Síntese de novos derivados heterocíclicos com potencial actividade para combate de parasitas humanos

Universidade do Minho Escola de Ciência Ana Rita Abreu Almeida Síntese de novos derivados heterocíclicos com potencial actividade para combate de parasitas humanos abril 2019 ii Declaração Nome: Ana Rita Almeida Abreu Endereço Eletrónico: [email protected] Telefone: (+351) 914 022 042 Cartão de Cidadão: 14382243 Orientadora: Professora Doutora Maria Alice Carvalho Título da Dissertação: Síntese de novos derivados heterocíclicos com potencial atividade para o combate de parasitas humanos Ano de Conclusão: 2019 Mestrado em Química Medicinal DE ACORDO COM A LEGISLAÇÃO EM VIGOR, NÃO É PERMITIDA A REPRODUÇÃO DE QUALQUER PARTE DESTA TESE/TRABALHO. https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ Universidade do Minho, 30 de abril de 2019 Assinatura:__________________________________________ iii Declaração de integridade Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração.Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. Universidade do Minho, 30 de abril de 2019 Assinatura:__________________________________________ iv Agradecimentos Durante a realização deste trabalho, produzido no âmbito desta tese, contei com o apoio de inúmeras pessoas que direta ou indiretamente contribuíram de uma forma positiva para a elaboração e finalização deste trabalho com êxito. Este projeto embora tenha sido de caráter individual, que resultou de um enorme esforço, coragem e dedicação, assim reconheço um sincero e profundo agradecimento a todos os que me apoiaram e escutaram durante esta etapa da minha vida. Quero manifestar o meu agradecimento, de uma forma especial aos meus colegas de trabalho quer aqueles que trabalharam comigo no laboratório, quer aqueles que trabalhavam noutros laboratórios, pelo companheirismo e apoio que tornou a realização deste trabalho mais leve. Aos meus pais que sempre me apoiaram e incentivaram sempre o meu desenvolvimento intelectual sem criar barreiras e limites na minha educação. Ao meu avô que embora não esteja presente fisicamente foi o grande motivo pela qual eu não desisti desta etapa e lutei para a terminar. À minha família que me apoiou incondicionalmente, mostrando o seu amor, carinho e compreensão durante o período da realização deste projeto. À Professora Doutora Maria Alice Carvalho pela orientação científica desta tese, pelo tempo disponibilizado e pelos ensinamentos que contribuíram para a minha formação cientifica e académica. À Dra. Vânia Azevedo e Dra. Elisa Pinto, pela disponibilidade na aquisição de espetros de RMN e na realização das análises elementares. À Universidade do Minho e ao Centro de Química pelas condições proporcionadas. A todos os que contribuíram para o equilíbrio dos meus dias, os meus sinceros agradecimentos. v Resumo O diaminomaleonitrilo (DAMN), reagente comercial, foi utilizado como precursor de estruturas quer lineares quer heterocíclicas. A reação do DAMN com o ortoformiato de etilo (TEOF) permitiu gerar o (Z)-N-(2-amino-1,2-dicianovinil)formimidato de etilo. Este composto, por reação com aminas primárias permitiu obter as (Z)-N-(2-amino-1,2dicianovinil)formamidinas que ciclizam, em meio básico, para gerar os 5-amino-4cianoformimidoilimidazoles. A reação das (Z)-N-(2-amino-1,2-dicianovinil)formamidinas e dos 5-amino-4cianoformimidoilimidazoles com ortoformiato de etilo permitiu gerar as 6-cianopurinas. As 6-cianopurinas foram usadas como reagente de partida para gerar as 6imidatopurinas por reação com o ião metóxido e estas, por reação com amidrazonas geraram 6-carbohidrazonamidopurinas. As 6-cianopurinas foram também usadas como reagente de partida para gerar novas 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas por reação com hidrazina e 3nitrobenzohidrazida. As 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas foram convertidos em pirimido[5,4-d]pirimidinas por aquecimento na presença de um nucleófilo. vi Abstract Diaminomaleonitrile (DAMN), a commercial reagent, was used as a precursor to generate both, linear and heterocyclic structures. Reaction of DAMN with triethylorthoformate (TEOF) afforded ethyl (Z)-N-(2-amino-1,2-dicyanovinyl) formimidate. This compound, on reaction with primary amines, afforded the (Z)-N-(2amino-1,2-dicyanovinyl)formamidines which cyclize in basic medium to give the 5amino-4-cyanoformimidoylimidazoles. Reaction of the (Z)-N-(2-amino-1,2-dicyanovinyl)formamidines and the 5-amino-4cyanoformimidoylimidazoles with triethylorthoformate allowed to generate 6cyanopurines. The 6-cyanopurines were used as the starting material to generate the 6-imidatopurines by reaction with the methoxide ion. The 6-imidatopurines were reacted with Amidrazones to generate 6-carbohydrazonamidopurines. 6-Cyanopurines were also used as starting material to generate novel 3,4dihydropyrimido[5,4-d]pyrimidines by reaction with hydrazine and 3nitrobenzohydrazide. The 3,4-dihydropyrimido[5,4-d]pyrimidines were converted to pyrimido[5,4-d]pyrimidines by heating in the presence of a nucleophile. vii Índice Agradecimentos ................................................................................................................ iv Resumo .............................................................................................................................. v Abstract ............................................................................................................................ vi Abreviaturas ...................................................................................................................... x I - Introdução .................................................................................................................... 1 1.1 A leishmaniose ........................................................................................................ 2 1.2 Ciclo de vida ............................................................................................................ 3 1.3 Tratamento ............................................................................................................. 5 1.4 Novas moléculas em estudo ................................................................................... 9 IIResultados e Discussão............................................................................................... 13 2.1 Síntese de reagentes de partida ........................................................................... 14 2.1.1 Síntese de 6-cianopurinas ............................................................................. 14 2.1.2 Mecanismos de reação para obtenção dos reagentes de partida ................ 17 2.1.3 Síntese de 6-imidatopurinas .......................................................................... 21 2.1.4 Mecanismo de reação ................................................................................... 23 2.2 Síntese de amidrazonas e 3-nitrobenzohidrazida ................................................ 24 2.2.1 Reação da hidrazina com aldeídos ................................................................ 24 2.2.2 Reação da hidrazina com 3-nitrobenzoato de etilo ...................................... 27 2.3 Caracterização física, analítica e espetroscópica das amidrazonas 49 e da 3nitrobenzohidrazida 52a ............................................................................................. 28 2.3.1 Dados físicos e analíticos das amidrazonas e da 3-nitrobenzohidrazida ...... 28 2.3.2 Espetroscopia de IV (Nujol/cm-1) das amidrazonas 49 e da 3nitrobenzohidrazida 52a ......................................................................................... 30 2.3.3 Espetroscopia de 1H RMN (400MHz, DMSO-d6,  (ppm)) das amidrazonas 49 e da 3-nitrobenzohidrazida 52a.............................................................................. 31 2.3.4 Espetroscopia de 13C RMN (100MHz, DMSO-d6,  (ppm)) das amidrazonas 49 e da hidrazida 52a................................................................................................... 33 2.4 Síntese de 6-carbohidrazinoamidopurinas 53 ...................................................... 35 2.4.1 Reação das imidatopurinas 46 com amidrazonas 49 .................................... 36 viii 2.4.2 Mecanismo da reação ................................................................................... 38 2.5 Caracterização física, analítica e espetroscópica das 6carbohidrazonamidapurinas 53 .................................................................................. 39 2.5.1 Dados físicos e analíticos para as 6-carbohidrazonamidopurinas ................ 39 2.5.2 Espetroscopia de IV (Nujol/cm-1) das 6-carbohidrazonamidopurinas 53 ..... 40 2.5.3 Caracterização espetroscópica de 1H RMN (400MHz, DMSO-d6),  (ppm) das 6-carbohidrazonamidopurinas 53 .......................................................................... 41 2.5.4 Caracterização espetroscópica de 13C RMN (100MHz, DMSO-d6),  (ppm) das 6-carbohidrazonamidapurinas 53 .......................................................................... 43 2.6 Síntese das 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas ............................................... 45 2.6.1 Reação das 6-cianopurinas com a hidrazina e 3-nitrobenzohidrazida .......... 45 2.6.2 Mecanismo de reação ................................................................................... 48 2.7 Caracterização física, analítica e espetroscópica das 3,4-dihidropirimido[5,4d]pirimidinas 56 .......................................................................................................... 49 2.7.1 Dados físicos e analíticos para as 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas 56 49 2.7.2 Espetroscopia de IV (Nujol/cm-1) das 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas 56 ............................................................................................................................ 50 2.7.3 Caracterização espetroscópica de 1H RMN (400MHz, DMSO-d6,  (ppm)) das 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas 56 ............................................................... 51 2.7.4 Caracterização espetroscópica de RMN de 13C (100MHz, DMSO-d6,  (ppm) das 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas 56 ........................................................ 53 2.8 Síntese de pirimido[5,4-d]pirimidinas .................................................................. 56 2.8.1 Conversão das 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas em pirimido[5,4d]pirimidinas ........................................................................................................... 58 2.8.2 Mecanismo de reação ................................................................................... 63 2.9 Caracterização física, analítica e espetroscópica das pirimido[5,4-d]pirimidinas 57 ................................................................................................................................ 64 2.9.1 Dados físicos e analíticos para as pirimido[5,4-d]pirimidinas 57 .................. 64 2.9.2 Espetroscopia de IV (Nujol/cm-1) das pirimido[5,4-d]pirimidinas 57 ............ 65 2.9.2 Caracterização espetroscópica de 1H RMN (400MHz, DMSO-d6,  (ppm)) das pirimido[5,4-d]pirimidinas 57 ................................................................................. 66 4 As moscas da areia do género Phlebotomus ou Leutzomia são vetores comprovados da leishmaniose. Os amastigotos, após serem ingeridos pelo hospedeiro vetor entram na corrente sanguínea do hospedeiro, migram para o intestino deste e transformam-se em promastigota. Após um período de dias a semanas, como resultado da replicação – bipartição – e subsequente migração para o foregut do inseto, os promastigotas obstroem-lhe parcialmente o trato digestivo. O inseto vetor infetado, aquando de uma nova recolha de alimento, deposita os promastigotas na corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado, como por exemplo os caninos, os marsupiais e roedores. Uma vez dentro da corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado, os promastigotas são fagocitados pelas células fagocíticas mononucleares deste, onde são transformados em amastigotos e aí iniciam a replicação através de fagolisossomas modificados – designados como vacúolos arasitoferos – eventualmente, as células do hospedeiro lisam e ocorre a libertação de parasitas livres que se espalham por células saudáveis e tecidos causando lesões e destruição destes. Os amastigotos presentes na corrente sanguínea de um ser humano infetado são ingeridos através da picada de um inseto vetor, e o ciclo de vida repete-se [8]. 5 1.3 Tratamento Atualmente existem perto de 25 compostos e formulações que apresentam efeito antileishmanial, mas apenas alguns são classificados como fármacos contra a leishmaniose em humanos. Contudo, devido à existência de várias espécies causadoras da doença e das várias manifestações clínicas, o tratamento da Leishmaniose é ainda um processo complicado e com algumas limitações [8-9]. Durante as últimas cinco décadas, os antimoniais pentavalentes, têm sido usados para o tratamento das várias formas de manifestação da leishmaniose, e ainda nos dias de hoje são usados como primeira linha de tratamento contra este parasita [10]. Os primeiros antimoniais usados contra a Leishmaniose foram Estibogluconato de Sódio 2, comercialmente conhecido como Pentatostan, e o Antimoniato de meglumina 1, conhecido como Glucantime. Estes foram considerados e ainda são a primeira linha de tratamento contra leishmaniose, apresentando um espetro de ação contra todas as formas conhecidas de leishmaniose [11-12]. Fig. 2 – Estruturas dos antimoniais usados na primeira linha de tratamento Surgiu mais tarde um novo antimonial, o antimonial pentavalente (Sbv), considerado uma pró-droga do fármaco antimónio trivalente (Sbiii) 3, e que parece ser capaz de matar o parasita, de acordo com a literatura [13-14]. Contudo, estudos realizados mostraram que estes fármacos apresentam elevada toxicidade causando vários efeitos secundários 1Antimoniato de meglumina 2Estibogluconato de sódio 6 em vários órgãos do ser humano, além de que o parasita desenvolveu resistência a este tipo de fármacos [15-16]. 3 Fig. 3 – Estrutura do Sbiii 3 Dado o aumento da resistência e a elevada taxa de toxicidade, por parte destes últimos, foi necessário o desenvolvimento de novos fármacos e tratamentos alternativos que apresentassem menos efeitos secundários para o ser humano [17]. A Anfotericina B 4, surgiu como um fármaco alternativo aos antimoniais apresentando eficácia elevada contra a leishmaniose, porém mostrou também elevada toxicidade [18]. 4 Fig. 4 – Estrutura da Anfotericina B 4 A Miltefosina 5, uma alquilfosfocolina, desenvolvida originalmente para o tratamento do cancro, mostrou também ter efeito anti-leishmanial. Foi usada contra a leishmaniose visceral, mas como os fármacos anteriores também apresentava sérios efeitos secundários [19]. 5 Fig. 5 – Estrutura da Miltefosina 5 7 A Paromomicina 6, é um antibiótico aminoglicosídeo com atividade antibacteriana e atividade contra a leishmaniose visceral e a leishmaniose cutânea. O parasita mostrou pouca resistência ao fármaco contudo ainda não há dados quanto aos efeitos secundários que este provoca no organismo humano [20-21]. 6 Fig. 6 – Estrutura da Paromomicina 6 A Sitamaquina 7, uma 8-aminoquinolina, foi desenvolvido exclusivamente para o tratamento da leishmaniose visceral. Crê-se que este fármaco afeta o crescimento do parasita e os efeitos secundários e a taxa de toxicidade estão em estudo [22-23]. 7 Fig. 7 – Estrutura da Sitamaquina 7 A Pentamidina 8, também usada como segunda linha de tratamento, tem a sua maior utilidade contra a leishmaniose visceral. Este fármaco é usado quando os antimoniais pentavalentes, primeira linha de tratamento, falham devido a resistência por parte do parasita. Embora seja um fármaco eficaz apresenta uma elevada taxa de toxicidade causando hipoglicemia, nefrotoxicidade e hipotensão, entre outros efeitos secundários [24]. 8 8 Fig. 8 – Estrutura da Pentamidina 8 9 1.4 Novas moléculas em estudo O fraco conhecimento da doença e a falta de políticas eficazes bem como a elevada toxicidade dos fármacos utilizados contra a leishmaniose são os principais obstáculos no combate à doença. Assim, a procura de novos compostos para a erradicação da leishmaniose continua a ser uma necessidade. Na literatura têm vindo a ser reportadas estruturas heterocíclicas como novos compostos com potencial para o combate a parasitas, em particular a leishmaniose. Algumas dessas estruturas têm origem em produtos naturais outras são de origem sintética. Alguns dos compostos que apresentaram propriedades antiparasitárias foram as quinonas, as quinolinas e os terpenóides [25]. As quinonas dividem-se em três grupos devido aos diferentes sistemas aromáticos, benzoquinonas 9, naftoquinonas 10 e antraquinonas 11 [26]. Fig. 9 – Estruturas da benzoquinona 9, naftoquinonas 10 e antraquinonas 11 Dos derivados de quinonas, as naftoquinonas 10 e as antraquinonas 11, foram os que apresentaram maior atividade antiparasitária [26]. Os derivados das naftoquinonas 10 que mostraram ter maior atividade antiparasitária, foram os compostos 12-15 devido a estes terem a capacidade de se ligarem à topoisomerase I do parasita, inibindo a sua atividade catalítica [27]. 12 13 14 15 10 Fig. 10 – Estruturas 1,4 naftoquinonas 12-15 Entre os derivados de antraquinonas que apresentaram atividade contra a leishmaniose temos como exemplo os compostos 16 e 17. A presença da função aldeído e o grupo hidroxilo mostraram ser fundamentais para a atividade antiparasitária destes compostos [28-29]. 16 17 Fig.11 – Derivados de antraquinonas 16 e 17. Alguns derivados de quinolina 20-22, também mostraram ter atividade contra a leishmaniose. O composto 2-n-propilquinolina 20 tem a capacidade de quando administrado individualmente suprimir 99% dos parasitas do fígado do hospedeiro. Os outros derivados 21-22 mostraram também ser bastantes eficazes provocando a supressão do parasita [30-31]. 18 19 20 Fig.12 – Estruturas dos derivados de quinolinas 18-20 O Espintanol 21, mostrou ter atividade antiparasitária contra 12 espécies de leishmaniose e o Kudtriol 22, outro derivado dos terpenóides, também mostrou ser bastante ativo. Estudos SAR efetuados, mostraram que a presença do grupo hidroxilo era essencial para a sua atividade anti-leishmanial [32-33]. 11 21 22 Fig.13 – Estruturas do Espitanol 21 e Kudtriol 22 Os sais de 1,2,3-triazoles 23, compostos de origem sintética, têm vindo a ser estudados como estruturas privilegiadas em química medicinal [5] e também eles mostraram atividade contra a leishmaniose, embora se desconheça o mecanismo de ação [36]. 23 Fig. 14 – Estrutura do sal de 1,2,3-triazole 23 Dos vários derivados sintetizados, os compostos 24-26 mostraram valores de SI50 82200M. Estes compostos mostraram ser mais eficazes, ter menos efeitos secundários e uma toxicidade baixa, do que os fármacos já existentes para o tratamento da leishmaniose [5]. 24 25 26 Fig.15 – Estruturas dos compostos com atividade anti-leishmanial 24-26 Os flavonoides 27-28, também mostraram ter potencial contra a leishmaniose. Estes compostos mostraram ter uma capacidade de interromper a atividade do parasita no macrófago, do que fármacos já existentes no combate á leishmaniose [8]. 12 27 28 Fig.16 – Estrutura dos flavonoides 27 e 28 Apesar dos avanços relativamente aos fármacos encontrados e testados contra a leishmaniose, esta continua a ser uma epidemia que afeta com maior incidência os países em desenvolvimento [5] e por isso é necessário que a comunidade científica continue ativamente a busca de novos fármacos. Nesta dissertação descreve-se a síntese de novos compostos heterocíclicos para serem avaliados contra a leishmaniose. 13 IIResultados e Discussão 20 Esquema 9 21 2.1.3 Síntese de 6-imidatopurinas As 6-imidatopurinas 46, estruturas altamente versáteis, já haviam sido sintetizadas e a sua reatividade estudada pelo nosso grupo de investigação. Estes compostos 46 são bastante utilizados como reagentes de partida para gerar novos compostos heterocíclicos [43-44]. A síntese de novos derivados de 6-imidatopurinas 46a-c, foi efetuada reproduzindo os procedimentos experimentais anteriormente utilizados pelo nosso grupo (esquema 10) [43]. Esquema 10 Primeiramente fez-se reagir a 6-cianopurina 34a com metanol (MeOH), na presença de DBU, à temperatura de 19oC. A reação foi monitorizada e ao fim de três dias o TLC mostrou ausência de reagente de partida 34. Assim sendo a reação foi considerada terminada, o sólido foi filtrado e lavado com metanol e éter etílico. O composto isolado foi identificado, após análise do espetro de 1H RMN como sendo apenas reagente de 22 partida 34a. Embora se tenha considerado a reação terminada após análise do TLC, como quer o reagente de partida quer o produto apresentam manchas na mesma posição e incolores, a interpretação do resultado foi errada, por isso repetiu-se a reação, variando o volume de solvente, e a quantidade de catalisador adicionado, mas foram obtidas misturas de 6-imidatopurina 46a com reagente 34a em diferentes proporções, (87:13), (43:57) e (10:90) (esquema 10). A reação foi então efetuada à temperatura de 25oC e aumentou-se o tempo de reação de 3 para 10 dias. Ao fim desse tempo, isolouse um sólido que, após análise do espetro de 1H RMN permitiu confirmar a presença de apenas 6-imidatopurina 46a, obtida com bom rendimento (esquema 10). Com base no resultado obtido na síntese da 6-imidatopurina 46a, realizou-se a síntese das 6imidatopurinas 46b-c, em condições similares (esquema 10). Após 8 e 6 dias de reação respetivamente, os produtos isolados foram identificados como 6-imidatopurinas 46bc após análise dos espetros de 1H RMN. 23 2.1.4 Mecanismo de reação O metanol na presença de DBU é desprotonado e gera o ião metóxido. Este por sua vez, na presença de uma 6-cianopurina 34, ataca o grupo nitrilo para gerar a 6-imidatopurina 46 (esquema 11). Esquema 11 24 2.2 Síntese de amidrazonas e 3-nitrobenzohidrazida 2.2.1 Reação da hidrazina com aldeídos As amidrazonas de estrutura 49 são compostos que serão usados na síntese de produtos finais e que não se encontram disponíveis comercialmente, sendo necessária a sua síntese. Para se obterem os compostos desejados fizeram-se reagir os aldeídos 48a-c e 48e com hidrazina (NH2NH2) (1,1 equiv.) usando etanol como solvente, à temperatura ambiente (esquema 12). Esquema 12 As reações foram monitorizadas por TLC, quando se verificou a ausência do reagente de partida, consideram-se terminadas. Os sólidos foram filtrados e lavados com etanol (EtOH) e éter etílico, e por análise dos espetros de IV, 1H RMN e 13C RMN, os compostos isolados foram identificados como amidrazonas 49a-c e 49e, obtidos com excelentes rendimentos (esquema 12). Fez-se também reagir o aldeído 48d com hidrazina (1,1 equiv.), em etanol com catálise ácida (H2SO4) (esquema 13). O H R 48a R=4-HOC6H4 b R=3,4-(HO)2C6H3 c R=4-HO-3-OMeC6H3 e R= 3,4-(OMe)2C6H3 49a R=4-HOC6H4; 93,4% b R=3,4-(HO)2C6H3; 95% c R=4-HO-3-OMeC6H3; 96,2% e R= 3,4-(OMe)2C6H3; 70,4% R HNNH2 NH2NH2.H2O (1,1 eq.); EtOH; t.a 25 Esquema 13 Seguiu-se a reação por TLC até se considerar terminada. Filtrou-se o sólido que havia em suspensão e lavou-se com água e umas gotas de éter etílico. Após análise do espetro de 1H RMN do sólido isolado foi possível identificar uma mistura de 49d e 50d numa proporção (47:53) (esquema 13). Este resultado mostrou que a interpretação feita do TLC estava incorreta. Verificou-se que as manchas de reagente e produto, embora diferentes, apareciam sobrepostas. Sendo assim, repetiu-se a reação usando como solvente o metanol e ausência de catálise ácida. Monitorizou-se a reação por TLC e após 15 minutos, considerou-se terminada. Isolou-se um sólido, que após analisado o espetro de 1H RMN foi possível identificá-lo como sendo o composto 50d, isolado com um rendimento de 18% (esquema 13). Tendo em conta o resultado obtido, decidiu-se repetir de novo a reação, mas aumentando os equivalentes de hidrazina (3 equiv.). Após 5 dias deu-se a reação por terminada. O sólido em suspensão foi filtrado e lavado com etanol e éter etílico e por análise dos dados espetroscópicos de IV, 1H RMN e 13C RMN, identificou-se o composto como 49d, obtido com bom rendimento (esquema 13). Também se fez reagir, o aldeído 48f com a hidrazina (1,1 equiv.) em etanol (esquema 14). Esquema 14 A reação foi seguida por TLC e após 5 dias, analisando por TLC a reação constatou-se a ausência da mancha do reagente de partida 48f. O sólido em suspensão foi filtrado e lavado com etanol e éter etílico. Por análise do espetro de 1H RMN foi possível identificar uma mistura de amidrazona 49f e dímero 50f numa proporção de 77,5:22,5. Com base neste e nos resultados obtidos anteriormente, a reação foi repetida, aumentando-se a quantidade de nucleófilo (hidrazina) para 3 equivalentes. Após 2 horas de reação, esta 26 foi considerada terminada, por análise do TLC, que foi levado a câmara de iodo para ser mais fácil a visualização no caso de haver manchas sobrepostas. O sólido foi filtrado, lavado com etanol e éter etílico. Analisados os dados espetroscópicos de IV, 1H RMN e 13C RMN do sólido obtido, este foi identificado como o composto 49f (esquema 14). Por último, fez-se também reagir o aldeído 48g com a hidrazina (1,1 equiv.) em etanol, à temperatura ambiente (esquema 15). Esquema 15 Numa primeira reação, após 45 horas, considerou-se esta terminada por análise do TLC, que mais uma vez induziu em erro a interpretação da reação devido á sobreposição das manchas o que se verificou após análise do espetro de 1H RMN que identificou-se o sólido isolado como uma mistura de 49g e 50g numa proporção de 86:14 (esquema 15). Como anteriormente, já haviam sido obtidos resultados similares, decidiu-se aumentar a quantidade de hidrazina (nucleófilo) para 3 equivalentes. Após a adição da hidrazina ao aldeído houve a precipitação imediata de um sólido e por TLC existia apenas um único composto. O sólido precipitado foi filtrado, lavado com etanol e éter etílico e por análise dos dados espetroscópicos de IV, 1H RMN e 13C RMN foi identificado como 49g (esquema 15). 27 2.2.2 Reação da hidrazina com 3-nitrobenzoato de etilo Para a síntese da 3-nitrobenzohidrazida 52a teve-se como reagente inicial o éster 51a correspondente. A reação da hidrazina monohidratada com o éster 51a foi efetuada na presença de catálise ácida (H2SO4), em etanol (esquema 16). Esquema 16 A mistura reacional foi colocada a 25oC, sob uma agitação eficiente, e a reação foi monitorizada por TLC. Quando se verificou a ausência de reagente 51a considerou-se a reação terminada. O sólido em suspensão foi filtrado e lavado com água destilada. O composto isolado, obtido com bom rendimento, foi identificado como 3nitrobenzohidrazida 52a após análise dos dados espetroscópicos de IV, 1H RMN e 13C RMN. 28 2.3 Caracterização física, analítica e espetroscópica das amidrazonas 49 e da 3nitrobenzohidrazida 52a 2.3.1 Dados físicos e analíticos das amidrazonas e da 3-nitrobenzohidrazida Os dados analíticos apoiam a fórmula empírica dos compostos 49 e 52a, embora não tenha sido possível obter análises elementares corretas para os compostos 49b, 49d-e e 49g. Os dados de espetrometria de massa permitiram confirmar as fórmulas moleculares dos compostos. 29 Tabela 1 - Dados físicos e analíticos das amidrazonas 49 e da hidrazida 52a Compost o R  (%) p. f. (oC) Fórmula Molecular; Mr C; H; N (%) Valores obtidos (Valores calculados) m/z 49a 93, 4 187188 C7H8N2O 136,15 61,75; 5,92; 20,58 (61,65; 6,00; 20,24) 136,96 [M+1]+ (74,09%) 49b 95 167168 C7H8N2O2 152,15 a) (51,94; 5,20; 17,06) 152,96 [M+1]+ (72,51%) 49c 94 105106 C8H10N2O2 166,18 57,82; 6,07; 16,86 (57,96; 6,16; 16,56) 166,96 [M+1]+ (95,37%) 49d 65 155156 C7H7ClN2 154,60 a) (55,85; 3,74; 11,29) 156,99 [M+2]+ (100%) 49e 60, 4 181182 C9H12N2O2 180,20 a) (57,48; 6,18; 9,23) 181,02 [M+1]+ (79,35%) 49f 71 115116 C10H14N2O3 210,23 57,13; 6,71; 13,33 (57,20; 6,68; 13,36) 233,04 [M+23]+ 49g 89 189190 C9H12N2O3 196,20 a) (49,91; 5,78; 7,71) b) 52a 99 145146 C7H7N3O3 181,15 46,41; 3,90; 23,20 (46,00; 4,06; 23,66) 182,02 [M+1]+ (2,48%) 180,04 [M-1]- (100%) a) Os valores experimentais de análise elementar ainda não se encontram disponíveis à data da escrita deste trabalho b) Não foi possível obter os valores de massa do composto 49g 36 2.4.1 Reação das imidatopurinas 46 com amidrazonas 49 Com base em resultados descritos anteriormente na literatura, [44-45] fez-se reagir as 6-imidatopurinas 46 com as amidrazonas 49 de acordo com o esquema 19. Esquema 19 Assim, começou-se por reagir a 6-imidatopurina 46b com 1,5 equivalentes de amidrazona 49a e 49c e a 6-imidatopurina 46c com a amidrazona 49b em DMSO com catálise ácida (H2SO4) à temperatura ambiente (esquema 19, Método A). Seguiram-se as reações por TLC e após 25 minutos a 1 dia de reação, o TLC mostrou ausência de reagente de partida 46. Ás misturas reacionais foi adicionada água, induzindo a precipitação de sólido. Os sólidos foram filtrados, lavados com água e umas gotas de éter etílico. Por análise dos dados espetroscópicos de IV, 1H RMN e 13C RMN, foi possível a identificação dos compostos como 6-carbohidrazonamidapurina 53c-d e g. Os compostos 53c-d foram obtidos com rendimentos baixos devido à solubilidade destes no meio reacional, contudo 53g foi isolado com um bom rendimento devido à sua insolubilidade no meio reacional. Fez-se também reagir a 6-imidatopurina 46c com a amidrazona 49a nas condições acima descritas. Por análise do espetro de 1H RMN do sólido isolado, identificou-se uma mistura de 49a com 53f numa proporção de 21:79. A presença de 49a no sólido isolado deve-se à insolubilidade deste reagente no solvente usado para o isolamento do 37 produto. Numa tentativa de purificação do produto, o sólido foi sujeito a um processo de recristalização, contudo foi isolado de novo uma mistura dos dois compostos. Efetuou-se também a reação da 6-imidatopurina 46c com a amidrazona 49c. Esta reação foi realizada três vezes, e em todas as tentativas foram isolados sólidos cuja análise por 1H RMN mostrou tratar-se misturas de produto 53e com a amidrazona 49c e uma impureza desconhecida, em diferentes proporções (esquema 19). Também nestes casos se tentou purificar o produto por recristalização, contudo foram obtidas novamente misturas. Considerando os resultados obtidos nestas últimas reações e a solubilidade das amidrazonas 49a-b, decidiu-se efetuar a reação da 6-imidatopurina 46a com as amidrazonas 49a-b, segundo o procedimento também já descrito anteriormente na literatura [44]. Sendo assim, fez-se reagir 46a com as amidrazonas 49a-b em excesso (1,05 equiv.), usando como solvente o acetonitrilo (CH3CN) e como catalisador o cloreto de anilíinio (PhNH3Cl) (esquema 19, Método B). As reações foram seguidas por TLC, e quando se verificou a ausência de reagente 49a considerou-se a reação terminada. Os sólidos foram filtrados diretamente do meio reacional, lavados com CH3CN e, por fim, com umas gotas de éter etílico. Após a análise dos espetros de IV, 1H RMN e 13C RMN os sólidos isolados foram identificados como 6-carbohidrazonamidas 53a-b, com bons rendimentos devido ao produto ser pouco solúvel no meio reacional (esquema 19). Como pelo Método A não foi possível obter um produto puro das reações da 6imidatopurina 46c com as amidrazonas 49a e 49c, estas reações foram realizadas também seguindo as condições reacionais do Método B. Seguiu-se as reações por TLC e após 2-3 dias de reação verificou-se a ausência de reagente de partida 46. Os sólidos foram isolados diretamente do meio reacional e lavados com CH3CN e umas gotas de éter etílico. Quando analisados os espetros de IV, 1H RMN e 13C foi possível identificar os sólidos como 6-carbohidrazonamidopurinas 53e-f. Os produtos foram obtidos com rendimentos moderados, uma vez que estes são um pouco solúveis no meio reacional (esquema 19). 38 2.4.2 Mecanismo da reação As 6-carbohidrazonamidapurinas 53, são formadas a partir da reação das 6imidatopurinas 46 com amidrazonas 49. As 6-imidatopurinas 46 na presença de catálise ácida, podem sofrer protonação na função imidato, ficando esta ativada para o ataque de um nucleofílico 49. O nitrogénio terminal da amidrazona 49, ataca o carbono eletropositivo para gerar um intermediário 55, após eliminação de metanol. Este último em solução evolui para o composto final, a 6-carbohidrazonamidopurina 53 (esquema 20). Esquema 20 39 2.5 Caracterização física, analítica e espetroscópica das 6-carbohidrazonamidapurinas 53 2.5.1 Dados físicos e analíticos para as 6-carbohidrazonamidopurinas Os dados de espetrometria de massa permitiram confirmar as fórmulas moleculares dos compostos 53. Tabela 5 - Dados físicos e analíticos das 6-carbohidrazonamidapurinas 53 Composto R R1  (%) P.f. (oC) Fórmula molecular; Mr C; H; N; S (%) Valores obtidos (Valores calculados) m/z 53a 80 226-227 C20H16N6O3 389,37 a) (58,61; 3,88; 25,18) 390,16 [M+1]+ (100%) 53b 73 247-248 C20H16N6O2 373,37 a) (61,12; 4,05; 26,26) 374,15 [M+1]+ (100%) 53c 29 245-246 C20H16N6O2 373,37 a) (61,12; 4,05; 26,26) 374,16 [M+1]+ (100%) 53d 15 154-155 C21H18N6O3 403,39 a) (59,55; 4,25; 24,31) 404,17 [M+1]+ (100%) 53e 59 220-221 C21H18N6O2 401,42 a) (62,83; 4,77; 24,42) 402,21 [M+1]+ (100%) 53f 43 249-250 C21H18N6O 371,40 a) (64,68; 4,61; 26,40) 372,18 [M+1]+ (100%) 53g 89 190-191 C22H20N6O2 387,39 a) (62,01; 4,42; 25,31) 388,18 [M+1]+ (100%) a) Os valores experimentais de análise elementar ainda não se encontram disponíveis à data da escrita deste trabalho 40 2.5.2 Espetroscopia de IV (Nujol/cm-1) das 6-carbohidrazonamidopurinas 53 Os compostos 53 apresentam nos espetros de IV bandas de absorção com intensidades variáveis com valores compreendidos entre 3089 a 3475 cm-1 que são sinais que podem ser atribuídos às vibrações de estiramento dos sinais N-H que se apresentam a valores mais altos e C-H que se apresentam com valores mais baixos. A região compreendida entre os 1514 e 1694 cm-1 é caracterizada por um grupo de bandas de intensidade variável, que resulta das vibrações de estiramento C=C e C=N e também das vibrações de deformação angular das ligações N-H (tabela 6). Tabela 6 - Caracterização espetroscópica de IV (Nujol/cm-1) das 6carbohidrazonamidopurinas 53 Composto R R1 3500-3000 1700-1500 53a 3443 (i); 3328 (m); 3265 (m) 1682 (i); 1584 (m); 1542 (m); 1509 (i) 53b 3441 (i); 3326 (m); 3095 (f) 1672 (i); 1592 (i); 1508 (f) 53c 3468 (i); 3339 (m) 1684 (m); 1625 (i); 1600 (f); 1575 (i); 1514(i) 53d 3446 (i); 3286 (m); 3089 (f) 1630 (m); 1583 (i); 1514 (i) 53e 3452 (m); 3337 (i) 1613 (i); 1577 (f); 1565 (i); 1519 (i) 53f 3475 (i); 3321 (m); 3094 (f) 1622 (i); 1588 (f); 1564 (i); 1514 (i) 53g 3553 (i); 3489 (m) 1607 (i); 1591 (i); 1564 (i); 1518 (i) 2.5.3 Caracterização espetroscópica de 1H RMN (400MHz, DMSO-d6),  (ppm) das 6-carbohidrazonamidopurinas 53 Nos espetros de 1H RMN é possível identificar dois singletos que correspondem aos protões C2-H e C8-H, com desvios químicos compreendidos  9,01-9,23 ppm e 8,93-9,30 ppm, respetivamente. Foi possível identificar também um singleto correspondente ao C10-H com um valor de desvio químico compreendido  8,36-8,65 ppm. A função amina aparece no espetro como um singleto largo a desvios químicos compreendidos  7,147,26 ppm. Este sinal não aparece nos espetros dos compostos 53a-b e 53f, cujos espetros foram realizados numa mistura de DMSO e TFA (tabela 7). Tabela 7 - Caracterização espetroscópica de 1H RMN das 6-carbohidrazonamidapurinas 53 (400MHz, DMSO-d6),  (ppm) Composto R R1 C2-H C8-H C10-H R R1/ NH2 53a 9,12 (s,1H) 9,13 (s,1H) 8,42 (s,1H) 6,93 (ddd, 1H, J 0.8, 2, 8Hz, Hp) 7,32 (dd, 1H, J 2, 8Hz, Ho) 7,36 (t, 1H, J 2.4Hz, Ho’) 7,44 (t, 1H, J 8Hz, Hm) 10,04 (sl, 1H, OH) 6,83 (d, 1H, J 8Hz, Hm’’) 7,22 (dd, 1H, J 2, 8Hz, Ho’’) 7,40 (d, 1H, J 2Hz, Ho’’’) 9,62 (sl, 1H, OH) 53b 9,23 (s,1H) 9,30 (s,1H) 8,65 (s,1H) 6,96 (ddd, 1H, J 0.8, 2, 8.4Hz, Hp) 7,31 (ta, 1H, J 2HZ, Ho) 7,36 (dd, 1H, J 2, 8.4Hz, Ho’) 7,44 (t, 1H, J 8.4Hz, Hm) 10,19 (s, 1H, OH) 6,90 (d, 2H, J 8.8Hz, Hm’’) 7,87 (d, 2H, J 8.8Hz, Ho’’) 10,37 (sl, 1H, OH) 53c 9,01 (s,1H) 8,96 (s,1H) 8,43 (s,1H) 6,98 (d, 2H, J 8.8Hz, Hm) 7,64 (d, 2H, J 8.8Hz, Ho) 9,92 (sl, 1H, OH) 6,84 (d, 2H, J 8.8Hz, Hm’’) 7,19 (sl, 2H, NH2) 7,78 (d, 2H, J 8.8Hz, Ho’’) 42 53d 9,01 (s,1H) 8,93 (s,1H) 8,42 (s,1H) 6,98 (d, 2H, J 8.8Hz, Hm) 7,64 (d, 2H, J 8.8Hz, Ho) 9,87 (sl, 1H, OH) 6,84 (d, 1H, J 8Hz, Hm’’) 7,24 (dd, 1H, J 2, 8Hz, Ho’’) 7,26 (sl, 2H, NH2) 7,62 (d, 1H, J 3.6Hz, Ho’’’) 53e 9,04 (s,1H) 9,03 (s,1H) 8,42 (s,1H) 2,40 (s, 3H, CH3) 7,45 (d, 2H, J 8.4Hz, Hm) 7,78 (d, 2H, J 8.4Hz, Ho) 3,86 (s, 3H, OMe) 6,84 (d, 1H, J 8Hz, Hm’’) 7,26 (dd, 3H, J 1.6, 8Hz, Ho’’+NH2) 7,63 (d, 1H, J 1.6Hz, Ho’’’) 9,47 (sl, 1H, OH) 53f 9,04 (s,1H) 9,03 (s,1H) 8,45 (s,1H) 2,39 (s, 3H, CH3) 7,43 (d, 2H, J 8.4Hz, Hm) 7,76 (d, 2H, J 8.4Hz, Ho) 6,85 (d, 2H, J 8.4Hz, Hm’’) 7,78 (d, 2H, J 8.4Hz, Ho’’) 9,97 (sl, 1H, OH) 53g 9,04 (s,1H) 9,03 (s,1H) 8,36 (s,1H) 2,40 (s, 3H, CH3) 7,44 (d, 2H, J 8.4Hz, Hm) 7,79 (d, 2H, J 8.4Hz, Ho) 6,80 (d, 1H, J 8.4Hz, Hm’’) 7,14 (sl, 2H, NH2) 7,19 (dd, 1H, J 2, 8Hz, Ho’’) 7,38 (d, 1H, J 2Hz, Ho’’’) 9,50 (sl, 1H, OH) 2.5.4 Caracterização espetroscópica de 13C RMN (100MHz, DMSO-d6),  (ppm) das 6carbohidrazonamidapurinas 53 Os espetros de HMQC dos compostos 53 mostram um acoplamento direto entre os protões C2-H e C8-H com os carbonos correspondestes C2 e C8, estes carbonos aparecem com desvios químicos compreendidos  151,72-152,22 ppm e 146,34-148,50 ppm, respetivamente. Através do espetro de HMBC foi possível a atribuição dos sinais de C4, C5 e C6 que se apresentam com desvios químicos compreendidos  152,46-153,00 ppm, 131,09-131,94 ppm e 142,11-148,93, respetivamente. Os carbonos C9 e C10 aparecem a desvios químicos mais altos com valores correspondidos  154,35-154,93 ppm e 155,59156,43 ppm (tabela 8). Fig.17 – Correlações em HMBC das 6-carbohidrazonamidapurinas 53 Tabela 8 - Caracterização espetroscópica de 13C RMN das 6carbohidrazonamidapurinas 53c-e e 53g(100MHz, DMSO-d6),  (ppm)) e das 53a-b e 53f (100MHz, DMSO-d6-TFA),  (ppm)) Composto R R1 C2/C8 C9/C10 C-núcleo purina R R1 53a 151,99 147,26 154,44 156,43 131,63 (C5) 148,93 (C6) a) 152,65 (C4) 110,86 (Co’) 114,15 (Co) 115,48 (Cp) 130,57 (Cm) 134,95 (Ci) 158,33(Cm’) 114,73 (Co’’’) 115,59 (Cm’’) 121,81 (Co’’) 125,90 (Ci’) 145,66 (Cm’’’) 148,93 (Cp’) a) 53b 152,22 148,50 154,35 156,36 131,94 (C5) 142,11 (C6) 153,00 (C4) 111,00 (Co’) 114,27 (Co) 115,82 (Cp) 130,68 (Cm) 134,69 (Ci) 158,46(Cm’) 115,96 (Cm’’) 124,29 (Ci’) 130,96 (Co’’) 161,21 (Cp’) 44 53c 151,72 146,60 154,88 155,59 131,09 (C5) 148,49 (C6) 152,59 (C4) 115,59 (Cm) 125,48 (Ci) 125,70 (Co) 157,50 (Cp) 115,23 (Cm’’) 126,38 (Ci’) 129,89 (Co’’) 159,63 (Cp’) 53d 151,79 146,69 154,98 155,86 131,15 (C5) 148,57 (C6) 152,66 (C4) 116,01 (Cm) 125,53 (Ci) 125,79 (Co) 157,56 (Cp) 55,78 (OMe) 110,42 (Co’’’) 115,34 (Cm’’) 123,12 (Co’’) 126,89 (Ci’) 148,03 (Cm’’’) 149,23 (Cp’) 53e 151,87 146,40 154,93 155,88 131,35 (C5) 148,50 (C6) 152,51 (C4) 20,73 (CH3) 123,73 (Co) 130,09 (Cm) 131,75 (Ci) 138,00 (Cp) 55,77 (OMe) 110,43 (Co’’’) 115,33 (Cm’’) 123,16 (Co’’) 126,87 (Ci’) 148,02 (Cm’’’) 149,24 (Cp’) 53f 151,76 146,34 154,89 155,72 131,32 (C5) 148,62 (C6) 152,46 (C4) 20,70 (CH3) 123,65 (Co) 130,04 (Cm) 131,80 (Ci) 137,93 (Cp) 115,60 (Cm’’) 126,40 (Ci’) 129,95 (Co’’) 159,69 (Cp’) 53g 151,87 146,39 154,71 156,18 131,32 (C5) 148,59 (C6) 152,51 (C4) 20,73 (CH3) 123,80 (Co) 130,17 (Cm) 131,74 (Ci) 138,00 (Cp) 114,48 (Co’’’) 115,56 (Cm’’) 121,28 (Co’’) 126,83 (Ci’) 145,55 (Cm’’’) 148,26 (Cp’) a) Os carbonos C6 e Cp’ do composto 53a aparecem sobrepostos a  148,93 ppm 45 2.6 Síntese das 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas Durantes estes últimos anos, o nosso grupo de investigação desenvolveu métodos de síntese que permitem gerar as 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas 56 por reação de 6-cianopurinas 34 com nucleófilos de nitrogénio [44, 46-48]. O método de síntese desenvolvido é bastante abrangente, pois permite gerar uma grande variedade de compostos 56 com diferentes substituintes e também alguns compostos 57. Não obstante, as reações devem ser controladas com cuidado, dado que podem existir reações competitivas gerando produtos como 53 (esquema 21). Esquema 21 2.6.1 Reação das 6-cianopurinas com a hidrazina e 3-nitrobenzohidrazida Tendo em atenção os resultados apresentados na literatura fez-se reagir as 6cianopurinas 34a-c com dois nucleófilos de azoto, a hidrazina e a 3-nitrobenzohidrazida 52a (esquema 22). Esquema 22 As reações das 6-cianopurinas 34a e 34c com a hidrazina ocorreram em etanol com um excesso de hidrazina (2.5 equiv.) à temperatura de 25oC (esquema 22). As reações foram 52 56d 8,68 (s,1H) 8,73 (s,1H) 8,56 (ddd, 1H, J 0.8, 2.4, 8Hz, Hp) 7,16 (t, 1H, J 8Hz, Hm) 7,34 (dd, 1H, J 2, 8Hz, Ho) 7,49 (ta, 1H, J 2Hz, Ho’) 7,69 (t, 1H, J 8Hz, Hm’’) 8,28 (ddd, 1H, J 1.2, 2.4, 8Hz, Hp’) 8,54 (dt, 1H, J 1.2, 7.6Hz, Ho’’) 8,92 (dd, 1H, J 1.6, 2.4 Hz, Ho’’’) 9,51 (sl, 2H, 4-NH+OH) 10,14 (s, 1H, 8-NH) 56e 8,63 (s,1H) 8,65 (s,1H) 6,79 (d, 2H, J 8.8Hz, Hm) 7,66 (d, 2H, J 8.8Hz, Ho) 7,70 (t, 1H, J 8Hz, Hm’’) 8,29 (dt, 1H, J 1.2, 8Hz, Hp’) 8,54 (d, 1H, J 7.6Hz, Ho’’) 8,91 (ta, 1H, J 2Hz, Ho’’’) 10,04 (sl, 2H, 4-NH+OH) 10,15 (s, 1H, 8-NH) 56f 8,64 (s,1H) 8,67(s,1H) 2,31 (s, 3H, CH3) 7,20 (d, 2H, J 8.4Hz, Hm) 7,81 (d, 2H, J 8Hz, Ho) 7,68 (t, 1H, J 8Hz, Hm’’) 8,26 (ddd, 1H, J 0.8, 2.4, 8Hz, Hp’) 8,40 (s, 1H, 4-NH) 8,54 (d, 1H, 7.6Hz, Ho’’) 8,91 (ta, 1H, J 2Hz, Ho’’’) 10,04 (s, 1H, 8-NH) 53 2.7.4 Caracterização espetroscópica de RMN de 13C (100MHz, DMSO-d6,  (ppm) das 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas 56 A partir dos espetros de 13C RMN dos compostos 56 foi possível recolher o desvio químico a que apareciam todos os carbonos presentes em cada um dos compostos. A análise conjunta dos espetros de HMQC e HMBC permitiu fazer a atribuição dos sinais aos carbonos. O espetro de HMQC mostrou uma correlação direta entre o C2-H e o C6-H, aparecendo C2 com desvios químicos  147,79-148,28 ppm e C6  154,80-155,98 ppm. No HMBC foi possível observar o acoplamento entre o C6-H com os carbonos C8 e C4a, com desvios químicos  156,35-156,62 ppm e  133,42-139,11 ppm respetivamente (Figura 18). Verificou-se também o acoplamento entre C2-H e os carbonos C4 e C8a. com desvios químicos  152,33-156,17ppm e  125,19-127,80ppm. Em alguns casos foi possível observar o acoplamento entre o 8-NH e os carbonos C8 e C8a. Nos espetros com a função hidrazida foi verificado um pico com desvio químico por volta de  167 ppm correspondente ao carbono C=O. Fig.18 – Correlações em HMBC das 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas 53 54 Tabela 12 - Caracterização espetroscópica de 13C RMN das 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas 56 (100MHz, DMSO-d6,  (ppm) Compost o R R1 C2 C6 C8/C4 C4a/C8a R R1/C9/Ci’ 56a H 148,24 154,80 156,54 156,08 138,16 125,49 108,34 (Co’) 110,79 (Cp) 112,14 (Co) 129,18 (Cm) 139,58 (Ci) 157,48 (Cm’) 56b 147,93 154,98 156,60 156,17 137,81 125,19 114,91 (Cm) 123,41 (Co) 129,19 (Ci) 153,95 (Cp) 56c 148,28 154,90 a) 156,62 a) 20,53 (CH3) 121,45 (Co) 128,96 (Cm) 132,75 (C-CH3) 136,06 (Ci) 56d 148,00 155,98 156,54 152,47 139,11 127,63 109,30 (Co’) 111,61 (Cp) 113,04 (Co) 129,12 (Cm) 157,49 (Cm’) 134,35 (Ci) 122,89 (Co’’’) 124,31 (Cp’) 129,23 (Cm’’) 134,68 (Co’’) 139,66 (Cm’’’) 147,41 (Ci’) 167, 68 (C9) 56e 147,79 152,28 156,52 152,46 133,42 127,62 115,07 (Cm) 124,26 (Co) 154,57 (Cp) 122,92 (Co’’’) 124,35 (Cp’) 129,15 (Cm’’) 55 129,47 (Ci) 134,70 (Co’’) 139,65 (Cm’’’) 147,43 (Ci’) 167,80 (C9) 56f 147,88 155,51 156,35 152,33 127,30 134,30 b) 20,33 (CH3) 121,88 (Co) 128,80 (Cm) 133,27 (Cp) 135,47 (Ci) 122,53 (Co’’) 123,87 (Cp’) 128,80 (Cm’’) c) 134,30 (Co’’) 139,90 (Cm’’’) 147,32 (Ci’) 161,80 (C9) a) Não foi possível estabelecer correlação b) Carbonos sobreposto de C4a/Co’’ c) Carbonos sobrepostos de Cm/Cm’’ 56 2.8 Síntese de pirimido[5,4-d]pirimidinas Na literatura têm vindo a ser descritos vários métodos de síntese de pirimido[5,4d]pirimidina 57. A síntese das pirimido[5,4-d]pirimidinas 57 substituídas foi realizada a partir do derivados 2,4,6,8-tetracloro 60. Por reação de composto 60 com o amino açúcar 61, na presença de base (Et3N) em butanol foram obtidos os compostos de estrutura 62-63. Posteriormente o composto gerado 62 e o seu isómero 63 foram tratados com uma solução aquosa de amoníaco em EtOH em que apenas a estrutura 63 era reativa dando origem ao composto 64, que por hidrogenação com Pd/C originou a pirmido[5,4-d]pirimidina 57 (esquema 25) [48]. Esquema 25 Curtin et al [49] também reportou a síntese da pirimido[5,4-d]pirimidina 57 a partir de 60 usando procedimentos ligeiramente diferentes do anteriormente descrito (esquema 26). Após reação do composto 60 com aminas secundárias e aromáticas e obtenção dos 57 compostos 65 os autores obtiveram os compostos 57 usando três métodos diferentes (Método A, B, C). Esquema 26 Este grupo de investigação obteve o composto 57 a partir da hidrogenação do composto 65 com Pd/H2/KOH (Método A). O Método B permitiu a obtenção destes mesmos compostos 57 por reação do composto 65 em THF com um excesso de amina, sob refluxo. Por último, o método utilizado por Curtin et al para gerar o composto 57, consistiu na reação do composto 65 com o alcóxido de sódio, sob refluxo, utilizando o respetivo álcool como solvente (esquema 26, Método C) [49]. Ao longo dos anos, o nosso grupo de investigação também desenvolveu métodos de síntese para a obtenção destes compostos 57 a partir de derivados de purina [41, 4445]. Carvalho et al sintetizou os compostos 57, por reação de 6-cianopurinas 34 com aminas [44]. Desta reação, quando se usou uma amina primária, obteve-se compostos puros de estrutura 56 ou misturas de compostos 56 e 57 (esquema 27). Esquema 27 Nos estudos mais recentes, efetuados pelo nosso grupo de investigação, foi reportado um método de síntese de pirimido[5,4-d]pirimidinas 57 a partir das 6- 58 carbohidrazonamidopurinas 53 [45]. A conversão das 6-carbohidrazonamidopurinas 53 em pirimido[5,4-d]pirimidinas 57 ocorreu em etanol ou numa mistura de solventes de etanol e DMF na presença de piperidina (esquema 28). Esquema 28 2.8.1 Conversão das 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas em pirimido[5,4d]pirimidinas Neste capitulo será apresentada e discutida a síntese das pirimido[5,4-d]pirimidinas 57, a partir dos precursores 56, tendo por base o rearranjo de Dimroth (esquemas 29-31). Esquema 29 Para obter a pirimido[5,4-d]pirimidina 57c a partir de 56c foi usado etanol na presença de piperidina (6 equiv.) á temperatura de 80oC (esquema 29). Inicialmente a reação foi mantida a esta temperatura durante 16 horas e ao fim desse tempo considerou-se a reação terminada. A mistura reacional foi concentrada no evaporador rotativo e por adição de ácido acético (2,5 equiv.) e etanol verificou-se a precipitação de um sólido na mistura reacional. Após análise do espetro de 1H RMN, identificou-se o sólido isolado como reagente de partida 56c. Posto este resultado decidiu-se aumentar a quantidade de nucleófilo para 10 equivalentes e também o tempo de reação de 16 horas para 32 59 horas. Fez-se então reagir o composto 56c sob as condições modificadas (esquema 29). Desta reação, por análise do espetro de 1H RMN do sólido isolado foi possível identificar uma mistura de 56c e 57c numa proporção de 71:29. Dado este resultado, foi possível perceber que o tempo de reação era o fator que influenciava a formação do composto 57c. Assim, fez-se reagir de novo a 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidina 56c seguindo as mesmas condições aumentando apenas o tempo de reação (esquema 29). Completadas 49 horas de reação a 80oC, esta considerou-se terminada. O sólido foi isolado usando o procedimento anteriormente descrito e, após análise do espetro de IV, 1H RMN e 13C RMN foi possível identificar o produto desta reação como pirimido[5,4-d]pirimidina 57c obtido com um baixo rendimento. Esquema 30 Atendendo aos resultados obtidos na síntese anterior, fez-se reagir as 3,4dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas 56d-f com piperidina (6 equiv.). Estas foram colocadas em etanol, a 80oC, na presença de um excelente nucleófilo, a piperidina (6 equiv.). Ao fim de 16 horas deram-se as reações por terminadas. Os sólidos foram isolados seguindo o procedimento acima descrito. Por análise do espetro de IV, 1H RMN e 13C RMN foi possível identificar o produto da reação de 56d como pirimido[5,4-d]pirimidina 57d, com bom rendimento. Relativamente à reação de 56f, após análise do espetro de 1H RMN, verificou-se que apenas se tinha isolado o reagente 56f (esquema 30). Considerando o resultado obtido na reação da 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidina 56f, repetiu-se a reação usando um solvente onde o reagente 56f fosse mais solúvel. Posto 60 isto, fez-se reagir as 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas 56e-f nas condições acima descritas, usando como solvente o DMSO (esquema 30). Após 16 horas de reação a 80oC, considerou-se as reações terminadas. As misturas reacionais foram concentradas no evaporador rotativo e, após repetir este processo duas vezes, adicionou-se ácido acético (2,5 equiv.) e água. Das misturas reacionais precipitaram sólidos que foram filtrados e lavados com água e umas gotas de éter etílico. Após análise do espetro de IV, 1H RMN e 13C RMN foi possível identificar os compostos isolados como pirimido[5,4-d]pirimidinas 57e-f, com excelentes rendimentos. 61 Fizeram-se também reagir as 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas 56a-b seguindo as condições reacionais acima descritas (esquema 31). Esquema 31 Relativamente à reação da 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidina 56a primeiramente esta foi colocada em etanol, com excesso de piperidina (10 equiv.), à temperatura de 80oC (esquema 31). Perfazendo 16 horas de reação a 80oC considerou-se a reação terminada e isolou-se o sólido seguindo o procedimento anteriormente descrito. Após análise do espetro de 1H RMN foi possível identificar o composto isolado como uma mistura de 56a e 57a numa proporção de 78:22. Analisados os resultados obtidos nesta primeira reação, decidiu-se repetir a mesma usando as mesmas condições reacionais aumentando apenas o tempo de reação de 16 para 32 horas (esquema 31). Posto isto, após as 32 horas de reação, esta foi considerada como terminada. O sólido foi isolado e por análise do espetro de 1H RMN, o composto mostrou ser de novo uma mistura de 56a e 57a, mas agora numa proporção de 59:41. Com isto, e considerando a insolubilidade do reagente 56a em etanol, repetiu-se de novo a reação usando como solvente o DMSO. Sendo assim, fez-se reagir 56a com piperidina em excesso (6 equiv.) em DMSO a 80oC (esquema 31). Ao fim de 14 horas de reação, deu-se a mesma por 68 2.9.4 Caracterização espetroscópica de 13C RMN (100MHZ, DMSO-d6,  (ppm)) das pirimido[5,4-d]pirimidinas 57 Os espetros de HMQC das pirimido[5,4-d]pirimidinas 57, mostram uma correlação direta entre os protões C2-H e C2 e C6-H e C6 surge a desvio químico compreendido entre  153,08-154,25 ppm e o valor do desvio químico de C2 surge a desvio químico compreendido entre  154,61-155,72 ppm. No espetro de HMBC, o protão C6-H mostra correlação com C4a e C8, o C2-H mostra correlação com o C4 e C8a (figura 19). Os espetros também mostram uma interação entre o C8-NH com C8 e C8a, que permite a identificação destes carbonos. Os carbonos C4 e C8 aparecem entre  154,07-156,19 ppm e  151,09157-20 ppm respetivamente. Os C4a e C8a aparecem entre  130,86-131,37 ppm. Além disso o HMBC permite a identificação do C9 com desvios entre  161,64-163,24 ppm (tabela 16). Fig. 19 – Correlações em HMBC das pirimido[5,4-d]pirimidinas 57 69 Tabela 16 – Caracterização espetroscópica de 13C RMN das pirimido[5,4d]pirimidinas 57 (100MHz, DMSO-d6),  (ppm) Composto R R1 C2/C6 C8/C4 C8a/C4a R R1/C9 57c H 154,76 153,63 156,19 157,20 130,87 131,37 20,53 (CH3) 121,37 (Co) 128,94 (Cm) 132,74 (Cp) 136,02 (Ci) 57d a) 155,46 153,36 155,96 153,22 131,24 132,03 108,17 (Co’) 110,72 (Cp) 112,00 (Co) 129,21 (Cm) 139,66 (Ci) 157,52 (Cm’) 121,49 (Co’’’) 123,76 (Cp’) 129,44 (Cm’’) 133,29 (Co’’) 139,15 (Cm’’’) 147,59 (Ci’) 162,32 (C9) 57e a) 154,61 154,25 156,27 154,07 131,89 131,11 114,99 (Cm) 123,53 (Co) 129,93 (Ci) 122,05 (Co’’’) 125,76 (Co’’) 130,21 (Cm’’) 133,73 (Cp’) 135,50 (Cm’’’) 147,81 (Ci’) 163,24 (C9) 57f a) 155,72 153,08 155,85 151,09 132,39 130,86 20,53 (CH3) 121,03 (Co) 128,96 (Cm) 132,54 (Cp) 136,31 (Ci) 121,19 (Co’’’) 122,70 (Cp’) 129,06 (Cm’’) 133,05 (Co’’) 141,05 (Cm’’’) 147,51 (Ci’) 161,64 (C9) a) Espetros realizados em DMSO com piperidina no meio 70 2.10 Reação de pirimido[4,5-d]pirimidinas com aldeídos Os compostos 68 foram obtidos por reação da pirimido[5,4-d]pirimidina 57c com três aldeídos, diferentes. Assim fez-se reagir o composto 57c com cada um dos aldeídos, em DMSO, usando catálise ácida (H2SO4) à temperatura de 25oC (esquema 33). Após adição de ácido à suspensão inicial, formou-se uma solução de cor alaranjada, em todas as reações. Monitorizou-se as reações por TLC e quando se verificou a ausência do reagente 57c deram-se estas por terminadas. Quando terminadas, adicionou-se água ás misturas reacionais, das quais precipitaram sólidos. Os compostos foram filtrados e lavados com água e éter etílico no final. Os compostos obtidos foram identificados como 68a-c e isolados com bons rendimentos. Esquema 33 71 2.11 Caracterização física, analítica e espetroscópica das pirimido[5,4-d]pirimidin-4-il hidrazona 68 2.11.1 Dados físicos e analíticos das pirimido[5,4-d]pirimidin-4-il hidrazona 68 Os dados obtidos por espetrometria de massa apoiam a fórmula molecular dos compostos. Tabela 17 - Dados físicos e analíticos das 4-hidrazinopirimido[5,4-d]pirimidinas 68 Composto R R1  (%) P. f. (oC) Fórmula molecular Mr C; H; N; S (%) Valores obtidos (Valores calculados) m/z 68a 84,2 271272 C20H17N7O 371,15 a) (64,68; 4,61; 26,40) 372,19 [M+1]+ (100%) 68b 94 245246 C20H17N7O2 387,14 a) (62,01; 4,42; 25,31) 388,19 [M+1]+ (85,14%) 68c 98 251252 C21H19N7O2 401,16 a) (62,83; 4,77; 24,42) 402,16 [M+1]+ (100%) a) Os valores experimentais de análise elementar ainda não se encontram disponíveis à data da escrita deste trabalho 72 2.11.2 Espetroscopia de IV (Nujol/cm-1) das pirimido[5,4-d]pirimidin-4-il hidrazona 68 Os compostos 68 apresentam nos espetros de IV bandas de absorção com uma intensidade forte, com valores compreendidos entre 3157 a 3353 cm-1, sinais que podem ser atribuídos às vibrações de estiramento das ligações N-H. A região compreendida entre os 1511 e 1651 cm-1 é caracterizada por um grupo de bandas de intensidade variável, que resulta das vibrações de estiramento C=C e C=N e também das vibrações de deformação angular das ligações N-H (tabela 18). Tabela 18 - Caracterização espetroscópica de IV (Nujol/cm-1) das pirimido[5,4d]pirimidin-4-il hidrazona 68 Composto R R1 3500-3000 1700-1500 68a 3353(i) 1651(i); 1600(i); 1567(m); 1536(m) 68b 3157(i) 1651(i); 1599(i); 1564(i); 1528(i); 68c 3283(i) 1653(m); 1590(i); 1564(i); 1538(i); 1538(i); 1511(i) 73 2.11.3 Caracterização de espetroscópica de 1H RMN (400MHz, DMSO-d6,  (ppm)) das pirimido[5,4-d]pirimidin-4-il hidrazona 68 Os espetros de 1H RMN dos compostos 68, mostram a presença de dois singletos que são correspondentes aos protões C2-H e C6H com desvios químicos de  8,53-8,57 ppm e  8,55-8,60 ppm respetivamente. Existe também um singleto que aparece com desvio químico mais alto que corresponde ao C9-H com valores compreendidos  8,62-8,67 ppm. Foi também possível observar um singleto largo com um desvio químico  10,0110,31 ppm que foi atribuído ao protão do 8-NH (tabela 19). Tabela 19 - Caracterização espetroscópica de 1H RMN das pirimido[5,4d]pirimidin-4-il hidrazona 68 (400MHz, DMSO-d6,  (ppm)) Composto R R1 C2/ C6-H R 8-NH/4-NH/R1/C9-H 68a 8,58 (s,1H) 8,57 (s,1H) 2,29 (s, 3H, CH3) 7,18 (d, 2H, J 8.4Hz, Hm) 7,84 (d, 2H, J 8.4Hz, Ho) 6,84 (d, 2H, J 8.8Hz, Hm’) 7,63 (d, 2H, J 8.8Hz, Ho’) 8,62 (s, 1H, C9-H) 10,01 (s, 1H, 8-NH) 68b 8,53 (s, 1H) 8,55 (s, 1H) 2,29 (s, 3H, CH3) 7,20 (d, 2H, J 8.4Hz, Hm) 7,82 (d, 2H, J 8.8Hz, Ho) 6,83 (d, 1H, J 8Hz, Hm’) 7,07 (dd, 1H, J 2, 8.4Hz, Ho’) 7,36 (d, 1H, J 2Hz, Ho’’) 8,65 (s, 1H, C9-H) 10,31 (s, 1H, 8-NH) 68c 8,57 (s, 1H) 8,67 (s, 1H) 2,30 (s, 3H, CH3) 7,21 (d, 2H, J 8.4Hz, Hm) 7,79 (d, 2H, J 8.4Hz, Ho) 3,87 (s, 3H, OMe) 6,88 (d, 1H, J 8Hz, Hm’) 7,24 (dd, 1H, J 1.2, 8Hz, Ho’) 7,49 (d, 1H, J 1.2Hz, Ho’’) 8,60 (s, 1H, C9-H) 10,31 (s, 1H, 8-NH) 74 2.11.4 Caracterização de espetroscópica de 13C RMN (100MHz, DMSO-d6,  (ppm)) das pirimido[5,4-d]pirimidin-4-il hidrazona 68 Os espetros de HMQC dos compostos 68, mostram uma correlação direta entre os protões C2-H e C2 e C6-H e C6, que se apresentam com um valor do desvio químico do C6 surge a um desvio químico compreendido entre  154,17-154,45 ppm e o valor do desvio químico de C2 surge a um desvio químico compreendido  150,92-152,92 ppm. No espetro de HMBC, o protão C6-H mostra correlação com C4a e C8, o C2-H mostra correlação com o C4 e C8a (figura 20). Os espetros de HMBC dos compostos 68 também mostram uma interação entre o Co’’ com C9 o que permite a identificação deste carbono a desvio químico que varia entre  150,51-152,73 ppm. Os carbonos C4 e C8 aparecem entre  153,44-153,57 ppm e  156,23-156,81 ppm respetivamente. Os C4a e C8a aparecem entre  128,99-131,61 ppm para os carbono C8a e desvios químicos de  125,12-125,33 ppm para o C4a. (tabela 20). Fig.20 – Correlações de HMBC pirimido[5,4-d]pirimidin-4-il hidrazona 68 75 Tabela 20 - Caracterização espetroscópica de 13C RMN pirimido[5,4-d]pirimidin4-il hidrazona 68 (100MHz, DMSO-d6,  (ppm)) Composto R R1 C2/C6 C8/C4 C8a/C4a R R1 68a 152,87 154,17 156,23 153,44 128,99 125,23 20,53 (CH3) 121,78 (Co) 128,97 (Cm) 133,20 (Cp) 135,76 (Ci) 115,80 (Cm’) 129,32 (Co’) 131,72 (Ci’) 150,51 (C9) 159,79 (Cp’) 68b 150,92 154,45 156,54 153,57 131,61 125,33 20,58 (CH3) 122,06 (Co) 129,01 (Cm) 133,54 (Cp) 135,54 (Ci) 113,66 (Co’’) 115,64 (Cm’) 121,45 (Co’) 131,95 (Ci’) 145,80 (Cm’’) 148,81 (Cp’) 152,15 (C9) 68c 151,30 154,42 156,81 153,48 131,01 125,12 20,56 (CH3) 122,15 (Co) 129,00 (Cm) 133,67 (Cp) 135,43 (Ci) 55,76 (OMe) 110,04 (Co’’) 115,56 (Cm’) 123,31 (Co’) 132,16 (Ci’) 148,13 (Cm’’) 150,00 (Cp’) 152,73 (C9) 76 III – Conclusão 77 O principal objetivo deste trabalho, foi a síntese de novos derivados de 6carbohidrazonamidopurinas 53 e pirimido[5,4-d]pirimidinas 57. Começou-se por sintetizar os reagentes de partida, as 6-cianopurinas 34 que foram obtidas por reação das amidinas 32 com TEOF na ausência de solvente, segundo métodos já descritos na literatura. Estes compostos foram obtidos com bons rendimentos. Após obtenção das 6-cianopurinas 34 realizou-se a síntese das 6-imidatopurinas 46 seguindo métodos de síntese também descritos anteriormente na literatura. Na síntese destes compostos houve dificuldades em seguir a reação. Nas primeiras tentativas de reação obteve-se ou apenas reagente de partida ou mistura de reagente com produto. Posto este resultado, aumentou-se o tempo de reação e realizou-se a síntese a temperatura controlada o que permitiu obter o produto desejado, a 6-imidatopurina 46. As amidrazonas, foram também usadas como reagentes de partida. Uma vez que não se encontram disponíveis comercialmente, foi também necessária a sua síntese. Nas primeiras tentativas de síntese foram obtidas misturas do composto desejado e de dímero. A obtenção do monómero desejado foi conseguida após aumentar a quantidade de hidrazina no meio reacional. Obtidos todos os reagentes de partida, procedeu-se á síntese de 6carbohidrazonamidopurinas 53. Estas foram obtidas pela reação de diferentes 6imidatopurinas 46 com derivados de amidrazonas usando condições de reação anteriormente descritos na literatura. Em algumas reações o uso de DMSO como solvente e catálise ácida, levou à obtenção do produto desejado puro, contudo noutras reações foram obtidas misturas. Nestes casos decidiu-se realizar a síntese usando o CH3CN como solvente e cloreto de anilíneo como catalisador. Nas novas condições, os tempos de reação aumentaram consideravelmente, contudo foi possível a obtenção de alguns derivados puros. 84 4.1.4 Síntese de 6-cianopurinas Método A: Para um balão com 25 mL de capacidade foi adicionado a amidina 32 juntouse o TEOF 37 (4 equiv.) e colocou-se a suspensão sob refluxo. Passados 10 minutos a mistura reacional entrou em ebulição e a reação encontrava-se terminada. O balão continha uma solução de cor escura. Desligou-se o refluxo, deixou-se o balão arrefecer por minutos à temperatura ambiente sendo depois colocado a -20oC até ao dia seguinte. O sólido precipitado da solução filtrou-se, lavou-se com etanol (2 mL) e éter etílico (2 mL). O sólido obtido foi identificado como 6-cianopurina 36 após análise do espetro de 1H RMN. 9-(3-hidroxifenil)-9H-purina-6-carbonitrilo 34a Método A: O composto 34a (0,70 g; 2,97 mmol) foi obtido como um sólido de cor bege-acinzentado, a partir da (Z)-N’-((Z)-2-amino-1,2dicianovinil)-N-(3-hidroxifenil)formimidamida 32a (0,86 g; 3,80 mmol) em TEOF 30 (4 equiv.; 2,52 mL; 15,20 mmol), após 40 minutos de reação, com 78% de rendimento. 9-(4-hidroxifenil)-9H-purina-6-carbonitrilo 34b Método A: O composto 34b (1,12 g; 4,93 mmol) foi obtido como um sólido de cor preto, a partir da (Z)-N’-((Z)-2-amino-1,2-dicianovinil)-N-(4hidroxifenil)formimidamida 32b (0,76 g; 3,21 mmol) em TEOF 30 (4 equiv.; 3,28 mL; 19,73 mmol), após 30 minutos de reação, com 65% de rendimento. 85 4.1.5 Síntese 9-(p-toluil)-9H-purina-6-carbonitrilo 34c Para um balão com 100mL de capacidade foi adicionado o imidazole 33a (3,78 g; 15,00 mmol) juntou-se TEOF 30 (4 equiv.; 9,97 mL; 60,00 mmol), CH3CN (60 mL) e por fim catálise de H2SO4. Levou-se o balão ao ultrassons durante 5-15 minutos. Após ultrassons colocou-se o balão com a mistura reacional sob uma agitação eficiente à temperatura ambiente (16oC). Passados 5 minutos um sólido de cor branca precipitou da mistura reacional. Realizou-se TLC 15 minutos após retirar a reação dos ultrassons e verificou-se que tinha terminado. Filtrou-se e lavou-se o sólido precipitado com éter etílico (20 mL) bem frio. O sólido obtido foi identificado como 6-cianopurina 34c (2,98 g; 12,66 mmol; 84%) após análise do espetro de 1H RMN. 86 4.1.6 Síntese de 6-imidatopurinas Procedimento geral: Para um balão de fundo redondo de 25 mL de capacidade adicionou-se a 6-cianopurina 34, metanol (1,5-8 mL) e colocou-se sob agitação eficiente a uma temperatura compreendida entre os 19oC e os 27oC. Sob agitação, adicionou-se DBU (cat.). A reação foi monitorizada por TLC até se verificar a inexistência de reagente de partida 34. Após 1 a 10 dias de reação esta encontrava-se terminada. Após arrefecimento em gelo, o sólido em suspensão foi filtrado e lavado com uma mistura de 4:1 de etanol e éter etílico. Depois de seco, o sólido recolhido foi identificado como 6imidatopurina 46 após análise do espetro de 1H RMN. Metil 9-(3-hidroxifenil)-9H-purina-6-carbimidato 46a O composto 46a (0,75 g; 2,78 mmol) foi obtido por reação da 6cianopurina 34a (1,70 g; 7,20 mmol) em metanol (5 mL) com DBU, após 10 dias de reação, com rendimento de 60% Metil 9-(4-hidroxifenil)-9H-purina-6-carbimidato 46b O composto 46b (1,21 g; 4,45 mmol) foi obtido por reação da 6cianopurina 34b (1,40 g; 5,87 mmol) em metanol (1,5 mL) com DBU, após 8 dias de reação com rendimento de 75% Metil 9-(p-toluil)-9H-purina-6-carbimidato 46c O composto 46c (0,53 g; 2,00 mmol) foi obtido por reação da 6cianopurina 34c (0,56 g; 2,38 mmol) em metanol (8 mL) com DBU, após 6 dias de reação, com rendimento de 84,2% 87 4.1.7 Síntese de amidrazonas Procedimento Geral: A uma solução/suspensão de aldeído em etanol, foram adicionados lentamente entre 1,1 a 3 equivalentes de hidrazina monohidratada, sob agitação magnética e à temperatura ambiente (19-27oC). Imediatamente após a adição da hidrazina ocorreu a precipitação de um sólido. À mistura foi adicionado mais etanol e esta permaneceu sob agitação magnética até estar terminada por TLC (5 minutos a 20 dias). O balão foi arrefecido em banho de gelo. Os sólidos foram filtrados sob vácuo e lavados com etanol e éter etílico frios. Depois de secos os sólidos foram recolhidos e identificados como amidrazonas 49a-g, após análise dos espetros de IV, 1H RMN, 13C RMN e análise elementar. (Z)-4-(hidrazonametil)fenol 49a O composto 49a (0,211 g; 1,56 mmol) foi obtido por reação do aldeído 4-hidroxibenzaldeído 48a (0,21 g; 1,66 mmol) com hidrazina monohidratada (1,1 equiv.; 0,09 mL) em etanol (1,2 mL), após 30 minutos de reação, com rendimento de 93,4% (Z)-4-hidrazonametil)benzeno-1,2-diol 49b O composto 49b (0,25 g; 1,64 mmol) foi obtido por reação do aldeído 3,4-hidroxibenzaldeído 48b (0,25 g; 1,72 mmol) com hidrazina monohidratada (1,1 equiv.; 0,09 mL) em etanol (2 mL), após 19 horas de reação, com rendimento de 95% 88 (Z)-4-(hidrazonametil)-2-metoxifenol 49c O composto 49c (0,25 g; 1,49 mmol) foi obtido por reação do aldeído 3metoxi-4-hidroxibenzaldeído 48c (0,24 g; 1,55 mmol) com hidrazina monohidratada (1,1 equiv.; 0,08 mL) em etanol (3 mL) após 3 horas de reação, com rendimento de 96.2% (Z)-(4-clorobenzildieno)hidrazina 49d O composto 49d (0,38 g; 2,43 mmol) foi obtido por reação do aldeído 4-clorobenzaldeído 48d (0,53 g; 3,76 mmol) com hidrazina monohidratada (3 equiv.; 0,56 mL) em etanol (1 mL) após 5 dias de reação, com rendimento de 65% (Z)-(3,4-dimetoxibenzildieno)hidrazina 49e O composto 49e (0,13 g; 0,74 mmol) foi obtido por reação do aldeído 3,4-dimetoxibenzaldeído 48e (0,20 g; 1,23 mmol) com hidrazina monohidratada (1,1 equiv.; 0,07 mL) em etanol (1 mL), após 1h30minutos de reação, com rendimento de 60,4% (Z)-(2,4,5-trimetoxibenzildieno)hidrazina 49f O composto 49f (0,25 g; 1,20 mmol) foi obtido por reação do aldeído 2,4,5-trimetoxibenzaldeído 48f (0,34 g; 1,71 mmol) com hidrazina monohidratada (3 equiv.; 0,26 mL) em etanol (8 mL), após 2 horas de reação, com rendimento de 71% (Z)-4-(hidrazonametil)--2,6-dimetoxifenol 49g O composto 49g (0,13 g; 0,64 mmol) foi obtido por reação do aldeído 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzaldeído 48g (0,13 g; 0,72 mmol) com hidrazina monohidratada (3 equiv.; 0,11 mL) em etanol (6 mL), após 5 minutos de reação, com rendimento de 89% 89 4.1.8 Síntese da 3-nitrobenzohidrazida A uma suspensão de 3-nitro-benzoato de etilo 51a (0,80 g; 4,11 mmol) em etanol (1 mL), foi adicionada catálise ácida (H2SO4) sob agitação magnética eficiente. Por fim foram adicionados lentamente 5 equivalentes de hidrazina monohidratada (1,23 mL). Colocouse o balão com a mistura reacional sob uma agitação eficiente à temperatura ambiente (20-27oC). Após alguns minutos sob agitação, um sólido de cor branca precipitou do meio reacional. Após 4 dias de reação o TLC mostrou ausência do reagente de partida. Filtrou-se e lavou-se o sólido em suspensão com água e éter etílico (1 mL) frio. Recolheuse um sólido de cor branca. Depois de seco o sólido foi identificado como 3nitrobenzohidrazida 52a (0,74 g; 4,07 mmol; 99%) após análise dos espetros de 1H RMN, 13C RMN, IV e análise elementar. 3.1.9 Síntese das 6-carbohidrazonamidopurinas Procedimento Geral Método A: Para um balão com 25 mL de capacidade foi adicionado a 6-imidatopurina 46, CH3CN (10 mL) e 1,05 equivalentes de amidrazona. A mistura foi colocada sob agitação magnética e à temperatura ambiente e por fim adicionou-se catálise ácida de PhNH3Cl. A reação permaneceu sob agitação magnética até estar terminada (3 a 14 dias). Terminada a reação, o sólido em suspensão foi filtrado e lavado com acetonitrilo (2 mL) e éter etílico (3 mL) frios. Depois de seco o sólido foi recolhido e identificado como 6-carbohidrazonamidopurina 53, após análise dos espetros de IV, 1H RMN, 13C RMN. Método B: Para um balão com 25mL de capacidade foi adicionado a 6-imidatopurina 46, DMSO (1 mL) e 1.5 equivalentes de amidrazona. A reação foi colocada sob agitação magnética, à temperatura ambiente, e, com bastante cuidado foi adicionado catálise de ácido sulfúrico (H2SO4). A reação permaneceu sob agitação magnética eficiente, à temperatura ambiente, até estar terminada (evidência por TLC). Foi então adicionada água à solução tendo precipitado um sólido. O sólido foi filtrado e lavado com H2O e 90 umas gotas de éter etílico. Depois de seco o sólido foi recolhido e identificado como 6carbohidrazonamidopurina 53, após análise dos espetros de IV, 1H RMN, 13C RMN. (6E,N’E)- N’-(4-hidroxi-3-metoxibenzildieno)-9-(4-hidroxifenil)-9H-purine-6carboximidamida 53d Método B: A purina 53d (0,05 g; 0,11 mmol) foi obtida como um sólido amarelo, a partir da 9-(4-hidroxifenil)-9H-purine-6carboximidoate 46b (0,20 g; 0,73 mmol) com (Z)-(3,4dimetoxibenzildieno)hidrazina 49e (1,5 equiv.; 0,18 g; 1,10 mmol), em DMSO (1 mL) com H2SO4 (cat.), após 6 horas de reação, com rendimento de 15%. (6E,N’E)- N’-(4-hidroxibenzildieno)-9-(4-hidroxifenil)-9H-purine-6-carboximidamida 53c Método B: A purina 53c (0,07 g; 0,21 mmol) foi obtido como um sólido laranja, a partir da 9-(4-hidroxifenil)-9H-purine-6carboximidoate 46b (0,19 g; 0,70 mmol) com (Z)-4- (hidrazonametil)fenol 49a (0,14 g; 1,06 mmol; 1,5 equiv.) em DMSO (1 mL) com H2SO4 (cat.), após 6 horas de reação, com rendimento de 29% (6E,N’E)- N’-(4-hidroxibenzildieno)-9-(3-hidroxifenil)-9H-purine-6-carboximidamida 53b Método A: A purina 53b (0,12 g; 0,31 mmol) foi obtido como um sólido laranja, a partir da 9-(3-hidroxifenil)-9H-purine-6carboximidoate 46a (0,11 g; 0,43 mmol) com (Z)-4- (hidrazonametil)fenol 49a (1,05 equiv.; 0,06 g; 0,45 mmol) em CH3CN (10 mL) com PhNH3Cl (cat.), após 13 dias de reação, com rendimento de 73% 91 (6E,N’E)- N’-(3,4-dihidroxibenzildieno)-9-(3-hidroxifenil)-9H-purine-6carboximidamida 53a Método A: A purina 53a (0,12 g; 0,31 mmol) foi obtido como um sólido amarelo, a partir da 9-(3-hidroxifenil)-9H-purine-6carboximidoate 46a (0,10 g; 0,38 mmol) com (Z)-4hidrazonametil)benzeno-1,2-diol 49b (1,05 equiv.; 0,06 g; 0,40 mmol) em CH3CN (10 mL) com PhNH3Cl (cat.), após 14 dias de reação, com rendimento de 81%. (6E,N’E)- N’-(4-hidroxi-3-metoxibenzildieno)-9-(p-toluil)-9H-purine-6carboximidamida 53e Método A: A purina 53e (0,14 g; 0,35 mmol) foi obtido como um sólido amarelo torrado, a partir da 9-(3-toluilfenil)-9Hpurine-6-carboximidoate 46c (0,16 g; 0,60 mmol) com (Z)- (3,4-dimetoxibenzildieno)hidrazina 49e (1,05 equiv.; 0,10 g; 0,63 mmol) em CH3CN (10 mL), com PhNH3Cl (cat.), após 3 dias de reação, com rendimento de 56%. (6E,N’E)- N’-(3,4-dihidroxibenzildieno)-9-(p-toluil)-9H-purine-6-carboximidamida 53g Método B: A purina 53g (0,28g; 0,72mmol) foi obtido como um sólido amarela, a partir da 9-(4-toluilfenil)-9H-purine-6carboximidoate 46c (0,22g; 0,80mmol) com (Z)-4hidrazonametil)benzeno-1,2-diol 49b (1,5 equiv.; 0,18 g; 1,21 mmol) em DMSO (1 mL) com H2SO4 (cat.), após 1 dia de reação, com rendimento de 89%. (6E,N’E)- N’-(4-hidroxibenzildieno)-9-(p-toluil)-9H-purine-6-carboximidamida 53f 92 Método A: A purina 53f (0,10 g; 0,26 mmol) foi obtido como um sólido amarelo, a partir da 9-(3-toluilfenil)-9H-purine-6carboximidoate 46c (0,17 g; 0,62 mmol) com (Z)-4- (hidrazonametil)fenol 49a (1,05 equiv.; 0,09 g; 0,65 mmol) em CH3CN (10 mL) com PhNH3Cl (cat.), após 2 dias de reação, com rendimento de 43%. 93 4.2 Síntese das 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidinas Procedimento Geral: Método A: À 6-cianopurina 34, colocada sob agitação magnética em etanol, foi adicionada hidrazina (2,5 equiv.). Após adicionar a hidrazina verificou-se a precipitação de um sólido. A reação continuou a 25oC, sob uma agitação eficiente durante 1h-1h30, até estar terminada (evidência por TLC). Filtrou-se o sólido em suspensão e lavou-se com etanol. Obteve-se um sólido de cor bege, que se identificou como após análise dos espetros de IV, 1H RMN, 13C RMN. Método B: O procedimento é semelhante ao método A, apenas foi adicionada quantidade catalítica de DBU à reação. Método C: À 6-cianopurina 36 e a 3-nitrobenzohidrazida 52 (1,5 equiv.) foram colocadas num balão ao qual se adicionou, em seguida, DMSO e catálise de DBU. A reação ocorreu a 25oC e foi monitorizada por TLC. Após terminada a reação, adicionou-se água destilada (3-5mL) à mistura reacional. Precipitou um sólido que se filtrou e lavou com água. O sólido obtido foi identificado como 62 após análise dos espetros de IV, RMN de 1H e 13C. 3-((7-amino-8-imino-7,8-dihidropirimido[5,4-d]pirimidin-4-il)amino)fenol 56a Método A: O composto 56a (0,79 g; 2,93 mmol) foi obtido como um sólido de cor bege a partir da 6-Cianopurina 34a (0,77 g; 3,22 mmol), hidrazina monohidratada (2,5 equiv.; 0,40 mL; 8,06 mmol), em etanol (13 mL), após 2h40minutos de reação, com rendimento de 91%. 4-((7-amino-8-imino-7,8-dihidropyrimido[5,4-d]pirimidin-4-il)amino)fenol 56b Método B: O composto 56b (0,11 g; 0,40 mmol) foi obtido como um sólido de cor bege a partir da 6-cianopurina 34b (0,14 g; 0,60 mmol), a hidrazina monohidratada (2,5 equiv.; 0,07 mL; 1,50 mmol), em etanol (3 mL) com DBU (cat.), após 45 minutos, com rendimento de 84%. 100 [1] P. Desjeux, El Servier, 27, (2004), 305-318; [2] M. B. Bhuwan; S. K. Rakesh; A. Srivastava; V.J. Tripathi; K. T. 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