Nueva alternativa a la cirugía en la queratopatía neurotrófica. Formulación de liposomas de extracto de membrana amniótica

NUEVA ALTERNATIVA A LA CIRUGÍA EN LA QUERATOPATÍA NEUROTRÓFICA. FORMULACIÓN DE LIPOSOMAS DE EXTRACTO DE MEMBRANA AMNIÓTICA. José Luis Rodríguez Ochoa FACULTAD DE FARMACIA TRABAJO FIN DE GRADO NUEVA ALTERNATIVA A LA CIRUGÍA EN LA QUERATOPATÍA NEUROTRÓFICA. FORMULACIÓN DE LIPOSOMAS DE EXTRACTO DE MEMBRANA AMNIÓTICA. Alumno: José Luis Rodríguez Ochoa Tutora: María Luisa González Rodríguez Doble Grado en Farmacia + Óptica y optometría Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica Facultad de Farmacia Universidad de Sevilla Fecha de presentación: julio 2019 Lugar de presentación: Facultad de Farmacia Trabajo de carácter experimental INDICE DE ABREVIATURAS ▪ BCA: ácido bicinconínico ▪ CH: colesterol ▪ CMC: concentración micelar crítica ▪ EA: estearilamina ▪ EE: eficacia de encapsulación ▪ EMA: extracto de membrana amniótica ▪ FC: fosfatidilcolina ▪ hCG: gonadotropina coriónica humana ▪ ID: índice de deformabilidad ▪ LC: lentes de contacto ▪ MMs: micelas mixtas ▪ NaC: colato sódico ▪ NaDC: desoxicolato sódico ▪ NaTC: taurocolato sódico ▪ PDI: índice de polidispersión ▪ PZ: potencial Z ▪ QN: queratopatía neurotrófica ▪ RH: radio hidrodinámico ▪ FEGSEM: microscopia electrónica de barrido INDICE DE TABLAS Y FIGURAS ▪ Figura 1: Distintos estadios de la QN. Estadios 1 (A), 2(B) y 3(C). ▪ Figura 2: Tratamiento de úlcera corneal con injerto de membrana amniótica. ▪ Figura 3: Esquema de un liposoma. ▪ Figura 4: Representación esquemática de las estructuras formadas por los tensioactivos a distintas concentraciones. ▪ Figura 5: Esquema de reacción del método BCA. ▪ Figura 6: Película lipídica formada en el proceso de elaboración de liposomas por el método TLE. ▪ Figura 7: Dispositivo de extrusión, donde se aprecia el extrusor y la bomba de recirculación del agua. ▪ Figura 8: Microscopio electrónico HITACHI S-5200. ▪ Figura 9: Equipo de permeación utilizado para el estudio in vitro. ▪ Figura 10: Resultados del estudio estadístico de validación. ▪ Figura 11: Cromatogramas obtenidos por HPLC. A la izquierda (A), la muestra de hCG estándar. A la derecha (B), una muestra de EMA. ▪ Figura 12: Concentración de proteínas extraídas en distintas condiciones. ▪ Figura 13: Estabilidad de las proteínas a lo largo del tiempo. ▪ Figura 14: Resultados obtenidos en el DSC de la muestra de EMA. ▪ Figura 15: Concentraciones del EMA control y el sometido a las condiciones de sedimentación de los liposomas. ▪ Figura 16: Lotes elaborados para la etapa de screening. ▪ Figura 17: Lotes elaborados después de ser agitados en vórtex durante 10 segundos. ▪ Figura 18: Muestras de los distintos lotes elaborados tras el proceso de centrifugación, ordenados del 1 al 9 de izquierda a derecha. ▪ Figura 19: Distribución de tamaños de lotes con una única o varias poblaciones. Lotes 9 (A) y 7 (B). ▪ Figura 20: Gráficos ANOM correspondientes a la respuesta del tamaño con respecto al activador del borde (A), agente de carga usado (B), cantidad de agente de carga (C), y con respecto a la concentración del EMA (D). ▪ Figura 21: Gráficos ANOM correspondientes a la respuesta del PDI con respecto al activador del borde (A), agente de carga usado (B), cantidad de agente de carga (C), y con respecto a la concentración del EMA (D). ▪ Figura 22: Gráficos ANOM correspondientes a la respuesta del potencial Z con respecto al activador del borde (A), agente de carga usado (B), cantidad de agente de carga (C), y con respecto a la concentración del EMA (D). ▪ Figura 23: Gráficos ANOM correspondientes a la respuesta de la EE con respecto al activador del borde (A), agente de carga usado (B), cantidad de agente de carga (C), y con respecto a la concentración del EMA (D). ▪ Figura 24: Características de los lotes elaborados para la etapa de optimización. ▪ Figura 25: Imágenes tomadas de los liposomas mediante FEGSEM. ▪ Figura 26: Perfiles de liberación de las proteínas en los liposomas y en el EMA. ▪ Figura 27: Perfiles de permeación de la hCG en la muestra de liposomas y de EMA. ▪ Tabla 1: Causas de la QN ▪ Tabla 2: Tratamientos actuales en cada estadio de la QN. ▪ Tabla 3: Condiciones ensayadas para determinar las de mayor eficacia de extracción. ▪ Tabla 4: Muestras sometidas a la calorimetría diferencial de barrido. ▪ Tabla 5: Composición de los lotes elaborados para determinar la concentración optima de NaC. ▪ Tabla 6: Factores analizados en el screening. ▪ Tabla 7: Experimentos correspondientes a la matriz experimental Taguchi L9. ▪ Tabla 8: Combinaciones ensayadas para la optimización. ▪ Tabla 9: Objetivos de la optimización ▪ Tabla 10: Características de los distintos lotes elaborados con cantidades crecientes de NaC sódico. ▪ Tabla 11: Características de los lotes ensayados en el screening. ▪ Tabla 12: Características de los lotes elaborados para la etapa de optimización. ▪ Tabla 13: Composición optimizada y definitiva de la formulación. 1 1 RESUMEN INTRODUCCIÓN. La queratopatía neurotrófica (QN) es una enfermedad rara que afecta entre 1- 5 de cada 10000 personas. Cursa con la aparición de defectos epiteliales de la córnea, produciendo úlceras y cicatrices, lo que compromete seriamente la visión. El tratamiento en casos graves consiste en un trasplante de membrana amniótica. OBJETIVO. Desarrollar nuevas formulaciones de extracto de membrana amniótica (EMA) menos agresivas que un trasplante, en forma de liposomas deformables. MÉTODOS. La cuantificación de proteínas se realizó usando el método del ácido bicinconínico (BCA). Las formulaciones de liposomas se elaboraron mediante la técnica TLE (Thin Layer Evaporation), partiendo de una composición previa de fosfatidilcolina, colesterol y EMA en tampón HEPES. Para obtener la composición deseada de las vesículas, se realizó un diseño experimental en el que se evaluó el tamaño, el índice de polidispersión (PDI), la carga y la eficacia de encapsulación (EE) obtenidos en función de distintos parámetros. Una vez optimizada la formulación, se realizaron ensayos in vitro de liberación y permeación, cuantificando la hCG por HPLC. RESULTADOS. El método BCA resultó ser lineal, exacto, repetitivo y preciso. Tras la elaboración y caracterización de una serie liposomas con distintas combinaciones en su composición y el análisis a través de una matriz Taguchi, se determinó el efecto de las variables en las características medidas. Atendiendo a los requerimientos de tamaño, PDI, carga y EE, se estableció como composición ideal el desoxicolato sódico (NaDC) como agente deformable, estearilamina como agente de carga en una cantidad de 0.06 mmol y una dilución al 75% del extracto. Esta composición mejoró los comportamientos de liberación y permeación de hCG. CONCLUSIONES. Este estudio ofrece nuevas posibilidades para mejorar el tratamiento de la QN mediante el uso de formulaciones no invasivas. En un futuro se iniciarán los estudios de eficacia in vivo. PALABRAS CLAVE: queratopatía neurotrófica, liposoma, membrana amniótica. 2 2 ÍNDICE 1 RESUMEN .................................................................................................................... 1 2 ÍNDICE ......................................................................................................................... 2 3 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 4 3.1 QUERATOPATÍA NEUROTRÓFICA .................................................................................. 4 3.1.1 HISTOPATOLOGÍA .................................................................................................. 4 3.1.2 ETIOLOGÍA ............................................................................................................. 4 3.1.3 CLASIFICACIÓN ...................................................................................................... 5 3.1.4 TRATAMIENTO ....................................................................................................... 5 3.2 ADMINISTRACIÓN DE FÁRMACOS VIA OFTÁLMICA ...................................................... 7 3.2.1 VIAS DE ADMINISTRACIÓN .................................................................................... 7 3.3 LIPOSOMAS ................................................................................................................... 8 3.3.1 TRANSFERSOMAS .................................................................................................. 9 4 OBJETIVOS ................................................................................................................. 10 5 METODOLOGÍA .......................................................................................................... 11 5.1 MATERIALES Y REACTIVOS .......................................................................................... 11 5.2 EQUIPOS E INSTRUMENTACIÓN .................................................................................. 12 5.3 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS ................................................................................ 12 5.3.1 VALIDACIÓN DEL MÉTODO BCA DE CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS ............... 12 5.3.2 CUANTIFICACIÓN POR HPLC ................................................................................ 14 5.4 EXTRACCIÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL POLVO DE PLACENTA ...................................... 15 5.5 ESTUDIO DE ESTABILIDAD DE LAS PROTEÍNAS ............................................................ 15 5.5.1 TIEMPO ................................................................................................................ 16 5.5.2 TEMPERATURA .................................................................................................... 16 5.5.3 CENTRIFUGACIÓN ................................................................................................ 16 5.6 ELABORACIÓN DE LAS FORMULACIONES .................................................................... 17 5.7 CARACTERIZACIÓN DE LAS VESÍCULAS ........................................................................ 18 5.7.1 ANALISIS DIMENSIONAL: TAMAÑO E INDICE DE POLIDISPERSIÓN (PDI) ............ 18 5.7.2 CARGA SUPERFICIAL: POTENCIAL Z (PZ) .............................................................. 18 5.7.3 EFICACIA DE ENCAPSULACIÓN (EE) ..................................................................... 19 5.7.4 INDICE DE DEFORMABILIDAD (ID) ....................................................................... 19 5.7.5 ANÁLISIS MORFOLÓGICO DE PARTÍCULAS MEDIANTE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO DE ALTA RESOLUCIÓN (FEGSEM) ............................................ 20 3 5.8 DETERMINACIÓN DE LA CMC DEL ÁCIDO CÓLICO ...................................................... 20 5.9 DISEÑO EXPERIMENTAL .............................................................................................. 21 5.10 OPTIMIZACIÓN DE LA FORMULACIÓN ........................................................................ 22 5.11 ENSAYOS IN VITRO ...................................................................................................... 23 5.11.1 ENSAYO DE LIBERACIÓN IN VITRO....................................................................... 23 5.11.2 ENSAYO DE PERMEACIÓN IN VITRO .................................................................... 23 6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................... 25 6.1 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS ................................................................................ 25 6.1.1 VALIDACIÓN DEL MÉTODO BCA .......................................................................... 25 6.1.2 CUANTIFICACION DE hCG POR HPLC ................................................................... 25 6.1.3 PORCENTAJE DE LA hCG DENTRO DE LAS PROTEÍNAS TOTALES DEL EMA .......... 26 6.2 EXTRACCIÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL POLVO DE PLACENTA ...................................... 26 6.3 ESTUDIO DE ESTABILIDAD DE LAS PROTEÍNAS ............................................................ 27 6.3.1 TIEMPO ................................................................................................................ 27 6.3.2 TEMPERATURA .................................................................................................... 27 6.3.3 CENTRIFUGACIÓN ................................................................................................ 28 6.4 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MICELAR CRÍTICA (CMC) DEL ÁCIDO CÓLICO .................................................................................................................................... 28 6.5 INFLUENCIA DE LOS FACTORES VARIABLES EN LA FORMULACIÓN ............................ 29 6.5.1 INFLUENCIA EN EL TAMAÑO ............................................................................... 31 6.5.2 INFLUENCIA EN EL PDI ......................................................................................... 31 6.5.3 INFLUENCIA EN EL POTENCIAL Z ......................................................................... 32 6.5.4 INFLUENCIA EN LA EE .......................................................................................... 33 6.6 OPTIMIZACIÓN DE LA FORMULACIÓN ........................................................................ 34 6.6.1 INDICE DE DEFORMABILIDAD (ID) ....................................................................... 35 6.6.2 ANÁLISIS MORFOLÓGICO DE PARTÍCULAS MEDIANTE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO ALTA RESOLUCIÓN (FEGSEM).................................................. 35 6.7 ENSAYOS IN VITRO ...................................................................................................... 36 6.7.1 ENSAYO DE LIBERACIÓN IN VITRO....................................................................... 36 6.7.2 ENSAYO DE PERMEACIÓN IN VITRO .................................................................... 37 7 CONCLUSIONES .......................................................................................................... 37 8 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 38 10 Estos activadores del borde que confieren esta actividad tan interesante son, por lo general, tensioactivos que reducen la tensión superficial de los líquidos. Uno de los factores a tener en cuenta a la hora de trabajar con activadores del borde es que, superada una determinada concentración, conocida como concentración micelar crítica (CMC), no sólo se agregan al resto de lípidos formando parte de la estructura de la bicapa, sino que empiezan a constituir por sí mismos distintos tipos de vesículas, conocidas como micelas mixtas (MMs), como afirmó Schubert (2003) en sus estudios y como se recoge en la Figura 4. Es importante resaltar que el valor de CMC no es fijo para cada sal biliar, ya que aspectos como la temperatura, fuerza iónica, existencia de impurezas o el pH del medio influyen significativamente en el valor obtenido (Ventura et al., 2014). Figura 4: Representación esquemática de las estructuras formadas por los tensioactivos a distintas concentraciones (Islas et al., 2010) I) Monómero; II) por debajo de la CMC, el tensioactivo se integra en la bicapa en forma de monómero; III) por arriba de la CMC, los monómeros se agregan formando micelas; IV) a concentraciones mucho mayores a la CMC se organizan en forma de superestructuras cilíndricas y de otros tipos. 4 OBJETIVOS Teniendo en cuenta los antecedentes anteriormente descritos en cuanto a la dificultad e invasividad del injerto de membrana amniótica y las ventajas que ofrecen los liposomas como sistemas de administración de fármacos por vía oftálmica, el objetivo general del presente trabajo de investigación fue la formulación de liposomas de EMA para su posterior uso en el tratamiento de la QN. 11 Para conseguir este objetivo general se definieron los siguientes objetivos parciales: 1. Poner a punto de métodos de cuantificación de las proteínas presentes en EMA por espectrofotometría UV-visible y por HPLC. 2. Caracterizar el EMA. 3. Estudiar la estabilidad de las proteínas en las diferentes condiciones de elaboración de los liposomas. 4. Diseñar, elaborar y caracterizar diferentes formulaciones de liposomas para vehicular el EMA. 5. Obtener una formulación optimizada y realizar estudios de caracterización. 6. Analizar el comportamiento de la formulación optimizada en ensayos de liberación y permeación in vitro. 5 METODOLOGÍA 5.1 MATERIALES Y REACTIVOS ▪ Acetona (Panreac, Barcelona) ▪ Acetonitrilo (Panreac, Barcelona) ▪ Agua Milli-Q® (Milli-Q® Advantage, Millipore) ▪ Bromuro de didodecildimetilamonio (DDAB) (Sigma-Aldrich, Barcelona) ▪ Cloroformo (Panreac Química, Barcelona) ▪ Colato sódico (NaC) (Sigma-Aldrich, Barcelona) ▪ Colesterol (CH) (Sigma-Aldrich, Barcelona) ▪ Desoxicolato sódico (NaDC) (Sigma-Aldrich, Barcelona) ▪ Estándar de ovoalbúmina (Sigma-Aldrich, Barcelona) ▪ Polvo liofilizado de gonadotropina coriónica humana (Sigma-Aldrich, Barcelona) ▪ Estearilamina (EA) (Fluka-Biochemika, Suiza) ▪ Fosfatidilcolina (FC) (Sigma-BioChemika, Alemania) ▪ Kit para determinación de proteínas Ácido Bicinconínico (Sigma-Aldrich, Barcelona) ▪ Metanol (Panreac, Barcelona) ▪ Polvo de placenta: Placenta acetone powders Human (Sigma-Aldrich, Barcelona) ▪ Taurocolato Sódico (NaTC) (Sigma-Aldrich, Barcelona) ▪ Tampón HEPES pH 7.4 (Panreac Química, Barcelona) ▪ Tampón fosfato: hidrógeno fosfato de disodio y dihidrógeno fosfato de sodio (Panreac Química, Barcelona) 12 5.2 EQUIPOS E INSTRUMENTACIÓN • Agitador magnético (Ret Basic IKA®- WERKE) • Calorímetro diferencial de barrido (DSC, Setaram 131) • Bala de nitrógeno (Alphagaz) • Balanza analítica de precisión (Explorer®Pro) • Baño de ultrasonidos (VWR Ultrasoniccleaner) • Baño termostatizado (Raypa ICI_200) • Bomba de vacío (Millipore) • Bomba peristáltica (RaininDynamax RP-1) • Centrífuga (Eppendorf Centrifuge 5804 R) • Equipo de HPLC (Hitachi Elite LaChrom) • Equipo de permeación (SES EmbH Analyesysteme) • Espectrofotómetro UV-visible (Agilent 8453) • Extrusor (LIPEX TM Thermobarrel Extruder) • Homogeneizador ultrasónico (Ultrasonic Processor UP100H) • Microscopio Electrónico de Barrido de Alta Resolución (Hitachi S-5200) • pH-metro (Crison pH-meter Basic 20+) • Rotavapor (BüchiRotavapor R-210 con Büchi Heating Bath B- 491) • Vórtex (Atom Atomixer) • Zetasizer Nano ZS (Malvern Zetasizer) 5.3 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS A lo largo del presente estudio, se cuantificaron las proteínas mediante dos métodos: el método del ácido bicinconínico (BCA) para proteínas totales, y por HPLC para la gonadotropina coriónica humana (hCG). Para conocer qué porcentaje representaba la hCG, se cuantificó una muestra de EMA por triplicado por ambos métodos. 5.3.1 VALIDACIÓN DEL MÉTODO BCA DE CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Para determinar el contenido proteico del EMA se empleó el método BCA. El fundamento de este método consiste en la reacción entre las proteínas con iones Cu2+ en un medio básico. Esta reacción da lugar a iones Cu+, los cuales al reaccionar con el BCA dan lugar a un complejo coloreado púrpura cuyo máximo de absorbancia se encuentra a 562 nm. Este pico de absorbancia permitió determinar la concentración de proteínas mediante espectrofotometría UV-visible (Figura 5). 13 Figura 5: Esquema de reacción del método BCA. Para el procedimiento de cuantificación, se añadieron 100 μL de muestra y 2 mL de reactivo previamente preparado (1:50 sulfato de cobre + 49:50 ácido bicinconínico). Las muestras se incubaron a 37 °C y en agitación durante 30 minutos. Posteriormente, se midió su absorbancia a 562 nm en el espectrofotómetro UV-visible. La validación del método se llevó a cabo realizando estudios estadísticos de: Linealidad. La linealidad es la capacidad del método de prueba para proporcionar resultados que son directamente proporcionales a la concentración de analito dentro de un rango dado. Para su determinación, se prepararon distintas diluciones de proteína estándar de concentraciones 0.3, 0.45, 0.6, 0.75 y 0.9 mg/mL por triplicado y se representaron frente a los valores de absorbancia obtenidos para cada concentración. A continuación, se evaluó por el método de regresión de mínimos cuadrados y el coeficiente de correlación (r). Mínimo detectable y mínimo cuantificable. El límite de detección (LOD) se define como la concentración más baja de un analito en una muestra que puede ser detectada pero no necesariamente cuantificada. El límite de cuantificación (LOQ) se define como la concentración más baja de un analito en una muestra que se puede cuantificar con resultados aceptables. Para ello, se prepararon diluciones de la solución estándar, de concentraciones 0.03, 0.15, 0.3, 0.48 y 0.6 mg/mL, por triplicado. Tras cuantificar la absorbancia de cada dilución, se calculó el factor de respuesta de cada una dividiendo el valor de absorbancia por el de concentración. Tras calcular la media y la desviación estándar de los factores de respuesta, se definieron los niveles de confianza y se representaron junto a los factores de respuesta de cada muestra frente a su concentración. La concentración más baja dentro de los niveles de confianza se fijó como LOQ. Como LOD se fijó la concentración más pequeña que diese un valor de absorbancia 10 veces mayor que el ruido del espectrofotómetro, independientemente de que fuese cuantificable. Exactitud. Este parámetro se define como la capacidad de medir un valor cercano a la magnitud real y fue estudiada mediante experimentos de recuperación. Estos experimentos se realizaron agregando cantidades conocidas a las soluciones de placebo. La recuperación se realizó a tres niveles: 50, 100 y 150% de la concentración estándar de proteína, siendo el 100% 0.6 mg/mL. 14 Cada nivel se determinó por triplicado. Luego se analizaron las soluciones y se calculó el porcentaje de recuperación a partir de la recta de calibrado. Asimismo, se calculó el promedio de los porcentajes de recuperación, así como su desviación estándar relativa (RSD). El porcentaje de recuperación promedio debe estar dentro de los criterios de aceptación de 98.0 a 102.0%. Además, la RSD debe ser inferior al 2.0%. Precisión. La precisión de un método se define como la concordancia entre los resultados de pruebas realizadas independientemente. La precisión proporciona una indicación de los errores aleatorios y se puede dividir en repetibilidad y precisión intermedia. La repetibilidad implica el análisis de las repeticiones por el mismo analista. Este parámetro se divide en: repetibilidad de inyección y repetibilidad de análisis. Repetibilidad de inyección. Se basa en la repetición de la medida de una misma muestra en un día dado. Para ello, se realizaron 10 medidas de una solución de concentración 0.9 mg/mL, calculando la media y la RSD de estas. Se considera el parámetro como válido si el valor de la RSD es menor de 2. Repetibilidad de análisis. Este ensayo se ha realizado con diferentes concentraciones de solución estándar de proteínas (0.3, 0.6 y 0.9 mg/mL). Se cuantificaron las absorbancias por triplicado, calculando medias y RSD en porcentaje de cada concentración. El parámetro es validado si el valor medio de las RSD es menor de 2. Precisión intermedia: Para la evaluación de la precisión intermedia, se realizó una repetibilidad adicional para comparar los resultados obtenidos por los diferentes operadores en dos días diferentes. Cada estudio de repetibilidad se realizó analizando dos inyecciones de dos soluciones estándar de concentración 0.6 mg/mL. El tratamiento de los datos se llevó a cabo de la misma forma que la repetibilidad del análisis. 5.3.2 CUANTIFICACIÓN POR HPLC Se siguió el método descrito por Pithadia et al. (2015) con ciertas modificaciones para la cuantificación de la hCG, proteína presente en el EMA. El análisis por HPLC fue llevado a cabo utilizando un equipo Hitachi Elite LaChrom. Se utilizó una columna Zorbax SB-C18 (4.6 x 150 mm, 3.5 μm). El flujo se fijó en 1 mL/min y el volumen de inyección en 20 μL. La fase móvil estaba constituida por tampón fosfato sódico (pH 7.0, 0.05 mM) y acetonitrilo, en proporción 87.5:12.5 % v/v. 15 Para la correcta detección, se requirió un tratamiento previo de la hCG. Para ello, se tomaron 350 μL de muestra en un eppendorf y se le adicionaron 700 μL de acetona. Las muestras se agitaron en vórtex durante 10 min y se centrifugaron a 4000 rpm/4°C/10 min. Una vez centrifugadas, se retiró el sobrenadante y se resuspendió la hCG en 200 μL de tampón HEPES 7.4. Este volumen se filtró usando filtros de acetato de celulosa (Pierce™ Spin Cups - Cellulose Acetate Filter) adaptados en eppendorf y centrifugando en las mismas condiciones. Finalmente, las muestras fueron trasvasadas a un vial de HPLC con inserto incorporado. 5.4 EXTRACCIÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL POLVO DE PLACENTA Para efectuar el proceso de extracción de las proteínas del polvo de placenta, se utilizó un homogeneizador ultrasónico usando como buffer de homogenizado HEPES pH 7.4, isotonizado con NaCl 150 mM. Se realizó la extracción de 40 mg de polvo de placenta en 2 mL de HEPES por duplicado, usando el procesador durante dos tiempos distintos (30 s y 60 s) para comprobar el efecto del tiempo sobre la eficacia de la extracción. Posteriormente, la muestra se centrifugó en 2 condiciones distintas, de nuevo, 3000 rpm/4 °C/10 minutos y 8000 rpm/4 °C/10 minutos para comprobar qué condiciones permiten una mayor extracción. Las proteínas totales de las 4 alícuotas fueron cuantificadas por el método BCA. Las muestras tratadas se recogen en la Tabla 3. Tiempo de sonicación (s) Velocidad de centrifugación (rpm) 1 30 3000 2 60 3000 3 30 8000 4 60 8000 Tabla 3: Condiciones ensayadas para determinar las de mayor eficacia de extracción. Una vez centrifugada la muestra, se recogió el sobrenadante y se conservó a 4 °C en nevera. Las posteriores extracciones se realizaron a las condiciones fijadas y almacenando los sobrenadantes en un único tubo falcon con el fin de utilizar en todos los ensayos un EMA con la misma concentración de proteínas. 5.5 ESTUDIO DE ESTABILIDAD DE LAS PROTEÍNAS Se evaluó la estabilidad de la proteína frente a las condiciones de elaboración y caracterización de los liposomas. Estos ensayos incluyeron estabilidad frente al tiempo, a la temperatura y la centrifugación. 16 5.5.1 TIEMPO Se cuantificó una vez por semana durante un mes la concentración de proteínas de las cuatro extracciones realizadas para el estudio de extracción, utilizando el método BCA. 5.5.2 TEMPERATURA Para el estudio de estabilidad frente a la temperatura, el método de cuantificación con BCA no es válido, ya que tanto la estructura macromolecular de la proteína y cuatro aminoácidos específicos (cisteína, cistina, triptófano y tirosina) son los responsables de la formación de color en muestras de proteínas cuando son ensayadas con este método. Esto implica que, aunque las proteínas se encuentren desnaturalizas, el BCA seguirá reaccionando con estos aminoácidos formando el complejo coloreado. Por ello, se llevó a cabo la técnica descrita por Cueto et al. (2003) para la determinación de temperatura de desnaturalización de proteínas, utilizando un calorímetro diferencial de barrido (DSC Setaram 131). El análisis se realizó con un gradiente de temperatura de 1 °C/min, en un rango de temperatura desde 30 °C hasta 90 °C. Después se enfrió rápidamente la muestra hasta los 30 °C y se dejó estabilizar a esa temperatura durante 5 minutos. En la Tabla 4 se recogen las muestras que fueron sometidas al ensayo, así como la muestra usada como control. El EMA se desnaturalizó sometiéndolo a 80 °C durante 30 minutos. Muestra Problema Muestra Control Peso muestra (mg) Polvo de Placenta Aire 7.5 HEPES HEPES 8.4 EMA HEPES 7.7 EMA Desnaturalizado HEPES 7.8 Tabla 4: Muestras sometidas a la calorimetría diferencial de barrido. 5.5.3 CENTRIFUGACIÓN Para evaluar si las proteínas permanecían estables a las condiciones de centrifugación necesarias para hacer precipitar los liposomas y poder así cuantificar el sobrenadante en la determinación de la eficacia de encapsulación (EE), se realizó una extracción la cual se separó en dos alícuotas. 17 Una de ellas se cuantificó inmediatamente por el método BCA y la otra se sometió a centrifugación (8000 rpm/4 °C/60 min) y se cuantificó. Posteriormente, se compararon ambos valores. 5.6 ELABORACIÓN DE LAS FORMULACIONES Para la elaboración de los liposomas, se empleó la técnica de evaporación en capa fina o Bangham (TLE, Thin Layer Evaporation), ampliamente utilizada por González-Rodríguez et al. (2016) con el fin de obtener una elevada EE del EMA, así como buenas características físicas de las vesículas. En primer lugar, se procedió a la formación de una película constituida por los materiales lipídicos, que posteriormente darán lugar a la bicapa del liposoma. Para ello, se añadieron 87.95 mg de FC, 10.44 mg CH, sal biliar y agente de carga (cantidad según formulación) a un matraz de fondo redondo de 50 mL. La mezcla de lípidos se disolvió en 8 mL de cloroformo/metanol (50:50). A continuación, se sometió la disolución a un proceso de rotaevaporación de los disolventes en el rotavapor a 58 °C hasta crear una fina película (Figura 6). Durante esta fase fue fundamental asegurarse de que el disolvente se evaporase de forma homogénea en toda la superficie, evitando la cristalización de los componentes y la formación de burbujas. La película se mantuvo a presión reducida durante 24 horas para asegurar la completa evaporación del disolvente. Figura 6 Película lipídica formada en el proceso de elaboración de liposomas por el método TLE. Posteriormente, se hidrató la película con la fase acuosa, constituida por el EMA en un tampón HEPES (pH 7.4). La función del HEPES es mantener los liposomas a un pH similar al del ojo e isotonizado con NaCl 150 mM. Para la formación de las vesículas, se sometió la mezcla a 5 ciclos de en agitar en vórtex (1 minuto) y calentar a 58°C (5 minutos). Se obtuvieron de esta forma los liposomas, que se envasaron rápidamente en viales de vidrio y almacenados a 4° C en oscuridad hasta su posterior uso. 18 5.7 CARACTERIZACIÓN DE LAS VESÍCULAS 5.7.1 ANALISIS DIMENSIONAL: TAMAÑO E INDICE DE POLIDISPERSIÓN (PDI) El tamaño de las vesículas se determinó por espectroscopía de correlación fotónica. Esta técnica calcula el radio hidrodinámico (RH) de las partículas que se encuentran suspendidas en un medio y, de este modo, el tamaño de dichas partículas, así como el índice de polidispersión (PDI). El PDI es un parámetro que aporta información sobre la homogeneidad de la muestra. Toma valores en un rango de 0-1, siendo más homogénea cuando menor es el valor. Valores elevados permiten detectar que las poblaciones son heterogéneas o que existen más de una población, siendo esto de especial importancia a la hora de observar la aparición de MMs por exceso de activador de borde. El equipo utilizado fue el Zetasizer Nano ZS que va a medir la distribución de los tamaños. Las medidas fueron realizadas por triplicado. 5.7.2 CARGA SUPERFICIAL: POTENCIAL Z (PZ) Las propiedades eléctricas de la superficie de los liposomas pueden tener gran influencia sobre la estructura de la bicapa, su fluidez e incluso su estabilidad durante el almacenamiento. Además, juega un papel importancia en la farmacodinamia de las formulaciones. En el caso de la formulación que nos ocupa, al contar la córnea con una carga superficial negativa, un valor positivo de la formulación favorecería la penetración y el tiempo de permanencia de esta (Law et al., 2000; Rabinovich-Guilatt et al., 2004). Por otro lado, cuando los liposomas posen una carga neutra, resulta inevitable que durante el almacenamiento se produzca el fenómeno de la agregación, pudiendo evitarse fácilmente introduciendo portadores de carga en la mezcla lipídica, de forma que se produzcan repulsiones electrostáticas entre los liposomas. El potencial zeta (ζ) es una medida de la carga que rodea a las partculas en suspensión. La movilidad electroforética refleja el grado de movimiento de coloides en dispersión bajo la influencia de un potencial eléctrico aplicado a través de ella y expresa la carga neta efectiva sobre la superficie de las vesículas. El equipo utilizado fue un Zetasizer Nano ZS que va a medir la distribución de cargas superficiales de las partículas. Las medidas fueron realizadas por triplicado. 19 5.7.3 EFICACIA DE ENCAPSULACIÓN (EE) Este parámetro refleja la cantidad en porcentaje de la proteína que se ha internalizado en las vesículas. Esta se determinó de forma indirecta, cuantificando la cantidad de proteínas existente en el medio y teniendo en cuenta la cantidad de proteína que se añadió. Para determinar la fracción no encapsulada, las muestras se sometieron a centrifugación en condiciones de 8000 rpm/4 °C/60 min/. Posteriormente, se retiró el sobrenadante y se cuantificó mediante el método del BCA. Por diferencia con el total de proteínas adicionado, que era conocido por la cuantificación del EMA y por el volumen añadido en cada lote, se determinó la fracción encapsulada y se representó en forma de porcentaje frente al total añadido. 5.7.4 INDICE DE DEFORMABILIDAD (ID) Uno de los parámetros más relevantes a la hora de caracterizar transfersomas es el índice de deformabilidad. Para la determinación de este factor, se hizo pasar la formulación optimizada de liposomas por una serie de poros de diámetro conocido con el fin de observar la capacidad de estos de recuperar su forma y tamaño una vez atravesados, evitando romperse y liberar el fármaco. Para ello, se diluyó la dispersión hasta 1.5 % p/v de lípidos y se extruyeron las vesículas a través de un filtro de membrana de policarbonato de 800 nm en un extrusor (LIPEX TM Thermobarrel Extruder), como se muestra en la Figura 7, bajo flujo de nitrógeno (González‐Rodríguez et al., 2012). El ID se calculó determinando el flujo (J) de la muestra a través del filtro y la relación del tamaño vesicular obtenido y el tamaño del poro. Para la determinación del flujo se hizo atravesar la formulación previamente tratada con el filtro de 800 nm por uno de 100 nm (rp) aplicando una presión de 290 psi durante 10 minutos. Posteriormente, se midió el tamaño promedio de los liposomas una vez extruidos (rv) utilizando el equipo Zetasizer nano (Malvern Instruments, Reino Unido). El ensayo se realizó por duplicado. El ID se calculó mediante la siguiente formula: 𝐼𝐷 = 𝐽 × ( 𝑟𝑣 𝑟𝑝 )2 26 En la Figura 11 se recogen imágenes de los cromatogramas obtenidos del estándar de hCG (A) y de una muestra del EMA (B). Se observa que la hCG es perfectamente detectable en el EMA, eluyendo ésta entre 2.30 y 2.34 minutos y mostrando un máximo de absorbancia en 265 nm. Figura 11: Cromatogramas obtenidos por HPLC. A la izquierda (A), la muestra de hCG estándar. A la derecha (B), una muestra de EMA. Para la cuantificación de las distintas muestras, se compararon las áreas de los distintos picos con el área del pico obtenido en el estándar (647252), de concentración conocida (1.075 μg/mL). 6.1.3 PORCENTAJE DE LA hCG DENTRO DE LAS PROTEÍNAS TOTALES DEL EMA Tras cuantificar por triplicado tanto las proteínas totales como la hCG del EMA, se determinó que ésta representaba un 7.846 % de las proteínas totales. Verificar que la hCG es una de las proteínas presentes en EMA como corroboran autores como Harada y Hershman (1978) permitió extrapolar la cantidad de proteínas totales existentes en las muestras de los ensayos de liberación y permeación, donde el elevado volumen de los reservorios donde se tomaba la muestra impedía utilizar de forma correcta el método BCA. 6.2 EXTRACCIÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL POLVO DE PLACENTA En este apartado, se evaluó la influencia de distintos factores que pudieran afectar a la extracción de las proteínas totales, del polvo de placenta comercial. De ellos, se seleccionaron las condiciones que repercutieron en una extracción más favorable. En la Figura 12 se puede apreciar cómo el aumento del tiempo de sonicación afecta considerablemente a la concentración de proteínas extraídas, disminuyéndola. Esto podría deberse a que la sonicación induce la precipitación de las proteínas, reduciendo así la cantidad solubilizada recuperada (Krishnamurthy et al., 2000). La velocidad de centrifugación no parece afectar a la cantidad extraída. A B 27 Figura 12: Concentración de proteínas extraídas en distintas condiciones. A la vista de los resultados obtenidos, las condiciones de extracción se fijaron en 30 segundos de sonicación y centrifugación a 3000 rpm/4 °C/ 10 min. 6.3 ESTUDIO DE ESTABILIDAD DE LAS PROTEÍNAS 6.3.1 TIEMPO Tal y como se observa en la Figura 13, las condiciones de conservación son las apropiadas para una solución de proteínas (Mobility, 2018). Figura 13: Estabilidad de las proteínas a lo largo del tiempo. 6.3.2 TEMPERATURA En la Figura 14 se recogen los termogramas correspondientes a las muestras de EMA control (A) y sometido a 80 °C durante 30 min. Se aprecia que los picos típicos de la desnaturalización de las proteínas (Cueto et al., 2003) no comienzan a aparecer hasta los 70° C. Figura 14: Resultados obtenidos en el DSC de la muestra de EMA. A la izquierda, la muestra sin someter a ningún tipo de tratamiento (A), se pueden observar varios picos que representan la desnaturalización de las proteínas presentes entre los 70 y 75ºC. En la imagen de la derecha, la muestra de EMA sometida a baño maría a 80ºC durante 30 minutos (B). Se puede apreciar cómo no aparecen los picos al encontrarse las proteínas ya desnaturalizadas. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 Concentración proteina (mg/mL)) 1 2 3 4 0 0,5 1 1,5 01234 Concentración de Proteinas (mg/mL) Semanas 1 2 3 4 A B 28 Dado que en el proceso de elaboración de los liposomas por TLE la temperatura máxima que se requiere es de 58 °C (González-Rodríguez et al., 2016), el método es adecuado para trabajar con proteínas. 6.3.3 CENTRIFUGACIÓN La determinación de proteínas de ambas muestras demostró que la centrifugación a estas condiciones no disminuye la cantidad de proteína recuperada en las condiciones de trabajo para determinar la EE (Figura 15). Figura 15: Concentraciones del EMA control y el sometido a las condiciones de sedimentación de los liposomas. 6.4 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MICELAR CRÍTICA (CMC) DEL ÁCIDO CÓLICO Este estudio se planteó con idea de determinar la cantidad de activador del borde (sal biliar) a usar en la elaboración de los liposomas, tal que se asegurara su incorporación en la bicapa y no la formación de micelas. Para ello, se llevó a cabo la determinación de la transmitancia de las muestras en el espectrofotómetro, estableciéndose el máximo en 657 nm. A partir de ahí, se determinó el porcentaje de transmitancia de cada uno de los lotes a esa longitud de onda. Los resultados obtenidos mostraron un incremento del valor de transmitancia a medida que aumentó la cantidad del colato. Ello puede deberse a la formación de micelas que, al tener un menor tamaño que los liposomas, interfieren menos en el paso de la luz (Svarc et al., 2012). Asimismo, cuando se evaluaron los tamaños de las muestras coloidales, se pudo observar cómo a concentraciones mayores de 6 mM deja de obtenerse una única población, detectándose al menos dos poblaciones distintas en los lotes elaborados con una concentración de NaC de 12 mM o mayor, como se recoge en la Tabla 10. Esto se debe a que al superarse la CMC aparecen las MMs, las cuales poseen tamaños muy dispersos (Schubert, 2003). 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 Concentración proteÍnas (mg/mL) Control 8000 rpm/4º/60 min 29 Con respecto al potencial Z, conforme se aumenta la cantidad de NaC, éste adquiere un valor más negativo, como es lógico al tener carga negativa la sal biliar. RH (nm) PDI PZ (mV) Transmitancia (%) L1 1042.7 ± 70.7 0.102 ± 0.103 -7.7 ± 0.5 7.3 ± 0.03 L2 815.6 ± 31.4 0.232 ± 0.028 -8.7 ± 0.2 12.69 ± 0.06 L3 1189.9 229.0 ± 129.8 ± 113.0 0.280 ± 0.082 -10.8 ± 0.3 18.55 ± 0.06 L4 457.9 5305.3 ± 4.4 ± 58.5 0.297 ± 0.005 -9.6 ± 0.1 31.97 ± 0.14 L5 1264.3 15.1 ± 98.4 ± 13.2 0.374 ± 0.080 -14.5 ± 0.2 36.09 ± 0.05 Tabla 10: Características de los distintos lotes elaborados con cantidades crecientes de NaC sódico. A la vista de los resultados obtenidos, se fijó en 6 mM la concentración de activador del borde que se utilizará en los distintos lotes, concentración que permitía la incorporación de la sal biliar en la bicapa sin formación de MMs. 6.5 INFLUENCIA DE LOS FACTORES VARIABLES EN LA FORMULACIÓN Una vez establecida la cantidad de sal biliar a incorporar en la formulación, se continuó el trabajo evaluando la influencia que determinados factores de formulación podrían afectar a las características de los sistemas coloidales obtenidos. Como se muestra en la sección de metodología, se seleccionaron cuatro factores a tres niveles (Tabla 6), cuya matriz experimental correspondió a una L9 Taguchi (Tabla 7). En las Figuras 16 y 17 pueden observarse una de las réplicas que se elaboraron de cada lote para esta etapa, recogiéndose en la Tabla 11 las características de cada uno. Figura 16: Lotes elaborados para la etapa de screening. Figura 17: Lotes elaborados después de ser agitados en vórtex durante 10 segundos. Se puede observar cómo los lotes donde se habían separado las fases vuelven a estabilizarse tras una simple agitación. 30 RH (nm) PDI PZ (mV) EE (%) 1 634.9 ± 136.8 0.384 ± 0.0016 - 9.66 ± 0.91 41.48 ± 10.97 2 1415.0 ± 50.9 0.220 ± 0.0026 + 26.50 0 68.78 ± 5.74 3 578.6 ± 2.3 0.536 ± 0.016 + 24.05 ± 1.34 - - 4 908.7 ± 22.7 0.229 ± 0.069 - 9.03 ± 0.64 58.60 ± 5.78 5 1156.8 ± 447.2 0.355 ± 0.187 + 28.05 ± 1.34 27.11 ± 13.23 6 1332.5 ± 89.8 0.206 ± 0.001 + 13.05 ± 1.34 64.06 ± 8.47 7 1067.0 ± 8.5 0.152 ± 0.057 - 8.61 ± 0.96 58.68 ± 4.29 8 1992.0 ± 647.5 0.050 ± 0.018 + 12.47 ± 6.70 81.86 ± 2.60 9 564.85 ± 137.8 0.580 ± 0.073 + 12.00 ± 3.12 - - Tabla 11: Características de los lotes ensayados en el screening. La caracterización de todos los lotes fue posible excepto en los lotes 3 y 9, los cuales presentaron muchas poblaciones de tamaño y se desestabilizaban con facilidad. Además, tras la centrifugación necesaria para el cálculo de la EE, los liposomas no precipitaron por lo que no se pudo caracterizar este parámetro en ellos, como se aprecia en la Figura 18. Esto puede ser debido a la formación de MMs, que poseen un menor tamaño y, por lo tanto, no precipitan en las mismas condiciones que los liposomas (Liu et al., 2019). La distribución de tamaños que se muestra en la Figura 19 y los valores elevados de PDI apoyan esta hipótesis. Los lotes 1 y 8, aunque también presentaban 2 poblaciones, no sufrieron este problema. Figura 18: Muestras de los distintos lotes elaborados tras el proceso de centrifugación, ordenados del 1 al 9. Se puede observar como en los lotes 3 y 9 liposomas no precipitaron, lo cual hizo imposible la separación del sobrenadante, necesaria para la determinación de la EE. Figura 19: Distribución de tamaños de lotes con una única o varias poblaciones. Lotes 9 (A) y 7 (B). A continuación, se procederá a la exposición de los resultados obtenidos en el tratamiento del screening del diseño experimental. Para determinar qué factores eran significativos en cada una de las variables, se establecieron unos límites de confianza, superior (UDL) e inferior (LDL), de forma que cuando un valor se encuentra fuera de ese margen se considera que ese factor es influyente en la respuesta evaluada. 31 6.5.1 INFLUENCIA EN EL TAMAÑO Los gráficos ANOM referentes al tamaño de los liposomas mostraron que el tamaño era significativamente menor al usar NaTC como activador del borde (Figura 20). Ello se debe a que al formar MMs y ser estas de menor tamaño, el tamaño medio de las poblaciones es menor. Figura 20: Gráficos ANOM correspondientes a la respuesta del tamaño con respecto al activador del borde (A), agente de carga usado (B), cantidad de agente de carga (C), y con respecto a la concentración del EMA (D). En cambio, no se observaron diferencias significativas entre NaC y NaDC. Por otra parte, el agente de carga que influyó de forma más significativa en el tamaño obtenido es la EA, obteniéndose con ésta el mayor tamaño. Esto es posiblemente debido al elevado peso molecular de esta, que contribuye a la obtención de vesículas de mayor tamaño al interponerse en la bicapa (Arroyo García, 2017). La cantidad de agente de carga y la concentración de proteínas no influyeron significativamente en los valores de tamaño obtenidos. 6.5.2 INFLUENCIA EN EL PDI En el estudio ANOM sobre el PDI (Figura 21), se observó que el uso de NaTC como activador del borde aumentó significativamente el valor de este, lo cual parece ser debido a que la cantidad ensayada de NaTC supera la CMC, obteniéndose MMs (Schubert, 2003). A B C D 32 Figura 21: Gráficos ANOM correspondientes a la respuesta del PDI con respecto al activador del borde (A), agente de carga usado (B), cantidad de agente de carga (C), y con respecto a la concentración del EMA (D). De nuevo, no se observan diferencias significativas entre NaC y NaDC para este parámetro. El agente de carga más idóneo parece ser la EA, ya que es la que permite obtener un menor valor de forma significativa. La cantidad de agente de carga que permitió obtener un menor valor fue el menor nivel ensayado, pero como se detalla en el apartado 6.5.3, este no interesa por no proporcionar un valor de potencial Z adecuado. Entre los otros dos niveles no existen diferencias significativas. Por último, respecto a la concentración de proteínas, el nivel intermedio (0.187 mg/mL) es el que proporciona un menor PDI de forma significativa. 6.5.3 INFLUENCIA EN EL POTENCIAL Z El activador del borde que obtuvo un mayor valor de potencial de forma significativa fue el NaTC, siendo el que menos el NaDC (Figura 22). Figura 22: Gráficos ANOM correspondientes a la respuesta del potencial Z con respecto al activador del borde (A), agente de carga usado (B), cantidad de agente de carga (C), y con respecto a la concentración del EMA (D). A B D C B A C D 33 Se observa también la existencia de diferencias significativas entre el uso de todos los niveles de agente de carga, al ser uno de los niveles la ausencia de agente de carga y poseer uno de los elementos básicos formadores de la bicapa (FC) una carga negativa, y EA y DDAB ser de naturaleza catiónica. Asimismo, se aprecia con claridad una relación lineal entre la cantidad de agente de carga añadida y el potencial Z obtenido como también observaron Carrión et al. (1997). Con respecto a la EE no existen diferencias significativas entre los niveles ensayados. 6.5.4 INFLUENCIA EN LA EE Como se recoge en la Figura 23, el resultado más revelador en las gráficas ANOM de la EE es la relación lineal inversa existente entre la cantidad de agente de carga y la EE obtenida, creando así un conflicto de objetivos, ya que se buscan potencial y EE máximos y estos tienen tendencias contrarias al aumentar la cantidad. Figura 23: Gráficos ANOM correspondientes a la respuesta de la EE con respecto al activador del borde (A), agente de carga usado (B), cantidad de agente de carga (C), y con respecto a la concentración del EMA (D). Por otro lado, se observa que NaTC proporcionó el menor valor de EE de forma significativa y que no existen diferencias entre NaC y NaDC. La EA mostró también ser el agente de carga más indicado al destacar la EE obtenida con ella, siendo el nivel intermedio de concentración de proteínas el que presentó un mayor valor de EE. Ante todos los resultados obtenidos anteriormente, y a modo de resumen, se decidió fijar el agente de carga en EA, ya que permitió obtener los mejores resultados en PDI, Z y EE, y la concentración de proteínas en 0.187 mg/mL. Los factores de activador del borde y cantidad de agente de carga se fijarían en un posterior estudio de optimización, descartando los factores de NaTC y 0.02 mmol, respectivamente. A B C D 34 6.6 OPTIMIZACIÓN DE LA FORMULACIÓN Una vez descartado el NaTC como sal biliar y la cantidad de 0.02 mmol para los estudios posteriores, se realizó una batería de cuatro experimentos con las combinaciones de NaC y NaDC, a 0.04 y 0.06 mol. En la Tabla 12 se detallan los resultados de la caracterización de los lotes elaborados para la optimización: RH (nm) PDI PZ (mV) EE (%) A 596.9 ± 108.8 0.468 ± 0.187 + 25.06 ± 3.37 76.64 ± 2.47 B 598.2 ± 58.8 0.357 ± 0.147 + 28.50 ± 3.75 59.67 ± 29.58 C 879.5 ± 169.7 0.268 ± 0.086 + 21.50 ± 3.56 76.83 ± 22.24 D 813.9 ± 52.1 0.093 ± 0.033 + 26.95 ± 2.90 75.44 ± 7.23 Tabla 12: Características de los lotes elaborados para la etapa de optimización. En adición a estos resultados, cabe destacar que en los lotes 1 y 2 se detectaron MMs, haciéndose patente este hecho por la distribución de tamaños y los valores de PDI elevados, como se puede apreciar en la Figura 24. Por este motivo estos lotes fueron descartados, quedando la decisión entre los lotes 3 y 4 y, por lo tanto, fijándose como activador del borde el NaDC. Figura 24: Características de los lotes elaborados para la etapa de optimización. Como quedó patente en el estudio ANOM, al aumentar la cantidad de agente de carga, el potencial Z obtenido aumenta de forma lineal como afirman Villasmil-Sánchez et al. (2010). Esto, junto a que los resultados de EE obtenidos en ambos lotes fueron similares, hicieron que la cantidad añadida en los lotes definitivos fuese el nivel más alto, 0.06 mmol. Por tanto, la composición definitiva se fijó en (Tabla 13): 35 FUNCIÓN COMPONENTE COMPOSICIÓN CUANTITATIVA Componentes básicos de la bicapa FC 0.11 mmol CH 0.027 mmol Activador del borde NaDC 0.018 mmol Agente de carga EA 0.06 mmol Fase acuosa HEPES 7.4 3 mL Principio activo EMA 0.187 mg/mL Tabla 13: Composición optimizada y definitiva de la formulación. Las características del lote óptimo son las detalladas en la Tabla 12, lote D. 6.6.1 INDICE DE DEFORMABILIDAD (ID) El ID es un parámetro único y crucial de los transfersomas, que permite diferenciarlos de los liposomas convencionales. La elasticidad conferida por el activador del borde les permite atravesar diámetros de poro mucho menores que sus propios radios. A nivel biológico, esto se traduce en una capacidad para atravesar las membranas biológicas reduciendo el riesgo de romperse, liberando el fármaco encapsulado durante el proceso de penetración (Chen et al., 2016). El valor de ID obtenido para la formulación optimizada fue de 4.38 ± 0.4, lo que demuestra la elevada flexibilidad de las vesículas. 6.6.2 ANÁLISIS MORFOLÓGICO DE PARTÍCULAS MEDIANTE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO ALTA RESOLUCIÓN (FEGSEM) En las microfotografías tomadas mediante FEGSEM (Figura 25) se puede apreciar la esfericidad de los sistemas lipídicos, confirmando naturaleza vesicular. Figura 25: Imágenes tomadas de los liposomas mediante FEGSEM.