Actividades enzimáticas de terribacillus SP. AE2B 122 con aplicaciones medioambientales

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA FACULTAD DE FARMACIA Actividades enzimáticas de Terribacillus sp. AE2B 122 con aplicaciones medioambientales Almudena Escobar Niño Sevilla, 2016 Memoria que presenta la Lcda. en Bioquímica Almudena Escobar Niño para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla ENCARNACIÓN MELLADO DURÁN, CATEDRÁTICA DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA Y DAVID CÁNOVAS LÓPEZ PROFESOR TITULAR DEL DEPARTAMENTO DE GENÉTICA, AMBQS DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA, INFORMAN: Que la Tesis Doctoral titulada: "Actividades enzimáticas de Terríbacillus sp. AE2B 122 con aplicaciones medioambientales", presentada por la Leda. en Bioquímica ALMUDENA ESCOBAR NIÑO, para optar al grado de Doctor, ha sido realizada en el Departamento de Microbiología y Parasitología y Departamento de Genética, ambos de la Universidad de Sevilla, bajo nuestra dirección, reuniendo los requisitos exigidos. Y para que así conste, expedimos y firmamos el presente informe en Sevilla, a 25 de Abril de 2016. Fdo.: Encarnación Mellado Durán MIGUEL ANGEL CAVIEDES FORMENTO, DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA Y ANDRÉS AGUILERA LÓPEZ, DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE GENÉTICA, AMBOS DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA, INFORMAN: Que la Tesis Doctoral titulada: "Actividades enzimáticas de Terribacil/us sp. AE2B 122 con aplicaciones medioambientales", presentada por la Leda. en Bioquímica ALMUDENA ESCOBAR NIÑO, para optar al grado de Doctor, ha sido realizada en el Departamento de Microbiología y Parasitología y Departamento de Genética, ambos de la Universidad de Sevilla, bajo la dirección de los Doctores Dña. ENCARNACIÓN MELLADO DURÁN y D. DAVID CÁNOVAS LÓPEZ. Y para que así conste, expedimos y firmamos el presente informe en Sevilla, a 25 de Abril2016. Fdo.: Miguel Ángel Caviedes Fe rmento La realización de esta Tesis Doctoral ha sido parcialmente financiada mediante las ayudas de los siguientes Proyectos de Investigación: Desarrollo de sistemas biológicos para la obtención de energías renovables (Biodiésel) (P08-RNM-3515). Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa de la Junta de Andalucía. 2009-2012. Extremozimas lipolíticas como catalizadores regioselectivos útiles en la síntesis de carbohidratos y polifenoles lipófilos (P11-CVI-7427 MO). Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa de la Junta de Andalucía. 2013-2016. AGRADECIMIENTOS En primer lugar, mi mayor agradecimiento a los Doctores Encarnación Mellado Duran y David Cánovas López por su confianza, apoyo y dirección durante el desarrollo de esta Tesis doctoral, sin su paciencia y sus consejos no habría sido posible la finalización de este trabajo ni el aprendizaje que para mí ha conllevado la realización del mismo. En segundo lugar, agradecer a la junta de Andalucía por la financiación recibida. Agradecer al Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis de Sevilla por su amabilidad al permitirnos el uso de sus instalaciones para la purificación de proteínas, en especial al técnico del Servicio de Cromatografía, Carlos Alberto Parejo Pérez, por su ayuda en el uso del FPLC. Me gustaría agradecer también al Doctor Carlos Luna Durán y en general al Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Córdoba, su colaboración en la realización de los análisis cromatográficos y su amabilidad a la hora de explicarme todo lo que he necesitado sobre el Biodiésel. Al Dr. Miguel Arévalo Rodríguez y a Juan Carlos Martínez Reyes, de la empresa Biomedal, por su ayuda en la sobreexpresión de proteínas. Agradecer a mis compañeros y amigos del Departamento de Genética, Ana, María, Leyre, Isidro, Nacho, Leandro, Violeta, Eugenio, Ani, Ale y María del Mar, por su ayuda en lo relacionado a la ciencia y por su compañía y amistad, que me hacen recordar con cariño hasta los momentos más difíciles de estos años de doctorado. Por último, deseo expresar mi agradecimiento a mi pareja y a mi familia por su apoyo incondicional a lo largo de este trayecto, ofreciéndome su cariño y comprensión siempre que lo he necesitado, en especial, a mi abuela, que vivió con orgullo el inicio y desarrollo de este trabajo sin poder presenciar su final. Muchas gracias a todos ÍNDICE 1. RESUMEN .......................................................................................................................................... 3 2. OBJETIVOS ........................................................................................................................................ 9 3. CAPÍTULO I ...................................................................................................................................... 13 3.1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 13 3.1.1. Biodiésel: Producción y enfoque actual ............................................................................. 13 3.1.2. Lipasas ................................................................................................................................... 19 3.1.2.1. Lipasas: características generales ..................................................................................... 19 3.1.2.2. Mecanismo de acción de las lipasas .................................................................................. 21 3.1.2.3. Condiciones óptimas de actuación de las lipasas .............................................................. 26 3.1.2.4. Clasificación de las enzimas lipolíticas bacterianas ........................................................... 27 3.1.2.5. Lipasas como catalizadores en la producción de Biodiésel ............................................... 32 3.1.3. Tecnologías de producción de Biodiésel que integran el glicerol ................................... 37 3.1.3.1. Método del dimetil carbonato ............................................................................................. 38 3.1.3.2. Método del acetato de metilo y acetato de etilo ................................................................. 39 3.1.3.3. Producción de Biodiésel con lipasas 1,3-regioespecíficas ................................................. 40 3.2. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................................... 45 3.2.1. Material biológico .................................................................................................................. 45 3.2.1.1. Cepas bacterianas .............................................................................................................. 45 3.2.1.2. Plásmidos ........................................................................................................................... 45 3.2.1.3. Conservación de las cepas ................................................................................................ 47 3.2.2. Medios y condiciones de cultivos ........................................................................................ 47 3.2.2.1. Medios de cultivo para la selección de organismos lipolíticos ........................................... 47 3.2.2.2. Análisis de las actividades hidrolíticas .............................................................................. 49 3.2.2.3. Medios para el crecimiento de las cepas de E. coli ............................................................ 49 3.2.3. Compuestos antimicrobianos .............................................................................................. 50 3.2.4. Procesamiento de las muestras de suelo ........................................................................... 50 3.2.5. Extracción, manipulación y purificación de ADN ............................................................... 51 3.2.5.1. Extracción y purificación de ADN ....................................................................................... 51 3.2.5.2. Manipulación del ADN ........................................................................................................ 53 3.2.5.3. Secuenciación y análisis del ADN ...................................................................................... 61 3.2.6. Extracción y análisis de ARN ............................................................................................... 63 3.2.6.1. Extracción de ARN ............................................................................................................. 63 3.2.6.2. Análisis del ARN................................................................................................................. 64 3.2.6.3. Análisis del ARN por RT-qPCR ......................................................................................... .64 3.2.7. Obtención de fracciones celulares bacterianas ................................................................. 66 3.2.8. Ensayos de actividad lipolítica ............................................................................................ 67 3.2.8.1. Aislamiento de microorganismos con actividad lipolítica (hidrólisis de tributirina en placa) ................................................................................................................................................. 67 3.2.8.2. Ensayo de actividad hidrolítica con MUF-Butirato (zimograma y placa multipocillo) ........ 67 3.2.8.3. Ensayo de actividad transesterificadora usando para-nitrofenol palmitato (p-NPP) ......... 68 3.2.8.4. Ensayo de actividad hidrolítica del p-NPP ......................................................................... 71 3.2.8.5. Determinación de la concentración de proteínas ............................................................... 72 3.2.9. Análisis del Biodiésel ........................................................................................................... 73 3.2.9.1. Producción de Biodiésel a escala de laboratorio, cinética y reutilización .......................... 73 3.2.9.2. Cromatografía de gases (CG) ........................................................................................... 74 3.2.9.3. Determinación de la viscosidad.......................................................................................... 75 3.2.10. Ensayo in vitro de producción de proteínas.................................................................... 76 3.2.11. Sobreexpresión de las lipasas/esterasas candidatas a partir de E. coli BIVU111 ....... 78 3.2.12. Purificación de las lipasas/esterasas con actividad transesterificadoras a partir de Terribacillus sp. AE2B 122 .................................................................................................... 79 3.2.13. Análisis de proteínas .......................................................................................................... 81 3.2.13.1. Electroforesis desnaturalizante de proteínas (SDS-PAGE) ............................................ 81 3.2.13.2. Tinción de proteínas en geles de acrilamida .................................................................... 83 3.3. RESULTADOS ............................................................................................................................ 87 3.3.1. Selección y caracterización de microorganismos productores de Biodiésel ................. 87 3.3.1.1. Zona de muestreo y análisis .............................................................................................. 87 3.3.1.2. Primer paso de la selección: aislamiento de microorganismos con actividad lipolítica (hidrólisis) ............................................................................................................................... 90 3.3.1.3. Segundo paso de selección: análisis de la actividad transesterificadora en las bacterias lipolíticas aisladas .................................................................................................................... 91 3.3.1.4. Tercer paso del método de selección: selección de sobrenadantes bacterianos capaces de producir Biodiésel a escala de laboratorio .......................................................................... 92 3.3.1.5. Medidas de la viscosidad ................................................................................................... 98 3.3.1.6. Análisis filogenético de las bacterias productoras de Biodiésel ......................................... 99 3.3.1.7. Caracterización de las actividades hidrolíticas de las bacterias productoras de Biodiésel ................................................................................................................................. 103 3.3.2. Estrategias para la identificación y aislamiento de los genes y proteínas responsables de la actividad transesterificadora de Terribacillus sp. AE2B 122 ................................. 105 3.3.2.1. Estrategia 1. Secuenciación y análisis bioinformático del genoma de Terribacillus sp. AE2B 122 ............................................................................................................................... 105 3.3.2.2. Estrategia 2. Análisis del secretoma de Terribacillus sp. AE2B 122 ................................ 110 3.3.2.3. Estrategia 3. Análisis de la expresión de las 8 lipasas/esterasas candidatas por RT-qPCR ................................................................................................................................ 112 3.3.2.4. Estrategia 4. Producción in vitro de las lipasas candidatas y comprobación de su actividad transesterificadora .................................................................................................. 115 3.3.2.5. Estrategia 5. Sobreexpresión de las lipasas candidatas de Terribacillus sp. AE2B 122 en E. coli BIVU111 ................................................................................................................ 117 3.3.2.6. Estrategia 6. Purificación de la proteína responsable de la actividad transesterificadora a partir del sobrenadante del cultivo de Terribacillus sp. AE2B 122 ...................................... 125 3.4. DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 143 3.4.1. Selección y caracterización de cepas productoras de Biodiésel ................................... 143 3.4.2. Identificación de las proteínas responsables de la actividad transesterificadora de Terribacillus sp. AE2B 122. Análisis genéticos ................................................................ 152 4. CAPÍTULO II ................................................................................................................................... 163 4.1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................... 163 4.1.1. Género Terribacillus ............................................................................................................ 163 4.1.2. Resistencia a metales ......................................................................................................... 164 4.1.2.1. Resistencia a arsénico ..................................................................................................... 164 4.1.2.2. Homeostasis de metales esenciales (cobalto, zinc, cadmio y cobre) ............................. 170 4.1.2.3. Resistencia a cromo ......................................................................................................... 174 4.2. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................... 181 4.2.1. Material biológico ................................................................................................................ 181 4.2.1.1. Cepas bacterianas ............................................................................................................ 181 4.2.1.2. Plásmidos ......................................................................................................................... 181 4.2.2. Medios y condiciones de cultivo ........................................................................................ 182 4.2.2.1. Medios para el estudio de resistencia a metales en medio líquido .................................. 183 4.2.2.2. Medios para el crecimiento de las cepas de E. coli .......................................................... 183 4.2.3. Compuestos antimicrobianos ............................................................................................ 184 4.2.4. Extracción, manipulación y purificación de ADN ............................................................. 184 4.2.4.1. Cebadores para amplificación por PCR ........................................................................... 185 4.2.5. Complementación heteróloga de E. coli AW3110 con los genes ars de Terribacillus sp. AE2B 122 ............................................................................................. 186 4.2.6. Extracción y análisis del ARN ............................................................................................ 189 4.3. RESULTADOS ........................................................................................................................... 193 4.3.1. Caracterización de la resistencia a metales de Terribacillus sp. AE2B 122 .................. 193 4.3.2. Análisis de la resistencia a metales en medio líquido de Terribacillus sp. AE2B 122 . 199 4.3.3. RT-qPCR de los genes de resistencia a arsénico de Terribacillus sp. AE2B 122 ......... 203 4.3.4. Expresión heteróloga de los genes ars de Terribacillus sp. AE2B 122 en E. coli ........ 205 4.4. DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 215 5. CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 225 6. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 229 ~ I ~ ÍNDICE DE ABREVIATURAS A: Adenina ADN: Ácido Desoxirribonucleico AE1B: Almazara Écija Balsa 1 AE2B: Almazara Écija Balsa 2 AEA: Almazara Écija Alpechín AEDH: Almazara Écija Deshidratado de Hojas Aio/ Aox/Aro/Aso: Nomenclaturas de genes de arsenito oxidasas AmpR: Resistencia a ampicilina ARN: Ácido Ribonucleico ATP: Adenosina trifosfato (Adenosin Tri-Phosphate) AZCL: Polisacáridos anclados a azurina (Azurine-Crosslinked Polysaccharides) BSA: Albúmina de suero bovino (Bovine Serum Albumin) C.E: Conductividad Electrónica CAT: Cloranfenicol Acetil Transferasa Ce: Coeficiente de extinción molar CE: Control de fracción extracelular CEM: Cromatografía de Exclusión Molecular CG: Cromatografía de Gases CI: Control de fracción intracelular CIH: Cromatografía de Interacción Hidrofóbica CmR: Resistencia a Cloranfenicol Cpf: Concentración de proteína en la fracción celular Cps: Concentración de proteína soluble cSt: Centistokes DDBJ: Base de datos japonesa de ADN (DNA Data Bank of Japan) DG: Diglicérido DGMC: Diglicéridos Metil Carbonato DMA: Dimetil-Arsina DMAA: Dimetil Arsenito y Arseniato DMA-III: Dimetil Arsenito DMA-V: Dimetil Arseniato ~ II ~ DO: Densidad Óptica E-acil: Intermediario acil-Enzima EMBL: Laboratorio europeo de biología molecular (European Molecular Biology Laboratory) ES: Complejo Enzima-Sustrato EXPASY: Sistema de análisis de proteínas (Expert Protein Analysis System) FAE: Éster de ácidos grasos (Fatty Acid Ester) FAEE: Éster etílico de ácidos grasos (Fatty Acid Ethyl Ester) FAME: Éster metílico de ácidos grasos (Fatty Acid Methyl Ester) fd: Factor de dilución FID: Detector de ionización por llama (Flame Ionization Detector) FPLC: Cromatografía líquida rápida de proteína (Fast Protein Liquid Chromatography) Glu: Glucosa GmR: Resistencia a gentamicina GSH: Glutation reducido gyrA: Subunidad A de la girasa HMA: Dominio asociado a metales pesados (Heavy Metal Associated domain) I.D: Diámetro interno (Internal Diameter) IEA: Agencia internacional de la energía (International Energy Agency) INIBIC: Instituto de investigación biomédica IPTG: Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido K: Grado kelvin Kb: Kilobase KDa: Kilodaltons LB: Medio de cultivo Luria Bertani LBT: Medio LB adicionado con tributirina M.O: Materia Orgánica Mb: Megabases MG: Monoglicérido MGDMC: Monoglicérido Dimetil Carbonato min: Minuto MMA: Metil arsenito MPa: Megapascales NalR: Resistencia a ácido Nalidíxico ~ III ~ NCBI: Centro nacional de información biotecnológica (National Center for Biotechnology Information) NGS: Secuenciación de última generación (Next Generation Sequencing) ºC: Grados centígrados OCDE: Organización para la Cooperación y Desarrollo Económico ORF: Marco abierto de lectura (Open Reading Frame) p/v: Peso/volumen PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) pBC: Plásmido pBlueScript pbs: Pares de bases PCR: Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction) PDB: Medio de cultivo de patata y dextrosa (Potato Dextrose Broth) PEG: Polietilen Glicol Pi: Fosfato inorgánico PLA2: Fosfolipasa A2 plac: Promotor del operón lac PLPs: Proteínas semejantes a la patatina (Patatine Like Proteins) p-NP: Para-nitrofenol (p-Nitrophenol) p-NPP: Para-nitrofenol palmitato (p-Nitrophenol Palmitate) PPL: Lipasa pancreática porcina (Pancreatic Porcine Lipase) PSA: Persulfato Amónico PYAT: Medio PYA adicionado con tributirina RAST: Servidor de anotación rápida (Rapid Annotation Server) RBS: Sitio de unión del ribosoma (Ribosomal Binding Site) RDB: Base de datos del ARN ribosomal (Ribosomal Database) RND: Resistencia-Nodulación-División rpm: Revoluciones por minuto rpoB: Subunidad β de la ARN polimerasa bacteriana RT: Retrotranscripción RT-qPCR: Retrotranscripción-PCR cuantitativa SA: Sulfato de Amonio SAM: S-Adenonil Metionina SDS: Dodecilsulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulfate)  2. OBJETIVOS  ~ 9 ~ 2. OBJETIVOS Ante la previsión de que el petróleo se agote en las próximas décadas, la Comisión Europea ha indicado como uno de los objetivos fundamentales para los próximos años reducir la utilización del petróleo mediante la introducción de energías alternativas renovables y de menor impacto ambiental. En este sentido, el Biodiésel es uno de los biocarburantes que constituye una alternativa prometedora al gasóleo, puesto que tiene una serie de ventajas respecto al Diésel derivado del petróleo y además, puede ser utilizado en cualquier motor Diésel, sin que sea necesario ningún tipo de modificación con un rendimiento energético similar. Actualmente, el proceso que se realiza a nivel industrial para la producción de Biodiésel es una metanólisis química de aceites utilizando catalizadores alcalinos (KOH y NaOH) que conlleva varios inconvenientes de difícil solución. Por este motivo, el desarrollo de nuevas tecnologías alternativas para la producción de Biodiésel ha cobrado importancia. La principal línea alternativa consiste en el desarrollo de procesos biocatalíticos. La primera parte de este trabajo aborda la utilización de bacterias lipolíticas en la producción de este combustible. La segunda parte de este trabajo de Tesis Doctoral, se desarrolla en el contexto de otro problema medioambiental actual, la contaminación por metales pesados y el uso de microorganismos en la biorremediación. Las principales fuentes de contaminación por metales son o bien naturales (manantiales termales, zonas volcánicas y mineras…etc) o bien como consecuencia de la actividad humana (minería, industria, pesticidas, agricultura...etc). Los iones de los metales pesados y los metaloides pueden ser muy tóxicos para las células, mediante su unión a proteínas esenciales de la cadena respiratoria, daño oxidativo debido a la producción de especies reactivas de oxígeno, o mediante daño directo al ADN. Debido a esto, muchos microorganismos han desarrollado mecanismos de resistencia a estos metales mediante mecanismos de absorción, quelación y/o transporte. Por tanto, este trabajo de investigación busca contribuir a paliar los efectos medioambientales causados por la actividad industrial, en concreto, para el desarrollo de este trabajo se han establecido tres objetivos específicos: ~ 10 ~ 1. Selección de bacterias con capacidad de producción de Biodiésel, incluyendo la caracterización de aquellas cepas más prometedoras para su utilización industrial. 2. Caracterización de las proteínas responsables de la actividad transesterificadora de la cepa más prometedora, Terribacillus sp. AE2B 122. 3. Caracterización de la resistencia a metales pesados de Terribacillus sp. AE2B 122. Los dos primeros objetivos se engloban en el Capítulo 1 y el último se aborda en el Capítulo 2.  3. CAPÍTULO I 3.1. INTRODUCCIÓN  ~ 13 ~ 3. CAPÍTULO I. Producción de Biodiésel usando lipasas 3.1. INTRODUCCIÓN 3.1.1. Biodiésel: Producción y enfoque actual La búsqueda de nuevas fuentes de energías alternativas, sostenibles y renovables se ha convertido en un área de investigación de gran importancia en los últimos años, debido, entre otras razones, a la previsión de que el petróleo se agote en las próximas décadas. En este sentido, el Biodiésel es una alternativa prometedora al gasóleo, debido a una serie de ventajas respecto al Diésel derivado del petróleo y a que puede ser utilizado en cualquier motor Diésel, sin necesidad de ningún tipo de modificación, con un rendimiento energético similar (Atabani y col., 2012; Ranganathan y col., 2008; Zhang y col., 2012). El Biodiésel es una mezcla de monoalquil ésteres obtenidos tras el procesamiento de aceites vegetales, animales, de algas o de aceites de desecho, debido a que los aceites no se pueden usar directamente en los motores Diésel por los siguientes inconvenientes: 1- Su alta viscosidad. 2- Su baja estabilidad contra la oxidación, con las consecuentes reacciones de polimerización. 3- La baja volatilidad, que da lugar a una combustión incompleta, y que a su vez provoca la formación de grandes cantidades de cenizas. Por estos motivos se han realizado grandes esfuerzos para el desarrollo de derivados de aceites vegetales, cuyas propiedades se aproximan al Diésel derivado del petróleo. El mejor ejemplo de estos derivados es el Biodiésel (Tabla 1) (Bajpai & Tyagi, 2006; Yusuf y col., 2011). El Biodiésel es un líquido de color amarillo ámbar, tiene una viscosidad parecida al Diésel convencional, no es inflamable y, a diferencia de éste, no es explosivo, con un punto de inflamación de 423 K comparado con el del Diésel del petróleo que es de 344 K. Además el Biodiésel es biodegradable, no es tóxico, y sus emisiones son menores durante la combustión. ~ 14 ~ Tabla 1. Propiedades químicas y físicas del Biodiésel y Diésel Propiedades Biodiésel Diésel Fórmula química (rango) (M)etil ésteres C14 – C24 o C15–25H28–48O2 Hidrocarburo C10-C21 Rango de viscosidad cinemática (mm2/s, a 313 K) 3,3 - 5,2 1,9 – 4,1 Rango de densidad (kg/m3, a 288 K) 860 - 894 840-870 Punto de ebullición (K) >457 >463 Rango del punto de inflamación (K) 366 - 450 327 - 344 Rango de destilación (K) 470 - 600 <633 Apariencia física De amarillo claro a oscuro, líquido claro Claro y brillante Biodegradabilidad Más degrabable que el Diésel derivado del petróleo Menos degradable que el Biodiésel Reactividad Estable, pero hay que evitar el contacto con agentes oxidantes fuertes Menos propenso a la oxidación Según estimaciones de las estadísticas actualizadas de Oil World, en el año 2013 los países que se consideran mayores productores de Biodiésel fueron USA y Alemania. Argentina, que desde 2010 a 2012 era el tercer mayor productor de Biodiésel, descendió por debajo de USA, Alemania, Indonesia y Brasil en los últimos dos años (Tabla 2). ~ 15 ~ Tabla 2. Principales países productores de Biodiésel en los últimos años País 2010 2011 2012 2013 2014 (estimado) Producción mundial de biodiésel 18,37 22,31 24,19 27,06 29,12 USA 1,14 3,22 3,3 4,53 4,3 Indonesia 0,68 1,38 1,99 2,63 3,8 Brasil 2,1 2,35 2,39 2,56 3 Alemania 2,8 2,79 2,63 2,7 2,75 Argentina 1,82 2,43 2,46 2 2,05 Tailandia 0,65 0,79 0,92 0,95 1 Holanda 0,36 0,48 0,8 0,98 1 *Datos expresados en miles de millones de litros y obtenidos de Oil World Para la producción de Biodiésel existen tres métodos bien establecidos, microemulsión, pirólisis y transesterificación, siendo este último el más utilizado. De hecho, actualmente el proceso de producción que se utiliza a nivel industrial es la catálisis básica homogénea, una metanólisis de aceites (transesterificación) utilizando catalizadores alcalinos (KOH y NaOH). El proceso se lleva a cabo tanto en continuo como en discontinuo (Aransiola y col., 2014; Zhang y col., 2003). La transesterificación usando catálisis básica homogénea consiste en el uso del catalizador en forma líquida, mezclándolo previamente con el alcohol, que conlleva la creación de un alcóxido nucleofílico (Figura 1) que ataca la parte electrofílica del grupo carbonilo del triglicérido. La ruptura del triglicérido se produce en tres pasos (Figura 2): 1- Formación del intermediario tetraédrico. 2- Ruptura del intermediario tetraédrico en un diglicérido y un éster de ácido graso. 3- Recuperación del catalizador por transferencia de protones. Este proceso se repite cada vez que se produce la ruptura de un enlace éster del triglicérido para dar lugar a la formación final de tres moléculas de ésteres de ácidos grasos y una de glicerol (Figura 3) (Aransiola y col., 2014). ~ 22 ~ Las lipasas pertenecen a la familia de hidrolasas con plegamiento α/β, presentando un dominio estructural canónico compuesto por ocho cadenas β paralelas, rodeadas y unidas por α-hélices, formando una hoja β (Figura 4) (Nardini & Dijkstra, 1999). La actividad funcional de las lipasas reside en la triada catalítica de aminoácidos: nucleófilo-ácido-histidina (Ser-Asp/Glu-His), la cual se ubica en zonas bien conservadas del dominio catalítico. El nucleófilo es generalmente serina y se encuentra normalmente en un giro que conecta una cadena β con una hélice α, en una secuencia pentapeptídica conservada Gly-X-Ser-X-Gly, formando así un motivo característico βgiro-α llamado “codo nucleofílico”. Las lipasas comparten este mismo, o al menos similar, patrón de plegamiento α/β-hidrolasa con las esterasas (González-Bacerio y col., 2010; Kapoor & Gupta, 2012; Stergiou y col., 2013). Figura 4. Estructura del dominio de las α/β hidrolasas. Las α-hélices y las cadenas β se representan mediante cilindros blancos y flechas grises, respectivamente. La localización de la triada catalítica se señala mediante puntos negros. Las líneas discontinuas indican la localización de posibles inserciones (Nardini & Dijkstra, 1999) El centro activo de lipasas y esterasas es químicamente similar pero estructuralmente diferente. El grupo hidroxilo de la serina de las lipasas está orientado de manera diferente al de las esterasas y esto tiene como resultado una inversión estereoquímica de la triada catalítica, es decir se distribuyen espacialmente de manera inversa (Kapoor & Gupta, 2012). ~ 23 ~ La cinética de las lipasas verdaderas se caracteriza por seguir un patrón de curva sigmoidea (Brockerhoff & Jensen, 1974), debido a que el centro activo permanece tapado por una “cubierta” o “tapadera” que impide la entrada del sustrato, el cual sólo puede entrar cuando la enzima se encuentra en su conformación activa, es decir, cuando la cubierta se ha desplazado. Estas enzimas son solubles en agua, y actúan sobre sustratos insolubles y agregados, por lo que operan en interfases lípido-agua mostrando un mecanismo específico denominado de “activación interfacial” (Figura 5). A bajas concentraciones de sustrato la actividad enzimática es también baja; sin embargo, tan pronto como la concentración del sustrato aumenta hasta un punto donde comienza a formar agregados (concentración micelar crítica), se forma una interfase entre las micelas hidrofóbicas formadas por el sustrato y la fase acuosa (hidrofílica), donde están suspendidas las lipasas. Llegado a este punto, la actividad lipolítica aumenta rápidamente (González-Bacerio y col., 2010; Kapoor & Gupta, 2012). La cubierta puede ser una α-hélice anfifílica o un lazo. En el caso de Geobacillus thermocatenulatus la cubierta de la lipasa presenta una estructura compleja que involucra a un gran porcentaje de aminoácidos de la enzima formando una doble cubierta. Por el contrario, la lipasa B de C. antartica tiene una cubierta muy simple y pequeña que no mantiene el centro activo totalmente tapado en la forma cerrada. La lipasa del cerdo guineano tiene una cubierta muy pequeña compuesta únicamente por 5 aminoácidos (González-Bacerio y col., 2010; Kapoor & Gupta, 2012; Stergiou y col., 2013). Figura 5. Mecanismo de activación interfacial de las lipasas ~ 24 ~ En su conformación activa el centro activo contiene una serie de residuos hidrofóbicos, de la región N-terminal y C-terminal de la lipasa, rodeando la serina catalítica y conformando una región electrofílica conocida como cavidad oxianiónica. En el centro activo hay una superficie significativamente apolar que se conoce como zona de contacto lipídico, donde se unen los ácidos grasos en tres huecos o posiciones distintas sn-1, sn-2 y sn-3. También aparecen algunas moléculas de agua que ayudan a mantener una conformación catalíticamente competente del centro activo. Además del centro activo principal, hay lipasas como la pancreática humana y la porcina que presentan en su región C-terminal un segundo posible sitio catalítico. Este sitio podría ser el responsable de la actividad enzimática frente a sustratos hidrosolubles como los ésteres de p-nitrofenol (González-Bacerio y col., 2010; Kapoor & Gupta, 2012). Como ya se ha mencionado, las lipasas aumentan su actividad catalítica en interfases lípido-agua (activación interfacial). Esta interfase es una superficie imaginaria que separa dos porciones del espacio homogéneas y distintas físicamente. A nivel molecular la interfase es un conjunto de dos capas adyacentes de moléculas de distinto carácter hidrofóbico-hidrofílico. En el proceso de activación, el ambiente dieléctrico en la superficie proteica en la capa hidrofóbica de la interfase se modifica, potenciando las interacciones electrostáticas. Esta modificación permite un cambio de conformación en la molécula, haciendo que la cubierta del centro activo se desplace y forme la cavidad oxianiónica y la zona de contacto lipídico, aumentando todo esto la afinidad de la lipasa por su sustrato lipídico (Figura 6). El mecanismo de acción conlleva el ataque nucleofílico del grupo hidroxilo de la serina al carbono del enlace éster del sustrato. Esto resulta en la formación de un intermediario tetraédrico que seguidamente pierde una molécula de alcohol para dar lugar a un intermediario acil-enzima. En este momento, una molécula de agua ataca al complejo acil-enzima provocando que se libere finalmente una molécula de ácido, volviendo la enzima a su conformación nativa (Figura 6). Hay lipasas cuyas cubiertas no exhiben activación interfacial, como las lipasas de P. glumae, Pseudomonas aeruginosa, la lipasa B de C. antartica, la lipasa pancreática del cerdo guineano y la lipasa pancreática del coipú (nutria). Otras como la lipasa de Staphylococcus hyicus, sólo muestran activación interfacial con algunos sustratos (González-Bacerio y col., 2010; Kapoor & Gupta, 2012). ~ 25 ~ Figura 6. Mecanismo de acción de la lipasa pancreática (PPL). TS: estado de transición; ES: complejo enzima-sustrato; E-acil: intermediario acil-enzima (Stergiou y col., 2013) Se ha comprobado que cuando la lipasa de R. miehei se encuentra en un disolvente orgánico no presenta activación interfacial, incluso en presencia de polietilen glicol (PEG) que ayuda a su completa solubilización. Sin embargo, la lipasa de Mucor circinelloides presenta activación en presencia de algunos disolventes orgánicos como dietanolamina, trietanolamina, piridina, piperazina, dimetil formamida y cetilpiridinio bromuro. Esta activación se debe a que se forma un enlace entre el grupo indol del residuo de triptófano localizado en la superficie de la cubierta del centro activo y la molécula activadora, lo que cambia la conformación de la cubierta a una posición catalítica favorable. Este fenómeno parece ser muy similar a la activación interfacial en un sistema acuoso (Kapoor & Gupta, 2012). ~ 26 ~ Con respecto al mecanismo de acción de esterificación, se ha visto que un ácido graso forma un complejo intermediario acil-enzima con la lipasa, liberando una molécula de agua, seguido por la unión del alcohol a este complejo. El complejo acil-enzima es entonces transformado a un complejo lipasa-éster, que acaba liberando la enzima y el éster. La esterificación se realiza en medios no acuosos o con baja cantidad de agua, utilizando disolventes orgánicos. Las reacciones catalizadas por lipasas en medios orgánicos tienen ciertas ventajas biotecnológicas, como son: aumento de la estabilidad termodinámica de la lipasa; desviación del equilibrio termodinámico a la producción de ésteres y la eliminación de contaminación microbiológica. Debido al carácter hidrofóbico de la zona de contacto lipídico cercana al centro activo, no se descarta la posible interacción con otros compuestos de carácter similar e incluso con zonas hidrofóbicas de otras enzimas. Estas interacciones producirían agregados con baja o ninguna actividad debido al bloqueo de los centros activos por estas enzimas (González-Bacerio y col., 2010; Stergiou y col., 2013). 3.1.2.3. Condiciones óptimas de actuación de las lipasas Muy pocas lipasas son específicas en sus reacciones, por lo que el término especificidad se ha ido sustituyendo en la literatura por el de selectividad. Las lipasas pueden ser selectivas para la posición, el sustrato (tanto por la clase de ácido graso como por el alcohol del mismo), el esteroisómero e incluso poseer combinaciones de las selectividades mencionadas (González-Bacerio y col., 2010; Kapoor & Gupta, 2012). En general, el pH óptimo de las lipasas depende del sustrato y del tampón utilizado, y se sitúa normalmente en un pH neutro o alcalino. Sin embargo, existen lipasas con pH óptimos que se encuentra en el rango ácido. El pH óptimo de las lipasas puede variar al ser inmovilizadas, con respecto a su forma soluble (Stergiou y col., 2013; Verma y col., 2012). La temperatura óptima depende entre otros factores del sustrato utilizado, ya que éste presenta un papel protector frente a la desnaturalización térmica. El intervalo normal de la temperatura óptima de las lipasas suele estar entre 35 y 50 ºC. El medio de cultivo es otro factor importante para determinar la temperatura de reacción (González-Bacerio y col., 2010). ~ 27 ~ Las lipasas pueden ser inhibidas por organofosfatos, carbodiimidas en presencia de nucleófilos, el iodo, los ácidos borónicos, el fenil-metil-sulfonil-fluoruro, los metales pesados, el EDTA, los iones halógenos, los alcaloides, el cloroformo, el n-hexanol, el dietil-fenil carbonato, el bromoformo, algunos cationes metálicos y algunos detergentes. Las proteínas inhibidoras son más específicas, pudiendo inhibir a muy pocas lipasas o una única lipasa. Hay proteínas hidrofóbicas como la albúmina de suero bovino, que inhiben a las lipasas mediante unión competitiva a la interfase. También existen fenómenos de inhibición por exceso de sustrato e inhibición por producto producida por los ácidos grasos. Los iones metálicos pueden estabilizar o desestabilizar la estructura de las lipasas, pudiendo actuar como inhibidores o activadores de las mismas. Hay muchas lipasas que requieren el ión Ca2+ para adquirir una conformación estable y catalíticamente competente. Además, algunos iones provocan efectos opuestos en lipasas diferentes. El efecto inhibitorio del EDTA se debe a que secuestra los iones de Ca2+. Al igual que los iones metálicos, los detergentes pueden actuar como activadores o inhibidores dependiendo de la lipasa y del detergente utilizado (González-Bacerio y col., 2010). 3.1.2.4. Clasificación de las enzimas lipolíticas bacterianas Las lipasas microbianas se clasificaron en 8 familias en base a la homología de las secuencias de aminoácidos y a sus funciones fisiológicas (Arpigny & Jaeger, 1999; Jaeger & Eggert, 2002). En los últimos años se han descrito 8 nuevas familias (Bassegoda y col., 2012; Bayer y col., 2010; Cantarel y col., 2009; Fu y col., 2013a; Handrick y col., 2001; Kim y col., 2009; Lee y col., 2010; Lee y col., 2006; Lenfant y col., 2012; Levisson y col., 2007; Montoro y col., 2009; Rao y col., 2011) y se ha subdividido la familia V (Lenfant y col., 2012). Familia I (Triacilglicerol lipasas) En esta familia se engloba a todas las lipasas verdaderas y está formada por ocho subfamilias. ~ 28 ~ Subfamilia I.1 y I.2 Las lipasas pertenecientes a la subfamilia I.1 muestran masas moleculares que oscilan entre 30 y 32 kDa. Estas dos subfamilias comprenden lipasas de bacterias Gramnegativas que son secretadas mediante el sistema de secreción de tipo II (Braun y col., 1996; Koster y col., 2000; Ma y col., 2003; Messaoudi y col., 2010; Pugsley, 1992; Tommassen y col., 1992). Ambas subfamilias incluyen dos residuos de ácido aspártico que median la unión de un ión Ca2+, el cual estabiliza y orienta la histidina catalítica (Nardini y col., 2000). Subfamilia I.3 Las lipasas de esta subfamilia, presentan una masa molecular de 50-65 kDa y, a diferencia de las subfamilias I.1 y I.2, se exportan utilizando el sistema de secreción de tipo I (Arpigny & Jaeger, 1999; Messaoudi y col., 2010). Estas lipasas poseen una señal de secreción C-terminal, en lugar de una secuencia señal N-terminal (Akatsuka y col., 1994; Amada y col., 2000; Delepelaire, 2004; Holland y col., 2005; Kwon y col., 2002). Estas enzimas poseen un ión Ca2+ que se une a la hélice de la tapadera de la lipasa y que resulta esencial para la actividad enzimática (Meier y col., 2007). Subfamilia I.4 Las lipasas de esta familia son triacilglicerol lipasas pequeñas de una masa molecular de 20 kDa (Arpigny & Jaeger, 1999). A este grupo pertenecen varias lipasas del género Bacillus que contienen una secuencia del pentapéptido conservado formado por Ala-X- Ser-X-Gly (Arpigny & Jaeger, 1999; Messaoudi y col., 2010). La posición X2 del pentapéptido está ocupada por una Met, lo que es exclusivo de esta subfamilia de lipasas (Ruiz y col., 2002). Esta subfamilia carece de un dominio “tapadera” y de un sitio de unión para el ión Ca2+ (Van Pouderoyen y col., 2001). Subfamilia I.5 Esta subfamilia comprende lipasas de diferentes bacterias Gram-positivas pertenecientes a los géneros Staphylococcus, Bacillus, Geobacillus y Clostridium. ~ 29 ~ El pH óptimo difiere notablemente en esta subfamilia, abarcando desde pH 7,5 a pH 9,5 (Kim y col., 1998; Lee y col., 1999; Rua y col., 1997). La masa se encuentra alrededor de 46 kDa (Nthangeni y col., 2001) debido a las grandes inserciones que poseen las típicas α/β hidrolasas (Tyndall y col., 2002). Subfamilia I.6 Engloba varias lipasas producidas por diferentes especies del género Staphylococcus. Estas lipasas se expresan como pre-proteínas con una masa molecular de aproximadamente 75 kDa, dando lugar a una lipasa madura con una masa molecular de 46 kDa (Gotz y col., 1998; Rosenstein & Gotz, 2000). Estas lipasas presentan estabilidad entre pH 4 y 9 (Sayari y col., 2001). Subfamilia I.7 Las lipasas de esta subfamilia muestran similitud con la región central de la estructura primaria de las lipasas de la subfamilia I.2. Se han identificado lipasas de este grupo provenientes de Streptomyces cinnamoneus (Sommer y col., 1997), Propionibacterium acnes (Miskin y col., 1997), Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus y Bifidobacterium adolescensis (Messaoudi y col., 2010). Subfamilia I.8 Esta subfamilia de lipasas se propuso tras la identificación de la lipasa Lip1 de la bacteria psicrófila Pseudoalteromonas haloplanktis (de Pascale y col., 2008). Lip1 posee una masa molecular de 51 kDa y muestra una actividad creciente hacia ésteres de cadena larga. Estas lipasas parecen carecer de “tapadera” así como del “bolsillo” de unión a calcio, y poseen la secuencia LGG(F/L/Y)STG como un nuevo motivo consenso de centro activo alrededor de la serina catalíticamente activa (de Pascale y col., 2008). Familia II Esta familia comprende las enzimas GDSL/SGNH, las cuales contienen, en lugar del pentapéptido conservado del centro activo GXSXG, un tetrapéptido GDS(L) ubicado en la parte N-terminal (Arpigny & Jaeger, 1999). Este tetrapéptido se ubica en el bloque 1 de los cinco bloques de aminoácidos conservados que contiene esta familia. ~ 30 ~ En cada uno de estos bloques se identifica un aminoácido conservado, siendo estos aminoácidos una serina, una glicina, una asparagina y una histidina, lo que les da el nombre de SGNH hidrolasas y son esenciales para la catálisis (Molgaard, 2003). Familia III Las lipasas extracelulares de las especies de Streptomyces y Moraxella forman parte de esta familia (Cruz y col., 1994; Feller y col., 1990; Perez y col., 1993), presentando una masa molecular de 32-35 kDa y una elevada similitud con isoformas monoméricas del factor de activación de plaquetas acetilhidrolasa de seres humanos (PAF-AH) (Arpigny & Jaeger, 1999; Kleeberg y col., 2005; Uchida y col., 2002). La estructura terciaria de una lipasa de S. exfoliatus reveló que no contenía la “tapadera” (Wei y col., 1998). Familia IV Esta familia comprende esterasas de microorganismos procariotas psicrófilos, mesófilos o termófilos, que muestran similitud con la familia de lipasas sensibles a hormonas de mamíferos (HSL) (Hemilae y col., 1994). Esta familia posee una secuencia consenso H- G-G-G, involucrada en la catálisis (De Simone y col., 2000; Manco y col., 1999; Wei y col., 1999). Las esterasas bacterianas de esta familia muestran actividad solo hacia ácidos grasos de cadena corta (Chahinian y col., 2005). Varias esterasas de esta familia (De Simone y col., 2000; De Simone y col., 2001; Wei y col., 1999; Zhu y col., 2003), han mostrando una estructura única, una “cubierta” que difiere notablemente de la “tapadera” de las lipasas verdaderas (Wang y col., 2005). Familia V A esta familia pertenecen esterasas producidas por diferentes bacterias mesófilas o por microorganismos adaptados a temperaturas extremas, como por ejemplo Est2 y EstV. Estas enzimas poseen el típico dominio α/β hidrolasa y muestran una alta similitud a enzimas bacterianas como las epóxido hidrolasas, las deshalogenasas y las haloperoxidasas (Arpigny & Jaeger, 1999). Todas ellas poseen características típicas de las carboxilesterasas (Cai y col., 2011; Kashima y col., 1998; Kashima y col., 1999; Ruiz y col., 2007). ~ 31 ~ Familia VI Las enzimas pertenecientes a esta familia presentan masas moleculares entre 23 y 26 kDa, con alguna excepción (Arpigny & Jaeger, 1999; Kim y col., 2006). Estas enzimas muestran una similitud de aproximadamente el 40% con las lisofosfolipasas de organismos eucariotas. Además de lisofosfolipasas, esta familia también se compone de carboxilesterasas con amplia especificidad de sustrato. Al igual que las familias IV y V, poseen tres bloques con dominios conservados (Arpigny & Jaeger, 1999; Lenfant y col., 2012). Familia VII Las esterasas de esta familia presentan una masa molecular de aproximadamente 55 kDa y muestran una similitud significativa con las acetilcolina esterasas y las carboxilesterasas del intestino y del hígado (Arpigny & Jaeger, 1999). Las enzimas de esta familia son producidas por varias cepas de los géneros Bacillus, Peanibacillus y Geobacillus (Nthangeni y col., 2005). Entre los sustratos típicos de estas carboxilesterasas se encuentran triglicéridos y derivados de p-nitrofenil con ácidos grasos de cadena corta. Familia VIII Las enzimas de la familia VIII tienen una masa molecular de unos 42 kDa y algunas necesitan la multimerización para la formación de enzimas activas. Estas enzimas no comparten la típica estructura α/β-hidrolasa, mostrando similitud con β-lactamasas y DD-peptidasas (Elend y col., 2006; Nishizawa y col., 1995; Schutte & Fetzner, 2007). La serina nucleofílica se encuentra localizada en el motivo SXXK (Petersen y col., 2001; Wagner y col., 2002). Algunas de estas esterasas presentan alta tolerancia a los disolventes y un motivo adicional en el extremo C-terminal (Elend y col., 2006; Ogino y col., 2004; Schutte & Fetzner, 2007). Nuevas familias de enzimas lipolíticas Además de las familias descritas por Arpigny y Jaeger (1999), se han aislado varias lipasas que se han propuesto como representantes de nuevas familias de enzimas lipolíticas. ~ 38 ~ 3.1.3.1. Método del dimetil carbonato Se ha descrito el uso de un posible nuevo método para la producción de Biodiésel en un solo paso y sin utilizar ningún catalizador, mediante la utilización de dimetilcarbonato supercrítico (Figura 7) (Ilham & Saka, 2009). En este proceso de interesterificación directa de triglicéridos se produciría FAMEs, y como subproductos del proceso, el carbonato de glicerol y ácido citramálico. La esterificación de los ácidos grasos libres produce FAMEs y glioxal, permitiendo así que puedan utilizarse materias primas con alto contenido en ácidos grasos, que en el proceso convencional reaccionarían con el catalizador alcalino, produciendo sustancias saponificables y reduciendo así el rendimiento del proceso. En el experimento que describe Ilham & Saka (2009), tras 12 minutos de reacción a 350ºC y 20 MPa, el aceite de colza tratado con dimetil carbonato supercrítico alcanzó un rendimiento del 94% de FAMEs. Al finalizar el proceso, la mezcla de reacción se separó en una fase superior e inferior tras la evaporación de dimetil carbonato. La fase superior estaba formada por triglicéridos, diglicéridos metil carbonato (DGMC), monoglicérido dimetil carbonato (MGDMC) y FAME. La fase inferior, al contrario, estaba compuesta por el glicerol carbonato y el ácido citramálico. Así el proceso se ha descrito en tres pasos (Figura 7): 1- El triglicérido reacciona con el dimetil carbonato dando lugar al DGMC. 2- El DGMC reacciona con el dimetil carbonato formando MGDMC. 3- Finalmente el MGDMC reacciona con el dimetil carbonato para formar FAME, glicerol carbonato y ácido citramálico. Así se produce una molécula de FAME en cada uno de los tres pasos descritos. Los subproductos formados en este proceso, el glicerol carbonato y el ácido citramálico son de mayor valor que el glicerol producido en el proceso convencional, aunque el mayor problema para su aplicación industrial son las severas condiciones de reacción utilizadas (Ilham & Saka, 2009; Ilham & Saka, 2010). ~ 39 ~ Figura 7. Esquema de producción de Biodiésel mediante el método de dimetil carbonato supercrítico 3.1.3.2. Método del acetato de metilo y acetato de etilo En un intento por mejorar la estabilidad de la enzima de C. antartica (Novozyme 435) en la producción de Biodiésel a partir de aceites vegetales se ha sustituido el metanol por dos aceptores acilo, el acetato de metilo y el acetato de etilo (Modi y col., 2007; Ognjanovic y col., 2009), cuya reacción produce triacetina en lugar de glicerol. El uso de acetato de metilo o de etilo resultó de gran interés, obteniendo rendimientos mayores del 90% y un mayor tiempo de vida media y reusabilidad de la enzima inmovilizada, comparada con la producción utilizando el metanol o etanol. La reacción con acetato de metilo se ha verificado también industrialmente, donde se obtuvieron rendimientos del 93,6% tras 8-10 h, sin decaer su productividad durante 72 h (Modi y col., 2007; Ognjanovic y col., 2009). Se ha descrito también la utilización de acetato de metilo supercrítico para la producción de Biodiésel a partir de aceite de colza, sin catalizador (Saka & Isayama, 2009). En este proceso de interesterificación de los triglicéridos se produce FAME y triacetina (Figura 8). El proceso ocurre, al igual que para la producción de Biodiésel mediante dimetil carbonato supercrítico, en tres pasos: 1- Reacción del triglicérido con el acetato de metilo para crear una molécula de monoacetildiglicérido y una de FAME. 2- Formación de una molécula de diacetilglicérido y otra de FAME al reaccionar una molécula de monoacetildiglicérido y una de acetato de metilo. ~ 40 ~ 3- Generación de triacetina y FAME al reaccionar el diacetilglicérido y el acetato de metilo. El Biofuel así producido es una mezcla de FAME y triacetina en un ratio molar 3:1 y no se vio afectado en sus características como fuel por la adición de la triacetina, al contrario, su punto de fluencia mejoró, y su estabilidad frente a la oxidación también. Figura 8. Esquema de interesterificación de triglicéridos mediante acetato de metilo La reacción de interesterificación de triglicéridos usando acetato de etilo es similar a la reacción de interesterificación con acetato de metilo, sólo que en vez de FAMEs y triacetina, se produce FAEEs y triacetina. Esto elimina el riesgo de desactivación de la enzima por glicerol, ya que no se produce este subproducto en la reacción. Además, la triacetina como subproducto de la interesterificación, no tiene efecto negativo en la actividad de la enzima. 3.1.3.3. Producción de Biodiésel con lipasas 1,3-regioespecíficas Se ha patentado un nuevo método para obtener Biodiésel mediante etanólisis (transesterificación) parcial de triglicéridos usando la lipasa pancreática porcina (PPL), una pequeña cantidad de solución acuosa de NaOH y etanol. Esta lipasa, al igual que otras muchas que ya se han mencionado en puntos anteriores, es 1,3-regioespecífica, por lo que sólo produce una transesterificación parcial de los triglicéridos, quedando el glicerol en forma de monoglicérido con un único ácido graso unido en el carbono 2 (Figura 9), lo que da lugar a una mezcla de FAEEs y monoglicéridos (MG) (Luna y col., 2013; Verdugo y col., 2010). Este tipo de Biodiésel presenta unas características físicas similares al Biodiésel convencional y al mismo tiempo mantiene al glicerol en su propia composición, lo que evita su producción como subproducto y posterior separación del Biodiésel, abaratando así el proceso de producción. También se ha demostrado que tanto los monoglicéridos como los diglicéridos aumentan la lubricidad del Biodiésel. ~ 41 ~ Figura 9. Esquema de reacción de transesterificación con etanol y una lipasa 1,3-regioespecífica A pesar de las ventajas de este nuevo Biodiésel, el principal inconveniente es el alto coste de la enzima purificada, y que no es fácil obtener rendimientos mayores del 60% a cortos tiempos de reacción, aunque existan trabajos donde se han conseguido rendimientos del 75 y 90% a tiempos relativamente largos (más de 24 h) (Camacho y col., 2006; Paula y col., 2007). Por lo tanto, es necesario optimizar este procedimiento enzimático antes de ser utilizado a escala industrial (Luna y col., 2013; Verdugo y col., 2010).  3. CAPÍTULO 1 3.2. MATERIALES Y MÉTODOS  ~ 45 ~ 3.2. MATERIALES Y MÉTODOS 3.2.1. Material biológico 3.2.1.1. Cepas bacterianas En la Tabla 7 se muestran las cepas comerciales bacterianas utilizadas en este trabajo. Tabla 7. Cepas bacterianas utilizadas CEPA BACTERIANA CARACTERÍSTICAS RELEVANTES FUENTE O REFERENCIA Escherichia coli DH5α F-, lacZ∆M15, recA1, hsdR17,supE44∆ (lacZYA argF) NalR (Hanahan, 1983) E. coli BIVU111 Derivada de E.coli BL21, sin el profago DE3, módulo nahR Psal::ARN pol T7 (de Lorenzo y col., 1993b) 3.2.1.2. Plásmidos Plásmidos utilizados Los plásmidos utilizados en este trabajo se muestran en la Tabla 8. Tabla 8. Plásmidos utilizados Plásmido Características relevantes Fuente o referencia pBC SK(+) Derivado de pUC19, promotor Plac, promotor T7, CmR (Short y col., 1988) pGEM-T Promotores T7 y SP6, AmpR Permite la clonación de productos de PCR con un extremo A libre Promega pET-15Kb Derivado de pET28c con un fragmento de 57 pbs que contiene el ORF de la enzima cloranfenicol acetil transferasa (CAT) Suministrado por el kit ExiProgenTM EC1 Protein Synthesis Kit. Bioneer) pBC: pBlueScript; CmR: resistencia a Cloranfenicol; AmpR: resistencia a ampicilina; Plac: promotor del operón lac ~ 46 ~ Plásmidos construidos Los plásmidos construidos durante el desarrollo de este trabajo se muestran en la Tabla 9. Tabla 9. Plásmidos construidos Plásmido Cepa hospedadora Características relevantes pGEM-T-Lip1 E.coli DH5α Derivado de pGEM-T AmpR con un fragmento de 0,888 kb que contiene el ORF de la lipasa/esterasa candidata 1 obtenido por PCR a partir del ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122, utilizando los oligonucleótidos Lip1F y Lip1R pGEM-T-Lip2 E.coli DH5α Derivado de pGEM-T AmpR con un fragmento de 0,6 kb que contiene el ORF de la lipasa/esterasa candidata 2 obtenido por PCR a partir del ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122, utilizando los oligonucleótidos Lip2F y Lip2R. pGEM-T-Lip3 E.coli DH5α Derivado de pGEM-T AmpR con un fragmento de 0,924 kb que contiene el ORF de la lipasa/esterasa candidata 3 obtenido por PCR a partir del ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122, utilizando los oligonucleótidos Lip3F y Lip3R pGEM-T-Lip4 E.coli DH5α Derivado de pGEM-T AmpR con un fragmento de 0,966 kb que contiene el ORF de la lipasa/esterasa candidata 4 obtenido por PCR a partir del ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122, utilizando los oligonucleótidos Lip4F y Lip4R pGEM-T-Lip5 E.coli DH5α Derivado de pGEM-T AmpR con un fragmento de 0,906 kb que contiene el ORF de la lipasa/esterasa candidata 5 obtenido por PCR a partir del ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122, utilizando los oligonucleótidos Lip5F y Lip5R pGEM-T-Lip6 E.coli DH5α Derivado de pGEM-T AmpR con un fragmento de 0,729 kb que contiene el ORF de la lipasa/esterasa candidata 6 obtenido por PCR a partir del ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122, utilizando los oligonucleótidos Lip6F y Lip6R pGEM-T-Lip7 E.coli DH5α Derivado de pGEM-T AmpR con un fragmento de 0,606 kb que contiene el ORF de la lipasa/esterasa candidata 7 obtenido por PCR a partir del ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122, utilizando los oligonucleótidos Lip7F y Lip7R pGEM-T-Lip8 E.coli DH5α Derivado de pGEM-T AmpR con un fragmento de 0,978 kb que contiene el ORF de la lipasa/esterasa candidata 8 obtenido por PCR a partir del ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122, utilizando los oligonucleótidos Lip8F y Lip8R pBC SK(+)- Lip1 E.coli BIVU111 Derivado de pBC KS (+)-CmR linearizado con EcoRV, con un fragmento de 0,920 kb que contiene el ORF de la lipasa/esterasa candidata 1 obtenido por PCR a partir del plásmido pGEMT-Lip1, utilizando los oligonucleótidos MAO346 y MAO347 pBC SK(+)- Lip2 E.coli BIVU111 Derivado de pBC KS (+)-CmR linearizado con EcoRV, con un fragmento de 0,632 kb que contiene el ORF de la lipasa/esterasa candidata 2 obtenido por PCR a partir del plásmido pGEMT-Lip2, utilizando los oligonucleótidos MAO348 y MAO349 pBC SK(+)- Lip3 E.coli BIVU111 Derivado de pBC KS (+)-CmR linearizado con EcoRV, con un fragmento de 0,956 kb que contiene el ORF de la lipasa/esterasa candidata 3 obtenido por PCR a partir del plásmido pGEMT-Lip3, utilizando los oligonucleótidos MAO350 y MAO351 ~ 47 ~ Plásmido Cepa hospedadora Características relevantes pBC SK(+)- Lip4 E.coli BIVU111 Derivado de pBC KS (+)-CmR linearizado con EcoRV, con un fragmento de 0,998 kb que contiene el ORF de la lipasa/esterasa candidata 4 obtenido por PCR a partir del plásmido pGEMT-Lip4, utilizando los oligonucleótidos MAO352 y MAO353 pBC SK(+)- Lip5 E.coli BIVU111 Derivado de pBC KS (+)-CmR linearizado con EcoRV, con un fragmento de 0,938 kb que contiene el ORF de la lipasa/esterasa candidata 5 obtenido por PCR a partir del plásmido pGEMT-Lip5, utilizando los oligonucleótidos MAO354 y MAO355 pBC SK(+)- Lip6 E.coli BIVU111 Derivado de pBC KS (+)-CmR linearizado con EcoRV, con un fragmento de 0,761 kb que contiene el ORF de la lipasa/esterasa candidata 6 obtenido por PCR a partir del plásmido pGEMT-Lip6, utilizando los oligonucleótidos MAO356 y MAO357 pBC SK(+)- Lip7 E.coli BIVU111 Derivado de pBC KS (+)-CmR linearizado con EcoRV, con un fragmento de 0,638 kb que contiene el ORF de la lipasa/esterasa candidata 7 obtenido por PCR a partir del plásmido pGEMT-Lip7, utilizando los oligonucleótidos MAO358 y MAO359 pBC SK(+)- Lip8 E.coli BIVU111 Derivado de pBC KS (+)-CmR linearizado con EcoRV, con un fragmento de 1,01 kb que contiene el ORF de la lipasa/esterasa candidata 8 obtenido por PCR a partir del plásmido pGEMT-Lip8, utilizando los oligonucleótidos MAO360 y MAO361 3.2.1.3. Conservación de las cepas La conservación de las cepas utilizadas en este trabajo se realizó utilizando dos procedimientos, mantenimiento a 4ºC y congelación a -20 y -80ºC. 3.2.2. Medios y condiciones de cultivo El pH de los medios se ajustó con NaOH 1 M (para un pH final de 7 - 7,5) o con HCl al 37% (para un pH final de 5,5 - 6) y se esterilizaron en autoclave a una temperatura de 121C durante 20 minutos. Para la preparación de los medios de cultivo sólidos se utilizó Bacto-Agar (Difco) a una concentración del 2 %. 3.2.2.1. Medios de cultivo para la selección de organismos lipolíticos Los organismos lipolíticos se seleccionaron en una serie de medios sólidos con 0,5% de tributirina. La tributirina, al tratarse de un triacilglicerol, es insoluble en agua y para la elaboración del medio fue necesario su sonicación mediante un sonicador Branson Sonifier 250, durante al menos 20 minutos, con el fin de conseguir una adecuada homogenización. ~ 54 ~ - Ligaciones de fragmento de ADN y vector con extremos cohesivos: se mantuvo una relación vector:inserto de 1:3. - Ligaciones de extremos romos: se utilizó la relación vector:inserto de 1:5. La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 10 μl en tubos estériles de 0,2 ml conteniendo las cantidades apropiadas de vector e inserto, así como el tampón de la ligasa a una concentración final 1X y la enzima T4 ADN ligasa, 1 µl (5 U), completando con agua destilada estéril según el volumen final de reacción. La mezcla de reacción se incubó a distintas temperaturas y tiempos dependiendo de si los fragmentos a ligar eran romos (16 ºC durante 4-18 horas) o cohesivos (temperatura ambiente durante 12 horas o 4 ºC durante toda la noche). En el caso de ligaciones de extremos romos, añadimos doble cantidad de T4 ADN ligasa. Para las ligaciones en pGEM-T se utilizó el kit de Promega siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las ligaciones se dejaron a 4ºC durante toda la noche. Eliminación de las endonucleasas de restricción Para eliminar los restos de enzimas y de tampones después de su actuación, se siguió el método de extracción con las soluciones fenol:cloroformo (1:1) y cloroformo, como describen Sambrook y Russell (Sambrook & Russell, 2001). En aquellos casos en los que fue necesaria una mayor purificación se utilizó el kit FavorPrep (Favorgen Biotech Corp) o el kit GFX PCR DNA and GEL PURIFICATION (GE Healthcare), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Transformación de células competentes por choque térmico Las células competentes utilizadas se prepararon utilizando el siguiente protocolo: 1. Se incubó a 37ºC una colonia de E. coli en 25 ml de medio LB toda la noche en un matraz de 250 ml 2. Se diluyeron las células 40 veces en medio LB nuevo en 4 matraces de 1L (2,5 ml de cultivo en cada matraz con 100 ml de medio LB) 3. Se incubó a 37ºC hasta que la DO600nm alcanzó 0,4-0,5 4. Se enfrió el cultivo en hielo durante 30 minutos 5. Se centrifugó en tubos de 50 ml a 4000 rpm y 4ºC durante 5 minutos. ~ 55 ~ 6. Se eliminó el sobrenadante y se colocaron las células en hielo. 7. Se resuspendieron las células de cada tubo de 50 ml en 25 ml de solución A 8. Se incubaron en hielo 30-60 minutos, con agitación manual ocasional 9. Se centrifugaron las células durante 10 minutos a 4ºC y 4000 rpm 10. Se eliminó el sobrenadante y se mantuvieron las células en hielo 11. Se resuspendieron las células con un volumen total de 6,7 ml de solución B para los 8 tubos de 50 ml (6,7 ml solución B/400 ml de cultivo original) 12. Se separaron 0,5 ml de suspensión de células en tubos estériles de 2 ml 13. Se congelaron los tubos con nitrógeno líquido y se mantuvieron a -80ºC El método rutinario de transformación que se ha utilizado durante el desarrollo de esta Tesis doctoral, ha sido el choque térmico descrito por Hanahan (1983) en células competentes de E. coli, en concreto las cepas DH5α y que se resume a continuación: 1. Las células competentes se descongelaron en hielo 2. Se pusieron en contacto 10 µl de ligación con las células competentes 3. La mezcla de transformación se mantuvo durante 30 minutos en hielo 4. Posteriormente la muestra se colocó durante 1 min en un baño a 42 ºC 5. Se dejó la mezcla en hielo durante 1 min 6. Se añadió 1 ml de medio LB 7. Se incubaron las células durante 1 h a 37 ºC en un agitador o baño 8. Se sembraron las células en placas de LB adicionadas con el antibiótico correspondiente 9. Se dejaron las placas crecer 24 h a 37 ºC en una estufa Reacción de amplificación de ADN mediante PCR  Solución A: 0,1 M CaCl2  Solución B: 0,1 M CaCl2-15% glicerol Todas las soluciones se preparan en H2O MilliQ  IPTG (solución stock de 1M preparado en H2O MilliQ estéril): Concentración final de 1 mM en las placas de medio sólido  X-Gal (solución stock de 20 mg/ml preparado en DMSO): Concentración final de 0,2 mg/ml en las placas de medio sólido ~ 56 ~ Los distintos cebadores que se utilizaron fueron diseñados en función del fragmento a amplificar. Los cebadores que se han utilizado en la presente Tesis Doctoral para la realización de PCRs convencionales se detallan en la Tabla 12. Tabla 12. Cebadores diseñados para la amplificación y secuenciación del ADN. Las letras subrayadas muestran la secuencia introducida de reconocimiento de la enzima de restricción Cebador 5´-Secuencia-3´ Nº de bases Tm (ºC) % GC Uso 16F27 AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 20 51 47 Amplificación del ARNr 16S bacteriano, a partir de ADN genómico. 16R1488 CGGTTACCTTGTTAGGACTTC ACC 24 58 50 Lip1F GCGCCATGGTTAAAATAGAC GGCGTTTTCTCA 32 65 47 Amplificación del ORF (incluido codón de inicio) del candidato 1 lipasa/esterasa a partir del ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122. Genera sitio de restricción NcoI y XhoI Lip1R GCGCTCGAGTGGCCAGCGCT TTAGGAA 27 68 62 Lip2F GCGCCATGGTTCAAAAATGG ATTTTTATCGGA 32 63 41 Amplificación del ORF (incluido codón de inicio) del candidato 2 lipasa/esterasa a partir del ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122. Genera sitio de restricción NcoI y XhoI Lip2R GCGCTCGAGCTTACGTTCTG CCGTAAAATA 30 65 50 Lip3F GCGCCATGGTTGGATTGAAT CCAAAAATACAG 32 63 44 Amplificación del ORF (incluido codón de inicio) del candidato 3 lipasa/esterasa a partir del ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122. Genera sitio de restricción NcoI y XhoI Lip3R GCGCTCGAGTTTATACAAAG CTTGTCTCAG 30 62 47 Lip4F GCGCCCGGGTTGCGGAGAAA AAGAGTGTGG 30 70 63 Amplificación del ORF (incluido codón de inicio) del candidato 4 lipasa/esterasa a partir del ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122. Genera sitio de restricción SmaI y XhoI Lip4R GCGCTCGAGTTCCGAATGTG CTTGCAAAAA 30 66 50 ~ 57 ~ Cebador 5´-Secuencia-3´ Nº de bases Tm (ºC) % GC Uso Lip5F GCGCCATGGTTCAAAAAAGA AAGATTTACCTG 32 62 41 Amplificación del ORF (incluido codón de inicio) del candidato 5 lipasa/esterasa a partir del ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122. Genera sitio de restricción NcoI XhoI Lip5R GCGCTCGAGTTCATCATCTTC CTGTATAAC 28 61 47 Lip6F GCGCCATGGTTGAGATACAT TCATCTGAGTCT 32 64 47 Amplificación del ORF (incluido codón de inicio) del candidato 6 lipasa/esterasa a partir del ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122. Genera sitio de restricción NcoI y XhoI Lip6R GCGCTCGAGTATACAGCTTC TCCCGAATTG 30 65 53 Lip7F GCGCCCGGGAGAAAATGTAA ACAAATTACGCTT 33 65 45 Amplificación del ORF (incluido codón de inicio) del candidato 7 lipasa/esterasa a partir del ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122. Genera sitio de restricción SmaI y XhoI Lip7R GCGCTCGAGATTTAGTAGAG CCTCTTTAATATG 33 61 42 Lip8F GCGCCCGGGCAACAACTTTC TAAAGTA 27 64 52 Amplificación del ORF (incluido codón de inicio) del candidato 8 lipasa/esterasa a partir del ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122. Genera sitio de restricción SmaI y XhoI Lip8R GCGCTCGAGAAGTCTGCTTT TTAAGAATTGATA 33 62 39 MAO346 AGAGGAGGTATATACATGAAA ATAGACGGCGTTTTCTCAG 40 63 40 Amplificación del promotor T7- RBS-codón inicio (ATG)-ORF de la lipasa-codón stop del candidato 1 lipasa/esterasa a partir del clon 2 pGEMT-lip1 MaO347 CCAAGGGGTTATGCTAGTTAT GGCCAGCGCTTTAGGAAGTG C 42 70 52 MAO348 AGAGGAGGTATATACATGGTT CAAAAATGGATTTTTATCG 40 60 33 Amplificación del RBS-codón inicio (ATG)-ORF de la lipasa-codón stop del candidato 2 lipasa/esterasa a partir del clon 4 pGEMT-lip2 MAO349 CCAAGGGGTTATGCTAGTTA CTTACGTTCTGCCGTAAAATA T 42 65 40 ~ 58 ~ Cebador 5´-Secuencia-3´ Nº de bases Tm (ºC) % GC Uso MAO350 AGAGGAGGTATATACATGGG ATTGAATCCAAAAATACAGG 40 62 38 Amplificación del RBS-codón inicio (ATG)-ORF de la lipasa-codón stop del candidato 3 lipasa/esterasa a partir del clon 3 pGEMT-lip3 MAO351 CCAAGGGGTTATGCTAGTTAT TTATACAAAGCTTGTCTCAGC 42 64 40 MAO352 AGAGGAGGTATATACATGTTG CGGAGAAAAAGAGTGTGGA 40 65 43 Amplificación del RBS-codón inicio (ATG)-ORF de la lipasa-codón stop del candidato 4 lipasa/esterasa a partir del clon 5 pGEMT-lip4 MAO353 CCAAGGGGTTATGCTAGTTAT TCCGAATGTGCTTGCAAAAAA 42 66 40 MAO354 AGAGGAGGTATATACATGCA AAAAAGAAAGATTTACCTGA 40 61 33 Amplificación del RBS-codón inicio (ATG)-ORF de la lipasa-codón stop del candidato 5 lipasa/esterasa a partir del clon 1 pGEMT-lip5 MAO355 CCAAGGGGTTATGCTAGTTAT TCATCATCTTCCTGTATAACG 42 64 40 MAO356 AGAGGAGGTATATACATGGA GATACATTCATCTGAGTCTA 40 61 38 Amplificación del RBS-codón inicio (ATG)-ORF de la lipasa-codón stop del candidato 6 lipasa/esterasa a partir del clon 1 pGEMT-lip6 MAO357 CCAAGGGGTTATGCTAGTTAT ATACAGCTTCTCCCGAATTGC 42 66 45 MAO358 AGAGGAGGTATATACATGAG AAAATGTAAACAAATTACGC 40 60 33 Amplificación del RBS-codón inicio (ATG)-ORF de la lipasa-codón stop del candidato 7 lipasa/esterasa a partir del clon 3 pGEMT-lip7 MAO359 CCAAGGGGTTATGCTAGTTAA TTTAGTAGAGCCTCTTTAATA 42 62 36 MAO360 AGAGGAGGTATATACATGGG GCAACAACTTTCTAAAGTAA 40 63 38 Amplificación del RBS-codón inicio (ATG)-ORF de la lipasa-codón stop del candidato 8 lipasa/esterasa a partir del clon 6 pGEMT-lip8 MAO361 CCAAGGGGTTATGCTAGTTAA AGTCTGCTTTTTAAGAATTGA 42 63 36 MAO362 GAAATTAATACGACTCACTAT AGGGAGAGGAGGTATATAC 40 60 38 Amplificación del promotor T7- RBS-codón inicio (ATG)-ORF de la lipasa-codón stop-Terminador T7, a partir de las PCRs MAO346/347-MAO360/MAO361 y MAO363/MAO364 ~ 59 ~ Cebador 5´-Secuencia-3´ Nº de bases Tm (ºC) % GC Uso MAO363 TAACTAGCATAACCCCTTGG 20 51 45 Amplificación del terminador T7 a partir de pET-15b del kit ExiProgenTM EC1 Protein Synthesis MAO364 TTTCAGCAAAAAACCCCTC 19 51 42 Para la amplificación de fragmentos de ADN se llevó a cabo el método de PCR siguiendo las indicaciones descritas en el manual de Sambrook y Russell (2001). Las reacciones se realizaron en un volumen total de 50 µl, utilizando tubos Eppendorf de 0,2 ml estériles y con ayuda de un termociclador. La enzima utilizada para amplificaciones fue la Taq ADN polimerasa (5-PRIME). En aquellos casos en los que fue necesario disminuir los posibles errores en la amplificación, se empleó Pfu ADN polimerasa (Stratagene) que proporciona una alta fiabilidad de copia en la reacción de polimerización. Para la amplificación de fragmentos de ADN que posteriormente se ligaron en pGEM-T, se utilizó AcuPrime Taq High Fidelity que deja extremos de adenina. El programa general de PCR utilizado para la amplificación de ADN (Figura 10) fue modificado en lo referente a la temperatura de hibridación de los cebadores (generalmente 5ºC menos que la Tm de los cebadores, sin bajar de los 50ºC) y al tiempo de elongación, dependiendo del tamaño de los fragmentos a amplificar (1 minuto/Kilobase). En general, tras una desnaturalización previa del ADN a 95 ºC durante 1 minuto, se aplicaron 30 ciclos constituidos por tres etapas: desnaturalización, hibridación de los cebadores y extensión. La reacción terminó con un ciclo de extensión a 72 ºC durante 10 minutos con el fin de permitir la elongación de los productos de reacción. La reacción, una vez finalizada, se mantenía a 4ºC si no se iba a utilizar en el momento. En el caso de la AcuPrime Taq High Fidelity, la temperatura de elongación fue de 68ºC. ~ 60 ~ 95ºC 95ºC 55ºCa 72ºC 4ºC 30 ciclos 1’ 1’ 1’ 1’40”b & Figura 10. Condiciones de las reacciones de PCR. aLa temperatura de hibridación se modificó en cada caso 5 ºC por debajo de la Tm de los cebadores utilizados. bEl tiempo de elongación fue aproximadamente de un minuto por Kb Los productos obtenidos en cada reacción se sometieron a electroforesis en geles de agarosa para comprobar si se había producido la amplificación del fragmento deseado. A continuación se muestran los componentes de la mezcla de reacción para PCR y las concentraciones finales a las que se utilizaron generalmente (Tabla 13). Tabla 13. Componentes de la mezcla de reacción de PCR Componente de la mezcla* Cantidad* Tampón 10x con Mg+2 5,0 μl dNTPs (2,5 mM cada dNTPs) 4,0 µl Cebador 1 (12 µM) 2,5 µl Cebador 2 (12 μM) 2,5 µl Taq ADN polimerasa 1,25 U ADN (1 mg/μl) 1,0 μl H2O MilliQ estéril hasta 50 µl *En cada caso hay que tener en cuenta las indicaciones del fabricante En los casos de comprobación de transformantes, se utilizó el método de PCR de colonia. Para esto se tomó una muestra de biomasa de la colonia en 50 µl de H2O MilliQ estéril, se hirvió 10 min en un baño y se centrifugó 5 min a 9000 rpm. Se utilizó 1 µl de este sobrenadante como molde para la PCR, para la que se utilizó la enzima iTaq y el mismo programa de amplificación descrito en la Figura 10. ~ 61 ~ 3.2.5.3. Secuenciación y análisis del ADN Secuenciación de fragmentos amplificados de ADN La secuenciación de los diferentes fragmentos de ADN amplificados en la presente Tesis Doctoral ha sido realizada por la empresa Stab Vida (Oeiras, Portugal), usando un secuenciador modelo 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems). La secuenciación ha sido realizada mediante el método de Sanger (Sanger y col., 1977). Los oligonucleótidos empleados para la secuenciación se indican en la Tabla 12. Análisis de los fragmentos secuenciados de ADN Los cromatogramas de las secuencias de ADN se visualizaron con el programa Chromas Pro versión 1.5. Para el análisis de las secuencias de ADN se procedió a la comparación de éstas con las secuencias disponibles en las bases de datos (EMBL, GenBank, DDBJ y RDB) con la ayuda del programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tooll) (Altschul y col., 1997), alojado en el servidor del NCBI (Nacional Center for Biotechnology Information). Análisis de la secuencia del ARNr 16S y construcción de árboles filogenéticos El ADN de las bacterias fue aislado siguiendo el protocolo estándar que se explica en el apartado 3.2.5.1. (Extracción de ADN genómico). El ADN total aislado se usó como molde para la amplificación del ARNr 16S mediante PCR, usando los cebadores universales diseñados para bacterias 16SF27 y 16SR1488 (Tabla 12) (Lane, 1991). Se secuenció un fragmento de 650 pbs del ARNr 16S amplificado, correspondiente a las posiciones de la base 39 a la 689 del gen ARNr 16S de E. coli. Esa secuencia parcial se alineó con la secuencia del gen ARNr 16S más similar en la base de datos GenBank, usando el algoritmo de búsqueda BLASTN y con el software disponible en el Ribosomal Database Project (RBD). Se realizó un alineamiento múltiple de secuencias utilizando las secuencias mas similares encontradas en GenBank, el software utilizado fue Clustal W (Thompson y col., 1997). ~ 62 ~ Los árboles filogenéticos se obtuvieron usando el software MEGA4 (Tamura y col., 2007) con el método Neighbor-Joining (Saitou & Nei, 1987). Los datos se sometieron a un proceso de bootstrap de 500 repeticiones para asegurarnos de la fiabilidad de cada rama del árbol. Las distancias evolutivas se calcularon usando el método de Maximum Composite Likelihood (Tamura y col., 2004) y se muestran como número de sustituciones de bases por sitio. Para algunos organismos elegidos, se secuenció el ARNr 16S completo y al igual que con la secuencia parcial, se comparó con las secuencias de la base de datos GenBanK. Secuenciación de ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122 La secuenciación y ensamblaje del genoma se realizó por la empresa BGI-HongKong Co., Ltd., utilizando una tecnología de secuenciación de última generación (NGS de sus siglas en inglés “Next Generation Sequencing”) en un secuenciador Illuminia de alto rendimiento, con una estrategia de 2 x 90 pbs (es decir, 90 pbs por los dos extremos). Para el ensamblaje de los fragmentos, primero se filtraron las secuencias para eliminar las de baja calidad, y luego se eliminaron las secuencias correspondientes a los oligonucleótidos utilizados en la construcción de la librería genética. Se utilizó el algoritmo SOAP denovo versión 1.05. Los resultados fueron ensamblados localmente y optimizados según los extremos emparejados y las relaciones de solapamiento, mapeando las lecturas para formar contigs y supercontigs. La anotación automática fue realizada por el profesor Gabriel Gutiérrez Pozo (Departamento de Genética, Universidad de Sevilla) utilizando el servidor RAST, el cual realiza anotaciones rápidas utilizando tecnología de subsistemas (Aziz y col., 2008). Análisis del genoma de Terribacillus sp. AE2B 122 Para análisis más detallados de las lipasas candidatas identificadas en el genoma de Terribacillus sp. AE2B 122, se utilizaron herramientas bioinformáticas tanto de los servidores NCBI como EXPASY. Los programas Blastp, InterProScan y MyHits se utilizaron para la búsqueda de dominios y familias. Los programas PSORTb, LipoP y signal P se utilizaron para predecir si las proteínas eran intracelulares o extracelulares, ~ 63 ~ LipoP y signal P se utilizaron más concretamente para la predicción de la presencia de péptido señal en las proteínas candidatas. 3.2.6. Extracción y análisis del ARN 3.2.6.1. Extracción del ARN Para la extracción de ARN de las células bacterianas se siguió el método de extracción con trizol que se indica a continuación: 1. Homogenizado: 1.1. Resuspender las células bacterianas en 100 μl de lisozima (3 mg/ml en tampón Tris-EDTA-Glucosa) y mantener a Tª ambiente 15-30 min 1.2. Congelar y descongelar la muestra, añadir 1 ml de trizol y pipetear varias veces para homogeneizar 2. Separación en dos fases: 2.1. Incubar 5 min a temperatura ambiente para permitir la disociación completa de proteínas 2.2. Centrifugar a 4ºC durante 10 min a 13000 rpm y recoger el sobrenadante en un eppendorf limpio. Así se elimina el ADN genómico 2.3. Añadir el mismo volumen de una mezcla fenol:cloroformo (1:1), mezclar bien y centrifugar 5 min a 4ºC y 13000 rpm 2.4. Recoger la fase superior y pasar a un eppendorf nuevo 2.5. Repetir los dos pasos anteriores hasta que desaparezca la interfase 2.6. Añadir el mismo volumen de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y mezclar con vortex 2.7. Centrifugar a 4ºC, 5 min y 13000 rpm 3. Precipitación del ARN: 3.1. Recoger la fase superior y añadir 2,5 volúmenes de etanol 100% y 1/10 de acetato sódico 3 M pH 5,2 3.2. Precipitar a -20ºC durante 30 min 3.3. Centrifugar 30 min a 13000 rpm y 4ºC 3.4. Lavar el pellet de células con 400 μl de etanol al 70% invirtiendo manualmente y centrifugando 5 min a 4ºC y 13000 rpm 3.5. Eliminar el etanol y secar a Tª ambiente ~ 70 ~ Tras 4-16 horas de reacción, se dejó reposar la muestra durante 10 minutos para permitir que la lipasa decantase hasta el fondo del tubo. Se cogieron 25 µl del sobrenadante y se extrajo con 1 ml de NaOH 0,05 M en un tubo eppendorf de 1,5 ml en hielo. El p-NP producido durante la reacción de transesterificación se extrajo en la fase acuosa alcalina que se forma al adicionar la solución de NaOH. Finalmente esta mezcla se pasó a una cubeta de 1 ml y se midió su absorbancia a 410 nm, usando un espectrofotómetro Beckman DU 640. Se utilizaron tres formas de cuantificar la actividad transesterificadora: 1- Actividad transesterificadora específica de proteína soluble. En este caso las unidades de actividad se expresaron como μmoles de p-NP liberado por cada hora de reacción y mg de proteína soluble. La concentración de proteínas solubles corresponde a la concentración de proteína medida en la mezcla de la reacción de transesterificación. La fórmula utilizada fue la siguiente: -Abs410nm: absorbancia (410 nm) de los ensayos de transesterificación. -fd: factor de dilución. -Ce: coeficiente de extinción molar del producto p-NP a 410 nm (17600 M-1 cm-1). -1000: 1000 es un factor de multiplicación utilizado para la conversión de la concentración de p-NP de M a mM. -Vt: volumen total de la reacción de transesterificación (1,06 ml). -Cps: concentración de proteína soluble (mg/ml). 2- Actividad transesterificadora específica de proteína de fracción utilizada. En este caso, las unidades de actividad se expresaron como μmoles de p-NP liberado por cada hora de reacción y mg de proteína presente en la fracción utilizada (extracelular, intracelular total e intracelular soluble) en el ensayo antes de ser liofilizada. La fórmula utilizada fue la siguiente: Actividad = (Abs410nm x fd) / Ce) x 1000 x Vt) / h / Cps x Vt ~ 71 ~ -Cpf: concentración de proteína de la fracción utilizada (mg/ml). -Vf: volumen de fracción liofilizada utilizada en el ensayo. 3- Actividad transesterificadora total. En este caso las unidades de actividad se expresaron como μmoles de p-NP liberado por cada hora de reacción y ml de fracción utilizada en el ensayo antes de ser liofilizada. La fórmula utilizada fue la siguiente: 3.2.8.4. Ensayo de actividad hidrolítica del p-NPP Al igual que la transesterificación, la hidrólisis del éster p-NPP da lugar a una coloración amarilla debida al p-nitrofenol liberado por la hidrólisis de dicho éster. La reacción de hidrólisis se llevó a cabo mezclando 0,1 ml de fracción celular o de fracción proteica, con 0,1 ml de pNPP 10 mM y 0,8 ml de tampón fosfato potásico 0,05 M y pH 7,6. La mezcla se dejó de 5–20 h a 37 ºC y se midió la absorbancia a 410 nm para comprobar la cantidad de pNP liberado por hidrólisis. Para la hidrólisis se realizaron tres tipos de cuantificación de actividad hidrolítica, la actividad hidrolítica específica de proteína soluble y de proteína de fracción y la actividad hidrolítica total de proteína de fracción. Para los cálculos se utilizaron las siguientes fórmulas: 1- Actividad hidrolítica específica de proteína de fracción: Las unidades se expresan como μmoles de producto (pNP) por cada hora de reacción y mg proteína presente en la fracción celular (extracelular, intracelular total e intracelular soluble) utilizada en el ensayo de reacción de hidrólisis. Actividad = (Abs410nm x fd) / Ce) x 1000 x Vt) / h / Cpf x Vf Actividad = (Abs410nm x fd) / Ce) x 1000 x Vt) / h / Vf Actividad = (Abs410nm) / Ce) x 1000 x Vt) / h / Cpf x Vf ~ 72 ~ 4- Actividad hidrolítica específica de proteína soluble: Las unidades se expresan como μmoles de producto (pNP) por cada hora de reacción y mg proteína soluble en la mezcla de reacción de hidrólisis. 5- Actividad hidrolítica total: Las unidades se expresan como μmoles de producto (pNP) por cada hora de reacción y ml de fracción celular utilizada en el ensayo de reacción de hidrólisis. 3.2.8.5. Determinación de la concentración de proteínas Para el cálculo de concentración de proteínas de las distintas fracciones y soluciones de proteínas utilizadas en este trabajo, se utilizó el reactivo Bradford (Biorad Protein Assay, Microassay Procedure). Se prepararon las muestras mezclando 100 μl de fracción o solución de proteínas con 700 μl de H2O destilada y 200 μl de reactivo Bradford. A los 10 minutos se midió su absorbancia a 595 nm. Para poder realizar el cálculo de la concentración de proteínas, se realizó una recta patrón mezclando 0 μl, 20 μl, 40 μl, 60 μl, 80 μl, 100 μl y 120 μl de albumina de suero bovino (BSA) 0,1 mg/ml con H2O destilada hasta 800 μl, y 200 μl de reactivo Bradford, resultando en una concentración final de 0, 2, 4, 6, 8, 10 y 12 μg/ml de BSA, respectivamente. Tras mezclarlos bien y esperar 10 minutos, se midió su absorbancia a 595 nm, se compararon las concentraciones conocidas de cada punto con las absorbancias medidas y se construyó una recta patrón. Las absorbancias medidas de las muestras se compararon con la fórmula de la recta patrón y se calcularon así las concentraciones de proteína de cada muestra. Si los valores de absorbancia obtenidos para la muestra problema no se encontraban en el rango lineal de la recta patrón, se realizaban diluciones de la muestra hasta conseguir que los valores obtenidos estuvieran en el rango adecuado. Actividad = (Abs410nm) / Ce) x 1000 x Vt) / h / Vf Actividad = (Abs410nm) / Ce) x 1000 x Vt) / h / Cps x Vf ~ 73 ~ 3.2.9. Análisis de Biodiésel 3.2.9.1. Producción de Biodiésel a escala de laboratorio, cinética y reutilización Para la producción de Biodiésel en el laboratorio, se utilizó el sobrenadante obtenido según el método explicado en el apartado 3.2.7. Para esto, se utilizó un cultivo de 5 ml de cada una de las bacterias lipolíticas seleccionadas, crecido durante toda la noche, para inocular un matraz con 25 ml de LB con un 2 % de tributirina hasta una DO600nm final de 0,1. Los matraces inoculados fueron cultivados durante 3 días a 30ºC y agitación rotacional de 200 rpm. Los cultivos se centrifugaron y se obtuvo el volumen completo del sobrenadante. Los sobrenadantes se trataron utilizando dos procedimientos antes de ser utilizados en las reacciones de transesterificación: A. Sobrenadante no procesado: se liofilizó, utilizando todo el extracto liofilizado directamente en una reacción de transesterificación. B. Sobrenadante procesado: Con la intención de eliminar sales, otros componentes del medio y la tributirina del sobrenadante se realizó un procedimiento de concentración seguido de una diálisis. Así, los sobrenadantes (25 ml de cada cultivo) se concentraron en membranas de diálisis, a una temperatura de 4ºC, durante toda la noche (tubo de membrana de diálisis, 12 KDa, D9527-100FT, SIGMA ALDRICH) usando polietilen glicol (PEG, 8 KDa, Sigma), luego se dializaron en tampón fosfato potásico 0,05 M (pH 7,6), realizando cuatro lavados de 30 minutos. Finalmente el sobrenadante concentrado y dializado resultante se liofilizó para ser utilizado en una reacción de transesterificación. La reacción de transesterificación se realizó con agitación continua, a 37ºC, durante 24 horas. La mezcla contenía 6 ml de aceite de girasol, 1,75 ml de etanol absoluto, 0,05 ml de NaOH 10 N y todo el sobrenadante, procesado o no procesado, procedente de los 25 ml de cultivo inicial. Al mismo tiempo se llevó a cabo un control negativo usando una mezcla de 6 ml de aceite de girasol, 1,75 ml de etanol absoluto y 0,05 ml de NaOH 10 N, sin sobrenadante. Los ésteres etílicos y glicéridos producidos en la reacción de transesterificación se analizaron usando cromatografía de gases (CG) como describiremos más adelante. ~ 74 ~ Para estudiar la cinética de la reacción, se recogieron muestras a distintos tiempos, tras iniciar la reacción de transesterificación antes descrita, y se analizaron por CG. Para cuantificar la estabilidad de los extractos enzimáticos en la producción de Biodiésel, los productos se centrifugaron, el sobrenadante se descartó y el precipitado se empleó para repetir la reacción de transesterificación y el análisis de CG. Ambos análisis se llevaron a cabo solo con sobrenadantes procesados. 3.2.9.2. Cromatografía de gases (CG) El método usado para el análisis químico del Biodiésel integra dos métodos oficiales, uno para la detección de ésteres (UNE EN ISO 14103) y otro para la detección de glicéridos (UNE EN ISO 14105), usando cetano (n-hexadecano) como patrón interno para cuantificar el contenido de glicerol, ésteres etílicos y mono-, di- y triglicéridos (Verdugo y col., 2010). Con este método modificado se obtiene un análisis completo de la muestra en una única inyección y una sola columna en un tiempo aproximado de 45 minutos, simplificando el proceso y aumentando la velocidad de análisis. Para el análisis se usó un cromatógrafo de gases Varian 430 GG conectado a una columna capilar HT5 (25 m x 0,32 mm, I.D x 0,1 µm, SGE, Supelco) con un detector de ionización por llama (FID) e inyección splitless. Para la preparación de la muestra, el producto de la reacción de transesterificación (12,5 µl) se mezcló con 4 ml de una mezcla etanol/diclorometano en proporción 1:1 (v/v) que a su vez contenía 0,1 g del patrón interno (cetano). Para el análisis se inyectaron en el cromatógrafo 0,5 µl de esta muestra preparada. El resultado se expresó en cantidades relativas de la suma del correspondiente éster etílico de ácido graso (FAEE) y algunos monoglicéridos (MG) de tiempos de retenciones menores (TR > 25 minutos) y la suma de cantidades de otros MG de TR mayores (TR > 25 minutos) y los diglicéridos (DG). El rendimiento se refiere a la cantidad relativa (%) de FAEE + MG (con TR menores) producidos. La conversión incluye la cantidad total (%) de triglicéridos transformados a FAEE, MG y DG. Se realizaron al mismo tiempo reacciones de controles negativos, las cuales sólo contenían una mezcla de aceite, etanol y NaOH. Los experimentos se repitieron al menos dos veces y se mostraron las medias de los resultados. Las condiciones cromatográficas empleadas se resumen en la Tabla 15. ~ 75 ~ Tabla 15. Condiciones cromatográficas empleadas en la determinación de ésteres etílicos y glicéridos en las muestras de Biodiésel Gas portador Helio, flujo 1,5 mL/min Modo inyección Splitless Temperatura inyector 350 ºC Temperatura detector 400 ºC Programa térmico Desde 90 ºC hasta 200 ºC a una velocidad de 7ºC/min, seguido de otra rampa desde 200 ºC hasta 360 ºC a una velocidad de 15 ºC/min, manteniendo los 360 ºC durante 10 minutos. 3.2.9.3. Determinación de la viscosidad La viscosidad se determinó utilizando un viscosímetro capilar Ostwald-Cannon-Fenske (Proton Routine Viscometer 33200, size 2150), midiendo el tiempo necesario para que un cierto volumen de líquido pase entre dos puntos marcados en el instrumento, colocado en posición vertical (Figura 12). Esto constituye una medida de la amortiguación que sufre el flujo del líquido, como consecuencia del frotamiento interno de sus moléculas, en función de sus viscosidades, siempre que se mantengan constantes las variables que influyen en el proceso, principalmente la temperatura. A partir del tiempo de flujo (t), expresado en segundos, se obtiene la viscosidad cinemática (ʋ) expresada en centistokes (cSt). Ésta se calcula mediante la fórmula ʋ x t = C, donde C es la constante de calibración del sistema de medida en cSt x s, que viene dada por el fabricante del aparato (0.10698 mm2/s, a 40 ºC, en este caso). ~ 76 ~ Figura 12. Viscosímetro capilar Ostwald-Cannon-Fenske Para las medidas de viscosidad se siguió el procedimiento descrito en la Norma Española UNE 55-105-73. La muestra, previamente centrifugada a 3.500 rpm durante 10 minutos, se sumergió en un baño termostatizado a 40 ºC durante 15 minutos, asegurándose de que la temperatura era estable. Posteriormente se introdujo la muestra en el viscosímetro y éste, a su vez, en el baño termostático, cuidando que estuviera situado en posición rigurosamente vertical, con el extremo inferior a una distancia mínima de 2 centímetros del fondo del baño. Se esperó el tiempo necesario para que se estableciera el equilibrio térmico, y una vez alcanzado, mediante un pequeño tubo de goma, se succionó haciendo subir el nivel de la muestra hasta alcanzar unos 5 milímetros por encima de la primera marca del viscosímetro. Se interrumpió la succión, dejando que el líquido descendiera libremente en el instrumento, poniendo en marcha el cronómetro en el momento en que el menisco superior pasó por la marca entre los dos bulbos, y parando el cronómetro en el momento que el menisco alcanzó la segunda marca. Se anotó el tiempo de flujo, expresado en segundos. Se repitió esta operación dos veces. 3.2.10. Ensayos in vitro de producción de proteínas Para este ensayo y el siguiente se transformaron células de E. coli DH5α con los genes de las lipasas/esterasas candidatas clonados en pGEM-T, siguiendo los pasos descritos a continuación: 1- Lo primero fue el diseño de los cebadores (Lip1-8F y R) para amplificar los genes candidatos desde el codón de inicio hasta el de terminación (Tabla 12). ~ 77 ~ 2- Estos cebadores se utilizaron para la amplificación de ADN genómico de Terribacillus sp. AE2B 122, con la enzima AcuPrime Taq High Fidelity que deja extremos de adenina libres para poder ligar posteriormente en pGEM-T. Las amplificaciones se separaron en un gel de agarosa al 0,8 % y las bandas del tamaño esperado se purificaron y ligaron en pGEM-T. Las ligaciones se transformaron en células competentes de E. coli DH5α. 3- Los transformantes que formaron colonias blancas se comprobaron mediante PCR de colonia y por restricción. Para la restricción se escogió una diana de restricción dentro del inserto (XhoI) y otra del plásmido (SphI) para comprobar la dirección del inserto en el vector. Se eligieron dos clones positivos de cada lipasa candidata y se utilizó el kit ExiProgenTM EC1 Protein Synthesis Kit (Bioneer), con los productos de PCR descritos en la Tabla 16, para sintetizar proteína in vitro. Tabla 16. Tabla de productos de PCR utilizados para la síntesis in vitro de proteínas PCR1 PCR2 Molde Primers Producto Molde Primers Producto Lipasa 1 pGEM-T-Lipase-1 MAO346 MAO347 920 pbs Producto PCR 1 + producto PCR terminador T7 MAO362 MAO364 982 pbs Lipasa 2 pGEM-T-Lipase-2 MAO348 MAO349 632 pbs 694 pbs Lipasa 3 pGEM-T-Lipase-3 MAO350 MAO351 956 pbs 1018 pbs Lipasa 4 pGEM-T-Easy- Lipase-4 MAO352 MAO353 998 pbs 1060 pbs Lipasa 5 pGEM-T-Lipase-5 MAO354 MAO355 938 pbs 1000 pbs Lipasa 6 pGEM-T-Lipase-6 MAO356 MAO357 761 pbs 823 pbs Lipasa 7 pGEM-T-Easy- Lipase-7 MAO358 MAO359 638 pbs 700 pbs Lipasa 8 pGEM-T-Easy- Lipase-8 MAO360 MAO361 1010 pbs 1072 pbs Terminador T7 pET-15b MAO363 MAO364 57 pbs ~ 78 ~ 4- Los productos de PCR1 (amplificación del ORF de cada lipasa candidata) se utilizaron como moldes en la reacción de amplificación PCR2 (Tabla 16), cuyos productos de amplificación quedarían como Promotor T7-RBS-ATG-ORF de la lipasa-Stop-Terminador T7. Los productos de la PCR 2 fueron los utilizados para la síntesis in vitro de proteínas. Las reacciones de síntesis in vitro de las proteínas se llevaron a cabo con ADN procedente de dos amplificaciones independientes de cada lipasa, excepto de la lipasa 8. En el lugar del duplicado de la lipasa 8 se utilizó la proteína Cloranfenicol Acetil Transferasa (CAT) amplificada para la síntesis in vitro de una proteína control. 5- De cada producto de la reacción in vitro se obtuvieron 0,6 ml, de los que 0,1 ml se utilizaron para la reacción de hidrólisis y 0,5 ml para la de transesterificación. La concentración de proteínas se determinó utilizando 0,1 ml de la mezcla de reacción mediante el método de Bradford. 3.2.11. Sobreexpresión de las lipasas/esterasas candidatas en E. coli BIVU111 Todos los productos de la PCR 1 utilizados en el ensayo in vitro (Tabla 16), se clonaron en pBC SK(+), linearizado con EcoRV y se transformaron en E. coli BIVU111, que es una cepa de expresión derivada de la cepa de E. coli BL21, que expresa la RNA polimeraza T7 la cual es específica del promotor T7, el cual es inducible por salicilato (de Lorenzo y col., 1993b). En nuestro caso el promotor T7 se encontraba en el plásmido pBC SK(+). Cada transformante se cultivó en medio TB o LB, incubándose a 37°C hasta una DO600nm entre 0,7 y 1, y se separaron cultivos que se indujeron o no con 0,1 mM de salicilato, incubándose a 30°C durante 4 horas o a 20°C durante 20 horas. Para cada transformante y condición (Tª y concentración de salicilato usada para la inducción), se recogieron 25 ml de sobrenadante y células provenientes de 50 ml de cultivo inducido. Tanto a las fracciones intracelulares (total y soluble) como a la extracelular se le determinó la concentración de proteínas mediante el método de Bradford y las actividades transesterificadora e hidrolítica. ~ 79 ~ 3.2.12. Purificación de las lipasas/esterasas con actividad transesterificadora a partir de Terribacillus sp. AE2B 122 Las proteínas presentes en el sobrenadante de Terribacillus sp. AE2B 122 se separaron mediante dos tipos de cromatografías: cromatografía de interacción hidrofófica y de exclusión molecular. La cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH) se basa en la unión reversible de las proteínas a ligandos hidrofóbicos inmovilizados (fase estacionaría). Durante la separación por CIH, los aminoácidos hidrofóbicos quedan expuestos y se unen a la matriz de la columna al usar un tampón con alta fuerza iónica. La elución se realiza utilizando un gradiente de disminución de la fuerza iónica del tampón (Queiroz y col., 2001). En la cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada filtración en gel o de tamiz molecular) las moléculas eluyen por orden decreciente de tamaño molecular (Duong-Ly & Gabelli, 2014; Hagel, 2011). Cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH) Se partió de cultivos de 2 L de Terribacillus sp. AE2B 122 con una DO600 inicial de 0,01 en medio PYA + 1,5% NaCl, repartidos en dos matraces de 5 L para obtener un volumen ocupado del 20% y así mantener las condiciones óptimas de aireación. Estos cultivos se crecieron a 30ºC y 200 rpm durante 72 h y se centrifugaron 1 h a 4000 rpm y 4ºC en una centrífuga preparativa. Posteriormente el sobrenadante se recogió, se introdujo en una membrana de diálisis de 12 KDa (SIGMA) y se concentró con PEG 8 KDa (SIGMA) toda la noche a 4ºC. El concentrado se dializó dividiéndolo en 2 vasos de 2 L de tampón fosfato potásico 0,05 M pH 7,6 con un 10% de sulfato de amonio (TPK+SA) durante 2 h. El dializado recuperado (35 ml) se filtró utilizando un filtro de membrana Millipore de 0,45 µm en un sistema de filtración STERIFIL conectado a una bomba de vacío. El volumen recuperado tras la filtración se pasó a través de una columna de CIH HiTrap Phenyl HP de 5ml (GE Healthcare). El procedimiento de purificación mediante FPLC (GE Akta Micro equipado con el software UNICORN) utilizado fue el siguiente: 1. Se lavó el sistema FPLC con H2O MilliQ. ~ 87 ~ 3.3. RESULTADOS 3.3.1. Selección y caracterización de microorganismos productores de Biodiésel Para la selección de organismos productores de Biodiésel se tuvo en cuenta no solo el método a seguir, sino también la elección de la zona de muestreo donde se esperaba encontrar organismos adaptados al crecimiento en ambientes lipídicos, como puede ser una almazara. Con respecto al método de selección utilizado se decidió seguir un sistema de tres pasos en el que se van descartando progresivamente cepas. En el primer paso se seleccionaron solo organismos lipolíticos con capacidad de hidrolizar tributirina. Los organismos lipolíticos seleccionados se sometieron a un segundo filtro más restrictivo en el que se seleccionaron por su capacidad para transesterificar el p-nitrofenol palmitato (pNP). Los extractos de las cepas capaces de transesterificar el pNP, con alta eficiencia, se sometieron a un análisis mediante cromatografía de gases para analizar los productos de la transesterificación de aceite de girasol. Finalmente, las mejores cepas que resultaron de este tercer análisis, se caracterizaron filogenéticamente mediante la secuenciación y el análisis del ARNr 16S, y bioquímicamente mediante el análisis en placa de distintas actividades enzimáticas (amilasa, proteasa, ADNasa, pululanasa y xilanasa). 3.3.1.1. Zona de muestreo y análisis Uno de los objetivos principales de este trabajo era obtener nuevos microorganismos capaces de producir Biodiésel a partir de aceites vegetales. Por eso, se seleccionaron zonas de muestreo ricas en aceites vegetales, en concreto cuatro zonas distintas de una almazara en Écija (Sevilla, España) a finales del mes de Enero de 2011. Las muestras se denominaron según la zona de la almazara donde se recogieron, denominando como balsa 1 (AE1B) y balsa 2 (AE2B) las muestras de balsas que contenían residuos líquidos de la almazara. La muestra de alpechín (AEA) se recogió de los residuos sólidos de la almazara y la última muestra, llamada “deshidratado de hojas” (AEDH), se obtuvo de residuos sólidos de la cosecha de aceitunas que contenían principalmente los restos de hojas y ramas. ~ 88 ~ Las características químicas y fisicoquímicas de las muestras recolectadas se muestran en la Tabla 18. El análisis de las muestras reveló que el elemento metálico más abundante en todas las muestras fue el Fe, aunque en la muestra AEDH se encontraron sólo diferencias mínimas entre el contenido de Fe, Mn, Cu y Zn. El resto de los elementos analizados fueron C > Ca > N > K > S > Mg > Na > P (del más al menos abundante). Las excepciones fueron la muestra AE2B donde no se detectó S, la muestra AEA donde el P fue más abundante que el Na y el N más abundante que el Ca, y la AEDH donde el Mg era más abundante que el S. El pH de todas las muestras estaba alrededor de 6,5, menos en la muestra de alpechín (AEA), la cual mostró un pH de 4,7. En la mayoría de las muestras la materia orgánica representaba el 30-40%, excepto en la muestra AEA, que fue la más rica en composición de materia orgánica (95,8%). ~ 89 ~ Tabla 18. Análisis químicos y físicos químicos de las muestras de la almazara Parámetros Muestrasa AE1B AE2B AEA AEDH C total (%) 16,24 22,490 66,410 22,970 N total (%) 0,894 0,616 1,169 0,819 S Total (%) 0,05594 N.Dd 0,100 0,052 K (%) 0,144 0,110 0,456 0,269 Na (mg/Kg) 61,234 130,597 168,019 235,668 Mg (%) 0,018 0,030 0,022 0,059 Ca (%) 1,602 1,500 0,074 1,861 P (mg/Kg) 36,755 43,541 280,390 168,848 Mn (mg/Kg) 63,528 95,033 12,015 125,528 Fe (mg/Kg) 599,663 651,608 139,812 151,260 Cu (mg/Kg) 73,277 49,632 27,195 140,325 Zn (mg/Kg) 19,163 14,253 29,750 11,955 pH (1/5) 6,84 6,55 4,68 6,27 C.E. 1/5 (mS/cm)b 1,68 2,62 3,89 2,14 Humedad (%) 5,460 4,690 5,819 5,179 M.O. (%)c 30,709 40,186 95,801 40,782 CaCO3 total (%) 9,499 8,808 1,262 6,314 a Todos los resultados se representan en relación a la masa seca de las muestras b C.E.: Conductividad Eléctrica c M.O.: Materia Orgánica d N.D.: No Detectado ~ 90 ~ 3.3.1.2. Primer paso de la selección: aislamiento de microorganismos con actividad lipolítica (hidrólisis) Como primer paso en el proceso de selección, se ensayó la actividad hidrolítica de los microorganismos de las distintas muestras tomadas en la almazara. Se utilizó un ensayo fácil y rápido, basado en la inspección visual de microorganismos formadores de halo de degradación alrededor de las colonias, en placas que contienen el sustrato lipídico tributirina, tal y como se describe en Material y Métodos. Para la separación de los microorganismos de las partículas de materia órgánica, un gramo de muestra de suelo se resuspendió en 3 ml de solución salina estéril (ClNa 0,85% p/v). Se aumentó el volumen de la suspensión con la misma solución salina (ClNa 0,85% p/v) hasta obtener un volumen de 25 ml. Para obtener colonias aisladas se sembraron distintas diluciones de la suspensión en medio sólido de LB, PDB, Agaragua, K9 A, K9 G o K9 Gamp, suplementado con 0,5% de tributirina. Durante esta primera ronda de selección, 1.016 colonias (hongos, levaduras y bacterias) se identificaron como productoras de halo de hidrólisis (Tabla 19). La muestra AEA fue la que mostró el menor número de bacterias lipolíticas aisladas y AE2B la que mostró mayor número. La mayoría de los microorganismos se obtuvieron en los medios K9 A, K9 G y K9 Gamp (68% de los hongos, 65% de las bacterias y 65% de las levaduras totales). Se decidió estudiar sólo las bacterias ya que a primera vista mostraron mayor diversidad fenotípica y por tanto, se seleccionaron las 291 bacterias lipolíticas aisladas para el posterior paso de selección. ~ 91 ~ Tabla 19. Distribución de los microorganismos lipolíticos aislados de las muestras de la almazara Muestra Total Bacterias Levaduras Hongos AE1B 256 61 21 174 AE2B 392 166 208 10 AEDH 248 57 190 1 AEA 128 7 70 51 Total 1.016 291 489 236 3.3.1.3. Segundo paso de selección: Análisis de la actividad transesterificadora en las bacterias lipolíticas aisladas Para este segundo paso de selección, se empleó un método basado en la transesterificación del p-nitrofenolpalmitato (p-NPP) con etanol para liberar el compuesto p-nitrofenol (p-NP) tal y como se ha descrito en Materiales y Métodos. Con el fin de seleccionar solo enzimas extracelulares, este segundo paso del proceso de selección se desarrolló usando únicamente el sobrenadante de las bacterias seleccionadas en el primer paso del método de selección y descartando las células. La selección se llevó a cabo cultivando cada bacteria lipolítica en 5 ml de LB, durante toda la noche. Estos cultivos se utilizaron para inocular tubos, con 5 ml de LB adicionado con un 2% de tributirina, a una DO600nm final de 0,1, que se incubaron durante 3 días a 30 ºC y 200 rpm. Posteriormente, el cultivo resultante se centrifugó, separando así las células del sobrenadante. Se tomaron 1,8 ml del sobrenadante y se liofilizaron. El sobrenadante liofilizado se utilizó en el ensayo de transesterificación, y se midió su absorbancia a 410 nm tras 16 h de reacción. Durante el proceso de selección se llevaron a cabo dos tipos distintos de reacciones control, una en ausencia de etanol y otra sin sobrenadante de las bacterias. El p-NP liberado bajo estas reacciones control se considera el resultado de una reacción de hidrólisis (en ausencia de etanol) o de una reacción no enzimática (en ausencia de sobrenadante). Los resultados de estos controles de hidrólisis se usaron como punto de ~ 92 ~ corte para determinar la existencia de actividad transesterificadora. El valor máximo de absorbancia a 410 nm obtenido en las reacciones de control de hidrólisis fue de 0,8. La reacción de transesterificación con todas las cepas lipolíticas seleccionadas en el primer paso del método, se llevó a cabo en paralelo. Todas las cepas bacterianas que mostraron valores de absorbancia por encima del punto de corte de DO600nm 0,8 se consideraron positivas, y los valores por debajo de este punto de corte se consideraron negativos (Tabla 20). Según los criterios descritos, 58 cepas se consideraron positivas, de estas, las 30 mejores, las cuales mostraron valores de absorbancias ≥1, fueron seleccionadas para posteriores análisis y cuantificación de la producción de Biodiésel a escala de laboratorio. Tabla 20. Clasificación y selección de bacterias mostrando actividad transesterificadora Absorbancia 410 nm Número de cepas Positivo/Negativo > 1 30 Positivo 1 – 0.8 28 Positivo < 0.8 233 Negativo 3.3.1.4. Tercer paso del método de selección: Selección de sobrenadantes bacterianos capaces de producir Biodiésel a escala de laboratorio El objetivo de este tercer paso fue identificar el mejor sobrenadante bacteriano en la producción de Biodiésel a escala de laboratorio. Para optimizar el protocolo de selección, primero se cultivaron las 30 bacterias seleccionadas, según lo indicado en materiales y métodos. En un primer intento los sobrenadantes no fueron procesados (ver Materiales y Métodos, apartado 3.2.9.1) y se liofilizaron directamente para obtener un polvo fino y seco que pudiera ser usado directamente para la producción de Biodiésel. La reacción de transesterificación para la producción de Biodiésel se llevó a cabo a pH básico con aceite de girasol, etanol y el sobrenadante liofilizado. Tras la finalización de la reacción, la mezcla de Biodiésel/lípido/ácido graso se analizó por CG. Los cromatogramas mostraron claras diferencias entre los tiempos de retención de los productos finales (FAEE + MG), iniciales (TG) e intermedios (DG) (Figura 13). ~ 93 ~ Figura 13. Cromatograma obtenido por CG de la mezcla de reacción tras la transesterificación del aceite de girasol y el etanol utilizando el sobrenadante procesado de la cepa AE2B 122. El cetano se usó como patrón interno. FAEE: Éster etílico de ácido graso; MG: Monoglicérido; DG: Diglicérido; TG: Triglicérido. La flecha de doble línea señala el tiempo de retención esperado para el glicerol (Luna y col., 2013; Verdugo y col., 2010) A diferencia del cromatograma de la mezcla de reacción tras la transesterificación de aceite de girasol y etanol utilizando el sobrenadante procesado de la cepa AE2B 122 (Figura 13), el cromatograma del aceite de girasol sin transesterificar (Figura 14) no contiene ninguna señal integrada, sólo muestra un acúmulo de picos a tiempos de retención elevados. ~ 94 ~ Figura 14. Cromatograma obtenido por CG del aceite de girasol. El cetano se usó como patrón interno. DG: Diglicérido; TG: Triglicérido. La flecha de doble línea señala el tiempo de retención esperado para el glicerol (Luna y col., 2013; Verdugo y col., 2010) El rendimiento de producción obtenido con este tipo de sobrenadante (no procesado) fue en todos los casos, menor del 22% (Figura 15). Por eso, para intentar mejorar el rendimiento de la producción de Biodiésel, los sobrenadantes de los cultivos fueron procesados (concentrados y dializados), tal y como se explica en Materiales y Métodos. Tras este procesamiento, se liofilizaron y utilizaron para los ensayos de producción de Biodiésel, observando que aumentaba drásticamente la producción (hasta 17,8 veces) en comparación con las muestras no procesadas alcanzando rendimientos cercanos al 100% (Figura 15). ~ 95 ~ Figura 15. Comparación de la producción de Biodiésel usando sobrenadante procesado y no procesado. Los sobrenadantes bacterianos se procesaron tal y como se describe en Materiales y Métodos. Ambos tipos de sobrenadantes (procesado y no procesado) fueron liofilizados y empleados en la reacción de transesterificación con aceite de girasol y etanol. Los resultados se muestran como porcentajes de FAE (FAEE + MG) producidos tras 24 h de reacción, usando 7 bacterias lipolíticas elegidas al azar. Los datos son la media de al menos 2 experimentos independientes Por tanto, descubrimos que con un proceso fácil y barato de concentración y diálisis se podía incrementar el rendimiento de la producción de Biodiésel. Una vez que este protocolo estuvo optimizado, se procedió a cuantificar la producción de Biodiésel en las 30 cepas bacterianas optimizadas y seleccionadas en el paso anterior. Los resultados completos de la reacción usando sobrenadantes procesados se muestran en la Tabla 21. Ya que la composición del Biodiésel es una mezcla de FAEEs y la composición del Biofuel que integran glicerol en forma de monoglicéridos es una mezcla de FAEs, el valor más importante a ser considerado es el porcentaje de FAE (FAEE + MG), el cual es una mezcla de 2 moles de FAEE y un mol de MG. Una vez analizados los datos, se observó que 5 de los sobrenadantes bacterianos fueron capaces de producir más de un 80% de FAEs, otros 10 sobrenadantes bacterianos produjeron entre 60-80% de FAEs, y la producción de los 15 restantes estaba por debajo del 60% de FAEs. ~ 102 ~ Tabla 22. Análisis filogenéticos de las cepas seleccionadas Muestra Cepa filogenéticamente relacionada Número de acceso % Similitud AE2B 29 Pseudomonas veronii AF064460 99-100 AE2B 30 AE2B 199 AE2B 222 AE2B 232 AE2B 263 AE2B 264 AE2B 332 AE2B 340 AE2B 130 Pseudomonas extremaustralis AJ583501 99-100 AE2B 133 AE2B 134 AE2B 261 AE2B 259 Pseudomonas grimontii CFML 97-514T; AF268029 AF268029 99 AE2B 85 Pseudomonas stutzeri AF094748 98-100 AE2B 120 AEDH 145 Acinetobacter lwoffii X81665 99 AE1B 89 Enterobacter ludwigii AJ853891 99-100 AE1B 90 AE1B 92 AE1B 20 Aeromonas hydrophila AJ508765 AJ508765 99 AE1B 22 Aeromonas media X60410 99-100 AE1B 27 AE1B 26 Bacillus simplex AJ439078 99-100 AE2B 250 AE1B 35 Bacillus muralis AJ316309 99 AE1B 28 Staphylococcus epidermidis ATCC 14990; D83363 D83363 99 AE1B 21 Terribacillus goriensisa T. saccharophilusa DQ519571 AB243845 99-100 AE2B 122 AE2B 131 aLas cepas AE1B 21, AE2B 122 y AE2B 131 mostraron el mismo % de similitud con ambos, T. goriensis y T. saccharophilus ~ 103 ~ La mayoría de estas cepas lipolíticas se obtuvieron de la muestra AE2B, obtenida de la balsa 2 (19 cepas): 16 de ellas pertenecen al género Pseudomonas, 2 de ellos al género Terribacillus y una cepa al género Bacillus. Diez de las cepas lipolíticas se obtuvieron de la muestra AE1B (balsa 1) y pertenecen a los géneros Enterobacter (3 cepas), Aeromonas (3 cepas), Bacillus (2 cepas), Staphylococcus (1 cepa) y Terribacillus (1 cepa). Solo una cepa se obtuvo de la muestra AEDH (deshidratado de hojas) y pertenece al género Acinetobacter. Un dato interesante es que no se seleccionaron cepas lipolíticas de la muestra AEA, obtenida del alpechín (Tabla 22). 3.3.1.7. Caracterización de las actividades hidrolíticas de las bacterias productoras de Biodiésel Para caracterizar las bacterias productoras de Biodiésel que se habían seleccionado, se analizó la actividad hidrolítica de estas 30 cepas. Para ello se sembraron en placas del medio adecuado conteniendo el correspondiente sustrato. Las actividades amilasa y ADNasa fueron las actividades hidrolítica más abundantes encontrada entre las bacterías aisladas (11 cepas). Ocho cepas mostraron actividad proteasa y 5 presentaron actividad pululanasa. Sin embargo, ninguna de ellas mostró actividad xilanasa (Tabla 23). Tres de las cepas (Aeromonas sp. AE1B 27, Aeromonas sp. AE1B 22 y Aeromonas sp. AE1B 20) mostraron todas las actividades hidrolíticas ensayadas (excepto xilanasa). Por el contrario, 12 de las cepas no mostraron ninguna actividad hidrolítica bajo nuestras condiciones de ensayo, lo que supone un 40% de los aislamientos. ~ 104 ~ Tabla 23. Actividades hidrolíticas de las 30 cepas bacterianas productoras de Biodiésel Muestra ADNasa Pululanasa Xilanasa Amilasa Proteasa AE2B 29 - - - - + AE2B 30 - - - - + AE2B 199 + - - + - AE2B 222 + - - + - AE2B 232 + - - + - AE2B 263 - - - - + AE2B 264 - - - - + AE2B 332 + - - + - AE2B 340 + - - + - AE2B 130 - - - - - AE2B 133 - - - - - AE2B 134 - - - - - AE2B 261 - - - - - AE2B 259 - - - - - AE2B 85 - + - + - AE2B 120 - + - + - AEDH 145 - - - - - AE1B 89 - - - - - AE1B 90 - - - - - AE1B 92 - - - - - AE1B 20 + + - + + AE1B 22 + + - + + AE1B 27 + + - + + AE1B 26 + - - - - AE2B 250 + - - - - AE1B 35 + - - - + AE1B 28 - - - + - AE1B 21 - - - - - AE2B 122 - - - - - AE2B 131 - - - - - ~ 105 ~ 3.3.2. Estrategias para la identificación y aislamiento de los genes y proteínas responsables de la actividad transesterificadora de Terribacillus sp. AE2B 122 Las cepas relacionadas con el género Terribacillus (AE2B 122 y AE1B 21), fueron las que proporcionaron mejores resultados en la producción de Biodiésel. Por tanto, se decidió continuar con una de ellas, en concreto Terribacillus sp. AE2B 122, para realizar un estudio más extenso. En primer lugar se trató de identificar el gen responsable de la actividad transesterificadora del sobrenadante de esta cepa, siguiendo las siguientes estrategias: Estrategia 1. Secuenciación y análisis bioinformático del genoma. Estrategia 2. Análisis del secretoma. Estrategia 3. PCR a tiempo real (RT) de las lipasas candidatas. Estrategia 4. Ensayos de producción in vitro de las lipasas candidatas y comprobación de su actividad transesterificadora. Estrategia 5. Sobreexpresión de las lipasas candidatas en E. coli BIVU111. Estrategia 6. Purificación a partir del propio organismo de la proteína responsable. 3.3.2.1. Estrategia 1. Secuenciación y análisis binformático del genoma de Terribacillus sp. AE2B 122 La secuenciación y ensamblaje del genoma de la cepa Terribacillus sp. AE2B 122, se realizó por la empresa BGI-HongKong Co., Ltd. Se utilizó una tecnología de secuenciación Illuminia de alto rendimiento para llevar a cabo la secuenciación de extremos emparejados de las muestras de ADN. En la Tabla 24 se muestra tanto la distribución del porcentaje de bases como la calidad de la secuencia a lo largo de las lecturas tras la filtración de los datos crudos de secuenciación. ~ 106 ~ Tabla 24. Datos de secuenciación y filtración de datos a Porcentaje de los conectores eliminados en los datos brutos b Porcentaje de la duplicación eliminada en los datos brutos c Tamaño de los datos limpios Los análisis del ensamblaje de la secuencia se realizaron usando el programa SOAPde novo, versión 1.05. El valor del parámetro clave K utilizado, para un resultado óptimo de ensamblaje, fue de 63. Tras la optimización del ensamblaje mediante el emparejamiento de extremos y las relaciones de solapamiento para construir contigs y supercontigs, se obtuvo el ensamblaje final de la secuencia con un total de 91 contigs, 22 supercontigs y un tamaño de 3.718.326 pbs (Tabla 25). Tabla 25. Resultados del ensamblaje tras la optimización Supercontig Contig Número total 22 91 Tamaño total (pbs) 3.725.516 3.718.326 N50 (pbs) 497.293 94.030 N90 (pbs) 134.116 29.455 Máxima longitud (pbs) 1.047.776 252.059 Mínima longitud (pbs) 529 200 %GC de la secuencia 42,88 42,88 Nota: la primera columna es la estadística de supercontig ≥ 500 pbs. La segunda columna es la estadística de los contigs obtenidos al romper los supercontig (≥ 500 pbs) de la primera columna con N El genoma se anotó utilizando el servidor RAST, el cual realiza anotaciones rápidas utilizando tecnología de subsistemas. Los datos estadísticos de esta anotación se muestran en la Tabla 26 y en la Figura 21. Nombre de muestra Tamaño de inserto (pbs) Datos brutos (Mb) a Conectores (%) b Duplicación (%) c Datos limpios (Mb) ADN AE2B 122 474 509 0,009 0,357 452 ~ 107 ~ Tabla 26. Datos estadísticos del genoma de Terribacillus sp. AE2B 122 con el servidor RAST Taxonomía Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Terribacillus sp Tamaño 3.718.326 bases Número de contigs* 91 Contenido GC (%)* 42,9 Tamaño del contig mas corto* 200 bases Tamaño del contig mediano 17.961 bases Tamaño medio de los contigs 40.860,7 bases Tamaño del contig mas largo* 252.059 bases ORFs 3.769 ARNs 42 Tamaño medio de ORF 863,24 bases *Estos datos coinciden con los de la Tabla 25 obtenidos con SOAPde novo ~ 108 ~ Figura 21. Distribución de los genes del genoma de Terribacillus sp. AE2B 122 en las categorías de subsistemas, utilizando el servidor RAST Tal y como se observa en la Figura 21, de los 3.769 ORFs anotados en el genoma de Terribacillus sp. AE2B 122, 1.632 se encontraban en subsistemas. La categoría de subsistemas que más genes abarcó (458 genes de 1.632) fue la del metabolismo de carbohidratos, y la que menos (4 genes de 1.632) fue la del metabolismo secundario. ~ 109 ~ También se identificaron homólogos de 7 genes en la categoría de fagos, profagos, transposones y plásmidos. Se identificaron 75 genes para el metabolismo de ácidos grasos, lípidos e isoprenoides. De estos genes, 8 se determinaron como posibles lipasas/esterasas candidatas responsables de la actividad transesterificadora. Para realizar unos análisis más detallados de las 8 lipasas candidatas se utilizaron herramientas bioinformáticas tanto del NCBI como de EXPASY: BLASTP; InterProScan; lipoP; signal P; PSORTb versión 3.0.2; y MyHits. Para la búsqueda de dominios y familias se utilizó Blastp, InterProScan y MyHits. Para determinar si las proteínas eran extracelulares o no se utilizaron los programas PSORTb, LipoP y signal P. A continuación se muestran en la Tabla 27 un resumen de los resultados más relevantes obtenidos del análisis bioinformático. Tabla 27. Análisis bioinformático de las lipasas/esterasas candidatas BlastP/ InterProScan/ MyHits Péptido señal y localización celular Proteína Superfamilias Multi-dominios Lipo P* Signal P* PSORTb Tel1 Familia fosfolipasas parecidas a la patatina (PLPs)  acilesterasa/fosfolipasa RssA  Dominio Acil transferasa/Acil hidrolasa/lisofosfolipasa No No Membrana citoplasmática Tel2 Familia II de lipasas** bacterianas (hidrolasa SGNH,GDSL)  SGNH, GDSL No No Citoplasmática Tel3 Familia esterasa/lipasa Familia IV de lipasas**  α/β-hidrolasa 3  Acetil esterasa-lipasa Aes No No Citoplasmática Tel4 Familia esterasa/lipasa Familia IV de lipasas**  α/β-hidrolasa 3  Acetil esterasa/-lipasa Aes Si No Membrana citoplasmática Tel5 Familia II de lipasas** bacterianas (hidrolasa SGNH,GDSL)  SGNH, GDSL Si Si Sin localización Tel6 Familia esterasa/lipasa  α/β-hidrolasa 5 No No Sin localización Tel7 Familia esterasa/lipasa Familia I.4 de lipasas**  Triacylglycerol esterasalipasa EstA  α/β-hidrolasa 6 Si Si Extracelular Tel 8 Familia esterasa/lipasa  α/β-hidrolasa 3  Acetil esterasa-lipasa Aes No No Citoplasmática *Predicción de presencia de péptido señal **Según alineamiento con el software Clustal Omega y filogenia con el software MEGA4 ~ 110 ~ 3.3.2.2. Estrategia 2: Análisis del secretoma de Terribacillus sp. AE2B 122 Una vez elucidada la secuencia del genoma nos planteamos un abordaje proteómico para identificar las proteínas secretadas, asumiendo que al menos una de ellas debería ser una lipasa/esterasa. En primer lugar se realizó la optimización de las condiciones de crecimiento de la cepa, para detectar aquellas condiciones que daban lugar a una mayor actividad transesterificadora, lo que nos serviría en el resto de estrategias de identificación del gen responsable de la actividad transesterificadora. Para esto se creció Terribacillus sp. AE2B 122 en distintos medios: PYA + 1,5% NaCl (PYA); PYA + 1,5% NaCl + 2% tributirina (PYAT); LB; y LB+2% tributirina (LBT), a 30ºC y 200 rpm. Se recogieron la fracciones intracelular y extracelular para realizar las medidas de actividad transesterificadora (Figura 22) a distintas horas (4, 7, 24, 48 y 72) y se analizó también la DO600 nm para controlar el crecimiento (Figura 23). Figura 22. Valores de la actividad transesterificadora específica de proteínas soluble en la mezcla de reacción del sobrenadante y de la fracción intracelular de Terribacillus sp. AE2B 122 a distintos tiempos. Se muestra el valor medio de 4 experimentos independientes. Intra: fracción intracelular; Extra: fracción extracelular ~ 111 ~ Como se aprecia en los resultados de la actividad transesterificadora (Figura 22), la mayor actividad transesterificadora se detecta a las 72 h de crecimiento en PYA, utilizando la fracción extracelular. Hay que destacar también el hecho de que los resultados de actividad extracelular en medio LB, desde la 48 h hasta las 72 h, presentan un error significativamente alto. Se pudo constatar una lisis celular a partir de las 24 h de crecimiento en medio LB, la cual permanecía incluso usando quelantes de Ca y Mg como el EDTA y EGTA, por lo que es posible que la lisis se deba a un proceso de quorum sensing y no a la presencia de fagos. Esta lisis celular que se detecta puede ser la responsable de los errores de la curva de crecimiento en medio LB, tras 24 h (Figura 23), ya que la recuperación del crecimiento tras el lisado en medio LB, al contrario que en LBT, es muy variable. Así, solo en medio LB se aprecia estos errores tan significativos en el crecimiento de la cepa y en la actividad transesterificadora. Figura 23. Curva de crecimiento de Terribacillus sp. AE2B 122 en distintos medios de cultivo El crecimiento de la cepa en medio PYA muestra los mejores resultados, llegando a las 48 h a la máxima DO600nm (1,4). El crecimiento en el medio PYAT se encuentra retrasado, comparado con el crecimiento en PYA, y en ningún caso la estirpe logra alcanzar la misma DO que en el medio sin tributirina (Figura 23). ~ 118 ~ Figura 29. Geles SDS-PAGE de la fracción intracelular (Intra) y extracelular (Extra) de la sobreexpresión de las distintas proteínas candidatas de Terribacillus sp. AE2B 122 en E. coli BIVU111 a 20ºC e inducidas con 0,1 mM de salicilato (I) y sin inducir (NI). Se cargaron entre 12 y 20 µl de muestras (7,5 μg). BIVU111: E. coli BIVU111 sin transformar; Tel1: E. coli BIVU111/Tel1; Tel2: E. coli BIVU111/Tel2; Tel3: E. coli BIVU111/Tel3; Tel4: E. coli BIVU111/Tel4; Tel5: E. coli BIVU111/Tel5; Tel6: E. coli BIVU111/Tel6; Tel7: E. coli BIVU111/Tel7; Tel8: E. coli BIVU111/Tel8 ~ 119 ~ Figura 30. Geles SDS-PAGE de la fracción intracelular de la sobreexpresión de las distintas proteínas candidatas de Terribacillus sp. AE2B 122 en E. coli BIVU111 a 20ºC e inducidas (+) con 0,1 mM de salicilato o sin inducir (-) y distinguiendo entre fracción soluble (SF) e insoluble (IF). Se cargaron entre 12 y 20 µl de muestras (7,5 μg). BIVU111: E. coli BIVU111 sin transformar; Tel1: E. coli BIVU111/Tel1; Tel2: E. coli BIVU111/Tel2; Tel3: E. coli BIVU111/Tel3; Tel4: E. coli BIVU111/Tel4; Tel5: E. coli BIVU111/Tel5; Tel6: E. coli BIVU111/Tel6; Tel7: E. coli BIVU111/Tel7; Tel8: E. coli BIVU111/Tel8. Las flechas indican las proteínas de interés En todos los casos los geles muestran bandas de los tamaños (KDa) esperados, sugiriendo que los genes se expresaron en las fracciones intracelulares (Figuras 29 y 30). En el gel donde se diferencia fracción intracelular soluble e insoluble (Figura 30), se aprecia que en todos los casos las proteínas se recuperaron en la fracción intracelular soluble. En los únicos casos donde la sobreexpresión resultó evidente fue para las proteínas Tel2, Tel3 y Tel8 (Figuras 29 y 30). ~ 120 ~ En primer lugar se midió la actividad hidrolítica (específica y total), de las fracciones intracelulares de los transformantes. Como controles se utilizaron las actividades hidrolíticas de la fracción intracelular de E. coli DH5α y extracelular de Terribacillus sp. AE2B 122 (Figuras 31 y 32). Se utilizaron dos tipos de controles de Terribacillus sp. AE2B 122, fracción extracelular concentrada y dializada en TPK-SA (1) y sin concentrar (2). Cada serie de experimentos se realizó por duplicado. De cada actividad se muestran las medias y errores de cada muestra. Figura 31. Valores de actividad hidrolítica específica (μmoles pNP/h/mg proteínas en la fracción liofilizada) de las fracciones intracelulares totales, intracelulares solubles y extracelulares. (1): resultados de actividad con el sobrenadante de Terribacillus sp. AE2B 122, crecido en medio PYA + 1,5% NaCl, a 30ºC y 200 rpm, durante 72 h, concentrado con PEG y dializado con TPK+SA; (2): resultados de actividad con el sobrenadante de Terribacillus sp. AE2B 122, crecido en PYA + 1,5% NaCl, a 30ºC y 200 rpm, durante 72 h; DH5α: resultados de actividad de la fracción intracelular de E. coli DH5α, crecido en medio LB a 30ºC y 200 rpm durante 20h. tel1, tel2, tel3, tel4, tel5, tel6, tel7 y tel8: fracción intracelular del transformante de E. coli BIVU111 que expresa el gen de una de las proteínas candidatas, crecido en LB, a 37ºC, e inducido 20h a 20ºC y con 0,1 mM de salicilato; BiVU111: control con la cepa E. coli BIVU111 sin plásmido ~ 121 ~ Figura 32. Valores de actividad hidrolítica total (μmoles pNP/h/ml fracción) de las fracciones intracelulares totales, intracelulares solubles y extracelulares. (1): resultados de actividad con el sobrenadante de Terribacillus sp. AE2B 122, crecido en PYA + 1,5% NaCl, a 30ºC y 200 rpm, durante 72 h, concentrado con PEG y dializado con TPK+SA; (2): resultados de actividad con el sobrenadante de Terribacillus sp. AE2B 122, crecido en PYA + 1,5% NaCl, a 30ºC y 200 rpm, durante 72 h; DH5α: resultados de actividad con la fracción intracelular de E. coli DH5α, crecido en LB a 30ºC y 200 rpm durante 20h. tel1, tel2, tel3, tel4, tel5, tel6, tel7 y tel8: fracción intracelular del transformante de E. coli BIVU111 que expresa el gen de una de las proteínas candidatas, crecido en LB, a 37ºC, e inducido 20h a 20ºC y con 0,1 mM de salicilato; BiVU111: control con la cepa E. coli BIVU111 sin plásmido Observando los resultados de la actividad hidrolítica específica y total se aprecia que la actividad de las proteínas Tel3, Tel6 y Tel8, expresadas en E. coli BIVU111, iguala el valor de actividad total de Terribacillus sp. AE2B 122, pero los valores más altos los presentan las enzimas candidatas Tel2 y Tel7, tanto en actividad hidrolítica específica como total (Figuras 31 y 32). En el caso de la actividad hidrolítica, el tratamiento de concentración del sobrenadante de Terribacillus sp. AE2B 122 [condiciones experimentales (1)] aumentó su actividad. ~ 122 ~ Los valores de actividad hidrolítica específica y total son distintos debido a que la referencia utilizada es diferente. En el caso de la actividad total se utiliza como referencia el volumen (ml) de fracción liofilizada y en la específica se utiliza la cantidad (mg) de proteínas en esa fracción liofilizada. Hay que interpretar convenientemente ambos valores de actividad ya que se trata de fracciones celulares con mezcla de proteínas desconocidas y no de una única proteína purificada. Por tanto, podríamos descartar fracciones con enzimas deseadas debido a que estas fracciones pueden contener gran cantidad de otras proteínas sin la actividad deseada, lo que reduciría notablemente el valor de actividad específica. En el caso de la actividad total, la cantidad de proteína no afecta al resultado, ya que las unidades se expresan por volumen (ml) de fracción. En paralelo se determinaron la actividad transesterificadora (específica y total), de las mismas fracciones intracelulares y extracelulares (Figuras 33 y 34). ~ 123 ~ Figura 33. Valores de actividad transesterificadora específica (μmoles pNP/h/mg de proteínas en la fracción liofilizada) de las fracciones intracelulares totales, intracelulares solubles y extracelulares. (1): resultados de actividad con el sobrenadante de Terribacillus sp. AE2B 122, crecido en PYA + 1,5% NaCl, a 30ºC y 200 rpm, durante 72 h, concentrado con PEG y dializado con TPK+SA; (2): resultados de actividad con el sobrenadante de Terribacillus sp. AE2B 122, crecido en PYA + 1,5% NaCl, a 30ºC y 200 rpm, durante 72 h; DH5α: resultados de actividad con la fracción intracelular de E. coli DH5α, crecido en LB a 30ºC y 200 rpm durante 20h. tel1, tel2, tel3, tel4, tel5, tel6, tel7 y tel8: fracción intracelular del transformante de E. coli BIVU111 que expresa el gen de una de las proteínas candidatas, crecido en LB, a 37ºC, e inducido 20h a 20ºC y con 0,1 mM de salicilato; BiVU111: control con la cepa E. coli BIVU111 sin plásmido ~ 124 ~ Figura 34. Valores de actividad transesterificadora total (μmoles pNP/h/ml fracción) de las fracciones intracelulares totales, intracelulares solubles y extracelulares. Terribacillus sp. AE2B 122 (1): resultados de actividad con el sobrenadante de Terribacillus sp. AE2B 122, crecido en PYA + 1,5% NaCl, a 30ºC y 200 rpm, durante 72 h, concentrado con PEG y dializado con TPK+SA; Terribacillus sp. AE2B 122 (2): resultados de actividad con el sobrenadante de Terribacillus sp. AE2B 122, crecido en PYA + 1,5% NaCl, a 30ºC y 200 rpm, durante 72 h; DH5α 20h: resultados de actividad con la fracción intracelular de E. coli DH5α, crecido en LB a 30ºC y 200 rpm durante 20h. tel1, tel2, tel3, tel4, tel5, tel6, tel7 y tel8: fracción intracelular del transformante de E. coli BIVU111 que expresa el gen de una de las proteínas candidatas, crecido en LB, a 37ºC, e inducido 20h a 20ºC y con 0,1 mM de salicilato; BiVU111: control con la cepa E. coli BIVU111 sin plásmido En las medidas de actividad transesterificadora específica y total de las enzimas en la fracción intracelular (soluble y total), ninguna muestra superó ni igualó la actividad del sobrenadante de la cepa Terribacillus sp. AE2B 122. Es importante destacar que la proteína Tel7 mostró la mayor actividad transesterificadora entre las proteínas candidatas, sin ser esta proteína una de las que se sobreexpresaron adecuadamente. ~ 125 ~ En el caso de la actividad transesterificadora, al contrario que para la actividad hidrolítica, el tratamiento de concentración realizado al sobrenadante de la bacteria afectó drásticamente a la actividad, haciéndola desaparecer (Figuras 33 y 34). Con las mismas fracciones celulares de la sobreexpresión en E. coli BIVU111, se realizó un ensayo de hidrólisis del sustrato MUF-butirato en placa multipocillo (Figura 35), donde se observó actividad de las enzimas Tel2, Tel3, Tel4, Tel7 y Tel8, siendo Tel3 y Tel8 las que más destacaron. Figura 35. Valores de actividad hidrolítica del sustrato MUF-butirato utilizando las distintas fracciones celulares de las lipasas candidatas sobreexpresadas en E. coli BIVU111. Tel1, Tel2, Tel3, Tel4, Tel5, Tel6, Tel7 y Tel8: proteínas candidatas expresadas en E. coli BIVU111 crecida en LB, a 37ºC, e inducida 20h a 20ºC, con 0,1 mM de salicilato; BiVU111: control con la cepa E. coli BIVU111 sin plásmido 3.3.2.6. Estrategia 6. Purificación de la proteína responsable de la actividad transesterificadora a partir del sobrenadante del cultivo de Terribacillus sp. AE2B 122 Debido a que con las estrategias anteriores no se llegó a resultados concluyentes, se procedió al intento de purificación de la enzima transesterificadora a partir del sobrenadante de Terribacillus sp. AE2B 122. Para la purificación se cultivó la bacteria en las condiciones óptimas para la detección de actividad transesterificadora determinadas previamente (PYA + 1,5% NaCl, a 30ºC y 200 rpm, durante 72 h). ~ 126 ~ En primer lugar se utilizó la cromatografía de intercambio hidrofóbico (CIH), ya que se conoce que las lipasas son enzimas altamente hidrofóbicas (Ribeiro y col., 2011). La CIH se realizó siguiendo el protocolo que se detalla en Materiales y Métodos. Se partió de un cultivo de 2 L de Terribacillus sp. AE2B 122, el sobrenadante de ese cultivo se concentró y posteriormente se dializó en TPK 0,05 M pH 7,6 adicionado con 10% de sulfato de amonio (SA). El volumen recuperado se filtró y utilizó en la purificación por CIH, donde se recuperaron 22 fracciones de 4 ml, que se concentraron con PEG y se dializaron en TPK 0,05 M y pH 7,6. Este paso de separación se repitió 11 veces, determinando en cada ocasión la actividad transesterificadora total y específica de cada fracción. A continuación se muestra un ejemplo de resultados de actividad total (Figura 36) y específica (Figura 37). En el caso de la actividad transesterificadora total (Figura 36) aparecen cuatro zonas de mayor actividad (rectángulos rojos), que aparecieron consistentemente en todas las repeticiones de la purificación mediante CIH. Figura 36. Resultados de la actividad transesterificadora total (μmoles pNP/h/ml sobrenadante liofilizado) de un ejemplo representativo de la separación por CIH del sobrenadante de Terribacillus sp. AE2B 122 La actividad específica es el resultado del cociente entre la actividad total y la concentración de proteínas en la fracción utilizada (Figura 37), que a diferencia de la actividad total, sólo muestra una zona de actividad con las primeras fracciones recogidas en la separación. ~ 127 ~ Esto se debe a que la concentración de proteínas en las fracciones aumentó a lo largo de la separación, siendo las últimas proteínas las de mayor superficie hidrofóbica. Estas proteínas corresponden a la concentración de una mezcla de proteínas entre las que podría estar la enzima responsable de la actividad buscada. De esta forma, la concentración de proteínas distintas a la proteína responsable de la actividad transesterificadora podría enmascarar una zona de fracciones con la actividad deseada. Por tanto, se utilizarán las cuatro zonas de actividad detectadas en los ensayos de actividad total, para no descartar ninguna fracción que pudiera contener la enzima deseada. Es decir, se trató de minimizar el riesgo de perder las fracciones de interés, aumentando los posibles falsos positivos. Figura 37. Resultados de la actividad transesterificadora específica (μmoles pNP/h/mg proteínas en la fracción liofilizada) de un ejemplo de separación por CIH del sobrenadante de Terribacillus sp. AE2B 122 Tras la separación de las proteínas mediante CIH, se prosiguió con el análisis de las proteínas de las 4 zonas de actividad en geles SDS-PAGE (Figuras 38 y 39). En la primera zona de actividad (Figura 38), se observaron dos bandas en la mayoría de las fracciones de las distintas repeticiones de la separación cromatográfica, una banda de 40-50 KDa y otra menor de ≈ 25 KDa. En las fracciones de la 4ª repetición, el bandeo fue distinto y además de las dos bandas mencionadas aparecieron muchas otras. ~ 230 ~ FC Neidhardt, JL Ingraham, KB Low, B Magasanik, M Schaechter, HE Umbarger, pp. 1190-219. Washington, D.C.: American Society for Microbiology Bajaj A, Lohan P, Jha PN, Mehrotra R. 2010. Biodiesel production through lipase catalyzed transesterification: An overview. J Mol Catal B-Enzym 62: 9-14 Bajpai D, Tyagi VK. 2006. Biodiesel: Source, Production, Composition, Properties and Its Benefits. J. Oleo Sci. 55: 487-502 Baker-Austin C, Dopson M, Wexler M, Sawers RG, Stemmler A, et al. 2007. Extreme arsenic resistance by the acidophilic archaeon 'Ferroplasma acidarmanus' Fer1. Extremophiles 11: 425-34 Basri M, Heng AC, Razak CAN, Wan Yunus WMZ, Ahmad M, et al. 1997. Alcoholysis of palm oil mid-fraction by lipase from Rhizopus rhizopodiformis. J Am Oil Chem Soc 74: 113-16 Bassegoda A, Pastor FI, Diaz P. 2012. Rhodococcus sp. strain CR-53 LipR, the first member of a new bacterial lipase family (family X) displaying an unusual Y-type oxyanion hole, similar to the Candida antarctica lipase clan. Appl Environ Microbiol 78: 1724-32 Bayer S, Kunert A, Ballschmiter M, Greiner-Stoeffele T. 2010. Indication for a new lipolytic enzyme family: isolation and characterization of two esterases from a metagenomic library. J Mol Microbiol Biotechnol 18: 181-7 Bouvet PJM, Grimont PAD. 1986. Taxonomy of the Genus Acinetobacter with the Recognition of Acinetobacter baumannii sp. nov. Acinetobacter haemolyticus sp. nov. Acinetobacter johnsonii sp. nov. and Acinetobacter junii sp. nov. and Emended Descriptions of Acinetobacter calcoaceticus and Acinetobacter lwofii. Int J Syst Bacteriol 36: 228-40 Branza-Nichita N, Negroiu G, Petrescu AJ, Garman EF, Platt FM, et al. 2000. Mutations at critical N-glycosylation sites reduce tyrosinase activity by altering folding and quality control. J Biol Chem 275: 8169-75 Brault G, Shareck F, Hurtubise Y, Lepine F, Doucet N. 2012. Isolation and characterization of EstC, a new cold-active esterase from Streptomyces coelicolor A3(2). PLoS One 7: e32041 Braun P, Tommassen J, Filloux A. 1996. Role of the propeptide in folding and secretion of elastase of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol 19: 297-306 Brisou J, Prevot AR. 1954. Studies on bacterial taxonomy. X. The revision of species under Acromobacter group. Ann Inst Pasteur (Paris) 86: 722-8 Brockerhoff H, Jensen RG. 1974. Lipolytic enzymes. Academic Press. Cai J, Xie Y, Song B, Wang Y, Zhang Z, Feng Y. 2011. Fervidobacterium changbaicum Lip1: identification, cloning, and characterization of the thermophilic lipase as a new member of bacterial lipase family V. Appl Microbiol Biotechnol 89: 1463-73 Cain JA, Solis N, Cordwell SJ. 2014. Beyond gene expression: the impact of protein posttranslational modifications in bacteria. J Proteomics 97: 265-86 Camacho F, Robles A, Gonzalez PA, Camacho B, Esteban L, Molina E. 2006. Mechanistic model for the lipase-catalyzed alcoholysis of triacylglycerols. Appl Catal A 301: 158-68 Canovas D, Cases I, de Lorenzo V. 2003. Heavy metal tolerance and metal homeostasis in Pseudomonas putida as revealed by complete genome analysis. Environ Microbiol 5: 1242-56 Cantarel BL, Coutinho PM, Rancurel C, Bernard T, Lombard V, Henrissat B. 2009. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res 37: D233-8 ~ 231 ~ Carlin A, Shi W, Dey S, Rosen BP. 1995. The ars operon of Escherichia coli confers arsenical and antimonial resistance. J Bacteriol 177: 981-6 Cavet JS, Borrelly GP, Robinson NJ. 2003. Zn, Cu and Co in cyanobacteria: selective control of metal availability. FEMS Microbiol Rev 27: 165-81 Cervantes C, Campos-Garcia J, Devars S, Gutierrez-Corona F, Loza-Tavera H, et al. 2001. Interactions of chromium with microorganisms and plants. FEMS Microbiol Rev 25: 335- 47 Cooksey DA. 1993. Copper uptake and resistance in bacteria. Mol Microbiol 7: 1-5 Cowan ST, Steel KJ. 1985. Manual para la identificación de bacterias de importancia médica. pp. 320. Continental. Cruz H, Perez C, Wellington E, Castro C, Servin-Gonzalez L. 1994. Sequence of the Streptomyces albus G lipase-encoding gene reveals the presence of a prokaryotic lipase family. Gene 144: 141-2 Cuypers A, Koistinen KM, Kokko H, Karenlampi S, Auriola S, Vangronsveld J. 2005. Analysis of bean (Phaseolus vulgaris L.) proteins affected by copper stress. J Plant Physiol 162: 383- 92 Cha JS, Cooksey DA. 1991. Copper resistance in Pseudomonas syringae mediated by periplasmic and outer membrane proteins. Proc Natl Acad Sci USA 88: 8915-9 Chahinian H, Ali YB, Abousalham A, Petry S, Mandrich L, et al. 2005. Substrate specificity and kinetic properties of enzymes belonging to the hormone-sensitive lipase family: comparison with non-lipolytic and lipolytic carboxylesterases. Biochim Biophys Acta 1738: 29-36 Chardin B, Dolla A, Chaspoul F, Fardeau ML, Gallice P, Bruschi M. 2002. Bioremediation of chromate: thermodynamic analysis of the effects of Cr(VI) on sulfate-reducing bacteria. Appl Microbiol Biotechnol 60: 352-60 Chattopadhyay AN, Dey A, Roy P, Chatterjee S, Saha P, Mukhopadhyay SK. 2014. Cold Active Extracellular Hydrolytic Enzyme Producing Culturable Heterotrophic Bacteria from NYÅLESUND, Arctic. IJBR 5: 271-78 Chen JW, Wu WT. 2003. Regeneration of immobilized Candida antarctica lipase for transesterification. J Biosci Bioeng 95: 466-9 Cheunga KH, Gu J-D. 2007. Mechanism of hexavalent chromium detoxification by microorganisms and bioremediation application potential: A review. Int Biodeter Biodegr 59: 8-15 Chirino Chace, Pilar B. 2009. Estudio funcional de la vía de degradación de 2-aminofenol presente en Burkholderia xenovorans LB400 y sus posibles aplicaciones en biotecnología ambiental. Universidad de Chile, Valparaíso, Chile. 72 pp. Choudhury R, Srivastava S. 2001. Zinc resistance mechanisms in bacteria. Curr Sci India 81: 768- 75 de la Fuente C, Clemente R, Bernal MP. 2008. Changes in metal speciation and pH in olive processing waste and sulphur-treated contaminated soil. Ecotoxicol Environ Saf 70: 207- 15 de Lorenzo V, Eltis L, Kessler B, Timmis KN. 1993a. Analysis of Pseudomonas gene products using lacIq/Ptrp-lac plasmids and transposons that confer conditional phenotypes. Gene 123: 17-24 ~ 232 ~ de Lorenzo V, Fernandez S, Herrero M, Jakubzik U, Timmis KN. 1993b. Engineering of alkyl- and haloaromatic-responsive gene expression with mini-transposons containing regulated promoters of biodegradative pathways of Pseudomonas. Gene 130: 41-6 de Pascale D, Cusano AM, Autore F, Parrilli E, di Prisco G, et al. 2008. The cold-active Lip1 lipase from the Antarctic bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 is a member of a new bacterial lipolytic enzyme family. Extremophiles 12: 311-23 De Simone G, Galdiero S, Manco G, Lang D, Rossi M, Pedone C. 2000. A snapshot of a transition state analogue of a novel thermophilic esterase belonging to the subfamily of mammalian hormone-sensitive lipase. J Mol Biol 303: 761-71 De Simone G, Menchise V, Manco G, Mandrich L, Sorrentino N, et al. 2001. The crystal structure of a hyper-thermophilic carboxylesterase from the archaeon Archaeoglobus fulgidus. J Mol Biol 314: 507-18 Delepelaire P. 2004. Type I secretion in gram-negative bacteria. Biochim Biophys Acta 1694: 149-61 Deng W, Li C, Xie J. 2013. The underling mechanism of bacterial TetR/AcrR family transcriptional repressors. Cell Signal 25: 1608-13 Du W, Xu Y, Liu D, Zeng J. 2004. Comparative study on lipasecatalyzed transformation of soyabeen oil for biodiesel production with acyl acceptors. J Mol Catal B-Enzym 30: 125– 29 Duong-Ly KC, Gabelli SB. 2014. Gel filtration chromatography (size exclusion chromatography) of proteins. Methods Enzymol 541: 105-14 Dworkin J. 2015. Ser/Thr phosphorylation as a regulatory mechanism in bacteria. Curr Opin Microbiol 24C: 47-52 Elend C, Schmeisser C, Leggewie C, Babiak P, Carballeira JD, et al. 2006. Isolation and biochemical characterization of two novel metagenome-derived esterases. Appl Environ Microbiol 72: 3637-45 Elomari M, Coroler L, Hoste B, Gillis M, Izard D, Leclerc H. 1996. DNA relatedness among Pseudomonas strains isolated from natural mineral waters and proposal of Pseudomonas veronii sp. nov. Int J Syst Bacteriol 46: 1138-44 Escudero LV, Casamayor EO, Chong G, Pedros-Alio C, Demergasso C. 2013. Distribution of microbial arsenic reduction, oxidation and extrusion genes along a wide range of environmental arsenic concentrations. PLoS One 8: e78890 Essghaier B, Dhieb C, Rebib H, Ayari S, Boudabous ARA, Sadfi-Zouaoui N. 2014. Antimicrobial Behavior of Intracellular Proteins from Two Moderately Halophilic Bacteria: Strain J31 of Terribacillus halophilus and Strain M3-23 of Virgibacillus marismortui. J Plant Pathol Microb 5: 1-7 Ewis HE, Abdelal AT, Lu CD. 2004. Molecular cloning and characterization of two thermostable carboxyl esterases from Geobacillus stearothermophilus. Gene 329: 187-95 Feller G, Thiry M, Gerday C. 1990. Sequence of a lipase gene from the antarctic psychrotroph Moraxella TA144. Nucleic Acids Res 18: 6431 Fu J, Leiros HK, de Pascale D, Johnson KA, Blencke HM, Landfald B. 2013a. Functional and structural studies of a novel cold-adapted esterase from an Arctic intertidal metagenomic library. Appl Microbiol Biotechnol 97: 3965-78 Fu Y, Tsui HC, Bruce KE, Sham LT, Higgins KA, et al. 2013b. A new structural paradigm in copper resistance in Streptococcus pneumoniae. Nat Chem Biol 9: 177-83 ~ 233 ~ Fukuda H, Kondo A, Noda H. 2001. Biodiesel fuel production by transesterification of oils. J Biosci Bioeng 92: 405-16 Garcia MT, Gallego V, Ventosa A, Mellado E. 2005. Thalassobacillus devorans gen. nov., sp. nov., a moderately halophilic, phenol-degrading, Gram-positive bacterium. Int J Syst Evol Microbiol 55: 1789-95 González-Bacerio J, Rodríguez Hernández J, del Monte Martínez A. 2010. Las lipasas: enzimas con potencial para el desarrollo de biocatalizadores inmovilizados por adsorción interfacial. Rev Colomb Biotecnol 12: 124-40 Gotz F, Verheij HM, Rosenstein R. 1998. Staphylococcal lipases: molecular characterisation, secretion, and processing. Chem Phys Lipids 93: 15-25 Graham MR, Smoot LM, Migliaccio CA, Virtaneva K, Sturdevant DE, et al. 2002. Virulence control in group A Streptococcus by a two-component gene regulatory system: global expression profiling and in vivo infection modeling. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 13855- 60 Green MR, Sambrook J. 2012. Molecular cloning : a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Gupta SD, Lee BT, Camakaris J, Wu HC. 1995. Identification of cutC and cutF (nlpE) genes involved in copper tolerance in Escherichia coli. J Bacteriol 177: 4207-15 Gutiérrez Corona JF, Cervantes C. 2008. Interacciones microbianas con el cromo: mecanismos y potencial biotecnológico. Ide@s CONCYTEG 3: 21-36 Hagel L. 2011. Gel filtration: size exclusion chromatography. Methods Biochem Anal 54: 51-91 Haki GD, Rakshit SK. 2003. Developments in industrially important thermostable enzymes: a review. Bioresour Technol 89: 17-34 Hama S, Yamaji H, Fukumizu T, Numata T, Tamalampudi S, et al. 2007. Biodiesel-fuel production in a packed-bed reactor using lipase-producing Rhizopus oryzae cells immobilized within biomass support particles. Biochem Eng J 34: 273–8 Hanahan D. 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol 166: 557-80 Handrick R, Reinhardt S, Focarete ML, Scandola M, Adamus G, et al. 2001. A new type of thermoalkalophilic hydrolase of Paucimonas lemoignei with high specificity for amorphous polyesters of short chain-length hydroxyalkanoic acids. J Biol Chem 276: 36215-24 Hantke K. 2001. Bacterial zinc transporters and regulators. Biometals 14: 239-49 Hemilae H, Koivula TT, Palva I. 1994. Hormonesensitive lipase is closely related to several bacterial proteins, and distantly related to acetylcholinesterase and lipoprotein lipase: identification of a superfamily of esterases and lipases. Biochim Biophys Acta 1210: 249- 53 Heyndrickx M, Lebbe L, Kersters K, De Vos P, Forsyth C, Logan NA. 1998. Virgibacillus: a new genus to accommodate Bacillus pantothenticus (Proom and Knight 1950). Emended description of Virgibacillus pantothenticus. Int. J. Syst. Bacteriol. 48: 99–106 Heyrman J, Logan NA, Rodriguez-Diaz M, Scheldeman P, Lebbe L, et al. 2005. Study of mural painting isolates, leading to the transfer of 'Bacillus maroccanus' and 'Bacillus carotarum' to Bacillus simplex, emended description of Bacillus simplex, re-examination of the strains previously attributed to 'Bacillus macroides' and description of Bacillus muralis sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 55: 119-31 ~ 234 ~ Hoffmann H, Stindl S, Stumpf A, Mehlen A, Monget D, et al. 2005. Description of Enterobacter ludwigii sp. nov., a novel Enterobacter species of clinical relevance. Syst Appl Microbiol 28: 206-12 Holland IB, Schmitt L, Young J. 2005. Type 1 protein secretion in bacteria, the ABC-transporter dependent pathway (review). Mol Membr Biol 22: 29-39 Hope GC, Dean ACR. 1974. Pullulanase synthesis in Klebsiella (Aerobacter) aerogenes strains growing in continuous culture. Biochem J 144: 403-11 Ilham Z, Saka S. 2009. Dimethyl carbonate as potential reactant in non-catalytic biodiesel production by supercritical method. Bioresour Technol 100: 1793-6 Ilham Z, Saka S. 2010. Two-step supercritical dimethyl carbonate method for biodiesel production from Jatropha curcas oil. Bioresour Technol 101: 2735-40 Ishikawa M, Ishizaki S, Yamamoto Y, Yamasato K. 2002. Paraliobacillus ryukyuensis gen. nov., sp. nov., a new Gram-positive, slightly halophilic, extremely halotolerant, facultative anaerobe isolated from a decomposing marine alga. J Gen Appl Microbiol 48: 269-79 Ishikawa M, Nakajima K, Itamiya Y, Furukawa S, Yamamoto Y, Yamasato K. 2005. Halolactibacillus halophilus gen. nov., sp. nov. and Halolactibacillus miurensis sp. nov., halophilic and alkaliphilic marine lactic acid bacteria constituting a phylogenetic lineage in Bacillus rRNA group 1. Int J Syst Evol Microbiol 55: 2427-39 Iso M, Chem B, Eguchi M, Kudo T, Shrestha S. 2001. Production of Biodiesel from triglycerides and ethanol using immobilized enzyme. J Mol Catal B Enzym 16: 53–58 Jaeger KE, Eggert T. 2002. Lipases for biotechnology. Curr Opin Biotechnol 13: 390-7 Jeffries CD, Holtman DF, Guse DG. 1957. Rapid method for determining the activity of microorganisms on nucleic acids. J Bacteriol 73: 590-1 Kaieda M, Samukawa T, Kondo A, Fukuda H. 2001. Effect of methanol and water contents on production of biodiesel fuel from plant oil catalyzed by various lipases in a solvent-free system. J Biosci Bioeng 91: 12-5 Kamble KD, Koche DK, Musaddiq M. 2010. Search of efficient DNase producing bacteria from soil. Deccan. Current Science 3: 162-69 Kapoor M, Gupta MN. 2012. Lipase promiscuity and its biochemical applications. Process Biochem. 47: 555-69 Kashima Y, Iijima M, Okamoto A, Koizumi Y, Udaka S, Yanahida F. 1998. Purification and characterization of intracellular esterases related to ethylacetate formation in Acetobacter pasteurianus. J Ferment Bioeng 85: 584-88 Kashima Y, Nakajima Y, Nakano T, Tayama K, Koizumi Y, et al. 1999. Cloning and characterization of ethanol-regulated esterase genes in Acetobacter pasteurianus. J Biosci Bioeng 87: 19- 27 Kawakami K, Oda Y, Takahashi R. 2011. Application of a Burkholderia cepacia lipase-immobilized silica monolith to batch and continuous biodiesel production with a stoichiometric mixture of methanol and crude Jatropha oil. Biotechnol Biofuels 4: 42 Kehres DG, Lawyer CH, Maguire ME. 1998. The CorA magnesium transporter gene family. Microb Comp Genomics 3: 151-69 Kim EY, Oh KH, Lee MH, Kang CH, Oh TK, Yoon JH. 2009. Novel cold-adapted alkaline lipase from an intertidal flat metagenome and proposal for a new family of bacterial lipases. Appl Environ Microbiol 75: 257-60 Kim HK, Park SY, Lee JK, Oh TK. 1998. Gene cloning and characterization of thermostable lipase from Bacillus stearothermophilus L1. Biosci Biotechnol Biochem 62: 66-71 ~ 235 ~ Kim YG, Hwang CY, Yoo KW, Moon HT, Yoon JH, Cho BC. 2007. Pelagibacillus goriensis gen. nov., sp. nov., a moderately halotolerant bacterium isolated from coastal water off the east coast of Korea. Int J Syst Evol Microbiol 57: 1554-60 Kim YJ, Choi GS, Kim SB, Yoon GS, Kim YS, Ryu YW. 2006. Screening and characterization of a novel esterase from a metagenomic library. Protein Expr Purif 45: 315-23 Kleeberg I, Welzel K, Vandenheuvel J, Muller RJ, Deckwer WD. 2005. Characterization of a new extracellular hydrolase from Thermobifida fusca degrading aliphatic-aromatic copolyesters. Biomacromolecules 6: 262-70 Koster M, Bitter W, Tommassen J. 2000. Protein secretion mechanisms in Gram-negative bacteria. Int J Med Microbiol 290: 325-31 Krishnamurthi S, Chakrabarti T. 2008. Proposal for transfer of Pelagibacillus goriensis Kim et al. 2007 to the genus Terribacillus as Terribacillus goriensis comb. nov. Int J Syst Evol Microbiol 58: 2287-91 Kuroda M, Hayashi H, Ohta T. 1999. Chromosome-determined zinc-responsible operon czr in Staphylococcus aureus strain 912. Microbiol Immunol 43: 115-25 Kwon HJ, Haruki M, Morikawa M, Omori K, Kanaya S. 2002. Role of repetitive nine-residue sequence motifs in secretion, enzymatic activity, and protein conformation of a family I.3 lipase. J Biosci Bioeng 93: 157-64 Lane DJ. 1991. 16S/23S rRNA sequencing In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics, ed. SEG M, pp. 115-48. Chichester, UK: Wiley Lebrun M, Audurier A, Cossart P. 1994. Plasmid-borne cadmium resistance genes in Listeria monocytogenes are similar to cadA and cadC of Staphylococcus aureus and are induced by cadmium. J Bacteriol 176: 3040-8 Lee D, Koh Y, Kim K, Kim B, Choi H, et al. 1999. Isolation and characterization of a thermophilic lipase from Bacillus thermoleovorans ID-1. FEMS Microbiol Lett 179: 393-400 Lee MH, Hong KS, Malhotra S, Park JH, Hwang EC, et al. 2010. A new esterase EstD2 isolated from plant rhizosphere soil metagenome. Appl Microbiol Biotechnol 88: 1125-34 Lee MH, Lee CH, Oh TK, Song JK, Yoon JH. 2006. Isolation and characterization of a novel lipase from a metagenomic library of tidal flat sediments: evidence for a new family of bacterial lipases. Appl Environ Microbiol 72: 7406-9 Lenfant N, Hotelier T, Velluet E, Bourne Y, Marchot P, Chatonnet A. 2012. ESTHER, the database of the a/b-hydrolase fold superfamily of proteins: tools to explore diversity of functions. Nucleic Acids Res 41: 423–29 Levisson M, van der Oost J, Kengen SW. 2007. Characterization and structural modeling of a new type of thermostable esterase from Thermotoga maritima. FEBS J 274: 2832-42 Li L, Du W, Liu D, Wang L, Li Z. 2006. Lipase-catalyzed transesterification of rapeseed oils for biodiesel production with a novel organic solvent as the reaction medium. J Mol Catal B Enzym 43 58–62 Li M, Yang LR, Xu G, Wu JP. 2013. Screening, purification and characterization of a novel coldactive and organic solvent-tolerant lipase from Stenotrophomonas maltophilia CGMCC 4254. Bioresour Technol 148: 114-20 Lim JM, Jeon CO, Song SM, Kim CJ. 2005. Pontibacillus chungwhensis gen. nov., sp. nov., a moderately halophilic Gram-positive bacterium from a solar saltern in Korea. Int J Syst Evol Microbiol 55: 165-70 Lindsay WL, Norvell WA. 1978. Development of a DTPA Soil Test for Zinc, Iron, Manganese, and Copper. Soil Sci Soc Am J 42: 421-28 ~ 236 ~ Liu J, Rosen BP. 1997. Ligand interactions of the ArsC arsenate reductase. J Biol Chem 272: 21084-9 Liu P, Wang YF, Ewis HE, Abdelal AT, Lu CD, et al. 2004. Covalent reaction intermediate revealed in crystal structure of the Geobacillus stearothermophilus carboxylesterase Est30. J Mol Biol 342: 551-61 Liu W, Jiang L, Guo C, Yang SS. 2010. Terribacillus aidingensis sp. nov., a moderately halophilic bacterium. Int J Syst Evol Microbiol 60: 2940-5 Liu Y, Liu T, Wang X, Xu L, Yan Y. 2011. Biodiesel synthesis catalyzed by Burkholderia cenocepacia lipase supported on macroporous resin NKA in solvent-free and isooctane systems. Energy Fuel 25 1206–12 Lopez NI, Pettinari MJ, Stackebrandt E, Tribelli PM, Potter M, et al. 2009. Pseudomonas extremaustralis sp. nov., a Poly(3-hydroxybutyrate) producer isolated from an antarctic environment. Curr Microbiol 59: 514-9 Lu J, Nogi Y, Takami H. 2001. Oceanobacillus iheyensis gen. nov., sp. nov., a deep-sea extremely halotolerant and alkaliphilic species isolated from a depth of 1050 m on the Iheya Ridge. FEMS Microbiol Lett 205: 291-7 Luna C, Sancho E, Luna D, Caballero V, Calero J, et al. 2013. Biofuel that Keeps Glycerol as Monoglyceride by 1,3-Selective Ethanolysis with Pig Pancreatic Lipase Covalently Immobilized on AlPO4 Support. Energies 6: 3879-900 Ma Q, Zhai Y, Schneider JC, Ramseier TM, Saier MH, Jr. 2003. Protein secretion systems of Pseudomonas aeruginosa and P. fluorescens. Biochim Biophys Acta 1611: 223-33 Maciaszczyk-Dziubinska E, Wawrzycka D, Wysocki R. 2012. Arsenic and antimony transporters in eukaryotes. Int J Mol Sci 13: 3527-48 Manco G, Febbraio F, Adinolfi E, Rossi M. 1999. Homology modeling and active-site residues probing of the thermophilic Alicyclobacillus acidocaldarius esterase 2. Protein Sci 8: 1789-96 Martinez-Perez O, Moreno-Ruiz E, Floriano B, Santero E. 2004. Regulation of tetralin biodegradation and identification of genes essential for expression of thn operons. J Bacteriol 186: 6101-9 Masomian M, Rahman RN, Salleh AB, Basri M. 2016. Analysis of Comparative Sequence and Genomic Data to Verify Phylogenetic Relationship and Explore a New Subfamily of Bacterial Lipases. PLoS One 11: e0149851 Mayr R, Busse HJ, Worliczek HL, Ehling-Schulz M, Scherer S. 2006. Ornithinibacillus gen. nov., with the species Ornithinibacillus bavariensis sp. nov. and Ornithinibacillus californiensis sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 56: 1383-9 McCue JT. 2009. Theory and use of hydrophobic interaction chromatography in protein purification applications. Methods Enzymol 463: 405-14 Meier R, Drepper T, Svensson V, Jaeger KE, Baumann U. 2007. A calcium-gated lid and a large beta-roll sandwich are revealed by the crystal structure of extracellular lipase from Serratia marcescens. J Biol Chem 282: 31477-83 Messaoudi A, Belguith H, Gram I, Hamida JB. 2010. Classification of EC 3.1.1.3 bacterial true lipases using phylogenetic analysis. Afr J Biotechnol 9: 8243-47 Meyer A, Gottheil O. 1901. Botanische beschreibung einiger bodenbakterien. Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. II 7: 680-91 ~ 237 ~ Miskin JE, Farrell AM, Cunliffe WJ, Holland KT. 1997. Propionibacterium acnes, a resident of lipid-rich human skin, produces a 33 kDa extracellular lipase encoded by gehA. Microbiology 143 ( Pt 5): 1745-55 Mittelbach M. 1990. Lipase catalyzed alcoholysis of sunflower oil. J Am Oil Chem Soc 67: 168-70 Modi MK, Reddy JR, Rao BV, Prasad RB. 2006. Lipase-mediated transformation of vegetable oils into biodiesel using propan-2-ol as acyl acceptor. Biotechnol Lett 28: 637-40 Modi MK, Reddy JR, Rao BV, Prasad RB. 2007. Lipase-mediated conversion of vegetable oils into biodiesel using ethyl acetate as acyl acceptor. Bioresour Technol 98: 1260-4 Molgaard A. 2003. Rhamnogalacturonan acetylesterase, a member of the SGNH-hydrolase family In Advances in Pectin and Pectinase Research, ed. FVHSRGF Visser, pp. 299-313. The Netherlands Kluwer Academic Montoro S, Martínez I, Navarro J, Takami H, García F, Sánchez A. 2009. Characterization of a novel termostable carboxylesterase from Geobacillus kaustophilus HTA426 shows the existence of a new carboxylesterase family. J. Bacteriol 191: 3076-85 Moore CM, Gaballa A, Hui M, Ye RW, Helmann JD. 2005. Genetic and physiological responses of Bacillus subtilis to metal ion stress. Mol Microbiol 57: 27-40 Morgan FJ, Adams KR, Priest FG. 1979. A cultural method for the detection of pullulan-- degrading enzymes in bacteria and its application to the genus Bacillus. J Appl Bacteriol 46: 291-4 Munkelt D, Grass G, Nies DH. 2004. The chromosomally encoded cation diffusion facilitator proteins DmeF and FieF from Wautersia metallidurans CH34 are transporters of broad metal specificity. J Bacteriol 186: 8036-43 Murphy J, Riley JP. 1962. A modified single solution method for the determination of phosphate in natural waters. Analytica Chimica Acta 27: 31-36 Nagai K, Ihara Y, Wada Y, Taniguchi N. 1997. N-glycosylation is requisite for the enzyme activity and Golgi retention of N-acetylglucosaminyltransferase III. Glycobiology 7: 769-76 Nardini M, Dijkstra BW. 1999. Alpha/beta hydrolase fold enzymes: the family keeps growing. Curr Opin Struct Biol 9: 732-7 Nardini M, Lang DA, Liebeton K, Jaeger KE, Dijkstra BW. 2000. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa lipase in the open conformation. The prototype for family I.1 of bacterial lipases. J Biol Chem 275: 31219-25 Nelson LA, Foglia TA, Marmer WN. 1996. Lipase-catalyzed production of biodiesel. J Am Oil Chem Soc 73: 1191–95 Nies DH, Silver S. 1995. Ion efflux systems involved in bacterial metal resistances. J Ind Microbiol 14: 186-99 Nishizawa M, Shimizu M, Ohkawa H, Kanaoka M. 1995. Stereoselective production of (+)-trans- chrysanthemic acid by a microbial esterase: cloning, nucleotide sequence, and overexpression of the esterase gene of Arthrobacter globiformis in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 61: 3208-15 Nthangeni MB, Patterton H, van Tonder A, Vergeer WP, Litthauer D. 2001. Over-expression and properties of a purified recombinant Bacillus licheniformis lipase: a comparative report on Bacillus lipases. Enzyme Microbiol Technol 28: 705-12 Nthangeni MB, Ramagoma F, Tlou MG, Litthauer D. 2005. Development of a versatile cassette for directional genome walking using cassette ligation-mediated PCR and its application in the cloning of complete lipolytic genes from Bacillus species. J Microbiol Methods 61: 225-34 ~ 238 ~ Nunes I, Tiago I, Pires AL, da Costa MS, Verissimo A. 2006. Paucisalibacillus globulus gen. nov., sp. nov., a Gram-positive bacterium isolated from potting soil. Int J Syst Evol Microbiol 56: 1841-5 Ogino H, Mimitsuka T, Muto T, Matsumura M, Yasuda M, et al. 2004. Cloning, expression, and characterization of a lipolytic enzyme gene (lip8) from Pseudomonas aeruginosa LST-03. J Mol Microbiol Biotechnol 7: 212-23 Ognjanovic N, Bezbradica D, Knezevic-Jugovic Z. 2009. Enzymatic conversion of sunflower oil to biodiesel in a solvent-free system: process optimization and the immobilized system stability. Bioresour Technol 100: 5146-54 Olsen SR, Cole CV, Watanabe FS, Dean LA. 1954. Estimation of available phosphorous in soil by extraction with sodium bicarbonate. Washington, D.C. : U.S. Dept. of Agriculture. 19 pp. Ordonez E, Letek M, Valbuena N, Gil JA, Mateos LM. 2005. Analysis of genes involved in arsenic resistance in Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. Appl Environ Microbiol 71: 6206-15 Overton TW. 2014. Recombinant protein production in bacterial hosts. Drug Discov Today 19: 590-601 Paez-Espino AD, Durante-Rodriguez G, de Lorenzo V. 2015. Functional coexistence of twin arsenic resistance systems in Pseudomonas putida KT2440. Environ Microbiol 17: 229-38 Páez-Espino D, Tamames J, de Lorenzo V, Cánovas D. 2009. Microbial responses to environmental arsenic. Biometals 22: 117-30 Pandey A, Selvakumar P, Soccol CR, Nigam P. 1999. Solid state fermentation for the production of industrial enzymes. Curr Sci 77: 149-62 Paula AV, Urioste D, Santos JC, de Castro HF. 2007. Porcine pancreatic lipase immobilized on polysiloxane-polyvinyl alcohol hybrid matrix: catalytic properties and feasibility to mediate synthesis of surfactants and biodiesel. J Chem Technol Biotechnol 82: 281–88 Pemberton JM, Kidd SP, Schmidt R. 1997. Secreted enzymes of Aeromonas. FEMS Microbiol Lett 152: 1-10 Perez C, Juarez K, Garcia-Castells E, Soberon G, Servin-Gonzalez L. 1993. Cloning, characterization, and expression in Streptomyces lividans 66 of an extracellular lipaseencoding gene from Streptomyces sp. M11. Gene 123: 109-14 Petersen EI, Valinger G, Solkner B, Stubenrauch G, Schwab H. 2001. A novel esterase from Burkholderia gladioli which shows high deacetylation activity on cephalosporins is related to beta-lactamases and DD-peptidases. J Biotechnol 89: 11-25 Petrarca P, Ammendola S, Pasquali P, Battistoni A. 2010. The Zur-regulated ZinT protein is an auxiliary component of the high-affinity ZnuABC zinc transporter that facilitates metal recruitment during severe zinc shortage. J Bacteriol 192: 1553-64 Popoff M, Veron M. 1976. A taxonomic study of the Aeromonas hydrophila-Aeromonas punctata group. J Gen Microbiol 94: 11-22 Porta Casanellas J, López-Acevedo Reguerín M, Rodríguez Ochoa R. 1986. Técnicas y Experimentos en Edafología. pp. 282. Pugsley AP. 1992. Translocation of a folded protein across the outer membrane in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 89: 12058-62 Qin HE, Yan X, Yun T, Dong W. 2008. Biodiesel production catalyzed by whole-cell lipase from Rhizopus chinensis. Chin J Catal 29 41–46 Queiroz JA, Tomaz CT, Cabral JM. 2001. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. J Biotechnol 87: 143-59 ~ 239 ~ Rademacher C, Masepohl B. 2012. Copper-responsive gene regulation in bacteria. Microbiology 158: 2451-64 Ramírez-Díaz MI, Díaz-Pérez C, Vargas E, Riveros-Rosas H, Campos-García J, Cervantes C. 2008. Mechanisms of bacterial resistance to chromium compounds. Biometals 21: 321-32 Ramos JL, Martinez-Bueno M, Molina-Henares AJ, Teran W, Watanabe K, et al. 2005. The TetR family of transcriptional repressors. Microbiol Mol Biol Rev 69: 326-56 Ranganathan SV, Narasimhan SL, Muthukumar K. 2008. An overview of enzymatic production of biodiesel. Bioresour Technol 99: 3975-81 Rao L, Xue Y, Zhou C, Tao J, Li G, et al. 2011. A thermostable esterase from Thermoanaerobacter tengcongensis opening up a new family of bacterial lipolytic enzymes. Biochim Biophys Acta 1814: 1695-702 Reder A, Hoper D, Weinberg C, Gerth U, Fraunholz M, Hecker M. 2008. The Spx paralogue MgsR (YqgZ) controls a subregulon within the general stress response of Bacillus subtilis. Mol Microbiol 69: 1104-20 Ren PG, Zhou PJ. 2005a. Salinibacillus aidingensis gen. nov., sp. nov. and Salinibacillus kushneri sp. nov., moderately halophilic bacteria isolated from a neutral saline lake in Xin-Jiang, China. Int J Syst Evol Microbiol 55: 949-53 Ren PG, Zhou PJ. 2005b. Tenuibacillus multivorans gen. nov., sp. nov., a moderately halophilic bacterium isolated from saline soil in Xin-Jiang, China. Int J Syst Evol Microbiol 55: 95-9 Rensing C, Grass G. 2003. Escherichia coli mechanisms of copper homeostasis in a changing environment. FEMS Microbiol Rev 27: 197-213 Reyes A, Leiva A, Cambiazo V, Mendez MA, Gonzalez M. 2006. Cop-like operon: structure and organization in species of the Lactobacillale order. Biol Res 39: 87-93 Ribeiro BD, de Castro AM, Coelho MA, Freire DM. 2011. Production and use of lipases in bioenergy: a review from the feedstocks to biodiesel production. Enzyme Res 2011: 615803 Robles-Medina A, Gonzalez-Moreno PA, Esteban-Cerdan L, Molina-Grima E. 2009. Biocatalysis: towards ever greener biodiesel production. Biotechnol Adv 27: 398-408 Rolain T, Bernard E, Beaussart A, Degand H, Courtin P, et al. 2013. O-glycosylation as a novel control mechanism of peptidoglycan hydrolase activity. J Biol Chem 288: 22233-47 Rosenstein R, Gotz F. 2000. Staphylococcal lipases: biochemical and molecular characterization. Biochimie 82: 1005-14 Roy S, Packer L. 1998. Redox regulation of cell functions by alpha-lipoate: biochemical and molecular aspects. Biofactors 8: 17-21 Royon D, Daz M, Ellenrieder G, Locatelli S. 2007. Enzymatic production of biodiesel from cotton seed oil using t-butanol as a solvent. Bioresour Technol 98: 648-53 Rua ML, Schmidt-Dannert C, Wahl S, Sprauer A, Schmid RD. 1997. Thermoalkalophilic lipase of Bacillus thermocatenulatus large-scale production, purification and properties: aggregation behaviour and its effect on activity. J Biotechnol 56: 89-102 Ruiz C, Blanco A, Pastor FI, Diaz P. 2002. Analysis of Bacillus megaterium lipolytic system and cloning of LipA, a novel subfamily I.4 bacterial lipase. FEMS Microbiol Lett 217: 263-7 Ruiz C, Falcocchio S, Pastor FI, Saso L, Diaz P. 2007. Helicobacter pylori EstV: identification, cloning, and characterization of the first lipase isolated from an epsilonproteobacterium. Appl Environ Microbiol 73: 2423-31 Saitou N, Nei M. 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol 4: 406-25