Otimização da fermentação em estado sólido da dreche

Universidade do Minho Escola de Engenharia Inês Moreira de Sá Otimização da fermentação em estado sólido da dreche Otimização da fermentação em estado sólido da dreche Inês Sá UMinho | 2022 Outubro 2022 Universidade do Minho Escola de Engenharia Inês Moreira de Sá Otimização da fermentação em estado sólido da dreche Dissertação de Mestrado Mestrado em Engenharia Química e Biológica Trabalho efetuado sob a orientação de Professor Doutor José António Teixeira Doutor André Mota Outubro 2022 ii Direitos de autor e condições de utilização do trabalho por terceiros Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição-SemDerivações CC BY-ND https://creativecommons.org/licenses/by-nd/4.0/ iii Agradecimentos Esta dissertação corresponde ao projeto final do meu mestrado em Engenharia Química e Biológica, etapa importante na minha vida e no meu percurso académico. Assim, quero agradecer a todos que de alguma forma contribuíram para a sua realização. Em primeiro lugar quero agradecer ao Professor Doutor José Teixeira pela orientação, apoio e disponibilidade prestada neste projeto. Agradeço também pela oportunidade de desenvolver esta dissertação com a Colab4Food, em especial, ao meu supervisor Doutor André Mota por toda a ajuda e paciência prestada e também a toda a equipa pelo apoio dado ao longo do estágio e na escrita da dissertação. À Doutora Sara Silvério do Departamento de Engenharia Biológica, agradeço toda a ajuda prestada quando me senti a navegar em alguns temas relativos ao meu projeto. Quero deixar também uma palavra de agradecimento aos meus amigos que estiveram sempre comigo ao longo deste tempo. Por último, mas não menos importante, quero agradecer aos meus pais, irmão, namorado e família pela motivação e por me mostrarem que com esforço tudo se consegue. iv Declaração de integridade Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. vi “Otimização da fermentação em estado sólido da dreche” RESUMO Os resíduos e produtos secundários provenientes dos setores agroindustrial e alimentar são considerados potenciais poluentes devido aos problemas de disposição final, sendo necessário encontrar soluções para estes subprodutos, ricos em proteína, minerais, lípidos e hidratos de carbono. A sua valorização tornou-se numa oportunidade para obter novos produtos com valor acrescentado. A fermentação em estado sólido (FES) utiliza resíduos como substratos e através do crescimento microbiano sintetiza novos compostos com interesse industrial e/ou elevado valor nutricional. O presente trabalho visa otimizar a FES da dreche, subproduto da indústria cervejeira, com recurso ao microrganismo Aspergillus niger para aumentar o conteúdo proteico da dreche. Foi utilizado um reator com tambor rotativo em que se estudaram duas concentrações de esporos (0,5 ×106 esporos/ml e 1 ×106 esporos/ml), duas humidades iniciais (80 e 70 %), com temperatura constante. Mediu-se a concentração de proteína solúvel (PS) em todos os ensaios e proteína bruta (PB) nos dias de maior concentração de PS. Através da medição da PS foi avaliado o efeito da autoclave em dreche seca e dreche húmida. Após autoclavar obteve-se maior concentração de PS para a dreche húmida. Foi na FES com maior concentração de esporos que se obteve a maior concentração de PS. Por sua vez, os melhores valores de PS foram obtidos para a humidade de 70 %. Também se analisou o comportamento do A. niger nas primeiras 24 h de crescimento e verificou-se que apresentava um crescimento dual, utilizando a hemicelulose e a celulose como fontes de carbono. Relativamente à proteína bruta (PB), verificou-se um aumento de 9 % para a condição correspondente à humidade de 70 % e concentração 1 ×106 esporos/ml, sendo que as outras condições estudadas não apresentaram uma diferença significativa da PB em comparação com a dreche inicial. Dentro dos valores considerados para os parâmetros estudados escolheu-se a melhor condição para realizar uma fermentação otimizada em que se verificou um aumento da PB em 1,2 vezes e vii da PS em 3,6 vezes, mostrando que o conteúdo proteico da dreche aumenta com a FES. Este trabalho foi realizado em contexto empresarial na Colab4Food. PALAVRAS-CHAVE Fermentação em estado sólido; Dreche; Proteína solúvel; Proteína bruta; Aspergillus niger viii “Optimization of solid state fermentation of brewers spent grain” ABSTRACT The waste and byproducts that come from the agro industrial and food industries are considered pollutants due to problems with their final disposition, so it is important to find solutions for this byproducts, that are rich in protein, minerals, lipids and carbohydrates. Their valorization turned out to be an opportunity to obtain new products with higher value. The solid state fermentation (SSF) uses waste products as substrate and synthesizes new products with the use of microorganisms. The present work aims to optimize the SSF of brewers spent grain (BSG), waste of the beer industry, with the microorganism Aspergillus niger for protein enrichment. It was used a rotary drum reactor and two inoculum sizes were tested (0,5 ×106 spores/ml e 1 ×106 spores/ml) alongside with two different moistures (80 and 70 %), with constant temperature. Before these studies the effect of autoclave of BSG before SSF was tested for dry and wet BSG. The concentration of soluble protein (SP) during the process of fermentation and the crude protein (CP) was measured on the days that had the highest concentration of SP. After the process of autoclave, the best concentration of SP was for the wet BSG. The highest inoculum size got the highest SP concentration. On the other side, the smaller moisture got the best values of SP. The behavior of A.niger was also analyzed in the first 24 h of growth and it was possible to verify that it presented a diauxic behavior where there were two carbon sources: hemicellulose and cellulose For the crude protein (CP) there was an increase of 9 % for the condition of 70 % moisture and inoculum of 1 ×106 spores/ml and the other conditions did not present a significant difference of CP comparing with the initial BSG. With the best condition it was done a optimized fermentation and it was observed an increase of 1.2-fold for CP and 3.6-fold for SP showing the protein increase of BSG with SSF. The present work was conducted as a member of Colab4Food. KEYWORDS Solid state fermentation; Brewers spent grain; Soluble protein; Crude Protein; Aspergillus niger 1 1. Introdução 1.1. Motivação e Objetivos Atualmente, o desenvolvimento de processos sustentáveis tem sido um desafio. O crescimento populacional e consumo de energia para a obtenção de alimentos conduziu a uma procura por processos que utilizem fontes renováveis e produzam menor quantidade de resíduos. Os setores agroindustriais e alimentar são dos que produzem uma maior quantidade de resíduos e produtos secundários que são potenciais poluentes devido aos problemas de disposição final e a sua valorização pode ser dificultada pela perda de nutrientes de alto valor ao longo do processo (Trzcinski, 2018). Estes produtos são considerados perecíveis devido aos elevados teores de matéria orgânica e água presentes e à elevada facilidade de contaminação microbiológica. Os subprodutos podem conter diversos nutrientes como proteína, minerais, lípidos e hidratos de carbono, dependendo da matéria-prima e do processo que os originou. Assim, a sua valorização é uma necessidade e também uma oportunidade para obter novos produtos com valor acrescentado e com um impacto positivo na economia das indústrias (Manuela E. Pintado, 2015). O aproveitamento de resíduos e a sua valorização é, cada vez mais, uma necessidade crescente para as indústrias alimentares, uma vez que a quantidade de resíduos gerada tem vindo a aumentar e é de interesse económico e ambiental transformá-los em produtos com valor acrescentado (Cooray & Chen, 2018). Existem vários métodos que permitem o reaproveitamento dos resíduos, como por exemplo, a digestão anaeróbia, a compostagem, reciclagem e a incineração energética. Num processo de digestão anaeróbia formam-se dois subprodutos: o biogás, uma fonte de energia renovável, e o biofertilizante, correspondente a uma biomassa que funciona como um adubo natural. A compostagem é um processo natural de reciclagem da parte putrescível dos resíduos sólidos, através de microrganismos que são responsáveis pela degradação da matéria orgânica. Por sua vez, a reciclagem corresponde ao processo de transformação de materiais que podem voltar ao seu estado original ou transformar-se num produto completamente diferente. A incineração é outra forma de aproveitamento dos resíduos que é vantajosa na redução dos volumes e elimina resíduos 2 patogénicos e tóxicos e produz energia sob a forma de eletricidade ou de vapor de água (Augusto Tavares Russo, 2003). No aproveitamento de resíduos, estes devem ser reduzidos ao mínimo e deve ser promovido o seu uso alimentar, tanto humano como animal. Em seguida, os resíduos devem ser usados para outros aproveitamentos industriais como a valorização energética ou para compostagem e em último caso, existe a opção do aterro sanitário ou incineração. Para entender o tipo de subproduto deve ser tida em conta a sua origem, que se traduz pela qualidade e sazonalidade da produção (Kuzina & Alimentar, 2014). É cada vez mais comum o uso dos resíduos como biomassa para produzir produtos de valor acrescentado com recurso a microrganismos (Cooray & Chen, 2018). A procura de bioprocessos que acrescentem o devido valor aos subprodutos levou ao destaque da fermentação em estado sólido, uma vez que utiliza os resíduos como substratos e através do crescimento microbiano sintetiza novos compostos de grande interesse industrial e/ou com um elevado valor nutricional (Thomas et al., 2013). O conceito de economia circular (EC) revela-se cada vez mais importante, no entanto, parte da comunidade científica considera-o vago porque “significa muitas coisas diferentes para diferentes pessoas” (Kirchherr et al., 2017). Kirchherr et al., 2017 analisaram 114 definições e concluíram que o conceito de EC é identificado como a combinação de reduzir, reutilizar e reciclar. Assim, a EC apresenta soluções para reduzir a quantidade de matérias-primas e outros recursos de entrada, resíduos e emissões, visando manter os fluxos de materiais e energia dentro da economia e sistemas de consumo (D’Amato, 2021) A fermentação em estado sólido de resíduos provenientes da indústria enquadra-se dentro do conceito de economia circular e, por isso, o objetivo geral desta dissertação é otimizar o processo de fermentação em estado sólido do subproduto dreche, proveniente da indústria cervejeira, para obtenção de um novo produto alimentar. Pretende-se utilizar o microrganismo Aspergillus niger e otimizar o seu crescimento durante a fermentação com a dreche. Por fim, pretende-se projetar a estabilização e caracterização do produto fermentado para perceber qual a melhor forma de o utilizar para obter um produto alimentar novo. 3 1.2. Organização da dissertação A presente dissertação contém a seguinte estrutura: o Introdução: Neste capítulo é feito um enquadramento do processo fermentativo que é abordado ao longo da dissertação, bem como a sua importância atualmente. São abordados os conceitos de aproveitamento de resíduos e economia circular. Além disso, é exposto o objetivo principal da tese. o Estado de arte: Este capítulo consiste na introdução teórica das temáticas que envolvem o processo em estudo. o Materiais e métodos: Neste capítulo são explicadas as metodologias utilizadas para realizar o estudo o Resultados e discussão: Apresenta os resultados obtidos e a respetiva discussão o Conclusão e Recomendações: Neste capítulo encontram-se as conclusões retiradas no trabalho e são feitas algumas recomendações para futuros estudos. o Bibliografia e Anexos: Estes dois últimos capítulos são referentes ao material auxiliar e necessário para a realização do trabalho 4 2. Estado de Arte Ao longo das últimas décadas a biotecnologia tem-se desenvolvido rapidamente através do aparecimento de novos processos a nível industrial que recorrem a microrganismos (Schürrle, 2020). Os processos biotecnológicos têm sido aplicados nas indústrias agroalimentares, farmacêuticas, química fina, de energia e do ambiente (Teixeira & Ferreira, 2003). Os processos biotecnológicos podem dividir-se em processos de crescimento microbiano e processos catalisados por enzimas (Teixeira & Ferreira, 2003). Estes processos têm como objetivo a síntese de compostos químicos intracelulares – proteínas – ou extracelulares – antibióticos – a produção de biomassa, de alimentos e energia (Teixeira & Ferreira, 2003). 2.1. Fermentação A fermentação é definida como um processo bioquímico que consiste na síntese de ATP sem envolver a cadeia respiratória e que funciona em condições anaeróbicas, sendo o aceitador final de eletrões uma molécula orgânica (Kuila & Sharma, 2018). Este processo utiliza microrganismos para a produção de compostos e pode ser aplicado em várias indústrias como, por exemplo, na produção de energia e nas indústrias farmacêutica, química e alimentar. Esta tecnologia tem sido utilizada desde os tempos antigos para preservar as propriedades dos alimentos e para produção de pão, cerveja, vinagre, iogurte, vinho e queijo (Kuila & Sharma, 2018). Produtos fermentados têm um prazo de validade elevado e possuem texturas e sabores únicos. A preservação destes produtos deve-se à produção de ácido lático e de ácidos orgânicos que reduzem o pH e inibem o crescimento de microrganismos patogénicos (Kuila & Sharma, 2018). 5 Em síntese, um processo fermentativo consiste em quatro etapas: 1. Preparação do meio fermentativo e inoculação 2. Fermentação, etapa em que os microrganismos transformam a matéria-prima no produto que se pretende obter 3. Tratamentos finais, necessários para obter o produto com melhor qualidade 4. Tratamento dos resíduos gerados O processo de fermentação está distribuído pela natureza e os microrganismos são descritos, desde sempre, como os principais organismos capazes de realizar fermentação. De um ponto de vista biológico, a fermentação consiste num processo que permite a obtenção de energia a partir de moléculas e é comum a todos os seres vivos. A libertação de produtos secundários como os antibióticos e as enzimas é muito comum nos processos fermentativos (Martínez & Espinosa, 2020). Associado aos processos biotecnológicos está o conceito de cultura pura, que começou a ser utilizado em 1896 a nível industrial, surgindo assim os métodos de assepsia que permitem manter o ambiente puro, ou seja, sem contaminações (Teixeira & Ferreira, 2003). Industrialmente, os métodos de assepsia foram implementados em 1940 e, neste ano, surgiram os primeiros elétrodos esterilizáveis de pH e oxigénio. Os produtos fermentados sofreram uma evolução desde produtos de baixo valor acrescentado, como o caso do vinagre, para produtos com alto valor acrescentado, que são obtidos por microrganismos geneticamente modificados. Estes organismos são manipulados geneticamente de forma a favorecer características desejadas, como por exemplo a cor e o tamanho (Teixeira & Ferreira, 2003). A interconexão da tecnologia com o processo fermentativo tornou possível a produção de produtos fermentados a uma escala industrial, em que a qualidade e a segurança do produto estão asseguradas devido ao desenvolvimento e à evolução da biotecnologia e da engenharia (Singhania et al., 2009). Existem dois tipos de fermentação: fermentação submersa (FS) e fermentação em estado sólido (FES). 6 Estes processos apresentam várias diferenças, como mostra a Tabela 1 . Tabela 1. Comparação entre fermentação em estado sólido e fermentação submersa. Adaptado de Hongzhang Chen, 2013 Fermentação em estado sólido Fermentação submersa O conteúdo de água do substrato é baixo Água é o componente principal do meio de cultura Existe um gradiente de concentração de nutrientes Não existe gradiente de concentração de nutrientes A área de superfície para inoculação é grande A área de superfície para inoculação é pequena Baixo consumo de energia Elevado consumo de energia Os microrganismos penetram no substrato sólido Os microrganismos distribuem-se uniformemente à superfície do líquido Taxa de produção e rendimento elevados Taxa de produção e rendimento baixos Mistura difícil Mistura fácil Heterogeneidade Homogeneidade Baixa atividade de água Elevada atividade de água Matéria-prima barata Matéria-prima cara Nesta dissertação será abordada a FES, como foi referido no capítulo da 1.Introdução. 2.2. Fermentação em estado sólido 2.2.1. Definição A FES é um bioprocesso de fermentação na qual os microrganismos crescem em material sólido na presença de uma baixa quantidade de água livre, através de um suporte sólido que pode ser um substrato natural ou inerte (Pandey et al., 2000). O objetivo da FES é a utilização de substratos sólidos como fonte de carbono e azoto para o crescimento e desenvolvimento de microrganismos para a obtenção de um produto fermentado com valor acrescentado (Hongzhang Chen, 2013). 7 A seleção apropriada de um microrganismo tendo em conta a composição química do substrato, a otimização dos parâmetros cruciais à FES como a temperatura, pH, arejamento, humidade, rácio C/N e altura do leito fermentativo assim como a purificação do produto final são pontos essenciais ao sucesso deste processo (Singhania et al., 2009). Neste processo existem três pontos cruciais: o objetivo pretendido com a fermentação, a escolha do microrganismo e a escolha do ambiente a que o microrganismo é sujeito (Chen, 2013). Assim, o objetivo desta dissertação corresponde à otimização do processo fermentativo de forma a obter um produto nutricionalmente enriquecido. A fermentação em estado sólido oferece várias oportunidades no processamento de resíduos agroindustriais porque requer pouca energia, baixa concentração de água e não origina tanto desperdício (águas residuais) como o processo de fermentação em meio líquido, logo é menos poluente (Pandey et al., 2000). 2.2.2. Vantagens e desvantagens O facto de ser possível produzir produtos com valor acrescentado através de resíduos a baixo custo industrial traduz-se numa mais-valia (Hongzhang Chen, 2013). A fermentação em estado sólido é vantajosa, uma vez que requer uma baixa quantidade de água, diminuindo o desperdício, forma elevadas concentrações de produto final, a repressão catabólica é baixa e os resíduos podem ser utilizados sem qualquer tipo de pré-tratamento, traduzindo-se numa vantagem em comparação com a FS que precisa sempre de pré-tratamento para hidrolisar os polissacarídeos e obter açucares simples fermentáveis. Além disso, contrariamente ao que acontece na FS, na FES existe uma simulação de um ambiente natural que melhora o desempenho dos microrganismos. Além disso, existe uma elevada produtividade e a energia necessária para aquecer, assim como os custos de operação, são baixos (Singhania et al., 2009). No entanto, existem obstáculos como o aumento de escala devido a dificuldades em controlar certos parâmetros como o calor e a transferência de massa (Trzcinski, 2018). Durante o processo, gera-se uma elevada quantidade de calor que, consequentemente, leva a uma redução da atividade metabólica do microrganismo. 8 A temperatura é um parâmetro critico porque afeta o crescimento do microrganismo, a formação e germinação de esporos e a formação do produto final (Pandey, 2003). Humidades muito elevadas levam a uma redução da porosidade do substrato, que como consequência impede a penetração de oxigénio, podendo levar a uma contaminação por bactéria. Por outro lado, baixas humidades levam a uma fraca acessibilidade de nutrientes e impedem o crescimento adequado dos microrganismos (Pandey, 2003). Os materiais sólidos utilizados têm condutividades térmicas baixas e por isso a remoção de calor durante o processo torna-se muito lenta (Pandey, 2003). Assim, existe acumulação de calor, que leva à desnaturação do produto final (Pandey, 2003). Parâmetros como a temperatura, pH, humidade e concentração de substrato são difíceis de controlar devido à baixa disponibilidade de água neste processo (Satari et al., 2016). Tendo em conta as vantagens, consequências e os problemas a serem resolvidos Satari et al. (2016) apresentou uma tabela sucinta, que está adaptada na Tabela 2. Tabela 2. Vantagens e respetivas consequências e problemas a resolver. Adaptado de Satari et al., 2016 Vantagens Consequências Problemas a ser resolvidos Baixa quantidade de água requerida Menos desperdício de água Criação de gradientes de humidade Elevada concentração de produto final Baixos custos de purificação — Baixa repressão catabólica Fermentação na presença de glucose — Utilização de um substrato sólido Concentrações elevadas do crescimento de substratos Criação de gradientes de humidade e de pH Suporte sólido para os microrganismos simulando um ambiente natural Melhor performance dos microrganismos — Produtividade de volumes elevada Volumes fermentados mais reduzidos — Baixa energia requerida para aquecer — Criação de gradientes de temperatura Aeração fácil Fontes de carbono abundantes — 9 Outra desvantagem da fermentação em estado sólido é a falta de métodos que caracterizem o crescimento dos microrganismos durante o processo. 2.2.3. Aplicações A fermentação em estado sólido tem sido usada ao longo dos anos para produzir alimentos através de fungos. Um exemplo é o processo fermentativo através de Aspergillus oryzae para produção de arroz e o uso de Penicillium roquefortii para produção de queijo. Atualmente existem vários bioprocessos em que a FES pode ser utilizada, como a biodegradação de compostos perigosos, desintoxicação biológica de resíduos agroindustriais, biotransformação de colheitas para aumento nutricional e para a produção de produtos com valor acrescentado (Krishna, 2005). A maioria das enzimas são produzidas através de FES. Os ácidos orgânicos como o acido cítrico, ácido fumárico e ácido lático também são produzidos por FES. Através de FES também são produzidos antibióticos como a penicilina (Krishna, 2005). 2.2.4. Reatores e modos de operação Nos processos de fermentação, os biorreatores fornecem o ambiente necessário ao crescimento dos microrganismos e existem vários fatores que afetam este crescimento, como a temperatura, o tipo de substrato, o tamanho do reator, a aeração e a taxa de arrefecimento (Bhargav et al., 2007). Em qualquer tipo de biorreator existem 5 fatores que limitam a performance do processo fermentativo: humidade, transferência de oxigénio, transferência de dióxido de carbono, transferência de calor e o próprio reator. O tipo de reator utilizado na fermentação em estado sólido depende do substrato (Abdul Manan & Webb, 2018). No processo fermentativo o reator tem quatro tarefas importantes: sustentar o substrato, manter os microrganismos, proteger o meio contra contaminações e controlar as condições do ambiente de forma a otimizar o crescimento do microrganismo e a formação do produto pretendido (Abdul Manan & Webb, 2018). Um reator deve ser capaz de prevenir a contaminação dos microrganismos, tanto quanto possível, manter a temperatura e humidade adequadas para o processo fermentativo, fornecer oxigénio suficiente aos microrganismos aeróbicos, fornecer um ambiente anaeróbico para os 10 microrganismos anaeróbicos, facilitar a extração dos produtos fermentados e distribuir o material da forma mais semelhante possível (Hongzhang Chen, 2013). Existem três modos de operação com que os reatores podem operar: descontínuo (batch), contínuo e semicontínuo (Kadic & Heindel, 2014). Tendo em conta o tipo de aeração existem 4 tipos de reatores: reator em tabuleiro, reator de leito fixo, reator de leito fluidizado e reator de tambor rotativo (Hongzhang Chen, 2013). O reator em tabuleiro ( tray reactor ) é o tipo de reator mais simples e pode ser feito de madeira, plástico ou metal. Este reator consiste numa câmara com prateleiras planas, onde circula o ar, com temperatura e humidade controladas, como mostra a Figura 1. Normalmente, as prateleiras estão colocadas umas acima das outras, com espaço entre elas, e o substrato encontra-se espalhado, por camadas, em cima das prateleiras. Antes da fermentação ser iniciada, as prateleiras são autoclavadas, arrefecidas e inoculadas para depois serem colocadas na câmara onde decorre a fermentação. Os parâmetros de humidade, aeração e temperatura são regulados e, depois da fermentação, os sólidos são recolhidos, dando início às operações de purificação. Estes reatores requerem quantidades elevadas de prateleiras e consequentemente maior volume, tornando-se desvantajoso para processos à escala industrial (Krishna, 2005). Segundo a patente Seiskari, (2006) estes reatores são inoculados depois da esterilização através de um spray que espalha o inoculo líquido na superfície de cada prateleira ou mergulhando o conteúdo do reator numa suspensão que contém o microrganismo. A operação de um reator em tabuleiro requer custos elevados de mão de obra porque cada prateleira deve ser preenchida e limpa manualmente. 17 Este microrganismo é um dos mais importantes na área da biotecnologia, tendo vindo a ser utilizado durante várias décadas para produzir enzimas e ácido cítrico. Além disso, é utilizado para o tratamento de resíduos. A. niger captou a atenção, pela primeira vez, em 1919 quando a sua capacidade para produzir acido cítrico foi explorada industrialmente. Desde 1960 este microrganismo tem sido uma fonte para várias enzimas que são importantes para a indústria alimentar (Schuster et al., 2002). A. niger é considerado um microrganismo promissor para a fermentação em estado sólido porque aumenta o conteúdo proteico (Carvalho Do Santos et al., 2015). Existem estudos que mostram o aumento de proteína como o estudo de Vandenberghe et al. (2000) em que com a produção de ácido cítrico também foi analisada a proteína e verificou-se o seu aumento. A utilização deste microrganismo é vantajosa porque este fungo é fácil de manipular, tem capacidade de fermentar várias matérias-primas com baixo custo e permite produzir elevadas quantidades de produto (Carvalho Do Santos et al., 2015). Além disso, A. niger é considerado não patogénico e não tóxico, o que faz com que seja geralmente reconhecido como seguro (GRAS) e por isso, o seu uso tem um impacto positivo na indústria alimentar (Carvalho Do Santos et al., 2015). Na fermentação em estado sólido os microrganismos apenas conseguem usar pequenas moléculas de açúcar, como a glucose (monossacarídeo), e não podem transportar macromoléculas diretamente para as células. Processos como o esmagamento e aquecimento permitem a hidrólise do substrato pelos microrganismos (Steudler et al., 2019). As alterações do ambiente são determinadas pelo calor e água provenientes do crescimento dos microrganismos. O crescimento e metabolismo dos microrganismos são afetados pela transferência de massa e calor do substrato. Por sua vez, o substrato pode sofrer alterações da estrutura e das suas propriedades físicas devido ao crescimento dos microrganismos. Desta forma, considera-se que existe uma relação entre as três variáveis: variáveis do ambiente (pH, temperatura, oxigénio e atividade da água), crescimento e metabolismo dos microrganismos, composição e propriedades físicas do substrato (Hongzhang Chen, 2013). 18 2.4. Seleção do substrato 2.4.1. Categorias de substratos aptos à FES A FES requer substratos com recursos essenciais para suportar o crescimento e metabolismo dos microrganismos. No entanto existe uma grande diversidade de matérias-primas de baixo custo com características adequadas para serem utilizadas com substrato em FES atuando como suporte para o crescimento microbiano e fonte de carbono e azoto, reduzindo os custos de produção (Hongzhang Chen, 2013). Os substratos utilizados costumam ser subprodutos ou resíduos de outros processos e, por isso, podem dividir-se em várias categorias, como os farelos, cascas, bagaços, entre outros. Estes materiais são considerados viáveis para biotransformação e são recursos naturais renováveis que são produzidos em grandes quantidades, podendo traduzir-se num problema ambiental. Desta forma, a sua reutilização tem sido cada vez mais explorada (Hongzhang Chen, 2013). Denominam-se materiais heterogéneos porque são compostos por celulose, hemicelulose, lignina, amido, pectina e proteínas, que servem como fonte de carbono e energia, assim como de suporte para o crescimento microbiano (Hongzhang Chen, 2013). O farelo é a matéria-prima mais usada na fermentação em estado sólido e para ser utilizado, muitas vezes, é necessário proceder a um pré-tratamento, sendo os processos mais comuns o esmagamento e cozedura. O esmagamento consiste em reduzir o tamanho das partículas do substrato de forma a aumentar a uniformidade das partículas e a área de superfície. O processo de cozedura facilita a degradação das macromoléculas (Hongzhang Chen, 2013). A dreche (Brewers spent grain, BSG) é um subproduto da indústria cervejeira que representa cerca de 85 % dos resíduos de cerveja e é obtido principalmente como um resíduo sólido após a produção do mosto no processo de fermentação (Pinheiro et al., 2019). 2.4.2. A Indústria Cervejeira como fonte de substrato para a FES A cerveja é uma das bebidas mais consumidas no mundo, em conjunto com o chá, as bebidas carbonatadas, o café e o leite. Em Portugal o volume de cerveja consumida em 2020 foi 46 L/capita (Conway, 2022). 19 A matéria-prima utilizada na produção de cerveja é a cevada maltada, mas algumas cervejarias também utilizam outros tipos de cereais como o trigo e o milho (Olajire, 2012). A fermentação da cevada consiste na conversão dos açucares dos grãos de cevada em álcool, sendo a fermentação a principal etapa do processo. Na fermentação são utilizados lúpulos, água e leveduras, sendo que para produzir cerveja são necessárias elevadas quantidades de energia elétrica, combustível e água (Olajire, 2012). Além de haver uma grande produção de cerveja, há também a geração de subprodutos. Gera-se uma elevada quantidade de água residual. Os resíduos sólidos gerados são a dreche, o trub, terra de diatomácea e o resíduo de levedura. A dreche é um resíduo que é gerado na etapa de produção de mosto. A terra de diatomácea advém do processo de filtração e é constituída por água e substâncias orgânicas, sendo considerada perigosa devido às quantidades elevada que são geradas no processo cervejeiro. O resíduo de levedura advém da maturação e fermentação da cerveja, contendo um teor elevado de proteínas e vitamina B (Olajire, 2012). 2.4.3. Dreche Segundo Pinheiro et al. (2019) as cervejarias na Europa geram cerca de 3,5 milhões de toneladas de BSG por ano. BSG é uma biomassa lignocelulósica que é constituída por fibra, lignina, celulose, hemicelulose, vitamina, minerais e proteína (Pinheiro et al., 2019). Este resíduo consiste na casca de grão da cevada obtida depois do processo de preparação do mosto, sendo que a quantidade de cada um dos compostos depende do tempo de colheita e uso dos grãos, do processo de maltagem e moagem e da quantidade e qualidade dos aditivos utilizados no processo (Aldana et al., 2021). Normalmente, a dreche apresenta altos valores de teor de humidade e de carbono, hemicelulose, lignina, celulose e compostos fenólicos e teor reduzido de cinzas (Aldana et al., 2021). 20 A Tabela 3 apresenta os dados relativos à composição química da dreche, existente na literatura. Tabela 3. Composição da dreche. Todos os valores estão descritos em g por 100 g de matéria seca (% p/p). Adaptado de Marcus & Fox, (2021) A dreche também é composta por minerais, vitaminas e aminoácidos. Os minerais existentes neste resíduo são o cálcio, cobalto, ferro, cobre, magnésio, fosforo, potássio, selénio e sódio, todos em concentrações abaixo dos 0,5 % p/p. O seu conteúdo em vitaminas consiste em biotina, colina, ácido fólico, niacina, entre outras (Mathias et al., 2015). Este subproduto é valioso devido ao seu conteúdo em açucares fermentáveis que são a fonte de alimento dos fungos e, por isso, tem elevado potencial para ser valorizado. Segundo Celus et al. (2007) a dreche contém o mesmo tipo de proteínas que a cevada e o malte (correspondentes ao material de onde vem a dreche) e cerca de 65 % p/p das proteínas do malte encontram-se na dreche e as restantes 35 % estão presentes no mosto. As proteínas da cevada são divididas em quatro grupos, tendo em conta a solubilidade: as albuminas que são solúveis em água, as globulinas (solúveis em sais diluídos), prolaminas (solúveis em misturas de álcool com água) e as glutelinas (solúveis em meio alcalino). As albuminas e as globulinas são as principais proteínas metabólicas dos grãos de cereais, sendo que as albuminas correspondem a cerca de 11 % p/p das proteínas da cevada e as globulinas correspondem a cerca de 15 % p/p. As prolaminas também podem ser chamadas hordeínas e correspondem a cerca de 37 % p/p das proteínas totais da cevada. As glutelinas constituem cerca Componente Valores (%) Proteína 10,0 – 26,7 Lípidos 3,0 – 10,6 Carbohidratos 1,0 – 13,0 Cinzas 1,2 – 4,6 Compostos fenólicos 0,7 – 2,0 Lignina 11,9 – 22,0 21 de 30 % p/p das proteínas da cevada e são as proteínas menos estudadas porque requerem condições de extração extremas, com solventes agressivos (Celus et al., 2007). Na dreche, as prolaminas encontram-se em maior quantidade e fazem com que este resíduo seja rico em glutamina e ácido glutâmico (Celus et al., 2007). A humidade da dreche, normalmente, ronda os 75 - 80 % e, devido a esta quantidade elevada e ao conteúdo de açucares fermentáveis, este resíduo é instável e deteriora-se rapidamente por causa da sua atividade microbiana. Assim, para poder utilizar a dreche é necessário conservá-la e uma das técnicas mais utilizadas é o processo de secagem que leva à redução do volume e dos custos de transporte e armazenamento, permitindo manter este resíduo à temperatura ambiente (Santos Mathias et al., 2015). Geralmente, a dreche é utilizada para alimentar os animais, tanto em base seca como em base húmida, mas a sua reutilização através da fermentação em estado sólido com microrganismos permite o aumento do seu conteúdo nutritivo, o que torna este resíduo numa alternativa que visa a sustentabilidade e a produção de produtos novos comerciais (Canedo et al., 2016). Além disso, a dreche tem potencial energético e, por isso, está a ser investigada a produção de biogás a partir deste resíduo. O seu valor enzimático e a quantidade abundante em ácidos fenólicos remetem para um potencial biotecnológico. Este resíduo é composto por β-glucanos, que é atrativo para a área medica, principalmente para tratamento de problemas gastrointestinais (Aldana et al., 2021). Assim, apesar da utilidade mais comum da dreche ser para alimentação animal, mais precisamente de gado, o aumento dos estudos e testes laboratoriais permitiu concluir que o valor da dreche pode aumentar com a utilização de microrganismos, o que leva à descoberta de novas utilidades deste resíduo da indústria cervejeira, tornando possível a síntese de novos produtos (Marcus & Fox, 2021). 2.5. Fermentação da dreche Atualmente, diversos estudos analisam o potencial de vários microrganismos para valorizar a dreche através de fermentação em estado sólido, dando origem a produtos novos de valor acrescentado. 22 Tendo em conta alguns destes estudos foi possível construir a Tabela 4 que mostra o microrganismo utilizado, em cada estudo, bem como as condições de temperatura e de tempo escolhidas. Tabela 4. Estudos realizados com diferentes microrganismos para valorizar a dreche Comprovou-se que o processo fermentativo leva ao aumento do conteúdo proteico (total e solúvel) da dreche. Para avaliar o efeito da FES na composição da dreche é necessário fazer uma caracterização físico-química antes e depois da fermentação. Os fungos filamentosos têm sido utilizados na produção de alimentos e bebidas fermentadas. Cooray & Chen, (2018) analisaram a fermentação da dreche com recurso ao microrganismo Rhizopus oligosporus , de forma a produzir um produto de valor acrescentado. O processo fermentativo demorou 72 horas a uma temperatura de 37 °C, como mostra a Tabela 4 e foram recolhidas amostras a cada 24 horas. Após os 3 dias de fermentação, o conteúdo da dreche alterou-se, tendo havido um decréscimo no conteúdo em gordura, nas fibras e no conteúdo em açúcares. A redução de gordura pode ser devido à hidrólise das lípases, produzidas durante o processo fermentativo de fungos. A redução de fibras pode ser uma consequência da degradação através da pectinase e da celulase, produzidas também durante a fermentação. Por sua vez, a produção de invertase leva à hidrólise da sacarose em frutose e glucose, ou seja, transforma os dissacarídeos em açucares simples que podem ser consumidos pelo fungo. Neste estudo, foram observados valores elevados de aminoácidos, ácido cítrico, vitamina e antioxidante na dreche fermentado, o que permitiu concluir que a fermentação, de facto, aumenta o valor nutricional deste Microrganismo Temperatura (°C) Tempo (h) Referência Rhizopus sp 30 192 (Ibarruri et al., 2019) Rhizopus oligosporus 37 72 (Cooray & Chen, 2018) Bacillus subtilis 37 48 (Tan et al., 2019) Aspergillus oryzae 28 840 (Ogunjobi et al., 2011) Aspergillus niger 30 144 (Sousa et al., 2018) 23 resíduo da indústria cervejeira conferindo-lhe potencial para ser utilizado na alimentação e produção de produtos de valor acrescentado. O estudo realizado por Sousa et al. (2018) teve como objetivo estudar o efeito da FES no valor nutricional de resíduos das indústrias cervejeira e vinícola, tendo sido testados três fungos e quatro resíduos diferentes. Foi avaliado o efeito do crescimento dos microrganismos e a relação entre os microrganismos e a composição do substrato. Os fungos utilizados foram o A. niger , A. uvarum e A. ibericus, com um processo fermentativo a uma temperatura de 30 °C, durante 6 dias. Verificouse que a dreche antes de fermentado já tinha um conteúdo proteico elevado, mas após a fermentação a proteína aumentou. Este estudo demonstrou o interesse em utilizar fungos do género Aspergillus para a fermentação em estado sólido da dreche. Com o intuito de analisar o conteúdo proteico da dreche, Ogunjobi et al. (2011) analisou os efeitos da fermentação em estado sólido com o A. oryzae . Ibarruri et al. (2019) otimizou os parâmetros para a fermentação em estado sólido da dreche com microrganismos do género Rhizopus , com o objetivo de melhorar a composição nutricional do substrato. 2.6. Produtos alimentares obtidos a partir de dreche Tendo em conta o produto final que se pretende obter, o uso de fungos em FES usando a dreche como substrato pode ser classificado em três categorias. O produto final pode ser uma enzima, um composto com elevado valor comercial, como o etanol, ou um substrato com valor nutricional melhorado (Marcus & Fox, 2021). Devido ao seu baixo custo e alto valor nutritivo, tem sido avaliada a possibilidade de utilizar a dreche para produzir pão de trigo, biscoitos e snacks. No entanto, como este resíduo é bastante granular, não pode ser aplicado diretamente em alimentos e, por isso, tem de ser convertido em farinha (Mathias et al., 2015) Segundo Mathias et al. (2015) uma farinha com alto valor proteico, preparada a partir de BSG, foi implementada em vários produtos de pastelaria, como bolachas, cereais, pão, panquecas e tortilhas. No entanto, existem limitações no uso desta farinha como aditivo proteico devido à sua cor e sabor uma vez que a dreche apresenta uma cor acastanhada quando se encontra húmida e só pode ser utilizada em produtos que sejam totalmente feitos a partir de farinhas de trigo. As 24 alterações no sabor do produto final levam a que sejam apenas incorporadas pequenas quantidades da farinha. Hassona, (1993), apresenta um pão com 10 % de dreche que tem um conteúdo proteico e de aminoácidos superior ao pão tradicional - sem dreche. Além disso, o novo pão tem menos 7 % em calorias. Mathias et al. (2015) referiu que a incorporação de produtos derivados da dreche na nossa dieta pode ser benéfica para a saúde humana. O uso de farinha de dreche em alimentos permite uma facilidade na mistura, o conteúdo calórico é reduzido para metade em comparação com a maioria das farinhas de trigo, existe uma capacidade de absorção de água elevada, fornece minerais, tem uma cor acastanhada uniforme e elevados conteúdos de proteína e fibra (Mathias et al., 2015). O baixo conteúdo de cinzas e elevado conteúdo em fibra da dreche levou ao seu uso para materiais de construção. Este resíduo pode ser utilizado para aumentar a porosidade e caraterísticas dos tijolos sem influenciar a cor e a qualidade do tijolo em si. Assim, a dreche pode ser um substituto do pó de serra que é utilizado normalmente em tijolos para aumentar a porosidade (Mathias et al., 2015). Também foi investigado o uso deste resíduo para a produção de papel devido à composição em fibra e verificou-se que os produtos tinham maior textura em comparação com produtos sem dreche (Mathias et al., 2015). Pode também ser fermentado de forma a produzir biogás, constituído por 60 – 70 % de metano, dióxido de carbono, pequenas quantidades de hidrogénio, azoto e monóxido de carbono. Assim, é possível afirmar que a dreche tem potencial para ser aplicado na produção de energia (Mathias et al., 2015). 25 Na Tabela 5 estão representados alguns exemplos de produtos obtidos através de FES utilizando a dreche como substrato e o respetivo microrganismo utilizado. Tabela 5. Produtos obtido com a fermentação da dreche e respetivo microrganismo. Adaptado de Marcus & Fox, (2021) Categoria Produto obtido Microrganismo Enzimas αamílase Aspergillus oryzae Amiloglucosidase Aspergillus niger Penicillium frequestans βamílase Aspergillus niger Aspergillus fumigatus Penicillium frequestans Celulase Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Fusarium oxysporum Neurospora crassa Glucanase Trichoderman spp Hemicelulase Fusarium Protéases Aspergillus oryzae Xilanases Penicillium janczewskii Outros produtos Bioetanol Neurospora crassa Etanol Zymomonas mobilis Glucose Trichoderma reesei Xilose Candida guilliermondii Ácido cítrico Aspergillus niger Proteína Aspergillus niger Dreche fermentado Digestão de hemicelulose Penicillium janczewskii Aumento dos aminoácidos, antioxidantes, vitaminas e conteúdo proteico Rhizopus oligosporus Aspergillus oryzae Aspergillus niger 26 2.7. Desafios para o futuro A dreche é um substrato versátil e a sua composição pode variar muito, por isso o processo deve ser capaz de suportar diferentes tipos de dreche. A humidade deste resíduo é geralmente alta, o que pode levar a riscos de contaminação microbiana. Além disso, se a dreche for mantida a temperatura ambiente pode apresentar atividade microbiana (Marcus & Fox, 2021). O aumento de escala da fermentação da dreche pode levar a um aumento da transferência de oxigénio para o substrato e consequentemente a uma maior produção de xilanase. Ainda não está provado se o aumento de escala afeta o crescimento microbiológico (Marcus & Fox, 2021). 33 De modo a evitar alterações da sua composição química, a dreche deve ser armazenado a uma temperatura abaixo de zero (-20 °C) até ser utilizado. Foi medida a humidade inicial do resíduo e obteve-se um valor de 71 %, o que vai de encontro com a literatura, que considera este resíduo uma biomassa com elevado teor de água. Depois de ser submetido a um processo de secagem a dreche é estabilizado e pode ser armazenado à temperatura ambiente. Após o processo de secagem, a humidade presente na dreche é residual apresentando um valor de 1,15 %. O resíduo seco apresenta uma cor acastanhada e manteve o odor a cereal. 4.3. Ensaios de fermentação Todas as fermentações conduzidas no âmbito desta dissertação foram realizadas no reator com tambor rotativo e agitação que se encontrava numa estufa com uma temperatura constante de 30 °C. No primeiro teste realizado parte da dreche foi autoclavada seca, com adição de água após o processo de autoclave em meio asséptico, e outra parte foi autoclavada húmida a 80 %. A proteína solúvel (PS) foi medida ao longo do tempo em que a fermentação decorreu. Os resultados do teste preliminar realizado encontram-se na Figura 10. 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0 2 4 6 8 10 12 Proteína solúvel (mg/ml) tempo (dias) Dreche seco Dreche húmido Figura 10. Evolução da proteína solúvel para dreche seca e dreche húmido, depois do processo de autoclave. 34 Um substrato é considerado bom para o crescimento de um determinado microrganismo quando se atingem condições de crescimento ótimas para o microrganismo em específico e, para tal, é necessário eliminar qualquer outro tipo de organismo que possa estar presente, através de um processo de esterilização, como a autoclave (Kotlar et al., 2011). A aplicação de biomassas lignocelulósicas, como é o caso da dreche, em processos de fermentação é melhorada se houver um pré-tratamento do substrato por calor e pressões elevadas porque torna a celulose e hemicelulose acessíveis para serem sacarificadas, através do processo parcial de hidrólise. A sacarificação corresponde à transformação dos carboidratos em açucares fermentescíveis, como a glucose e a xilose, e estes açucares são utilizados pelos microrganismos para catalisar o seu crescimento (Debiagi et al., 2020; Ravindran & Jaiswal, 2016). Este prétratamento pode ser conseguido através da autoclave, que é um método de esterilização através do uso de água e, por isso, leva à ocorrência de um processo de auto hidrólise, onde há libertação dos açucares e formação de produtos solúveis em água, como as proteínas solúveis (Tarconsky, 1985). Verificou-se que autoclavar a dreche húmida leva a um aumento superior da concentração de proteína solúvel em comparação com a dreche seca e, além disso, os picos de concentração foram atingidos em dias diferentes. No dia 6, para a dreche húmida, obteve-se uma concentração de 0,572 mg/ml, sendo este o maior valor medido, e com dreche seca o maior valor medido foi 0,342 mg/ml no dia 8, revelando-se um processo mais demorado. Segundo a literatura, a escolha das condições de autoclave e da biomassa interfere na fermentação dos hidrolisados obtidos e, por isso, o teor de humidade da biomassa interfere nos rendimentos do processo (Tarconsky, 1985). Tal foi possível comprovar na Figura 10. com a diferença de concentração da dreche esterilizada húmida para a seca. Estes resultados podem ser interpretados como fruto da diminuição da violência do processo de autoclave na dreche húmida porque parte do calor latente de vaporização foi utilizado para aquecer a água na dreche húmida (Tarconsky, 1985). As diferenças são notórias nas primeiras 24 horas sendo que neste teste preliminar a quantidade de PS, no primeiro dia, para a dreche húmida e dreche seca foi, respetivamente, 0,227 mg/ml e 0,063 mg/ml. Assim, é possível afirmar que autoclavar a dreche húmida otimiza a obtenção de proteína. 35 A diferença na concentração inicial de esporos também foi analisada, para a mesma humidade de 80 %. As concentrações de esporo são adicionadas ao substrato através do inóculo, sendo que para uma concentração de esporo específica se adiciona um volume de inoculo específico. A evolução da PS, ao longo de 7 dias de fermentação, em função das diferentes concentrações de inóculo testadas (0,5 ×106 esporos/ml e 1 ×106 esporos/ml) está representada na Figura 11. Através da realização do primeiro teste com uma humidade de 80 %, uma concentração de esporos de 1 ×106 esporos/ml e comparando os resultados obtidos com os do teste preliminar previamente realizado, aferiu-se que as 24 e 48 h não eram pontos tão relevantes como as 120 h e 144 h. Deste modo, no segundo teste efetuado, com concentração de esporos de 0,5 ×106 esporos/ml, alteraram-se os dias de análise de amostras, para obter a concentração máxima de proteína solúvel possível, não tendo sido analisadas as primeiras 48 h e sim as 120 e 144 h, como mostra a Figura 11, sendo possível prever o comportamento dos dias em falta através dos valores existentes. Além disso, para uma concentração de esporos de 1 ×106 esporos/ml obteve-se uma maior concentração de PS. No sétimo dia (168 h), em ambas as concentrações de esporos, verificou-se um decréscimo da quantidade de proteína, obtendo-se valores semelhantes entre as duas concentrações testadas correspondendo a 0,261 mg/ml e 0,268 mg/ml para 1 ×106 Figura 11. Evolução da proteína solúvel ao longo dos 7 dias para as duas concentrações iniciais de esporos. 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 024 48 72 96 120 144 168 Proteína solúvel (mg/ml) Tempo (h) 1x10^6 esporos/ml 0,5x10^6 esporos/ml 36 esporos/ml e 0,5 ×106 esporos/ml, respetivamente. De acordo com Erten et al. (2006) , uma concentração de esporo superior leva à redução da fase de latência que consequentemente resulta em taxas de fermentação mais rápidas e em concentrações de proteína superiores, que se pode confirmar com a Figura 11 em que se vê, por exemplo, que com 1 ×106 esporos/ml se atingiu a concentração de 0,300 mg/ml mais rápido do que com 0,5 ×106 esporos/ml (Erten et al., 2006; Gibbons & Westby, 1986). Assim, verificou-se que os resultados obtidos vão de encontro com a bibliografia. Apesar da diferença de valores, é percetível que de uma concentração para a outra não houve uma diferença significativa na quantidade de PS, o que permite assumir que para analisar de forma mais realista o efeito do volume de inoculo deve ser testado um intervalo de concentrações de esporo maior, por exemplo 1 ×107 esporos/ml e 1 ×108 esporos/ml. Espera-se que uma concentração de esporo muito baixa leve a um crescimento insuficiente e, consecutivamente, produzem-se menores concentrações de proteína. O mesmo pode ocorrer com uma concentração de esporo muito elevada porque pode levar à escassez de nutrientes impedindo a atividade metabólica do microrganismo (Subhosh Chandra & Rajasekhar Reddy, 2013). Na Figura 12 está descrito o comportamento do Aspergillus niger ao longo da fermentação para as duas condições estudadas. 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 024 48 72 96 120 144 Proteína solúvel (mg/ml) Tempo (h) Esporo 1x10^6 Esporo 0,5x10^6 Exponencial (Esporo 1x10^6) Exponencial (Esporo 0,5x10^6) Figura 12. Crescimento microbiológico para as duas concentrações de esporos. 37 Analisando a Figura 12 percebe-se que houve uma taxa de crescimento superior para a concentração de esporo de 1 ×106 esporos/ml. Pelo gráfico determinou-se a equação de crescimento do microrganismo para ambas as concentrações. As equações para 1 ×106 esporos/ml e 0,5 ×106 esporos/ml estão apresentadas, respetivamente, nas equações 3 e 4. y = 0,1624 𝑒0,0076𝑥 Eq. 3 y = 0,1445 𝑒0,0074𝑥 Eq. 4 As taxas de crescimento máximo (µmax) para 1 ×106 esporos/ml e 0,5 ×106 esporos/ml são, respetivamente, 0,0076 ℎ−1 e 0,0074 ℎ−1, o que comprova que para uma concentração de esporos superior existe um crescimento superior. As taxas de crescimento obtidas não são comparáveis com a literatura porque não existem estudos suficientes para as taxas de crescimento em FES do A.niger . No entanto, Pll et al. (1998) apresenta a diferença entre taxas de crescimento para FES e FS deste microrganismo com condições diferentes. Contrariamente a esta dissertação em que se estuda a biomassa, o estudo de Pll et al. (1998) é feito em glucose e, por isso, os valores obtidos são elevados. Apesar de não ser possível comparar valores concretos, foi possível aferir que a FES obtém melhores taxas de crescimento do que a FS em que, para a mesma quantidade de glucose (50 g/l) se obteve 0,323 ℎ−1 e 0,091 ℎ−1 para FES e FS, respetivamente, o que mostra a vantagem de realizar FES. Para perceber de que forma se comporta o microrganismo na dreche deve ser feito um estudo entre FES e FS em biomassa, de forma a ser possível comparar os valores de taxa de crescimento, no entanto este estudo está fora do âmbito desta dissertação pelo que é recomendado para projetos futuros. O facto de estas duas concentrações de esporos terem uma diferença é reduzida, visto que as taxas especificas de crescimento são muito parecidas, suporta a ideia de ser importante testar mais concentrações de esporo, tendo em atenção que um aumento de concentração de esporos leva à diminuição da fase de latência e consecutivamente obtém-se uma maior quantidade de produto em menos tempo até se esgotar a biomassa, ou seja, espera-se que o aumento exagerado 38 dos esporos leve à escassez de biomassa e, por isso, afeta a obtenção de produto final, porque sem biomassa o microrganismo não consegue continuar a produção e atinge mais rapidamente a fase de decréscimo. O efeito da humidade também foi testado tendo sido analisadas duas humidades: 80 e 70 %, para uma concentração de esporo de 1 ×106 esporos/ml. A Figura 13 retrata os resultados obtidos para a fermentação com diferentes valores de humidade durante os 7 dias de fermentação. A fermentação em estado sólido é definida como um processo fermentativo que utiliza pouca água e a água presente neste tipo de fermentação é proveniente do substrato utilizado, podendo encontrar-se entre as partículas sólidas ou como uma camada fina que está absorvida pela superfície das partículas. A água só se encontra livre dentro do sistema de fermentação quando ocorre saturação da capacidade do substrato, ou seja, depende do nível de humidade suportado. Desta forma, a humidade é um parâmetro que é considerado importante na FES e afeta o crescimento microbiano, as reações metabólicas e os processos de transferência de massa. A humidade ótima varia conforme o substrato (Mussatto et al., 2012; Raimbault, 1998). 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 024 48 72 96 120 144 168 192 Proteína solúvel (mg/ml) Tempo (h) Humidade 80 Humidade 70 Figura 13. Evolução da proteína ao longo dos 7 dias para as duas humidades. 39 Quando as condições de crescimento do microrganismo não são as adequadas ou quando o substrato é consumido até ao seu limite pode ocorrer esporulação, redução do crescimento e morte celular (Raimbault, 1998). Estudos anteriores revelam que valores baixos de humidade podem levar à esporulação do microrganismo. Por outro lado, valores mais elevados levam à redução da porosidade do sistema, que corresponde à percentagem de volume total de substrato que não é ocupada por sólidos e é composta por água e ar. Por sua vez, a diminuição da porosidade leva à limitação da transferência de oxigénio. Em geral, o valor ótimo de humidade para o crescimento num substrato sólido varia entre 40 % a 70 % (Raimbault, 1998). Neste estudo a PS apresentou valores de concentração superiores para uma humidade de 70 %, correspondendo a um aumento de 3,6 vezes no 4º dia de crescimento. Apesar de as concentrações, para a humidade de 80 %, serem inferiores aos valores da humidade de 70 % foi possível observar que no 4º dia de fermentação houve um aumento de 3,4 vezes. Os menores valores de concentração de PS a 80 % podem ser explicadas pelo facto de esta humidade já não ser adequada para a dreche estudada. De facto, ao longo da fermentação verificou-se dificuldade na mistura porque a dreche fermentada estava demasiado húmida e ficava agarrada às paredes dos tubos. Além disso, a humidade de 80 % é superior à humidade da dreche inicial (71 %) e por isso, faz sentido que com uma humidade de 70 % se observe um melhor crescimento, o que permite assumir que a 80 % de humidade ocorre saturação da capacidade deste substrato. No sétimo dia de fermentação a concentração de proteína diminuiu para 0,261 mg/ml e 0,415 mg/ml para as condições de 80 e 70 % de humidade, respetivamente. Segundo Ibarruri et al., (2019) o metabolismo do fungo é elevado a uma temperatura de 30 °C. O tempo de fermentação também aumenta a atividade metabólica. Atividades metabólicas altas levam a uma assimilação de aminoácidos para a produção de biomassa e, por isso, a determinada altura a quantidade de PS diminui. Ainda analisando a Figura 13 é percetível que nas primeiras 24 h existe um elevado aumento da proteína, em comparação com as restantes horas. 40 Neste estudo analisou-se a proteína até ao 4º dia, não tendo sido observado o seu crescimento nos dias 5 e 6 e concluiu-se que poderiam ser dias importantes para o aumento do conteúdo proteico. Assim, foi feita uma nova fermentação para uma humidade de 70 % em que se obteve uma quantidade máxima de proteína no 5º dia, que será discutida mais à frente neste capítulo. Os dias em que se obteve uma concentração máxima de proteína coincidem com os valores da literatura, que mostram um máximo de conteúdo proteico no quinto dia de fermentação (Canedo et al., 2016). Na Figura 14 está descrita a curva do crescimento na fase exponencial do fungo Aspergillus niger para as duas humidades estudadas. Pela Figura 14 é notório que houve um melhor desempenho para a humidade de 70 %. Também foram determinadas as equações de crescimento do fungo para as humidades estudadas. As equações 5 (correspondente à equação 3 descrita anteriormente) e 6 representam, respetivamente, as humidades de 80 e 70 %. Y = 0,1624 𝑒0,0076𝑥 Eq. 5 y = 0,1996 𝑒0,2027𝑥 Eq. 6 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 024 48 72 96 Proteína solúvel (mg/ml) Tempo (horas) Humidade 80% Humidade 70% Exponencial (Humidade 80%) Exponencial (Humidade 70%) Figura 14. Crescimento microbiológico para as duas humidades estudadas. 41 Nas equações 5 e 6 estão descritas as taxas específicas de crescimento do microrganismo. Para uma humidade de 70 % observou-se um µmax de 0,2027 ℎ−1, sendo este um valor superior à µmax para 80 %, que foi apenas de 0,0076 ℎ−1, comprovando que a humidade de 70 % é melhor do que 80 %. Com o objetivo de perceber o que acontece nas primeiras horas de crescimento retiraram-se amostras ao longo das 24 h iniciais, para uma humidade de 70 % e concentrações de esporo de 1 ×106 esporos/ml e obteve-se o gráfico representado na Figura 15. Na análise do comportamento do A. niger (Figura 15) verifica-se que nas duas primeiras horas há uma fase de latência, que é seguida pela primeira fase exponencial com uma duração de 6 horas. Das 8 horas às 18 horas verifica-se que a gama de aumento de proteína diminui, apresentando um comportamento parecido ao de uma fase de latência, que pode ser justificado pela mudança de fonte de carbono, visto que às 18 horas volta a haver um aumento exponencial. Este comportamento remete ao chamado crescimento dual. Este fenómeno acontece quando estão presentes duas fontes de carbono, havendo dois crescimentos exponenciais separados por uma fase de latência intermédia (Chu & Barnes, 2016). O crescimento dual é uma adaptação do microrganismo que permite maximizar o seu crescimento na presença de mais do que um nutriente (Chu & Barnes, 2016). 0,200 0,400 0,600 0246810 12 14 16 18 20 22 24 Proteína solúvel(mg/ml) Tempo (horas) Figura 15. Concentração de proteína ao longo das primeiras 24 horas de crescimento do A.niger . 42 Segundo a literatura, as enzimas que degradam a celulose e hemicelulose podem ser produzidas por microrganismos através da FES em que o substrato fornece os nutrientes necessários ao crescimento microbiano, induzindo a produção enzimática (Dias et al., 2018). O A. niger é considerado um bom produtor de enzimas que degradam a celulose e hemicelulose, como as xilanas, β-xilosidase e β-glucosidase e celulases (Dias et al., 2018). Além disso, segundo Zhang et al. (2022) este microrganismo utiliza a celulose e a hemicelulose como fontes de carbono. Por sua vez, Mirón et al. (2002) mostra que A. niger tem a capacidade de ter um crescimento dual e, embora este estudo seja referente a fontes de carbono diferentes da celulose e hemicelulose, a capacidade do fungo utilizar duas fontes de carbono é comprovada. Assim, considera-se que o A. niger apresenta um comportamento dual na dreche através de duas fontes de carbono: a hemicelulose e a celulose. A celulose é encontrada principalmente na parede celular da biomassa e é constituída por longas cadeias lineares de moléculas de glicose, ligadas por pontes ésteres α-D-glicosídicas e por pontes de hidrogénio, o que torna a sua degradação complicada. Por sua vez, a hemicelulose é constituída por xilanas (pentoses), unidades alternadas de manoses e glicoses e unidades de galactoses, sendo mais fácil de degradar (Dias et al., 2018). Por norma as hemiceluloses estão ligadas às ligninas por ligações covalentes e através de um processo de hidrolise estas ligações podem ser quebradas. Além disso, a hemicelulose e a lignina formam uma barreira protetora à volta da celulose, impedindo o seu acesso (Andlar et al., 2018; Dias et al., 2018). Como foi referido acima, inicialmente houve um processo de autoclave que induziu a autohidrolise parcial na dreche e, por isso, tendo em conta a literatura assume-se que as ligações entre a hemicelulose e a lignina foram quebradas. Sendo mais fácil aceder à hemicelulose, existe a forte suspeita de que a primeira fonte de carbono consumida pelo fungo é a hemicelulose e a segunda fonte é a celulose. Para compreender o que acontece, de facto, com estas fontes de carbono seria importante em trabalhos futuros determinar a atividade das enzimas. 49 Chen, H. (2013). Modern Solid State Fermentation. In Modern Solid State Fermentation . Chu, D., & Barnes, D. J. (2016). The lag-phase during diauxic growth is a trade-off between fast adaptation and high growth rate. Scientific Reports , 6 . Conway, J. (2022). 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