Efecto del tratamiento con metformina en el sistema dopaminérgico nigroestriado: posible implicación en la enfermedad de parkinson.

“Lee” Es la primera palabra que vino en el Corán, una indicación clara de la importancia de la ciencia en la construcción y el desarrollo de la civilización humana. UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA Dpt. Bioquímica y Biología Molecular AFRAH ABDUL KARIM ISMAIEL TESIS DOCTORAL. 2014 EFECTO DEL TRATAMIENTO CON METFORMINA EN EL SISTEMA DOPAMINÉRGICO NIGROESTRIADO. POSIBLE IMPLICACIÓN EN LA ENFERMEDAD DE PARKINSON DEDICATORIA Y AGRADECIMIENTOS ABREVIATURAS 6-OHDA ACh ATP AICAR α-sin AMPc AMPK ATV BHE CB CR DA DAT DE DMSO DOPA EA EP ERK EROs FBS GABA Glu GP GPe GPi GPI GT1b HPM IgG IL iNOS i.p. IRAK JNK K.O. LBP L-DOPA LPS LRR 6-hidroxidopamina Acetilcolina Adenosina trifosfato 5-amino-4-imidazol- carboxamida ribosa Alfa-sinucleína Adenosín monofosfato cíclico Proteína quinasa activada por AMP Área tegmental ventral Barrera hematoencefálica Calbindina Calretinina Dopamina Transportador de dopamina Desviación estándar Dimetil sulfóxido Dihidroxifenilalanina Enfermded de Alzheimer Enfermedad de Parkinson Quinasa regulada por señales extracelulares Especies reactivas de oxígeno Suero fetal bovino Ácido γ-aminobutírico Glutamato Globo pálido Globo pálido externo Globo pálido interno Glicosilfosfatidilinositol Trisialogangliósido Haz prosencefálico medial Inmunoglobulina G Interleuquina Óxido nítrico sintasa inducible Intraperitoneal Quinasa asociada al receptor de IL-1 Proteinquinasa del factor de transcripción c-jun Knockout Proteína de unión al LPS Levodopa Lipopolisacárido Repeticiones ricas en leucina MAPK MHC MPDP+ MPO MPP+ MPPP MPTP MTT NADPHox NF-κB NMDA NO NOS NST PBS PK PLC PV RLOs RT-PCR s.c. SM SN SNC SNc SNl SNr SUP TBS TF TH TK TNF TNFr TPB Proteína quinasa activada por mitógenos Complejo mayor de histocompatibilidad 1-metil-4-fenil-2,3- dihidropiridina Mieloperoxidasa 1-metil-4-fenilpiridina 1-metil-4-fenil-4- propionpiperidina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6- tetrahidropiridina Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5- difeniltetrazol NADPH oxidasa Factor nuclear κB N-metil-D-aspartato Óxido nítrico Óxido nítrico sintasa Núcleos subtalámicos Tampón fosfato salino Proteinquinasa Fosfolipasa C Parvoalbúmina Radicales libres de oxígeno PCR a tiempo real Subcutáneo Esfingomielasa Sustancia negra Sistema nervioso central Sustancia negra compacta Sustancia negra lateral Sustancia negra reticular Sistema ubiquitina-proteosoma Tampón Tris salino Factor tisular Tirosina hidroxilasa Tirosinquinasa Factor de necrosis tumoral Receptor de TNF Tetrafenilborato ÍNDICE ÍNDICE OBJETIVOS. INTRODUCCION. 1. GANGLIOS BASALES 1.1 Neurotransmisores y Neuromoduladores de los Ganglios Basales 1.2 Principales Conexiones de los Ganglios Basales 1.2.1 Vía de la Corteza a los Ganglios Basales y de nuevo hacia la Corteza 1.2.2 Relaciones de los Núcleos Talámicos Intralaminares y Los Ganglios Basales 1.2.3 Tractos de salida de los Ganglios Basales hacia el Tronco Encefálico 1.2.4 Vía Nigro-Estriada 1.3 Funciones de Los Ganglios Basales 1.3.1 Inhibición del tono motor por los Ganglios Basales 1.3.2 Función del Núcleo Caudado y Putamen 1.3.3 Función del Globo Pálido 1.4 Síndromes Clínicos Resultantes del Daño a los Ganglios Basales 1.4.1 Enfermedad de Parkinson 2. TEORÍAS Y MODELOS DE NEURODEGENERACIÓN 2.1 Animales Transgénicos 2.2 Modelos Basados En La Inyección de Neurotoxinas 2.2.1 Estrés Oxidativo 2.2.2 Fallo Energético Mitocondrial 2.2.3 Inflamación 3. MODELO ANIMAL DE EP POR FALLO ENERGÉTICO MITOCONDRIAL: INYECCIÓN DE MPTP 3.1 Descubrimiento del MPTP Como Modelo de la EP 3.2 Modelo de MPTP En Ratón 3.3 Modo de Acción del MPTP 4. MODELO ANIMAL DE EP POR INFLAMACIÓN: INYECCIÓN DE LPS 4.1 Lipopolisacárido 4.1.1 Interacción Entre el LPS y Proteínas Solubles de Membrana 4.1.2 Transducción de Señal Inducida Por el LPS 4.2 LPS Como Modelo de la EP 5. MECANISMOS MOLECULARES EN LA NEURODEGENERACIÓN 6. LA METFORMINA 6.1 Mecanismo de Acción de La Metformina 6.2 Efecto Anti-Inflamatorio de La Metformina MATERIALES Y MÉTODOS 1. ANIMALES 2. CULTIVOS CELULARES 3. OPERACIONES QUIRÚRGICAS 4. TRATAMIENTOS 4.1 Ratas 4.2 Ratones 4.3 Células N27 1 5 5 7 8 10 11 12 12 15 15 15 16 17 17 21 22 24 25 26 26 31 32 33 36 39 39 40 42 45 52 57 60 64 71 71 71 73 74 74 74 75 ÍNDICE 5. PERFUSIÓN DE LOS ANIMALES 6. INMUNOCITOQUÍMICA DE TIROSINA HIDROXILASA, OX-6 E IBA-1 7. DESHIDRATACIÓN Y MONTAJE DE LAS SECCIONES 8. ANÁLISIS DE LOS DATOS INMUNOHISTOQUÍMICOS 9. PCR A TIEMPO REAL 10. MEDIDA DE DA Y DOPAC 11. ENSAYOS DE VIABILIDAD CELULAR 11.1 Ensayo del MTT 11.2 Ensayo de Muerte Celular 12. MEDIDA DE LOS NIVELES DE ATP PARA EVALUAR EL GRADO DE LA INHIBICIÓN DEL COMPLEJO I MITOCONDRIAL 13. MEDIDA DE LA PRODUCCIÓN DE EROS 14. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 15. REACTIVOS RESULTADOS 1. EFECTO DE LA METFORMINA EN LA ACTIVACIÓN MICROGLIAL Y EN LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE TNF-a, IL-1Β E INOS. 2. EFECTO DE LA METFORMINA EN EL SISTEMA DOPAMINERGICO 2.1 Inmunoreactividad De Las Células Dopaminergicas En SN. Recuento de Células TH 2.2 Cuantificación de La Cantidad de Dopamina y DOPAC 3. EFECTO DE LA METFORMINA Y EL MPP+ SOBRE LA VIABILIDAD CELULAR DE NEURONAS DOPAMINÉRGICAS N27 3.1 Ensayo de Viabilidad Celular 3.2 Ensayo de Muerte Celular 3.3 Efecto de La Metformina y El MPP+ sobre los niveles de ATP en Las Neuronas N27 3.4 Efecto de La Metformina Y El MPP+ Sobre La Producción de Especies Reactivas de Oxígeno En Las Neuronas N27 DISCUSIÓN 1. EFECTO DE LA METFORMINA EN EL MODELO DE LPS 1.1 Efecto de La Metformina Sobre La Activación Microglial 1.2 Efecto de La Metformina Sobre La Pérdida Neuronal 2. EFECTO DE LA METFORMINA EN EL MODELO DE MPTP 2.1 Efecto de La Metformina Sobre La Activación Microglial 2.2 Efecto de La Metformina Sobre La Pérdida Neuronal 3. EFECTO DE LA METFORMINA EN LA VIABILIDAD NEURONAL Y LA PRODUCCIÓN DE ATP 4. EFECTO DE LA METFORMINA SOBRE LA PRODUCCIÓN DE EROS 5. RELACIÓN ENTRE METFORMINA Y ENFERMEDAD DE PARKINSON CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA 77 77 79 79 80 82 83 83 84 84 85 86 86 91 91 99 99 104 106 106 110 111 114 117 119 119 122 125 126 127 129 131 132 139 143 OBJETIVOS OBJETIVOS 1 Dada la relevancia de la neuroinflamación en el desarrollo de la enfermedad de Parkinson (EP) y la actividad anti-inflamatoria de la metformina, el objetivo del presente trabajo es determinar si el tratamiento con este fármaco es capaz de proteger a las neuronas Dopaminergicas (Daérgicas) de la sustancia negra compacta (SNc) de un fuerte estímulo inflamatorio inducido a través de dos modelos animales de EP, el inducido por la inyección intranigral del inflamógeno lipopolisacárido bacteriano (LPS) y el inducido por la inyección intraperitoneal (i.p.) de la neurotoxina 1-metil-4-fenil- 1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP). Para ello, se llevarán a cabo técnicas inmunohistoquímicas combinadas con técnicas estereológicas para determinar el número de neuronas DAérgicas supervivientes tras los dos tratamientos mencionados. Así mismo, se llevarán a cabo técnicas de HPLC para cuantificar el contenido de dopamina (DA) y Dihidroxifenilalanina (DOPAC) en el estriado de los animales, como una medida indirecta de la pérdida neuronal en la SNc. Varios estudios han mostrado que uno de los posibles mecanismos protectores de la metformina es su capacidad para inhibir la inflamación, por lo que se estudiará el grado de inflamación cerebral tanto a nivel celular como molecular. La densidad de microglía reactiva será cuantificada a partir de criterios morfológicos por inmunohistoquímica de Iba1 y OX-6. Para el estudio de la liberación de citoquinas proinflamatorias, tales como el factor de necrosis tumoral (TNF-α), la Interleuquina 1β (IL- 1β) o la IL-6, se llevarán a cabo técnicas de PCR a tiempo real (RT-PCR). Para completar los estudios in vivo, se llevarán a cabo estudios in vitro a través del cultivo de células DAérgicas N27 a las que se tratarán con diferentes dosis de 1- metil-4-fenilpiridina (MPP+) y de metformina. A partir de estos cultivos celulares se estudiará la viabilidad neuronal, la producción de radicales y la producción de Adenosina trifosfato (ATP) bajo los distintos tratamientos. Finalmente, se llevarán a INTRODUCCIÓN 8 El principal neurotransmisor de los ganglios basales es el GABA, que tiene acción inhibitoria. En el estriado, el GABA se halla en las neuronas de proyección, las neuronas espinosas de tipo medio. Estas neuronas, que poseen abundantes espinas dendríticas, proyectan sus axones a los dos segmentos del GP (GPe y GPi) y a la SNr. Además del GABA, las neuronas espinosas medias contienen encefalinas o sustancia P y dinorfinas. Las neuronas de proyección de los segmentos interno y externo del GP y de la SNr contienen también GABA. En consecuencia, el núcleo de salida de los ganglios basales es inhibidor. El Glu, considerado un neurotransmisor excitatorio, se encuentra en las neuronas piramidales, siendo la principal aferencia al estriado (el principal núcleo de entrada a los ganglios basales), en las terminales de las neuronas talámicas en el estriado y en las neuronas de proyección de los NST. (Rajakumar, 1994). Las neuronas de la parte compacta de la SN y del ATV son dopaminérgicas (DAérgicas). El término “substantia nigra” deriva de la presencia del pigmento negro neuromelanina, contenido en las neuronas de la parte compacta. La neuromelanina es un polímero de dihidroxifenilalanina (DOPA), precursor de la DA. La ACh es también un neurotransmisor habitual en los ganglios basales, encontrándose presente en las interneuronas del estriado, en las que es un neurotransmisor importante para la función de los circuitos neuronales (Fig. 2). (Haber, 1968). 1.2. PRINCIPALES CONEXIONES DE LOS GANGLIOS BASALES. Al contrario que la mayoría de los componentes del sistema motor, los núcleos subcorticales no reciben ni envían ninguna conexión directa con la médula espinal. Su aferencia principal proviene de la corteza cerebral y su eferencia se dirige, a través del INTRODUCCIÓN 9 tálamo, de vuelta a la corteza, concretamente a las regiones prefrontal, premotora y motora. Por tanto, los ganglios basales, junto con el cerebelo, constituyen el más importante bucle subcortical del sistema motor. Fig. 2. Ilustración de los neurotransmisores de los ganglios basales (en negro) en relación con la organización de los circuitos de estos ganglios. Las flechas azules indican conexión de tipo excitador mediada por Glu, y las flechas rojas indican conexión de tipo inhibidor mediada por GABA. La conexión entre la SNc y el estriado, que está mediada por DA, puede ser excitadora (si actúa sobre receptores D1) o inhibidora (si actúa sobre receptores D2). GABA, ácido γ-aminobutírico; GPi, segmento interno del globo pálido; GPe, segmento externo del globo pálido; SNr, parte reticulada de la SN; SNc, parte compacta de la SN; ATV, área tegmental ventral; NST, Núcleos subtalámicos. (Adaptado de Haber, S.N. 1968). El cerebelo regula directamente la ejecución del movimiento, mientras que los ganglios basales están implicados en aspectos cognitivos y de orden superior del control motor. Además, debido a las extensas conexiones de la corteza asociativa y estructuras límbicas, los ganglios basales participan en aspectos no relacionados con el movimiento, como las funciones afectivas y cognitivas. (Bourdiol, 1991). INTRODUCCIÓN 10 A continuación se describen con más detalle, las distintas conexiones que recorre la señal neuronal desde su aferencia principal, la corteza, hacia los ganglios basales, y de nuevo hacia la corteza una vez procesada la información. 1.2.1. VÍA DESDE LA CORTEZA HASTA LOS GANGLIOS BASALES Y DE NUEVO HACIA LA CORTEZA. La Figura 3 ilustra la vía que compromete el mayor número de fibras nerviosas del sistema de los ganglios basales. Comienza en todas las áreas de la corteza cerebral y pasa a través de las cuatro etapas siguientes: 1) Desde la corteza hacia el núcleo caudado y putamen. 2) Desde el núcleo caudado y putamen hacia el GP, penetrando finalmente en el segmento medial del GP. 3) Desde el segmento medial del GP hasta los núcleos ventroanterior y ventrolateral del tálamo. Hacia estos mismos núcleos talámicos se transmiten también las señales provenientes del cerebelo. 4) Desde los núcleos ventroanterior y ventrolateral del tálamo de nuevo hacia todas las áreas de la corteza. Esencialmente, todas las fibras nerviosas provenientes del caudado y el putamen hacia el GP (etapa 2) son vías inhibitorias que liberan el neurotransmisor GABA de sus terminaciones nerviosas. Debido a este paso inhibitorio, esta vía circular que comienza en la corteza y regresa nuevamente a ésta, forma un circuito de retroalimentación negativa que proporciona estabilidad a muchos aspectos de las interacciones del control motor. INTRODUCCIÓN 11 Fig. 3. Representación esquemática de las principales conexiones de los ganglios basales. El principal componente de los ganglios basales, el estriado, recibe aferencias de la corteza. Dos vías de salida principales se dirigen al GP y al complejo de la parte reticulada de la SN. Las neuronas de DA de la SNc mandan proyecciones al estriado y proporcionan una retroalimentación a través de la vía nigroestriada. (Leisman y Melillo, 2013). 1.2.2. INTERRELACIONES DE LOS NÚCLEOS TALÁMICOS INTRALAMINARES Y LOS GANGLIOS BASALES. Existe un circuito de retroalimentación entre los núcleos intralaminares del tálamo y los ganglios basales que es similar al circuito de retroalimentación entre la corteza cerebral y los ganglios basales. También existe una estrecha relación con la INTRODUCCIÓN 12 parte inferior del tronco encefálico. Son, en conjunto, porciones antiguas del sistema nervioso que tienen importancia en el control de los aspectos más primitivos del control motor (Carr, 1989). 1.2.3. TRACTOS DE SALIDA DESDE LOS GANGLIOS BASALES HACIA LA PARTE INFERIOR DEL TRONCO ENCEFÁLICO. Aunque se sabe que los ganglios basales pueden tener efectos importantes sobre las funciones del control motor del tronco encefálico, sorprendentemente existen pocas proyecciones de fibras nerviosas directas desde los ganglios basales hacia la parte inferior del tronco encefálico. No obstante, existen varias vías pequeñas que se dirigen hacia la formación reticular del tronco encefálico. La mayor parte de las señales que provienen del GP pasan a través de los NST o de la SN antes de penetrar en la formación reticular. (Floor, 1998). 1.2.4. VIA NIGRO-ESTRIADA. La SN, aunque presenta una situación más caudal, se incluye dentro de las estructuras de los ganglios basales por su íntima relación anatómica y funcional. Es un núcleo mesencefálico, el cual yace dorsal al crus cerebri, un tracto nervioso que se halla entre el cerebro y la médula oblonga, y se extiende hacia el mesencéfalo; juega un papel central en el control del movimiento, y actúa como centro principal de salida y entrada de los ganglios basales (Parent y col 1983; Fink y smith, 1990). Ha sido dividida citoarquitectónicamente en tres partes diferentes: 1) la SNc, formada por una capa horizontal empaquetada de células largas y medias que ocupan 1/3 del dorsal; 2) SNr, una división más difusa y pobre en células, que contiene neuronas medias y pequeñas dispuestas entre las SNc y el pedúnculo cerebral; y 3) SNl, formada por un pequeño INTRODUCCIÓN 13 grupo de células medianas que se extienden rostro-caudalmente a lo largo del borde lateral de la SNc y la SNr (Danner y Pfister, 1982; Fallon y Seroogy , 1985; Yelnik y col, 1987; McRitchie y Halliday, 1995; McRitchie y col, 1996). Los cuerpos neuronales DAérgicos localizados en la SNc proyectan sus axones hacia el núcleo caudado o el putamen (Lindvall y Björklund, 1978). Esta proyección nigro-estriada es principalmente ipsilateral, donde sólo un 5% de sus fibras cruzan al neoestriado contralateral (Parent y col, 1983). Estas proyecciones DAérgicas establecen conexiones con diversos sistemas neuronales, entre las que se encuentran las interneuronas colinérgicas (McGeer y McGeer, 1980). Así, del 30 al 50% de las células del núcleo caudado proyectan a la SN (Bunney y Aghajanian, 1976). Además, también hay neuronas del GP que proyectan a la SN (Grofová, 1975). La mayoría de las fibras originadas en el neoestriado acaban en la SNr (Grofová, 1975), mientras que las originadas en el GP hacen sinapsis en la SNc (Hattori y col, 1975). De acuerdo con su neurotransmisor, las neuronas nigrales se clasifican en DAérgicas y GABAérgicas (Dahlström y Fuxe, 1964; Hökfelt y col, 1984; Mugnaini, 1985); ambas están involucradas en los diferentes desórdenes patofisiológicos de los ganglios basales (Albin y col, 1989). Las neuronas GABAérgicas son uno de los más importantes puntos de salida de los ganglios basales proyectando al tálamo, al colículo y al tegmentum (Grofová, 1982; Appell y Behan, 1990; Moriizumi y Hattori, 1992; Redgrave y col, 1992), y las neuronas DAérgicas son el origen de la proyección ascendente mesotelencefálica, cuyo principal blanco es el estriado (Lindvall y Björklund, 1978; Fallon y col, 1983; Gerfen y col, 1985). Las neuronas DAérgicas de la SN corresponden al grupo de células de la zona A9 de Dahlström y Fuxe (1964) y mientras estas se encuentran dispuestas cerca del mesencéfalo, la formación reticular retrorrubral y el ATV, se identificaron como A8 y A10 respectivamente. La mayoría de INTRODUCCIÓN 14 las neuronas DAérgicas se localizaron en la SNc, algunas en la SNr, y sólo unas pocas de ellas dispuestas en la SNl (Hökfelt y col, 1984; Mugnaini, 1985; Smith y col, 1987; German y Manaye, 1993; Nelson y col, 1996). Además de la DA y del GABA, se han encontrado en las células de la SN otras sustancias neuroactivas. La colecistoquinina (CCK), un péptido que ha sido propuesto como modulador de la liberación de diferentes neurotransmisores (Crawley, 1991; Wu y Wang, 1994; You y col, 1996), se expresa en una porción significativa de las células DAérgicas (Fallon y col, 1983; Hökfelt y col, 1984; Seroogy y col, 1989). La Calbindina D28k (CB), la Calretinina (CR) y la Parvoalbúmina (PV), son tres proteínas unidas a Ca2+ intracelular (Heizmann, 1984; Baimbridge y col, 1992; Heizmann y Braun, 1992) que se han relacionado con la neuroprotección (Iacopino y col, 1990; Iacopino y col, 1992; Geloso y col, 1998) y con algunas propiedades fisiológicas de las neuronas (Carr y col, 1989). La CB se expresa en las neuronas DAérgicas de la parte medial (McRitchie y Halliday, 1995; McRitchie y col, 1996) y dorsal de la SNc (Gerfen, 1992) y en la SNl (McRitchiey col, 1996; Liang y col, 1996). La CR está presente en aproximadamente el 50% de las neuronas DAérgicas de la SNc, en el 55- 80% de la SNl y una pequeña porción de ellas en la SNr (Liang y col,1996; McRitchie y Halliday, 1995). La PV, por el contrario, sólo está presente en las neuronas GABAérgicas de la SNr y SNl (Reiner y Anderson, 1990; Rajakumar y col, 1994). Por otra parte, neuronas distribuidas en la SNr y SNl muestran inmunorreactividad a la óxido nítrico sintasa (NOS) (Rodrigo y col, 1994), la enzima responsable de la síntesis del óxido nítrico (NO), una pequeña molécula libre que ha sido involucrada como mensajero intercelular en eventos fisiológicos como la potenciación a largo plazo y la liberación de neurotransmisores (Faber-Zuschratter y Wolf, 1994; Schuman y Madison, 1994; Garthwaite y Boulton, 1995), y como mediador INTRODUCCIÓN 15 de procesos neuroprotectores y neurotóxicos (Dawson y col, 1991; Lei y col, 1992), incluyendo aquellos que implican a las neuronas de la SN (Hantraye y col, 1996; Przedborsky coli, 1996; González-Hernández y col, 1997). 1.3. FUNCIONES DE LOS GANGLIOS BASALES. Para poder definir las funciones de los ganglios basales, describiremos preferiblemente las funciones de ciertas porciones del sistema de ganglios basales, teniendo en cuenta que el sistema realmente opera junto con la corteza motora y el cerebelo como una unidad total, y que no pueden asignarse funciones particulares a las diferentes partes individuales de los ganglios basales. 1.3.1. INHIBICIÓN DEL TONO MOTOR POR LOS GANGLIOS BASALES. Uno de los efectos generales de la excitación difusa de los ganglios basales es inhibir el tono muscular en todo el cuerpo. Este efecto es el resultado de señales inhibitorias transmitidas desde los ganglios basales tanto hacia la corteza motora como hacia la parte inferior del tronco encefálico. En consecuencia, cuando se produce una destrucción extensa de los ganglios basales se provoca una rigidez muscular en todo el cuerpo. No obstante, la estimulación de ciertas áreas específicas dentro de estos ganglios puede desencadenar contracciones musculares y a veces patrones complejos de movimientos (Parent y Hazrati 1995). 1.3.2. FUNCIÓN DEL NÚCLEO CAUDADO Y PUTAMEN. Parecen funcionar juntos para iniciar y regular movimientos corporales intencionados que normalmente llevamos a cabo de forma inconsciente, INTRODUCCIÓN 16 comprometiendo también a la corteza motora. Para llevar a cabo esta función, transmiten impulsos a través de dos vías diferentes: 1) hacia el GP, pasando desde allí al tálamo, hacia la corteza cerebral y finalmente hacia abajo en dirección a la médula espinal por la vía corticoespinal; 2) hacia abajo a través del GP y la SN, por medio de axones cortos hacia la formación reticular y finalmente hacia la médula espinal principalmente a través de los tractos reticuloespinales (Jones y col, 1995). 1.3.3. FUNCIÓN DEL GLOBO PÁLIDO. Prácticamente todo el flujo de salida de señales proveniente de los ganglios basales es canalizado a través del GP en su regreso hacia la corteza o en su vía hacia centros cerebrales inferiores. También tiene otra función que opera en estrecha relación con el subtálamo y el tronco encefálico para ayudar a controlar los movimientos corporales axiales y de la cintura, así como las funciones motoras de las manos y de los pies. Las lesiones en el GP interfieren seriamente en los movimientos asociados a actividades precisas, en los que son necesarios una ubicación concreta y específica de la mano, por lo que resultaría difícil o imposible la utilización de ésta para actividades definidas. La estimulación eléctrica del GP mientras se está llevando a cabo un movimiento corporal brusco, detendrá a menudo el movimiento en una posición estática, sosteniendo esa posición durante unos segundos mientras la estimulación continua. Por tanto el GP está implicado en algún tipo de sistema de control motor por retroalimentación que es capaz de bloquear las diferentes partes del cuerpo en posiciones específicas (Parent y col, 1983). INTRODUCCIÓN 17 1.4. SÍNDROMES CLÍNICOS RESULTANTES DEL DAÑO A LOS GANGLIOS BASALES. Como se ha comentado, existe una notable variedad de disfunciones conductuales que van asociadas a la patología de los ganglios basales. Entre ellas se encuentran la EP, la enfermedad de Huntington, la atenosis y el hemibalismo, entre otras. 1.4.1. ENFERMEDAD DE PARKINSON. La EP es una enfermedad neurodegenerativa progresiva y crónica que afecta a más de seis millones de personas en el mundo. La media de edad ronda los 60 años, siendo la edad un factor de riesgo irrefutable para esta enfermedad idiopática (Rijk y col., 1997). Referencias históricas de síntomas motores similares a los de la EP se encuentran desde el siglo 12 a.C. Sin embargo, hasta que James Parkinson no publicó “Un Ensayo de La Parálisis Agitante” en 1987 y Jean-Martin Charcot no añadió más síntomas a la descripción original de Parkinson, la EP no ganó un reconocimiento como entidad clínica distintiva. En la EP se produce una severa patología de los ganglios basales, con especial predilección por la zona ventrolateral de la SNc (Tretiakoff, 1919). La aparición de ciertos rasgos clínicos, como la ataxia, reflejan degeneración en otras áreas cerebrales. Estas regiones incluyen al núcleo periamigdaloide, al locus coeruleus, al núcleo motor dorsal del vago, a la sustancia innominada, a los núcleos del rafe y al hipotálamo. El síndrome es normalmente asimétrico, con patología de los ganglios basales en el hemisferio contralateral. En la SNc de estos enfermos no se encuentra presente la neuromelanina. También se encuentran afectadas las neuronas DAérgicas de otras partes del sistema INTRODUCCIÓN 24 Otro modelo es el animal K.O. para el gen DJ-1. Dicho gen está relacionado con procesos que incluyen estrés oxidativo y transformación celular. Sus mutaciones se han relacionado con un desarrollo temprano de la EP. En general, los estudios en ratones con ausencia de expresión de DJ-1, muestran déficit en las funciones motoras y alteraciones de los niveles de DA en la via nigroestriada. Las mutaciones en el gen PINK1 son la segunda causa más frecuente de herencia de EP familiar, y se piensa que su finalidad es la de prevenir la disfunción mitocondrial. De manera que el estudio con ratones K.O. para PINK1 mostraron que actúan en la protección celular contra el estrés oxidativo, al igual que ocurría con DJ-1. Por último, se ha descrito un grupo de animales transgénicos que sobreexpresan la α-sin, con los que se pretende reproducir en la mayor medida posible la patología humana. Se han generado diferentes cepas de ratones transgénicos, con formas salvajes y/o mutadas de la alfa-sinucleína (α-sin) humana bajo diferentes promotores (Fig. 4). Los resultados han sido animales con un menor número de terminales DAérgicas, inclusiones citoplásmicas de α-sin y ubiquitina, y depósitos nucleares (Masliah y col, 2000). 2.2. MODELOS BASADOS EN LA INYECCIÓN DE NEUROTOXINAS. Una de las características de la EP en todos los modelos animales inducidos por toxinas es la neurodegeneración de las neuronas DAérgicas de la SNpc. Cada modelo, sin embargo, tiene sus propias particularidades, dependiendo de las especies involucradas y la toxina utilizada. En otras palabras, la muerte de las células DAérgicas es la piedra angular de estos modelos animales, pero el mecanismo de acción difiere entre ellos. INTRODUCCIÓN 25 La EP se puede modelar en niveles histológicos, moleculares, y conductuales. Cuando el objetivo de la investigación es el estudio de las consecuencias de la muerte de células DAérgicas y para probar miméticos de DA u otras estrategias para el tratamiento de los síntomas, el mecanismo de acción de la neurotoxina es irrelevante. Sin embargo, este no es el caso si el objetivo es el estudio de las rutas implicadas en la muerte celular neuronal o el desarrollo de estrategias neuroprotectoras. Para ambas circunstancias, la validación del modelo animal utilizado se basa en la posibilidad de convertir los resultados obtenidos con el modelo en una aplicación clínica para el tratamiento de los pacientes con EP. Respecto al primer caso, estos modelos han hecho posible que la L-DOPA y otras drogas dirigidas a los síntomas se desarrollen como una opción terapéutica. En el segundo caso, los modelos ayudaron a esclarecer algunos aspectos de la patogénesis de la EP, tales como el papel del estrés oxidativo, la apoptosis, la disfunción mitocondrial, la inflamación, el deterioro de las proteínas y las vías de degradación de los orgánulos y la α-sin (Bové y Perier, 2012). 2.2.1. ESTRÉS OXIDATIVO. La más importante de las teorías de neurodegeneración se refiere al estrés oxidativo como causa del daño a las neuronas del SNC. Este estrés oxidativo podría estar originado por un incremento de los niveles de radicales libres de oxígeno (RLOs) o bien por una disminución de los mecanismos de defensa frente a ellos. El modelo animal de EP por estrés oxidativo más importante es el basado en el uso de la 6-hidroxidopamina (6-OHDA) como una toxina DAérgica específica. La 6-OHDA destruye las neuronas DAérgicas mediante un mecanismo mediado por radicales libres (Cohen y Heikkila, 1974). La especificidad de la neurotoxicidad de la 6-OHDA está asociada a su recaptación por un mecanismo de transporte específico de las propias neuronas INTRODUCCIÓN 26 DAérgicas (el transportador de recaptación de DA; DAT) donde se acumula y oxida para producir peróxido de hidrógeno, superóxido y radicales hidroxilos (Cohen y Heikkila, 1974; Graham, 1978). 2.2.2. FALLO ENERGÉTICO MITOCONDRIAL. Existen numerosos datos que apuntan a la implicación de defectos mitocondriales en la patogénesis de la EP (Beal, 2003), como la actividad reducida del complejo I en el cerebro, las plaquetas y el músculo esquelético de pacientes con EP (Parker y col., 1989; Schapira y col., 1990). Aunque ésta no parece ser la causa primaria de la enfermedad, podría ser un factor importante en su desarrollo. El modelo animal de EP por fallo energético mitocondrial más habitual e importante es el basado en el uso del MPTP y su metabolito MPP+, un compuesto cuyo principal efecto tóxico es la inhibición de la actividad del complejo I mitocondrial (Gu y col, 1998). Su selectividad sobre las neuronas DAérgicas parece ser debida a su recaptación en las terminales nerviosas del sistema DAérgico a través del sistema de recaptación de DA anteriormente mencionado (Chiba y col, 1985; Javitch y col, 1985), con su posterior acumulación en la mitocondria. 2.2.3. INFLAMACIÓN. Desde 1988, cuando McGeer y col. mostraron la presencia de marcadores de inflamación en el SNC de pacientes con EP, se postuló la implicación de los eventos inflamatorios en la patogénesis de esta enfermedad neurodegenerativa. McGeer y col., 1988 a, b). Ellos mostraron la presencia de linfocitos T, supresores citotóxicos, CD+ y de células microgliales con el complejo mayor de histocompatibilidad clase II activado (MHC II), en el tejido de pacientes con EP. INTRODUCCIÓN 27 Además, se han descrito diferentes marcadores inflamatorios en cerebros parkinsonianos (Hunot y Hirsch, 2003): (a) Importantes proliferaciones de macrófagos ameboides y microglía reactiva (McGeer y col., 1988a; Hirsch y col., 1998). (b) También aparecen en la SN de este tipo de pacientes células gliales activadas que expresan distintas citoquinas proinflamatorias como el TNF-α, la IL-1β y el interferón γ (IFN- γ) (Mogi y col, 1994; Hunot y col, 1999), junto con una expresión de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) (Hunot y col,1997; Mogi y col, 1998). (c) Por último, se han encontrado incrementos en la expresión de IL-1β, IL-6 y TNF-α en el fluido cerebroespinal de pacientes con la EP. Aunque la activación de la microglía es la mayor defensa del cerebro, ésta produce la liberación de varias citoquinas, radicales libres como el ión superóxido (O2-) y el NO (Minghetti y col, 1999). Estos factores microgliales pueden incrementar la neurotoxicidad y contribuir a la neurodegeneración en las enfermedades mediadas por inflamación (McGeer y col, 1988a). (Fig. 5). En estas condiciones, los procesos inflamatorios (proliferación y activación de la microglía) podrían ser un evento secundario producido por los procesos degenerativos que ocurren directamente en las neuronas DAérgicas, pero al mismo tiempo podrían ayudar al progreso de la degeneración. Además, existe la posibilidad de que los procesos inflamatorios por sí mismos pudieran ser dañinos para las neuronas DAérgicas en el sistema nigroestriado. INTRODUCCIÓN 28 Fig. 5. Interacciones neurona-glía que podrían llevar a la muerte neuronal. La inflamación puede estar inducida directamente por diversos factores “externos” como un accidente cerebrovascular (ACV), una infección o un traumatismo, que también podrían producir la rotura de la barrera hematoencefálica (BHE) con la consiguiente extravasación de compuestos que podrían activar las células microgliales y llevar a la formación de RLO. Además, la microglía activada libera varios compuestos, como citoquinas proinflamatorias, NO y RLO, lo que podría llevar a la muerte neuronal. Dentro de la neurona DAérgica, la cadena respiratoria mitocondrial puede estar afectada por toxinas e inhibidores, lo cual llevaría a un fallo energético, a la producción de RLO y a la reducción de la viabilidad de las neuronas. Estos RLO podrían actuar como una señal para la activación de las células microgliales, indicando que las neuronas no están sanas. La DA puede ejercer una acción tóxica a través de sus metabolitos y formar RLO. La DA también puede formar complejos con la cisteína, inhibiendo la cadena respiratoria mitocondrial y produciendo más RLO. La inhibición de la activación microglial puede ser uno de los factores más importantes en la prevención de los procesos neurodegenerativos, ya que la eliminación de la inducción inflamatoria podría disminuir el daño neuronal (Herrera y col, 2005). Existen diversos inductores fisiológicos/patológicos de neuroinflamación, que podrían estar implicados en la degeneración del sistema DAérgico (Fig. 5). Diferentes toxinas, como 6-OHDA, el MPTP/MPP+ o rotenona, inducen un proceso inflamatorio, Energy failure Energy failure Fallo energético ACV Infeción Traumatismo Toxinas Inhibidores DA-Cys DA RLO Citokinas RLO NO BHE Microglia Necrosis o Apoptosis Energy failure Energy failure Energy failure Fallo energético ACV Infeción Traumatismo Toxinas Inhibidores DA-Cys DA RLO Citokinas RLO NO BHE Microglia Necrosis o Apoptosis INTRODUCCIÓN 29 además de sus mecanismos tóxicos específicos. También se ha descrito la relación entre el traumatismo físico y la EP (Lees, 1997; Tansey y col, 2007).Por otro lado, existen compuestos proinflamatorios capaces de producir la activación microglial junto con una inducción de los procesos inflamatorios. Entre estos compuestos destacan las inmunoglobulinas G (IgGs), LPS, trisialogangliósido (GT1b) y trombina. (A) Inmunoglobulinas G. Las células microgliales también son activadas por IgGs de pacientes parkinsonianos en presencia de membranas celulares DAérgicas modificadas, por bajas dosis de dopa-quinona o H2O2, pero no en presencia de membranas celulares colinérgicas (Le y col, 2001). Esta activación requiere del receptor microglial FCgammaR. A pesar de que la activación microglial produce la liberación de varias citoquinas y EROs, sólo el NO y el H2O2 parecen mediar en el daño celular DAérgico inducido por la microglía. (B) Lipopolisacárido. Los LPS de las bacterias Gram-negativas son moléculas glucolipídicas que constituyen la membrana de estos microorganismos. Estas moléculas han sido aisladas de una gran variedad de bacterias Gram-negativas y algunas cianobacterias. Estudios previos en nuestro laboratorio (Castaño y col., 1998; Herrera et al., 2000, 2005, 2008; de Pablos et al., 2005, 2006, 2014; Tomás-Camardiel et al., 2004; Hernández-Romero et al., 2008; Villarán et al., 2009) demostraron que la inyección de 2 µg de LPS en la SN de la rata induce una fuerte activación microglial junto con la inducción de la expresión de diversos mediadores de la inflamación, tales como la iNOS, la IL-1β, la IL-6 y el TNF-α. Esta reacción microglial se acompaña de una fuerte pérdida de neuronas DAérgicas en esta estructura. Esta degeneración es específica ya que la inyección de LPS no afecta en cambio a otras áreas cerebrales ni tampoco a INTRODUCCIÓN 30 otros fenotipos neuronales, por lo que se considera al LPS como el modelo de EP por inflamación por excelencia. (C) Trisialogangliósido. El GT1b es un componente abundante en las membranas celulares del sistema nervioso humano. Se ha demostrado que este compuesto induce la muerte de las neuronas DAérgicas en cultivos celulares de mesencéfalo de rata (Chung y col, 2001). Además, Ryu y colaboradores (2002) examinaron los efectos neurotóxicos del GT1b en las neuronas DAérgicas de la SN de ratas y encontraron que 7 días tras la inyección del GT1b se produce la muerte de neuronas nigrales, incluidas las neuronas DAérgicas, y una activación de la microglía presente en esta estructura. La neurotoxicidad ejercida por el GT1b sobre las neuronas DAérgicas de la SN es mediada, al menos en parte, por la liberación de NO de las células microgliales. (D) Trombina. La trombina es una serinproteasa multifuncional producida rápidamente desde la protrombina en los lugares de lesión y de rotura de la BHE, lo que sugiere que podría entrar fácilmente en el SNC. Estudios previos en nuestro laboratorio (Carreño-Müller y col, 2003) demostraron que la inyección de diferentes concentraciones de trombina en la SN de la rata produce una fuerte reacción macrófago/microglial en esta estructura Además, la inyección de trombina produce un daño selectivo sobre las neuronas DAérgicas de la SN, dejando inalteradas el resto de fenotipos neuronales presentes en esta estructura. INTRODUCCIÓN 31 3. MODELO ANIMAL DE EP POR FALLO ENERGÉTICO MITOCONDRIAL. INYECCIÓN DE MPTP. Como ya se ha comentado el modelo animal de EP por fallo energético mitocondrial más habitual e importante es el basado en el uso del MPTP y su metabolito MPP+ (1-metil-4-fenilpiridinium), un compuesto cuyo principal efecto tóxico es la inhibición de la actividad del complejo I mitocondrial (Gu y col, 1998). Su selectividad sobre las neuronas DAérgicas parece ser debida a su recaptación en las terminales nerviosas del sistema DAérgico a través del sistema de recaptación de DA anteriormente mencionado (Chiba y col, 1985; Javitch y col, 1985), con su posterior acumulación en la mitocondria. La relación cronológica que existe entre activación microglial y neurodegeneración, demuestra que la microgliosis resultante del tratamiento con MPTP es la que inicia el daño neuronal. Así mismo, la microglía contribuye al daño neuronal, a través de las especies reactivas de oxígeno (EROs) derivadas de la actividad de la NADPH oxidasa (NADPHox). Entre todos los factores medidos, la producción de superóxidos extracelulares por parte fundamentalmente de la NADPHox, es la más determinante. Experimentos con el inhibidor de la NADPHox, apomicina, atenúa la neurodegeneración provocada por el MPTP sólo en presencia de glia. Aún más significativo es el hecho de que neuronas DAérgicas de ratón, sin NADPHox, son significativamente más resistentes al daño por MPTP que aquellos cultivos controles (Gao y col, 2003a). La microgliosis reactiva actúa, mediante el daño inducido por MPTP, a través de la NADPHox, mediando la producción de superóxidos. Esto mostraba a su vez a la NADPHox como posible objetivo en terapias de tratamiento de la EP (Gao y col, 2003b). INTRODUCCIÓN 32 Debido a que en diversos tratamientos en los que se dañan las neuronas DAérgicas de la SN se produce fundamentalmente el daño a través de una inhibición mitocondrial del complejo I (6-OHDA, MPTP, etc.), parece ser que este paso, el del fallo mitocondrial, podría ser un paso común entre las causas de la patogénesis de la EP tanto en la rama genética como en la epigenética de la enfermedad. 3.1. DESCUBRIMIENTO DEL MPTP COMO MODELO DE LA EP. En ocasiones la ciencia avanza movida por la casualidad. Los casos de Barry Kidston y el de otros siete heroinómanos conocido como el caso de los adictos paralizados (The Case of the Frozen Addicts) ayudaron al descubrimiento del MPTP. Barry Kidston, estudiante de Química de 23 años, era adicto a las drogas. Usando sus conocimientos, sintetizó 1-metil-4-fenil-4-propionpiperidina (MPPP), un opiáceo análogo a la meperidina y con efecto similar a la heroína. En 1976, después de varios meses de administración intravenosa, en una urgencia, elaboró de nuevo el compuesto, pero acortó el método y algo salió mal. Tras varios días de consumo, ingresó en urgencias, manifestaba mutismo, rigidez severa, debilidad, temblores, cara inexpresiva y sensibilidad alterada. El equipo médico observó que los síntomas eran equivalentes a los que se producen en la EP y le administró L-DOPA, medicación habitual en el Parkinson. Kidston mejoró parcialmente. Con el tiempo desarrolló tolerancia a la L-DOPA, manifestaba lentitud de pensamiento, se deprimió y siguió consumiendo drogas. Dieciocho meses después murió víctima de una sobredosis de cocaína. La autopsia reveló una destrucción masiva de las neuronas de la SN que usan la DA como neurotransmisor. El análisis de los restos de la dosis defectuosa reveló la existencia de INTRODUCCIÓN 33 MPPP (el opiaceo deseado) junto con otras sustancias sin determinar claramente. Una inyección de la dosis en ratas produjo una parálisis parcial en el animal, pero el equipo no fue capaz de reproducir los resultados completos (posteriormente se demostró que las ratas son resistentes al compuesto tóxico. (Boyce y col., 1984; Chiueh y col., 1984). En 1982 un joven ingresó en un hospital de California en estado de parálisis. Poco después lo hizo su novia y en distintos hospitales otros tres jóvenes. Eran incapaces de hablar, pero uno de ellos podía mover la mano. El equipo liderado por William Langston le dio un papel y un lápiz y el joven escribió "heroína". Langston habló por televisión alertando de una partida tóxica de heroína y dos nuevos casos aparecieron, así como el vendedor de la droga que manifestó que era sintética. Investigaron la droga y resultó no ser heroína sino MPPP. Pero el MPPP no es tóxico de modo que no era el responsable del desastre. Alguien en el equipo recordó el caso de Barry Kidston y cotejaron ambas drogas. El análisis reveló una sustancia nueva MPTP, un subproducto indeseado de la síntesis de MPPP. Tras su aplicación en animales (concretamente en monos) y viendo en ellos muerte selectiva de las neuronas DAérgicas en la SN y un síndrome similar a la EP idiopática, se utiliza como un excelente modelo animal para la investigación de fármacos contra la enfermedad (Langston y col., 1984; Langston y Irwin, 1986). 3.2. EL MODELO DE MPTP EN RATÓN. El modelo de ratón con MPTP, especialmente la cepa C57BL (Heikkila y col., 1990; Arai y col., 1990; Araki y col., 2001; Muthane y col., 1994; Wu y col., 2002), es el modelo clásico utilizado para estudiar las vías moleculares que intervienen en la muerte de células neuronales en la EP y para probar la eficacia de neuroprotectores. Las INTRODUCCIÓN 40 P P P P P GlcN GlcN KDO KDO KDO HepHep Hep Glu Gal GalGlu Glu- Nac n Polisacárido O-específico Núcleo polisacarídico Lípido A Core externo Core interno Variabilidad alta intermedia baja Muy baja P P P P P GlcN GlcN KDO KDO KDO HepHep Hep Glu Gal GalGlu Glu- Nac n Polisacárido O-específico Núcleo polisacarídico Lípido A Core externo Core interno Variabilidad alta intermedia baja Muy baja Fig. 8. Estructura química y variabilidad del LPS. http://scielo.sld.cu/pdf/bta/v26n1/bta01109.pdf. hidrófobo, denominado lípido A (Fig. 8). El heteropolisacárido comprende dos regiones: la cadena O-específica también llamada antígeno O, formada por unidades repetitivas de oligosacárido, y la región central o core. Éste a su vez se subdivide en core externo (formado por hexosas), mediante el cual se une al antígeno O, y el core interno (formado por heptosas). El lípido A se compone en general de un disacárido fosforilado, unido a dos D-glucosaminas en posición β1,6 y que porta un máximo de seis o siete residuos acilo. Se une al core interno mediante un residuo llamado KDO (ácido 2-ceto-3-desoxioctanoico). Existen variaciones en la longitud, posición y número de ácidos grasos que componen el lípido A. 4.1.1. INTERACCIÓN ENTRE EL LPS Y PROTEÍNAS SOLUBLES DE MEMBRANA. Un requisito previo para la activación de las células por el LPS es su interacción con moléculas específicas de unión al LPS en la superficie de sus células diana. Se han descrito varias estructuras de unión al LPS, pero sólo se ha demostrado relevancia fisiológica para algunas de ellas (Fig. 9). La proteína de la superficie celular más importante relacionada con la unión al LPS y a su activación celular es la glucoproteína INTRODUCCIÓN 41 de 55 kDa CD14 (Tanaka y col, 2000). El CD14 existe como una proteína de membrana (CD14m) anclada a un glicosilfosfatidilinositol (GPI) en las células monocíticas, células epiteliales, leucocitos polimorfonucleares y algunos linfocitos B (Gu y col, 1998). La unión del LPS al CD14m en los monocitos es necesaria para la estimulación de estas células, lo cual lleva a una producción y liberación de mediadores inmunes. La unión del LPS al receptor CD14 está fuertemente incrementada por una glucoproteína sérica de 60 kDa denominada proteína de unión al LPS (LPS-binding protein o LBP) (Staal y Sonsalla, 2000; Tanaka y col, 2000). Durante la respuesta de fase aguda, la concentración de LBP se incrementa desde 5-10 μg/ml hasta 200 μg/ml (Staal y Sonsalla, 2000). El LBP reduce la concentración de LPS requerida para la activación de los monocitos formando complejos LBP-LPS, que son reconocidos por el CD14. Además del CD14m, existen distintos tipos de CD14 solubles (de 48, 53 y 55 kDa) presentes en concentraciones alrededor de 2-6 μg/ml en suero (Frey y col, 1992), y que son liberados por monocitos o bien secretados por formas libres de GPI (Alam y col, 1997; McNaught y Olanow, 2003). Se sabe que el LPS se une directamente a las formas solubles del CD14 (CD14s), un proceso altamente facilitado por el LBP, a pesar de que esta proteína no está presente en los complejos de LPS-CD14s (Andrew y col, 1993). Los complejos LPS-CD14s permiten la activación de algunas células sin CD14m, como células endoteliales, fibroblastos y células del músculo liso, que producirían citoquinas (Benveniste, 1992; Good y col, 1992; Wang, 2000). Así, se ha postulado la existencia de un receptor específico para los complejos de LPS-CD14s que se expresaría en estas células y que mediaría la activación por el LPS de las células sin CD14. En conclusión, el CD14 como receptor soluble de membrana, jugaría un papel extremadamente INTRODUCCIÓN 42 importante en el reconocimiento molecular del LPS en varias células. Sin embargo, parece que para la activación celular se requieren moléculas de membrana adicionales. Fig. 9. Mecanismos de activación celular del LPS. (Arditi y col, 1995). 4.1.2. TRANSDUCCIÓN DE SEÑAL INDUCIDA POR EL LPS. Se han identificado en humanos y ratones una familia de proteínas denominadas receptores semejantes a Toll (Toll-like receptors o TRLs). Se trata de proteínas transmembrana con un dominio extracelular con repeticiones ricas en leucina (LRR) y un receptor citoplasmático Toll/IL-1 (TIR) con un dominio de gran semejanza estructural con el receptor de la IL-1 (O´Neill y Greene, 1998; Anderson, 2000). Existen evidencias que sugieren que estos TRLs son las moléculas más importantes de reconocimiento de patógenos y que se utilizan diferencialmente en el inicio de las cascadas de señalización en respuesta a infecciones con diferentes clases de patógenos. LPS LBP-LPS LBP LPS LPS LBP mCD14 mCD14-LPS LPS sCD14 TRL ¿otros? LPS LBP-LPS TRL ¿otros? LPS mCD14 TLR4 LPS LBP INTERNALIZACIÓN ACTIVACIÓN IP3 Fosforilación Calcio LIBERACIÓN DE MEDIADORES Células inmunoinflamatorias Células sin CD14 Plaquetas Células endoteliales Células musculares lisas TRL ¿otros? LPS LBP-LPS LBP LPS LPS LBP mCD14 mCD14-LPS LPS sCD14 TRL ¿otros? LPS LBP-LPS TRL ¿otros? LPS mCD14 TLR4 LPS LBP INTERNALIZACIÓN ACTIVACIÓN IP3 Fosforilación Calcio LIBERACIÓN DE MEDIADORES Células inmunoinflamatorias Células sin CD14 Plaquetas Células endoteliales Células musculares lisas TRL ¿otros? INTRODUCCIÓN 43 Una vez que el LPS estimula las células diana ocurren una serie de acontecimientos intracelulares. El más importante y mejor caracterizado es la activación del factor nuclear κB (NFκB), que juega un papel central en la regulación de las respuestas inflamatorias e inmunes (Ghosh y col, 1998; May y Ghosh, 1998). El NFκB representa un grupo de proteínas relacionadas estructuralmente, incluidas la p65, p50, p52, RelB y c-Rel. En condiciones normales, el NFκB se encuentra secuestrado en el citosol como una forma inactivada homo o heterodimérica, con interacciones no covalentes con sus proteínas de inhibición, denominadas IKKβs. Tras la estimulación con el agonista apropiado, el IKKβ es fosforilado, ubiquitinizado y degradado. Así, el NFκB es liberado y se transloca al núcleo iniciando fenómenos de expresión génica. Dentro de los genes diana del NFκB se incluyen aquellos que codifican para citoquinas, quimioquinas, moléculas de adhesión, proteínas de fase aguda, péptidos antimicrobianos, la iNOS y la ciclooxigenasa 2 (COX-2). En conjunto, estos mediadores proporcionan protección inmediata al huésped e inducen el desarrollo de la respuesta inmune adaptativa (Ghosh y col 1998, May y Ghosh, 1998). En los últimos años se ha producido una importante expansión de nuestro conocimiento sobre los mecanismos de señalización por los que el LPS induce la activación del NFκB. De hecho, se han descubierto varios de los componentes moleculares implicados en este proceso (Fig. 10). El TLR4 es un receptor primario transmembrana de señalización para el LPS. Una vez unido al receptor de superficie del LPS (CD14), éste debe transferirse al TLR4, dando como resultado la homodimerización del TLR4 y un cambio conformacional de su dominio citoplasmático. Posteriormente, se recluta sobre el receptor una proteína adaptadora llamada MyD88, lo cual va seguido de la interacción con la quinasa asociada al IL-1R (IRAK-1, -2 o –M). La IRAK se disocia del complejo del receptor y recluta al factor 6 INTRODUCCIÓN 44 asociado al receptor de TNF (TRAF6), que finalmente resulta en el ensamblaje y activación del complejo IKKα/β/γ y la posterior fosforilación y degradación del Iκβ y la translocación al núcleo del NFκB. El mecanismo por el cual el TRAF6 activa a las IKKs no se conoce bien, aunque hay evidencias que muestran que el TRAF6 podría interaccionar con moléculas adicionales que ayudarían a activar a proteínas quinasas en cascada, lo cual llevaría a la fosforilación y activación de las IKKs. Se han identificado tres proteínas TRAF6, denominadas intermediario evolutivo conservado de señales en la vía Toll (ECSIT), proteínas de unión a TAK-1, una quinasa activada por el factor de crecimiento transformante β-2 (TAB2) y proteína de unión al TRAF6 (T6BP) (Zhang y Ghosh, 2000). (Fig. 10). Existen otras vías de transducción de señales del LPS. En diversos estudios in vitro con monocitos y fibroblastos se han implicado proteínas G y pequeñas proteínas G que pueden participar en la activación de tirosinaquinasas (TK) ((Tanke y col, 1991; Mayeux, 1997), la fosfolipasa C (PLC) y (A2) (Chang y col, 1990; Fleming y col., 1996), así como la calmodulina (Nakano y col, 1993; Mattson y Rydel, 1996). También se ha atribuido el papel de segundo mensajero a la esfingomielasa (SM), que hidrolizaría la esfingomielina en ceramida, la cual activaría diferentes proteinfosfatasas (PPT) y proteinquinasas (PK), como la PK activada por ceramida (Joseph y col, 1994), que podrían intervenir en la señal del LPS activando o inhibiendo diversas enzimas como la PK C, las fosfolipasas PLC y PLA2, y la COX-2 (Hayakawa y col, 1996; Liu y col, 1999). Otra vía es la formada por las PK, en la cual están implicados varios grupos: las serina-treonina PK A y C (Shapira y col, 1990; Kozak y col, 1997) y un gran conjunto INTRODUCCIÓN 45 de TK (Ruetten y Thiemermann, 1997). El conjunto de las TK activadas por mitógenos y MAP quinasas (MAPK), también participan en gran medida en las señales intracelulares del LPS. Esta gran familia consta de PK que fosforilan restos de serinatreonina y tirosina-treonina. Según diferentes estudios in vitro realizados en macrófagos, otros leucocitos, células endoteliales, células musculares lisas y otros tipos celulares (Arditi y col, 1995; Downey y Han, 1998; Baydoun y col, 1999), existen al menos cuatro subgrupos de MAPK, de los cuales se ha descrito que tres están relacionados con las respuestas inducidas por el LPS. Una de ellas está formada por las quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK). Las otras vías relacionadas con las MAPK incluyen el conjunto de proteínas que forman la subfamilia de PK del factor de transcripción c-jun, llamadas JNK. Las quinasas p38 también juegan un papel crucial en la regulación de la respuesta con citoquinas tras la estimulación con el LPS. De hecho, se sabe que un inhibidor específico de estas quinasas, el SB203580, previene completamente la liberación de citoquinas tras la estimulación de los monocitos con el LPS (Lee y col, 1994). 4.2. EL LPS COMO MODELO DE LA EP. Los procesos inflamatorios, incluida la activación microglial, parecen ser importantes en el desarrollo y progresión de varias enfermedades neuronales degenerativas, entre ellas la EP (McGeer y col, 1988b; Akiyama y McGeer, 1989). La cinética de la reacción inflamatoria que sigue a la administración intracerebral del LPS ya se ha descrito en el SNC de ratones (Anderson y col, 1992) y ratas (Bourdiol y col, 1991; Montero-Menei y col, 1994,1996; Szczepanik y col, 1996). INTRODUCCIÓN 46 De igual manera, estudios previos de nuestro grupo de investigación trataron de determinar si la activación glial inducida por una única inyección de LPS en la SN podría tener algún efecto sobre la viabilidad de las neuronas DAérgicas in vivo y si este efecto era selectivo para este tipo de neuronas. El modelo que describieron permitiría determinar en qué medida está implicada la activación glial en la progresiva degeneración nigral característica de la EP y también en qué medida los factores derivados de la glía, como las citoquinas o la deprivación de factores neurotróficos, clásicamente asociados con una importante muerte neuronal in vivo, están implicados en la degeneración DAérgica. CD1 4 ? LPS TLR4 MD- 2 MyD8 8 IRAK1/2/M TRAF6 T6BP ? IKKα/β/γ NFκB/IκB NFκB Expresión génica ECSIT TAB2 MEKK 1 TAK1 NIK Membrana Ligando Complejo Receptor Adaptador Serina/Treonin a Quinasa Adaptador Adaptador MAP3K Complejo IKK Proteínas Rel Núcleo Fig. 10. Vías de señalización inducidas por el LPS que acaban en la activación del NFκB. Tras la unión del LPS al CD14, éste puede ser transferido al complejo receptor TLR4-MD-2 en la membrana celular o bien activar una cascada de proteasas que generan un ligando para el TLR4. Consecuentemente, el TLR4 puede dimerizarse, lo cual provocaría un reclutamiento en cascada de moléculas y por último la activación del NFκB, así como la transcripción de varios genes implicados en la respuesta inmune e inflamatoria. Por otro lado, el TLR2 es el responsable de mediar la señal inducida por otros productos microbianos y, al igual que en la cascada del LPS, se usan idénticos intermediarios de señalización para activar al NFκB. Las vías de señalización independientes de MyD88 también existen en la activación del NFκB inducida por el LPS; sin embargo, las identidades moleculares de estos mediadores aún no han sido determinadas. Adaptado de Zhang y Ghosh, 2000). INTRODUCCIÓN 47 Dichos estudios revelaron que la inyección de 2 μg de LPS en la SN de la rata producía una serie de eventos dañinos en esta estructura cerebral (Castaño y col, 1998). Cuatro días después de la inyección de LPS hubo una degeneración del sistema DAérgico puesta de manifiesto por el descenso significativo de los niveles de DA tanto en la SN como en el estriado. Mientras que los niveles de DA decrecieron, las relaciones ácido homovanílico (HVA)/DA y DOPAC/DA (indicadores del intercambio metabólico de la propia DA) se incrementaron en todos los tiempos en la SN y el estriado, lo que indicaría que el daño DAérgico inducido por la inyección de LPS incrementa la transmisión sináptica de DA. El descenso en los niveles de DA también está en consonancia con el descenso en la actividad de la tirosina hidroxilasa o TH (la enzima inicial y limitante de la biosíntesis de catecolaminas), sobre todo en el estriado. Este daño sobre las neuronas DAérgicas también se puso de manifiesto por la pérdida de neuronas TH positivas en la SN. La neurodegeneración encontrada está de acuerdo con estudios previos con LPS. Andersson y colaboradores (1992) describieron la pérdida de células piramidales de la capa CA1 del hipocampo de ratones tras una inyección intrahipocampal de 2 μg de LPS. Además, se ha descrito una leve pero significativa pérdida de receptores neuronales NMDA tras una única inyección de LPS en el estriado (Bourdiol y col, 1991). La eficacia del LPS como activador inmune en el SNC se mostró por el cambio en la morfología de la microglía y el incremento del número de células OX-42 positivas Dos días tras la inyección de LPS, las células microglíales ya muestran una morfología activada en la SN dañada (Fig. 11). Este resultado está de acuerdo con estudios previos que muestran que el LPS es un potente estimulante de la microglía (Anderson y col, 1992; Lee y col, 1993; Montero-Menei y col, 1994, 1996). INTRODUCCIÓN 48 Sin embargo, la reacción inflamatoria inducida por la inyección de LPS parece afectar de distinta manera a los diferentes tipos neuronales. Estudios in vitro han mostrado que las neuronas DAérgicas son dos veces más sensibles a los efectos tóxicos del LPS que las neuronas TH negativas (Bronstein y col, 1995). Nuestro grupo mostró en estudios previos que las neuronas DAérgicas son sensibles al LPS sólo cuando éste se ha inyectado en la SN. Los distintos parámetros bioquímicos e inmunohistoquímicos estudiados mostraron que la inyección de LPS en el haz prosencefálico medial (HPM) o en el estriado, no afectan al sistema DAérgico, excepto por un incremento en los niveles de DA y DOPAC en el estriado a los 15 días tras la inyección de LPS en esta estructura, lo que podría deberse a un incremento en la producción de factores de crecimiento en respuesta al LPS. Esta diferente reacción inflamatoria entre la SN y el estriado también fue patente en la característica desaparición de los astrocitos en el lugar de la inyección del LPS, de manera que cuando el LPS fue inyectado en el estriado, el área carente de astrocitos fue muy estrecha y localizada alrededor del tracto de inyección, y no se observaron fuertes agrupaciones de macrófagos. La pérdida de astrocitos ya se había descrito en estudios anteriores cuando se hacían daños en el SNC, como con la inyección de excitotoxinas (Bjorklund y col, 1986; Ross y Ebner, 1990; Jorgensen y col, 1993), o con la inyección de 6-OHDA en el HPM (Stromberg y col, 1986). Sin embargo, algunos autores no han observado pérdida de astrocitos cuando se inyectaron neurotoxinas en el estriado (Bjorklund y col 1986, Isacson y col 1987). Tras la apertura de la BHE, como en el caso de la muerte neuronal, el incremento masivo de componentes séricos, como el Glu, pueden inducir la hinchazón de los astrocitos (Kimelberg y Ransom, 1986). Sin embargo, también tenemos que INTRODUCCIÓN 49 tener en cuenta que en estudios in vitro, el LPS altera la función astrocítica y su estructura a través de la liberación de citoquinas pro-inflamatorias (Hu y col 1994). Fig. 11: Posible papel de mecanismos celulares durante la degeneración DAérgica en la EP. Las neuronas DAérgicas inmersas en un proceso degenerativo, activan las células gliales, particularmente la microglia, la cual activa un proceso inflamatorio en la zona de daño neuronal. La inmunidad innata del SNC mediada por la microglia, podría contribuir a la recaptación de leucocitos periféricos (linfocitos T) que contribuirían al mantenimiento del proceso inflamatorio. Este mecanismo crea un ciclo continuo que puede amplificar o perpetuar la neurodegeneración en la EP. Al contrario que su efecto sobre el sistema DAérgico, el LPS no afectó otros tipos neuronales estudiados. Estos estudios mostraron que el LPS no indujo daño sobre las neuronas GABAérgicas tras la inyección de LPS en la SN o en el estriado. Por su parte el sistema serotoninérgico mostró un daño transitorio (Herrera y col, 2000); los Muerte celular Proceso Inflamatorio INTRODUCCIÓN 56 Además de la evidencia de que la α-sin puede modular la activación microglial in vivo e in vitro cuando se sobreexpresa (Su y col, 2007), existen evidencias de que la parkina y la DJ-1, pueden modular la respuesta inflamatoria celular. Existen estudios que sugieren que la parkina es un activador del NFκB y por tanto de la cascada de activación de componentes neuroprotectores a través del SUP (Henn y col, 2007). Si alguna neurona tiene una disfunción en la parkina, no se activará correctamente la cascada NFκB como consecuencia de la presencia de alguna citoquina inflamatoria, como por ejemplo el TNF, y por lo tanto no se activará con la fuerza necesaria el brazo opuesto al pro-apoptótico del TNF, por lo que dicha citoquina complicaría la supervivencia neuronal. El TNF-α juega un papel importante en la EP tanto en las fases tempranas como en las fases tardías. Diversos estudios de ciertos de sus receptores (TNFr 1 y 2), muestran que éstos se expresan en células activas del sistema inmune como la microglía, y también en células DAérgicas e hipocampales (McGuire y col, 2001; Marchetti y Abbracchio, 2004; Bernardino y col, 2005). Los niveles de TNF en cerebros adultos humanos son generalmente muy bajos (Breder y col, 1993). En cambio, se han visto altos niveles de TNF y de TNFr1 tanto en el líquido cefalorraquídeo como en la SN de cerebros con EP post-mortem. (Boka y col, 1994; Mogi y col, 1994). Las neuronas DAérgicas son extremadamente sensibles al TNF (Aloe y Fiore, 1997), ya que puede activar la microglía (Lawson y col, 1990), por lo que potenciaría la respuesta inflamatoria, llevando a cabo la superproducción de EROs, NO y radicales superóxidos que potencian la formación de peroxinitritos (Beckman, 1993). La activación microglial dependiente de TNF en la SN crea un microambiente de estrés oxidativo a través de la activación de la NADPHox (Hunot, 1999) que fortalece el daño a las neuronas DAérgicas. INTRODUCCIÓN 57 6. LA METFORMINA. La diabetes tipo 2 es la forma de diabetes más frecuente en personas mayores de 40 años. Se la conoce también como diabetes del adulto, aunque está aumentando mucho su incidencia en adolescentes e incluso preadolescentes con obesidad. En este tipo de diabetes la capacidad de producir insulina no desaparece pero el cuerpo presenta una resistencia a esta hormona. En fases tempranas de la enfermedad, la cantidad de insulina producida por el páncreas es normal o alta. Con el tiempo la producción de insulina por parte del páncreas puede disminuir. Las personas con diabetes no mueren de su enfermedad, sino de las complicaciones que ésta conlleva. Después de muchos años, la diabetes puede llevar a problemas serios:  Problemas oculares, como dificultad para ver (especialmente por la noche), sensibilidad a la luz e incluso ceguera  Úlceras e infecciones en pies, piel, tracto genital femenino y en vías urinarias.  La diabetes puede dificultar el control de la presión arterial y el colesterol. Esto puede llevar a un ataque cardíaco, accidente cerebrovascular y otros problemas.  Los nervios pueden sufrir daño, causando dolor, picazón y pérdida de la sensibilidad.  Debido al daño a los nervios, se pueden presentar problemas para digerir el alimento, sentir debilidad o tener problemas para ir al baño.  Daño renal.  Neurodegeneración. Recientes estudios han revelado que el sistema nervioso central está directamente implicado en la diabetes tipo 2 como parte de un mecanismo asociado a la inflamación hipotalámica que provoca la resistencia a la insulina. El deficiente control de la diabetes podría tener un impacto negativo INTRODUCCIÓN 58 a largo plazo sobre el deterioro cerebral. Las investigaciones constatadas en este campo proporcionan una explicación sobre la prevalencia del deterioro cognitivo en pacientes con desordenes metabólicos, estableciendo un enlace directo entre la resistencia a la insulina y el daño cerebral. Igualmente estudios epidemiológicos revelan el mayor riesgo de neurodegeneración, como la que acontece en la EA y la EP, en personas que padecen diabetes. Así, se sabe que los pacientes con diabetes tienen más riesgo de padecer EA, incluso cuando toman antidiabéticos orales. La incidencia epidemiológica y patológica de ambas enfermedades aumenta con la edad, y la incidencia de diabetes aumenta en personas con la EA. Desde el punto de vista patológico, ambas enfermedades se asocian con una homesostasis alterada de glucosa y con la acumulación extracelular de proteínas amiloides, el polipéptido amiloide insular y de la proteína Aβ. Por otro lado, la resistencia a insulina es una característica central en la diabetes y existen muchas evidencias de que esta resistencia a insulina es la que contribuye a la patología de la EA. En cuanto a la EP, recientes estudios epidemiológicos han demostrado una asociación entre la diabetes mellitus y el riesgo de padecer EP (Wahlqvist y col., 2012). Al comienzo de la diabetes ésta se podrá controlar en muchas personas con cambios en el estilo de vida que incluyen una dieta normo o hipocalórica y ejercicio físico diario. Los controles de glucemia capilar son muy importantes aunque no se esté utilizando insulina como tratamiento. Si con estas medidas no se consigue tener un buen control metabólico se añadirán fármacos (antidiabéticos orales) o insulina. Aunque existen diferentes tipos de antidiabéticos orales, los más utilizados son la rosiglitazona, la pioglitazona, las sulfonilureas, la repaglinida, la acarbosa y la metformina. INTRODUCCIÓN 59 La metformina, comercialmente denominada clorhidrato de metformina, es un miembro de la clase de las biguanidas de antihiperglucémicos orales (3- (diaminometiliden)-1,1-dimetilguanidina). De hecho, hoy en día, es el tratamiento más ampliamente prescrito para tratar la hiperglucemia en individuos con diabetes mellitus tipo II y es recomendado como terapia oral de primera línea. La metformina es tan efectiva reduciendo los niveles elevados de glucosa en sangre como otros muchos antidiabéticos pero, a diferencia de muchos de ellos, por si sola, no produce hipoglucemia. Su fórmula empírica es C4H11N5*HCl. Se trata de un polvo de color blanco a blanquecino, cristalino, que es fácilmente soluble en agua y prácticamente insoluble en acetona, éter y cloroformo, y cuya fórmula estructural se muestra en la Fig. 13. La metformina fue aceptada clínicamente para el tratamiento de la hiperglucemia en Inglaterra en 1958, en Canadá en 1972, y en los EE.UU. en 1995, por su efecto antihiperglucemiante al reducir la producción de glucosa hepática y disminuir la resistencia a la insulina, así como los niveles de insulina plasmática en ayunas. La resistencia a la insulina ha sido el mecanismo central que subyace a diversas patologías (además de a la diabetes tipo II) y, por disminuir esta resistencia, la metformina imparte su papel beneficioso en un amplio espectro de enfermedades asociadas con la resistencia a la insulina (Viollet y col., 2009). Además, tiene potencial terapéutico en otras condiciones entre las que se incluyen la nefropatía diabética, las enfermedades cardiovasulares, la enfermedad de ovarios poliquísticos (Rotella y col., 2006) e incluso se ha investigado como antiviral y anticancerígeno (Rotella y col.l, 2006; Ben Sahra y col., 2010). INTRODUCCIÓN 60 Fig. 13. Estructura de la Metformina. 6.1. MECANISMO DE ACCIÓN DE LA METFORMINA. La principal acción de metformina es disminuir las concentraciones de glucosa sin causar hipoglucemia. Esto lo consigue principalmente inhibiendo la gluconeogénesis (Natali y Ferrannini, 2006). Ejerce su acción metabólica directa y especialmente sobre el hígado (Fig. 14) al parecer por la predominante expresión de transportadores de cationes orgánicos tipo 1 (OCT 1) en los hepatocitos, que facilitan la entrada celular de metformina, ya que debido a su constante de disociación alta, en condiciones fisiológicas existe en una forma protonada de carga positiva (Shu y col., 2007). El interés en el uso terapéutico de la metformina se ha visto incrementado actualmente por el reconocimiento de sus acciones pleiotrópicas en varios tejidos que se ven afectados por resistencia a la insulina y/o por hiperinsulinemia (Palomba y col., 2009). Esta mejora en la sensibilidad a la insulina se asocia a su efecto positivo sobre la expresión de los receptores de insulina (Gunton y col., 2003). Según Zhou y colaboradores (2001) las acciones pleiotrópicas de la metformina están íntimamente asociadas con la activación de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK), enzima importante en el balance de energía del cuerpo mediante el control de los hidratos de carbono y metabolismo de los lípidos a través de la señalización de insulina (Musi y INTRODUCCIÓN 61 col., 2002; Gruzman y col., 2009). Este control protege las funciones celulares bajo condiciones de energía restrictivas. La AMPK es una proteína heterotrimérica que consiste en una subunidad catalítica α y dos subunidades reguladoras β y γ, donde cada subunidad tiene al menos dos isoformas. La AMPK se activa por un aumento en la razón AMP/ATP y/o ADP/ATP intracelular resultante del balance entre consumo y producción de ATP. Esta activación implica la unión del AMP a los sitios reguladores de la subunidad γ. Esto causa cambios conformacionales que activan alostéricamente a la enzima e inhiben la desfosforilación de Thr172 dentro de la subunidad α (la activación de AMPK requiere la fosforilación de la Thr172 por quinasas como LKB1 y CaMKKβ). La activación de AMPK por tanto inhibe las vías que consumen ATP y estimula vías alternativas para la regeneración de ATP (Carling, 2004); es decir, cambia las células de un estado anabólico a uno catabólico, cerrando las vías sintéticas que consumen ATP y restaurando el equilibrio energético. Como resultado la síntesis de glucosa, lípidos y proteínas y el crecimiento celular se inhiben mientras que la oxidación de los ácidos grasos y la captación de glucosa se estimulan (Fig. 14). INTRODUCCIÓN 62 Fig. 14. Acciones de la metformina en el hígado (Adaptado de Diamanti-Kandarakis, y col, 2010). Pero la activación de AMPK por metformina no parece que se produzca directamente, sino que es secundaria a su efecto en la mitocondria, blanco primario de la droga. Según se informó a principios del año 2000, la metformina induce inhibición específica del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial (Fig. 15). Esto se observó inicialmente en hígados perfundidos y hepatocitos aislados de roedores (El-Mir y col., 2000; Owen y col., 2000), pero más tarde también en otros tejidos, como el músculo esquelético (Brunmair y col., 2004), células endoteliales (Detaille y col., 2005), células beta pancreáticas (Hinke y col., 2007) y neuronas (El-Mir y col., 2008). Lipogénesis de INTRODUCCIÓN 63 Fig. 15. El complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial es el principal objetivo de la metformina. (Adaptado de Viollet y col., 2012). Aunque el mecanismo exacto por el cual la metformina inhibe el complejo I de la cadena respiratoria sigue siendo desconocido, se ha demostrado que este efecto no requiere AMPK. Por tanto, la activación de la AMPK por la metformina en el hígado, y probablemente en otros tejidos, es la consecuencia directa de una reducción transitoria en el estado de energía celular inducido por la inhibición específica del complejo I de la cadena respiratoria por la droga (Stephenne y col., 2011), lo que da lugar a un bajo consumo de oxígeno por las células y a un aumento en la relación NADH/NAD. La βoxidación de los ácidos grasos es llevada a cabo por la enzima L-3 hidroxi acil CoA deshidrogenasa, la cual utiliza NAD como cofactor. Al producirse un aumento en la relación de NADH/NAD, se bloquea la β-oxidación de los ácidos grasos, aumentando la relación AMP/ATP y resultando en la activación de AMPK (Aljada y Mousa, 2012) (Fig. 16). INTRODUCCIÓN 64 La demostración de que el complejo I de la cadena respiratoria y no la AMPK es el principal blanco de la metformina se reforzó al mostrar que el efecto metabólico del fármaco se preserva en el hígado de ratones deficientes en AMPK, por lo que otro/s mecanismo/s independiente/s de AMPK podría/n estar implicado/s. Fig. 16. Efecto de la inhibición del complejo I de la fosforilación oxidativa en la mitocondria por metformina. (Aljada y Mousa, 2012). 6.2. EFECTO ANTI-INFLAMATORIO DE LA METFORMINA. Como ya se ha demostrado en diferentes estudios, la inflamación parece estar implicada en varios mecanismos patológicos, como por ejemplo, los que conducen a la muerte de neuronas DAérgicas en la EP. Varios resultados de estudios clínicos y experimentales sugieren que la metformina, a parte de su acción hipoglucemiante, INTRODUCCIÓN 65 puede atenuar tanto la inflamación periférica como la central. El potencial antiinflamatorio de metformina se ha estudiado en particular en modelos experimentales de inflamación periférica. Se ha demostrado que atenúa la respuesta pro-inflamatoria en las células endoteliales (Isoda y col., 2006), disminuye la proliferación de células de músculo liso de aorta humana (Li y col., 2005) y aminora la activación de macrófagos (Mamputu y col., 2003). Isoda y colaboradores (2006) investigaron estos efectos anti-inflamatorios en células de la pared vascular humana, donde observaron que la metformina ejerce un efecto anti-inflamatorio al inhibir al NF-kB a través del bloqueo de la vía PI-3 quinasas. Por otro lado, en células endoteliales, la actividad de la AMPK se asocia con la fosforilación y la activación de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), que resulta en una acción anti-inflamatoria en la pared vascular (Zou y col., 2002). También se han descrito efectos anti-inflamatorios de la metformina en monocitos humanos en los que se observa una reducción en la producción de TNF y TF (factor tisular) (Arai y col., 2010). Estudios recientes también han puesto de manifiesto que la metformina reduce de forma significativa las citoquinas inflamatorias como el TNF-α, la proteína 1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1), la IL-1β, la MIP-1α, la IL-6, la leptina, y la IL-18 en la uveítis inducida por endotoxina en ratas (Kalariya y col., 2012). Así mismo, se han descrito efectos beneficios terapéuticos de la metformina en la lesión hepática inducida por endotoxina, lo que sugiere su potencia farmacológica en los trastornos por inflamación. Otros datos que apoyan el efecto anti-inflamatorio de la metformina fueron obtenidos por Koh y col. (2014) al encontrar que la metformina suprime la activación de NF-κB en las células epiteliales intestinales y amilora la colitis en ratones, lo que MATERIALES Y MÉTODOS 72  Añadir una cantidad suficiente de tripsina 0.25% para cubrir la superficie del cultivo.  Incubar durante 5 min a 37 ºC  Añadir el medio de cultivo precalentado a 37 ºC para detener la tripsinisación.  Recoger las células, centrifugarlas, resuspender el precipitado en un volumen deseado y resembrar. Para determinar el número de células vivas se utilizó la cámara de Neubauer y el azul de Tripán. El azul de Tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan rotura de membranas, siendo inviables las células de color azul y viables las células blancas. El procedimiento utilizado fue el siguiente:  Homogenizar la suspensión de células y pasar 10 μL a un tubo eppendorf.  Mezclar con un volumen igual de una solución de 0,4% de azul de Tripán y agitar muy bien la solución con el colorante vital.  Rellenar los compartimientos de la cámara de Neubauer con 10 μL de la suspensión.  Contar el número de células mediante un microscopio invertido (Leica DMIL). Las fórmulas utilizadas para determinar el número de células/mL: Células/mL = media del número de células contadas en las cuatro cuadrículas x 104 x Factor de dilución (2). Total de células = (Células/mL) x Volumen original de la suspensión celular Para la conservación de las células, se siguió el siguiente protocolo:  Recoger 10 mL de una suspensión celular y se centrifuga durante 5 min a 1000 rpm a temperatura ambiente. MATERIALES Y MÉTODOS 73  Resuspender el precipitado en 5-10 mL de medio de congelación consistente en 10% (p/v) dimetil sulfóxido (DMSO) como crioprotector y 90% de una solución de 10% FBS en RPMI.  Hacer alícuotas de la suspensión celular en viales de congelación estériles.  Como el DMSO es tóxico a temperatura ambiente, es conveniente proceder rápidamente al enfriamiento de los viales. La congelación, sin embargo, debe ser llevada a cabo lentamente. A tal efecto, se mantienen los viales a una temperatura de -20 ºC durante 2 h y luego se transfieren a un congelador a -80 ºC 2-3 días y, finalmente, se guardan en nitrógeno líquido. La descongelación de los viales para recuperar las células conservadas debe ser lo más rápido posible, siguiendo un protocolo consistente en:  Colocar los viales en un baño a 37 ºC hasta descongelar la suspensión celular.  Transferir la suspensión celular a tubos de centrífuga con 9 mL de medio de cultivo precalentado a 37 ºC.  Centrifugar las células a baja velocidad durante 5 min a 4 ºC, resuspender el precipitado en medio de cultivo precalentado y proceder a la siembra. 3. OPERACIONES QUIRÚRGICAS. Las operaciones intracerebrales se practicaron a las ratas mediante trepanación del cráneo previa anestesia con hidrato de cloral (400 mg/Kg de peso; i.p.), posicionando el animal en un estereotáxico (Kopf Instruments, Tujunga, CA, EEUU). Las coordenadas para inyectar en la SNpc fueron tomadas siguiendo el atlas de cerebro de Paxinos y Watson (1986). Todas las inyecciones se realizaron con una jeringa Hamilton posicionada 5,5 mm posterior, ±1,8 mm lateral y 8,3 mm ventral con respecto al punto bregma. El flujo de inyección fue de 0,5 μl/min y el volumen total inyectado de MATERIALES Y MÉTODOS 74 2 μl (vehículo o LPS). Después de cada inyección se esperaron 10 minutos para evitar el reflujo a lo largo del tracto de inyección. 4. TRATAMIENTOS. 4.1. RATAS. Para el modelo de EP por inyección de LPS los animales fueron distribuidos en 4 grupos (Fig.18), de acuerdo a dos variables distintas: según la solución ingerida (agua o metformina) y según el producto inyectado en la SN (vehículo o LPS). El grupo I recibió una única inyección en la SN izquierda de 2 µl de vehículo, compuesto por azul de monastral al 1%, utilizado como trazador inerte para localizar el sitio de la inyección, disuelto en solución salina (NaCl al 0,9%). El grupo II siguió exactamente el mismo protocolo que el grupo I, salvo la diferencia de que se administró por vía oral 150 mg/Kg de metformina disuelta en agua, 2 veces al día durante los 7 días del experimento. El grupo III recibió una única inyección en la SN izquierda de 2 µg de LPS disuelto en 2 μl de vehículo. El grupo IV siguió exactamente el mismo protocolo que el grupo III, salvo la diferencia de que se administró por vía oral 150 mg/Kg de metformina disuelta en agua, 2 veces al día durante los 7 días del experimento. Los animales usados para la inmunohistoquímica completaron un tratamiento de 7 días antes de ser sacrificados. Los animales utilizados para RT-PCR se sacrificaron por decapitación 6 horas después de la inyección de LPS o vehículo en la SN, por lo que solo recibieron una dosis de metformina/agua por vía oral. 4.2. RATONES. Para el modelo de EP por inyección de MPTP los animales fueron distribuidos en 4 grupos (Fig. 18), de acuerdo a dos variables distintas: según la solución ingerida MATERIALES Y MÉTODOS 75 (agua o metformina) y según el producto inyectado i.p. (vehículo o MPTP). El grupo V fue tratado con agua por vía oral y dos inyecciones al día de vehículo (salino) por vía i.p. durante 7 días. El grupo VI siguió exactamente el mismo protocolo que el grupo V, salvo la diferencia de que se administró por vía oral 150 mg/Kg de metformina disuelta en agua, 2 veces al día durante los 7 días del experimento. El grupo VII fue tratado durante dos días con 80 mg de MPTP por vía i.p, 10mg/dosis, 4 dosis al día cada dos horas y agua por vía oral. El grupo VIII siguió exactamente el mismo protocolo que el grupo VII, salvo la diferencia de que se administró por vía oral 150 mg/Kg de metformina disuelta en agua, 2 veces al día durante los 7 días del experimento. Todos los animales se sacrificaron 7 días después del inicio del tratamiento. 4.3. CÉLULAS N27. Las células fueron expuestas a metformina (1 mM y 100 μM) y MPP+ (25 μM, 50 μM y 100 μM), individualmente y combinados, durante 24h (Fig.19). Para estudiar los efectos sobre células completamente diferenciadas las células fueron pretratadas con 2mM de dibutiril adenosín monofosfato cíclico (AMPc) durante 3-5 días. Los efectos de los tratamientos se cuantificaron utilizando varios métodos analíticos: el ensayo de viabilidad celular basado en el uso del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5- difeniltetrazol (MTT), el ensayo de muerte celular mediante la combinación de anexina- V/yoduro de propidio, la medida de los niveles de ATP para evaluar la inhibición del complejo I mitocondrial y el ensayo de producción de EROs mediante el uso de una sonda (CellRox Deep Red Reagent). MATERIALES Y MÉTODOS 76 Fig. 18. Representación esquemática de los distintos tratamientos en el modelo de ratones. En el modelo de LPS (grupos I-IV) los tratamientos comienzan el día 1 con una única inyección intranigral de salino o LPS. Los grupos II y IV además recibieron dos dosis al día de metformina (150 mg/kg; vía oral) durante los 7 días que duró el experimento. Todos los animales se sacrificaron 1 semana después de la inyección de LPS, excepto los utilizados para RT-PCR que fueron sacrificados 6 horas después de la inyección de LPS. En el modelo de MPTP (grupos V-VIII) los tratamientos comienzan el día 1 con 4 inyecciones de 10 mg de MPTP o salino (i.p.) que se administran durante los 2 primeros días. Los grupos VI y VIII además recibieron dos dosis al día de metformina (150 mg/kg; vía oral) durante los 7 días que duró el experimento. Todos los animales se sacrificaron 1 semana después de iniciar el tratamiento. MATERIALES Y MÉTODOS 77 Fig. 19. Representación esquemática de los distintos tratamientos aplicados a las células. 5. PERFUSIÓN DE LOS ANIMALES. Para la técnica de inmunohistoquímica, los animales fueron perfundidos bajo anestesia profunda con hidrato de cloral (400 mg/Kg; i.p.) con una solución salina (NaCl al 0.9% en agua), seguido de 60 ml (ratones) -200 ml (ratas) de paraformaldehído al 4% en tampón fosfato, pH 7.4. Los cerebros se separaron y se crioprotegieron sumergiéndolos en sacarosa en PBS, pH 7.4, primero al 10% durante 24 horas y más tarde al 30% hasta que se hundieron completamente (2-5 días). A continuación se congelaron en isopentano a –20 ºC. 6. INMUNOCITOQUÍMICA DE TIROSINA HIDROXILASA, OX-6 E IBA-1. Al menos 5 animales se utilizaron en cada grupo. Los cerebros criopreservados se cortaron seriadamente en un criostato a -20º C y las secciones, de 20 μm de grosor, se MATERIALES Y MÉTODOS 78 montaron en portaobjetos gelatinizados. Los anticuerpos primarios usados para el caso de las ratas fueron obtenidos de ratón, y reconocían respectivamente a la tirosina hidroxilasa (anti-TH) y al MHC II (OX-6, Serotec, RU, 1:200). OX-6 reconoce directamente al antígeno MHC II de la rata, siendo esta proteína expresada únicamente por la microglía reactiva y no por el resto de células. En el caso de los ratones, los anticuerpos primarios usados fueron obtenidos de conejo y reconocían respectivamente a la tirosina hidroxilasa (anti-TH) y a Iba-1, anticuerpo que marca específicamente las células microgliales (anti-Iba-1, Wako). Las incubaciones y lavados de todos los anticuerpos se realizaron en tampón salino Tris (TBS, pH 7,4). Salvo que se indique lo contrario, todo el trabajo se realizó a temperatura ambiente. Una vez lavadas, las secciones se trataron con peróxido de hidrógeno al 0,3% en metanol durante 15 minutos; tras otro lavado se incubaron en una cámara húmeda con una disolución que contenía TBS y suero de caballo (Vector, para los anticuerpos contra rata) o suero de cabra (Vector, para los anticuerpos contra ratón) al 1% durante 1 hora. A continuación, se añadió el suero para incubar de nuevo las secciones, esta vez con los respectivos anticuerpos primarios, en una disolución que contenía 1% de suero de caballo/cabra y 0,25% de Triton-X-100 durante 24 h a una temperatura de 4º C en una cámara húmeda. Posteriormente, los cortes se incubaron durante 2 horas con el anticuerpo secundario biotinilado anti IgG correspondiente a cada uno de los anticuerpos primarios, a una concentración 1:200, que se une a los anteriores anticuerpos primarios. Dicho anticuerpo secundario se diluyó en una disolución que contenía TBS y 0,25% de Tritón- X-100, y su adición fue precedida por tres lavados de 10 minutos cada uno en TBS. Las secciones fueron entonces incubadas con una solución de ExtrAvidin®-Peroxidasa (Kit ABC) diluida al 1% en TBS. La peroxidasa se visualizó revelando con una solución estándar de diaminobenzidina/peróxido de hidrógeno durante 5 minutos. MATERIALES Y MÉTODOS 79 7. DESHIDRATACIÓN Y MONTAJE DE LAS SECCIONES. Para la deshidratación de las secciones se utilizó un procedimiento general mediante el cual se sumergieron en soluciones de concentraciones crecientes de etanol (50, 70, 80, 90 y 100% respectivamente) durante 5 minutos en cada uno de ellos, exceptuando el etanol al 100%, donde estuvieron expuestas 10 minutos; seguidamente se mantuvieron durante 15 minutos en histolemon. El medio de montaje utilizado una vez completado el proceso fue el DPX. 8. ANÁLISIS DE LOS DATOS INMUNOHISTOQUÍMICOS. Las células que mostraron inmunorreactividad al OX-6 o Iba-1 se contaron usando 5 secciones por animal, sistemáticamente distribuidas a través del eje anteroposterior de la SN. En cada sección se muestreó un área ocupada por las células OX- 6/Iba-1 positivas, dividida en 5 campos elegidos aleatoriamente. El contaje de dichas células se limitaba a una rejilla de dimensiones conocidas (40 x 25 µm = 1000 µm2) superpuesta sobre la sección de tejido a contar, bajo el objetivo de 100x con aceite de inmersión. Los distintos tipos de células OX-6/Iba-1 positivas (dependiendo de su estado de activación poseen diversas formas) fueron contadas como un único tipo y expresadas en células/mm2. El número de neuronas en la SN fue estimado de acuerdo a una aproximación estereológica (Gundersen y col., 1988). El conteo de las neuronas TH positivas de cada sección se realizó a intervalos regulares con unas dimensiones predeterminadas (x =150 μm e y = 200 μm). El muestreo sistemático del área ocupada por la SNpc se inició a partir de un corte aleatorio. En el punto de recuento se superpuso una rejilla de área MATERIALES Y MÉTODOS 80 conocida (40×25μm=1000μm2) que se usó con el objetivo de 100x con aceite de inmersión. Así pues la fracción del área de muestreo para cada una de las secciones era de 1000/(150×200)=0.033μm2. El eje Z de cada sección se normalizó, por tanto el grosor de la fracción muestreada fue de 1. Así pues, en todos los animales, secciones de 20 μm separadas entre sí 100 μm, fueron analizadas; por tanto, el porcentaje de muestras analizadas fue de 20/100=0.20. El número de neuronas de la SNpc se calculó multiplicando el número de neuronas contadas dentro de la región de conteo por la inversa de la fracción del área de muestreo y la inversa del total de las secciones contadas. 9. RT-PCR A TIEMPO REAL. La SN del hemisferio izquierdo de cada rata fue extraída 6 horas después de cada tratamiento y rápidamente congelada en nitrógeno líquido para ser posteriormente crioalmacenada a -80º C. En el caso de los ratones, la SN izquierda fue extraída al finalizar el último día de tratamiento (7 días). El ARN total fue extraído de la SN con el kit RNeasy®. El ADNc fue sintetizado a partir de 1μg del ARN total usando el reverse transcription kit ® (Qiagen) en un volumen de reacción de 20μl como se describía en el protocolo del fabricante. La PCR a tiempo real se llevó a cabo por medio del iQ™SYBR® Green Supermix (Bio-Rad), usando 0,4μM de cebadores y 1 μl de ADNc. Los controles se llevaron a cabo sin la presencia del ADNc. La amplificación tuvo lugar en un termociclador Mastercycler® ep realplex (Eppendorf) a 94ºC durante 3 minutos, seguidos de 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, de alineamiento a 55ºC o 65ºC durante 45 segundos y de extensión a 72ºC durante 45 segundos, seguidos de una elongación final a 72ºC durante 7 minutos. Tras la amplificación, se MATERIALES Y MÉTODOS 81 realizó el análisis de una curva de desnaturalización calentando las reacciones desde 65ºC a 95ºC a intervalos de 1ºC mientras se monitoriza la fluorescencia. El análisis confirmó un producto de PCR simple en la temperatura de desnaturalización pronosticada. La -actina sirvió como control interno (gen de referencia) y fue usada para normalizar las muestras. Las secuencias de los cebadores para IL-1β, TNF-, iNOS y β-actina en cada caso (rata y ratón) se muestran en la tabla 1. Se determinó el ciclo al que cada muestra alcanza un umbral de fluorescencia (Ct) y se calculó el promedio de los valores triplicados para cada ADNc. Los análisis de PCR a tiempo real se hicieron usando un método comparativo de Ct. Tabla 1. Secuencia de los cebadores para las distintas PCRs MATERIALES Y MÉTODOS 88 Anexina-V-FITC, el yoduro de propidio y el binding buffer se obtuvieron de Miltenyi Biotec. La concentración de ATP se midió con el kit CellTiter-Glo (Promega). La sonda para la medida de la producción de especies reactivas de oxígeno fue proporcionada por Invitrogen (CellROX® Deep Red Reagent, Invitrogen). RESULTADOS RESULTADOS 91 1. EFECTO DE LA METFORMINA EN LA ACTIVACIÓN MICROGLIAL Y EN LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE TNF-α, IL-1β E INOS. Hemos estudiado la microglía en los niveles morfológico y molecular para evaluar su activación en la SN inducida tras la inyección intranigral de LPS y tras la administración intraperitoneal de MPTP. Se realizaron técnicas de inmunohistoquímica contra marcadores morfológicos de microglía reactiva (OX-6 en ratas e Iba-1 en ratón), y medida de los niveles de TNF-α, IL-1β y la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), para evaluar el efecto de la metformina sobre la neuroinflamación inducida en los dos modelos animales utilizados. En el modelo de LPS realizado en ratas (Fig. 20) se puede observar como el grupo control y el tratado con metformina mostraron solamente una leve inmunoreactividad de OX-6 alrededor del tracto de inyección (132,6 ± 84,3 y 94,4 ± 131,1 células/mm2; Fig. 20A, B y E), por lo que la metformina no produjo ningún efecto añadido a la propia inyección de salino. Por el contrario, el grupo tratado con LPS mostró una clara activación microglial casi 10 veces superior comparado con el grupo control (1141,9 ± 207,8 células/mm2, p< 0.01; Fig. 20C y E). Como era de esperar por sus propiedades anti-inflamatorias, el tratamiento con metformina redujo la activación microglial inducida por el LPS hasta prácticamente la mitad (584,2 ± 230,1 células/mm2, p< 0.01; Fig. 20D y E). Por lo tanto, la metformina disminuye significativamente el efecto inflamatorio causado por el LPS. RESULTADOS 92 RESULTADOS 93 Fig. 02. Cambios en la inmunorreactividad frente a OX-6 en la SN de las ratas tras los distintos tratamientos en el modelo de LPS. A) Sección coronal que muestra las células OX-6 positivas en un animal inyectado con vehículo en la SN. B) Sección coronal que muestra la inmunorreactividad frente a OX-6 de un animal inyectado con vehículo en la SN y que ha recibido dos dosis diarias de metformina. La expresión de células OX-6 positivas se restringe al sitio de inyección. C) Sección coronal que muestra las células microgliales OX-6 positivas en un animal inyectado con 2μg de LPS en la SN. La flecha indica el sitio de inyección alrededor del cual se puede observar una fuerte reacción microglial. D) Sección coronal que muestra las células microgliales OX-6 positivas en un animal inyectado con 2μg de LPS en la SN y tratado con dos dosis diarias de metformina. Barra de escala: 250 μm. E) Cuantificación del número de células OX-6 positivas tras el tratamiento por LPS y/o metformina descrito antes. Los resultados se expresan como medias ± DE de al menos 4 experimentos independientes en número de células por mm2. La significación estadística se calculó a través de un ANOVA de una vía seguido del test LSD de comparaciones múltiples. P < 0.01. a ≠ control; b ≠ LPS. Abreviaturas: Sal: animales inyectados con vehículo en la SN; SalMet: animales inyectados con vehículo en la SN y tratados con metformina; LPS: animales inyectados con LPS en la SN; LPSMet: animales inyectados con LPS y tratados con metformina. RESULTADOS 94 La microglía activada produce varias citoquinas y sustancias proinflamatorias con diferentes acciones dependiendo del inductor de su activación. El análisis por PCR a tiempo real mostró que los ARNm para las citoquinas proinflamatorias TNF-α e IL-1β y la enzima iNOS fueron inducidos en la SN a 6 horas después de la inyección de LPS (496,3 ± 53%; 243,3 ± 96%; 199,5 ± 66,5% con respecto al grupo control, respectivamente; p<.0.01 para TNF-α e IL-1β y p<.0.05 para iNOS). Como se observa en la (Fig. 21), el tratamiento con metformina redujo significativamente el aumento inducido por LPS en los niveles de los ARNm de los marcadores inflamatorios TNF-α y IL-1β pero no produjo ningún cambio en iNOS (322,9,4 ± 67,6%; 38,1 ± 13,5%; 211,6 ± 115,2% con respecto al grupo control, respectivamente; p<0.01). En el modelo de MPTP realizado en ratones (Fig. 22) se puede observar como el tratamiento con metformina tampoco produjo cambios en el número de células marcadas con Iba-1 (464,8 ± 60,5 cél/mm2; Fig. 22B y E) con respecto al grupo control (421,2 ± 73,5 cél/mm2; Fig 22A y E). Por el contrario, el tratamiento con MPTP aumentó el número de células microgliales hasta 673,9 ± 53,2 cél/mm2 (Fig. 22C y E; p< 0.01). Al igual que ocurrió en el caso anterior, el tratamiento con metformina redujo el número de células microgliales hasta valores controles (421,2 ± 41 cél/mm2; Fig. 22D y E; p< 0.01). Por lo tanto, se confirma de nuevo el efecto anti-inflamatorio de la metformina, en este caso producida la inflamación por MPTP. RESULTADOS 95 Fig. 21. Efecto de los distintos tratamientos sobre los niveles de expresión de los ARNm de TNF-α, IL- 1β, e iNOS en el modelo de LPS. El ARN total se extrajo de las SN de los animales tratados con los distintos tratamientos 6 horas después de la inyección de LPS/vehículo en la SN. Los resultados se expresan como media ± DE de al menos 4 experimentos independientes como porcentaje respecto a la β-actina. La significación estadística fue calculada a través de un ANOVA de una vía seguido del test LDS para comparaciones múltiples. Abreviaturas: Sal: animales inyectados con vehículo en la SN; SalMet: animales inyectados con vehículo en la SN y tratados con metformina; LPS: animales inyectados con LPS en la SN; LPSMet: animales inyectados con LPS y tratados con metformina. P < 0.01 para TNF-α e IL- 1β; P < 0.05 para iNOS. a ≠ Sal; b ≠ SalMet c ≠ LPS. b c RESULTADOS 96 RESULTADOS 97 Fig. 22. Cambios en la inmunorreactividad frente a Iba-1 en la SN de los ratones tras los distintos tratamientos en el modelo de MPTP. A) Sección coronal que muestra las células Iba-1 positivas en una animal inyectado con vehículo i.p. B) Sección coronal que muestra la inmunorreactividad frente a Iba-1 de un animal inyectado con vehículo i.p. y que ha recibido dos dosis diarias de metformina. Las células microgliales presentan, al igual que en el control, una morfología ramificada propia de células microgliales no activadas. C) Sección coronal que muestra las células microgliales Iba-1 positivas en un animal inyectado con 10 mg i.p. de MPTP 4 veces al día durante dos días. Se puede observar una fuerte reacción microglial con células activadas de aspecto fagocítico. D) Sección coronal que muestra las células microgliales Iba-1 positivas en un animal inyectado con MPTP i.p. y tratado con dos dosis diarias de metformina. La reacción microglial es claramente inferior a la del animal inyectado sólo con MPTP. Barra de escala: 100 μm. E) Cuantificación del número de células Iba-1 positivas tras el tratamiento por MPTP y/o metformina descrito antes. Los resultados se expresan como medias ± DE de al menos 4 experimentos independientes en número de células por mm2. La significación estadística se calculó a través de un ANOVA de una vía seguido del test LSD de comparaciones múltiples. P < 0.01. a ≠ control; b ≠ MPTP. Abreviaturas: Sal: animales inyectados con vehículo i.p; SalMet: animales inyectados con vehículo i.p. y tratados con metformina; MPTP: animales inyectados con MPTP i.p.; MPTPMet: animales inyectados con MPTP i.p. y tratados con metformina. RESULTADOS 104 2.2. CUANTIFICACIÓN DE LA CANTIDAD DE DOPAMINA Y SU METABOLITO DOPAC. La cantidad de DA y su metabolito DOPAC fueron medidos en el estriado de los animales sometidos al modelo de MPTP (Fig. 26). Se puede observar como la cantidad de DA en esta estructura disminuyó en un 47% de los valores control en los animales tratados con MPTP (p< 0.01). Esta reducción fue mucho mayor cuando se combinó MPTP y metformina (15,6% respecto al grupo control; p< 0.01; Fig. 26A). En el caso del metabolito DOPAC, el contenido de este metabolito en esta estructura fue también reducido en los animales tratados con MPTP (72.3% respecto al grupo control; p< 0.01; Fig. 26B). De la misma manera que ocurría con la DA, el efecto combinado de MPTP y metformina redujo notablemente la cantidad del metabolito en el estriado (26,9% respecto del control; p< 0.01; Fig. 26B). Fig. 26. Cuantificación de la cantidad de DA y su metabolito DOPAC en el estriado de animales tras los distintos tratamientos a través de la técnica de HPLC. A) Cuantificación de la cantidad de DA. El tratamiento con MPTP reduce significativamente la cantidad de DA en el estriado, mientras que el tratamiento con MPTP y metformina aumenta este efecto. B) Cuantificación de la cantidad de DOPAC. El tratamiento con MPTP reduce significativamente la cantidad de DOPAC en el estriado, mientras que el tratamiento con MPTP y metformina aumenta este efecto. Significación estadística: ANOVA de una vía seguido del test LSD de comparaciones múltiples. a ≠ control; b ≠ MPTP. P<0.01. Abreviaturas: Sal: animales inyectados con vehículo i.p; SalMet: animales inyectados con vehículo i.p. y tratados con metformina; MPTP: animales inyectados con MPTP i.p.; MPTPMet: animales inyectados con MPTP i.p. y tratados con metformina. RESULTADOS 105 RESULTADOS 106 3. EFECTO DE LA METFORMINA Y EL MPP+ SOBRE LA VIABILIDAD CELULAR DE NEURONAS DOPAMINÉRGICAS N27. 3.1. ENSAYO DE VIABILIDAD CELULAR. En primer lugar se comprobó el efecto de cada tratamiento mostrado en la Fig. 19 sobre la viabilidad de las células DAérgicas N27 diferenciadas por AMPc. Para esto se realizó el ensayo del MTT, 24 h después de cada tratamiento. Como puede observarse en la Fig. 27, ninguna de las dosis de metformina (100 μM y 1 mM) produjeron variaciones significativas en el porcentaje de viabilidad celular, comparado con el 100% del grupo control (99,5 ± 14,7% y 91,2 ± 6,3%, respectivamente). Cuando el MPP+ lo utilizamos a la dosis más baja, 25 μM, puede observarse en la Fig. 27A que no produjo ningún efecto significativo, con respecto al grupo control, sobre la viabilidad celular, ni sólo ni combinado con las dosis de 100 μM y 1 mM de metformina (92,7 ± 5,3%, 91,1± 2,73% y 76,0 ± 16,65%, respectivamente con respecto al grupo control). En la Fig 27B, se observa como la aplicación de la dosis de 50 μM de MPP+ produjo un descenso significativo de la viabilidad celular con respecto al grupo control (78,6 ± 4,81%; p< 0.001). La combinación con 100 μM de metformina produjo una pérdida de viabilidad celular similar a la producida por sí solo (75,1 ±10,1%, respecto del control; p< 0.001). Cuando se combinó con 1 mM de metformina, la pérdida de viabilidad fue algo mayor que la producida por sí solo (63,5 ± 6,4%, respecto al grupo control; p< 0.001). La dosis más alta de MPP+ (100 μM) produjo el efecto mayor por sí solo sobre la viabilidad (66,2% ± 1,86, Fig. 27C; p< 0.001). Cuando se combinaron las dosis más altas de metformina y MPP+ (1 mM y 100 μM, respectivamente), se observó el mayor RESULTADOS 107 efecto sobre la viabilidad celular, llegando a encontrarse un 54,5 ± 2,4% y un 53,1 ± 3,28% de viabilidad respecto al grupo control en los grupos tratados con 100 μM de MPP+ y 100 μM/1 mM de metformina respectivamente (Fig. 27C; p< 0.001). Fig. 27. Efecto sobre la viabilidad celular de los diferentes tratamientos ensayados por el método del MTT. El efecto de los diferentes tratamientos sobre la viabilidad celular se ensayó. a las diferentes dosis de las drogas (Metf 100 μM, Metf 1mM, MPP+ 25 μM, MPP+ 50 μM y MPP+ 100 μM) por sí solas y combinadas entre sí. (A) Efecto de la dosis de 25 μM de MPP+ por sí sola y combinada con las diferentes dosis de metformina. (B) Efecto de la dosis de 50 μM de MPP+ por sí sola y combinada con las diferentes dosis de metformina. (C) Efecto de la dosis de 100 μM de MPP+ por sí sola y combinada con las diferentes dosis de metformina. Significación estadística: ANOVA de una vía seguido del test LSD de comparaciones múltiples. a ≠ control; b ≠ Metf 100 μM; c ≠ Metf 1 mM; d ≠ MPP+ 50 μM (en B) ó MPP+ 100 μM (en C). p<0.01. A B C RESULTADOS 108 RESULTADOS 109 Fig. 28. Ensayo de muerte celular. Para determinar qué tipo de muerte celular tiene lugar con las dosis más altas de los tratamientos ensayados se realizó el estudio por citometría de flujo. (A) Gráfico de puntos donde se muestran las tinciones con anexina V y yoduro de propidio correspondientes a cada tratamiento. Cada punto representa una única célula. (B) Cuantificación de células apoptóticas en las diferentes condiciones ensayadas. (C) Cuantificación de células necróticas en las diferentes condiciones ensayadas. Se encontraron diferencias significativas al tratar las células con MPP+ y/o metformina. Significación estadística: ANOVA de una vía seguido del test LSD de comparaciones múltiples. a ≠ control; b ≠ MPP+100µM; P<0.01. RESULTADOS 110 3.2. ENSAYO DE MUERTE CELULAR. Con el objetivo de valorar si la muerte celular causada por las dosis altas de MPP+ y metformina (100 μM y 1 mM, respectivamente) que observamos por MTT se producía por apoptosis o necrosis, hicimos un estudio por citometría de flujo empleando anexina V y yoduro de propidio. Cuando una célula entra en apoptosis, la fosfatidilserina, que en condiciones normales se localiza en la cara interna de la membrana plasmática, se transloca a la membrana externa quedando así expuesta. La anexina V es un anticuerpo que se une a la fosfatidilserina. Al unirla a un fluorocromo e incubar con ella las células podremos detectar el grado de apoptosis en función del número de células postivas para anexina V. Por otro lado, el yoduro de propidio es un agente intercalante del ADN que sólo penetra en las células necróticas: Por tanto, incubando nuestras células con ambos reactivos podríamos encontrar los dos casos que nos interesan: - Células positivas para anexina V y negativas para yoduro de propidio: células apoptóticas - Células positivas para anexina V y yoduro de propidio: células necróticas. Los resultados sólo mostraron diferencias significativas en el número de células necróticas, es decir, positivas para yoduro de propidio; mientras que el número de células apoptóticas no varió con el tratamiento (Fig. 28B). El número de células necróticas inducido por el MPP+ fue 1.6 veces superior al encontrado en el grupo control, (Fig. 28C, p< 0.01), y este número se incrementó hasta 2.3 veces el grupo control al co-tratar las células con metformina (Fig. 28C; p<0.01), lo cual sugiere que la necrosis fue el mecanismo de muerte celular implicado. RESULTADOS 111 3.3. EFECTO DE LA METFORMINA Y EL MPP+ SOBRE LOS NIVELES DE ATP EN LAS NEURONAS N27. Los niveles de ATP se midieron en células N27 diferenciadas crecidas durante 1h en presencia de galactosa y de los diferentes tratamientos ensayados. Como puede observarse en la Fig. 29, el tratamiento con metformina en las dos dosis ensayadas (100 μM y 1 mM) no produjeron diferencias significativas en los niveles de ATP respecto al control (96.7 ± 5% y 92.0 ± 8,5%, respectivamente; p< 0.001). Fig. 29. Grado de inhibición de la cadena respiratoria por metformina y MPP+. Los niveles de ATP se midieron para evaluar la inhibición de la cadena respiratoria en células N27 diferenciadas crecida en presencia de galactosa durante 1h y tratadas con 100 μM y 1 mM de metformina, 100 μM de MPP+ y combinando ambos tratamientos. Se puede observar como la combinación de la dosis más alta de metformina (1 mM) combinada con 100 μM de MPP+ produce la mayor disminución en los niveles de ATP, a pesar de que la metformina por sí sola no tiene ningún efecto. Significación estadística: ANOVA de una vía seguido del test LSD de comparaciones múltiples. a ≠ control; b ≠ metformina 100 μM; c ≠ metformina 1 mM; d ≠ MPP+ 100 μM. P<0.01. RESULTADOS 112 Sin embargo, el tratamiento con 100 μM de MPP+ si produjo un descenso significativo con respecto al grupo control (88.3 ± 5,1%, p< 0.001). Cuando se aplicó la combinación de tratamientos, 100 μM de metformina junto con 100 μM de MPP+ y 1 mM de metformina junto con 100 μM de MPP+, se observaron los niveles más bajos de ATP (80.3 ± 5,4% y 76.2 ± 8,1% respectivamente respecto del control; p< 0.01). Según esto, el efecto de la combinación es mayor que la de cada tratamiento por separado. Fig. 30. Determinación de la producción de EROs por los diferentes tratamientos ensayados mediante la sonda fluorogénica CellROX. Para determinar el grado de estrés oxidativo producido por los diferentes tratamientos ensayados, se midió la producción de EROs 24h después de cada tratamiento: 1 mM de metformina, 25 μM, 50 μM y 100 μM de MPP+ y combinando cada dosis de MPP+ con 1 mM demetformina. A) Células sin tratar (grupo control). B) Células tratadas con metformina 1mM. C) Células tratadas con 100 μM de MPP+. D) Células tratadas con 1mM de metformina y 100 μM de MPP+. (E) Efecto de la dosis de 25 μM de MPP+ por sí sola y combinada con 1 mM de metformina. (F) Efecto de la dosis de 50 μM de MPP+ por sí sola y combinada con 1 mM de metformina. (G) Efecto de la dosis de 100 μM de MPP+ por sí sola y combinada con 1 mM Metformina. Significación estadística: ANOVA de una vía seguido del test LSD de comparaciones múltiples. a ≠ control; b ≠ MPP 100 µM P<0.01. RESULTADOS 113 DISCUSIÓN 120 de transcripción al núcleo es clave para desencadenar una respuesta inflamatoria, su inhibición por parte de la metformina se ha relacionado sistemáticamente con efectos anti-inflamatorios, tales como la reducción en la producción de IL-1β, de TNF-α o de la activación de las fosfoquinasas pro-inflamatorias p38 y ERK. La activación de la AMPK afecta a las repuestas pro-inflamatorias de la microglía, las que actualmente se consideran como los principales componentes del sistema inmune cerebral (Giri y col., 2004). La microglía controla constantemente el contenido cerebral y evalúa la seguridad del ambiente neuronal, que a su vez regula a estas células (Hanish y Kettenmann, 2007). Sin embargo, la activación prolongada y sostenida de la microglía se relaciona con la patogénesis de un buen número de desórdenes neurológicos, incluyendo el daño cerebral por isquemia/reperfusión, la EA, la EP, la demencia asociada al VIH y la esclerosis múltiple (Benveniste, 1997). Teniendo en cuenta las propiedades descritas para la metformina, debido al hecho de que puede atravesar la BHE (Wilcock y Bailey, 1994; Chen y col., 2009) y puesto que la AMPK se expresa en las células microgliales (Giri y col., 2004; Kuo y col., 2008), nuestra teoría es que la metformina puede modular la respuesta inflamatoria microglial inducida por la inyección de LPS o de MPTP. De hecho, estudios recientes han demostrado que la metformina es capaz de disminuir la respuesta inflamatoria en cultivos de microglía (Labuzek y col., 2010). Estos autores muestran cómo la metformina afecta a la liberación de citoquinas pro y anti-inflamatorias y reduce la producción de moléculas tóxicas promoviendo un cambio de la microglía hacia fenotipos de activación alternativos o anti-inflamatorios. La activación de la proteína AMPK constituye el mecanismo de acción mejor conocido de la metformina (Zhou y col., 2001). Parece razonable por tanto considerar la activación de la AMPK por la metformina como la responsable de los efectos anteriormente comentados. DISCUSIÓN 121 Por ello nos propusimos estudiar inicialmente el efecto de la metformina sobre la activación microglial en los dos modelos de las enfermedades neurodegenerativas comentados anteriormente. El LPS es el modelo de EP por inflamación por excelencia por lo que se eligió como primera opción para estudiar el efecto de la metformina sobre la activación de las células microgliales. Al estudiar los cambios en la microglía de los animales inyectados con LPS, se observó un fenómeno de activación, definido por una característica ramificación y posterior transformación fenotípica ameboide tras el estímulo inflamatorio. Concretamente, el número de células microgliales reactivas en la SN tras la inyección de LPS, fue diez veces mayor que en los animales a los que se les administró vehículo. Cuando el LPS fue inyectado en animales tratados con metformina se observó una clara reducción hasta prácticamente la mitad en el número de células OX-6 positivas alrededor del tracto de inyección. Estos resultados demuestran que la metformina, probablemente a través de su acción sobre la enzima AMPK, es capaz de inhibir la activación microglial en el mesencéfalo de la rata tras un estímulo inflamatorio, en este caso inducido por la inyección intranigral de LPS. La glía está involucrada en la liberación de numerosas sustancias que generan o promueven el proceso inflamatorio. Por tanto, 6 horas tras la inyección de LPS y la posterior reacción glial, se midió la síntesis de distintos parámetros que podrían estar involucrados en el proceso inflamatorio inducido por LPS, lo que desembocaría finalmente en el daño neuronal. Los niveles de IL-1β, TNF-α e iNOS aumentaron entre 2 y 5 veces respecto a los animales control. Esto está de acuerdo con anteriores estudios en los que mediante técnicas de RT-PCR, se realizaron medidas de dichos parámetros en la SN a distintas horas tras la inyección del LPS. Estos estudios mostraron que a las 6 horas tras la inyección de LPS se producía un pico en los niveles de expresión de las DISCUSIÓN 122 citoquinas, que empezaban a disminuir a partir de ese momento hasta alcanzar niveles normales entre las 24 y las 48 horas tras la inyección de LPS, dependiendo de la citoquina estudiada (Tomás-Camardiel y col., 2005). En nuestras condiciones experimentales, el tratamiento con metformina redujo los niveles de expresión del TNF-α, siendo esta disminución aún mayor en el caso de la IL-1β. Sin embargo, los niveles de iNOS no se modificaron con el tratamiento con metformina. Estos resultados corroboran los obtenidos a nivel celular a través de inmunohistoquímica y demuestran de nuevo un claro efecto anti-inflamatorio de este fármaco. 1.2 EFECTO DE LA METFORMINA SOBRE LA PÉRDIDA NEURONAL Los dos modelos de EP utilizados en este trabajo se caracterizan por una elevada pérdida de neuronas DAérgicas de la SNpc. En el caso del modelo basado en la inyección de LPS, esta pérdida neuronal se justifica por la fuerte reacción inflamatoria, mediada por la microglía, producida por este compuesto. Sin embargo, no siempre la activación microglial debe llevarnos a un estado no beneficioso para el organismo. Mediante la administración intranigral de la IL-4 (citoquina anti-inflamatoria) o ciertos glucocorticoides, los macrófagos secretan quimioquinas atrayentes para otros leucocitos, citoquinas anti-inflamatorias y algunos componentes de la matriz extracelular que favorecerían la proliferación celular, la angiogénesis y la reconstrucción de la matriz extracelular (McGeer y McGeer, 2007). La inyección de 2 μg de LPS en la SN de la rata produjo una pérdida significativa en el número de cuerpos celulares TH-positivos y alteró claramente el patrón de tinción DISCUSIÓN 123 tanto para los cuerpos celulares como para las fibras. Estos son efectos idénticos a los descritos en estudios previos en nuestro laboratorio (Castaño y col., 1998; Herrera et al., 2000, 2005, 2008; de Pablos et al., 2005, 2006, 2014; Tomás-Camardiel et al., 2004; Hernández-Romero et al., 2008; Villarán et al., 2009). El hecho de que el proceso inflamatorio que se da en la SN tras la inyección de LPS afecte exclusivamente a las neuronas DAérgicas, sugiere que la inflamación puede estar involucrada en ciertos procesos neurodegenerativos del sistema DAérgico de la vía nigroestriada, como por ejemplo la EP. Como ya se mencionó con anterioridad, está descrito el incremento de la síntesis de citoquinas inflamatorias por parte de la glía que se encuentra en la SN de pacientes con EP (Floor y Wetzel, 1998). Las neuronas DAérgicas de la SN son más susceptibles que otras neuronas de distintas regiones cerebrales a la inflamación, probablemente debido a que en esta estructura la microglia es 4,5 veces más abundante que en cualquier otra área cerebral (Qin y col., 2007). Sin embargo, algunos autores han argumentado que la inflamación no es el factor más importante en la progresión de la EP. Así por ejemplo, Croisier y col (2005), correlacionaron la cantidad de α-sin depositada en la SN con la activación microglial. No obstante, esta observación es difícil de argumentar ya que la actividad microglial es complicada de interpretar durante un periodo largo de activación, mientras que estos resultados son siempre evidencias a tiempos cortos. Sin embargo, teniendo en cuenta la coexistencia de distintos tipos de neuronas en esta estructura, la mayor densidad de microglía en la SN no sería suficiente para explicar la especial vulnerabilidad de las neuronas DAérgicas. Esto obliga a pensar que estas neuronas deben tener unas características que justifiquen dicho comportamiento. Entre las posibles causas que pudieran justificar este hecho podríamos considerar la menor capacidad de protección frente al estrés oxidativo inducido por los radicales DISCUSIÓN 124 libres de la SN (Jenner, 1998) y/o las altas concentraciones endógenas de DA en dicha estructura. Así, existen estudios previos en los que la propia DA juega un papel crucial en la degeneración de las neuronas DAérgicas de la SN (de Pablos y col., 2005). En dicho estudio los autores observaron que tras la inyección del LPS directamente en la SN del animal, se produce una pérdida de más del 40% de neuronas TH positivas en el hemisferio tratado con respecto al hemisferio control, inyectado con vehículo. Este efecto se pudo paliar mediante la administración de α-metilparatirosina (α-MPT), un inhibidor de la enzima TH, que por lo tanto disminuye la DA endógena. Sin embargo, al reponer los niveles de DA a través de la administración de su precursor, la L-DOPA, el daño sobre las neuronas Daérgicas volvía a producirse. Esto señalaría a la propia DA como uno de los factores causantes de la muerte neuronal durante el proceso inflamatorio provocado por el LPS (de Pablos y col., 2005). Otra teoría interesante sobre la pérdida de neuronas DAérgicas relacionada con la activación microglial está relacionada con la expresión de ciertos receptores de la DA. La microglía expresa receptores de DA (D1 y D2) y noradrenérgicos, entre otros. La expresión de estos receptores in vitro, atenúa la liberación de TNF-α e IL-6 inducida por LPS. Esto podría sugerir que la pérdida de las neuronas DAérgicas se produce también por la propia pérdida del efecto anti-inflamatorio endógeno. Ya que en el modelo de LPS la pérdida neuronal se produce fundamentalmente a través de la activación microglial, nuestra teoría era que el tratamiento con metformina, al disminuir todos los parámetros inflamatorios, debería disminuir también la muerte de neuronas Daérgicas. Sin embargo, y sorprendentemente, en nuestras condiciones experimentales, el tratamiento con metformina no protegió de los efectos dañinos originados por la inyección intranigral de LPS sino que, por el contrario, aumentó el número de neuronas TH positivas que degeneran tras la inyección de LPS en la SN. DISCUSIÓN 125 2. EFECTO DE METFORMINA EN EL MODELO DE MPTP. Aunque, como ya se ha comentado, el mecanismo de acción más conocido de la metformina es la activación de la AMPK con las consiguientes respuestas antiinflamatorias, recientemente se ha demostrado que la diana inicial de la metformina no es esta enzima, sino que este fármaco es capaz de inhibir de manera débil al complejo I de la cadena de transporte de electrones. La observación inicial se hizo en hígados perfundidos y hepatocitos aislados de roedores (Satoh y Kim, 1995; Sawada y col., 2007), aunque más tarde se extendió a otros tejidos, incluyendo el músculo esquelético (Shaftel y col., 2007), las células endoteliales (Si y col., 1996), las células beta pancreáticas (Sonoda y col., 2007) y las neuronas (Saeedi y col., 2008). Por tanto, una vez visto que el tratamiento con metformina atenúa la respuesta inflamatoria pero no protege a las neuronas DAérgicas, nos propusimos estudiar el efecto de este fármaco con otro modelo de EP, el basado en la inyección de MPTP, uno de los modelos de EP más ampliamente utilizado. Como ya se ha comentado, el MPTP es una protoxina de toxicocinética compleja que se transforma en su metabolito tóxico, el MPP+ (Heikkila y col., 1984). Tras su administración sistémica el MPTP atraviesa la BHE en cuestión de segundos (Markey y col., 1984) debido a su alta lipofobicidad (Riachi y col., 1989) y una vez en el cerebro es transformado rápidamente en MPP+ a través de las células gliales y serotoninérgicas (Chiba y col., 1984, 1985; Peterson y col., 1985). El MPP+ es liberado al espacio extracelular y es captado por las neuronas Daérgicas a través del DAT, por el que tiene alta afinidad (Bezard y col., 1999; Javitch y col., 1985). Una vez dentro de las neuronas altera la respiración mitocondrial inhibiendo al complejo multienzimático de la NADH-ubiquinona oxidorreductasa (complejo I) de la cadena de transporte de electrones (Nicklas y col., 1985), produciendo la muerte neuronal. DISCUSIÓN 126 2.1. EFECTO DE LA METFORMINA SOBRE LA ACTIVACIÓN MICROGLIAL. En nuestras condiciones experimentales la inyección de MPTP indujo la activación de la microglía, como se puso de manifiesto a través de inmunocitoquímica de Iba-1. Así, la mayor parte de las células microgliales en los animales tratados con MPTP muestran una morfología más redondeada típica de microglía activada y una mayor densidad (160% más respecto al grupo control) bajo estas condiciones. El tratamiento con metformina de nuevo disminuye la densidad microglial hasta niveles próximos a los controles en los animales inyectados con MPTP. Por otro lado, los experimentos llevados a cabo a través de técnicas de RT-PCR mostraron un aumento significativo en los niveles de expresión del TNF-α, la IL-1β y la enzima iNOS en los animales tratados con MPTP, todos ellos mediadores de la inflamación liberados por la microglía reactiva en condiciones de inflamación. En nuestras condiciones experimentales, los niveles de expresión de dichas citoquinas, incluida la iNOS, se redujeron tras el tratamiento con metformina, lo que pone de manifiesto de nuevo el poder anti-inflamatorio de este fármaco. La diferencia en la protección ejercida por la metformina sobre la producción de iNOS en los dos modelos de EP usados puede deberse a que en el modelo inducido por el LPS la cuantificación de iNOS se realizó a 6 horas tras el tratamiento con LPS, de manera que los animales solo habían recibido una dosis de metformina, mientras que por el contrario en el modelo inducido por el MPTP la iNOS se midió al final del tratamiento por lo que los animales recibieron 2 dosis diarias de metformina durante los 7 días que duró el tratamiento. DISCUSIÓN 127 2.2. EFECTO DE LA METFORMINA SOBRE LA PÉRDIDA NEURONAL. Para valorar el efecto de la metformina en animales tratados con MPTP se usaron en primer lugar técnicas de inmunocitoquímica frente a la enzima TH. En nuestras condiciones experimentales la inyección de MPTP indujo la muerte de las neuronas prácticamente hasta la mitad con respecto al control, tal como se puso de manifiesto a través de inmunocitoquímica de TH. Para corroborar este efecto se decidió estudiar las cantidades de DA y su metabolito DOPAC en el estriado de los ratones. La medida de DA y DOPAC es un método ampliamente aceptado para estimar la pérdida neuronal en la SN, ya que éstas neuronas proyectan sus axones al estriado y allí liberan la DA. Por tanto, una pérdida de DA en el estriado se relaciona con una pérdida de cuerpos neuronales en la SN ipsilateral. Existen diversos métodos para determinar catecolaminas en el cerebro, pero de entre ellos el que se considera que tiene más sensibilidad es la cromatografía líquida de alta resolución o HPLC con detección electroquímica (Kissinger, 1996; Chaurasia, 1999; Raggi y col., 1999; Sabbioni y col., 2004). Esta técnica permite estimar con exactitud la liberación de neurotransmisores y sus metabolitos y estudiar los cambios inducidos en ellos por drogas que pueden perfundirse a través de la sonda de diálisis o ser administradas por vía sistémica (Bito y col., 1966). La técnica fue ideada por Bito y col. (1966) y, aunque inicialmente presentaba ciertas limitaciones, posteriormente fue perfeccionada por otros grupos de investigadores (Delgado y col., 1984; Ungerstedt y Hallström, 1987). Nuestros resultados muestran como el tratamiento con MPTP a las dosis estudiadas induce la pérdida tanto de DA como de DOPAC en el estriado de los animales, lo que corrobora los datos obtenidos mediante inmunocitoquímica. DISCUSIÓN 128 Sin embargo, y de nuevo en contra de lo que cabría esperar debido a su efecto anti-inflamatorio, el tratamiento con metformina en animales tratados con MPTP indujo una mayor muerte de neuronas DAérgicas en la SN, así como menores niveles de DA y DOPAC en el estriado, por lo que el tratamiento con metformina, lejos de proteger, aumenta el daño sobre estas neuronas. El efecto dañino de la metformina se puede explicar a través de la inhibición que este fármaco ejerce sobre el complejo I mitocondrial. La actividad reducida en el complejo I altera la respiración mitocondrial y se asocia con un amplio espectro de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la EP. De hecho, se ha encontrado una reducción de la actividad del complejo I en autopsias de tejidos de cerebro y de plaquetas de pacientes afectados con EP esporádicos. Además, se ha sugerido que los fenómenos de disfunción mitocondrial tienen lugar en estadios tempranos de la enfermedad. Aunque los mecanismos por los que las neuronas DAérgicas de la SNpc son especialmente sensibles a la inhibición de la respiración mitocondrial no están del todo esclarecidos, en un estudio reciente Gandhi y col. (2012) demostraron que la DA presente en estas neuronas es capaz de producir la apertura del poro de transición mitocondrial en el modelo de EP basado en la pérdida de función del gen PINK1, uno de los modelos clave para estudiar las patologías mitocondriales en la EP (Valente y col., 2004). Finalmente, Matsuda y col. (2009) han mostrado la enorme arborización de las neuronas DAérgicas de la SNc. El mantenimiento de esta arborización requiere grandes cantidades de ATP por lo que cualquier circunstancia que disminuya el sumistro de energía en estas neuronas, como puede ser a través de la inhibición del complejo I, puede comprometer la viabilidad de las mismas. Aunque el mecanismo exacto por el cual la metformina inhibe el complejo I de la cadena respiratoria sigue siendo desconocido, recientemente se ha demostrado que DISCUSIÓN 129 este efecto no requiere de la AMPK (Wilkinson y Landreth, 2006, El-Mir y col., 2000) demostraron que la metformina inhibe específicamente al complejo I de la cadena respiratoria a través de un mecanismo indirecto que no funciona a través de las vías de señalización celulares tradicionales, pero que requiere que las células estén intactas para ser iniciado (Satoh y col., 1995). Esto llevó a los autores a proponer que los efectos de la metformina deben producirse a través de una vía de señalización compleja, en cuya primera etapa puede haber una interacción entre el fármaco y un receptor de membrana. Sin embargo, nuevas investigaciones siguen siendo necesarias para aclarar el mecanismo por el cual la metformina modula el complejo I de la cadena respiratoria de una manera única. También vale la pena mencionar que la metformina probablemente también ejerce algunos efectos no mitocondriales ya que se ha demostrado que afecta el metabolismo de los eritrocitos, una célula carente de mitocondrias, mediante la modulación de la fluidez de membrana (Wu y col., 1999; Xie y col., 2002). 3. EFECTO DE LA METFORMINA SOBRE LA VIABILIDAD NEURONAL Y LA PRODUCCIÓN DE ATP. Para profundizar un poco más en los mecanismos por los que la metformina incrementa el daño sobre las neuronas DAérgicas, en este estudio hemos querido evaluar los efectos del tratamiento con metformina sobre un cultivo de neuronas DAérgicas N27 diferenciadas tratadas con MPP+. La viabilidad celular se midió a través del ensayo del MTT. El tratamiento con distintas dosis de metformina (100µM y 1 Mm) sola o en combinación con diferentes dosis de MPP+ (desde 25 a 100 µM) produjo un claro efecto sobre la viabilidad neuronal. En el caso de la metformina hemos elegido la dosis de 100 µM por ser la concentración fisiológica alcanzada tras el tratamiento con