Aplicación de técnicas espectroscópicas vibracionales al estudio de la extractabilidad de compuestos fenólicos procedentes de subproductos enológicos.

APLICACIÓN DE TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS VIBRACIONALES AL ESTUDIO DE LA EXTRACTABILIDAD DE COMPUESTOS FENÓLICOS PROCEDENTES DE SUBPRODUCTOS ENOLÓGICOS Berta Baca Bocanegra Área de Nutrición y Bromatología. Facultad de Farmacia c/ P. García González 2. 41012 SEVILLA (Spain). Tel. (34) 954 55 67 61 Fax (34) 954 55 70 17 La tesis titulada “Aplicación de técnicas espectroscópicas vibracionales al estudio de la extractabilidad de compuestos fenólicos procedentes de subproductos enológicos”, presentada por la Lda. Dª. Berta Baca Bocanegra para optar al grado de Doctor, ha sido realizada en el Área de Nutrición y Bromatología del Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal (Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla), bajo la dirección de los Doctores D. Francisco José Heredia Mira, Catedrático de la Universidad de Sevilla y D. José Miguel Hernández Hierro, Profesor Ayudante Doctor de la Universidad de Sevilla. Considerando que se han alcanzado los objetivos inicialmente previstos, y que el trabajo reúne los requisitos necesarios, autorizan su presentación En Sevilla, a 31 de octubre de 2018. Fdo. Francisco José Heredia Mira Fdo. Berta Baca Bocanegra Fdo. José Miguel Hernández Hierro Directores de la Tesis Este trabajo ha sido realizado con el apoyo institucional de la Universidad de Sevilla mediante un Contrato Predoctoral PIF-2014 (V Plan Propio de Investigación - Convocatoria II.2) y con la ayuda para la realización de una estancia breve en el extranjero para el año 2017 (V Plan Propio de Investigación), gracias a la cual ha sido posible optar a la Mención Internacional del Título de Doctor. El trabajo se ha desarrollado en el ámbito del proyecto I+D+i del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España: “Evaluación de estrategias tecnológicas adaptativas para vinificación en condiciones de cambio climático” (AGL2014-58486-C2-2), del que el doctor Francisco José Heredia Mira es el investigador principal ÍNDICE PRODUCCIÓN CIENTÍFICA .............................................................. 1 RESUMEN ............................................................................................... 3 INTRODUCCIÓN ................................................................................... 9 1. ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL ................................... 11 2. UVA Y VINIFICACIÓN ................................................................. 15 2.1. Morfología y estructura de la uva ........................................................................ 15 2.2. Composición fenólica de la uva ............................................................................ 16 2.2.1. Flavonoides ..................................................................................................... 16 2.2.2. No flavonoides ................................................................................................. 19 2.3. Extractabilidad de los compuestos fenólicos de la uva....................................... 19 2.4. Vino tinto: composición y elaboración ................................................................ 21 3. MADERA DE ROBLE .................................................................... 23 3.1. El género Quercus. Clasificación y distribución geográfica .............................. 23 3.2. Composición química de la madera de roble ...................................................... 23 3.2.1. Compuestos volátiles ....................................................................................... 24 3.2.2. Compuestos fenólicos ...................................................................................... 25 3.3. Importancia de la madera de roble en el sector enológico ................................. 26 4. TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS ............................................ 29 4.1. Espectrofotometría de absorción en la región ultravioleta–visible ................... 31 4.2. Espectroscopía de infrarrojo ................................................................................ 32 4.2.1. Análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano ........................... 33 4.2.2. Espectroscopía en el infrarrojo mediante transformada de Fourier .............. 36 1 PRODUCCIÓN CIENTÍFICA La estructura de esta memoria sigue la modalidad “Conjunto de Trabajos”, recogida en el Artículo 9 de la Normativa Reguladora de Tesis Doctoral de la Universidad de Sevilla (Bous nº 3 de 23 de mayo de 2012), a partir de la siguiente producción científica: Artículos: Baca Bocanegra, Berta; Nogales Bueno, Julio; Heredia Mira, Francisco José; Hernández Hierro, José Miguel: Influence of oak wood chips-grape mix maceration on the extraction of anthocyanins from low-extractable anthocyanin content red grapes. En: European Food Research and Technology 2018. Vol. 244. Pág. 729–734, ISSN 1438-2377. Factor de impacto: 1.919. Segundo cuartil. Baca Bocanegra, Berta; Nogales Bueno, Julio; Heredia Mira, Francisco José; Hernández Hierro, José Miguel: Estimation of total phenols, flavanols and extractability of phenolic compounds in grape seeds using vibrational spectroscopy and chemometric tools. En: Sensors 2018. Vol. 18. Pág. 2426-2438, ISSN 1424-8220. Factor de impacto: 2.475. Segundo cuartil. Baca Bocanegra, Berta; Nogales Bueno, Julio; Hernández Hierro, José Miguel; Heredia Mira, Francisco José: Evaluation of extractable polyphenols released to wine from cooperage byproduct by near infrared hyperspectral imaging. En: Food Chemistry 2018. Vol. 244. Pág. 206–212, ISSN 0308-8146. Factor de impacto: 4.946. Primer cuartil. Baca Bocanegra, Berta; Hernández Hierro, José Miguel; Nogales Bueno, Julio; Heredia Mira, Francisco José: Feasibility study on the use of a portable micro near infrared spectroscopy device for the “in vineyard” screening of extractable polyphenols in red grape skins. En: Talanta, 2019. Vol. 192. Pág. 353–359, ISSN 0039-9140. Factor de impacto: 4.244. Primer cuartil. Baca Bocanegra, Berta; Nogales Bueno, Julio; García Estévez, Ignacio; Escribano Bailón, María Teresa; Hernández Hierro, José Miguel; Heredia Mira, Francisco José: Screening of wine extractable total phenolic and ellagitannin contents in revalorized cooperage byproducts: evaluation by Micro-NIRS technology. Enviado a: Food and Bioprocess Technology (en revisión). ISSN 1935-5130. Factor de impacto: 2.998. Primer cuartil. Baca Bocanegra, Berta; Nogales Bueno, Julio; Gorey, Brian; Heredia Mira, Francisco José; Byrne, Hugh J.; Hernández Hierro, José Miguel: On the use of vibrational spectroscopy and scanning electron microscopy to study phenolic extractability of cooperage byproducts in wine. Enviado a Food Chemistry (en revisión), ISSN 0308-8146. Factor de impacto: 4.946. Primer cuartil. 2 Baca Bocanegra, Berta; Nogales Bueno, Julio; Hernández Hierro, José Miguel; Heredia Mira, Francisco José: Valorization of American barrel-shoot wastes: effect of post fermentative addition and readdition on phenolic composition and chromatic quality of Syrah red wines. Enviado a: Food Chemistry (en revisión). ISSN 0308-8146. Factor de impacto: 4.946. Primer cuartil. RESUMEN 5 RESUMEN Las características de la uva en el momento de la vendimia condicionan en gran medida la calidad del vino elaborado a partir de ellas. En regiones de clima cálido, las altas temperaturas ambientales, acentuadas en las últimas décadas por los efectos del cambio climático, originan un desfase entre la madurez tecnológica de la uva, cada vez más temprana y la madurez fenólica, cada vez más tardía, que desencadena, entre otros, problemas de estabilidad cromática en el envejecimiento. Ante esta situación se pone de manifiesto la necesidad de implementar medidas de adaptación que permitan preservar la calidad de estos vinos. En este sentido, el aprovechamiento de subproductos de la industria vitivinícola ricos en compuestos fenólicos, como pueden ser las virutas de madera cruda de las tonelerías, añadidas en etapas iniciales de la vinificación, se presenta como una estrategia enológica, nueva y sostenible, para paliar los efectos del cambio climático en la calidad de los vinos tintos. Los compuestos fenólicos de la madera, que pasarán al vino durante el proceso de maceración, junto con los compuestos fenólicos procedentes de la uva, determinarán la composición fenólica del vino y condicionarán sus características cromáticas y organolépticas. Tradicionalmente, la composición fenólica, y la facilidad de cesión de estos compuestos al vino desde diferentes matrices, se ha controlado por métodos de análisis fisicoquímicos que, en muchos casos, resultan complejos y tediosos. En las últimas décadas se han desarrollado técnicas espectroscópicas que permiten estimar de forma rápida, no destructiva y respetuosa con el medio ambiente, distintos parámetros de interés enológico. En este trabajo, inicialmente se ha evaluado el efecto que tiene la adición de chips de madera en la extracción de compuestos antociánicos del hollejo de uva tinta clasificada hiperespectralmente como uva con baja capacidad de cesión de dichos compuestos. Se ha comprobado que la adición de copigmentos provenientes de la madera, que contribuyen a mejorar el color del vino, no altera el equilibrio de extracción de antocianos del hollejo. Se ha utilizado el análisis de imagen hiperespectral en la región del infrarrojo cercano y la regresión por mínimos cuadrados parciales (MPLS) para analizar de forma rápida el contenido total y el contenido extraíble de fenoles totales y flavanoles en semillas de uva tinta. De forma similar, se ha desarrollado un modelo MPLS para predecir el contenido fenólico extraíble en viruta cruda de roble. Se ha evaluado la capacidad de la espectroscopía NIR portátil para estimar in situ de forma rápida el contenido fenólico extraíble del hollejo de uva y de la viruta cruda de roble. La influencia de las condiciones ambientales en el viñedo en el momento de la adquisición espectral pueden condicionar los resultados obtenidos para los hollejos, de forma que los modelos presentan errores que comprometen su aplicación con fines predictivos. Sin embargo, en virutas de roble, los 6 modelos propuestos para la predicción del contenido extraíble de fenoles totales y de elagitaninos ofrecen resultados satisfactorios para todos los parámetros evaluados. Así mismo, utilizando espectroscopía en el infrarrojo medio por transformada de Fourier y espectroscopía Raman se han caracterizado muestras de viruta cruda de madera y se han relacionado las características espectrales con la facilidad de extracción de compuestos fenólicos. De esta forma, se ha podido confirmar la relación existente entre la extractabilidad de compuestos fenólicos en viruta de madera y la composición y distribución de los componentes de su pared celular. La microscopía electrónica de barrido (SEM) aporta información topográfica complementaria que respalda la relación entre la estructura de la madera y los niveles de extractabilidad fenólica. Por último, se ha evaluado objetivamente el potencial enológico de la viruta cruda de roble, subproducto de tonelería. Para ello se ha determinado, en una situación real de vinificación en tinto, la influencia de la adición post-fermentativa de virutas en la composición fenólica y la calidad cromática de vinos tintos de variedad Syrah. Los resultados obtenidos demuestran que la adición pos-fermentativa de viruta de madera cruda representa un procedimiento útil para la elaboración de vinos tintos en clima cálido, ya que produce una mejora tanto de la composición fenólica como de la calidad y estabilidad cromática. 7 ABSTRACT Wine quality mainly depends on the characteristics of harvested grapes. In warm climate regions, the production of quality red wines are facing serious problems related to high temperatures, more accused during last decades due to the effect of the climatic changes. Usually, there is a gap between saccharimetric and phenolic maturity, which causes, among others, chromatic stability problems during aging. Taking it into account, the need to implement adaptative strategies in order to preserve wine quality is evident. Utilization of byproducts from the wine industry such as raw oak shavings, as cooperage byproduct, represents a new and sustainable oenological strategy to minimize the effects of the climate change on the quality of red wines. Phenolic compounds of wood, which will release to wine during the maceration stage, together with phenolic compounds from grapes, will determine wine phenolic composition and its chromatic and organoleptic characteristics. Traditionally, phenolic composition and phenolic compounds extractability are determined by physical and chemical analyses, which are usually time consuming. During the past several decades, spectroscopic techniques have grown significantly, as technology improved. This growth has allowed developing fast, non-destructive and green chemistry methods for the screening of different parameters of value for oenology. The effect that copigments coming from oak wood chips presents on the anthocyanin extraction from red grape skins, previously classified by near infrared hyperspectral image analysis as low-extractable anthocyanin grapes, has been initially evaluated. In this work it has been proven that the addition of copigments coming from oak wood chips, that improve or stabilize wine colour, has not reduce the amount of extracted anthocyanins from red grape skin. Near infrared hyperspectral imaging and modified partial least squares regression (MPLS) have been applied to analyse, in a fast way, total and extractable content of total phenols and flavanols in red grape seeds. Similarly, a MPLS model has been developed in order to estimate extractable phenolic content in oak wood shavings. The capability of portable NIR spectroscopy to predict quickly and in situ extractable phenolic content in grape skins has been evaluated. Vineyard environmental conditions maybe play a critical role on its use and influence on the obtained data, so that the developed models present errors that compromise their application for predictive purposes. However, in oak wood shavings, the models proposed for the prediction of extractable content of total phenols and ellagitannins offer satisfactory results for all parameters evaluated. Likewise, Fourier transform infrared and Raman spectroscopy have shown to be useful to characterize oak wood shavings and to relate the more important spectral features to phenolic extractability. In this way, it has been confirmed the relationship between the extractability of 8 phenolic compounds in wood shavings and the composition and distribution of their cell wall compounds. Scanning electron microscopy (SEM) provided valuable topographic information that supports the relationship between the structure of wood and phenolic extractability levels. Finally, the oenological potential of raw oak wood shavings, as cooperage by-product, has been evaluated. For this purpose, it has been determined, in a real red vinification situation, the effect of post-fermentative addition of oak shavings on phenolic composition and chromatic quality of Syrah red wines. Based on the obtained results, post-fermentative addition of raw wood shavings could be considered a useful winemaking procedure for the production of high quality red wines in warm climate since it improves the phenolic composition as well as the quality and stability of colour. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 16 flavanoles, apareciendo tanto en forma de monómeros como de oligómeros y polímeros compuestos de distintas subunidades monoméricas (Ristic y Iland, 2005). 2.2. Composición fenólica de la uva Los compuestos fenólicos constituyen un grupo de sustancias químicas ampliamente distribuidas en el reino vegetal. En la uva, estos compuestos se encuentran repartidos por todo el fruto, tanto en semillas como hollejos y pulpa, y pasarán directamente al vino durante el proceso de maceración (Waterhouse, 2002). Existen más de 8000 estructuras fenólicas diferentes, que pueden variar desde una molécula fenólica sencilla a la de un polímero de alto peso molecular complejo (Balasundram, Sundram, y Samman, 2006). La estructura básica de todas ellas se caracteriza por un anillo aromático que lleva uno o más grupos hidroxilo, y pueden clasificarse en base al número y disposición de los átomos de carbono. Los principales compuestos fenólicos encontrados en la uva y sus derivados se pueden agrupar en flavonoides y no flavonoides (Cheynier, Moutounet, y Sarni-Machado, 2003). 2.2.1. Flavonoides Los flavonoides poseen un esqueleto básico de 15 átomos de carbono (C6-C3-C6), que en su nivel más simple consta de dos anillos fenilo (anillos A y B) conectados por un esqueleto de tres átomos de carbono que, generalmente, se encuentra formando un anillo heterocíclico (anillo C) (Figura 1) Figura 1.Estructura base de los flavonoides Las principales clases de flavonoides son flavanoles, flavonoles, flavonas, flavanonas, isoflavonas, chalconas y antocianos. Esta clasificación se realiza en función del grado de insaturación y sustituyentes del anillo C. UVA Y VINIFICACIÓN 17  Flavanoles Los flavan-3-oles son los flavonoides más abundantes en la uva. Los principales flavanoles monómeros de la uva son la (+) catequina y su isómero cis (-)-epicatequina, pudiendo encontrarse este último en forma de éster gálico (galato de epicatequina) (Cheynier, et al., 2003). No obstante, los monómeros representan tan solo una pequeña proporción, ya que la mayor parte de ellos están en forma de polímeros que se conocen como taninos condensados. Estos compuestos se localizan principalmente en las semillas, y también en cierta cantidad en hollejos, incluso se han detectado trazas de monómeros y dímeros en la pulpa. Los contenidos de flavanoles en las semillas son siempre superiores a los de los hollejos, ya se trate de monómeros, oligómeros o polímeros. Estos compuestos están implicados en importantes sensaciones organolépticas como el color vía pigmentación con los antocianos, la astringencia y el amargor del vino (Hufnagel y Hofmann, 2008a).  Flavonoles Los flavonoles constituyen una familia de compuestos con colores de blanco a amarillo cuya principal función es proteger al fruto de la radiación solar. Los cuatro principales flavonoles que pueden encontrarse en uva son kaempferol, quercetina, miricetina e isoramnetol. Se pueden encontrar en forma glucosilada (más abundante), pero se encuentran igualmente cantidades importantes de glucurónidos. Otros azúcares a los que pueden aparecer unidos los flavonoles son galactosa, xilosa y arabinosa (Cheynier, et al., 2003). Aparecen tanto en variedades blancas como en tintas, con concentraciones totales similares aunque si atendemos a los compuestos individuales las cantidades varían dependiendo de que se trate de uva blanca o tinta. Estos compuestos se encuentran principalmente en el hollejo de la uva aunque también han sido detectados en pulpa (Hernandez-Jimenez, Gomez-Plaza, Martinez- Cutillas, y Kennedy, 2009; Kammerer, Claus, Carle, y Schieber, 2004). Los flavonoles tienen cierta influencia en el amargor de los vinos (Preys, Mazerolles, Courcoux, Samson, Fischer, Hanafi, et al., 2006) y además pueden influir en la sensación de astringencia (Hufnagel, et al., 2008a; Hufnagel y Hofmann, 2008b). Por otro lado, contribuyen al color del vino tinto y a su estabilización ya que se comportan como buenos copigmentos de los antocianos (Boulton, 2001; Gómez-Míguez, González-Manzano, Escribano-Bailón, Heredia, y Santos-Buelga, 2006).  Antocianos Los antocianos son una familia de compuestos de naturaleza flavonoide que se localizan en el hollejo y, para las variedades tintoreras, también en la pulpa. Estos compuestos son muy importantes en las uvas y en el vino tinto tanto cuantitativa como cualitativamente, ya que se INTRODUCCIÓN 18 encuentran en cantidades bastante elevadas, siendo los responsables del color característico de estos productos (Crozier, Clifford, y Ashihara, 2006). Su estructura consta de un esqueleto con dos anillos bencénicos (A y B) unidos por una cadena de tres átomos de carbono ciclada en un heterociclo oxigenado, insaturado y catiónico, denominado catión flavilio (antocianidina). De todas las antocianidinas monoméricas que han sido descritas, cianidina, peonidina, delfinidina, petunidina y malvidina están ampliamente distribuidas en la uva y por tanto, en el vino. Las diferencias entre ellas se limitan a los distintos niveles de hidroxilación y metilación del catión flavilio (Figura 2). Además, los distintos azúcares y ácidos que esterifican a las antocianidinas y la posición donde aparece el enlace glucosídico permiten distinguir las diferentes familias de antocianos. La glucosa es el principal azúcar que aparece unido a las antocianidinas en uva, comúnmente en la posición 3 del anillo C. Los principales ácidos que esterifican el azúcar son el ácido acético, el ácido p-cumárico y el ácido cafeico. Teniendo esto en cuenta, los antocianos presentes en uva pueden agruparse según se encuentren acilados o no acilados y dentro de los acilados, según cual sea el ácido que esterifique al azúcar (acetatos, cumaratos o cafeoatos) (Cheynier, et al., 2003; Zamora, 2003). Antocianidina R R’ Cianidina OH H Delfinidina OH OH Peonidina OCH3 H Petunidina OCH3 OH Malvidina OCH3 OCH3 Figura 2. Estructura de las antocianidinas presentes en uva El color de los antocianos puede verse afectado por la existencia de procesos de copigmentación que son posibles gracias a la estructura plana de los antocianos y de los compuestos con los que interacciona mediante fuerzas débiles, denominados copigmentos (Boulton, 2001; Escribano-Bailon, et al., 2012; Trouillas, et al., 2016). Los ácidos fenólicos, los flavonoles y los flavanoles pueden actuar como copigmentos. Los antocianos están involucrados además en gran cantidad de reacciones a partir de las cuales se generan otros pigmentos derivados que, debido principalmente a su mayor estabilidad química, pueden ser responsables de ciertas tonalidades del color en los vinos tintos envejecidos según el tipo y la cantidad de pigmentos formados. UVA Y VINIFICACIÓN 19 2.2.2. No flavonoides Los compuestos no flavonoides son el resto de compuestos fenólicos que no comparten dicha estructura común. Este grupo incluye dos grandes familias: los ácidos fenólicos, divididos en ácidos hidroxibenzóicos y ácidos hidroxicinámicos, y los estilbenos.  Acidos fenólicos Los ácidos hidroxicinámicos son los ácidos fenólicos más comunes en la uva, se encuentran en las vacuolas de las células del hollejo y la pulpa, siendo el contenido en el hollejo más elevado que en la pulpa. Estos ácidos se pueden encontrar tanto libres como esterificados con otros compuestos tanto de naturaleza flavonoide como no flavonoide. Los más importantes son los ácidos cafeico, ferúlico y p-cumárico, así como sus ésteres tartáricos, denominados ácidos caftárico, fertárico y cutárico, respectivamente. La forma natural es la trans (E) pero los isómeros cis (Z) también existen aunque en pequeña cantidad. Durante el proceso de vinificación, estos ésteres pueden hidrolizarse de manera que en el vino coexisten las formas libres y esterificadas (Crozier, et al., 2006). En cuanto a ácidos benzoicos, la uva contiene principalmente ácido gálico, presente en forma de éster de flavanoles. Este ácido puede alcanzar concentraciones superiores a 100 mg L-1 en vino tinto (Cheynier, et al., 2003). Los ácidos fenólicos no presentan una influencia demasiado relevante en el sabor ni en el aroma de los vinos, pero sí son precursores de compuestos fenólicos volátiles que pueden afectar a estas propiedades organolépticas. Además, estos compuestos pueden afectar al color del vino ya que han demostrado ser capaces de reaccionar con los antocianos.  Estilbenos Bajo el punto de vista del color y de otras propiedades organolépticas, los estilbenos no presentan importancia destacable. No obstante, últimamente han cobrado una gran relevancia científica debido a los efectos beneficiosos que el resveratrol y otros compuestos parecen ejercer sobre la salud humana. 2.3. Extractabilidad de los compuestos fenólicos de la uva Las propiedades y la calidad del vino dependen no solo de la composición fenólica cualitativa y cuantitativa de las uvas utilizadas para su elaboración sino también de la facilidad con que estos compuestos son cedidos al vino durante el proceso de vinificación. El estado de maduración de la uva en el momento de la vendimia va a influir de manera importante en este proceso ya que la liberación de los compuestos fenólicos de las partes sólidas INTRODUCCIÓN 20 de las uvas (semillas y hollejos) requiere la degradación de la pared celular. Sin embargo, hay que tener en cuenta que en los hollejos, la extractabilidad fenólica aumenta con la madurez, mientras que en las semillas disminuye (Ribéreau-Gayon, et al., 2006). En el hollejo de uva, la extracción de compuestos fenólicos aumenta a medida que aumenta el contenido de sólidos solubles en el mosto de uva, es decir, con el grado de madurez de la uva (Fournand, Vicens, Sidhoum, Souquet, Moutounet, y Cheynier, 2006; Torchio, Cagnasso, Gerbi, y Rolle, 2010; Zouid, Siret, Jourjon, Mehinagic, y Rolle, 2013). Además, se ha demostrado que diferentes etapas de la maduración de la uva (premaduración, maduración y sobremaduración) afectan a la cantidad de fenoles extraíbles de la misma manera que lo hacen sobre el total de sólidos solubles (Canals, Llaudy, Valls, Canals, y Zamora, 2005; Fournand, et al., 2006; Hernandez-Hierro, Quijada-Morin, Rivas-Gonzalo, y Escribano-Bailon, 2012) como consecuencia de las diferencias en la composición polisacarídica de la pared celular del hollejo y de la diferente metilación de las pectinas que forman la misma en las diferentes etapas de maduración de la uva. Este parámetro de extracción de compuestos fenólicos también se ve afectado por las condiciones de maceración de la uva (González-Manzano, Rivas-Gonzalo, y Santos-Buelga, 2004). En lo que respecta a las propiedades físicas del hollejo, el espesor de dicha pared o la densidad de la misma deben ser también consideradas en la evaluación de la extracción de los compuestos fenólicos de la uva (Ortega-Regules, Romero-Cascales, Ros-García, López- Roca, y Gómez-Plaza, 2006). Por lo que respecta a la semilla de uva, la extractabilidad disminuye durante la maduración, de aproximadamente el 25% en las primeras etapas a aproximadamente el 5% en la última (Rodriguez-Pulido, Hernández-Hierro, Nogales-Bueno, Gordillo, Gonzalez-Miret, y Heredia, 2014). Este fenómeno podría estar relacionado con la presencia del tegumento intermedio, que es impermeable y muy duro cuando las semillas maduran y lignifican, y podría evitar la extracción (Cadot, Minana-Castello, y Chevalier, 2006). Por otro lado, cambios en la estructura polisacarídica de la pared celular podría afectar la solubilidad de los flavonoides (Bautista-Ortín, Jiménez-Pascual, Busse-Valverde, López-Roca, Ros-García, y Gómez-Plaza, 2013). Además, la maceración enzimática, normalmente utilizada en el proceso de elaboración del vino para degradar la pared celular del hollejo con el fin de aumentar el color, también puede favorecer la extracción de flavonoides procedentes de las semillas debido a la degradación de la pared celular de las semillas, especialmente si están inmaduras y muestran baja lignificación. UVA Y VINIFICACIÓN 21 2.4. Vino tinto: composición y elaboración (Asselin y Delteil, 2003; Carbonneau, Champagnol, Deloire, y Sevilla, 2003; Razungles, Blouin, Boulet, Escudier, Feuillat, Flanzy, et al., 2003; Ribéreau-Gayon, et al., 2006; Zamora, 2003) El vino tinto se define como el producto resultante de la fermentación alcohólica del mosto obtenido a partir de la uva tinta. Durante la vinificación se forman diferentes sustancias que, junto con las presentes originariamente en la uva, y en función de la tecnología empleada para la elaboración y envejecimiento del vino, determinan la composición del mismo. Entre los compuestos fenólicos presentes en el vino, poseen un especial interés los compuestos de estructura flavonoide, tanto por su contribución a las propiedades sensoriales del vino (color, sabor, astringencia y amargor) (Arnold, Noble, y Singleton, 1980) como por el posible efecto fisiológico que pueden tener consecuencia de su actividad antioxidante y captadora de radicales libres (Teissedre, Frankel, Waterhouse, Peleg, y German, 1996). Estos compuestos se encuentran principalmente en el hollejo y la semilla de la uva, desde donde son extraídos al medio líquido durante el proceso de vinificación. Las etapas más importantes en la elaboración del vino tinto se detallan a continuación:  Maceración y fermentación alcohólica El proceso de maceración comprende desde el momento en que se llena la cuba con la uva hasta el descube del vino, esto es, antes, durante y después de la fermentación. A lo largo de estos procesos se produce la extracción de los compuestos procedentes de la uva al mosto a partir del que se generará el vino. Durante la maceración pre-fermentativa el medio es acuoso y se encuentra a una temperatura moderada, extrayéndose principalmente los antocianos y los flavonoles de la piel de la uva, así como parte de los polisacáridos. A continuación ocurre la fermentación alcohólica, durante la cual la glucosa es transformada por las levaduras presentes en etanol, convirtiendo el medio en hidroalcohólico. Este medio facilita la extracción de compuestos fenólicos del hollejo y permite la extracción de compuestos fenólicos presentes en la semilla. Además durante este periodo comienzan a darse algunas interacciones entreantocianos y flavanoles. Por último tiene lugar la maceración post-fermentativa, desde que finaliza la fermentación hasta el descube del vino. Durante esta etapa, continúa la extracción de taninos, principalmente desde la semilla de la uva.  Fermentación maloláctica Este proceso, esencial en los vinos tintos, se produce tras la fermentación alcohólica y en él intervienen las bacterias lácticas que, de manera natural, se encuentran en la uva. Su misión es transformar el ácido málico en ácido láctico, lo que, en cuanto a sabor se refiere, consigue la disminución de la acidez en el vino. El ácido láctico resulta más suave que el málico, por lo que tiene lugar un aumento de la untuosidad y los aromas en el vino, y se asegura una mayor INTRODUCCIÓN 22 estabilidad biológica ya que, al desaparecer el ácido málico que sirve como nutriente a las bacterias lácticas, es difícil que éstas proliferen en el medio provocando riesgos bilógicos. Además de la generación de ácido láctico, durante la fermentación maloláctica se liberan al medio diferentes sustancias que pueden afectar principalmente al aroma y al sabor del vino, tanto positiva como negativamente.  Envejecimiento El vino es un medio en constante evolución por lo que el envejecimiento se produce hasta el momento de su consumo. En condiciones idóneas, durante este tiempo el vino consigue una perfecta maduración, afinando sus características organolépticas. Durante el envejecimiento en barricas de roble, tienen lugar diversos procesos mediante los cuales el vino gana en complejidad y estabilidad. Por una parte la madera permite una entrada de oxígeno de manera moderada, vital para que se den las reacciones de polimerización y combinación entre antocianos y flavanoles que conllevan a la estabilización del color y a la modulaciónde la astringencia. Por otra parte, se produce la precipitación de parte de la materia colorante del vino, evitando así que aparezcan precipitados durante la permanencia del vino en botella. Además, como se detalla más adelante, el roble aporta gran cantidad de compuestos al vino: sustancias volátiles y compuestos fenólicos, tanto nativos de la madera como formados durante el secado y tostado de la misma, que mejoran el aroma y la calidad gustativa del vino. Las sustancias volátiles aportan aromas característicos al vino que solo se consiguen mediante el envejecimiento. Los compuestos fenólicos participan principalmente en el sabor, aunque algunos de ellos tienen también importancia en la evolución del vino y en las transformaciones que sufren los pigmentos responsables del color. MADERA DE ROBLE 23 3. MADERA DE ROBLE 3.1. El género Quercus. Clasificación y distribución geográfica El termino roble hace referencia a las más de 150 especies de árboles que agrupa el género Quercus, perteneciente a la familia de las fagáceas. Son árboles de gran porte por lo general, aunque también se incluyen arbustos. Entre las diversas especies que componen este género, Quercus alba L., Quercus petraea (Matt.) Liebl. y Quercus robur L.son las tres especies con mayor relevancia en el sector enológico (Vivas, 2002). La mayor parte de estas especies de alto valor enológico se encuentran ampliamente distribuidas a lo largo de Europa, América del norte y América central, el sudeste asiático y en menor medida, en el norte de África y la región norte de Sudamérica. No obstante, las principales zonas productoras de las tres especies de roble de interés enológico son Francia y los Estados Unidos de América. En Francia se pueden encontrar tanto robles de la especie Quercus petraea, como de la especie Quercus robur. La especie Quercus petraea se cultiva principalmente en las regiones Centro de Francia, Borgoña y Vosges donde se adapta bien a los suelos arenosos y no requiere demasiada luminosidad. Mientras que la especie Quercus robur crece fundamentalmente en la zona de Limusin y requiere suelos fértiles y mucha más luminosidad. La especie Quercus alba procede de América del Norte siendo las principales áreas de producción los bosques de los estados de Virginia, Carolina del Norte, Tennessee, Kentucky, Missouri y Oregón (Vivas, 2002; Zamora, 2003). Por este motivo, tradicionalmente en tonelería se habla de roble francés o roble americano sin hacer distinción entre especies. 3.2. Composición química de la madera de roble La madera de roble posee una amplia variabilidad en su composición química determinada por factores como la especie, el origen geográfico, las condiciones de cultivo o la edad de la madera (Mosedale, Puech, y Feuillat, 1999; Singleton, 1995). Se sabe que puede existir variabilidad entre individuos de la misma especie que crecen juntos en un mismo bosque, e incluso dentro de un mismo árbol (Chatonnet y Dubourdieu, 1998; Masson, Moutounet, y Puech, 1995; Mosedale, et al., 1999; Prida y Puech, 2006; Sauvageot y Feuillat, 1999). Celulosa, hemicelulosa y lignina son los principales constituyentes de la pared celular de la madera de roble. Estos compuestos confieren a la madera sus características propiedades físicomecánicas como la resistencia a la tracción y a la compresión. El resto de los componentes constituyen la llamada fracción extraíble, y pueden presentarse intercalados con los polímeros en la pared celular o como inclusiones en los lúmenes celulares. Estos compuestos contribuyen al INTRODUCCIÓN 24 desarrollo de varias propiedades organolépticas de los vinos tratados con madera tales como el color, sabor y olor (Ribéreau-Gayon, et al., 2006). De entre ellos los más abundantes son los elagitaninos, pero también se encuentran otros componentes de diversa naturaleza y estructura. 3.2.1. Compuestos volátiles Los compuestos volátiles procedentes de la madera de roble tostada, como el metilfurfural, el siringaldehido o el eugenol, son los principales responsables del aroma y sabor típicos de los vinos que han tenido contacto con madera. La composición volátil de la madera depende del origen geográfico de esta pero también está muy influenciada por los procesos a los que son sometidas las duelas, principalmente por el tostado (Alañón, Castro-Vázquez, Díaz-Maroto, Gordon, y Pérez-Coello, 2011; Caldeira, Climaco, de Sousa, y Belchior, 2006). En la tabla 1 se muestran los compuestos volátiles que el roble aporta al vino. Tabla 1. Principales sustancias volátiles procedentes de la madera de roble ORIGEN Furanos Furfural POLISACÁRIDOS Metilfurfural Hidroximetilfurfural Alcohol furfurílico Otros heterociclos volátiles Maltol Dimetilpirazinas Ácido acético Aldehídos fenoles Vinillina LIGNINA Siringaldehído Sinapaldehído Coniferaldehído Fenil cetonas Acetofenona Aetovainillona Propiovainillona Butirivainillona Fenoles volátiles Guayacol Metil-guayacol Etil-guayacol Eugenol Etil-4-fenol Β-Metil γ-octolactona Isómero cis LÍPIDOS Isómero trans MADERA DE ROBLE 25 3.2.2. Compuestos fenólicos Además de los compuestos aromáticos, la madera de roble puede ceder al vino otros compuestos que participan principalmente en su sabor, aunque algunos de ellos tienen también importancia en la evolución del vino y en las transformaciones que sufren los pigmentos que aportan el color al vino. Básicamente se trata de compuestos fenólicos cedidos por la madera al vino como son los ácidos fenólicos, taninos gálicos, taninos elágicos y cumarinas.  Ácidos fenólicos En la madera de roble se han identificado ácidos fenólicos tales como ácido gálico, vainillínico, siríngico, ferúlico, sinápico, elágico, etc. De entre todos ellos, posee especial importancia el ácido elágico y el ácido gálico (Canas, Leandro, Spranger, y Belchior, 2000). Estos compuestos, además de aportar una cierta acidez, pueden participar en la evolución del color del vino tinto por su contribución como posibles copigmentos (Vivas, 1997) y su efecto protector de la oxidación de los antocianos (Vivas y Glories, 1996).  Taninos hidrolizables Prácticamente la totalidad de los taninos que se encuentran en la madera de roble pertenecen al grupo de los taninos hidrolizables divididos en galotaninos y elagitaninos. Los taninos gálicos o galotaninos están formados por una molécula de glucosa, cuyos grupos hidroxilo están esterificados total o parcialmente con moléculas de ácido gálico. Estos compuestos presentan sabor ácido, ligeramente astringente y muy amargo. Sin embargo, su contribución al sabor del vino es mínima ya que, en realidad, la cantidad de estos taninos en la madera de roble es reducida (Vivas, 1997). Los taninos elágicos o elagitaninos, por el contrario, son los compuestos fenólicos más importantes que puede ceder la madera de roble al vino debido a su abundancia. Destaca la presencia de elagitaninos de tipo C-glucosidícos que, debido a su alta polaridad, son solubilizados con facilidad por el medio acuoso del vino. Entre ellos se encuentran vescalagina, castalagina, grandinina y roburina E (Figura 3), siendo la castalagina y vescalagina los principales elagitaninos encontrados en la madera de roble (Scalbert, Monties, y Janin, 1989; Viriot, Scalbert, Dupenhoat, y Moutounet, 1994). Estos compuestos pueden contribuir de manera importante a la estructura del vino, aportándole astringencia. Además, las propiedades oxidorreductoras de estos compuestos hacen que su presencia en el vino influya en gran medida en la evolución de su color, tanto por su efecto protector de la oxidación de antocianos, como por su posible implicación en la combinación antociano-tanino que conlleva una mayor estabilidad de los pigmentos (Vivas, et al., 1996). Su capacidad de formación de acetaldehído favorece la polimerización de los flavanoles del vino, y también pueden unirse a ellos formando complejos flavanol-elagitaninos INTRODUCCIÓN 32 4.2. Espectroscopía de infrarrojo Entre las radiaciones electromagnéticas utilizadas para el análisis de muestras agroalimentarias, la radiación infrarroja es una de las más importantes y más utilizadas. Esta radiación se relaciona con los movimientos vibracionales y rotacionales de los enlaces moleculares. Se divide a su vez en tres zonas en función de su cercanía al espectro visible: infrarrojo cercano, infrarrojo medio e infrarrojo lejano (NIR, MIR y FIR por sus siglas en ingles). Figura 5. Espectros ultravioleta, visible e infrarrojo Como se ha detallado anteriormente, la energía del infrarrojo medio es del orden de la energía necesaria para alterar el estado vibracional de un enlace. Energías menores (infrarrojo lejano) solo consiguen alterar los estados rotacionales de los átomos y moléculas presentes en la muestra, mientras que energías mayores, correspondientes a la región del infrarrojo cercano, permiten conseguir mayores transiciones vibracionales, los llamados sobretonos y bandas de combinación. Figura 6. Características espectrales típicas de los espectros NIR En el espectro infrarrojo aparecen, por tanto, bandas de absorción en longitudes de onda pertenecientes a las regiones del infrarrojo medio y del infrarrojo cercano. Las bandas del TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS 33 infrarrojo medio son bandas intensas y estrechas por lo general ya que las transiciones de este tipo son relativamente frecuentes y se dan a longitudes de onda concretas para cada enlace y modo vibracional. Sin embargo, las bandas en el infrarrojo cercano son debidas a transiciones vibracionales entre niveles energéticos más distantes (sobretonos) y a combinaciones de varias transiciones fundamentales pertenecientes a distintos modos vibracionales. Los cambios energéticos que las producen son menos frecuentes y, por tanto, estas bandas son menos intensas. Además, en la región del infrarrojo cercano los sobretonos y las bandas de combinación de los distintos enlaces presentes en las muestras agroalimentarias se superponen, complicando enormemente la interpretación directa de esta región del espectro infrarrojo (Bokobza, 1998). Teniendo en cuenta lo anterior, la espectroscopía de infrarrojo puede dividirse en dos técnicas claramente diferenciadas según la región del infrarrojo que utilicen (cercano o medio). 4.2.1. Análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano El análisis de imagen hiperespectral permite obtener, de manera simultánea, información espacial y espectral de una misma muestra (Sun, 2010). Esta tecnología integra las características del análisis de imagen con las de técnicas espectroscópicas, lo que la ha convertido en pocos años en una técnica poderosa y en rápido crecimiento para el control de alimentos. Su utilidad y el motivo por el que el análisis de imagen hiperespectral está en auge radican en la esencia de su funcionamiento: en una imagen hiperespectral se encuentra asociado a cada uno de sus píxeles el espectro medio de la pequeña zona que representa este, pudiéndose llegar a relacionar la composición superficial de una muestra con el espectro de cada píxel. Por tanto, el análisis de imagen hiperespectral se encuentra entre el análisis de imagen convencional y la espectroscopía superando, en algunos casos, a ambas técnicas (Tabla 2). Tabla 2. Principales diferencias entre el análisis de imagen convencional, espectroscopía y el análisis de imagen hiperespectral. Característica Análisis de imagen Espectroscopía Análisis de imagen hiperespectral Información espacial  NO  Información espectral NO   Información Multiconstituyente NO   Construcción de imagen química NO NO  Facilidad de extracción de información espectral NO NO  INTRODUCCIÓN 34 Las técnicas de imagen hiperespectral, al igual que la mayoría de las técnicas de análisis espectroscópico, pueden ser desarrolladas para trabajar usando reflexión, transmisión o fluorescencia. En el campo del análisis de alimentos se pueden encontrar ejemplos de las tres (Baiano, Terracone, Peri, y Romaniello, 2012; Barbin, Elmasry, Sun, y Allen, 2013; Kim, Kim, Chen, y Kong, 2004; Yoon, Lawrence, Smith, Park, y Windham, 2008) aunque lo más común es trabajar con reflectancias, que pueden transformarse fácilmente en absorbancias aparentes. 𝐴=log⁡(1 𝑅) Para la industria de los alimentos, el análisis de imagen hiperespectral tiene un gran interés ya que permite conseguir una información precisa y detallada, pero sobre todo de forma más rápida que otras tecnologías. Es una técnica no destructiva y perfectamente apta para aplicaciones on‒ line, las cuales requieren una rápida respuesta para que otros equipos actúen de forma inmediata. Las características de esta técnica la hacen muy apropiada para la realización de dos procesos muy comunes en la industria de alimentos: la identificación de productos con una determinada cualidad y la determinación de su composición. Para la realización del análisis de imagen hiperespectral no es necesaria una preparación de muestra tediosa, ya que la captura de la imagen se realiza sobre el alimento en su estado original. Además, es un método de análisis no contaminante y seguro, pues no necesita del uso de reactivos químicos. Una vez puesto a punto, tiene grandes ventajas económicas con respecto a los análisis tradicionales, es más rápido, requiere menos inversión en reactivos y no genera residuos. Por último, el hecho de ser una técnica no invasiva ni destructiva permite la utilización de la misma muestra para realizar otros análisis tras la captura de los datos hiperespectrales (Sun, 2010). En el análisis de imagen hiperespectral se genera un hipercubo de datos compuesto por la información espacial y el espectro de cada píxel. Tras la adquisición de datos existe la posibilidad de seleccionar determinadas regiones de interés (ROI por sus siglas en inglés). Esta selección se puede hacer de forma previa o posterior a la adquisición y es usada para seleccionar objetos con una determinada característica espectral. Con esta técnica se consigue una buena resolución espectral y es posible realizar estudios cualitativos y cuantitativos para determinar uno o varios parámetros de forma simultánea. Otra característica interesante del análisis de imagen hiperespectral, al menos para muestras relativamente grandes o con cierta heterogeneidad, es que se puede realizar un mapa de composición de la muestra debido a que la composición está íntimamente relacionada con el espectro y a que se dispone de información espacial de la muestra. TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS 35 De forma orientativa, los equipos de adquisición de imágenes hiperespectrales constan de una fuente de iluminación, con un espectro de emisión adecuado para medir en la zona del espectro electromagnético donde el detector es sensible, una zona de medida o portamuestras, un sistema óptico de recogida y guiado de la radiación electromagnética proveniente de la muestra (lentes, espejos, fibra óptica, etc.), un elemento dispersivo o espectrógrafo que separa la radiación en las distintas longitudes de onda, un detector y un sistema informático que permite gobernar el instrumento, guardar y tratar los datos adquiridos. Los dispositivos de adquisición de imágenes hiperespectrales más utilizados en agroalimentación usan detectores sensibles en la zona del visible o del infrarrojo cercano. Son detectores compuestos a base de semiconductores que utilizan el efecto llamado unión p‒n. Este efecto consiste en la unión de dos semimetales dopados con impurezas que permiten tener una estructura con electrones o huecos con cierta libertad de movimiento. Al incidir radiación electromagnética sobre el detector, se produce un movimiento de los electrones o huecos que puede ser fácilmente contabilizado y relacionado con la radiación recibida (Rogalski, 2003). Este tipo de detectores son usados en una amplia zona del espectro electromagnético. Los detectores a base de silicio trabajan principalmente en la zona visible del espectro aunque son sensibles también en una pequeña parte de la región del infrarrojo cercano (hasta 1000 nm). Sin embargo, el más utilizado en esta región es el detector InGaAS, el cual tiene gran sensibilidad, rápida respuesta y funciona en un amplio intervalo espectral, desde 900 a 1700 nm, o incluso hasta 2500 nm si se incrementa la proporción de Indio en la aleación, aunque esto genera una menor relación señal‒ruido (Rogalski, 2003; Sun, 2010). El análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano y su aplicación a la industria enológica ha sido ampliamente estudiado (Nogales-Bueno, et al., 2016). Existen numerosos estudios que utilizan esta técnica para determinar parámetros de interés vitivinícola en uva. Entre ellos, se aplica el análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano para predecir contenidos de compuestos fenólicos tanto en la baya completa como en la semilla (Chen, Zhang, Ning, Liu, Zhang, y Yang, 2015; Rodriguez-Pulido, et al., 2014), controlar la madurez fenólica y tecnológica de la uva (Nogales-Bueno, Hernández-Hierro, Rodríguez-Pulido, y Heredia, 2014), caracterización de semillas (Rodríguez-Pulido, Barbin, Sun, Gordillo, González-Miret, y Heredia, 2013) y en la caracterización de subproductos de vinificación (Jara-Palacios, Hernanz, Escudero-Gilete, y Heredia, 2016). El análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano también ha sido utilizado para la determinación de parámetros de interés en muestras de madera (Lestander, Geladi, Larsson, y Thyrel, 2012; Thumm, Riddell, Nanayakkara, Harrington, y Meder, 2010). Sin embargo, no se han encontrado referencias de la utilización de esta técnica al análisis de madera de roble con fines enológicos, si bien si se encuentra descrito en la literatura el uso de técnicas de infrarrojo INTRODUCCIÓN 36 cercano convencional para la determinación de fenoles totales en madera de roble (Zahri, Moubarik, Charrier, Chaix, Bailleres, Nepveu, et al., 2008) y para la clasificación de duelas completas y su posterior uso en barricas teniendo en cuenta el contenido fenólico de las mismas (Giordanengo, Charpentier, Boizot, Roussel, Roger, Chaix, et al., 2009; Jourdes, et al., 2011). 4.2.2. Espectroscopía en el infrarrojo mediante transformada de Fourier La espectroscopía de transformada de Fourier se basa en el interferómetro de Michelson, un elemento que divide la luz proveniente de la fuente de iluminación en dos haces. Uno de los haces se dirige hacia un espejo fijo y el otro hacia un espejo móvil. Ambos haces recorren caminos distintos, uno de ellos con una longitud variable y pasando por la muestra. El diferente camino óptico genera una diferencia de fase entre ambos haces además de diferencias espectrales debidas a que uno de los haces interacciona con la muestra (Skoog, et al., 2009). El interferómetro genera interferencias constructivas o destructivas, según la posición del espejo móvil, y el detector mide la intensidad de esta radiación. Posteriormente, el sistema informático permite, con la ayuda de la transformada de Fourier, obtener el espectro de la muestra medida. El uso de los instrumentos de transformada de Fourier tiene ciertas ventajas con respecto a los equipos dispersivos: tienen pocos elementos ópticos y ninguna rendija que atenúe la radiación. Como resultado, la potencia radiante que llega al detector es mucho mayor que en un instrumento dispersor, y se observan relaciones señal-ruido mucho mayores. Además, pueden medirse todas las longitudes de onda de forma simultánea ya que no es necesaria la utilización de una rejilla que seleccione la longitud de onda que llega al detector en cada momento. Esta característica facilita la obtención de datos de un espectro completo en tiempos más reducidos. Finalmente, los instrumentos de transformada de Fourier poseen alta potencia de resolución lo cual facilita el análisis de espectros complejos en los que el número absoluto de líneas y espectros implicados dificultan la determinación de las características espectrales individuales. Estas ventajas han provocado que la espectroscopía de transformada de Fourier en el infrarrojo haya sido ampliamente usada, en detrimento de la espectroscopía de redes de difracción (Siesler, Ozaky, Kawata, y Heise, 2002). 4.3. Espectroscopía Raman El efecto Raman fue nombrado de esta manera en honor a su descubridor, el físico indio Sir C. V. Raman, que observó el efecto en la luz solar. Raman descubrió que la longitud de onda visible de una pequeña fracción de la radiación dispersada por ciertas moléculas difiere de la del haz incidente y, además, que los desplazamientos de la longitud de onda dependen de la estructura TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS 37 química de las moléculas causantes de la dispersión. Como resultado de este descubrimiento surgió una nueva forma de espectroscopía, la espectroscopía Raman, basada en los fenómenos de dispersión inelástica de la radiación. Una molécula puede absorber un fotón si la energía de este coincide con una diferencia entre niveles cuánticos, aunque, tras la colisión, el fotón también puede ser dispersado, independientemente de la energía de este. La mayoría de los fotones dispersados no sufren ningún cambio en su frecuencia y energía (dispersión elástica de Rayleigh) pero una pequeña fracción de la luz es dispersada inelásticamente experimentando cambios de frecuencias con respecto a los fotones incidentes produciéndose así el denominado efecto Raman. La dispersión inelástica puede provocar aumentos o disminuciones de la energía del enlace que generan, respectivamente, líneas Stokes o anti‒Stokes en el espectro Raman. Estas variaciones energéticas son debidas a cambios en los estados vibracionales o rotacionales de los enlaces presentes en la molécula, por lo que los desplazamientos energéticos de los fotones dispersados frente a los fotones incidentes son medidas directas de los distintos modos vibracionales o rotacionales de la molécula (Skoog, et al., 2009). A temperatura ambiente, según la ley de distribución de energías de Maxwell-Botzman, el 99% de las moléculas se encuentran en el estado vibracional de menor energía, y por tanto, la probabilidad de que ocurran transferencias de energía que den lugar a la dispersión Raman Stokes es mucho mayor que la de la dispersión Raman anti-Stokes. Esto se traduce en que la intensidad de la dispersión Raman Stokes es del orden de 100 veces superior, por lo que habitualmente se trabaja midiendo solo el efecto Stokes. Aunque hay similitudes entre los espectros Raman y los espectros en el infrarrojo, hay suficientes diferencias entre las clases de grupos que son activos en uno u otro para hacer que las técnicas sean complementarias y no competitivas. Una ventaja importante de la espectroscopía Raman frente a la espectroscopía en el infrarrojo radica en que la molécula de agua es prácticamente pasiva frente el efecto Raman, lo que es de gran utilidad en la medida de muestras biológicas. Además, el efecto Raman, al ser provocado por una dispersión energética, puede aparecer en cualquier región del espectro electromagnético mientras que las absorciones medidas por la espectroscopía de infrarrojo están provocadas por transiciones vibracionales con energías confinadas en la región infrarroja del espectro. Por tanto, la espectroscopía Raman es una técnica extremadamente versátil ya que puede ser llevada a cabo excitando en las regiones UV, visible o infrarrojo cercano. En los últimos años la espectroscopía Raman ha evolucionado de forma considerable y se ha establecido como una herramienta de laboratorio que rivaliza con la espectroscopía de infrarrojo convencional (Byrne, et al., 2011). INTRODUCCIÓN 38 4.4. Espectroscopía Portátil Las técnicas de espectroscopía vibracional representan un procedimiento analítico que goza de prestigio en la industria agroalimentaria como técnica rápida, no destructiva y respetuosa con el medio ambiente para reemplazar a los tradicionales métodos analíticos de referencia. Los diferentes campos de aplicación de estas técnicas destacan su versatilidad. En el sector enológico, concretamente, la aplicación de la espectroscopía vibracional es bien conocida y su uso extendido. Son numerosos los trabajos desarrollados con resultados prometedores (Ferrer-Gallego, Hernández-Hierro, Rivas-Gonzalo, y Escribano-Bailón, 2010; Ferrer-Gallego, Hernández-Hierro, Rivas-Gonzalo, y Escribano-Bailón, 2011; Hernández-Hierro, Nogales-Bueno, Rodríguez- Pulido, y Heredia, 2013; Nogales-Bueno, et al., 2014; Rodriguez-Pulido, et al., 2014). Sin embargo, a pesar de la eficiencia, rapidez y efectividad de estas técnicas para predecir diferentes parámetros en el sector agroalimentario, la mayoría de estos estudios deben ser llevados a cabo en el laboratorio y, por tanto, implican el transporte de muestras con los inconvenientes que ello conlleva. Para resolver este problema, y cumplir otras exigencias de la industria, en los últimos años el interés se ha dirigido hacia el desarrollo de una nueva generación de espectrómetros portátiles que permiten su uso directo en la localización original de la muestra gracias a la innovación en el diseño del sistema óptico y a la reducción de tamaño (De la Roza- Delgado, Garrido-Varo, Soldado, Gonzalez Arrojo, Cuevas Valdes, Maroto, et al., 2017; Perez- Marin, Paz, Guerrero, Garrido-Varo, y Sanchez, 2010; Pérez-Marín, Sánchez, Paz, Soriano, Guerrero, y Garrido-Varo, 2009; Prado, Fernandez-Ibanez, Gonzalez, y Soldado, 2011; Saranwong, Sornsrivichai, y Kawano, 2003; Wiedemair, De Biasio, Leitner, Balthasar, y Huck, 2018). A pesar de que estos espectrómetros portátiles ofrecen varias ventajas, como análisis no destructivos e in situ, su desarrollo debe considerar algunos aspectos críticos, como costes, tamaño, peso, robustez, facilidad de uso, precisión de medida, ergonomía, diseño, etc. Las innovaciones tecnológicas en los instrumentos dispersivos portátiles han ido aumentando y por tanto, también lo han hecho las ventajas de estos instrumentos con respecto a los equipos de laboratorio. En la actualidad los equipos portátiles incorporan la precisión analítica necesaria para la identificación y cuantificación química con una resolución espectral equivalente a los instrumentos de mesa, lo que permite flexibilidad para el análisis en un entorno industrial ya que el equipo puede transportarse fácilmente (Sorak, Herberholz, Iwascek, Altinpinar, Pfeifer, y Siesler, 2012). Actualmente las principales tendencias son hacia la miniaturización, aumentando la calidad de las especificaciones mientras se reduce el costo de los dispositivos. Se trata de sistemas vis/NIR TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS 39 portátiles de bajo peso que no necesitan ninguna sonda, fibra óptica o fuente de iluminación externa porque todas las partes necesarias están incorporadas en su diseño miniaturizado. Figura 7. Espectrómetro portátil (MicroNIR™, VIAVI) El número de estudios publicados basados en el uso de espectroscopia portátil ha aumentado en la última década y se espera que aumente sustancialmente en los próximos años. Sin embargo, todavía queda camino por recorrer para optimizar el uso de estos equipos en análisis in situ en determinados sectores como por ejemplo el sector enológico, ya que hay que tener en cuenta que se debe compensar cualquier interferencia ambiental como luz, temperatura y humedad. A pesar de que son numerosos los trabajos que utilizan instrumentos portátiles, muchas de las aplicaciones han sido en realidad llevadas a cabo bajo condiciones de laboratorio (Ayvaz, Sierra-Cadavid, Aykas, Mulqueeney, Sullivan, y Rodriguez-Saona, 2016; Basri, Hussain, Bakar, Sharif, Khir, y Zoolfakar, 2017; Blakey, 2016). MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO 41 5. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO La microscopía óptica ha sido la técnica usada tradicionalmente para obtener información detallada de la naturaleza física de las superficies. Sin embargo, a pesar de que todavía es un recurso importante, la resolución de la microscopía óptica está limitada por los efectos de difracción respecto a la longitud de onda de la luz. Para obtener una resolución superior es necesario recurrir a alguno de los métodos de microscopía electrónica, que utilizan como fuente haces de electrones acelerados con longitud de onda asociada bastante menor de 1Å, y por tanto, permiten obtener, al menos teóricamente, resolución atómica. La microscopía electrónica de barrido, SEM del inglés Scanning Electron Microscopy, tiene su fundamento en la interacción producida entre un haz de electrones puntual y la superficie de una muestra sólida. La fuente de electrones está constituida normalmente por un filamento de wolframio. Los electrones son acelerados dentro de la columna de microscopía hasta una energía de entre 1 y 30 keV. Un sistema magnético constituido por lentes condensadoras y lentes del objetivo reducen las dimensiones del haz a un diámetro de 2 a 10 nm cuando llega a la muestra. El sistema de lentes condensadoras, que puede constar de una o más lentes, se encarga de que el haz de electrones llegue a la lente del objetivo, y ésta determina el tamaño del haz de electrones que incide sobre la superficie de la muestra. El barrido se efectúa mediante dos pares de bobinas electromagnéticas ubicadas dentro de la lente del objetivo; un par desvía el haz en la dirección x de la muestra, y el otro par lo desvía en la dirección y. Como resultado de la interacción entre el haz de electrones y la muestra, en la cámara de la muestra, se generan varios tipos de señales que pueden ser detectadas y procesadas para generar la imagen, manteniéndose el sistema a alto nivel de vacío (Skoog, et al., 2009). CROMATROGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA 49 7. .CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA La cromatografía agrupa un conjunto importante de métodos que permiten la separación, identificación y determinación de componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas. En la cromatografía líquida, la muestra se disuelve con una fase móvil la cual se hace pasar a través de una fase estacionaria inmiscible fija en una columna. Las dos fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen en grados distintos entre la fase móvil y la fase estacionaria. Como consecuencia de las distintas velocidades de migración, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas distintas que se pueden analizar en forma cualitativa y cuantitativa (Sogorb Sánchez, 2006). Inicialmente, la cromatografía líquida se llevaba a cabo en columnas de vidrio que tenían una longitud de varias decenas de centímetros y diámetros internos de 10 a 50 mm. Para asegurar tasas de flujo razonables a través de la fase estacionaria, las dimensiones de las partículas sólidas se mantenían en más de 150 a 200 μm. Incluso así, las tasas de flujo eran bajas, de un máximo de una pocas décimas de mililitro por minuto. Por consiguiente, los tiempos de separación eran largos, a menudo de varias horas. Los intentos para acelerar el procedimiento clásico mediante la aplicación de vacío o por bombeo no resultaron efectivos ya que generaban perdidas de eficiencia y rápidos deterioros de los equipos. Con el tiempo se descubrió que se podía aumentar de forma notable la eficiencia de la columna al disminuir el tamaño de las partículas y mejorar su empaquetamiento. Sin embargo, fue apenas a finales de los años sesenta cuando se perfeccionó la técnica adecuada para producir y utilizar empaques de tamaño de partícula tan pequeños como del orden de 3 a 10 μm. Esta técnica requería instrumentos más complejos que contrastaban de manera notable con las sencillas columnas de vidrio de la cromatografía de líquidos clásica cuyo flujo se debía a la gravedad. Las nuevas columnas necesitaban una mayor presión para operar a flujos aceptables, por lo que se substituyó el vidrio por metal, y tenían una menor capacidad de carga, es decir, aceptaban menor cantidad de muestra para analizar. Por consiguiente, fue necesario el desarrollo de detectores capaces de registrar señales originadas por muy pequeñas cantidades de electrolito. Para diferenciar estos procedimientos más nuevos de los métodos originales de flujo por gravedad se empleó la denominación de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés). La cromatografía líquida de alta resolución es la técnica más utilizada para el análisis de compuestos fenólicos (Markham, 1982). Mediante esta técnica se puede conseguir la separación rápida y eficiente de mezclas complejas, seleccionando adecuadamente los eluyentes, la columna, el flujo, la temperatura y el gradiente (Hong y Wrolstad, 1990a, 1990b). INTRODUCCIÓN 50  Columnas Las columnas analíticas de HPLC son cilindros de acero de entre 10 y 25 cm de longitud y 4-5 mm de diámetro interno. La fase estacionaria se halla en el interior de los cilindros, siendo lo más común fases estacionarias en fase reversa a base de sílice químicamente modificada mediante la inclusión de cadenas de hidrocarburos. Pueden encontrarse columnas con cadenas constituidas por 8 y por 18 átomos de carbono (C8 y C18 respectivamente) siendo más usadas estas últimas. El tamaño de partícula de la fase estacionaria oscila entre 2 y 10 μm, dimensiones que se consideran el mejor compromiso entre capacidad, consumo de fase móvil, velocidad de elución y resolución.  Fases móviles Existe una gran variedad en cuanto a fases móviles dependiendo de las características de los analitos que componen la muestra. Para muestras con composición polifenólica se suele usar como fase móvil un gradiente binario, formado por un solvente polar acidificado y otro menos polar. Los modificadores orgánicos que más comúnmente se utilizan en las fases móviles son el acetonitrilo y el metanol. Con el fin de minimizar las colas de los picos cromatográficos, habitualmente se acidifican las fases móviles. Los acidificantes más frecuentes son el ácido acético y el ácido fórmico, con este último se obtiene mejor resolución. El ácido trifluoroacético también ha sido ampliamente utilizado debido a las ventajas que ofrece por ser un ácido menos corrosivo y que mejora la reproducibilidad de los tiempos de retención de antocianos (Lopes-da-Silva, de Pascual-Teresa, Rivas-Gonzalo, y Santos-Buelga, 2002).  Detectores El detector registra una propiedad físico–química del material eluido por la columna en función del tiempo. El sistema de detección más habitual en HPLC es la detección ultravioleta/visible (UV–Vis), utilizando matrices de fotodiodos como sensores. Sin embargo, también se usan sistemas de detección por fluorescencia o electroquímica cuando la absorbancia de los compuestos en UV–Vis es muy baja. La detección mediante espectrometría de masas ha progresado mucho en las dos últimas décadas por ser el detector más sensible, selectivo y universal de los existentes. La técnica de HPLC-MS tiene la capacidad de proporcionar huellas dactilares de un producto particular sometido a elución en lugar de confiar solo en el tiempo de retención. La combinación permite la determinación funcional y estructural de las moléculas, con una elevada sensibilidad y límites de detección muy bajos, y de forma más rápida y fiable (Skoog, et al., 2009). QUIMIOMETRÍA 51 8. QUIMIOMETRÍA La quimiometría es una disciplina que utiliza las matemáticas, la estadística y la lógica formal para diseñar o seleccionar los procedimientos óptimos de experimentación y proporcionar la máxima información analizando los datos y sistemas químicos (Vandeginste, Massart, y Buydens, 1998). El análisis espectroscópico proporciona una señal de conjunto que contiene toda la información física y química de la muestras y para obtener la respuesta buscada es necesaria la aplicación de diversas técnicas quimiométricas que sean capaces de extraer dicha información. Atendiendo al tipo de información que se necesite obtener (respuesta categórica o de escala) los métodos se dividen en cualitativos o cuantitativos. Los cualitativos o métodos de reconocimiento de pautas, se pueden subdividir en métodos supervisados y no supervisados, dependiendo de si se conoce o no a priori, si el objeto pertenece a una clase determinada. Los métodos no supervisados buscan agrupamientos en un espacio n‒ dimensional sin conocer las clases a las que pertenece el objeto; sin embargo, en los supervisados se tiene un conocimiento previo de las clases y posteriormente, tras generar el modelo, se obtiene a cuál de ellas pertenece un determinado objeto. En el caso de los métodos cuantitativos, se puede hacer una primera división entre métodos univariantes y multivariantes. Dentro de éstos se distingue entre modelos lineales y no lineales dependiendo del tipo de función matemática que presente su algoritmo. Tradicionalmente, los modelos lineales han sido los más empleados debido a su mayor sencillez. Si se opera con las variables originales, se utiliza la regresión lineal múltiple, y cuando se trabaja con variables reducidas, se usa la regresión por componentes principales o la regresión por mínimos cuadrados parciales (Brereton, 2003; Vandeginste, et al., 1998). 8.1. Pretratamientos espectrales Los principales problemas que presentan los espectros en espectroscopía de infrarrojo y Raman se encuentran asociados a la dispersión de la luz, considerada en este caso desde un punto de vista macroscópico, y en el caso particular de la espectroscopía Raman a la fluorescencia. La dispersión de la luz se origina por características físicas de la muestra como el tamaño de partícula, la forma o el grado de compactación o factores externos como la temperatura o la humedad. Además, también tienen influencia aspectos relacionados con la medida instrumental, unido a la forma de los espectros en el infrarrojo cercano y en algunas regiones del infrarrojo medio con bandas muy anchas que se solapan. INTRODUCCIÓN 52 En espectroscopía Raman, la iluminación usada para excitar la muestra puede producir fluorescencia. Este fenómeno se da principalmente en muestras coloreadas cuando la excitación se produce en la región UV‒visible. El uso de fuentes de iluminación que emiten en el infrarrojo cercano reduce sobremanera este efecto, aunque también reduce la intensidad de las señales Raman. Por esto, en algunos casos, incluso una débil fluorescencia puede enmascarar las señales Raman. La combinación de los pretratamientos que se describen a continuación ofrece un amplio abanico para intentar eliminar o reducir los efectos que enmascaran, de alguna forma, la señal apropiada para el propósito analítico. Los pretratamientos comúnmente utilizados son: Promediado de espectros: el promediado pretende, entre otras cosas, reducir el ruido aleatorio, y por tanto aumentar la relación señal/ruido, por lo que se usa en diferentes ramas de la espectroscopía con buenos resultados. Es un método muy efectivo en análisis de imagen hiperespectral debido a la gran cantidad de espectros que proporciona una imagen. Corrección del efecto multiplicativo de la dispersión MSC (Multiplicative Scatter Correction): los efectos de la dispersión de la luz se asocian principalmente a factores físicos como puede ser el tamaño de partícula o de muestra. Estos efectos pueden ser aditivos o multiplicativos, afectando a la relación del espectro con las propiedades químicas de la muestra. Mediante este tratamiento se pretende evitar que los efectos de la dispersión se impongan a las propiedades químicas de la muestra. La corrección se efectúa utilizando un espectro ideal, que suele ser el espectro medio del conjunto de muestras. En general, esta corrección mejora la linealidad de los espectros y conserva la información química a la vez que se minimizan las diferencias entre los espectros (Geladi, Macdougall, y Martens, 1985) presenta el inconveniente de que es necesario realizar de nuevo los cálculos cuando se hace algún cambio en el conjunto de muestras; recalculando el espectro medio y por consiguiente todos los parámetros. Tipificación de la absorbancia SNV (Standard Normal Variate): al igual que el anterior, este tratamiento intenta minimizar la dispersión debida principalmente a factores físicos, como puede ser el tamaño de partícula o de muestra. Este tratamiento se aplica individualmente a cada espectro y por tanto no necesita el cálculo de un espectro medio o de referencia, ni rehacer los cálculos si se elimina alguna muestra del conjunto inicial. Existe una relación lineal con MSC, haciendo que los resultados ofrecidos por ambos métodos sean similares (Barnes, Dhanoa, y Lister, 1989). Corrección de la tendencia DT (Detrend): este tratamiento se aplica de forma individual a cada espectro e intenta minimizar la curvatura de la línea base, que surge como consecuencia del diferente tamaño de partícula o de muestra y del distinto grado de compactación en su empaquetamiento. Cada espectro, después de esta corrección, tiene una media igual a cero y una desviación estándar distinta a la unidad (Barnes, Dhanoa, y Lister, 1989). QUIMIOMETRÍA 53 Derivadas: son una herramienta muy utilizada en el procesado de los espectros en el infrarrojo cercano porque permiten disminuir sus problemas más característicos: bandas solapadas y variaciones en la línea base ocasionadas por características físicas de la muestras, como pueden ser el tamaño de partícula, empaquetamiento de muestras sólidas y otra serie de factores relacionados con las muestras y su presentación. El método para el cálculo de las derivadas emplea el método gap o segmento, utilizando la información de un segmento localizado en el espectro para calcular la derivada. Previamente se puede aplicar un suavizado sustituyendo los datos de un segmento por el valor promedio. La utilización de la primera derivada, pendiente de la curva espectral, elimina los términos constantes a todas las longitudes de onda, por lo que corrige desplazamientos de la línea base. La segunda derivada representa el cambio de pendiente de la curva espectral, y además, corrige los términos que varían de forma lineal con la longitud de onda. No suelen utilizarse derivadas superiores a la segunda ya que suponen un aumento del ruido en las medidas espectrales. La notación utilizada consta de 4 dígitos como a,b,c,d, siendo a, el orden de derivada, b, el número de puntos en los cuales se realiza la derivada, c el número de puntos en los cuales se realiza el primer suavizado y d, el número de puntos en los cuales se realiza el segundo suavizado (Shenk y Westerhaus, 1995). En este método de derivadas y suavizado se introduce una variable que es el segmento en el cual se realizan estas correcciones. Un segmento demasiado pequeño puede aumentar el ruido espectral, mientras que uno demasiado grande puede hacer que no se represente el comportamiento del espectro en el resultado o eliminar información importante (Infrasoft International LLC, 2000). Eliminación de la línea base: además de términos constantes y linealmente dependientes a la longitud de onda, los espectros pueden presentar otras modificaciones no lineales de la línea base, tanto en Raman como en el infrarrojo. Estas modificaciones son difíciles de eliminar mediante los tratamientos anteriores. En espectroscopía Raman suelen ser debidas a dispersiones de Rayleigh residuales que los procesos de filtrado de señal no han podido suprimir por completo o a fenómenos de fluorescencia producidos fundamentalmente por moléculas orgánicas inherentes a la muestra o provenientes de algún tipo de contaminación. En espectroscopía de infrarrojo, heterogeneidades en el sólido, contaminación lumínica o absorciones no controladas pueden provocar también este efecto. La eliminación de esta línea base permite obtener señales más fácilmente interpretables, pudiendo así dilucidar mejor las longitudes de onda donde aparecen los picos o la intensidad de estos (Goehner, 1978; Mazet, Carteret, Brie, Idier, y Humbert, 2005). Existen procedimientos que estiman la línea base usando ajustes por regresión de mínimos cuadrados, en los que se necesita que el usuario identifique y seleccione partes de los espectros pertenecientes a la línea base, sin incluir picos espectrales (Goehner, 1978). Sin embargo, seleccionar los puntos correctos no es siempre sencillo, puede ser un proceso bastante complejo y lento si deben de ser procesados un gran número de espectros. Para automatizar el proceso de INTRODUCCIÓN 54 eliminación de la línea base de los espectros se han desarrollado métodos basados en la minimización de funciones de costo no cuadráticas, donde no existe la necesidad de seleccionar manualmente zonas pertenecientes a la línea base (Lieber y Mahadevan-Jansen, 2003; Mazet, et al., 2005). Los ajustes a la línea base espectral mediante funciones de costo no cuadráticas se diseñan para que a valores de error cercanos a 0 (en regiones donde la función de costo y el espectro a ajustar están próximos), el ajuste sea similar al conseguido con funciones cuadráticas. Sin embargo, para mayores errores (en regiones donde la función de costo y el espectro a ajustar no están próximos) el comportamiento del ajuste sea lineal. De esta forma, las funciones de costo no cuadráticas permiten ajustar la línea base de los espectros a funciones poligonales sin tener en cuenta los picos. En este tipo de ajustes, el usuario tiene que definir un umbral que permite que el algoritmo diferencie los picos espectrales de la curvatura natural de la curva base (Mazet, et al., 2005). Transformada de Fourier: el uso del interferómetro en espectroscopía implica la adquisición de datos a periodos regulares en el tiempo, por lo que se obtiene una señal en el dominio del tiempo. De esta forma se consigue una mayor velocidad de adquisición de datos que usando medios convencionales (espectroscopía de difracción). Sin embargo, el dominio del tiempo no es fácilmente interpretable, y es necesaria una herramienta que transforme la señal al dominio de las frecuencias, es decir, al dominio donde los datos aparecen ordenados según la frecuencia. 8.2. Análisis cualitativos utilizados 8.2.1. Análisis discriminante lineal (LDA) El análisis discriminante es un método de clasificación supervisada que crea un modelo predictivo para determinar la pertenencia de una muestra a un grupo. El modelo está compuesto por una función discriminante (o, para más de dos grupos o categorías, un conjunto de funciones discriminantes 𝑞−1) basada en combinaciones lineales de las variables predictoras que proporcionan la mejor discriminación posible entre los grupos. Las funciones se generan a partir de un conjunto de casos para los que se conoce el grupo de pertenencia; posteriormente, las funciones pueden ser aplicadas a nuevos casos que dispongan de datos para las variables predictoras pero de los que se desconozca el grupo de pertenencia. El análisis discriminante es una técnica estadística capaz de determinar qué variables permiten diferenciar a los grupos y cuántas de estas variables son necesarias para alcanzar la mejor clasificación posible. La pertenencia a los grupos, conocida de antemano, se utiliza como variable dependiente (una variable categórica con tantos valores discretos como grupos). Las variables en QUIMIOMETRÍA 55 las que se supone que se diferencian los grupos se utilizan como variables independientes o variables discriminantes. Estas variables deben ser cuantitativas continuas, o al menos, admitir un tratamiento numérico con significado. El análisis discriminante aprovecha las relaciones existentes entre las variables independientes para maximizar la capacidad de discriminación. No todas las variables independientes de las que se parte para realizar un análisis discriminante influyen en la misma medida en el resultado final. Además, el uso de todas las variables implicaría disponer de un número de muestras igual al de variables para que el sistema tuviese solución. Debido a esto, existen distintos algoritmos para seleccionar las variables independientes usadas en el análisis discriminante: algoritmos de selección de variables hacia adelante, eliminación hacia atrás y de regresión por pasos.  Los algoritmos de selección hacia adelante comienzan eligiendo la variable que más discrimina entre las 𝑞 categorías. A continuación seleccionan la segunda más discriminante y así sucesivamente. Cuando ninguna de las variables que quedan por elegir discrimina de forma significativa entre los grupos analizados el algoritmo finaliza y no se seleccionan más variables.  Los algoritmos de eliminación hacia atrás proceden de forma inversa. Se comienza suponiendo que todas las variables son necesarias para discriminar y se elimina la menos discriminante entre los grupos analizados y así sucesivamente. Cuando todas las variables no eliminadas discriminan significativamente entre los grupos analizados el algoritmo finaliza.  Los algoritmos de regresión por pasos utilizan una combinación de los dos algoritmos anteriores. Permiten la posibilidad de rectificar, eliminando del conjunto seleccionado una variable introducida en el conjunto de discriminación en un paso anterior o introduciendo en dicho conjunto una variable previamente eliminada. Para construir el modelo, es necesario asignar los objetos del conjunto de entrenamiento a una categoría dada. Para ello, se añade una variable categórica a la matriz de datos conteniendo tantas categorías como sean necesarias. El análisis discriminante estima los coeficientes 𝑎1,𝑎2,…,𝑎𝑚, de la función discriminante lineal, 𝑓: 𝑓=𝑎1𝑥1+𝑎2𝑥2+⋯+𝑎𝑚𝑥𝑚 que es capaz de predecir la pertenencia de los objetos a una u otra categoría. Por encima de un cierto valor de 𝑓, el objeto queda clasificado en una determinada categoría, y por debajo de dicho valor en otra. Las funciones discriminantes se construyen de una en una, buscando las direcciones del espacio que maximizan la expresión: INTRODUCCIÓN 56 𝜆′=𝑆𝐶𝐷 𝑆𝐶𝐼 donde 𝑆𝐶𝐷 es la suma de los cuadrados de las distancias euclídeas entre los objetos que pertenecen a distintas categorías, en la dirección que índica la función discriminante, y 𝑆𝐶𝐼 la suma de los cuadrados de las distancias euclídeas entre los objetos pertenecientes a la misma categoría, también en la dirección de la función discriminante. La primera función discriminante es la dirección del espacio en la que los grupos se ven más separados entre sí, y a la vez más compactos internamente. Análogamente, la segunda función discriminante es la dirección del espacio que, siendo ortogonal a la primera, cumple con el mismo criterio. La función 𝜆′ no está acotada, por lo que varía solamente con el número de objetos y con la separación entre ellos. Por ello, en lugar de maximizar 𝜆′, se suele minimizar la lambda de Wilks (𝜆𝑊), que se define como: 𝜆𝑊=1 1+𝜆′=𝑆𝐶𝐼 𝑆𝐶𝐼+𝑆𝐶𝐷 La lambda de Wilks tiene valores entre 0 y 1. Categorías con una separación nítida, dan valores de 𝜆𝑊 cercanos a 0, mientras que categorías ampliamente solapadas dan valores cercanos a la unidad. Se evalúa la bondad del modelo por medio del porcentaje de casos correctamente clasificados en las diferentes modalidades de validación existentes (interna, cruzada, una muestra fuera o externa) (Ramis-Ramos y García-Álvarez-Coque, 1999). 8.2.2. Análisis discriminante basado en regresión por mínimos cuadrados parciales (DPLS) Este método de reconocimiento de pautas prefijadas se fundamenta en la realización de una regresión por mínimos cuadrados parciales sobre unas variables categóricas denominadas dummy. El método de regresión por mínimos cuadrados parciales (PLS) se describirá más detalladamente en el apartado de métodos cuantitativos, si bien es necesario hacer una breve referencia. Básicamente, un método PLS trata de concentrar la información relevante contenida en las variables medidas, en un número menor de variables sin pérdida de información relevante; en la construcción de estas nuevas variables se tiene en cuenta el dato de referencia. La regresión se realiza con estas nuevas variables, simplificando el modelo de calibración y la interpretación de los resultados. Dependiendo si el modelo se realiza para un solo analito o dato de referencia o QUIMIOMETRÍA 57 para varios a la vez, tendremos las modalidades de PLS 1 y PLS 2 respectivamente (Brereton, 2003; Vandeginste, et al., 1998). Puesto que en el desarrollo del modelo se conoce a priori el grupo al cual pertenecen las muestras, se organizan archivos que contengan los espectros de todas las muestras pertenecientes a una misma clase, tantos como clases existan. Automáticamente se genera una matriz temporal con las muestras de todas las clases y unas nuevas variables dummy, tantas como clases existan. El porcentaje de muestras correctamente clasificadas en las clases a las que pertenecen indica finalmente la bondad del modelo desarrollado. Si la predicción se realiza sobre las muestras que han servido para desarrollar el modelo estaremos realizando la validación interna del mismo, por el contrario, si las muestras son distintas a las utilizadas en la obtención del modelo estaremos realizando una validación externa. 8.2.3. Agrupamiento mediante el algoritmo de K–medias El agrupamiento mediante el algoritmo de K–medias es uno de los métodos no supervisados más simples para la clasificación de muestras en un número de grupos a determinar por el usuario. Este método, agrupa las muestras de acuerdo a su grado de similitud. Analiza las variables independientes y forma grupos con características similares en cuanto a estas variables. El número de grupos (𝑘) debe ser elegido a priori por el usuario, quien debe de disponer de la información necesaria para realizar esta elección. Inicialmente, el algoritmo define 𝑘 centroides maximizando la distancia que separa unos de otros. Seguidamente, cada punto perteneciente al set de datos es asignado al grupo del centroide más próximo. Cuando todos los puntos han sido asignados a un grupo, los centroides son recalculados como los baricentros de los grupos creados previamente. Tras esto, vuelven a reasignarse todos los puntos al grupo cuyo centroide es más cercano y se recalculan los centroides. El proceso se repite hasta que el cálculo de los centroides arroja unos resultados suficientemente similares a los del paso anterior dando por finalizado el proceso iterativo (MacQueen, 1967). 8.2.4. Análisis de componentes principales (PCA) El análisis de componentes principales (PCA), es un método de análisis quimiométrico cualitativo habitual en análisis multivariante. Mediante reconocimiento de pautas, el objetivo es reducir el número de variables iniciales, sin perder información y así poder observar estructuras y tendencias en las muestras. El PCA (Deane, 1992) consiste en: INTRODUCCIÓN 64 Además, para comprobar la robustez del modelo de calibración, se realiza una validación externa, aplicando las ecuaciones a un conjunto de muestras que no pertenecen al colectivo de calibración. Algunos de los parámetros que se pueden evaluar son: • Media de los residuales. • Porcentaje de error respecto al valor de referencia. • RMSE: error cuadrático medio (root mean standard error). 𝑅𝑀𝑆𝐸=(∑(𝑦𝑐𝑎𝑙𝑖−𝑦𝑡𝑒𝑜𝑖)2 𝑁 𝑖=1 𝑁)1 2 En esta ecuación 𝑦𝑐𝑎𝑙𝑖 e 𝑦𝑡𝑒𝑜𝑖 son respectivamente, los datos calculados y teóricos para cada una de las i‒muestras y 𝑁 es el número de muestras utilizadas para realizar la validación externa. La fórmula es la misma que se emplea en validación interna (para el SEP), pero aplicada a muestras que no pertenecen al colectivo de calibración. La utilización del término SEP para referirse a este parámetro en validación externa se puede encontrar de forma habitual en la bibliografía, indicando que se refiere a dicho tipo de validación. OBJETIVOS GENERALES 67 OBJETIVOS GENERALES El objetivo general de este trabajo pretende dar respuesta a la demanda de estrategias enológicas sostenibles, alternativas a la vinificación tradicional, para hacer frente al problema de inestabilidad cromática de los vinos tintos. Para ello, se evaluará mediante técnicas espectroscópicas la aptitud fenólica de la uva de vinificación y el potencial de la viruta cruda de madera de roble, subproducto de tonelería, como coadyuvante de vinificación. En concreto se han planteado los siguientes objetivos específicos:  Conocer el efecto que tiene la adición de chips tostados de madera de roble como fuente de copigmentos en la extracción de compuestos antociánicos en hollejo de uva tinta clasificada como uva con bajo contenido extraíble, predicho a partir de un modelo desarrollado previamente por análisis de imagen hiperespectral NIR.  Desarrollar métodos rápidos y no destructivos mediante análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano para la estimación del contenido total y contenido extraíble de fenoles totales y flavanoles en semillas de uva tinta y el contenido fenólico extraíble en viruta cruda de roble.  Evaluar la viabilidad del uso de un dispositivo portátil miniaturizado de espectroscopía de infrarrojo cercano, MicroNIRTM, para la estimación in situ del contenido fenólico extraíble en hollejos de uva tinta y virutas crudas de roble.  Estudiar mediante espectroscopía vibracional (espectroscopía en el infrarrojo medio y Raman) y microscopía electrónica de barrido la relación existente entre la estructura de la pared celular y la extractabilidad de compuestos fenólicos en virutas de roble.  Determinar, en situaciones reales de vinificación en tinto, el efecto de la adición postfermentativa de viruta de madera cruda, sobre la composición química y la calidad cromática de vinos tintos de variedad Syrah. 69 GENERAL OBJECTIVES The main aim of this work is to meet the demand for sustainable oenological strategies, alternatives to traditional winemaking, to cope the problem of chromatic instability of red wines. For this purpose, the phenolic capability of grapes and the suitability of raw oak wood shavings, cooperage byproduct, as processing aids, are evaluated by spectroscopic analysis tools. In particular, the following specific aims have been proposed:  To evaluate the influence of oak wood chips, as copigment sources, on the anthocyanin extraction from red grape skins. Those grapes were previously classified by near infrared hyperspectral image analysis as low-extractable anthocyanin grapes.  To develop fast and non-destructive methods using near infrared hyperspectral imaging for the screening of total content and extractable content of total phenols and flavanols in red grape seeds and total phenolic content in oak wood shavings.  To check the feasibility of a portable micro near infrared spectroscopy device, MicroNIRTM, for in situ screening of extractable polyphenolic content in red grapes and raw oak wood shavings, cooperage byproduct.  To evaluate the relationship between cell wall structure and the extractability of phenolic compounds from oak wood shavings, cooperage byproduct, by vibrational spectroscopy (Fourier transform infrared and Raman) and scanning electron microscopy.  To assess, in a real red vinification process, the effect of post-fermentative addition of raw wood shaving, as cooperage byproduct, on chemical composition and chromatic quality of Syrah red wines. MATERIALES Y MÉTODOS TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS 73 1. MUESTRAS 1.1. Uva Se han utilizado muestras de uva tinta de dos viñedos pertenecientes a la región del Condado de Huelva (Andalucía, España). En concreto, se han tomado uvas de dos variedades de Vitis vinifera L., Tempranillo y Syrah. La variedad Tempranillo es originaria del valle del Ebro (Rioja y Aragón) aunque su cultivo se encuentra ampliamente extendido por el resto de las regiones vitícolas españolas. Por su parte, Syrah es una variedad de uva tinta, procedente del valle del Ródano, conocida por su fácil adaptación a condiciones de clima cálido como las que se dan en la zona (Gordillo, et al., 2012). Se llevaron a cabo muestreos específicos para los diferentes estudios en los que se utiliza la uva como matriz pero en todos ellos se ha mantenido una metodología de muestreo similar siguiendo una modificación del método propuesto por Bergqvist, et al. (2001): en cada parcela se eligieron y marcaron cuatro hileras de vides separadas entre sí y de los extremos de la parcela por al menos tres hileras más. De esta forma se pretende cubrir la mayor parte de cada viñedo para considerar la posible heterogeneidad entre distintas zonas. Se tomó un grano de uva por cada planta, teniendo la precaución de tomar de distintas partes del racimo (zonas inferior, superior y media) y cortando el pedicelo para evitar procesos oxidativos tras el muestreo. Con el objetivo de evitar la recogida de muestras poco representativas solo se recogió uva a partir de la quinta vid en cada hilera. Para reducir la influencia de la orientación solar, el muestreo se realizó en las zonas de solana y umbría de cada hilera (Figura 13). Figura 13. Esquema de muestreo de uva MATERIALES Y MÉTODOS 80 Figura 17. Espectrómetro MicroNIR Pro Lite 1700 y accesorios de medida 2.2.2. Adquisición de datos espectrales Para la adquisición de parte de los datos espectrales registrados en esta memoria se ha utilizado un espectrofotómetro NIR portátil (MicroNIRTM Pro Lite 1700), un dispositivo creado y diseñado por la empresa VIAVI (Santa Rosa, CA, EE.UU.) que permite medir reflectancia difusa y/o transmitancia en la región NIR del espectro electromagnético, si bien, y esto es lo que le diferencia de otros espectrómetros, posee la peculiaridad de un diseño compacto, sin partes móviles y dimensiones muy reducidas. Este dispositivo incorpora tecnología óptica de alta precisión utilizando como elemento dispersivo un filtro lineal variable de película delgada (LVF). Se trata de un filtro paso banda de Fabry-Perot, cuyo revestimiento se dispone intencionadamente en forma de cuña en una dirección y, como resultado del espesor variable de la película, la longitud de onda transmitida a través del filtro varía linealmente en la dirección de la cuña. El LVF está directamente acoplado a un detector de barrera de diodos de InGaAS de 128 píxeles que cubre el rango espectral entre 908 y 1676 nm con una resolución espectral de 6.2 nm. El LVF hace que cada píxel del detector responda a una longitud de onda diferente. Este núcleo espectroscópico ultracompacto está acoplado con electrónica de lectura miniaturizada y un sistema de iluminación difusa compuesto por dos lámparas de tungsteno. La unidad se alimenta a través de un puerto USB y posee un peso de 64 g y un diámetro de 50 mm. TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS 81 En la Figura 18 se muestra un esquema del diseño y principio de funcionamiento del MicroNIR. Figura 18. Esquema del diseño y funcionamiento del espectrómetro MicroNIR, adaptado del manual de usuario del equipo En el modo de reflexión difusa dos lámparas de tungsteno integradas iluminan una región de la muestra que tiene aproximadamente 3 mm de diámetro, a una distancia de 3 mm del instrumento. La radiación reflejada difusa se recoge y se dirige nuevamente al motor espectral, donde es leída y transformada por la electrónica del equipo para ser mostrada, en forma de espectro, en la pantalla conectada al equipo vía USB. Los espectros se registran usando el software MicroNIRTM Pro v.2.2 (VIAVI, Santa Rosa, California, USA). Antes de cada registro, es necesario realizar una calibración automática de doble punto usando un material cerámico Spectralon® como referencia blanca (100% de reflectancia), mientras que la corriente oscura (0% de reflectancia) se registra al aire, situando el dispositivo a no menos de 0.5 metros de cualquier objeto. En las dos aplicaciones en las que se ha utilizado este equipo en la presente memoria, las medidas se han realizado utilizando un accesorio protector con ventana de zafiro que facilita la medida. MATERIALES Y MÉTODOS 82 2.3. Espectroscopía de infrarrojo mediante transformada de Fourier con reflexión total atenuada (ATR‒FTIR) 2.3.1. Material y equipos - Espectrómetro Spotligh 400 FTIR Perkin Elmer® (MA, EE.UU.). - Detector High‒quality MCT (mercurio, cadmio y teluro) de amplio intervalo espectral. - Accesorio para medidas de reflectancia total atenuada (ATR). - Accesorio para medidas de imágenes ATR. - Software Spectrum 10TM. 2.3.2. Medidas ATR‒FTIR La adquisición de espectros ATR‒FTIR se realizó utilizando el espectrómetro Perkin Elmer® (MA, EE.UU.) Spotlight 400N FTIR junto con el accesorio universal para medir reflectancia total atenuada (ATR). Este accesorio proporciona una superficie de medida plana de diamante que permite comprimir la muestra para asegurar una correcta superficie de contacto durante la medida. Usando este accesorio, el haz infrarrojo se proyecta para que atraviese el cristal de diamante, que tiene un elevado índice de refracción. La onda evanescente llega hasta la muestra, en íntimo contacto con el cristal, con la que interacciona produciéndose la absorción de parte de la energía, mientras que la otra parte es reflejada hasta la cara interna del cristal que, de nuevo, la refleja hasta la muestra, donde vuelve a ocurrir la absorción, y así sucesivamente. Este avance en zigzag, produce la atenuación del haz hasta que, finalmente, llega al detector. Se trata de un método muy versátil que permite la medida de muestras líquidas y sólidas sin prácticamente preparación de las mismas. De esta forma, el accesorio ATR permite que la interacción entre la radiación electromagnética y la muestra no sea puntual, si no que se distribuya por toda la superficie de contacto. El equipo cuenta con un detector High‒quality MCT basado en semiconductores a base de mercurio, cadmio y teluro, modificando el dopaje del mismo para ampliar su intervalo de sensibilidad, pudiendo medir desde 580 cm-1 a 7800 cm-1. Sin embargo, el intervalo de medida más utilizado es desde 600 a 4000 cm-1, donde el detector tiene una mayor sensibilidad y donde aparecen la mayoría de las absorciones debidas a vibraciones fundamentales de los enlaces más comunes en muestras biológicas. Para la realización de los estudios descritos en la presente memoria, los espectros se obtuvieron realizando 8 escaneos en el intervalo comprendido entre 650 y 4000 cm-1, con una resolución TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS 83 espectral de 4 cm-1. Las muestras se fijaron en el accesorio ATR controlando que la presión aplicada fuera la misma para todas ellas. Además, se midió el espectro de fondo (aire) y el equipo lo sustrajo de forma automática de todas las medidas. 2.3.3. Medidas de imágenes ATR-FTIR Para la adquisición de las imágenes ATR‒FTIR se utilizó el mismo espectrómetro Perkin Elmer® (MA, EE.UU.) Spotlight 400N FTIR pero en este caso adaptado con un accesorio de imágenes ATR, un cristal de germanio con índice de refracción de 4.0 y dimensiones de ~ 600 μm × 600 μm. Este accesorio proporciona una superficie sobre la que es posible comprimir la muestra para asegurar una correcta superficie de contacto durante la medida y permite la recolección de imágenes ATR de un área de muestra identificada previamente de forma visual con microscopio. Para asegurar un buen contacto óptico durante la recolección de datos, el accesorio incluye un mecanismo que aplica una fuerza de compresión constante y controlable entre la muestra y el cristal ATR. Este equipo permite analizar grandes áreas de muestra en minutos o segundos en lugar de horas. Su alta sensibilidad permite detectar las muestras más pequeñas, mientras que su velocidad mejora el tiempo de resolución de problemas, extendiendo así el análisis IR a aplicaciones con un rango de medida de 4500 cm-1 a 720 cm-1. Las imágenes espectrales se adquirieron en el intervalo espectral entre 750 y 4000 cm-1, en una región de 500 μm x 500 μm del cristal ATR, con un tamaño de píxel de 6.25 μm x 6.25 μm, 4 escaneos por píxel y una resolución espectral de 8 cm-1. Para realizar la medida, el cristal ATR se colocó suavemente en contacto con la muestra utilizando la presión suficiente para garantizar un buen contacto entre la muestra y el cristal pero evitando el deterioro de la misma. El espectro de fondo se adquirió en ausencia de muestra y evitando el contacto entre el cristal y el soporte. Cada píxel de la imagen registrada corresponde a un espectro de alta calidad y al utilizar las rutinas del Software Spectrum 10TM integrado de Spotlight, las imágenes registradas son imágenes que muestran rápidamente la distribución de los diferentes componentes de las muestras a partir de las diferencias espectrales entre los píxeles y por tanto eventuales diferencias químicas. 2.4. Espectroscopía Raman 2.4.1. Material y equipos - Espectrómetro Horiba® Jobin–Yvon LabRAM HR800 (CA, EE.UU.) MATERIALES Y MÉTODOS 84 - Detector CCD de intervalo dinámico de 16 bits, refrigerado a –70 ºC. - Láser de alta eficacia Horiba® de 785 nm y 300 mW. - Microscopio dual. - Objetivos ×50 Olympus®. - Software LabSpec 6 Horiba®. 2.4.2. Medidas Raman La adquisición de espectros Raman se realizó utilizando el espectrómetro Horiba® (CA, EE.UU.) Jobin–Yvon LabRAM HR800. Este equipo cuenta con un microscopio dual que permite seleccionar las distintas zonas de medida y enfocar correctamente la radiación de excitación sobre la muestra. Se utilizó un objetivo ×50 Olympus® (Tokio, Japón). Como fuente de iluminación se usó un láser Horiba® de 785 nm y 300 mW de una alta eficacia en el infrarrojo cercano. Este láser es menos energético que aquellos que emiten en visible, y por tanto produce emisiones Raman menos intensas. Sin embargo, a diferencia de los láseres que emiten en visible, la excitación en el infrarrojo cercano genera un efecto de fluorescencia casi nulo, con lo que los espectros adquiridos usando esta excitación aparecen mejor resueltos. Además, la baja energía del láser reduce el riesgo de destrucción de la muestra por sobrecalentamiento. La calibración espectral del equipo se realiza para la línea a 520.7 cm-1 correspondiente a un modo vibracional del silicio activo en Raman, usando el Material Estándar de Referencia Nº 2243 del National Institute of Standars (CO, EE.UU.). La adquisición de espectros se realizó en el intervalo espectral desde 200 a 3600 cm-1 con una resolución de ~ 0.9 a 1.6 cm-1 utilizando el detector CCD de intervalo dinámico de 16 bits, refrigerado a –70 ºC mediante efecto Peltier. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO 85 3. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO 3.1.1. Material y equipos - Microscopio Hitachi® SU 6600 FE-SEM - Cintas conductivas adhesivas de carbón para microscopía electrónica - Software SEM Data Manager 3.1.2. Medidas de microscopía Se ha usado un microscopio electrónico de barrido Hitachi SU 6600 FE-SEM. El reducido tamaño del haz de electrones que incide sobre la muestra en un Field Emission-SEM, menor que en SEM convencional, permitió obtener imágenes de muy alta resolución, revelando detalles en el intervalo de 1 a 5 nm. Dado su carácter no conductor, las virutas de madera se colocaron sobre cintas o parches conductivos de carbón antes de introducirlas en la cámara de muestras. Se utilizó una tensión de aceleración de 2 kV, distancia de trabajo de 30 mm, lente condensadora de 21.0 y corriente de 20 μA para todas las muestras. Se utilizó el software “SEM data manager” para el registro automático de las imágenes, el ajuste de los parámetros de interés y su almacenado en base de datos. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO 87 4. MEDIDAS DE COLOR POR COLORIMETRÍA TRIESTÍMULO. ESPACIO CIELAB 4.1.1. Material y reactivos - Espectrofotómetro UV‒Vis Agilent® 8453 (Agilent Technologies®) (CA, EE.UU.). - Cubeta de vidrio de 2 mm (Hellma Analytics) - Conjunto de filtración de muestras Millipore (Billerica) (MA, EE.UU.), constituido por jeringa, portafiltro y filtros AP20 de 13 mm de diámetro - Software CromaLab® 2.0 4.1.2. Medida del color La medida del color de las muestras de vino se ha realizado por Colorimetría Triestímulo, a partir de medidas espectrofotométricas de transmisión dentro del espectro de la radiación electromagnética visible (380-780 nm). La aplicación de la Colorimetría Triestímulo permite obtener los valores triestímulos X, Y, Z, que definen el color de la muestra y que son el punto de partida para calcular el resto de variables colorimétricas de otros espacios de color como CIELAB: L*, a*, b*, C*ab y hab Antes de realizar la medida de color los vinos fueron filtrados usando un filtro Millipore AP20 de 13 mm de diámetro. Para realizar la medida, la muestra de vino, previamente filtrada, se deposita en una cubeta de vidrio de 2 mm de paso de luz y se registra el espectro de absorción en la región visible por espectrofotometría, frente a agua destilada como blanco de referencia, a intervalos constantes de 2 nm. A partir de los espectros registrados y utilizando el software de cálculo original CromaLab® (Heredia, Álvarez, González-Miret, y Ramírez, 2004) se obtuvieron los datos de color de cada uno de los vinos analizados en el espacio CIELAB, en concreto, se obtuvieron las coordenadas colorimétricas (a*, b*) y los parámetros claridad, croma y tono (L*, C*ab y hab). Este software tiene en cuenta las recomendaciones de la Comisión Internacional de Iluminación (CIE, 2004): observador estándar de 10º e iluminante estándar D65. El parámetro colorimétrico diferencia de color (ΔE*ab), se ha calculado como la distancia euclídea entre dos puntos en el espacio tridimensional definido por L*, a* y b*: ∆𝐸𝑎𝑏 ∗=√(∆𝐿∗)2+(∆𝑎∗)2+(∆𝑏∗)2 ANÁLISIS QUÍMICO 89 5. ANÁLISIS QUÍMICO 5.1. Composición fenólica 5.1.1. Material y reactivos - Metanol (J.T. BAKER®) (PA, EE.UU.). - Ácido clorhídrico 12M (Panreac®) (Barcelona, España). - Agua desionizada (Milli‒Q, Merck Millipore®) (Darmstadt, Germany). - Etanol absoluto (Panreac®) (Barcelona, España). - Ácido tartárico (L+) (Panreac®) (Barcelona, España). - Hidróxido sódico 0.5 M (J.T. BAKER®) (PA, EE.UU.). - Reactivo de Folin‒Ciocalteu (Merck®) (Darmstadt, Germany). - Carbonato sódico anhidro (Panreac®) (Barcelona, España). - Patrón de referencia, ácido gálico (Analytical Carlo Erba®) (Barcelona, España). - 4-(dimetilamino) cinamaldehído (DMACA) (Sigma Aldrich®) (MO, EE.UU.). - Patrón de referencia, (+)-catequina (Sigma Aldrich®) (MO, EE.UU.). - Acetonitrilo calidad HPLC (J.T. BAKER®) (PA, EE.UU.). - Ácido trifluoroacético (Sigma Aldrich®) (MO, EE.UU.). - Patrón de referencia, malvidina-3-O-glucósido, cloruro de oenina (Extrasynthese®) (Lyon, Francia). - Ácido acético (Panreac Quimica SLU, Castellar del Vallès, España). - Isopropanol HPLC (HiPerSolv® Chromanorm, BDHProlabo, VWR International) (Briare, Francia) - Metanol HPLC (HiPerSolv® Chromanorm, BDHProlabo, VWR International) (Briare, Francia) - Patrón Galocatequina (Sigma Aldrich®) (MO, EE.UU.). - Patrones de elagitaninos no comerciales, aislados y purificados a partir de un extracto de madera de roble. - Baño de ultrasonidos JP Selecta® (Barcelona, España). MATERIALES Y MÉTODOS 96 6.2. Regresión por mínimos cuadrados parciales modificada (MPLS) Se ha utilizado la regresión por mínimos cuadrados parciales modificada (MPLS) para valorar la relación (de forma predictiva) entre una variable dependiente y otras variables independientes. Para la realización de este análisis se ha utilizado el software Win ISI® (v1.50), siguiendo el siguiente procedimiento: Tras la realización del análisis de componentes principales (PCA), que permite conocer la distribución de muestras en el espacio recién creado, determinar outliers espectrales (𝐻>3), si existen, y seleccionar subconjuntos de muestras representativas del conjunto inicial, se asocia a cada muestra espectral los datos de referencia, determinados previamente. Con el objetivo de reducir al máximo el error de validación cruzada se probaron distintos pretratamientos espectrales, derivadas y suavizados sobre la matriz espectral de calibración antes de comenzar el cálculo de la regresión. La selección de muestras se realizó de forma parcialmente guiada, seleccionando aleatoriamente una muestra de cada uno de los grupos espectralmente similares identificados, utilizando el criterio NH, para el subconjunto de calibración y otra para el de validación. El método MPLS divide el set de muestras de calibración en una serie de subgrupos para realizar una validación cruzada que permite fijar el número de factores de mínimos cuadrados parciales (factores PLS), reduciendo así la posibilidad de sobreajuste (Shenk, et al., 1995) y ayudando a eliminar outliers químicos. Al realizar la predicción, las muestras que presentan un error residual alto son eliminadas, permaneciendo aquéllas que presentan un valor de 𝑇≤2.5. El error de validación obtenido en cada muestra se combina en forma de error estándar de validación cruzada (𝑆𝐸𝐶𝑉). Finalmente, se realizó una validación externa de los modelos generados utilizando el subconjunto de muestras de validación. De este proceso de validación se obtiene el error estándar de validación externa que permite, junto con otros parámetros, evaluar la bondad de los modelos MPLS calculados. 6.2.1. Aplicación de los modelos desarrollados Los modelos MPLS desarrollados se aplicaron a muestras externas a éstos con el objetivo de predecir los valores que tendrán los parámetros de interés para las cuales estos modelos fueron creados. La aplicación de un modelo MPLS a nuevas muestras es posible siempre y cuando sus espectros pertenezcan al mismo espacio espectral que los espectros de las muestras que generaron el modelo. Para comprobar que se cumple esta condición, los espectros de las nuevas muestras se descomponen en el espacio espectral generado por el PCA y se calcula la distancia de QUIMIOMETRÍA 97 Mahalanobis (𝐻) entre cada espectro de estas nuevas muestras y el centro del espacio espectral. Esta distancia tiene que ser menor a 3 unidades para que la nueva muestra pueda ser evaluada por los modelos MPLS desarrollados previamente. Tras la aplicación de los modelos MPLS a un set de nuevas muestras, se obtuvienen los valores de los parámetros de referencia predichos. Estos valores permiten conocer características de las muestras de forma rápida y no destructiva, que pueden ser aplicadas para el diseño de nuevos estudios. En la presente memoria, este procedimiento se ha aplicado en distintas ocasiones. Bien para conocer la distribución de compuestos fenólicos predichos, extraíbles o totales, en un set de muestras o para conocer contenidos extraíbles predichos de compuestos fenólicos en hollejo de uva y poder clasificar después las muestras según estos contenidos predichos. 6.3. Análisis de la varianza (ANOVA) En general, el propósito del ANOVA es encontrar diferencias significativas entre las medias, a través de una variable dependiente, cuantitativa, y un conjunto de variables independientes o factores, que son cualitativas. El valor del nivel de significación estadística p representa la probabilidad de error que implica aceptar como válido el resultado observado. En concreto, se ha utilizado el ANOVA con el objetivo de evaluar la influencia de la adición de fragmentos de madera en etapa fermentativa y postfermentativa sobre el contenido antociánico extraíble de hollejos de uva tinta y sobre la composición fenólica y calidad cromática de vino tinto, respectivamente. Se ha utilizado el software Statistica v.8.0 (StatSoft Inc, 2007) aplicando el test post hoc de Tukey para detectar qué grupos son significativamente diferentes, en cuanto a sus valores medios. Se estableció un nivel de significación estadística de α=0.05 en todos los análisis en los que se realizó este test. 6.4. Agrupamiento mediante el algoritmo de k-medias La aplicación de este algoritmo ha permitido agrupar muestras de semilla de uva en dos grupos con distintos niveles de extractabilidad fenólica. El análisis se desarrolló utilizando el software Statistica v.8.0. Para iniciar el análisis se seleccionaron los centros iniciales de cada grupo de forma que las distancias iniciales entre cada grupo fueran máximas. El algoritmo iterativo continúa asignando cada muestra al grupo cuyo centro sea el más cercano y recalculando los centros al finalizar la asignación. El algoritmo finaliza cuando el reparto de la población de muestras entre los distintos grupos se repite. MATERIALES Y MÉTODOS 98 6.5. Análisis Discriminante Lineal (LDA) Se ha aplicado el análisis discriminante lineal a muestras de uva tinta y muestras de semillas de uva con el objetivo de discriminar entre distintos niveles de contenido fenólico extraíble y extractabilidad fenólica de las muestras, respectivamente. En ambos casos las variables independientes utilizadas fueron las puntuaciones obtenidas en el PCA de los espectros NIR de las muestras. Se ha usado el software SPSS 22.0 (IBM®, 2015) para realizar estos análisis, utilizando la modalidad de análisis por pasos. Ésta selecciona las variables más significativas para la discriminación entre las diferentes categorías usando el estadístico F para evaluar la significancia del cambio en la Lambda de Wilks al añadir o eliminar una variable. La capacidad de predicción se estimó considerando el porcentaje de muestras correctamente clasificadas usando un proceso de validación dejando una muestra fuera (leave‒one‒out) o una validación externa, según el caso. 6.6. Análisis discriminante basado en la regresión por mínimos cuadrados parciales (DPLS) El análisis DPLS se ha utilizado con el objetivo de discriminar muestras de uva entre los distintos niveles de contenido fenólico extraíble (fenoles totales, flavanoles y antocianos) establecidos previamente. El software win ISI® (v1.50) se utilizó para llevar a cabo el análisis DPLS y se realizó utilizando, como variables independientes los espectros de los hollejos asignados a los conjuntos de calibración para cada parámetro evaluado obteniéndose los porcentajes de muestras correctamente clasificadas en validación interna. Además, los modelos desarrollados se probaron con los espectros asignados a los conjuntos de validación y se obtuvieron los porcentajes de las muestras clasificadas correctamente en la validación externa. 6.7. Índice de similitud de Pearson El índice de similitud de Pearson se ha utilizado para discriminar muestras de uva entre los niveles de alto y bajo contenido fenólico extraíble (fenoles totales, flavanoles y antocianos). Para ello, se calcularon los espectros promedio de las muestras de uva clasificadas previamente como muestras con alto y bajo contenido extraíble del conjunto de calibración atendiendo a datos químicos, obteniéndose, por tanto, dos espectros promedio, uno correspondiente a las muestras de alto contenido fenólico extraíble y otro a las de baja. A continuación, se realizó una regresión lineal entre el espectro de cada muestra y el espectro promedio de la clase de bajo contenido QUIMIOMETRÍA 99 extraíble y se repitió el mismo procedimiento utilizando el espectro promedio de la clase de alto contenido extraíble, obteniendo para cada muestra dos coeficientes de correlación R, uno para la clase alta y otro para la baja. A partir de este coeficiente se calculó el índice de similitud de Pearson de cada muestra con respecto a las dos clases estudiadas según la siguiente ecuación: Índice⁡de⁡similitud=⁡ 1 1−𝑅2 Para cada muestra se compararon los dos índices y se clasificaron en el grupo para el que se obtuvo el índice más alto (es decir, contenido extraíble bajo o alto), obteniendo los porcentajes de muestras clasificadas correctamente en validación interna. Por último, se utilizó el conjunto de muestras de validación para obtener los porcentajes de muestras clasificadas correctamente en la validación externa. Este procedimiento se repitió para cada parámetro de referencia (contenido extraíble de fenoles totales, flavanoles y antocianos). El software win ISI® (v1.50) se utilizó para llevar a cabo el análisis. En la Figura19 se puede observar de forma esquemática el procedimiento realizado en este análisis. Figura 19. Esquema de obtención del Índice de similitud de Pearson RESULTADOS Y DISCUSIÓN CAPÍTULO 1 103 CAPÍTULO 1: INFLUENCIA DE LA ADICIÓN DE CHIPS DE MADERA DE ROBLE EN LA EXTRACCIÓN DE ANTOCIANOS PROCEDENTES DE HOLLEJO DE UVA CON BAJO CONTENIDO ANTOCIÁNICO EXTRAÍBLE En: Baca Bocanegra, Berta; Nogales Bueno, Julio; Heredia Mira, Francisco José; Hernández Hierro, José Miguel: Influence of oak wood chips-grape mix maceration on the extraction of anthocyanins from low-extractable anthocyanin content red grapes. European Food Research and Technology 2018. Vol. 244. Pág. 729–734, https://doi.org/10.1007/s00217-017-2999-7 1. Antecedentes El color es una de las principales características que definen la calidad de un vino y, por lo general, el primer atributo percibido por los consumidores. Por tanto, el color del vino es un parámetro muy importante enológicamente si se desea obtener vinos de alta calidad. Los antocianos extraídos del hollejo de la uva son los principales responsables del color de los vinos tintos y sus interacciones con otros compuestos fenólicos, llamados copigmentos, normalmente incoloros, permiten la estabilización del color de los vinos mediante reacciones de copigmentación (Boulton, 2001; Escribano-Bailon, et al., 2012). Las condiciones climáticas típicas de las regiones cálidas, como Andalucía, dificultan la obtención de vinos tintos de alta calidad especialmente cuando se someten a procesos de envejecimiento (Mira de Orduña, 2010). Esto se debe, fundamentalmente, a que la maduración fenólica y tecnológica de las uvas no ocurre al mismo tiempo y por tanto, en el momento de la vendimia las uvas tienen un alto contenido de azúcar pero cantidades fenólicas insuficientes (Mori, et al., 2005). En estas condiciones, los fenómenos de copigmentación, que contribuyen a la estabilización del color, se ven obstaculizados por la escasez de pigmentos y copigmentos (Trouillas, et al., 2016). Numerosos estudios demuestran que la adición de copigmentos al vino produce mejoras en sus características cromáticas y en la estabilización del color (González-Manzano, Dueñas, Rivas- Gonzalo, Escribano-Bailón, y Santos-Buelga, 2009; Gordillo, Rodriguez-Pulido, Gonzalez-Miret, Quijada-Morin, Rivas-Gonzalo, Garcia-Estevez, et al., 2015). Teniendo en cuenta que la madera de roble es una fuente natural de fenoles (De Rosso, Panighel, Vedova, Stella, y Flamini, 2009), podría considerarse una fuente potencial de copigmentos para usar en vinificación. A pesar de que en las reacciones de copigmentación suelen estar implicados principalmente compuestos de naturaleza flavanólica, los antocianos del vino también tienen la capacidad de reaccionar directamente con otros compuestos fenólicos cedidos por la madera de roble como, RESULTADOS Y DISCUSIÓN 104 por ejemplo, los elagitaninos (Chassaing, Lefeuvre, Jacquet, Jourdes, Ducasse, Galland, et al., 2010; Quideau, Jourdes, Lefeuvre, Montaudon, Saucier, Glories, et al., 2005). Las propiedades oxidorreductoras de los elagitaninos hacen que su presencia en el vino influya en la evolución de su color, tanto por su efecto protector frente a la oxidación de los antocianos como por su combinación con estos compuestos que conduce a una mayor estabilidad de los pigmentos (Vivas, et al., 1996). Sin embargo, la adición de fragmentos de madera de roble como fuente de copigmentos con el objetivo de mejorar o estabilizar el color del vino puede tener también ciertos inconvenientes. En contacto con la madera, el vino sufre una serie de transformaciones que conducen a cambios importantes en el color pero también en el aroma, sabor y astringencia (Glabasnia, et al., 2006; Puech, et al., 1999; Zamora, 2003). Por tanto, la adición de madera puede aportar aromas indeseados, excesivo amargor o astringencia al vino. Además, es posible que los fragmentos de madera adsorban pigmentos antociánicos consiguiéndose así un efecto contrario al deseado. 2. Objetivo El objetivo principal de este trabajo ha sido evaluar el efecto que tiene la adición de chips de madera de roble como fuente de copigmentos sobre la extracción de antocianos en hollejo de uva tinta clasificada como uva con bajo contenido extraíble predicho a partir de un modelo desarrollado previamente usando el análisis de imagen hiperespectral NIR . 3. Parte experimental Este estudio se llevó a cabo a partir de un conjunto original de doscientas uvas de las variedades tintas Syrah y Tempranillo, cuyo contenido extraíble de antocianos había sido previamente predicho a partir del modelo desarrollado por Nogales-Bueno, Baca-Bocanegra, Rodríguez-Pulido, Heredia, y Hernández-Hierro (2015) utilizando el análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano. Las uvas se recolectaron en el momento de la vendimia de la campaña 2013. Se recolectaron cien bayas de cada variedad siguiendo un modificación de la metodología descrita por Bergqvist, et al. (2001). Una vez recolectadas, las muestras se transportaron refrigeradas al laboratorio donde, tras alcanzar la temperatura ambiente, fueron sometidas al análisis de imagen hiperespectral. A continuación, se separaron los hollejos de cada uva, se pesaron y se almacenaron a ‒20 ºC hasta la realización de los correspondientes análisis químicos. Teniendo en cuenta los resultados del modelo hiperespectral desarrollado, según los cuales el contenido antociánico extraíble predicho es menor para las uvas de variedad Syrah que para las de variedad Tempranillo, se consideró la variedad Syrah como la más interesante para la CAPÍTULO 1 105 evaluación del efecto de la adición de copigmentos. Las muestras del subconjunto de variedad Syrah fueron ordenadas de acuerdo con el contenido extraíble predicho de antocianos y separadas en dos grupos: bajo y alto contenido extraíble predicho; usando la mediana como valor de corte para la clasificación (1.8 m g-1 hollejo). Finalmente, para realizar el ensayo, se seleccionaron aleatoriamente 10 muestras del grupo de bajo contenido extraíble predicho. El hollejo de cada una de las 10 uvas seleccionadas se dividió en dos partes aproximadamente iguales, y se maceraron de forma individual durante un periodo de 3 días en vino sintético, manteniendo constante la relación de volumen de disolvente respecto al peso de hollejo. Para estudiar la influencia que pudieran tener los copigmentos provenientes de los chips en la extracción de antocianos de hollejo de uva tinta, una de las extracciones se llevó a cabo en presencia de chips de roble americano, en una concentración de 4 g L-1, manteniendo la otra extracción como testigo del proceso. Los sobrenadantes obtenidos de las extracciones realizadas a los hollejos fueron analizados mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) para determinar la cantidad de antocianos extraída, siguiendo una modificación del método descrito por Matilde García-Marino, José Miguel Hernández-Hierro, Julián C. Rivas-Gonzalo, y M.Teresa Escribano-Bailón (2010). Se identificaron hasta 15 antocianos diferentes por medio de las características espectrales y cromatográficas de estos picos y la suma de todos ellos se expresó como antocianos totales. Los resultados obtenidos en este ensayo corroboran la bondad del modelo utilizado para la predicción del contenido extraíble de antocianos totales en las muestras seleccionadas ya que solo dos muestras tienen un contenido total de antocianos extraíbles ligeramente superior a 1.8 mg g-1 de hollejos. Para estudiar el efecto de la presencia de copigmentos provenientes de chips de roble americano en la extracción de antocianos en hollejo de uva, se realizó un análisis de componentes principales (PCA) y se buscaron agrupaciones no condicionadas de las muestras en función de la presencia o ausencia de chips de madera de roble. Sin embargo, no pudo encontrarse ninguna agrupación o tendencia en cuanto al factor analizado. Para confirmar este resultado se realizó un ANOVA. Se utilizaron como variables dependientes, los contenidos extraíbles de antocianos obtenidos mediante HPLC y como factor la presencia o ausencia de copigmentos en el medio de extracción. No se encontraron diferencias significativas (𝑝 < 0.05) para ninguna de las variables dependientes estudiadas, lo que permite afirmar que la presencia de estos copigmentos no altera el proceso de extracción de antocianos en hollejo de uva. Por lo que estos copigmentos pueden ser añadidos en la vinificación con el objetivo de mejorar la calidad cromática de los vinos producidos, aumentando y estabilizando su color, sin temor a perjudicar de alguna forma la cantidad de antocianos extraída de los hollejos macerados. Eur Food Res Technol 1 3 10. González-Manzano S, Rivas-Gonzalo JC, Santos-Buelga C (2004) Extraction of flavan-3-ols from grape seed and skin into wine using simulated maceration. Anal Chim Acta 513:283–289 11. Canals R, Llaudy MC, Valls J, Canals JM, Zamora F (2005) Influence of the physiological stage and the content of soluble solids on the anthocyanin extractability of Vitis vinifera L. cv. Tempranillo grapes. Anal Chim Acta 53:4019–4025 12. Fournand D, Vicens A, Sidhoum L, Souquet JM, Moutounet M, Cheynier V (2006) Accumulation and extractability of grape skin tannins and anthocyanins at different advanced physiological stages. J Agric Food Chem 54:7331–7338 13. Hernandez-Hierro JM, Quijada-Morin N, Rivas-Gonzalo JC, Escribano-Bailon MT (2012) Influence of the physiological stage and the content of soluble solids on the anthocyanin extractability of Vitis vinifera L. cv. Tempranillo grapes. Anal Chim Acta 732:26–32 14. Zouid I, Siret R, Jourjon F, Mehinagic E, Rolle L (2013) Impact of grapes heterogeneity according to sugar level on both physical and mechanical berries properties and their anthocyanins extractability at harvest. J Texture Stud 44:95–103 15. Mori K, Sugaya S, Gemma H (2005) Decreased anthocyanin biosynthesis in grape berries grown under elevated night temperature condition. Sci Hortic Amst 105:319–330 16. González-Manzano S, Dueñas M, Rivas-Gonzalo JC, Escribano- Bailón MT, Santos-Buelga C (2009) Studies on the copigmentation between anthocyanins and flavan-3-ols and their influence in the colour expression of red wine. Food Chem 114:649–656 17. Gordillo B, Rodriguez-Pulido FJ, Gonzalez-Miret ML, Quijada- Morin N, Rivas-Gonzalo JC, Garcia-Estevez I, Heredia FJ, Escribano-Bailon MT (2015) Application of differential colorimetry to evaluate anthocyanin–flavonol–flavanol ternary copigmentation interactions in model solutions. J Agric Food Chem 63:7645–7653 18. De Rosso M, Cancian D, Panighel A, Dalla Vedova A, Flamini R (2008) Chemical compounds released from five different woods used to make barrels for aging wines and spirits: volatile compounds and polyphenols. Wood Sci Technol 43:375–385 19. Escribano-Bailón T, Dangles O, Brouillard R (1996) Coupling reactions between flavylium ions and catechin. Phytochemistry 41:1583–1592 20. Francia-Aricha EM, Guerra MT, Rivas-Gonzalo JC, Santos- Buelga C (1997) New anthocyanin pigments formed after condensation with flavanols. J Agric Food Chem 45:2262–2266 21. Rivas-Gonzalo JC, Bravo-Haro S, Santos-Buelga C (1995) Detection of compounds formed through the reaction of malvidin 3-monoglucoside and catechin in the presence of acetaldehyde. J Agric Food Chem 43:1444–1449 22. Vivas N, Glories Y, Lagune L, Saucier C, Augustin M (1994) Estimation du degré de polymérisation des procyanidines du raisin et du vin par la méthode au p-dimethylaminocinnamaldéhyde. J Int Sci Vigne Vin 28:319–336 23. Timberlake CF, Bridle P (1976) Interactions between anthocyanins, phenolic compounds, and acetaldehyde and their significance in red wines. Am J Enol Vitic 27:97–105 24. Quideau S, Jourdes M, Lefeuvre D, Montaudon D, Saucier C, Glories Y, Pardon P, Pourquier P (2005) The chemistry of wine polyphenolic C-glycosidic ellagitannins targeting human topoisomerase II. Chemistry 11:6503–6513 25. Chassaing S, Lefeuvre D, Jacquet R, Jourdes M, Ducasse L, Galland S, Grelard A, Saucier C, Teissedre P-L, Dangles O, Quideau S (2010) Physicochemical studies of new anthocyano-ellagitannin hybrid pigments: about the origin of the influence of oak C-gly- cosidic ellagitannins on wine color. Eur J Org Chem 1:55–63 26. García-Estévez I, Escribano-Bailón MT, Rivas-Gonzalo JC, Alcalde-Eon C (2012) Validation of a mass spectrometry method to quantify oak ellagitannins in wine samples. J Agric Food Chem 60:1373–1379 27. Cadahia E, Varea S, Muñoz L, Fernandez de Simon B, García- Vallejo MC (2001) Evolution of ellagitannins in Spanish, French, and American oak woods during natural seasoning and toasting. J Agric Food Chem 49:3677–3684 28. Nogales-Bueno J, Baca-Bocanegra B, Rodríguez-Pulido FJ, Heredia FJ, Hernández-Hierro JM (2015) Use of near infrared hyperspectral tools for the screening of extractable polyphenols in red grape skins. Food Chem 172:559–564 29. Garcia-Marino M, Hernandez-Hierro JM, Rivas-Gonzalo JC, Escribano-Bailon MT (2010) Colour and pigment composition of red wines obtained from co-maceration of Tempranillo and Graciano varieties. Anal Chim Acta 660:134–142 30. Hernández-Hierro JM, Nogales-Bueno J, Rodríguez-Pulido FJ, Heredia FJ (2013) Feasibility study on the use of near-infrared hyperspectral imaging for the screening of anthocyanins in intact grapes during ripening. J Agric Food Chem 61:9804–9809 31. Crozier A, Clifford MN, Ashihara H (2006) Plant secondary metabolites. Occurrence, structure and role in the human diet. Blackwell Publishing, Oxford 32. Kontoudakis N, Esteruelas M, Fort F, Canals JM, De Freitas V, Zamora F (2011) Influence of the heterogeneity of grape phenolic maturity on wine composition and quality. Food Chem 124:767–774 CAPÍTULO 2 113 CAPÍTULO 2: ESTIMACIÓN DEL CONTENIDO Y LA EXTRACTABILIDAD DE FENOLES TOTALES Y FLAVANOLES EN SEMILLAS DE UVA MEDIANTE ANALISIS DE IMAGEN HIPERESPECTRAL EN EL INFRARROJO CERCANO En: Baca Bocanegra, Berta; Nogales Bueno, Julio; Heredia Mira, Francisco José; Hernández Hierro, José Miguel: Estimation of total phenols, flavanols and extractability of phenolic compounds in grape seeds using vibrational spectroscopy and chemometric tools. Sensors 2018. Vol. 18. Pág. 2426-2438, https://doi.org/10.3390/s18082426 1. Antecedentes En la uva, los compuestos fenólicos se encuentran repartidos por todo el fruto, tanto en semillas como hollejos y pulpa. Aunque las semillas representan solo 0-6% del peso de la baya, son una fuente importante de compuestos fenólicos para los vinos. Dependiendo de la variedad, las semillas de uva contienen hasta la mitad de los compuestos fenólicos de la baya, y representan entre 4 y 6% del peso de la semilla (Ribéreau-Gayon, et al., 2006). Los compuestos fenólicos más importantes en la semilla de uva son los flavanoles y pueden aparecer tanto en forma de monómeros como de oligómeros y polímeros compuestos de distintas subunidades monoméricas (Hidalgo Togores, 2010; Ristic, et al., 2005). Durante el proceso de vinificación, concretamente en la maceración, los compuestos fenólicos presentes en la semilla pasan directamente al vino (Waterhouse, 2002) y condicionan de forma considerable las características sensoriales del mismo. Por lo general, están relacionados con el sabor (acidez, amargor y astringencia) y el color (a través del fenómeno de la copigmentación) de los vinos tintos (Ribéreau-Gayon, Glories, Maujean y Dubourdieu, 2006). Por lo tanto, conocer la cantidad de fenoles de las semillas de uva que se transfieren al vino, o contenido fenólico extraíble, despierta interés en la industria del vino, ya que la calidad del vino depende en gran medida de este aspecto. Factores como el grado de madurez del fruto y la degradación de la pared celular, condicionan la facilidad de extracción de los compuestos fenólicos desde las semillas de uva (Bautista-Ortín, et al., 2013; Cadot, et al., 2006; Rodriguez-Pulido, et al., 2014). Tradicionalmente, la determinación de los compuestos fenólicos de la uva o de las diferentes partes de la misma se ha llevado a cabo mediante análisis espectrofotométricos o cromatográficos que requieren maceraciones previas de las muestras. Estos métodos además de ser lentos, conllevan la destrucción de la muestra, por lo que tiene gran interés reemplazarlos por métodos RESULTADOS Y DISCUSIÓN 114 más rápidos y no destructivos que permitieran hacer un número más elevado de determinaciones en menos tiempo y utilizar las mismas muestras para diferentes análisis. En los últimos años, la espectroscopía de infrarrojo cercano se ha instaurado como alternativa a los métodos tradicionales proporcionando una respuesta rápida, no destructiva y respetuosa con el medio ambiente. Concretamente, el análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano ha sido aplicado en varias ocasiones para la determinación, a modo exploratorio, de diversos parámetros de interés en uva con buenos resultados. Puede ser considerada una técnica adecuada para la estimación del contenido y la extractabilidad de compuestos fenólicos en semillas de uva. 2. Objetivo El objetivo de este capítulo ha sido el desarrollo de métodos rápidos y no destructivos para la estimación del contenido total, contenido extraíble y extractabilidad de fenoles totales y flavanoles totales en semillas de uva tinta mediante análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano. 3. Parte Experimental Se utilizaron muestras de semilla de uva tinta pertenecientes a las variedades Tempranillo y Syrah, recolectadas en la región del Condado de Huelva (Andalucía, España) durante la vendimia de 2014. Se recolectó un total de doscientas uvas, cien por variedad. Con el fin de obtener conjuntos representativos de muestras, se recogieron uvas de la parte superior, media e inferior del racimo y de racimos situados en zona de sol y de sombra. Las muestras fueron refrigeradas e inmediatamente transportadas al laboratorio. Tras la recepción de las muestras, las semillas de cada uva fueron separadas del resto de la baya. A continuación, siguiendo la metodología descrita por Rodriguez-Pulido, et al. (2014) se registraron las imágenes hiperespectrales de las semillas de uva pertenecientes a cada uva individual. Las imágenes de cada una de las muestras se calibraron respecto a un patrón de referencia y la corriente oscura del equipo, y se almacenó el espectro medio de cada muestra (950−1650 nm). Finalmente, las muestras de semillas se pesaron y se almacenaron a ‒20 ºC hasta la realización de los correspondientes análisis químicos. Se aplicó un análisis de componentes principales (PCA) con el objetivo de reducir la dimensión de la matriz espectral obtenida, sin pérdida de información espectral significativa, y seleccionar muestras representativas del conjunto de datos espectrales. La selección de muestras se llevó a cabo siguiendo una modificación del método de Nogales-Bueno, et al. (2015) como se describe en detalle en Nogales-Bueno, Baca-Bocanegra, Rooney, Hernandez-Hierro, Byrne, y CAPÍTULO 2 115 Heredia (2017). Teniendo en cuenta 8 componentes principales se consiguió explicar el 90 % de la variabilidad espectral de los datos originales. Se calcularon las distancias de Mahalanobis (H) para cada muestra y se agruparon todas las muestras que tuvieran una distancia de Mahalanobis a muestra vecina (𝑁𝐻) menor que 0.6, obteniéndose 66 grupos distintos. A continuación, se crearon conjuntos de calibración y validación asignando una muestra de cada grupo creado a cada conjunto. El conjunto de calibración consistió en 66 muestras en el cual estaba representada toda la variabilidad espectral del conjunto original, mientras que el conjunto de validación estaba compuesto por solo 26 muestras ya que 40 de los 66 grupos creados estaban formados por una única muestra. Finalmente, se pesaron las 92 muestras de semillas seleccionadas y se conservaron a -20 ºC hasta que se llevaron a cabo los análisis químicos. Se determinó el contenido fenólico total extraíble (EPC), el contenido flavanólico extraíble (EFC), el contenido fenólico total (TPC), el contenido flavanólico total (TFC), la extractabilidad de fenoles totales (ETP) y la extractabilidad de flavonoles (EF) para las 92 muestras seleccionadas, y estas nuevas variables se usaron como parámetros de referencia en los análisis quimiométricos posteriores. Los contenidos extraíbles se determinaron mediante el análisis de los sobrenadantes de las extracciones de semillas de uva en vino modelo (12.5% (v/v) de etanol, 4 g de ácido tartárico L-1, ajustado a pH 3,6 con NaOH 0.5 M). A continuación, las semillas de uva se sometieron a una extracción exhaustiva en metanol:agua 75:25 (v/v) y se obtuvieron los contenidos totales de fenoles y flavanoles como la suma de ambas extracciones . Finalmente, la extractabilidad de fenoles totales y flavanoles de cada muestra se determinó como el cociente entre el contenido extraíble y el contenido total para cada parámetro. Se aplicó el método de Folin-Ciocalteu (Singleton, et al., 1965) para determinar el contenido fenólico total extraíble y el contenido fenólico total, mientras que para la determinación del contenido flavanólico extraíble y el contenido flavanólico total se siguió una modificación del método de Vivas, et al. (1994). Una vez determinados los parámetros de referencia, se realizó la calibración mediante regresión por mínimos cuadrados parciales modificada (MPLS) utilizando los espectros alojados en el set de calibración y los datos de referencia anteriormente mencionados. Se probaron distintos pretratamientos espectrales para optimizar el error estándar de calibración que se obtiene en el proceso de validación cruzada (SECV) y se seleccionó el modelo que menor error generaba. Tras esto, se realizó la validación externa del modelo usando las muestras seleccionadas para tal efecto. Como resultado del proceso de validación, se obtuvo el error estándar de predicción (SEP) en validación externa para cada modelo. Los algoritmosdesarrollados permiten predecir de forma adecuada el contenido fenólico total y el contenido flavanólico total en semillas de uva con errores estándar de predicción de 11.23 y 4.85 mg g-1 de semilla de uva (32.15% y 23.31% respectivamente). Errores similares han sido descritos previamente para estos parámetros usando RESULTADOS Y DISCUSIÓN 116 espectroscopia en el infrarrojo cercano (Cozzolino, Kwiatkowski, Parker, Cynkar, Dambergs, Gishen, et al., 2004; Ferrer-Gallego, et al., 2010; Jara-Palacios, et al., 2016; Rodriguez-Pulido, et al., 2014). Para el resto de los parámetros evaluados (EPC, EFC, ETP y EF) los modelos proporcionan errores estándar de predicción en validación externa elevados que comprometen su uso con fines predictivos. Debido a la gran importancia de estos parámetros, se llevaron a cabo otros enfoques para ETP y EF con el fin de vincular la extractabilidad fenólica en semillas de uva a sus características espectrales en la región del infrarrojo cercano. Para ello, las muestras de semilla de uva se clasificaron según su extractabilidad de compuestos fenólicos (extractabilidad de fenoles totales y extractabilidad de flavonoles) utilizando un análisis de conglomerados de K- medias. Teniendo en cuenta estas dos variables, las muestras de calibración y validación se clasificaron en muestras con alta y baja capacidad de extracción. Posteriormente, se realizó un análisis discriminante lineal (LDA) por pasos para discriminar las muestras entre los dos niveles de extractabilidad (alto o bajo). Se introdujeron como variables clasificatorias las puntuaciones de los 8 primeros componentes principales, obtenidas de datos hiperespectrales y utilizadas previamente para la selección de muestras. Este modelo permitió discriminar correctamente un 83.3% de las muestras en el proceso de validación interna y un 76.9% de éstas en la validación cruzada dejando una muestra fuera. Por último, los métodos desarrollados, tanto cuantitativos como cualitativos, se aplicaron a todo el conjunto de muestras de semillas de uva recolectadas, con excepción de un outlier espectral (H>3) encontrado en el análisis de componentes principales inicial. Al aplicar los modelos de calibración cuantitativa, se realizó la predicción de los contenidos totales fenólicos y flavanólicos. Los dos parámetros presentan una distribución gaussiana para las dos variedades de uva analizadas, Tempranillo y Syrah, lo que confirma la heterogeneidad fenólica descrita previamente en bibliografía para el contenido fenólico de uvas con el mismo estado de maduración (Nogales-Bueno, et al., 2015). Los parámetros predichos muestran valores más altos para la variedad Syrah. El análisis cualitativo permitió clasificar el conjunto total de semillas como muestras con alto o bajo nivel de extractabilidad de forma que el conjunto de bajo nivel de extractabilidad estaba constituido por un total 172 muestras, 30 de la variedad Syrah y 97 de variedad Tempranillo mientras que el conjunto de alto nivel de extractabilidad estaba formado por 72 muestras en la proporción 69:3 Syrah:Tempranillo. Estos resultados indican mayores extractabilidades fenólicas en las semillas de uva de variedad Syrah. CAPÍTULO 2 117 4. Conclusiones  El análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano puede considerarse una técnica adecuada para estimar el contenido fenólico total y contenido flavanólico total en semillas de uva tinta de una manera rápida y razonablemente económica. Sin embargo, proporciona errores mayores a los esperados en la estimación del contenido extraíble y la extractabilidad de fenoles totales y flavanoles en las muestras objeto de análisis.  El análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano tiene un poder discriminatorio satisfactorio para la clasificación de muestras de semilla de uva tinta según su nivel de extractabilidad fenólica.  La aplicación de los modelos cuantitativos desarrollados para la estimación del contenido fenólico total y contenido flavanólico total en semillas de uva proporciona una distribución gaussiana de estos parámetros que confirma la heterogeneidad fenólica descrita en bibliografía. Para ambos parámetros se observan valores más altos en las muestras de variedad Syrah que en las de Tempranillo, resultado que se corresponde con mayores extractabilidades fenólicas en las semillas de variedad Syrah según los resultados obtenidos al aplicar el modelo cualitativo desarrollado. sensors Article Estimation of Total Phenols, Flavanols and Extractability of Phenolic Compounds in Grape Seeds Using Vibrational Spectroscopy and Chemometric Tools Berta Baca-Bocanegra, Julio Nogales-Bueno * ID , Francisco JoséHeredia and JoséMiguel Hernández-Hierro ID Food Colour and Quality Laboratory, Área de Nutrición y Bromatología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, 41012 Sevilla, Spain; [email protected] (B.B.-B.); [email protected] (F.J.H.); jmhhierr[email protected] (J.M.H.-H.) *Correspondence: [email protected]; Tel.: +34-954-557-017 Received: 18 June 2018; Accepted: 24 July 2018; Published: 26 July 2018   Abstract: Near infrared hyperspectral data were collected for 200 Syrah and Tempranillo grape seed samples. Next, a sample selection was carried out and the phenolic content of these samples was determined. Then, quantitative (modified partial least square regressions) and qualitative (K-means and lineal discriminant analyses) chemometric tools were applied to obtain the best models for predicting the reference parameters. Quantitative models developed for the prediction of total phenolic and flavanolic contents have been successfully developed with standard errors of prediction (SEP) in external validation similar to those previously reported. For these parameters, SEPs were respectively, 11.23 mg g −1 of grape seed, expressed as gallic acid equivalents and 4.85 mg g −1 of grape seed, expressed as catechin equivalents. The application of these models to the whole sample set (selected and non-selected samples) has allowed knowing the distributions of total phenolic and flavanolic contents in this set. Moreover, a discriminant function has been calculated and applied to know the phenolic extractability level of the samples. On average, this discrimination function has allowed a 76.92% of samples correctly classified according their extractability level. In this way, the bases for the control of grape seeds phenolic state from their near infrared spectra have been stablished. Keywords: phenolic compounds; extractability; total phenols; flavanols; grape seeds; near infrared; vibrational spectroscopy; chemometrics 1. Introduction There is a high variability of phenolic compounds in grapes (Vitis vinifera L.). These compounds can be found in the whole berry (skin, pulp and seeds) and in the fermentation stage, they become part of the wine [ 1 ]. Depending on varieties, grape seeds contains up to half of the berry phenolic compounds, and they represent between 4% and 6% of the seed weight [ 2 ]. In grape seed, the most important phenolic compounds are flavanols (or flavan-3-ols). They can be found as monomers ((+)-catechin, ( − )-epichatechin or epichatechin 3-galate) oligomers or polymers [ 3 ]. Moreover, phenolic acids (benzoic or hidroxycinnamic acids) are also found in grape seeds [ 4 ]. These phenolic compounds play an important role in the sensory characteristics of wine. They are typically linked to the flavor (acidity, bitterness and astringency) and color (via copigmentation phenomena) of red wines [5]. Therefore, knowing the amount of phenols that are transferred to wine from grape seeds (i.e., extractable total phenolic content or extractable phenolic content) is an essential issue in the wine Sensors 2018,18, 2426; doi:10.3390/s18082426 www.mdpi.com/journal/sensors Sensors 2018,18, 2426 2 of 12 industry, since the quality of wine depends largely on this aspect. Extractable phenolic content largely depends on the total amount of phenolic compounds that grape seeds have (i.e., total phenolic content). In consequence, it is necessary to define the extractability as the ratio between the extractable phenolic content and the total phenolic content. Phenolic extractability allows comparing samples with different total phenolic content and sorting samples according to their phenolic extractability. There are a number of methods that allow obtaining the extractable or total content of the more important phenolic families. For example, in grape seed samples, the Folin-Ciocalteu [ 6 ] and 4-dimethyl-aminocinnamaldehyde (DMACA) [ 7 ] methods can be applied in order to obtain the extractable or total content of total phenols and flavanols, respectively (being total phenols the totality of phenolic compounds present in grape seeds, i.e., phenolic acids, flavanols, flavonols, etc.). These kind of traditional methods for the control of parameters of interest in grapes are being replaced by non-destructive and green chemistry methods. Among them, a high number of near infrared hyperspectral methods have been developed in the last decade in order to screen several parameters of interest in grapes [ 8 ]. In some studies, hyperspectral imaging is applied to predict total or extractable phenolic content in grapes or grape seeds [ 9 , 10 ], to control phenolic or technological maturity [ 11 ] or to control the composition of oenological by-products [12]. In this study, hyperspectral imaging has been applied to control the extractable phenolic content, the total phenolic content and the extractability of phenolic compounds. In particular, flavanols and total phenols have been studied. Near infrared spectra have been acquired for two hundred samples of Syrah and Tempranillo grape seeds and a sample selection procedure has been carried out. Next, reference parameters, extractable and total contents and phenolic extractability of total phenols and flavanols, have been chemically evaluated for selected samples. Then a number of chemometric approaches have been interrogated (PCA, MPLS, K-means cluster analysis and LDA) in order to obtain the best methods for predicting the reference parameters. Finally, the developed methods have been applied to all samples with the exception of spectral outliers and the obtained distributions of the reference parameters have been evaluated in the samples. 2. Materials and Methods 2.1. Samples Grape seeds from two hundred Syrah and Tempranillo grapes (Vitis vinifera L.) were used in this study. The procedures carried out for grape collection and grape seed extraction from the whole grapes are described in detail elsewhere in [ 13 ]. Briefly, two hundred Syrah and Tempranillo red grape samples were collected from two vineyards located in the Condado de Huelva Designation of Origin D.O. (Andalusia, Spain) on two different dates (7 and 11 August 2014). In order to achieve representative samples sets, single grapes were collected from the top, middle and bottom of the cluster and from the sunlight and shade side. The samples were refrigerated and immediately transported to the laboratory. 2.2. Acquisition of Hyperspectral Data Hyperspectral images of grape seeds belonging to an individual grape were jointly acquired. Hyperspectral data collection is described in Rodríguez-Pulido, et al. [ 10 ]. Briefly, hyperspectral imaging device (Infaimon S.L., Barcelona, Spain) comprised a Xenics ® XEVA-USB InGaAs camera (320 × 256 pixels; Xenics Infrared Solutions, Inc., Leuven, Belgium), a spectrograph (Specim ImSpector N17E Enhanced; Spectral Imaging Ltd., Oulu, Finland) covering the spectral range between 900 and 1700 nm (spectral resolution of 3.25 nm). Samples were placed 40 cm below the camera’s scanning window and two 70 W tungsten iodine halogen lamps (Prilux, Barcelona, Spain) were used as lighting sources at 45◦from the vertical. Raw hyperspectral images were corrected from the dark current effect, then, the regions of interest (i.e., pixels belonging to grape seeds) were selected. The selection of the regions of interest was carried Sensors 2018,18, 2426 3 of 12 out by means of a forward stepwise discriminant analysis. For that, a number of spectra belonging to seeds and background (a homogeneous surface composed of polyethylene) were manually collected and they were used for the creation of the algorithm of segmentation. The algorithm saved all the masks of segmentation and they were visually supervised for ensuring the suitability of the proposed method. Then, the average reflectance spectra were obtained for each grape seed sample. Next, spectra were transformed to relative absorbances and the spectral region comprised between 950 and 1650 nm was saved and a spectral matrix (200 samples × 215 wavelengths) was formed. Figure 1describes the whole procedure carried out for each sample from the spectra acquisition until the obtaining the average spectrum. Sensors2018,18,xFORPEERREVIEW 3of12 wascarriedoutbymeansofaforwardstepwisediscriminantanalysis.Forthat,anumberofspectra belongingtoseedsandbackground(ahomogeneoussurfacecomposedofpolyethylene)were manuallycollectedandtheywereusedforthecreationofthealgorithmofsegmentation.The algorithmsavedallthemasksofsegmentationandtheywerevisuallysupervisedforensuringthe suitabilityoftheproposedmethod.Then,theaveragereflectancespectrawereobtainedforeach grapeseedsample.Next,spectraweretransformedtorelativeabsorbancesandthespectralregion comprisedbetween950and1650nmwassavedandaspectralmatrix(200samples×215 wavelengths)wasformed.Figure1describesthewholeprocedurecarriedoutforeachsamplefrom thespectraacquisitionuntiltheobtainingtheaveragespectrum.  Figure1.Descriptionoftheprocedurecarriedoutforeachsamplefromtherawhyperspectralimage acquisitionuntilobtainingtheaveragespectrum. 2.3.SampleSelection Asampleselectionprocedurewascarriedouttoreducethedimensionofthespectralmatrix withoutlosingofsignificantspectralinformationandtodecreasethenumberofseedsamplestobe chemicallyanalyzed.Sampleselectionwascarriedoutfollowingamodificationofthemethodof Nogales‐Bueno,etal.[14]asitisdescribedindetailin[13].Inbrief,aprincipalcomponentanalysis (PCA)wasappliedtothenearinfraredspectralmatrixand,asresult,66groupsofsamplesspectrally differentwereidentified.Next,calibrationandvalidationsetswerecreatedbyallocatingonesample fromeverygrouprespectively.Therefore,thecalibrationsetconsistedof66samples,whilethe validationsetwascomposedofonly26samplesbecausethereweretwoormoresamplesinonly26 groups.Finally,theweightofthese92seedsampleswasmeasuredandtheywereconservedat−20 °Cuntilchemicalanalyseswerecarriedout. 2.4.PhenolicCharacterizationofGrapeSeeds:ExtractableContent,TotalContentandExtractabilityofTotal PhenolsandFlavanols Extractabletotalphenoliccontent(EPC),extractableflavanoliccontent(EFC),totalphenolic content(TPC),totalflavanoliccontent(TFC),extractabilityoftotalphenols(ETP)andextractability offlavanols(EF)weremeasuredforsamplesselectedinSection2.3andthesevariableswereusedas referenceparametersinthesubsequentchemometricapproaches. Extractablecontentsweredeterminedbytheanalysisofthesupernatantsofgrapeseeds extractionsinmodelwine(12.5%(v/v)ethanol,4gL −1 tartaricacid,adjustedatpH3.6withNaOH0.5 M).Aratioof25mLofmodelwinepereachgramofseedwaskeptconstantforallsamples.These macerationswerecarriedoutatroomtemperatureinadryplaceduring72hwithoutanyexternal agitation.Supernatantswereusedforthedeterminationoftheextractablecontents.Next,theywere freeze‐dried,groundedandmaceratedinmethanol:water75:25(v/v),sonicatedduring15min(JP Figure 1. Description of the procedure carried out for each sample from the raw hyperspectral image acquisition until obtaining the average spectrum. 2.3. Sample Selection A sample selection procedure was carried out to reduce the dimension of the spectral matrix without losing of significant spectral information and to decrease the number of seed samples to be chemically analyzed. Sample selection was carried out following a modification of the method of Nogales-Bueno, et al. [ 14 ] as it is described in detail in [ 13 ]. In brief, a principal component analysis (PCA) was applied to the near infrared spectral matrix and, as result, 66 groups of samples spectrally different were identified. Next, calibration and validation sets were created by allocating one sample from every group respectively. Therefore, the calibration set consisted of 66 samples, while the validation set was composed of only 26 samples because there were two or more samples in only 26 groups. Finally, the weight of these 92 seed samples was measured and they were conserved at − 20 ◦ C until chemical analyses were carried out. 2.4. Phenolic Characterization of Grape Seeds: Extractable Content, Total Content and Extractability of Total Phenols and Flavanols Extractable total phenolic content (EPC), extractable flavanolic content (EFC), total phenolic content (TPC), total flavanolic content (TFC), extractability of total phenols (ETP) and extractability of flavanols (EF) were measured for samples selected in Section 2.3 and these variables were used as reference parameters in the subsequent chemometric approaches. Extractable contents were determined by the analysis of the supernatants of grape seeds extractions in model wine (12.5% (v/v) ethanol, 4 g L −1 tartaric acid, adjusted at pH 3.6 with NaOH 0.5 M). A ratio of 25 mL of model wine per each gram of seed was kept constant for all samples. These macerations were carried out at room temperature in a dry place during 72 h without any external agitation. Supernatants were used for the determination of the extractable contents. Next, they were freeze-dried, grounded and macerated in methanol:water 75:25 (v/v), sonicated during Sensors 2018,18, 2426 10 of 12 TPC, differences are lower than in the previous case, although five Syrah samples show really high total contents. Sensors2018,18,xFORPEERREVIEW 10of12 equivalents),thesestatisticswereforSyrahsamples,respectively:24.21mgg−1and5.51mgg−1and forTempranillosamples15.98mgg−1and3.84mgg−1. InFigure5a,samplesareplottedaccordingtotheirTPCandTFCvalues.Itcanbeobservedthat, inmostcases,SyrahsampleshaveahigheramountofTFCthanTempranillosamples.Regardingto TPC,differencesarelowerthaninthepreviouscase,althoughfiveSyrahsamplesshowreallyhigh totalcontents.  Figure5.Representationofgrapeseedsamplesaccordingtheirpredictedtotalphenoliccontent(TPC) andtotalflavanoliccontent(TFC).Samplesarecodifiedas(a)SyrahorTempranillosamplesor(b) sampleswithloworhighphenolicextractabilities. 3.5.2.PhenolicExtractabilityLevels Inordertodeterminetheextractabilitylevelforthewholegrapeseedset(spectraloutlierwas nottakenintoaccount),thediscriminantfunctionpreviouslyobtained(Table4)wasapplied.For thesesamples,scoresofthefirst8PCswereintroducedinthediscriminantfunctionandsamples wereclassifiedaccordingtotheirphenolicextractabilitylevelassampleswithloworhigh extractabilitylevel. Asresult,127grapeseedswereclassifiedassampleswithlowextractabilitylevelandthe remaining72seedssamplesassampleswithhighextractabilitylevel.Amonghighextractability samples,69wereSyrahsampleswhereasonly3whereTempranillo.Inconsequence,low extractabilitygroupwascomposedof30Syrahand97Tempranillosamples.Thoseresultsindicate higherextractabilityofphenoliccompoundsinSyrahthaninTempranilloseeds.Thishigher extractabilitycanbeattributedtothephysiologicaldifferencesamongbothvarieties.Forexample, Tempranillograpesgenerallypresentamorematurestatethanothervarietiesonsimilardates.In thisway,TempranillograpespresentmorematureseedsthanSyrahgrapesanditiswell‐knownthat phenolicextractabilityingrapeseedsdecreasesduringripeningdueto,amongothers,changesinthe cellwallpolysaccharidestructureandlignification[10,13,26]. InFigure5b,samplesofdifferentextractabilitylevelsareplottedseparatelyaccordingtotheir TPCandTFCvalues.Itisnoteworthythatsampleswiththehighesttotalcontents(TPCandTFC)are notalwayssampleswithahighextractabilitylevel.Althoughthesesampleshavehightotalcontents, theydonotnecessarilyreleasephenoliccompoundeasierthansampleswithalowertotalamountof thesecompounds.Nevertheless,inalargenumberofcasesandespeciallyforTFC,sampleswithhigh contentaresamplesofhighextractability. 4.Conclusions Quantitativemodelscarriedoutinthiswork,fromnearinfraredhyperspectralimages,provide goodresultsforthescreeningoftotalphenolicandflavanoliccontentsingrapeseedsinafastand reasonablyinexpensiveway.Thesemodelshaveerrorswhicharecomparativelysimilartotheerrors previouslyreportedfortheseparametersinbibliography.Moreover,spectralregionwithhigh Figure 5. Representation of grape seed samples according their predicted total phenolic content (TPC) and total flavanolic content (TFC). Samples are codified as ( a ) Syrah or Tempranillo samples or ( b ) samples with low or high phenolic extractabilities. 3.5.2. Phenolic Extractability Levels In order to determine the extractability level for the whole grape seed set (spectral outlier was not taken into account), the discriminant function previously obtained (Table 4) was applied. For these samples, scores of the first 8 PCs were introduced in the discriminant function and samples were classified according to their phenolic extractability level as samples with low or high extractability level. As result, 127 grape seeds were classified as samples with low extractability level and the remaining 72 seeds samples as samples with high extractability level. Among high extractability samples, 69 were Syrah samples whereas only 3 where Tempranillo. In consequence, low extractability group was composed of 30 Syrah and 97 Tempranillo samples. Those results indicate higher extractability of phenolic compounds in Syrah than in Tempranillo seeds. This higher extractability can be attributed to the physiological differences among both varieties. For example, Tempranillo grapes generally present a more mature state than other varieties on similar dates. In this way, Tempranillo grapes present more mature seeds than Syrah grapes and it is well-known that phenolic extractability in grape seeds decreases during ripening due to, among others, changes in the cell wall polysaccharide structure and lignification [10,13,26]. In Figure 5b, samples of different extractability levels are plotted separately according to their TPC and TFC values. It is noteworthy that samples with the highest total contents (TPC and TFC) are not always samples with a high extractability level. Although these samples have high total contents, they do not necessarily release phenolic compound easier than samples with a lower total amount of these compounds. Nevertheless, in a large number of cases and especially for TFC, samples with high content are samples of high extractability. 4. Conclusions Quantitative models carried out in this work, from near infrared hyperspectral images, provide good results for the screening of total phenolic and flavanolic contents in grape seeds in a fast and reasonably inexpensive way. These models have errors which are comparatively similar to the errors previously reported for these parameters in bibliography. Moreover, spectral region with high importance in the prediction of these parameters have been identified and the heterogeneity of total polyphenols within the same ripeness stage has been observed. Qualitative models have also been carried out for the identification of grape seed samples with low or high phenolic extractability levels. The model classifies correctly the 83.3% of the samples in leave-one-out cross-validation and the 76.9% of the samples in external validation. By the application Sensors 2018,18, 2426 11 of 12 of the developed model, higher extractabilities of phenolic compounds have been found in Syrah than in Tempranillo seeds. In this preliminary study, a number of simplifications have been adopted to obtain the feasibility of using the hyperspectral imaging in the control of phenolic extractability in grape seeds. These simplifications are intended to simulate a post-fermentative process. In future studies, it would be interesting to recalculate these chemometric models for pre-fermentative or fermentative processes. For example, ethanol or temperature variations, regular agitation, changes in pH, production of enzymes or the formation of new polyphenols during the fermentation may be taken into account. Author Contributions: Conceptualization, J.N.-B.; Funding acquisition, F.J.H.; Investigation, B.B.-B.; Methodology, J.M.H.-H.; Supervision, J.M.H.-H.; Validation, B.B.-B.; Writing—original draft, J.N.-B.; Writing—review & editing, F.J.H.. Funding: This research was funded by Spanish Ministerio de Economía y Competitividad, grant number AGL2017-84793-C2 and by Universidad de Sevilla, grant numbers VPPI-II.2, VPPI-II.4. Acknowledgments: The authors thank the technical staff of Biology Service (Servicios Generales de Investigación (SGI), Universidad de Sevilla). Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest. References 1. Waterhouse, A.L. Wine Phenolics; The New York Academy of Sciences: New York, NY, USA, 2002; pp. 21–36. 2. Ribéreau-Gayon, P.; Dubourdieu, D.; Doneche, B.; Lonvaud, A.; Glories, Y.; Maujean, A.; Branco, J.M. Handbook of Enology, The Microbiology of Wine and Vinifications; Wiley & Sons: West Sussex, UK, 2006. 3. Ristic, R.; Iland, P.G. Relationships between seed and berry development of Vitis Vinifera L. cv Shiraz: Developmental changes in seed morphology and phenolic composition. Aust. J. Grape Wine Res. 2005 ,11, 43–58. [CrossRef] 4. Jara-Palacios, M.J.; Gordillo, B.; González-Miret, M.L.; Hernanz, D.; Escudero-Gilete, M.L.; Heredia, F.J. Comparative Study of the Enological Potential of Different Winemaking Byproducts: Implications in the Antioxidant Activity and Color Expression of Red Wine Anthocyanins in a Model Solution. J. Agric. Food Chem. 2014,62, 6975–6983. [CrossRef] [PubMed] 5. Ribéreau-Gayon, P.; Glories, Y.; Maujean, A.; Dubourdieu, D. Handbook of Enology, The Chemistry of Wine: Stabilization and Treatments; Wiley & Sons: West Sussex, UK, 2006. 6. Singleton, V.L.; Rossi, J.A. Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagents. Am. J. Enol. Vitic. 1965,16, 144–158. 7. Vivas, N.; Glories, Y.; Lagune, L.; Saucier, C.; Augustin, M. Estimation du degréde polymérisation des procyanidines du raisin et du vin par la méthode au p-dimethylaminocinnamaldéhyde. J. Int. Sci. Vigne Vin. 1994,28, 319–336. [CrossRef] 8. Nogales-Bueno, J.; Rodríguez-Pulido, F.J.; Baca-Bocanegra, B.; González-Miret, M.L.; Heredia, F.J.; Hernández-Hierro, J.M. Hyperspectral Imaging—A Novel Green Chemistry Technology for the Oenological and Viticultural Sectors. In Agricultural Research Updates; Gorawala, P., Mandhatri, S., Eds.; Nova Science Publishers, Inc.: New York, NY, USA, 2016; Volume 12, pp. 45–56. 9. Chen, S.; Zhang, F.; Ning, J.; Liu, X.; Zhang, Z.; Yang, S. Predicting the anthocyanin content of wine grapes by NIR hyperspectral imaging. Food Chem. 2015,172, 788–793. [CrossRef] [PubMed] 10. Rodríguez-Pulido, F.J.; Hernández-Hierro, J.M.; Nogales-Bueno, J.; Gordillo, B.; González-Miret, M.L.; Heredia, F.J. A novel method for evaluating flavanols in grape seeds by near infrared hyperspectral imaging. Talanta 2014,122, 145–150. [CrossRef] [PubMed] 11. Nogales-Bueno, J.; Hernández-Hierro, J.M.; Rodríguez-Pulido, F.J.; Heredia, F.J. Determination of technological maturity of grapes and total phenolic compounds of grape skins in red and white cultivars during ripening by near infrared hyperspectral image: A preliminary approach. Food Chem. 2014 ,152, 586–591. [CrossRef] [PubMed] 12. Jara-Palacios, M.J.; Rodríguez-Pulido, F.J.; Hernanz-Vila, M.D.; Escudero-Gilete, M.L.; Heredia, F.J. Determination of phenolic substances of seeds, skins and stems from white grape marc by near-infrared hyperspectral imaging. Aust. J. Grape Wine Res. 2016,22, 11–15. [CrossRef] Sensors 2018,18, 2426 12 of 12 13. Nogales-Bueno, J.; Baca-Bocanegra, B.; Rooney, A.; Hernández-Hierro, J.M.; Byrne, H.J.; Heredia, F.J. Study of phenolic extractability in grape seeds by means of ATR-FTIR and Raman spectroscopy. Food Chem. 2017 ,232, 602–609. [CrossRef] [PubMed] 14. Nogales-Bueno, J.; Baca-Bocanegra, B.; Rodríguez-Pulido, F.J.; Heredia, F.J.; Hernández-Hierro, J.M. Use of near infrared hyperspectral tools for the screening of extractable polyphenols in red grape skins. Food Chem. 2015,172, 559–564. [CrossRef] [PubMed] 15. Geladi, P.; MacDougall, D.; Martens, H. Linearization and Scatter-Correction for Near-Infrared Reflectance Spectra of Meat. Appl. Spectrosc. 1985,39, 491–500. [CrossRef] 16. Dhanoa, M.S.; Lister, S.J.; Barnes, R.J. On the Scales Associated with Near-Infrared Reflectance Difference Spectra. Appl. Spectrosc. 1995,49, 765–772. [CrossRef] 17. Shenk, J.S.; Westerhaus, M.O. Routine Operation,Calibration, Development and Network System Management Manual; NIRSystems: Silver Spring, MD, USA, 1995. 18. Ferrer-Gallego, R.; Hernández-Hierro, J.M.; Rivas-Gonzalo, J.C.; Escribano-Bailón, M.T. Feasibility study on the use of near infrared spectroscopy to determine flavanols in grape seeds. Talanta 2010 ,82, 1778–1783. [CrossRef] [PubMed] 19. Zhang, N.; Liu, X.; Jin, X.; Li, C.; Wu, X.; Yang, S.; Ning, J.; Yanne, P. Determination of total iron-reactive phenolics, anthocyanins and tannins in wine grapes of skins and seeds based on near-infrared hyperspectral imaging. Food Chem. 2017,237, 811–817. [CrossRef] [PubMed] 20. Cozzolino, D.; Kwiatkowski, M.J.; Parker, M.; Cynkar, W.U.; Dambergs, R.G.; Gishen, M.; Herderich, M.J. Prediction of phenolic compounds in red wine fermentations by visible and near infrared spectroscopy. Anal. Chim. Acta 2004,513, 73–80. [CrossRef] 21. Slinkard, K.; Singleton, V.L. Total Phenol Analysis: Automation and Comparison with Manual Methods. Am. J. Enol. Vitic. 1977,28, 49–55. 22. Ivanova, V.; Stefova, M.T.; Chinnici, F. Determination of the polyphenol contents in Macedonian grapes and wines by standardized spectrophotometric methods. J. Serbian Chem. Soc. 2010,75, 45–49. [CrossRef] 23. Osborne, B.G.; Fearn, T.; Hindle, P.T. Practical NIR Spectroscopy with Applications in Food and Beverage Analysis; Longman Scientific and Technical: Harlow, UK, 1993. 24. Siesler, H.W.; Ozaky, Y.; Kawata, S.; Heise, H.M. Near Infrared Spectroscopy: Principles, Instruments, Applications; Wiley-VCH: Weinheim, Germany, 2002. 25. Hernández-Hierro, J.M.; Nogales-Bueno, J.; Rodríguez-Pulido, F.J.; Heredia, F.J. Feasibility study on the use of near-infrared hyperspectral imaging for the screening of anthocyanins in intact grapes during ripening. J. Agric. Food Chem. 2013,61, 9804–9809. [CrossRef] [PubMed] 26. Bautista-Ortín, A.B.; Jiménez-Pascual, E.; Busse-Valverde, N.; López-Roca, J.M.; Ros-García, J.M.; Gómez-Plaza, E. Effect of Wine Maceration Enzymes on the Extraction of Grape Seed Proanthocyanidins. Food Bioprocess Technol. 2013,6, 2207–2212. [CrossRef] © 2018 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY) license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). CAPÍTULO 3 131 CAPÍTULO 3: APLICACIÓN DEL ANALISIS DE IMAGEN HIPERESPECTRAL EN EL INFRARROJO CERCANO A LA ESTIMACIÓN DEL CONTENIDO EXTRAIBLE DE COMPUESTOS FENÓLICOS EN SUBPRODUCTOS DE TONELERÍA En: Baca Bocanegra, Berta; Nogales Bueno, Julio; Hernández Hierro, José Miguel; Heredia Mira, Francisco José: Evaluation of extractable polyphenols released to wine from cooperage byproduct by near infrared hyperspectral imaging. Food Chemistry 2018. Vol. 244. Pág. 206– 212, https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.10.027 . 1. Antecedentes El procesamiento de la madera para la elaboración de barricas genera subproductos que, en la mayoría de los casos, se eliminan directamente como desecho. Sin embargo, en el campo de la enología, los desechos de barricas de roble se postulan como un producto interesante debido a su potencial para liberar compuestos de alto valor añadido para el vino durante procesos de maceración, tanto fermentativa como postfermentativa. La madera es la segunda gran fuente natural de fenoles para el vino. Además de compuestos aromáticos, aporta al vino ácidos fenólicos y taninos hidrolizables, que no se encuentran naturalmente en la uva. Estos compuestos pueden participar en la estabilización del color del vino mediante procesos de copigmentación y protección de los antocianos frente a la oxidación (Chassaing, et al., 2010; Jourdes, et al., 2011; Vivas, et al., 1996). Además, juegan un papel importante en la astringencia de los vinos (Ribéreau-Gayon, et al., 2006; Zamora, 2003). Las características finales del vino dependen no solo de la cantidad de compuestos fenólicos que contiene la madera, sino también de la cantidad de estos compuestos que pasarán a formar parte del vino tras el proceso de maceración. Existe gran heterogeneidad de estos compuestos en la madera en función del tipo de roble, el origen geográfico, el cultivo o el grado tostado de la madera entre otros (Del Álamo Sanza, et al., 2006; Del Alamo Sanza, et al., 2004; Fernández de Simón, et al., 2010; Frangipane, et al., 2007), incluso, diferentes zonas anatómicas de la misma madera pueden diferir en términos de contenido fenólico total y contenido fenólico extraíble (Colares, Pastore, Coradin, Marques, Moreira, Alexandrino, et al., 2016). En cualquier caso, sería de interés disponer de un método rápido que permita el análisis del contenido fenólico extraíble de las virutas de madera de roble añadidas al vino dada la importancia de este parámetro en la elaboración de vinos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 132 La espectroscopía en el infrarrojo cercano (NIRS) es una técnica rápida y no destructiva que ha sido utilizada con buenos resultados para desarrollar métodos que puedan reemplazar las técnicas tradicionales de análisis en distintas matrices de interés en agricultura y enología. En el caso concreto de la madera, se encuentra descrito en la literatura el uso de técnicas de infrarrojo cercano convencional para la determinación de fenoles totales en madera de roble (Zahri, et al., 2008) y para la clasificación de duelas completas y su posterior uso en barricas, teniendo en cuenta el contenido fenólico de las mismas (Giordanengo, et al., 2009; Michel, Jourdes, Le Floch, Giordanengo, Mourey, y Teissedre, 2013). Sin embargo, no se han encontrado referencias de la utilización del análisis de imagen hiperespectral NIR para el análisis de madera de roble con fines enológicos, si bien sí ha sido empleada en el análisis de otras variedades y con otros fines (Lestander, et al., 2012; Thumm, et al., 2010). Por tanto, el análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano se puede considerar un candidato válido para la estimación del contenido fenólico extraíble de virutas de roble americano obtenidas como subproducto de tonelería. Este modelo permitirá realizar una selección adecuada de la madera de roble, cualitativa y cuantitativamente hablando, para conseguir el efecto deseando en el vino mediante la adicción de copigmentos externos. 2. Objetivo El objetivo de este capítulo ha sido el desarrollo de un método rápido y no destructivo, mediante análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano, para la estimación del contenido extraíble de fenoles totales en viruta cruda de roble americano, subproducto de tonelería. 3. Parte experimental Para la realización de este estudio se han utilizado muestras de viruta cruda de roble americano (Quercus alba L.), subproducto de tonelería, suministradas por Tonelería Salas S.L. (Bollullos Par del Condado, Huelva, España). Con el objetivo de obtener un conjunto de muestras representativo, se eligieron 4 puntos diferentes del proceso de fabricación de las barricas: serrado automático de las duelas (A), serrado manual de las duelas (B), cepillado de las duelas (C) y cepillado de los cantos de los fondos de las barricas (D), y se tomaron muestras periódicamente entre junio de 2015 y enero de 2016, hasta completar un total de doscientas muestras. Las muestras que pertenecen a los conjuntos A, B y C corresponden a diferentes procesados de las duelas pero siempre en la dirección longitudinal de las fibras. Sin embargo, las muestras del grupo D son el resultado de un procesado de las duelas en la dirección transversal de las fibras. CAPÍTULO 3 133 Tras la recepción, las muestras se tamizaron y se realizó inmediatamente el análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano siguiendo la metodología descrita por Hernández-Hierro, et al. (2013). La imagen de cada muestra se sometió a una calibración de doble punto, para ello se adquirieron imágenes de un material de referencia y de la corriente oscura del equipo, señal que recoge el detector cuando no recibe luz. El espectro medio de cada una de ellas se almacenó en una única matriz de datos (950−1650 nm). Tras la adquisición espectral, las muestras se colocaron en bolsas herméticas y se almacenaron en un lugar seco hasta la realización de los correspondientes análisis químicos. Siguiendo un procedimiento similar al descrito en el capítulo anterior se desarrolló un modelo para la estimación del contenido extraíble de fenoles totales en viruta cruda de roble americano. En primer lugar, la matriz espectral de datos se sometió a un análisis de componentes principales (PCA) con el objetivo de reducir su dimensión y realizar una selección espectral de muestras que permitiera reducir el número de ellas manteniendo la variabilidad espectral de la matriz original. En este caso se consigue explicar el 99.21% de la variabilidad espectral de los datos originales teniendo en cuenta 8 componentes principales y se encontraron 5 outliers espectrales que fueron eliminados del conjunto de muestras estudiado. Las muestras restantes se ordenaron de acuerdo a su distancia de Mahalanobis (𝐻) y se agruparon todas aquellas que tuvieran una distancia de Mahalanobis a la muestra vecina (𝑁𝐻) menor que 0.9, obteniéndose 36 grupos con diferentes características espectrales. 15 de los 36 grupos creados estaban formados por una única muestra y 3 de ellos agruparon un número elevado de muestras (más de 10 muestras). Con el fin de lograr conjuntos representativos de calibración y validación, los grupos más numerosos se dividieron en 3 subgrupos a partir de los valores de NH (NH≤0.3, 0.3≤NH≤0.6, 0.6≤NH≤0.9). Para construir los conjuntos de calibración y validación, se seleccionó una muestra de cada uno de los grupos/subgrupos obteniéndose así un set de calibración constituido por 42 muestras en el cual estaba representada toda la variabilidad espectral del conjunto original de 195 muestras y un set de validación constituido por 21 muestras (15 de los grupos creados contenían una única muestra). A continuación, se determinó el contenido extraíble de fenoles totales para las 63 muestras de viruta seleccionadas (calibración y validación). Para ello las muestras fueron maceradas durante tres días en vino sintético, una disolución en base acuosa con un 12.5% de etanol, 4 g L-1 de ácido tartárico y un pH de 3.6. Seguidamente, se determinó la concentración de los fenoles totales presentes en los extractos, utilizando el método espectrofotométrico de Folin−Ciocalteu (Singleton, et al., 1965). A partir de los datos espectrales y el parámetro de referencia calculado para el conjunto de calibración, se desarrolló un modelo de calibración mediante regresión por mínimos cuadrados RESULTADOS Y DISCUSIÓN 134 parciales modificada (MPLS) que permite la estimación del contenido extraíble de fenoles totales en viruta cruda de roble americano en el intervalo de 0-65 mg g-1 y se realizó la validación externa del modelo usando las muestras seleccionadas para tal efecto. Este modelo, desarrollado utilizando pretratamiento Detrend 1.5.51 como el más adecuado, presenta un coeficiente de determinación (RSQ) de 0.89 y un error estándar de predicción (SEP) de 6.3 mg g-1 de viruta (19.40%). Por último, el método desarrollado se utilizó para predecir el contenido extraíble de fenoles totales en todas las muestras (195), sin tener en cuenta los outliers espectrales. Los resultados obtenidos muestran una variabilidad sustancial de este parámetro dentro de cada grupo de muestras. El contenido extraíble de fenoles totales es mayor en las muestras de los conjuntos A, B y C, obtenidas mediante procesados de las duelas en la dirección longitudinal de las fibras, que en aquellas obtenidas tras un procesado de las duelas en la dirección transversal (D). 4. Conclusiones  En la elaboración de vinos, la utilización de residuos de madera de roble, obtenidos durante el proceso de fabricación de barricas, puede considerarse una estrategia interesante para la revalorización de este subproducto gracias a la extracción de compuestos de elevado interés para el vino como son los polifenoles.  El modelo MPLS desarrollado, a partir del análisis de imagen hiperespectral en el infrarrojo cercano, permite estimar el contenido extraíble de fenoles totales procedentes de viruta cruda de roble americano de forma rápida y razonablemente económica.  La aplicación del modelo desarrollado revela una variabilidad sustancial en el contenido fenólico extraíble dentro de cada grupo de muestras, resultado que corrobora la heterogeneidad fenólica de la madera de roble descrita en bibliografía. Se observan diferencias en el contenido extraíble de compuestos fenólicos según la dirección del procesado de las duelas: longitudinal o transversal a las fibras; lo que podría estar relacionado con diferencias estructurales y/o morfológicas entre los dos grupos de muestras. Contents lists available at ScienceDirect Food Chemistry journal homepage: www.elsevier.com/locate/foodchem Evaluation of extractable polyphenols released to wine from cooperage byproduct by near infrared hyperspectral imaging Berta Baca-Bocanegra, Julio Nogales-Bueno, José Miguel Hernández-Hierro, Francisco José Heredia ⁎ Food Colour and Quality Laboratory, Área de Nutrición y Bromatología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, 41012 Sevilla, Spain ARTICLE INFO Keywords: Byproduct Oak Near infrared hyperspectral imaging Phenolic compounds ABSTRACT Extractable total phenolic content of American non-toasted oak (Quercus alba L.) shavings has been determined using near infrared hyperspectral imaging. A like-wine model solution was used for the simulated maceration procedure. Calibrations were performed by partial least squares regression (MPLS) using a number of spectral pre-treatments. The coefficient of determination of wood for extractable total phenolic content was 0.89, and the standard error of prediction was 6.3 mg g −1 . Thus, near infrared hyperspectral imaging arises as an attractive strategy for predicting extractable total phenolic content in the range of 0–65 mg g −1 , of great relevance from the point of view of quality assurance regarding wood used in the wine sector. Near infrared hyperspectral imaging arises as an attractive strategy for the feasibility of enhancing the value of cooperage byproduct through the fast determination of extractable bioactive molecules, such as polyphenols. 1. Introduction Wood is the second great natural source of phenols for wine. In addition to aromatic compounds, wood releases to wine phenolic acids and hydrolysable tannins, which are not naturally found in grape. These compounds are involved in the stabilization of wine color by means of co-pigmentation processes and protection against oxidation and they play an important role in the astringency of wines (Ribérau-Gayon, Glories, Maujean, & Dubourdieu, 2000; Zamora, 2003). Oak wood has been used for centuries for the construction of barrels where the wine is stored during aging. Although the original function of the barrels was the mere storage and transport of wine, it has been shown that during barrel aging, wine undergoes a series of transformations leading to important changes in aroma, color, taste, and astringency (Glabasnia & Hofmann, 2006; Puech, Feuillat, & Mosedale, 1999; Zamora, 2003). Since the European Community approved the addition of wood chips to produce accelerated aging (CE 2165/2005 and CE 1507/2006), it has become an extended practice (Bautista-Ortín et al., 2008; Del Álamo, Nevares, Gallego, Martin, & Merino, 2008; Frangipane, Santis, & Ceccarelli, 2007; Guchu, Díaz-Maroto, Pérez- Coello, González-Viñas, & Ibáñez, 2006; Rodríguez-Bencomo, Ortega- Heras, Pérez-Magarino, & González-Huerta, 2009). Quercus genus is widely distributed all over the world. However, the main producing areas of the three oak species used for the production of barrels are France and the United States of America. In fact, in cooperated the terms French oak and American oak are widely used. Alternative sources of wood for barrel making have been assayed, including mainly chestnut, acacia and cherry, in an effort to give a particular personality to aged wines (Alañón, Castro-Vázquez, Díaz- Maroto, & Pérez-Coello, 2012; De Rosso, Panighel, Vedova, Stella, & Flamini, 2009; Fernández de Simón, Martínez, et al., 2014; Fernández de Simón, Sanz, et al., 2014; Rodríguez-Bencomo et al., 2009). Even so, most of the oak barrels that are marketed at this time continue to be oak wood and, in particular, American white oak (Quercus alba L.) and European oak (Quercus robur L.). Winemakers are continuously looking for high quality wines. In geographical areas with typical climatological conditions of warm climate, such as Andalucía, the stressful climate increases the difficulty of obtaining high quality red wines because of color instability over time (Gordillo et al., 2012). In these warm regions, the phenolic maturity does not coincide with the technological maturity of grapes, therefore, at the moment of harvesting, different levels of both phenolic and sugar maturity exist (Mira de Orduña, 2010; Mori, Sugaya, & Gemma, 2005). Thus, copigmentation phenomena, which contribute to color stabilization, are hampered by the shortfall of pigments and copigments (Boulton, 2001). Taking that into account, an extra contribution of phenolic compounds might be necessary to partially solve the problem. The external addition of phenolic compounds from natural sources to the musts has been reported for the purpose of color stabilization (Canals, Llaudy, Canals, & Zamora, 2008; Cejudo-Bastante et al., 2016; http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.10.027 Received 9 May 2017; Received in revised form 5 October 2017; Accepted 6 October 2017 ⁎ Corresponding author. E-mail address: [email protected] (F.J. Heredia). Food Chemistry 244 (2018) 206–212 Available online 10 October 2017 0308-8146/ © 2017 Elsevier Ltd. All rights reserved. MARK Gordillo, Cejudo-Bastante, Rodriguez-Pulido, Gonzalez- Miret, & Heredia, 2013; Gordillo et al., 2014; Pedroza, Carmona, Alonso, Salinas, & Zalacain, 2013). However, the use of raw wood shavings, cooperage byproduct, to get high quality red wines is not so frequent. Wood processing for the elaboration of barrels generates byproducts which could be burned to meet energy needs in the wood industries but in most cases they are directly disposed as waste products. It is known that cooperage byproduct contain many compounds whose extraction could create new business opportunities. In this context, oak barrelshoot wastes seem to be an interesting product due to its potential to release high added value compounds for wine. Factors such as oak species, geographic origin, seasoning and toasted degree have been shown to affect the chemical composition of the oak wood used (Del Alamo Sanza, Nevares Domı  nguez, Cárcel Cárcel, & Navas Gracia, 2004; Del Álamo Sanza & Nevares Domínguez, 2006; Fernández de Simón, Cadahía, del Álamo, & Nevares, 2010; Frangipane et al., 2007) and even various anatomical parts of wood may differ in terms of concentration and composition (Colares et al., 2016). However, the characteristics of the final wines depend not only on the composition of the oak wood used but also on the amount of phenolic compounds that may be extracted from wood to the must. This transfer processes could be affected by contact surface between wine and wood, alcoholic degree, duration time etc. The contact surface depends on the size of the oak fragment and on the amount used (Arapitsas, Antonopoulos, Stefanou, & Dourtoglou, 2004; Bautista-Ortín et al., 2008). Due to the importance in the different productive sectors, the qualitative and quantitative characterization of woods applying fast and efficient analytical methods has been required. Spectroscopic methods based on near-infrared spectroscopy (NIR) have shown great potential for qualitative and quantitative analyses of wood. The rapid assessment of the chemical composition using NIR in applications related to the quality has provided an increasing number of publications for industrial applications in this area (Da Silva et al., 2013; Jones, Schimleck, Peter, Daniels, & Clark, 2006; Sun, Liu, Liu, & Yang, 2011; Yao et al., 2010). In a further step, near infrared hyperspectral imaging has also been applied for analyses of wood (Lestander, Geladi, Larsson, & Thyrel, 2012; Thumm, Riddell, Nanayakkara, Harrington, & Meder, 2010). References for the use of this technique in the analysis of byproducts of oak wood for oenological purposes have not been found, although in the literature the use of conventional near infrared techniques is described for the quantification of oak wood extractives (Michel et al., 2013; Zahri et al., 2008) and for the correlations between NIR quantification and classification with extractive level in wood, (Giordanengo et al., 2009). Correlation between oak wood extractives and oxygen consumption of wine aged in contact of wood in relation of the classified wood has been already reported in some studies (Michel et al., 2016; Navarro et al., 2016). In none of these studies, the assignment of these compounds from wood to wine is estimated by the use of spectral techniques recording the spectrum of the wood. A rapid estimation of wood extractable content of phenolic compounds could assist in selecting oak wood suited for improving wine quality through the addiction of external copigments to wine. For the same purpose near-infrared hyperspectral imaging has been applied previously in our lab in order to predict different parameter in grapes (Hernández-Hierro, Nogales- Bueno, Rodríguez-Pulido, & Heredia, 2013; Nogales-Bueno, Baca- Bocanegra, Rodríguez-Pulido, Heredia, & Hernández-Hierro, 2015; Nogales-Bueno, Hernández-Hierro, Rodríguez-Pulido, & Heredia, 2014). The aim of this study is to look at the feasibility of enhancing the value of cooperage byproduct through the extraction of bioactive molecules, such as polyphenols. To this end near infrared hyperspectral imaging has been used for the screening of the extractable content of phenolic compounds in raw wood. 2. Material and methods 2.1. Samples American non-toasted oak (Quercus alba L.) shavings, cooperage byproduct, were used for this study. Samples were provided by Toneleria Salas S.L. (Bollullos Par del Condado, Huelva, Spain). Wood staves were seasoned under natural conditions in the open air during 24 months approximately before being used in the process of making barrels. In order to achieve representative sample sets, the samples were taken at 4 different points in the process of making barrels, so four samples were collected at each date (A, B, C and D). Samples belonging to A, B and C groups are generated by different sawing processes of the staves but always in the longitudinal direction of the fibers. In detail, an automatic or manual processing of the staves is the only difference between the samples A and B respectively. With respect to the group D, the samples are the result of a processing of the staves in the transversal direction of the fibers. All sampling points are pre-molded and pretoasted of the staves. Samples were collected periodically, between June of 2015 and January of 2016. Two hundred samples were collected during the aforesaid period. Upon receipt, the samples were sieved and subjected to the hyperspectral analysis. Wood shaving samples were screened using 2 mm and 10 mm mesh sieves placed in tandem. Only shaves of each sample which were retained between them were taken into account in the assay. After that, wood shavings were placed in stoppered plastics bags and stored in a dry chamber until use. 2.2. Hyperspectral image acquisition Hyperspectral imaging device (Infaimon S.L., Barcelona, Spain) comprised a Xenics®XEVA-USB InGaAs camera (320 × 256 pixels; Xenics Infrared Solutions, Inc., Leuven, Belgium), a spectrograph (Specim ImSpector N17E Enhanced; Spectral Imaging Ltd., Oulu, Finland) covering the spectral range between 900 and 1700 nm (spectral resolution of 3.25 nm), two 70 W tungsten iodine halogen lamps (Prilux, Barcelona, Spain) mounted as source light, a mirror scanner (Spectral Imaging Ltd.) and a computer system. The hyperspectral image of each sample on a polyethylene plastic was recorded. Equipment and procedure used to image recording are described in detail elsewhere in Hernández-Hierro et al. (2013). After calibration and segmentation processes, the average spectral profile for each sample was saved. Noisy wavebands at both extremes of the spectra range were removed and only spectral data in the resulting effective wavelength 950–1650 nm regions were used in data analysis due to reduced efficiency outside this range in the used device. 2.3. Extractable total phenolic content Wood shavings were immersed in a model wine hydroalcoholic solution (4 g L −1 tartaric acid, 12.5% ethanol, adjusted at pH 3.6 with NaOH 0.5 M) for a maceration period of 72 h. Oak wood shavings were added to the wine-like solution in a 4 g L −1 ratio. The supernatant was used in the analysis. Extractable total phenolic content was determined using the Folin-Ciocalteu method (Singleton & Rossi, 1965). For quantification, results were expressed as mg of gallic acid equivalents per gram of wood. 2.4. Image processing and data analysis 2.4.1. Image processing Prior to the qualitative and quantitative analysis, a discriminant method was applied to the shaving images to isolate the shavings from other parts of the image. Firstly, a set of reflectance spectra belonging to shaving and background (regions of interest (ROIs)) were selected to develop a stepwise lineal discriminant model. The aforementioned discriminant model classified each pixel into two classes (sample or no B. Baca-Bocanegra et al. Food Chemistry 244 (2018) 206–212 207 sample pixel) using the reflectance values from seven wavelengths (1073, 1177, 1216, 1396, 1445, 1527 and 1540 nm) as can be seen in Fig. 1a. Fig. 1b shows the average spectra belonging to shavings and background (a homogeneous surface composed of polyethylene). After calibration and segmentation processes, the average spectrum of the wood region was extracted and then transformed into Log (1/R) units. Although the spatial dimensions has not been used directly, this information is conveyed through the averaged value. The procedure was repeated for each sample and the obtained spectra were combined into the spectral matrix. Noisy wavebands at both extremes of the spectra range were removed and only spectral data in the resulting effective wavelength 950–1650 nm regions were used in data analysis due to reduced efficiency outside this range in the used device. Image treatment was carried out using Matlab (R2010b; The Math Works, Inc., USA). 2.4.2. Data analysis Prior to quantitative analysis, an unsupervised pattern recognition technique, principal component analysis (PCA), was used in order to provide information about the latent structure of spectral matrix and to find spectral differences among all spectral samples. This method provides not only information related to spectral outliers and the distribution of samples in the newly-created space, but is also an important source of knowledge with which to create cross-validation groups used in the calibration process (Brereton, 2003; Shenk & Westerhaus, 1995). PCA was also used to select representative samples from the spectral data set. Mahalanobis distances (H) for each sample were calculated and samples were grouped according their neighborhood H values (NH). Using the raw spectral data, testing different spectral pretreatments and allocating the corresponding extractable total phenolic to each sample, calibrations were performed by modified partial least squares regression (MPLS). In this method, the group of calibration samples is divided into a series of subsets in order to perform cross-validation to set the number of PLS factors, reduce the possibility of overfitting (Shenk & Westerhaus, 1995) and remove chemical outliers. Using the T≥2.5 criterion, samples that presented a high residual value when they were predicted were eliminated from the set. Finally, validation errors are combined into a single figure, the standard error of crossvalidation (SECV). Spectral pretreatments are usually applied to NIR raw data. Scattering effects were removed using detrending pretreatment (Dhanoa, Lister, & Barnes, 1995; Geladi, MacDougall, & Martens, 1985). Moreover, the effect of differentiation and variations in spectral ranges were tested in the development of the NIRS calibrations. The software used was Win ISI®(v1.50) (Infrasoft International, LLC, Port. Matilda, PA, USA). This software allowed the data pretreatment, principal components analysis and sample selection and development of quantitative models. 3. Results and discussion 3.1. Sample selection Sample selection was made in order to reduce the number of samples maintaining as much spectral variety as possible. To keep as much spectral information as possible, this selection was carried out from a PCA. A SNV (2,5,5,1) spectral pre-treatment was applied to the spectra of all samples in the 950–1650 nm region, where the hyperspectral system has revealed greater efficiency. Using all spectral samples, eight principal components were taken into account. More than ninety-nine per cent of the spectral variability of the original spectral matrix was explained (99.21%). Moreover, five spectral outliers (H > 3) were found and removed from this matrix. In this eight-dimensional space the 195 samples were grouped according a NH ≤0.9 criterion. So, 36 groups with different spectral characteristics were created. 15 of the 36 groups that were created had not more than one sample and 3 of them grouped a number of samples (more than 10 samples). In order to achieve representative calibration and validation sets, the most numerous groups were divided into 3 subgroups based on NH (NH ≤0.3, 0.3 ≤NH ≤0.6, 0.6 ≤NH ≤0.9). One sample from every group or subgroup was allocated in the calibration set. 42 samples were selected to develop a calibration process. In addition, to create the validation set, another sample from every group/subgroup was selected. Only 21 samples were allocated in this set because some groups created had not more than one sample. Fig. 2 shows a graphical description of the sample selection process. Fig. 3a shows the scores of the wood samples in the space defined by the first and second principal components which described 47.78% (PC1) and 35.40% (PC2) of the spectral variability in the data. PC1 could be used to separate the samples according to the cutting direction of the staves (longitudinal or transversal to the fibers, A, B and C vs D) although this separation would not be complete. If these same samples are represented in the space defined by the first and the third principal components, a slight separation of the samples can be appreciated depending on the staves processed (A, B, C, D) to obtain them (Fig. 3b). Samples belonging to A and B groups have been obtained in the same way, an automatic or manual processing of the staves is the only difference between them, and therefore appear overlapping in this representation. Fig. 3c shows the scores of the calibration and validation samples in the space defined by PC1 and PC2. This space is not entirely the same as the space used to select the calibration and validation sets Fig. 1. Obtained mask after the segmentation procedure (a) and spectra of raw wood and background (b). B. Baca-Bocanegra et al. Food Chemistry 244 (2018) 206–212 208 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 240 durante periodos de maceración más prolongados, incrementa los niveles iniciales de copigmentación (aumenta la relación copigmento/pigmento), lo que conduce a la formación de pigmentos derivados más estables. En este contexto, la adición post-fermentativa de virutas crudas de roble se puede considerar una estrategia interesante. La madera es una importante fuente de compuestos fenólicos que podrían participar directa o indirectamente en la estabilización de los pigmentos extraídos de la uva, tanto porque mejoran la proporción de copigmento/pigmento como porque evitan la degradación de los antocianos gracias al efecto protector frente a la oxidación que ejercen los elagitaninos. La utilización de subproductos de tonelería como coadyuvantes en vinificación implica, además, la reutilización y aprovechamiento de desechos industriales y aporta sostenibilidad al proceso lo que se traduce en importantes beneficios económicos y ambientales para la industria del vino. 2. Objetivo El objetivo general de este trabajo es la evaluación del potencial de la viruta cruda de roble americano, subproducto de tonelería, como coadyuvante de vinificación. Para ello, se estudia la influencia de la adición post-fermentativa de virutas crudas de roble, en la composición fenólica y la calidad cromática de vinos tintos de variedad Syrah elaborados en zonas de clima cálido. 3. Parte experimental Para este ensayo se elaboraron vinos a partir de uva tinta Vitis vinifiera L. de variedad Syrah, cultivada en un viñedo de la región del Condado de Huelva, correspondiente a la campaña de vendimia 2016. Se utilizaron 900 kg de uva cosechada con madurez tecnológica óptima (14 Bé). Los vinos fueron elaborados en la bodega experimental que el grupo de investigación tiene en la Bodega “Cooperativa Nuestra Sra. Del Socorro” en Rociana del Condado (Huelva), siguiendo el método tradicional de vinificación en tinto. Para su elaboración, la masa de vendimia (uvas despalilladas y trituradas) se distribuyó en seis tanques de 220 litros de capacidad donde se desarrolló la fermentación alcohólica con la adición de levadura seleccionada Saccharomyces cerevisiae (VINIFERM BY, 25 g hL-1, Agrovin, Ciudad Real, Spain). Durante la fase de fermentación alcohólica (6 días) se hicieron bazuqueos una vez al día. Pasado este tiempo, los vinos fueron descubados a nueve depósitos de acero inoxidable de 50 litros de capacidad para llevar a cabo tres tratamientos experimentales post-fermentativos, por triplicado: CAPÍTULO 7 241  Vinos elaborados por vinificación tradicional (sin adición post-fermentativa), como vino de control (3 depósitos), CW.  Vinos con 30 días de maceración post-fermentativa con virutas crudas de roble americano, subproducto de tonelería, agregando 12 g L-1 de virutas (3 depósitos). De ahora en adelante “adición simple”, SW.  Vinos con doble maceración post-fermentativa: adición de 12 g L-1 de virutas (30 días) y una segunda adición de 12 g L-1 de virutas (30 días) una vez eliminada la primera adición (3 depósitos). De ahora en adelante “adición doble”, DW. Simultáneamente a la adición de virutas, se inocularon bacterias de ácido láctico Oenococcus oeni para estimular el desarrollo de la fermentación maloláctica. Los vinos se mantuvieron en tanques de acero inoxidable hasta el final de la maceración post-fermentativa y durante el proceso de estabilización. La elaboración del vino fue cuidadosamente seguida analizando muestras de forma periódica para la determinación de parámetros enológicos de control. La viruta de madera utilizada en este ensayo fue generada en un único punto del proceso de elaboración de las barricas, (cepillado de la madera en dirección longitudinal de las fibras, C) y en una única fecha. En la fecha elegida, se recolectaron 10 kg de virutas, cantidad suficiente para dosificar, después del proceso de tamizado, en una proporción de 12 g viruta por cada litro de vino. Una vez recogida y tamizada, la muestra fue caracterizada por análisis de imagen hiperespectral a partir del modelo desarrollado por B. Baca-Bocanegra, et al. (2018) en el Capítulo 3 de esta memoria, que permite estimar el contenido fenólico extraíble en viruta cruda de roble. Debido al tamaño de la muestra y con el fin de considerar la posible heterogeneidad fenólica característica de la madera, la cantidad inicial fue dividida en varias submuestras y se aplicó el modelo a cada una de ellas. La viruta fue dosificada en los distintos depósitos, teniendo en cuenta el contenido fenólico extraíble predicho, de tal forma que este parámetro no suponga un nuevo factor de variabilidad en el ensayo de vinificación. Para cada vino elaborado, se tomaron muestras en diferentes momentos de la vinificación, antes del embotellado: adición de viruta (0 días), final de la maceración (30 días para la adición simple y 60 para la adición doble) y final de la fase de estabilización antes del embotellado (120 días). Para cada muestra se determinó el perfil antociánico, contenido de fenoles totales, contenido de flavanoles totales, parámetros colorimétricos, diferencias de color, porcentajes de copigmentación y polimerización de antocianos. La determinación de antocianos se realizó mediante análisis cromatográfico, siguiendo una modificación del método descrito por M. García-Marino, et al. (2010) como se describe en Hernández-Hierro, et al. (2013). Para la determinación de flavanoles se utilizó el método espectrofotométrico descrito por Vivas, et al. (1994), el cual mide la reacción entre el reactivo 4- RESULTADOS Y DISCUSIÓN 242 (dimetilamino)cinamaldehído (DMACA) y los compuestos flavanólicos de la muestra, mientras que la determinación de los fenoles totales presentes en los extractos se utilizó el también método espectrofotométrico de Folin−Ciocalteu (Singleton, et al., 1965). La determinación de los parámetros de color se llevó a cabo por espectrofotometría UV-Vis. Se registraron los espectros visibles (380-780 nm) de cada muestra con un espectrofotómetro Agilent 8453 UV-Vis (Palo Alto, EE. UU.), utilizando cubetas de vidrio de 2 mm de paso de luz y agua destilada como blanco de referencia. Los parámetros de color CIELAB (L*, a*, b*, C*ab y hab) se calcularon a partir de los espectros de transmitancia utilizando el software original CromaLab® (Heredia, et al., 2004). Las diferencias de color (∆𝐸𝑎𝑏 ∗) se han calculado como la distancia euclídea entre dos puntos en el espacio tridimensional definido por L *, a * y b *: ∆𝐸𝑎𝑏 ∗=√(∆𝐿∗)2+(∆𝑎∗)2+(∆𝑏∗)2 La contribución de los antocianos copigmentados al color total del vino a pH 3.6 (% de antocianos copigmentados) y el grado de polimerización de antocianos (porcentaje de pigmentos poliméricos) se determinarón siguiendo el método propuesto por (Boulton, 1996). La acidez de las muestras de vino se ajustó previamente a un valor de pH de 3.6 usando NaOH 1M o HCl de la misma molaridad en dicho ajuste. Se aplicó el ANOVA para estudiar la influencia de la adición post-fermentativa de viruta de roble sobre la composición fenólica y la calidad cromática de los vinos. Se utilizaron como variables dependientes los diferentes parámetros de referencia calculados y como factor el tratamiento (control, adición simple y adición doble). Los análisis estadísticos se realizaron con el software Statistica v.8.0 StatSof Inc®. La adición de viruta dio lugar a un aumento significativo (p<0.05) del contenido de fenoles totales tanto en SW como en DW, con respecto al vino control, al final del proceso de maceración (30 días para SW y 60 días para DW). Este aumento está relacionado con la cesión, durante la maceración, de compuestos fenólicos de la madera tales como ácidos fenólicos y elagitaninos y, como cabría esperar, es mayor en el caso de la adición doble. Por el contrario, la contribución al contenido de flavanoles es prácticamente despreciable debido a su escasa presencia en la madera. En esta etapa del proceso de vinificación, el contenido de antocianos en SW y DW experimenta una caída con respecto al vino control, muy ligera en el caso de la adición simple y significativa (p<0.05) en el ensayo de adición doble. Este efecto puede estar relacionado con la formación de antocianos poliméricos durante las primeras etapas de la vinificación. Además, la viruta añadida puede adsorber en su superficie los compuestos antociánicos provocando una disminución de su concentración especialmente cuando la cantidad de viruta añadida es elevada y el periodo de maceración largo (Gordillo, et al., 2016). Durante la fase de estabilización, la disminución de antocianos continúa, observándose este efecto en los tres vinos elaborados pero de forma mucho CAPÍTULO 7 243 más acusada en SW y DW, de tal forma que las diferencias entre ellos y el control son significativas (p<0.05). Reacciones de oxidación, hidratación y polimerización están, probablemente, relacionadas con esta disminución de antocianos (Cejudo-Bastante, et al., 2017). De acuerdo con estas observaciones, se obtienen mayores porcentajes de polimerización en los vinos SW y DW (66.81 - 64.16 %) que en el vino control (60%) lo que indica mayores proporciones de antocianos más estables en los vinos macerados con virutas y por tanto más estabilidad química. A pesar de que al final de la fase de maceración existe una diferencia importante en la caída que experimentan los antocianos en DW con respecto a SW, al final de la fase estabilización no existen diferencias significativas para este parámetro entre estos dos vinos, siendo los niveles comparables e incluso ligeramente superior para el ensayo de adición doble. Esta compensación puede estar relacionada con el efecto protector que ejercen los elagitaninos (Cano-Lopez, Lopez-Roca, Pardo-Minguez, y Gomez Plaza, 2010), añadidos en mayor cantidad en el caso de la adición doble de viruta. En cuanto a las características cromáticas, los vinos SW y DW presentan cromas mayores y valores de tono menores que el control, es decir, vinos con mayor intensidad cromática y tonos rojos más azulados que el control aunque estas diferencias sólo son significativas en el caso del tono. No se aprecian diferencias entre los ensayos y el control con respecto a la claridad. DW presenta mayor valor para el tono, es decir, tonos más rojos anaranjados, que están en concordancia con mayor cantidad de antocianos libres, menos estables y menos porcentaje de polimerización que el ensayo de adición simple. La adición de viruta provoca un efecto positivo no solo en la densidad de color (croma) y el tono sino también en la estabilidad del color, es decir, durante la fase de estabilización, la perdida de color que experimentan los vinos elaborados añadiendo viruta es menor que en el vino control. Esta pérdida de color es menor en el ensayo de adición simple que en el doble. Las diferencias de color se deben fundamentalmente a diferencias cualitativas (Δhab) ya que es el único parámetro para el que existen diferencias significativas entre los ensayos y el control. Con el objetivo de comparar las dos adiciones al final de la fase de estabilización se determinaron las diferencias de color entre SW y DW con respecto a CW (SW120 vs CW120 y DW120 vs CW120). La mayor diferencia de color se aprecia en el caso de la adición simple (4.51 frente a 3.76 unidades) aunque estas diferencias entre los ensayos no son significativas. En ambos casos, las diferencias de color con respecto al testigo son apreciables por el ojo humano. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 244 4. Conclusiones  La adición post-fermentativa de virutas crudas de roble modifica el contenido fenólico, dando lugar a vinos con un contenido de fenoles totales significativamente mayor que los vinos elaborados mediante vinificación tradicional. Se puede considerar, por tanto, una alternativa tecnológica interesante para aumentar la relación copigmento/pigmento.  En referencia al color, la adición post-fermentativa condujo a vinos con características colorimétricas diferentes a los vinos elaborados por vinificación tradicional, siendo la diferencia visualmente apreciable tanto en la adición simple como en la doble. Concretamente, favoreció la elaboración de vinos con mayor intensidad cromática y tonalidad más azulada. Dichos resultados demostraron la efectividad de la maceración post-fermentativa con viruta de madera, para estabilizar el color de los vinos y provocar modificaciones de color más bajas a lo largo del tiempo, produciendo vinos cromáticamente más estables para un mejor envejecimiento posterior.  Entre las dos adiciones ensayadas, la adición post fermentativa simple condujo a vinos con color más estable, que mantuvieron sus tonalidades azuladas durante más tiempo. En el caso de la adición doble, la eventual adsorción de los pigmentos sobre las virutas durante la maceración parece tener mayor efecto sobre el color que el incremento de copigmentación y/o polimerización. Elsevier Editorial System(tm) for Food Chemistry Manuscript Draft Manuscript Number: Title: Valorization of American barrel-shoot wastes: effect of post fermentative addition and readdition on phenolic composition and chromatic quality of Syrah red wines Article Type: Research Article (max 7,500 words) Keywords: Anthocyanins; wood; byproducts; colour; wine. Corresponding Author: Dr. José Miguel Hernández-Hierro, Corresponding Author's Institution: Universidad de Sevilla First Author: Berta Baca-Bocanegra Order of Authors: Berta Baca-Bocanegra; Julio Nogales-Bueno; José Miguel Hernández-Hierro; Francisco José Heredia Abstract: The influence of post fermentative addition of American barrelshoot wastes on phenolic composition and chromatic quality of Syrah red wines has been evaluated as an oenological alternative to the conventional winemaking for avoiding the common color loss of red wines elaborated in warm climates. American oak wood byproducts added were previously classified by hyperspectral image analysis according to the amount of phenolic compounds transferred to the extraction media. After that, wines were elaborated under different maceration conditions by applying only one proportion of wood (12 g L-1) and two different maceration procedures. The simple post-fermentative addition led to wines with a more stable color, which maintained their bluish hues for a longer time. In the case of double addition, the adsorption of the pigments during the maceration seems to have a stronger effect on the colour than copigmentation and polymerization due to the copigments extracted from the wood. UNIVERSIDAD DE SEVILLA DEPARTAMENTO DE NUTRICION Y BROMATOLOGIA TOXICOLOGÍA Y MEDICINA LEGAL Laboratorio de Color y Calidad de Alimentos Dr. J. M. Hernández Hierro E-mail: [email protected] Facultad de Farmacia - Phone: +34 954556761 41012 Sevilla, Spain Fax: +34 954557017 Sevilla, October 29, 2018 Dear Editor, Please find enclosed our manuscript entitled “Valorization of American barrel-shoot wastes: effect of post fermentative addition and readdition on phenolic composition and chromatic quality of Syrah red wines”, which we would like to submit for your consideration for publication in Food Chemistry. The influence of the post fermentative addition of American barrel-shoot wastes on the phenolic composition and chromatic quality of Syrah red wines has been evaluated as an oenological alternative to the conventional winemaking for avoiding the common color loss of red wines elaborated in warm climates. American oak wood byproducts added were previously classified by hyperspectral image analysis according to the amount of phenolic compounds transferred to the extraction media. After that, wines were elaborated under different maceration conditions by applying only one proportion of wood (12 g/L) and two different maceration procedures. The simple post-fermentative addition led to wines with a more stable color, which maintained their bluish hues for a longer time. In the case of double addition, the adsorption of the pigments during the maceration seems to have a stronger effect on the color than copigmentation and polymerization due to the copigments extracted from the wood. The use of cooperage by-products as source of copigments for wine leads to a sustainable and competitive cooperage industry, through waste reduction and by-product valorization. I hope that this work will be of interest for your journal. I look forward to hearing from you. Yours sincerely, José Miguel Hernández Hierro Cover Letter 1 Highlights  Post fermentative addition of American barrel-shoot has been evaluated.  Two different maceration conditions were applying.  Simple addition led to wines with a more stable colour and bluish hues.  Adsorption of pigments presents a strong effect on colour in double addition. *Highlights (for review) 1 Valorization of American barrel-shoot wastes: effect of post fermentative addition and 1 readdition on phenolic composition and chromatic quality of Syrah red wines. 2 Berta Baca-Bocanegra1, Julio Nogales-Bueno1, José Miguel Hernández-Hierro1*, Francisco 3 José Heredia1 4 5 1 Food Color and Quality Laboratory, Section of Nutrition and Food Science, Facultad de 6 Farmacia, Universidad de Sevilla, 41012 Sevilla, Spain. 7 Running Title: Valorization of cooperage byproduct in wine 8 9 Berta Baca-Bocanegra: b[email protected] 10 Julio Nogales-Bueno: julionoga[email protected] 11 José Miguel Hernández-Hierro: [email protected] 12 Francisco José Heredia: [email protected] 13 * Corresponding author: 14 José Miguel Hernández-Hierro 15 Food Colour & Quality Lab., Dept. Nutrition & Food Science. Facultad de Farmacia. 16 Universidad de Sevilla. 41012-Sevilla, Spain 17 Tel.: +34 954556495 Fax: +34 954556110 18 E-mail: jmhhierr[email protected] 19 20 *Manuscript Click here to view linked References 2 Summary 21 The influence of post fermentative addition of American barrel-shoot wastes on phenolic 22 composition and chromatic quality of Syrah red wines has been evaluated as an oenological 23 alternative to the conventional winemaking for avoiding the common color loss of red wines 24 elaborated in warm climates. American oak wood byproducts added were previously 25 classified by hyperspectral image analysis according to the amount of phenolic compounds 26 transferred to the extraction media. After that, wines were elaborated under different 27 maceration conditions by applying only one proportion of wood (12 g L-1) and two different 28 maceration procedures. 29 The simple post-fermentative addition led to wines with a more stable color, which 30 maintained their bluish hues for a longer time. In the case of double addition, the adsorption 31 of the pigments during the maceration seems to have a stronger effect on the colour than 32 copigmentation and polymerization due to the copigments extracted from the wood. 33 Keywords 34 Anthocyanins; wood; byproducts; colour; wine. 35 9 larger chromatics and smaller hues than the control, that is, wines with greater chromatic 185 intensity and more bluish red hues than the control, although these differences they are only 186 significant in case of hue. There are no differences between the tests and the control with 187 respect to lightness. The double test has a higher hue, ie, redder orange hues, which are in 188 agreement with a larger amount of free anthocyanins, less stable and less percentage of 189 polymerization than the simple addition test. 190 This fact can be observed in the color diagram (Figure 2). The different position of the 191 traditionally produced wines and the wines made with the addition of raw wood, at the end of 192 the stabilization phase, make it possible to objectively establish their chromatic 193 characteristics. All the wines are located in the first quadrant (positive values of a and b). 194 However, SW and DW wines have smaller b values that result in wines with higher purple or 195 reddish-blue hues than control wines. 196 In order to evaluate the color stability of each wine, the CIELAB color differences (ΔE*ab) 197 and the differences for the different color parameters (ΔL*, ΔC*ab and Δhab) were calculated 198 for each wine (CW, SW and DW) considering the end point of the stabilization stage with 199 respect to the initial point (day 0, chip addition) (Table 3). The addition of raw wood causes a 200 positive effect not only on color density (chroma) and hue but also on color stability. This 201 means that, during the stabilization stage, the loss of color experienced by the wines made by 202 adding wood is less than in the control wine. As expected, this loss of color is less in the 203 simple addition test than in the double test. The color differences are mainly due to qualitative 204 differences (Δhab) since it is the only parameter for which there are significant differences 205 between the tests and the control; CW, SW and DW experience positive variations of the hue 206 towards redder-orange tones, these differences being smaller in the case of SW. All wines 207 experience losses in the chroma but the differences between them are negligible. With regard 208 10 to lightness, this parameter increases in the three wines, with SW experiencing a smaller 209 increase although the differences between them are not significant. 210 In order to evaluate the influence of the post-fermentation addition at the end of the 211 stabilization stage, the color differences between SW and DW with respect to CW (SW120 vs 212 CW120 and DW120 vs CW 120) were determined (Table 4). The greatest color difference is seen 213 in the case of the simple addition (4.51 vs. 3.76 units) although these difference between the 214 tests is not significant. Taking into account that ΔE*ab greater than 3 CIELAB units indicate 215 appreciable differences by the human eye (Martínez, Melgosa, Pérez, Hita, & Negueruela, 216 2001), the color differences caused by the post-fermentative addition of raw wood both 217 simple and re-addition or double are appreciable for the human eye. 218 Conclusions 219 The improvement experienced by the wines made by adding oak wood may be related to the 220 transference to the wine of compounds coming from wood, especially ellagitannins. Its 221 presence can favor the formation of new pigments derived from anthocyanins that increase the 222 stability of the color due to an increase in blue hues which in turn leads to a decrease in the 223 yellow hues. 224 It can be concluded that the simple post-fermentative addition of raw American oak wood led 225 to wines with a more stable color, which maintained their bluish hues for a longer time. In the 226 case of double addition, the adsorption of the pigments during the maceration seems to have a 227 stronger effect on the color than copigmentation and polymerization (color stabilization) due 228 to the copigments extracted from the wood. 229 Acknowledgments 230 The Spanish Ministerio de Economía y Competitividad is thanked for project AGL2017-231 84793-C2. Universidad de Sevilla is thanked for B. Baca-Bocanegra predoctoral grant (VPPI-232 II.2) and J. Nogales-Bueno postdoctoral grant (VPPI-II.4). The authors thank the technical 233 11 staff of Biology Service [Servicios Generales de Investigación (SGI), Universidad de Sevilla]. 234 They also thank Tonelería Salas S.L. (Bollulos Par del Condado, Huelva, Spain) for supplying 235 the cooperage byproduct samples. 236 237 12 References 238 239 Baca-Bocanegra, B., Nogales-Bueno, J., Hernández-Hierro, J. M., & Heredia, F. J. (2018). Evaluation 240 of extractable polyphenols released to wine from cooperage byproduct by near infrared 241 hyperspectral imaging. Food Chemistry, 244, 206-212. 242 Boulton, R. (2001a). The copigmentation of anthocyanins and its role in the color of red wines. A 243 critical review. American Journal of Enology and Viticulture, 52(67-87). 244 Boulton, R. (2001b). The copigmentation of anthocyanins and its role in the color of red wines. A 245 critical review. American Journal of Enology and Viticulture, 52, 67-87. 246 Cano-Lopez, M., Lopez-Roca, J. M., Pardo-Minguez, F., & Gomez Plaza, E. (2010). Oak barrel 247 maturation vs. micro-oxygenation: Effect on the formation of anthocyanin-derived pigments 248 and wine colour. Food Chemistry, 119(1), 191-195. 249 Cejudo-Bastante, M. J., Rivero-Granados, F. J., & Heredia, F. J. (2017). Improving the color and 250 aging aptitude of Syrah wines in warm climate by wood-grape mix maceration. European 251 Food Research and Technology, 243(4), 575-582. 252 CIE. (2004). Colorimetry (3rd ed.). Vienna, Austria. 253 Downey, M. O., Dokoozlian, N. K., & Krstic, M. P. (2006). Cultural practice and environmental 254 impacts on the flavonoid composition of grapes and wine: A review of recent research. 255 American Journal of Enology and Viticulture, 57(3), 257-268. 256 Ferrer-Gallego, R., Hernandez-Hierro, J. M., Rivas-Gonzalo, J. C., & Escribano-Bailon, M. T. (2012). 257 Influence of climatic conditions on the phenolic composition of Vitis vinifera L. cv. Graciano. 258 Anal Chim Acta, 732, 73-77. 259 13 Garcia-Marino, M., Hernandez-Hierro, J. M., Rivas-Gonzalo, J. C., & Escribano-Bailon, M. T. (2010). 260 Colour and pigment composition of red wines obtained from co-maceration of Tempranillo 261 and Graciano varieties. Analytica Chimica Acta, 660(1-2), 134-142. 262 Gordillo, B., Baca-Bocanegra, B., Rodriguez-Pulido, F. J., Lourdes Gonzalez-Miret, M., Garcia 263 Estevez, I., Quijada-Morin, N., Heredia, F. J., & Teresa Escribano-Bailon, M. (2016). 264 Optimisation of an oak chips-grape mix maceration process. Influence of chip dose and 265 maceration time. Food Chemistry, 206, 249-259. 266 Gordillo, B., Cejudo-Bastante, M. J., Rodriguez-Pulido, F. J., Gonzalez-Miret, M. L., & Heredia, F. J. 267 (2013a). Application of the differential colorimetry and polyphenolic profile to the evaluation 268 of the chromatic quality of Tempranillo red wines elaborated in warm climate. Influence of 269 the presence of oak wood chips during fermentation. Food Chem, 141(3), 2184-2190. 270 Gordillo, B., Cejudo-Bastante, M. J., Rodriguez-Pulido, F. J., Gonzalez-Miret, M. L., & Heredia, F. J. 271 (2013b). Application of the differential colorimetry and polyphenolic profile to the evaluation 272 of the chromatic quality of Tempranillo red wines elaborated in warm climate. Influence of 273 the presence of oak wood chips during fermentation. Food Chemistry, 141(3), 2184-2190. 274 Gordillo, B., Rodriguez-Pulido, F. J., Mateus, N., Escudero-Gilete, M. L., Gonzalez-Miret, M. L., 275 Heredia, F. J., & de Freitas, V. (2012). Application of LC-MS and tristimulus colorimetry to 276 assess the ageing aptitude of Syrah wine in the Condado de Huelva D.O. (Spain), a typical 277 warm climate region. Anal Chim Acta, 732, 162-171. 278 He, F., Liang, N.-N., Mu, L., Pan, Q.-H., Wang, J., Reeves, M. J., & Duan, C.-Q. (2012). 279 Anthocyanins and Their Variation in Red Wines II. Anthocyanin Derived Pigments and Their 280 Color Evolution. Molecules, 17(2), 1483-1519. 281 Heredia, F. J., Alvarez, C., Gonzalez-Miret, M. L., & Ramirez, A. (2004). CromaLab, análisis de 282 color, CromaLab, análisis de color Sevilla, Spain. 283 14 Hernández-Hierro, J. M., Nogales-Bueno, J., Rodríguez-Pulido, F. J., & Heredia, F. J. (2013). 284 Feasibility study on the use of near-infrared hyperspectral imaging for the screening of 285 anthocyanins in intact grapes during ripening. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 286 61(41), 9804-9809. 287 Martínez, J. A., Melgosa, M., Pérez, M. M., Hita, E., & Negueruela, A. I. (2001). Note. Visual and 288 Instrumental Color Evaluation in Red Wines. Food Science and Technology International, 289 7(5), 439-444. 290 Mira de Orduña, R. (2010). Climate change associated effects on grape and wine quality and 291 production. Food Research International, 43(7), 1844-1855. 292 Rentzsch, M., Schwarz, M., Winterhalter, P., & Hermosin-Gutierrez, I. (2007). Formation of 293 hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in Grenache wines: Precursor levels and evolution during 294 aging. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55(12), 4883-4888. 295 Ribéreau-Gayon, P., Dubourdieu, D., Doneche, B., Lonvaud, A., Glories, Y., Maujean, A., & Branco, 296 J. M. (2006). Handbook of Enology, The Microbiology of Wine and Vinifications. West 297 Sussex, England: J. Wiley & Sons. 298 Rivero, F. J., Jara-Palacios, M. J., Gordillo, B., Heredia, F. J., & Gonzalez-Miret, M. L. (2019). Impact 299 of a post-fermentative maceration with overripe seeds on the color stability of red wines. Food 300 Chem, 272, 329-336. 301 Ryan, J. M., & Revilla, E. (2003). Anthocyanin composition of Cabernet Sauvignon and Tempranillo 302 grapes at different stages of ripening. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(11), 303 3372-3378. 304 Singleton, V. L., & Rossi, J. A. (1965). Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic-305 Phosphotungstic Acid Reagents. American Journal of Enology and Viticulture(16), 144-158. 306 15 Vivas, N., Glories, Y., Lagune, L., Saucier, C., & Augustin, M. (1994). Estimation du degré de 307 polymérisation des procyanidines du raisin et du vin par la méthode au p-308 dimethylaminocinnamaldéhyde. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin, 28, 309 319-336. 310 311 Fig. captions1 312 Fig. 1. Schematic representation of the wine elaboration process. 313 Fig.2. Location of wines at the end of the stabilization phase (120 days) on the CIELAB 314 (a*b*)-diagram. 315 316 1 NOTE: All figures should be in color on the Web and in black-and-white in print. 317 318 Table 1. Polyphenol content (mg L-1) for the different elaborated wines (CW, SW and DW) in three different stages of the winemaking process. Significant differences (=0.05). C30 S30 C60 D60 C120 S120 D120 Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD Total Phenols 2019.19a ± 36.07 2466.32b ± 218.38 2174.45a ± 157.95 2503.72b ± 119.89 2304.90a ± 292.92 1984.79a ± 221.36 2052.87a ± 165.94 Total Flavanols 141.21a ± 7.24 136.55a ± 8.24 129.11a ± 9.28 102.24b ± 9.31 137.66a ± 16.91 70.43b ± 4.17 88.03b ± 8.87 Total Anthocyanins 150.20a ± 11.12 141.17a ± 4.84 132.44a ± 19.04 68.74b ± 3.49 113.57a ± 40.77 15.77b ± 1.10 23.63b ± 6.70 Total non acylated 67.83a ± 2.00 66.02a ± 3.62 62.99a ± 7.05 35.67b ± 2.15 54.66a ± 18.63 6.85b ± 0.56 11.33b ± 3.50 Total acetyls 46.53a ± 2.34 45.27a ± 0.61 43.50a ± 5.47 24.14b ± 1.28 36.94a ± 12.60 6.70b ± 0.39 9.77b ± 2.44 Total coumaroyls 36.51a ± 7.28 30.55a ± 1.16 26.63a ± 6.64 9.60b ± 0.21 22.64a ± 9.55 2.89b ± 0.35 3.21b ± 0.77 Total acylated 82.71a ± 9.20 75.49a ± 1.40 69.79a ± 12.10 33.41b ± 1.34 59.25a ± 22.14 9.25b ± 0.55 12.64b ± 3.22 Delphinidin-3-O-glucoside 2.90a ± 0.19 2.91a ± 0.13 2.81a ± 0.36 1.61b ± 0.07 2.53a ± 0.68 0.60b ± 0.04 0.78b ± 0.13 Petunidin-3-O-glucoside 5.56a ± 0.15 5.39a ± 0.16 5.20a ± 0.65 3.00b ± 0.12 4.63a ± 1.46 1.00b ± 0.04 1.38b ± 0.28 Peonidin-3-O-glucoside 5.53a ± 0.88 4.62a ± 0.96 4.50a ± 0.61 2.35b ± 0.10 3.46a ± 1.11 0.52b ± 0.06 0.66b ± 0.13 Malvidin-3 O-glucoside 54.85a ± 1.14 54.12a ± 2.43 51.49a ± 5.92 29.72b ± 1.86 45.05a ± 15.38 5.74b ± 0.45 9.53b ± 2.96 Delphinidin-3-O-(6´acetyl)-glucoside 1.56a ± 0.70 1.48a ± 0.72 1.60a ± 0.19 1.18b ± 0.07 1.42a ± 0.30 0.78b ± 0.02 0.83b ± 0.06 Petunidin-3-O-(6´acetyl)-glucoside 2.18a ± 0.25 2.08a ± 0.06 1.84a ± 0.30 1.13b± 0.04 1.74a ± 0.53 0.72b ± 0.02 0.79b ± 0.09 Peonidin-3-O-(6´acetyl)-glucoside 1.03a ± 0.19 1.06a ± 0.09 1.04a ± 0.25 0.44b ± 0.03 0.83a ± 0.28 0.64b ± 0.02 0.60b ± 0.03 Malvidin-3-O-(6´acetyl)-glucoside 4.42a ± 0.13 4.61a ± 0.56 4.44a ± 0.31 2.50b ± 0.20 3.65a ± 1.05 0.83b ± 0.04 1.09b ± 0.22 Delphinidin-3-O-(6′-p-coumaroyl)glucoside (trans) 38.70a ± 2.63 37.39a ± 0.93 35.93a ± 4.87 20.24b ± 1.03 30.65a ± 10.54 5.08b ± 0.32 7.80b ± 2.13 Malvidin- 3-O-(6´ caffeoyl)-glucoside (trans) 1.42a ± 0.23 1.11a ± 0.08 0.77a ± 0.39 0.50a ± 0.07 0.70a ± 0.23 0.62a ± 0.02 0.59a ± 0.02 Cyanidin-3-O-(6′-p-coumaroyl)glucoside 1..48a ± 0.16 1.36a ± 0.17 0.95a ± 0.37 0.66a ± 0.18 0.98a ± 0.26 0.37b ± 0.01 0.39b ± 0.02 Petunidin-3-O-(6′-p-coumaroyl)glucoside (trans) 3.48a ± 1.28 2.66a ± 0.25 2.07a ± 0.67 0.88b ± 0.22 1.80a ± 0.60 0.41b ± 0.01 0.39b ± 0.01 Malvidin-3-O-(6′-p-coumaroyl)glucoside (cis) 2.91a ± 1.88 1.21a ± 0.51 0.96a ± 0.19 0.448b ± 0.04 0.66a ± 0.12 0.65a ± 0.05 0.61a ± 0.07 Peonidin-3-O-(6′-p-coumaroyl)glucoside (trans) 2.86a ± 0.05 2.90a ± 0.70 2.98a ± 1.30 1.32b ± 0.09 2.44a ± 0.60 0.56 b± 0.09 0.56b ± 0.07 Malvidin-3-O-(6′-p-coumaroyl)glucoside (trans) 26.05a ± 3.93 23.00a ± 0.41 20.59a ± 3.78 7.47b ± 0.59 17.77a ± 8.29 1.88b ± 0.23 2.37b ± 0.70 Table 1 Table 2. CIELAB color parameters (L*, a*, b*, C*ab, and hab) for the different elaborated wines (CW, SW and DW) in three different stages of the winemaking process Stage Control Simple Double Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD Initial (0 day) L* 74.34 ± 0.53 74.83 ± 0.87 73.90 ± 0.76 a* 27.18 ± 0.80 28.88 ± 0.88 28.51 ± 0.55 b* -0.99 ± 0.25 -1.72 ± 0.25 -1.68 ± 0.14 C*ab 27.20 ± 0.79 28.93 ± 0.89 28.23 ± 0.54 hab -2.10 ± 0.57 -3.40 ± 0.43 -3.53 ± 0.37 Maceration (30 days) L* 79.17a ± 0.54 83.44b ± 0.22 a* 19.18a ±0.72 15.19b ± 0.17 b* 2.41a ±0.31 3.39b ± 0.18 C*ab 20.22a ± 0.61 15.57b ± 0.13 hab 6.29a± 1.36 12.57b ± 0.77 Maceration (60 days) L* 79.96a ± 1.24 81.31a ± 0.45 a* 20.25a ± 0.89 19.49a ± 0.25 b* 1.00a ± 0.15 1.55b ± 0.06 C*ab 20.77a± 0.68 19.55a ± 0.26 hab 2.74a ± 0.54 4.54b ± 1.14 Stabilization (120 days) L* 80.81a ± 0.52 80.54a ± 1.76 80.92a ± 1.33 a* 18.01a ± 0.63 18.89a ± 1.17 18.60a ± 1.35 b* 3.91a ± 0.45 1.50b ± 0.10 2.14b ± 0.26 C*ab 17.87a ± 1.32 18.95a ± 1.17 18.73a ± 1.35 hab 10.94a ± 0.71 4.55b ± 0.37 6.59c ± 0.92 Significant differences (=0.05) Table 2 Table 3. Colour differences for each wine (CW, SW and DW) considering the end point of the stabilization with respect to the initial point (day 0, wood addition). Control Simple Double Stage Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD Stabilization (120 days) ΔE*ab 13.50a ± 3.20 12.00a ± 2.65 12.76a ± 1.90 ΔL* 6.47a ± 0.58 5.71a ± 2.24 7.02a ± 1.48 ΔCab -9.99a ± 3.21 -9.99a ± 1.90 -9.51a ± 1.38 Δhab 13.04a ± 1.24 7.94b ± 0.75 10.12b ± 1.28 Significant differences (=0.05). Table 3 274 QUINTA: En muestras de uva, los modelos desarrollados utilizando un espectrómetro NIR portátil miniaturizado, para estimar in situ el contenido extraíble de antocianos, flavanoles y fenoles totales, presentan errores que comprometen su aplicación con fines predictivos. De forma similar, los bajos porcentajes de clasificación correcta de las muestras según su nivel de contenido fenólico extraíble comprometen la utilidad de esta técnica con fines clasificatorios. SEXTA: A partir del análisis espectral NIR portátil, es posible obtener modelos fiables para estimar el contenido extraíble de fenoles totales y elagitaninos en viruta cruda de roble, que confirman las ventajas del procesado de la madera en dirección longitudinal de las fibras en cuanto al nivel de contenido fenólico extraíble. Se han identificado las zonas alrededor de 1200 y 1400 nm del espectro como las de mayor influencia en la predicción de este parámetro. El desarrollo de modelos aplicables in situ permitirá una mayor versatilidad y eficiencia para la toma de decisiones en el proceso de vinificación sobre la adecuación y/o dosificación de este subproducto. SÉPTIMA: La espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier y la espectroscopía Raman han probado ser técnicas efectivas y fiables para relacionar las características espectrales más importantes con el nivel de extractabilidad de fenoles totales en viruta cruda de roble. Estas técnicas, junto con la microscopía electrónica de barrido, confirman la influencia de la estructura y la morfología de la pared celular de la madera en la extractabilidad de compuestos fenólicos. OCTAVA: Se ha confirmado que la adición post-fermentativa de viruta de madera cruda representa un procedimiento enológico útil para la elaboración de vinos tintos en clima cálido, ya que conduce a una mejora de la calidad y estabilidad cromática con respecto a la vinificación tradicional. Las diferencias de color, evaluadas por Colorimetría Triestímulo, demuestran que se obtienen vinos con mejores características cromáticas cuando el tiempo de maceración y la cantidad de viruta añadida son moderados. 275 GENERAL CONCLUSIONS In this work, different spectroscopic techniques have been successfully used to study the extractability of phenolic compounds from grapes and cooperage by-products, used as processing aids. The following main conclusions are drawn from the studies carried out: FIRST: Copigments coming from toasted oak wood chips can improve and stabilize wine color without hampering the extraction equilibrium of anthocyanins compounds. It has been proven that the addition of these copigments do not reduce the amount of anthocyanins extracted from grape skins during the maceration stage. SECOND: Calibration models can be obtained from a reduced number of samples by the use of principal component analysis. This reduction can be achieved without loss of spectral heterogeneity of the original sample set. The application of this methodology allows developing models for the screening of different parameters of interest in grapes (seeds and skins) and oak wood shavings, reducing the resources necessary for this, both from the computational and experimental point of view. THIRD: Extractable content of total phenols and flavanols can be predicted in red grape seeds using near infrared hyperspectral imaging. The spectral regions around 1200 and 1400 nm have been identified as important regions for the phenolic screening. Moreover, this methodology allows sorting red grape seeds according to their extractability of phenolic compounds. The obtained results indicate higher extractability of phenolic compounds in Syrah than in Tempranillo seeds. FOURTH: Near infrared hyperspectral imaging and modified partial least squares regression (MPLS) have been successfully used for the screening of extractable phenolic content in oak wood shavings. The extractable content of total phenols is higher in shavings generated by processes of the staves in the longitudinal direction of the fibers than in transversal ones. The application of NIR hyperspectral imaging techniques will allow a fast and objective selection of the most suitable oak shavings according to the characteristics desired for wine. 276 FIFTH: Portable NIR spectroscopy does not present enough accuracy for the “in vineyard” screening of extractable polyphenols (anthocyanins, flavanols and total phenols) in red grape skins. Similar to quantitative results, the different approaches carried out for the discriminations of samples according to their level of extractable compounds show unremarkable results. SIXTH: Portable NIR spectroscopy allows developing reliable models to estimate the extractable content of total phenols and ellagitannins in oak wood shavings. This procedure confirms the advantages of wood processing in the longitudinal direction of the fibers in terms of the level of extractable phenolic content. The spectral regions around 1200 and 1400 nm have shown to have important contributions for the phenolic screening. Development of applicable models in situ will allow a greater versatility and efficiency for the decision-making in the winemaking process on the adequacy and/or dosage of these byproducts according to the requirements of the wine. SEVENTH: Fourier transform infrared and Raman spectroscopy have proven to be effective and reliable tools to relate the more important spectral features to phenolic extractability levels in oak wood shavings. These techniques, together scanning electron microscopy, confirm the influence of the structure and/or morphology of the cell wall wood on phenolic compounds extractability. EIGHTH: Post-fermentative addition of oak wood shavings is a useful oenological procedure to elaborate red wines in warm climates since it improves both phenolic composition and quality and stability of colour with respect to traditional vinification. Color differences, evaluated by Tristimulus Colorimetry, show that wines with better chromatic characteristics are obtained when the time of maceration and the amount of shavings added are moderate. REFERENCIAS 279 REFERENCIAS Agarwal, U. P. (2014). 1064 nm FT-Raman spectroscopy for investigations of plant cell walls and other biomass materials. Frontiers in Plant Science, 5, 490. Alañón, M. E., Castro-Vázquez, L., Díaz-Maroto, M. C., Gordon, M. H., y Pérez-Coello, M. S. (2011). A study of the antioxidant capacity of oak wood used in wine ageing and the correlation with polyphenol composition. Food Chemistry, 128(4), 997-1002. Arnold, R. A., Noble, A. C., y Singleton, V. L. (1980). Bitterness and astringency of phenolic fractions in wine. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 28(3), 675-678. Asselin, C., y Delteil, D. (2003). Vinificaciones: principales operaciones unitarias comunes. En Enología: Fundamentos Científicos y Tecnológicos, (2ª ed. (pp.). Madrid, España: AMV Ediciones y Mundi-Prensa. Ayvaz, H., Sierra-Cadavid, A., Aykas, D. P., Mulqueeney, B., Sullivan, S., y Rodriguez-Saona, L. E. (2016). Monitoring multicomponent quality traits in tomato juice using portable mid-infrared (MIR) spectroscopy and multivariate analysis. Food Control, 66, 79-86. Baca-Bocanegra, B., Nogales-Bueno, J., Heredia, F. J., y Hernandez-Hierro, J. M. (2018). Estimation of Total Phenols, Flavanols and Extractability of Phenolic Compounds in Grape Seeds Using Vibrational Spectroscopy and Chemometric Tools. Sensors 18(8). Baca-Bocanegra, B., Nogales-Bueno, J., Hernandez-Hierro, J. M., y Heredia, F. J. (2018). Evaluation of extractable polyphenols released to wine from cooperage byproduct by near infrared hyperspectral imaging. Food Chemistry, 244, 206-212. Baca-Bocanegra, B., Nogales-Bueno, J., Rodríguez-Pulido, F., González-Miret, M., Hernández- Hierro, J., y Heredia, F. (2016). Near infrared hyperspectral imaging: recent applications in the oenological and viticultural sectors. NIR news, 27(6), 14-18. Baiano, A., Terracone, C., Peri, G., y Romaniello, R. (2012). Application of hyperspectral imaging for prediction of physico-chemical and sensory characteristics of table grapes. Computers and Electronics in Agriculture, 87, 142-151. Balasundram, N., Sundram, K., y Samman, S. (2006). Phenolic compounds in plants and agriindustrial by-products: Antioxidant activity, occurrence, and potential uses. Food Chemistry, 99(1), 191-203. Barbin, D. F., Elmasry, G., Sun, D. W., y Allen, P. (2013). Non-destructive determination of chemical composition in intact and minced pork using near-infrared hyperspectral imaging. Food Chemistry, 138(2-3), 1162-1171. Barnes, R. J., Dhanoa, M. S., y Lister, S. (1989). Standard Normal Variate Transformation and De-trending of Near-Infrared Diffuse Reflectance Spectra. Applied Spectroscopy, 43(5), 772-777. 280 Basri, K. N., Hussain, M. N., Bakar, J., Sharif, Z., Khir, M. F. A., y Zoolfakar, A. S. (2017). Classification and quantification of palm oil adulteration via portable NIR spectroscopy. Spectrochimica Acta Part a-Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 173, 335-342. Bautista-Ortín, A. B., Jiménez-Pascual, E., Busse-Valverde, N., López-Roca, J. M., Ros-García, J. M., y Gómez-Plaza, E. (2013). Effect of Wine Maceration Enzymes on the Extraction of Grape Seed Proanthocyanidins. Food and Bioprocess Technology, 6(8), 2207-2212. Bergqvist, J., Dokoozlian, N., y Ebisuda, N. (2001). Sunlight eposure and temperature effects on berry growth and composition of Cabernet Sauvignon and Grenache in the central San Joaquin Valley of California. American Journal of Enology and Viticulture, 52, 1-7. Blakey, R. J. (2016). Evaluation of avocado fruit maturity with a portable near-infrared spectrometer. Postharvest Biology and Technology, 121, 101-105. Bokobza, L. (1998). Near infrared spectroscopy. Journal of Near Infrared Spectroscopy, 6(1), 3- 17. Boulton, R. (2001). The copigmentation of anthocyanins and its role in the color of red wines. A critical review. American Journal of Enology and Viticulture, 52, 67-87. Boulton, R. B. (1996). A method for the assessment of copigmentation in red wines. In 47 th Annual Meeting of the American Society for Enology and Viculture, Reno, NV. Brereton, R. G. (2003). Chemometrics: data analysis for the laboratory and chemical plant. Chichester, West Sussex, England: J. Wiley. Byrne, H. J., Ostrowska, M. K., Nawaz, H., Dorney, J., Meade, D. A., Bonnier, F., y Lyng, M. F. (2014). Vibrational Spectroscopy: Disease Diagnostics and Beyond. En Optical Spectroscopy and Computational Methods in Biology and Medicine, (pp. 355-399). Dordrecht, Netherlands: Springer Netherlands. Byrne, H. J., Sockalingum, G. D., y Stone, N. (2011). Chapter 4 Raman Microscopy: Complement or Competitor? En Biomedical Applications of Synchrotron Infrared Microspectroscopy: A Practical Approach, (pp. 105-143). Karlsruhe, Germany: The Royal Society of Chemistry. Cadot, Y., Minana-Castello, M. T., y Chevalier, M. (2006). Anatomical, histological, and histochemical changes in grape seeds from Vitis vinifera L. cv Cabernet franc during fruit development. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(24), 9206-9215. Caldeira, I., Climaco, M. C., de Sousa, R. B., y Belchior, A. P. (2006). Volatile composition of oak and chestnut woods used in brandy ageing: Modification induced by heat treatment. Journal of Food Engineering, 76(2), 202-211. Canals, R., Llaudy, M. C., Valls, J., Canals, J. M., y Zamora, F. (2005). Influence of the physiological stage and tehe content of soluble solids on the anthocyanin extractability of Vitis vinifera L.cv. Tempranillo grapes. Analytica Chimica Acta, 53, 4019-4025. 281 Canas, S., Leandro, M. C., Spranger, M. I., y Belchior, A. P. (2000). Influence of botanical species and geographical origin on the content of low molecular weight phenolic compounds of woods used in Portuguese cooperage. Holzforschung, 54(3), 255-261. Cano-Lopez, M., Lopez-Roca, J. M., Pardo-Minguez, F., y Gomez Plaza, E. (2010). Oak barrel maturation vs. micro-oxygenation: Effect on the formation of anthocyanin-derived pigments and wine colour. Food Chemistry, 119(1), 191-195. Carbonneau, A., Champagnol, F., Deloire, A., y Sevilla, F. (2003). Vendimia y calidad de la uva. En Enología: Fundamentos Científicos y Tecnológicos, (2ª Edición ed. (pp.). Madrid, España: AMV Ediciones y Mundi-Prensa. Casassa, L. F., Bolcato, E. A., y Sari, S. E. (2015). Chemical, chromatic, and sensory attributes of 6 red wines produced with prefermentative cold soak. Food Chemistry, 174, 110-118. CE_1507/2006. (2006). Reglamento (CE) No 1507/2006 de la comisión. Diario Oficial de la Unión Europea, 280, 9-11. Cejudo-Bastante, M. J., Gordillo, B., Hernanz, D., Escudero-Gilete, M. L., Gonzalez-Miret, M. L., y Heredia, F. J. (2014). Effect of the time of cold maceration on the evolution of phenolic compounds and colour of Syrah wines elaborated in warm climate. International Journal of Food Science and Technology, 49(8), 1886-1892. Cejudo-Bastante, M. J., Rivero-Granados, F. J., y Heredia, F. J. (2017). Improving the color and aging aptitude of Syrah wines in warm climate by wood-grape mix maceration. European Food Research and Technology, 243(4), 575-582. Cejudo-Bastante, M. J., Rodríguez-Morgado, B., Jara-Palacios, M. J., Rivas-Gonzalo, J. C., Parrado, J., y Heredia, F. J. (2016). Pre-fermentative addition of an enzymatic grape seed hydrolysate in warm climate winemaking. Effect on the differential colorimetry, copigmentation and polyphenolic profiles. Food Chemistry, 209, 348-357. CIE. (2004). Technical Report: Colorimetry (3rd ed.). Vienna, Austria: Commission Internationale de l’Eclairage Central Bureau. Colares, C. J. G., Pastore, T. C. M., Coradin, V. T. R., Camargos, J. A. A., Moreira, A. C. O., Rubim, J. C., y Braga, J. W. B. (2015). Exploratory Analysis of the Distribution of Lignin and Cellulose in Woods by Raman Imaging and Chemometrics. Journal of the Brazilian Chemical Society, 26(6), 1297-1305. Colares, C. J. G., Pastore, T. C. M., Coradin, V. T. R., Marques, L. F., Moreira, A. C. O., Alexandrino, G. L., Poppi, R. J., y Braga, J. W. B. (2016). Near infrared hyperspectral imaging and MCR-ALS applied for mapping chemical composition of the wood specie Swietenia Macrophylla King (Mahogany) at microscopic level. Microchemical Journal, 124, 356-363. 282 Cozzolino, D., Kwiatkowski, M. J., Parker, M., Cynkar, W. U., Dambergs, R. G., Gishen, M., y Herderich, M. J. (2004). Prediction of phenolic compounds in red wine fermentations by visible and near infrared spectroscopy. Analytica Chimica Acta, 513(1), 73-80. Crozier, A., Clifford, M. N., y Ashihara, H. (2006). Plant Secondary Metabolites. Occurrence, Structure and Role in the Human Diet. Oxford, England: Blackwell Publishing. Chassaing, S., Lefeuvre, D., Jacquet, R., Jourdes, M., Ducasse, L., Galland, S., Grelard, A., Saucier, C., Teissedre, P.-L., Dangles, O., y Quideau, S. (2010). Physicochemical studies of new anthocyano-ellagitannin hybrid pigments: about the origin of the influence of oak C-glycosidic ellagitannins on wine color. European Journal of Organic Chemistry, 1, 55- 63. Chatonnet, P., y Dubourdieu, D. (1998). Comparative study of the characteristics of American white oak (Quercus alba) and European oak (Quercus petraea and Q-robur) for production of barrels used in barrel aging of wines. American Journal of Enology and Viticulture, 49(1), 79-85. Chen, S., Zhang, F., Ning, J., Liu, X., Zhang, Z., y Yang, S. (2015). Predicting the anthocyanin content of wine grapes by NIR hyperspectral imaging. Food Chemistry, 172, 788-793. Cheynier, V., Moutounet, M., y Sarni-Machado, P. (2003). Los compuestos fenólicos. En Enología: fundamentos científicos y tecnológicos, (pp. 114-136). Madrid, España: AMV Ediciones y Mundi-Prensa. Christen, H. R., y Beltrán, J. (1977). Fundamentos de la química general e inorgánica. Barcelona, España: Reverté. De la Roza-Delgado, B., Garrido-Varo, A., Soldado, A., Gonzalez Arrojo, A., Cuevas Valdes, M., Maroto, F., y Perez-Marin, D. (2017). Matching portable NIRS instruments for in situ monitoring indicators of milk composition. Food Control, 76, 74-81. De Rosso, M., Panighel, A., Vedova, A. D., Stella, L., y Flamini, R. (2009). Changes in Chemical Composition of a Red Wine Aged in Acacia, Cherry, Chestnut, Mulberry, and Oak Wood Barrels. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57(5), 1915-1920. Deane, J. M. (1992). Chapter 5 Data Reduction Using Principal Components Analysis. 9, 125- 177. Del Álamo Sanza, M., y Nevares Domínguez, I. (2006). Wine aging in bottle from artificial systems (staves and chips) and oak woods. Analytica Chimica Acta, 563(1-2), 255-263. Del Alamo Sanza, M., Nevares Domınguez, I., Cárcel Cárcel, L. M., y Navas Gracia, L. (2004). Analysis for low molecular weight phenolic compounds in a red wine aged in oak chips. Analytica Chimica Acta, 513(1), 229-237. Escribano-Bailon, M. T., y Santos-Buelga, C. (2012). Anthocyanin Copigmentation - Evaluation, Mechanisms and Implications for the Colour of Red Wines. Current Organic Chemistry, 16(6), 715-723. 283 Faix, O. (1992). Fourier Transform Infrared Spectroscopy. En Methods in Lignin Chemistry, (pp. 83-109). Berlin: Springer Fernández De Simón, B., Cadahía, E., Conde, E., y García-Vallejo, M. C. (1999). Ellagitannins in woods of Spanish, French and American oaks. Holzforschung, 53(2), 147-150. Fernández de Simón, B., Cadahía, E., del Álamo, M., y Nevares, I. (2010). Effect of size, seasoning and toasting in the volatile compounds in toasted oak wood and in a red wine treated with them. Analytica Chimica Acta, 660(1-2), 211-220. Ferrer-Gallego, R., Hernández-Hierro, J. M., Rivas-Gonzalo, J. C., y Escribano-Bailón, M. T. (2010). Feasibility study on the use of near infrared spectroscopy to determine flavanols in grape seeds. Talanta, 82(5), 1778-1783. Ferrer-Gallego, R., Hernández-Hierro, J. M., Rivas-Gonzalo, J. C., y Escribano-Bailón, M. T. (2011). Determination of phenolic compounds of grape skins during ripening by NIR spectroscopy. LWT - Food Science and Technology, 44(4), 847-853. Fournand, D., Vicens, A., Sidhoum, L., Souquet, J. M., Moutounet, M., y Cheynier, V. (2006). Accumulation and extractability of grape skin tannins and anthocyanins at different advanced physiological stages. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 7331- 7338. Frangipane, M. T., Santis, D. D., y Ceccarelli, A. (2007). Influence of oak woods of different geographical origins on quality of wines aged in barriques and using oak chips. Food Chemistry, 103(1), 46-54. García-Estévez, I., Escribano-Bailón, M. T., Rivas-Gonzalo, J. C., y Alcalde-Eon, C. (2010). Development of a fractionation method for the detection and identification of oak ellagitannins in red wines. Analytica Chimica Acta, 660(1-2), 171-176. García-Estévez, I., Escribano-Bailón, M. T., Rivas-Gonzalo, J. C., y Alcalde-Eon, C. (2012). Validation of a mass spectrometry method to quantify oak ellagitannins in wine samples. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60(6), 1373-1379. García-Marino, M., Hernández-Hierro, J. M., Rivas-Gonzalo, J. C., y Escribano-Bailón, M. T. (2010). Colour and pigment composition of red wines obtained from co-maceration of Tempranillo and Graciano varieties. Analytica Chimica Acta, 660(1-2), 134-142. García-Marino, M., Hernández-Hierro, J. M., Rivas-Gonzalo, J. C., y Escribano-Bailón, M. T. (2010). Colour and pigment composition of red wines obtained from co-maceration of Tempranillo and Graciano varieties. Analytica Chimica Acta, 660(1-2), 134-142. Geladi, P., Macdougall, D., y Martens, H. (1985). Linearization and scatter-correction for nearinfrared reflectance spectra of meat. Applied Spectroscopy, 39(3), 491-500. Giordanengo, T., Charpentier, J. P., Boizot, N., Roussel, S., Roger, J. M., Chaix, G., Robin, C., y Mourey, N. (2009). Oakscan: procédé de mesure rapide et non destructif des polyphénols du bois de chêne de tonnellerie. Revue française d'Oenologie, 10-15. 290 fermentation on wine colour and phenolic composition. Lwt-Food Science and Technology, 84, 544-550. Rodríguez-Pulido, F. J., Barbin, D. F., Sun, D.-W., Gordillo, B., González-Miret, M. L., y Heredia, F. J. (2013). Grape seed characterization by NIR hyperspectral imaging. Postharvest Biology and Technology, 76, 74-82. Rodriguez-Pulido, F. J., Hernández-Hierro, J. M., Nogales-Bueno, J., Gordillo, B., Gonzalez- Miret, M. L., y Heredia, F. J. (2014). A novel method for evaluating flavanols in grape seeds by near infrared hyperspectral imaging. Talanta, 122, 145-150. Rogalski, A. (2003). Infrared detectors: status and trends. Progress in Quantum Electronics, 27(2–3), 59-210. Saranwong, S., Sornsrivichai, J., y Kawano, S. (2003). On-tree evaluation of harvesting quality of mango fruit using a hand-held NIR instrument. Journal of Near Infrared Spectroscopy, 11(4), 283-293. Saucier, C., Jourdes, M., Glories, Y., y Quideau, S. (2006). Extraction, detection, and quantification of flavano-ellagitannins and ethylvescalagin in a Bordeaux red wine aged in oak barrels. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(19), 7349-7354. Sauvageot, F., y Feuillat, F. (1999). The influence of oak wood (Quercus robur L., Q-petraea Liebl.) on the flavor of Burgundy Pinot noir. An examination of variation among individual trees. American Journal of Enology and Viticulture, 50(4), 447-455. Scalbert, A., Monties, B., y Janin, G. (1989). Tannins in wood - comparison of different estimation methods. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 37(5), 1324-1329. Schultz, T. P., y Glasser, W. G. (1986). Quantitative structural analysis of lignin by diffuse reflectance Fourier transform spectrometry. Holzforschung, 40(SUPPL.), 37-44. Shenk, J. S., y Westerhaus, M. O. (1995). Routine Operation,Calibration, Development and Network System Management Manual. Silver Spring, Maryland: NIRSystems. Siesler, H. W., Ozaky, Y., Kawata, S., y Heise, H. M. (2002). Near infrared spectroscopy: principles, instruments, applications. Weinheim, Germany: Wiley-VCH. Singleton, V. L. (1995). Maturation of wines and spirits - comparisons, facts, and hypotheses. American Journal of Enology and Viticulture, 46(1), 98-115. Singleton, V. L., y Rossi, J. A. (1965). Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic- Phosphotungstic Acid Reagents. American Journal of Enology and Viticulture(16), 144- 158. Skoog, D. A., Holler, F. J., y Crouch, S. R. (2009). Principios de análisis instrumental (6ª ed.). España. Sogorb Sánchez, M. Á. (2006). Técnicas analíticas de contaminantes químicos: aplicaciones toxicológicas, medioambientales y alimentarias. Madrid, España: Ediciones Díaz de Santos. 291 Sorak, D., Herberholz, L., Iwascek, S., Altinpinar, S., Pfeifer, F., y Siesler, H. W. (2012). New Developments and Applications of Handheld Raman, Mid-Infrared, and Near-Infrared Spectrometers. Applied Spectroscopy Reviews, 47(2), 83-115. Soto Vazquez, E., Rio Segade, S., y Orriols Fernandez, I. (2010). Effect of the winemaking technique on phenolic composition and chromatic characteristics in young red wines. European Food Research and Technology, 231(5), 789-802. Spectral Imaging Ltd (2010). SpectralDAQ Versión 3.62. StatSoft Inc (2007). STATISTICA (data analysis software system) Version 8.0. Sun, D. W. (2010). Hyperspectral Imaging for Food Quality Analysis and Control. San Diego, California: Elsevier Science & Technology. Teissedre, P. L., Frankel, E. N., Waterhouse, A. L., Peleg, H., y German, J. B. (1996). Inhibition of in vitro human LDL oxidation by phenolic antioxidants from grapes and wines. Journal of the Science of Food and Agriculture, 70(1), 55-61. Teixeira dos Santos, C. A., Lopo, M., Pascoa, R. N. M. J., y Lopes, J. A. (2013). A Review on the Applications of Portable Near-Infrared Spectrometers in the Agro-Food Industry. Applied Spectroscopy, 67(11), 1215-1233. The MathWorks (2012). Matlab® Versión R2012b. Thumm, A., Riddell, M., Nanayakkara, B., Harrington, J., y Meder, R. (2010). Near infrared hyperspectral imaging applied to mapping chemical composition in wood samples. Journal of Near Infrared Spectroscopy, 18(6), 507-515. Torchio, F., Cagnasso, E., Gerbi, V., y Rolle, L. (2010). Mechanical properties, phenolic composition and extractability indices of Barbera grapes of different soluble solids contents from several growing areas. Analytica Chimica Acta, 660(1-2), 183-189. Trouillas, P., Sancho-Garcia, J. C., De Freitas, V., Gierschner, J., Otyepka, M., y Dangles, O. (2016). Stabilizing and Modulating Color by Copigmentation: Insights from Review Theory and Experiment. Chemical Reviews, 116(9), 4937-4982. Vandeginste, B. G. M., Massart, D. L., y Buydens, L. M. C. (1998). Handbook of Chemometrics and Qualimetrics (Vol. 20). Amsterdam, Netherlands: Elsevier. Viriot, C., Scalbert, A., Dupenhoat, C., y Moutounet, M. (1994). Ellagitannins in woods of sessile oak and sweet chestnut dimerization and hydrolysis during wood aging. Phytochemistry, 36(5), 1253-1260. Vivas, N. (1997). Recherches sur la qualité de chêne français de tonnellerie (Q. petraea Liebl., Q. robur L.) et sur les méchanismes d’oxidoréducction des vins rouges au cours de leur élevage en barriques. Unpublished Thesis, Université Bordeaux. Vivas, N. (2002). Manuel de Tonnellerie a l´usage des utilisateurs de futailles (2 ème ed.). France. Vivas, N., y Glories, Y. (1996). Role of oak wood ellagitannins in the oxidation process of red wines during aging. American Journal of Enology and Viticulture, 47(1), 103-107. 292 Vivas, N., Glories, Y., Lagune, L., Saucier, C., y Augustin, M. (1994). Estimation du degré de polymérisation des procyanidines du raisin et du vin par la méthode au pdimethylaminocinnamaldéhyde. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin, 28, 319-336. Waterhouse, A. L. (2002). Wine phenolics. New York, New york: The New York Academy of Sciences. Wiedemair, V., De Biasio, M., Leitner, R., Balthasar, D., y Huck, C. W. (2018). Application of Design of Experiment for Detection of Meat Fraud with a Portable Near-Infrared Spectrometer. Current Analytical Chemistry, 14(1), 58-67. Yoon, S. C., Lawrence, K. C., Smith, D. P., Park, B., y Windham, W. R. (2008). Bone fragment detection in chicken breast fillets using transmittance image enhancement. Transactions of the Asabe, 51(1), 331-339. Zahri, S., Moubarik, A., Charrier, F., Chaix, G., Bailleres, H., Nepveu, G., y Charrier, B. (2008). Quantitative assessment of total phenol contents of European oak (Quercus petraea and Quercus robur) by diffuse reflectance NIR spectroscopy on solid wood surfaces. Holzforschung, 62(6), 679-687. Zamora, F. (2003). Elaboración y crianza del vino tinto:Aspectos cientificos y prácticos. Madrid: Mundi Prensa. Zouid, I., Siret, R., Jourjon, F., Mehinagic, E., y Rolle, L. (2013). Impact of grapes heterogeneity according to sugar level on both physical and mechanical merries properties and their anthocyanins extractability at harvest. Journal of Texture Studies, 44(2), 95-103.