Estudio de las bases genéticas implicadas en la enfermedad de Parkinson
Abstract
La enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda enfermedad neurodegenerativa más común caracterizada por la degeneración de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra. Se trata de una enfermedad multifactorial causada por la interacción de factores genéticos y tóxico-metabólicos. Se han identificado hasta 11 genes responsables de formas monogénicas de la enfermedad, tanto dominantes (SNCA, LRRK2 y VPS35) como recesivos (PARK2, PINK1, DJ-1, ATP13A2, PLA2G6, FBXO7 y DNAJC6). Sin embargo, solo un pequeño porcentaje de los casos de EP son debido a una única mutación causativa. La mayoría se deben a la interacción de variaciones genéticas que confieren un riesgo bajo-moderado. Hasta la fecha, se han identificado varios loci y genes de riesgo (GBA el mejor conocido) asociados a la EP. A pesar de todos estos estudios, la mayor parte de la heredabilidad de la enfermedad es todavía desconocida. Se espera que la tecnología de última generación de secuenciación masiva y los estudios de asociación de genoma completo, junto a la aplicación de las técnicas genéticas tradicionales, contribuyan a ampliar el conocimiento sobre la etiología de la EP. Además, es necesario la replicación de los hallazgos encontrados en cohortes independientes para comprobar su robustez. Debido al aumento de la prevalencia de la enfermedad, en una población cada vez más envejecida, al gasto económico y social que conlleva, y a la falta de terapias que frenen el proceso degenerativo, resulta fundamental conocer en profundidad las bases moleculares involucradas en el desarrollo de la enfermedad. La hipótesis de esta tesis es que a través del estudio de las bases genéticas de la EP se contribuirá a ampliar el conocimiento sobre su etipatogenia. Para ello, nuestro primer objetivo ha sido estudiar la implicación en la fisiopatogenia de la EP de genes causativos de formas monogénicas de la enfermedad. Con este objetivo se han analizado mediante secuenciación masiva 17 genes relacionados con la EP, causativos y de riesgo, confirmados y no confirmados (SNCA, LRRK2, PINK1, PARK2, ATP13A2, FBXO7, VPS35, DJ1, PLA2G6, EIF4G1, DNAJC6, HTRA2, SMPD1, SNYJ1, UCHL1, GIGYF2 y GBA). Para ello se ha reclutado una cohorte de 117 pacientes de EP de inicio temprano de la Comunidad de Madrid. Se han identificado variaciones con potencial efecto deletéreo en 29,06% de los pacientes estudiados, concentrado los genes PARK2, LRRK2, PINK1 y GBA el 23,08% de los casos. El gen en el que se localizaron más variaciones fue PARK2, siendo la variación p.N52fs la más frecuente. LRRK2 también parecía tener un papel más relevante que el que se pensaba en la población estudiada, debido a su alta frecuencia (presente en el 6,84% de los pacientes). Además, se ha evidenciado la co-ocurrencia de variaciones en los genes ATP13A2 y PARK2 y entre LRRK2 y GIGYF2, sugiriendo efectos aditivos en ambos casos. Con este objetivo también se estudió la implicación en la fisiopatogenia de la EP de los genes CHCHD2 y TMEM230, dos nuevos genes propuestos causativos de EP, en una cohorte de pacientes de EP del Hospital Universitario Virgen del Rocío y controles sanos. Se han identificado 4 variaciones no exónicas en el gen CHCHD2, pero ninguna parece ser causativa o factor de riesgo para la EP. En el gen TMEM230 se han identificado 13 variaciones genéticas, pero tampoco parecen ser causativas o factor de riesgo para la enfermedad. Estos resultados sugieren que los genes CHCHD2 y TMEM230 no están implicados en el desarrollo de la EP, al menos en población del sur de España. El segundo objetivo fue la replicación de 5 loci de riesgo para la EP en una cohorte de pacientes del Hospital Universitario Virgen del Rocío, que previamente se habían asociado a una cohorte de EP de Granada. En este estudio se ha replicado la asociación de los loci ACMSD/TMEM16 y MAPT con la EP, de manera que polimorfismos en MAPT parecen jugar un papel protector frente a la EP, mientras que variaciones en ACMSD/TMEM16 pueden ser un factor de riesgo para la enfermedad. Los resultados de este estudio ponen de manifiesto la complejidad genética que hay detrás de la EP. A pesar de todos los esfuerzos realizados en esta materia, en éste y otros trabajos, todavía queda mucho por conocer sobre su etiopatonegia. Aumentar el número de pacientes en los estudios de genoma completo, así como la secuenciación cada vez más extendida del genoma o exoma humano, junto con los análisis adecuados, contribuirán a ampliar nuestro conocimiento sobre la EP.
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ESTUDIO DE LAS B GENÉTICAS IMPLICADAS EN LA DEPARTAMENTO DE MEDICINA CRISTINA TEJERA PARRADO ESTUDIO DE LAS BASES GENÉTICAS IMPLICADAS EN LA ENFERMEDAD DE PARKINSON DEPARTAMENTO DE MEDICINA CRISTINA TEJERA PARRADO Tesis doctoral Sevilla, 2019 ASES GENÉTICAS IMPLICADAS ENFERMEDAD DE DEPARTAMENTO DE MEDICINA
Memoria presentada por Cristina Tejera Parrado para optar al grado de Doctor con mención internacional por la Universidad de Sevilla. El presente trabajo de investigación ha sido realizado en el Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), bajo la supervisión del Doctor Pablo Mir Rivera y la Doctora Mª del Pilar Gómez Garre. Cristina Tejera Parrado ha recibido financiación de los contratos predoctorales o de Personal Investigador en Formación (PIF) para el desarrollo del programa propio de I+D+i de la Universidad de Sevilla.
D. Pablo Mir Rivera, Profesor Asociado del Departamento de Medicina de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sevilla y Facultativo Especialista de Área en Neurología en el Hospital Universitario Virgen del Rocío, y Dña. Mª del Pilar Gómez Garre, Doctora en Biología e investigadora de la UGC de Neurología del Hospital Virgen del Rocío, CERTIFICAN: Que la memoria del trabajo titulada “Estudio de las bases genéticas implicadas en la Enfermedad de Parkinson” elaborada por Cristina Tejera Parrado, graduada en Biotecnología, ha sido realizada bajo su dirección y cumple las condiciones exigidas para optar al grado de Doctor con Mención Internacional por la Universidad de Sevilla. Para que así conste, firman la presente en Sevilla Abril 2019. Fdo: D. Pablo Mir Rivera Mª del Pilar Gómez Garre
RESUMEN La enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda enfermedad neurodegenerativa más común caracterizada por la degeneración de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra. Se trata de una enfermedad multifactorial causada por la interacción de factores genéticos y tóxico-metabólicos. Se han identificado hasta 11 genes responsables de formas monogénicas de la enfermedad, tanto dominantes (SNCA, LRRK2 y VPS35) como recesivos (PARK2, PINK1, DJ-1, ATP13A2, PLA2G6, FBXO7 y DNAJC6). Sin embargo, solo un pequeño porcentaje de los casos de EP son debido a una única mutación causativa. La mayoría se deben a la interacción de variaciones genéticas que confieren un riesgo bajo-moderado. Hasta la fecha, se han identificado varios loci y genes de riesgo (GBA el mejor conocido) asociados a la EP. A pesar de todos estos estudios, la mayor parte de la heredabilidad de la enfermedad es todavía desconocida. Se espera que la tecnología de última generación de secuenciación masiva y los estudios de asociación de genoma completo, junto a la aplicación de las técnicas genéticas tradicionales, contribuyan a ampliar el conocimiento sobre la etiología de la EP. Además, es necesario la replicación de los hallazgos encontrados en cohortes independientes para comprobar su robustez. Debido al aumento de la prevalencia de la enfermedad, en una población cada vez más envejecida, al gasto económico y social que conlleva, y a la falta de terapias que frenen el proceso degenerativo, resulta fundamental conocer en profundidad las bases moleculares involucradas en el desarrollo de la enfermedad. La hipótesis de esta tesis es que a través del estudio de las bases genéticas de la EP se contribuirá a ampliar el conocimiento sobre su etipatogenia. Para ello, nuestro primer objetivo ha sido estudiar la implicación en la fisiopatogenia de la EP de genes causativos de formas monogénicas
de la enfermedad. Con este objetivo se han analizado mediante secuenciación masiva 17 genes relacionados con la EP, causativos y de riesgo, confirmados y no confirmados (SNCA, LRRK2, PINK1, PARK2, ATP13A2, FBXO7, VPS35, DJ1, PLA2G6, EIF4G1, DNAJC6, HTRA2, SMPD1, SNYJ1, UCHL1, GIGYF2 y GBA). Para ello se ha reclutado una cohorte de 117 pacientes de EP de inicio temprano de la Comunidad de Madrid. Se han identificado variaciones con potencial efecto deletéreo en 29,06% de los pacientes estudiados, concentrado los genes PARK2, LRRK2, PINK1 y GBA el 23,08% de los casos. El gen en el que se localizaron más variaciones fue PARK2, siendo la variación p.N52fs la más frecuente. LRRK2 también parecía tener un papel más relevante que el que se pensaba en la población estudiada, debido a su alta frecuencia (presente en el 6,84% de los pacientes). Además, se ha evidenciado la co-ocurrencia de variaciones en los genes ATP13A2 y PARK2 y entre LRRK2 y GIGYF2, sugiriendo efectos aditivos en ambos casos. Con este objetivo también se estudió la implicación en la fisiopatogenia de la EP de los genes CHCHD2 y TMEM230, dos nuevos genes propuestos causativos de EP, en una cohorte de pacientes de EP del Hospital Universitario Virgen del Rocío y controles sanos. Se han identificado 4 variaciones no exónicas en el gen CHCHD2, pero ninguna parece ser causativa o factor de riesgo para la EP. En el gen TMEM230 se han identificado 13 variaciones genéticas, pero tampoco parecen ser causativas o factor de riesgo para la enfermedad. Estos resultados sugieren que los genes CHCHD2 y TMEM230 no están implicados en el desarrollo de la EP, al menos en población del sur de España. El segundo objetivo fue la replicación de 5 loci de riesgo para la EP en una cohorte de pacientes del Hospital Universitario Virgen del Rocío, que previamente se habían asociado a una cohorte de EP de Granada. En este estudio se ha replicado la asociación
de los loci ACMSD/TMEM16 y MAPT con la EP, de manera que polimorfismos en MAPT parecen jugar un papel protector frente a la EP, mientras que variaciones en ACMSD/TMEM16 pueden ser un factor de riesgo para la enfermedad. Los resultados de este estudio ponen de manifiesto la complejidad genética que hay detrás de la EP. A pesar de todos los esfuerzos realizados en esta materia, en éste y otros trabajos, todavía queda mucho por conocer sobre su etiopatonegia. Aumentar el número de pacientes en los estudios de genoma completo, así como la secuenciación cada vez más extendida del genoma o exoma humano, junto con los análisis adecuados, contribuirán a ampliar nuestro conocimiento sobre la EP.
HRM: High Resolution Melting HTRA2: HTRA Serine Peptidase 2 LPA: Lipoprotein (A) LRRK2: Leucine-Rich Repeat Kinase 2 MAPT: Microtubule Associated Protein Tau MIR4697: MicroRNA 4697 MLPA: Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification NL: Neuritas de Lewy OR: Odds ratio PARK11: Parkinson Disease 11 PB: Par de bases (del inglés: Pair base) PINK1: PTEN Induced Kinase 1 PLA2G6: Phospholipase A2 PODXL: Podocalyxin Like PARK2: Parkin PTRHD1: Peptidyl-TRNA Hydrolase Domain Containing 1 RAB39B: Ras-Related Protein Rab-39B RAI1: Retinoic Acid Induced 1 REM: Rapid Eye Movement RIC3: RIC3 Acetylcholine Receptor Chaperone SMPD1: Sphingomyelin Phosphodiesterase 1 SNCA: α-Synuclein SNP: Polimorfismo de un solo nucleótido (del inglés: single nucleotide polimorphism) SNPs: Polimorfismos de un solo nucleótido (del inglés: single nucleotide polimorphisms)
SREBF: Sterol Regulatory Element Binding Transcription Factor STK39: Serine/Threonine Kinase 39 SYNJ1: Synaptojanin 1 TMEM163: Transmembrane Protein 163 TMEM230: Transmembrane Protein 230 TNFRSF9: Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 9 UCHL1: Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1 VOUS: Variaciones genéticas de significado incierto (del inglés: variants of unknown significance) VPS13C: Vacuolar Protein Sorting 13 Homolog C VPS35: Vacuolar Protein Sorting 35
ÍNDICE DE CONTENIDOS I. INTRODUCCIÓN.........................................................................................1 1. ENFERMEDAD DE PARKINSON: CARACTERÍSTICAS GENERALES............1 1.1. CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS......................................................................2 1.2. CARACTERÍSTICAS ANATOMOPATOLÓGICAS .......................................2 1.3. EPIDEMIOLOGÍA..............................................................................................4 2. ETIOPATOGENIA DE LA EP...................................................................................5 2.1. FACTORES GENÉTICOS EN LA EP................................................................5 2.1.1. GENES CAUSATIVOS DE FORMAS MONOGÉNICAS DE EP........10 2.1.1.1. GENES CON HERENCIA AUTOSÓMICA DOMINANTE.....11 2.1.1.1.1. SNCA................................................................................11 2.1.1.1.2. LRRK2..............................................................................12 2.1.1.1.3. VPS35...............................................................................12 2.1.1.2. GENES CON HERENCIA AUTOSÓMICA RECESIVA.........13 2.1.1.2.1. PARK2..............................................................................13 2.1.1.2.2. PINK1...............................................................................13 2.1.1.2.3. DJ-1..................................................................................14 2.1.1.2.4. ATP13A2..........................................................................14 2.1.1.2.5. PLA2G6............................................................................15 2.1.1.2.6. FBXO7..............................................................................15 2.1.1.2.7. DNAJC6...........................................................................15 2.1.1.2.8. SYNJ1..............................................................................15 2.1.2. GENES PROPUESTOS CAUSATIVOS DE FORMAS MONOGÉNICAS DE EP PERO NO CONFIRMADOS...........................16 2.1.2.1. GENES CON HERENCIA AUTOSÓMICA DOMINANTE.....16
2.1.2.1.1. DNAJC13.........................................................................16 2.1.2.1.2. CHCHD2..........................................................................17 2.1.2.1.3. TMEM230.........................................................................17 2.1.2.1.4. UCHL1.............................................................................18 2.1.2.1.5. GIGYF2............................................................................18 2.1.2.1.6. HTRA2..............................................................................18 2.1.2.1.7. EIF4G1.............................................................................18 2.1.2.1.8. RIC3.................................................................................19 2.1.2.2. GENES CON HERENCIA AUTOSÓMICA RECESIVA O LIGADOS AL CROMOSOMA X.....................................................19 2.1.2.2.1. PODXL.............................................................................19 2.1.2.2.2. PTRHD1...........................................................................20 2.1.2.2.3. RAB39B............................................................................20 2.1.2.2.4. VPS13C............................................................................22 2.1.3. LOCI DE RIESGO EN LA EP................................................................22 2.1.4. GENES DE RIESGO EN LA EP.............................................................25 2.1.4.1. SNCA............................................................................................25 2.1.4.2. LRRK2..........................................................................................26 2.1.4.3. GBA..............................................................................................26 2.1.4.4. MAPT...........................................................................................27 2.1.5. GENES NO CONFIRMADOS DE RIESGO EN LA EP.......................27 2.1.5.1. SMPD1.........................................................................................27 2.1.5.2. HTRA2..........................................................................................28 2.2. RUTAS METABÓLICAS IMPLICADAS EN LA EP.....................................28 2.3. FACTORES AMBIENTALES EN LA EP........................................................30
II. HIPÓTESIS, OBJETIVOS Y DISEÑO EXPERIMENTAL...................33 1. HIPÓTESIS DE TRABAJO................................................................................33 2. OBJETIVOS........................................................................................................34 3. DISEÑO EXPERIMENTAL...............................................................................35 III. RESULTADOS............................................................................................39 1. Objetivo 1: Estudiar la implicación en la fisiopatogenia de la EP de genes causativos de formas monogénicas de EP...........................................................39 1.1. Sub-objetivo 1: Estudiar exhaustivamente 17 genes relacionados con la EP y otros parkinsonismos en pacientes de inicio temprano de la Comunidad de Madrid...........................................................................................................39 1.1.1. Manuscrito en vías de publicación: Mutational landscape of early onset Parkinson’s disease in a Spanish population by targeted exome sequencing. Tejera-Parrado C, Mir P, Periñán MT, Vela-Desojo L, Abreu-Rodríguez I, Alonso-Cánovas A, Bernal-Bernal I, Bonilla- Toribio M, Buiza-Rueda D, Catalán MJ, García-Ramos R, García- Ruiz PJ, Huertas-Fernández I, Jesús S, López-Manzanares L, Martínez-Castrillo JC, Posada IJ, Rojo-Sebastián A, Ruiz-Huete C, Del Val J, Gómez-Garre P................................................................39 1.1.2. Resumen ............................................................................................77 1.2. Sub-objetivo 2: Estudiar la implicación en la fisiopatogenia de la EP de CHCHD2, nuevo gen propuesto causativo de EP, en población del sur de España............................................................................................................81
1.2.1. Publicación: Genetic analysis of CHCHD2 in a southern Spanish population. Tejera-Parrado C, Jesús S, Huertas-Fernández I, Bernal-Bernal I, Bonilla-Toribio M, Córdoba-Tevar I, Abreu- Rodríguez I, Carrillo F, Bernal-Escudero M, Vargas-Gonzáleza L, Carballoa M, Gómez-Garrea P, Mir P.............................................81 1.2.2. Resumen ............................................................................................87 1.3. Sub-objetivo 3: Estudiar la implicación en la fisiopatogenia de la EP de TMEM230, nuevo gen propuesto causativo de EP, en población del sur de España............................................................................................................89 1.3.1. Publicación: TMEM230 in Parkinson’s disease in a southern Spanish population. Tejera-Parrado C, Jesús S, López-Ruíz A, Buiza- Rueda D, Bonilla-Toribio M, Bernal.Bernal I, Periñán MT, Vargas- González L, Gómez-Garre P, Mir P..................................................89 1.3.2. Resumen ..........................................................................................101 2. Objetivo 2: Replicación de 5 loci de riesgo para la EP, previamente asociados a una cohorte de EP de Granada, en otra cohorte independiente del sur de España................................................................................................................103 2.1. Manuscrito en vías de publicación: A replication study of GWAS-genetic risk variants associated with Parkinson’s disease in a Spanish population: a case-control study. Tejera-Parrado C, Oliva-Ariza G, Jesús S, Adarmes- Gómez AD, Bernal-Bernal I, Bonilla-Torbio M, Buiza-Rueda D, Carrillo F, Vargas-González L, Carballo M, Gómez-Garre P, Mir P..........................103
2.2. Resumen .....................................................................................................123 IV. DISCUSIÓN GENERAL..........................................................................125 1. Objetivo 1: Estudiar la implicación en la fisiopatogenia de la EP de genes causativos de formas monogénicas de EP. .....................................................126 1.1.Sub-objetivo 1: Estudiar exhaustivamente 17 genes relacionados con la EP y otros parkinsonismos en pacientes de inicio temprano de la Comunidad de Madrid........................................................................................................126 1.2.Sub-objetivo 2: Estudiar la implicación en la fisiopatogenia de la EP de CHCHD2, nuevo gen propuesto causativo de EP, en población del sur de España........................................................................................................129 1.3.Sub-objetivo 3: Estudiar la implicación en la fisiopatogenia de la EP de TMEM230, nuevo gen propuesto causativo de EP, en población del sur de España........................................................................................................131 2. Objetivo 2: Replicación de 5 loci de riesgo para la EP, previamente asociados a una cohorte de EP de Granada, en otra cohorte independiente del sur de España................................................................................................................133 V. CONCLUSIONES.....................................................................................139 VI. CONCLUSIONS.......................................................................................141 VII. BIBLIOGRAFÍA.......................................................................................143
ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Principales características anatomopatológicas de la EP...................................3 Figura 2. Representación esquemática del tipo de variaciones genéticas involucradas en la etiopatogenia de la EP...................................................................................................7 Figura 3. Esquema de las distintas estrategias empleadas para el estudio de los factores genéticos implicados en las enfermedades humanas complejas como la EP....................9 Figura 4. Representación esquemática de la arquitectura genética de la EP...................21 Figura 5. Esquema del diseño experimental seguido en la Tesis Doctoral.....................35
ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Genes causativos de formas monogénicas de EP..............................................10 Tabla 2. 28 señales independientes en 24 loci asociados con la EP en el estudio de metaanálisis de Nalls y col., 2014...........................................................................................23 Tabla 3. 17 loci asociados con la EP en el estudio de meta-análisis de Chang y col., 2017.................................................................................................................................24
6 Hasta la fecha, se han identificado 11 genes responsables de formas monogénicas de la enfermedad, tanto dominantes como recesivos. Sin embargo, sólo un pequeño porcentaje de los casos de EP son formas monogénicas causadas por una única mutación, con penetrancia variable. Se estima que tan sólo el 30% de los casos monogénicos familiares y sobre el 3-5% de los casos complejos esporádicos pueden explicarse por este tipo de mutaciones (Kumar y col., 2011). La gran mayoría de casos son genéticamente complejos, donde hay una interacción entre variaciones genéticas que confieren cierto riesgo y condiciones ambientales, con múltiples presentaciones clínicas. Esta naturaleza de las enfermedades complejas ha llevado a elaborar dos teorías (Figura2): Common disease rare variant (CDRV): mutaciones de alta penetrancia con baja frecuencia en la población (<1%) son la causa de la enfermedad. Common disease common variant (CDCV): variaciones comunes presentes en la población (>1%) conllevan un aumento del riesgo en el desarrollo de enfermedades complejas como la EP. Ambas teorías no son excluyentes, sino que las dos conjuntamente pueden explicar la complejidad etiológica que hay detrás de las enfermedades complejas como la EP (Bras y col., 2009).
Figura 2. Representación esquemática etiopatogenia de la EP. Estas variaciones co alta penetrancia raras en la población, a variaciones comunes de here cuyo papel se ve interrelacionado con otras variaciones genéticas (Modificado de Manolio y col., 2009). Tradicionalmente se han empleado miembros afectos para identificar embargo, en el caso de la EP la accesibilidad a muestras Además, otros problemas como la penetrancia incompleta o la variabilidad clínica de los enfermos entran en juego en este tipo de son útiles para la detección de los casos descarta la identificación de nuevas formas monogénicas de la EP en futuros estudios de ligamiento en familias (Bonifati y col., 2014 variaciones comunes de bajo 7 Representación esquemática del tipo de variaciones genéticas invo Estas variaciones co mprenden desde mutaciones de herencia monogénica de alta penetrancia raras en la población, a variaciones comunes de herencia compleja asociadas a la EP, cuyo papel se ve interrelacionado con otras variaciones genéticas , así como con factores ambientales Manolio y col., 2009). se han empleado los estudios de ligamiento en familias con varios miembros afectos para identificar mutaciones causativas de alta p embargo, en el caso de la EP , los casos de herencia mendeliana son raros. Por otra parte, a muestras de famil ias con varios miembros afectos Además, otros problemas como la penetrancia incompleta o la variabilidad clínica de los enfermos entran en juego en este tipo de abordaje. A pesar de todo son útiles para la detección de los casos de mutaciones causativas de Parkinson descarta la identificación de nuevas formas monogénicas de la EP en futuros estudios de (Bonifati y col., 2014 ) . Sin embargo, para el estudio de variaciones comunes de bajo -moderado riesgo para la EP, el abordaje por excelencia variaciones genéticas invo lucradas en la desde mutaciones de herencia monogénica de ncia compleja asociadas a la EP, como con factores ambientales los estudios de ligamiento en familias con varios mutaciones causativas de alta p enetrancia. Sin son raros. Por otra parte, ias con varios miembros afectos es compleja. Además, otros problemas como la penetrancia incompleta o la variabilidad clínica de A pesar de todo , estos estudios Parkinson , y no se descarta la identificación de nuevas formas monogénicas de la EP en futuros estudios de . Sin embargo, para el estudio de el abordaje por excelencia es
8 el estudio de asociación de genoma completo (GWAS). Esta tecnología representa una mejora frente a los estudios tradicionales de genes candidatos, en los que los tamaños poblacionales eran menores, y en los que las variaciones genéticas estudiadas se limitaban a aquellas zonas genómicas que a priori podían estar involucradas en la etiopatogenia de la EP. Para realizar los estudios de asociación de genoma completo (GWA) se emplean chips de miles de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) comunes en la población, localizados a lo largo de todo el genoma para genotiparlos en grandes cohortes poblacionales. Así se puede comprobar si su frecuencia alélilca está asociada con la patología. Esta técnica ha permitido identificar nuevos loci de riesgo para la EP, lo que ha llevado a un mejor entendimiento de las bases moleculares que están detrás de la enfermedad (Manolio y col., 2009; Bonifati y col., 2014). La aparición de la tecnología de secuenciación masiva de nueva generación (Figura 3) está contribuyendo aún más a descifrar la compleja red genética implicada en la EP. Por un lado, se están secuenciando regiones genómicas identificadas a priori por medio de estudios de ligamiento o mediante estudios GWA. Por otro lado, a través de la secuenciación del exoma o genoma completo de pacientes de EP y mediante el filtrado de variaciones genéticas nuevas y potencialmente patogénicas, se posibilita la identificación de nuevas mutaciones causativas para la EP. Con el coste cada vez menor de esta tecnología su uso está cada vez más extendido (Bonifati y col., 2014). La identificación de variaciones genéticas mediante las diferentes estrategias descritas, hace necesarios los estudios de replicación en nuevas cohortes que validen los resultados (Bonifati y col., 2014). Además, los estudios funcionales son fundamentales para verificar la implicación de los nuevos genes identificados en la EP, sin embargo, estos estudios son difíciles de llevar a cabo en esta patología debido a la gran
complejidad del sistema nervioso y comple jidad del cerebro humano Figura 3. Esquema de las distintas estrategias empleadas para el estudio de los factores genéticos implicados en las enfermedade s humanas complejas como la EP permiten identificar mutaciones causativas de alta penetrancia enfermedad. Mediante los estudios riesgo asociados a la enfermedad. La tecnología de secuenciación masiva permite el estudio exhaustivo de regiones previamente identificadas susceptibles de estar involucradas en el desarro enfermedad, o la secue nciación de todo e candidatas a ser patogénicas. Los resultados de todas estas técnicas son neces estudios en cohortes independientes y mediante estudios funcionales in Bonifati y col., 2014). 9 del sistema nervioso y a la falta de modelos in vitro que repliquen la jidad del cerebro humano (Billingsley y col., 2018). Esquema de las distintas estrategias empleadas para el estudio de los factores genéticos s humanas complejas como la EP . Los estu dios de ligamiento familiares permiten identificar mutaciones causativas de alta penetrancia en regiones a priori relacionadas con la estudios de asociación de genoma completo se pueden identificar loci de enfermedad. La tecnología de secuenciación masiva permite el estudio exhaustivo de regiones previamente identificadas susceptibles de estar involucradas en el desarro nciación de todo e l exoma o genoma humano, para identific ar candidatas a ser patogénicas. Los resultados de todas estas técnicas son neces arios validarlos mediante estudios en cohortes independientes y mediante estudios funcionales in vitro e in vivo que repliquen la Esquema de las distintas estrategias empleadas para el estudio de los factores genéticos dios de ligamiento familiares en regiones a priori relacionadas con la se pueden identificar loci de enfermedad. La tecnología de secuenciación masiva permite el estudio exhaustivo de regiones previamente identificadas susceptibles de estar involucradas en el desarro llo de la ar nuevas variaciones validarlos mediante vivo (Modificado de
10 2.1.1. GENES CAUSATIVOS DE FORMAS MONOGÉNICAS DE EP Hasta ahora, se ha demostrado que mutaciones en los genes, SNCA, LRRK2 y VPS35 causan formas dominantes de EP, mientras que mutaciones en PINK1, DJ-1, PARK2, ATP13A2, FBXO7, PLA2G6, DNAJC6 y SYNJ1 son responsables de formas recesivas de la enfermedad. Existen otros genes descritos cuya implicación en la etiopatogenia de la EP aún no se ha demostrado (Tabla 1). Tabla 1. Genes causativos de formas monogénicas de la EP FORMAS MONOGÉNICAS EN LA ENFERMEDAD DE PARKINSON GENES CONFIRMADOS GEN PROTEÍNA MODELO SNCA α-Synuclein AD LRRK2 Leucine-Rich Repeat Kinase 2 AD VPS35 Vacuolar Protein Sorting 35 AD PARK2 Parkin AR PINK1 PTEN Induced Kinase 1 AR DJ-1 Deglycase DJ-1 AR ATP13A2 ATPase Cation Transporting 13A2 AR PLA2G6 Phospholipase A2 AR FBXO7 F-Box Only Protein 7 AR DNAJC-6 DnaJ Heat Shock Protein Family (Hsp40) Member C6 AR SYNJ1 Synaptojanin 1 AR GENES SIN CONFIRMAR GEN PROTEÍNA MODELO DNAJC13 DnaJ Heat Shock Protein Family (Hsp40) Member C13 AD CHCHD2 Coiled-Coil-Helix-Coiled-Coil-Helix Domain Containing 2 AD TMEM230 Transmembrane Protein 230 AD UCHL1 Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1 AD GIGYF2 GRB10 Interacting GYF Protein 2 AD HTRA2 HTRA Serine Peptidase 2 AD EIF4G1 Eukaryotic Translation Initiation Factor 4 Gamma 1 AD RIC3 RIC3 Acetylcholine Receptor Chaperone AD PODXL Podocalyxin Like AR
11 GEN PROTEÍNA MODELO PTRHD1 Peptidyl-TRNA Hydrolase Domain Containing 1 AR RAB39B Ras-Related Protein Rab-39B ligado al X VPS13C Vacuolar Protein Sorting 13 Homolog C AR AD: Autosómico dominante; AR: Autosómico recesivo. 2.1.1.1. GENES CON HERENCIA AUTOSÓMICA DOMINANTE 2.1.1.1.1. SNCA: Las mutaciones en el gen SNCA son una causa rara de EP. La primera mutación identificada en este gen que sienta las bases del carácter genético de la EP, es también la más frecuente (p.A53T). Se identificó por primera vez en una familia de origen italiano (Polymeropoulos y col., 1997). Su implicación ha sido demostrada en estudios posteriores en familias de diferente procedencia (Athanassiadou y col. 1999; Spira y col., 2001; Choi y col., 2008; Ki y col., 2007; Puschmann y col., 2009). Además de ésta, otras variaciones puntuales en este gen se han descrito asociadas a la EP (Kruger y col., 1998; Zarranz y col., 2004). También son frecuentes las variaciones en el número de copia del gen, tanto duplicaciones (Chartier-Harlin y col., 2004; Fuchs y col.; 2007; Ibanez y col., 2004; Ikeuchi y col., 2008; Nishioka y col., 2006; Nuytemans y col., 2009; Troiano y col., 2008), como triplicaciones (Singleton y col., 2003; Farrer y col., 2004; Ibanez y col., 2004). Parece que la gravedad de la EP desarrollada por este tipo de variaciones genéticas es dosis dependiente, siendo la EP debida a triplicaciones en el gen más severa que la debida a duplicaciones (Hernández y col., 2016). Poco después del primer descubrimiento del
12 gen SNCA en relación con la EP, se descubrió que la α-sinucleína era el componente principal de los CL, la característica anatomopatológica más representativa de la enfermedad, aunque su papel en la EP no está aún claro (Spillantini y col., 1997). 2.1.1.1.2. LRRK2: Las mutaciones en este gen son la causa genética más frecuente de la EP de inicio tardío. Son responsables del 10% de los casos de EP familiar de herencia autosómica dominante, y del 3,6% de los casos esporádicos (Hernández y col., 2016). Se han descrito más de 100 mutaciones en este gen, pero sólo 7 han demostrado tener significancia clínica: p.R1441C/G/H, p.Y1699C, p.S1761R, p.I2012T, p.G2019S, y p.I2020T. En concreto, la mutación p.G2019S es la más frecuente en la población, siendo responsable del 0,5-4% de los casos en población caucásica, del 28% en judíos Askenazí y llega hasta el 39% en árabes del norte de África (Bandrés-Ciga y col., 2016; Lill, 2016). La penetracia de la mutación es también muy variable según la edad (Hernandez y col., 2016; Healy y col., 2008). 2.1.1.1.3. VPS35: La primera mutación en este gen, p.D620N, fue identificada en 2011, en una familia de Austria, y posteriormente este hallazgo fue confirmado por otro estudio en una familia suiza (Haugarvoll y Wszolek, 2009; Vilariño-Güell y col., 2011). Esta mutación es responsable de alrededor del 1% de los casos de EP familiar y sólo del 0,2% de los casos de EP esporádica (Hernández y col., 2016; Kumar y col., 2012). La penetrancia de la mutación no es completa, pues se ha
13 encontrado en personas no afectas de edad avanzada (Vilariño-Güell y col., 2011). Se han identificado otras mutaciones en este gen, pero su patogenicidad no está clara todavía (Sheerin y col., 2012). 2.1.1.2. GENES CON HERENCIA AUTOSÓMICA RECESIVA Las mutaciones en estos genes causan principalmente enfermedad de Parkinson de inicio temprano (EPIT), siendo responsables del 20% de estos casos y de un 3% de los casos de EP de inicio tardío (Hernandez y col., 2016). 2.1.1.2.1. PARK2: Las mutaciones en PARK2 representan la primera causa de EP de herencia autosómica recesiva. Fue el segundo gen identificado causativo de EP y se identificó por primera vez en una familia japonesa con EP de inicio juvenil (EPIJ, edad de inicio menor de 35 años). Kitada y col. (1998) identificaron una deleción homocigota de varios exones del gen PARK2. Posteriormente se han identificado alrededor de 150 mutaciones en este gen, de las cuales el 33% son mutaciones puntuales, el 13% pequeñas deleciones y hasta el 54% grandes deleciones y duplicaciones de varios exones (Hernández y col., 2016). Estas mutaciones se encuentran presentes en aproximadamente el 50% de los pacientes con EPIT de herencia autosómica recesiva y hasta en un 77% de los casos esporádicos de EPIJ (Lucking y col., 2000). 2.1.1.2.2. PINK1: Valente y col. (2004) describen por primera vez dos mutaciones homocigotas en el gen PINK1, p.G309D y p.W437X, identificadas en
14 una familia española y otra italiana respectivamente. Actualmente hay unas 10 mutaciones homocigotas y heterocigotas compuesta identificadas en este gen, siendo la segunda causa más frecuente de EP de herencia autosómica recesiva (Bonifati y col., 2005; Hernández y col., 2016). La presencia de mutaciones en este gen en heterocigosis en casos de EP esporádicos (2-4%) hace pensar que pueda suponer también un factor de riesgo para el desarrollo de la enfermedad (Nuytemans y col., 2010; Kumazawa y col., 2008). 2.1.1.2.3. DJ-1: En 2003, DJ-1 se convirtió en el tercer gen asociado a la EP de herencia autosómica recesiva (Bonifati, 2003). Se han identificado tanto mutaciones puntuales como deleciones exónicas en homocigosis o en heterocigosis compuesta en varios estudios. A pesar de esto, sigue siendo una causa rara de EP, representando menos del 1% de los casos de EP de herencia autosómica recesiva (Bonifati y col., 2003; Annesi y col., 2005; Abou-Sleiman y col., 2003). 2.1.1.2.4. ATP13A2: Las mutaciones en ATP13A2 se han descrito causativas del síndrome Kufor-Rakeb, una forma rara hereditaria de EPIJ. Tanto mutaciones en homocigosis como en heterocigosis compuesta han sido descritas en un total de 30 casos en 11 familias. Las mutaciones en este gen son muy poco frecuentes y el fenotipo es muy variable dependiendo de la mutación heredada (Eiberg y col., 2012; Park y col., 2015).
15 2.1.1.2.5. PLA2G6: En 2006 se asoció este gen por primera vez con enfermedades neurodegenerativas pediátricas que conllevan acumulación de hierro, aparentemente no relacionadas con la EP. Sin embargo, más tarde se identificaron mutaciones en este gen asociadas a un tipo de parkinsonismo con distonia, que responde a levodopa (Morgan y col., 2006; Paisán-Ruiz y col., 2009; Sina y col., 2009). Estas mutaciones son poco frecuentes y se han descrito casos tanto en homocigosis como en heterocigosis compuesta. 2.1.1.2.6. FBXO7: Se han identificado mutaciones en este gen en homocigosis y en heterocigosis compuesta en casos de EPIJ familiar en Irán y en Italia, ausentes en controles. Los casos se presentaban con distintos grados de severidad respecto a los síntomas asociados (Shojaee y col., 2008; Di Fonzo y col., 2009). 2.1.1.2.7. DNAJC6: En 2012 y 2013 se identificaron por primera vez casi simultáneamente mutaciones en el gen DNAJC6 en dos familias con consanguinidad procedentes de Palestina y Turquía de EPIJ (Edvardson y col., 2012; Köroglu y col., 2013). Más tarde Olgiati identificó mutaciones en este gen en dos pacientes con EPIT familiar y de forma heterocigota en dos casos esporádicos de EPIT, confirmando este gen como causa de EP (Olgiati y col., 2015). 2.1.1.2.8. SYNJ1: Una mutación idéntica, p.R258G, fue identificada en dos estudios publicados al mismo tiempo en dos familias, una de Sicilia y
22 2.1.3. LOCI DE RIESGO EN LA EP Los estudios GWA se han aplicado en el campo del Parkinson desde que en 2005 se identificara mediante esta técnica un locus de riesgo para la degeneración macular (Klein y col., 2005). Los primeros estudios GWA en la EP fallaron debido a que el número de muestras no era suficiente para detectar variaciones comunes con un odds ratio (OR) bajo o moderado. Por ello, los trabajos colaborativos entre diferentes grupos y laboratorios resultan fundamentales para contar con cohortes suficientes que permitan identificar este tipo de variaciones. En 2009, dos trabajos colaborativos identificaron los primeros loci de riesgo para la EP, como SNCA o MAPT (Satake y col., 2009; Simón- Sánchez y col., 2009). Y desde entonces se han publicado numerosos trabajos identificando nuevos loci de riesgo (Edwards y col., 2010; Hernández y col., 2012; Pihlstrom y col.2013). Pero no fue hasta 2014 cuando Nalls y col. realizan el primer meta-analisis de estudios publicados GWA en población de origen europeo, contando por primera vez con una cohorte de varios miles de muestras: 19061 pacientes de EP y 100833 controles (Nalls y col., 2014). En este estudio se identificaron en total 28 señales independientes situadas en 24 loci de riesgo para la EP (Tabla 2). A este trabajo le sigue un posterior meta-analisis realizado por Chang y col. con 26035 pacientes de EP y 403190 controles (Chang y col., 2017), en el que se identifican 17 nuevos loci de riesgo para la EP (Tabla 3). En España en 2016, Bandrés-Ciga y col. estudian la arquitectura genética de esta enfermedad en población del sur de España (Bandrés-Ciga y col., 2016). De los 24 loci de riesgo identificados previamente, sólo 5 se replicaron en este estudio (Tabla 2). Sin embargo, este análisis en población española tiene la limitación de contar con una cohorte pequeña (240 casos de EP y 192 controles). Más estudios en ésta y otras
23 poblaciones son necesarios para confirmar estos loci de riesgo para la EP, así como estudios funcionales que logren identificar los genes implicados. Tabla 2. 28 señales independientes en 24 loci asociados con la EP en el estudio de meta-análisis de Nalls y col., 2014. CHR:BP SNP Gen candidato OR 1:155135036 rs35749011 GBA/SYT11 1,82 1:154898185 rs114138760 GBA/SYT11 1,59 1:205723572 rs823118 RAB7L1/NUCKS1 1,12 1:232664611 rs10797576 SIPA1L2 1,13 2:135539967 rs6430538 ACMSD/TMEM163* 0,88 2:169110394 rs1474055 STK39 * 1,21 3:182762437 rs12637471 MCCC1 0,84 4:951947 rs34311866 TMEM175/GAK/DGKQ 0,79 4:944210 rs34884217 TMEM175/GAK/DGKQ 1,11 4:15737101 rs11724635 BST1 1,13 4:77198986 rs6812193 FAM47E/SCARB2 0,91 4:90626111 rs356182 SNCA 0,76 4:90763703 rs7681154 SNCA 0,93 6:32666660 rs9275326 HLA-DQB1 0,83 6:32343604 rs13201101 HLA-DQB1 1,22 7:23293746 rs199347 GPNMB 1,11 8:16697091 rs591323 FGF20 0,92 10:121536327 rs117896735 INPP5F 1,62 11:133765367 rs329648 MIR4697* 1,11 12:40614434 rs76904798 LRRK2 1,16 12:123303586 rs11060180 CCDC62 1,11 14:55348869 rs11158026 GCH1 0,90 15:61994134 rs2414739 VPS13C 1,11 16:31121793 rs14235 BCKDK/STX1B 1,10 17:17715101 rs11868035 SREBF/RAI1* 0,94 17:43994648 rs17649553 MAPT* 0,77 18:40673380 rs12456492 RIT2 0,90 20:3168166 rs8118008 DDRGK1 1,11 *loci replicados en población de Granada (sur de España) en el estudio de Bandrés-Ciga y col., 2016 CHR: chromosome; PB: pair base; SNP: single nucleotide polymorphism; OR: odds-ratio
24 Hasta la fecha, se sabe que entre un 6-7% de la heredabilidad de la EP puede explicarse a loci ya identificados, pero se estima que hasta un 27% de la heredabilidad del Parkinson podría deberse a este tipo de variaciones comunes por lo que queda todavía mucho trabajo que realizar en este sentido. Serán necesarios esfuerzos comunes entre laboratorios para contar con grandes cohortes que permitan identificarlas (Keller y col., 2012; Bras y Singleton, 2009). Además, es probable que una parte de esa heredabilidad perdida se deba a variaciones raras con bajo o alto riesgo para la EP, junto a variaciones estructurales que se escapan en los estudios GWA, por lo que son necesarias otras técnicas genéticas con el fin de desentrañar toda la etiología involucrada en la EP. Tabla 3. 17 loci asociados con la EP en el estudio de meta-análisis de Chang y col., 2017 CHR:PB SNP Gen Candidato OR 1:226916078 rs4653767 ITPKB 0,92 2:102413116 rs34043159 IL1R2 1,08 2:166133632 rs353116 SCN3A 0,94 3:18277488 rs4073221 SATB1 1,1 3:48748989 rs12497850 NCKIPSD/CDC71 0,93 3:52816840 rs143918452 ALAS1/TLR9/DNAH1/BAP1/PHF7/NI SCH/STAB1/ITIH3/ITIH4 0,68 4:114360372 rs78738012 ANK2/CAMK2D 1,13 5:60273923 rs2694528 ELOVL7 1,15 6:27681215 rs9468199 ZNF184 1,11 8:11707174 rs2740594 CTSB 1,09 8:22525980 rs2280104 ORBS3/PDLIM2/C8orf58/BIN3 1,07 9:17579690 rs13294100 SH3GL2 0,92 10:15569598 rs10906923 FAM171A1 0,93 14:88472612 rs8005172 GALC 1,08 16:19279464 rs11343 COQ7 1,07 16:52599188 rs4784227 TOX3 1,09 17:40698158 rs601999 ATP6V0A1/PSMC3IP/TUBG2 0,93 CHR: chromosome; PB: pair base; SNP: single nucleotide polymorphism; OR: odds-ratio
25 2.1.4. GENES DE RIESGO EN LA EP Mientras que los estudios GWA señalan los loci asociados a la EP, el gen responsable de la patogenicidad es desconocido. En numerosos estudios, se ha tratado de dilucidar como estos factores de riesgo pueden estar involucrados en la patología de la enfermedad a través de las rutas metabólicas en las que participan. El hecho es que muchos de estos factores de riego identificados en grandes estudios GWA aparecen también en formas monogénicas de la enfermedad por lo que se piensa que los mismos mecanismos moleculares están involucrados en las dos vertientes de la enfermedad (Parikshak y col., 2015). Variaciones en los genes SNCA, LRRK2 y MAPT, así como variaciones menos frecuentes en GBA, son las señales más asociadas estadísticamente en estos estudios, así como en estudios de genes candidatos. 2.1.4.1.SNCA: A través de numerosos estudios se ha confirmado que este gen, además de mutaciones deletéreas causativas de EP, contiene variaciones en regiones no codificantes que contribuyen al riesgo de desarrollo de la enfermedad. El primer estudio publicado en este sentido identificó la asociación de un polimorfismo, REP1, ubicado en el promotor de este gen (Maraganore y col., 2006). Posteriores estudios GWA han señalado repetidamente variaciones en regiones no codificantes de SNCA asociadas con la EP (Simón-Sánchez y col., 2009; Lill y col.; 2012, Nalls y col.; 2014, Chang y col., 2017), e incluso se han propuesto varias señales independientes dentro del mismo locus, aunque todavía no se conoce con certeza cuántas hay.
26 2.1.4.2. LRRK2: Dos líneas de investigación sugieren que este gen está implicado en la EP como un factor de riesgo, además de contener mutaciones causativas. Por un lado en diversos estudios se han detectado dos polimorfismos, p.G2385R y p.R1628P, cuya presencia implica el doble de riesgo de padecer EP, sobre todo en población asiática (Di Fonzo y col., 2006, Farrer y col., 2007, Tan y Schapira 2008, Tan y col., 2007). Por otra parte, numerosos estudios GWA señalan varios polimorfismos situados en regiones no codificantes cerca de este gen que incrementan el riesgo de padecer EP en 1,2, sobre todo en población caucásica (Chang y col., 2017). Parece que alteraciones en la expresión del gen o en el splicing podrían estar implicados en este caso incrementando el riesgo de desarrollo de EP, aunque para conocer las variaciones exactas implicadas se necesita un estudio más profundo. 2.1.4.3. GBA: Debido a que las variaciones en GBA tienen una frecuencia menor del 5% en la población, este gen no fue detectado en los primeros estudios GWA realizados en la EP, sino que fue a través de estudios de genes candidatos. En primer lugar se identificaron mutaciones en homocigosis causativas de la enfermedad de Gaucher. Sin embargo, con el tiempo observaron que familiares de primer y segundo grado de estos enfermos tenían una incidencia alta de EP (Neudorfer y col., 1996; Aharon-Peretz y col., 2004; Halperin y col., 2006). Más tarde, Sindransky y col., mediante un estudio de meta-análisis de los datos publicados hasta la fecha identificaron dos mutaciones en el gen GBA en heterocigosis con una alta frecuencia en casos de EP frente a controles, que conferían un riesgo de
27 hasta cinco veces superior de desarrollo de EP (Sidransky y col., 2009). Se estima que en torno al 5-10% de pacientes de EP son portadores de mutaciones en GBA, siendo particularmente frecuente en judíos Askenazí (Mitsui y col., 2009). La penetrancia varía dependiendo de la mutación, y con ella el fenotipo asociado (Ferreira y col., 2017). 2.1.4.4. MAPT: La asociación entre la EP y MAPT resulta intrigante puesto que MAPT codifica para la proteína Tau que es el mayor componente de los depósitos de neurofibrillas características de la enfermedad de Alzheimer, pero no de la EP. Se ha observado, sin embargo, la asociación entre variaciones en el haplotipo H1 de MAPT con el riesgo de desarrollo de EP en diversos grupos poblacionales (Fung y col., 2006; Kwok y col., 2004; Skipper y col., 2004; Zabetian y col., 2007), aumentando hasta un 1,3 el riesgo de la enfermedad. De hecho, MAPT es una de las señales más consistentes en los estudios GWA, aunque más en población caucásica que en asiática. 2.1.5. GENES NO CONFIRMADOS DE RIESGO EN LA EP 2.1.5.1. SMPD1: Se sabe que mutaciones en este gen, p.R496L, p.L302P y p.fs330P, son causativas de la enfermedad de Niemann-Pick en judíos Askenazí (Levran y col., 1991; Levran y col., 1991; Levran y col., 1993), aunque algunas de ellas han sido asociadas posteriormente con la EP en algunos estudios (Gan-Or y col., 2013; Dagan y col., 2015), pero no en otros (Foo y col., 2013; Gan-Or y col., 2013).
28 2.1.5.2. HTRA2: El papel de HTRA2 como factor de riesgo en la EP sigue siendo controvertido, ya que se ha descrito que actúa como factor de riesgo para la EP e incluso se han corroborando estos resultados con estudios in vitro (Strauss y col., 2005). Sin embargo, en 2008, Simón-Sánchez y Singleton, no encuentran ninguna de las mutaciones previamente descritas relacionadas con la EP (Simón-Sánchez y Singleton, 2008). 2.2. RUTAS METABÓLICAS IMPLICADAS EN LA EP Más allá de identificar las causas genéticas implicadas en la enfermedad, esclarecer los mecanismos por los cuales estos factores están implicados en el desarrollo de la EP es el objetivo último, incluyendo si actúan independientemente o conjuntamente a través de determinadas rutas metabólicas. Tras los últimos meta-análisis, los genes propuestos asociados a la EP parecen pertenecer en su mayoría a unas pocas rutas ya propuestas relacionadas con la patología como son la autofagia, la biología mitocondrial, el estrés oxidativo, el tráfico de vesículas sinápticas o la neuroinflamación. Estos mecanismos no son excluyentes y normalmente hay interacción entre ellos. Por ello, mucho de los genes están involucrados en más de una de estas rutas. La α-sinucleína es una proteína presináptica que en condiciones normales se encuentra sin plegar. Mutaciones en el gen SNCA provocan un mal plegamiento de la proteína, así como un aumento en su concentración si se trata de duplicaciones o triplicaciones en el gen (Cacabelos, 2017). En estas dos condiciones, la proteína tiende a plegarse y formar agregados que formarán los CL característicos de la EP. Parece que estos acúmulos fomentan la salida de la dopamina de las vesículas presinápticas de manera que se acumula en el citoplasma. La dopamina en el citoplasma tiende a formar especies oxidativas, produciendo daño oxidativo y muerte celular (Fujita y col., 2014).
29 Por otra parte, la vía de recilaje de proteínas mal plegadas o dañadas del sistema ubiquitina proteosoma está involucrada en el desarrollo de la EP. La proteína codificada por PARK2 es una E3 ubiquitina ligasa encargada de ubiquitinar la α-sinucleína para su degradación en el proteosoma. La proteína codificada por UCHL1 también está involucrada en este proceso, a través del mantenimiento de ubiquitinas disponibles (Fujita y col., 2014; Karimi-Moghadam y col., 2018). La reducción en el funcionamiento del proteosóma por mutaciones en estos genes afecta la degradación de proteínas, y en concreto a la inadecuada eliminación de fibrillas disfuncionales de αsinucleína, aumentando su concentración y rompiendo la homeostasis de la dopamina, lo que produce neurotoxicidad por el incremento del estrés oxidativo. Los defectos bioenergéticos, la disrupción de la cadena de transporte de electrones y el aumento de las especies reactivas de oxígeno debido a un mal funcionamiento de la mitocondria juegan también un papel central en la patogénesis tanto de EP familiar como esporádico. Parece ser que PARK2 junto a PINK1 están involucrado en el sistema de control de la mitocondria a través de la vía de degradación dependiente del lisosoma (autofagia o mitofagia) de las mitocondrias dañadas. DJ-1 se ha sugerido también que juega un papel similar a PINK1-PARK2 en el mantenimiento de la función mitocondrial en presencia de estrés oxidativo (Rocha y col., 2018). Es más, la causa más común de EP monosómico es la mutación G2019S en LRRK2 y se ha visto implicada en el mal funcionamiento de la mitocondria en fibroblastos humanos que portaban esa mutación (Mortiboys y col., 2010). Otros genes más recientemente relacionados con la EP también precen estar implicados en este proceso como PLA2G6, CHCHD2, HTRA2, EIF4G1 y VPS13C. El estrés oxidativo, como consecuencia de la disfunción mitocondrial, lleva a la degeneración de neuronas dopaminérgicas, especialmente vulnerables a este daño (Poewe y col., 2017).
30 Por otra parte, la neuroinflamación y la activación del sistema inmune también son procesos asociados a enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer o la EP (Fujita y col., 2014). La microglía, presente en abundancia en zonas del cerebro como la pars compacta, detecta la α-sinucleína mal plegada y produce neurotoxicidad mediante la producción de estrés oxidativo y citoquinas proinflamatorias (Zhang y col., 2005; Alvarez-Erviti y col., 2011). Se ha visto como la expresión de genes relacionados con la EP, como LRRK2, PARK2 o DJ1, están involucrados en esta respuesta (Gillardon y col., 2012; Frank-Cannon y col., 2008; Waak y col., 2009). 2.3. FACTORES AMBIENTALES EN LA EP Vivir en ambientes rurales, dedicarse a la agricultura o consumir agua de pozo, son estilos de vida que aumentan la exposición a determinados tóxicos asociados a un mayor riesgo de padecer EP, como pesticidas, herbicidas o metales pesados (Obeso y col., 2017; Fleming y col., 2017). Dos pesticidas en concreto son ampliamente conocidos factores de riesgo para la EP, el Paraquat y la Rotenona. Ambos interfieren en la cadena de transporte de electrones creando estrés oxidativo, lo que lleva a la degeneración de neuronas dopaminérgicas (Ramachandiran y col., 2007, Liou y col., 1997, Semchuk y col., 1992). Los dos metales pesados cuya relación con la EP se encuentra mejor descrita son el hierro y el manganeso. El manganeso es una metal que se encuentra de forma libre en la naturaleza y una excesiva exposición a él, como en la minería o en la soldadura, se ha visto que es un factor de riesgo para el desarrollo de una patología neurodegenerativa relacionada con la EP (Kwakye y col., 2015). La relación entre el hierro y la EP es conocida desde hace décadas. Parece que actúa a nivel de la
31 neuromelamina de las neuronas dopaminérgicas, pero su papel en la EP aún no está claro (Dexter y col., 1987; Sofic y col., 1988; Gorell y col., 1995; Double y col., 2003). Otros factores, sin embargo, han demostrado tener un efecto protector a la hora de desarrollar EP. En múltiples estudios se demuestra que los fumadores tienen menos de la mitad de riesgo de padecer Parkinson en comparación con los no fumadores, siendo el efecto además dosis dependiente (Hernàn y col., 2002; Fleming y col., 2017; Ritz y col., 2007). Por otra parte, consumir grandes cantidades de cafeína ha sido asociada a una disminución de hasta el 60% de riesgo de padecer Parkinson en hombres, aunque no en mujeres (Palacios y col., 2012; Yamada-Fowler y col., 2015). Lo niveles altos de ácido úrico en sangre han demostrado también tener un efecto protector en el desarrollo de la EP (Weisskopf y col., 2007), y así se ha confirmado en un estudio en población española (Jesús S y col., 2013). Los mecanismos implicados en los efectos protectores de estas sustancias continúan bajo estudio.
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39 III. RESULTADOS 1. Objetivo 1: Estudiar la implicación en la fisiopatogenia de la EP de genes causativos de formas monogénicas de EP. 1.1. Sub-objetivo 1: Estudiar exhaustivamente 17 genes relacionados con la EP y otros parkinsonismos en pacientes de inicio temprano de la Comunidad de Madrid. 1.1.1. Manuscrito en vías de publicación: Mutational landscape of early-onset Parkinson’s disease in a Spanish population by targeted exome sequencing. Tejera- Parrado C, Mir P, Periñán MT, Vela-Desojo L, Abreu-Rodríguez I, Alonso- Cánovas A, Bernal-Bernal I, Bonilla-Toribio M, Buiza-Rueda D, Catalán MJ, García-Ramos R, García-Ruiz PJ, Huertas-Fernández I, Jesús S, López- Manzanares L, Martínez-Castrillo JC, Posada IJ, Rojo-Sebastián A, Ruiz-Huete C, Del Val J, Gómez-Garre P.
40
41 Mutational landscape of early onset Parkinson's disease in a Spanish population by targeted exome sequencing Tejera-Parrado Cristina1, Mir Pablo1,2*, Periñán María Teresa1,2, Vela-Desojo Lydia3, Abreu-Rodríguez Irene1, Alonso-Cánovas Araceli4, Bernal-Bernal Inmaculada1, Bonilla- Toribio Marta1, Buiza-Rueda Dolores1,2, Catalán María José5, García-Ramos Rocío5, García-Ruiz Pedro José6, Huertas-Fernández Ismael1, Jesús Silvia1,2, López-Manzanares Lydia7, Martínez-Castrillo Juan Carlos4, Posada Ignacio Javier8, Rojo-Sebastián Ana9, Ruiz-Huete Cristina10, Del Val Javier6, Gómez-Garre Pilar1,2* 1Unidad de Trastornos del Movimiento, Servicio de Neurología y Neurofisiología. Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla, Seville, Spain 2Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED), Madrid, Spain 3Servicio de Neurología, Hospital Fundación Alcorcón, Madrid, Spain 4Servicio de Neurología, Hospital Ramón y Cajal, Madrid, Spain 5Servicio de Neurología. Hospital Clínico San Carlos, Madrid, Spain 6Servicio de Neurología, Fundación Jiménez Díaz, Madrid, Spain 7Servicio de Neurología, Hospital La Princesa, Madrid, Spain 8Servicio de Neurología, Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid, Spain 9 Servicio de Neurología, Hospital Príncipe de Asturias, Madrid, Spain 10 Servicio de Neurología, Clínica Nuestra Señora del Rosario, Madrid, Spain
42 * Corresponding authors: Dr. Pilar Gómez-Garre and Dr. Pablo Mir Unidad de Trastornos del Movimiento Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) Hospital Universitario Virgen del Rocío Avda. Manuel Siurot s/n. 41013 Sevilla, Spain Fax: +34-955923101 Telephone: +34-955923039 email: [email protected] / [email protected]/ Short Title: Mutational landscape of early onset Parkinson's disease in a Spanish population Keywords: Parkinson's disease, targeted sequencing, MLPA, Clinical Genetics, Spanish population, Genetic variants.
43 ABSTRACT Introduction: Several genes have been described as responsible for both recessive and dominant forms of Parkinson’s disease (PD). The aim of this study was to assess the contribution of several genes to the pathophysiology of early onset PD in a cohort from central Spain. Methods: We analyzed a cohort of 117 patients with early onset PD (age at onset < 50 years old) using a pipeline, based on a combination of a next-generation sequencing panel of 17 genes previously related with PD and other Parkinsonisms (PARK7, ATP13A2, PINK1, HTRA2, DNAJC6, GIGYF2, EIF4G1, UCHL1, SNCA, PARK2, SMPD1, LRRK2, VPS35, SNYJ1, FBXO7, PLA2G6 and GBA), and MLPA. Results: Twenty-seven patients (23.08%) carried putative pathogenic variants in PARK2, LRRK2, PINK1, or GBA. The gene most frequently mutated was PARK2, and p.Asn52Metfs was the most common variation in this gene. Pathogenic variants were not observed in genes SNCA, FBXO7, PARK7, HTRA2, DNAJC6, PLA2G6, and UCHL1. No significant differences relating to age at onset were observed between patients with pathogenic variants in LRRK2 in comparison with those with pathogenic variants in PARK2. Co-occurrence of mutations involving two genes suggests additive effects of ATP13A2 and PARK2 genes, as well as of LRRK2 and GIGYF2 genes. Conclusions: Our results contribute to the understanding of the genetic architecture associated with early onset PD, showing different associated backgrounds. However, a large proportion of genetic components remains unknown. All in all, this study might contribute to genetic diagnosis and counseling for families with early onset PD.
44 INTRODUCTION PD is the second most common neurodegenerative disorder characterized by the loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra. It is a chronic and progressive disorder of multifactorial etiology, in which causative and susceptibility genetic factors are involved. Emerging evidence has provided support for the hypothesis that PD is the result of complex interactions among genetic abnormalities, environmental toxins, mitochondrial dysfunction, and other cellular processes. Since Polymeropoulos et al. identified a causative variant in gene encoding Synuclein alpha (SNCA) [1], many efforts have been made to identify genes involved in the development of PD. Mutations in SNCA, LRRK2, and Vacuolar Protein Sorting 35 (VPS35) genes have been linked to autosomal dominant forms of PD (ADPD) [2, 3]. In fact, the mutations in LRRK2 are the most common cause of ADPD. In addition, the Eukaryotic Translation Initiation Factor 4 Gamma 1 (EIF4G1), was initially related to ADPD, but subsequent studies have failed to replicate this association [4]. Furthermore, genes related to autosomal recessive forms of PD (ARPD) have also been discovered. Thus, the genes coding for Parkin (PARK2), PTEN-induced kinase 1 (PINK1), and the Protein deglycase DJ1 (PARK7) have been related to typical early-onset PD (EOPD; age at onset <50 years old). Other genes, such as those coding for the ATPase Cation Transporting 13A2 (ATP13A2), the Phospholipase A2 Group VI (PLA2G6), the F- Box Protein 7 (FBXO7), HSP40 Auxilin (DNAJC6) and the Synaptojanin-1 (SNYJ1), have been related to atypical PD with juvenile onset (age at onset <35 years old) [4]. On the other hand, the gene GIGYF2 (encoding Grb10-Interacting GYF Protein 2) has been described as responsible for typical autosomal dominant PD [5]. Its pathogenic
45 contribution to PD is still not clear but it has been suggested that some variations are risk factors for PD in Caucasians [6]. Nevertheless, monogenic mutations are not a very common cause of PD. Indeed, risk variants with a moderate effect size are more usual. Variations in genes such as GBA (encoding glucocerebrosidase) or SMPD1 (encoding sphingomyelin phosphodiesterase 1) constitute risk factors for PD. In fact, mutations in GBA are the most important risk factor for idiopathic PD [7]. To date, genome wide association studies (GWAS) have allowed identification of several PD risk loci [8]. However, a large proportion of genetic heritability remains unknown. Nowadays, next generation sequencing (NGS) of whole genome (WGS) or just the exome (WES) are expected to contribute to elucidating the missing heritability through the identification of new risk variants related to PD. Since genetic background has a higher impact on PD with early disease onset, the aim of this study was to assess the contribution of the main seven genes previously related to PD, and unconfirmed genes, to the pathophysiology of the EOPD in a cohort of patients from central Spain. For that purpose a combination of NGS-based targeted sequencing and Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) were applied. PATIENTS AND METHODS Subjects and Clinical Assessments We included 117 EOPD (age at onset younger than 50 years old) patients. Among them, thirty-three reported a family history of PD. The demographic characteristics of the participants are summarized in Table 1. Patients were recruited from the
46 Neurology outpatient clinic at different hospitals in the Comunidad Autónoma de Madrid (Spain). PD was diagnosed by Movement Disorders neurologists according to the United Kingdom Parkinson’s Disease Society Brain Bank criteria [9]. Patients were clinically evaluated and an extensive set of clinical features was obtained. After clinical diagnosis, peripheral blood samples were collected from each subject. Ethics Statements The study was approved by the ethics committees from all participating centers and it was conducted according to the principles expressed in the Helsinki Declaration. Each individual who participated in the study signed a written informed consent form prior to blood withdrawal. Genetic analysis DNA isolation Genomic DNA was isolated from peripheral blood samples from each subject according to established protocols, by manual and automated commercial procedures (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA). The quantity and purity of the DNA were determined by Qubit 3.0 fluorometer (Invitrogen) and NanoDrop2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Florida, USA), respectively. Targeted gene enrichment and next-generation sequencing (NGS) Targeted re-sequencing was performed using a customized Haloplex Target Enrichment Panel, which was designed using Agilent's online Sure Design tool, following the manufacturer’s protocol (Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA). This customized panel covered all coding exons, exon-intron boundary regions, and 3' and 5' untranslated regions of 17 selected genes. These genes were those related to dominant and recessive forms of PD, as well as risk genes, and unconfirmed genes:
47 SNCA, LRRK2, PINK1, PARK2, ATP13A2, FBXO7, VPS35, DJ1, PLA2G6, EIF4G1, DNAJC6, HTRA2, SMPD1, SNYJ1, UCHL1, GIGYF2, and GBA. Sample preparation was carried out according to the manufacturer’s protocol. The concentration of the enriched and amplified samples was determined using a Bioanalyzer High Sensitivity chip (Agilent Technologies). Then, samples were pooled in equimolar amounts and sequenced at the Illumina NextSeq platform (Illumina Inc., San Diego, CA, USA). Bioinformatics analysis for NGS results Data analysis and prioritization of variants were performed using the workflow summarized in Suppl. Fig. 1. Briefly, sequenced reads quality were examined by FastQC (Babraham Bioinformatics, Cambridge, UK) and poor quality bases were trimmed by Cutadapt v1.9.1. The reference genome was downloaded from NCBI, version GRCh37/hg19. The Burrows- Wheeler Aligner v0.7.12 was used to align the remaining clean reads. All variants, single nucleotide polymorphisms (SNP) and small indels, were detected using SAMtools v1.2. Variants were filtered by Bcftools v1.2 and GATK v4.0, and only those with depth read over 30 and quality over 20 remained. Subsequently, variants were annotated using SeattleSeq Annotation 138 (http://snp.gs.washington.edu/SeattleSeqAnnotation138/) and wANNOVAR (http://wannovar.wglab.org/index.php). The variants where the fraction of nonreference reads was <0.3 were rejected. In addition, a scoring and priorization analysis of deleterious alleles were performed using the software Expert Variant Interpreter (eVAI), from enGenome (www.engenome.com/product) and variants were categorized
54 such, this kind of co-occurrence involving both genes has been previously described and associated with an earlier age at onset of PD, suggesting additive effects [5]. Further genetic studies and functional analysis are necessary to conclude the implications in PD of variants located in GIGYF2. Among risk factors in PD, GBA is well known [27]. Mutations in this gene are present in multiple ethnicities [28]. Heterozygous mutations are dominantly inherited, and the penetrance is high, related to EOPD [29]. Importantly, our GBA mutational spectrum did not include the most frequent pathogenic variants L444P and N370S [30]. It might be due to difficulties in GBA sequencing using targeted next generation sequencing because the existence of the pseudo-GBA, with very similar sequence. In addition, it has been shown that GBA variants have a different impact on the PD phenotype according to their pathogenicity (both deleterious and benign). Because of preselecting for pathogenic, likely pathogenic or VOUS variants, it may very well be an underestimate of the true yield of variants in GBA affecting Parkinson’s disease in our population. This study focused on exonic and intronic variants; however, most of the variants found were located in the untranslated regions (mainly in 3’UTR). Interestingly, heterozygous pathogenic mutations in recessive genes were detected in some patients that also presented variants in untranslated regions. Therefore, it is important to perform further analysis in order to study their contribution to disease pathogenesis. In conclusion, this study, in terms of cohort size, number of included genes and applied methods is the first systematic study of genetic variability in PD-related genes in EOPD patients from Spain. Our results substantially expand on previous investigations, and provide a comprehensive genomics profile of EOPD. In addition, further evidence for
55 gene interaction involving ATP13A2 and PARK2 are provided in an individual with cooccurrence of mutations in both genes, who had a much earlier onset of PD than patients with single-gene mutations. Perhaps, most importantly, our study suggests a greater role for LRRK2 in typical, idiopathic EOPD than previously believed in the Spanish population. Thus, our results could weight utility in personalized genetic counselling.
56 Contributorship statement - Cristina Tejera-Parrado: Analysis and interpretation of data; writing of the first draft, review and critique of the manuscript. - Pablo Mir: Conception and design of the study; review and critique of the manuscript. - María Teresa Periñán: Analysis and interpretation of data; review and critique of the manuscript. - Lydia Vela-Desojo: Acquisition of data; review and critique of the manuscript. - Irene Abreu-Rodríguez: Analysis and interpretation of data; review and critique of the manuscript. - Araceli Alonso-Cánovas: Acquisition of data; review and critique of the manuscript. - Inmaculada Bernal-Bernal: Acquisition of data; review and critique of the manuscript. - Marta Bonilla-Toribio: Acquisition of data; review and critique of the manuscript. - Dolores Buiza-Rueda: Acquisition of data; review and critique of the manuscript. - José Catalán María: Acquisition of data; review and critique of the manuscript. - Rocío García-Ramos: Acquisition of data; review and critique of the manuscript. - Pedro José García-Ruiz: Acquisition of data; review and critique of the manuscript. - Ismael Huertas-Fernández: Analysis of data; review and critique of the manuscript.
57 - Silvia Jesús: Acquisition of data; review and critique of the manuscript. - Lydia López-Manzanares: Acquisition of data; review and critique of the manuscript. - Juan Carlos Martínez-Castrillo: Acquisition of data; review and critique of the manuscript. - Javier Posada Ignacio: Acquisition of data; review and critique of the manuscript. - Ana Rojo-Sebastián: Acquisition of data; review and critique of the manuscript. - Cristina Ruiz-Huete: Acquisition of data; review and critique of the manuscript. - Javier Del Val: Acquisition of data; review and critique of the manuscript. - Pilar Gómez-Garre: Conception and design of the study; analysis and interpretation of data; review and critique of the manuscript. All the listed authors gave their final approval of the final version of the manuscript. Acknowledgments: We would like to thank patients who participated in this study. We also thank Raquel Gómez (Multiple Uses Laboratory), and Juan Antonio Cordero (Bioinformatic and Computational Biology Service), both of them from the Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), for their technical support, and the HUVR-IBiS Biobank (Andalusian Public Health System Biobank and ISCIII-Red de Biobancos PT13/0010/0056) for the human specimens used in this study.
58 Financial Disclosure/Conflict of Interest concerning the research related to the manuscript: This study was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness [PI14/01823, PI16/01575, PI18/01898] co-founded by ISCIII (Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación) and by Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), the Consejería de Economía, Innovación, Ciencia y Empleo de la Junta de Andalucía [CVI-02526, CTS-7685], the Consejería de Salud y Bienestar Social de la Junta de Andalucía [PI-0437-2012, PI-0471-2013], the Sociedad Andaluza de Neurología, the Fundación Alicia Koplowitz, the Fundación Mutua Madrileña. Pilar Gómez-Garre was supported by the "Miguel Servet" (from ISCIII-FEDER) and “Nicolás Monardes” (from Andalusian Ministry of Health) programs. Silvia Jesús Maestre was supported by the "Juan Rodés" program (from ISCIII-FEDER). Cristina Tejera was supported by VPPI-US from the Universidad de Sevilla. Conflict of interests: The authors declare no conflict of interest.
59 REFERENCES [1] M.H. Polymeropoulos, C. Lavedan, E. Leroy, S.E. Ide, A. Dehejia, A. Dutra, B. Pike, H. Root, J. Rubenstein, R. Boyer, E.S. Stenroos, Mutation in the alpha-Synuclein Gene Identified in Families with Parkinson's Disease, Science 276(5321) (1997) 2045-7. [2] C. Paisan-Ruiz, S. Jain, E.W. Evans, W.P. Gilks, J. Simon, M. van der Brug, A. Lopez de Munain, S. Aparicio, A.M. Gil, N. Khan, J. Johnson, J.R. Martinez, D. Nicholl, I.M. Carrera, A.S. Pena, R. de Silva, A. Lees, J.F. Marti-Masso, J. Perez-Tur, N.W. Wood, A.B. Singleton, Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease, Neuron 44(4) (2004) 595-600. [3] A. Zimprich, A. Benet-Pages, W. Struhal, E. Graf, S.H. Eck, M.N. Offman, D. Haubenberger, S. Spielberger, E.C. Schulte, P. Lichtner, S.C. Rossle, N. Klopp, E. Wolf, K. Seppi, W. Pirker, S. Presslauer, B. Mollenhauer, R. Katzenschlager, T. Foki, C. Hotzy, E. Reinthaler, A. Harutyunyan, R. Kralovics, A. Peters, F. Zimprich, T. Brucke, W. Poewe, E. Auff, C. Trenkwalder, B. Rost, G. Ransmayr, J. Winkelmann, T. Meitinger, T.M. Strom, A mutation in VPS35, encoding a subunit of the retromer complex, causes late-onset Parkinson disease, American journal of human genetics 89(1) (2011) 168-75. [4] V. Bonifati, Genetics of Parkinson's disease – state of the art, 2013, Parkinsonism & Related Disorders 20 (2014) S23-S28. [5] C. Lautier, S. Goldwurm, A. Durr, B. Giovannone, W.G. Tsiaras, G. Pezzoli, A. Brice, R.J. Smith, Mutations in the GIGYF2 (TNRC15) gene at the PARK11 locus in familial Parkinson disease, Am J Hum Genet 82(4) (2008) 822-33. [6] Y. Zhang, Q.Y. Sun, R.H. Yu, J.F. Guo, B.S. Tang, X.X. Yan, The contribution of GIGYF2 to Parkinson's disease: a meta-analysis, Neurol Sci 36(11) (2015) 2073-9. [7] J. Trinh, M. Farrer, Advances in the genetics of Parkinson disease, Nat Rev Neurol 9(8) (2013) 445-54.
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61 B. Ford, M. Rezak, K. Novak, J.H. Friedman, R. Pfeiffer, L. Marsh, B. Hiner, A. Siderowf, R. Ottman, K. Marder, L.N. Clark, Frequency of known mutations in early-onset Parkinson disease: implication for genetic counseling: the consortium on risk for early onset Parkinson disease study, Archives of neurology 67(9) (2010) 1116-22. [15] N. Spataro, A. Roca-Umbert, L. Cervera-Carles, M. Valles, R. Anglada, J. Pagonabarraga, B. Pascual-Sedano, A. Campolongo, J. Kulisevsky, F. Casals, J. Clarimon, E. Bosch, Detection of genomic rearrangements from targeted resequencing data in Parkinson's disease patients, Mov Disord 32(1) (2017) 165-169. [16] A. Gorostidi, J.F. Marti-Masso, A. Bergareche, M.C. Rodriguez-Oroz, A. Lopez de Munain, J. Ruiz-Martinez, Genetic Mutation Analysis of Parkinson's Disease Patients Using Multigene Next-Generation Sequencing Panels, Mol Diagn Ther 20(5) (2016) 481-91. [17] S. Bandres-Ciga, N.E. Mencacci, R. Duran, F.J. Barrero, F. Escamilla-Sevilla, S. Morgan, J. Hehir, F. Vives, J. Hardy, A.M. Pittman, Analysis of the genetic variability in Parkinson's disease from Southern Spain, Neurobiology of aging 37 (2016) 210 e1-5. [18] A. Ramirez, A. Heimbach, J. Grundemann, B. Stiller, D. Hampshire, L.P. Cid, I. Goebel, A.F. Mubaidin, A.L. Wriekat, J. Roeper, A. Al-Din, A.M. Hillmer, M. Karsak, B. Liss, C.G. Woods, M.I. Behrens, C. Kubisch, Hereditary parkinsonism with dementia is caused by mutations in ATP13A2, encoding a lysosomal type 5 P-type ATPase, Nat Genet 38(10) (2006) 1184-91. [19] D. Ysselstein, J.M. Shulman, D. Krainc, Emerging links between pediatric lysosomal storage diseases and adult parkinsonism, Mov Disord (2019). [20] C.M. Lill, Genetics of Parkinson's disease, Molecular and cellular probes 30(6) (2016) 386- 396. [21] D.G. Hernandez, X. Reed, A.B. Singleton, Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance, J Neurochem 139 Suppl 1 (2016) 59-74.
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63 Samaddar, C. Schulte, M. Sharma, A. Singleton, M. Spitz, E.K. Tan, N. Tayebi, T. Toda, A.R. Troiano, S. Tsuji, M. Wittstock, T.G. Wolfsberg, Y.R. Wu, C.P. Zabetian, Y. Zhao, S.G. Ziegler, Multicenter analysis of glucocerebrosidase mutations in Parkinson's disease, The New England journal of medicine 361(17) (2009) 1651-61. [29] M. Ferreira, J. Massano, An updated review of Parkinson's disease genetics and clinicopathological correlations, Acta neurologica Scandinavica (2016). [30] F. Zhao, L. Bi, W. Wang, X. Wu, Y. Li, F. Gong, S. Lu, F. Feng, Z. Qian, C. Hu, Y. Wu, Y. Sun, Mutations of glucocerebrosidase gene and susceptibility to Parkinson's disease: An updated meta-analysis in a European population, Neuroscience 320 (2016) 239-46.
70 SUPPLEMENTARY METHODS Prediction of the significance of variants For the prediction of the significance of variants we followed the combination of several criteria: 1) Type of the variation: whether variation results in a null variant: that is nonsense, frameshift or affecting to canonical splice sites that result in frameshift of the coding sequence, mutations affecting the initiation codon, and those leading to exon(s) deletion. 2) In-silico prediction: We used multiple bioinformatics tools and the impact was interpreted with respect to all known isoforms of each gene. For missense variants, a total of thirteen tools were examined. Therefore, we used 6 functional prediction scores (SIFT, Polyphen-2, MutationTaster, MutationAssesor, LRT, and FATHMM), 4 conservation scores (GERP++, PhyloP, PhastCons, and Grantham Score), and three ensemble-based prediction scores (CADD, LR, and RadialSVM). A threshold was set for each tool above in which the variant was classified as damaging (Suppl. Table 1). In addition, all variants were analyzed using GWAVA, CADD, and the splicing predictions from the Batch version of the annotation software package Alamut (Interactive Biosoftware, Rouen, France), that integrates 5 sources: Splice Site Finder, MaxEntScan, NNSplice, GeneSplicer and Human Splicing Finder (Suppl. Table 1). We also considered the dbscsnv11 database for predicting the splicing impact by Ada Boost and Random Forest (Suppl. Table 1). Moreover, non-coding variants were prioritized when ReMM- score >0.8 and IW-score with an associated P-value<0.05. 3) Score from Regulome-DB of 1. 4) Co-occurrence with pathogenic variants.
71 SUPPLEMENTARY FIGURE 1
72 Supplementary Table 1. Summary of deleteriousness prediction methods used in our study. Name Category Thereshold SIFT Function prediction < 0.05 Polyphen-2 Function prediction > 0.85 Mutation Taster Function prediction Disease causing o Disease causing automatic PhyloP Conservation score > 0.7 CADD Ensembl score > 10 Grantham Score Conservation score > 100 PhastCons Conservation score > 0.7 GERP++ Conservation score > 3 LRT Function prediction Deleterious Mutation Assessor Function prediction High o Medium LR Ensembl score Deleterious FATHMM Function prediction Deleterious RadialSVM Ensembl score Deleterious SSF Effect on splicing > 70 MaxEnt Effect on splicing > 0 NNSPLICE Effect on splicing > 0.4 GeneSplicer Effect on splicing > 0 HSF Effect on splicing > 65 dbscSNV_RF_Score Effect on splicing < 0.6 dbscSNV_RF_Score Effect on splicing < 0.6
73 Supplementary Table 2. Description of preselected candidate pathogenic variants after applying bioinformatics filters. Nonsense variants and those missense variants which were predicted as likely pathogenic by at least 53’9% (seven of thirteen) of the bioinformatics tools. Score Prediction Score Prediction Score Prediction Score Prediction ATP13A2 1:17328585 p.G217S c.G649A Hetero 0 Damaging 1 Probably damaging 1Disease causing 5,577 22,8 56 0,956 4,89 3,41 Medium Deleterious Deleterious Deleterious Deleterious VOUS ND 1 ATP13A2 1:17318246 p.R745H c.G2234A Hetero 0,03 Damaging 1 Probably damaging 1Disease causing 7,265 21,1 29 1 4,93 2,315 Medium Deleterious Tolerated Deleterious Deleterious VOUS ND 1 DNAJC6 1:65831737 p.S77F c.C230T Hetero 0,09 Tolerated 1 Probably damaging 1Disease causing 7,247 29,1 155 1 5,51 2,62 Medium Deleterious Deleterious Deleterious Deleterious VOUS ND 1 DNAJC6 1:65854097 p.K341E c.A1021G Hetero 0 Damaging 0,992 Probably damaging 1Disease causing 6,548 20,4 56 1 4,9 2,44 Medium Deleterious Deleterious Deleterious Deleterious VOUS ND 1 DNAJC6 1:65877062 p.V865M c.G2593A Hetero 0 Damaging 1 Probably damaging 1Disease causing 9,657 29,6 21 1 5,03 3,03 Medium Deleterious Tolerated Tolerated Tolerated VOUS ND 1 EIF4G1 3:184040997 p.G693C c.G2077T Hetero 0,05 Damaging 0,999 Probably damaging 1Disease causing 0,872 18,54 159 1 5,16 0,895 Low Deleterious Tolerated Tolerated Tolerated VOUS ND 1 EIF4G1 3:184045661 p.L1282H c.T3845A Hetero 0,56 Tolerated 1 Probably damaging 1Disease causing 7,698 31 99 1 6,17 1,74 Low Deleterious Tolerated Tolerated Tolerated VOUS ND 2 EIF4G1 3:184046529 p.M1362T c.T4085C Hetero 0 Damaging 0,998 Probably damaging 1Disease causing 7,698 18,64 81 1 4,54 2,48 Medium Deleterious Tolerated Tolerated Tolerated VOUS ND 1 GBA 1:155207997 p.V230G c.T689G Hetero 0,25 Tolerated 0,011 Benign 1 Disease causing 5,309 4,868 109 0,987 2,5 0,77 Nonfunctional Neutral Deleterious Deleterious Deleterious VOUS ND 1 GBA 1:155206220 p.I347T c.T1040C Hetero 0,11 Tolerated 0,937 Possibly damaging 1Disease causing 8,274 17,27 89 0,984 3,67 1,365 Low Deleterious Deleterious Deleterious Deleterious VOUS ND 1 GBA 1:155206167 p.E365K c.G1093A Hetero 0,43 Tolerated 0,03 Benign 0 Disease causing 0,838 11,06 56 0,845 3,67 1,01 Low Neutral Deleterious Deleterious Deleterious VOUS P / RF 1 GBA 1:155206052 p.S403N c.G1208A Hetero 0,1 Tolerated 0,996 Probably damaging 0,554 Polymorphism 5,361 20,3 46 1 3,57 2,045 Medium Deleterious Deleterious Deleterious Deleterious LP P 1 GIGYF2 2:233712207 p.R1225C c.C3673T Hetero 0 Damaging 0,946 Possibly damaging 1Disease causing 1,725 17,35 180 0,997 5,4 0,625 Nonfunctional Deleterious Tolerated Tolerated Tolerated VOUS ND 1 LRRK2 12:40704236 p.R1441C c.C4321T Hetero 0,14 Tolerated 1 Probably damaging 1Disease causing 3,654 23,5 180 0,082 4,74 1,97 Medium Deleterious Tolerated Deleterious Deleterious P P 1 LRRK2 12:40713845 p.R1628H c.G4883A Hetero 0,22 Tolerated 1 Probably damaging 1Disease causing 8,853 33 29 1 5,54 1,43 Low Deleterious Tolerated Tolerated Tolerated VOUS VOUS 2 LRRK2 12:40734202 p.G2019S c.G6055A Hetero 0 Damaging 1 Probably damaging 1Disease causing 9,527 36 56 0,966 5,69 3,765 High Deleterious Deleterious Deleterious Deleterious LP P 5 PARK2 6:162864434 p.K27X c.A79T Homo 1 Tolerated . . 1 Disease causing 6,231 38 NA 1 5,63 . . Deleterious . . . LP ND 1 PARK2 6:162864388 p.R70P c.G209A Hetero 0,15 Tolerated 0,726 Possibly damaging 1Disease causing 0,727 21,2 103,29 1 4,74 3,47 Medium Deleterious Tolerated Deleterious Deleterious VOUS VOUS 1 PARK2 6:162394349 p.T240M c.C635T Hetero 0,05 Damaging 0,991 Probably damaging 0,983 Polymorphism 6,594 16,31 81 0,299 5,14 1,78 Low Neutral Deleterious Deleterious Deleterious LP P 1 PARK2 6:162206909 p.R256C c.C766T Hetero 0,02 Damaging 1 Probably damaging 0,999 Disease causing 8,289 26,9 180 0,06 5,75 2,3 Medium Deleterious Deleterious Deleterious Deleterious VOUS ND 1 PARK2 6:161781200 p.R402H c.G1205A Hetero 0,01 Damaging 1 Probably damaging 1Disease causing 5,469 21,2 29 0,686 4,89 2,56 Medium Deleterious Deleterious Deleterious Deleterious VOUS ND 1 PARK2 6:161771195 p.W445X c.G1334A Hetero 1 Tolerated . . 1 Disease causing 5,476 34 NA 1 5,27 . . Deleterious . . . P ND 1 PINK1 1:20972133 p.L347P c.T1040C Homo 0 Damaging 1 Probably damaging 1Disease causing 6,959 15,71 98 0,775 4,9 4,13 High Deleterious Tolerated Deleterious Deleterious LP P 1 PLA2G6 22:38508553 p.R745Q c.G2234A Hetero 0 Damaging 1 Probably damaging 1Disease causing 6,995 28,7 43 1 4,54 2,64 Medium Deleterious Tolerated Deleterious Deleterious VOUS ND 1 PLA2G6 22:38509628 p.V690I c.G2068A Hetero 0 Damaging 1 Probably damaging 1Disease causing 4 17,29 29 0,962 4,36 1,85 Low Deleterious Tolerated Deleterious Deleterious VOUS VOUS 1 SMPD1 11:6414486 p.R377C c.C1129T Hetero 0 Damaging 1 Probably damaging 1Disease causing 4,64 22,4 180 1 5,41 3,785 High Deleterious Deleterious Deleterious Deleterious VOUS ND 1 SMPD1 11:6415566 p.R541Q c.G1622A Hetero 0,14 Tolerated 0,981 Probably damaging 0,75 Disease causing 1,982 13,8 43 0,919 2,94 2,255 Medium Neutral Deleterious Deleterious Tolerated VOUS VOUS 1 SYNJ1 21:34060625 p.A320V c.C959T Hetero 0,02 Damaging 1 Probably damaging 1Disease causing 9,061 36 64 1 6,16 2,11 Medium Deleterious Tolerated Tolerated Tolerated VOUS VOUS 1 SYNJ1 21:34003786 p.G1453E c.G4358A Hetero 0,01 Damaging 0,989 Probably damaging 1Disease causing 4,989 22,9 NA 0,988 5,13 1,845 Low Deleterious Tolerated Tolerated Tolerated VOUS B 4 SYNJ1 21:34060664 p.R307H c.G920A Hetero 0,64 Tolerated 1 Probably damaging 1Disease causing 7,193 18,67 29 1 6,16 1,145 Low Deleterious Tolerated Tolerated Tolerated VOUS ND 1 VPS35 16:46696262 p.A654S c.G1960T Hetero 0,08 Tolerated 0,999 Probably damaging 1Disease causing 7,818 34 99 1 5,49 2,87 Medium Deleterious Tolerated Deleterious Deleterious VOUS ND 1 VPS35 16:46717460 p.Q21L c.A62T Hetero 0,32 Tolerated 0 Benign 1 Disease causing 7,972 15,92 113 1 5,42 0,64 Nonfunctional Deleterious Tolerated Tolerated Tolerated VOUS ND 2 GERP++ MutationAssessor PhyloP CADD Grantham Score Phast Cons ACMG ClinVar N Gene Chr: position Amino acid change Nucleotide change Zygosity SIFT Polyphen-2 MutationTaster LRT FATHMM RadialSVM LR
74 VOUS: Variant of uncertain significance; P: Pathogenic; LP: Likely pathogenic; B: Benign; N: number of carriers; ND: No data. Supplementary Table 3. Putative pathogenic variants found in our PD-population from central Spain Gene (MI) Transcript Exon (E) / Intron (I) Nucleotide change Amino acid change dbSNP ID Carriers (n=117) maf Previously Reported Effect Het Hom Our study GO-ESP& ExAc* ATP13A2 (AD) NM_022089.3 E8 c.649G>A p.Gly217Ser rs199961048 1 0 4.27e-3 ND 1.62e-05 Yes MS E20 c.2234G>A p.Arg745His rs140455242 1 0 4.27e-3 1.16e-04 1.5e-05 Yes MS I24 c.2762+21T>C - rs560897844 1 0 4.27e-3 ND 1.5e-05 Yes SR DNAJC6 (AR) NM_001256864 E4 c.401C>T p.Ser134Phe - 1 0 4.27e-3 ND ND No MS E9 c.1192A>G p.Lys398Glu - 1 0 4.27e-3 ND ND No MS E18 c.2764G>A p.Val922Met - 1 0 4.27e-3 ND ND No MS EIF4G1 (AD) NM_001194946 E15 c.2077G>T p.GLy693Cys rs112019125 1 0 4.27e-3 ND 9e-05 Yes MS/SR E28 c.4085T>C p.Met1362Thr rs144059151 1 0 4.27e-3 8.14e-04 5.8e-04 Yes MS GBA (AD-RF) NM_001005741.2 E9 c.1040T>C p.Ile347Thr - 1 0 4.27e-3 ND ND No MS E9 c.1208G>A p.Ser403Asn - 1 0 4.27e-3 ND ND No MS GIGYF2 (AD-S) NM_001103147 E29 c.3673C>T p.Arg1225Cys rs149440697 1 0 4.27e-3 1.16e-04 4.47e-05 Yes MS LRRK2 (AD) NM_198578.3 E30 c.4229C>T p.Thr1410Met rs72546327 1 0 4.27e-3 0 1.2e-04 Yes MS E31 c.4321C>T p.Arg1441Cys rs33939927 1 0 4.27e-3 ND 1.5e-05 Yes MS I31 c.4536+3A>G - rs41286476 1 0 4.27e-3 5.81e-04 4.38e-04 Yes SR E41 c.6055G>A p.Gly2019Ser rs34637584 5 0 0.022 5.8e-04 6.29e-04 Yes MS PARK2 (AR) NM_004562.2 2 c.79A>T p.Lys27Stop - 0 1 8.55e-3 ND ND No SG 2 c.125G>C p.Arg42Pro rs368134308 1 0 4.27e-3 1.16e-04 4.5e-05 Yes MS 2 c.155delA p.Asn52Metfs rs754809877 3 7 0.073 6.06e-04 3.15e-04 Yes FS 6 c.719C>T p.Thr240Met rs137853054 1 0 4.27e-3 2.33e-04 1.35e-04 Yes MS 7 c.766C>T p.Arg256Cys rs150562946 1 0 4.27e-3 4.65e-04 5.14e-04 Yes MS 11 c.1205G>A p.Arg402His rs766915327 1 0 4.27e-3 ND 0 Yes MS 12 c.1334G>A p.Trp445Stop - 1 0 4.27e-3 ND ND No SG 3 Del Del - 0 1 8.55e-3 - - - DEE 4 Del Del - 1 0 4.27e-3 - - - DEE 3, 4, 5, 6 Del Del - 1 2 0.021 - - - DEE 7 Del Del - 4 0 0.017 - - - DEE PINK1 (AR) NM_032409.2 5 c.1040T>C p.Leu347Pro rs28940285 0 1 8.55e-3 ND 0 Yes MS PLA2G6 (AR) NM_003560.2 E15 c.2068G>A p.Val690Ile rs141777179 1 0 4.27e-3 8.14e-04 9.17e-04 Yes MS E16 c.2234G>A p.R745Q rs368514303 1 0 4.27e-3 1.2e-04 0 Yes MS
75 Gene (MI) Transcript Exon (E) / Intron (I) Nucleotide change Amino acid change dbSNP ID Carriers (n=117) maf Previously Reported Effect Het Hom Our study GO-ESP& ExAc* SMPD1 (RF) NM_000543.4 E2 c.441G>A p.V147V rs148944108 2 0 8.55e-3 0 1.67e-04 Yes SN / SR E3 c.1132C>T p.R378C rs369088417 1 0 4.27e-3 0 0 Yes MS SYNJ1 (AR) NM_003895.3 E7 c.959C>T p.A320V - 1 0 4.27e-3 ND ND No MS VPS35 (AD) NM_018206.5 E15 c.1960G>T p.A654S - 1 0 4.27e-3 No ND No MS MI: Mode of Inheritance; AD: Autosomal dominant; AR: Autosomal recessive; S: Susceptibility; RF: Risk factor; N: Number of carriers; Het: Heterozygosity; Hom: Homozygosity; SG: Stop gain; MS: Missense; FS: Frameshift; DEE: Deletion of the entire exon; SR: Splice region; SN: Synonymous; MAF: Minor allele frequency; &: European Americans; *: Non-Finnish European.
76 Supplementary Table 4. Variants putatively affecting splicing Chr: chromosome; E: Exon; I: Intron; N: number of carriers; SSF: Splicing Sequences Finder; MaxEnt: Maximum Entropy Scan; NNSplice: Splice site prediction by Neural Network: HSF: Human Splicing Finder; ADA: adaptive boosting, RF: random forest; *: Predicted as likely pathogenic by all 5 tools with high scores 1000G EUR Affected Score variation Score variation Score variation Score variation Score variation ada rf E10 1: 17326767 c.881G>A - 5' 27 rs56367069* 5 0.018 0.0214 79.69 (+12.7%) 6.46 (+55.9%) 0.79 appear 6.76 (+142%) 87.86 (+5.9%) - - appear a putative new 5' donor site in c.882 I24 1: 17314796 c.2762+21T>C - 5' 19 rs560897844* 1 0.0002 (all) 0.0043 81.66 (+5.3%) 8.48 (+25.7%) 0.54 appear 5.18 (+146.3%) 92.05 (+2.2%) - - stronger criptic 5' donor site I26 1: 17313454 c.3084-3C>T - 3' 1 rs7531163 68 0.25 0.325 76.52 (-7.5%) 9.90 (+6.5%) 0.96 (+4.4%) 13.19 (+14.3%) 84.49 (-8.3%) 0.0011 0.1 weaker 3' acceptor site I27 1: 17313283 c.3235+17G>A - 5' 15 rs56146840 5 0.019 0.0214 70.14 appear 3.78 appear - - 1.96 appear 83.47 appear - - appear a new 3' acceptor site in c.3235+18 DNAJC6 E9 1: 65854097 c.1192A>G + 5' 2 - 1 - 0.0043 78.90 (-10.2) 10.15 (+0.7%) 0.99 (-0.2%) 4.94 (+21.9%) 84.56 (-5.4%) 0.9934 0.96 weaker 5' donor site in c.1193 I11 3: 184040606 c.1796-3C>T + 3' 1 rs190378563 1 0.001 0.0043 87.71 (-6.6%) 11.84 (-12.84%) 0.99 (+0.2%) 10.07 (-12.9%) 87.91 (-8.0%) 0.0018 0.196 weaker 3' acceptor site E13 3: 184040997 c.2056G>T + 5' 33 rs112019125* 1 - 0.0043 80.14 appear 5.28 appear 0.92 appear 2.52 appear 87.15 appear - - appear a putative new 5' donor site in c.2054 I29 3: 184049399 c.4398+5G>A + 5' 3 rs16858676 1 0.014 (all) 0.0043 74.71 (-14.0%) 6.04 (-37.4%) 0.88 (-9.3%) 6.17 (-37.3%) 77.73 (-13.5%) 0.9556 0.656 weaker 5' donor site GIGYF2 I4 2: 233568203 c.-44+4A>G + 5' 2 rs746723892 1 - 0.0043 89.92 (-10.1%) 10.28 (-5.3%) 0.96 (-3.4%) 5.73% (-16.2%) 91.66 (-8.3%) 0.3339 0.44 weaker 5' donor site LRRK2 I31 12: 40704454 c.4536+3A>G + 5' 1 rs41286476 1 - 0.0043 77.31 (-5.3%) 5.19 (-41.8%) desappear - desappear - 86.21 (-11.4%) 0.9712 0.86 weaker 5' donor site SMPD1 E2 11: 6412736 c.441G>A + 3' 120 rs148944108* 2 0.002 0.0086 81.75 (+5.6%) 8.98 (+100.6%) 0.75 appear 4.85 appear 87.50 (+1.3%) - - appear a new 5' donor site in c.438 SYNJ1 I1 21: 34100124 c.-23+24G>A - 5' 22 rs755252765 2 - 0.0086 70.57 appear 5.10 (+79.3%) - - 4.73 (+60.9%) 82.29 (+1.0%) - - appear a putative new 5' donor site (refered to isoforms 3 and 4) UCHL1 I2 41259149 c.45+6T>C + 5' 4 rs11556273 21 0.09 0.098 77.42 (-6.9%) 5.89 (-29.9%) 0.90 (-8.3%) 4.22 (-34.4%) 85.13 (-2.5%) 0.8166 0.724 weaker 5' donor site Gene Intron / Exon Chr position Nucleotide change ID N Frequency SSF MaxEnt Strand Splice Site NNSplice ATP13A2 EIF4G1 Putative consequence dncsSNV scoresDistance to Splice Site GeneSplicer HSF
77 1.1.2. Resumen Desde que se describió la primera mutación causativa de EP, se han realizado numerosos estudios con el fin de dilucidar la complejidad genética que se esconde tras esta enfermedad. Genes de herencia autosómica dominante como SNCA, LRRK2 o VPS35 se sabe que son causa de EP, aunque se han descrito otros como EIF4G1, GIGYF2 o UCHL1 cuya implicación continúa bajo estudio. También se han identificado genes causativos de EP de herencia autosómica recesiva como PARK2, PINK1, DJ-1, ATP13A2, PLA2G6, FBXO7, DNAJC6 y SYNJ. Sin embargo, las mutaciones monogénicas no son la causa más común de la EP. Lo más frecuente en la población son variaciones genéticas comunes de riesgo moderado. El gen GBA es el factor de riesgo descrito más importante de EP idiopático, y otros genes como SMPD1 o GIGYF2 se han descrito también de riesgo para la EP, aunque su implicación continúa bajo estudio. A pesar de todos los factores genéticos descritos hasta la fecha, la mayor proporción de la heredabilidad del Parkinson sigue siendo desconocida. En los pacientes de EPIT hay una mayor contribución de los factores genéticos en el desarrollo de la enfermedad, por lo que el objetivo de este trabajo fue estudiar genes descritos causativos y de riesgo relacionados con la EP, en una cohorte de 117 pacientes de EPIT procedentes de distintos hospitales de la Comunidad Autónoma de Madrid (España). Como la tecnología de secuenciación masiva se espera que contribuya a identificar nuevas variaciones genéticas, se realizó la secuenciación dirigida de 17
78 genes causativos y de riesgo para la EP, y de genes no confirmados (SNCA, LRRK2, PINK1, PARK2, ATP13A2, FBXO7, VPS35, DJ1, PLA2G6, EIF4G1, DNAJC6, HTRA2, SMPD1, SNYJ1, UCHL1, GIGYF2 y GBA). Además se llevó a cabo un estudio de dosis génica mediante MLPA. En total se detectaron 224 variaciones categorizadas como probablemente patogénicas, patogénicas o con significado incierto (VOUS) de acuerdo con las guías internacionales del ACMG (Figura 1). De éstas, 82 estaban en regiones codificantes y 142 en regiones no codificantes. Se consideraron variaciones con potencial significado clínico aquellas predichas como patogénicas por el 69% de las herramientas bioinformáticas, así como las descritas como patogénicas en ClinVar (Tabla suplementaria 3). En el gen PARK2, 3 variaciones se consideraron directamente de pérdida de función ya que introducían un codón de stop o provocaba una pauta abierta de lectura de la proteína. Además, se detectaron 4 deleciones en este gen: 3 deleciones de un solo exón y 1 afectando a 4 exones consecutivos (Tabla suplementaria 3). Otras 13 variaciones afectaban al sitio de splicing según las herramientas bioinformáticas (Tabla suplementaria 4), y de ellas 4 (rs560897844, rs112019125, rs148944108 y rs41286476) fueron clasificadas como posiblemente patogénicas por todas las herramientas de predicción bioinformáticas empleadas y presentaban frecuencias alélicas mayores que las descritas en las principales bases de datos, considerándolas candidatas a ser deletéreas (Tabla suplementaria 4). Finalmente, se escogieron aquellas variaciones que se encontraban en heterocigosis en genes dominantes y en homocigosis o en heterocigosis
79 compuesta en los recesivos. Así, 34 de los 117 pacientes (29,06%) tenían alguna variación potencialmente patogénica en 8 genes (Figura 2; Tabla 2). 27 pacientes (23,08%) tenían variaciones potencialmente patogénicas para la EP en PARK2, LRRK2, PINK1 o GBA, genes bien descritos relacionados con la EP. Concretamente, 16 de ellos (13,68%) tenían estas variaciones en el gen PARK2, tratándose en 8 de los casos de deleciones de exones completos (Figura 2; Tabla2). La variación más frecuente fue la p.N52fs, también en PARK2. Además, 8 pacientes de los 27 (6,84%) tenían variaciones potencialmente patogénicas en el gen LRRK2. No se encontraron diferencias significativas (p= 0,205) en la edad de inicio entre los pacientes que tenían variaciones potencialmente patogénicas en el gen LRRK2 y los que tenían variaciones de este tipo en el gen PARK2. Los genes PINK1 y VPS35 han resultado ser una causa rara de EP en la población estudiada, ya que sólo se localizó una variación potencialmente patogénica en cada gen. Finalmente, 2 pacientes tenían 2 variaciones no descritas previamente en GBA (p. I347T y p.S403S). Un total de 8 variaciones potencialmente patogénicas se localizaron en otros genes relacionados con la EP: ATP13A2 (p.G217S, p.R754H y c.2762+21T>C), EIF4G1 (p.G693C y p.M1362T), GIGYF2 (p.R1225C), y SMPD1 (p.V.147V y p.R378C) (Tabla 2).
87 1.2.2. Resumen En este trabajo se evaluó la existencia de variaciones genéticas en el gen CHCHD2, propuesto como gen involucrado en la fisiopatogenia de la EP desde 2015 por Funayama y col. En su trabajo, Funayama y col. describen por primera vez una mutación causativa de EP de herencia autosómica dominante en el gen CHCHD2, p.T61I, en una familia japonesa. Posteriores trabajos identifican también variaciones de riesgo asociada a la EP en este gen, aunque su papel en la enfermedad sigue siendo controvertido ya que en otros estudios no se corroboran estos resultados. Con el fin de dilucidar la implicación de CHCHD2 en la EP, el objetivo de este trabajo fue analizar este gen en una población del sur de España compuesta por 518 sujetos sanos y 536 pacientes de EP de la Unidad de Trastornos del Movimiento del Hospital Universitario Virgen del Rocío (Sevilla, España), de los cuales 101 tenían EPIT. En total se identificaron 4 variaciones genéticas en la población estudiada: 3 en la región 5’-UTR (c.9T>G, c.34C>A, c.65T>G) y 1 en la región 3’-UTR (c.*125G>A). Ninguna de las variaciones genéticas se encontraba asociada a la EP en este estudio, ni tampoco cuando se analizaron por separado los 101 casos de EPIT frente a los controles sanos. El gen CHCHD2 no parece actuar como un factor de riesgo para la EP, al menos en la población de estudio.
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89 1.3. Sub-objetivo 3: Estudiar la implicación en la fisiopatogenia de la EP de TMEM230, nuevo gen propuesto causativo de EP, en población del sur de España. 1.3.1. Publicación: TMEM230 in Parkinson’s disease in a southern Spanish population. Tejera-Parrado C, Jesús S, López-Ruíz A, Buiza-Rueda D, Bonilla-Toribio M, Bernal.Bernal I, Periñán MT, Vargas-González L, Gómez-Garre P, Mir P.
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RESEARCH ARTICLE TMEM230 in Parkinson’s disease in a southern Spanish population Cristina Tejera-Parrado 1 , Silvia Jesu ´s 1 , Adria ´n Lo ´pez-Ruı ´z 1 , Dolores Buiza-Rueda 1 , Marta Bonilla-Toribio 1 , Inmaculada Bernal-Bernal 1 , Marı ´a Teresa Periña ´n 1 , Laura Vargas- Gonza ´lez 1 , Pilar Go ´mez-Garre 1,2 *, Pablo Mir 1,2 * 1Unidad de Trastornos del Movimiento, Servicio de Neurologı ´a y Neurofisiologı ´a Clı ´nica, Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital Universitario Virgen del Rocı ´o/CSIC/Universidad de Sevilla, Sevilla, España, 2Centro de Investigacio ´n Biome ´dica en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED), Madrid, España *[email protected] (PM); mgomez[email protected] (PG) Abstract TMEM230 has been associated with autosomal dominant Parkinson’s disease (PD). Subsequent studies have remained negative, and none of previous described mutation has been reported anymore. We investigated the implication of this gene in the PD in a population of 703 PD patients and 695 unrelated healthy controls from southern Spain. Thirteen variants were found, twelve of them observed only in controls or in patients and controls, and one (c.190A>G) observed only in one patient. Subsequent analysis of this variant indicates that probably it is not pathogenic. In addition, we found a variation in the 3’-UTR (rs183551373) and related with the miRNA hsa-miR-4299 but it was observed only in healthy controls. Our results suggest that variants in TMEM230 gene are not associated with the development of PD. Introduction Parkinson’s disease (PD) is a complex pathology in which both environmental and genetic factors are involved. More than 18 genes, like PARK2,LRRK2 or SNCA, among others, are well documented as causative genes or risk factors for PD [1]. However, the study of other described genes is still needed for understanding their implication in the pathophysiology of PD. Recently, a missense mutation (p.Arg141Leu) in TMEM230 gene has been described to be a cause of autosomal dominant PD in a large family from North American [2]. Two other mutations (p.Tyr92Cys and p.184Trpext5) were also identified in two young onset unrelated PD patients in that study. Furthermore, in a Chinese population, a new mutation in TMEM230 (p.184ProGlyext5) was identified as being related with PD in 7 familial cases. Several additional studies in different populations have failed to find neither causative mutation nor risk factors in TMEM230associated with PD [3–16] (S1 Table). In order to complete the picture of the involvement of TMEM230 gene in PD, we have analyzed this gene in a PD population from southern Spain. PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0197271 May 17, 2018 1 / 5 a1111111111 a1111111111 a1111111111 a1111111111 a1111111111 OPEN ACCESS Citation: Tejera-Parrado C, Jesu ´s S, Lo ´pez-Ruı ´z A, Buiza-Rueda D, Bonilla-Toribio M, Bernal-Bernal I, et al. (2018) TMEM230 in Parkinson’s disease in a southern Spanish population. PLoS ONE 13(5): e0197271. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0197271 Editor: Patrick Lewis, University College London Institute of Neurology, UNITED KINGDOM Received: February 6, 2018 Accepted: April 30, 2018 Published: May 17, 2018 Copyright: ©2018 Tejera-Parrado et al. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Data Availability Statement: All relevant data are within the paper and its Supporting Information files. Funding: This study was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness [PI14/01823 to Pilar Go ´mez- Garre, PI16/01575 to Pablo Mir] co-founded by the Instituto de Salud Carlos-III (ISCIII) and by Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), the Consejerı ´a de Economı ´a, Innovacio ´n, Ciencia y Empleo de la Junta de Andalucı ´a [CVI-02526, CTS-
Materials and methods The study was approved by the Ethics Committee of the Hospital Virgen del Rocı ´o and was conducted according to the Declaration of Helsinki. All subjects, both patients and controls, were informed (orally and in writing) of the nature of the study and signed a written consent before blood collection. We included a total of 703 PD patients from the Movement Disorders Unit of the Hospital Universitario Virgen del Rocı ´o (Seville, Spain), and 695 healthy controls (HC). One hundred forty-eight patients had familial PD (Table 1). PD was diagnosed using the criteria of the United Kingdom Parkinson’s Disease Society Brain Bank [17]. A positive family history was defined as the presence of Parkinson’s disease in at least other first-degree and/or second-degree relative. Signed consent forms were obtained for each individual studied and the study was approved by the local ethic committee. Genomic DNA was isolated from peripheral blood from each subject, according to established protocols by standard or automated methods (MagNA Pure LC, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). To detect mutations, all the 5 exons of TMEM230 (NM_001009923 and NM_001009925) and their intron boundary regions were analyzed using high-resolution melting analysis in a LightCycler 480-II (Roche). Samples showing abnormal melting profiles were sequenced in an ABI3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystem). The identified variants were annotated according to the longest isoform (NM_001009923). A variant call of sequenced samples was made using Variant Reporter software v1.1. (Applied Biosystem). Results We detected a total of 13 genetic variants (two not reported before) in our population: two at 3’-untranslated region, one in 5’-untranslated region, one intronic variant, four synonymous variants, and five nonsynonymous variants (Table 2). Ten were rare variants (minor allele frequency <0.01). From those, four variants were observed in patients and controls (rs141394228, rs147693982, rs148033002, and c.670T>C) and five were observed only in controls (rs368686615, rs186628284, rs776037148, rs143571424, and rs183551373). One novel variant (c.190A>G) was present in one patient only. This variant results in the loss of the start codon in the most common isoform of TMEM230. However, another variant found in the present study, c.191T>C, carrying the same effect was present in two healthy controls and in one PD patient. Another novel variant was identified in 3’UTR region, c.670T>C but it was present in patients and control subjects. None of these variations were identified in the familial cases. Neither of the known variants previously related with PD have been found in this study. Three frequent variants (rs10221980, rs6107576, and rs6116651) were present in PD case cohort and control cohort with similar frequencies. Discussion In this study we have reported 13 variants in TMEM230but neither of them seems to be related with the development of PD, since they are present only in HC or in both patients and HC. The exception has been c.190A>G, which is present in a single patient. This variation causes Table 1. Demographic characteristics of studied population. Subjects (n) % males (M/F) Mean age (y) Mean AO (y) Healthy controls (695) 55. 4 (385 / 310) 57 ±15 - PD Total (703) 54.6 (384 / 319) 64 ±12 56 ±13 Familial (148) 45. 9 (68 / 80) 62.5 ±11 53 ±14 PD: Parkinson’s disease; y: years; AO: age at onset; n: number of samples https://doi.org/10.1371/journal.pone.0197271.t001 TMEM230 in PD Spanish population PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0197271 May 17, 2018 2 / 5 7685], the Consejerı ´a de Salud y Bienestar Social de la Junta de Andalucı ´a [ PI-0437-2012, PI-0471- 2013], the Sociedad Andaluza de Neurologı ´a to Pablo Mir, the Jacques and Gloria Gossweiler Foundation to Pablo Mir, the Fundacio ´n Alicia Koplowitz to Pablo Mir, and the Fundacio ´n Mutua Madrileña. Pilar Go ´mez-Garre was supported by the "Miguel Servet" (from ISCIII-FEDER) and “Nicola ´s Monardes” (from Andalusian Ministry of Health) programmes. Silvia Jesu ´s was supported by the "Juan Rode ´s" programme (from ISCIIIFEDER). Cristina Tejera-Parrado was supported by VPPI-US from the Universidad de Sevilla. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Competing interests: The authors have declared that no competing interest exist.
the loss of the ATG start codon in the isoform 2 of TMEM230 (NP_001009925; c.1A>G, p. Met1Val), therefore, it could be disease causing. However, the variant c.191T>C, with similar consequences in the protein (NP_001009925; c.2A>G, p.M1Thr), is present in healthy controls in this study and in previous ones [3]. In addition, the subsequent amino acid of TMEM230pro- tein is also methionine, which would act as an alternative start codon to generate a novel protein that lacks only the first amino acid. So, it is expected that this variation does not cause a significant alteration of the protein. In addition, a variation in the 3’-UTR (rs183551373) has been related with the miRNA hsa-miR-4299 but it was found only in healthy controls in our population and, thereupon, the pathogenicity of this variant seems not be probable. Conclusions Our findings suggest that the incidence of pathogenic variations in TMEM230 is very low and, therefore, TMEM230 do not play a major role in familial and sporadic PD patients in southern Spanish population which can have important implication in clinical investigation. Supporting information S1 Table. Summary of characteristics of previously reported studies for TMEM230 (up to April 2018). (PDF) Acknowledgments We thank the patients and healthy individuals who participated in this study for their cooperation. This research has been conducted using samples from the HUVR-IBiS Biobank (Andalusian Public Health System Biobank and ISCIII-Red de Biobancos PT13/0010/0056). Table 2. Variants identified in TMEM230 in our population. Chromosome position & Variant § Maf PD population (Pres/Abs) Nucleotide change Aminoacid change rs number 1000 genomes # ExAc ESP Chr20: 5093685 c.-11C>T - rs368686615 NI 0 0 Abs Chr20: 5092233 c.87G>A p.Ser29Ser rs186628284 NI NI NI Abs Chr20: 5092141 c.174+5G>C - rs10221980 0.103 0.3214 NI Pres Chr20: 5090076 c.190A>G p.Met64Val - NI NI NI Pres Chr20: 5090075 c.191T>C p.Met64Thr rs141394228 0.004 0.0018 0.0015 Pres Chr20: 5090057 c.209A>G p.Asn70Ser rs776037148 NI 1.5 e-05 NI Abs Chr20: 5086939 c.306T>A p.Pro102Pro rs6116651 0.0905 0.1114 0.1093 Pres Chr20: 5086918 c.327C>T p.Ile109Ile rs147693982 0.0169 0.0162 0.0181 Pres Chr20: 5086915 c.330A>G p.Ala110Ala rs6107576 0.0099 0.0126 0.0136 Pres Chr20: 5086870 c.375A>G p.Ile125Met rs148033002 0.001 0.0012 0.0008 Pres Chr20: 5081478 c.511C>T p.Arg171Cys rs143571424 0 0.0039 0.0020 Abs Chr20: 5080819 c.618A>G - rs183551373 0 0 NI Abs Chr20: 5079983 c.670T>C - NI NI NI Pres Chr: chromosome; &: GRCh37/hg19) §: referred to the longest TMEM230 isoform (NM_001009923, NP_001009923) #: European population ExAC: Exome Aggregation Consortium (Non-Finnish European) ESP: Exome Sequencing Project (European American); NI: No information. Pres/Abs: present or absent in our analyzed PD population https://doi.org/10.1371/journal.pone.0197271.t002 TMEM230 in PD Spanish population PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0197271 May 17, 2018 3 / 5
Author Contributions Conceptualization: Pilar Go ´mez-Garre, Pablo Mir. Data curation: Cristina Tejera-Parrado, Silvia Jesu ´s. Formal analysis: Cristina Tejera-Parrado, Silvia Jesu ´s, Marı ´a Teresa Periña ´n. Funding acquisition: Pilar Go ´mez-Garre, Pablo Mir. Investigation: Cristina Tejera-Parrado, Adria ´n Lo ´pez-Ruı ´z, Dolores Buiza-Rueda, Marta Bonilla-Toribio, Inmaculada Bernal-Bernal. Resources: Cristina Tejera-Parrado, Silvia Jesu ´s, Laura Vargas-Gonza ´lez. Supervision: Pilar Go ´mez-Garre, Pablo Mir. Visualization: Silvia Jesu ´s. Writing – review & editing: Cristina Tejera-Parrado, Silvia Jesu ´s, Pilar Go ´mez-Garre, Pablo Mir. References 1. Trinh J, Farrer M. Advances in the genetics of Parkinson disease. Nature reviews Neurology. 2013; 9 (8):445–54. https://doi.org/10.1038/nrneurol.2013.132 PMID: 23857047 2. Deng HX, Shi Y, Yang Y, Ahmeti KB, Miller N, Huang C, et al. Identification of TMEM230 mutations in familial Parkinson’s disease. Nature genetics. 2016; 48(7):733–9. https://doi.org/10.1038/ng.3589 PMID: 27270108 3. Buongarzone G, Monfrini E, Franco G, Trezzi I, Borellini L, Frattini E, et al. Mutations in TMEM230 are rare in autosomal dominant Parkinson’s disease. Parkinsonism & related disorders. 2017; 39:87–8. 4. Giri A, Mok KY, Jansen I, Sharma M, Tesson C, Mangone G, et al. Lack of evidence for a role of genetic variation in TMEM230 in the risk for Parkinson’s disease in the Caucasian population. Neurobiology of aging. 2017; 50:167 e11–e13. 5. Ibanez L, Dube U, Budde J, Black K, Medvedeva A, Davis AA, et al. TMEM230 in Parkinson’s disease. Neurobiology of aging. 2017; 56:212 e1–e3. 6. Quadri M, Breedveld GJ, Chang HC, Yeh TH, Guedes LC, Toni V, et al. Mutations in TMEM230 are not a common cause of Parkinson’s disease. Movement disorders: official journal of the Movement Disorder Society. 2017; 32(2):302–4. 7. Shi CH, Li F, Shi MM, Yang ZH, Mao CY, Zhang SY, et al. Genetic analysis of the TMEM230 gene in Chinese Han patients with Parkinson’s disease. Scientific reports. 2017; 7(1):1190. https://doi.org/10. 1038/s41598-017-01398-9 PMID: 28446760 8. Wu H, Zheng X, Cen Z, Xie F, Chen Y, Lu X, et al. Genetic analysis of the TMEM230 gene in Chinese patients with familial Parkinson disease. Parkinsonism & related disorders. 2017; 36:105–6. 9. Yan W, Tang B, Zhou X, Lei L, Li K, Sun Q, et al. TMEM230 mutation analysis in Parkinson’s disease in a Chinese population. Neurobiology of aging. 2017; 49:219 e1–e3. 10. Yang X, An R, Xi J, Zheng J, Chen Y, Huang H, et al. Sequencing TMEM230 in Chinese patients with sporadic or familial Parkinson’s disease. Movement disorders: official journal of the Movement Disorder Society. 2017; 32(5):800–2. 11. Baumann H, Wolff S, Munchau A, Hagenah JM, Lohmann K, Klein C. Evaluating the role of TMEM230 variants in Parkinson’s disease. Parkinsonism & related disorders. 2017; 35:100–1. 12. Conedera SA, Li Y, Funayama M, Yoshino H, Nishioka K, Hattori N. Genetic analysis of TMEM230 in Japanese patients with familial Parkinson’s disease. Parkinsonism & related disorders. 2018; 48:107– 8. 13. Fan TS, Lin CH, Lin HI, Chen ML, Wu RM. Lack of TMEM230 mutations in patients with familial and sporadic Parkinson’s disease in a Taiwanese population. American journal of medical genetics Part B, Neuropsychiatric genetics: the official publication of the International Society of Psychiatric Genetics. 2017; 174(7):751–6. 14. He YC, Huang P, Li QQ, Sun Q, Li DH, Wang T, et al. TMEM230 stop codon mutation is rare in parkinson’s disease and essential tremor in eastern China. Movement disorders: official journal of the Movement Disorder Society. 2017; 32(2):301–2. TMEM230 in PD Spanish population PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0197271 May 17, 2018 4 / 5
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102 secuencia y está presente en dos controles y un paciente, por lo que parece que su efecto no es deletéreo. Se identificó además otra variación no descrita en la región 3’-UTR (c.*670T>C), pero estaba presente tanto en controles como en pacientes. Ninguna de las variaciones identificadas se encontraban en pacientes de EP familiar. Tampoco se localizaron variaciones descritas previamente relacionadas con la EP. En cuanto a las variaciones más frecuentes, su presencia era similar en los dos grupos de estudio (c.174+5G>C, p.A110A y p.P102P). Los resultados derivados de este trabajo sugieren que el gen TMEM230 no está implicado en la EP, al menos en la población de este estudio.
103 2. Objetivo 2: Replicación de 5 loci de riesgo para la EP, previamente asociados a una cohorte de EP de Granada, en otra cohorte independiente del sur de España. 2.1. Manuscrito en vías de publicación: A replication study of GWAS-genetic risk variants associated with Parkinson’s disease in a Spanish population: a case-control study and meta-analysis. Tejera-Parrado C, Jesús S, Periñán MT, Buiza-Rueda D, Oliva-Ariza G, Adarmes-Gómez AD, Macías-García D, Gómez- Garre P, Mir P.
104
105 A replication study of GWAS-genetic risk variants associated with Parkinson’s disease in a Spanish population: a case-control study and meta-analysis. Cristina Tejera‐Parrado1, Silvia Jesús1,2, María T Periñán1,2, Dolores Buiza‐Rueda1,2, Guillermo Oliva‐Ariza1, Astrid D Adarmes‐Gómez1,2, Daniel Macías‐García1,2, Pilar Gómez‐Garre1,2*, Pablo Mir1,2*. 1Unidad de Trastornos del Movimiento, Servicio de Neurología y Neurofisiología Clínica, Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla, Sevilla, España. 2Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED), Madrid, España * Corresponding authors: Dr. Pilar Gómez‐Garre and Dr. Pablo Mir Unidad de Trastornos del Movimiento Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) Hospital Universitario Virgen del Rocío Avda. Manuel Siurot s/n. 41013 Seville, Spain Fax: +34‐955923101 Telephone: +34‐955923039 e‐mail: mgomez‐[email protected] / p[email protected]
106 Abstract Recently, 5 previously Parkinson’s disease (PD)‐related loci: ACMSD/TMEM163, STK39, MIR4697, SREBF/RAI1PD and MAPT, have been associated to PD in a Southern Spanish population. However, due to the small sample size of the cohort, this association did not reach genome wide significance. Our aim was to investigate the robustness of this association in a larger and independent cohort from the South of Spain. Variants were genotyped employing TaqMan SNP Genotyping Assay and high resolution melting analysis in 738 PD patients and 1138 healthy controls. Furthermore, a meta‐analysis study was carried out with both cohorts. In the replication analysis, only two loci (ACMSD/TMEM16 and MAPT) were replicated with a Bonferroni significance level. In the meta‐analysis study no loci reached a genome‐wide significance level (P<5xE‐8), but a suggestive association (P‐value = 1.04E‐6) between rs6430538 (ACMSD/TMEM163) and an increased risk of PD was found. In addition, rs9468 (MAPT) was associated with a decreased risk of PD (P‐value = 5.70E‐7). Our results add further support for the genetic involvement of these two loci in the susceptibility to PD in population from the South of Spain. We believe that our findings will be very useful for future genetic studies on PD. Keywords: Parkinson’s disease, Genome wide association studies, GWAS, genetic risk, Spanish population
107 1. Introduction Parkinson’s disease (PD) is the second most frequent neurodegenerative disorder affecting approximately 1% of the population over the age of 60 years. However, the etiology underlying the development of PD remains unclear. Broad efforts are being made to identify genes involved in the development of PD. While high penetrant pathogenic mutations causative of dominant or recessive forms of the disease are rare in the population, most PD cases are sporadic [5]. A combination of low penetrant variants, but also common variants and environmental factors, seems to be the cause of sporadic parkinsonism [13]. Last years, many Genome‐Wide Association Studies (GWAS) have identified risk loci to contribute to PD [2, 4, 6, 8, 10, 11]. In 2014, Nalls et al. reported 24 risk loci for PD in a large scale meta‐analyses study of all PD GWAS of European ancestry existing so far [7]. It is well known that replication studies in other populations are essential to check the reliability of these GWAS. Therefore, in 2016, Bandrés‐Ciga et al. reported a marginal association (nominal P‐value <0.05) of 5 of those 24 previously reported PD loci (ACMSD/TMEM163, MIR4697, SREBF/RAI1, MAPT, and STK39) through a GWAS in an independent Spanish cohort from Granada [1]. However, results from that study were limited because of the small sample size of the studied cohort (240 PD cases and 192 healthy controls). Consequently, the purpose of the present study was to investigate whether there was a link between those variants in ACMSD/TMEM163, MIR4697, SREBF/RAI1, MAPT, and STK39 loci, and PD in a larger independent PD cohort also from the South of Spain. Furthermore, we performed a meta‐analysis that combined our data with those of Bandrés‐Ciga et al, to understand the role of these risk variants in our population.
108 2. Methods 2.1 Patients We included a total of 738 PD patients (432 males and 306 females, mean age 65.4±11.5 years, mean age of onset 55.3±12.6 years) from the Movement Disorders Unit of the Hospital Universitario Virgen del Rocío (Seville, Spain) and 1138 healthy controls (HC) (646 males and 492 females, mean age 58.4±15.3 years). Demographic characteristics are shown in Table 1. PD was diagnosed using the criteria of the United Kingdom Parkinson’s Disease Society Brain Bank [3]. Patients were clinically evaluated by movement disorders specialists and an extensive set of clinical features were obtained. Peripheral blood samples were obtained from each subject. 2.2 Ethical Statements The study was approved by the ethic committee of the Hopsital Virgen del Rocío de Sevilla and conducted according to the principles expressed in the Helsinki Declaration. Signed consent forms were obtained from each individual studied (both patients and healthy controls) before to blood withdrawal. 2.3 Genetic analysis 2.3.1. DNA isolation Genomic DNA was isolated from peripheral blood from each subject according to established protocols with standard or automated methods (MagNA Pure LC, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA). DNA quantification was determined by Qubit 3.0 fluorometer (Invitrogen) and DNA purity was assessed by the NanoDrop2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Florida, USA). In addition, a quality control was stablish checking sex inconsistencies. 2.3.2. Genotyping
109 Five risk variants with nominal uncorrected P‐value<0.05 from Bandrés‐Ciga’s study were selected for genotyping in our population. Those were rs6430538 (in ACMSD/TMEM163 loci), rs329648 (in MIR4697 loci), rs11868035 (in SREBF/RAI1 loci), rs17649553 (in MAPT loci) and rs1955337 (in STK39 loci). The first four variants were genotyped using TaqMan SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems) in a LightCycler480 (Roche Applied Science). The SNP rs1955337 was analyzed by high‐resolution melting analysis and subsequent DNA sequencing for those samples showing abnormal melting profiles. 2.3.3 Association analysis Genotyped samples were excluded if they failed in more than one genotyped variant. An association analysis of the variants was carried out with PLINK software [9]. Allelic association between cases and controls and Hardy‐Weinberg equilibrium in the control group were tested by Chi‐square test. The Bonferroni method was used to adjust the significance level for multiple comparisons. Therefore, statistically signification threshold was stablished in nominal P‐value < 0.01. Quality controls were applied as follow: remove SNPs with P< 0.01 in a Hardy‐ Weinberg equilibrium test, genotype call rate less than 90%, or MAF less than 1%. 2.3.4. Meta-analysis The meta‐analysis with the Granada cohort [1] and our cohort from Seville was conducted using PLINK software. Heterogeneity between the studies was assessed using the Q‐statistic and its derived metric I2. When no heterogeneity was observed, that is P‐value of Q test (PQ) greater than 0.1 and I2 less than 50%, the pooled OR would be estimated using fixed‐effect models. Otherwise, random‐effect models would be applied for the analyses. 3. Results Demographic characteristics of both Spanish populations are described in Table 1. Our cohort was showed to be similar overall to the cohort from Granada, but the average age at onset of
the affected subjects from our cohort was statistically younger than those from the Granada study (P-value = 1.4E‐10). Table 1. Demographic characteristics of both Spanish populations Whole All N (% males) 1876 (57.46) 738 (58.54) 193 (59.07) Age (Y ± SD) 61,2 ± 14,4 65.4 ± 11.5 62.6 ± 11.7 AAO (Y± SD) ‐ 55.3 ± 12.6 51.6 PD: Parkinson's D isease; HC: Healthy AAO: Age At Onset. 3.1 Association analysis in Seville cohort Each locus was genotyped in more than 95% of individuals. Around genotyped twice or thrice to check genotyping consistency, showing 100% identical genotypes. All variants were in Hardy‐ Weinberg equilibrium in the con minor allele frequency greater than 5%. SNP rs17649553, in MAPT, had to be excluded because of assay failure. Therefore, it was replaced by the SNP rs9468, which was also in with the SNP rs17649553. Table 2. Association analyses of the genotyped SNPs with PD in our popula SNP: Single Nucleotide Polymorphism; BP: Base position in the chromosome Parkinson's disease patients ; HC: Healthy Controls, N: N Interval; Adj: Adjusted for age; P recessive model. The genotype distribution of rs1955337 (STK39 ), were significantly associated to PD 110 the affected subjects from our cohort was statistically younger than those from the Granada Demographic characteristics of both Spanish populations Seville PD HC Whole Familial Non‐familial 193 (59.07) 545 (58.35) 1138 (56.77) 432 (55.56) 62.6 ± 11.7 66.5 ± 11.3 58.4 ± 15.3 63.14 ± 51.6 ± 13.2 56.6 ± 12.1 ‐ ‐ isease; HC: Healthy Controls; N: Number of samples; Y: Y ears; SD: Standard Seville cohort Each locus was genotyped in more than 95% of individuals. Around 4. 5% of the samples were genotyped twice or thrice to check genotyping consistency, showing 100% identical genotypes. Weinberg equilibrium in the control individuals and all of them h minor allele frequency greater than 5%. The main genotypic features are shown in Table 2. had to be excluded because of assay failure. Therefore, it was replaced by the SNP rs9468, which was also in MAPT and in perfect linkage disequilibrium (LD) Association analyses of the genotyped SNPs with PD in our population Single Nucleotide Polymorphism; *: In perfect linkage disequilibrium with rs17649553; position in the chromosome ; A1: Reference allele; A2: Alternate allele; MAF: M ; HC: Healthy Controls, N: N umber of samples ; OR: Odds Ratio; CI: Confidence P geno: Genotypic P‐value; Pdom: P‐value for dominant model; The genotype distribution of three SNPs, rs9468 (MAPT), rs6430538 ( ACMSD/TMEM16 ), were significantly associated to PD (adjusted P‐ value the affected subjects from our cohort was statistically younger than those from the Granada Granada Whole PD HC 432 (55.56) 240 (64.56) 192 (44.77) 63.14 ± 13 67.4 ± 11 58.07 ± 14 ‐ 61.9± 13.8 ‐ ears; SD: Standard Deviation; 5% of the samples were genotyped twice or thrice to check genotyping consistency, showing 100% identical genotypes. trol individuals and all of them h ad The main genotypic features are shown in Table 2. The had to be excluded because of assay failure. Therefore, it was and in perfect linkage disequilibrium (LD) tion from Seville. rs17649553; Chr: Chromosome; M inor Allele Frequency; PD: ; OR: Odds Ratio; CI: Confidence for dominant model; Prec: P‐value for ACMSD/TMEM16 ) and value < 0.01) in our
111 population (Table 2). Interestingly, the SNP rs9468 was associated with a decreased risk of PD in the dominant model (P‐value = 7.24E‐6; OR = 0.64; CI: 0.53 ‐ 0.78), while the SNP rs6430538 was associated with an increased risk of PD in the recessive model (P‐value = 7.38E‐6; OR = 1.74; CI: 1.4 ‐ 2.2). The SNP rs1955337 did not reach this high association with the PD risk, but a P‐value< 0.05 was observed in the dominant model (P‐value = 1.9E‐3; OR = 1.4; CI: 1.13 – 1.74). The other SNPs failed the association with PD in our population from Seville (Table 2). 3.2 Meta‐analysis with Granada cohort Finally, 944 PD patients (206 from the Granada cohort and 738 from our cohort) and 1310 healthy controls (172 from the Granada cohort and 1138 from our cohort) were included in the meta‐analysis study. All variants showed similar minor allele frequency in both Spanish populations (Supplementary Table). A certain degree of heterogeneity was observed only for allele contribution OR of the SNP rs329648. Our analysis revealed that no variant was PD related at genome‐wide significance level (P<5.0E‐8) in the Spanish population. However, rs6430538 (ACMSD/TMEM163) and rs9468 (MAPT) showed a suggestive adjusted for age P‐ values. This study also suggests that loci SREBF/RAI1, STK39 and MIR4697 are not related with PD, at least in population from the South of Spain (Table 3). Table 3. Results from meta‐analysis with Southern Spanish cohorts Locus SNP PQ I2 Het obs? P‐value OR (95% CI) MAPT rs9468* 0.6475 0.00 No 5.70E‐7 0.69 (0.6 – 0.8) ACMSD/TMEM163 rs6430538 0.5405 0.00 No 1.04E‐6 1.38 (1.21 – 1.57) STK39 rs1955337 0.1963 40.10 No 2.43E‐4 1.41 (1.18 – 1.70) SREBF/RAI1 rs11868035 0.2451 25.97 No 9.10E‐3 0.83 (0.72 – 0.95) MIR4697 rs329648 0.1292 56.56 Yes 0.1818 1.2 (0.92 – 1.56) SNP, Single Nucleotide Polymorphism; PQ, P‐value of Cochran’s Q test; Het obs, Heterogeneity between the studies observed; OR, Odds Ratio; CI, Confidence Interval.
118 Supplementary figures captions Supplementary Figure 1. Forest plot of rs9468* meta-analysis on Parkinson’s disease. Results of meta‐analysis for allelic model. Supplementary Figure 2. Forest plot of rs6430538 meta-analysis on Parkinson’s disease. Results of meta‐analysis for allelic model. Supplementary Figure 3. Forest plot of rs1955337 meta-analysis on Parkinson’s disease. Results of meta‐analysis for allelic model. Supplementary Figure 4. Forest plot of rs11868035 meta-analysis on Parkinson’s disease. Results of meta‐analysis for allelic model. Supplementary Figure 5. Forest plot of rs329648 meta-analysis on Parkinson’s disease. Results of meta‐analysis for allelic model.
119 Supplementary Figure 1. Supplementary Figure 2.
120 Supplementary Figure 3. Supplementary Figure 4.
121 Supplementary Figure 5.
122 Supplementary Table. Data from Association analysis in Seville cohort, Granada cohort and Nalls’ meta‐analysis cohort. Locus SNP Seville cohort Granada cohort Nalls’ metaanalysis cohort M A MAF OR M A MAF OR M A MAF OR MAPT rs1764955 3 C* 0.27 8 0.69 9 T 0.30 7 0.63 2 T 0.22 6 0.76 9 ACMSD/TMEM16 3 rs6430538 C 0.42 8 1.35 7 C 0.41 1 1.53 3 T 0.43 0 0.87 5 STK39 rs1955337 T 0.14 7 1.37 3 T 0.17 9 2.34 6 T 0.12 8 1.21 4 SREBF/RAI1 rs1186803 5 A 0.29 7 0.85 3 A 0.29 2 0.65 8 A 0.29 8 0.93 9 MIR4697 rs329648 T 0.42 4 1.08 6 T 0.43 4 1.44 3 T 0.35 4 1.10 5 SNP, Single Nucleotide Polymorphism; MA, Minor Allele; MAF, Minor Allele Frequency; OR, Odds Ratio; *Due to problems with the genotyping of the SNP rs17649553, in our study it was replaced by rs9468, in perfect LD.
123 2.2. Resumen En los últimos años, muchos estudios GWA han identificado loci de riesgo que contribuyen al desarrollo de la EP. Pero no fue hasta 2014 que Nalls y col. realizaron un extenso meta-análisis de todos los estudios GWA publicados hasta la fecha en población de descendencia europea, logrando identificar 24 loci de riesgo para la EP. Para confirmar estos resultados es necesario que se realicen sucesivos estudios de replicación en diferentes cohortes y grupos étnicos. Bandrés-Ciga y col. en 2016 estudiaron los factores genéticos de riesgo asociados a la EP en población de Granada, en el sur de España, a través de un GWAS. De los 24 loci identificados por Nalls y col., encontraron que sólo 5 de ellos se mantenían asociados a la EP (p nominal <0,05). Sin embargo, los resultados de este estudio son limitados debido al pequeño tamaño de la cohorte analizada (240 pacientes de EP y 192 controles). Por ello, el propósito de este trabajo fue investigar la asociación de estos 5 loci de riesgo identificados en la población de Bandrés-Ciga y col. (ACMSD/TMEM163, MIR4697, SREBF/RAI1, MAPT y STK39) en una población mayor de EP, también del sur de España. Además, se realizó un meta-análisis combinando los resultados de ambas cohortes con el fin de comprender mejor el papel de estos loci en población del sur de España. Para ello se cuenta con una cohorte de 738 pacientes de EP de la Unidad de Trastornos del Movimiento del Hospital Universitario Virgen del Rocío (Sevilla, España), y 1138 controles sanos.
124 Tres SNPs se asociaron significativamente a la EP en nuestra población: rs6430538 (ACMSD/TMEM16), rs9468 (MAPT) y rs1955337 (STK39), con una p ajustada por edad < 0,01. El SNP rs9468 fue asociado a una disminución de riesgo de EP siguiendo un modelo dominante (p=7,24x10-6; OR=0,64; CI, 0,53 - 0,78), mientras que el SNP rs6430538 se asoció a un incremento de riesgo de EP siguiendo un modelo recesivo (p=7,38x 10- 6; OR=1,74; CI, 1,4 - 2,2). El SNP rs1955337 no alcanzó una asociación tan significativa, pero si mostró un patrón de herencia dominante con una p<0,05 (p= 0,0019; OR= 1,4; CI, 1,13 - 1,74). Los dos SNPs restantes no mostraron estar asociados a la EP en este estudio. Para realizar el meta-análisis se contaron finalmente con 944 pacientes de EP (206 de Bandrés-Ciga y col. y 738 de nuestra cohorte) y 1310 controles sanos (172 de Bandrés-Ciga y col. y 1138 de nuestra cohorte). Ninguno de los SNPs analizados mostraron estar asociados a la EP a un nivel de significación de genoma completo (p<5x10-8), aunque los SNPs rs6430538 (ACMSD/TMEM163) y rs9468 (MAPT) si mostraron una p ajustada por edad sugestiva (p<5x10-6). Se ha conseguido replicar en este estudio la asociacion de los loci ACMSD/TMEM16 y MAPT. El loci STK39 mostró una asociación moderada. Y en cuanto a los loci MIR4697 y SREBF/RAI1, no se ha replicado su asociación con la EP, al menos en población del sur de España.
125 IV. DISCUSIÓN GENERAL El esclarecimiento de las bases genéticas que subyacen tras las enfermedades complejas es una cuestión de gran interés, objeto de una intensa investigación por parte de la comunidad científica. Esta tesis doctoral se ha centrado en el estudio de factores genéticos que se encuentran involucrados en la predisposición a padecer la segunda enfermedad neurodegenerativa más frecuente en la población, la enfermedad de Parkinson. Y es que, a pesar de los avances logrados en los últimos años, la etipatogenia de la enfermedad continúa sin conocerse en gran medida. Además, en las enfermedades neurodegenereativas en las que la enfermedad va avanzando a lo largo del tiempo, resulta de crucial importancia su detección temprana cuando el proceso neurodegenerativo ya ha comenzado pero no hay síntomas que lleven al diagnóstico de la enfermedad. Identificar la enfermedad en esta ventana temporal resulta de gran importancia para poder poner en práctica una terapia neuroprotectora. La aplicación temprana de este tipo de terapia, podría disminuir considerablemente el impacto de la enfermedad y su evolución. La mejora del conocimiento de las bases genéticas de las enfermedades complejas ayuda a la comprensión de las bases moleculares y de los mecanismos fisiopatológicos subyacentes. Con este tipo de estudios se puede contribuir a la identificación de nuevos marcadores útiles para el diagnóstico temprano, mejor pronóstico, tratamiento personalizado e incluso constituir nuevas dianas terapéuticas contra las que diseñar nuevos fármacos. Este trabajo se ha enfocado por una parte en el estudio de la contribución de genes descritos causativos o de riesgo para la EP, y por otra parte, en el estudio de replicación de 5 loci de riesgo previamente asociados con la EP en población del sur de España. Con ello se pretende contribuir a esclarecer los factores genéticos involucrados en la EP.
126 1. Objetivo 1: Estudiar la implicación en la fisiopatogenia de la EP de genes causativos de formas monogénicas de EP. 1.1. Sub-objetivo 1: Estudiar exhaustivamente 17 genes relacionados con la EP y otros parkinsonismos en pacientes de inicio temprano de la Comunidad de Madrid. En este trabajo se han examinado 17 genes previamente relacionados con la EP mediante secuenciación masiva y MLPA en 117 pacientes de EP procedentes de la región central de España. 27 pacientes de los 117 estudiados (23,08%) tenían variaciones potencialmente patogénicas en genes robustamente asociados con la EP. Las variaciones patogénicas en el gen PARK2 son la causa más frecuente de EPIT de herencia autosómica recesiva, con una prevalencia variable entre los diferentes estudios (Macedo y col., 2009; Koziorowski y col., 2013; Alcalay y col., 2010). En el presente estudio, la causa más frecuente de EP fueron las mutaciones en este gen (13,68%, 16 pacientes de 117), siendo una variación conocida, la p.N52fs, la más frecuente (6,4%, 15/234; Spataro y col 2017). En un trabajo previo en 72 pacientes de EPIT del País Vasco sólo se localizó esta variación en homocigosis en 1 paciente (1,4%, 2/244; Gorostidi y col., 2016). Sí que fue similar la frecuencia con la que se identificó en un estudio previo del sur de España de 26 pacientes de EPIT (5,8%; 3/52; Bandrés-Ciga y col., 2016). Estos resultados sugieren que aunque esta mutación está altamente extendida por todo el mundo, es menos prevalente en población vasca y podría estar asociada al efecto de un fundador y la consiguiente dispersión de la misma. Resulta interesante un paciente (EP-17) que tenía la mutación p.N52fs en homocigosis en el gen PARK2, y también era portador de una variación genética en ATP13A2
127 (c.2762+21T>C), considerada patogénica por las herramientas bioinformáticas afectando al sitio de splicing. La edad de inicio de este paciente fue menor que la del resto de pacientes portadores de la mutación p.N52fs, lo que podría indicar un efecto aditivo entre ambas variaciones. Variaciones en el gen ATP13A2 se han descrito anteriormente relacionadas con ciertos tipos de parkinsonismo de inicio temprano (Ramírez y col., 2006). Aunque el papel de estas variaciones en heterocigosis continúa bajo estudio, se ha descrito su efecto como factor de riesgo, y se ha sugerido también que las neuronas dopaminérgicas que sobrexpresan la proteína ATP13A2 son menos susceptibles a la muerte celular (Ysselstein y col., 2019). Sin embargo, debido a la baja frecuencia de estas variaciones, para confirmar estas hipótesis es necesario secuenciar poblaciones mayores. Por otra parte, las mutaciones en LRRK2, una proteína multidominio con función GTPasa y kinasa, es la causa genetica más frecuente de EP de herencia autosómica dominante. Se han identificado más de 100 variaciones asociadas a la EP en este gen. La más frecuente es la p.G2019S y su prevalencia es muy variable según la población (Bandrés-Ciga y col., 2016, Lill, 2016, Hernández y col., 2016). En caucásicos su prevalencia está en torno al 4%, que es similar a la que se ha encontrado en este estudio (5 pacientes de 117, 4,27%). En total el 6,4% de los pacientes de este estudio tenían variaciones potencialmente patogénicas en este gen, sin diferencia en la edad de inicio respecto a aquellos que tenían variaciones en el gen PARK2. Nuestros resultados muestran el papel tan importante de LRRK2 en EPIT en población española. Las variaciones en el gen GIGYF2 se han relacionado anteriormente con EP familiar (Lautier y col., 2008), aunque no se ha demostrado en todos los casos (Bras y col., 2009; Guella y col, 2011; Bonetti y col., 2009). Un paciente de este estudio (EP-33) que tenía la variación c.4536+3A>G en LRRK2, que afecta al sitio de splicing, también era