medida en años -Variable independiente cuantitativa continua 2. EDAD DIAGNÓSTICO DM -Edad de diagnóstico de DM medida en años -Variable independiente cuantitativa continua 3. T EV DM -Tiempo de evolución de la diabetes en el momento en que se solicita el estudio genético, medida en años -Variable independiente cuantitativa continua 4. PÉPTIDO C PANEL -Niveles de Péptido C en ayunas o tras ingesta registrados antes de la solicitud del estudio genético, medidos en nmol/l. -Variable independiente cuantitativa continua 67 e. FUENTES DE LOS DATOS. La recogida de datos se realiza durante el periodo 2020-2021 por parte del investigador principal. Los datos proceden de la historia clínica de los pacientes así como de los informes de genética realizados en el periodo 2017-2021 por la Unidad de Gestión Clínica de laboratorios del Hospital Universitario Virgen del Rocío y en menor medida por laboratorio IMEGEN de Valencia y el laboratorio del Hospital Clinic de Barcelona. 68 f. METODOLOGÍA DEL ANÁLISIS ESTADÍSTICO f.1. TAMAÑO DE MUESTRA En una población diabética de 100 pacientes, para estimar el impacto de modificación de tratamiento producido al sumar la información del estudio genético del paciente a la de su estudio clínico, se considera un porcentaje esperado de cambios de tratamiento del 25%, un nivel de confianza del 95%, una imprecisión máxima aceptable del 5% y una pérdida estimada del 5%, resultando necesario analizar un mínimo de 76 pacientes. La selección de pacientes se realizará mediante muestreo consecutivo bajo el cumplimiento de criterios de inclusión. f.2. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Las variables cuantitativas se resumen con medias y desviaciones típicas o medianas y cuartiles si se trata de distribuciones asimétricas, y las variables cualitativas con frecuencias y porcentajes. Para comparar características numéricas entre dos subgrupos de pacientes se aplica la prueba t de Student para dos muestras independientes o la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney. Para más de dos subgrupos, se realiza un modelo ANOVA de la varianza o se utiliza la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. Las diferencias significativas se cuantifican con intervalos de confianza al 95% y se acompañan con gráficos de Box and Whisker. Las asociaciones entre características cualitativas independientes se estudian mediante tablas de contingencia y la aplicación de la prueba Chi-Cuadrado o los métodos no asintóticos de Montecarlo y la prueba exacta. Para analizar muestras relacionadas se aplica el test de Wilcoxon para variables cuantitativas y el test de McNemar o McNemar-Bowker en el caso de ser cualitativas. Finalmente, se intenta generar un modelo de regresión logística binaria para identificar el efecto independiente del tipo de diabetes y la edad al diagnóstico, ajustado por otras 69 características, en el riesgo de que se produzca un cambio en el tratamiento de la diabetes al incorporar la información genética. El análisis de los datos se realiza con el software estadístico IBM SPSS 28.0. 70 g. ETAPAS Y CALENDARIO FASES DEL ESTUDIO DISEÑO RECOGIDA DE DATOS ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE DATOS RESULTADOS DIVULGACIÓN FECHA ESTIMADA DE REALIZACIÓN 2018- 2019 2020-2021 Enero-febrero 2022 Marzo 2022 A partir de abril de 2022 71 h. GESTIÓN DE LOS DATOS Y CONTROL DE CALIDAD Los datos se codifican respetando la confidencialidad, el anonimato y la intimidad de todos los pacientes Se asegura la calidad de los datos con una codificación clara de las variables incluyendo la codificación para posibles valores ausentes y por la elección de una sola persona para su recogida. Se realiza una prueba piloto con datos iniciales para detectar errores inesperados. Los datos se recogen en hoja de cálculo Excel, la cual se verifica periódicamente para detectar errores u omisiones y poder corregirlos. La base de datos y muestras de los registros son revisadas por el tutor y directores de tesis y por otros colaboradores del estudio. Se utiliza la estadística descriptiva (tablas de frecuencias, mínimos y máximos, valores fuera de los criterios de inclusión…etc) para detectar valores de datos no habituales o ilógicos por errores en la transcripción o codificación. 72 i. LIMITACIONES DE LOS MÉTODOS DE INVESTIGACIÓN Estudio unicéntrico: se minimiza esta limitación por las fuentes de datos seleccionadas.La elaboración de las historias clínicas y de los informes genéticos de diagnóstico en el ámbito asistencial debe cumplir las recomendaciones a nivel nacional e internacional. Esto aumenta la posibilidad de generalización y la validez externa de los resultados. Al mismo tiempo la población en estudio (pacientes con DM) tiene características generales similares en los distintos centros sanitarios. Aspecto retrospectivo: La información es recogida en la historia clínica por lo que evitamos el sesgo de información por parte de los pacientes al no ser capaces de recordar si estuvieron expuestos o no a ciertos factores. Seguimiento clínico de los pacientes por distintos profesionales: La posible inexactitud en la codificación diagnóstica o falta de alguna variable que pudiera influir en los resultados finales se ha paliado por la recogida de datos por un solo profesional y por las medidas para controlar la calidad en la recogida y codificación de los datos. 73 80 81 9. RESULTADOS a. ESTADÍSTICA DESCRIPTIVA a.1 Descripción general del grupo en estudio VARIABLES CUALITATIVAS Recuento % válido SEXO hombre 34 31,2% mujer 75 68,8% TIPO DE DIABETES AP DM1 40 36,7% DM2/DG 29 26,6% DM monogénica 40 36,7% TIPO DM TRAS PANEL DM1 37 33,9% DM2/DG 22 20,2% DM monogénica 50 45,9% RECLASIFICACION sí 25 22,9% no 84 77,1% VALOR DCO FINAL sí 52 47,7% no 57 52,3% AF DM 2 GEN sí 63 58,9% no 44 41,1% AUTOINMUNIDAD sí 6 5,9% no 96 94,1% HLA RIESGO sí 11 78,6% no 3 21,4% PÉPTIDO C DETECTABLE sí 54 71,1% no 22 28,9% CARACTERÍSTICAS SINDRÓMICAS sí 14 12,8% no 95 87,2% TRATAMIENTO PREPANEL sin tto f/tto f no ins 39 36,8% ins no completa 16 15,1% ins completa 51 48,1% TRATAMIENTO POSTPANEL sin tto f/tto f no ins 45 42,5% ins no completa 17 16,0% ins completa 44 41,5% IMPACTO MODIFICACION sí 23 22,5% no 79 77,5% VARLAB A VSI 47 87,0% prob patog 4 7,4% patog 3 5,6% VARLAB B VSI 9 90,0% prob patog 1 10,0% patog 0 0,0% VARLAB C VSI 2 66,7% prob patog 0 0,0% patog 1 33,3% VARLAB D VSI 1 100,0% prob patog 0 0,0% patog 0 0,0% VARAGRUPLAB VSI 45 41,2% prob patog o patog 9 8,3% no info detcc var 55 50,5% VARIANTE MOD VSI 13 11,9% prob patog o patog 41 37,6% no info detcc var/sigue inf lab 55 50,5% DESCRITA A sí 32 59,3% no 22 40,7% 82 DESCRITA B sí 5 50,0% no 5 50,0% DESCRITA C sí 2 100,0% no 0 0,0% DESCRITA D sí 1 100,0% no 0 0,0% IMC.dco.25 <25 20 55,6% >=25 16 44,4% VARIABLES CUANTITATIVAS N Media Desviación típica Mínimo Máximo Percentiles Válido Perdidos 25 mediana 75 EDAD PANEL 109 0 41,85 14,29 16 83 32,00 40,00 54,50 EDAD DCO 108 1 26,99 12,33 ,9 58,1 17,64 27,73 35,66 T EV DM 88 21 15,65 12,45 1 59 5,00 13,00 25,00 PÉPTIDO C PANEL 76 33 ,02 5,61 ,02 1,26 1,94 Se han incluido en el estudio 109 pacientes diabéticos o con alteraciones en el metabolismo hidrocarbonado atendidos en el Área Sanitaria Sur de Sevilla durante el periodo 2017-2021. Fueron en su mayoría mujeres (68,8% M vs 31,2% H) con una edad media de 41,85 +/- 14,29 años y una mediana de tiempo de evolución de la DM de 13 años. Antes del estudio genético el 37,6 % estaban clasificadas como DM tipo 1, el 26,6% como DM2 o relacionadas (alteración del metabolismo hidrocarbonado o diabetes gestacional) y el 36,7% como DM monogénica. La media de edad de diagnóstico de DM era 26,99 +/- 12,33 años, la mayoría tenía péptido C detectable (el 71,1%) y ausencia de autoinmunidad pancreática (el 94,1% ). El 58,9% tenían antecedentes familiares de DM en al menos 2 generaciones. En los 109 estudios en casos índices se detectaron en 54 pacientes 68 variantes asociadas a diabetes monogénica. 27 de esas variantes no estaban descritas en la literatura ni en las bases de datos consultadas en el momento de redacción del informe del laboratorio referente en el diagnóstico molecular. Fueron categorizadas como variantes de significado clínico incierto el 86,75%, como probablemente patogénicas el 7,35% y patogénicas el 5,9%. 27 variantes no descritas 68 variantes detectadas 109 estudios genéticos solicitados 83 Los 109 pacientes del grupo en estudio, según el diagnóstico molecular informado por el laboratorio se agruparon en distintos subgrupos: sin diagnóstico o sin detectarse variante mutacional el 50,5% ( n=55), con variantes de significado incierto el 41,3% (n=45), y con variante patogénica o probablemente patogénica el 8,3% (n=9). Según el diagnóstico clínico propuesto por el endocrinólogo tras integrar la información molecular o genética con parámetros clínicos los 109 pacientes del grupo en estudio se agruparon de la siguiente manera: sin diagnóstico o sin detectarse variante mutacional el 50,5% ( n=55), con variantes de significado incierto el 11,9% (n=13), y con variante patogénica o probablemente patogénica el 37,6% (n=41). 0 10 20 30 40 50 60 Grupos de pacientes según el DIAGNÓSTICO MOLECULAR informado por el laboratorio (% del total de pacientes) Sin diagnóstico VSI Patogénico o probablemente patogénico 0 10 20 30 40 50 60 Grupos de pacientes según el DIAGNÓSTICO CLÍNICO INTEGRADO (MOLECULAR + CLÍNICA) del endocrinólogo (% del total de pacientes) Sin diagnóstico VSI Patogénico o probablemente patogénico 84 El cambio de tratamiento o plan terapeútico tras recibir la información genética o molecular del laboratorio se pudo valorar en 102 pacientes. 23 de ellos (22,5%) modificaron su tratamiento mientras que los 79 restantes (77,5%) no tuvieron modificación. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 MODIFICACIÓN DE TRATAMIENTO tras el estudio genético (% de pacientes que lo modifican) Sí No 0 10 20 30 40 50 60 PreGenética PostGenética TIPO DE TRATAMIENTO de DM antes y después del estudio genético (% del total de pacientes) Sin fármacos/fármacos no insulínicos Insulinización no completa Insulinización completa 85 Entre las variantes detectadas en los genes asociados a diabetes monogénicas destacaron por su frecuencia los cambios observados en HNF4A (n=6), PDX1 (n=6), ZP57 (n=6), INSR (n=5), TBC1D4 (n=5), BLK (n=4), ABBC8 (n=4), KCNJ11 (n=4), WFS1 (n=4), AKT2 (n=3) y CP (n=3). 0 1 2 3 4 5 6 7 n Tipo de variantes detectadas (frecuencias en números absolutos) HNF4A/PDX1/ZP57 (n=6) INSR/TBC1D4 (n=5) BLK/ABCC8/KCNJ11/WFS1 (n=4) AKT2/CP (n=3) ALMS1/HNF1B/KLF11/HNF1A/RFX6 (n=2) GLIS3/PKHD1/SLC2A2/CEL/PTF1A/EIF2AK3/SLC19A2/GCK (n=1) 86 a.2 Clasificación diagnóstica de la DM antes y después de la realización del estudio genético DM.TP.2 Total DM clásica DM monog. DM.AP.2 DM clásica Recuento 53 16 69 % dentro de DM.AP.2 76,8% 23,2% 100,0% % del total 48,6% 14,7% 63,3% DM monog. Recuento 6 34 40 % dentro de DM.AP.2 15,0% 85,0% 100,0% % del total 5,5% 31,2% 36,7% Total Recuento 59 50 109 % dentro de DM.AP.2 54,1% 45,9% 100,0% % del total 54,1% 45,9% 100,0% Tras el estudio genético 16 de los 69 pacientes con diabetes categorizada como clásica son clasificados como diabetes monogénica. Entre los 40 pacientes con sospecha de diabetes monogénica, tras la realización del estudio molecular, 34 pacientes confirman el diagnóstico mientras que 6 pacientes se reclasifican a diabetes clásicas. Globalmente tras el estudio genético o NGS un 9,2 % de la DM clasificada como clásica pasa a ser monogénica, sin significación estadística. 0 10 20 30 40 50 60 70 DM Clásicas DM Monogénica Diagnóstico de DM antes y después del estudio genético (porcentaje del total de pacientes) PreNGS PostNGS 87 b. ESTADÍSTICA INFERENCIAL b.1. ASOCIACIÓN DE LAS VARIABLES RECOGIDAS EN EL ESTUDIO CON LA MODIFICACIÓN DEL TRATAMIENTO O EL PLAN TERAPÉUTICO TRAS EL ESTUDIO GENÉTICO O NGS (Variable dependiente IMPACTO MODIFICACIÓN) b.1.1. ANÁLISIS UNIVARIANTE CON LAS VARIANTES CUALITATIVAS Resumen de procesamiento de casos Casos Válido Perdidos Total N N N SEXO * IMPACTO MODIFICACION 102 7 109 TIPO DE DIABETES AP * IMPACTO MODIFICACION 102 7 109 AF DM 2 GEN * IMPACTO MODIFICACION 100 9 109 AUTOINMUNIDAD * IMPACTO MODIFICACION 96 13 109 PÉPTIDO C DETECTABLE > AÑOS * IMPACTO MODIFICACION 75 34 109 CARACTERÍSTICAS SINDRÓMICAS * IMPACTO MODIFICACION 102 7 109 TRATAMIENTO PREPANEL * IMPACTO MODIFICACION 101 8 109 b.1.1.1. Asociación de la variable SEXO (hombre o mujer) con la modificación del tratamiento o el plan terapéutico tras el estudio genético o NGS. Tabla cruzada IMPACTO MODIFICACION Total sí no SEXO Hombre Recuento 7 26 33 % dentro de SEXO 21,2% 78,8% 100,0% Residuo corregido -,2 ,2 Mujer Recuento 16 53 69 % dentro de SEXO 23,2% 76,8% 100,0% Residuo corregido ,2 -,2 Total Recuento 23 79 102 % dentro de SEXO 22,5% 77,5% 100,0% No se observa en el grupo de pacientes incluidos en el estudio relación entre el sexo y la modificación del tratamiento farmacológico o el plan terapéutico de la diabetes mellitus. 88 b.1.1.2. Asociación del diagnóstico de DM establecido antes del estudio genético con la modificación del tratamiento o el plan terapéutico tras el estudio genético o NGS (objetivo principal de la tesis doctoral). Tabla cruzada IMPACTO MODIFICACION Total sí No TIPO DE DIABETES AP DM1 Recuento 3 35 38 % dentro de TIPO DE DIABETES AP 7,9% 92,1% 100,0% Residuo corregido -2,7 2,7 DM2/DG Recuento 3 23 26 % dentro de TIPO DE DIABETES AP 11,5% 88,5% 100,0% Residuo corregido -1,6 1,6 DM monogénica Recuento 17 21 38 % dentro de TIPO DE DIABETES AP 44,7% 55,3% 100,0% Residuo corregido 4,1 -4,1 Total Recuento 23 79 102 % dentro de TIPO DE DIABETES AP 22,5% 77,5% 100,0% En la tabla 3x2 se observa asociación entre el diagnóstico de diabetes mellitus establecido antes de la realización del estudio genético de diabetes monogénica y la modificación del tratamiento o el plan terapéutico (p<0,001). La sospecha inicial de diabetes monogénica muestra un mayor número de modificaciones terapéuticas respecto a la DM tipo 1 y a la agrupación DM2/DG (17 vs 3 y 3 pacientes, respectivamente). Por otro lado el diagnóstico inicial de DM tipo 1 y la agrupación DM2/DG se relaciona con un mayor número de tratamientos o planes terapéuticos no modificados al compararlo con el diagnóstico e diabetes monogénica (35 y 23 vs 21 pacientes, respectivamente). Tabla cruzada DM.AP.2*IMPACTO MODIFICACION IMPACTO MODIFICACION Total No sí DM.AP.2 DM clásica Recuento 58 6 64 % dentro de DM.AP.2 90,6% 9,4% 100,0% Residuo corregido 4,1 -4,1 DM monog. Recuento 21 17 38 % dentro de DM.AP.2 55,3% 44,7% 100,0% Residuo corregido -4,1 4,1 Total Recuento 79 23 102 % dentro de DM.AP.2 77,5% 22,5% 100,0% 89 Se sigue estudiando esta asociación agrupando las DM tipo 1 y las DM2/DG en una variable denominada DM clásica y elaborando una tabla comparativa 2x2. Se sigue observando la relación entre el diagnóstico de diabetes establecido antes de la realización del estudio genético y la modificación posterior del tratamiento farmacológico o el plan terapéutico (p<0,001). El diagnóstico inicial de diabetes monogénica sigue mostrando un mayor número de modificaciones terapéuticas respecto a las diabetes mellitus denominadas clásicas (17 vs 6 pacientes, OR 7,8 con IC 95% [2,72; 22,49]). Por otro lado el diagnóstico inicial de diabetes clásica parece relacionarse con una mayor posibilidad de no cambiar el tratamiento (58 vs 21 pacientes en la sospecha inicial de diabetes monogénica). b.1.1.3. Asociación de la presencia de antecedentes familiares de DM en al menos 2 generaciones con patrón autosómico dominante (sin incluir al propio paciente) con la modificación del tratamiento o el plan terapéutico tras el estudio NGS Tabla cruzada IMPACTO MODIFICACION Total sí No AF DM 2 GEN sí Recuento 17 42 59 % dentro de AF DM 2 GEN 28,8% 71,2% 100,0% Residuo corregido 1,7 -1,7 no Recuento 6 35 41 % dentro de AF DM 2 GEN 14,6% 85,4% 100,0% Residuo corregido -1,7 1,7 Total Recuento 23 77 100 % dentro de AF DM 2 GEN 23,0% 77,0% 100,0% No se encuentra asociación estadística entre tener antecedentes familiares de DM en al menos dos generaciones con patrón de herencia autosómica dominante y el cambio o modificación del tratamiento tras la realización del estudio genético. Pese a esto sí parece existir una tendencia ya que prácticamente se triplica el número de modificaciones terapéuticas si hay antecedentes familiares de diabetes mellitus frente a no tenerlos (17 vs 6 pacientes). b.1.1.4. Asociación de la presencia de autoinmunidad anti-islotes de células beta pancreáticas (al menos GAD y/o IA2) con Ia modificación del tratamiento o el plan terapéutico tras el estudio NGS. 96 b.2. ASOCIACIÓN DE LAS VARIABLES CON EL TIPO DE VARIANTE MUTACIONAL INFORMADA POR EL LABORATORIO QUE REALIZA EL TEST GENÉTICO. DIAGNÓSTICO DEL LABORATORIO (Variable VARAGRUPLAB) b.2.1. ANÁLISIS UNIVARIANTE CON LAS VARIANTES CUALITATIVAS N N N SEXO * VARAGRUPLAB 109 0 109 TIPO DE DIABETES AP * VARAGRUPLAB 109 0 109 AF DM 2 GEN * VARAGRUPLAB 107 2 109 AUTOINMUNIDAD * VARAGRUPLAB 102 7 109 PÉPTIDO C DETECTABLE > AÑOS * VARAGRUPLAB 76 33 109 CARACTERÍSTICAS SINDRÓMICAS * VARAGRUPLAB 109 0 109 TRATAMIENTO PREPANEL * VARAGRUPLAB 106 3 109 b.2.1.1. Asociación de la variable SEXO (hombre o mujer) con la clasificación de las variantes por parte del laboratorio (en VSI, patogénicas o probablemente patogénicas o sin detección de variante). Tabla cruzada VARAGRUPLAB Total VSI prob patog o patog no info detcc var SEXO hombre Recuento 13 2 19 34 % dentro de SEXO 38,2% 5,9% 55,9% 100,0% Residuo corregido -,4 -,6 ,8 mujer Recuento 32 7 36 75 % dentro de SEXO 42,7% 9,3% 48,0% 100,0% Residuo corregido ,4 ,6 -,8 Total Recuento 45 9 55 109 % dentro de SEXO 41,3% 8,3% 50,5% 100,0% No se encuentra relación entre el sexo (hombre o mujer) y la clasificación de las variantes por parte del laboratorio. 97 b.2.1.2. Asociación del diagnóstico de DM establecido ANTES del estudio genético con la clasificación de las variantes por parte del laboratorio (en VSI, patogénicas o probablemente patogénicas o sin detección de variante). Tabla cruzada VARAGRUPLAB Total VSI prob patog o patog no info detcc var TIPO DE DIABETES AP DM1 Recuento 14 0 26 40 % dentro de TIPO DE DIABETES AP 35,0% 0,0% 65,0% 100,0% Residuo corregido -1,0 -2,4 2,3 DM2/DG Recuento 11 2 16 29 % dentro de TIPO DE DIABETES AP 37,9% 6,9% 55,2% 100,0% Residuo corregido -,4 -,3 ,6 DM monogénica Recuento 20 7 13 40 % dentro de TIPO DE DIABETES AP 50,0% 17,5% 32,5% 100,0% Residuo corregido 1,4 2,7 -2,9 Total Recuento 45 9 55 109 % dentro de TIPO DE DIABETES AP 41,3% 8,3% 50,5% 100,0% Se observa asociación significativa entre el tipo de diabetes establecido antes de la realización del panel NGS y la clasificación de las variantes por parte del laboratorio(p=0,010) tras la realización del estudio genético. Según se visualiza en la tabla cruzada 3x3 en el grupo con sospecha inicial de diabetes monogénica 7 pacientes se clasificaron como patogénicas o probablemente patogénicas en contraste con lo observado en los filiados como DM tipo 1 y DM2/DG ( 0 y 2 pacientes respectivamente). Por otro lado en el grupo con DM1 inicial no se detectó variante mutacional en 26 pacientes frente a los 16 en el grupo DM2/DG y los 13 pacientes en el grupo con DM monogénica en el diagnóstico inicial. Tabla cruzada DM.AP.2*VARAGRUPLAB VARAGRUPLAB Total VSI prob patog o patog no info detcc var DM.AP.2 DM clásica Recuento 25 2 42 69 % dentro de DM.AP.2 36,2% 2,9% 60,9% 100,0% Residuo corregido -1,4 -2,7 2,9 DM monog. Recuento 20 7 13 40 % dentro de DM.AP.2 50,0% 17,5% 32,5% 100,0% Residuo corregido 1,4 2,7 -2,9 Total Recuento 45 9 55 109 % dentro de DM.AP.2 41,3% 8,3% 50,5% 100,0% Se profundiza en el estudio de esta asociación agrupando las DM1/DM2/DG en la variable DM clásica, detectando también la relación entre el tipo de diabetes establecido antes de la 98 realización del panel NGS y la clasificación de las variantes por parte del laboratorio(p=0,030). La tabla 2x3 obtenida muestra en el grupo con sospecha de DM monogénica prepanel NGS 7 pacientes con variables patogénicas o probablemente patogénicas frente a los 2 pacientes diagnosticados en el grupo de diabetes clásicas. Por otro lado en el grupo de diabetes clásicas destacan los 42 pacientes en los que no se ha encontrado variante mutacional frente a los 13 en el grupo con sospecha de diabetes monogénica. b.1.2.3. Asociación de los antecedentes familiares de DM en al menos dos generaciones con patrón de herencia autosómica dominante (sin incluir al paciente) con la clasificación de las variantes por parte del laboratorio (en VSI, patogénicas o probablemente patogénicas o sin detección de variante). Tabla cruzada VARAGRUPLAB Total VSI prob patog o patog no info detcc var AF DM 2 GEN sí Recuento 26 9 28 63 % dentro de AF DM 2 GEN 41,3% 14,3% 44,4% 100,0% Residuo corregido -,2 2,6 -1,3 no Recuento 19 0 25 44 % dentro de AF DM 2 GEN 43,2% 0,0% 56,8% 100,0% Residuo corregido ,2 -2,6 1,3 Total Recuento 45 9 53 107 % dentro de AF DM 2 GEN 42,1% 8,4% 49,5% 100,0% Los antecedentes familiares de DM en al menos dos generaciones con patrón de herencia autosómica dominante se han relacionado con la clasificación de las variantes (VSI, probablemente patogénicas o patogénicas y no detectadas) en el informe del laboratorio que realiza el estudio genético (p=0,029). Destaca el hallazgo de 9 pacientes con variantes probablemente patogénicas o patogénicas en el grupo con antecedentes familiares de diabetes respecto a ningún paciente en el grupo que no los tiene. b.1.2.4. Asociación de la presencia de autoinmunidad anti-islotes de células beta pancreáticas (al menos GAD y/o IA2) con la clasificación de las variantes por parte del laboratorio (en VSI, patogénicas o probablemente patogénicas o sin detección de variante). Tabla cruzada VARAGRUPLAB Total VSI prob patog o patog no info detcc var AUTOINMUNIDAD sí Recuento 2 0 4 6 % dentro de AUTOINMUNIDAD 33,3% 0,0% 66,7% 100,0% Residuo corregido -,3 -,7 ,7 99 no Recuento 38 8 50 96 % dentro de AUTOINMUNIDAD 39,6% 8,3% 52,1% 100,0% No se observan diferencias entre la presencia o no de autoinmunidad anti-islotes de células beta pancreáticas y la clasificación de las variantes (VSI, probablemente patogénicas o patogénicas y no detectadas) en el informe del laboratorio que realiza el estudio genético. No obstante sí hay tendencia para la detección de variantes patogénicas o probablemente patogénicas en el grupo no autoinmune frente al grupo con autoinmunidad anti-islotes positiva (8 vs 0 pacientes). b.1.2.5. Asociación de la reserva pancreática de insulina preservada 3 años después del diagnóstico de DM medida mediante péptido C (en ayunas o tras ingesta) con la clasificación de las variantes por parte del laboratorio que realiza el estudio NGS (en VSI, patogénicas o probablemente patogénicas o sin detección de variante). Tabla cruzada VARAGRUPLAB Total VSI prob patog o patog no info detcc var PÉPTIDO C DETECTABLE > AÑOS sí Recuento 19 4 31 54 % dentro de PÉPTIDO C DETECTABLE > AÑOS 35,2% 7,4% 57,4% 100,0% Residuo corregido -,8 1,3 ,2 no Recuento 10 0 12 22 % dentro de PÉPTIDO C DETECTABLE > AÑOS 45,5% 0,0% 54,5% 100,0% Residuo corregido ,8 -1,3 -,2 Total Recuento 29 4 43 76 % dentro de PÉPTIDO C DETECTABLE > AÑOS 38,2% 5,3% 56,6% 100,0% La presencia de reserva pancreática funcionante medida mediante péptido C no se relaciona con la clasificación de las variantes (VSI, probablemente patogénicas o patogénicas y no detectadas) en el informe del laboratorio que realiza el estudio genético. Pese a esto existe una cierta tendencia que parece aumentar la posibilidad de clasificar la variante en patogénica o probablemente patogénica en el grupo con péptido C detectable en comparación con el que no lo tiene (4 vs 0 pacientes). b.1.2.6. Asociación de la presencia de características sindrómicas asociadas a DM monogénica (hipoacusia, quistes renales, atrofia del nervio óptico, retraso psicomotor, diagnóstico de DM antes del primer año de edad, resistencia a la insulina extrema, 100 insuficiencia renal de aparición precoz y otras) con la clasificación de las variantes por parte del laboratorio (en VSI, patogénicas o probablemente patogénicas o sin detección de variante). Tabla cruzada VARAGRUPLAB Total VSI prob patog o patog no info detcc var CARACTERÍSTICAS SINDRÓMICAS sí Recuento 8 2 4 14 % dentro de CARACTERÍSTICAS SINDRÓMICAS 57,1% 14,3% 28,6% 100,0% Residuo corregido 1,3 ,9 -1,8 no Recuento 37 7 51 95 % dentro de CARACTERÍSTICAS SINDRÓMICAS 38,9% 7,4% 53,7% 100,0% Residuo corregido -1,3 -,9 1,8 Total Recuento 45 9 55 109 % dentro de CARACTERÍSTICAS SINDRÓMICAS 41,3% 8,3% 50,5% 100,0% No se encuentra asociación entre las características sindrómicas y la clasificación de las variantes (VSI, probablemente patogénicas o patogénicas y no detectadas) en el informe del laboratorio que realiza el estudio genético. Sí existe una tendencia que parece sugerir que los pacientes sin características sindrómicas tienen más posibilidades de que no se informe la presencia de variables mutacionales en los informes del laboratorio frente al grupo de pacientes con características sindrómicas (51 vs 4 pacientes). b.1.2.7. Asociación del tratamiento antidiabético realizado por el paciente antes del panel genético (sin tratamiento o con fármacos no insulínicos/insulinización no completa/insulinización completa) con la clasificación de las variantes por parte del laboratorio (en VSI, patogénicas o probablemente patogénicas o sin detección de variante). Tabla cruzada VARAGRUPLAB Total VSI prob patog o patog no info detcc var TRATAMIENTO PREPANEL sin tto f/tto f no ins Recuento 18 6 15 39 % dentro de TRATAMIENTO PREPANEL 46,2% 15,4% 38,5% 100,0% Residuo corregido ,6 1,9 -1,7 ins no completa Recuento 4 1 11 16 % dentro de TRATAMIENTO PREPANEL 25,0% 6,3% 68,8% 100,0% Residuo corregido -1,5 -,3 1,7 ins completa Recuento 23 2 26 51 % dentro de TRATAMIENTO PREPANEL 45,1% 3,9% 51,0% 100,0% Residuo corregido ,5 -1,6 ,4 Total Recuento 45 9 52 106 % dentro de TRATAMIENTO PREPANEL 42,5% 8,5% 49,1% 100,0% 101 No se observa relación entre el tratamiento antidiabético realizado por los pacientes antes del panel NGS y la clasificación de las variantes (VSI, probablemente patogénicas o patogénicas y no detectadas) en el informe del laboratorio que realiza el estudio genético. Aún así existe una clara tendencia en la que aquellos pacientes sin tratamiento farmacológico (con tratamiento dietético por ejemplo) o con tratamiento no insulínico tienen un mayor número de casos informados con variantes patogénicas o probablemente patogénicas frente a los insulinizados parcialmente o de forma completa (6 vs 1 y 2 pacientes, respectivamente). Por otro lado los grupos insulinizados parecen tener más posibilidades de que no se detecte variante alguna en el informe de laboratorio (68,8% en insulinización parcial y 51% en insulinización completa) en contraste con lo observado en el grupo no insulinizado (38,5%). b.2.2. ANÁLISIS UNIVARIANTE CON LAS VARIANTES CUANTITATIVAS Asociación de las variables numéricas (edad en el diagnóstico de la DM, edad de realización del estudio NGS, IMC en el momento del diagnóstico de DM, tiempo de evolución de la DM) con la clasificación de las variantes por parte del laboratorio (en VSI, patogénicas o probablemente patogénicas o sin detección de variante). Resumen de procesamiento de casos VARAGRUPLAB Casos Válido Perdidos Total N N N Edad.dco VSI 45 0 45 prob patog o patog 9 0 9 no info detcc var 54 1 55 EDAD PANEL VSI 45 0 45 prob patog o patog 9 0 9 no info detcc var 55 0 55 IMC DCO VSI 15 30 45 prob patog o patog 4 5 9 no info detcc var 17 38 55 T EV DM VSI 37 8 45 prob patog o patog 8 1 9 no info detcc var 43 12 55 b.2.2.1. Asociación de la edad en el diagnóstico de la DM medida en años con la clasificación de las variantes por parte del laboratorio (en VSI, patogénicas o probablemente patogénicas o sin detección de variante). 102 La edad de diagnóstico de DM no se relaciona con la clasificación de las variantes (VSI, probablemente patogénicas o patogénicas y no detectadas) en el informe del laboratorio que realiza el estudio genético. b.2.2.2. Asociación de la edad con la que se realiza el panel genético con la clasificación de las variantes por parte del laboratorio (en VSI, patogénicas o probablemente patogénicas o sin detección de variante) que realiza el estudio NGS. 103 No se encuentra relación entre la edad con la que se realiza el panel NGS y la clasificación de las variantes (VSI, probablemente patogénicas o patogénicas y no detectadas) en el informe del laboratorio que realiza el estudio genético. b.2.2.3. Asociación del IMC en el momento del diagnóstico de DM (kg/m2) con la clasificación de las variantes por parte del laboratorio (en VSI, patogénicas o probablemente patogénicas o sin detección de variante) que realiza el estudio NGS. 104 Inicialmente no se encuentra asociación entre el IMC y la clasificación de las variantes (VSI, probablemente patogénicas o patogénicas y no detectadas) en el informe del laboratorio que realiza el estudio genético Tablas cruzadas Tabla cruzada IMC.dco.25*VARAGRUPLAB VARAGRUPLAB Total VSI prob patog o patog no info detcc var IMC.dco.25 <25 Recuento 13 0 7 20 % dentro de IMC.dco.25 65,0% 0,0% 35,0% 100,0% Residuo corregido 3,2 -2,4 -1,6 >=25 Recuento 2 4 10 16 % dentro de IMC.dco.25 12,5% 25,0% 62,5% 100,0% Residuo corregido -3,2 2,4 1,6 Total Recuento 15 4 17 36 % dentro de IMC.dco.25 41,7% 11,1% 47,2% 100,0% Sin embargo cuando se realiza la tabla 2x3 con la variable IMC agrupada (pacientes con <25 kg/m2 y pacientes con > ó = 25 kg/m2) sí se encuentra asociación con la clasificación de las variantes informadas por el laboratorio (p=0,01). Llamativamente 4 de los pacientes con IMC > ó = a 25 kg/m2 ha tenido variantes clasificadas como patogénicas o probablemente patogénicas frente ningún paciente en el grupo con IMC < 25 kg/m2. Por otro lado 13 pacientes con IMC < 25 kg/m2 tienen variantes clasificadas como VSI mientras que en aquellos pacientes que tienen un IMC > ó = a 25 kg/m2 el número baja a 2 pacientes. Es también relevante que el número de pacientes en el que no se detecta variante mutacional es mayor en el subgrupo con IMC > ó = a 25 kg/m2 respecto a lo observado en los que tienen IMC <25 kg/m2 (10 vs 7 pacientes). 105 b.2.2.4. Asociación del tiempo de evolución de la diabetes medido en años en el momento en el que se realiza el panel genético con la clasificación de las variantes por parte del laboratorio (en VSI, patogénicas o probablemente patogénicas o sin detección de variante) que realiza el estudio NGS. No se observa asociación entre el tiempo de evolución de la DM antes del panel NGS y la clasificación de las variantes (VSI, probablemente patogénicas o patogénicas y no detectadas) en el informe del laboratorio que realiza el estudio genético. Sin embargo se estima una mediana del tiempo de evolución de 5,5 años (rango 1,25-20 años) en el grupo de pacientes que han tenido variantes patogénicas o probablemente patogénicas, menor que en el grupo VSI y el grupo en el que no se detecta variante (12 y 14 años respectivamente). 112 Para estudiar dicha tendencia se agrupa VSI y la no detección de variante mutacional en una única variable. Se elabora una tabla 2x2 y se encuentra la asociación (p=0,027) sospechada anteriormente con las variables no agrupadas (tabla 2x3). Se obtiene en el grupo con características sindrómicas un 64,3% de variantes patogénicas o probablemente patogénicas frente al 33,7% en el grupo que no las tiene. Se estima que un paciente con características sindrómicas tiene más de tres veces más riesgo de VARIANTEMOD patogénica o probable patogénica (OR 3,55 con IC 95% [1,09; 11,5]). En consonancia con esto el grupo que no tiene características sindrómicas tiene un 66,3% de variantes VSI o no detectadas frente al 35,7% en el grupo con características sindrómicas. b.3.1.7. Asociación del tratamiento antidiabético realizado por el paciente antes del panel genético (sin tratamiento o con fármacos no insulínicos/insulinización no completa/insulinización completa) con el DIAGNÓSTICO CLÍNICO INTEGRADO Tabla cruzada VARIANTE MOD Total VSI prob patog o patog no info detcc var/sigue inf lab TRATAMIENTO PREPANEL sin tto f/tto f no ins Recuento 2 22 15 39 % dentro de TRATAMIENTO PREPANEL 5,1% 56,4% 38,5% 100,0% Residuo corregido -1,7 2,9 -1,7 ins no completa Recuento 1 4 11 16 % dentro de TRATAMIENTO PREPANEL 6,3% 25,0% 68,8% 100,0% Residuo corregido -,8 -1,2 1,7 ins completa Recuento 10 15 26 51 % dentro de TRATAMIENTO PREPANEL 19,6% 29,4% 51,0% 100,0% Residuo corregido 2,2 -1,9 ,4 Total Recuento 13 41 52 106 % dentro de TRATAMIENTO PREPANEL 12,3% 38,7% 49,1% 100,0% El tratamiento antidiabético utilizado antes de la relación panel NGS ha demostrado relación con la clasificación de las variantes por parte del endocrinólogo (VSI, probablemente patogénicas o patogénicas y no detectadas) tras la integración de los datos genéticos con la información clínica (p=0,021). 22 de los pacientes sin tratamiento farmacológico (dieta por ejemplo) o con tratamiento farmacológico no insulínico tiene variantes clasificadas como patogénicas o probablemente patogénicas frente a los pacientes con insulinizaciones no completas y completas (4 y 15 pacientes respectivamente). Por otro lado 10 pacientes con insulinización completa tiene VSI frente a los 2 pacientes con terapias no insulínicas y 1 paciente en el grupo con insulinización no completa. 113 Tabla cruzada VARIANTEMOD.2 Total VSI+no detc var+sigue inf lab prob patog o patog TRATAMIENTO PREPANEL sin tto f/tto f no ins Recuento 17 22 39 % dentro de TRATAMIENTO PREPANEL 43,6% 56,4% 100,0% Residuo corregido -2,9 2,9 ins no completa Recuento 12 4 16 % dentro de TRATAMIENTO PREPANEL 75,0% 25,0% 100,0% Residuo corregido 1,2 -1,2 ins completa Recuento 36 15 51 % dentro de TRATAMIENTO PREPANEL 70,6% 29,4% 100,0% Residuo corregido 1,9 -1,9 Total Recuento 65 41 106 % dentro de TRATAMIENTO PREPANEL 61,3% 38,7% 100,0% Se elabora una tabla 3x2 al agrupar VSI y la no detección de variante mutacional en una variable y se sigue observando la relación (p=0,016). 114 b.3.2. ANÁLISIS UNIVARIANTE CON LAS VARIANTES CUANTITATIVAS Asociación de las variables numéricas (edad en el diagnóstico de la DM, edad de realización del estudio NGS, IMC en el momento del diagnóstico de DM, tiempo de evolución de la DM) con el DIAGNÓSTICO CLÍNICO INTEGRADO. b.3.2.1. Asociación del IMC en el momento del diagnóstico de DM (kg/m2) con el DIAGNÓSTICO CLÍNICO INTEGRADO. Tabla cruzada VARIANTEMOD.2 Total VSI+no detc var+sigue inf lab prob patog o patog IMC.dco.25 <25 Recuento 9 11 20 % dentro de IMC.dco.25 45,0% 55,0% 100,0% Residuo corregido -1,0 1,0 >=25 Recuento 10 6 16 % dentro de IMC.dco.25 62,5% 37,5% 100,0% Residuo corregido 1,0 -1,0 Total Recuento 19 17 36 % dentro de IMC.dco.25 52,8% 47,2% 100,0% No se encuentra relación entre el IMC < 25 kg/m2 o > ó = a 25 kg/m2 y la clasificación de las variantes por parte del endocrinólogo (VSI/no detectadas o probablemente patogénicas o patogénicas) tras la integración de los datos genéticos con la información clínica. No obstante existe un mayor número de pacientes con variantes clasificadas como patogénicas o probablemente patogénicas en el grupo con IMC < 25 kg/m2 frente al grupo con IMC > ó = a 25 kg/m2 (11 vs 6 pacientes). 115 b.3.2.2. Asociación de la edad medida en años en el momento de la petición del estudio genético con el DIAGNÓSTICO CLÍNICO INTEGRADO. La edad con la que se realiza el panel NGS muestra relación en la prueba de muestras independientes con la clasificación de la variante en patogénica o probablemente patogénica por parte del endocrinólogo (p=0,037). Se estima una diferencia de 5,86 años de media entre el grupo con mutación patogénica o probablemente patogénica (38,20 +/- 13,72 años) y el grupo que agrupa VSI/no detección de variante ((44,06 +/- 14,26 años). b.3.2.3. Asociación de la edad con la que se diagnostica la DM medida en años con el DIAGNÓSTICO CLÍNICO INTEGRADO. 116 No se encuentra relación entre la edad de diagnóstico de la DM y la clasificación de las variantes por parte del endocrinólogo (VSI/no detectadas o probablemente patogénicas o patogénicas) tras la integración de los datos genéticos con la información clínica b.3.2.4. Asociación del tiempo de evolución de la diabetes medido en años en el momento en el que se realiza el panel genético con el DIAGNÓSTICO CLÍNICO INTEGRADO. Se observa asociación entre el tiempo de evolución de la DM y y la clasificación de las variantes por parte del endocrinólogo (VSI/no detectadas o probablemente patogénicas o patogénicas) tras la integración de los datos genéticos con la información clínica (p=0,001). Se estima una mediana de 8 años de diferencia menor (rango 3-13 años) entre el grupo de pacientes con variantes clasificadas como probablemente patogénicas o patogénicas y el grupo con variantes VSI/no detectadas. 117 b.3.3. Análisis multivariante Para confirmar las asociaciones detectadas en el análisis univariante se crea un modelo multivariante (diseño multivariante 1). Incluso en un segundo paso se reduce el número de variables que pudieran ser confusoras o poco informativas (diseño multivariante 2). Multivariante 1 Variables en la ecuación B Error estándar Wald gl Sig. Exp(B) 95% C.I. para EXP(B) Inferior Superior Paso 1 DM.AP.2(1) 1,197 ,803 2,222 1 ,136 3,310 ,686 15,965 AF DM 2 GEN(1) ,405 ,685 ,350 1 ,554 1,499 ,392 5,735 PÉPTIDO C DETECTABLE > AÑOS(1) 1,626 1,077 2,279 1 ,131 5,084 ,616 41,974 CARACTERÍSTICAS SINDRÓMICAS(1) 2,148 1,044 4,236 1 ,040 8,569 1,108 66,261 TRATAMIENTOPREPANEL 2,920 2 ,232 TRATAMIENTOPREPANEL(1) -1,742 1,264 1,901 1 ,168 ,175 ,015 2,085 TRATAMIENTOPREPANEL(2) ,287 ,853 ,113 1 ,736 1,333 ,250 7,093 Edad.dco -,002 ,032 ,003 1 ,954 ,998 ,938 1,063 T EV DM -,078 ,041 3,570 1 ,059 ,925 ,852 1,003 Constante -1,849 1,392 1,766 1 ,184 ,157 Variables en la ecuación B Error estándar Wald gl Sig. Exp(B) 95% C.I. para EXP(B) Inferior Superior Paso 1 DM.AP.2(1) 1,263 ,575 4,824 1 ,028 3,535 1,146 10,911 Constante -1,358 ,374 13,205 1 <,001 ,257 En el análisis multivariante 1 se vuelve a encontrar la relación entre el diagnóstico de diabetes establecido antes de la realización del estudio genético y la clasificación de las variantes por parte del endocrinólogo tras la integración de los datos genéticos del panel NGS con la información clínica (p <0,028). También se encuentra asociación entre la presencia de características sindrómicas y el diagnóstico modificado (integración de clínica y molecular) por parte del endocrinólogo. 118 Multivariante 2 Variables en la ecuación B Error estándar Wald gl Sig. Exp(B) 95% C.I. para EXP(B) Inferior Superior Paso 1 DM.AP.2(1) 1,292 ,696 3,445 1 ,063 3,639 ,930 14,236 PÉPTIDO C DETECTABLE > AÑOS(1) 1,335 ,958 1,941 1 ,164 3,800 ,581 24,849 CARACTERÍSTICAS SINDRÓMICAS(1) 2,249 1,019 4,874 1 ,027 9,478 1,287 69,805 T EV DM -,078 ,039 3,937 1 ,047 ,925 ,856 ,999 Constante -1,567 ,938 2,789 1 ,095 ,209 Variables en la ecuación B Error estándar Wald gl Sig. Exp(B) 95% C.I. para EXP(B) Inferior Superior Paso 1 DM.AP.2(1) 1,291 ,574 5,054 1 ,025 3,636 1,180 11,207 Constante -1,386 ,373 13,837 1 <,001 ,250 Según lo observado en el análisis multivariante 2 (depurado, con eliminación de variables confusoras) el tipo de diabetes establecido o la sospecha diagnóstica de DM antes del panel NGS se asocia de forma independiente a la modificación del diagnóstico por parte del endocrinólogo tras integrar la información clínica y la molecular (OR 3,636 IC95%[1,18;11,20], p=0,025). La presencia de características sindrómicas (p=0,027) y el tiempo de evolución de la DM (p=0,047) antes de la solicitud del estudio genético también se asocian de forma independiente en el análisis multivariante a la modificación del diagnóstico clínico integrado. 119 b.4. TABLAS DE RESUMEN DE LA ESTADÍSTICA INFERENCIAL Asociación de las variables con la MODIFICACIÓN DEL TRATAMIENTO tras el estudio genético Univariante Paso 1 Univariante Paso 2 Multivariante 1 Multivariante 2 DM.AP. <0,001 <0,001 0,006 0,006 AF DM 2 GEN NS NS NS EDAD PANEL NS NS T EV DM 0,043 NS NS Asociación de las variables con el DIAGNÓSTICO DEL LABORATORIO tras el estudio genético Univariante Paso 1 Univariante Paso 2 DM.AP. 0,010 0,030 AF DM 2 GEN 0,029 IMC NS 0,01 Asociación de las variables con el DIAGNÓSTICO CLÍNICO INTEGRADO tras el estudio genético Univariante Paso 1 Univariante Paso 2 Univariante Paso 3 Multivariante 1 Multivariante 2 DM.AP. <0,001 <0,001 <0,001 0,028 0,025 AF DM 2 GEN NS NS PÉPTIDO C DETECTABLE > AÑOS 0,011 NS NS NS CARACTERÍSTICAS SINDRÓMICAS NS 0,027 0,040 0,027 TRATAMIENTO PREPANEL 0,021 0,016 NS EDAD DCO NS NS T EV DM 0,001 <0,001 NS 0,047 120 c. DESCRIPCIÓN INDIVIDUAL DE LOS PACIENTES 1. Paciente número 1 -Resumen clínico: Mujer con diabetes pregestacional diagnosticada con 40 años. Fenotipo delgado y DM familiar en varias generaciones con patrón de herencia autosómica dominante. Glucemia no progresiva. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: En el gen GLIS3 (NM_001042413.1) se detecta una variante tipo SNP heterocigota en la posición chr9:3937028 que no produce cambio en la lectura de la proteína c.1872C>T. No descrita en ClinVar. Al analizarla in silico en el programa predictor mutation Taster la cataloga como posible causante de enfermedad. 2. Paciente número 2 -Resumen clínico: Mujer con diabetes mellitus no progresiva. DM familiar en varias generaciones con patrón de herencia autosómica dominante. Péptido C detectable más de 3 años después del diagnóstico. Fenotipo delgado. Quistes renales y hepáticos, bajo peso al nacer. Baja talla en tratamiento con GH hasta los 16 años. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: En el análisis molecular directo de la región codificante del gen PKHD1, hemos detectado los cambios de secuencia c.9689delA y c.737T>C en heterocigosis. a. Variante c.9689delA (p.Asp3230Valfs*33, rs398124502) se ha descrito previamente como mutación patogénica asociada a PQAR y se encuentra registrada en la base de datos ClinVar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/variation/96444/). b. Variante c.737T>C (p.Ile246Treo, rs1037991711), también está registrada en la base de datos ClinVar, pero se encuentra catalogada como una variante de significado clínico incierto (VUS) en el contexto de PQAR (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/RCV000667175, fecha de última actualización: 12 de mayo de 2017). 3. Paciente número 3 121 -Resumen clínico: Mujer con diabetes mellitus filiada inicialmente como tipo 1. Diagnóstico a los 19 años, con autoinmunidad antiGAD positiva e IMC 29 kg/m2. Marcada resistencia a la insulina con requerimientos de 3-4 unidades de insulina por kilogramo. DM en varias generaciones de su familia con patrón de herencia autosómica dominante. Parto por cesárea electiva a las 29+6 semanas de gestación por CIR severo. Recién nacido con hiperglucemia en primera semana de vida que precisa insulina. Posteriormente y en pocos días tiene normoglucemia sin precisar insulina. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: En el gen ALMS1 se ha detectado un cambio en heterocigosis que consiste en una transición de C por una T(c.5459C>T) que a nivel de la proteína produce presumiblemente el cambio de la prolina de la posición 1822 por una leucina (p.P1822L). Este cambio es considerado por la base de datos del ClinVar(ID:241003) como un cambio de significado clínico incierto por 4 laboratorios, ya que su frecuencia en las bases de datos poblacionales es baja. Sin embargo ha sido en la base de datos HGMD (CM1212148) asociado al síndrome de Alstrom, ya que ha sido descrito, de novo y en heterocigosis , en un paciente afecto , aunque no se detectó un segundo cambio patogénico ni se han realizado estudios funcionales del cambio(Piñeiro-Gallego T et al. Mol Vis. 2012;18;1794-802). Además el análisis in silico con la mayoría de programas utilizados predice que probablemente se trate de un cambio benigno. De ahí que, en base a la información disponible actualmente y a que las evidencias no son suficientes, consideramos este cambio de significado incierto. 4. Paciente número 4 -Resumen clínico: Mujer con diabetes mellitus filiada como probable diabetes monogénica no confirmada mediante estudio Sanger. Diagnóstico de DM a los 13 años. Fenotipo delgado. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas. DM en varias generaciones de su familia con patrón de herencia autosómica dominante. Retirada de tratamiento insulínico bolus-basal con sulfonilureas. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Clasificada como variante de significado incierto con matizaciones: Variante heterocigota tipo SNP en el gen HNF1B(NM_ 000458.3) intrónica, en la posición chr17:36091574: c.1045+12T>C descrita en ClinVar como variante con conflicto de interpretación de resultados 128 concluyentes ya que son necesarias pruebas complementarias que permitan determinar la implicación que tiene en el desarrollo de la enfermedad. 19. Paciente número 19 -Resumen clínico Varón con diabetes mellitus filiada inicialmente como tipo 2 de curso atípico, poco progresiva. HLA de riesgo de DM autoinmune negativo. Autoinmunidad reciente negativa antiislotes de células beta pancreáticas aunque hace años los ac antiGAD fueron levemente positivos. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Se ha encontrado una variante heterocigótica tipo SNP en la posición cromosómica chr4:6290847, en el gen WFS1 en la posición c.449C>T;p.Ala150Val descrita en ClinVar de forma conflictiva: Likely benign; Uncertain significance Se ha encontrado otra variante heterocigota tipo SNP en la posición cromosómica chr6:117250084 en el gen RFX6 en la posición c.2561C>T; p.Ser854Leu, descrita en ClinVar de forma conflictiva: Likely benign; Uncertain significance 20. Paciente número 20 -Resumen clínico Varón con DM con diagnóstico a los 16 años. DM en varias generaciones de su familia con patrón de herencia autosómica dominante. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas. Evolución temporal de la enfermedad atípica. Valores de HbA1c inferiores a lo esperado tras muchos años desde el diagnóstico y escasa frecuencia de autocontroles. Retirada de insulina prandial con sulfonilureas. Diagnóstico de su padre con prácticamente la misma edad (sobre los 16 años) y una evolución muy similar durante más de 30 años. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Se ha encontrado variante heterocigota tipo SNP en el gen KCNJ11 (NM_000525.3) en la posición c.568G>A que produce cambio en la lectura de la proteína p.Ala190Thr. No descrita en ClinVar pero 129 el predictor Mutation Taster considera esta variante como disease causing por lo que la interpretamos como variante de significado incierto. Otra variante encontrada es heterocigota tipo SNP en el gen TBC1D4 (NM_014832.4) en la posición c.1529A>G que produce cambio en la lectura de la proteína; p.Glu510Gly. No descrita en ClinVar pero el predictor Mutation Taster considera esta variante como disease causing por lo que la interpretamos como variante de significado incierto. 21. Paciente número 21 -Resumen clínico Varón con diagnóstico de DM a los 25 años. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas. Péptido C detectable 3 años después del diagnóstico. Siempre se ha mantenido en normopeso. Aparición precoz de ERC Estadio G4. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Se ha encontrado una variante heterocigota tipo SNP en el gen ABCC8 (NM_000352.4) en la posición c.354C>T que no produce cambio en la lectura de la proteína. <descrita en ClinVar com conflicto de interpretación de resultados. El predictor “Mutation Taster” considera esta variante como disease causing por lo que la interpretamos variante de significado incierto. 22. Paciente número 22 -Resumen clínico Mujer con diabetes mellitus conocida desde los 27 años. DM en varias generaciones de su familia con patrón de herencia autosómica dominante. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas. Tratamiento inicial con hipoglucemiantes orales por tener reserva insular e insulinizada poco tiempo después. Mal control crónico. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Se han encontrado tres variantes de significado incierto asociadas a su patología: a. Variante heterocigota tipo SNP en el gen 130 TBC1D4 (NM_014832.4) en la posición chr13:75884250 que no produce cambio en la lectura de la proteína c.2421C>G. No descrita en ClinVar pero según el predictor “in silico” “Mutation Taster”, podría alterar el splicing y la considera Disease causing. b. Variante heterocigota tipo SNP en el gen WFS1 (NM_006005.3) en la posición chr4:6303423 que produce un cambio en la lectura de la proteína c.1901A>G; p.Lys634Arg . No descrita en ClinVar pero según el predictor “in silico” “Polyphen2”, podría ser patrológica c. Variante heterocigota tipo SNP en el gen BLK (NM_001715.2) en la posición chr8:11418856 que produce cambio en la lectura de la proteína c.1075C>T; p.Arg359Cys. Descrita en ClinVar como probablemente benigna en base a la frecuencia poblacional, no obstante, la informamos para su valoración pues solo hay un suscriptor y el predictor polyphen2 la considera posiblemente patológica. 23. Paciente número 23 -Resumen clínico Mujer con DM en varias generaciones de su familia con patrón de herencia autosómica dominante. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas. Fenotipo no obeso. Buena respuesta a sulfonilureas. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: HNF4A heterocigosis NM_175914.4:c.467C>T NP_787110.2:p.A156V VSI PTF1A heterocigosis NM_178161.2:c.780_784+6del Probablemente patogénica Los resultados del presente estudio no permiten confirmar ni descartar el diagnóstico. Son necesarias pruebas complementarias que permitan segregar dichos cambios y determinar la implicación que tienen en el desarrollo de la enfermedad. En el caso del gen PTF1A, al estar asociado a una enfermedad recesiva, sería necesario otro cambio patogénico para confirmar el diagnóstico. 24. Paciente número 24 -Resumen clínico Mujer con autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas en momento del diagnóstico de diabetes mellitus. Glucemia basal no progresiva. Fenotipo delgado. 131 -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Se ha encontrado una variante heterocigota tipo SNP en el gen INSR (NM_000208.3) en la posición c.3399T>C que no produce cambio en la lectura de la proteína. No descrita en ClinVar ni en dbSNP. Al utilizar el predictor de afectación de splicing “Human Splicing Finder” clasifica la variante como potencialmente capaz de alterar el splicing. 25. Paciente número 25 -Resumen clínico Mujer con DM en varias generaciones de su familia con patrón de herencia autosómica dominante. Durante su embarazo y pese a la hiperglucemia sostenida la biometría fetal se mantiene por debajo del p50. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: La paciente es portadora de cambio de significado clínico incierto en el gen ALMS1: Cambio en heterocigosis de una C por una T (c.5403 C>T) que a nivel de proteína produce, presumiblemente, un cambio sinómino en posición 1803 (p.T1803T). 26. Paciente número 26 -Resumen clínico Mujer con DM en varias generaciones de su familia con patrón de herencia autosómica dominante. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas. Fenotipo delgado. Marcada resistencia a la insulina. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Se ha detectado una variante de significado inciertoaunque posiblemente patogénica- en el gen AKT2 del cromosoma 19. El cambio consiste en una trasnversión de una A por una C (c.1234A>C) que a nivel de proteína produce presumiblemente , el cambio de isoleucina de la posición 412 por una leucina (p.I412L). Este cambio aunque ya ha sido descrito en la base de datos dbSNP, no ha sido previamente descrito in en las bases de datos clínicas ni poblacionales. Este cambio se localiza haca la región C terminal y el análisis in silico de los programas utilizados es contradictorio, ya que unos consideran que se trata un cambio probablemente deletéreo, mientras que otros lo consideran neutral. 132 27. Paciente número 27 -Resumen clínico Mujer con diabetes mellitus diagnosticada con 26 años. DM en varias generaciones de su familia con patrón de herencia autosómica dominante. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas. Péptido C detectable más de 3 años después del diagnóstico. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Variante tipo SNP, heterocigota, en el gen TBC1D4 (NM_014832.4) que no produce cambio en la lectura de la proteína c.2043G>A no descrita en ClinVar. En el predictor de alteraciones del splicing Human Splicing Finder valora una posible afectación del splicing. 28. Paciente número 28 -Resumen clínico DM en varias generaciones de su familia con patrón de herencia autosómica dominante. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Variante heterocigota tipo SNP en el gen PDX1 (NM_000209.3) en la posición chr13:28494501 que produce un cambio en la secuencia de aminoácidos c.226G>A; p.Asp76Asn. Descrita en la base de datos ClinVar con distintas interpretaciones. El sistema de análisis in silico Mutation Taster considera esta variante disease causing por lo que la interpretamos como variante de significado incierto. 29. Paciente número 29 -Resumen clínico Mujer con DM filiada como tipo 1. DM en varias generaciones de su familia con patrón de herencia autosómica dominante. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas. Hija con DM diagnosticada a los 11 meses de edad. 133 -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Variante de significado incierto: Se ha encontrado una variante heterocigota tipo SNP en el gen BLK (NM_001715.2) en la posición chr8:11420604 que no produce cambio en la lectura de la proteína c.1297C>A. No descrita en ClinVar pero según el predictor ''in silico'' ''Human Splicing Finder'', podría alterar el splicing. 30. Paciente número 30 -Resumen clínico Mujer con DM con diagnóstico a los 12 años. DM en varias generaciones de su familia con patrón de herencia autosómica dominante. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas. Hermana con DM filiada como tipo1. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Se detecta variante de significado incierto en el gen CP en heterocigosis NM_000096.3:c.2684G>C NP_000087.1:p.G895A. 31. Paciente número 31 -Resumen clínico Mujer con DM diagnosticada a los 13 años de edad. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas. Péptido C detectable más de 3 años después del diagnóstico. Buena respuesta a introducción de sulfonilureas. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Variante heterocigota tipo SNP en el gen WFS1 (NM_006005.3) en la posición c.2452C>T que produce un cambio en la lectura de la proteína p.Arg818Cys. Descrita en ClinVar como variante de significado incierto. Se ha encontrado otra variante homocigota tipo SNP en el gen HNF4A (NM_001287182.1) en la posición c.666T>A que produce un cambio en la lectura de la proteína p.Asn222Lys. No descrita en las bases de datos consultadas, pero por el cambio de aminoácidos existe la posibilidad de que tenga implicación clínica, a valorar o descartar por su médico especialista. 134 32. Paciente número 32 -Resumen clínico Varón con DM filiada como tipo 1 con diagnóstico a los 28 años. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas. Aparente refractariedad a la producción de cetosis. Hermano también con DM filiada como tipo 1 y autoinmunidad negativa -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Se ha detectado un cambio en heterocigosis en el gen RFX6 (Regulatory Factor X 6) que consiste en una transversión de una C por una A (c.2039C>A) que a nivel de proteína produce presumiblemente el cambio de treonina por lisina en posición 680 (p.T680K). Este cambio es considerado de significado clínico incierto. 33. Paciente número 33 -Resumen clínico Mujer con DM diagnosticada con 22 años de edad. Comportamiento poco progresivo a lo largo de los años, con péptido C detectable de forma persistente. DM en varias generaciones de su familia con patrón de herencia autosómica dominante. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: En el gen PDX1 se ha detectado un cambio en heterocigosis NM_000209.3:c.178G>T NP_000200:p.G60C. Este cambio no ha sido descrito previamente en la literatura mie en las bases de datos consultadas por lo que ha de ser considerada de significado clínico incierto. El análisis in silico en la mayoría de programas utilizados predice que probablemente se trate de un cambio patogénico. 34. Paciente número 34 -Resumen clínico Mujer con DM con diagnóstico a los 9 años. Fenotipo delgado. Disfunción cognitiva leve. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas. Hermana con anemia ferropénica refractaria al tratamiento con hierro oral y trastornos mnésicos. 135 -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: En el gen CP se ha detectado un cambio en heterocigosis NM_000096.3:c.2684G>C NP_000087.1:p.G895A. Este cambio es considerado por la base de datos del ClinVar como un cambio de significado clínico incierto por seis laboratorios y en la base de datos HGMD ha sido asociado a aceruloplasminemia, ya que ha sido descrito un individuo afecto de deficiencia hereditaria de ceruloplasmina (Kono S. et al. Biol Res. 2006;39(1):15-23). Además el análisis in silico con todos los programas utilizados predice que probablemente se trate de un cambio patogénico, aunque estas predicciones no han sido confirmadas por estudios funcionales publicados . De ahí que en base a la información disponible actualmente y a que las evidencias no son suficientes, consideremos este cambio de significado incierto. 35. Paciente número 35 -Resumen clínico Varón con DM con autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas. Ausencia de resistencia insulínica u obesidad. Excelente respuesta a gliclazida. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Variante de significado incierto EIF2AK3 heterocigosis NM_004836.5:c.1611 G>A NP_004827: p.T537T. El análisis in sílico no predice que este cambio de lugar a la creación de un nuevo sitio críptico de splicing, por lo que podría tratarse de una variante rara sin significado clínico. 36. Paciente número 36 -Resumen clínico Varón con DM filiada como tipo 1 con diagnóstico a los 11 años de edad. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas. Dificultad para las relaciones sociales y trastornos afectivos. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Se han encontrado dos variantes de significado incierto: 136 a. Variante heterocigota tipo SNP en el gen INSR (NM_000208.3) en la posición c.3034G>A que produce cambio en la lectura de la proteína p.Val1012Met . Descrita en ClinVar como conflicto de interpretación de resultados (aunque muchas descripciones la consideran benigna) b. Variante heterocigota tipo SNP en el gen KLF11 (NM_ 003597.4) en la posición c.358A>G que produce cambio en la lectura de la proteína p.Arg120Gly. Descrita en ClinVar como de Significado Incierto. Este gen tiene un gap en el exón 1, si consideran que pueda ser causa de su enfermedad recomendamos encargar su secuenciación por tecnología Sanger. 37. Paciente número 37 -Resumen clínico Varón con DM en varias generaciones de su familia con patrón de herencia autosómica dominante. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Variante heterocigota de significado incierto tipo SNP en gen ZFP57 en posición c.112C>T con cambio en proteina p.Arg38Trp. 38. Paciente número 38 -Resumen clínico Mujer con DM en varias generaciones de su familia con patrón de herencia autosómica dominante. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Se detecta variante tipo SNP heterocigota en el gen PDX1 (NM_000209.3) en la posición chr13:28494501, que produce un cambio en la secuencia de aminoácidos c.226G>A; p.Asp76Asn. Esta variante está descrita en ClinVar con distintas interpretaciones mientras el sistema de análisis in silico Mutation taster la considera disease causing. 39. Paciente número 39 137 -Resumen clínico Mujer con DM con diagnóstico a los 31 años. Abundantes antecedentes familiares de diabetes con diagnóstico a edad temprana -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Variante de significado incierto en heterocigosis del cambio c2913A>T (p.G971G) en el gen TBC1D4. 40. Paciente número 40 -Resumen clínico Varón con diabetes mellitus diagnosticada a los 38 años con normopeso.Marcadores de autoinmunidad pancreática negativos. Péptido C normal 8 años después del diagnóstico. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Se detecta variante heterocigota tipo SNP en el gen INSR (NM_000208.3) en la posición c.3399T>C que no produce cambio en la lectura de la proteína. No descrita en ClinVar ni en dbSNP. Al utilizar el predictor de afectación de splicing Human Splicing Finder clasifica la variante como potencialmente capaz de alterar el splicing. 41. Paciente número 41 -Resumen clínico Mujer con DM diagnosticada a los 15 años. Autoinmunidad negativa antiislotes de células beta pancreáticas. Péptido C detectable tras más de 4 años del debut de la diabetes. Antecedentes familiares de diabetes en padre y abuela paterna. Reducción de dosis insulínica con metformina, incluso con retirada transitoria de la insulina prandial. -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: En el gen AKT2 se ha detectado un cambio en heterocigosis NM_001626.5:c.1008G>A NP_001617:p.L336L. Este cambio, aunque ha sido descrito en la base de datos dbSNP ha de ser considerado de significado clínico incierto ya que su frecuencia en las bases de datos poblacionales es muy baja y no hay datos sobre su implicación clínica. El análisis insilico con el software Human 144 -Informe del laboratorio que realiza el estudio genético: Se ha encontrado una variante heterocigota tipo SNP en el gen INSR (NM_000208.3) en la posición c.779T>G que produce cambio en la lectura de la proteína p.Leu260Arg . Descrita en ClinVar como patológica pero sin proporcionar criterios de afirmación. 145 146 10. DISCUSIÓN Los estudios genéticos han cambiado la manera en la que nos enfrentamos a nuestros pacientes con diabetes. En los últimos años los estudios NGS mediante secuenciación masiva ( paneles de genes seleccionados, exomas completos o parciales y genomas completos) han revolucionado nuestras posibilidades diagnósticas (200). Sin embargo posiblemente aún es pronto para generalizar su uso en las diabetes mellitus clasificadas tradicionalmente como tipo 1 o como tipo 2 por su carácter poligénico y por la posibilidad de que su etiopatogenia esté relacionada con factores externos poco controlables o epigenéticos (12,14,58,64). Sin embargo la diabetes monogénica se postula como un ejemplo de la llamada medicina de precisión o medicina personalizada y “a medida”, siendo esencial el estudio genético para la confirmación de esa causa “única” de enfermedad que es la variante mutacional de un gen concreto (7,85,190). Salvo en el caso de las diabetes mellitus asociadas a mutación del gen GCK o algunas diabetes monogénicas asociadas a otros rasgos sindrómicos (como por ejemplo las diabetes asociadas a mutación HNF1B, WFS1 o ALMS), en las cuales posiblemente podríamos solicitar el estudio aislado del gen mediante Sanger, es recomendable realizar estudios de secuenciación masiva que incluyan todos los genes conocidos implicados en la aparición de la diabetes monogénica (165,200). En el año 2017 en el servicio de endocrinología del Hospital Universitario de Valme comenzamos a solicitar estudios de diabetes monogénica con tecnología de NGS o secuenciación masiva, inicialmente en laboratorios externos como el centro Imegen de Valencia. Es en el año 2019 cuando comienzan a realizarse estos estudios en nuestro centro de referencia, el laboratorio del Hospital Universitario Virgen del Rocío. Desde esa fecha y hasta la actualidad el aumento en el número de estudios genéticos de diabetes monogénica realizados por nuestro servicio ha sido exponencial. Esto motivó el diseño de un estudio que permitiera evaluar cómo la información procedente de las técnicas moleculares y genéticas permitía la correcta clasificación de los pacientes con diabetes mellitus. Al mismo tiempo queríamos valorar su repercusión en la evolución y el tratamiento de nuestros pacientes, así como describir y caracterizar las variantes mutacionales encontradas. Este estudio descriptivo longitudinal retrospectivo incluye 109 pacientes con diabetes mellitus o alteraciones del metabolismo hidrocarbonado a los que se les ha realizado estudios de diabetes monogénica mediante técnicas NGS o de secuenciación masiva. 147 Tras el estudio hemos observado que un 9,2% de las diabetes mellitus clasificadas como clásicas (DM1/DM2/DG) pasaban a clasificarse como monogénicas. Los diagnósticos de diabetes monogénica previos a la realización de estudio NGS pasaron por tanto del 36,7% al 45,9%. Pese a que estas cifras pueden no ser especialmente llamativas sí que es importante el impacto clínico. En el caso de una diabetes clásica conocer que se trata de una diabetes monogénica puede condicionar cambios drásticos en el tratamiento, por ejemplo la retirada de la dosis de insulina total o parcialmente en una DM tipo 1 o tipo 2. También es importante dentro de las formas clásicas gestacionales o pregestacionales conocer la presencia de una determinada mutación como pudiera ser GCK o AKT2 en las cuales se podría ser permisivo con la hiperglucemia materna si la biometría fetal es normal y pudiendo causar hipoglucemias la insulinización e incluso yatrogenia en el recién nacido (201,202). En algunas diabetes clásicas conocer el estado de portador de una variante asociada a diabetes monogénica ha permitido poner en marcha herramientas de cribaje para detectar rasgos sindrómicos asociados a DM (por ejemplo hipoacusia o atrofia retininiana en WFS1) (144). En el caso del 45,9% de diabetes monogénicas o probablemente monogénicas categorizadas tras la realización del estudio genético y la integración de los datos clínicos por parte del endocrinólogo se podría discutir si la subida diagnóstica es poco reseñable respecto a la sospecha de diabetes monogénica descrita antes de realizar el panel NGS (36,7%). Sin embargo en este estudio hemos demostrado de forma estadísticamente significativa que el tipo de diagnóstico de diabetes establecido antes del estudio NGS y concretamente el diagnóstico de sospecha inicial de diabetes monogénica se asocia tras el estudio genético y de forma independiente a un mayor porcentaje de modificaciones en el tratamiento farmacológico o en el plan terapéutico de la diabetes mellitus respecto a las diabetes mellitus denominadas clásicas (44,7%, n=17 vs 9,4%,n=6, OR 7,8 con IC 95% [2,72; 22,49]). Esto se podría explicar por distintas razones. Por un lado, el endocrinólogo cuando se detecta una variante que es patogénica o probablemente patogénica actúa con mayor seguridad para iniciar fármacos específicos para una mutación concreta, para subir la dosis de la medicación o por supuesto para retirar medicación no indicada o inespecífica (89). Mención aparte merecen los casos de diabetes gestacional en los que es fundamental conocer el gen afectado para maximizar la seguridad en el manejo de la gestación tanto para la madre como para el feto (201,202). El conocimiento del gen específico ha permitido diagnosticar a dos hermanas que teníamos en seguimiento con sospecha de diabetes monogénica. Sin embargo, una es portadora de mutación WFS1 (paciente 6, ver descripción individual de pacientes) mientras que la otra es portadora de una variante de HNF1A (paciente número 52, ver descripción individual de pacientes) lo cual modifica su seguimiento, evolución y tratamiento. Gracias a conocer la mutación KCNJ11 en la paciente número 48 (ver descripción individual de 148 pacientes) hemos podido realizar el estudio familiar en su hermano con DM con bolus-basal y retraso psicomotor y sustituir la insulinización por sulfonilureas a dosis bajas. En los resultados se ha comentado la ausencia de asociación estadística entre los antecedentes familiares de diabetes en al menos dos generaciones con patrón de herencia autosómico dominante, la presencia de péptido C detectable más de tres años después del diagnóstico y las características sindrómicas y el posible cambio en el tratamiento tras el estudio genético. Pensamos que la relación estadísticamente significativa podría obtenerse aumentando el tamaño muestral. Esta afirmación parece particularmente evidente en el caso de los antecedentes familiares y el péptido C detectable ya que aunque la asociación no tuviera significación , sí mostraba tendencia. Es llamativo también que la autoinmunidad negativa anti-islotes de células beta pancreáticas no haya demostrado relación con la posibilidad de modificaciones en el plan terapéutico. Pensamos que esto se debe a la propia naturaleza de la población en estudio y al carácter retrospectivo. En la mayoría de pacientes el diagnóstico de diabetes mellitus se estableció hace muchos años (en algún caso incluso décadas). El momento ideal para pedir la autoinmunidad pancreática es el momento del diagnóstico. Es conocido que a lo largo de los años los distintos anticuerpos pueden negativizarse (34,42,70), lo cual explicaría los numerosos casos de pacientes con autoinmunidad negativa y ausencia de detección de variante mutacional en el estudio NGS. Por otro lado los anticuerpos se han realizado con distintas técnicas, incluso a veces en distintos laboratorios, lo cual aconseja interpretar sus informes con cautela. En nuestra opinión y tal como sugieren distintas guías y revisiones de la diabetes monogénicas debemos ampliar nuestro panel de anticuerpos con los anti Znt8, para aumentar la precisión diagnóstica (32,36). El tratamiento utilizado por los pacientes antes de la realización del estudio NGS no ha demostrado asociación estadística con el cambio en el tratamiento o en el plan terapéutico. Hay una tendencia leve con un mayor porcentaje de modificaciones en el tratamiento en el grupo tratado con terapias no insulínicas y concordante con la evidencia científica existente que pensamos que podría tener significación aumentando el tamaño muestral. La edad de diagnóstico tampoco se ha asociado a variaciones en el tratamiento o el plan terapéutico. Posiblemente en una población en estudio como la nuestra mayor de 18 años y una mediana de edad al diagnóstico de 27,7 años la edad al diagnóstico no es un factor determinante (probablemente sí lo seria una población pediátrica que incluyera niños menores de un año) y sí lo es el tiempo de evolución de la DM , variable que sí ha mostrado asociación estadísticamente significativa con el cambio 149 en el tratamiento (p=0,043). Se ha estimado una mediana de 5 años menor (rango 0-11 años) en el grupo de pacientes que han tenido modificaciones en el tratamiento respecto a los que no lo han modificado. Es presumible que los pacientes con más años de evolución tienen más riesgo de haber agotado la reserva de insulina pancreática y por tanto pueden utilizar una batería de fármacos más reducidas, excluyendo en muchos casos la posibilidad de usar sulfonilureas incluso en mutación claramente sensible a este grupo farmacológico (por ejemplo, en HNF1A o KCNJ11) (88,186). La ausencia de asociación del IMC en el debut de DM con la modificación del tratamiento puede relacionarse por un lado por la ausencia de datos de esta variable en el estudio retrospectivo (por ejemplo en pacientes de larga evolución no tenemos registros del IMC en el momento del diagnóstico) o porque conscientemente no se han reflejado en la historia al no ser valorable en determinadas etapas de la vida (por ejemplo paciente que tiene su primera visita por el endocrinólogo durante la gestación). En todo caso se reitera en la literatura científica reciente que por los cambios sociodemográficos el fenotipo delgado o con sobrepeso deja de ser un marcador fiable para la clasificación diagnóstica de la DM. Filiar a un diabético delgado como probablemente tipo 1 o MODY o a un obeso como probablemente tipo 2 nos puede llevar a un error en el diagnóstico (4,203). El diagnóstico de DM establecido antes del panel NGS se asocia a la clasificación de las variantes por parte del laboratorio (p=0,030) tras la realización del estudio genético. En el grupo con diagnostico de DM monogénica pre-panel NGS se ha obtenido un porcentaje de un 17,5% de variables patogénicas o probablemente patogénicas frente al 2,9% obtenido en el grupo de diabetes clásicas. Por otro lado en el grupo de diabetes clásicas destaca un 60,9% pacientes en los que no se ha encontrado variante mutacional frente al 32,5% en el grupo con sospecha de diabetes monogénica. Esto pensamos que se relaciona con el buen criterio clínico de los endocrinólogos que han estado siguiendo a los pacientes ya que su sospecha clínica, incluso desde años antes de poder disponer de una técnica genética molecular, se ha confirmado en un número elevado de los casos. Aunque no se haya utilizado la calculadora de riesgo MODY se han valorado todas las variables recogidas en esta herramienta de estimación antes de solicitar el estudio molecular. Al mismo tiempo estos resultados recomiendan valorar con sumo detalle los pacientes con diabetes clásicas antes de plantear la solicitud del estudio genético, asegurando la petición racional de estos recursos costosos en la situación de incertidumbre económica en la que nos encontramos. En nuestro estudio sólo un 9.2% de las diabetes clasificadas como clásicas modificaron el tratamiento tras la realización del estudio NGS. Sin embargo estas modificaciones en una diabetes clásica tienen una gran magnitud clínica, por ejemplo al retirar la insulinización en un paciente diagnosticado como tipo 1 (pacientes números 4 y 44, ver descripción individual de pacientes), por lo que merece la pena valorar el estudio genético en situaciones concretas. 150 En nuestra opinión sería razonable solicitarlo en pacientes jóvenes con DM con algún rasgo sindrómico sospechoso. Puede servir como ejemplo nuestra paciente número 3 (ver descripción individual de pacientes) con DM filiada como tipo 1 y mal control en gestación que tiene un recién nacido con CIR severo, en el que también se confirmó que era portador de variante WFS1 (no está incluido en el estudio por ser menor de 18 años). La detección de una variante mutacional en el gen ALMS 1 permitió introducir metformina mejorando el control glucémico y la reducción de la dosis insulínica. En cualquier caso son necesarios más estudios con análisis de costes que apoyen el uso de las técnicas genéticas en adultos con diabetes mellitus tal como ocurre en las diabetes diagnosticadas en menores de 6 meses de edad (157). Los antecedentes familiares de DM con patrón autosómico dominante sí han mostrado asociación con el diagnóstico molecular por parte del laboratorio. Esto es concordante con el tipo de herencia predominante en la diabetes monogénica (82,161,185,163,190,194). En nuestro estudio el péptido C detectable, la autoinmunidad anti-islotes pancreática, el tipo de tratamiento utilizado y las características sindrómicas no han mostrado asociación estadísticamente significativa con el diagnóstico de DM monogénica o probablemente monogénica en el informe molecular. Todas ellas son variables clásicas relacionadas con el diagnóstico de diabetes monogénica (82,161,185,163,190,194) y muestran tendencia que las podría relacionar estadísticamente con el diagnóstico de DM monogénica o probablemente monogénica en el informe de genética si aumentáramos el tamaño muestral. La edad de diagnóstico de la DM no ha mostrado relación con la clasificación de las variantes o la ausencia de detección de éstas por parte del laboratorio. De nuevo esto es esperable en el grupo de estudio de pacientes mayores de 18 años con una mediana de edad en el diagnóstico de DM de 27,7 años. El IMC > ó= a 25 kg/m2 curiosamente sí tiene asociación con el diagnóstico de DM monogénica o probablemente monogénica, aunque no tenemos claro que sea una relación casual. Sin embargo el IMC por las razones expuestas anteriormente es un dato que se ha recogido de forma incompleta y que va perdiendo peso en el diagnóstico de la diabetes monogénica (203). Uno de las variables recogidas en nuestro estudio ha sido denominada variante modificada, que recoge la reclasificación de las variantes mutacionales tras la integración de la información de los estudios genético y la información recogida en la actividad clínica habitual por el endocrinólogo. Esta actuación no menoscaba la labor de nuestros referentes el laboratorio clínico sino que intenta complementarla con nuestra experiencia clínica. En todo caso y tal como recoge la reciente Monografía 151 de Genética y Diabetes de la SED es fundamental la comunicación estrecha entre el clínico y el genetista para optimizar el rendimiento de los test moleculares y la correcta interpretación de las variantes de significado incierto (204). En nuestro grupo de estudio el análisis multivariante demuestra la relación entre el diagnóstico de diabetes establecido antes de la realización del estudio genético y la clasificación de las variantes por parte del endocrinólogo tras la integración de los datos genéticos del panel NGS con la información clínica (p <0,028). Esto se traduce que en nuestro grupo de estudio tener previamente al panel NGS diagnóstico de DM monogénica respecto a la DM clásica (DM1/DM2/DG) multiplica por más de 3 (hasta 11) el riesgo de tener una variante patogénica o probablemente patogénica tras integrar el endocrinólogo los datos clínicos y moleculares. El aumento de diagnósticos de DM probablemente monogénicas tras sumar la información clínica se ha establecido tras un minucioso examen de las distintas historias clínicas, determinando que un gran porcentaje de las variantes de significado incierto son probablemente patogénicas. El porcentaje de DM probablemente patogénicas o patogénicas identificadas tras el cribaje clínico es superior al informado por el laboratorio (45,9% vs 17,5%) y se aproxima al diagnóstico pre-panel de diabetes monogénica (36,7%), variable que como se ha comentado anteriormente se ha asociado a la modificación del tratamiento o el plan terapéutico de la DM de forma estadísticamente significativa. Se ha demostrado la asociación entre las características sindrómicas y la clasificación de las variantes por parte del endocrinólogo en patogénicas o probablemente patogénicas tras la integración de los datos genéticos (p=0,027). Se estima que un paciente con características sindrómicas tiene más de tres veces más riesgo de clasificación patogénica o probablemente patogénica por parte del endocrinólogo (OR 3,55 con IC 95% [1,09; 11,5]). La presencia de características sindrómicas (hipoacusia, retraso psicomotor, atrofia del nervio óptico , diagnóstico antes de los 6 meses, gran resistencia a la insulina y otras) constituye un marcador ampliamente reconocido por su asociación al diagnóstico de DM monogénica , lo cual es concordante con la significación estadística pese al bajo número de pacientes con características sindrómicas. El tiempo de evolución de la diabetes sí se ha asociado al diagnóstico clínico de diabetes monogénica o probablemente monogénica tras integrar los datos moleculares (p=0,047). Se estima una mediana de 8 años de diferencia menor (rango 3-13 años) en el grupo de pacientes con variantes clasificadas como probablemente patogénicas o patogénicas y respecto al grupo con variantes VSI/no detectadas. Se puede explicar por la posibilidad de aprendizaje y la mejor interpretación de los parámetros de laboratorio y las variables clínicas por parte de los endocrinólogos de nuestra unidad desde que se 152 iniciaron los paneles NGS en el año 2017, lo cual ha permitido seleccionar mejor a los pacientes que pudieran tener una mutación patogénica o probablemente patogénica. El tratamiento no insulínico se ha asociado a la posibilidad de detección de variante patogénica por el endocrinólogo tras la integración de la información genética y clínica, lo cual está recogido en la literatura (139). No se ha confirmado en el análisis multivariante posiblemente por la pérdida de datos en el diseño. Los antecedentes familiares de DM no han demostrado asociación con la clasificación de las variantes por parte del endocrinólogo tras la integración de los datos genéticos con la clínica. La tendencia observada, sin embargo, orienta a que probablemente el aumento del tamaño muestral logre alcanzar la significación. La ausencia de asociación estadísticamente significativa de la autoinmunidad podría explicase por la pérdida de positividad de los anticuerpos en DM de larga evolución y por requerirse mayor tamaño muestral. La significación estadística del péptido C no demostrada al agrupar variables podría solventarse también con una mayor n en el grupo en estudio. 153