Validação dos métodos de análise de AdBlue® pela norma ISO 22241-2

Universidade do Minho Escola de Ciências Francisca Beatriz Ferreira da Silva agosto de 2023 Validação dos métodos de análise de AdBlue® pela norma ISO 22241-2 Francisca Beatriz Ferreira da Silva Validação dos métodos de análise de AdBlue® pela norma ISO 22241-2 UMinho|2023 Universidade do Minho Escola de Ciências Francisca Beatriz Ferreira da Silva agosto de 2023 Validação dos métodos de análise de AdBlue® pela norma ISO 22241-2 Trabalho efetuado sob a orientação da Professora Doutora Maria Dulce Silva Geraldo e da Engenheira Sofia Alexandra Fernandes Oliveira Dissertação de Mestrado Mestrado em Técnicas de Caracterização e Análise Química ii Direitos de autor e condições de utilização do trabalho por terceiros Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição-NãoComercial-SemDerivações CC BY-NC-ND https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ iii Agradecimentos “O caminho faz-se caminhando” e há que agradecer a quem tornou este caminho tão esplêndido e gratificante. Ao Mestrado em Técnicas de Caracterização e Análise Química, do Departamento de Química da Universidade do Minho e ao Grupo RNM pela oportunidade de estágio que me permitiu concluir mais uma etapa da minha vida académica. À professora doutora Dulce Geraldo por toda a disponibilidade, preocupação, carinho demonstrado e por me ajudar a cumprir este objetivo. À engenheira Sofia Oliveira pelo acolhimento, ajuda, amizade e por me ter mostrado como funciona o mundo empresarial. À equipa do laboratório da RNM pelos bons momentos vividos, pelas experiências partilhadas e por me terem feito “sentir em casa” durante estes meses. Aos meus pais e irmão por serem o meu porto de abrigo, por me incentivarem a lutar pelos meus sonhos e, sobretudo, por me ajudarem a concretizá-los. Aos meus amigos pelo apoio constante, pelos momentos inesquecíveis que me proporcionaram e por caminharem lado a lado comigo. A todos, o meu maior obrigada! iv Declaração de integridade Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. v Validação dos métodos de análise de AdBlue® pela norma ISO 22241-2 Resumo O presente trabalho teve como principal intuito a verificação de cinco dos métodos de análise presentes na norma ISO 22241-2, que permitem controlar a qualidade do AdBlue®, um produto essencial na redução das emissões de óxidos de nitrogénio em veículos a diesel. O AdBlue® é uma solução aquosa de ureia de alta pureza que converte os óxidos de nitrogénio em componentes naturais do ar, como nitrogénio molecular e água. Os métodos analíticos estudados incluem a determinação do teor de ureia pelo índice de refração, alcalinidade, matéria insolúvel, teor de fosfato e de biureto. O desempenho de cada método foi avaliado comparando os critérios de aceitação definidos na norma ISO 22241-2 ou estipulados internamente, visando determinar a adequação de cada método ao propósito proposto. De acordo com o estipulado na referida norma, para cada método foram utilizadas diversas metodologias para avaliar os limiares analíticos, a precisão em diversas condições e a justeza. Nos métodos instrumentais de análise foi ainda avaliada a linearidade, a estabilidade da reta de calibração e a gama de trabalho. Além disso, em todos os métodos de análise foi obtida uma estimativa da incerteza do método baseada em dados de validação e de controlo de qualidade. Os resultados indicaram que os métodos foram devidamente verificados e que podem ser utilizados para avaliar a qualidade do produto AdBlue®, assegurando que este cumpra as especificações descritas na norma ISO 22241-2. Assim é possível garantir a comercialização adequada deste produto químico pela RNM e, assim, contribuir para a redução dos poluentes atmosféricos e seus impactos negativos no meio ambiente e na saúde pública. Palavras-chave: AdBlue®; ISO 22241-2; Óxidos de nitrogénio; Verificação de métodos de análise vi Validation of AdBlue® analysis methods by the ISO 22241-2 standard Abstract The main objective of this work was to verify five of the analysis methods present in the ISO 22241-2 standard, which allow controlling the quality of AdBlue®, an essential product in the reduction of nitrogen oxides emissions in diesel vehicles. AdBlue® is a high-purity aqueous urea solution that converts nitrogen oxides into natural air components such as molecular nitrogen and water. The analytical methods studied include the determination of urea content by refractive index, alkalinity, insoluble matter, phosphate and biuret content. The performance of each method was evaluated by comparing the acceptance criteria defined in the ISO 22241-2 standard or stipulated internally, aiming to determine the suitability of each method for the proposed purpose. As stipulated in the aforementioned standard, for each method diverses methodologies were used to assess the analytical thresholds, precision under diverse conditions and trueness. In the instrumental methods of analysis, the linearity, the stability of the calibration curve and the working range were also evaluated. In addition, for all analysis methods, an estimate of the uncertainty of the method was obtained based on validation and quality control data. The results indicated that the methods were properly verified and that they can be used to evaluate the quality of the AdBlue® product, ensuring that it complies with the specifications described in the ISO 22241-2 standard. Thus, it is possible to guarantee the adequate commercialization of this chemical product by RNM and, thus, contribute to the reduction of atmospheric pollutants and their negative impacts in the environment and public health. Keywords: AdBlue®; ISO 22241-2; Nitrogen oxides; Verification of analysis methods vii Índice Direitos de autor e condições de utilização do trabalho por terceiros ...................................................... ii Agradecimentos ..................................................................................................................................... iii Declaração de integridade ...................................................................................................................... iv Resumo ................................................................................................................................................... v Abstract ................................................................................................................................................. vi Lista de abreviaturas, siglas e símbolos ................................................................................................ xiv Índice de Figuras ................................................................................................................................... xxi Índice de Tabelas ................................................................................................................................ xxiii 1. Introdução ...................................................................................................................................... 1 1.1. Enquadramento ...................................................................................................................... 2 1.2. Apresentação da empresa ...................................................................................................... 2 1.3. Poluição atmosférica: problemas e soluções ........................................................................... 3 1.4. Tecnologia SCR ...................................................................................................................... 5 1.5. AdBlue®: especificações ........................................................................................................ 6 1.6. Métodos de análise ................................................................................................................ 9 1.6.1. Determinação da concentração de ureia pelo índice de refração .................................... 9 1.6.2. Determinação da alcalinidade ........................................................................................12 1.6.3. Determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico ........................................ 14 1.6.4. Determinação do teor de fosfato .................................................................................... 15 1.6.5. Determinação do teor de biureto ................................................................................... 17 1.7. Validação de métodos analíticos ............................................................................................ 18 1.7.1. Reta de calibração .........................................................................................................19 1.7.2. Sensibilidade ................................................................................................................. 21 1.7.3. Gama de trabalho ......................................................................................................... 22 1.7.4. Limiares analíticos ........................................................................................................ 23 xiv Lista de abreviaturas, siglas e símbolos a: ordenada na origem 𝑨: absorvância ANOVA: Análise de Variâncias (proveniente do inglês: Analysis of Variance ) AUS: Solução Aquosa de Ureia (proveniente do inglês: Aqueous Urea Solution ) b: declive b : bias 𝒃𝒊: desvio da recuperação obtida relativamente à recuperação ideal de 100 % 𝒃𝒓𝒎𝒔: quadrado médio relativo dos desvios das análises de fortificação da amostra c: concentração 𝒄: média das concentrações 𝒄´ : média dos resultados obtidos após a fortificação 𝒄𝑬𝑹: média dos resultados obtidos antes da fortificação CQE: Controlo de Qualidade Externo CQI: Controlo de Qualidade Interno 𝑪𝒔𝒐𝒍.: concentração efetiva da solução 𝒄𝒔𝒑𝒊𝒌𝒆: concentração de analito adicionado na fortificação CV: coeficiente de variação 𝑪𝑽𝑷𝑰: coeficiente de variação de precisão intermédia 𝑪𝑽𝒓: coeficiente de variação de repetibilidade d: desvio DEF: Fluído de um Escape Diesel (proveniente do inglês: Diesel Exhaust Fluid ) 𝑫𝒊: diferença entre o valor medido e o definido para a amostra xv 𝑫𝒓𝒎𝒔: raiz quadrada média do desvio entre o resultado obtido e o definido para cada amostra 𝑬𝒏: erro normalizado EN: Norma Europeia (proveniente do inglês: European Norm ) EUA: Estados Unidos da América F: valor tabelado da distribuição de Fisher-Snedecor 𝑭𝒄: fator de calibração 𝑭𝑫: fator dia 𝑭𝟏: fator de conversão de kg para g 𝑭𝟐: fator de conversão de mg para µg g.l: graus de liberdade H: frases de perigo HC: hidrocarbonetos H₀: hipótese nula IR: Índice de Refração ISO: Organização Internacional de Padronização (proveniente do inglês: International Organization for Standardization ) k: fator de expansão LD: limite de deteção LIA: limite Inferior de Aviso LIC: limite Inferior de Controlo LQ: limite de quantificação LSA: limite Superior de Aviso LSC: limite Superior de Controlo 𝒎: massa xvi 𝒎𝑭𝑳: massa do filtro seco 𝒎𝑭𝑹: massa do filtro seco com depósito de amostra MR: Material de Referência MRC: Material de Referência Certificado MRI: Material de Referência Interno 𝒎𝒔: massa da amostra 𝒏: número de medições efetuadas 𝑵: número de ensaios 𝒏𝒊𝒍𝒄: número de ensaios interlaboratoriais 𝒏𝑰𝑹: índice de refração 𝒏𝑰𝑹𝟏: índice de refração do primeiro meio 𝒏𝑰𝑹𝟐: índice de refração do segundo meio 𝒏𝑴: número de ensaios efetuados com o material de referência 𝒏𝒏: número de ensaios de recuperação NOx: óxidos de nitrogénio NP: Norma Portuguesa p: grupos P: frases de prudência PE: polietileno PEE: polifluoretileno PFA: perfluoroalcoxialcanos PG: razão entre variâncias PIB: poliisobutileno xvii PM: partículas em suspensão PP: polipropileno PTFE: politetrafluoretileno PVDF: polifluoreto de vinilideno PVDF-HFP: copolimero de fluoreto de vinilideno e hexafluoropropileno P1: primeiro padrão da reta de calibração P6: último padrão da reta de calibração QM: Quadrado Médio 𝑸𝑴𝒃: Quadrado Médio entre grupos 𝑸𝑴𝒘: Quadrado Médio dentro de grupos r: coeficiente de correlação R: recuperação aparente 𝒓𝑷𝑰: limite de precisão intermédia 𝒓𝒓: limite de repetibilidade 𝑹´: recuperação 𝑺: desvio padrão 𝑺𝒂: desvio padrão associado à ordenada na origem 𝑺𝒃: desvio padrão associado ao declive 𝑺𝒃𝒆𝒕𝒘𝒆𝒆𝒏: desvio padrão entre grupos 𝑺𝒃𝑴: desvio padrão das réplicas independentes realizadas ao material de referência SCR: Redução Catalítica Seletiva (proveniente do inglês : Selective Catalytic Reduction ) SGQ: Sistema de Gestão de Qualidade 𝑺𝑷𝑰: desvio padrão de precisão intermédia xviii SQ: Soma dos Quadrados 𝑺𝑸𝒃: Soma dos Quadrados entre grupos 𝑺𝑸𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍: Soma dos Quadrados total 𝑺𝑸𝒘: Soma dos Quadrados dentro de grupos 𝑺𝒓: desvio padrão de repetibilidade 𝑺𝒚/𝒙: desvio padrão residual 𝑺𝟎 ´: desvio padrão corrigido S²: variância 𝑺𝟏 𝟐: variância do primeiro padrão da reta de calibração 𝑺𝟏𝟎 𝟐: variância do último padrão da reta de calibração TCC: proveniente do inglês: Tuebingen Chemical Company 𝒖: incerteza U: incerteza expandida 𝒖𝒂𝒅𝒅: incerteza da adição do analito 𝒖𝒃: incerteza associada à justeza 𝒖𝒄: incerteza combinada 𝒖𝑪𝒂𝒍𝒊𝒃.𝑩𝒂𝒍: incerteza associada à calibração da balança 𝒖𝒄𝒐𝒏𝒄: incerteza da concentração do analito adicionado 𝒖𝒄𝒓𝒆𝒇𝑬𝑰𝑳: incerteza definida no ensaio interlaboratorial 𝒖𝑪𝒓𝒆𝒇𝑴: incerteza do material de referência 𝑼𝒍𝒂𝒃: incerteza expandida do valor obtido pelo laboratório 𝑼𝒓𝒆𝒇: incerteza expandida do resultado considerado como verdadeiro (referência) 𝒖𝑹𝒆𝒑.𝑩𝒂𝒍: incerteza associada à repetibilidade da pesagem xix 𝒖𝑹𝒘: incerteza associada à precisão 𝒖𝒕𝒆𝒎𝒑𝒆𝒓𝒂𝒕𝒖𝒓𝒂: incerteza associada à temperatura 𝒖𝒗𝒐𝒍: incerteza do volume adicionado UV-Vis: ultravioleta-visível UWS: Solução de Ureia-Água (proveniente do inglês: Urea-Water Solution ) u(x): incerteza padrão 𝐮(𝐱)𝐠𝐞𝐫𝐚𝐥: incerteza padrão geral 𝐮(𝐱)𝐦: incerteza padrão do desvio entre a massa bruta e a massa da tara 𝐮(𝐱)/𝐱: incerteza padrão relativa V: volume VDA: Associação Alemã da Indústria Automóvel (proveniente do alemão: Verband Der Automobilindustrie ) VL: resultado obtido pelo laboratório VR: Valor de Referência 𝑽𝒔: volume da solução tratada 𝒗𝟏: velocidade da luz no primeiro meio 𝒗𝟐: velocidade da luz no segundo meio 𝑾𝑩𝒊: teor de biureto 𝑾𝒊𝒏𝒔: teor de matéria insolúvel 𝑾𝑵𝑯𝟑: teor de alcalinidade 𝑾𝒑: teor de fosfato 𝑾𝑼: concentração de ureia 𝒙 : média dos valores xx 𝒙𝒓𝒆𝒇: valor estabelecido no material de referência. 𝒙𝒔: valor suspeito y: sinal instrumental 𝒚 : média dos sinais instrumentais 𝒚𝒊 : sinal obtido por interpolação na reta de calibração Z: valor de z-score 𝜽𝒊: ângulo incidente 𝜽𝒓: ângulo refratado λ: comprimento de onda 𝝆: densidade 𝚫𝒄: variação da concentração ∆𝑻: intervalo de temperatura 𝚫𝒚: variação do sinal instrumental [AUS]: concentração da solução aquosa de ureia [𝑷𝑶𝟒 −𝟑]: concentração do padrão de fosfato xxi Índice de Figuras Figura 1. Sede do Grupo RNM ................................................................................................................ 2 Figura 2. Efeito das normas Euro 4 a 7 ao longo do tempo, na Europa ................................................. 4 Figura 3. Esquema resumo da tecnologia SCR....................................................................................... 6 Figura 4. Esquema resumo dos fundamentos da técnica de refratometria ............................................ 10 Figura 5. Refratómetro usado para a determinação da concentração de ureia pelo índice de refração .. 11 Figura 6. Equipamento necessário para realizar uma titulação. ............................................................ 13 Figura 7. Constituintes de um espectrofotómetro ................................................................................... 16 Figura 8. Procedimento de validação. ...................................................................................................19 Figura 9. Metodologia passo a passo ................................................................................................... 30 Figura 10. Diagrama espinha de peixe. ................................................................................................. 31 Figura 11. Carta de controlo de médias ou de indivíduos. .................................................................... 36 Figura 12. Reta de calibração do teor de fosfato ...................................................................................78 Figura 13. Carta de controlo de indivíduos para o método da determinação do teor de fosfato. ............ 81 Figura 14. Reta de calibração do método da determinação do teor de biureto. .................................... 93 Figura 15. Carta de controlo de indivíduos para o método da determinação do teor de biureto ........... 96 Figura 16. Carta de controlo do pH da água desmineralizada utilizada na produção de AdBlue® ...... 101 Figura 17. Carta de controlo da condutividade da água desmineralizada usada no fabrico de AdBlue® ........................................................................................................................................................... 101 Figura 18. Carta de controlo da concentração de ureia do AdBlue® armazenado no depósito 12. .....102 Figura 19. Carta de controlo da concentração de ureia do AdBlue® presente no depósito 13. ...........103 Figura 20. Carta de controlo da concentração de ureia do AdBlue® armazenado no depósito 14. .....103 Figura 21. Carta de controlo do índice de refração do AdBlue® armazenado no depósito 12. ............104 Figura 22. Carta de controlo do índice de refração do AdBlue® armazenado no depósito 13. ............104 Figura 23. Carta de controlo do índice de refração do AdBlue® presente no depósito 14. ..................105 Figura 24. Diagrama em espinha de peixe para a determinação da incerteza associada à solução de amónia 0,2818 % (m/m). .................................................................................................................... 118 Figura 25. Diagrama em espinha de peixe para a determinação da incerteza associada à solução mãe de celulose microcristalina 5001,0 mg/l ............................................................................................. 121 Figura 26. Diagrama em espinha de peixe para a determinação da incerteza associada à solução intermédia de celulose microcristalina 500,1 mg/l ............................................................................ 123 xxii Figura 27. Diagrama em espinha de peixe para a determinação da incerteza associada à solução padrão de celulose microcristalina 20,00 mg/l. ................................................................................. 125 Figura 28. Diagrama em espinha de peixe para a determinação da incerteza associada à solução mãe de fosfato 202,45 mg/l...................................................................................................................... 130 Figura 29. Diagrama em espinha de peixe para a determinação da incerteza associada à solução intermédia de fosfato 2,0245 mg/l. ................................................................................................... 132 Figura 30. Diagrama em espinha de peixe para a determinação da incerteza associada a cada solução padrão de fosfato da reta de calibração. ............................................................................................ 135 Figura 31. Diagrama em espinha de peixe para a determinação da incerteza associada a cada solução padrão de fosfato para a verificação da reta de calibração .................................................................. 137 Figura 32. Diagrama em espinha de peixe para a determinação da incerteza associada à solução padrão de fosfato 0,2025 mg/kg para a verificação do método.. ....................................................... 139 Figura 33. Diagrama em espinha de peixe para a determinação da incerteza associada à solução padrão de fosfato 0,04049 mg/kg para o estudo dos limiares analíticos do método.. ........................ 141 Figura 34. Diagrama em espinha de peixe para a determinação da incerteza associada à solução padrão de fosfato 0,4049 mg/kg para o estudo da precisão.. ............................................................ 143 Figura 35. Diagrama em espinha de peixe para a determinação da incerteza associada ao MR de 0,3000 mg/kg para o estudo da justeza. ............................................................................................ 145 Figura 36. Diagrama em espinha de peixe para a determinação da incerteza associada à solução mãe de biureto 0,7796 mg/ml.. ................................................................................................................. 149 Figura 37. Diagrama em espinha de peixe para a determinação da incerteza associada a cada solução padrão de biureto da reta de calibração.. ............................................................................................152 xxiii Índice de Tabelas Tabela 1. Propriedades físico-químicas do AdBlue® ............................................................................... 8 Tabela 2. Materiais recomendados e não aconselháveis para o contacto directo com AdBlue®. ............ 9 Tabela 3. Características dos métodos para a determinação da concentração de ureia, presentes na norma ISO 22241-2...............................................................................................................................12 Tabela 4. Informações provenientes da ANOVA: fator único ................................................................. 26 Tabela 5. Características da água desmineralizada utilizada no trabalho.. ........................................... 38 Tabela 6. Equipamento utilizado para a determinação da concentração de ureia pelo índice de refração................................................................................................................................................ 38 Tabela 7. Reagentes utilizados no método da determinação da concentração de ureia pelo índice de refração................................................................................................................................................ 39 Tabela 8. Equipamentos utilizados para a determinação da alcalinidade. ............................................ 39 Tabela 9. Materiais utilizados para a determinação da alcalinidade...................................................... 40 Tabela 10. Reagentes utilizados para a determinação da alcalinidade .................................................. 40 Tabela 11. Equipamentos utilizados para a determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico. ............................................................................................................................................................ 42 Tabela 12. Materiais utilizados para a determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico. ... 42 Tabela 13. Reagentes utilizados para a determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico.. 43 Tabela 14. Equipamentos utilizados para a determinação do teor de fosfato.. ...................................... 44 Tabela 15. Materiais utilizados para a determinação do teor de fosfato.. .............................................. 45 Tabela 16. Reagentes utilizados para a determinação do teor de fosfato.. ............................................ 46 Tabela 17. Valores para a construção da reta de calibração do teor de fosfato das soluções padrão. ... 48 Tabela 18. Equipamentos utilizados para a determinação do teor de biureto. ...................................... 49 Tabela 19. Materiais utilizados para a determinação do teor de biureto. .............................................. 50 Tabela 20. Reagentes utilizados para a determinação do teor de biureto. ............................................. 51 Tabela 21. Valores obtidos experimentalmente para os limiares analíticos do método da determinação da concentração de ureia pelo índice de refração.. .............................................................................. 56 Tabela 22. Valores experimentais dos limiares analíticos do método da determinação da concentração de ureia pelo índice de refração. .......................................................................................................... 56 Tabela 23. Valores obtidos para o estudo da precisão, em condições de repetibilidade e precisão intermédia para o método da determinação da concentração de ureia pelo índice de refração .............57 3 O Grupo RNM atua no setor químico, garantindo produtos químicos ao nível da produção, logística, transporte e distribuição para diversas áreas, como a indústria cosmética, farmacêutica, têxtil, automóvel, petroquímica, plásticos, detergência, alimentar, tratamento de águas, entre outras.7 Atualmente, o Grupo RNM possui as empresas RNM – Produtos Químicos, RNM – Transportes Químicos, Tuebingen Chemical Company (TCC), Quimitejo – Produtos Químicos, Flexaco – Concentrados e Aditivos Plásticos, InChemica – Indústria Química de Especialidades, Limsa - Oleochemicals, Rivaz Química, BlueChem e Urteaga, de forma a satisfazer as necessidades de cada cliente.7 A RNM – Produtos Químicos é responsável pela produção e distribuição de produtos químicos, enquanto a RNM – Transportes Químicos transporta produtos químicos em cisternas, contentores e embalados por meios ferroviários, marítimos e rodoviários. A empresa TCC, representante exclusiva da marca CHT em Portugal, pretende dar resposta ao ramo têxtil com corantes.5 A Quimitejo foca-se na produção e distribuição de coagulantes de sais de alumínio, sendo uma forte presença no setor do tratamento de águas. A Flexaco, situada em Albergaria-a-Velha, elabora concentrados de cor e aditivos (masterbatch) aplicáveis na indústria de transformação de plásticos. A InChemica fornece tensioativos aniónicos para o setor da detergência, cosmética e higiene pessoal. A Limsa dedica-se ao campo da cosmética, cuidados pessoais e detergência. A Rivaz destina-se à distribuição de produtos químicos industriais para as indústrias das tintas, minas, água (tratamento de águas potáveis, industriais e efluentes) e do papel. A BlueChem produz e comercializa o produto AdBlue®. Por fim, a Urteaga, empresa mais recente do Grupo, situada no País Basco, é especialista em produtos químicos para uso industrial, tratamento de águas residuais, potáveis e piscinas.7 Com forte presença na Península Ibérica, o Grupo RNM aposta numa equipa de excelência, qualidade e rigor nos serviços prestados. Como tal, as empresas do Grupo dispõem de um Sistema Integrado de Gestão da Qualidade, Ambiente e Segurança e são certificadas pelas normas ISO 9001, ISO 14001 e ISO 45001.5 1.3. Poluição atmosférica: problemas e soluções Nos últimos anos, o uso de veículos a diesel tem aumentado significativamente, resultando num acréscimo considerável da emissão de gases de escape (óxidos de nitrogénio (NOx), monóxido de carbono, dióxido de carbono, hidrocarbonetos (HC), entre outros).8,9 Os NOx são considerados um dos principais poluentes atmosféricos, contribuindo para a formação de chuvas ácidas, para o buraco na camada de ozono e causando danos à saúde humana, nomeadamente a nível respiratório.10–12 A fim de reduzir as emissões de NOx, o Parlamento Europeu emitiu rígidas normas designadas por Euro. As 4 diferentes versões destas normas são representadas por algarismos romanos para os veículos pesados e por algarismos árabes para os veículos ligeiros.9,13–15 Conforme ilustrado na Figura 29, os limites máximos permitidos de emissões de NOx e partículas em suspensão (PM) nos veículos de passageiros a diesel diminuíram drasticamente ao longo dos anos pelas normas Euro 4, 5 e 6, que surgiram em 2005, 2009 e 2014, respetivamente.9 Atualmente, a norma Euro 7, proposta pela Comissão Europeia, encontra-se em aprovação para entrada em vigor em 2025.16 Figura 2. Efeito das normas Euro 4 a 7 ao longo do tempo, na Europa. De 2005 a 2014 registou-se uma diminuição de emissões de NOx e de PM nos veículos de passageiros a diesel pelas normas Euro 4 a 6. A Euro 7 encontra-se em aprovação. Adaptada de: https://www.concawe.eu/wp-content/uploads/2017/09/Portugese-Introducao-as-emissoes-de-carros-de-passageiros.pdf.9 De forma a atender aos requisitos referidos nas normas, a tecnologia de redução catalítica seletiva (SCR, proveniente do inglês: Selective Catalytic Reduction ) mostrou ser o método mais promissor na transformação de NOx em nitrogénio molecular e água – componentes naturais do ar.13,17 É de notar que este processo apenas ocorre em veículos a diesel, uma vez que, além dos veículos a gasolina não possuírem SCR, as emissões de NOx provenientes destes são bastantes inferiores às dos veículos a diesel. Tal deve-se aos motores dos veículos a gasolina funcionarem, numa razão arcombustível igual a 1, enquanto os motores a diesel atuam numa razão ar-combustível superior a 1.9 A abordagem SCR apresenta diversos benefícios na sua aplicação, tais como: exibição de uma temperatura de reação baixa, ter uma alta eficiência e não apresentar poluição secundária.11 No entanto, este processo carece de um produto químico distribuído na Europa e nos EUA sob a designação comercial de AdBlue® e DEF (proveniente do inglês: Diesel Exhaust Fluid ), respetivamente. Este é constituído por 67,5 % de água desmineralizada e 32,5 % de ureia pura, sendo frequentemente denominado de UWS (proveniente do inglês: Urea-Water Solution ).18 A água desmineralizada utilizada no fabrico sofre um processo de osmose reversa de forma a apresentar uma condutividade inferior a 4 5 µS/cm. Além disto, o pH deve situar-se na gama entre os 5,00 a 7,00.19 Por sua vez, a ureia, também denominada de carbamida, é adquirida, não sendo possível a utilização de ureia destinada a fins agrícolas.2,20 1.4. Tecnologia SCR O sistema SCR utiliza a amónia como agente redutor. No entanto, devido à amónia ser tóxica e corrosiva, por questões de segurança é aplicado o AdBlue® onde, através de um processo de três etapas, a ureia decompõe-se em amónia.21,22 Primeiramente, o AdBlue® é injetado no sistema de escape ocorrendo a evaporação da água gerando ureia fundida, conforme descrito na Equação 1.22 Por termólise, a ureia (H₂NCONH₂) decompõe-se em amónia (NH₃) e ácido isociânico (HNCO), a uma temperatura elevada (Equação 2).18 Por sua vez, o ácido isociânico hidrolisa produzindo amónia e dióxido de carbono, como apresentado na Equação 3.23 Por fim, a amónia reage com os óxidos de nitrogénio, geralmente NO uma vez que representam cerca de 90 % dos NOx presentes nos gases de escape, numa estequiometria de 1:1, com consumo de oxigénio produzindo nitrogénio molecular e água (Equação 4).23 Equação 122 Equação 218 Equação 323 Equação 423 Em suma, a Figura 324 retrata o processo SCR, sendo também possível constatar, a partir das Equações 218 e 323, que 1 mol de ureia gera 2 mol de amónia.23 As reações SCR podem ser designadas por reação padrão, lenta e rápida de acordo com as quantidades existentes de NH₃, NO e NO₂.22 6 Figura 3. Esquema resumo da tecnologia SCR. Conversão catalítica de NOx, provenientes dos gases de escape de um motor a diesel, em componentes naturais do ar (N₂ e H₂O) por meio de NH₃, gerada a partir do AdBlue®. Adaptada de: https://www.ao-cheng.com/news/abeginner-guide-to-adblue-r-diesel-exhaust-fluid.24 Apesar da tecnologia SCR ser bastante promissora ainda enfrenta algumas adversidades que comprometem a sua eficácia. Um dos problemas é a desigual distribuição da concentração de amónia no catalisador, comprometendo o bom funcionamento do sistema e promovendo um elevado desgaste do catalisador.25,26 Outro obstáculo é a insuficiente passagem de calor do gás de exaustão de modo a ocorrer evaporação e posterior decomposição da ureia.18 Além disso, uma incompleta evaporação e decomposição da ureia produz uma quantidade insuficiente de amónia capaz de neutralizar a totalidade de óxidos de nitrogénio, formando depósitos sólidos no tubo de escape. Estes depósitos podem ser de ureia ou subprodutos, como ácido cianúrico, biureto e ammelide, resultantes de reações a diferentes temperaturas em que o ácido isociânico participa.27,28 Tais depósitos podem bloquear o tubo de escape, danificando este, o catalisador e o motor do veículo.26,28 De forma a solucionar estes problemas, o mercado atual encontra-se em pesquisa, tendo já criado um aditivo para o AdBlue®. Este tem como propósito prevenir a formação de depósitos, contribuindo para uma maior eficiência do sistema SCR e uma maior vida útil do sistema SCR. 1.5. AdBlue®: especificações O AdBlue® é um aditivo independente do combustível e, por isso, possui um depósito próprio.29 Este pode estar localizado junto ao depósito do combustível diesel, na divisão do motor ou na mala, consoante o modelo do veículo.29 Embora o consumo de AdBlue® dependa da temperatura ambiente, da temperatura do sistema automóvel e do tipo de condução, estima-se que o seu consumo seja cerca de 5 % do consumo de combustível.22,29 7 A marca AdBlue® é detida pela Associação Alemã da Indústria Automóvel (VDA, proveniente do alemão: Verband Der Automobilindustrie ), que gere a sua produção com base na norma ISO 22241.20 Além disso, frequentemente designa-se por AUS32 (AUS, proveniente do inglês: Aqueous Urea Solution ) as soluções fabricadas de acordo com esta norma. A ISO 22241 divide-se em quatro partes, sendo a primeira parte sobre requisitos de qualidade do AdBlue®, a segunda parte sobre os métodos de análise, a terceira parte sobre manuseamento, transporte e armazenamento e, por fim, a quarta parte que aborda a interface de reabastecimento.1–4 A Tabela 1 ilustra as propriedades físico-químicas que este produto químico apresenta.17 Em relação à amostragem, primeiramente, deve-se certificar que os frascos usados para a recolha de AdBlue® estejam limpos e isentos de contaminantes (poeira do ar ou outra matéria que se tenha depositado durante o armazenamento destes, resíduos aquando da sua fabricação ou limpeza). Posteriormente, os recipientes devem ser enxaguados com água desmineralizada seguida de AdBlue®, devendo este último enchimento ser desprezado. Após o frasco ser etiquetado, deve-se realizar novo enchimento com 1 l de AdBlue® e, por fim, fechar hermeticamente o recipiente. É de notar que todo o local de amostragem deve se encontrar limpo e que durante os enchimentos a tampa do frasco deve estar disposta, numa superfície limpa, com a abertura voltada para baixo.30 O material escolhido para estar em contacto com o AdBlue® é de extrema importância, visto que pode alterar as suas características. Por essa razão, os materiais adequados e não recomendáveis para a produção, manuseamento, transporte e armazenamento do produto encontram-se mencionados na Tabela 2.3 O produto químico deve ser mantido a uma temperatura inferior a 30 ºC, em caso de transporte e armazenamento prolongado. Uma exposição acima de 30 ºC pode desencadear a evaporação da água em situações de recipientes ventilados assim como a decomposição da ureia, alterando e possivelmente infringindo o limite de alcalinidade definido na ISO 22241-1.2,3 De modo a evitar altas temperaturas, o AdBlue® deve se encontrar afastado de fontes de calor. Em contrapartida, o armazenamento do produto não deve ser inferior a -5 ºC, uma vez que pode promover a solidificação do AdBlue®, acarretando perigo de explosão dos recipientes pois o AUS32 solidificado possui um volume cerca de 7 % maior que o produto em temperatura ambiente.3 8 Tabela 1. Propriedades físico-químicas do AdBlue®. Parâmetros e respetivos limites para o produto AdBlue®. Adaptada da ficha técnica do AdBlue®.17 Parâmetro Característica Aspeto Líquido incolor a branco Odor Sem odor ou com leve odor a amónia Hidrossolubilidade Solúvel Ureia (% (m/m)) 31,8 – 33,2 Densidade (g/cm³) 1,0870 – 1,0930 Índice de refração (20 °C) 1,3814 – 1,3843 Alcalinidade (NH₃) (%) ≤ 0,2 Biureto (%) ≤ 0,3 Aldeídos (ppm) ≤ 5,0 Matéria insolúvel (ppm) ≤ 20,0 Fosfato (𝑃𝑂4−3) (ppm) ≤ 0,5 Cálcio (Ca) (ppm) ≤ 0,5 Ferro (Fe) (ppm) ≤ 0,5 Cobre (Cu) (ppm) ≤ 0,2 Zinco (Zn) (ppm) ≤ 0,2 Crómio (Cr) (ppm) ≤ 0,2 Níquel (Ni) (ppm) ≤ 0,2 Alumínio (Al) (ppm) ≤ 0,5 Magnésio (Mg) (ppm) ≤ 0,5 Sódio (Na) (ppm) ≤ 0,5 Potássio (K) (ppm) ≤ 0,5 9 Tabela 2. Materiais recomendados e não aconselháveis para o contacto directo com AdBlue®. Adaptada da norma ISO 22241-3.3 Materiais recomendados para contacto direto com AdBlue® Polietileno (PE), isento de aditivos que possam danificar o sistema SCR Aços austeníticos Cr-Ni e aços inoxidáveis Cr-Ni-Mo-Ti Polipropileno (PP), isento de aditivos que possam danificar o sistema SCR Titânio Ligas de Ni-Mo-Cr-Mn-Cu-Si-Fe, por exemplo, Hastelloy C-276 Poliisobutileno (PIB), isento de aditivos que possam danificar o sistema SCR Perfluoroalcoxialcanos (PFA), isento de aditivos que possam danificar o sistema SCR Polifluoretileno (PEE), isento de aditivos que possam danificar o sistema SCR Polifluoreto de vinilideno (PVDF), isento de aditivos que possam danificar o sistema SCR Politetrafluoretileno (PTFE), isento de aditivos que possam danificar o sistema SCR Copolimero de fluoreto de vinilideno e hexafluoropropileno (PVDF-HFP), isento de aditivos que possam danificar o sistema SCR Materiais não recomendados para contacto direto com AdBlue® Alumínio e ligas de alumínio Magnésio e ligas de magnésio Metais não ferrosos e ligas: cobre, chumbo, zinco, ligas de cobre Plásticos ou metais revestidos com níquel Soldas contendo chumbo, prata, zinco ou cobre Materiais que, formando compostos resultantes da reação com amónia, podem inteferir negativamente na tecnologia SCR: aço carbono, aço carbono revestido com zinco, ferro macio 1.6. Métodos de análise 1.6.1. Determinação da concentração de ureia pelo índice de refração O método da determinação da concentração de ureia, presente no documento normativo ISO 22241-24, baseia-se na medição do índice de refração para posterior cálculo da concentração de ureia em solução aquosa. A refratometria é o método mais utilizado para a determinação da concentração em soluções aquosas, através da medição do índice de refração.31 Nesta técnica, um determinado raio de luz incide num novo meio com um ângulo (𝜃𝑖), refratando-se. O raio refratado (𝜃𝑟) possui uma 10 velocidade diferente da velocidade no primeiro meio (Figura 4).31 Este processo ocorre segundo a lei de Snell, definida pela Equação 531. Figura 4. Esquema resumo dos fundamentos da técnica de refratometria. Um raio incidente com um ângulo, 𝜃𝑖, a uma determinada velocidade e no meio ar/vácuo refrata-se ao atravessar um novo meio, denominando-se este de ângulo refratado, 𝜃𝑟. Adaptada de: Mohan, S.; Kato, E.; Drennen, J. K.; Anderson, C. A. Refractive Index Measurement of Pharmaceutical Solids: A Review of Measurement Methods and Pharmaceutical Applications. J. Pharm. Sci. 2019, 108 (11), 3478–3495. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2019.06.029.31 𝑛𝐼𝑅1×𝑠𝑒𝑛𝜃1=𝑛𝐼𝑅2×𝑠𝑒𝑛𝜃2 Equação 531 em que 𝑛𝐼𝑅1 representa o índice de refração do primeiro meio, 𝜃𝑟 o ângulo incidente no primeiro meio, 𝑛𝐼𝑅2 o índice de refração do segundo meio e 𝜃2 o ângulo incidente no segundo meio.31 Em contrapartida, uma vez que a velocidade da luz difere nos dois meios, o índice de refração (𝑛𝐼𝑅) pode ser estimado de acordo com a Equação 631. 𝑛𝐼𝑅=𝑣2 𝑣1 Equação 631 em que 𝑣1 representa a velocidade da luz no primeiro meio e 𝑣2 a velocidade da luz no segundo meio.31 11 Além disto, existem fatores que alteram a velocidade da luz e consequentemente o índice de refração, como o comprimento de onda do raio incidente, a composição e estado físico do meio.32,33 Neste trabalho, utilizou-se um refratómetro específico de acordo com a norma ISO 222411–4 (Figura 5), tendo a designação de RFM990-AUS32, do fornecedor Bellingham + Stanley. Este equipamento permite o ajuste da temperatura para 20 ºC, conforme requerido pela norma ISO 2224124, procedendo ao cálculo da concentração de ureia. Figura 5. Refratómetro usado para a determinação da concentração de ureia pelo índice de refração. Refratómetro utilizado no trabalho prático, com as especificações descritas na norma ISO 22241-24 e apresentação do valor da concentração da ureia. A norma ISO 22241-24 apresenta também um outro método para a determinação da concentração de ureia. Este procedimento baseia-se numa combustão a altas temperaturas, onde os óxidos de nitrogénio são reduzidos a nitrogénio. Após extração dos interferentes resultantes da combustão, procede-se à medição do nitrogénio com o auxílio de um detetor de condutividade térmica. Posteriormente, a concentração de ureia é determinada pela subtração do teor de biureto ao teor de nitrogénio quantificado.4 12 Em síntese, a Tabela 34 apresenta as características de cada método referido anteriormente.4 A partir da mesma é possível averiguar que o método da determinação da concentração de ureia pelo índice de refração é um procedimento mais prático e, portanto, mais vantajoso para a rotina do laboratório do que o método da determinação da concentração de ureia pelo nitrogénio total. De referir que ambos os métodos apresentam a mesma gama de trabalho: 30 % (m/m) a 35 % (m/m) de ureia. Tabela 3. Características dos métodos para a determinação da concentração de ureia, presentes na norma ISO 22241-24. Equipamentos necessários e especificações dos mesmos para a determinação da concentração de ureia pelo método do índice de refração e pelo método de nitrogénio total. Adaptada da norma ISO 22241-2 anexo B e C.4 Determinação da concentração de ureia Índice de refração Nitrogénio total Equipamento Refratómetro Analisador automático de nitrogénio Especificações dos equipamentos T = 20,0 ± 0,1 ºC; λ = 589,3 ± 5,0 nm; Apresenta valores de concentração de AUS32 Baseado em métodos de combustão; Cálculo da concentração de AUS32, conforme descrito na ISO 22241-24 – Anexo B 1.6.2. Determinação da alcalinidade A alcalinidade no AdBlue® é determinada como amónia numa gama de trabalho de 0,1 a 0,5 %. Essa determinação consiste numa titulação potenciométrica, em que se titula a solução de analito com ácido clorídrico até atingir o ponto final a pH = 5,7.4 A titulação é uma técnica que tem como finalidade a determinação da concentração de um analito numa amostra.34 A Figura 635 ilustra os princípios básicos da titulação, em que o titulante, presente numa bureta, é adicionado ao titulado (solução contendo o analito) até que a reação esteja finalizada.35 19 Figura 8. Procedimento de validação. Processo desde a apresentação do problema do cliente até à decisão do laboratório sobre se o pedido do cliente pode ou não ser realizado com o método escolhido. Adaptada de: Eurachem Guide: The Fitness for Purpose of Analytical Methods – A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics56. 1.7.1. Reta de calibração A reta de calibração é uma representação gráfica da relação entre a resposta instrumental de um equipamento e a concentração de uma espécie. Para construir este gráfico, geralmente é usado o método dos mínimos quadrados, onde o eixo vertical (eixo y) representa o sinal do equipamento, enquanto o eixo horizontal do gráfico (eixo x) contém a concentração dos padrões analisados. Essa escolha deve-se ao facto dos erros associados aos valores das concentrações (abcissas) serem desprezáveis comparativamente aos valores dos sinais medidos (ordenadas). Além disso, estes valores apresentam uma distribuição normal e uma homogeneidade de variâncias ao longo da reta de calibração. A partir da interpolação na reta de calibração é possível determinar a concentração da espécie a partir da propriedade em estudo.57 Para a construção de uma reta de calibração aconselha-se que sejam preparados dez padrões, sendo o mínimo recomendável de cinco padrões. Além disso, os padrões devem estar dispostos uniformemente pela gama de trabalho.57 Existem vários tipos de retas de calibração, como a linear, a quadrática, a logarítmica, entre outras.57,61,62 Através do modelo linear obtém-se uma equação da reta de primeiro grau dada pela Equação 1057. 20 𝑦=𝑏𝑐+𝑎 Equação 1057 em que y representa o sinal instrumental, b o declive, c a concentração e a a ordenada na origem.57 Os dados da reta de calibração permitem o cálculo do desvio padrão residual (𝑆𝑦/𝑥). Este desvio consiste na dispersão dos valores obtidos pelo equipamento relativamente aos valores interpolados na reta de calibração, podendo ser obtido através das funcionalidades da ferramenta Excel ou pela Equação 1157. 𝑆𝑦/𝑥=√∑[𝑦𝑖  − (𝑎+𝑏.𝑐)]2 𝑛 𝑖=1 𝑛−2 Equação 1157 em que 𝑦𝑖  representa o sinal obtido por interpolação na reta de calibração e 𝑛 o número de medições efetuadas.57 Geralmente efetua-se o teste para a rejeição de valores da reta de calibração, onde um resultado da reta de calibração é desprezado caso satisfaça a condição descrita na Equação 1254. |𝑦−𝑦𝑖 |≥2𝑆𝑦/𝑥 Equação 1254 Os desvios padrão associados ao declive e à ordenada na origem da reta de calibração, 𝑆𝑏 e 𝑆𝑎 respetivamente, são calculados pelas Equações 1357 e 1457. 𝑆𝑏=𝑆𝑦/𝑥 √∑(𝑐−𝑐)2 Equação 1357 em que 𝑐 representa a média das concentrações.57 𝑆𝑎=𝑆𝑦/𝑥√∑𝑐2 𝑛∑(𝑐−𝑐)2 Equação 1457 Por sua vez, os limites de confiança associados ao declive e à ordenada na origem são apresentados conforme descrito nas Equações 1557 e 1657, respetivamente, onde o valor de t é obtido a partir da tabela t-student considerando um nível de confiança de 95 % e n-2 graus de liberdade (g.l).57 𝑏±𝑡𝑆𝑏 Equação 1557 21 𝑎±𝑡𝑆𝑎 Equação 1657 Assim, a equação da reta de calibração é dada pela Equação 1757. 𝑦=(𝑏±𝑡𝑆𝑏)𝑐+(𝑎±𝑡𝑆𝑎) Equação 1757 O coeficiente de correlação, vulgarmente conhecido como r, é uma variável estatística que permite aferir a calibração analítica, ou seja, a correlação existente entre o x e o y. Este parâmetro é adimensional e pode situar-se entre -1 e 1, sendo que o valor de -1 revela uma correlação negativa, o valor de zero indica a inexistência de correlação linear entre as variáveis x e y e o resultado de 1 demonstra uma correlação positiva.57,59 O Guia RELACRE 1357 recomenda um r superior a 0,995.57 O r pode ser obtido a partir das ferramentas do software Excel ou através da Equação 1857. 𝑟= ∑{(𝑐−𝑐)(𝑦−𝑦)} √[∑(𝑐−𝑐)2∑(𝑦−𝑦)2] Equação 1857 em que 𝑦 representa a média dos sinais instrumentais. Para averiguar se a correlação é significativa, pode-se efetuar um teste de significância t (Equação 1954), a partir do qual se conclui a existência de correlação entre x e y se o t calculado, em módulo, for superior ao t tabelado ou o contrário se o t calculado, em módulo, for igual ou inferior ao t tabelado. O t tabelado é obtido a partir da tabela t-student, assumindo um nível de confiança de 95 % e n-2 graus de liberdade.54 𝑡=|𝑟|√𝑛−2 √1−𝑟2 Equação 1954 1.7.2. Sensibilidade A sensibilidade traduz-se na variação do sinal instrumental em função da alteração da concentração do analito, conforme descrito na Equação 20.54,56,57 𝑆𝑒𝑛𝑠𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒=Δ𝑦 Δc Equação 2054 em que Δ𝑦 representa a variação do sinal instrumental e Δ𝑐 a variação da concentração.54 Num modelo linear, a sensibilidade corresponde ao declive da reta de calibração, mantendo-se estável ao longo da mesma. Em contrapartida, numa função quadrática, o parâmetro sensibilidade é 22 definido como a primeira derivada da reta de calibração num dado valor de concentração, variando ao longo da reta de calibração.54,57 O estudo deste parâmetro analítico é muito importante, pois permite aferir a sensibilidade dos métodos ao longo do tempo, estabelecer as diferenças desta grandeza para diversos analitos e comparar a magnitude do sinal em inúmeros métodos analíticos de função linear e destinados a quantificar o mesmo analito.57 1.7.3. Gama de trabalho A gama de trabalho é definida como o intervalo de concentrações em que o método de análise apresenta resultados fidedignos com uma incerteza aceitável.56,63 O limite inferior da gama de trabalho é considerado o limite de quantificação, enquanto que a extremidade superior da gama de trabalho corresponde à concentração em que se começam a verificar irregularidades na sensibilidade do método. Este parâmetro analítico pode ser classificado como instrumental ou do método. Na gama de trabalho instrumental é traçada uma reta de calibração do sinal de resposta obtido em função da concentração do analito em estudo. Em contrapartida, a gama de trabalho do método consiste num gráfico em que o eixo das ordenadas corresponde às concentrações obtidas e o eixo das abcissas as concentrações conhecidas, obtendo-se assim uma equação da reta em que o declive é igual a um e a ordenada na origem igual a zero.54–56,61 De forma a avaliar a gama de trabalho, é fundamental ter em consideração o processo de calibração sugerido e a linearidade do método.54 Por sua vez, quando um método envolve a elaboração de uma reta de calibração, recorre-se ao teste de homogeneidade de variâncias para avaliar a gama de trabalho, sendo aconselhável a norma ISO 8466-161 para modelos lineares e a norma ISO 8466-262 para modelos polinomiais de segundo grau.57,61,62 A partir do teste de homogeneidade de variâncias é possível averiguar se a gama de trabalho está ajustada. Por isso, são efetuadas dez réplicas independentes do primeiro e último padrão da reta de calibração. A norma ISO 8466-161 aconselha a preparação de dez padrões de calibração, sendo cinco padrões o mínimo recomendável. As variâncias (S²) do primeiro e último padrão são determinadas pela Equação 21.54–57,61 𝑆²=∑(𝑦𝑖,𝑗−𝑦𝑖 )² 10 𝑗=1 𝑛𝑖−1 Equação 2157 23 Através dos resultados obtidos pela Equação 2157, é calculado o valor de PG de acordo com as Equações 2257 ou 2357, conforme a situação. 𝑃𝐺=𝑆12 𝑆10 2 , se 𝑆12> 𝑆10 2 Equação 2257 𝑃𝐺=𝑆10 2 𝑆12 , se 𝑆10 2> 𝑆12 Equação 2357 em que PG representa a razão entre variâncias, 𝑆12 a variância obtida para o primeiro padrão da reta de calibração e 𝑆10 2 a variância do último padrão da reta de calibração, que idealmente corresponde ao décimo padrão da reta de calibração.57 Em seguida, o valor de PG calculado pelas Equações 2257 ou 2357 é comparado com o valor tabelado da distribuição de Fisher-Snedecor (F) para n-1 graus de liberdade. Caso PG ≤ F as desigualdades entre as variâncias não são significativas e a gama de trabalho encontra-se bem ajustada. Se verificar-se a condição PG > F comprova-se que as diferenças entre as variâncias são consideráveis e a gama de trabalho não está bem ajustada, pelo que se deve reduzir a mesma ou utilizar uma regressão ponderada.54,57 1.7.4. Limiares analíticos Os limiares analíticos são caracterizados pelo limite de deteção (LD) e pelo limite de quantificação (LQ). O LD corresponde à concentração mínima de analito que um método consegue detetar com um nível de confiança estabelecido, enquanto que o LQ consiste na concentração mínima quantificável por um método com um nível de confiança definido.54,56 Este parâmetro analítico pode ser distinguido entre limiares analíticos do método e instrumental. A principal diferença entre ambos reside no facto de que para LD/LQ do método é efetuado o mesmo tratamento das amostras teste às soluções ou amostras, ao contrário do LD/LQ instrumental onde as soluções não sofrem o processo de preparação de amostra.54,56 Existem várias abordagens para a determinação dos limiares analíticos. O desvio padrão (𝑆) é calculado por recurso às ferramentas do Excel, sendo posteriormente determinado o desvio padrão corrigido (𝑆0´) de acordo com a Equação 24.54,56 𝑆0´=𝑆 √𝑛 Equação 2456 24 Através das Equações 2556 e 2656 é possível determinar o LD e o LQ, respetivamente. 𝐿𝐷=3 × 𝑆0´ Equação 2556 𝐿𝑄=10× 𝑆0´ Equação 2656 Existe também uma metodologia alternativa a partir da qual se calcula o LD e o LQ pelo método gráfico, ou seja, com base nos valores provenientes da reta de calibração.54 Assim sendo, o LD pode ser calculado através da Equação 2754, enquanto o LQ pode ser determinado de acordo com a Equação 2854. 𝐿𝐷=3,3×𝑆𝑦/𝑥 𝑏 Equação 2754 𝐿𝑄=10×𝑆𝑦/𝑥 𝑏 Equação 2854 1.7.5. Precisão A dispersão de resultados obtidos de várias medições na mesma amostra ou amostras idênticas sob determinadas circunstâncias é definida como precisão. Este parâmetro, associado aos erros aleatórios, pode ser avaliado em três condições, sendo elas, a repetibilidade, a precisão intermédia e a reprodutibilidade. A repetibilidade espelha a precisão obtida em ensaios repetidos na mesma amostra, utilizando o mesmo método de análise, equipamentos, tipo de reagentes e realizados no mesmo local pelo mesmo analista durante um curto espaço de tempo, geralmente, no mesmo dia. A precisão intermédia, também designada de reprodutibilidade intralaboratorial, exprime os resultados obtidos por um determinado método de analise, efetuado pelo mesmo operador, no mesmo local e utilizando os mesmos reagentes e equipamentos, durante um longo período de tempo, ou seja, em dias distintos. Por fim, a reprodutibilidade relaciona-se com medições repetidas na mesma amostra utilizando o mesmo método de análise, mas realizado em locais distintos, por diferentes analistas e usando diferentes equipamentos e, portanto, em laboratórios diferentes. Como tal, prevê-se que se observe uma menor variabilidade nos resultados provenientes da repetibilidade, seguindo-se a precisão intermédia e depois a reprodutibilidade.54,56,57,63–65 25 A precisão varia com a concentração do analito em estudo. Por este motivo, torna-se importante avaliar este parâmetro em vários níveis de concentração. Além disso, espera-se obter uma maior variabilidade nos resultados à medida que a concentração do analito diminui.54,56 De modo a avaliar a precisão é calculado o coeficiente de variação (CV) de acordo com a Equação 2954. 𝐶𝑉=𝑆𝑐×100 Equação 2954 As condições repetibilidade e precisão intermédia podem ser estudadas individualmente ou em simultâneo, através do recurso à ferramenta ANOVA (proveniente do inglês: Analysis of Variance ). Por sua vez, a reprodutibilidade, geralmente, é avaliada em conjunto com a repetibilidade.54 1.7.5.1. Repetibilidade Para avaliação individual da repetibilidade são efetuadas seis a quinze réplicas a um material de referência (MR), a uma amostra teste ou a um branco fortificado durante um curto intervalo de tempo.56,63 Em seguida, é determinado o desvio padrão de repetibilidade (𝑆𝑟) através das ferramentas do Excel e o coeficiente de variação de repetibilidade (𝐶𝑉𝑟) pela Equação 3057. 𝐶𝑉𝑟=𝑆𝑟 𝑐×100 Equação 3057 A partir do 𝑆𝑟 é calculado o limite de repetibilidade (𝑟𝑟), conforme a Equação 3157. A informação proveniente do 𝑟𝑟 permite ao analista decidir se aceita ou não os valores obtidos de duas réplicas em condições de repetibilidade.54 𝑟𝑟=2,8×𝑆𝑟 Equação 3157 1.7.5.2. Precisão intermédia O estudo da precisão em condições de precisão intermédia é efetuado a partir da análise de seis a quinze réplicas de um MR, uma amostra teste ou um branco fortificado.54,56 O desvio padrão de precisão intermédia (𝑆𝑃𝐼) é calculado, obtendo-se de seguida o coeficiente de variação de precisão intermédia (𝐶𝑉𝑃𝐼) pela Equação 32. 𝐶𝑉𝑃𝐼=𝑆𝑃𝐼 𝑐 ×100 Equação 32 Por sua vez, o limite de precisão intermédia (𝑟𝑃𝐼) pode ser determinado através da Equação 3354. 26 𝑟𝑃𝐼=2,8×𝑆𝑃𝐼 Equação 3354 1.7.5.3. Repetibilidade e precisão intermédia Como referido anteriormente, a ANOVA separa e estima as diferentes causas de variação, permitindo a avaliação em simultâneo da precisão em condições de repetibilidade e precisão intermédia.66 Esta ferramenta estatística agrupa os resultados por dia, método, analista, equipamento, ou outros, possibilitando a associação das variâncias entre e dentro de grupos. A informação proveniente da ANOVA: fator único, esquematizada na Tabela 4, tem em consideração p grupos (geralmente, entre 6 a 15 grupos de medidas), com n replicados (usualmente, duplicados, ou seja, n=2) para um total de N ensaios (N=pxn) e graus de liberdade (g.l).54,66–68 Tabela 4. Informações provenientes da ANOVA: fator único. Cada linha corresponde a uma fonte de variação diferente. A primeira linha representa a variação entre grupos (Equações 34 e 37), a segunda linha ilustra a variação dentro de grupos (Equações 35 e 38) e a terceira linha descreve a variação total do conjunto de valores (Equações 36 e 39). Adaptada de: Eurachem Guide: The Fitness for Purpose of Analytical Methods – A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics56. Fonte de variação Soma dos quadrados (SQ) Equação Graus de liberdade (g.l) Quadrado médio (QM) Equação Entre grupos (b) 𝑆𝑄𝑏=𝑛∑(𝑐𝑖 −𝑐)² 𝑖 34 p - 1 𝑄𝑀𝑏=𝑆𝑄𝑏 (𝑝−1) 37 Dentro de grupos (w) 𝑆𝑄𝑤=∑∑(𝑐𝑖𝑗    −𝑐)² 𝑗𝑖 35 N - p 𝑄𝑀𝑤=𝑆𝑄𝑤 (𝑁−𝑝) 38 Total 𝑆𝑄𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙=𝑆𝑄𝑏+𝑆𝑄𝑤 36 N - 1 - 39 A partir da informação obtida da ANOVA: fator único é possível calcular o 𝑆𝑟, o desvio padrão entre grupos (𝑆𝑏𝑒𝑡𝑤𝑒𝑒𝑛) e o 𝑆𝑃𝐼, pelas Equações 4056, 4156 e 4256, respetivamente. 𝑆𝑟=√𝑄𝑀𝑤 Equação 4056 𝑆𝑏𝑒𝑡𝑤𝑒𝑒𝑛=√𝑄𝑀𝑏−𝑄𝑀𝑤 𝑛 Equação 4156 27 𝑆𝑃𝐼=√𝑆𝑟2+𝑆𝑏𝑒𝑡𝑤𝑒𝑒𝑛 2 Equação 4256 1.7.6. Justeza A justeza, também denominada de veracidade, define-se como o grau de concordância entre o valor médio de várias medições e um valor de referência, aceite como verdadeiro.54,57,63 Em contrapartida, a exatidão indica a diferença entre um resultado de uma medição e um valor verdadeiro de uma mensuranda, englobando, assim, a contribuição da veracidade e da precisão.54,56,57 O parâmetro justeza não pode ser medido, pelo que é quantitativamente expresso como bias . O bias total é formado pelo bias do método (erros sistemáticos característicos do método e independentes do laboratório) e pelo bias do laboratório (erros sistemáticos resultantes do desempenho do laboratório).54,56 De modo a determinar quantitativamente a justeza, existem três abordagens: participação em ensaios interlaboratoriais, ensaios de recuperação, análise de materiais de referência (MR) e testes comparativos com outro método.54–57,63 1.7.6.1. Ensaios interlaboratoriais Um laboratório deve ter implementado um sistema de gestão de qualidade (SGQ) dos valores obtidos. Para tal, deve ter em consideração dois processos: controlo de qualidade interno (CQI) e controlo de qualidade externo (CQE).56 De forma a garantir o CQE pode-se recorrer à participação em ensaios interlaboratoriais. Nestes ensaios participam vários laboratórios com o intuito de avaliar o desempenho de ensaios sob condições pré-definidas para posterior comparação e determinação da exatidão.60,69,70 Existem vários tipos de ensaios interlaboratoriais de acordo com a finalidade pretendia, podendo ser denominados de ensaios colaborativos/normalização, ensaios comparativos, ensaios de consenso/conformidade, ensaios de certificação ou ensaios de aptidão.71 O parâmetro mais usado para averiguar os valores obtidos num ensaio interlaboratorial designa-se por z-score e pode ser calculado através da Equação 43.54,72 𝑍=𝑉𝐿−𝑉𝑅 𝑑 Equação 4354 em que Z representa o valor de z-score , VL o resultado obtido pelo laboratório, VR o valor de referência e d o desvio.54 28 Um l z-score l inferior ou igual a dois indica que o resultado obtido é satisfatório, enquanto um l z-score l entre dois e três indica que o valor obtido é questionável. Já um l z-score l igual ou superior a três revela que o resultado é insatisfatório.54,72 Por sua vez, o erro normalizado é determinado pela Equação 4454 com o objetivo de avaliar o desempenho do laboratório.54,72 𝐸𝑛=𝑉𝐿−𝑉𝑅 √𝑈𝑙𝑎𝑏 2+𝑈𝑟𝑒𝑓 2 Equação 4454 em que 𝐸𝑛 representa o erro normalizado, 𝑈𝑙𝑎𝑏 a incerteza expandida do valor obtido pelo laboratório e 𝑈𝑟𝑒𝑓 a incerteza expandida do resultado considerado como verdadeiro (referência).54 Um l𝐸𝑛l menor ou igual a um indica que o valor obtido é satisfatório, enquanto que um l𝐸𝑛l superior a um indica que o valor obtido não é satisfatório.72 1.7.6.2. Ensaios de recuperação Por definição, um ensaio de recuperação consiste na adição de uma determinada quantidade do analito em estudo a uma amostra ou branco de amostra.73 Dado que as amostras possam já conter o analito em estudo, deve-se ter em atenção que a fortificação não ultrapasse a gama de trabalho, pois caso aconteça não há garantia da linearidade da função.54,56 Como tal, são analisadas no mínimo dez réplicas da amostra ou branco de amostra, seguindo-se a fortificação.56 Procede-se de novo à análise das dez réplicas da amostra ou branco de amostra fortificado. A recuperação é determinada pela Equação 4556, em que idealmente o valor obtido deve ser de 100 %. Porém, este resultado depende do procedimento utilizado assim como da concentração de analito presente na amostra, pelo que se recomenda determinar a recuperação em pelo menos três níveis de concentração da gama de trabalho.73 𝑅´ (%)=𝑐´ −𝑐𝐸𝑅     𝑐𝑠𝑝𝑖𝑘𝑒 ×100 Equação 4556 em que 𝑅´ representa a recuperação, 𝑐´  a média dos resultados obtidos após a fortificação,𝑐𝐸𝑅 a média dos resultados obtidos antes da fortificação e 𝑐𝑠𝑝𝑖𝑘𝑒 a concentração de analito adicionado na fortificação.56 35 Em seguida, compara-se o G calculado com o G tabelado, considerando n observações e um nível de confiança de 95 %. Se o G calculado for menor que o G tabelado, o valor suspeito não é desprezado. Em contrapartida, se o G calculado for igual ou superior ao G tabelado, o valor suspeito é rejeitado.66,78 1.7.8.2. Teste t A comparação de dois métodos de análise pode ser realizada utilizando um teste de significância t. Este teste pode ser de comparação de médias, das diferenças (amostras emparelhadas) ou de regressão linear entre dois métodos.57 No teste t de comparação de médias usa-se o teste two-tailed (bicaudal), uma vez que neste teste pretende-se aferir se os resultados obtidos pelos dois métodos diferem significativamente. Assim, existem duas situações: as variâncias dos dois métodos divergirem significativamente ou as variâncias dos dois métodos não diferem significativamente. Caso as variâncias dos dois métodos não diferirem significativamente, o t calculado é determinado pela Equação 64.54,57,66 𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜=|𝑥1    −𝑥2    | √𝑆2(1 𝑛1+1 𝑛2) Equação 6466 Se o t calculado, em módulo for inferior ao valor t tabelado presente na tabela t-student para 𝑛1+ 𝑛2−2 graus de liberdade concluiu-se que os dois métodos testados são equivalentes. Caso contrário, os valores obtidos pelos dois métodos diferem significativamente, pelo que não são equivalentes.54,66 1.7.9. Cartas de controlo de médias ou de indivíduos Os resultados obtidos num laboratório são monitorizados de forma a assegurar que estes são válidos. Para isso, são efetuados testes estatísticos como referido anteriormente. Porém, estes testes apenas avaliam os resultados quando se efetua a análise e não ao longo do tempo.59 Como tal, são utilizadas as cartas de controlo para assegurar o CQI do laboratório. Estas cartas surgiram em 1931 por Walter A. Shewhart com o intuito de averiguar o processo laboratorial e tomar medidas corretivas de imediato, sem que sejam necessários cálculos para tal decisão. Existem vários tipos de cartas de controlo, designadas por cartas de somas cumulativas (cartas “CuSum”), cartas de amplitudes ou de amplitudes móveis e cartas de médias ou de indivíduos (de Shewhart).70 As cartas de médias ou de indivíduos exibem a variação de um dado parâmetro em relação ao tempo, permitindo o controlo da exatidão. Este tipo de cartas subdividem-se em cartas de médias (os pontos apresentados na carta são valores médios de análises efetuadas) e em cartas de indivíduos (cada ponto da carta é um ensaio experimental).54,70 Para a construção de um carta de controlo de 36 médias ou de indivíduos, representada na Figura 1170, são necessárias 20 a 30 determinações de um determinado material. A presença de outliers é verificada de modo a determinar a média e o desvio padrão dos valores obtidos.54,70 Figura 11. Carta de controlo de médias ou de indivíduos. Representação de uma carta de controlo de Shewhart com os respetivos limites definidos. Adaptada de: Guia RELACRE 13 - Validação de Métodos Internos de Ensaio em Análise Química57. Os limites de uma carta de controlo de indivíduos são definidos como valor alvo, limite superior de aviso (LSA), limite inferior de aviso (LIA), limite superior de controlo (LSC) e limite inferior de controlo (LIC). O valor alvo representa a linha central que é o valor médio das determinações ou a concentração nominal de um MR, por exemplo. Já os valores LSA, LIA, LSC e LIC são definidos pelas Equações 6570, 6670, 6770 e 6870, respetivamente. Os LSA e LIA são obtidos com 95 % de confiança, enquanto os LSC e LIC são obtidos com um nível de confiança de 99,7 %.54,70 𝐿𝑆𝐴=𝑥+2×𝑆 Equação 6570 𝐿𝐼𝐴=𝑥−2×𝑆 Equação 6670 𝐿𝑆𝐶=𝑥+3×𝑆 Equação 6770 𝐿𝐼𝐶=𝑥−3×𝑆 Equação 6870 37 2. Parte Experimental 38 Neste capítulo são descritos os procedimentos experimentais referentes aos métodos da determinação da concentração de ureia, alcalinidade, matéria insolúvel, teor de fosfato e teor de biureto, baseados na norma ISO 22241-24. Além disso, são mencionados os equipamentos, materiais, reagentes e soluções necessárias para a execução dos métodos. A água desmineralizada usada ao longo do trabalho apresenta características muito próprias em relação à gama de pH e condutividade. Como tal, as propriedades da água desmineralizada encontram-se apresentadas na Tabela 5.19 Tabela 5. Características da água desmineralizada utilizada no trabalho. Especificações da água desmineralizada: pH e condutividade, expressa em µS/cm. Adaptada do plano de controlo da produção de AdBlue® - IT8819. pH Condutividade (µS/cm) 5,00 - 7,00 < 4,00 2.1. Determinação da concentração de ureia pelo índice de refração 2.1.1. Equipamentos O equipamento usado encontra-se mencionado na Tabela 6, assim como a respetiva marca, modelo e incerteza. As instruções de calibração/verificação do refratómetro referido na Tabela 6 encontram-se descritas no Anexo 6.1.1.79. Tabela 6. Equipamento utilizado para a determinação da concentração de ureia pelo índice de refração. Equipamento necessário para a determinação da concentração de ureia e índice de refração, com a respetiva marca, modelo e incerteza, expressa em unidades de IR. Equipamento Marca Modelo ± Incerteza Refratómetro Bellingham + Stanley RFM990-AUS 0,00005 IR 2.1.2. Materiais Neste método apenas foi necessário utilizar pipetas de Pasteur como material. 2.1.3. Reagentes A Tabela 7 menciona as características do material de referência certificado (MRC) que foi utilizado. 39 Tabela 7. Reagentes utilizados no método da determinação da concentração de ureia pelo índice de refração. O material de referência certificado (MRC) utilizado vem acompanhado do respetivo estado físico, concentração da solução aquosa de ureia ([AUS], AUS proveniente do inglês: Aqueous Urea Solution), expressa em % (m/m), índice de refração e marca. Reagente Estado [AUS] % (m/m) Índice de refração Marca MRC aquoso 32,5 1,38290 ± 0,000034 Bellingham + Stanley 2.1.4. Procedimento experimental Levantar o prensador e proceder à limpeza do prisma com água desmineralizada. Com o auxílio de uma pipeta de Pasteur, retirar uma pequena quantidade de amostra do centro do frasco que contém a amostra e descartar a mesma. De seguida, repetir a recolha da amostra e colocar a amostra na superfície do prisma, com o intuito de cobrir a mesma. Após se ter baixado o prensador e introduzido o respetivo valor de biureto da amostra, dar início à medição. Em cada análise, realizar três medições. Caso o índice de refração de duas das três medições se tenha desviado mais de 0,00005 nD20, repetir as determinações. O resultado deve ser expresso como a média aritmética dos três valores determinados, sendo arredondado ao valor mais próximo de 0,1 % para a fração mássica e até 0,0001 para o índice de refração de acordo com as indicações da norma ISO 22241-2.4 2.2. Determinação da alcalinidade 2.2.1. Equipamentos Os equipamentos usados encontram-se na Tabela 8, assim como a respetiva marca, modelo e incerteza. As instruções de calibração/verificação do potenciómetro referido na Tabela 8 estão exibidas no Anexo 6.2.1.80. Tabela 8. Equipamentos utilizados para a determinação da alcalinidade. Equipamento necessário para a determinação da alcalinidade, acompanhado da marca, modelo e incerteza. Equipamento Marca Modelo ± Incerteza Balança analítica Mettler Toledo XS204 0,0001 g Potenciómetro HANNA instruments HI2210 0,01 unidades de pH 40 2.2.2. Materiais A Tabela 9 menciona os materiais utilizados, tal como a capacidade e incerteza associadas. Tabela 9. Materiais utilizados para a determinação da alcalinidade. Materiais necessários para o método da alcalinidade com a respetiva capacidade e incerteza, expressas em ml. Material Capacidade (ml) ± Incerteza (ml) Bureta 25,00 0,03 Balão volumétrico 50,00 0,06 500,00 0,25 Matraz 250 - Pipeta de Pasteur - - Pipeta graduada 1,000 0,007 5,00 0,03 Proveta 100,00 0,50 2.2.3. Reagentes A Tabela 10 indica as características dos reagentes que foram utilizados. As frases de perigo (H) e de prudência (P) de cada reagente mencionado na Tabela 10 estão descritas no Anexo 6.2.2 – Tabela 6781,82. Tabela 10. Reagentes utilizados para a determinação da alcalinidade. Reagentes necessários para a realização do método da alcalinidade com a respetiva fórmula química, estado, massa molar expressa em g/mol e marca. Reagente Fórmula química Estado Massa molar g/mol Marca Ácido clorídrico 𝐻𝐶𝑙 solução aquosa 36,46 Fisher Chemical Amónia 𝑁𝐻3 solução aquosa 17,03 VWR 41 2.2.4. Preparação das soluções 2.2.4.1. Solução de ácido clorídrico 0,010 mol/l (Anexo 6.2.3.) Para obtenção da solução de ácido clorídrico 0,010 mol/l (Anexo 6.2.3.) recorreu-se a uma diluição do ácido clorídrico 1 mol/l comercial. Como tal, pipetou-se 5 ml de ácido clorídrico 1 mol/l para um balão volumétrico de 500 ml, perfazendo-o com água desmineralizada. 2.2.4.2. Solução de amónia 0,2818 ± 0,0034 % (m/m) (Anexo 6.2.4.) Por diluição da amónia 28,18 % (m/m) comercial, pipetou-se 0,5 ml desta para um balão volumétrico de 50 ml, perfazendo-o com água desmineralizada. 2.2.5. Procedimento experimental 2.2.5.1. Preparação, manuseamento e conservação da amostra Transportar e armazenar a uma temperatura que não excede os 25 ºC a amostra recolhida. Fechar hermeticamente o frasco que contém AdBlue® e não interromper o tempo de análise para evitar a evaporação da amónia. 2.2.5.2. Determinação Adicionar a um matraz 2 g de amostra e 100 ml de água desmineralizada. De seguida, titular com a solução de ácido clorídrico 0,010 mol/l, sob agitação controlada, até pH=7,5. Posteriormente titular, sob agitação reduzida, até ao ponto final de pH=5,7. Em cada análise, realizar duplicados. O resultado deve ser expresso como a média aritmética das duas medições, sendo arredondado ao valor mais próximo de 0,01 % para a fração mássica, de acordo com as indicações da norma ISO 22241-2.4 2.3. Determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico 2.3.1. Equipamentos Os equipamentos utilizados constam na Tabela 11, assim como a marca, modelo e incerteza associadas. 42 Tabela 11. Equipamentos utilizados para a determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico. Equipamento necessário para a determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico, acompanhado da marca, modelo e incerteza. Equipamento Marca Modelo ± Incerteza Balança BOECO Germany - 0,01 g Balança analítica Mettler Toledo XS204 0,0001 g Equipamento para filtração a vácuo - - - Estufa Scientific Engineering 922 0,1 ºC 2.3.2. Materiais Na Tabela 12 estão apresentados os materiais utilizados. Tabela 12. Materiais utilizados para a determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico. Materiais necessários para o método da matéria insolúvel com a respetiva capacidade e incerteza. Material Capacidade ± Incerteza (ml) Balão volumétrico 1000,0 ml 0,4 250,00 ml 0,15 Cadinhos de porcelana 100 ml - Espátula - - Exsicador com sílica gel como agente de secagem 5 l - Filtros com membrana de mistura de ésteres de celulose Tamanho do poro 0,8 µm, diâmetro 47 mm - Gobelé 600 ml - Pinça - - Pipeta Pasteur - - Placas de Petri de alumínio - - Proveta 100,0 ml 1,0 25,00 ml 0,25 43 2.3.3. Reagentes A Tabela 13 apresenta as características dos reagentes usados. As frases de perigo (H) e de prudência (P) de cada reagente mencionado na Tabela 13 encontram-se descritas no Anexo 6.3.1. – Tabela 6983,84. Tabela 13. Reagentes utilizados para a determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico. Reagentes necessários para a determinação do método da matéria insolúvel com a respetiva fórmula química, estado, densidade e marca. Reagente Fórmula química Estado Densidade Marca Celulose microcristalina (C₆H₁₀O₅)n sólido 1,50 kg/l Biochem Chemopharma 2.3.4. Preparação das soluções 2.3.4.1. Solução mãe de celulose microcristalina 5001,0 ± 4,1 mg/l (Anexo 6.3.2.) A celulose microcristalina foi pesada (massa = 5,0010 g) e seca na estufa a 100 ºC durante 1h. Em seguida, a um balão volumétrico de 1000 ml, foi adicionado a celulose microcristalina e água desmineralizada até perfazer o balão. Antes de cada utilização, a suspensão foi bem agitada.37 2.3.4.2. Solução intermédia de celulose microcristalina 500,1 ± 4,1 mg/l (Anexo 6.3.3.) Por diluição da solução mãe de celulose microcristalina 5001,0 ± 4,1 mg/l (Anexo 6.3.2.), transferiu-se 100 ml desta para um balão volumétrico de 1000 ml, perfazendo-o com água desmineralizada. 2.3.4.3. Solução padrão de celulose microcristalina 20,00 ± 0,45 mg/l (Anexo 6.3.4.) A solução padrão de celulose microcristalina 20,00 ± 0,45 mg/l (Anexo 6.3.4.) foi preparada transferindo-se 10 ml da solução intermédia de celulose microcristalina 500,1 ± 4,1 mg/l (Anexo 6.3.3.) para um balão volumétrico de 250 ml. Em seguida, perfez-se o balão com água desmineralizada. 44 2.3.5. Procedimento experimental 2.3.5.1. Preparação do filtro Lavar o filtro no equipamento de filtração a vácuo com cerca de 100 ml de água desmineralizada. Posteriormente, secar o filtro na estufa a 105 ºC e armazenar no exsicador à temperatura ambiente. Antes de cada análise, pesar o filtro na placa de Petri. 2.3.5.2. Preparação da amostra Agitar a amostra e transferir cerca de 100 ml da amostra para um gobelé de 600 ml com separação volumétrica. Registar o peso da amostra. Adicionar ao gobelé 200 ml de água desmineralizada. A amostra não deve ser pipetada para pesagem. 2.3.5.3. Filtração Sem aplicar vácuo, humedecer o filtro anteriormente preparado com cerca de 1 a 2 ml de água desmineralizada. Após filtração da amostra no equipamento de filtração a vácuo, lavar o gobelé com cerca de 5 porções de água desmineralizada (cada porção com cerca de 30 a 50 ml). Certificar se a amostra passou completamente pelo filtro antes da primeira lavagem. Por fim, secar o filtro na estufa a 105 ºC e manter no exsicador à temperatura ambiente até ser pesado. 2.4. Determinação do teor de fosfato 2.4.1. Equipamentos As características dos equipamentos usados encontram-se na Tabela 14. Tabela 14. Equipamentos utilizados para a determinação do teor de fosfato. Equipamento necessário para a determinação do teor de fosfato, acompanhado da marca, modelo e incerteza. Equipamento Marca Modelo ± Incerteza Balança analítica Mettler Toledo XS204 0,0001 g Espectrofotómetro Thermo scientific Evolution 201 0,001 unidades de A Estufa Scientific Engineering 922 - Mufla NABERTHERM LT 9/11/B410 - Placa de aquecimento VELP SCIENTIFICA T.ARE - 51 2.5.3. Reagentes A Tabela 20 menciona as características dos reagentes que foram usados. As frases de perigo (H) e de prudência (P) de cada reagente apresentado na Tabela 20 estão descritas no Anexo 6.5.1. – Tabela 85.81,83,92–95 Tabela 20. Reagentes utilizados para a determinação do teor de biureto. Reagentes necessários para a realização do método da determinação do teor de biureto com a respetiva fórmula química, estado, massa molar expressa em g/mol, pureza em % e marca. Reagente Fórmula química Estado Massa molar (g/mol) Pureza % Marca Ácido clorídrico 𝐻𝐶𝑙 aquoso 36,46 - Fisher Chemical Biureto 𝐶2𝐻5𝑁3𝑂2 sólido 103,08 97,0 Thermo scientific Hidróxido de sódio 𝑁𝑎𝑂𝐻 sólido 40,00 ≥ 99,0 Fisher Chemical Sulfato de cobre(II) pentahidratado 𝐶𝑢𝑆𝑂4∙5𝐻2𝑂 sólido 249,68 ≥ 98,0 VWR Tartarato de sódio e potássio tetrahidratado 𝐶4𝐻4𝐾𝑁𝑎𝑂64𝐻2𝑂 sólido 282,22 ≥ 99,0 labkem 2.5.4. Preparação das soluções 2.5.4.1. Solução de ácido clorídrico 0,10 mol/l (Anexo 6.5.2.) Por diluição da solução comercial de ácido clorídrico 1 mol/l, adicionou-se 25 ml desta a um balão volumétrico de 250 ml. Em seguida, perfez-se o balão volumétrico com água desmineralizada. 2.5.4.2. Solução mãe de biureto 0,7796 ± 0,0013 mg/ml (Anexo 6.5.3.) O reagente biureto foi seco na estufa a 105 ºC durante 3 h e armazenado no exsicador. Posteriormente, num gobelé, dissolveu-se 803,7 mg de biureto em água desmineralizada sem 𝐶𝑂2. Esta solução foi transferida para um balão de 1000 ml. Em seguida, perfez-se o balão com água desmineralizada sem 𝐶𝑂2. 52 2.5.4.3. Solução de sulfato de cobre 0,015 g/ml (Anexo 6.5.4.) A um balão volumétrico de 1000 ml, adicionou-se 15 g de sulfato de cobre(II) pentahidratado. Em seguida, perfez-se o balão volumétrico com água desmineralizada sem 𝐶𝑂2. 2.5.4.4. Solução alcalina de tartarato de sódio e potássio Num gobelé, dissolveu-se 40 g de hidróxido de sódio em 500 ml de água desmineralizada. Transferiu-se esta solução para um balão volumétrico de 1000 ml. Após arrefecimento, adicionou-se ao balão volumétrico 50 g de tartarato de sódio e potássio, perfazendo o mesmo com água desmineralizada. Esta solução teve de ficar em repouso 1 dia antes da sua utilização. 2.5.5. Procedimento experimental 2.5.5.1. Preparação da reta de calibração Para a construção da reta de calibração, transferir 2, 5, 10, 15, 20 e 25 ml da solução mãe de biureto de 0,7796 ± 0,0013 mg/ml (Anexo 6.5.3.) para 6 balões volumétricos de 50 ml e adicionar água desmineralizada até um volume de aproximadamente 25 ml. Em seguida, sob agitação, transferir para cada balão volumétrico 10 ml da solução alcalina de tartarato de sódio e potássio e 10 ml da solução sulfato de cobre. Posteriormente, mergulhar os balões num banho de água com a temperatura de 30 ± 1 ºC durante 15 minutos. Após arrefecimento à temperatura ambiente, perfazer cada balão volumétrico com água desmineralizada. Preparar um branco com todos os reagentes (exceto a solução mãe de biureto). Ler a absorvância das 7 soluções preparadas no espectrofotómetro num comprimento de onda de 550 nm. Repetir anualmente a construção da reta de calibração assim como a determinação do fator de calibração. 2.5.5.2. Fator dia Semanalmente, realizar uma medição de 10 ml da solução mãe de biureto (correspondente a 8 mg de biureto) para um balão volumétrico de 50 ml e proceder consoante descrito em 2.5.5.3.. Em cada análise realizar duas medições independentes. 2.5.5.3. Determinação A um matraz adicionar 100 g de amostra e neutralizar a mesma para pH inferior a 7,0 com ácido clorídrico 0,10 mol/l. Transferir a solução para um balão volumétrico de 250 ml, perfazer o mesmo com água desmineralizada e homogeneizar a solução. Transferir 10 ml da solução preparada para um balão volumétrico de 50 ml e adicionar, sob agitação, 10 ml da solução alcalina de tartarato de sódio e potássio e 10 ml da solução de sulfato de cobre. Mergulhar o balão volumétrico num banho 53 de temperatura controlado a 30 ± 1 ºC durante 15 minutos. Após arrefecimento à temperatura ambiente, perfazer o balão com água desmineralizada e ler a absorvância ao comprimento de onda de 550 nm. Preparar sempre um branco e, em cada análise, realizar duplicados. 54 3. Apresentação e discussão de resultados 55 Este capítulo apresenta duas seções distintas: a primeira aborda os resultados obtidos na verificação dos métodos necessários para caracterizar o produto químico AdBlue® produzido pela RNM enquanto a segunda apresenta os resultados das outras atividades desenvolvidas no laboratório ao longo do projeto individual. 3.1. Verificação dos métodos referentes ao AdBlue® Neste subcapítulo são apresentados e discutidos os resultados obtidos para cada parâmetro de desempenho estudado referente à verificação dos métodos da determinação da concentração de ureia, alcalinidade, matéria insolúvel, teor de fosfato e biureto, reportados na norma ISO 22241-24. 3.1.1. Determinação da concentração de ureia pelo índice de refração A verificação do método da determinação da concentração de ureia pelo índice de refração, presente na norma ISO 22241-24, consistiu na avaliação dos seguintes parâmetros de desempenho: limiares analíticos, precisão em condições de repetibilidade e precisão intermédia, justeza e incerteza do método. Para tal, manuseou-se brancos de reagente, um material de referência certificado (MRC) e amostras teste de AdBlue®. Os valores da concentração de ureia e do índice de refração foram obtidos a partir da leitura direta no visor do refratómetro, não sendo necessário qualquer cálculo, uma vez que o refratómetro utilizado atende todos os requisitos inerentes a este método e apresenta o resultado em unidades de concentração (% (m/m)). 3.1.1.1. Limiares analíticos A fim de determinar o limite de deteção e de quantificação recorreu-se à análise de seis brancos de reagente em duplicado. Os resultados obtidos para a concentração de ureia e para o índice de refração encontram-se descritos na Tabela 21, sendo que nenhum dos valores foi rejeitado pelo teste de Grubbs (Equação 63). Os resultados obtidos para a concentração de ureia estão apresentados com dois algarismos significativos, enquanto os valores obtidos para o índice de refração estão arredondados à quarta casa decimal, conforme indicado na norma ISO 22241-24. 56 Tabela 21. Valores obtidos experimentalmente para os limiares analíticos do método da determinação da concentração de ureia pelo índice de refração. Resultados da concentração de ureia (𝑊𝑈), expressa em % (m/m), e do índice de refração, provenientes da análise de seis brancos de reagente em duplicado. Cada linha da tabela representa um ensaio independente, referentes às duas réplicas para cada parâmetro. Ensaio 𝑾𝑼 (% (m/m)) Índice de refração 1 0,010 0,010 1,3330 1,3330 2 0,017 0,017 1,3830 1,3830 3 0,013 0,013 1,3830 1,3830 4 0,017 0,017 1,3330 1,3330 5 0,013 0,013 1,3830 1,3330 6 0,0067 0,010 1,3330 1,3330 A partir do cálculo do desvio padrão (Equação 24) dos valores descritos na Tabela 21, foi possível estimar o limite de deteção e de quantificação pelas Equações 25 e 26, respetivamente. Deste modo, verificou-se que, em termos de concentração de ureia, a concentração mínima detetável foi de 0,0075 % (m/m) e a concentração mínima quantificável foi de 0,025 % (m/m) (Tabela 22). No caso do índice de refração, constatou-se que o método deteta e quantifica índices de refração superiores a 0,000012 e a 0,000039, respetivamente (Tabela 22). Tabela 22. Valores experimentais dos limiares analíticos do método da determinação da concentração de ureia pelo índice de refração. Limite de deteção (LD) e de quantificação (LQ) obtido experimentalmente da concentração de ureia (𝑊𝑈), expressa em % (m/m), e do índice de refração descrito na norma ISO 22241-2.4 LD LQ 𝑾𝑼 % (m/m) 0,0075 0,025 Índice de refração 0,000012 0,000039 Os valores de limiares analíticos são muito baixos e permitem determinar com grande rigor os valores compreendidos na gama de trabalho de 30 a 35 % (m/m). 3.1.1.2. Precisão A precisão deste método foi avaliada em condições de repetibilidade e precisão intermédia. Para o estudo da repetibilidade analisou-se um MRC em duplicado para determinar a concentração de ureia e 57 o índice de refração. Por sua vez, estas medições foram efetuadas durante seis dias de modo a avaliar também a precisão intermédia. O MRC adquirido ao fornecedor Bellingham + Stanley, apresenta uma concentração em AUS de 32,5 % (m/m) e um índice de refração de 1,38290 ± 0,000034. Na Tabela 23 estão apresentados os valores obtidos da concentração de ureia e índice de refração, sendo que nenhum valor foi rejeitado pelo teste de Grubbs (Equação 63). Os resultados apresentados foram arredondados à primeira casa decimal para a concentração de ureia e à quarta casa decimal para o índice de refração, consoante referido na norma ISO 22241-24. Tabela 23. Valores obtidos para o estudo da precisão, em condições de repetibilidade e precisão intermédia para o método da determinação da concentração de ureia pelo índice de refração. Ensaios em duplicado (colunas) da concentração de ureia (𝑊𝑈), expressa em % (m/m), e do índice de refração durante seis dias (linhas). Foi utilizado um MRC com a concentração de 32,5 % (m/m) e índice de refração de 1,38290 ± 0,000034. Data Ensaios 𝑾𝑼 (% (m/m)) Índice de refração 21/12/2022 32,5 32,5 1,3830 1,3829 22/12/2022 32,5 32,5 1,3830 1,3830 23/12/2022 32,5 32,5 1,3830 1,3830 18/01/2023 32,4 32,5 1,3829 1,3829 19/01/2023 32,5 32,5 1,3830 1,3829 20/01/2023 32,4 32,4 1,3829 1,3829 Por recurso à ferramenta ANOVA: fator único obtiveram-se os valores descritos na Tabela 24. 58 Tabela 24. Informações provenientes da ANOVA: fator único para o estudo da precisão no método da determinação da ureia pelo índice de refração. Informações da ANOVA: fator único, como a soma dos quadrados (SQ), graus de liberdade (g.l) e quadrado médio (QM) para o estudo da precisão em condições de repetibilidade e precisão intermédia. Os resultados destes parâmetros para a concentração de ureia (𝑊𝑈) estão dispostos na terceira, quarta e quinta linha, enquanto os resultados para o índice de refração encontram-se apresentados na oitava, nona e décima linha. 𝑾𝑼 (% (m/m)) Fonte de variação SQ g.l QM Entre grupos 8,9×10−3 5 1,8×10−3 Dentro de grupos 2,3×10−3 6 3,8×10−4 Total 1,1×10−2 11 - Índice de refração Fonte de variação SQ g.l QM Entre grupos 2,1×10−8 5 4,1×10−9 Dentro de grupos 5,8×10−9 6 9,7×10−10 Total 2,7×10−8 11 - A partir destes valores foi possível calcular o desvio padrão de repetibilidade (𝑆𝑟) e o desvio padrão de precisão intermédia (𝑆𝑃𝐼), pelas Equações 40 e 42, respetivamente. Para a concentração de ureia, o 𝑆𝑟 obtido foi de 0,020 % (m/m), enquanto que o 𝑆𝑃𝐼 obtido foi de 0,033 % (m/m) (Tabela 25). Em relação ao índice de refração, o 𝑆𝑟 e de 𝑆𝑃𝐼 obtido foi de 0,000031 e de 0,000050, respetivamente (Tabela 25). Em ambos os parâmetros, observa-se uma maior variabilidade nos valores obtidos em contexto de precisão intermédia, comparativamente aos resultados obtidos em contexto de repetibilidade. Isto deveu-se aos desvios padrão calculados de precisão intermédia serem superiores aos desvios padrão de repetibilidade. Calculou-se o coeficiente de variação de repetibilidade (𝐶𝑉𝑟) e o coeficiente de variação de precisão intermédia (𝐶𝑉𝑃𝐼), de acordo com as Equações 30 e 32, respetivamente. Para a concentração de ureia, o coeficiente de variação obtido foi de 0,060 % em condições de repetibilidade e de 0,10 % em condições de precisão intermédia (Tabela 25). Para o índice de refração, o 𝐶𝑉𝑟 foi de 0,0022 %, enquanto o 𝐶𝑉𝑃𝐼 foi de 0,0037 % (Tabela 25). O laboratório tem definido como critério de aceitação um CV < 10 %. Visto que o 𝐶𝑉𝑟 e o 𝐶𝑉𝑃𝐼, em ambos os casos, se encontram abaixo dos 10 %, conclui-se que os erros aleatórios não afetam a confiança nos resultados. Por conseguinte, com o intuito de se estabelecer um limite de aceitabilidade para a diferença entre duplicados de amostra, determinou-se o limite de repetibilidade (𝑟𝑟) e o limite de precisão intermédia 59 (𝑟𝑃𝐼), de acordo com as Equações 31 e 33, respetivamente. Desta forma, o 𝑟𝑟 e o 𝑟𝑃𝐼 para a concentração de ureia foi de 0,055 % (m/m) e de 0,092 % (m/m), respetivamente (Tabela 25). Comparando o 𝑟𝑟 mencionado na norma ISO 22241-24 (0,154 % (m/m)) com o determinado experimentalmente (0,055 % (m/m)) verificou-se que este último é inferior e, por isso, admissível (Tabela 25). Relativamente ao índice de refração, também se obteve um 𝑟𝑟 experimental (0,000087) inferior ao referido na norma ISO 22241-24 (0,00025) e, por isso, aceitável. Já o 𝑟𝑃𝐼 obtido para o índice de refração foi de 0,00014 (Tabela 25). Pela análise da Tabela 25, constatou-se que embora os valores obtidos para a precisão intermédia sejam superiores aos obtidos para a repetibilidade, a diferença não é significativa. Assim, conclui-se que a realização de análises no mesmo dia ou em diferentes dias não influenciam consideravelmente os resultados. Tabela 25. Parâmetros para avaliar a precisão, em condições de repetibilidade e precisão intermédia no método da determinação da ureia pelo índice de refração. Valores do desvio padrão de repetibilidade (𝑆𝑟), desvio padrão de precisão intermédia (𝑆𝑃𝐼), coeficiente de variação de repetibilidade (𝐶𝑉𝑟), coeficiente de variação de precisão intermédia (𝐶𝑉𝑃𝐼), limite de repetibilidade (𝑟𝑟) e limite de precisão intermédia (𝑟𝑃𝐼) experimentais, referidos na norma ISSO 22241-24 e definido pelo laboratório para a concentração de ureia (𝑊𝑈) e para o índice de refração. 𝑾𝑼 Índice de refração Variável Experimental Norma4 Laboratório Experimental Norma4 Laboratório 𝑆𝑟 (% (m/m)) 0,020 - - 0,000031 - - 𝑆𝑃𝐼 (% (m/m)) 0,033 - - 0,000050 - - 𝐶𝑉𝑟 (%) 0,060 - < 10 0,0022 - < 10 𝐶𝑉𝑃𝐼 (%) 0,10 - < 10 0,0037 - < 10 𝑟𝑟 (% (m/m)) 0,055 0,154 - 0,000087 0,00025 - 𝑟𝑃𝐼 (% (m/m)) 0,092 - - 0,00014 - - 3.1.1.3. Justeza Neste método, o estudo da justeza consistiu na participação em seis ensaios interlaboratoriais, mais propriamente, em ensaios colaborativos. Em cada análise, determinou-se a concentração de ureia e o índice de refração de amostras teste de AdBlue®, em paralelo com um laboratório externo. Os resultados destes ensaios constam na Tabela 26, sendo que em todos os cálculos considerou-se como valor de referência os resultados do laboratório externo. 60 Tabela 26. Valores obtidos na participação em seis ensaios interlaboratoriais para avaliar a justeza no método da determinação da concentração de ureia pelo índice de refração. Valores obtidos pelo laboratório (VL) e pelo laboratório externo, aceite como o valor de referência (VR) para a concentração de ureia (𝑊𝑈), em % (m/m), e para o índice de refração. Os resultados obtidos foram arredondados ao valor mais próximo de 0,1 % (m/m) para a concentração de ureia e até 0,0001 para o índice de refração, conforme mencionado na norma ISO 22241-24. 𝑾𝑼 (% (m/m)) Índice de refração VL VR VL VR 32,7 32,8 1,3836 1,3835 32,5 32,6 1,3834 1,3834 32,7 32,8 1,3837 1,3836 32,6 32,7 1,3836 1,3835 32,7 32,8 1,3838 1,3837 32,4 32,5 1,3832 1,3832 De modo a avaliar o desempenho do laboratório calculou-se para cada amostra o z-score e o erro normalizado, de acordo com as Equações 43 e 44, respetivamente. Pelo mesmo motivo, calculouse também o bias relativo para cada amostra (Equação 47) e, consequentemente, o valor médio do bias relativo, com o intuito de averiguar a ocorrência de erros sistemáticos. Segundo a Tabela 27, observa-se que, para a concentração de ureia, o valor mínimo de l z-score l observado foi de 0,8 % (m/m), enquanto o valor máximo observado foi de 1,3 % (m/m). Já para o índice de refração, observou-se que o valor mínimo de l z-score l foi de 0,0500 e o valor máximo observado foi de 0,5667. Em ambas as situações, verifica-se que os z-score , em módulo, são inferiores a 2, revelando que os resultados são satisfatórios. Tais afirmações foram corroboradas pelo facto dos erros normalizados, expressos em módulo, serem inferiores ou iguais a 1 por arredondamento às unidades, nos dois parâmetros em estudo. Por fim, o bias médio relativo para a concentração de ureia e para o índice de refração correspondeu a 0,32 % e a 0,0044 %, respetivamente. Estes valores enquadram-se no critério de aceitação definido internamente, de um bias menor que 5,0 %, corroborando a conclusão acerca da justeza do método. 67 de 10 réplicas independentes de uma amostra teste de AdBlue® antes e pós fortificação, assim como o valor de recuperação obtido em cada ensaio, a recuperação média obtida e o valor de recuperação esperado. O teste de Grubbs (Equação 63) efetuado à recuperação obtida em cada ensaio, revelou que nenhum dos valores foi desprezado. Tabela 34. Valores da fortificação de uma amostra teste de AdBlue® para avaliação da justeza do método da determinação da alcalinidade. Resultados obtidos do teor de alcalinidade (𝑊𝑁𝐻3 ) antes e pós fortificação de uma amostra teste de AdBlue® em % (m/m), assim como a recuperação obtida em cada ensaio (R´ obtida), valor médio de recuperação obtido e recuperação ideal, expressos em %. Os resultados da amostra antes e pós fortificação são apresentados com três algarismos significativos, assim como a R´ obtida e o valor médio de recuperação obtido para posterior comparação com a taxa de recuperação ideal de 100 %. 𝑾𝑵𝑯𝟑 (% (m/m)) Amostra antes da fortificação Amostra fortificada R´ obtida (%) 0,00884 0,109 90,6 0,0100 0,112 93,1 0,00908 0,121 102 0,00912 0,121 102 0,0101 0,117 97,1 0,0108 0,095 76,2 0,0119 0,093 73,5 0,00944 0,124 104 0,00893 0,106 88,1 0,0102 0,119 99,3 Valor médio de recuperação obtido (%) 95,5 Recuperação ideal (%) 100 68 3.1.2.4. Incerteza do método A norma ISO 11352:201277 refere a estimativa da incerteza do método baseada em dados de validação e controlo de qualidade. Por isso, para a quantificação da incerteza de medição teve-se em consideração os dados relativos à precisão e à justeza. Na estimativa da incerteza associada à precisão, considerou-se o desvio padrão de precisão intermédia de 0,0074 % (m/m), calculado anteriormente no estudo do parâmetro da precisão. Por isso, obteve-se, pela Equação 59, uma incerteza relativa associada à precisão intermédia (𝑢𝑅𝑤 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎) de 0,026. Esta abordagem foi a eleita porque a amostra de controlo de qualidade manuseada no estudo da precisão cobriu todo o processo analítico e era semelhante em matriz e níveis de concentração de analito às amostras teste. A componente da incerteza associada à justeza foi avaliada a partir de ensaios de recuperação, dado ter sido utilizada esta abordagem aquando o estudo da justeza do método. Assim, a partir dos valores de recuperação obtidos anteriormente, da taxa de recuperação considerada ideal de 100 %, dos 10 ensaios efetuados e da incerteza associada à concentração de amónia adicionada na fortificação, determinou-se a incerteza relativa da justeza (𝑢𝑏 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎) pela Equação 61, tendo esta correspondido a 0,13. Por sua vez, a partir dos valores de 𝑢𝑅𝑤 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 e 𝑢𝑏 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 calculou-se a incerteza relativa combinada (𝑢𝑐 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎) de 0,13 (Equação 56). Por fim, a incerteza expandida (U) foi obtida a partir da Equação 57 e tendo em consideração um fator de expansão igual a dois, tendo-se obtido o valor de 26 %. A Tabela 35 apresenta os resultados intermédios para o cálculo da incerteza relativa combinada e incerteza expandida. 69 Tabela 35. Valores para o cálculo da incerteza do método da determinação da alcalinidade. Desvio padrão da precisão intermédia (𝑆𝑃𝐼), incerteza associada à precisão (𝑢𝑅𝑤), concentração da solução de amónia (𝐶𝑠𝑜𝑙. 𝑎𝑚ó𝑛𝑖𝑎), desvio da recuperação obtida relativamente à recuperação ideal de 100 % (𝑏𝑖), número de ensaios de recuperação efetuados (𝑛𝑛), quadrado médio relativo dos desvios das análises de fortificação da amostra (𝑏𝑟𝑚𝑠), incerteza da concentração do analito adicionado (𝑢𝑐𝑜𝑛𝑐), incerteza do volume adicionado (𝑢𝑣𝑜𝑙), incerteza da adição do analito (𝑢𝑎𝑑𝑑), incerteza associada à justeza (𝑢𝑏), incerteza combinada (𝑢𝑐), fator de expansão (𝑘) e incerteza expandida (U). Variável Valor 𝑆𝑃𝐼 (% (m/m)) 0,0074 𝑢𝑅𝑤 (% (m/m)) 0,0074 Csol. amónia (% (m/m)) 0,28 𝑢𝑅𝑤 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,026 𝑢𝑅𝑤2 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,00069 Σ𝑏𝑖2 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 0,16 𝑛𝑛 10 𝑏𝑟𝑚𝑠 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 0,13 𝑏𝑟𝑚𝑠 2 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 0,016 𝑢𝑐𝑜𝑛𝑐 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,029 𝑢𝑣𝑜𝑙 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,014 𝑢𝑎𝑑𝑑 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,032 𝑢𝑎𝑑𝑑 2 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,0010 𝑢𝑏 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,13 𝑢𝑏 2 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,017 𝑢𝑐 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,13 𝑘 2 𝑈 (%) 26 Em síntese, todos os parâmetros de desempenho estudados foram devidamente verificados de forma a permitir a determinação da alcalinidade em amostras de AdBlue®, tendo em consideração a norma ISO 22241-24. 70 3.1.3. Determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico A fim de verificar o método da determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico, reportado na norma ISO 22241-24, estudou-se os seguintes parâmetros de desempenho: limiares analíticos, precisão em condições de repetibilidade e precisão intermédia, justeza e incerteza do método. Para tal, manuseou-se brancos de reagente, uma solução padrão de celulose microcristalina e amostras teste de AdBlue®. O teor de matéria insolúvel foi obtido a partir da Equação 704, descrita no documento normativo ISO 22241-24. Os resultados finais foram arredondados a 0,1 mg/kg para teores de matéria insolúvel inferiores a 10 mg/kg e arredondados a 1 mg/kg para teores de matéria insolúvel iguais ou superiores a 10 mg/kg.4 𝑊𝑖𝑛𝑠=(𝑚𝐹𝑅−𝑚𝐹𝐿) 𝑚𝑠×1000 Equação 704 em que 𝑊𝑖𝑛𝑠 representa o teor de matéria insolúvel em mg/kg, 𝑚𝐹𝑅 a massa do filtro seco com depósito de amostra em mg, 𝑚𝐹𝐿 a massa do filtro seco em mg e 𝑚𝑠 a massa da amostra em g.4 3.1.3.1. Limiares analíticos Os limiares analíticos foram determinados mediante a análise de seis brancos de reagente. A Tabela 36 indica os valores obtidos, sendo que nenhum valor suspeito foi desprezado pelo teste de Grubbs (Equação 63). Tabela 36. Resultados experimentais para os limiares analíticos do método da determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico. Resultados do teor de matéria insolúvel, em mg/kg, provenientes da análise de seis brancos de reagente. Os valores foram expressos por arredondamento às décimas conforme indicado na norma ISO 22241-24. Ensaio 𝑾𝒊𝒏𝒔 (mg/kg) 1 1,0 2 1,1 3 1,1 4 1,1 5 1,0 6 1,1 71 A partir da Tabela 36 estimou-se o desvio padrão (Equação 24) de 0,037 mg/kg. Pelos resultados presentes na Tabela 37, obtidos através das Equações 25 e 26, verifica-se que o presente método é capaz de detetar e de quantificar teores de matéria insolúvel superiores a 0,11 mg/kg e a 0,37 mg/kg, respetivamente. Comparativamente ao limite de quantificação (LQ) indicado na norma ISO 22241-24 de 1,0 mg/kg, observa-se que o LQ obtido experimentalmente de 0,37 mg/kg é inferior (Tabela 37). Tal revela que o método desenvolvido é mais sensível, permitindo quantificar teores de matéria insolúvel mais baixos. Tabela 37. Valores dos limiares analíticos do método da determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico. Limite de deteção (LD) e de quantificação (LQ) obtido experimentalmente e apresentado na norma ISO 22241-24 do teor de matéria insolúvel (𝑊𝑖𝑛𝑠), em mg/kg. LD experimental LQ experimental LQ norma4 𝑾𝒊𝒏𝒔 (mg/kg) 0,11 0,37 1,0 3.1.3.2. Precisão A precisão foi avaliada em condições de repetibilidade e precisão intermédia. Para isso, analisou-se em duplicado e durante seis dias uma solução padrão de celulose microcristalina com concentração igual a 20,00 ± 0,45 mg/l (Anexo 6.3.4.). De forma a expressar os resultados na mesma unidade de concentração, a solução padrão de celulose microcristalina foi convertida de mg/l para mg/kg, segundo a Equação 71. 𝑐 𝜌=20,00 1,50 =13,33 𝑚𝑔/𝑘𝑔 Equação 71 em que 𝑐 representa a concentração em mg/l e 𝜌 a densidade da celulose microcristalina (a 20 ºC) em kg/l. Na Tabela 38 constam os valores obtidos para a precisão, dos quais nenhum foi desprezado pelo teste de Grubbs (Equação 63). 72 Tabela 38. Valores para o estudo da precisão, em condições de repetibilidade e precisão intermédia para o método da determinação da matéria insolúvel. Ensaios em duplicado (colunas) da matéria insolúvel (𝑊𝑖𝑛𝑠), expressa em mg/kg durante seis dias (linhas). Data 𝑾𝒊𝒏𝒔 (mg/kg) 26/04/2023 14,04 15,66 27/04/2023 14,95 12,87 28/04/2023 12,30 10,75 02/05/2023 16,56 15,46 03/05/2023 13,36 13,25 04/05/2023 14,20 15,46 Na Tabela 39 estão descritos os parâmetros da ferramenta ANOVA: fator único obtidos com os valores de precisão. Tabela 39. Informações provenientes da ANOVA: fator único para o estudo da precisão no método da determinação da matéria insolúvel. Informações da ANOVA: fator único, como a soma dos quadrados (SQ), graus de liberdade (g.l) e quadrado médio (QM) para o estudo da precisão em condições de repetibilidade e precisão intermédia no método da matéria insolúvel. Fonte de variação SQ g.l QM Entre grupos 25 5 5,0 Dentro de grupos 4,5 6 0,75 Total 29 11 - A partir dos dados presentes na Tabela 39, determinou-se o desvio padrão de repetibilidade (𝑆𝑟) de 0,87 mg/kg e o desvio padrão de precisão intermédia (𝑆𝑃𝐼) de 1,7 mg/kg, pelas Equações 40 e 42, respetivamente. Tal como esperado, através da Tabela 40, observa-se uma maior variabilidade nos resultados da precisão intermédia relativamente aos da repetibilidade. Posteriormente, calculou-se o coeficiente de variação de repetibilidade (𝐶𝑉𝑟) (Equação 30) de 6,2 % e o coeficiente de variação de precisão intermédia (𝐶𝑉𝑃𝐼) (Equação 32) de 12 %. Verifica-se que o CV de precisão intermédia é de 12 %, mas o documento normativo ISO 22241-2 refere apenas o limite de repetibilidade e de reprodutibilidade (Tabela 40). O limite de repetibilidade (𝑟𝑟) (Equação 31) e o limite de precisão 73 intermédia (𝑟𝑃𝐼) (Equação 33) obtidos foram de 2,425 mg/kg e de 4,732 mg/kg, respetivamente. Como o 𝑟𝑟 obtido experimentalmente de 2,425 mg/kg é menor que o 𝑟𝑟 reportado no documento normativo ISO 22241-24 de 4,871 mg/kg, considera-se o 𝑟𝑟 experimental aceitável (Tabela 40). Tal indica que os erros aleatórios não afetam a confiança nos resultados. Tabela 40. Parâmetros para avaliar a precisão, em condições de repetibilidade e precisão intermédia no método da determinação da matéria insolúvel. Valores do desvio padrão de repetibilidade (𝑆𝑟), desvio padrão de precisão intermédia (𝑆𝑃𝐼), coeficiente de variação de repetibilidade (𝐶𝑉𝑟), coeficiente de variação de precisão intermédia (𝐶𝑉𝑃𝐼), limite de repetibilidade (𝑟𝑟) e limite de precisão intermédia (𝑟𝑃𝐼) experimentais e definidos na norma ISO22241-24 para a matéria insolúvel (𝑊𝑖𝑛𝑠). 𝑾𝒊𝒏𝒔 Variável Experimental Norma4 𝑆𝑟 (mg/kg) 0,87 - 𝑆𝑃𝐼 (mg/kg) 1,7 - 𝐶𝑉𝑟 (%) 6,2 - 𝐶𝑉𝑃𝐼 (%) 12 - 𝑟𝑟 (mg/kg) 2,425 4,871 𝑟𝑃𝐼 (mg/kg) 4,732 - 3.1.3.3. Justeza De forma a avaliar a justeza do método recorreu-se à participação em ensaios interlaboratoriais, mais propriamente, em ensaios colaborativos. Para isso, determinou-se, em paralelo com um laboratório externo, o teor de matéria insolúvel em seis amostras teste de AdBlue®. Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 41, sendo que se assumiu como valores de referência os resultados provenientes do laboratório externo. 74 Tabela 41. Valores obtidos na participação em seis ensaios interlaboratoriais para avaliar a justeza no método da determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico. Valores obtidos pelo laboratório (VL) e pelo laboratório externo, aceite como o valor de referência (VR) para o teor de matéria insolúvel (𝑊𝑖𝑛𝑠), em mg/kg. Os resultados obtidos foram apresentados por arredondamento à primeira casa decimal como referido na norma ISO 22241-24. 𝑾𝒊𝒏𝒔 (mg/kg) VL VR 1,1 1,5 3,5 4,3 2,9 2,2 2,8 2,2 3,3 2,2 3,7 2,9 O desempenho do laboratório foi avaliado, tendo por base os parâmetros z-score (Equação 43) e erro normalizado (Equação 44) de cada amostra. Assim, pela Tabela 42, verifica-se que os z-score obtidos, em módulo, foram inferiores a 2 e que os erros normalizados, em módulo, foram inferiores a 1. Tais afirmações indicam que os resultados são satisfatórios. Em seguida, determinou-se a recuperação aparente para cada amostra (Equação 48). O teste de Grubbs (Equação 63) efetuado aos valores de recuperação aparente descritos na Tabela 41 indicou que nenhum dos valores suspeitos foi desprezado. Mais tarde, calculou-se o valor médio da recuperação aparente de 114,4 % (Tabela 42). Em suma, tais parâmetros indicam que o presente método é considerado justo. 75 Tabela 42. Parâmetros para avaliar a justeza provenientes da participação em seis ensaios interlaboratoriais para o método da determinação da matéria insolúvel. z-score, erro normalizado (𝐸𝑛), recuperação aparente (R), em percentagem, e valor médio da recuperação aparente (R), em percentagem, para o teor de matéria insolúvel (𝑊𝑖𝑛𝑠 ). 𝑾𝒊𝒏𝒔 (mg/kg) z-score 𝑬𝒏 R (%) - 0,09 - 0,038 71,00 - 0,16 -0,068 81,94 0,15 0,065 133,6 0,12 0,049 125,1 0,22 0,094 148,5 0,16 0,067 126,2 Valor médio da R (%) 114,4 3.1.3.4. Incerteza do método A quantificação da incerteza do método baseou-se na metodologia referida na norma ISO 11352:201277. Por este motivo, recorreu-se aos dados de controlo de qualidade e validação, mais propriamente, à informação relativa à precisão (associada aos erros aleatórios) e à justeza (associada aos erros sistemáticos). Na quantificação da incerteza associada à precisão (𝑢𝑅𝑤) considerou-se o desvio padrão de precisão intermédia de 1,7 mg/kg, calculado aquando o estudo da precisão do método (Tabela 43). Deste modo, pela Equação 59, obteve-se uma 𝑢𝑅𝑤 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 de 0,016 (Tabela 43). A incerteza associada à justeza (𝑢𝑏) foi calculada segundo os dados obtidos no estudo da justeza, ou seja, a participação em seis ensaios interlaboratoriais. Assim, através da Equação 60, calculou-se a 𝑢𝑏 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 de 0,32 (Tabela 43). A partir dos dados de 𝑢𝑅𝑤 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 e de 𝑢𝑏 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎, determinou-se a incerteza padrão combinada (𝑢𝑐) na forma relativa, pela Equação 56, de 0,10 (Tabela 43). Por último, a incerteza expandida (U) de 21 % foi calculada de acordo com a Equação 57 e tendo em conta um fator de expansão (k) igual a 2, para um nível de confiança de 95 %, consoante descrito na Tabela 43. 76 Tabela 43. Dados para o cálculo da incerteza de medição do método da determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico. Desvio padrão da precisão intermédia (𝑆𝑃𝐼), incerteza associada à precisão (𝑢𝑅𝑤), diferença entre o valor medido e o definido para a amostra (𝐷𝑖), número de ensaios interlaboratoriais (𝑛𝑖𝑙𝑐), raiz quadrada média do desvio entre o resultado obtido e o definido para cada amostra (𝐷𝑟𝑚𝑠), incerteza definida no ensaio interlaboratorial (𝑢𝑐𝑟𝑒𝑓𝐸𝐼𝐿), incerteza associada à justeza (𝑢𝑏), incerteza combinada (𝑢𝑐), fator de expansão (𝑘) e incerteza expandida (𝑈). Variável Valor 𝑆𝑃𝐼 (mg/kg) 1,7 𝑢𝑅𝑤 (mg/kg) 1,7 𝑢𝑅𝑤 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,016 𝑢𝑅𝑤2 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,00026 Σ𝐷𝑖2𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,61 𝑛𝑖𝑙𝑐 6 𝐷𝑟𝑚𝑠 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,32 𝐷𝑟𝑚𝑠 2 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,10 𝑢𝐶𝑟𝑒𝑓𝐸𝐼𝐿 2 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,0023 𝑢𝑏 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,32 𝑢𝑏 2 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,011 𝑢𝑐 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,10 𝑘 2 U (%) 21 Sumariamente, o estudo dos diferentes parâmetros de desempenho permitiram caracterizar o presente método, indicando que o mesmo é adequado para a determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico no laboratório. 83 primeiro e ao último padrão. Determinou-se o valor de PG de acordo com a Equação 23, tendo este correspondido a 1,683 (Tabela 49). Comparou-se este valor com o valor tabelado de F de 4,026, referido na tabela “ two tailed test ”, para um n = 9 e para um nível de confiança de 95 % (Tabela 49). Como o PG calculado de 1,683 é menor que o valor de F tabelado de 4,026, conclui-se que as diferenças entre as variâncias não são significativas e, por isso, a gama de trabalho encontra-se bem ajustada (Tabela 49). Tabela 48. Valores de concentração de fosfato para o teste da homogeneidade de variâncias. Valores da concentração de fosfato (𝑊𝑝) obtidos para o teor de fosfato do primeiro (P1 – 0,03994 ± 0,00030 mg/kg (Anexos 6.4.4. e 6.4.5.)) e do último (P6 – 0,3998 ± 0,0025 mg/kg (Anexos 6.4.4. e 6.4.5.)) padrão da reta de calibração (Figura 12). 𝑾𝒑 P1 P6 0,04291 0,4198 0,06034 0,4089 0,03202 0,4416 0,03856 0,4198 0,04509 0,4067 0,04073 0,4154 0,04727 0,4133 0,04073 0,4263 0,03638 0,4198 Tabela 49. Valores provenientes do teste de homogeneidade de variâncias para o método da determinação de fosfato. Desvio padrão (S), variância (S²), valor de PG e valor de F tabelado (considerando a tabela “two tailed test”, um n=9 e um nível de confiança de 95%). Teste de homogeneidade de variâncias Variável Valor Primeiro padrão Último padrão S (mg/kg) 0,007602 0,009864 S² (mg/kg) 5,780E-05 9,729E-05 PG 1,683 F tabelado 4,026 84 3.1.4.4. Análise de padrão para a verificação do método Conforme citado em 2.4.5.4., a norma ISO 22241-24 exige a verificação do método de 3 em 3 meses recorrendo à análise de um padrão de fosfato de concentração conhecida. Os valores obtidos não podem diferir de ± 2 % do valor teórico do padrão de fosfato.4 Por isso, analisaram-se 3 réplicas independentes da solução padrão de fosfato de 0,2025 ± 0,0010 mg/kg (Anexo 6.4.7.), conforme descrito em 2.4.5.4. Os valores obtidos do teor de fosfato, em mg/kg, encontram-se na Tabela 50. Relativamente à solução padrão de fosfato 0,2025 ± 0,0010 mg/kg (Anexo 6.4.7.), os valores experimentais diferem mais de 2 %. Contudo, a incerteza do presente método (20 %), determinada em 3.1.4.8., associada aos valores experimentais contemplam o valor nominal de 0,2025 mg/kg, pelo que se considera válido o método da determinação de fosfato (Tabela 50). Tabela 50. Valores nominal e experimentais para a verificação do método da determinação do teor de fosfato. Valor nominal da concentração de fosfato (𝑊𝑝) com a respetiva incerteza, em mg/kg e valores experimentais, com a respetiva incerteza, da concentração de fosfato (𝑊𝑝) em mg/kg da análise de 3 réplicas independentes (linhas) da solução padrão 0,2025 ± 0,0010 mg/kg (Anexo 6.4.7.). 𝑾𝒑 ± u (mg/kg) 𝑾𝒑 experimental ± u (mg/kg) 0,2025 ± 0,0010 0,219 ± 0,044 0,232 ± 0,046 0,215 ± 0,043 3.1.4.5. Limiares analíticos Os limiares analíticos indicam o teor mínimo de fosfato que o método é capaz de detetar (limite de deteção) e de quantificar (limite de quantificação). Inicialmente, determinou-se o limite de deteção e de quantificação do método. Por isso, analisaram-se 6 réplicas independentes do primeiro padrão da reta de calibração. Dado as 6 réplicas independentes terem sofrido o processo de tratamento da amostra (2.4.5.5.), preparou-se uma solução com a concentração igual à do primeiro padrão da reta de calibração (Figura 12), de 0,04049 ± 0,00020 mg/kg, a partir da solução intermédia de fosfato de 2,0245 ± 0,0080 mg/kg (Anexo 6.4.8.). Após os processos de tratamento da amostra (2.4.5.5.) e de determinação espectrofotométrica (2.4.5.6.), obtiveram-se os valores do teor de fosfato mencionados na Tabela 51, sendo que nenhum valor foi rejeitado pelo teste de Grubbs (Equação 63). Porém, visualmente, observa-se que o valor 85 relativo ao primeiro ensaio (0,08422 mg/kg) é metade dos restantes valores presentes na Tabela 51. Além disso, a inclusão do valor 0,08422 mg/kg (Tabela 51) nos cálculos resultaria num LQ superior ao antepenúltimo padrão da reta de calibração (Figura 12), englobando apenas os dois últimos padrões da reta de calibração (Figura 12). Por estes motivos, decidiu-se desprezar o valor de 0,08422 (Tabela 51) para o cálculo dos limiares analíticos do método. Tabela 51. Valores obtidos experimentalmente para os limiares analíticos do método da determinação do fosfato. Resultados do teor de fosfato (𝑊𝑝), expressos em mg/kg, provenientes da análise de seis réplicas independentes do primeiro padrão da reta de calibração. Ensaio 𝑾𝒑 (mg/kg) 1 0,08422* 2 0,1174 3 0,1331 4 0,1682 5 0,1349 6 0,1516 *Valor rejeitado. Assim, com base nos resultados apresentados na Tabela 51, estimou-se o desvio padrão de 0,014 mg/kg, o LD do método de 0,041 mg/kg e o LQ do método de 0,14 mg/kg, pelas Equações 24, 25 e 26, respetivamente (Tabela 52). Determinaram-se também os limiares analíticos recorrendo ao método gráfico. Obteve-se um LD de 0,014 mg/kg (Equação 27) e um LQ de 0,044 mg/kg (Equação 28) (Tabela 52). É importante frisar que estes valores correspondem ao LD e ao LQ instrumental, uma vez que não se fez tratamento aos padrões. Os resultados obtidos pelo LD/LQ do método e pelo LD/LQ instrumental diferem significativamente (Tabela 52). A divergência entre estes valores deve-se a diversos fatores, sendo o mais relevante o facto de que na determinação dos limiares analíticos do método o primeiro padrão da reta de calibração analisado sofreu o processo de tratamento da amostra. Visto que esta é uma etapa demorada e complexa, pode ter ocorrido perdas de fosfato, principalmente no processo de evaporação da amostra na estufa e da incineração da mesma na mufla. Tal motivo induz a um resultado do teor de fosfato inferior ao real, pelo que se torna impossível detetar e quantificar fosfato em concentrações muito baixas. De facto, observou-se que o método não conseguiu quantificar as duas primeiras soluções padrão da reta de calibração (Figura 12). Tal deveu-se ao facto do LQ do método ser superior 86 às concentrações das duas primeiras soluções padrão. Em virtude dos limiares analíticos do método retratarem melhor a determinação do teor de fosfato por este método, os limiares analíticos obtidos segundo esta metodologia são definidos como o LD e o LQ do presente método. Por este motivo e dado o intervalo de 0,05 mg/kg a 10 mg/kg, reportado na norma ISO 22241-24, em que é possível quantificar fosfato por este método, seria interessante no futuro alargar o intervalo de concentrações da reta de calibração para concentrações superiores ao último padrão da reta de calibração (Figura 12). Tabela 52. Valores dos limiares analíticos para o método da determinação do teor de fosfato. Resultados do limite de deteção (LD) e do limite de quantificação (LQ) do método e instrumental, pelo método gráfico, para a determinação do teor de fosfato, em mg/kg. Método Instrumental LD (mg/kg) 0,041 0,014 LQ (mg/kg) 0,14 0,044 3.1.4.6. Precisão A precisão foi estudada em condições de repetibilidade e de precisão intermédia. Por isso, analisou-se, em duplicado e durante seis dias, uma solução padrão de concentração em fosfato igual a 0,4049 ± 0,0019 mg/kg (Anexo 6.4.9.). Este nível de concentração foi escolhido tendo em conta o intervalo definido na norma ISO 22241-24 de 0,218 mg/kg a 1,007 mg/kg aquando da avaliação da precisão do método e a gama de trabalho em que o método é capaz de determinar a quantidade de fosfato de forma rigorosa. A solução de 0,4049 ± 0,0019 mg/kg foi preparada a partir da solução intermédia de fosfato de 2,0245 ± 0,0080 mg/kg (Anexo 6.4.9.) e sofreu o processo de tratamento da amostra (2.4.5.5.), uma vez que o resultado do teste de significância t (Equação 64) indicou que os resultados das soluções com tratamento da amostra diferem dos resultados das soluções sem tratamento da amostra. Os valores obtidos do teor de fosfato, em mg/kg, constam na Tabela 53, sendo que nenhum valor foi desprezado pelo teste de Grubbs (Equação 63). 87 Tabela 53. Valores obtidos para o estudo da precisão, em condições de repetibilidade e precisão intermédia para o método da determinação do teor de fosfato. Ensaios em duplicado (colunas) do teor de fosfato (𝑊𝑝), expresso em mg/kg durante seis dias (linhas). Data 𝑾𝒑 (mg/kg) 10/04/2023 0,4050 0,3870 11/04/2023 0,3860 0,3530 12/04/2023 0,3690 0,3670 13/04/2023 0,3200 0,3370 14/04/2023 0,3540 0,3690 17/04/2023 0,3860 0,4000 A Tabela 54 exibe os resultados provenientes das especificações da ANOVA: fator único. Tabela 54. Informações relativas à ANOVA: fator único para o estudo da precisão no método da determinação do teor de fosfato. Informações retiradas da ANOVA: fator único, como a soma dos quadrados (SQ), graus de liberdade (g.l) e quadrado médio (QM) para o estudo da precisão em condições de repetibilidade e precisão intermédia no método da determinação do teor de fosfato. Fonte de variação SQ g.l QM Entre grupos 0,0060 5 0,0012 Dentro de grupos 0,0011 6 0,00018 Total 0,0071 11 - A partir dos valores ilustrados na Tabela 54, determinou-se o desvio padrão de repetibilidade (𝑆𝑟) de 0,013 mg/kg e o desvio padrão de precisão intermédia (𝑆𝑃𝐼) de 0,026 mg/kg, pelas Equações 40 e 42, respetivamente (Tabela 55). Como esperado, verificou-se uma maior variabilidade nos resultados de precisão intermédia em relação aos da repetibilidade. Consequentemente, calculou-se os coeficientes de variação de repetibilidade (𝐶𝑉𝑟) e de precisão intermédia (𝐶𝑉𝑃𝐼) (Equações 30 e 32, respetivamente), tendo se obtido um 𝐶𝑉𝑟 de 3,6 % e um 𝐶𝑉𝑃𝐼 de 7,1 % (Tabela 55). Estes CV revelaram-se inferiores ao CV estabelecido pelo laboratório (CV < 10 %) e, por isto, foram considerados aceites (Tabela 55). Por último, determinou-se o limite de repetibilidade (𝑟𝑟) (Equações 31) e o limite de precisão intermédia (𝑟𝑃𝐼) (Equações 33), que corresponderam a 0,037 mg/kg e a 0,073 mg/kg, respetivamente (Tabela 55). Observou-se que o 𝑟𝑟 experimental de 0,037 mg/kg foi ligeiramente 88 superior ao 𝑟𝑟 descrito na norma ISO 222414-24 de 0,028 mg/kg, aquando da avaliação da precisão do método (Tabela 55). Tal facto pode ter advindo do processo de tratamento da amostra, ou seja, pode ter ocorrido projeções da amostra no processo de evaporação desta na estufa ou na etapa de incineração na mufla. Estas perdas de amostra podem ter culminado num teor de fosfato inferior ao seu duplicado, afetando assim o desvio padrão de repetibilidade e, consequentemente, o limite de repetibilidade. Tabela 55. Parâmetros para avaliar a precisão, em condições de repetibilidade e precisão intermédia no método da determinação do teor de fosfato. Valores do desvio padrão de repetibilidade (𝑆𝑟), desvio padrão de precisão intermédia (𝑆𝑃𝐼), coeficiente de variação de repetibilidade (𝐶𝑉𝑟), coeficiente de variação de precisão intermédia (𝐶𝑉𝑃𝐼), limite de repetibilidade (𝑟𝑟) e limite de precisão intermédia (𝑟𝑃𝐼) experimentais, definidos na norma ISO22241-24 e pelo laboratório para o teor de fosfato (𝑊𝑝). 𝑾𝒑 Variável Experimental Norma4 Laboratório 𝑆𝑟 (mg/kg) 0,013 - - 𝑆𝑃𝐼 (mg/kg) 0,026 - - 𝐶𝑉𝑟 (%) 3,6 - < 10 𝐶𝑉𝑃𝐼 (%) 7,1 - < 10 𝑟𝑟 (mg/kg) 0,037 0,028 - 𝑟𝑃𝐼 (mg/kg) 0,073 - - 3.1.4.7. Justeza A justeza do presente método foi avaliada por recurso à análise de um material de referência (MR). Assim sendo, foram realizadas 10 réplicas independentes do material de referência de fosfato com a concentração igual a 0,3000 ± 0,0038 mg/kg em PO4 −3. Nota-se que esta solução foi preparada a partir do material de referência comercial de 10,0 ± 0,1 mg/l (Anexo 6.4.10.) e que o nível de concentração de 0,3000 mg/kg foi escolhido dado a gama de trabalho do presente método (3.1.4.3.) e o LQ do método obtido em 3.1.4.5. Além disso, o material de referência sofreu o procedimento de tratamento da amostra (2.4.5.5.), dado que o teste de significância t (Equação 64) efetuado revelou que os valores com e sem a etapa do tratamento da amostra diferem 89 significativamente. Deste modo, os resultados da análise das 10 réplicas independentes encontram-se na Tabela 56. Tabela 56. Valores do teor de fosfato para avaliação da justeza do método da determinação do teor de fosfato. Resultados do teor de fosfato (𝑊𝑝 ), em mg/kg, provenientes da análise de 10 réplicas independentes do material de referência com concentração igual a 0,3000 ± 0,0038 mg/kg em 𝑃𝑂4−3 para a avaliação da justeza do método da determinação do teor de fosfato. Réplicas 𝑾𝒑 (mg/kg) 1 0,2697 2 0,2524 3 0,2359 4 0,2523 5 0,3010 6 0,3359 7 0,2864 8 0,3536 9 0,2863 10 0,2527 Com base na Tabela 56, calculou-se o valor médio das 10 réplicas independentes, tendo se obtido o valor de 0,28 mg/kg (Tabela 57). Determinou-se também o bias (Equação 46) e o bias relativo (Equação 47), tendo estes correspondido a 0,017 mg/kg e a 5,8 %, respetivamente (Tabela 57). Em relação ao bias relativo, foi definido para este método um critério de aceitabilidade de bias relativo de 10 %, dado a gama de trabalho trabalhada apresentar baixas concentrações de fosfato e, por isso, espera-se obter um erro maior. Assim sendo, o bias relativo experimental de 5,8 % é inferior ao bias relativo definido de 10 % e, por isso, aceite (Tabela 57). Por fim, foi calculada a recuperação aparente (𝑅), através da Equação 48, tendo se obtido o valor de 94,2 %, que se demonstra satisfatório dado a proximidade do R ideal de 100 % (Tabela 57). 90 Tabela 57. Parâmetros do estudo da justeza para o método da determinação do teor de fosfato. Valores experimentais e definidos pelo laboratório do valor médio, bias, bias relativo e recuperação aparente (𝑅) da análise de 10 réplicas independentes do material de referência com concentração igual a 0,3000 ± 0,0038 mg/kg em 𝑃𝑂4−3 para avaliação da justeza no método da determinação do teor de fosfato (𝑊𝑝 ). 𝑾𝒑 Variável Experimental Laboratório Valor médio(mg/kg) 0,28 - bias (mg/kg) 0,017 - bias relativo (%) 5,8 < 10 R (%) 94,2 100 3.1.4.8. Incerteza do método A quantificação da incerteza do método baseou-se na norma ISO 11352:201277. Por este motivo, teve-se em consideração as informações relativas à precisão (erros aleatórios) e à justeza (erros sistemáticos) anteriormente estudadas. Na componente da incerteza associada à precisão (𝑢𝑅𝑤) assumiu-se o resultado do desvio padrão de precisão intermédia (𝑆𝑃𝐼), de 0,026 mg/kg, determinado anteriormente no estudo da precisão (Tabela 58). Consequentemente, determinou-se a incerteza relativa associada à precisão de 0,065 (Tabela 58). Para a incerteza associada à justeza (𝑢𝑏) teve-se em conta as informações relativas à avaliação da justeza recorrendo ao material de referência. Procedeu-se ao cálculo de 𝑢𝑏 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 pela Equação 62, tendo se obtido um valor de 0,073 (Tabela 58). A incerteza relativa combinada, obtida pela Equação 56, foi de 0,098 (Tabela 58). Por conseguinte, a incerteza expandida (U), calculada pela Equação 57 e tendo em consideração um fator de expansão (k) igual a 2 para um nível de confiança de 95%, foi de 20 % (Tabela 58). Todas os resultados intermédios assim como os valores finais para a quantificação da incerteza do método encontram-se ilustrados na Tabela 58. 91 Tabela 58. Dados para a determinação da incerteza do método da determinação do teor de fosfato. Desvio padrão da precisão intermédia (𝑆𝑃𝐼), incerteza associada à precisão (𝑢𝑅𝑤), concentração do padrão de fosfato ([𝑃𝑂4−3]), bias (𝑏), desvio padrão das réplicas independentes realizadas ao material de referência (𝑆𝑏𝑀), número de ensaios efetuados com o material de referência (𝑛𝑀); incerteza do material de referência (𝑢𝐶𝑟𝑒𝑓𝑀), incerteza associada à justeza (𝑢𝑏), incerteza combinada (𝑢𝑐), fator de expansão (𝑘) e incerteza expandida (𝑈). Variável Valor 𝑆𝑃𝐼 (mg/kg) 0,026 𝑢𝑅𝑤 (mg/kg) 0,026 [PO4 −3] (mg/kg) 0,4049 𝑢𝑅𝑤 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,065 𝑢𝑅𝑤2 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,0042 𝑏 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 0,058 𝑏2 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 0,0034 𝑆𝑏𝑀 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 0,14 𝑛𝑀 10 𝑢𝐶𝑟𝑒𝑓𝑀 2𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,00016 𝑢𝑏 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,073 𝑢𝑏 2 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,0054 𝑢𝑐 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 0,098 𝑘 2 𝑈 (%) 20 Em jeito de conclusão, os parâmetros de desempenho para este método foram avaliados com sucesso, sugerindo-se apenas como melhoria o alargamento da gama de concentrações na reta de calibração. 92 3.1.5. Determinação do teor de biureto A verificação do método de determinação do teor de biureto iniciou-se com o estudo da reta de calibração, gama de trabalho e limiares analíticos. Além disso, foi efetuada a análise considerando o fator dia conforme exigido pela norma ISO 22241-24. O teor de biureto foi calculado por recurso à Equação 744, descrita na norma ISO 22241-24, e os resultados foram expressos com arredondamento a 0,01 % (m/m).4 𝑊𝐵𝑖=𝐴×𝐹𝐷×250 𝑚𝑠×10×1000×100 Equação 744 em que 𝑊𝐵𝑖 representa o teor de biureto em % (m/m), 𝐴 a absorvância medida no comprimento de onda de 550 nm, 𝐹𝐷 o fator dia em mg, calculado de acordo com a Equação 754, e 𝑚𝑠 a massa da amostra em g.4 𝐹𝐷=8 𝐴 Equação 754 em que 𝐹𝐷 representa o fator dia em mg e 𝐴 o valor médio das absorvâncias de 2 medições lidas no comprimento de onda de 550 nm.4 3.1.5.1. Reta de calibração Na Tabela 59 constam as concentrações efetivas e respetivas incertezas associadas das soluções padrão de biureto em mg/ml (Anexo 6.5.5.) e os valores médios das leituras de absorvância obtidos no comprimento de onda de 550 nm. A partir dos valores presentes na Tabela 59 traçou-se uma reta de calibração da absorvância em função da concentração de biureto das soluções padrão em mg/ml (Figura 14). 99 Tabela 64. Informações do teste de homogeneidade de variâncias para o método da determinação do teor de biureto. Desvio padrão (S), variância (S²), valor de PG e valor de F tabelado (considerando a tabela “two tailed test”, um n=9 e um nível de confiança de 95%). Teste de homogeneidade de variâncias Variável Valor Primeiro padrão Último padrão S (mg/ml) 0,0023 0,011 S² (mg/ml) 0,0000054 0,00012 PG 22,10 F tabelado 4,026 3.1.5.4. Limiares analíticos Para o estudo dos limiares analíticos do método, analisaram-se 6 réplicas independentes do primeiro padrão da reta de calibração ([biureto]= 0,03118 ± 0,00015 mg/ml), seguindo o procedimento descrito em 2.5.5.3.. Os valores do teor de biureto em % (m/m), calculados pela Equação 74, encontram-se na Tabela 65. Nenhum valor apresentado na Tabela 65 foi desprezado pelo teste de Grubbs (Equação 63). Tabela 65. Valores obtidos experimentalmente para os limiares analíticos do método da determinação do teor de biureto. Resultados do teor de biureto (𝑊𝐵𝑖), expresso em % (m/m), provenientes da análise de seis réplicas independentes do primeiro padrão da reta de calibração. Ensaio 𝑾𝑩𝒊 % (m/m) 1 0,03988 2 0,04941 3 0,05500 4 0,03947 5 0,05932 6 0,04839 100 A partir da Tabela 65 estimou-se o desvio padrão (Equação 24) de 0,0056 % (m/m) e, consequentemente, o LD de 0,017 % (m/m) e o LQ de 0,056 % (m/m), pelas Equações 25 e 26 respetivamente (Tabela 66). Deste modo, é possível concluir que os limiares analíticos obtidos experimentalmente permitem determinar com grande rigor os valores compreendidos na gama de trabalho de 0,1 a 0,5 % (m/m), conforme reportado na norma ISO 22241-24. Tabela 66. Valores dos limiares analíticos para o método da determinação do teor de biureto. Resultados do limite de deteção (LD) e do limite de quantificação (LQ) do método para a determinação do teor de biureto (𝑊𝐵𝑖), em % (m/m). LD LQ 𝑾𝑩𝒊 % (m/m) 0,017 0,056 Para o presente método pode-se concluir que os parâmetros de desempenho foram avaliados com sucesso. Apenas se sugere, como melhoria, reduzir a gama de trabalho ou utilizar a regressão ponderada. 3.2. Outras atividades Além da verificação dos métodos de análise supracitados, foram desenvolvidas outras atividades em laboratório, nomeadamente, o controlo do pH e da condutividade da água desmineralizada utilizada na produção de AdBlue® e a verificação da qualidade do AdBlue® armazenado nos depósitos da empresa. 3.2.1. Análise da água desmineralizada usada na fabricação de AdBlue® A água desmineralizada utilizada na produção de AdBlue® apresenta características muito próprias em relação à gama de pH e condutividade. Por este motivo, a água desmineralizada foi analisada uma vez por dia de forma a garantir o cumprimento das especificações de cada parâmetro mencionado. Como referido anteriormente, o pH desta água deve situar-se entre 5,00 a 7,00.19 Por isso, para a carta de controlo apresentada na Figura 16, o limite inferior de controlo (LIC) definido foi de 5,00 e o limite superior de controlo (LSC) foi de 7,00. 101 Figura 16. Carta de controlo do pH da água desmineralizada utilizada na produção de AdBlue®. Carta de controlo da análise diária ao parâmetro de pH desde o dia 13/10/22 até ao dia 07/06/23. Foi definido para esta carta de controlo um limite inferior de controlo (LIC) de 5,00 unidades de pH e um limite superior de controlo (LSC) de 7,00 unidades de pH.19 Pela análise da Figura 16 observou-se que todos os resultados de pH obtidos se encontram dentro dos limites definidos na carta de controlo referente ao pH. Por outro lado, elaborou-se uma carta de controlo alusiva ao parâmetro da condutividade, expressa em µS/cm (Figura 17). Definiu-se como limite superior de controlo (LSC) o valor de 4,00 µS/cm, dado ser este o valor máximo que a condutividade desta água desmineralizada pode apresentar.19 Figura 17. Carta de controlo da condutividade da água desmineralizada usada no fabrico de AdBlue®. Carta de controlo da análise diária ao parâmetro da condutividade, expressa em µS/cm, desde o dia 13/10/22 até ao dia 07/06/23. Foi definido para esta carta de controlo um limite superior de controlo (LSC) de 4,00 µS/cm.19 102 A partir da análise da carta de controlo presente na Figura 17, verificou-se que alguns valores foram superiores ao permitido, pelo que nestes casos foram tomadas, de imediato, medidas corretivas. 3.2.2. Controlo de qualidade do AdBlue® armazenado em depósitos A empresa dispõe de três depósitos para armazenamento de AdBlue®, enquanto este não é escoado. Deste modo, foram realizadas, uma vez por semana, análises à concentração de ureia e ao índice de refração do AdBlue® presente nos depósitos 12, 13 e 14. Para controlo imediato dos parâmetros indicados, construiu-se uma carta de controlo para cada depósito e parâmetro em estudo. Assim, as Figuras 18, 19 e 20 correspondem aos resultados obtidos das medições da concentração de ureia do AdBlue® presente nos depósitos 12, 13 e 14, respetivamente. O limite inferior de controlo (LIC) definido para as estas três cartas de controlo foi de 31,8 % (m/m), enquanto o limite superior de controlo (LSC) estabelecido foi de 33,2 % (m/m). Estes limites foram definidos atendendo ao intervalo de resultados que as amostras de AdBlue® podem apresentar de concentração de ureia, conforme reportado na norma ISO 22241-12 e na ficha técnica do AdBlue®17. Figura 18. Carta de controlo da concentração de ureia do AdBlue® armazenado no depósito 12. Carta de controlo da análise semanal à concentração de ureia ([ureia]) do AdBlue® presente no depósito 12, expressa em % (m/m), desde o dia 26/10/22 até ao dia 01/06/23. Estabeleceu-se para esta carta de controlo um limite inferior de controlo (LIC) de 31,8 % (m/m) e um limite superior de controlo (LSC) de 33,2 % (m/m), visto que estes valores correspondem aos limites estipulados na ficha técnica do AdBlue®17 e na norma ISO 22241-24. 103 Figura 19. Carta de controlo da concentração de ureia do AdBlue® presente no depósito 13. Carta de controlo da análise semanal à concentração de ureia ([ureia]) do AdBlue® presente no depósito 13, expressa em % (m/m), desde o dia 26/10/22 até ao dia 01/06/23. Para esta carta de controlo foi definido um limite inferior de controlo (LIC) de 31,8 % (m/m) e um limite superior de controlo (LSC) de 33,2 % (m/m), dado serem os valores estabelecidos na ficha técnica do AdBlue®17 e na norma ISO 22241-24. Figura 20. Carta de controlo da concentração de ureia do AdBlue® armazenado no depósito 14. Carta de controlo da análise semanal à concentração de ureia ([ureia]) do AdBlue® presente no depósito 14, expressa em % (m/m), desde o dia 26/10/22 até ao dia 12/06/23. Foi definido para esta carta de controlo um limite inferior de controlo (LIC) de 31,8 % (m/m) e um limite superior de controlo (LSC) de 33,2 % (m/m), uma vez que são os limites estipulados na ficha técnica do AdBlue®17 e na norma ISO 22241-24. Ao longo do período de tempo em que foi monitorizada a concentração de ureia constatou-se que o AdBlue® se encontrava em conformidade com as especificações2, dado nenhum resultado experimental ter ultrapassado os limites estipulados (Figuras 18, 19 e 20). 104 As cartas de controlo ilustradas nas Figuras 21, 22 e 23 referem-se às análises do índice de refração efetuadas ao AdBlue® armazenado nos depósitos 12 ,13 e 14, respetivamente. Para as cartas de controlo indicadas nas Figuras 21, 22 e 23 estabeleceu-se um LIC de 1,3814 e um LSC de 1,3843, uma vez que a norma ISO 22241-12 e a ficha técnica do AdBlue® 17 estabelecem estes valores como limite mínimo e máximo permitido para este parâmetro. Figura 21. Carta de controlo do índice de refração do AdBlue® armazenado no depósito 12. Carta de controlo da análise semanal ao índice de refração, desde o dia 26/10/22 até ao dia 01/06/23. Foi definido para esta carta de controlo um limite inferior de controlo (LIC) de 1,3814 e um limite superior de controlo (LSC) de 1,3843, dado serem estes os limites estipulados na ficha técnica do AdBlue®17 e na norma ISO 22241-24. Figura 22. Carta de controlo do índice de refração do AdBlue® armazenado no depósito 13. Carta de controlo da análise semanal ao índice de refração, desde o dia 26/10/2022 até ao dia 01/06/2023. Estabeleceu-se para esta carta de controlo um limite inferior de controlo (LIC) de 1,3814 e um limite superior de controlo (LSC) de 1,3843, visto que foram estes os limites definidos na ficha técnica do AdBlue®17 e na norma ISO 22241-24. 105 Figura 23. Carta de controlo do índice de refração do AdBlue® presente no depósito 14. Carta de controlo da análise semanal ao índice de refração, desde o dia 26/10/2022 até ao dia 12/06/2023. Para esta carta de controlo foi definido um limite inferior de controlo (LIC) de 1,3814 e um limite superior de controlo (LSC) de 1,3843, dado serem estes os valores limite descritos na ficha técnica do AdBlue®17 e na norma ISO 22241-24. Através das Figuras 21, 22 e 23 concluiu-se que nenhum valor determinado excedeu os limites definidos, corroborando a evidência que o AdBlue® se encontrava de acordo com os critérios exigidos2. 106 4. Conclusão 107 A presente dissertação teve como principal objetivo a verificação de alguns dos métodos de análise de AdBlue®, associados à norma ISO 22241-24. Por esta razão, em cada método caracterizouse os parâmetros analíticos de forma a verificar os mesmos. Procedeu-se à verificação do método da determinação da concentração de ureia pelo índice de refração, seguindo-se o método da determinação da alcalinidade, determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico, determinação de fosfato e determinação de biureto. Com base nas considerações apresentadas no fim de cada método de análise pode-se salientar as seguintes conclusões gerais. Na determinação da concentração de ureia pelo índice de refração foram avaliados os limiares analíticos, a precisão em condições de repetibilidade e precisão intermédia, a justeza e a incerteza do método. Os resultados demonstraram que o método é adequado ao objetivo, apresentando valores de limites de deteção e quantificação adequados, precisão dentro dos critérios de aceitação e justeza satisfatória, assim como incerteza do método extremamente baixa. No caso da determinação da alcalinidade, os mesmos parâmetros de desempenho foram estudados e o método foi considerado adequado para a análise de amostras de AdBlue®. Os limiares analíticos, a precisão em condições de repetibilidade e precisão intermédia, bem como a justeza e a incerteza do método, estavam em conformidade com a norma ISO 22241-24 e critérios de aceitação definidos. Para a matéria insolúvel pelo método gravimétrico, os parâmetros de desempenho foram avaliados. O limite de deteção obtido foi adequado ao objetivo. A precisão do método mostrou-se aceitável, e a justeza foi considerada satisfatória, com uma recuperação aparente próxima do valor ideal. A incerteza do método também foi determinada e estava dentro dos padrões aceitáveis. No que diz respeito à determinação do teor de fosfato, a sensibilidade, a gama de trabalho, os limiares analíticos, a precisão em condições de repetibilidade e precisão intermédia, a justeza e a incerteza do método foram avaliados. A calibração foi considerada ser linear e o método foi verificado com sucesso. Nos limiares analíticos sugeriu-se o alargamento da gama de concentrações. A precisão e a justeza estavam em conformidade com os critérios internos de aceitação e a incerteza do método foi quantificada. Finalmente, o método da determinação do teor de biureto foi avaliado quanto à reta de calibração, ao fator dia, à gama de trabalho e aos limiares analíticos. A linearidade da reta de calibração foi confirmada e o método demonstrou ser sensível e estável ao longo do tempo. Foi sugerida 108 uma melhoria na gama de trabalho para garantir um melhor ajuste. Os limiares analíticos do método foram considerados adequados para as concentrações em questão. Em conclusão, os métodos de análise em estudo referente ao produto AdBlue® foram verificados e demonstraram ser adequados para as respetivas determinações no laboratório. Os resultados obtidos estavam em conformidade com a norma ISO 22241-24 e com os critérios de aceitação internos do laboratório. Essa abordagem rigorosa garante a precisão e confiabilidade das análises realizadas, contribuindo para a qualidade e confiabilidade do produto final. Assim, é possível garantir a comercialização adequada deste produto químico pela RNM. Além disso, estes fatores contribuem para o cumprimento das normas Euro e, consequentemente, para a redução dos poluentes atmosféricos e seus impactos negativos no meio ambiente e na saúde pública. Este projeto individual possibilitou a aplicação de conceitos e de metodologias de análise, permitindo a aquisição de novos conhecimentos e a interação com novos equipamentos. Além disso, representou uma oportunidade de desenvolvimento profissional em ambiente empresarial. 115 6. Anexos 116 6.1. Verificação do método da determinação da concentração de ureia pelo índice de refração 6.1.1. Instruções de calibração/verificação do refratómetro79 Diariamente: 1. Ligar o equipamento no ON/OFF e esperar que o mesmo estabilize para uma temperatura de 20 ºC; 2. Após surgir a mensagem “calibração automática (ajuste o zero)”, pressionar a tecla “Aceitar”, introduzir o pin e, em seguida, pressionar a tecla “Enter”; 3. Após indicação, limpar o prisma com água desmineralizada e pressionar a tecla “Enter”; 4. Irá surgir no ecrã “Punto objetivo: 1,33299”, manter o valor, adicionar água desmineralizada ao prisma e pressionar a tecla “Enter”; 5. Após aparecer a mensagem “Calibração terminada”, pressionar a tecla “Enter”; Semanalmente: 1. A verificação do refratómetro é realizada usando água desmineralizada e usar pelo menos um MRC com ≥1,3827 nD20; 2. Confirmar a aceitabilidade do valor obtido. Se o índice de refração de qualquer MRC desviar mais de 0,00005 nD20 do valor mencionado no certificado, deve-se proceder à recalibração do refratómetro. Mensalmente: 1. O refratómetro é verificado utilizando no mínimo 3 MRC que vão além da gama de medição de 1,3814 a 1,3843 nD20 e água desmineralizada; 2. Confirmar a aceitabilidade do valor obtido. Se o índice de refração de qualquer MRC desviar mais de 0,00005 nD20 do valor mencionado no certificado, deve-se proceder à recalibração do refratómetro. 6.2. Verificação do método da determinação da alcalinidade 6.2.1. Instruções de calibração/verificação do potenciómetro80 1. Pressionar a tecla “CAL” e mergulhar o elétrodo de pH e a sonda de temperatura na solução padrão solicitada pelo potenciómetro, agitar e deixar estabilizar; 2. Surgirá no ecrã do potenciómetro o sinal “CFM”; 117 3. Pressionar a tecla “CFM” para confirmar calibração; 4. O segundo padrão será solicitado pelo medidor de pH. Repetir igualmente o procedimento até agora descrito; 5. Quando a leitura estiver estável, a mensagem “READY” aparecerá e, em seguida, “CFM”; 6. Pressionar a tecla “CFM” para confirmar a calibração; 7. Verificar a calibração, mergulhando o elétrodo de pH e a sonda de temperatura num padrão de um fornecedor diferente em relação ao utilizado na calibração. Se a leitura do pH corresponder ao pH do padrão, o aparelho está operacional. Nota: Medições numa gama ácida exigem como primeiro padrão o de pH = 7,01, seguindo-se o padrão de pH = 4,01. Já para medições na zona alcalina o primeiro padrão usado é o de pH = 7,01 e, em seguida, o padrão de pH = 10,01. 6.2.2. Frases de perigo e prudência Tabela 67. Legenda das siglas das frases de perigo (H) e prudência (P). Adaptada de: https://ec.europa.eu/taxation_customs/dds2/SAMANCTA/PT/Safety/HP_PT.htm83 e da ficha de dados de segurança dos reagentes ácido clorídrico 1 mol/l81 e amónia 82. Ácido clorídrico 1 mol/l Sigla Legenda H290 Pode ser corrosivo para metais. P234 Manter o produto no recipiente original. P390 Absorver o reagente derramado de forma a não provocar danos. Amónia Sigla Legenda H314 Provoca queimaduras na pele e danos oculares graves. H335 Provoca irritação nas vias respiratórias. H400 Perigoso para o meio aquático. P273 Evitar libertação para o meio ambiente. P280 Utilizar proteção adequada: luvas, proteção ocular e facial, vestuário. P301+P330+P331 Em caso de ingestão, enxaguar a boca e não provocar o vómito. P304+P340 Em caso de inalação, mover a pessoa para um local arejado e colocá-la numa posição que não prejudique a respiração. P308+P310 Em caso de exposição, contactar o médico/centro de antivenenos. 118 6.2.3. Cálculo da concentração efetiva da solução de ácido clorídrico 0,010 mol/l A concentração efetiva da solução de ácido clorídrico (𝐶𝑠𝑜𝑙. 𝐻𝐶𝑙 0,010) foi calculada pela Equação 77, tendo em conta a concentração inicial de 1 mol/l, o volume pipetado de 0,005 l e o volume final de 0,5 l. 𝐶𝑠𝑜𝑙. 𝐻𝐶𝑙 0,010=1×0,05 0,5 =0,010 𝑚𝑜𝑙/𝑙 Equação 77 6.2.4. Cálculo da concentração efetiva da solução de amónia e respetiva incerteza associada A concentração efetiva da solução de amónia (𝐶𝑠𝑜𝑙. 𝑎𝑚ó𝑛𝑖𝑎) foi calculada pela Equação 78, tendo em conta a concentração inicial de 28,18 % (m/m), o volume pipetado de 0,5 ml e o volume final de 50 ml. 𝐶𝑠𝑜𝑙. 𝑎𝑚ó𝑛𝑖𝑎=28,18×0,5 50 =0,2818 % (𝑚/𝑚) Equação 78 A incerteza associada à solução de amónia 0,2818 % (m/m) foi determinada com base na abordagem passo a passo ilustrada na Figura 9. O diagrama em espinha de peixe da Figura 24 indica as fontes de incerteza para este caso particular. Figura 24. Diagrama em espinha de peixe para a determinação da incerteza associada à solução de amónia 0,2818 % (m/m). Apresentação das fontes de incerteza tidas em consideração para a quantificação da incerteza associada à preparação da solução de amónia 0,2818 % (m/m). Volume do balão Calibração Temperatura Temperatura Calibração Concentração da solução de amónia 28,18 % (m/m) Volume da pipeta Concentração da solução de amónia 0,2818 % (m/m) 119 A incerteza padrão (u(x)) da componente da concentração da solução de amónia 28,18 % (m/m) foi calculada a partir da Equação 49, tendo sido obtido o valor de 0,058 % (m/m). Por sua vez, a incerteza padrão relativa (u(x)/x) foi de 0,0020. Quanto à incerteza associada ao volume da pipeta teve-se em consideração fatores como a calibração e a temperatura, obtendo-se uma incerteza padrão do volume da pipeta de 0,0029 ml (Equação 53) e uma incerteza padrão relativa associada ao volume da pipeta de 0,0057. Para o volume do balão procedeu-se da mesma forma, tendo se obtido uma u(x) de 0,031 ml (Equação 53). Por conseguinte, a u(x)/x obtida para o volume do balão foi de 0,00061. Posto isto, a incerteza combinada da concentração da solução de amónia 0,2818 % (m/m) foi de 0,0017 % (m/m) (Equação 54) e a incerteza expandida foi de 0,0034 % (m/m) considerando um fator de expansão igual a dois (Equação 55). Na Tabela 68 constam os resultados da incerteza padrão e da incerteza padrão relativa para as diferentes fontes de incerteza, assim como a incerteza expandida associada à concentração da solução de amónia 0,2818 % (m/m). Tabela 68. Resultados para a incerteza associada à preparação da solução de amónia 0,2818 % (m/m). Valores da incerteza padrão (u(x)) e da incerteza padrão relativa (u(x)/x) para as fontes de incerteza, assim como o resultado da incerteza combinada (𝑢𝑐) e expandida (U) para a concentração da solução de amónia 0,2818 % (m/m). Concentração da solução de amónia – 28,18 % (m/m) Descrição Valor da incerteza u(x) u(x)/x concentração da solução 0,10 % (m/m) 0,058 % (m/m) 0,0020 Volume da pipeta – 0,5 ml Descrição Valor da incerteza u(x) u(x)/x calibração 0,0070 ml 0,0029 ml temperatura 0,00032 ml 0,00018 ml volume da pipeta 0,0029 ml 0,0057 Volume do balão - 50 ml Descrição Valor da incerteza u(x) u(x)/x calibração 0,060 ml 0,024 ml temperatura 0,032 ml 0,018 ml volume do balão 0,031 ml 0,00061 Concentração da solução de amónia – 0,2818 % (m/m) Descrição 𝒖𝒄 k U concentração da solução 0,0017 % (m/m) 2 0,0034 % (m/m) 120 6.3. Verificação do método da determinação da matéria insolúvel pelo método gravimétrico 6.3.1. Frases de perigo e prudência Tabela 69. Legenda das siglas das frases de perigo (H) e prudência (P). Adaptada de: https://ec.europa.eu/taxation_customs/dds2/SAMANCTA/PT/Safety/HP_PT.htm83 e da ficha de dados de segurança do reagente celulose microcristalina para cromatografia em camada fina84. Celulose microcristalina Sigla Legenda P280 Utilizar proteção ocular/ luvas/ vestuário. P304+P340 Em caso de inalação, mover a pessoa para um local arejado e colocá-la numa posição que não prejudique a respiração. P301 + P330 + P331 Em caso de ingestão, enxaguar a boca com água. P303 + P361 + P353 Em caso de contacto com a pele, retirar a roupa contaminada e enxaguar a pele com água. P305+P351+P338 Em contacto com os olhos, lavar cuidadosamente com água. Em caso de uso de lentes de contacto, retirar se possível e continuar a enxaguar com água. 6.3.2. Cálculo da concentração efetiva e da incerteza associada à solução mãe de celulose microcristalina A concentração efetiva da solução mãe de celulose microcristalina (𝐶𝑠𝑜𝑙.𝑚ã𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑜𝑠𝑒 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑐𝑟𝑖𝑠𝑡𝑎𝑙𝑖𝑛𝑎) foi obtida a partir da Equação 79, atendendo à massa pesada de 5001,0 mg e ao volume final de 1 l. 𝐶𝑠𝑜𝑙.𝑚ã𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑜𝑠𝑒 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑐𝑟𝑖𝑠𝑡𝑎𝑙𝑖𝑛𝑎=5001,0 1=5001,0 𝑚𝑔/𝑙 Equação 79 121 A incerteza associada à solução mãe de celulose microcristalina 5001,0 mg/l foi determinada tendo em conta todas as etapas da abordagem passo a passo, ilustradas na Figura 9. Primeiramente, estabeleceu-se um diagrama em espinha de peixe (Figura 25) com o intuito de identificar as fontes de incerteza. Figura 25. Diagrama em espinha de peixe para a determinação da incerteza associada à solução mãe de celulose microcristalina 5001,0 mg/l. Apresentação das fontes de incerteza que foram tidas em consideração para a quantificação da incerteza associada à preparação da solução mãe de celulose microcristalina 5001,0 mg/l. A seguir, procedeu-se à quantificação das componentes da incerteza. Para a massa de celulose microcristalina, determinou-se a incerteza padrão (u(x)) (Equação 52), tendo em conta as principais fontes de incerteza para a pesagem: calibração e repetibilidade. Por isso, obteve-se uma u(x) igual a 0,38 mg. Além disso, determinou-se a incerteza padrão relativa (u(x)/x) de 0,000075. Para o cálculo da u(x) associada ao volume do balão teve-se em consideração fatores como a calibração e a temperatura. A partir da Equação 53 determinou-se a u(x) associada ao volume do balão de 0,00040 l. Posteriormente, calculou-se a u(x)/x do volume do balão de 0,00039. Consequentemente, determinouse a incerteza combinada de 2,0 mg/l (Equação 54). Por fim, a incerteza expandida (U) da solução mãe de celulose microcristalina 5001,0 mg/l, de 4,1 mg/l, foi obtida segundo a Equação 55 e tendo em conta um fator de expansão (k) igual a 2. A Tabela 70 apresenta os resultados da incerteza combinada e expandida da solução mãe de celulose microcristalina 5001,0 mg/l, assim como os resultados intermédios das fontes de incerteza. Volume do balão Calibração Temperatura Repetibilidade Calibração Massa de celulose microcristalina Concentração da solução mãe de celulose microcristalina 5001,0 mg/l 122 Tabela 70. Resultados para a incerteza associada à preparação da solução mãe de celulose microcristalina 5001,0 mg/l. Valores obtidos da incerteza padrão (u(x)) e da incerteza padrão relativa (u(x)/x) para as fontes de incerteza, assim como o resultado da incerteza combinada (𝑢𝑐) e expandida (U), considerando um fator de expansão igual a 2, para a concentração da solução mãe de celulose microcristalina 5001,0 mg/l. Massa de celulose microcristalina – 5001,0 mg Descrição Valor da incerteza u(x) u(x)/x calibração 0,15 mg repetibilidade 0,22 mg massa pesada de celulose microcristalina 0,38 mg 0,000075 Volume do balão – 1 l Descrição Valor da incerteza u(x) u(x)/x calibração 0,0004 l 0,00016 l temperatura 0,00063 l 0,00036 l volume do balão 0,00040 l 0,00039 Concentração da solução mãe de celulose microcristalina - 5001,0 mg/l Descrição 𝒖𝒄 k U concentração da solução 2,0 mg/l 2 4,1 mg/l 6.3.3. Cálculo da concentração efetiva e da incerteza associada à solução intermédia de celulose microcristalina A concentração efetiva da solução intermédia de celulose microcristalina (𝐶𝑠𝑜𝑙.𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑚é𝑑𝑖𝑎 𝑐.𝑚.) foi obtida a partir da Equação 80, tendo em conta a concentração efetiva da solução mãe de celulose microcristalina de 5001,0 mg/l, o volume inicial de 0,1 l e o volume final de 1 l. 𝐶𝑠𝑜𝑙.𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑚é𝑑𝑖𝑎 𝑐.𝑚.=5001,0×0,1 1=500,1 𝑚𝑔/𝑙 Equação 80 A determinação da incerteza associada à solução intermédia de celulose microcristalina 500,1 mg/l baseou-se na abordagem passo a passo (Figura 9). Por este motivo, a Figura 26 apresenta, sob a forma de diagrama de peixe, as fontes de incerteza. 123 Figura 26. Diagrama em espinha de peixe para a determinação da incerteza associada à solução intermédia de celulose microcristalina 500,1 mg/l. Apresentação das fontes de incerteza que foram tidas em consideração para a quantificação da incerteza associada à preparação da solução intermédia de celulose microcristalina 500,1 mg/l. A incerteza padrão (u(x)) associada à concentração da solução mãe de celulose microcristalina 5001,0 mg/l, de 2,3 mg/l, foi calculada a partir da Equação 49 e considerando o valor da incerteza expandida determinada no Anexo 6.3.2. Por sua vez, a incerteza padrão relativa (u(x)/x) foi de 0,00047. Na componente da incerteza do volume da proveta obteve-se uma u(x) de 0,00041 l (Equação 53) e uma u(x)/x de 0,0041. Para a componente associada ao volume do balão procedeu-se da mesma forma que para o volume da proveta, tendo se obtido uma u(x) de 0,00040 l (Equação 53) e uma u(x)/x de 0,00040. Deste modo, a incerteza combinada da concentração da solução intermédia de celulose microcristalina 500,1 mg/l foi de 2,1 mg/l (Equação 54) e a incerteza expandida foi de 4,1 mg/l para um fator de expansão igual a 2 (Equação 55). A Tabela 71 apresenta os resultados da incerteza padrão e da incerteza padrão relativa para as diferentes fontes de incerteza, assim como a incerteza expandida associada à concentração da solução intermédia de celulose microcristalina 500,1 mg/l. Volume do balão Calibração Temperatura Temperatura Calibração Concentração da solução mãe de celulose microcristalina 5001,0 mg/l Volume da proveta Concentração da solução intermédia de celulose microcristalina 500,1 mg/l 124 Tabela 71. Resultados para a incerteza associada à preparação da solução intermédia de celulose microcristalina 500,1 mg/l. Valores obtidos da incerteza padrão (u(x)) e da incerteza padrão relativa (u(x)/x) para as fontes de incerteza, assim como o resultado da incerteza combinada (𝑢𝑐) e expandida (U), considerando um fator de expansão (k) igual a 2, para a concentração da solução intermédia de celulose microcristalina 500,1 mg/l. Concentração da solução mãe de celulose microcristalina - 5001,0 mg/l Descrição Valor da incerteza u(x) u(x)/x concentração da solução 4,1 mg/l 2,3 mg/l 0,00047 Volume da proveta – 0,01 l Descrição Valor da incerteza u(x) u(x)/x calibração 0,001 l 0,00041 l temperatura 0,000063 l 0,000036 l volume da proveta 0,00041 l 0,0041 Volume do balão – 1 l Descrição Valor da incerteza u(x) u(x)/x calibração 0,0004 l 0,00016 l temperatura 0,00063 l 0,00036 l volume do balão 0,00040 l 0,00040 Concentração da solução intermédia de celulose microcristalina – 500,1 mg/l Descrição 𝒖𝒄 k U concentração da solução 2,1 mg/l 2 4,1 mg/l 6.3.4. Cálculo da concentração efetiva e da incerteza associada à solução padrão de celulose microcristalina A concentração efetiva da solução padrão de celulose microcristalina (𝐶𝑠𝑜𝑙.𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜 𝑐.𝑚.) foi obtida a partir da Equação 81, tendo em conta a concentração da solução intermédia de celulose microcristalina de 500,1 mg/l, o volume inicial de 0,01 l e o volume final de 0,250 l. 𝐶𝑠𝑜𝑙.𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜 𝑐.𝑚.=500,1×0,01 0,250 =20,00 𝑚𝑔/𝑙 Equação 81