Diseño de sistemas nanoparticulares lipídicos para co-administración de teofilina y ciprofloxacino en el tratamiento de la fibrosis quística

TESIS DOCTORAL DISEÑO DE SISTEMAS NANOPARTICULARES LIPÍDICOS PARA CO-ADMINISTRACIÓN DE TEOFILINA Y CIPROFLOXACINO EN EL TRATAMIENTO DE LA FIBROSIS QUÍSTICA María Oliva Guerra Morillo Sevilla, 2019 AGRADECIMIENTOS Por fin veo la luz al final del túnel. Han sido cinco años difíciles en los que pensé en tirar la toalla más de una y de dos veces. Tardes interminables en el laboratorio en las que algún que otro aparato que todos conocemos nos ha dado algún “susto” y días en los que el ordenador no quería trabajar. Años llenos de buenos, pero también de malos momentos, por ello quiero agradecer a todas las personas que me han dado el aliento necesario para seguir adelante. A mis directores, María Luisa González Rodríguez, Antonio María Rabasco Álvarez por estar siempre pendientes de mí y apoyarme para que no abandonase y María José Cózar Bernal, por la oportunidad que me han brindado formando parte de su grupo de investigación. Su dedicación y guía han sido fundamental para finalizar con éxito la tesis que tienen en sus manos. Gracias por la dedicación y todos los buenos momentos vividos. A todos mis compañeros del grupo de investigación: Carmen, Elena, Nabila, Ana y Sergio, por acompañarme en todo momento en este camino, por estar ahí en los momentos de agobio y desazón, por ayudarme a extruir más de una vez, por las largas horas frente al HPLC y por los miles de momentos de risas vividos. No olvido a aquellos compañeros con los que comenzó esta aventura: Fernando, Miguel, Mariló, Flavia y muchos otros que han ido pasando a lo largo de estos años: Ana Novak, David, Francesca. Gracias por amenizar esas interminables horas de laboratorio con conversaciones interesantes y por haber tenido la oportunidad de vivir esta experiencia con vosotros. A todos los compañeros del departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica, por todas las horas pasadas en sus instalaciones colaborando con el buen clima de trabajo y el compañerismo. A la Facultad de Ciencias y Tecnología de la Universidad del Algarve, especial mención a la Profesora Ana Grenha y a Filipa, por su gran aportación en los estudios de cultivos celulares. Gracias por aportar vuestros conocimientos y por el interés mostrado en este proyecto. A mis padres, Juan y Mª Antonia, y a mi hermano Juan Carlos, por el apoyo incondicional en todo momento, por escucharme y animarme a seguir adelante en los momentos difíciles. Por enseñarme a ser constante en todos mis propósitos y por ayudarme a buscar el tiempo necesario para hacer mi trabajo. A Diego, mi compañero de viaje, por apoyarme en todos mis proyectos por transmitirme su alegría y optimismo, por hacer fácil lo que parece imposible y por demostrarme que juntos podemos conseguir todo lo que nos propongamos. Gracias por estar siempre ahí. Muchas gracias a todos por hacer posible que esta tesis llegue a su fin. ÍNDICE GENERAL Resumen general………………………………………………………………………1 Abreviaturas…………………………………………………………………………...3 Introducción…………………………………………………………………………...7 Capítulo I ……………………………………………………………………………51 Capítulo II ………………………………………………………………………….127 Conclusiones generales …………………………………………………………….203 [Escriba aquí] 2 7 INTRODUCCIÓN La fibrosis quística consiste en un desorden genético causado por mutaciones en el gen CFTR que codifica una proteína encargada de regular la actividad de los canales de sodio y cloruro. Hay alrededor de 70000 casos alrededor del mundo, predominando en el continente europeo, donde aparece en 1 de cada 2000- 3000 nacimientos, considerándose una enfermedad rara. Su diagnóstico se encuentra instaurado desde hace tiempo, siendo la prueba del talón o cribado neonatal la más empleada. Cursa principalmente con retención de moco e infección crónica, así como con inflamación de las vías aéreas. Actualmente, la mayoría de tratamientos existentes para la fibrosis quística están diseñados para tratar sus síntomas, siendo la enfermedad pulmonar la más común y la que causa mayor morbi-mortalidad. Los sistemas nanoparticulares son una buena opción para encapsular principios activos en el tratamiento de esta enfermedad siendo idóneos para la administración pulmonar debido a su pequeño tamaño, su liberación sostenida y su elevada biocompatibilidad. Existen varios sistemas nanoparticulares para la liberación de fármacos por vía pulmonar para esta enfermedad. Sin embargo, la mayoría se componen de un único fármaco, encontrándose además en fase de estudio y siendo mayoritariamente antibióticos. En un futuro debe buscarse la co-encapsulación de fármacos que permita tratar tanto la sintomatología y como los defectos en el gen CFTR. 8 9 ÍNDICE INTRODUCCIÓN GENERAL 1. CONCEPTO DE LA ENFERMEDAD ...................................................................... 11 2. PAPEL DEL CANAL CFTR EN LA ENFERMEDAD ............................................ 13 3. EPIDEMIOLOGÍA Y DEMOGRAFÍA DE LA ENFERMEDAD ............................ 15 4. DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD ................................................................ 16 4.1. Cribado prenatal .................................................................................................. 17 4.2. Cribado en recién nacidos.................................................................................... 18 4.2.1. Confirmación de la enfermedad ................................................................... 18 5. PATOGÉNESIS DE LA ENFERMEDAD ................................................................ 19 5.1. Manifestaciones desde la etapa uterina hasta la edad adulta de los diferentes síntomas ...................................................................................................................... 20 6. MANIFESTACIONES CLÍNICAS POR SISTEMAS .............................................. 23 6.1. Intestinales ........................................................................................................... 23 6.2. Alteraciones en las glándulas sudoríparas ........................................................... 26 6.3. Ausencia de conductos deferentes ....................................................................... 26 6.4. Enfermedad pulmonar ......................................................................................... 26 7. MANEJO Y CONSIDERACIONES SOBRE LA ENFERMEDAD ......................... 28 7.1. Manejo de los síntomas gastrointestinales........................................................... 29 7.2. Inmunización ....................................................................................................... 30 7.3. Manejo de la enfermedad pulmonar .................................................................... 30 8. TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO ................................................................... 32 8.1. Aparato respiratorio ............................................................................................. 32 8.2. Aparato gastrointestinal ....................................................................................... 33 8.3. Tratamiento actual y perspectivas futuras ........................................................... 34 9. AVANCES EN EL USO DE LIPOSOMAS PARA EL TRATAMIENTO DE LA FIBROSIS QUÍSTICA ................................................................................................... 35 10. CONCLUSIONES .................................................................................................... 40 11. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 41 10 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Mutaciones más frecuentes en la FQ con sus defectos y consecuencias ......... 11 Tabla 2. Aparición de distintos síntomas de la FQ según el avance de la enfermedad . 16 Tabla 3. Relación entre el fenotipo, genotipo y la función CFTR en pacientes con FQ y en individuos sanos ......................................................................................................... 17 Tabla 4. Manifestaciones clínicas y sintomatología de la fibrosis quística según diferentes grupos de edad. .............................................................................................. 19 Tabla 5. Estudios en los que se usan liposomas para tratar la FQ. ................................ 36 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Efectos de la disfunción CFTR. ..................................................................... 13 Figura 2. Formación del biofilm de Pseudomonas aeruginosa y su crecimiento en el pulmón en pacientes que presentan FQ. ......................................................................... 27 Figura 3. Encapsulación de fármacos para la FQ en liposomas. ................................... 35 Figura 4. Mecanismo de acción de Arikace®.. .............................................................. 37 Figura 5. Dispositivo Tobi®. .......................................................................................... 38 Figura 6. Formulación de Pulmaquin®. ......................................................................... 39 11 1. CONCEPTO DE LA ENFERMEDAD La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad causada por la mutación de un gen que codifica el canal clorhídrico transmembrana llamado regulador de la conductancia transmembrana de la FQ (CFTR), que regula el transporte de aniones y aclaramiento mucociliar en las vías aéreas (Rafeeq y Murad, 2017) . El fallo funcional en el CFTR deriva en la retención de moco y en infección crónica y, subsecuentemente, en la inflamación de las vías aéreas, lo cual resulta perjudicial para los pulmones. La disfunción del gen RTFQ afecta principalmente a las células epiteliales, aunque existen evidencias de que las células inmunes juegan un papel importante (Zhang et al., 2018). El gen CFTR se localiza en 7q31.2. identificándose más de 1900 mutaciones de las cuales, ‘F508del’ (la deleción de 3 bases que codifican fenilalanina en la posición 508) es la más común (Zhang et al., 2018). En la Tabla 1 se describen las seis mutaciones más comunes. Tabla 1. Mutaciones más frecuentes en la FQ con sus defectos y consecuencias (adaptada de Rafeeq y Murad, 2017). Clase de mutación Defecto Resultado Mutación común I Producción de proteínas Ausencia total de la proteína CFTR debido a una terminación temprana del ARNm G542X, W1282X, R553X, 621+G>T II Procesamiento de proteínas Incapacidad de la proteína de localizar el emplazamiento celular correcto debido a modificaciones anormales posttraslacionales F508del, N1303K, A455E III Regulación de proteínas Actividad disminuida de la proteína (canal de cloruro) en respuesta a anormalidades en el plegado en las regiones centrales de la proteína G551D IV Conducción de proteínas Reducción de la frecuencia del flujo de iones y de la apertura del canal, aunque haya generación de corrientes de cloruro estimuladas por el AMPc R117H V Reducción del CFTR funcional disponible Estabilidad comprometida de ARNm y de la proteína madura A455E VI Cantidad normal de CFTR funcional Rotación aumentada debido a anormalidades en la proteína C reactiva Q1412X 12 Las mutaciones de clase I provocan la producción defectuosa de la proteína, lo que lleva a la completa ausencia de la proteína CFTR; ésta se encuentra en el 2-5% de la población mundial, con la excepción de los judíos Ashkenazi, en los que el 60% de los pacientes posee al menos una copia. Las mutaciones de clase II contribuyen a anormalidades en el procesamiento de la proteína, lo que lleva a localizaciones aberrantes. La mutación más común es la F508, responsable del 70% de los casos en EEUU. Aproximadamente, el 50% de los pacientes son homocigóticos y el 90% son heterocigóticos para este alelo. Las mutaciones de clase III contribuyen a problemas en la regulación de las anormalidades de la proteína, lo que lleva a un descenso de la actividad. También incluye otras mutaciones, especialmente en el dominio regulatorio G551D (esta es la mutación III más común). La mutación IV contribuye a anormalidades en la conducción de proteínas, llegando a alterar el flujo iónico. La mutación más común es la R117H. Las mutaciones V llevan a la reducción de la proteína CFTR funcional y las de clase VI causan una sobreproducción de la proteína. Los pacientes que muestran las mutaciones I - III presentan manifestaciones más severas de la enfermedad. Sin embargo, la influencia de modificadores genéticos, como TGF-beta1 (factor de crecimiento transformador beta1) y la unión manosa-lecitina, hacen que no exista una combinación específica de mutaciones. La FQ afecta a varios sistemas corporales, estando la morbi-mortalidad causada principalmente por bronquiectasias, pequeñas obstrucciones de las vías aéreas y discapacidad respiratoria progresiva (O’Grady et al., 2018). Aparte de éstas, ocurren alteraciones en otros órganos como el páncreas (malabsorción), hígado (cirrosis hepática), glándulas sudoríparas (golpe de calor) y otras, como infertilidad. Existen equipos multidisciplinares, que se dedican a desarrollar medicamentos que mejoren el aclaramiento de moco en los pulmones y la subsecuente infección, junto con la mejora de la insuficiencia pancreática y la desnutrición. Gracias al trabajo de estos grupos se han conseguido importantes avances en la calidad de vida y en los resultados clínicos de los pacientes con FQ, que ahora tienen una esperanza de vida superior a 40 años (Cooney et al., 2018). En los últimos años se han ido desarrollando terapias que atacan al defecto de base en la FQ y son efectivas mejorando la función pulmonar y reduciendo las exacerbaciones en este órgano. Así, se está avanzando en la implantación de terapias genéticas con el fin de 13 mejorar la función del gen CFTR y que resultan prometedoras en la modificación de la enfermedad y mejora de la calidad de vida de estos pacientes (Smyth et al., 2014). 2. PAPEL DEL CANAL CFTR EN LA ENFERMEDAD El defecto en el canal CFTR afecta de manera importante al transporte de cloruro y bicarbonato (Larkin et al., 2015). No obstante, la interacción entre CFTR y otros canales iónicos, particularmente el canal epitelial de sodio (ENaC), así como las interacciones de CFTR con vías celulares relacionadas con la inflamación (inflamasoma) pueden ser importantes en la fisiopatología de la FQ. Es importante conocer la fisiopatología de esta enfermedad durante los primeros años de vida, hecho que ha sido recalcado en los últimos estudios, que muestran que sobre los tres años de edad, casi un tercio de los niños con FQ muestran en los TAC obstrucción por moco, bronquiectasia e inflamación producida por los neutrófilos, elastasa de neutrófilos, y episodios de infección recurrentes, como se recoge en la Figura 1 (Ramsey et al., 2014). Figura 1. Efectos de la disfunción CFTR (adaptada de Elborn, 2003). La hipótesis primaria para explicar estas características clínicas es que el aclaramiento mucociliar defectuoso causado por una hidratación anormal de la superficie de las vías aéreas se convierte en el factor más importante en el desarrollo de la enfermedad (Button et al., 2012; Henderson et al., 2014). Esta hipótesis ha sido refutada por hallazgos en 14 algunos modelos de animales, pero no en otros, de manera que en varios modelos animales desarrollados recientemente, como el cerdo y el hurón con FQ, no se ha observado una reabsorción de sodio excesiva (Larkin et al., 2015). Este descubrimiento apoya la hipótesis de que una hidratación adecuada es necesaria en el aclaramiento mucociliar. CFTR también transporta bicarbonato, por lo que la disfunción de la proteína cambia el pH del líquido de la superficie aérea (Button et al., 2012). Esta modificación conlleva importantes repercusiones a nivel de ataque microbiano; de hecho, existe un estudio en el cual se empleó líquido de la superficie de las vías aéreas proveniente de cerdos; los resultados mostraron que la muerte bacteriana era dependiente del pH, por lo que un cambio en éste puede resultar en un sistema inmune deprimido, reduciendo así la función de los péptidos antimicrobianos (Keiser et al., 2015). Por otra parte, el moco existente en las vías aéreas es muy dependiente de la presencia de bicarbonato para su funcionamiento normal, por lo que concentraciones reducidas del anión pueden causar desajustes del espesor del moco, aumentando su viscosidad en las vías aéreas. Por lo tanto, es posible que la disfunción del CFTR resulte en consecuencias en la hidratación, en el aclaramiento mucociliar, en el espesor y la función del moco, daños en la inmunidad innata, y puede también predisponer al aumento de la inflamación celular intrínseca. El impacto de estos problemas asociados a una disfunción del CFTR pueden cambiar con la edad y la progresión de la enfermedad. La heterogeneidad en la evolución puede ser explicada en parte porque algunos tratamientos mejoran los síntomas de este defecto, como es el caso de los fármacos que mejoran el aclaramiento mucociliar o los agentes antimicrobianos (Graeber et al., 2013). La clonación del gen CFTR ha permitido comprender mucho mejor el funcionamiento del aclaramiento mucociliar en la salud y en la enfermedad. Así, entendiendo el proceso de regulación de la hidratación de las vías aéreas y el aclaramiento mucociliar mediante la influencia de las fuerzas osmóticas se permitirá mejorar el pronóstico de un amplio rango de enfermedades pulmonares asociadas con infecciones. Por ejemplo, el consumo de tabaco produce una disfunción en el CFTR, incluso aunque no existan mutaciones y pueden aumentar los síntomas respiratorios, afectando al transporte mucociliar y aumentando el riesgo de padecer bronquitis crónicas (Courville et al., 2014). Todo ello puede ayudar a identificar los factores que influyen en las enfermedades pulmonares, 15 como las enfermedades obstructivas pulmonares y las bronquiectasias, así como a conseguir nuevos tratamientos (Rab et al., 2013). 3. EPIDEMIOLOGÍA Y DEMOGRAFÍA DE LA ENFERMEDAD Los notables progresos que se han logrado con la mejora del aclaramiento mucociliar de las vías aéreas y el control de la infección pulmonar, han conseguido que la FQ deje de ser una enfermedad predominante en niños para convertirse en un desorden de los adultos (Davis, 2015). El número de adultos con FQ continuará aumentando, con casi todas las muertes, en la población adulta (Parkins et al., 2011). Además, en los últimos cinco años, en los países con sistemas sanitarios potentes, ha habido más adultos que niños con FQ. En los países europeos desarrollados, el número de adultos con FQ se prevé que aumente un 70% para el 2025 (Burgel et al., 2015). Sin embargo, en algunos países de Europa con sistemas sanitarios menos desarrollados, la esperanza de vida puede quedarse en la segunda década debido a una falta de acceso al tratamiento (McCormick et al., 2010). La sustancial mejora de la esperanza de vida en los países desarrollados ha sido fruto de la existencia de centros bien organizados y multidisciplinares y del empleo de fármacos efectivos para tratar la infección y mejorar el aclaramiento mucociliar (Conway et al., 2014). Como se ha referido anteriormente, la FQ afecta a varios sistemas corporales y los efectos fenotípicos varían según la edad (Tabla 2). La progresión de la enfermedad requiere de un cuidado multidisciplinar y progresivamente de una mayor especialización. Por tanto, los sistemas de salud tienen el reto de mejorar el cuidado del paciente adulto debido al reciente aumento de enfermos de esta edad. Tanto es el aumento que incluso en varios países los adultos enfermos de FQ son tratados en servicios pediátricos (Burgel et al., 2015). 16 Tabla 2. Aparición de distintos síntomas de la FQ según el avance de la enfermedad (adaptada de Elborn, 2003). 0 - 10 años 10 - 20 años 20 - 35 años > 35 años Vías aéreas Taponamiento de la secreción mucosa y bronquiectasia Bronquiectasia establecida Bronquiectasia establecida con hematosis / neumotórax Fallo pulmonar progresivo / trasplante de pulmón Infecciones predominant es Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus (intermitentemente) y Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa y otras bacterias Gram negativas no fermentadoras, ABPA (Aspergilosis broncopulmonar alérgica) Páncreas Insuficiencia pancreática exocrina Diabetes mellitus relacionada con FQ Hígado Resultados anormales en el funcionamiento del hígado Cirrosis Hipertensión portal (5-10%) Trasplante de hígado Microbiota Meconium ileus Síndrome de obstrucción intestinal distal Sistema reproductivo Ausencia de vas deferens Otros Artropatía, enfermedad articular relacionada con la FQ 4. DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD La FQ se identifica normalmente mediante el cribado a los recién nacidos o durante los primeros años de vida (McCloskey et al., 2000). Las personas que son diagnosticadas después de los 20 años de edad tienen normalmente una mutación asociada con la función residual de CFTR, como por ejemplo Arg117His (también conocida como R117H), como se puede apreciar en la Tabla 3 (Bartlett et al., 2009). Estos individuos pueden tener síntomas de taponamiento respiratorio en la infancia, pero desarrollan bronquiectasias, pancreatitis o presentan infertilidad más adelante. El diagnóstico se realiza mediante el test del sudor y el análisis del ADN (McKone et al., 2015). Los individuos con un diagnóstico tardío tienen una buena supervivencia, lo que 23 aunque la concepción podría ocurrir con un embarazo vigilado resultando en el nacimiento de un niño sano, mientras se mantenga una buena alimentación y un buen estado pulmonar (Cohen-Cymberknoh et al., 2011). 6. MANIFESTACIONES CLÍNICAS POR SISTEMAS 6.1. Intestinales 6.1.1. Insuficiencia pancreática La insuficiencia pancreática se convierte en una de las manifestaciones clínicas que se presentan con mayor frecuencia en pacientes con FQ. Más del 50% de los pacientes presentan signos clínicos de IP durante los primeros días de vida y hasta el 90% los manifiestan dentro del primer año. Por otra parte, es la causa principal de desnutrición y retraso en el crecimiento de estos pacientes. Como es bien sabido, la secreción pancreática es una solución con un volumen elevado de bicarbonato (HCO3-) como respuesta a la estimulación por secretina y colecistoquinina (Olivier et al., 2015). Su función principal consiste en neutralizar el pH ácido producido por las secreciones gástricas y permitir un funcionamiento óptimo de las enzimas pancreáticas. La FQ se caracteriza por una disminución del volumen y la concentración de HCO3- en la secreción pancreática, lo cual da como resultado una secreción retrasada de las enzimas pro-digestivas. Ello ocasiona una sobreactivación de las enzimas pancreáticas, destruyendo las células acinares. Este daño continuado da lugar a la insuficiencia pancreática exocrina (Regard et al., 2018) que se manifiesta por un descenso o ausencia en la producción de enzimas pancreáticas como proteasas, amilasas, lipasas, colipasas y fosfolipasas. Por lo tanto, se origina malabsorción de los lípidos manifestándose clínicamente con dolor abdominal, esteatorrea, flatulencia, diarrea y disminución en la absorción de vitaminas liposolubles. Para que se den estas manifestaciones, la función enzimática del páncreas debe disminuir un 3% de lo normal (McCloskey et al., 2000). Los pacientes que presentan IP se diagnostican de la enfermedad a edades más tempranas y cursan con cuadros clínicos más graves, mientras que aquellos que no manifiestan IP tienen como promedio una esperanza de vida veinte años mayor que los que la presentan (Layer et al., 2019). Y es que los pacientes con FQ que no presentan IP también presentan 24 una función pancreática defectuosa con una baja concentración de bicarbonato, pero con una cantidad suficiente de enzimas que evitan que se produzca esteatorrea. 6.1.2. Reflujo gastroesofágico El reflujo gastroesofágico consiste en el flujo retrógrado del contenido gástrico hacia el esófago. Se trata de una de las manifestaciones más frecuentes de esta enfermedad y ocurre en el 50% de los niños menores de tres meses. Sin embargo, esta manifestación desaparece en su mayoría a los dos años de edad (Cohen-Cymberknoh et al., 2011). En caso de que los síntomas persistan, alcanza los 16 años de edad y es más común en pacientes con co-morbilidades como asma, problemas neurológicos y dolor abdominal (Maqbool y Pauwels, 2017). Los problemas de deglución, regurgitación y el dolor abdominal son comunes en niños pequeños, mientras que la acidez y la regurgitación son más habituales en adolescentes y adultos. Los síntomas pueden dividirse en típicos, como acidez o regurgitación y atípicos, como tos crónica, ronquera, jadeos y asma. Estos pueden agravarse causando esofagitis o esófago de Barrett (Dziekiewicz et al., 2015). 6.1.3. Síndrome de obstrucción intestinal distal El síndrome de obstrucción intestinal distal es una complicación común en la FQ. Se caracteriza por la acumulación de materia fecal en el lumen del intestino junto con moco pegajoso en las paredes terminales del íleo y del ciego. Esta masa se une con fuerza a las criptas y a las vellosidades y es difícil de retirar. En la mayoría de los casos, es una enfermedad permanente que se agrava a veces por la aparición de más materia, lo que explica que los síntomas sean intermitentes (Colombo et al., 2011). Pueden ser agudos, con una obstrucción intestinal, o más comúnmente, subagudos, con dolor abdominal intermitente, acompañado generalmente de distensión abdominal (Hort et al., 2019). La incidencia de obstrucción intestinal completa resulta ser de entre 5-12 episodios en 1000 pacientes infantiles en Europa a lo largo de un año (Houwen et al., 2009). 6.1.4. Meconium ileus 25 El Meconium ileus (MI) suele ser la primera manifestación de la FQ y ocurre aproximadamente en el 20% de pacientes con esta patología. Posee dos formas de manifestarse: simple y compleja. En la simple, el meconium viscoso obstruye físicamente el íleo terminal y el intestino proximal. En la compleja, los segmentos distales del meconium ileus pueden dar lugar a complicaciones como vólvulos prenatales, isquemia, necrosis, atresia intestinal o perforación y extrusión del meconium hacia el perineo. El tiempo que dure la perforación influye en el resultado final (Escobar et al., 2005). Si ocurre rápido en el útero, puede ocurrir la reabsorción de parte del meconium en el perineo, dejando un pequeño número de calcificaciones. Si la necrosis y la perforación ocurren en las asas intestinales, puede darse más fácilmente la peritonitis del meconium. Además, éste podría ser encapsulado parcialmente, ocurriendo una peritonitis gigante cistítica. Tanto la simple como la compleja se presentan con igual frecuencia en pacientes con FQ (Sathe y Houwen, 2017). 6.1.4. Daño hepático La enfermedad hepática puede afectar a niños y adultos con FQ, aunque su progresión y su impacto en la salud puede variar. La prevalencia se sitúa en un 10-30%, con un comienzo de la enfermedad normalmente en la primera década de vida, mientras que la prevalencia de cirrosis en niños es del 5-10%. Se manifiesta normalmente por una pérdida de la función de la proteína CFTR. La bilis se vuelve anormalmente viscosa, queda retenida en el árbol biliar y activa la inflamación y la fibrosis mediante la activación celular. Aunque al principio es localizada, la fibrosis biliar puede progresar a cirrosis. Además, la alteración del metabolismo de los fosfolípidos y la diabetes relacionada con la FQ, pueden causar esteatosis. Por otra parte, debido al metabolismo de fármacos como antibióticos, se puede producir daño hepático, normalmente de tipo idiosincrático, causando un aumento de las enzimas hepáticas o de la bilirrubina (Davison, 2018). Además, los enfermos de FQ pueden presentan enfermedades hepáticas no relacionadas como disfunción hepática, enfermedad autoinmune hepática y enfermedad de Wilson; aunque son menos comunes, pueden darse y tienen tratamiento. No se debe olvidar la posible hepatitis viral, obesidad, uso esporádico de drogas y alcohol como posibles causas para provocar enfermedad hepática (Debray et al., 2017). 26 6.2. Alteraciones en las glándulas sudoríparas Como se ha comentado anteriormente, el CFTR tiene un importante papel en la absorción y secreción de electrolitos y fluidos. En los enfermos de FQ, la disfunción de este gen provoca manifestaciones clínicas importantes. Aunque las tasas de secreción colinérgica de sudor son muy similares en pacientes con FQ y sin ella, la secreción beta-adrenérgica está ausente en la FQ (Quinton, 2007). La incapacidad del conducto para absorber el ión cloruro impide el transporte de sodio y, por lo tanto, la absorción de sales se ve reducida, aumentando los niveles de NaCl, produciendo un sudor anormalmente salado, convirtiéndose en una de las características de la enfermedad (Palma et al., 2014). Aunque en condiciones normales esto no es un problema para estos enfermos, cuando las condiciones son cálidas y húmedas, los pacientes con FQ pueden perder excesivas cantidades de sales y fluidos, causando deshidratación. Además, este aumento del sudor es la base del test cuantitativo de la pilocarpina mediante iontoforesis, que aún se sigue usando con fines diagnósticos. Este test mide la concentración de ión cloruro en el sudor y requiere la introducción iontoforética de pilocarpina (un agonista colinérgico) para estimular la suficiente producción de sudor local para el análisis de cloruro (Salinas et al., 2017). 6.3. Ausencia de conductos deferentes La ausencia bilateral congénita de conductos deferentes ocurre en el 1-2% de los hombres infértiles y se encuentra presente en el 6% de los casos obstructivos de azoospermia. Cerca del 95% de los varones con FQ presentan esta alteración consistente en azoospermia e hipoplasia de vesículas seminales, conductos eyaculadores y epidídimo, por lo que estos pacientes tienen problemas de fertilidad. Las mujeres con FQ parecen no presentar problemas para quedarse embarazadas (Silva de Souza et al., 2017).. 6.4. Enfermedad pulmonar La patología predominante en el pulmón es la inflamación, generada principalmente por un fallo en la eliminación de los patógenos y la generación de un ambiente proinflamatorio local (Regard et al., 2018). Esta se manifiesta en una etapa muy temprana, y sobre un tercio de los enfermos la desarrollan durante los primeros meses. Las bronquiectasias se asocian con concentraciones elevadas de la neutrófilo-elastasa, lo que altera la inmunidad innata, aumenta la producción de mocos, daña péptidos y 27 proteínas de las vías aéreas y daña la matriz extracelular. Esta enzima y otras proteasas derivadas de éstas, como la catepsina S y las metaloproteinasas de la matriz son las responsables de dañar la vía pulmonar y provocar las bronquiectasias (Dios et al., 2016). En estos niños con FQ, las infecciones recurrentes por virus y bacterias como Haemophilus influenzae y Staphylococcus aureus resultan en un daño directo e indirecto como consecuencia de la respuesta inflamatoria debido a la infección pulmonar. A medida que la enfermedad avanza, las bronquiectasias se desarrollan y los enfermos de FQ se vuelven susceptibles a un rango de bacterias Gram-negativas. Estos microorganismos se encuentran comúnmente en el ambiente y solamente se asocian con infecciones en humanos en situaciones donde el huésped se encuentra inmunocomprometido o la integridad del epitelio de éste se encuentra comprometida (Hassett et al., 2009). El microorganismo predominante en las infecciones pulmonares es Pseudomonas aeruginosa, que forma un biofilm en el tejido pulmonar provocando exacerbaciones agudas, como se puede apreciar en la Figura 2. Figura 2. Formación del biofilm de Pseudomonas aeruginosa y su crecimiento en el pulmón en pacientes que presentan FQ (figura adaptada de Hassett et al., 2009). Además de estas especies bacterianas, también se pueden encontrar otras bacterias Gramnegativas, no fermentadoras como Stenotrophomonas maltophilia y Achromobacter spp. Estos microorganismos han adquirido resistencia a los antibióticos que actúan contra las Gram-negativas; por ello, cuando ocurren exacerbaciones de los síntomas, los pacientes necesitan ser tratados por vía intravenosa. Las bacterias del complejo Burkholderia 28 cepacia, en concreto Burkholderia cenocepacia, son patógenos invasores en la FQ y se asocian con una elevada mortalidad. Un control adecuado de la infección ha reducido la transmisión de B. cenocepacia entre pacientes, reduciéndose en la población que presenta FQ (Waters y Smyth, 2015). Aparte de las bacterias Gram-negativas, están aumentando las infecciones por micobacterias ambientales no tuberculosas, en concreto Mycobacterium abscessus y Mycobacterium avium-intracellulare, las cuales son difíciles de tratar porque son muy resistentes a la antibioterapia. Estudios recientes, en los que se han empleado técnicas de secuenciación de la siguiente generación, han identificado un rango mucho mayor de bacterias en las vías aéreas, incluyendo anaerobios estrictos. Estas bacterias pueden ser detectadas en las vías aéreas de los individuos sanos. Aunque no está claro si existen más microorganismos patógenos, algunos estudios en pacientes con FQ sugieren que si existe una gran variedad de microorganismos diferentes en las vías aéreas, la función pulmonar sería mejor que si existiera la colonización por una única especie como P. aeruginosa (Moreno-Sastre et al., 2016). Todo esto sugiere y cuestiona el uso de antibióticos para tratar la FQ, y podría explicar por qué algunos estudios en los que se trató a enfermos recién diagnosticados con profilaxis antibiótica, los casos de infección por P. aeruginosa aumentaron. 7. MANEJO Y CONSIDERACIONES SOBRE LA ENFERMEDAD Los pacientes con FQ presentan varias expresiones fenotípicas basadas en sus genotipos. Por tanto, el tratamiento de atención primaria por parte de los enfermeros especialistas debe ser participativa, individualizada, multidisciplinar y centrada tanto en el cuidado del paciente como de la familia. Los pacientes diagnosticados con FQ deben ser tratados en un centro médico especializado en la materia. Debe existir un cuidado colaborativo con líneas abiertas y frecuentes de comunicación en la atención primaria entre paciente, familia y el centro que reúna a todo el equipo: médicos, trabajadores sociales, trabajadores, enfermeros especialistas y otros. Los objetivos más importantes son mantener un crecimiento normal y el manejo adecuado de la enfermedad pulmonar. Durante los 2-3 meses después del diagnóstico de la enfermedad se deben las siguientes pruebas: radiografía pulmonar, análisis completo de sangre, medida de los niveles de electrolitos, tests de funcionamiento del hígado y de los niveles de vitamina A, D y E, así como enseñar a manejar los síntomas respiratorios (Goetzinger, 2017). 29 7.1. Manejo de los síntomas gastrointestinales La nutrición es el punto central que hay que manejar para conseguir una promoción total de la salud en pacientes con FQ. El enfermero especialista debe enseñar al paciente la importancia de una alimentación apropiada. Por lo tanto, se recomienda una adecuada monitorización del crecimiento desde la infancia hasta la edad adulta, ya que existe una correlación directa entre un crecimiento óptimo en el niño y el peso del adulto con muchas probabilidades de tener mejor función pulmonar en esta enfermedad (Yen et al., 2013). Se ha demostrado que el aumento de la longevidad en estos pacientes se debe, en parte, al aumento del apoyo nutricional. Una atención nutricional especializada por parte del enfermero empezando desde la infancia, es esencial, porque este es un período de crecimiento remarcable con demandas metabólicas importantes (Kim et al., 2004). La Fundación de la FQ recomienda que sobre los dos años de edad los niños con FQ alcancen al menos el percentil 50. Además, un mantenimiento del peso con la edad en el percentil 10 o mayor para preescolares con FQ se asocia con mejor funcionamiento pulmonar y aumenta la supervivencia. Para el manejo de la insuficiencia pancreática y los déficits nutricionales, es necesario un tratamiento oral sustitutivo enzimático y vitamínico, así como un control glucémico exógeno y una alimentación enteral adecuada (Singh y Schwarzenberg, 2017). Así, aquellos niños con genotipo o evidencias objetivas de insuficiencia pancreática, como niveles de elastasa menores de 200 μg/g o síntomas evidentes de malabsorción, deben empezar terapia enzimática de reemplazo y de vitaminas específicas de la FQ tan pronto como se detecte en la prueba del cloro (Borowitz et al., 2009). Algunos factores pueden impedir alcanzar los objetivos nutricionales adecuados en pacientes con FQ. Por lo tanto, cuando la nutrición no es suficiente para asegurar un funcionamiento nutricional óptimo, el enfermero, en colaboración con el equipo de FQ, el paciente y la familia, deben considerar una forma de alimentación enteral mediante tubo que puede proporcionar los nutrientes necesarios. Esto puede incluir la sonda nasogástrica, nasoyeyunal, gastrostomía o gastrostomía endoscópica percutánea. La educación nutricional es primordial para conseguir un crecimiento óptimo y un mantenimiento de peso, incluyendo la alimentación a través de sonda, que debe ser aplicada por el enfermero a lo largo de toda la vida del paciente (White et al., 2013). Con un correcto manejo nutricional empleando suplementación, terapia enzimática sustitutiva, 30 comida saludable en general, consejo nutricional, mantenimiento del peso y vigilancia de la diabetes, estos pacientes pueden combatir con éxito la enfermedad (Borowitz et al., 2009). 7.2. Inmunización Una parte esencial del plan de salud es la inmunización, para conseguir mejorar la salud en general, mantener y prevenir. Reducir el riesgo de infecciones en pacientes con FQ puede prevenir exacerbaciones pulmonares, hospitalizaciones, infecciones sistémicas, ingresos en la UCI y posible ventilación mecánica. El enfermero encargado debe estar al tanto de la inmunización del paciente y vacunarlo anualmente contra el virus Influenza (administrada en menores de 6 meses) en los pacientes con FQ, miembros de la familia y personal sanitario (Borowitz et al., 2009). Además, la asociación de FQ recomienda que los niños entre 2 y 5 años con FQ reciban la primera dosis de la vacuna polisacarídica del neumococo (i.e., PPSV23), 8 semanas después de la vacuna conjugada (PCV13; Prevnar, Wyeth, Madison, NJ) (Borowitz et al., 2009). 7.3. Manejo de la enfermedad pulmonar Un aspecto del manejo de la FQ por parte del enfermero incluye optimizar la función pulmonar del paciente usando broncodilatadores, mucolíticos, antiinfecciosos y antiinflamatorios. Un moco espeso y la existencia de problemas en las vías aéreas son los síntomas más comunes asociados a la FQ. Las exacerbaciones pulmonares se observan a menudo en casos agudos y es importante controlarlas. En la enfermedad pulmonar es importante atacar la infección respiratoria para actuar contra Pseudomonas aeruginosa. El daño pulmonar secundario a la infección crónica determina la morbi-mortalidad en el paciente con FQ. Los individuos con FQ son altamente susceptibles a la infección bacteriana en el tracto respiratorio y es necesaria una antibioterapia intensiva para mantener la función pulmonar y la calidad de vida, con el fin de reducir las exacerbaciones en pacientes afectados. En este sentido, la antibioterapia busca erradicar Pseudomonas aeruginosa, el patógeno mayoritario en la FQ. Después de mejorar el tratamiento de la infección por esta bacteria y del tratamiento crónico de esta infección, la esperanza media de vida ha aumentado en las últimas décadas. En 1969, los enfermos de FQ en los países industrializados tenían una esperanza media de vida de 14 años, mientras que en 2010, ésta superaba los 40 años. Desgraciadamente, este desarrollo positivo no se ha observado en todos los países del 31 mundo y la edad media de muerte sigue siendo 20-30 años. El genotipo de la FQ, las diferentes maneras de tratar la enfermedad, entre ellas la infección, la selección de antibióticos y el modo de acción, así como los recursos del país y del propio paciente influyen en el desarrollo de la enfermedad (McCormick et al., 2010). Se cree que las vías aéreas de pacientes con FQ no se infectan en el nacimiento y que son las bacterias patogénicas oportunistas las que entran en las vías aéreas procedentes del medio ambiente. Estas bacterias son capaces de establecerse eventualmente de manera crónica en algunas personas debido a una inmunidad innata insuficiente (Dios et al., 2016) y se asocia con una respuesta inflamatoria. Como ya se ha comentado, las bacterias más comunes en la enfermedad son Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter xylosoxidans y Burkholderia. Recientes estudios microbiológicos han demostrado que la infección de las vías aéreas por estos microorganismos es más complicada que lo que se aprecia normalmente en los métodos de cultivo, como se detallará más adelante. Aunque se cree que la mayoría de estas bacterias son patogénicas, nuestro conocimiento sobre cómo tratar cada una de ellas aún sigue incompleto, siendo el más conocido el de Pseudomonas aeruginosa. Esta bacteria penetra en las vías aéreas inferiores presumiblemente mediante inhalación y puede infectar transitoriamente las vías aéreas en algunos pacientes con FQ (esto ocurre en un rango del 10-50%). Parece claro que algunos pacientes con esta enfermedad son capaces de aclarar el patógeno espontáneamente, presentando el resultado de los cultivos negativo (Döring et al., 2012). Sin embargo, el patógeno va a persistir o va a ser recurrente y se va a desarrollar eventualmente en una infección crónica, que se define como la presencia de colonias positivas repetidas y de anticuerpos positivos contra el patógeno (Döring et al., 2004). En este sentido, la definición de Leeds (Lee et al., 2003) clasifica a los pacientes en 4 grupos según el resultado del cultivo de las vías aéreas obtenido en los últimos 12 meses: “Infección crónica”, que se refiere a pacientes que han tenido más de un 50% de colonias positivas en los últimos 12 meses; “infección intermitente”, referida a pacientes con menos de un 50% de colonias positivas en los últimos 12 meses; “libre de la bacteria”, cuando los pacientes no presentan la bacteria en los 12 meses previos, a pesar de una historia previa de colonización con Pseudomonas aeruginosa. Finalmente, “Nunca infectado”, se refiere a pacientes en los que nunca se ha encontrado la bacteria (Lee et al., 2003). 32 La infección crónica resulta en una respuesta inflamatoria prolongada, que se cree que causa daño en el tejido pulmonar, llevando a una pérdida de la función pulmonar. Hay bastante evidencia que indica que la erradicación temprana y la prevención de la infección crónica se asocia con un beneficio clínico. De forma general, se ha observado que en pacientes jóvenes con FQ que no presentan infección por Pseudomonas aeruginosa y aquellos que siguen el tratamiento de erradicación, han preservado la función pulmonar (por espirometría), en contraste con el descenso de la función pulmonar en aquellos que presentan infección crónica (Kozlowska et al., 2008). Los pacientes con FQ presentan exacerbaciones recurrentes de la enfermedad, que son episodios en los que hay un aumento en los síntomas de las infecciones crónicas pulmonares, particularmente tos y producción de esputo. Se asocian con fatiga respiratoria, reducción de la tolerancia al ejercicio y síntomas sistémicos asociados con una fase aguda inflamatoria. 8. TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO El tratamiento de la enfermedad abarca el uso de fármacos para tratar tanto las causas como los síntomas. Las dianas del tratamiento de los síntomas incluyen: 8.1. Aparato respiratorio El manejo de la enfermedad respiratoria siempre ha sido fundamental en el tratamiento de la enfermedad ya que el fallo respiratorio provocado por la infección constituye la segunda causa de muerte por esta enfermedad.  Tratamiento antibiótico oral e inhalado En el caso de las exacerbaciones pulmonares, los antibióticos se suelen administrar de forma intravenosa, mientras que para tratamientos prolongados se emplean inhaladores o fármacos por vía oral (Döring et al., 2012). Las fluoroquinolonas han demostrado eficacia como tratamiento antibiótico oral; entre ellas destacan ciprofloxacino y levofloxacino. Además, tobramicina (inhalatoria) y amikacina (intravenosa) han demostrado su efectividad en la prevención de las exacerbaciones pulmonares asociadas a las infecciones del tracto respiratorio, especialmente en aquellas causadas por Pseudomonas aeruginosa. 39 seguro y bien tolerado, a pesar del efecto adverso más importante que es la producción de tos, mostrando un perfil adecuado en estudios en fase III.  Ciprofloxacino Se trata de una fluoroquinolona que afecta a la función de la enzima girasa en bacterias, y ha sido ampliamente empleado por vía oral en pacientes con FQ y otras patologías. Se ha demostrado que la aerosolización de liposomas de este fármaco en cerdos guinea previenen la muerte de estos animales por Legionella pneumophila y Francisella tularensis, sugiriendo que la liberación de estos fármacos al tracto respiratorio inferior podría ser efectiva para los pacientes con FQ (Hamblin et al., 2014). Existen dos tipos de formulaciones liposomales de ciprofloxacino: Lipoquin® (Aradigm, Inc., Hayward, CA), con un 99% de ciprofloxacino encapsulado, y otra denominada Pulmaquin® (Aradigm, Inc., Hayward, CA), con un 70% de ciprofloxacino encapsulado y un 30% no encapsulado. Ambas han demostrado ser prometedoras para el tratamiento vía inhalatoria de la FQ (Cipolla et al., 2016). Como el ciprofloxacino no encapsulado es poco soluble a pH 6.0, se preparan dos viales para esta formulación: uno con el encapsulado y otro con el no encapsulado. Figura 6. Formulación de Pulmaquin® (adaptado de Cipolla et al., 2016). Estas formulaciones han demostrado ser eficaces para tratar infecciones pulmonares causadas por Yersinia pestis y la fiebre Q. Ambas soluciones fueron aerosolizadas convenientemente, manteniendo la integridad del liposoma ya que la formación de 40 cristales del fármaco a largo plazo podría reducir su estabilidad mecánica (Cipolla et al., 2016).  Galio - Gentamicina El galio, un metal parecido al hierro, ha demostrado inhibir de alguna manera el crecimiento bacteriano de bacterias como Pseudomonas aeruginosa. Los estudios in vitro han demostrado que una formulación conjunta de galio-gentamicina fue capaz de eliminar los biofilms de esta bacteria y bloqueó la comunicación bacteriana (quorum sensing). Empleando concentraciones muy bajas de gentamicina (0.94 mg/L), esta demostró ser más eficaz que la que contenía el antibiótico en solitario. Por tanto, el galio sigue siendo investigado por su potencial para el tratamiento de infecciones bacterianas en la FQ (Halwani et al., 2008).  Lumacaftor e ivacaftor Otro enfoque diferente en el tratamiento de esta enfermedad se basa en tratar la causa fundamental de la enfermedad, dirigiéndose hacia la disfunción de la proteína CFTR (Zhang et al., 2018). El tratamiento consiste básicamente en dos aspectos: corrección de los defectos celulares y potenciar que el canal se abra más. Para ello, se propuso la combinación de dos fármacos con diferentes mecanismos de acción que pueden ser aplicados simultáneamente en el tratamiento de la FQ. Uno de los fármacos es el lumacaftor (Luma), el cual ha demostrado corregir el fenotipo Phe508del del gen CFTR aumentando la cantidad de células de superficie (Griesenbach y Alton, 2015). El otro fármaco es ivacaftor (Iva), un potenciador del CFTR que aumenta la probabilidad de que se abran los canales ya que estudios in vitro han demostrado que potencia el fenotipo Phe508del del gen CFTR. Así, la combinación de ambos fármacos ha demostrado asociarse con un aumento del transporte del ión cloruro que no puede ser logrado con cada fármaco en solitario. Por ello, la nanoencapsulación de ambos demostró ser interesante para su administración vía pulmonar, ya que la liberación directa a pulmón puede aumentar su eficacia y reducir sus efectos adversos (Garbuzenko et al., 2019). 10. CONCLUSIONES  Actualmente, los tratamientos para la FQ se basan en atender los aspectos sintomatológicos. Un aspecto interesante para el futuro sería el desarrollar fármacos que traten el defecto en el gen CFTR. 41  La vía pulmonar es idónea para la administración de fármacos por su elevada área superficial (100 m2), su extensa vasculatura y, por tanto, su elevada absorción. Sin embargo, el aclaramiento por parte de los macrófagos hace que a veces no todas las formulaciones puedan administrarse por esta vía.  Los liposomas permiten la incorporación de fármacos lipofílicos e hidrofílicos, pudiendo fabricarse éstos a partir de lípidos biocompatibles, similares a los que componen la membrana y el surfactante pulmonar. Además, las partículas lipídicas pueden ser aerosolizadas fácilmente y son bien captadas por los pulmones, permitiendo una retención más prolongada.  Entre los sistemas nanoparticulares existentes para la liberación de fármacos vía pulmonar para el tratamiento de la FQ, la mayoría se componen de un único fármaco, que suelen ser un antibiótico. Se propone en un futuro la coencapsulación de fármacos que permita tratar otro tipo de sintomatología y los defectos en el gen CFTR. 11. BIBLIOGRAFÍA Alton, EWFW, Armstrong DK, Ashby D, Bayfield KJ, Bilton D, Bloomfield EV, Boyd AC. 2015. 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Caracterización físico-química de los liposomas extruidos con diferentes fármacos.......................................................................................................................... 90 Tabla 4. Propiedades físico-químicas de los fármacos seleccionados. .......................... 92 Tabla 5. Propiedades físico-químicas de los lotes de TEO antes y después de la extrusión. Se prepararon usando diferentes cantidades de desoxicolato sódico (Deo-Na) ............. 93 Tabla 6. Parámetros de caracterización y PdE% de ambos fármacos encapsulados por TLE y por el método del pH transmembrana. .............................................................. 102 56 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Concepto y métodos convencionales de elaboración de liposomas Los liposomas son considerados el tipo de sistemas nanoparticulares más estudiado como transportadores de fármacos y han ganado importancia como sistemas trascendentales en la liberación de éstos. Se definen globalmente como vesículas constituidas por materiales lipídicos como fosfolípidos, que se encuentran dispersas en una fase acuosa, formándose una o más bicapas concéntricas con una estructura similar a la membrana celular, y que separan compartimentos acuosos, como se muestra en la Figura 1 (Eloy et al., 2014; Huang et al., 2014). Figura 1. Esquema de un liposoma y su composición. (https://www.wikiwand.com/es/ Liposoma). En función del número de bicapas y el tamaño de las vesículas, se clasifican los liposomas en: multilaminares (MLV), unilaminares pequeños (SUV) y unilaminares grandes (LUV). En la Figura 2 se recoge una imagen de cada uno de ellos. 57 Figura 2. Tipos de liposomas según tamaños y número de bicapas. MLV (Vesículas multilaminares), LUV (vesículas unilaminares) y SUV (pequeñas vesículas unilaminares). (https://biopharma.co.uk/blog/2016/11/16/why-you-should-chose-extrusion-for-your-liposomal- enhancement/). Debido a su conformación especial, los liposomas aportan grandes ventajas como sistemas de liberación de fármacos. En primer lugar, la capacidad de las vesículas para separar la fase interna de la externa puede mejorar la estabilidad de los fármacos encapsulados (Oliveira et al., 2014). En segundo lugar, cuando éstos son encapsulados en los liposomas, los que poseen baja solubilidad en fase acuosa han mostrado mejorar su biodisponibilidad, además de lograr una liberación sostenida o controlada tras la encapsulación (Swaminathan y Ehrhardt, 2012). Adicionalmente, los liposomas, que son compuestos biodegradables, poseen una excelente afinidad celular, lo que permite mejorar la distribución in vivo del fármaco, optimizando así el índice terapéutico de ciertas moléculas (Mohammed et al., 2004; Fan y Zhang, 2013; Huang et al., 2014). Por otra parte, ciertos ligandos pueden modificar la superficie de los liposomas, con el objetivo de alterar sus características y el comportamiento biológico del producto final (Abra et al., 2002). Existen en la actualidad una gran variedad de métodos de preparación de liposomas, cada uno de ellos con sus características propias y sus ventajas. La óptima selección de unos métodos adecuados junto con las novedosas técnicas disponibles, hace que las nuevas preparaciones puedan ser preparadas fácil y eficazmente (Huang et al., 2014). A continuación, se describirán brevemente los métodos más empleados en la elaboración de liposomas. 58 1.1.1. Métodos convencionales para preparar vesículas gigantes unilaminares (GUV) 1.1.1.1. Hidratación de una película fosfolipídica Este método consiste en depositar los fosfolípidos desde una solución contenida en un solvente orgánico, como cloroformo o etanol, sobre un sustrato. La película, que está formada por bicapas lipídicas apiladas, se hidrata durante dos días en ausencia de flujo hidrodinámico obteniéndose una dispersión acuosa de GUVs (Figura 3). Aunque una fracción importante de la preparación también se compone de vesículas multilaminares (MLV), este método es el más adecuado para obtener GUV con fosfolípidos cargados (Kuroiwa et al., 2009). Figura 3. Vesículas gigantes unilaminares (https://www.x-mol.com/paper/5666911). 1.1.1.2. Electroformación En este método, la bicapa lipídica se deposita en unos electrodos y es hidratada posteriormente durante un par de horas en presencia de un campo eléctrico. Aunque las GUV son formadas por corrientes alternas y directas, la corriente continua no es la de elección, ya que provoca la formación de burbujas debido a la electrolisis del agua (Rodríguez et al., 2005). En la Figura 4 se recoge un esquema del proceso. 59 Figura 4. Representación esquemática de la formación de GUVs en una estructura tipo “sandwich” (adaptada de Li et al., 2016). ITO: cristal de óxido de indio, PMDs: cristales de polidimetilsiloxano. 1.1.1.3. Coalescencia de vesículas pequeñas Otros métodos válidos para obtener GUV, aunque no se usan muy frecuentemente, se basan en la coalescencia de pequeñas vesículas que se mantienen en dispersión durante varios días, y que resultan finalmente en la formación de GUV (Figura 5). La fusión de vesículas unilaminares grandes (LUV) puede ser inducida por diferentes métodos, incluyendo ciclos de congelación-descongelación en soluciones concentradas de electrolitos, usando fosfolípidos con carga opuesta, añadiendo polietilenglicol, péptidos fusogénicos o incorporando cationes divalentes a fosfolípidos cargados negativamente (Knorr et al., 2018). Figura 5. Formación de GUVs por la unión de vesículas más pequeñas. (http://repository. icesi.edu.co/biblioteca_digital/bitstream/10906/83510/1/T01258.pdf.) 60 1.1.2. Métodos convencionales para preparar vesículas multilaminares (MLV) 1.1.2.1. Hidratación en capa fina (TLE) Las MLV se forman cuando una bicapa lipídica de fosfolípidos empaquetados, depositada sobre un sustrato, que puede ser el fondo de un matraz de fondo redondo, se rehidrata bajo la influencia de fuertes flujos hidrodinámicos durante un par de horas (Figura 6). La dispersión de vesículas MLV resultante es heterogénea tanto en tamaño como en laminaridad (Villasmil-Sánchez et al., 2013). Figura 6. Método de evaporación en capa fina (TLE). https://www.omniascience.com/books/. 1.1.2.2. Método del solvente esférico Consiste en mezclar vigorosamente una fase orgánica que contiene fosfolípidos y una fase acuosa durante una hora a vacío, formando una emulsión oleosa-acuosa que contiene pequeñas esferas de lípidos que contienen solventes. Posteriormente, se retira la fase orgánica mediante evaporación, lo que resulta en la conversión de las esferas en vesículas MLV con una estrecha distribución de tamaños (Kim et al., 1985). 1.1.2.3. Método de hidratación de proliposomas Los proliposomas son estructuras granulares estables, secas y “con flujo libre” que contienen el fosfolípido y el denominado portador/fármaco, y que forman MLV cuando se dispersan en la fase acuosa (Figura 7). Son estructuras estables que previenen de la inestabilidad del liposoma o de la salida de fármaco durante el almacenamiento. Pueden ser hidratados para formar liposomas añadiendo un solvente acuoso a la hora de usarlos (Ye et al., 2018). 61 Figura 7. Proceso de elaboración de proliposomas. (a) Solución lipídica con etanol. (b) Solución de lípidos-etanol con claritromicina. (c) Suspensión lipídica de claritromicina en combinación con un transportador. (d) Secado en un paso. (e) Proliposoma. (f) Liposoma reconstituido. (MAN: manitol; TOB: tobramicina; CLA: claritromicina). (Adaptada de Ye et al., 2018). 1.1.3. Métodos convencionales para preparar vesículas unilaminares pequeñas y grandes (SUV y LUV) 1.1.3.1. Evaporación en fase reversa Este método es similar al del solvente esférico que se usa para preparar MLV. Es análogo al método TLE, pero en él se forman agregados en su preparación debido al uso de polielectrolitos, que hay que eliminar. La evaporación en fase reversa también incluye la hidratación de los fosfolípidos disueltos en la fase orgánica mediante la adición de agua, a la vez que se agita vigorosamente. En este caso se forma una emulsión acuosa en una suspensión oleosa con LUVs (Figura 8). Algunos autores han demostrado que menores concentraciones de fosfolípidos en la dispersión acuosa llevaron a mayor cantidad de vesículas LUV con respecto a las MLV (Shohda et al., 2015). 62 Figura 8. Representación esquemática de la técnica de evaporación en fase reversa (1) Disolución de los componentes lipídicos en solvente orgánico. (2) Adición de la fase acuosa, que contiene el fármaco. (3) Sonicación hasta obtener una emulsión de color blanco y de aspecto lechoso, correspondiente a la formación de micelas invertidas. (4) Eliminación del solvente orgánico con ayuda de un rotavapor. (5) Formación del gel. (6) Colapso del gel y formación de la dispersión de liposomas. 1.1.3.2. Inyección de un solvente orgánico con fosfolípidos en una fase acuosa Este método consiste en inyectar un solvente orgánico (etanol o éter dietílico) en el cual se encuentran los fosfolípidos disueltos en una fase acuosa. Al inyectar etanol, se mezcla este solvente con el agua y la mezcla se diluye hasta alcanzar la concentración crítica, lo que fuerza al autoensamblaje de los fosfolípidos en la fase acuosa formándose SUV. Por el contrario, si se inyecta una solución de éter y fosfolípidos en agua, la formación de SUV resulta de la evaporación de éter. Se ha demostrado que el aumento en la concentración de fosfolípidos en el solvente orgánico conlleva un aumento del tamaño, polidispersión y laminaridad de los liposomas finales (Zhang et al., 2019). 1.1.3.3. Diálisis del detergente La diálisis del detergente, usada comúnmente para preparar LUV, fue propuesta en primer lugar con el objetivo de reconstituir proteínas integrales de membrana en las bicapas fosfolipídicas. En este método, los fosfolípidos son solubilizados por micelas de detergente en una fase acuosa. Posteriormente, se retira el detergente mediante diálisis, 63 resultando en la coalescencia de los fosfolípidos que son ricos en micelas, formando LUV. También pueden emplearse técnicas cromatográficas para retirar el detergente (Hildebrand et al., 2003). 1.1.3.4. Reducción de la laminaridad y el tamaño de las MLV Como la formación espontánea de vesículas MLV se consigue fácilmente, se emplean técnicas como la prensa francesa, sonicación, homogeneización y la extrusión de la membrana para convertir MLV en SUV y LUV. En la sonicación, las ondas ultrasónicas destruyen las MLV para formar vesículas con un tamaño aproximado de 30-50 nm. Sin embargo, se consiguen volúmenes pequeños de SUV con una elevada polidispersión y se puede degradar tanto el fosfolípido como el fármaco encapsulado, lo que limita el uso de este equipo para reducir el tamaño (Taladrid et al., 2017). La técnica de la prensa francesa (French Press) consiste en extruir dispersiones de vesículas MLV a elevadas presiones a través de un orificio de dimensiones reducidas, lo que da lugar a la formación de SUV. A pesar de ello, los liposomas resultantes son de mayor tamaño que los obtenidos por la sonicación de vesículas MLV (Marasini et al., 2017). La homogeneización se emplea normalmente para reducir el tamaño y la laminaridad de los lotes preparados a nivel industrial. Durante el proceso, la formulación de liposomas es bombeada de forma continua a través de un orificio y colisiona con un dispositivo de acero en la pared del homogeneizador a presiones muy elevadas para reducir el tamaño de los liposomas. No obstante, el principal problema de este método es el uso de presiones muy elevadas (Pando et al., 2013). El método más empleado para formar SUV y LUV a partir de MLV es la extrusión a través de membrana, empleando para ello un extrusor, como el que se recoge en la Figura 9. En este método, se extruye una dispersión de MLV varias veces a través de poros cilíndricos uniformes en una membrana de policarbonato, dando lugar a vesículas pequeñas. El tamaño medio de las vesículas obtenidas por extrusión disminuye a medida que aumenta la presión transmembrana y el número de ciclos. Sin embargo, el tamaño medio depende mucho del tamaño del poro de la membrana (Ghosh et al., 2019). 64 Figura 9. Imagen del extrusor empleado en nuestro grupo de investigación Lipex® Thermobarrel. 1.2. Método de gradiente transmembrana El método tradicional de elaboración de liposomas más empleado es el de evaporación en capa fina (TLE). Tiene el inconveniente de que conlleva la aplicación de temperaturas y condiciones extremas, que pueden afectar a moléculas sensibles como las proteínas. El método que se describe a continuación, denominado método del gradiente transmembrana ofrece ciertas posibilidades que pueden evitar parcial o totalmente estas limitaciones (Bi et al., 2019). La encapsulación remota / activa mediante el método transmembrana es uno de los métodos más eficaces para lograr una elevada concentración de fármaco dentro del liposoma. Para que la encapsulación sea efectiva, el fármaco debe tener ciertas características estructurales que le permitan permear y difundir a través de la bicapa lipídica con el fin de almacenarse en el liposoma y difundir hacia el interior de las vesículas (Zucker et al., 2009). Así, se requiere que las moléculas tengan un log P a pH 7 en el rango -2.5 a 2.0, un pKa ≤ 11 para una base anfipática débil o un pKa > 3 para un ácido débil anfipático (Zucker et al., 2009). Indicado, por tanto, para bases o ácidos débiles anfipáticos, este método se basa en el intercambio de protones (H+) entre el interior del liposoma y el medio externo, que suele ser una solución tampón. El proceso se basa en la presencia del catión NH4+ en el interior de la vesícula procedente de una sal de amonio, que se disocia en un H+ y NH3. Esta disociación depende del pH, de manera que cuanto mayor sea el gradiente de pH, mayor es la disociación del anión NH4+. Además, el NH3 resultante de la disociación atraviesa con facilidad la bicapa lipídica debido a su elevado valor de coeficiente de permeabilidad. En la Figura 10 se recoge un esquema del mecanismo general de generación del gradiente 71 con el hierro, puede sustituirlo e inhibir los procesos que dependen de éste. Sin embargo, también ha demostrado una elevada toxicidad en solitario. Por otra parte, los liposomas, como sistemas transportadores de fármacos, tienen la capacidad de mejorar la terapia antibiótica, reduciendo su toxicidad, mejorando la acción del fármaco y aumentando la eficacia bacteriana, ya que son capaces de fusionarse con la membrana de la bacteria (Zhou et al., 2014). La posibilidad de co-encapsulación de ambos compuestos referidos anteriormente (gentamicina y galio) en liposomas ofrecería una nueva alternativa para controlar múltiples factores de la enfermedad. Así, la formulación demostró ser estable y se concluyó en el estudio que utilizar liposomas como sistemas transportadores de dos fármacos optimizó la actividad antimicrobiana de gentamicina y redujo la toxicidad del galio, previniendo la formación del biofilm bacteriano y reduciendo la resistencia bacteriana, la cual está asociada con la infección pulmonar crónica en pacientes con FQ. 1.3. Fármacos en estudio 1.3.1. Teofilina Ha sido el broncodilatador más usado en las últimas décadas debido, entre otros aspectos, a su bajo coste. Alcaloide de la familia metilxantina, teofilina (TEO) es la 1,3 dimetilxantina (Figura 11). Figura 11. Estructura química de la teofilina. Se presenta como polvo cristalino blanco, inodoro. Estable al aire. Fácilmente soluble en soluciones de hidróxidos alcalinos y amoníaco; moderadamente soluble en alcohol, cloroformo y éter, y poco soluble en agua. La solubilidad en agua es 7.36 mg/mL a 25 ºC y se incrementa hasta 11.2 mg/mL con el aumento de la temperatura (Viridén et al., 2011). 72 Es un compuesto que presenta polimorfismo. Se han identificado cuatro formas diferentes de TEO anhidra; la forma tipo II es la más utilizada en las preparaciones farmacéuticas, debido a que posee una estabilidad superior a temperatura ambiente. Esta forma cristalina se caracteriza por la presencia de un enlace de hidrógeno entre nitrógeno e hidrógeno y dos enlaces entre C, H y O formando una estructura de bicapa. Sin embargo, cuando las condiciones de almacenamiento son de gran humedad o durante la granulación húmeda, la molécula de TEO sufre una dimerización en presencia de agua para formar un canal hidratado monocíclico. Esto lleva a cambios en las características físico-químicas del fármaco y en parámetros como estabilidad, biodisponibilidad y eficacia clínica (Korang- Yeboah et al., 2016). Presenta una rápida absorción tras su administración oral, alcanzándose los valores de Cmax a las 1-2 horas en las formulaciones de liberación inmediata, y de 4-9 h para los preparados retard. Por vía i.v. es efectiva en unos minutos. Por vía respiratoria ha demostrado ser irritante e inefectiva (Viridén et al., 2011). Presenta metabolismo hepático y posterior excreción urinaria, con una semivida de eliminación de 6-12 horas. Es un fármaco proclive a soportar numerosas fuentes de variabilidad, dependientes de la edad, peso, presencia de enfermedades, altura, tipo de alimentación, etc. Su intervalo terapéutico de concentración plasmática se encuentra entre 10 y 20 µg/mL, aunque generalmente manteniendo los valores en 10-15 µg/mL se consigue el efecto terapéutico. Si se superan los 20 µg/mL no aumenta prácticamente la acción broncodilatadora, pero sí aparecen efectos tóxicos cardiacos y nerviosos (Barnes, 2013). 1.3.2. Ciprofloxacino Es una fluoroquinolona de nueva generación relacionada estructuralmente con el ácido nalidíxico. El mecanismo primario de acción es la inhibición de la ADN girasa. Se presenta como polvo cristalino amarillo pálido. Químicamente es un ácido (Figura 12), soluble en ácido acético diluido, muy poco soluble en alcohol y cloruro de metileno, y prácticamente insoluble en agua (Cipolla et al., 2016). Con el fin de mejorar sus propiedades de solubilidad, se comercializa en forma de su sal clorhidrato, alcanzando valores de solubilidad en agua de 1.35 mg/mL. 73 Figura 12. Estructura química de ciprofloxacino. CIP tiene un ICM90 ≤ 1 mg/mL (lo que indica susceptibilidad) frente a todas las especies de enterobacterias, excepto algunas especies del género Providencia. Pseudomonas aeruginosa ha demostrado ser susceptible en un rango 0.12-1 mg/mL, si bien es cierto que este fármaco es menos activo para otras especies de Pseudomonas, requiriendo un intervalo superior, de 0.25- 16 mg/mL (De Smet et al., 2009). Tras la administración oral en dosis únicas (50-1000 mg), se obtienen Cmax de 0.28-5.92 mg/mL) a las 0.5-2 horas. La biodisponibilidad de CIP por vía oral es de 69-85%. Las concentraciones séricas aumentan en proporción a la dosis administrada dentro del rango terapéutico. La comida no ejerce un efecto significativo en la farmacocinética del ciprofloxacino, salvo que retrasa la velocidad de absorción. Su farmacocinética se caracteriza por ajustarse a un modelo tricompartimental: uno central y dos periféricos (rápido y lento) (Principi y Espósito, 2015). La farmacocinética del ciprofloxacino no se ve afectada normalmente ni por la edad ni por la presencia de enfermedades como la FQ. Sin embargo, las concentraciones séricas tienden a ser mayores en pacientes de edad avanzada, posiblemente por una disminución de la función renal o cambios en el volumen de distribución (Cios et al., 2014). 1.4. Hipótesis y objetivos En base a los antecedentes revisados anteriormente en lo referente a la posibilidad de coencapsular TEO y CIP en una única formulación de liposomas empleando el método transmembrana, por sus peculiaridades de atrapar fármacos de diferente naturaleza ácida o básica, se plantea como OBJETIVO GENERAL la determinación de que el método transmembrana es el más adecuado para la encapsulación de TEO y CIP, evitando el uso de condiciones extremas que podrían afectar a las características físico-químicas de las vesículas y a la encapsulación de los fármacos. 74 Para ello, se proponen los siguientes objetivos parciales: 1. Poner en evidencia la generación del gradiente de iones transmembrana mediante la aplicación de técnicas de variación de la conductividad entre medio externo e interno y empleando una metodología colorimétrica que permitirá apreciar el cambio de color en las soluciones de liposomas, utilizando azul de bromotimol como indicador de pH. 2. Valorar la influencia de ciertos parámetros en el método transmembrana, como las características físico-químicas de diferentes fármacos y el efecto de la deformabilidad en el éxito del método. 3. Proceder a la co-encapsulación de TEO y CIP una vez puesto a punto el método para los fármacos por separado con el fin de comprobar que es adecuado para coencapsular los dos conjuntamente. 4. Estudiar el efecto de las sales de amonio en la solubilidad de los dos fármacos, empleando cuatro sales diferentes y estudiando su efecto en la encapsulación de los fármacos. 5. Evaluar la influencia de la concentración de los fármacos y la composición del medio externo a la hora de realizar el proceso de diálisis, sobre el atrapamiento de los fármacos y las características fisicoquímicas de las vesículas resultantes. 6. Llevar a cabo un análisis comparativo del método desarrollado con el método convencional de evaporación en capa fina (TLE), con el fin de analizar las ventajas que el método propuesto ofrece. 75 2. PARTE EXPERIMENTAL Los materiales y equipos empleados en el presente capítulo se encuentran detallados en el Índice de Materiales e Índice de Equipamiento de la presente Memoria. 2.1. Productos y reactivos Cloruro de sodio (NaCl), teofilina (TEO), clorhidrato de metformina (MET) y acetazolamida (ACZ) fueron adquiridos en Acofarma (España). Acetonitrilo (ACN), cloroformo, metanol, etanol, ácido 2-[4(2-hidroxietil)-1-piperacinil] etanosulfónico (Hepes) y acetato amónico se obtuvieron de Panreac Química (España). L-α fosfatidilcolina de la yema de huevo (PC), colesterol (CH), desoxicolato sódico (Deo- Na), citrato amónico, sulfato amónico, fosfato amónico, dicetilfosfato (DCP) y azul de bromotimol (ABT), se adquirieron de Sigma-Aldrich (Italia). Dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) fue proporcionado por Avanti Polar Lipids. INC (Alabaster, Alabama). Sumatriptán succinato fue recibido como muestra de Glaxo Smith Kline (UK). Clorhidrato de ciprofloxacino fue adquirido en Fagron (Terrassa, Barcelona). Hidróxido sódico (NaOH) fue adquirido en Applichem (Darmstadt, Alemania) y el ácido clorhídrico (HCl) en T3Q Química (Sentmenat, Barcelona). El medio Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), la solución de L- glutamina (200 nM), la solución de aminoácidos no esenciales, penicilina/estreptomicina (10,000 unidades/mL, 10,000 g/mL), la solución de tripsina-EDTA (2.5 g/l, 0.5 g/l 5 EDTA), la solución de azul de tripano (0.4%), el dimetiltiazol-2-ilo-2,5-difeniltetrazol (MTT) y el dodecilsulfato sódico (SDS) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Alemania). El Tritón- X 100 fue proporcionado por Amresco (USA). El kit de lactato deshidrogenasa (LDH) fue de Takara Bio (Tokyo, Japan). El suero fetal bovino (FBS) fue obtenido de Gibco (Life Technologies, USA). Los solventes fueron de calidad HPLC. El resto de reactivos empleados en este estudio fueron de grado analítico. Se utilizó agua desionizada purificada utilizando un sistema Milli-Q (Millipore). Las membranas de policarbonato con un tamaño de poro de 800 y 400 nm se adquirieron en Millipore (Condado de Cork, Irlanda). 76 2.2. Preparación de los liposomas 2.2.1 Método pasivo de carga por evaporación en capa fina (TLE) Los liposomas fueron elaborados utilizando la técnica de evaporación en capa fina o método Bangham (TLE, Thin Layer Evaporation) obteniéndose vesículas multilaminares (MLV). Para elaborarlos, se añadieron los siguientes componentes lipídicos: fosfatidilcolina de huevo (PC), colesterol (CH), dicetilfosfato (DCP) y desoxicolato sódico (Deo-Na), en una relación molar de 70/5/10/15, en base a la experiencia previa del grupo de investigación y la de otros autores (Roy et al., 2009; Villasmil-Sánchez et al., 2013). Siguiendo la técnica de preparación, en primer lugar, se procedió a la formación de la película lipídica, para lo cual se pesaron en un matraz de fondo redondo los componentes lipídicos (Balanza de precisión Explorer Pro) y se disolvieron en 8 mL de cloroformo, constituyendo la fase orgánica de los liposomas. Seguidamente, se procedió a su evaporación hasta crear una fina película lipídica. Este proceso se llevó a cabo en un rotavapor (Büchi rotavapor R-210 con Büchi Heating Bath B-491) a una temperatura de 58 °C, temperatura superior a la temperatura de transición de los lípidos. Este proceso ha de hacerse lentamente y de forma homogénea en toda la superficie de la película con el fin de evitar cristalizaciones de los componentes. A continuación, la película obtenida se hidrató con la fase acuosa, como es lo habitual en todo proceso de elaboración de liposomas (Gregoriadis, 2016). En este caso, la fase acuosa estuvo constituida por una disolución de ciprofloxacino, CIP (2 mg/mL) y/o teofilina, TEO (1 mg/mL). Una vez hidratada la película, se sometió el preparado a 5 ciclos de agitación en vórtex durante 1 minuto intercalados con 5 minutos en baño termostatizado a 58 °C hasta la obtención de un preparado de color blanquecino opalescente en el que se encuentran dispersos los liposomas. La realización de estos ciclos de vórtex da lugar a la formación de las vesículas multilaminares (Villasmil-Sánchez et al., 2013). Finalmente, los liposomas se conservaron a 4 °C hasta su posterior uso. En la Figura 13 se recoge un esquema de esta técnica de elaboración. 77 Figura 13. Representación esquemática del método TLE. 2.2.2. Método activo de carga por gradiente transmembrana El método de elaboración de liposomas por esta técnica (Figura 14) consiste en preparar inicialmente una película lipídica similar a la del método anterior. A continuación, se hidrató con una solución de acetato amónico 250 mM (5 mL), completando con seis ciclos de vórtex consistentes en 5 min de calor (58 °C) en baño seguidos de 1 min de agitación. 78 Figura 14. Representación esquemática del proceso de elaboración de los liposomas por gradiente transmembrana. 1: Se forman los liposomas mediante TLE y se extruyen. 2: Se realiza la diálisis. 3: Los fármacos se encapsulan en los liposomas blancos previamente extruidos. La siguiente etapa del proceso es la extrusión de las muestras, con la finalidad de reducir el tamaño de los liposomas, así como obtener una distribución de tamaños homogénea. Para ello, se empleó un extrusor LIPEXTM (Thermobarrel Extruder), dispositivo de acero inoxidable que emplea nitrógeno para aplicar presiones moderadas (generalmente 100 - 800 psi), forzando de esta forma el paso de las vesículas a través de filtros de policarbonato de tamaño de poro definido. La presión empleada fue de 600 psi y se utilizaron filtros de policarbonato de 0.8 µm y 0.2 µm, a través de los cuales se hizo pasar la muestra tres veces por cada uno de ellos. Una vez obtenidas las muestras extruidas, se procedió a realizar una diálisis frente a un volumen 100 veces mayor de Hepes a pH 7.4 hasta conseguir el intercambio de protones 79 entre la membrana y el medio. Este proceso se va monitorizando midiendo la conductividad con el tiempo, hasta conseguir valores estables. Finalmente, la carga del fármaco en el preparado se lleva a cabo por adición gota a gota mediante vórtex. 2.3. Caracterización de las formulaciones 2.3.1. Parámetros dimensionales El tamaño de las vesículas se determinó por espectroscopía de correlación fotónica. Mediante esta técnica se analiza la intensidad de la luz dispersada en intervalos de tiempo de milisegundos, de forma que es el movimiento browniano de las partículas el que origina la amplitud del espectro, la cual está relacionada con el tamaño y la forma de las partículas. También denominada Dynamic Light Scattering, esta técnica permite calcular el radio hidrodinámico de las partículas suspendidas o dispersadas. Esta técnica también permite calcular el índice de polidispersión (IP), parámetro que hace referencia a la homogeneidad / heterogeneidad de la muestra analizada, con respecto a sus dimensiones. Representa una medida de la diferencia del tamaño que suele tener la mayoría de los liposomas analizados en función de su diámetro medio. En la práctica, cuanto mayor es el IP, mayor será la diferencia entre el tamaño medio de la población de liposomas analizada y, por tanto, más heterogéneas serán las vesículas. Así, un valor elevado de IP (0.8 - 1) es indicativo de una muestra heterogénea, mientras que un valor bajo de IP (< 0.2) indicará una elevada homogeneidad de las vesículas en cuanto a sus dimensiones. El equipo utilizado fue un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). Las medidas se efectuaron por triplicado. Para ello, las muestras de liposomas a analizar fueron diluidas con tampón Hepes pH 7.4 en una proporción 1:20. 2.3.2. Carga superficial Las propiedades eléctricas de la superficie de los liposomas pueden tener gran influencia sobre la estabilidad física de la dispersión coloidal, durante su almacenamiento y en su posterior interacción con las células. El potencial zeta () es una medida de la carga que rodea a las partículas en suspensión. La movilidad electroforética () refleja el grado de movimiento de coloides en dispersión bajo la influencia de un potencial eléctrico aplicado a través de ella y expresa la carga neta efectiva sobre la superficie de las vesículas. Este 80 parámetro resulta de especial interés en los preparados coloidales, ya que constituye un importante indicador de la estabilidad física de la dispersión. Según la teoría DLVO, un sistema será estable en una solución electrolítica simple cuando las fuerzas de repulsión entre dos partículas sean mayores a sus fuerzas de atracción de Van der Waals. Para determinar la carga superficial de los liposomas, se introdujeron 4 mL de la dispersión liposomal en el equipo Zetasizer Nano ZS, donde se calculó  a partir de , empleando la ecuación de Smoluchowsky (Bertolotto et al., 2010);  = / donde  es la viscosidad del medio y  la constante dieléctrica. La dispersión de liposomas atraviesa una serie de canalículos hasta el interior de una célula fotoeléctrica en donde se soporta una diferencia de potencial. Allí, los liposomas migran hasta el electrodo de carga opuesta. La velocidad de migración de las vesículas se calcula en función de la variación de la frecuencia de la luz de un rayo láser que difracta al chocar con los liposomas en movimiento por el campo eléctrico (movilidad electroforética). El equipo cuenta con un software de control que permite crear un entorno de trabajo personalizado donde se definen las variables de control (presión de aire en bar, porcentaje de vibración de la bandeja, etc.) para cada tipo de ensayo. Las medidas se han realizado por triplicado empleando una dilución 1:20 con tampón Hepes pH 7.4. 2.3.3. Intercambio de iones Con el fin de extraer alguna información sobre la segunda etapa de elaboración de los liposomas por el método de gradiente transmembrana, en la que se procede a la realización de una diálisis con el fin de crear el gradiente iónico para favorecer posteriormente la entrada del fármaco al interior de las vesículas, se aplicaron dos técnicas: medida de la conductividad y método colorimétrico. La conductividad está relacionada con la presencia de sales en solución, cuya disociación genera iones (electrolitos) capaces de transportar la energía eléctrica si se somete el líquido a un campo eléctrico. En este estudio, se llevó a cabo la medida de la conductividad del medio acuoso externo a la bolsa de diálisis con el fin de detectar el intercambio de iones fuera y dentro de dicha bolsa. La medida se llevó a cabo en un conductivímetro (Hanna Edge®, España), introduciendo la celda del conductivímetro y recogiendo los valores (mS/cm) hasta conseguir la estabilización de los datos. Para corroborar la existencia del intercambio iónico entre el interior y el exterior de las membranas previo a la encapsulación del fármaco, se aplicó un método colorimétrico 87 sobrenadante de las células expuestas a las muestras durante 24 horas. Se seleccionaron las dos concentraciones más altas del ensayo del MTT y también se testaron TEO y CIP libres como controles. Se llevó a cabo un control negativo de LDH incubando las células con medio de cultivo celular solo y con Tritón-X 100 (10%), que se usó como control positivo, asumiendo una liberación de LDH del 100%. Tras la exposición durante 24 horas, se recolectó el sobrenadante de las células y se centrifugó (16000×g, 5 min, 4 °C), cuantificándose la liberación de LDH mediante un kit comercial. Las absorbancias se midieron mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 490 nm (con una corrección de 690 nm). Se determinó la liberación de LDH de cada muestra en comparación con el control positivo. Todas las mediciones se realizaron por triplicado. 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Estudios preliminares sobre el método El método transmembrana se basa en el intercambio de iones entre el interior y exterior del liposoma. Cuando el interior del liposoma es ácido, el valor externo de pH tiende a ajustarse para lograr las condiciones fisiológicas mediante diálisis con Hepes a pH 7.4. Estas condiciones preliminares son necesarias para lograr una eficacia mayor en la carga del fármaco no ionizado, que difundirá dentro de las vesículas para ser encapsulado. En este ensayo, se utilizó el gradiente transmembrana del acetato para estudiar el intercambio de iones entre las membranas y se evaluó midiendo la conductividad y el cambio de color del indicador de pH ABT. Los valores de conductividad de la solución receptora se recopilaron durante 3 horas. La Figura 16 muestra la existencia de un intercambio iónico, ya que los valores de conductividad varían a lo largo del tiempo. En primer lugar, los valores de conductividad fueron bajos, debido a que el medio externo fue Hepes. A medida que avanza el tiempo cuando la membrana de diálisis con acetato amónico es introducida, se produce el intercambio iónico entre ambos medios, modificando los valores de conductividad a lo largo del tiempo. Finalmente, una vez que los valores de conductividad fueron estables, concluye el proceso. 88 Figura 18. Medidas de conductividad en el medio receptor externo, fuera de las membranas de diálisis con respecto al tiempo. 1: liposomas blancos no extruidos; 2: medio externo (Hepes); 3: liposomas blancos extruidos. Cuando los liposomas son homogéneos y se encuentran en un ambiente estable dispersos en una solución acuosa, la interfaz entre la solución (tampón Hepes) y la bicapa lipídica es suave. Además, al igual que ocurre con las biomembranas, muy pocos iones pasan a través de la membrana de fosfolípidos, y el área superficial de los liposomas en contacto con el medio acuoso es escasa. Por lo tanto, la parte ionizada de la cabeza de los fosfolípidos es estable, quedándose en la parte superficial de los liposomas. El número de iones libres se reduce, lo que explica la baja conductividad cuando hay condiciones de neutralidad (pH 7.4, Hepes). Por tanto, la conductividad de la dispersión de liposomas en condiciones neutras es baja, lo que indica que los liposomas son más estables e integrados (Fan et al., 2017). Sin embargo, a medida que aumenta la entrada de protones en el medio interno, los valores de conductividad aumentan y sale la sal al medio externo, los liposomas se desestabilizan ligeramente debido a que las cabezas de los fosfolípidos capturan el exceso de protones y la membrana se debilita ligeramente destruyendo la estructura estable; sin embargo, se aprecia que a pesar del aumento de conductividad inicial, una vez que desaparece todo el Hepes, la conductividad vuelve a bajar alcanzando valores similares a los iniciales, formando liposomas estables finalmente. Por otro lado, para detectar el intercambio de iones, se añadió una solución diluida de ABT dentro de la membrana de diálisis en la cual estaba presente la dispersión de liposomas. ABT es un indicador que vira de pH ácido (amarillo) a pH básico (azul) en el rango de 2.5 a 12.5 (Figura 17). Este resultado puede ser detectado visualmente debido al 89 cambio de pH en la solución interna de acetato amónico, demostrando que existe un intercambio de protones entre ambos medios. Se puede observar que la absorbancia de la solución receptora decrece con el cambio de pH; cuanto más ácida es, más amarilla es la señal y por lo tanto se detecta una mayor absorbancia. A la vez se observa que la absorbancia aumenta con el incremento de pH, cuanto más básica es la solución más azul es y, por lo tanto, más absorbente. Ambos comportamientos pueden explicarse por la ley de Lambert – Beer (Gobrecht et al., 2015). En la Figura 20 se visualiza el intercambio de iones cuando las muestras ubicadas dentro de la membrana de diálisis se centrifugan, antes (derecha) y después (izquierda) de producido ese intercambio de protones. Se aprecia en la parte inferior del falcon el precipitado de liposomas, cuyo interior es ácido (amarillo). Respecto al líquido sobrenadante, se diferencian las tonalidades del ABT, ya que en el tubo de la derecha aún no se ha producido el intercambio (amarillo verdoso), mientras que, en el tubo de la izquierda, ya ha tenido lugar dicho intercambio de protones, y la coloración torna a azulada (pH más básico). Figura 19. Diferentes soluciones de azul de bromotimol (ABT) a distintos pH. Figura 20. Muestras centrifugadas antes (derecha) y después (izquierda) del proceso de la diálisis. 90 3.2. Efecto de las características físico-químicas del fármaco El método transmembrana consiste básicamente en el intercambio de iones entre el interior y el exterior de las vesículas. En este método, el fármaco se carga en liposomas preformados mediante un proceso remoto. Debido a esto, debe ser favorecido el cambio de especias neutras (sin carga), que sean capaces de difundir a través de la membrana, a moléculas ionizadas que no son capaces de difundir a través de ésta. Por tanto, basándonos en este hecho, conocer el grado de ionización y la solubilidad de un fármaco en el medio es fundamental para el éxito del proceso. Las bases débiles anfipáticas y los ácidos débiles cumplen con estos requerimientos. Por otro lado, la fuerza externa que impulsa la difusión del fármaco del medio externo al interior del liposoma y que mantiene al fármaco dentro, es otra condición esencial para que tenga lugar el proceso (Zucker et al., 2009). Para evaluar la influencia de estas propiedades en la carga del fármaco, se prepararon cuatro formulaciones con diferentes fármacos. Se evaluaron parámetros dimensionales, potencial zeta y el porcentaje de fármaco encapsulado en los liposomas. Los resultados se resumen en la Tabla 3. Tabla 3. Caracterización físico-química de los liposomas extruidos con diferentes fármacos. MET: clorhidrato de metformina. SUM: succinado de sumatriptán. ACZ: acetazolamida. TEO: teofilina. IP: índice de polidispersión. MET SUM ACZ TEO Tamaño (nm) 216.2±3.13 210.2±3.33 220.7±1.25 210.5±1.36 IP 0.15±0.014 0.20±0.015 0.15±0.021 0.18±0.006 Potencial zeta (mV) -18.2±0.52 -20.2±1.42 -22.7±1.93 -17.50±0.62 Los tamaños medios estuvieron comprendidos entre 201.2 y 220.7 nm y el IP entre 0.149 y 0.201; ello indica que el paso del fármaco a través de las vesículas no afectó a las características dimensionales de estas. De forma similar, la carga superficial sufrió ligeras modificaciones estando comprendidas entre -17.50 mV en el caso de TEO y -22.7 mV para ACZ. Sin embargo, cuando se evaluó el PdE de los fármacos se obtuvieron diferencias significativas. La Figura 19 muestra que la TEO fue encapsulada más eficientemente que los otros fármacos. 91 Analizando los resultados obtenidos, se puede establecer una relación entre la capacidad de atrapamiento del fármaco y las propiedades de ionización de estos, ya que se logró mayor PdE cuando el pKa del fármaco fue menor. La mayor eficacia de encapsulación fue obtenida para las muestras de TEO (47.8%, pKa 8.7), ACZ (30%, pKa 7.2), después SUM (25.67%, pKa 9.2) y finalmente MET (9.81%, pKa 12.4). Se sabe que para que ocurra una entrada adecuada del fármaco en el medio amónico, las moléculas han de tener un pKa comprendido entre 2.0 y 11.0, además de tener una elevada solubilidad en agua (Alyane et al., 2016). En nuestro caso, las bases débiles anfipáticas cumplen esos requerimientos y en este caso explica por qué la MET fue encapsulada en mucho menor porcentaje que el resto de los fármacos (Zucker et al., 2009; Eloy et al., 2014), mostrando diferencias estadísticamente significantes con el fármaco siguiente (SUM). Sin embargo, esta relación es menos evidente para las otras formulaciones., Por otra parte, otras propiedades como el pKa, la solubilidad en agua o el coeficiente de partición (Kp) también han de tenerse en cuenta. Figura 21. Porcentaje de fármaco encapsulado (PdE) en los lotes analizados.Los valores son las medias ± SEM (n=3). El valor medio fue significativamente diferente comparado por pares (*P < 0.05, *** <0.001, test de t-Student). MET: metformina hidrocloruro. SUM: sumatriptán succinato. ACZ: acetazolamida. TEO: teofilina. pKa 12,4 pKa 9.2 pKa 7.2 pKa 8.7 010 20 30 40 50 60 Metformin HCl Sumatriptan succinate Acetazolamide Theophylline PdE (%) *** * TEO ACZ SUM MET 92 En la Tabla 4 se recogen las propiedades más importantes de las moléculas seleccionadas para este estudio. Tabla 4. Propiedades físico-químicas de los fármacos seleccionados. PM: peso molecular. S: solubilidad. MET: metformina hidrocloruro. SUM: sumatriptán succinato. ACZ: acetazolamida. TEO: teofilina. MET SUM ACZ TEO Est. qca. pKa 12.4 9.2 7.2 8.7 Log P -2.6 1.17 -0.26 -0.02 PM 129.16 295.4 222.25 180.16 S (mg/mL) 1060 21.4 0.98 7.36 Se sabe que el Kp puede favorecer la difusión pasiva. En estos liposomas, en los que la fase interna es diferente del medio externo debido a la modificación iónica y al pH de la fase acuosa, el Kp del fármaco puede afectar al comportamiento del liposoma. Además, el Kp reduce el coeficiente de partición en el interior de la membrana, disminuyendo la tasa de desorción, como fue demostrado por Maurer-Spurej et al. (1999). Esto justifica la elevada eficacia de atrapamiento de TEO (log P -0.02) comparado con ACZ (log P -0.26). Por otra parte, la elevada solubilidad en agua de TEO (7.36 mg/mL) en comparación con ACZ (0.98 mg/mL) causa un incremento del gradiente de concentración en el interior y exterior de las vesículas, favoreciendo la encapsulación del fármaco. Los otros fármacos, que no se encuentran ionizados a pH fisiológico, como MET, pueden ser encapsulados mediante otros métodos como con ciclodextrinas. Esta es la razón por la que este fármaco tiene el PdE más bajo; por lo tanto, el método transmembrana no es el más adecuado para encapsular este fármaco, ya que éste no es ionizable (Russo-Spena et al., 2018). Aparte de todo esto, el peso molecular (PM) constituye otro parámetro que podría influir en el PdE. En este estudio, se demuestra la existencia de una correlación inversa entre el peso molecular y la eficacia de atrapamiento, aumentando a medida que el PM disminuye. La MET es la excepción, probablemente debido a su limitada solubilidad en agua, que 93 explica su dificultad para ser encapsulada. Esto puede justificarse porque los puentes de hidrógeno entre el fármaco y la fase acuosa disminuyen (Li et al., 2009). 3.3. Efecto de la deformabilidad en la carga del fármaco Una vez demostrado que TEO es un fármaco adecuado para ser encapsulado en los liposomas mediante el método del gradiente transmembrana, se realiza un estudio para evaluar el efecto de la deformabilidad de la vesícula en la capacidad de la TEO para deformarse. Para esto, se incluyeron tres concentraciones diferentes de DeO-Na en la bicapa lipídica. Los resultados obtenidos (Tabla 5) muestran que la carga superficial de las vesículas no presenta diferencias significativas ni antes, ni tras la extrusión, como ha sido corroborado por otros autores (Bhardwaj y Burgess, 2010). Sin embargo, el tamaño y el IP disminuyen con la extrusión, como es lógico, y ambos se mantienen constantes en los lotes. Tabla 5. Propiedades físico-químicas de los lotes de TEO antes y después de la extrusión. Se prepararon usando diferentes cantidades de desoxicolato sódico (Deo-Na). NE: no extruido. E: extruido. Las concentraciones de Deo-Na son 5, 10 y 15 (mol%). Lote % Deo- Na Tamaño (nm) IP Potencial Zeta (mV) PdE (%) NE_Deo5 5 448.96 ± 3.69 0.47 ± 0.03 -20.43 ± 0.95 - E_Deo5 5 209.23 ± 3.76 0.13 ± 0.01 -18.00 ± 1.15 23.9 ± 3.5 NE_Deo10 10 505.57 ± 6.45 0.45 ± 0.03 -19.57 ± 0.76 - E_Deo10 10 208.40 ± 3.70 0.15 ± 0.04 -17.90 ± 0.40 33.8 ± 5.6 NE_Deo15 15 495.50 ± 8.86 0.32 ± 0.07 -22.26 ± 0.46 - E_Deo15 15 206.80 ± 3.35 0.12 ± 0.20 -19.50 ± 2.45 47.8 ± 4.4 Como ya ha sido mencionado previamente, este fenómeno puede ser explicado porque antes de la extrusión, las vesículas se encuentran en un estado de equilibrio, sin estrés en su superficie. Durante la extrusión, la tensión superficial aumenta con respecto a la presión de la membrana, debido a la presión aplicada y al paso de las vesículas a través del filtro, llevando a la ruptura de las vesículas y a la formación de liposomas de menor tamaño. Tras la extrusión, la bicapa reduce su tensión superficial y las vesículas vuelven a un estado de relajación (Zhu et al., 2007). 94 En términos de IP, los lotes extruidos son siempre iguales o más pequeños que los no extruidos, confirmando que la extrusión favorece la formación de liposomas menos polidispersos en términos de tamaño. Por lo tanto, de acuerdo con la teoría de Mui y Hope (2007) se confirma la idoneidad de este método para la obtención de muestras más homogéneas. Observando la eficacia de la encapsulación de TEO por el método transmembrana en las vesículas, se encapsuló un mayor porcentaje de fármaco a medida que el porcentaje de Deo-Na aumenta, como se recoge en la Tabla 5. Esto puede ser explicado basándonos en la afinidad de la TEO por la región hidrofóbica en la bicapa lipídica en la que el Deo-Na presente debe solubilizar y encapsular el fármaco. Por lo tanto, la mayor eficacia de encapsulación se consiguió usando el porcentaje más elevado de Deo-Na (15% del total de lípidos), de acuerdo con Hao et al. (2016). La adición de sales biliares, como el Deo-Na, en formulaciones de liposomas, queda, por tanto, justificada en este estudio. En primer lugar, actúan como activadores del borde, aumentando la deformabilidad de las vesículas. Por otra parte, son derivados anfipáticos del colesterol que aumentan la dispersión lipídica. Para las formulaciones pulmonares, la barrera de surfactante es el primer contacto que la sustancia inhalada encuentra, una vez alcanzado el alveolo. Esta fina barrera cubre el área respiratoria del pulmón, lo que ofrece protección frente a las sustancias tóxicas inhaladas (Zuo et al., 2008). En condiciones normales, la tensión superficial cambia durante el ciclo de respiración, haciendo que respirar sea más fácil. Sin embargo, si se encuentra dañado, la tensión superficial no aumenta durante la compresión espiratoria, pudiendo colapsar el alveolo; además, los bronquiolos respiratorios pueden llenarse de líquido, haciendo el proceso respiratorio complicado. En el tema que nos ocupa, algunos autores (Hildebrand et al., 2003; Sørli, 2015) demostraron que la interacción y solubilización entre las bicapas de PC y las sales biliares colato sódico (CS) y Deo-Na muestran que el comportamiento del proceso de solubilización depende de la concentración de la sal y de la longitud de la cadena de fosfolípidos (Hildebrand et al., 2002). 3.4. Co-encapsulación de teofilina y ciprofloxacino Una vez que la formulación de TEO es encapsulada mediante carga remota, el siguiente paso fue incluir CIP en la formulación. Esta fluorquinolona tiene la capacidad de alcanzar elevadas concentraciones en el pulmón y bajas concentraciones sistémicas tras la 95 inhalación, comparado con la vía oral o la administración intravenosa. Por otro lado, las formulaciones de liposomas con ambos fármacos, CIP y TEO, podrían mejorar la tolerancia, aumentar el cumplimiento por parte del paciente al reducir la dosis y mejorar la penetración en los biofilms bacterianos, mejorando el tratamiento de las infecciones intracelulares. Como CIP es un ácido débil, la primera etapa consistió en evaluar el efecto de diferentes sales de amonio en la encapsulación de ambos fármacos y en las propiedades de los liposomas. 3.4.1. Efecto de las sales de amonio en la solubilidad de los fármacos Siguiendo con el propósito de este proyecto de investigación, el siguiente paso consistió en co-encapsular TEO con otro fármaco que hubiese demostrado tener una elevada eficacia en el tratamiento de la FQ, el CIP. Para esto, se llevó a cabo un primer estudio basado en la solubilidad de cada uno de los fármacos en diferentes sales de amonio para seleccionar la sal más adecuada que proporcione mayor nanoprecipitado en el interior del compartimento acuoso de los liposomas. Las Figuras 22 y 23 muestran que la solubilidad de TEO y CIP en acetato amónico dependen del valor de pH de manera que disminuye con el descenso del valor de pH de esta sal. Sin embargo, se observa un comportamiento diferente con las otras sales (citrato, fosfato y sulfato). Tratándose de TEO, no existen diferencias significativas cuando las sales de amonio se usan a diferentes pH. Parece probable que la cosmotropía (estructura) del contraión contribuye a la solubilidad de TEO. Las sales usadas para la carga, citrato, sulfato y fosfato, son todas componentes de las series liotrópicas o de Hofmeister (Hafez et al., 2000). Estas series reflejan el ranking de iones según su fuerza de unión con el agua pura, y con el descenso concomitante en la hidratación de otros compuestos. 96 Figura 22. Porcentaje de TEO solubilizada usando diferentes sales de amonio a pH 4 y pH 7. Figura 23. Porcentaje de CIP solubilizado usando diferentes sales de amonio a pH 4 y pH 7. Por otra parte, la solubilidad de CIP en todos los tampones con pH 7 es elevada, mientras que a pH 4 la solubilidad fue baja y se formaron grandes precipitados. Este estudio muestra que la solubilidad del CIP es dependiente del pH, sobre todo con las sales de sulfato y acetato. Del estudio de solubilidad, se pueden extraer dos conclusiones importantes. En primer lugar, el acetato amónico fue la sal seleccionada como donadora para obtener la fuerza necesaria para crear el gradiente que permita la carga del fármaco. En segundo lugar, las amplias diferencias en la solubilidad de los fármacos entre el pH 4 y el pH 7, refutan la 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Acetate Citrate Phosphate Sulfate Porcentaje de TEO solubilizada pH 4 Theo pH 7 Theo 0 20 40 60 80 100 Acetate Citrate Phosphate Sulfate Porcentaje de CIP solubilizado pH 4 CIP pH 7 CIP * pH 4 TEO pH 7 TEO Acetato Citrato Fosfato Sulfato * Acetato Citrato Fosfato Sulfato 103 el fármaco, mientras que las micelas formadas por copolímeros anfifílicos tienen cubiertas hidrofílicas y núcleos hidrofóbicos para transportar fármacos poco solubles. Normalmente, el tamaño, la composición y las modificaciones en la superficie son claves para conocer su función y sus posibles efectos adversos (Moghimi et al., 2012). Es crucial que los sistemas de liberación de fármacos sean seguros y que cumplan su propósito causando la menor toxicidad posible (Nel et al., 2013). En este apartado de la Tesis Doctoral, lo que se pretende es evaluar la citotoxicidad que puedan causar las formulaciones desarrolladas, con el fin de optimizar la composición para futuros estudios en animales de experimentación. Para ello, se realizarán estudios con la formulación optimizada en los apartados anteriores (lo denominaremos como proporción 100% lípidos/fármacos) para después reducir esta proporción al 75% y 50% con el fin de aumentar el denominado drug loading. 3.3.1. Evaluación de la viabilidad celular de las formulaciones con el 100% de fosfolípidos El MTT, previamente detallado en la parte experimental de la memoria, evalúa la actividad metabólica de las células mediante la exposición de éstas a nuestras muestras, y se ha usado a menudo en el estudio de fármacos encapsulados en nanotransportadores (Rodrigues et al., 2015). Evalúa la capacidad que tienen las células para reducir el MTT a sales de tetrazolio, una acción que depende del metabolismo mitocondrial. De esta forma, una reducción de la actividad metabólica es aceptado como un indicador de daño celular (Scherliess, 2011). En este trabajo, las células A549 fueron cultivadas y expuestas a diferentes concentraciones de TEO y CIP, en solitario y en combinación, así como liposomas blancos y cargados con fármacos. Los fármacos se usaron a 1 mg/mL (TEO) y a 2 mg/mL (CIP), ya que fueron las concentraciones que alcanzaron la mayor eficacia de encapsulación. Se parte de la premisa de que la encapsulación ha de ser la mayor posible para reducir la toxicidad celular para aumentar la ratio fármacos / lípidos. Además, ambas formulaciones se testaron durante un período de tiempo corto (3 horas) y durante un tiempo más largo (24 horas). La norma ISO 10993 considera que el efecto citotóxico existe cuando la viabilidad celular desciende por debajo del 70%. Por lo tanto, este fue el valor a tener en cuenta para los ensayos. 104 Los resultados expuestos en la Figura 28 mostraron que, tras una exposición de 3 horas, los fármacos libres presentaban toxicidad celular a las concentraciones más elevadas, donde la viabilidad celular fue menor del 70%. En los fármacos libres, TEO mostró mayor toxicidad. Como se ha explicado anteriormente, su rango terapéutico es muy estrecho, situándose entre 30 - 100 μM (Buhecha et al., 2019). Casi todas las concentraciones probadas demostraron ser tóxicas alcanzando el 60% de la viabilidad celular registrada con respecto al control de las células incubadas en el medio de cultivo (100%, p < 0.05). CIP, de forma general, induce mayores niveles de viabilidad celular a las mismas concentraciones que TEO, pero esto solo se mantiene hasta 0.5 mg/mL. Superada esta concentración, la situación se invierte, alcanzando CIP una viabilidad en torno al 40% para 2 mg/mL, una concentración que no fue probada para TEO. La combinación de los dos fármacos siguió un perfil dirigido esencialmente por el contenido de CIP, con resultados similares al fármaco en solitario. En cuanto al efecto de los liposomas blancos y cargados (Figura 29), la viabilidad celular tras 3 horas de exposición fue generalmente más alta en comparación con los fármacos libres. 105 C oncentración (m g/m L) V iabilidad celular (% sobre el control) M ed io 0.007813 0.015625 0.023438 0.03125 0.046875 0.0625 0.0937 5 0.125 0.187 5 0.25 0.375 0.5 0.75 1 1.5 2 3 0 20 40 60 80 100 120 T E O C IP T E O /C IP Figura 28. Viabilidad celular de los fármacos en estudio para 3 horas. C oncentración (m g/m L) V iabilidad celular (% sobre el control) M edio 0.0078 0.0156 0.0313 0.0625 0.125 0.25 0.273 0.5 0.547 1 1.094 2 2.188 4.375 8.75 17.535 0 20 40 60 80 100 120 Liposom as blancos Liposom as con T EO Liposom as con C IP L iposom as con TEO /CIP Figura 29. Viabilidad celular de los liposomas con el 100% de fosfolípidos cargados con los fármacos en estudio para 3 horas. De hecho, solo en dos casos, los valores se acercan al 60% de la viabilidad celular, nunca yendo más allá de este valor. Por lo tanto, se puede sugerir que los liposomas tienen un efecto protector para las células, permitiendo una mejora del perfil de seguridad del fármaco. Los estudios se llevaron a cabo testando liposomas cargados con CIP a una 106 concentración máxima de 2 mg/mL, los de TEO a un máximo de 1 mg/mL y los liposomas de CIP/TEO a una concentración máxima de 3 mg/mL (que corresponde a 2 mg/mL para CIP y a 1 mg/mL para TEO). Los tests con TEO fueron priorizados debido a su elevada toxicidad ya que, según la literatura, su rango terapéutico es muy estrecho, causando toxicidad por encima de 1 mg/mL (Buhecha et al., 2019). La exposición prolongada de hasta 24 horas (Figura 30) indujo mayor variabilidad en la viabilidad celular, en algunos casos aumentando la toxicidad identificada en el ensayo de 3 horas. Con la excepción de las concentraciones más bajas de CIP (hasta 0.03 mg/mL), todas las muestras de fármaco libre produjeron niveles de viabilidad celular inferiores al 70% (Figura 30). También se observó un aumento de la toxicidad en las formulaciones de liposomas. La Figura 31 muestra que la viabilidad celular decrece significativamente cuando las células fueron expuestas a liposomas blancos y cargados, con una viabilidad celular menor al 70% a partir de la concentración de 0.0625 mg/mL. Sin embargo, hasta esta concentración, fue visible el efecto protector de los liposomas, como fue comprobado también en el test de 3 horas. En general, se observa un efecto tiempo-concentración dependiente en la viabilidad celular producido por los fármacos libres y las formulaciones liposomales (p < 0.05). C oncentración (m g/m L) V iabilidad celular (% sobre el control) Med io 0.007813 0.015625 0.023438 0.0312 5 0.046875 0.0625 0.0937 5 0.125 0.1875 0.25 0.375 0.5 0.75 1 1.5 2 3 0 20 40 60 80 100 120 T E O C IP T E O /C IP Figura 30. Viabilidad celular de los fármacos en estudio para 24 horas. 107 C oncentración (m g/m L) V iabilidad celular (% sobre el control) M edio 0.0078 0.0156 0.0313 0.0625 0.125 0.25 0.273 0.5 0.547 1 1.0942 2.188 4.375 8.75 17.535 0 20 40 60 80 100 120 Liposom as blancos Liposom as con TEO Liposom as con C IP L iposom as con TE O /C IP Figura 31. Viabilidad celular de los liposomas con el 100% de fosfolípidos cargados con los fármacos en estudio para 24 horas. A concentraciones bajas, la toxicidad de ambos fármacos fue similar; sin embargo, cuando alcanzan 1 mg/mL, CIP incrementa su toxicidad. Una posible explicación podría ser la fototoxicidad de CIP, ya que las fluoroquinolonas inducen la peroxidación de la membrana lipídica y la citotoxicidad de cultivos celulares (Haddad y Kümmerer, 2014). Además, cuando CIP fue encapsulado en los liposomas, la viabilidad celular descendió un poco, particularmente a partir de 0.25 mg/mL y concentraciones mayores. Posiblemente, la presencia de los lípidos aceleró el proceso de degradación de los fármacos, alterando los procesos de degradación y llevando a la formación de diferentes productos de degradación. La composición de las bicapas lipídicas tuvo, por tanto, un impacto significativo en este proceso; la presencia de cadenas de ácidos grasos insaturados llevó a la pérdida de CO2 y aumentó la frecuencia de deshidrogenación, seguida de una pérdida del átomo de flúor (Zgadzaj et al., 2019). Según la literatura existente, las vías de transformación del CIP durante la fotodegradación en soluciones acuosas ocurre principalmente por la sustitución del átomo de flúor, hidroxilación del núcleo de la quinolona, degradación oxidativa del anillo de piperazina o transformación de la amina en amida (Haddad y Kümmerer, 2014). 108 Cuando los fármacos se encuentran en su forma libre, como se ha explicado anteriormente, TEO muestra un efecto concentración-dependiente, aunque no muy acentuado. CIP muestra un efecto más pronunciado concentración-dependiente. A las 24 horas, ambos fármacos muestran un efecto tiempo-dependiente, manteniendo TEO solo el 60% de la viabilidad celular a las concentraciones más bajas ensayadas (0.008 mg/mL). Sin embargo, de forma general, la encapsulación en liposomas generalmente parece reducir la toxicidad de estos fármacos. Esto podría ser explicado porque el contacto entre el fármaco y la célula se produce a medida que éste es liberado del liposoma. Sin embargo, el fármaco libre es captado rápidamente por la membrana celular (Ron-Doitch et al., 2016). Por ello, se confirma por qué los liposomas son los sistemas de liberación más empleados en la práctica clínica (Zhang et al., 2019). Como test complementario para evaluar la citotoxicidad, se determinó la cantidad de LDH liberada de las células tras 24 horas de exposición a diferentes concentraciones de los materiales. La Figura 32 recoge los resultados obtenidos, mostrando que todas las muestras ensayadas inducen una liberación significativamente menor de LDH en comparación con el control positivo (Tritón X-100). Sin embargo, se observaron diferencias significativas (p < 0.05) para casi todas las muestras ensayadas en comparación con el control negativo, lo que significa que la exposición a las muestras impactó en la integridad de la membrana celular. De hecho, a excepción de TEO libre, TEO encapsulada y los liposomas de CIP/TEO, las dos últimas a la concentración de 0.5 mg/mL, el resto de muestras indujeron una liberación de LDH estadísticamente significativa respecto al control negativo. Los resultados de los fármacos libres indican que TEO muestra un perfil más seguro, aunque esta tendencia no es coincidente con los resultados previos de MTT. Además, la combinación de los dos fármacos también resultó en una respuesta ligeramente mejor en comparación con CIP libre, con menor liberación de LDH a la concentración de 1.5 mg/mL (p < 0.05). Por su parte, las formulaciones liposomales a 1 mg/mL generaron respuestas similares entre los grupos analizados. Además, la liberación de LDH aumentó como consecuencia de la exposición a liposomas blancos, de una forma concentración-dependiente. Curiosamente, se observó que, tanto CIP como la combinación de este con TEO, generaron un aumento de la liberación de LDH. La encapsulación de ambos fármacos en liposomas mejoró la viabilidad celular, ya que se obtuvieron valores más bajos de LDH 109 (p < 0.05 y p < 0.01, en comparación con la solución de CIP y la CIP/TEO respectivamente). Sin embargo, para TEO, que en este ensayo indujo resultados similares al control cuando se analizó como fármaco libre, la encapsulación resultó en un aumento de la toxicidad (p < 0.05), posiblemente como consecuencia de los propios lípidos. De hecho, la respuesta celular a los materiales expuestos es claramente dependiente de su composición. Los resultados obtenidos en este ensayo refuerzan los obtenidos en el ensayo MTT, indicando un considerable nivel de toxicidad proveniente de los propios lípidos, al menos a las concentraciones empleadas. Una aproximación terapéutica sería la optimización de la formulación para asegurar una mayor carga y permitiendo la liberación de las dosis empleadas usando menor cantidad de lípidos. 110 Figura 32. Ensayo MTT de las formulaciones con el 100% de fosfolípidos. 0 20 40 60 80 100 120 0.5 mg/mL 1 mg/mL 1 mg/mL 2 mg/mL 1.5 mg/mL 3 mg/mL 17.5 mg/mL 35 mg/mL 0.5 mg/mL 1 mg/mL 1 mg/mL 2 mg/mL 0.5 mg/mL 1 mg/mL Medio TEO CIP TEO/CIP Liposomas blancos Liposomas con TEO Liposomas con CIP Liposomas con TEO/CIP Tritón X-100 Liberación de LDH (% sobre el control) ** * * * * * * * * 111 3.3.2. Evaluación de la viabilidad celular de las formulaciones con el 75% y 50% de fosfolípidos Como quedó planteado en el apartado anterior, se redujeron las concentraciones de fosfolípidos empleadas, al 75 y 50% con el objetivo de comprobar si la viabilidad celular mejoraba. En este trabajo, las células A549 fueron cultivadas y expuestas a diferentes formulaciones de liposomas con el 75 y el 50% de la formulación inicial de fosfolípidos, conteniendo 1 mg/mL (TEO) y 2 mg/mL (CIP), ya que como se ha expuesto anteriormente, fueron las concentraciones que alcanzaron la mayor eficacia de encapsulación y ésta ha de ser la mayor posible para reducir la toxicidad celular. Además, ambas formulaciones se probaron durante un período de tiempo corto (3 horas) y durante un tiempo más largo (24 horas). Igualmente, se consideró el 70% como el límite de viabilidad celular. Los resultados obtenidos mostraron que, tras una exposición de 3 horas, la viabilidad celular fue inferior al 70% para 1 mg/mL de ambas formulaciones, alcanzando valores en torno al 60%; concretamente, la formulación con un 50% de carga en fosfolípidos mostró una viabilidad en torno al 66% y en la del 75% fue de un 58% aproximadamente (Figuras 33 y 34). Teniendo en cuenta que la formulación inicial (100%) demostró una toxicidad de aproximadamente un 60%, la reducción de la cantidad de fosfolípidos resultó en una mayor viabilidad celular. Esto queda contrastado con los resultados de estudios llevados a cabo recientemente, como el de Rezaei et al. (2020) en el que se demostró que un aumento de la concentración lipídica llevó a una reducción de la viabilidad celular. 112 M T T 3 horas - Lote 1 (75% FL) C oncentración (m g/m L) V iabilidad celular (% sobre el control) C ontrol 0.015625 0.03125 0.0625 0.125 0.25 0.5 1 0 20 40 60 80 100 120 Figura 33. Viabilidad celular del lote 1 (75% de FL) en estudio para 3 horas. M T T 3h - L ote 2 (50% FL) C oncentración (m g/m L) V iabilidad celular (% sobre el control) C ontrol 0.015625 0.03125 0.0625 0.125 0.25 0.5 1 0 20 40 60 80 100 120 Figura 34. Viabilidad celular del lote 2 (50% de FL) en estudio para 3 horas. 119 1998. 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Los sistemas nanoparticulares, en concreto los liposomas, son candidatos ideales para la administración por esta ruta debido a su similitud con el surfactante pulmonar. Para simular el comportamiento de las nanopartículas en las vías aéreas con fines de investigación, se utilizan dispositivos multifase en cascada. En nuestro estudio se ha utilizado el Twin Impinger. Para validar su uso, se emplearon soluciones de salbutamol y una formulación comercial de éste, para ser nebulizadas, analizando sus propiedades físico-químicas y su deposición en los compartimentos del dispositivo. Seguidamente, se nebulizaron soluciones de teofilina y ciprofloxacino, tanto libres como encapsulados en las formulaciones de liposomas previamente estudiadas en el capítulo 1, comprobando que se repetía el comportamiento de las soluciones de salbutamol. 128 ÍNDICE DEL CAPÍTULO II 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 131 1.1. Administración de medicamentos por vía pulmonar ............................................. 131 1.2. Sistemas de administración de medicamentos vía inhalatoria............................... 135 1.2.1. Tipos de inhaladores ........................................................................................... 136 1.2.2. Deposición de partículas y mecanismos de aclaramiento de las vías aéreas ...... 143 1.3. Uso de nanopartículas por vía inhalatoria ............................................................. 148 1.3.1. Sistemas nanoparticulares de administración pulmonar ..................................... 149 1.4. Hipótesis y objetivos ............................................................................................. 154 2. PARTE EXPERIMENTAL ...................................................................................... 155 2.1. Equipos e instrumentación..................................................................................... 155 2.2. Productos y reactivos ............................................................................................. 156 2.3. Montaje del dispositivo Twin Impinger ................................................................. 156 2.4. Estudios de pulverización ...................................................................................... 161 2.4.1. Formulaciones a pulverizar ................................................................................ 161 2.4.2. Variables de respuesta ensayadas ....................................................................... 162 2.5. Validación del proceso con el Twin Impinger ....................................................... 165 2.6. Caracterización morfológica por Microscopía Electrónica de Barrido ................. 166 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................. 167 3.1. Formulaciones de salbutamol ................................................................................ 167 3.1.1. pH y conductividad ............................................................................................. 167 3.1.2. Análisis dimensional y carga superficial ............................................................ 175 3.1.3. Contenido de salbutamol en las cámaras de deposición ..................................... 179 3.2. Formulaciones de teofilina y ciprofloxacino ......................................................... 183 3.2.1. pH y conductividad ............................................................................................. 183 3.2.2. Contenido de ciprofloxacino y teofilina en las cámaras de deposición .............. 187 4. CONCLUSIONES .................................................................................................... 192 5. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 193 135 Por otra parte, se sabe que el surfactante no solo estabiliza la membrana alveolar creando una única bicapa de moléculas anfipáticas en la interfaz líquido-aire, sino también estabiliza la red de membranas comprendidas entre la superficie alveolar y las estructuras de superficie que allí se encuentran (Alonso et al., 2005). La composición del surfactante pulmonar define la estructura de la membrana alveolar, sus propiedades y sus funciones. Este se encuentra compuesto mayoritariamente de lípidos (en torno a un 90% del total del surfactante). De estos lípidos, predominan los fosfolípidos, especialmente las fosfatidilcolinas zwitteriónicas (consisten en el 60-79%) y especies aniónicas como el fosfatidilglicerol y el fosfatidilinositol, que constituyen el 8-15% del total. Otra fracción importante la constituyen ciertos lípidos neutros, mayoritariamente colesterol, en un 8-10%, el cual es crucial para las propiedades del surfactante y cuyo contenido es clave para optimizar la actividad del mismo (Possmayer et al., 2010). En los mamíferos, la especie lipídica más común es la dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), que es un fosfolípido disaturado indispensable para permitir una reducción extrema de la tensión superficial en la interfaz alveolar agua-aire. El resto de fosfatidilcolinas y fosfolípidos acídicos son mayoritariamente insaturados, conteniendo ácidos grasos monoenoicos y dienoicos que están esterificados en la posición n-2 del grupo glicerol. Por otro lado, otra fracción importante del surfactante la componen las proteínas, en torno a un 10% del total, en las que se incluyen SP-A (es la más abundante) y SP-D, ambas implicadas en mecanismos de defensa innata del alveolo (hidrofílica), y SP-B y SP-C (hidrofóbicas), las cuales son cruciales para la función biofísica del surfactante (Possmayer et al., 2010). 1.2. Sistemas de administración de medicamentos vía inhalatoria Para mejorar la eficacia de los tratamientos de ciertas enfermedades pulmonares y reducir el límite de exposición de ciertos órganos a fármacos potencialmente tóxicos, parece lógico pensar en una liberación directamente a los pulmones mediante inhalación (Lehofer et al., 2014). Esta vía de administración debe proporcionar una liberación específica en las células diana, limitar el tiempo de exposición de las células pulmonares sanas y evitar la salida del fármaco a la circulación sistémica (Reis y Damgé, 2012). A pesar de que existen varios dispositivos de liberación de fármacos en el mercado, que se encuentran probados e implementados en la práctica clínica, algunos grupos terapéuticos 136 de fármacos para la liberación local a través de la vía pulmonar siguen aún en fase de desarrollo e investigación. El término liberación local por vía inhalatoria, en la mayoría de los casos se refiere al uso de esta vía para liberar fármacos u otras entidades externas directamente a los pulmones con una acumulación preferente en áreas específicas del pulmón o células, y con una entrada limitada en el torrente circulatorio. La liberación de fármacos a los pulmones mediante inhalación presenta varias ventajas, como una gran biodisponibilidad, rápido inicio de acción debido a su elevada área superficial para la absorción, una administración propia, lo que aumenta la complicidad con el paciente, naturaleza no invasiva, escasa pérdida de fármaco y elevada permeabilidad de los solutos. Este tipo de sistemas de inhalación son especialmente útiles para tratar enfermedades pulmonares. El objetivo que se persigue con ello es el transporte del principio activo al sitio de acción y que realice allí su efecto durante un tiempo determinado. La eficacia dependerá principalmente de la aerodinámica pulmonar, las condiciones respiratorias, el tamaño de partícula y los métodos de inhalación y dispositivos usados (Sagalla y Smaldone, 2014), ya que para ser inhalado, el líquido o sólido pulverizado debe ser suspendido en un medio gaseoso para formar un aerosol (Hasenpusch et al., 2011). 1.2.1. Tipos de inhaladores Para lograr un acceso adecuado de la formulación a los pulmones, es necesario superar la barrera física y fisiológica, que incluye la enorme bifurcación del aparato respiratorio, así como la respuesta inmunológica innata. Además, para conseguir que las partículas lleguen a estos niveles del sistema respiratorio, estas deben poseer un tamaño comprendido entre 1 y 7 μm (Nanjwade et al., 2011). Los aerosoles monodispersos con una población muy estrecha de tamaños pueden ir específicamente a áreas del pulmón donde son más efectivas. Sin embargo, como las partículas más pequeñas son más fácilmente absorbidas hacia la circulación vía alveolar, estas formulaciones pueden asociarse con una mayor incidencia de efectos adversos (Lötvall, 2001). Para un uso correcto de los dispositivos, es importante enseñar a los pacientes la técnica de inhalación y entrenar adecuadamente a las personas con enfermedades pulmonares. El rápido inicio de acción y la reducción de los efectos adversos son algunas de las ventajas del uso de la vía pulmonar en lugar de la sistémica. La elección del dispositivo inhalatorio 137 se basa en la mejora de la respuesta clínica junto con la mejora de la colaboración del paciente al usar los diferentes dispositivos. El proceso de inhalación, a pesar de lo que se piensa, no es nuevo; la conocida como fumigación mediante inhalación se conocía en el siglo primero y la terapia con el aerosol antiséptico fue popular a mediados del siglo XX (Pandey y Khuller, 2005). Los tres sistemas de administración que permiten una inhalación eficaz de fármacos por vía pulmonar son: los sistemas dosificadores presurizados, los nebulizadores y los inhaladores de polvo seco. 1.2.1.1. Sistemas dosificadores presurizados Los aerosoles presurizados son los sistemas mayormente empleados para administrar los fármacos por vía inhalatoria. Estos ofrecen múltiples ventajas, como la portabilidad, no necesidad de ninguna fuente externa y precisión en la dosificación (Hess y Faarc 2000). Se utilizan para administrar fármacos como broncodilatadores, esteroides, agentes antiinflamatorios y anticolinérgicos. El dispositivo consiste en un sistema presurizado compuesto de propelentes, agentes saborizantes, surfactantes, conservantes y el fármaco, que comprende aproximadamente un 1% del contenido total. La liberación tiene lugar cuando la mezcla sale del dispositivo inhalatorio a través de una válvula que se inserta en un sistema a presión, como se aprecia en la Figura 4. Los cambios en el diseño del pulsador pueden afectar a las características del pulverizador (García-Contreras et al., 2015). Figura 4. Partes de un inhalador presurizado. A: cámara expansiva donde el “actuator” activa la aerosolización del fármaco. B: pieza de la boca responsable de la liberación a alta velocidad del aerosol. C: válvula dosificadora, responsable de liberar la cantidad de dosis necesaria. D: formulación líquida que contiene el propelente (adaptado de Chandel et al., 2019). 138 Los pulverizadores son considerados adecuados en términos de beneficio terapéutico en condiciones ambientales y la forma de administrarlos no varía ni la dosis ni la consistencia. A pesar de esto, su efectividad depende de su diseño y de la técnica de inhalación. Su desarrollo actual intenta mejorar el patrón de administración, lo que determinará su eficacia. Además de poseer un adecuado diseño técnico, deben ser fáciles de usar, respetuosos con el medio ambiente, mantener estable su contenido durante un determinado periodo de tiempo y ser seguros. Están diseñados para pulsar y liberar la dosis adecuada, aunque se podría producir una dosificación inadecuada si hubiera cambios en las propiedades fisicoquímicas, el diámetro de partícula, en el tiempo de evaporación del propelente, etc. Aunque existen varios inhaladores disponibles en el mercado, ninguno de ellos es capaz de alcanzar las necesidades específicas en términos de resultados clínicos, complicidad con el paciente, impacto económico y suficiente adherencia terapéutica para alcanzar los efectos terapéuticos óptimos. Hoy día, la terapia inhalatoria ofrece beneficios clínicos importantes en patologías respiratorias como asma o EPOC, logrados tras la evolución del nebulizador de atropina y adrenalina (Price et al., 2006), y en la administración de péptidos y proteínas para su favorecer su acceso a circulación sistémica (Frijlink y de Boer, 2004). La evidencia clínica demuestra que estos dispositivos funcionan en la mayoría de ocasiones, incluyendo las exacerbaciones y el tratamiento diario (Geller, 2005), aunque debe haber una selección racional del dispositivo según las variaciones interindividuales entre pacientes y los factores ambientales (Ari y Fink, 2011). Los pulverizadores más recientes pueden clasificarse en dispositivos de coordinación o de respiración activa. Los de respiración activa, como el Easibreathe®, están diseñados para superar el problema de la falta de coordinación entre la respiración del paciente y el dispositivo, de forma que funcionan según la respiración del paciente, la cual activa la sensibilidad del pulsador para la activación del dispositivo. Estos se coordinan con la respiración, y están diseñados para sincronizar la tasa de inspiración y la descarga desde el inhalador. 139 1.2.1.2. Inhaladores de polvo seco Estos dispositivos liberan la formulación a los pulmones en forma de polvo seco, lo cual requiere una coordinación mínima entre la respiración del paciente y la actuación del dispositivo. Una vez liberado el polvo, la formulación es sometida a fuerzas potentes de dispersión que desaglomeran los posibles agregados de partículas hasta convertirlos en partículas individuales. Cabe mencionar dispositivos como el Clickhaler®, el Multihaler®, y el Diskus®, que tienen la capacidad de introducir el polvo en un flujo de aire a elevada velocidad capaz de romper los agregados, consiguiendo partículas respirables. Por su parte, los dispositivos Spinhaler® y Turbuhaler® dependen de los mecanismos de desaglomeración debido al impacto de las partículas con la superficie del dispositivo (Borgström et al., 2005). El diseño de inhaladores de polvo seco presenta algunas limitaciones, como es el mantenimiento del balance entre el flujo y la resistencia del inhalador. Así, en este tipo de inhaladores, es necesario un flujo más rápido para conseguir la desagregación del polvo, y es posible que mediante impactos más fuertes se consiga una fracción más fina de partículas. No obstante, ocurre que un flujo rápido puede aumentar las probabilidades de deposición en la región de la orofaringe y también reducir la liberación en los pulmones (Chougule et al., 2007). Para conseguir la máxima dosis del dispositivo, el flujo inhalatorio debe generarse de forma apropiada, lo cual es difícil debido al aumento de la resistencia de dicho dispositivo. En este campo, el desarrollo y la aplicación de la dinámica de fluidos computacional ha sido útil en el abordaje y aplicación de dispositivos de polvo seco, ya que comprende el efecto de los cambios en el sistema de flujo junto con la desagregación en el dispositivo inhalatorio (Terzano, 2008). Existen algunos retos clínicos de los inhaladores de polvo seco, particularmente los relacionados con la edad, la condición clínica y el flujo inspiratorio (Islam y Gladki, 2008). Los dispositivos modernos incluyen inhaladores individuales o multidosis. Los individuales han sido diseñados también para la liberación sistémica y oral del fármaco, resultando muy económicos (Friebel y Steckel, 2010). Los inhaladores múltiples ofrecen también un coste reducido y una liberación adecuada de fármacos en un dispositivo compacto y transportable (Sims, 2011). Hoy día, entre las opciones disponibles, la 140 mayoría de polvos secos consisten en un fármaco constituido de un polvo fino (con un tamaño de partícula < 5 μm) incluidos en soportes de partículas, generalmente de lactosa. La presencia de lactosa ayuda a mejorar el flujo de los componentes de la formulación. En la Figura 5 se incluye el esquema de un dispositivo inhalador de polvo seco de cápsulas. Los elementos aparecen referidos en la misma. Figura 5. Inhalador de polvo seco de cápsulas. A. Pieza de la boca, que sirve para la salida del aire y liberación de la formulación. B. Botón diseñado para la activación del dispositivo. C. Filtro / rejilla que produce cambios en la resistencia interna. D. Cámara de la cápsula para que ésta se mantenga dentro del dispositivo. E. Cápsula: la liberación de la dosis después de la compresión de la misma tiene lugar a través de la boquilla del dispositivo. F. Salida del aire, que impacta significativamente en la aerosolización del polvo (adaptado de Chandel et al., 2019). Todos los estudios concluyen que las formulaciones deben ser transportadas correctamente a través de las vías aéreas, depositándose en las regiones del pulmón donde mejoran su actividad (Lavorini et al., 2017). Las partículas con un tamaño comprendido entre 1 y 5 μm se depositan en los bronquiolos de menor tamaño, mientras que las dimensiones apropiadas para lograr llegar a la región del epitelio alveolar (un objetivo importante para la liberación / absorción de los compuestos inhalados vía oral) y las vías aéreas menores (un objetivo anatómico importante para el tratamiento de asma y EPOC), deben estar comprendidas entre 1–2 μm. El hecho de que los inhaladores de polvo seco sean intercambiables es motivo de confusión para los pacientes que reciben terapia inhalatoria, si bien existen estudios previos que indican que no existe relación entre el tipo de inhalador y la respuesta (Chrystyn, 2005). Durante un estudio cuantitativo llevado a cabo por Booker (2005) con 499 pacientes asmáticos, se analizó este aspecto y aproximadamente la mitad de los pacientes (51%) respondió positivamente al cambio del inhalador de polvo seco por otro 141 dispositivo. Además, otro de los resultados del estudio reveló que aproximadamente el 50% de los pacientes no tomaba su medicación debido a la falta de adherencia, por no saber utilizar el dispositivo. Los inhaladores de polvo seco presentan varias cualidades para ser inhaladores ideales pero, sin embargo, ningún dispositivo muestra todas las funcionalidades para mostrar una respuesta positiva en las enfermedades respiratorias. El adecuado diseño del dispositivo basado en la función pulmonar del paciente es clave para conseguir una respuesta terapéutica efectiva, que puede modificarse según el tipo de inhalador, con diferentes mecanismos de acción, uso de una pieza específica para la boca y una correcta educación del paciente. Los nuevos inhaladores de polvo seco han sido usados en la EPOC para maximizar la concentración de fármaco en las vías aéreas, minimizando a su vez la exposición sistémica y su toxicidad asociada (Onoue et al., 2009). El ritmo de respiración de los inhaladores de polvo seco tiene un diseño operacional que indica que se debe producir una inhalación antes de usar el spray. En estos dispositivos se combina la resistencia junto con el flujo inhalatorio para generar la energía turbulenta que causa la disgregación de la formulación del fármaco produciendo una dosis eficiente. En los inhaladores de polvo seco, comparando un inhalador con bajo flujo y una elevada resistencia y uno con un flujo rápido y baja resistencia se crea la misma energía turbulenta. Por lo tanto, existen variaciones en los diferentes dispositivos. En la guía de Chandel et al. (2019) se concluyó que no existían diferencias significativas en los resultados clínicos obtenidos empleando los diferentes inhaladores (Geller, 2005). 1.2.1.3. Nebulizadores Constituyen un tipo de dispositivos menos empleado. Convierten, utilizando energía mecánica o ultrasonidos, una disolución o una suspensión de un fármaco en un aerosol niebla, formado por gotículas de tamaño muy reducido, que son inhaladas de forma inmediata por el paciente (Ari, 2014). Estos sistemas presentan ciertas limitaciones, como su utilización con fármacos que posean una solubilidad acuosa limitada, ya que pueden cristalizar o precipitar, haciendo difícil la nebulización. Además, los nebulizadores son menos efectivos que los sistemas presurizados para conseguir una dosis adecuada y una medicación consistente. Por otra parte, la nebulización suele generar más residuos y se desperdicia más fármaco, por lo que los costes se incrementan. 142 No obstante, el nebulizador aporta eficacia in vitro, ya que este dispositivo no requiere coordinación ni pausa respiratoria, y se puede hacer de manera continua, permitiendo administrar diferentes fármacos juntos o por separado, así como modificar la concentración de éstos, aportando bastante información en el laboratorio. La eficacia del dispositivo también es variable, según el nebulizador, y dependiente de la técnica y de factores del propio dispositivo utilizado. Básicamente, los nebulizadores pueden ser de tres tipos:  Tipo “jet”: se usan normalmente para el tratamiento de pacientes con enfermedades pulmonares: son voluminosos y requieren una fuente de energía. Debido a las gotas aerosolizadas y al solvente que satura el aire que sale, los nebulizadores de este tipo enfrían la solución de fármaco en el nebulizador y aumenta la concentración de soluto en el volumen residual (Abdelbary et al., 2012). Figura 6. Nebulizador tipo “jet”. A) Aire inhalado adicional. B) Pieza para la boca: está pensada para la inhalación por parte del paciente. C) Liberación del aerosol a través del orificio mediante el paso del gas a través de él. D) Deflector del aerosol que tiene lugar tras el choque del aire con éste. E) Reservorio del fármaco. F) Fuente de aire externa. Adaptada de Chandel et al. (2019).  Ultrasónicos: son más eficientes y compactos que el tipo “jet”, pero no se pueden utilizar para la liberación de proteínas o suspensiones por su posible desnaturalización y desestabilización, respectivamente (Geller, 2005). Son los que se usan preferentemente para la liberación de partículas aerosolizadas. 143 Figura 7. Nebulizador ultrasónico. A) Generador responsable de la generación de ondas ultrasónicas. B) Las ondas ultrasónicas se forman a través del generador. C) El aire se genera a través de la boquilla. D) Ventilador. E) Pieza para la boca diseñada para la inhalación. F) Cable al que se conecta la fuente de alimentación. Adaptada de Chandel et al. (2019).  De ”malla vibrante”: usan ondas de menor frecuencia, eliminando temperaturas elevadas y otros factores que provocan la desnaturalización proteica. También han demostrado ser útiles para la liberación de suspensiones de liposomas y ácidos nucleicos (Rüegger y Bassler, 2019). 1.2.2. Deposición de partículas y mecanismos de aclaramiento de las vías aéreas Otra razón que contribuye a ello es la incapacidad del paciente para cooperar con los diferentes tipos de inhaladores. La mejora en la terapia de aerosoles requiere una correcta comprensión por parte del paciente y un diseño favorable del inhalador para conseguir resultados favorables para los desórdenes respiratorios. La deposición pulmonar de la medicación inhalada difiere según los diferentes inhaladores que se encuentran disponibles en el mercado. Estudios realizados sobre la deposición pulmonar de la medicación inhalada indican que la respuesta terapéutica depende de la mezcla fármacopropelente, del patrón respiratorio del paciente y del diseño del dispositivo (Tronde et al., 2003). A lo largo de las vías respiratorias, las partículas o gotículas de la formulación administrada por inhalación, se depositan en una zona determinada, siendo esta región en la que se retienen las partículas donde se produce la acción del principio activo (Deng et al., 2019). Una vez inhalada la formulación por la boca, existen tres mecanismos de deposición para las partículas o gotículas que se dirigen hacia el pulmón: impacto por inercia, sedimentación gravitacional y difusión browniana, como se recoge en la Figura 8. El 144 impacto y la sedimentación tienen una papel primordial en la deposición de micropartículas y agregados de nanopartículas. Por ejemplo, aquellas micropartículas con tamaños superiores a 5 µm, se depositan en la orofaringe debido a su gran tamaño, que resulta en una elevada gravitación e inercia (Williams et al., 2011). El comportamiento de las nanopartículas se encuentra afectado por difusión, mientras que la influencia del impacto y la sedimentación es casi nulo. La respiración profunda lleva a la deposición porque confiere más tiempo para la difusión de las nanopartículas. Sin embargo, el aclaramiento mucociliar juega un papel fundamental en el aclaramiento pulmonar de las partículas depositadas: las células ciliadas del epitelio mueven el moco y a las partículas hacia la faringe, siendo deglutidas o expectoradas (Tronde et al., 2003). Figura 8. Mecanismos de deposición de partículas y zona de las vías aéreas donde se depositan según ese mecanismo (adaptado de Williams et al., 2011). El aclaramiento mucociliar tiende a tener un mayor impacto en partículas insolubles con un diámetro mayor de 6 µm. En cambio, las partículas pequeñas tienden hacia la deposición alveolar, estando disueltas o retenidas durante más tiempo en el pulmón que las grandes insolubles. Mientras que las partículas pequeñas depositadas en el alveolo tienden a ser fagocitadas por los macrófagos alveolares, parece que las partículas de 1.5 – 3.0 µm tienden a ser más susceptibles a la fagocitosis. En la Figura 9 quedan recogidos