Procedimiento de estabilización de las aguas de procesado de semilla de Lupinus spp., extracción de alcaloides y su uso como biocida ecológico

ES 2 539 644 B2 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 21 Número de publicación: 2 539 644 Número de solicitud: 201301123 51 Int. CI.: A01N 65/20 (2009.01) A01P 7/04 (2006.01) A01P 3/00 (2006.01) 12 PATENTE DE INVENCIÓN CON EXAMEN PREVIO B2 54 Título: Procedimiento de estabilización de las aguas de procesado de semilla de Lupinus spp., extracción de alcaloides y su uso como biocida ecológico 73 Titular/es: UNIVERSIDAD DE SEVILLA (100.0%) Paseo de las Delicias s/n - Pabellón de Brasil 41013 Sevilla (Sevilla) ES 72 Inventor/es: FERNÁNDEZ-BOLAÑOS GUZMÁN, José María; MAYA CASTILLA, Inés; MARTOS DELGADO, Sergio; MANSILLA VÁZQUEZ, José Pedro y PÉREZ OTERO, Rosa 22 Fecha de presentación: 28.11.2013 43 Fecha de publicación de la solicitud: 02.07.2015 Fecha de la concesión: 17.12.2015 45 Fecha de publicación de la concesión: 28.12.2015 57 Resumen: La invención que se presenta pertenece al sector de la agroquímica y la agricultura y tiene como objeto proporcionar un procedimiento para la estabilización y conservación de las aguas de procesado de la semilla de Lupinus spp., con sulfitos o bisulfitos y su utilización con biocida. Asimismo, también aborda la separación de las fracciones alcaloideas y no alcaloideas de dichas aguas con tierra de diatomeas macroporosas y su utilización como biocida ecológico. Se puede realizar consulta prevista por el art. 40.2.8 LP. Aviso: 5 Procedimiento de estabilizaci& de las aguas de procesado de semilla de L u p i nu s s pp , extracci& de alcaloides y su uso como biocida ecolOgico. OBJETO DE LA INVENCION La presente invenciOn, segOn se expresa en el enunciado de esta memoria descriptive, tiene por objeto aportar soluciones respecto al tratamiento de las aguas de procesado de 10 las semillas que actUan como biocidas, ya que debido a la gran cantidad de materia organica que contienen son susceptibles de sufrir ennegrecimiento paulatino, descomposici& y putrefacciOn. Asi, en esta patente describimos la estabilizaci& de estas aguas de procesado y su utilized& como bioplaguicida ecolOgico. 15 La tecnica objeto de la presente patente se encuadra en el area de la agroquimica y de la agriculture. El Sector de Actividad en el que se aplicarla la invencion corresponde a la de productos fitosanitarios aislados de plantas, concretamente de distintas especies de L u p i nu s . 20 ANTECEDENTES EN EL ESTADO DE LA TECNICA Atendiendo al estado de la tecnica, son muchas las publicaciones cientificas que describen la presencia de alcaloides de tipo quinolizidinico tanto en semillas de L u p i nu s 25 spp. (Resta, D.; Boschin, G.; D'Agostina, A.; Arno Idi, A. Mol. Nutr. Food Res., 2008, 52, 490-495) como en las partes aereas de la planta (Neto, A. T.; Oliveira, C. Q.; Ilha, V.; Pedroso, M.; Burrow, R. A.; Delco!, I. I.; Morel, A. F. J. Mol. Struct., 2011, 1004, 174-177; Cook, D.; Lee, S. T.; Pfister, J. A.; Stonecipher, C. A.; Welch, K. D.; Green, B. T.; Panter, K. E. Phytochem. Anal., 2012, 23, 278-284). 30 Los alcaloides, la mayor parte de ellos quinolizidinicos, suponen entre el 0.4% y el 5% en peso de la semilla (Ganzera, M.; Kruger, A.; Wink, M. J. Pharm. Biomed. Anal., 2010, 53, 1231-1235), y le aportan sabor amargo a este. Estos metabolitos son sintetizados por las plantas de L u p i nu s como mecanismo de defensa frente a insectos y herbivoros (Kordan, DESCRIPCIÓN  ES 2 539 644 B2 2 B.; Dancewicz, K.; Wroblewska, A.; Gabrys, B. Phytochem. Lett., 2012, 5, 71-77), ya que presentan propiedades neurotOxicas. En humanos es necesaria una ingesta elevada para tener sintomas (Litkey, J.; Dailey, M. W. Am. J. Emerg. Med., 2007, 25, 215-217). La lupanina es un alcaloide quinolizidinico caracteristico del genero L u p i nu s ya que esta 5 presente en todas las especies, siendo con frecuencia el alcaloide mayoritario. (Ganzera, M.; Kruger, A.; Wink, M. J. Pharm. Biomed. Anal., 2010, 53, 1231-1235) Tiene un efecto anticolinergico sobre el sistema nervioso central, bloqueando reversiblemente los receptores del neurotransmisor acetilcolina. Algunas de las familias mas comunes de insecticidas, como los nicotinoides y los carbamatos actuan de manera similar. Tambien 10 ha sido descrita una actividad antimicrobiana de extractos ricos en alcaloides (Villa-Ruano, N.; Pacheco-Hernandez, Y.; Rubio-Rosas, E.; Ruiz-Gonzalez, N.; Cruz-Duran, R. Lozoya- Gloria, E.; Zurita-Vasquez, G.; Franco-Monsreal, J. Arch. Biol. Sci., 2012, 64, 1065-1071; KOcOkboyaci, N.; Ozkan, S.; Tosun, F. Rec. Nat. Prod., 2012, 6:1, 71-74) donde entre otros la lupanina y la 13-hidroxilupanina estan presentes, asi como una actividad 15 antifungica y alelopatica (Erdemoglu, N.; Semiha, 0.; Fatma, T. Phytochem. Rev. 2007, 6, 197-201). Los caldos de desamargamiento derivados de la preparacion industrial del altrannuz, son abundantes en alcaloides y otros metabolitos hidrosolubles presentes en la semilla de L u p i nu s spp., de ahl el interes en el aprovechamiento de dichos caldos como insecticida 20 (Ortiz Falantes, J. 2008, WO 2008003795) y como promotores del crecimiento de plantas (Przybylak, J. K.; Ciesiolka, D.; Wysocka, W.; Garcia-Lopez, P. M.; Ruiz-LOpez, M. A.; Wysocki, W.; Gulewicz, K. Ind. Crops Prod., 2005, 21, 1-7). Los extractos acuosos de semillas de L u p i n u s spp. tambien presentan actividad insecticida (Bermudez-Torres, K.; Martinez Herrera, J.; Figueroa Brito, R.; Wink, M.; Legal, 25 L. BioControl, 2009, 54, 459-466), nematicida, (Yildiz, S. Afr. J. Biotechnol., 2011, 10, 13252-13255) antifungica y antibacteriana (Erdemoglu, N.; Semiha, 0.; Fatma, T. Phytochem. Rev. 2007, 6, 197-201). Se ha determinado (Stobiecki, M.; Blaszczyk, B.; Kowalczyk-Bronisz, S. H.; Gulewicz, K. J. Appl. Toxicol., 1993, 13, 347-52) la toxicidad en ratones tanto de extractos acuosos de la semilla de L u p i nu s spp. conteniendo un 10% de 30 alcaloides (LD50 > 4000 mg.kg-1 de peso del animal), como de distintas fracciones. Recientemente se ha descrito la actividad antimicrobiana (Carreira, A.; Monteiro, S.; Ferreira, R. B. Brit. UK Pat. Appl., 2012, GB 2484509 A 20120418.), antifOngica y como promotor del crecimiento de plantas de un extract° de proteinas obtenidos a partir de ES 2 539 644 A1  3 ES 2 539 644 B2 3 semillas, cotiledones o plantulas (Ferreira, R. B.; Monteiro, S.; Teixeira, A. R.; Loureiro, V. PCT Int. App!., 2007, WO 2007010459 A2 20070125). Se ha asignado dicha actividad al peptido BLAD (Banda L u p i n u s Alba Doce) de 20 kDa generado durante la germinacion a partir de P-conglutina. (Monteiro, S.; Freitas, R.; Rajasekhar, B. T.; Teixeira, A. R.; 5 Ferreira, R. B. PLoS One, 2010, 5, 11) A modo de conclusiOn, esta invencion aporta respect° al estado de la tecnica, un procedimiento de estabilizaciOn de las aguas de procesado de la semilla de L u p i n u s spp., que evita una degradaci6n progresiva con un oscurecimiento gradual, aparicion de materia 10 insoluble y perdida de actividad como insecticida. Asi mismo, esta invenciOn tambien aborda la separaciOn de los alcaloides presentes en estos caldos que implica: 15 ExtracciOn en fase solida de los alcaloides utilizando columnas o cartuchos con relleno de tierra de diatomeas macroporosas, en sustituciOn de los procedimientos tradicionales de extracci6n liquido-liquido. Se obtiene asi una fracci6n soluble en disolventes organicos apr6ticos (por ejemplo diclorometano) constituida por los alcaloides presentes en las aguas y otra fracci6n 20 no alcaloidea (muy pobre o carente de alcaloides) que se extrae de la columna por tratamiento con disolventes polares prOticos no acuosos (por ejemplo etanol o metanol). Por Ultimo, en esta invenciOn se describe la aplicaciOn como plaguicida tanto de la fracci6n 25 alcaloidea como de la fracci6n no alcaloidea. EXPLICACION DE LA INVENCION A modo de explicaciOn de la invencion "Procedimiento de estabilizacion de las aguas de 30 procesado de semilla de Lupinus spp, extracciOn de alcaloides y su uso como biocida ecologico" la misma trata de desplegar de forma secuencial los siguientes objetivos: Desarrollar un procedimiento para la estabilizacion de las aguas de desamargamiento derivados de la preparaci6n industrial del altramuz ( L u p i n u s spp.). ES 2 539 644 A1  4 ES 2 539 644 B2 4 Establecer un procedimiento para la separacion en fase sOlida de los alcaloides presentes en las aguas. Utilizar los extractos alcaloideos y no alcaloideos como plaguicidas. 5 Para ello, el procedimiento propuesto con la presente invencion se despliega en base a las siguientes etapas; A. La centrifugacion de los caldos de desamargamiento de la semilla de L u p i nu s s p p . para eliminar materia insoluble si la hubiera. 10 B. La adici6n a la fraccion soluble obtenida despues de la centrifugacion de alguno de los siguientes elementos: Benzoato s6dico y pirosulfito de sodio E223. Pirosulfito de potasio E224, HidrOgenosulfito de sodio E222. 15 v Sulfito de sodio E221. C. La conservacion a 5 ° C y en la oscuridad con objeto de prolongar la actividad. D. Extraccion alternativa de la fracciOn alcaloidea y no alcaloidea. ES 2 539 644 A1  5 ES 2 539 644 B2 5 A continuacion se hace un recorrido completo del procedimiento donde se describen cada una de las referidas etapas. FASE 1-EstabilizaciOn del color frente a microomanismos 5 Los extractos naturales de plantas con frecuencia sufren una degradaciOn progresiva que conlleva la modificaciOn de sus propiedades y la proliferaciOn de microorganismos. En el caso de los caldos obtenidos en el desamargamiento de la semilla del altramuz, se produce un oscurecimiento gradual que evidencia la degradacion del producto, adernas de 10 presentar el inconveniente de perder atractivo visual a la hora de comercializar el producto. Los caldos de desamargamiento se someten a centrifugaci6n para eliminar posible materia solida en suspensiOn. La fracci6n sOlida se desecha y la fraccion liquida (sobrenadante) se ha estabilizado utilizando diversas combinaciones de productos como 15 conservantes. Se ha procedido al estudio de la estabilizaciOn del color y aspecto del sobrenadante. a. Hemos comprobado que se produce un ennegrecimiento marcado de la muestra conteniendo 2 g/L de benzoato sOdico tras un mes a temperatura ambiente tanto con la muestra en un vial cerrado como expuesto al aire. 20 b. Hemos comparado la actividad del sulfito sOdico (E221) y el pirosulfito sodico, tambien llamado pirosulfito sodico (E223) sobre la estabilizacion del color, comprobando que el pirosulfito resulta mas efectivo que el sulfito. Asi por ejemplo, el color del sobrenadante despues de dos meses bajo luz indirecta y conteniendo una cantidad de 0.2 mg/mL de pirosulfito (ensayo 7, Tab la 1) es mas claro que Si usamos 2 mg/mL de sulfito (ensayo 25 5, Tab la 1). Utilizando 2 mg/mL de pirosulfito, la muestra es practicamente incolora tras 2 meses. La mayor actividad del pirosulfito se debe su capacidad de dar productos de adici6n bisulfitica por reacciOn con el grupo carbonflico de los azucares reductores. De esta 30 manera, se inhiben las etapas iniciales de la reaccion de Mail lard (o de pardeamiento no enzimatico) que da lugar una compleja ruta de transformaciones quirnicas en las que estan implicados azikares y aminoacidos/proteinas y que origina productos coloreados. ES 2 539 644 A1  6 ES 2 539 644 B2 6 5 10 15 20 Tabla 1. Ensayos de estabilizaciOn del color del sobrenadante, usando distintas concentraciones de los aditivos sulfito s6dico y metabisulfito s6dico, a lo largo de 2 meses. E n s a Y ° C o n c e n t r a c i on a r t i l y ° I n g i m A d i t i v o a R e s u b i d e l n d i r e c t a 0 . 1 S t i ll t o sô c i c o I n d i r e c t a 0 . 2 S u l fi t o so c i a l I n d i r e c t a 1 . 0 S t ifi t o s ó c k o I n d i r e c t a 2 . 0 S t l l i t o só di c o I n d i r e c t a 0 . 1 p i r o s i lfi t o s ó di c o I n d i r e c t a 0 . 2 p i r o s t i f t o s ó di co I nd i r e c t a 1 . 0 p i r o s u l fi t o s e r i c o I n d i r e c t a 2 . 0 p i r o s t i fi t o s t o i c ° I n c l i r e c t a +4 + 1 0 D i 1 1 0 . 1 p i r o s . i f l t o s ó c i c o D i r e c t a 1 2 0 . 2 p i r o s i i t l t o s ó c b o o D i r e c t a 1 3 1 . 0 p i r o su l f i t o B a c k e D i r e c t a 1 4 2 . 0 p i r o s u l fi t o s ô d i co D i r e c t a a La muestra original contiene BzONa (2 g/L) como aditivo. b Ennegrecimiento de la referencia; + no ennegrecimiento; ++ ligero aclaramiento;+++ aclaramiento marcado. 25 Adernas hemos estudiado la influencia de otros factores como la temperatura y la luz solar comprobandose que ambos afectan negativamente a la conservaciOn del color. Las muestras conservadas a 5 °C presentaban una coloraciOn menor que las conservadas a temperatura ambiente. Las muestras expuestas a la luz directa del sol (ensayos 10-14, Tabla 1) presentan un color mas oscuro que las expuestas a luz indirecta. Observandose 30 como la intensidad del color disminuye al aumentar la concentracion de pirosulfito. En cuanto a la conservaciOn del caldo frente a microorganismos, hemos comprobado que en caldos de desamargamiento de altramuz sin aditivos, se produce la putrefacciOn en ES 2 539 644 A1  7 ES 2 539 644 B2 7 5 menos de una semana con proliferaciOn de microorganismos y aparici6n de un olor desagradable. Hemos comprobado que tanto el benzoato como el pirosulfito sodico preserva a la muestra de la putrefaccion durante al menos una semana a temperatura ambiente. La cornbinaciOn de ambos conservantes en concentraciones de 1.0 mg/mL (Tabla 2) preserva la muestra durante al menos un mes. Tabla 2. Ensayos de conservacion de los caldos a temperatura ambiente frente a la 10 putrefacci6n usando pirosulfito y benzoato s6dico. 15 E C on c e r d m c i ô n N a 2 S 2 O 1 m g f m L o n c e n t r a c i 6 n B z O N a m g i n t P u I r e f a c c i o n s a m a r a ) P u i r e f a c c i o n ( 1 m e s ) S i S i b e n z o a t o s o c i m e 1 . 0 N o S i p r o s u I fi t o se c r e c o 1 . 0 S i m e z c l a 1 . 0 1 . 0 N o N o 20 a Las muestras se conservan en tubos de ensayo a temperatura ambiente con cierre no hermetic°. Por tanto, la adici6n combinada de pirosulfito s6dico (para estabilizar el color e impedir el crecimiento de microorganismos) y de benzoato s6dico (contra los microorganismos) 25 resulta ser muy efectiva. Por ejemplo a una concentracion de 1 g/L de bisulfito s6dico y 1g/L de benzoato sOdico no se observa oscurecimiento de los caldos ni proliferacion de microorganismos tras un mes a temperatura ambiente. Otras concentraciones e incluso otras combinaciones de estabilizantes tambien resultaron efectivas para dicho fin. 30 FASE 2-Extracci6n de alcaloides en fase solida Los caldos de desamargamiento sometidos a centrifugacion y desechada la fraccion solida, la fracci6n liquida (sobrenadante) se basifica hasta pH 12, y se vuelve a ES 2 539 644 A1  8 ES 2 539 644 B2 8 5 centrifugar. El sobrenadante obtenido se introduce en una columna de tierra de diatomeas macroporosa y despues de unos minutos para que el liquido se distribuya a lo largo de la columna, se hacen pasar CH2Cl2 por la columna recolectando la fase organica (Hamada fracciOn alcaloidea), mientras que la fase acuosa sigue retenida en el interior de la columna. Se realiza una o mas extracciones con diclorometano hasta que se observa que no se recupera mas materia. A continuaci6n se hacen pasar por la columna etanol 96% con lo que se recupera la materia retenida en la columna disuelta en agua-alcohol (denominada 10 fraccion no alcaloidea o hidrosoluble). Ambas fracciones se concentran a sequedad a presiOn reducida. La fracci6n alcaloidea se obtiene en forma aceitosa de color amarillo palido y la fraccion no alcaloidea presenta un aspecto de solid° amorfo de color marrOn. Ambas fracciones fueron sometidas a analisis 15 por GC-MS y evaluadas como insecticidas. FASE 3-Analisis de alcaloides Los analisis de la fracciOn alcaloidea se realizaron en un cromatOgrafo de gases Agilent 20 GC 6890N, equipado con un muestreador autornatico (Autosampler 7683 series de Agilent) y una columna capilar de alta resoluciOn Agilent J&W Scientifics DB-5ms (30m x 0.25mm x 0.25pm). El cromat6grafo de gases esta acoplado con un espectrometro de masas Micromass AutospecQ, donde la fuente de ionizacion opera en modo de impacto electrOnico (El) a 70 eV. Los datos se adquieren desde 50 hasta 650 m/z. 25 FASE 4-Actividad como insecticida Se evaluo la eficacia como insecticida de las fracciones alcaloideas y no alcaloideas obtenidas de las aguas de desamargamiento de la semilla de l u p i nu s . Como ensayo modelo se analizaron dichas fracciones como insecticida en el control de pulgones 30 Toxoptera citricidus Kirkaldi, el afido transmisor del virus de la tristeza de los citricos (CTV), y sobre otras especies de insectos. ES 2 539 644 A1  9 ES 2 539 644 B2 9 5 10 'labia 6 Actividaci insectidda del caldo de caccion de semiNas de L u p i n u s a l b u s y de las fracciones alcaloideas y no alcaloideas t a n t e a A p h i s p e a en manzano. l ius s t r a E fi c a c i a a l a s 2 4 h c l . t . E f i c a c i a a l as 4 8 M t C a l d o c m : d o n 7 5 1 00 A l c a l o i de s p H 5 1 0 0 - A l c a l o i de s p H 1 2 95 1 0 0 F r a c c i o n n o a l c a l o i d e a 20 1 0 0 C on t r o l 0 1 5 Tabla 7. Actividad insecticida del caldo de cocci% de semillas de L u p i n u s s i b u s y de las 15 tracdones alcaloideas y no alcalaideas frente a Ctenarytaira s p a t u k t a sobre brote de 20 25 30 E uc e l y p t o s & b u t I I A m a l f i B e n i c i a a l o s 24 h . d . t . E f i c a c i a a l a s 4 8 l t d . t . C a l d o c o c c i b n 7 0 1 0 0 A l c a l o i d e s p H 5 1 0 0 - A l c a l o i d e s p H 1 2 7 5 9 5 F r a c d o n n o a l c a l o i de a 1 0 1 0 0 C on t r o l 0 1 0 ES 2 539 644 A1  16 ES 2 539 644 B2 16 5 1. Procedimiento de estabilizaciOn de las aguas de procesado de semilla de Lupinus spp y extracciOn de alcaloides caracterizado por Ilevarse a cabo en base a un procedimiento que aborda las siguientes etapas: A. La centrifugaciOn de los caldos de desamargamiento de la semilla de L u p i n u s s p p . para eliminar materia insoluble si la hubiera. B. La adicion a la fracci6n soluble obtenida despues de la centrifugaci6n de 10 alguno de los siguientes elementos: ✓ Benzoato s6dico y pirosulfito de sodio E223. ✓ Pirosulfito de potasio E224, ✓ Hidrogenosulfito de sodio E222. ✓ Sulfito de sodio E221. 15 C. La conservacion a 5 ° C y en la oscuridad con objeto de prolongar la actividad. D. Extraccion alternativa de la fracciOn alcaloidea y no alcaloidea. 2. Uso como biocida ecolOgico, tanto insecticida como fungicida, de los extractos acuosos obtenidos mediante el procedimiento descrito en la reivindicacion 1 sin 20 acometer la extracciOn de la fracci6n alcaloidea y no alcaloidea. 3. Procedimiento de estabilizaciOn de las aguas de procesado de semilla de Lupinus spp y extraccion de alcaloides segun reivindicacion 1, caracterizado porque en la etapa D, el procedimiento de extracciOn de los alcaloides contenidos en los 25 extractos acuosos obtenidos en el tratamiento (remojo, coccion o lavado) de la semilla de L u p i nu s s p , se Ileva a cabo segOn el siguiente proceso: A. El uso de una matriz de tierras diatomeas macroporosas como soporte para la extracci6n liquido-liquido de los alcaloides contenidos en extractos acuosos de 30 L u p i nu s s p . B. La eluciOn de los alcaloides con un disolvente organic° inmiscible con el agua. C. La posterior adicion a la matriz de un disolvente polar (etanol, agua) para la recuperacion de una fracciOn libre de alcaloides. REIVINDICACIONES  ES 2 539 644 B2 17 4. Uso como biocida ecologic°, tanto insecticida como fungicida, de la fracci6n alcaloidea obtenida mediante el procedimiento descrito en la reivindicacion 1 y 3. 5 5. Uso como biocida ecologic°, tanto insecticida como fungicida, de la fraccion no alcaloidea obtenida mediante el procedimiento descrito en la reivindicaciOn 1 y 3. ES 2 539 644 A1  18 ES 2 539 644 B2 18  ES 2 539 644 B2 19  ES 2 539 644 B2 20  ES 2 539 644 B2 21  ES 2 539 644 B2 22 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 21 N.º solicitud: 201301123 22 Fecha de presentación de la solicitud: 28.11.2013 32 Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA 51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas A A A WO 2008003795 A1 (BIOFAL 2002, S. L.) 10.01.2008, páginas 1-4; reivindicaciones 1,3. GB 230203 A (WILHELM SCHMITZ) 12.03.1925, página 1, líneas 43-46,54-60; página 1, línea 83 – página 2, línea 14. GANZERA, M., KRÜGER, A., WINK, M. Determination of quinolizidine alkaloids i n different Lupinus species by NACE using UV and MS detection. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010; Vol. 53, nº 5, páginas 1231-1235. ISSN 0731-7085. Doi: 10.1016/j.jpba.2010.05.030. Ver página 1232, párrafo 2.2. 1,2,4,5 2,4 3 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado  para todas las reivindicaciones  para las reivindicaciones nº: Fecha de realización del informe 27.10.2014 Examinador A. Sukhwani Página 1/4 INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA Nº de solicitud: 201301123 CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD A01N65/20 (2009.01) A01P7/04 (2006.01) A01P3/00 (2006.01) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) A01N, A01P Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, X-FULL, NPL, FSTA, CAPLUS, AGRICOLA, CABA Informe del Estado de la Técnica Página 2/4 OPINIÓN ESCRITA Nº de solicitud: 201301123 Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 27.10.2014 Declaración Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Reivindicaciones 1 - 5 SI Reivindicaciones NO Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Reivindicaciones 1 - 5 SI Reivindicaciones NO Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986). Base de la Opinión.- La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica. Consideraciones: La presente invención tiene por objeto un procedimiento de estabilización de las aguas de procesado de semillas de Lupinus spp y extracción de alcaloides que comprende las etapas de (reivindicación 1): A. Centrifugación de los caldos de desamargamiento de la semilla de Lupinus spp B. Adicción a la fracción soluble obtenida de algunos de los siguientes elementos antisépticos:  Benzoato sódico y pirosulfito de sodio  Pirosulfito de potasio  Hidrogenosulfito de sodio  Sulfito de sodio C. Conservación a 5oC y en la oscuridad con objeto de prolongar la actividad D. Extracción alternativa de la fracción alcaloidea y no alcaloidea En la etapa D., el procedimiento de extracción de los alcaloides contenidos en los extractos acuosos de la semilla de Lupinus, se lleva a cabo (reivindicación 3) con las etapas de: a) Uso de una matriz de tierras diatomeas macroporosas b) Elución de los alcaloides con un disolvente orgánico inmiscible con el agua c) Posterior adición a la matriz de un disolvente polar (etanol, agua) para la recuperación de la fracción libre de alcaloides Por último es objeto de protección el uso como biocida, tanto insecticida como fungicida, de los extractos acuosos obtenidos mediante el procedimiento antes de la extracción alcaloidea y no alcaloidea (reiv. 2); el mismo uso de la fracción alcaloidea obtenida mediante el procedimiento de las reivindicaciones 1 y 3 (reiv. 4) y el mismo uso como biocida, tanto insecticida como fungicida, de la fracción no alcaloidea obtenida mediante el procedimiento de las reivindicaciones 1 y 3 (reiv. 5). Informe del Estado de la Técnica Página 3/4