Hitos y retos en la biofortificación de cassava.

1 Hitos y retos en la biofortificación de cassava Trabajo de fin de Grado Junio 2022 Dpto. Bioquímica Vegetal y Biología Molecular Ángela Peláez Fernández Grado en Bioquímica. Universidad de Sevilla y Universidad de Málaga 2 Índice 1. Resumen ....................................................................................................................... 3 2. Introducción ................................................................................................................... 3 2.1 Importancia de los micronutrientes y enfermedades asociadas a sus deficiencias . 3 2.2 Biofortificación de cultivos ....................................................................................... 5 3. La cassava como cultivo de interés para la biofortificación ............................................ 6 3.1 Valor nutricional de la cassava................................................................................ 7 4. Vitamina A ..................................................................................................................... 8 4.1 Deficiencia de vitamina A ........................................................................................ 9 4.2 Biofortificación en cassava de vitamina A: BioCassava+ ........................................ 9 5. Vitamina B6 ................................................................................................................. 11 5.1 Deficiencia de vitamina B6 .................................................................................... 12 5.2 Biofortificación en cassava de vitamina B6 ........................................................... 12 6. Hierro y zinc ................................................................................................................. 13 6.1 Funciones e implicaciones de la deficiencia de hierro ........................................... 13 6.2 Funciones e implicaciones de la deficiencia de zinc .............................................. 14 6.3 Biofortificación en cassava de hierro y zinc ........................................................... 14 7. Proteínas ..................................................................................................................... 15 7.1 Deficiencia de proteínas ....................................................................................... 15 7.2 Biofortificación en cassava de proteínas ............................................................... 16 8. Eliminación de cianuro de hidrógeno ........................................................................... 16 9. Resistencia a enfermedades ........................................................................................ 18 9.1 Virus del mosaico de la cassava ........................................................................... 18 9.2 Enfermedad de la raya parda de la cassava ......................................................... 19 10. Mejora de la cantidad y la calidad del almidón.......................................................... 21 11. Reducción del deterioro tras la recolección .............................................................. 23 12. Retos y perspectivas de futuro en la investigación ................................................... 24 13. Conclusiones ............................................................................................................ 25 14. Bibliografía ............................................................................................................... 26 3 1. Resumen La cassava es uno de los pilares fundamentales de la dieta en muchos países tropicales, especialmente en países del tercer mundo, pues es un cultivo muy productivo y que supone un gran aporte de energía. A pesar de esto, es un cultivo con un valor nutricional pobre, con un contenido bajo en proteínas y algunos minerales y vitaminas, y del que además depende la seguridad alimentaria de muchos países. Todo esto hace que la cassava sea una planta en estudio para desarrollar estrategias de biofortificación que pasan por la modificación genética del cultivo. En este trabajo se recogen las principales aproximaciones que se han realizado al respecto, desde la mejora de su calidad nutricional, su resistencia a estrés biótico y la eliminación de compuestos tóxicos potencialmente nocivos para los consumidores. También se detallan las perspectivas de estas investigaciones en un futuro próximo para mejorar tanto el consumo como la seguridad de este cultivo. 2. Introducción La OMS recoge el concepto de malnutrición como aquel que “abarca la desnutrición (emaciación, retraso del crecimiento e insuficiencia ponderal), los desequilibrios de vitaminas o minerales, el sobrepeso y la obesidad, y las enfermedades no transmisibles relacionadas con la alimentación”. Esta misma organización afirma que las carencias de micronutrientes más relevantes en cuanto a salud pública mundial son de hierro, vitamina A y yodo, que suponen una grave amenaza especialmente para los niños y las mujeres embarazadas en países considerados del tercer mundo (https://www.who.int/es/news-room/factsheets/detail/malnutrition). En este trabajo vamos a revisar las principales carencias de micronutrientes asociadas a las dietas basadas en cassava, uno de los pilares fundamentales de la nutrición en países subdesarrollados y las soluciones que ofrece la biotecnología vegetal. Las carencias de micronutrientes son referidas como “el hambre silenciosa” (“hidden hunger”), término introducido por UNICEF y la OMS (UNICEF, 1990). Se le denomina así porque son carencias que en principio no tienen implicaciones inmediatas ni especialmente evidentes, pero a largo plazo producen graves problemas, e incluso la muerte, dado que los micronutrientes tienen un papel esencial en la coordinación y el buen funcionamiento del metabolismo (Bailey et al., 2015). 2.1 Importancia de los micronutrientes y enfermedades asociadas a sus deficiencias El concepto de micronutriente incluye las vitaminas y los minerales requeridos por el organismo en pequeñas cantidades, pero cuya presencia en la dieta es esencial ya que están implicados en procesos vitales, de forma que la deficiencia de cualquier micronutriente puede producir enfermedades graves. Sus implicaciones en el cuerpo son muy variadas, ya que son 4 necesarios para la actividad enzimática y la producción de hormonas y otras moléculas vitales para el crecimiento y el desarrollo. Las deficiencias pueden causar problemas de salud poco evidentes, como la pérdida de energía, de claridad mental o de coordinación, y problemas más graves, como abortos, problemas del desarrollo físico y cognitivo o diarreas que pueden llevar a la muerte (Zea & Ochoa, 2013), cuando las carencias se producen a largo plazo (https://www.who.int/health-topics/micronutrients#tab=tab_1). Dentro de los micronutrientes más conocidos están las vitaminas, que se dividen en dos grupos: las liposolubles (vitaminas A, D, E y K) y las hidrosolubles, que actúan como precursores de coenzimas vitales para procesos metabólicos, por ejemplo, la vitamina B1 es precursor de la tiamina pirofosfato (TPP), la B2 del flavin adenin dinucleótido (FAD) y la niacina del nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), la vitamina B6 es precursor del piridoxal fosfato y la B9 del tetrahidrofolato. A su vez, los minerales son en muchos casos cofactores para enzimas antioxidantes: el cobre es cofactor de las citocromo oxidasas y, junto al zinc, de la superóxido dismutasa (SOD) citosólica, el manganeso de la SOD mitocondrial, el selenio de la glutatión peroxidasa y el hierro de la catalasa. Estas enzimas antioxidantes son necesarias para la eliminación de los radicales libres producidos normalmente por el metabolismo, que también pueden ser neutralizados por algunas vitaminas con papel antioxidante: A, C, E y K. Por último, hay un tercer tipo de micronutriente, los polifenoles, que son fitoquímicos o compuestos activos que se encuentran en los vegetales como metabolitos secundarios protectores (Opara & Rockway, 2006). Las vitaminas también pueden actuar como cofactores, como es el caso de la vitamina K que actúa como cofactor en reacciones de carboxilación de residuos de glutamato para formar el aminoácido γ-carboxiglutamato (Gla) (Cranenburg et al., 2007). En los países considerados del tercer mundo son más prevalentes las deficiencias de micronutrientes y los problemas de salud asociados a estas: en el mundo, 161 millones de niños padecen retrasos en el desarrollo debidos a carencias de micronutrientes (Figura 1), y la mitad de ellos vive en Asia y un tercio en África (de Onis & Branca, 2016). Las deficiencias de micronutrientes más importantes, tanto por su incidencia como por la gravedad de su impacto en la salud, son las deficiencias de hierro, vitamina A, yodo, folato y zinc (Bailey et al., 2015). 5 Figura 1. Prevalencia del retraso en el crecimiento en niños menores de 5 años por países. Figura tomada del artículo “Childhood stunting: a global perspective” (de Onis & Branca, 2016). La malnutrición es la causa subyacente de un 30% de las muertes de niños menores de 5 años, y alcanza un 35% si se tiene en cuenta la alimentación deficiente por amamantamiento (WHO, 2008). Un ejemplo de área geográfica con un importante problema de malnutrición y hambre silenciosa es Nigeria, donde el 75% de los niños menores de 5 años tiene anemia de hierro y un 20% de los niños en dicha franja de edad sufren deficiencia de zinc. Para las mujeres en edad reproductiva, el 22% está por debajo de su normopeso y el 47,8% tiene unos niveles de hemoglobina en sangre por debajo de lo normal (<12 g/L) (Olumakaiye et al., 2021). Siendo tales las implicaciones de las deficiencias de micronutrientes, se hace necesario buscar posibles soluciones o estrategias que mejoren el estado nutricional de las poblaciones más vulnerables a estos problemas. De ahí el interés de la modificación genética de cultivos, que puede ser una herramienta útil para introducir características que permitan garantizar la seguridad alimentaria en aquellos cultivos que suponen un pilar de la dieta en los países del tercer mundo. 2.2 Biofortificación de cultivos La biofortificación es una estrategia muy útil para tratar de paliar estas deficiencias. Se define como el proceso de incrementar el contenido de micronutrientes de un cultivo a través de “breeding” selectivo, modificaciones genéticas o el uso de fertilizantes enriquecidos. En concreto, con respecto a las modificaciones genéticas, un transgénico u organismo genéticamente modificado (GMO por sus siglas en inglés) es un organismo en el que se han introducido mejoras heredables para usos específicos por ingeniería genética (https://www.usda.gov/topics/biotechnology/biotechnology-glossary). 6 3. La cassava como cultivo de interés para la biofortificación Dentro de los cultivos que actualmente se encuentran en estudio para su mejora mediante biofortificación se encuentra la cassava (Figura 2). La cassava (Manihot esculenta Cranz), también conocida como yuca, mandioca o tapioca, es un arbusto (Figura 2a) capaz de alcanzar los 2-3 metros de altura, de hojas anchas y palmadas y cuya raíz de almacenamiento presenta una piel marrón y suberosa de aproximadamente 1,5 mm (Figura 2b), que envuelve la parte comestible firme, de color blanco y rica en almidón (Cartay, 2004). Pertenece a la familia de las euforbiáceas, dentro de la subfamilia Crotonoideae. Se reproduce más rápidamente por esquejes que por semillas (Figura 2c). Es originaria de América del Sur y su cultivo se ha extendido a otras zonas tropicales y subtropicales de Asia y África, de condiciones climáticas similares, en las que supone la tercera fuente de carbohidratos de la dieta (tras el arroz y el maíz). Debido a las adaptaciones adquiridas por el tipo de clima de su origen, no resiste las heladas y requiere bastante humedad y luz solar para crecer en condiciones óptimas. El momento óptimo para la recolección de su raíz es al alcanzar la edad de un año; pasado este tiempo, la raíz se endurece y pierde su valor gastronómico. El interés de la cassava para la biofortificación reside en varios factores: en algunas zonas tropicales de recursos limitados es común que la dieta dependa fuertemente de este cultivo, por lo que introducir mejoras que le confieran valor nutricional añadido podría contribuir a la mejora de la salud de sus consumidores; además, dada la fuerte dependencia de estos países del cultivo de cassava, favorecer mediante la generación de transgénicos la productividad y la resistencia a condiciones adversas del cultivo supondría una mayor accesibilidad a este alimento y un mayor beneficio para quienes lo cultivan. Figura 2. (a) Arbusto de casava, (b) raíces y tallos, (c) esquejes para propagación. Figura adaptada del artículo “The biocassava plus program: Biofortification of cassava for sub-Saharan Africa” (Sayre et al., 2011). Las estrategias generales para la biofortificación de este cultivo se centran en mejorar su calidad nutricional (Leyva-Guerrero et al., 2012; Narayanan et al., 2011, 2015, 2019; Sayre et al., 2011) reducir la cantidad de glucósidos cianogénicos tóxicos (Gómez, Berkoff, et al., 2019; 7 Siritunga & Sayre, 2004, 2003), mejorar la calidad y cantidad de almidón (Bull et al., 2018; Koehorst-van Putten et al., 2012; Raemakers et al., 2005), reducir el tiempo que tarda en deteriorarse tras la cosecha (Liu et al., 2017; Wu et al., 2022) o conferirle resistencia a plagas como el virus del mosaico (Chellappan et al., 2004) o el de la raya parda (Beyene et al., 2017; Gómez, Lin, et al., 2019), entre otras. La mejora a través de la obtención de transgénicos de todos estos aspectos supone un gran avance para garantizar la optimización del cultivo de cassava (Cock & Connor, 2020). 3.1 Valor nutricional de la cassava La cassava es un alimento con un alto contenido energético, además es un cultivo muy eficiente en cuanto a su productividad por hectárea, con 71 toneladas/hectárea al año y 1045 kJ/hectárea al día (Montagnac et al., 2009). La raíz de almacenamiento, que es la parte más ampliamente consumida, presenta un alto contenido de carbohidratos y agua, y supone poco aporte de grasas y proteínas. Aporta bastante vitamina C, pero de otras vitaminas y minerales supone un porcentaje mínimo de la RDA (Recommended Dietary Allowance). De hecho, carece de ciertos nutrientes (o posee una cantidad tan mínima que ni siquiera se tiene en cuenta en su valor nutricional), por ejemplo, de pigmentos como el licopeno, la luteína y la zeaxantina; de vitaminas D y B12, y de ácidos grasos trans y colesterol. En las tablas I y II se recogen los datos publicados por United States Department of Agriculture (USDA) sobre el valor nutricional tanto de macronutrientes como de micronutrientes (https://fdc.nal.usda.gov/fdc-app.html#/food-details/169985/nutrients). Tabla 1. Valor nutricional (macronutrientes y agua) de la raíz de cassava, datos publicados por el USDA. Macronutrientes Valor nutricional (por 100 g) Carbohidratos 38,1 g Azúcares 1,7 g Fibra 1,8 g Grasas 0,28 g Proteínas 1,36 g Agua 59,7 g Tabla 2. Valor nutricional (micronutrientes) de la raíz de cassava, información publicada por el departamento de agricultura de los EEUU (USDA) Micronutrientes Cantidad por cada 100 gramos Vitamina A (retinol) 13 µg beta-caroteno 0,8 µg 8 Vitamina B1 (tiamina) 0,087 mg Vitamina B2 (riboflavina) 0,048 mg Vitamina B3 (niacina) 0,854 mg Vitamina B5 (ácido pantoténico) 0,107 mg Vitamina B6 0,088 mg Vitamina C (ácido ascórbico) 20,6 mg Vitamina E (alfa-tocoferol) 0,19 mg Vitamina K 1,9 µg Folato 27 µg Ácidos grasos saturados 0,074 g Ácidos grasos monoinsaturados 0,075 g Ácidos grasos poliinsaturados 0,048 g Potasio 271 mg Fósforo 27 mg Magnesio 21 mg Calcio 16 mg Como podemos ver en los datos recogidos en la tabla II, la cassava tiene un alto contenido de vitamina C, que contrasta con el bajo contenido en vitaminas del grupo B y en vitaminas A, E y K, suponiendo un aporte muy insuficiente de estos micronutrientes para el requerimiento diario (RDA) (Montagnac et al., 2009). En este trabajo se van a revisar diversas investigaciones en las que se ha modificado genéticamente la planta de cassava para conseguir una mayor acumulación de micronutrientes, una mayor seguridad alimentaria para los consumidores de este alimento (por ejemplo, eliminando tóxicos) además de una mayor productividad del cultivo mejorando su resistencia a plagas, así como la reducción del deterioro post-cosecha, etc. El principal objetivo de este trabajo es comprender los avances que se han realizado en ese sentido y también plantear los retos que se han encontrado en el proceso de mejora del cultivo de cassava y cuáles son las posibles vías para solucionarlos. 4. Vitamina A La cassava es el quinto cultivo más extendido en el mundo (Parmar et al., 2017) y el tercero en los trópicos, representando una de las principales fuentes de calorías en los países del tercer mundo. Es la mayor fuente de calorías para unos 500 millones de personas, muchos de ellos en África (Bayata, 2019), pero como ya se ha mencionado no supone un aporte suficiente de ciertos nutrientes, en particular de vitamina A. Una ración típica de adulto de 9 cassava, 500 gramos, sólo aporta un 10% del requerimiento diario de vitamina A (WHO & FAO, 2001). La vitamina A engloba retinol (-OH), ácido retinoico (-COOH) y retinal (-CHO). Cabe destacar el papel de los carotenoides presentes en los vegetales: algunos, como el β-caroteno, son precursores de 40 carbonos capaces de formar moléculas de 20 carbonos que producen vitamina A por la acción de la enzima 15-15’-dioxigenasa. Los carotenoides cumplen una importante función como antioxidantes (Opara & Rockway, 2006). Esta vitamina liposoluble se une en el núcleo celular a receptores dimerizados para modificar la expresión génica, aunque también tiene funciones mediadas por cambios conformacionales (rodopsina de los bastones retinales) y por su actuación como cofactor (Carazo et al., 2021). Se requieren unos 1000 µg de vitamina A diarios para suplir las necesidades del organismo. La vitamina A participa en el mantenimiento de la integridad epitelial (McCullough et al., 1999) y la función inmune (Stephensen, 2001), en la espermatogénesis (Hogarth & Griswold, 2010) y las migraciones celulares de la morfogénesis embriogénica (Zile, 2010), en la función neurológica al mediar procesos que participan en la plasticidad sináptica (Olson & Mello, 2010), en el crecimiento óseo regulando el equilibrio entre osteoblastos y osteoclastos (Herschel Conaway et al., 2013) y en la visión en oscuridad y el mantenimiento de la córnea (Dowling, 2020). 4.1 Deficiencia de vitamina A La carencia de vitamina A produce problemas de gravedad variable para la salud al verse afectadas las funciones llevadas a cabo por esta vitamina. Es especialmente prevalente dentro del grupo de los menores de 5 años por encima de cualquier otro rango de edad. La prevalencia geográfica es mayor en la zona central de la región del África subsahariana, con 25905,22 casos por cada 100000 habitantes, seguido por la zona este (23500,02/100000) y la zona oeste (15570,91/100000) de la misma región (Zhao et al., 2022). 4.2 Biofortificación en cassava de vitamina A: BioCassava+ En el contexto de la búsqueda de una mejora genérica de cultivos como la cassava nació en 2004 el programa BioCassava+ (BC+) financiado por la fundación Bill y Melinda Gates dentro de los grandes retos para la salud global, con una financiación de más de 20 millones de dólares. Centrándose en el África sub-Sahariana, el programa ha tratado de mejorar el contenido nutricional (zinc, hierro, proteína y vitamina A) de la cassava; así como conferirle características que mejoren su productividad y por ello la aceptabilidad por parte de los agricultores y los consumidores (resistencia a virus, aumento de la durabilidad y reducción de los componentes tóxicos) (Sayre et al., 2011). En esta investigación (Sayre et al., 2011) se usa la variedad de Manihot esculenta 60444, una de las más comúnmente utilizadas en estudios de modificación genética. Sobre esta variedad 16 enzimas, proteínas y vitaminas antioxidantes, con lo que se deduce que la patología surge de un exceso de radicales libres y una carencia de mecanismos antioxidantes. Se ralentiza el metabolismo de proteínas y se reduce el catabolismo de lípidos (limitando la generación de energía), se producen alteraciones hormonales (insulina, T3 y T4, TSH, leptina, etc.), aumenta la proliferación de patógenos en la microbiota y aparecen concentraciones anormalmente altas de citoquinas proinflamatorias (Pham et al., 2021). 7.2 Biofortificación en cassava de proteínas Con el objetivo de incrementar la concentración de proteínas en la raíz de cassava se ha desarrollado la estrategia de sobreexpresar enzimas del metabolismo de proteínas bajo el control de promotores específicos para promover la acumulación en las raíces. Se consiguió la sobreexpresión del gen que codifica la hidroxinitrilo liasa (HNL, que participa en el metabolismo de glucósidos cianogénicos) bajo el control del promotor de patatina (Figura 6). Tanto el gen como el promotor se clonaron en el vector pCambia2300, que se introdujo en Agrobacterium tumefaciens para llevar a cabo la transformación de plantas de cassava del cultivar TMS60444. Con esta aproximación se multiplicó por tres el contenido de proteínas totales en la raíz y se aceleró la cianogénesis tras el procesamiento del tubérculo, y por tanto se obtuvo un alimento mucho más seguro. Tras 90 minutos desde el procesamiento, las raíces transgénicas presentaban una reducción del 80-90% del contenido de acetona cianohidrina (un metabolito tóxico). En ellas también se producía una reducción del 53-74% del contenido de linamarina (que producirá acetona cianohidrina). Como la enzima HNL contiene un 50% de aminoácidos esenciales, el consumo de tubérculos de cassava que acumulan esta proteína supondrá un incremento en el aporte proteico de la raíz (Narayanan et al., 2011). Figura 6. Resumen gráfico del artículo “Overexpression of hydroxynitrile lyase in cassava roots elevates protein and free amino acids while reducing residual cyanogen levels” (Narayanan et al., 2011). 8. Eliminación de cianuro de hidrógeno En la cassava hay dos componentes, linamarina y lotaustralina, que al ser hidrolizados generan cianuro de hidrógeno, un compuesto muy tóxico que se une a la enzima citocromo c oxidasa impidiendo el correcto funcionamiento de la cadena transportadora de electrones. Su 17 función parece ser la de proteger frente al estrés biótico, pues la separación espacial entre el sustrato (linamarina) y la enzima linamarasa que lo hidroliza hace que sólo interacciones y por tanto se produzcan metabolitos tóxicos cuando ocurre un daño en los tejidos debido a la acción de herbívoros u hongos o frente a un daño mecánico, aunque no se descarta que sea un recurso para la movilización en la planta de formas reducidas de nitrógeno. Otras plantas que producen estos glucósidos cianogénicos son los almendros, el sorgo o las cañas de bambú (Ndubuisi & Chidiebere, 2018). Esto supone un importante peligro asociado al consumo de este alimento, especialmente en las variantes amargas que tienen un contenido mucho más alto de glucósidos cianogénicos (Tshala-Katumbay et al., 2016). En estas variantes se requieren procesamientos más exhaustivos que pueden implicar la pérdida de nutrientes, por lo que obtener variantes de cassava con un contenido menor de glicósidos cianogénicos permitiría reducir la cantidad de procesamientos a llevar a cabo y por ello mantener más nutrientes en las elaboraciones culinarias. Para eliminar estos compuestos cianogénicos se han generado plantas transgénicas de cassava en las que se ha inhibido la expresión de los genes CYP79D1 y CYP79D2 del citocromo P450 bajo el control del promotor Cab1, específico de las hojas (Siritunga & Sayre, 2003) (Figura 7). Los resultados demostraron una reducción del 99% de la cantidad de linamarina en las raíces, con lo que no solo se consigue una variante sin glucósidos cianogénicos sino que además se demuestra que estos compuestos se sintetizan en las hojas y posteriormente se distribuyen al resto de la planta. En el mismo sentido, se han obtenido también transgénicos de cassava con un metabolismo y volatilización acelerada de los cianogénicos (hasta tres veces más rápido) durante el procesamiento mediante la sobreexpresión de HNL (hidroxinitrilo liasa), la enzima involucrada en el último paso de la cianogénesis (Figura 7). En estas plantas transgénicas, la acetona cianohidrina se transforma en acetona y cianuro volátil en las raíces, lo cual supone una ventaja importante sobre el silvestre que sólo expresa HNL en hojas, y tiende a acumular ese metabolito tóxico en las raíces (Siritunga & Sayre, 2004). Más recientemente y usando la técnica de CRISPR-Cas9 para impedir la actividad de CYP79D1 y CYP79D2 de forma individual y conjunta (Figura 7), encontraron que el “knockout” de CYP79D2 reduce casi totalmente la producción de cianogénicos, por lo que contribuye más a la cianogénesis que CYP79D1, cuyo “knockout” presenta una reducción menor del contenido de compuestos cianogénicos. El doble “knockout” de ambos genes elimina al completo la presencia de cianogénicos (Gómez, Berkoff, et al., 2019), con el consiguiente beneficio económico que esto supone. 18 Figura 7. Resumen gráfico de los artículos “Generation of cyanogen-free transgenic cassava” (Siritunga & Sayre, 2003), “Engineering cyanogen synthesis and turnover in cassava (Manihot esculenta)” (Siritunga & Sayre, 2004) y “CRISPR-Cas9-mediated knockout of CYP79D1 and CYP79D2 in cassava attenuates toxic cyanogen production” (Gómez, Berkoff, et al., 2019). 9. Resistencia a enfermedades 9.1 Virus del mosaico de la cassava El virus del mosaico de la cassava es el patógeno más ampliamente distribuido en África, y es transmitido por la mosca blanca (Bemisia tabaci) y por la acción del hombre al tomar esquejes infectados. El síntoma más común es el mosaico clorótico característico de la hoja (que afecta especialmente a plantas jóvenes), y la sintomatología varía desde casi imperceptible hasta un retraso extremo del crecimiento y reducción del tamaño de la hoja (Fauquet & Fargette, 1990). Se han conseguido obtener diversas variedades de plantas resistentes a virus mediante la resistencia derivada de patógenos que consiste en la expresión de ciertos genes virales que pueden conferir resistencia o atenuar la susceptibilidad de la planta. El mecanismo que media estos procesos de resistencia es el silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS por sus siglas en inglés), que es un mecanismo de degradación específica de mRNAs desencadenado por la formación de un intermediario de RNA de doble cadena que es cortado y procesado por proteínas DICER y el complejo RISC, respectivamente, para formar siRNAs (“small interfering RNA”) que llevan a cabo el silenciamiento. Al diseñar transgénicos de cassava con el gen AC1 modificado del virus del mosaico de la cassava africano (ACMV) expresado de forma constitutiva bajo el control del promotor de 19 CsVMV (Figura 8); se obtuvo resistencia a dicho virus por el desencadenamiento del mecanismo PTGS (Chellappan et al., 2004). No se han realizado grandes esfuerzos en esta línea de investigación desde entonces, no sólo porque ya se consiguió un transgénico resistente, sino también porque no puede usarse la técnica de mutagénesis dirigida CRISPR/Cas9 ya que no se conocen los genes de susceptibilidad ante el virus del mosaico en la cassava (Lin et al., 2019). 9.2 Enfermedad de la raya parda de la cassava La enfermedad de la raya parda de la cassava (“Cassava Brown Streak Disease”, CBSD) es causada por el virus homónimo (CBSV) y la variante de Uganda del mismo (UCBSV). Se describe por primera vez en los años 30 en Tanzania (Storey, 1936) por los síntomas característicos en las hojas viejas de cassava y la putrefacción de las raíces, aunque luego se observó que los síntomas podían aparecer en cualquier parte de la planta (Nichols, 1950). Se caracteriza por la necrosis de los tubérculos, la clorosis foliar, la aparición de constricciones radiales en las raíces y rayas o lesiones marrones en los tallos (Figura 8). No se distorsiona la morfología de la hoja como en CMD y además los síntomas son muy variables en gravedad, inicio y partes afectadas, por lo que resulta muy difícil identificar las plantas infectadas (Tomlinson et al., 2018). Figura 8. Síntomas de CBSD: necrosis de las raíces (A) y constricciones en las mismas (B), clorosis de las hojas (C) y lesiones en los tallos (D). Figura tomada del artículo “Cassava brown streak disease: historical timeline, current knowledge and future prospects” (Tomlinson et al., 2018). Se estima que al año se pierden una media de 750 millones de dólares (US$) por el efecto del CBSD sobre los cultivos de cassava de Kenia, Tanzania, Uganda y Malawi (Hillocks & 20 Maruthi, 2015). De ahí la importancia de evitar este tipo de enfermedades en el cultivo: tanto por las pérdidas económicas como por la pérdida de alimento para comercializar que causan. Al introducir en un transgénico una secuencia viral repetitiva invertida de CBSV se puede desencadenar el proceso de PTGS, confiriendo a la planta resistencia al virus. Para comprobarlo se expresaron de forma constitutiva (usando el promotor de CsVMV) tres tipos de RNAi diseñados a partir del gen CP (Coat Protein), usando su secuencia completa o los fragmentos C- o N-terminal (Figura 9) (Patil et al., 2011). Esta proteína participa en la encapsulación y la replicación del ADN del virus. Primero, estas construcciones se expresaron en Nicotiana benthamiana, por su simplicidad de estudio y rapidez de crecimiento con respecto a la cassava, y confirmaron que la resistencia máxima se producía al expresar la secuencia CP completa, siendo un 85% de los transgénicos totalmente resistentes, y que en las otras dos tipos de líneas donde sólo se expresaban los fragmentos C o N terminal también se producía resistencia, aunque algo menor. A su vez, confirmaron la protección cruzada contra otras cepas del mismo virus en aquellos transgénicos que expresaban la secuencia completa del gen CP (Patil et al., 2011). Las mismas construcciones se expresaron posteriormente en cassava (Figura 9), y se encontró que los transgénicos presentaban resistencia total a los síntomas o un importante retraso en la aparición de estos, así como resistencia cruzada a otras cepas (UCBSV, CBSV) (Ogwok et al., 2012). Para asegurar la resistencia a estas cepas del virus (CBSV y UCBSV) se transformaron plantas de cassava con una construcción de repeticiones en tándem de la proteína CP de ambos virus, obteniendo resistencia a ambos (Beyene et al., 2017). Para que los virus de la familia Potyviridae puedan infectar, la proteína VPg (“genome-linked protein”) tiene que unirse a un factor de iniciación de la traducción E4 del organismo hospedante. En cassava hay cinco isoformas de E4: eIF4E, eIF4E-1, eIF4E-2, novel capbinding protein-1 (nCBP-1) y 2 (nCBP-2). Al obtener mediante CRISPR/Cas9 “knock-outs” para los genes de nCBP-1 y 2 (Figura 9) encontraron que los mutantes de nCBP-2 ven reducida la intensidad de los síntomas del virus CBSD en la raíz con respecto al silvestre y al mutante nCBP-1, lo cual puede deberse a que nCBP-2 sea la isoforma de expresión dominante, por lo que su inactivación obligaría al virus a interactuar con isoformas de menor afinidad, atenuando la gravedad de la infección. El doble mutante ve reducidos los síntomas tanto en la zona aérea como en las raíces, así como la incidencia de la enfermedad (Gómez et al., 2019). 21 Figura 9. Resumen gráfico de los artículos “RNAi-mediated resistance to diverse isolates belonging to two virus species involved in Cassava brown streak disease” (Patil et al., 2011), “Transgenic RNA interference (RNAi)-derived field resistance to cassava brown streak disease” (Ogwok et al., 2012)y “Simultaneous CRISPR/Cas9-mediated editing of cassava eIF4E isoforms nCBP-1 and nCBP-2 reduces cassava brown streak disease symptom severity and incidence” (Gómez, Lin, et al., 2019). Actualmente, el principal problema de los transgénicos de cassava resistentes a enfermedades es que es difícil obtener transgénicos con una resistencia duradera, porque para ello habría que combinar varias modificaciones en el mismo organismo, hoy en día las estrategias son limitadas. Además, es imposible deducir cuál va a ser la aceptación de los productos modificados biotecnológicamente por los agricultores, si habrá problemas con la regulación de la comercialización, etc. (Bart & Taylor, 2017). 10. Mejora de la cantidad y la calidad del almidón Potenciando la síntesis de carbohidratos en los tejidos sumidero (como los tubérculos) se pretende obtener un contenido mayor de biomasa, con lo que se aumentaría la productividad del cultivo ya sea por acelerar su recolección o por incrementar la cantidad de alimento que contiene. La síntesis de almidón puede ser incrementada mediante la expresión del gen de la enzima AGPasa (ADP-glucosa pirofosforilasa), en este caso una modificación del gen glgC bacteriano, bajo el control del promotor de patatina tipo I (Figura 10) (Ihemere et al., 2006). Esta enzima media el paso limitante de la síntesis de almidón, por lo que el incremento en la actividad dará lugar al incremento del flujo hacia esta ruta. En este sentido, se obtuvieron plantas transgénicas con hasta un 70% más de actividad AGPasa y un incremento de la biomasa de hasta 2.6 veces más que en las plantas silvestres de cassava (Ihemere et al., 2006). 22 El almidón está formado por dos tipos de polímeros de glucosa, la amilosa y la amilopectina. La amilopectina está ramificada por enlaces α-1,6, mientras que la amilosa es solo la cadena central α-1,4 sin estas ramificaciones. El consumo de almidón con una proporción alta de amilosa es beneficioso ya que reduce la probabilidad de sufrir alteraciones metabólicas y además ese almidón puede ser digerido por la microbiota para producir compuestos beneficiosos para nuestro organismo (Li et al., 2019). En un estudio reciente, se ha llevado a cabo una mutagénesis dirigida sobre el gen que codifica SBE2, la enzima ramificante del almidón 2 (sbe2) usando CRISPR/Cas9 (Figura 10) (Luo et al., 2022). La desregulación de esta enzima en las plantas mutantes hizo que acumularan hasta un 56% más de amilosa. De forma simultánea, otro grupo ha publicado resultados similares en el incremento del contenido de amilosa del almidón en el tubérculo de la cassava mediante la inhibición de algunos de los genes de la enzima ramificante del almidón: sbe1, sbe2a y sbe2c (Figura 10). La transformación se llevó a cabo mediante Agrobacterium tumefaciens, introduciendo cDNAs que dieron lugar a RNAi contra cada uno de estos genes, de forma que se suprimió su expresión (Utsumi et al., 2022). La diferencia de estructuras entre amilopectina y amilosa tiene implicaciones más allá de la salud de los consumidores. En cuanto a sus aplicaciones biotecnológicas, la amilopectina es muy soluble en agua, mientras que la amilosa tiende a recristalizarse tras la dispersión en agua perdiendo la estabilidad de su viscosidad al producirse la recristalización o retrogradación (Koehorst-van Putten et al., 2012). El aumento de la estabilidad del almidón con menos amilosa mejora su funcionalidad en aplicaciones industriales. Se ha conseguido transformar plantas de cassava usando plásmidos con el gen de la luciferasa (gen reportero) bajo el control del promotor y el terminador de CaMV35S y el cDNA del gen GBSSI de cassava parcialmente en orientación antisentido entre el promotor de GBSSI de patata y el terminador del gen de la nopalina sintasa (Figura 10) (Raemakers et al., 2005), con lo que consiguieron plantas transgénicas de cassava del cultivar TMS60444 cuyos tubérculos acumulaban almidón libre de amilosa por la inhibición antisentido del gen que codifica la enzima GBSSI, la almidón sintasa unida a gránulo (Granule Bound Starch Synthase en inglés) que media la biosíntesis de almidón. En otra investigación generaron construcciones con una repetición invertida del gen GBSSI de cassava bajo el control del promotor de GBSSI de patata, y un marcador selectivo que permite el crecimiento en medios con PPT (fosfinotricina) y la resistencia a herbicidas en cultivo (Koehorst-van Putten et al., 2012); y con ellos se transformaron plantas de cassava del cultivar Adira4. Los resultados obtenidos fueron similares a los de la investigación mencionada previamente (Raemakers et al., 2005). Además estudiaron en profundidad las características organolépticas y de textura de elaboraciones realizadas a partir de los transgénicos, concluyendo que las características introducidas les 23 confieren propiedades beneficiosas para su uso en la industria (Koehorst-van Putten et al., 2012). También mediante la técnica CRISPR/Cas9 ha podido mejorarse esta característica de la cassava: la mutagénesis dirigida de dos de los genes implicados en la síntesis de amilosa, PTST1 y GBSS, reduce enormemente el contenido de amilosa del almidón de los tubérculos (Bull et al., 2018). Figura 10. Resumen gráfico de los artículos “Genetic modification of cassava for enhanced starch production” (Ihemere et al., 2006), “Suppressed expression of starch branching enzime 1 and 2 increases resistant starch and amyose content and modifies amylopectin structure in cassava” (Utsumi et al., 2022) y “Editing of the starch branching enzime gene SBE2 generates high-amylose storage roots in cassava” (Luo et al., 2022). 11. Reducción del deterioro tras la recolección Uno de los problemas que surgen durante el cultivo a gran escala de cassava es que se deteriora muy rápidamente tras la recolecta, pasando por un proceso llamado deterioro fisiológico post-cosecha (“Physiological Post-harvest deterioration”, PPD) en sólo 48 horas, llegando a ser incomestible tras 72 horas. El proceso se desencadena por las lesiones mecánicas en la recolección, con lo que se desata la cianogénesis que inhibe a la citocromo oxidasa mitocondrial, de forma que se acumulan especies reactivas de oxígeno (ROS). Al sobreexpresar enzimas antioxidantes, cabe esperar un retraso en el inicio del PPD (Uarrota et al., 2016). Por este motivo, un intento de limitar el PPD se basó en la expresión transgénica de AOX1A (Arabidopsis thaliana) bajo el promotor de patatina. Esta es una enzima mitocondrial insensible a cianuro que reduce oxígeno, por lo que devuelve los complejos mitocondriales I y III a su estado reducido para evitar que produzcan ROS (Zidenga et al., 2012). En los tubérculos de estos transgénicos tuvo lugar un retraso en el inicio del PPD de al menos dos semanas. El problema de esta aproximación es que puede reducirse la síntesis de ATP al cambiar el potencial de membrana, lo cual supondría un detrimento a la productividad del cultivo. 24 Durante el PPD se producen compuestos fenólicos a través de la vía biosintética de la hidroxicumarina en la que participa la polifenol oxidasa dependiente de O2 (PPO) (Uarrota et al., 2016). Por ello, la inhibición de la actividad PPO puede evitar el proceso de PPD. Usando un vector con los genes para la superóxido dismutasa (MeCu/ZnSOD) bajo el promotor de p54 y para la catalasa (MeCAT1) bajo el control del promotor de CaMV35S se transformaron plantas de cassava para la expresión transgénica de estas dos enzimas que eliminan ROS (Xu et al., 2013). En ellas, sin perder productividad el cultivo, se obtuvo un retraso de la aparición de PPD de 10 días, observándose los síntomas claros en los tubérculos pasados 14 días desde la cosecha. La escopoletina, una de las cumarinas involucradas en el proceso de PPD, es sintetizada por una vía de biosíntesis controlada por la feruloil-CoA 6’-hidroxilasa. El genoma de la cassava contiene una familia de genes de esta enzima de la cual cuatro miembros se expresan en el tubérculo. Para una región altamente conservada de tres de ellos se crearon construcciones de RNAi para transformar las plantas de cassava y reducir significativamente la expresión de la feruloil-CoA 6’-hidroxilasa (Liu et al., 2017). En la investigación llevada a cabo por el Dr. Wu y colaboradores (Wu et al., 2022), comprobaron primero la capacidad inhibitoria de la lisozima de la clara de huevo sobre la actividad oxidativa de los tubérculos de cassava, y una vez confirmada generaron los transgénicos del cultivar TMS60444 con expresión de HEWL (lisozima de la clara del huevo) bajo el control del promotor de p54/1.0 específico del sistema vascular. Confirmaron tras el cultivo y la cosecha de los transgénicos que se reducía enormemente e incluso se eliminaba en algunas líneas la descoloración vascular, así como que la acumulación de ROS estaba sustancialmente inhibida, lo cual indica que el desarrollo de PPD fue reprimido, y no empezaron a desarrollarse los síntomas de PPD hasta pasados 14 días desde la cosecha (Wu et al., 2022). 12. Retos y perspectivas de futuro en la investigación Las variedades transgénicas de cassava pueden llevar asociadas desventajas importantes, a menudo porque la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens puede llevar asociada una alteración del balance de expresión génica normal (Ceballos et al., 2020). Se puede destacar la pérdida de contenido de almidón en los tubérculos de las plantas de cassava modificadas para sobreexpresar la fitoeno sintasa (Sayre et al., 2011), la pérdida de la resistencia natural a CMD-2 al desarrollar transgénicos resistentes a CBSD (Cassava Brown Streak Disease) (Beyene et al., 2016) o la reducción del contenido de materia seca de los tubérculos en variantes biofortificadas en provitamina A (Beyene et al., 2018). En los últimos años han tenido lugar importantes avances en la modificación genética, siendo uno de ellos el sistema CRISPR/Cas9, pero el hecho de no conocer en profundidad el genoma 25 de la cassava limita su uso, por lo que los hallazgos que se produzcan en los próximos años abrirán la puerta a nuevas aplicaciones (Otun et al., 2022), como la obtención por CRISPR/Cas9 de transgénicos de cassava resistentes a CMV, actualmente no factibles por el desconocimiento de los mecanismos que median la resistencia natural de algunos cultivares (Rybicki, 2019). Aún así, este sistema no está exento de problemas: a veces se observan efectos distintos al deseado y pueden verse afectados genes vecinos al gen diana, por ejemplo en el caso de la afección en el desarrollo de los tubérculos en plantas con floración inducida por sobreexpresión de MeFT1 para la aceleración de su maduración (Odipio et al., 2020). Es importante que en el futuro se trabaje en eliminar o al menos reducir estos problemas asociados a la técnica, para que su aplicación sea lo más efectiva posible (Bicko et al., 2021). Además, hay otras características que pueden mejorarse a parte de las que se han tratado en este trabajo, especialmente en el ámbito nutricional. Algunas vitaminas para las cuales la cassava no supone un aporte suficiente son la vitamina B9 (ácido fólico y folato) y la E (tocoferoles y tocotrienoles). La deficiencia de vitamina B9 puede provocar anemia, deterioro del tracto gastrointestinal, alteraciones de la división celular y defectos en el desarrollo del tubo neural durante el embarazo, entre otros. En otros cultivos, como el tomate, ya se han llevado a cabo investigaciones de biofortificación de esta vitamina con éxito (Díaz De La Garza et al., 2007). Por su parte, la vitamina E es un antioxidante lipídico que protege membranas celulares y evita la oxidación de LDL. En este caso, se ha investigado la posibilidad de biofortficación en soja (Sattler et al., 2004). Para estos y otros micronutrientes y características beneficiosas, y con ayuda de la ampliación del conocimiento del genoma de la cassava, podrán desarrollarse estrategias de biofortificación útiles para garantizar la seguridad alimentaria en las zonas dependientes del cultivo de cassava. Uno de los principales retos en la incorporación de transgénicos de cassava al cultivo y al mercado es el aspecto legislativo. En muchos países aún no se ha legislado el uso de cultivos transgénicos, y es probable que el desarrollo biotecnológico supere las limitaciones en la producción de transgénicos de cassava antes de que se establezca la legislación que permita su uso (Bart & Taylor, 2017). 13. Conclusiones Debido al crecimiento exponencial de la población mundial en las últimas décadas se busca incrementar la productividad de los cultivos para abastecer la demanda de alimentos. El amplio consumo de cultivos como la cassava, sobre todo en países del tercer mundo, y la regulación de la seguridad alimentaria que supone, han incentivado tanto la investigación de las características propias de la planta como de las posibilidades de modificación de éstas, por lo que en los últimos años se ha generado mucha información al respecto y se han dado 32 endosperm. Science, 287(5451), 303–305. https://doi.org/doi: 10.1126/science.287.5451.303. Zea, A., & Ochoa, T. J. (2013). Diarrea y micronutrientes Diarrhea and micronutrients. Rev Med Hered, 24, 62–67. Zhao, T., Liu, S., Zhang, R., Zhao, Z., Yu, H., Pu, L., Wang, L., & Han, L. (2022). Global Burden of Vitamin A Deficiency in 204 Countries and Territories from 1990–2019. Nutrients, 14(5), 950–965. https://doi.org/10.3390/nu14050950 Zidenga, T., Leyva-Guerrero, E., Moon, H., Siritunga, D., & Sayre, R. (2012). Extending cassava root shelf life via reduction of reactive oxygen species production. Plant Physiology, 159(4), 1396–1407. https://doi.org/10.1104/pp.112.200345 Zile, M. H. (2010). Vitamin A-not for your eyes only: Requirement for heart formation begins early in embryogenesis. In Nutrients (Vol. 2, Issue 5, pp. 532–550). MDPI AG. https://doi.org/10.3390/nu2050532