Desarrollo de nuevos soportes para sistemas analíticos de extracción por electromembrana.

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE QUÍMICA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA DESARROLLO DE NUEVOS SOPORTES PARA SISTEMAS ANALÍTICOS DE EXTRACCIÓN POR ELECTROMEMBRANA TESIS DOCTORAL Cristina Román Hidalgo Sevilla, Diciembre 2018 DESARROLLO DE NUEVOS SOPORTES PARA SISTEMAS ANALÍTICOS DE EXTRACCIÓN POR ELECTROMEMBRANA El Director La Directora Memoria presentada por Cristina Román Hidalgo para optar al título de Doctor en Química con Mención Internacional por la Universidad de Sevilla. Fdo.: Cristina Román Hidalgo Graduada en Química Fdo.: D. Miguel Ángel Bello López Fdo.: Dña. María Jesús Martín Valero Catedrático de Universidad Departamento de Química Analítica Universidad de Sevilla Profesora Titular de Universidad Departamento de Química Analítica Universidad de Sevilla D. FERNANDO DE PABLOS PONS, CATEDRÁTICO DE QUÍMICA ANALÍTICA Y DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTCA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA, CERTIFICA: Que el presente trabajo de investigación titulado “Desarrollo de nuevos soportes para sistemas analíticos de extracción por electromembrana”, que constituye la Memoria presentada por Cristina Román Hidalgo para aspirar al grado de Doctor en Química con Mención Internacional, ha sido realizado en los laboratorios del Departamento de Química Analítica de la Universidad de Sevilla, bajo la dirección de los Doctores Miguel Ángel Bello López y María Jesús Martín Valero, profesores de este Departamento, reuniendo a mi juicio las condiciones exigidas para este tipo de trabajos. Y para que conste, expido y firmo el presente certificado en Sevilla, a 18 de diciembre de 2018. Fdo.: Fernando de Pablos Pons AGRADECIMIENTOS En primer lugar, quiero expresar mi agradecimiento a los directores de este trabajo, D. Miguel Ángel Bello López y Dña. María Jesús Martín Valero, por su constante apoyo y estímulo. Gracias por confiar en mí, por toda la atención y ayuda prestada, por todos los conocimientos que me han enseñado y por el trato personal recibido. A la Universidad de Sevilla, por la ayuda concedida para la realización de esta Tesis Doctoral, a través del V Plan Propio de Investigación. Al Director del Departamento de Química Analítica, D. Fernando de Pablos Pons, por permitirme llevar a cabo este trabajo y facilitarme los medios necesarios para ello. A todos mis compañeros y componentes del Grupo de Investigación, por su eterna disposición y generosidad y por su amistad. A Mercedes, Rut, Manolo, Juan Luis, Noemí, Julia y, en general, a todo el personal del Departamento de Química Analítica, docentes y no docentes, por todos los buenos momentos compartidos y por tenderme la mano siempre que lo he necesitado. A los supervisores de las diferentes estancias realizadas: Proffesor Stig Pedersen-Bjergaard, Dr. Nickolaj J. Petersen y Proffesor Jörg P. Kutter de la Universidad de Copenhague (Dinamarca), y Dr. Pavel Kubáň (Brno, República Checa). Thanks to all of them for giving me the opportunity to work with them and to learn from their experience. A mis amigos químicos, Alejandra, Bea, Patri, Joselu y Jose, y a los no químicos, por estar ahí siempre, por apoyarme y darme ánimos en todo momento y por hacerme reír. Y, por último, a toda mi familia y, en especial, a mis padres y a mi hermana, por su eterna confianza y apoyo. Sin su ayuda, no hubiera sido posible. A todos, muchas gracias. ÍNDICE 7 El objetivo de esta Tesis es el desarrollo de nuevos materiales para su uso como soportes de la membrana líquida en sistemas de extracción por electromembrana, proporcionando alternativas viables a los soportes tradicionalmente usados. Se pretende la obtención de materiales de diferente naturaleza y estructura química para su participación activa en el procedimiento de extracción por electromembrana. Se propone la incorporación a la estructura química del soporte de determinadas especies, como nanopartículas metálicas o ciertos grupos funcionales, a fin de crear interacciones específicas entre el soporte y los analitos que favorezcan, e incluso posibiliten, la extracción de los mismos. Se propone el uso de cuatro materiales de distinta naturaleza y características: films de agar con nanopartículas de plata (AgNPs), tejidos nanoestructurados Tiss®-OH, membranas de inclusión polimérica (PIMs) y membranas de quitosano. Se analizan para ello los diferentes parámetros experimentales que influyen en el proceso de extracción de una serie de analitos seleccionados mediante su posterior determinación por cromatografía líquida de alta resolución con detección ultravioleta. Asimismo, se estudia la aplicabilidad de los métodos propuestos en la determinación de dichos compuestos en matrices biológicas. 9 The main goal of this Thesis is the development of new materials as supports of the liquid membrane in electromembrane extraction systems, providing viable alternatives to traditionally used supports. The aim is to obtain materials of different nature and chemical structure for their active participation in the electromembrane extraction procedure. It is proposed the inclusion of certain species, such as metal nanoparticles or some functional groups, into the chemical structure of the support in order to create specific interactions between the support and the analytes that could favor, and even allow, their extraction. The use of four materials with different nature and characteristics is proposed: agar films with silver nanoparticles (AgNPs), nanostructured tissues Tiss®-OH, polymeric inclusion membranes (PIMs) and chitosan membranes. Different experimental parameters of the extraction process of selected compounds are analyzed and subsequently determined by highperformance liquid chromatography (HPLC) with ultraviolet detection. Additionally, applicability of the proposed methods in the determination of target analytes from biological matrices is studied. CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN 13 1. INTRODUCCIÓN El análisis de compuestos químicos presentes en muestras biológicas o ambientales requiere un procedimiento analítico complejo que implica un paso previo de tratamiento y preparación de la muestra. La etapa de tratamiento de muestra tiene como objetivos, por una parte, minimizar la complejidad de la misma, de manera que sea apta para su análisis mediante la instrumentación analítica habitual, y, por otro lado, eliminar las posibles interferencias presentes en la matriz, favoreciendo así un eficiente “cleanup” [1]. Constituye, por lo general, la etapa más compleja y, en consecuencia, la que mayor tiempo requiere en los procedimientos analíticos. La necesidad de garantizar una recuperación cuantitativa de los analitos o compuestos analizados, evitando pérdidas, así como la naturaleza compleja de la mayoría de matrices biológicas y ambientales, contribuyen a esta consideración. A esto se le suma, además, el elevado consumo de muestra y reactivos, en algunos casos tóxicos, lo que implica que se generen posibles contaminaciones [2, 3]. La mayoría de los avances producidos en la metodología analítica en los últimos años han ido encaminados, por tanto, a solventar en la medida de lo posible estos problemas. En este sentido, la automatización y la miniaturización en la preparación de la muestra constituyen las principales tendencias [4-6]. En el primer caso, el acoplamiento entre la técnica de tratamiento de la muestra y el método de detección posterior permite acelerar el proceso de medida, por lo que se reduce el tiempo de análisis. Asimismo, se incrementan la sensibilidad del método, al minimizar las posibles pérdidas de muestra, y la precisión analítica, al reducir los errores derivados de la manipulación personal. En el caso de la miniaturización, reduciendo la cantidad de muestra se disminuye también el consumo de reactivos y de disolventes caros y tóxicos, contribuyendo así hacia la llamada “Química Verde”. 14 1.1. Técnicas de extracción La mayoría de los procedimientos de tratamiento de muestra generalmente implican una extracción líquido-líquido (liquid-liquid extraction, LLE) o una extracción en fase sólida (solid phase extraction, SPE). La LLE es una de las técnicas convencionales más empleadas tradicionalmente en el tratamiento de muestras líquidas debido a su versatilidad y simplicidad instrumental. Sin embargo, presenta numerosos inconvenientes, como son el elevado tiempo de análisis que requiere, la dificultad de acoplamiento con los equipos de medida analíticos de uso habitual, el elevado consumo de disolventes orgánicos potencialmente peligrosos, lo que supone un grave problema medioambiental, y, en general, una baja selectividad. En la década de los 70, la extracción en fase sólida (SPE) surge como una alternativa a la LLE. La SPE consiste en un cartucho desechable relleno de un material absorbente con el que interaccionan los analitos en función de su afinidad, por lo que podría considerarse una versión miniaturizada de la cromatografía líquida clásica. Supuso un gran avance con respecto a las técnicas empleadas anteriormente, pues entre otras ventajas permitía aumentar la selectividad y las posibilidades de automatización con el uso de una instrumentación sencilla. Sin embargo, entre sus principales limitaciones se encuentra una limitada capacidad de absorción, el desplazamiento del analito y la oclusión del cartucho con el uso de muestras sucias [1-2, 7]. Por otra parte, pese a reducir la cantidad de disolvente orgánico empleado en comparación con la LLE, requiere elevadas cantidades de muestra, lo que supone un problema, por ejemplo, para el análisis de muestras biológicas, donde la cantidad de muestra es muy limitada. Así, con el objetivo de minimizar algunas de estas limitaciones y teniendo en consideración las tendencias de miniaturización, se propusieron una serie de métodos de microextracción como alternativa a los métodos clásicos. En 1990 Arthur y Pawlisyzn [8] desarrollaron latécnica de 15 microextracción en fase sólida (solid phase microextraction, SPME). Desde entonces, esta técnica ha sido aplicada en numerosos campos analíticos, como en análisis medioambientales, alimentarios o bioanálisis, entre otros [9-16]. La SPME se basa en el equilibrio de los analitos presentes en la muestra y una fibra metálica o de sílice fundida recubierta de un material de absorción apropiado [17-19]. Entre los revestimientos más empleados destacan divinilbenceno (DVB), polidimetilsiloxano (PDMS), carboxeno (CAR), polietilenglicol (PEG) y Carbowax (CW) en diferentes espesores y combinaciones, siendo el PDMS el más comúnmente usado [20, 21]. Asimismo, también se han combinado materiales polares y no polares para la separación y enriquecimiento de mezclas de compuestos con un amplio rango de polaridad, como por ejemplo éteres o alcoholes. La SPME es una de las técnicas de preparación de muestras más ampliamente usadas en la separación y/o preconcentración de un amplio rango de analitos con el empleo de una mínima cantidad de disolventes, por lo que puede considerarse una técnica “verde”. Entre sus principales ventajas se encuentran la reducción de los tiempos de análisis, minimizando costes y consumo de disolventes, permite el uso de pequeñas cantidades de muestra y proporciona capacidad de automatización, elevada sensibilidad y facilidad de acoplamiento con diferentes técnicas instrumentales como cromatografía líquida (LC), cromatografía de gases (GC), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) tanto en modo on-line como off-line [17]. Pese a estas ventajas, la SPME presenta algunas limitaciones derivadas de las fibras comerciales, como la escasa selectividad, lo que conduce a un importante efecto matriz y a la presencia de interferencias, la baja estabilidad química, física y térmica, el desprendimiento del revestimiento y un tiempo de vida limitado [19, 20]. Por ello, en los últimos años se han realizado numerosos esfuerzos para desarrollar nuevos materiales que permitan solventar estos problemas, entre los que se incluyen líquidos iónicos (ILs), inmunosorbentes (ISs), nanopartículas metálicas (NPs), silicatos mesoporosos y nanoporosos, 22 Figura 1.3. Esquema del procedimiento de extracción por electromembrana (EME) para la extracción de analitos catiónicos. Esencialmente, el proceso de extracción consiste en que, bajo la influencia del campo eléctrico, los analitos cargados presentes en la muestra migran, atravesando la SLM, hacia el electrodo de carga opuesta localizado en la fase aceptora, donde finalmente quedan atrapados debido a la ionización y a la dirección del campo eléctrico [46]. Por tanto, para que ocurra la migración electrocinética del analito a través de la SLM, éste ha de encontrarse ionizado en ambas fases acuosas, lo cual se consigue mediante el control del pH de ambas disoluciones. La extracción de analitos básicos se lleva a cabo colocando el electrodo positivo en la fase donadora y el negativo en la fase aceptora, por lo que el pH debe tener un valor tal que asegure que los analitos se encuentran cargados positivamente [47-49]. Para analitos ácidos, se invierte la dirección del campo eléctrico, colocando en este caso el electrodo negativo en la fase donadora y el positivo en la aceptora, mientras que el pH debe controlarse para garantizar que los analitos se carguen negativamente [50]. Por tanto, en comparación con los métodos de extracción líquidolíquido (LLE) y extracción en fase sólida (SPE), EME se diferencia 23 fundamentalmente en dos aspectos. Por un lado, implica un consumo mínimo de disolvente orgánico y, por otro, ofrece la posibilidad única de ajustar la selectividad de la extracción. Ésta puede controlarse fácilmente con la fuente de alimentación externa a través de la dirección y la magnitud del potencial eléctrico. Así, la dirección controla si se extraen cationes o aniones, mientras que la magnitud del potencial eléctrico controla el tipo de compuesto que se extrae, esto es, la selectividad. Asimismo, respecto a HFLPME, ofrece una mayor flexibilidad y velocidad, reduciendo notablemente el tiempo de extracción. Además, la selectividad de la extracción también puede manipularse por el tipo de disolvente orgánico usado como membrana líquida soportada [51]. La EME permite obtener extractos limpios a partir de matrices complejas, así como elevadas recuperaciones empleando volúmenes de muestra pequeños. Además, dado que los analitos se extraen en una fase aceptora acuosa, esta técnica es directamente compatible con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía líquidaespectrometría de masas (LC-MS) y electroforesis capilar (CE). La mayoría de los procedimientos EME empleados hasta la fecha emplean la configuración de fibra hueca descrita anteriormente [52]. Asimismo, se han desarrollado diferentes dispositivos entre los que destaca el uso de múltiples fibras huecas (Figura 1.4a) para la extracción exhaustiva de compuestos básicos en matrices biológicas [53] o para la extracción simultánea de compuestos de diferentes características, como cationes y aniones [54], polares y no polares [55] o ácidos y básicos [56]. La configuración de fibra hueca también se ha empleado en la extracción asistida con un capilar de sílice de electroforesis y conectado on-line a un detector UV-Visible (Figura 1.4b), en lo que se conoce como Nano-EME [57]. 24 (a) (b) SLM Figura 1.4. Ejemplos de diferentes dispositivos EME empleados. (a) Múltiples fibras huecas [53]; (b) Nano-EME [57]. Sin embargo, aunque la HF-EME constituya el formato más extendido para procedimientos EME, también se han desarrollado otros dispositivos y modos operacionales. Entre ellos, destaca el uso de membranas planas, lo que supone, desde su introducción en 2008 [58], uno de los principales progresos en el desarrollo de la EME [46]. El uso de membranas planas dio lugar al desarrollo de la microextracción en gota o drop-to-drop EME [59] 25 (Figura 1.5), lo que permitía, por primera vez, disminuir la escala hasta tan solo unos pocos microlitros, favoreciendo así una rápida transferencia de masa sin necesidad de agitación. Esta técnica constituye, además, las bases para el posterior desarrollo de procedimientos EME en dispositivos de microfluídica. Figura 1.5. Esquema se microextracción en gota (drop-to-drop) [59]. Así, en el año 2010, Petersen et al., propusieron por primera vez la incorporación de la EME en dispositivos chip, dando lugar a lo que se conoce actualmente como on-chip EME [60]. Bajo este concepto, la muestra es impulsada hacia el interior de una pequeño canal (50 µm de profundidad) localizado dentro del chip, en el que los analitos son continuamente extraídos a través de la SLM soportada en los poros de una membrana porosa plana hasta el interior de una disolución aceptora situada al otro lado de la membrana. En una primera variante, este sistema empleaba una fase aceptora estática y una fase donadora dinámica (Figura 1.6a), de manera que la muestra se suministraba continuamente, proporcionando una gran eficacia de extracción. Posteriormente, se desarrolló un sistema de doble flujo (Figura 1.6b), donde tanto la fase aceptora como la donadora se bombeaban constantemente hacia el interior del dispositivo chip, acoplado on-line para la detección directa UV/MS del extracto [61]. La posibilidad de 26 renovar las disoluciones donadora y aceptora durante las extracciones, junto con una transferencia de masa más rápida como consecuencia de que las distancias entre los analitos y la SLM son más pequeñas, hacen de los sistemas on-chip EME una importante como técnica de tratamiento de muestra. (a) (b) Figura 1.6. Esquemas de dispositivos on-chip empleados en EME. (a) fase donadora estática [60]; (b) sistema de doble flujo [61]. 27 Los sistemas de microextracción mediante electromembrana se encuentran en permanente revisión y mejora, y el desarrollo de diferentes modalidades de trabajo crece continuamente. Así, entre algunas de ellas, cabe mencionar la extracción por electromembrana usando pulsos de voltaje (pulsed electromembrane extraction, PEME) en lugar de voltaje constante, propuesta para mejorar la estabilidad del sistema y disminuir la resistencia a la transferencia de masa, lo que se traducía en una mejora de la repetibilidad [62]. También se han desarrollado procedimientos EME con voltaje programado (voltage-step pulsed electromembrane extraction, VSPEME) [63], así como manteniendo constante la intensidad de corriente (constant-current electomembrane extraction, CC-EME) [64]. Más recientemente, se han desarrollado sistemas EME basados en un campo eléctrico rotatorio [65], así como en el uso de un electrodo rotatorio en la fase aceptora y electrodos con geometría diversa (Figura 1.7) [66, 67]. Por último, cabe destacar el uso de membranas líquidas libres (free liquid membranes, FLMs) sin inmovilizar en un soporte poroso (Figura 1.8) [68- 70], así como sistemas que permiten la extracción simultánea a través de configuraciones EME acopladas (Figura 1.9) [71-73]. Clásica Hélice Cilíndrica Figura 1.7. Ejemplos de diferente geometría de electrodos [67]. 28 Figura 1.8. Ejemplos de membranas líquidas empleadas en EME [70, 68]. Desde la introducción de EME en 2006, se han investigado y optimizado varios factores que afectan a la extracción y al enriquecimiento de fármacos básicos [74-76] y ácidos [77], se ha mejorado el conocimiento acerca de los parámetros que afectan a la eficiencia de la extracción y se ha desarrollado una importante base teórica para comprender en profundidad dicho proceso. Por tanto, a pesar de ser un procedimiento que se encuentra aún en un estado incipiente de desarrollo, se puede considerar que tiene un futuro prometedor, ya que mantiene las ventajas de la HF-LPME en cuanto a preconcentración y “clean-up”, aportando además una disminución del tiempo de extracción y un importante control en la selectividad de la extracción. 29 Fuente eléctrica Electrodos de platino Fase aceptora Disoluciones tampón Vial de muestra (fase donadora) Agitador magnético Placa de agitación magnética Multímetro Cátodo Ánodo Hilo de Pt Hilo de Pt Hilo de cobre SLMs Imanes 2-Etilhexanol 1-octanol Figura 1.9. Sistemas de electromembrana para la extracción dual simultánea [71-73]. 30 1.2.1. Evaluación del rendimiento de la extracción La eficacia del proceso de extracción se determina en función de la concentración de analito presente en la fase aceptora una vez finalizada la misma. De tal manera que, cuanto mayor sea la concentración de analito en la fase aceptora, mayor es la eficacia del proceso de extracción, para concentraciones iniciales de analito en la fase donadora idénticas. Asimismo, la concentración de analito en la fase aceptora se determina, en este caso, a partir del análisis cromatográfico de los extractos obtenidos. Los parámetros empleados para determinar la eficacia del procedimiento de extracción son el porcentaje de recuperación (%R) y el factor de enriquecimiento (EF). La recuperación se define como la fracción de analito i presente en la muestra que es transferida a la fase aceptora y se calcula, para cada uno de los analitos i, según la siguiente ecuación (Ecuación 1). Ri (%) = 𝑛𝑎𝑖 𝑛𝑠𝑖 · 100% = 𝑉 𝑎 · 𝐶𝑎𝑖 𝑉 𝑠 · 𝐶𝑠𝑖 · 100% (Ecuación 1) donde 𝑛𝑎𝑖 es la cantidad de analito, i, transferida a la fase aceptora y 𝑛𝑠𝑖 es la cantidad de analito, i, presente originalmente en la muestra. Vs y Va son los volúmenes de las fases donadora y aceptora, respectivamente, mientras que 𝐶𝑠𝑖 y 𝐶𝑎𝑖 son las concentraciones de analito, i, presentes en las fases donadora y aceptora, respectivamente. Por otra parte, el factor de enriquecimiento (EFi) para cada analito i se calcula según la siguiente ecuación (Ecuación 2). EFi = 𝐶𝑎𝑖 𝐶𝑠𝑖 = Ri · 𝑉 𝑠 𝑉 𝑎 (Ecuación 2) donde, la concentración de analito i en la fase aceptora, 𝐶𝑎𝑖, se estima a partir las rectas de calibrado obtenidas en los análisis cromatográficos mediante HPLC-UV. 31 1.2.2. Parámetros operacionales que influyen en el procedimiento EME Teniendo en cuenta el fundamento operacional de los procedimientos EME, resulta evidente que la eficacia y rendimiento de los mismos van a verse afectados por numerosos factores. Así, a fin de controlar el flujo de analitos hacia la fase aceptora a través de la membrana líquida, resulta fundamental la elección del pH apropiado, el empleo de un disolvente que sea adecuado para el tipo de analito que se quiere extraer y que, además, permita el paso de la corriente, además de la agitación constante y vigorosa en todo el sistema. Por otro lado, el voltaje aplicado es uno de los parámetros más importantes en la extracción por electromembranas ya que de él va a depender en gran medida la transferencia de masa del analito y la selectividad del sistema. 1.2.2a. Membrana líquida soportada (SLM) La composición de la SLM juega un papel fundamental en la eficacia de extracción, pues los procedimientos EME requieren el uso de un disolvente orgánico apropiado que conduzca la corriente eléctrica. El disolvente orgánico ideal para formar la SLM en procedimientos EME debe ser inmiscible con el agua y tener una cierta hidrofobicidad para evitar fugas hacia las fases aceptora y donadora, además de impregnar por completo el soporte de la membrana. Asimismo, debe ser líquido a temperatura ambiente y de baja viscosidad para proporcionar una rápida transferencia de masa de los analitos, tener una gran capacidad para establecer interacciones moleculares con los analitos (como puentes de hidrógeno o interacciones dipolo-dipolo) que permitan su transferencia hacia la SLM y, finalmente, tener un punto de ebullición suficientemente alto para evitar pérdidas por evaporación del disolvente y mantener la estabilidad del sistema [78]. Las características del disolvente orgánico apropiado dependen también de la naturaleza de los analitos que quieran extraerse y pueden estudiarse en términos de sus parámetros solvatocrómicos de Kamlet y Taft ,  y π [79, 80]. Así, de acuerdo con la literatura, la extracción por 38 [13] J. Li, Y.B. Wang, K.Y. Li, Y.Q. Cao, S. Wu, L. Wu, Advances in different configurations of solid-phase microextraction and their applications in food and environmental analysis, TrAC-Trends Anal. Chem. 72 (2015) 141-152. [14] E.A. Souza-Silva, R. Jiang, A. Rodríguez-Lafuente, E. Gionfriddo, J. Pawliszyn, A critical review of the state of the art of solid-phase microextraction of complex matrices I. Environmental analysis, TrAC-Trends Anal. Chem. 71 (2015) 224-235. [15] E.A. Souza-Silva, E. Gionfriddo, J. Pawliszyn, A critical review of the state of the art of solid-phase microextraction of complex matrices II. Food analysis, TrAC-Trends Anal. Chem. 71 (2015) 249-274. [16] E.A. Souza-Silva, N. Reyes-Garcés, G.A. Gómez-Ríos, E. Boyacı, B.J. Bojko, Pawliszyn, A critical review of the state of the art of solid-phase microextraction of complex matrices III. Bioanalytical and clinical applications, TrAC-Trends Anal. Chem. 71 (2015) 236-248. [17] J. Płotka-Wasylka, N. Szczepańska, M. de la Guardia, J. Namieśnik, Miniaturized solid-phase extraction techniques, TrAC-Trends Anal. Chem.73 (2015) 19–38. [18] J. Namieśnik, A. Spietelun, Ł. Marcinkowski, Green sample preparation techniques for chromatographic determination of small organic compounds, Int. J. Chem. Eng. Appl. 6 (2015) 215–219. [19] A. Amiri, Solid-phase microextraction-based sol-gel technique, TrAC- Trends Anal. Chem. 75 (2016) 57–74. [20] E.A. Souza Silva, S. Risticevic, J. Pawliszyn, Recent trends in SPME concerning sorbent materials, configurations and in vivo applications, TrAC- Trends Anal. Chem. 43 (2013) 24–36. [21] A. Spietelun, M.M. Pilarczyk, A. Kloskowski, J. Namieśnik, Current trends in solid-phase microextraction (SPME) fibrecoatings, Chem. Soc. Rev. 39 (2010) 4524–4537. [22] E. Baltussen, P. Sandra, F. David, C. Cramers, Stir bar sorptive extraction (SBSE), a novel extraction technique for aqueous samples: theory and principles, J. Microcolumn Sep. 11 (1999) 737–747. [23] M.A. Farajzadeh, S.M. Sorouraddin, M.R.A. Mogaddam, Liquid phase microextraction of pesticides: a review on current methods, Microchim. Acta 181 (2014) 829–851. [24] M.A. Jeannot, F.F. Cantwell, Solvent microextraction into a single drop, Anal. Chem. 68 (1996) 2236-2240. 39 [25] M.A. Jeannot, F.F. Cantwell, Mass transfer characteristics of solvent extraction into a single drop at the tip of a syringe needle, Anal. Chem. 69 (1997) 235-239. [26] Y. He, H.K. Lee, Liquid-phase microextraction in a single drop of organic solvent by using conventional microsyringe, Anal. Chem. 69 (1997) 4634- 4640. [27] G. Audunsson, Aqueous/aqueous extraction by means of a liquid membrane for sample cleanup and preconcentration of amines in a flow system, Anal. Chem. 58 (1986) 2714-2723. [28] E. Thordarson, S. Pálmarsdóttir, L. Mathiasson, J. Å. Jönsson, Sample preparation using a miniaturized supported liquid membrane device connected on-line to packed capillary liquid chromatography, Anal. Chem. 68 (1996) 2559-2563. [29] S. Pedersen-Bjergaard, K. E. Rasmussen, Liquid-liquid-liquid microextraction for sample preparation of biological fluids prior to capillary electrophoresis, Anal. Chem. 71 (1999) 2650-2656. [30] M. Asensio-Ramos, L.M. Ravelo-Pérez, M.Á. González-Curbelo, J.Hernández-Borges, Liquid phase microextraction applications in foodanalysis, J. Chromatogr. A 1218 (2011) 7415–7437 [31] T.S. Ho, T.G. Halvorsen, S. Pedersen-Bjergaard, K.E. Rasmussen, Liquid-phase microextraction of hydrophilic drugs by carrier-mediated transport, J. Chromatogr. A 998 (2003) 61-72. [32] P. Wieczorek, J. Å. Jönsson, L. Mathiasson, Concentration of amino acids using supported liquid membranes with di-2-ethylhexyl phosphoric acid as a carrier, Anal. Chim. Acta, 346 (1997) 191-197. [33] C. Fontas, M. Hidalgo, V. Salvado, E. Antico, Selective recovery and preconcentration of mercury with a benzoylthiourea-solid supported liquid membrane system, Anal. Chim. Acta 547 (2005) 255-261. 40 [34] R. Romero, J. Liu, P. Mayer, J.Å. Jönsson, Equilibrium sampling through membranes of freely dissolved copper concentrations with selective hollow fiber membranes and the spectrophotometric detection of a metal stripping agent, Anal. Chem. 77 (2005) 7605-7611. [35] K.E. Kramer, A.R.J. Andrews, Screening method for 11-nor-Δ9- tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid in urine using hollow fiber membrane solvent microextraction with in-tube derivatization, J. Chromatogr. B 760 (2001) 27-36. [36] T.S. Ho, J.L.E. Reubsaet, H.S. Anthonsen, S. Pedersen-Bjergaard, K.E. Rasmussen, Liquid-phase microextraction based on carrier mediated transport combined with liquid chromatography–mass spectrometry: new concept for the determination of polar drugs in a single drop of human plasma, J. Chromatogr. A 1072 (2005) 29-36. [37] S. Pedersen-Bjergaard, K.E. Rasmussen, Electrokinetic migration across artificial liquid membranes, New concept for rapid sample preparation of biological fluids, J. Chromatogr. A 1109 (2006) 183-190. [38] Y. Yamini, A. Pourali, S. Seidi, M. Rezazadeh, Electromembrane extraction followed by high performance liquid chromatography: an efficient method for extraction and determination of morphine, oxymorphone, and methylmorphine from urine samples, Anal. Methods 6 (2014) 5554-5565. [39] C. Huang, K.F. Seip, A. Gjelstad, S. Pedersen-Bjergaard, Electromembrane extraction of polar basic drugs from plasma with pure bis(2-ethylhexyl) phosphite as supported liquid membrane, Anal. Chim. Acta 934 (2016) 80-87. [40] B. Zargar, H. Parham, A. Hatamie, Hollow fiber liquid based microextraction of nalidixic acid in urine samples using Aliquat 336 as a carrier combined with High-Performance Liquid Chromatography, J. Chromatogr. Sci. 54 (2016) 257-263. 41 [41] H.Y. Kim, S.H. Yoon, T.Y. Jeong, S. Yu, S.D. Kim, Determination of conjugated estrogens in human urine using carrier-mediated hollow-fiber liquid phase microextraction and LC-MS/MS, Desalin. Water Treat. 57 (2016) 16024-16033. [42] Y. Wang, Y. Liu, J. Han, L. Wang, T. Chen, L. Ni, Selective extraction and preconcentration of trace lead(II) in medicinal plant-based ionic liquid hollow fiber liquid phase microextraction system using dicyclohexyl-18- crown-6 as membrane carrier, Anal. Methods 7 (2015) 2339–2346. [43] S. Pedersen-Bjergaard, C. Huang, A. Gjelstad, Electromembrane extraction–recent trends and where to go, J. Pharm. Anal. 7 (2017) 141-147. [44] M. Rezaee, Y. Assadi, M.R. Milani Hosseini, E. Aghaee, F. Ahmadia, S. Berijani, Determination of organic compounds in water using dispersive liquid-liquid microextraction, J. Chromatogr. A 1116 (2006) 1-9. [45] R. Costa, Newly introduced sample preparation techniques: towards miniaturization, Crit. Rev. Anal. Chem. 44 (2014) 299-310. [46] C. Huang, Z. Chen, A. Gjelstad, S. Pedersen-Bjergaard, X. Shen, Electromembrane extraction, TrAC-Trends Anal. Chem. 95 (2017) 47-56. [47] I.J.O. Kjelsen, A. Gjelstad, K.E. Rasmussen, S. Pedersen-Bjergaard, Low-voltage electromembrane extraction of basic drugs from biological samples, J. Chromatogr. A 1180 (2008) 1-9. [48] T.M. Middelthon-Bruer, A. Gjelstad, K.E. Rasmussen, S. Pedersen- Bjergaard, Parameters affecting electro membrane extraction of basic drugs, J. Sep. Sci. 31 (2008) 753-759. [49] A. Gjelstad, K.E. Rasmussen, S. Pedersen-Bjergaard, Electromembrane extraction of basic drugs from untreated human plasma and whole blood under physiological pH conditions, Anal. Bioanal. Chem. 393 (2009) 921-928. 42 [50] M. Balchen, A. Gjelstad, K.E. Rasmussen, S. Pedersen-Bjergaard, Electrokinetic migration of acidic drugs across a supported liquid membrane, J. Chromatogr. A 1152 (2007) 220-225. [51] A. Gjelstad, S. Pedersen-Bjergaard, Recent developments in electromembrane extraction, Anal. Methods 5 (2013) 4549-4557. [52] M. Rezazadeh, Y. Yamini, S. Seidi, Electrically stimulated liquid-based extraction techniques in bioanalysis, Bioanalysis 8 (2016) 815-828. [53] L.E.E. Eibak, A. Gjelstad, K.E. Rasmussen, S. Pedersen-Bjergaard, Exhaustive electromembrane extraction of some basic drugs from human plasma followed by liquid chromatographyemass spectrometry, J. Pharm. Biomed. Anal. 57 (2012) 33-38. [54] S. Seidi, Y. Yamini, M. Rezazadeh, A. Esrafili, Low-voltage electrically enhanced microextraction as a novel technique for simultaneous extraction of acidic and basic drugs from biological fluids, J. Chromatogr. A 1243 (2012) 6-13. [55] L. Arjomandi-Behzad, Y. Yamini, M. Rezazadeh, Pulsed electromembrane method for simultaneous extraction of drugs with different properties, Anal. Biochem. 438 (2013) 136-143. [56] M.H. Koruni, H. Tabani, H. Gharari, A.R. Fakhari, An all-in-one electromembrane extraction: development of an electro-membrane extraction method for the simultaneous extraction of acidic and basic drugs with a wide range of polarities, J. Chromatogr. A 1361 (2014) 95-99. [57] M. Ramos-Payán, B. Li, N.J. Petersen, H. Jensen, S.H. Hansen, S. Pedersen-Bjergaard, Nano-electromembrane extraction, Anal. Chim. Acta 785 (2013) 60-66. [58] L. Xu, P.C. Hauser, H.K. Lee, Electro membrane isolation of nerve agent degradation products across a supported liquid membrane followed by capillary electrophoresis with contactless conductivity detection, J. Chromatogr. A 1214 (2008) 17-22. 43 [59] N.J. Petersen, H. Jensen, S.H. Hansen, K.E. Rasmussen, S. Pedersen- Bjergaard, Drop-to-drop microextraction across a supported liquid membrane by an electrical field under stagnant conditions, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 1496-1502. [60] N.J. Petersen, H. Jensen, S.H. Hansen, S.T. Foss, D. Snakenborg, S. Pedersen- Bjergaard, On-chip electro membrane extraction, Microfluid. Nanofluid. 9 (2010) 881-888. [61] N.J. Petersen, S.T. Foss, H. Jensen, S.H. Hansen, C. Skonberg, D. Snakenborg, J.K. Kutter, S. Pedersen-Bjergaard, On-chip electro membrane extraction with online ultraviolet and mass spectrometric detection, Anal.Chem. 83 (2011) 44-51. [62] M. Rezazadeh, Y. Yamini, S. Seidi, A. Esrafili, Pulsed electromembrane extraction: a new concept of electrically enhanced extraction, J. Chromatogr. A 1262 (2012) 214-218. [63] M. Rezazadeh, Y. Yamini, S. Seidi, L. Arjomandi-Behzad, Voltage-step pulsed electromembrane as a novel view of electrical field-induced liquidphase microextraction, J. Chromatogr. A 1324 (2014) 21-28. [64] A. Slampova, P. Kuban, P. Bocek, Electromembrane extraction using stabilized constant d.c. electric current e a simple tool for improvement of extraction performance, J. Chromatogr. A 1234 (2012) 32-37. [65] S.S. Hosseiny Davarani, H.R. Moazami, E. Memarian, S. Nojavan, Electromembrane extraction through a virtually rotating supported liquid membrane, Electrophoresis 37 (2016) 339-346. [66] S. Asadi, H. Tabani, K. Khodaei, F. Asadian, S. Nojavan, Rotating electrode in electro membrane extraction: a new and efficient methodology to increase analyte mass transfer, RSC Adv. 6 (2016) 101869-101879. [67] H.R. Moazami, S.S. Hosseiny Davarani, J. Mohammadi, S. Nojavan, M. Abrari, The effect of electric field geometry on the performance of 44 electromembrane extraction systems: footprints of a third driving force along with migration and diffusion, Anal. Chim. Acta 891 (2015) 151-159. [68] P. Kuban, P. Bocek, Preconcentration in micro-electromembrane extraction across free liquid membranes, Anal. Chim. Acta 848 (2014) 43-50. [69] P. Kuban, K.F. Seip, A. Gjelstad, S. Pedersen-Bjergaard, Microelectromembrane extraction using multiple free liquid membranes and acceptor solutions - Towards selective extractions of analytes based on their acid-base strength, Anal. Chim. Acta 943 (2016) 64-73. [70] P. Kuban, P. Bocek, Simultaneous micro-electromembrane extractions of anions and cations using multiple free liquid membranes and acceptor solutions, Anal. Chim. Acta 908 (2016) 113–120. [71] C. Basheer, J. Lee, S. Pedersen-Bjergaard, K.E. Rasmussen, H.K. Lee, Simultaneous extraction of acidic and basic drugs at neutral sample pH: A novel electro-mediated microextraction approach, J. Chromatogr. A 1217 (2010) 6661-6667. [72] S. Nojavan, S. Asadi, Electromembrane extraction using two separate cells: A new design for simultaneous extraction of acidic and basic compounds, Electrophoresis 37 (2016) 587-594. [73] S. Asadi, S. Nojavan, Two-step voltage dual electromembrane extraction: A new approach to simultaneous extraction of acidic and basic drugs, Anal. Chim. Acta 923 (2016) 24-32. [74] A. Gjelsad, S. Andersen, K.E. Rasmussen, S. Pedersen-Bjergaard, Microextraction across supported liquid membranes forced by pH gradients and electrical fields, J. Chromatogr. A 1157 (2007) 38-45. [75] A. Gjelstad, K.E. Rasmussen, S. Pedersen-Bjergaard, Electrokinetic migration across artificial liquid membranes Tuning the membrane chemistry to different types of drug substances, J. Chromatogr. A 1124 (2006) 29-34. 45 [76] A. Gjelstad, K.E. Rasmussen, S. Pedersen-Bjergaard, Simulation of flux during electro-membrane extraction based on the Nernst-Planck equation, J. Chromatogr. A 1174 (2007) 104-111. [77] J. Peng, J. Liu, X. Hu, G. Jiang, Direct determination of chlorophenols in environmental water samples by hollow fiber supported ionic liquid membrane extraction coupled with high-performance liquid chromatography, J. Chromatogr. A 1139 (2007) 165-170. [78] C. Huang, A. Gjelstad, S. Pedersen-Bjergaard, Organic solvents in electromembrane extraction: recent insights, Rev. Anal. Chem. 35 (2016) 169-183. [79] R.W. Taft, M.J. Kamlet, The solvatochromic comparison method. 2. The alpha-scale of solvent hydrogen-bond donor (HBD) acidities, J. Am. Chem. Soc. 98 (1976) 2886-2894. [80] A. de Juan, G. Fonrodona, E. Casassas, Solvent classification based on solvatochromic parameters: a comparison with the Snyder approach, TrAC- Trends Anal. Chem. 16 (1997) 52-62. [81] Y. Yamini, S. Seidi, M. Rezazadeh, Electrical field-induced extraction and separation techniques: promising trends in analytical chemistry-a review, Anal. Chim. Acta 814 (2014) 1-22. [82] C. Huang, A. Gjelstad, K.F. Seip, H. Jensen, S. Pedersen-Bjergaard, Exhaustive and stable electromembrane extraction of acidic drugs from human plasma, J. Chromatogr. A 1425 (2015) 81-87. [83] Y.A. Asl, Y. Yamini, S. Seidi, M. Rezazadeh, Simultaneous extraction of acidic and basic drugs via on-chip electromembrane extraction, Anal. Chim. Acta 937 (2016) 61-68. [84] C. Huang, H. Jensen, K.F. Seip, A. Gjelstad, S. Pedersen-Bjergaard, Mass transfer in electromembrane extraction – the link between theory and experiments, J. Sep. Sci. 39 (2016) 188-197. 46 [85] A. Šlampová, P. Kubáň, P. Boček, Additional considerations on electrolysis in electromembrane extraction, J. Chromatogr. A 1429 (2016) 364-368. [86] P. Kubáň, P. Boček, The effects of electrolysis on operational solutions in electromembrane extractions: the role of acceptor solution, J. Chromatogr. A 1398 (2015) 11-19. [87] M.A. Bello-López, M. Ramos-Payán, J.A. Ocaña-González, R. Fernández-Torres, M. Callejón-Mochón, Analytical applications of hollow fiber liquid phase microextraction (HF-LPME): a review, Anal. Lett. 45 (2012) 804-830. [88] A. Gjelstad, S. Pedersen-Bjergaard, Recent developments in electromembrane extraction, Anal. Methods 5 (2013) 4549-4557. [89] V.K. Marothu, M. Gorrepati, R. Vusa, Electromembrane extraction – a novel extraction technique for pharmaceutical, chemical clinical and environmental analysis, J. Chromatogr. Sci. 51 (2013) 619-631. [90] M. Ramos-Payán, M.A. Bello-López, R. Fernández-Torres, M. Villar- Navarro, M. Callejón-Mochón, Electromembrane extraction (EME) and HPLC determination of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in wastewater samples, Talanta 85 (2011) 394-399. [91] M. Ramos-Payán, M. Villar-Navarro, R. Fernández-Torres, M. Callejón- Mochón, M.A. Bello-López, Electromembrane extraction (EME)—an easy, novel and rapid extraction procedure for the HPLC determination of fluoroquinolones in wastewater samples, Anal. Bioanal. Chem. 405 (2013) 2575-2584. [92] Y. Li, Y. Xiong, J. Fang, L. Wang, Q. Liang, Application of hollow fiber liquid-phase microextraction in identification of oil spill sources, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 6155-6161. [93] S. Cui, S. Tan, G. Ouyang, J. Pawliszyn, Automated polyvinylidene difluoride hollow fiber liquid-phase microextraction of flunitrazepam in 47 plasma and urine samples for gas chromatography/tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 2241-2247. [94] X. Wang, J. Liu, Y. Wang, X. Zhao, L. Gao, D. Xu, Hollow fiber liquid phase microextraction of tramadol from water and biological samples, Sepu 24 (2006) 641-644. [95] Y. Zhu, X. Chen, F. Zheng, X. Bai, Application of three-phase hollow fiber liquid-phase microextraction for analysis of hydroxybenzoic acids, Sepu 27 (2009) 769-775. [96] J.F. Peng, J.X. Lu, X.L. Hu, J.F. Liu, G.B. Jiang, Determination of atrazine, desethyl atrazine and desisopropyl atrazine in environmental water samples using hollow fiber-protected liquid-phase microextraction and high performance liquid chromatography, Microchim. Acta 158 (2007) 181-186. [97] J. Lee, F. Khalilian, H. Bagheri, H.K. Lee, Optimization of some experimental parameters in the electro membrane extraction of chlorophenols from seawater, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 7687-7693. [98] M. Ramos-Payán, H. Jensen, N.J. Petersen, S.H. Hansen, S. Pedersen- Bjergaard, Liquid-phase microextraction in a microfluidic-chip – high enrichment and sample clean-up from small sample volumes based on threephase extraction, Anal. Chim. Acta 735 (2012) 46-53. [99] N.J. Petersen, J.S. Pedersen, N.N. Poulsen, H. Jensen, C. Skonberg, S.H. Hansen, S. Pedersen-Bjergaard, On-chip electromembrane extraction for monitoring drug metabolism in real time by electrospray ionization mass spectrometry, Analyst 137 (2012) 3321-3327. [100] M. Ramos-Payán, R. Fernández-Torres, J.L. Pérez-Bernal, M. Callejón-Mochón, M.A. Bello-López, A novel approach for electromembrane extraction based on the use of silver nanometallic-decorated hollow fibers, Anal. Chim. Acta 849 (2014) 7-11. [101] K.S. Hasheminasab, A.R. Fakhari, A. Shahsavani, H. Ahmar, A new method for the enhancement of electromembrane extraction efficiency using 54 elasticidad, claridad y estabilidad, lo que impide que las bacterias patógenas puedan digerirlo. En la industria alimentaria, se emplea como aditivo alimentario por tratarse de un espesante natural no tóxico, sin ningún sabor y no degradable por ácidos o enzimas proteolíticas presentes en algunas frutas, como en la piña. La capacidad espesante del agar se debe a su poder para hacer que los líquidos se vuelvan más viscosos, produciendo así un efecto gelificante. Estas características lo hacen muy apropiado en la fabricación de conservas de pescado y carne, proporcionándoles una mejor textura. Además, proporciona una capa protectora que impide que los alimentos entren en contacto con las paredes metálicas del interior de los envases, evitando que se dañe su conservación. En el sector de las bebidas, se emplea para purificar y aclarar los líquidos al conseguir que las impurezas se depositen en el fondo. Asimismo, se emplea como estabilizante en sopas, helados o productos lácteos, entre otros. Por otra parte, encuentra utilidad como laxante gracias a su capacidad de absorber agua y, en consecuencia, aumentar de volumen, lo cual estimula el peristaltismo del intestino, evitando así el estreñimiento. Asimismo, el agar constituye una matriz de gel ideal para la difusión y el movimiento electrocinético de biopolímeros, además de ser biológicamente inerte y tener propiedades iónicas controladas, por lo que es ampliamente utilizado en biomedicina y biotecnología en técnicas de difusión e inmunodifusión, electroforesis capilar, cromatografía en gel, cromatografía de intercambio iónico y de afinidad o en bioingeniería [3]. Los medios electroforéticos en gel de agar se han utilizado durante muchos años para separar e identificar proteínas del suero y del líquido cefalorraquídeo y otras mezclas biológicas, facilitando el diagnóstico de determinadas enfermedades. Las aplicaciones de separación electroforética usando geles de agar incluyen ácidos nucleicos, lipoproteínas, isoenzimas de deshidrogenasa láctica, glicoproteínas, heparina, proteínas bacterianas, etc. 55 En cromatografía, son ampliamente usadas columnas de partículas de gel de agarosa, comercializadas bajo los nombres Sepharose® y Bio-Gel® A, como medios para la separación de moléculas de elevado peso molecular, así como para la separación de mezclas artificiales de proteínas y virus. Por su parte, la aplicación del agar en inmunología es extensa e incluye técnicas como la difusión en gel de agarosa, inmunodifusión radial, inmunoelectroforesis, o electroinmunoensayo, entre otras. Por último, la agarosa juega un papel importante como vehículo biológicamente inerte al que se enlazan o se introducen enzimas o células, bien durante la formación del gel o por difusión y posterior insolubilización. Así, se emplean perlas de agarosa como bioconversores para transformar un producto químico en otro. Por tanto, el elevado poder de gelificación en medio acuoso, junto con su estabilidad térmica y frente al pH, hacen del agar un polisacárido con numerosas ventajas. Si un gel de agar sufre una evaporación lenta del disolvente, se pueden generar películas de espesor controlable en función de la cantidad añadida. Estos films de agar son híbridos entre xerogel y aerogel, ya que mantiene una fracción de la estructura tridimensional del sol-gel de partida al ser secado a temperatura ambiente, produciéndose una importante contracción de la estructura. Asimismo, ha de considerarse la existencia de grupos polares en la estructura del xerogel/aerogel debidos a la agaropectina, pudiendo exhibir una funcionalidad química de la que carecen los soportes tradicionales de polipropileno. Adicionalmente, es posible sintetizar directamente nanopartículas de plata (AgNPs) en un gel de agar [4-6], por lo que podría ser posible obtener un film que las contuviese. 56 2.1.2. Nanopartículas de plata Actualmente, el interés sobre especies químicas de tamaño nanométrico es una de las áreas de trabajo más importantes de la investigación en química debido, fundamentalmente, a la gran variedad de nuevas propiedades y potenciales aplicaciones que se pueden explotar en diversos campos. En este sentido, una de las unidades básicas de construcción para diversas aplicaciones de la nanotecnología la constituyen las nanopartículas [7]. En los últimos años, las nanoestructuras y nanopartículas han adquirido un interés creciente en el campo de la Química Analítica debido a su particular comportamiento, siendo ampliamente empleadas para aumentar la sensibilidad o selectividad de ciertos procedimientos analíticos. Así, se han descrito aplicaciones analíticas de dispositivos de análisis de tamaño nanométrico, como polímeros de impresión molecular [8], disolventes supramoleculares (líquidos nanoestructurados) [9, 10], nanotubos de carbono [11, 12] y todo tipo de membranas nanoestructuradas [13], entre otros. Las nanopartículas (NP) son partículas más grandes que los átomos y las moléculas que no obedecen a la química cuántica, ni a las leyes de la física clásica, poseyendo características propias. No existe una definición única de nanopartícula aunque la mayoría de autores piensan que son porciones de materia diferenciadas del medio donde se encuentran y cuya longitud, al menos en una de sus dimensiones está entre 1 y 100 nanómetros [14]. Dentro de este rango los materiales pueden tener propiedades muy diferentes, tanto por un aumento sustancial de la superficie en relación con la masa, como por los efectos cuánticos que tienen lugar en esas dimensiones, lo que lleva a cambios significativos en las propiedades físicas. Una de las características de las NP es que la relación entre el número de átomos superficiales y el tamaño de la partícula es de carácter 57 exponencial. En los sistemas nanométricos, las superficies pasan a jugar un papel más importante que el que tenían en los sistemas macroscópicos. Por ello, propiedades relacionadas con la superficie, como las eléctricas, mecánicas, magnéticas, ópticas o químicas son diferentes a las de los mismos materiales a escala no nanométrica [14]. Estas propiedades, están directamente relacionadas con el tamaño y la forma de las nanopartículas, características que, por lo general, se controlan a través del método de preparación. Así, se pueden obtener nanopartículas de muy diversas formas y tamaños, como, por ejemplo, NPs esféricas, nanocables, nanoprismas o nanocubos, entre otras [15, 16]. Es difícil encontrar una única clasificación de las nanopartículas ya que éstas se pueden clasificar atendiendo a un gran número de factores, entre los que cabe destacar su naturaleza química, la morfología, el medio donde se encuentran dispersas, el estado de dispersión y las modificaciones superficiales que puedan tener. Una clasificación muy general de las nanopartículas es la basada en su origen, donde se pueden encontrar tres grandes categorías. Así, se diferencia entre las nanopartículas de origen natural (biológico, mineral o ambiental), antropogénicas (producidas de forma involuntaria como consecuencia de la actividad humana) y artificiales o manufacturadas (obtenidas deliberadamente mediante las llamadas nanotecnologías). Estas últimas, a su vez, se pueden clasificar según su composición, diferenciándose nanopartículas de carbono, metálicas, dendrímeros y nanocomposites. De todas las nanopartículas, las basadas en metales o en óxidos metálicos muestran, entre otras, interesantes propiedades biológicas, ópticas, magnéticas, electrónicas y catalíticas, relacionadas, en general, con su tamaño y forma y que pueden ser interesantes desde el punto de vista de su aplicación práctica [7]. 58 En los últimos años, la plata ha ganado mucho interés debido a su gran estabilidad química, excelente conductividad eléctrica y a su actividad catalítica y antibacteriana [17]. Debido a ello, las nanopartículas de plata (AgNPs) constituyen en la actualidad uno de los nanomateriales más empleados en la industria, presente en al menos 600 productos de consumo, desde textiles o electrodomésticos a bactericidas [18]. Se utilizan en electrónica, ropa, pinturas, cosméticos, bactericidas, biofungicidas, aplicaciones biomédicas, así como en la industria médico-farmacéutica y alimentaria [17]. Así, en el contexto del gran desarrollo que ha experimentado la nanociencia y la nanotecnología en los últimos años, se han desarrollado diferentes métodos físicos y químicos para la obtención de nanopartículas de plata, la mayoría de ellos basados en reacciones de reducción de sales metálicas de plata (I) [7]. Una de las propiedades más importantes de las nanopartículas de plata es su actividad antibacteriana, razón por la que encuentra aplicación en numerosos dispositivos empleados en el ámbito médico. Por otra parte, se ha demostrado que muestran una gran capacidad para controlar procesos inflamatorios, además de emplearse como agente cicatrizante. Asimismo, las nanopartículas de plata se han incorporado también en la industria textil y en el sector alimentario, así como en consumibles diarios o electrodomésticos [7, 17]. Las nanopartículas de plata presentan una elevada conductividad eléctrica, además de propiedades ópticas extraordinarias que permiten variar las propiedades ópticas de otros materiales. Mencionar, por último, una característica importante que presentan las nanopartículas: la posibilidad de ser modificadas superficialmente con objeto de obtener nanopartículas funcionalizadas con moléculas útiles a la aplicación para las que se han diseñado. Las modificaciones más comunes suelen consistir en la adsorción de tensioactivos o ligandos cargados, polímeros, tanto sintéticos como naturales, antígenos, etc. Esta característica pudiera ser de 59 gran valor en técnicas analíticas de extracción, ya que permitiría obtener soportes más selectivos y específicos para determinados analitos, facilitando así la extracción de los mismos en presencia de otros. 2.1.3. Soporte estudiado En este capítulo se proponen como soportes de la membrana líquida en procedimientos EME, films de agar con nanopartículas de plata generadas in situ durante la fabricación del gel. De esta manera, la inclusión de nanopartículas metálicas en los soportes empleados en EME está orientada, por una parte, al aprovechamiento de sus propiedades electrónicas para homogeneizar e incrementar el campo eléctrico a través del soporte de la membrana líquida que, como ya se ha indicado, presenta, en general, muy baja conductividad eléctrica. Por otra parte, se pretende hacer uso de ciertas propiedades como, por ejemplo, la capacidad de las nanopartículas metálicas de interaccionar con determinados grupos funcionales como tioles o aminas. La combinación de films de agar, un material estable y de fácil preparación, con nanopartículas metálicas pretende dar lugar a un nuevo soporte para sistemas EME que proporcione una ventaja primordial, la mejora de la conductividad eléctrica del sistema, lo que se traduce en un aumento del rendimiento del proceso de extracción. 2.2. SÍNTESIS Los films de agar con nanopartículas de plata (AgNPs) se prepararon siguiendo el método propuesto por Muthuswamy [19]. De este modo, la síntesis se llevó a cabo disolviendo 0,5 g de agar-agar en 50 ml de agua ultrapura en ebullición y agitación. Seguidamente, esta mezcla se dejó enfriar hasta 50ºC y se añadieron 30 ml de etanol y 0,05 g de polivinilpirrolidona (PVP) con agitación constante. Por otro lado, se pesaron cantidades variables de AgNO3 (0,043, 0,085 y 0,107 g) que se disolvieron 60 en 10 ml de agua ultrapura y se adicionaron gota a gota a la disolución anterior. Por último, la disolución resultante se calentó a reflujo durante 2 horas a 90ºC en ausencia de luz. Transcurrido dicho periodo de tiempo, la disolución adquiere un color amarillo como consecuencia de las AgNPs formadas, cuya reducción completa se asegura por el exceso de polivinilpirrolidona (PVP), que actúa como agente reductor. Haciendo uso de esta síntesis, se prepararon diferentes membranas de agar con características variables. Para ello, se vertieron distintos volúmenes de la disolución anterior en placas Petri de 8 cm de diámetro, que se almacenaron posteriormente en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que el producto obtenido estuviera completamente seco y pudiera despegarse como una película independiente (unos 3-4 días). Siguiendo este procedimiento se prepararon un total de 12 films de diferente espesor y contenido en plata. El espesor del film se controló con el volumen de disolución vertido en la placa Petri, de manera que, para volúmenes de 5, 10, 20 y 30 ml se obtuvieron films de 20, 25, 30 y 35 μm de espesor, respectivamente, medidos posteriormente por microscopía óptica. Asimismo, el contenido en plata se controló por la cantidad de AgNO3 añadida, de manera que para 0,043, 0,085 y 0,107 g de AgNO3, se obtuvieron membranas con un contenido en plata de 55,0, 107,9 y 215,9 mg de Ag/g de agar, respectivamente. Por tanto, como resultado de combinar cada una de las cantidades de AgNO3 pesadas con los distintos volúmenes vertidos en las placas de Petri, se obtienen un total de 12 films con características variables. 2.3. CARACTERIZACIÓN Las nanopartículas de plata generadas "in situ" en los films sintetizados se caracterizaron por Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM). El estudio se llevó a cabo sumergiendo una rejilla de cobre recubierta con una película de carbono en la disolución que contiene las AgNPs durante 1 minuto. Posteriormente, la rejilla se dejó secar durante varias 61 horas en oscuridad y a temperatura ambiente. El análisis de TEM se llevó a cabo con un microscopio electrónico de transmisión Hitachi CM 200 funcionando a 200 KV del servicio de Microscopía del Centro de Investigación, Tecnología e Innovación de la Universidad de Sevilla (CITIUS). La Figura 2.2 muestra las imágenes de TEM para los tres films nanometálicos analizados, todos ellos con un espesor de 20 µm. Puede observarse que en los films con un contenido de 55,0 mg Ag/g de agar (Figura 2.2a), las AgNPs tienen una forma cónica y algunas de ellas parecen estar agrupadas formando aglomerados de alrededor de 50-60 nm. Por otro lado, las AgNPs presentes en los films con un contenido de 107,9 mg de Ag/g de agar (Figura 2.2b) tienen una forma esférica y bien definida, así como un tamaño más pequeño, alrededor de 20-30 nm, sin formar aglomerados. En el caso de los films que contienen 215,9 mg de Ag/g de agar (Figura 2.2c) se observa claramente que las AgNPs son más grandes (alrededor de 60 nm) y prácticamente todas están formando aglomerados. a) AgNPs en el film con 55,0 mg Ag/g agar b) AgNPs en el film con 107,9 mg Ag/g agar c) AgNPs en el film con 215,9 mg Ag/g agar Figura 2.2. Imágenes TEM de los films nanometálicos en función de su diferente contenido en plata. 62 Por otra parte, se obtuvieron los mapas de conductividad de las films nanometálicos mediante Microscopía de Fuerza Atómica, empleándose para estas mediciones un Microscopio de Fuerza Atómica CSI Nano- Observer (Scientec Ibérica SL, Madrid, España) en el modo conductor (C- AFM). En los mapas de conductividad obtenidos en un escáner de 2 μm (Figura 2.3a), se observan regiones de alta conductividad en las zonas donde hay AgNPs presentes, mientras que no se obtiene conductividad en las regiones sin partículas nanometálicas (Figura 2.3b). Asimismo, la anchura de los picos de conductividad es compatible con el tamaño de las AgNPs obtenido a partir de estudios TEM. (b) (a) Figura 2.3. Caracterización del film nanometálico por Microscopía de Fuerza Atómica. La caracterización de los films mediante microscopía electrónica revela, en primer lugar, que la cantidad de AgNO3 añadida durante la síntesis determina no sólo el tamaño de las nanopartículas de plata generadas, sino también la forma de las mismas y que, un aumento de la cantidad de AgNO3 no conduce necesariamente a la formación de un número superior de nanopartículas, ya que en este caso, como se ha comprobado, se forman aglomerados de mayor tamaño. En sentido opuesto, una menor cantidad de AgNO3 tampoco excluye la formación de aglomerados, de hecho, únicamente los films con un contenido medio de plata (107,9 mg de Ag/g de agar) presentan nanopartículas de plata aisladas y bien definidas. 63 Asimismo, los mapas de conductividad evidencian que la presencia de AgNPs en los films de agar es fundamental para obtener zonas de elevada conductividad, puesto que en las regiones donde no existen AgNPs no se observa conductividad alguna. 2.4. ESTABILIDAD Para llevar a cabo el estudio de la estabilidad de los films nanometálicos, éstos se sometieron a diferentes condiciones de luz y temperatura. Así, se analizó la estabilidad de los films a temperaturas de - 18ºC, -5ºC, 5ºC, 20ºC y 35ºC durante 24-48 horas, observándose que los films conservados a -18ºC y -5ºC no podían utilizarse para el procedimiento de EME debido a que el proceso de descongelación afectaba a las características mecánicas de la membrana de una manera irreversible, produciéndose la desagregación y ruptura de la misma. En cambio, los films conservados a temperaturas entre 5ºC y 35ºC si resultaban útiles para el procedimiento de extracción. Por otra parte, para analizar la estabilidad frente a la luz, los films fueron expuestos a la luz del día y conservados en la oscuridad. Se observó que los films sometidos a la exposición de la luz durante un período de tiempo de cuatro días experimentaban un proceso de metalización, adquiriendo una apariencia de espejo, no siendo efectivos para ser empleados en el procedimiento EME. Por el contrario, se observó que aquellos que se conservaron en la oscuridad eran óptimos para el procedimiento de extracción y se podían utilizar hasta tres meses después de su síntesis. Los estudios de estabilidad manifiestan, por tanto, que temperaturas muy bajas (por debajo de 5ºC) así como la exposición a la luz solar, afectan a las propiedades de los films, impidiendo, por tanto, su uso en sistemas EME. En consecuencia, las condiciones apropiadas de conservación de los 70 En la Figura 2.5, se muestra el cromatograma obtenido haciendo uso del método de separación anterior. SAL 2,146 IBU 9,010 NAX 5,811 DIC 8,833 KTP 5,533 Figura 2.5. Cromatograma de los AINEs estudiados. Las longitudes de onda empleadas para la detección de los AINEs estudiados se seleccionaron en función de los espectros de absorción correspondientes. Para ello, se empleó un espectrofotómetro de absorción Thermo Spectronic UNICAM UV 500 (Cambridge, Reino Unido). Los espectros de absorción obtenidos para cada uno de los compuestos se representan en la Figura 2.6. (a) SAL 71 (b) KTP (c) NAX (d) DIC (e) IBU Figura 2.6. Espectros de absorción de los AINEs estudiados. (a) ácido salicílico (SAL), (b) ketoprofeno (KTP), (c) naproxeno (NAX), (d) diclofenaco (DIC), (e) ibuprofeno (IBU). 72 A partir de los espectros obtenidos, se seleccionaron las longitudes de máxima absorbancia de cada fármaco en la detección de los mismos, siendo 235 nm para SAL, 255 nm para KTP, 230 nm para NAX, 280 nm para DIC y 224 nm para IBU. 2.8. RESULTADOS 2.8.1. Ensayos preliminares Se realizaron una serie de ensayos previos en los que se analizó la influencia que tienen en el proceso de extracción factores como el tipo de disolvente orgánico empleado, la presencia o ausencia de nanopartículas de plata en los films de agar o la existencia de campo eléctrico. Estos ensayos preliminares se llevaron a cabo empleando como fase donadora disoluciones acuosas de 4 µg mL-1 en cada AINE seleccionado, films de 25 µm de espesor y un contenido en plata de 107,9 mg Ag/g de agar como soporte de la membrana líquida y aplicando unas condiciones de extracción de 50 V durante 40 minutos. Asimismo, se emplearon dihexiléter y 1-octanol como disolventes orgánicos soportados. Como se ha demostrado previamente para los procedimientos de microextracción en fase líquida (LPME) y extracción por electromembrana (EME) [25, 26], la eficiencia de la extracción aumenta con la velocidad de agitación siempre que no implique la formación de vórtices en la disolución donadora. Por este motivo, se fijó una velocidad de agitación de 600 rpm en todos los ensayos. En un trabajo previo realizado en el seno del Grupo de Investigación donde se desarrolla esta Tesis, el disolvente orgánico seleccionado para un procedimiento anterior usando como soporte fibras huecas de polipropileno (HF-LPME) fue el dihexiléter [26]. Sin embargo, su empleo en EME no resultaba factible al interrumpirse la corriente eléctrica, imposibilitando, por tanto, la realización del proceso de extracción, motivo por el cual fue 73 reemplazado por 1-octanol [25]. En este caso, en cambio, los films nanometálicos permiten el uso de ambos disolventes, observándose mejores resultados con dihexiléter. Asimismo, se aplicaron las condiciones antes descritas en el proceso de extracción empleando films de agar sin AgNPs. Para la realización de este ensayo, se prepararon films de agar de diferentes espesores siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 2.5, a excepción de la etapa correspondiente a la adición de AgNO3. En estas condiciones, como puede verse en la Tabla 2.3, los compuestos se extraían pero con factores de enriquecimiento muy bajos, con valores máximos comprendidos entre 0,5 y 0,9, para el film de menor espesor (20 µm), lo que evidencia la mejora que se produce por la presencia de AgNPs. Adicionalmente, se ensayó el film nanometálico en ausencia de campo eléctrico (en condiciones de LPME), observándose en este caso que tras 40 minutos de extracción con agitación a 600 rpm, no se producía la extracción de ningún analito. Los resultados derivados de estos ensayos previos indicaban, en primer lugar, que la ausencia de AgNPs en el film de agar conduce a rendimientos de extracción mucho menores que los obtenidos al emplear films conteniendo AgNPs. Asimismo, los ensayos revelaban que el empleo de films de agar con AgNPs en procesos de microextracción en fase líquida en ausencia de campo eléctrico no conduce a la extracción de los compuestos estudiados. Una vez realizados los ensayos preliminares y, teniendo en cuenta las observaciones extraídas durante los mismos, se procedió a optimizar el procedimiento de extracción por electromembrana evaluando la influencia del pH, el espesor de la membrana, el tamaño de las nanopartículas y el tiempo y voltaje aplicados en el proceso de extracción. 74 2.8.2. Influencia del pH de las fases donadora y aceptora Como ya se ha indicado anteriormente, la elección adecuada del pH es un aspecto importante a tener en cuenta ya que de él va a depender, en gran parte, el flujo de analitos a través de la membrana líquida. Así, con objeto de evaluar la influencia del pH en el procedimiento de extracción, se llevaron a cabo diferentes ensayos en los que se ajustó el pH de las fases donadora y aceptora en el rango 1-12. En la Figura 2.7 se muestran los resultados obtenidos al variar el pH de la fase donadora, manteniendo la composición de la fase aceptora constante (agua ultrapura). Figura 2.7. Influencia del pH de la fase donadora en la eficacia del proceso EME. Puede observarse, en primer lugar, que no aparecen resultados para un valor de pH 1, lo cual se debe a que, a dicho pH, los films de agar se rompían, imposibilitando llevar a cabo el procedimiento de extracción. En el rango de pH de 2 a 3, los factores de enriquecimiento que se obtienen son muy bajos (inferiores a 2), siendo ligeramente superiores para pH 3. 0 3 6 9 12 15 pH 2 pH 3 pH 4 pH 5 Factores de enriquecimiento, Ef SAC KTP NAX DIC IBU pH 5-12 75 Como se puede observar, la eficacia de la extracción aumenta considerablemente a pH 4 y 5, alcanzándose los mayores factores de enriquecimiento para el ácido salicílico (6 a pH 4 y 15,3 a pH 5), mientras que los valores más bajos se registraron para el diclofenaco (1,4 a pH 4 y 2,5 a pH 5). Se observó que, para valores de pH entre 5 y 12, los factores de enriquecimiento se mantenían prácticamente constantes para todos los AINEs, lo que concuerda con el hecho de que todos se encuentran en su forma neutra, es decir, completamente protonados, pues presentan valores de pKa comprendidos entre 3 y 4,8. Por otra parte, se analizó la influencia del pH de la fase aceptora, observándose en este caso que los resultados obtenidos no se veían afectados al variar el pH de la misma. Adicionalmente, se observó que la fase donadora conteniendo los AINEs en disolución acuosa presentaba un valor de pH alrededor de 5. Por tanto, los experimentos de extracción empleando films nanometálicos se desarrollaron sin llevar a cabo un control del pH en ninguna de las dos fases. En estas condiciones, el pH de la fase aceptora, correspondiente al del agua ultrapura, es 5,6 aproximadamente, mientras que el pH de la fase donadora es ligeramente más ácido debido a la naturaleza de los analitos presentes en ella. 2.8.3. Influencia del espesor del film y del tamaño de las AgNPs La caracterización de los diferentes tipos de films mediante microscopía electrónica (apartado 2.3) indica que el contenido en plata de los films determina el tamaño y la forma de las AgNPs generadas. El hecho de disponer de AgNPs con distintas formas y tamaños, podría ser, en principio, un parámetro a considerar en el procedimiento de extracción. Así, con objeto de determinar la influencia de las características de las AgNPs presentes en los films, así como del espesor de los mismos, se llevó a cabo el procedimiento de extracción empleando films con distintas cargas de plata 76 (55,0; 107,9 y 215,9 mg Ag/g agar), cada uno de ellos, a su vez, de 4 espesores diferentes (20, 25, 30 y 35 µm), como se describió en el apartado 2.2. El procedimiento de extracción se aplicó en todos los casos a la determinación de los AINEs indicados anteriormente (SAL, KTP, NAX, DIC e IBU), obteniéndose los factores de enriquecimiento que se representan en la Tabla 2.3. Puede observarse que cuando se emplean films con un contenido en plata de 55,0 mg Ag/g agar y espesores de 20 y 25 µm, los factores de enriquecimiento que se obtienen son prácticamente nulos para todos los compuestos. Para este mismo contenido en plata y espesores de 30 y 35 µm, no se llegan a detectar los analitos. Por otra parte, los films con un contenido en plata de 215,9 mg Ag/g agar y espesores de 30 y 35 µm, se despegaron del capilar de vidrio durante el tiempo de extracción, lo que impedía llevar a cabo el procedimiento. No ocurría así cuando se empleaban films de menor espesor (20 y 25 µm) con el mismo contenido en plata, sin embargo, los factores de enriquecimiento que se obtenían en estos casos eran muy bajos, inferiores a 0,6 para la mayoría de los analitos. Únicamente se alcanzaban valores de 1,2 y 1,5 para el diclofenaco y el ibuprofeno, respectivamente, cuando se empleó el film de menor espesor (20 µm). En cambio, se observó que para un contenido en plata de 107,9 mg Ag/g agar, la extracción resultaba eficiente para todos los compuestos, observándose los mayores enriquecimientos cuando se empleaba el film de menor espesor (20 µm). En este caso, los factores de enriquecimiento obtenidos para todos los compuestos presentan valores superiores a 2,5, alcanzándose un valor máximo de 15,3 para el ácido salicílico. Los factores de enriquecimiento más bajos para este contenido en plata se obtuvieron con films de 35 µm, con valores entre 0,0 y 3,2, mejorándose ligeramente para un espesor de 30 µm con valores entre 0,2 y 5,3. 77 Tabla 2.3. Factores de enriquecimiento obtenidos para films con distinto espesor y contenido en Ag. Factores de enriquecimientoa Films de diferente espesor conteniendo AgNPs Analito Films sin AgNPs 215,9 mg Ag/g agar 107,9 mg Ag/g agar 55,0 mg Ag/g agar 20 µm 25 µm 30 µm 35 µm 20 µm 25 µm 30 µm 35 µm 20 µm 25 µm 30 µm 35 µm 20 µm 25 µm 30 µm 35 µm SAC 0,9 0,7 0,3 * 0,1 0,0 * * 15,3 5,3 5,3 3,2 0,3 0,2 n.d. n.d. KTP 0,5 0,3 0,1 * 0,3 0,3 * * 3,4 2,4 2,5 1,2 0,0 0,1 n.d. n.d. NAX 0,7 0,3 0,1 * 0,5 0,1 * * 2,5 0,6 0,5 0,3 0,1 0,0 n.d. n.d. DIC 0,8 0,6 0,2 * 1,2 0,1 * * 2,7 1,5 0,2 0,0 0,0 0,0 n.d. n.d. IBU 0,9 0,7 0,3 * 1,5 0,2 * * 2,6 2,8 0,7 1,0 0,0 0,1 n.d. n.d. *despegados durante la extracción. n.d.: no detectado. aTodos los datos se calculan como la media de determinaciones por triplicado (% RSD<6). 78 Como puede observarse, se produce un incremento en los factores de enriquecimiento de los compuestos al disminuir el espesor del film. Asimismo, resulta evidente que las características de las nanopartículas de plata (tamaño y forma), directamente relacionadas con la cantidad de plata presente en el film, ejercen una gran influencia en el procedimiento de extracción. De hecho, como puede comprobarse en la Tabla 2.3, los mejores resultados se obtienen cuando se emplean films con un contenido intermedio de 107,9 mg Ag/g agar, correspondientes a AgNPs aisladas y esféricas de 20-30 nm de diámetro. 2.8.4. Influencia del voltaje de extracción Una vez que se ha comprobado la influencia del espesor de los films, así como de las características de las AgNPs presentes en los mismos, se procedió a la optimización del voltaje y tiempo de extracción, para lo cual se aplicaron diferentes voltajes durante tiempos variables y con agitación de la muestra a 600 rpm. Se observó que cuando se aplican voltajes inferiores a 40 V (10, 20 y 30 V) durante tiempos de extracción de 10, 20 y 40 minutos, no se consigue la extracción de los compuestos en ninguno de los casos. Por otra parte, cuando el voltaje alcanza un valor de 40 V, únicamente algunos de los AINEs son extraídos de la fase donadora, pero obteniéndose factores de enriquecimiento muy pobres. Se aplicaron, por tanto, voltajes superiores (50, 60, 80 y 100 V) durante 20, 40 y 60 minutos, empleándose en todos los casos films con un contenido en plata de 107,9 mg Ag/g agar y un espesor de 20 µm y sin control de pH en las fases donadora y aceptora. La Tabla 2.4 muestra los resultados obtenidos. 79 Tabla 2.4. Factores de enriquecimiento obtenidos con el film nanometálico óptimo para diferentes tiempos de extracción y voltajes aplicados. Factores de enriquecimientoa Voltaje (V) Tiempo de extracción (min) SAC KTP NAX DIC IBU 50 20 8,2 3,4 2,5 2,7 2,6 40 15,3 4,4 4,1 2,5 4,0 60 42 7,4 3,2 0,3 0,4 60 20 7,4 3,5 2,4 2,4 2,1 40 14,8 4,6 4,0 2,3 3,5 60 23,4 7,0 2,9 1,0 1,2 80 20 4,5 0,0 0,0 1,8 1,5 40 15,1 3,0 1,4 2,1 2,2 60 26,2 3,3 1,6 1,1 1,3 100 20 0,3 0,0 0,0 0,3 0,3 40 14,5 2,0 1,3 1,5 1,3 60 32,5 3,2 1,5 1,1 2,2 aTodos los datos se calculan como la media de determinaciones por triplicado % RSD<6. Se puede observar que el ácido salicílico es el analito más sensible, dado que los factores de enriquecimiento obtenidos para dicho compuesto son los más elevados en todos los experimentos realizados. Por otra parte, atendiendo a los factores de enriquecimiento de todos los analitos, se observa que, en términos generales, los mejores resultados se obtienen cuando se aplican voltajes de 50 y 60 V. 2.8.5. Influencia del tiempo de extracción En general, los factores de enriquecimiento aumentaban cuando se incrementa el tiempo de extracción de 20 a 40 minutos, con independencia del voltaje aplicado. Sin embargo, el comportamiento de los AINEs difiere para extracciones de 60 minutos. Así, los factores de enriquecimiento para el ácido salicílico y el ketoprofeno aumentan significativamente en todos los casos, siendo este aumento mucho más acentuado para el ácido salicílico. 86 [17] A. Ávalos, Al. Haza, D. Mateo, P. Morales, Silver nanoparticles: applications and toxic risks to human health and environment, RCCV- Revista Complutense de Ciencias Veterinarias 7 (2013) 1-23. [18] H. Jiang, B. Hu, B. Chen, L. Xia, Hollow fiber liquid phase microextraction combined with electrothermal atomic absorption spectrometry for the speciation of arsenic (III) and arsenic (V) in fresh waters and human hair extracts, Anal. Chim. Acta 634 (2009) 15-21. [19] E. Muthuswamy, S. Sree Ramadevi, H.N. Vasan, C. Garcia, L. Noe, M. Vereldt, Highly stable Ag nanoparticles in agar-agar matrix as inorganic– organic hybrid J. Nanopart. Res. 9 (2007) 561-567. [20] M. Feria, Fármacos analgésicos-antitérmicos y antiinflamatorios no esteroideos. Antiartríticos, Jesús Florez, Juan Antonio Armijo, África Mediavilla (Eds.) Farmacología Humana (1997) 355-387. [21] A.S. Michaelidou, D. Hadjipavlou-Litina, Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAIDs): a Comparative QSAR Study, Chem. Rev. 105 (2005) 3235– 3271. [22] P. Maslo, R. O. Cervera, N. Casals, N, Las dolencias de la espalda, Ed. Paidotribo (2001). [23] J. G. Hardman, L. E. Limbird, A. Goodman-Gilman, Analgésicos antipiréticos, antiinflamatorios y fármacos que se utilizan en el tratamiento de la gota. Goodman & Gilman, las bases farmacológicas de la terapéutica, 27 (1996). [24] C. Jiménez-Cartagena, Contaminantes orgánicos emergentes en el ambiente: productos farmacéuticos, Rev. Lasallista Investig. 8 (2011) 143- 153. [25] M. Ramos-Payán, M.A. Bello-López, R. Fernández-Torres, M. Villar- Navarro, M. Callejón-Mochón, Electromembrane extraction (EME) and HPLC determination of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in wastewater samples, Talanta 85 (2011) 394-399. 87 [26] M. Ramos-Payán, M. A. Bello-López, R. Fernández-Torres, J. L. Pérez- Bernal, M. Callejón-Mochón, HPLC determination of ibuprofen, diclofenac and salicylic acid using hollow fiber-based liquid phase microextraction (HFLPME), Anal. Chim. Acta 653 (2009) 184-190. [27] S. Nojavan, A. R. Fakhari, Electro membrane extraction combined with capillary electrophoresis for the determination of amlodipine enantiomers in biological samples, J. Sep. Sci. 33 (2010) 3231-3238. [28] N.J. Petersen, H. Jensen, S.H. Hansen, K.E. Rasmussen, S. Pedersen- Bjergaard, Drop-to-drop microextraction across a supported liquid membrane by an electrical field under stagnant conditions, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 1496-1502. [29] L.E.E. Eibak, M.P. Parmer, K.E. Rasmussen, S. Pedersen-Bjergaard, A. Gjelstad, Parallel electromembrane extraction in a multiwell plate, Anal. Bioanal. Chem. 406 (2014) 431-440. CAPÍTULO 3. Tejidos nanoestructurados Tiss®-OH 91 SUMMARY In this section, a nanostructured support is proposed for carriermediated electromembrane extraction of highly polar compounds. This support (Tiss®-OH) is a 100 μm thickness sheet nanofiber membrane composed by acrylic nanofibers and manufactured by electrospinning by nanoMyP® (Granada, Spain). This support has been used in the extraction, combined with the subsequent separation and detection by HPLC/UV-DAD, of four high polarity acidic compounds: nicotinic acid (NIC), amoxicillin (AMX), hippuric acid (HIP) and salicylic acid (SAL). Tissues with different properties were supplied and tested in a collaborative way with nanoMyP® in order to provide valuable information for developing the final manufacturing procedure of these materials. Composition of the SLM, volume and pH of donor and acceptor phases, voltage and extraction time were investigated. Once the optimal conditions were established, the analytes were extracted from an aqueous sample solution (pH 4) (donor phase) using a Tiss®-OH sheet that supports a 5% (w/v) Aliquat®336 in 1-octanol liquid membrane. Aqueous solution (pH 6) was used as acceptor phase. The electrical field was generated from a d.c. electrical current of 100 V through two spiral shaped platinum wires placed into donor and acceptor phases. In these conditions, the analytes were extracted in 10 min with recoveries in the 60–85% range. Additionally, the proposed EME procedure was successfully applied to the determination of the target analytes in human urine samples. 93 3.1. DESCRIPCIÓN DEL SOPORTE El uso de tejidos nanoestructurados, compuestos por nanofibras poliméricas, en procedimientos EME, constituye otra posible alternativa a los soportes tradicionales. El empleo de este tipo de soporte en sistemas EME surgió en la búsqueda de materiales más apropiados para la extracción de compuestos de elevada polaridad, dada la problemática que supone su baja lipofilia a la hora de abandonar las disoluciones acuosas y atravesar la SLM característica de estos sistemas. En este sentido, los tejidos nanoestructurados que se presentan en este capítulo son materiales más hidrofílicos que las fibras de polipropileno habitualmente empleadas, por lo que podrían facilitar, a priori, el transporte de estos compuestos a través de la SLM, participando, por tanto, de manera activa en el procedimiento de extracción. Los tejidos nanoestructurados empleados en esta Tesis han sido proporcionados por la empresa granadina nanoMyP®, Spin Off de la Universidad de Granada especialista en el diseño y síntesis de nano y micropartículas poliméricas e híbridas, polímeros y copolímeros lineales y materiales inteligentes con propiedades físico-químicas adaptadas a las necesidades del cliente, proporcionando, por tanto, materiales "a la carta". De manera colaborativa con dicha empresa, se han ensayado diferentes tejidos suministrados a demanda, de cuyas pruebas experimentales se obtuvo información de gran utilidad que sirvió de base para el desarrollo y la implementación del proceso de fabricación de este tipo de materiales. Tiss®-OH hace referencia a nuevos soportes nanoestructurados altamente difusivos y versátiles, de fácil funcionalización y manipulación (física y química). Se trata de un soporte mucho más versátil que el ampliamente usado polietileno, cuyas características permite su posible participación activa en el proceso de microextracción, incluso en reacciones antígeno-anticuerpo específicas o altamente selectivas. 94 Bajo la denominación de Tiss®-Membranes, estos materiales constituyen una familia de tejidos de fibras poliméricas producidos mediante electrospinning con diversas funcionalizaciones químicas y/o dopados con nanopartículas metálicas [1]. Se trata de productos muy versátiles cuyas características les confieren la posibilidad de ser empleados en múltiples aplicaciones. Así, encuentran cabida tanto en el sector biotecnológico como en otros campos, resultando ser muy buenos candidatos para la inmovilización química de cualquier tipo de molécula (biomoléculas, fármacos, tintes, nanopartículas) para la preparación de kits de ensayo y diagnóstico (ELISA), biocatálisis (biotransformaciones, química enzimática orgánica), sistemas de liberación controlada de moléculas (medicamentos, antioxidantes o antimicrobianos), descontaminación o eliminación de metales del agua, nuevas fases sensoras ópticas, envases y etiquetas inteligentes, etc. Estos tejidos se caracterizan por presentar una superficie específica muy elevada, superando con creces a la de las fibras y láminas de polipropileno. Asimismo, son altamente hidrofílicos pero insolubles tanto en medio acuoso como en disolventes apolares, como aceite, tolueno, etc. No obstante, al ser fácilmente funcionalizables, es posible controlar su hidrofobicidad con objeto de sintetizar tejidos que sean altamente hidrofóbicos. Por otra parte, presentan excelentes propiedades mecánicas que los hacen fáciles de manipular. En este sentido, poseen elevada resistencia mecánica y consistencia (por lo que no se deshilachan), flexibilidad, alta resistencia a la temperatura (pudiendo soportar temperaturas de hasta 100ºC) y, además, mantienen la estructura de la fibra tanto en medios acuosos como en mezclas de agua y disolventes orgánicos. Presentan, asimismo, excelentes propiedades químicas, basadas en la tecnología patentada de NanoMyP®, para la inmovilización covalente directa de una alta carga de casi cualquier tipo de biomolécula (enzima, anticuerpo, 95 antígeno) en condiciones suaves de temperatura, pH y tiempo. Todo esto hace que sean fácilmente procesables a escala industrial y a bajo coste. Dentro de la familia Tiss®-Membranes, existen distintas variedades de tejidos con diferentes características y aplicaciones. Así, se pueden encontrar, entre otros, tejidos preactivados para la inmovilización covalente directa de biomoléculas que contengan grupos tiol, amina y/o imidazol a la superficie del tejido, dando lugar a un material altamente bioactivo (Tiss®- Link) que no necesita ser preactivado para la inmovilización. Este hecho implica un aumento de la sensibilidad con una menor cantidad de biomolécula, así como la mejora de la estabilidad de las biomoléculas inmovilizadas. Asimismo, se pueden encontrar tejidos con una gran cantidad de nanopartículas metálicas de plata y oro para la inmovilización y purificación de biomoléculas (Tiss®-Metal). En este caso, los tejidos propuestos como soporte para la membrana líquida en procedimientos EME, Tiss®-OH, están funcionalizados con grupos hidroxilo (–OH), lo que los hace altamente hidrofílicos. Presentan un espesor de 100 μm y un tamaño de poro entre fibras variable, entre 800 nm para nanofibras secas y 1-3 μm para nanofibras húmedas. En la Figura 3.1, se muestra una imagen del tejido Tiss®-OH, obtenida por Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM), donde se pueden observar las fibras de tamaño nanométrico en la estructura de la membrana. Teniendo en cuenta las numerosas ventajas y características que presentan estos materiales nanoestructurados, se propone, por primera vez, el estudio de su aplicabilidad en los procedimientos de extracción por electromembrana al ser empleados como soporte de las membranas líquidas. 102 Tabla 3.2. Condiciones cromatográficas para la elución en gradiente de los compuestos polares seleccionados. A: ácido fórmico 0.05% (v/v), B: Acetonitrilo (ACN). Tiempo (min) % A % B 0 99 1 3 90 10 4 90 10 4,1 60 40 12 60 40 tiempo de retención (min) NIC 1,78 AMX 6,12 HIP 7,32 SAL 8,53 Figura 3.3. Cromatograma de los compuestos polares seleccionados. La detección UV-DAD de los compuestos se realizó empleando las longitudes de onda obtenidas a partir de los espectros de absorción correspondientes, representados en la Figura 3.4. 103 (a) NIC (b) AMX (c) HIP (d) SAL Figura 3.4. Espectros de absorción de los compuestos polares estudiados. (a) ácido nicotínico (NIC), (b) amoxicilina (AMX), (c) ácido hipúrico (HIP) y (d) ácido salicílico (SAL). 104 Teniendo en cuenta los espectros indicados en la Figura 3.4, las longitudes de onda seleccionadas para la detección de los diferentes compuestos fueron 260 nm para NIC, 230 nm para AMX y 235 nm para HIP y SAL. 3.5. RESULTADOS 3.5.1. Estudios previos del comportamiento de diferentes tipos de tejidos Durante el desarrollo experimental de este apartado se realizaron algunos ensayos con tejidos obtenidos durante distintas fases del procedimiento de fabricación de los mismos, con idea de analizar su manipulación y comportamiento como posible alternativa a los soportes tradicionales empleados en EME. Se adquirieron en primer lugar dos tipos de tejidos, uno de ellos con propiedades hidrofílicas obtenido tras una etapa de tratamiento térmico (TNAH), y otro obtenido de la misma forma, a excepción de esa etapa térmica, lo que le proporcionaba cierta hidrofobicidad (TNBH). Las pruebas realizadas con estos dos tipos de tejidos consistieron básicamente en analizar su comportamiento en presencia de diferentes disolventes orgánicos, así como su resistencia eléctrica en contacto con las diferentes fases acuosas (donadora y aceptora). Como ya se ha indicado anteriormente, el disolvente orgánico empleado como SLM en procedimientos EME debe tener una cierta hidrofobicidad que lo haga inmiscible con el agua y así poder formar la membrana líquida y, a su vez, debe ser suficientemente conductor para permitir la existencia de corriente eléctrica en el sistema. En este sentido, se analizó el comportamiento de los tejidos al ser impregnados con diferentes disolventes orgánicos, así como las características que presentaba la superficie del tejido impregnado al 105 adicionar sobre ella una gota de agua. Para estas pruebas, se empleó el tejido más hidrofílico (con tratamiento térmico). Se observó que, disolventes como metanol, hexanol, t-butanol, 3- piridilcarbinol, difenilpropanodiol y 4-flurobencilalcohol deterioraban el tejido al impregnarlo. Por otra parte, hexano, tolueno y orto-, meta- y para-xileno, se evaporaban con cierta rapidez. En cambio, dihexiléter, 1-octanol, peppermint oil, nitrofeniloctiléter (NPOE) y tiofenol proporcionaban buenos resultadosya que aseguraban la inmiscibilidad de las disoluciones donadora y aceptora cuando ambas fases se pusieran en contacto a través de la SLM. De todos ellos, el tiofenol resulta ser moderadamente tóxico y dihexiléter, peppermint oil y NPOE cortaban la corriente eléctrica. Por tanto, debido a sus características de impregnación e hidrofobicidad, así como por su baja toxicidad y relativamente alta constante dieléctrica, el 1-octanol resultaba ser el disolvente orgánico más adecuado para su empleo como SLM en procedimientos EME con este tipo de soporte. Por otra parte, se llevó a cabo un registro de la intensidad de corriente generada durante el procedimiento de extracción cuando se emplean este tipo de tejidos como soportes de la SLM. Para ello, se empleó un multímetro digital (3430 4 ½-digit PeakTech®, Ahrensburg, Alemania) capaz de registrar, para un potencial constante, dos valores de intensidad por segundo. En la Figura 3.5, se muestran las curvas de intensidad obtenidas con cada uno de los tejidos empleados. Como puede observarse en estas representaciones, el procedimiento de extracción se caracteriza por un pico de intensidad en el momento inicial, seguido de un brusco descenso. La tendencia posterior difiere para cada tipo de tejido, siendo ésta creciente para el TNAH, con valores más altos de intensidades de corriente, mientras que para el TNBH los valores de intensidad alcanzados son inferiores y se mantienen prácticamente constantes durante todo el proceso de extracción. Estas observaciones se ajustan a la naturaleza de los tejidos, ya que el tejido de mayor carácter 106 hidrofílico (TNAH) y, por tanto, menor resistencia eléctrica, es el que genera valores más elevados de intensidad de corriente. Figura 3.5. Curva intensidad vs tiempo de extracción con tejidos TNBH y TNAH (para detalles ver texto). Una posible interpretación de este comportamiento podría ser la formación inicial de una doble capa eléctrica como consecuencia de la diferencia de potencial aplicada, lo que se correspondería con el pico de intensidad observado. Asimismo, el comportamiento posterior de las curvas de intensidad podría deberse al inicio y consecución del proceso de electromigración, de manera que la transferencia de iones desde la fase donadora a la aceptora se caracterizaría por un descenso de la intensidad de corriente generada. Por tanto, según esta interpretación, un comportamiento creciente de la intensidad implicaría una menor transferencia de iones y, en consecuencia, una menor eficacia de extracción. 3.5.2. Ensayos preliminares Para llevar a cabo la optimización de los diferentes factores operacionales que influyen en el procedimiento de extracción, se usó un tejido completamente desarrollado y optimizado por la empresa nanoMyP®, Imáx=33.10 µA Imáx=24.97 µA 0 5 10 15 20 25 30 35 0200 400 600 800 1000 1200 Intensidad (µA) tiempo (s) TNBH TNAH 107 denominado Tiss-OH®, de gran hidrofilicidad debido a la presencia de grupos hidroxilo en su estructura. Dada las características observadas anteriormente con cada uno de los diferentes disolventes orgánicos probados, se seleccionó 1-octanol como disolvente para la SLM. Por otro lado, debido a que el uso de carriers puede mejorar la extracción de compuestos muy polares [16] y teniendo en cuenta que en la fase donadora los analitos estudiados se encuentran mayoritariamente en su forma desprotonada, se usó como SLM 1-octanol conteniendo un 5% (p/v) de Aliquat®336 (carrier catiónico) en los diferentes ensayos de extracción por electromembrana. Así, las primeras pruebas se llevaron a cabo usando el procedimiento descrito anteriormente, aplicando un voltaje de 100 V durante 10 minutos y con agitación a 300 rpm. Se seleccionó este voltaje ya que valores superiores conducían a un incremento del volumen de la fase aceptora durante el proceso de extracción, mientras que en el caso de aplicar voltajes más bajos, las extracciones eran muy pobres. Con idea de optimizar la eficacia del proceso de extracción de los analitos estudiados, se evaluó la influencia de diferentes factores experimentales como el pH y el volumen de las fases aceptora y donadora, el voltaje aplicado, el tiempo de extracción y la cantidad de carrier disuelto en el disolvente orgánico empleado como SLM. 3.5.3. Influencia del pH de las fases donadora y aceptora Para estudiar la influencia del pH en el proceso de extracción, se empleó como fase donadora 10 mL de una disolución acuosa de los compuestos seleccionados de 1 mg L-1 de concentración y 300 μL de disolución acuosa como fase aceptora. El volumen de fase aceptora se limitó a un mínimo de 300 μL debido a que el diseño experimental impedía emplear volúmenes más pequeños. 108 Hay que destacar que en los dispositivos EME uno de los aspectos que debe considerarse es la posible electrolisis del agua, ya que la formación de burbujas y la consecuente generación de iones OH- y H+ puede ocasionar cambios bruscos de pH tanto en la fase aceptora como en la donadora, que pueden afectar, en consecuencia, al rendimiento del proceso de extracción [17-20]. En este caso, se comprobó que la electrolisis en la fase aceptora conducía a un importante descenso del pH de la misma durante el proceso de extracción, lo que podría a priori ser especialmente significativo. Por tanto, se consideró el uso de diferentes disoluciones tampón para intentar asegurar un valor de pH prácticamente constante en esta fase aceptora. Igualmente, se estudió también la influencia de la electrolisis del agua en la fase donadora. Se comprobó que, después del proceso de extracción, se producía un importante incremento en el pH de la fase donadora hasta alcanzar un valor aproximado de pH 11. Sin embargo, este hecho tenía un efecto sinérgico positivo en el proceso de extracción debido a los valores de pKa de los analitos estudiados. A valores elevados de pH, los analitos se encuentran mayoritariamente en su forma iónica, lo que favorece su extracción formando par iónico con el carrier. Así, la fase donadora conteniendo los analitos estudiados a una concentración de 1 mg L−1 sin control del pH (aproximadamente pH 4), se sometió al procedimiento EME aplicando un potencial de 100V durante 10 min. Por su parte, para ajustar el pH de la fase aceptora se emplearon disoluciones tampón acético/acetato, fosfato y amoníaco/amonio de concentración 100 mM para cubrir un rango de pH entre 4-10. Se empleó HCl para el ajuste de pH 2 y NaOH para pH 11, pH 12 y pH 13. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 3.6. 109 Figura 3.6. Influencia del pH de la fase aceptora. Como puede observarse, las recuperaciones aumentan para todos los analitos cuando el pH se incrementa hasta un valor aproximadamente de 5.5. Para valores de pH superiores, las recuperaciones se mantienen prácticamente constantes. Por tanto, se empleó una disolución tampón acético/acetato 100 mM a pH 6 para ajustar el pH de la fase aceptora para el resto de experimentos, considerando así este pH como el óptimo de la fase aceptora. Como ya se ha mencionado, no se realizó ningún ajuste sobre el pH de la fase donadora dado que el incremento de pH que sufre durante el proceso de extracción favorece la extracción de los analitos seleccionados. 3.5.4. Influencia del voltaje de extracción El voltaje se estudió en un rango comprendido entre 10 y 200 V. Se observó que en ausencia de potencial los compuestos no se extraían. En cambio, como puede verse en la Figura 3.7, las recuperaciones de los compuestos aumentaban considerablemente con el incremento de voltaje hasta un valor máximo a 100 V. Para voltajes superiores a este valor, se producía un incremento del volumen de la fase aceptora. Por tanto, se 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 2 4 6 8 10 12 14 Recuperación (%) pH NIC AMX HIP SAL 110 seleccionó un voltaje de 100 V como valor óptimo para llevar a cabo el procedimiento de extracción. Figura 3.7. Influencia del voltaje de extracción. 3.5.5. Influencia del tiempo de extracción El tiempo de extracción se estudió en un rango entre 5 y 15 minutos. Se observó que las recuperaciones de los compuestos aumentaban con el tiempo de extracción hasta los 10 minutos. Por encima de este tiempo, el volumen de la fase aceptora aumentaba, por lo que no se midió. Dada la naturaleza nanoestructurada de la membrana de nanofibras, la presencia de un sistema poroso nanométrico podría hacer relevante el flujo electrosmótico, permitiendo así el flujo de agua desde la fase donadora a la aceptora. Para tiempos de extracción inferiores a los 10 minutos, este hecho no afecta de forma significativa a la relación de volúmenes de fase. Por tanto, se empleó como tiempo óptimo un tiempo de extracción de 10 minutos. 3.5.6. Influencia del volumen de las fases donadora y aceptora Otro de los factores que se estudió fue la relación de volúmenes de fase donadora/aceptora. En el caso de la fase aceptora, no podían probarse 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 020 40 60 80 100 Recuperación (%) Voltaje (V) NIC AMX HIP SAL 111 volúmenes inferiores a 300 μL debido al diseño del dispositivo experimental. Por tanto, fijando 300 μL de fase aceptora, se probaron volúmenes de fase donadora que variaban entre 10 y 100 mL. Se observó que, para 10 mL de fase donadora se obtenían recuperaciones elevadas para todos los compuestos. Adicionalmente, usando 10 mL de fase donadora, se probaron volúmenes crecientes de fase aceptora sin observar mejora en las recuperaciones obtenidas. Por tanto, se seleccionaron 300 μL y 10 mL como volúmenes óptimos para las fases aceptora y donadora, respectivamente. 3.5.7. Influencia de la concentración de carrier Con objeto de evaluar la influencia de la concentración de carrier, se llevaron a cabo una serie de pruebas usando diferentes cantidades de carrier disueltas en la membrana líquida. De este modo, se probaron concentraciones comprendidas entre 2.5% y 7% (p/v) de Aliquat®336. Se observó que las recuperaciones aumentaban al aumentar la cantidad de carrier hasta un 5% (p/v), manteniéndose prácticamente constantes para cantidades superiores. Por tanto, se estableció como cantidad óptima del carrier un 5% (p/v). 3.5.8. Validación Teniendo en cuenta todas las condiciones experimentales previamente establecidas, las recuperaciones obtenidas para los analitos estudiados empleando el procedimiento EME propuesto fueron 77% para NIC, 60% para AMX, 62% para HIP y 85% para SAL. Por tanto, las membranas de nanofibras Tiss®-OH podrían ser una elección adecuada como soporte para la extracción por electromembrana de compuestos ácidos de elevada polaridad. Adicionalmente, como se mencionó en el apartado 3.1, sus excelentes propiedades mecánicas, así como su versatilidad química, llevan a considerar este material como un soporte prometedor para la extracción de compuestos de naturaleza muy diferente. 118 [14] T. Kawamoto, M. Koga, T. Oyama, Y. Kodama, Habitual and genetic factors that affect urinary background levels of biomarkers for organic solvent exposure, Arch. Environ. Contam. Toxicol. 30 (1996) 114-120. [15] L.H. Shen, H.N. Wang, P.J. Chen, C.X. Yu, Y.D. Liang, C.X. Zhang, The analytical determination and electrochemiluminescence behavior of amoxicillin, J. Food Drug Anal. 24 (2016) 199–205. [16] S. Pedersen-Bjergaard, K.E. Rasmussen, Electrokinetic migration across artificial liquid membranes, New concept for rapid sample preparation of biological fluids, J. Chromatogr. A 1109 (2006) 183-190. [17] N. Drouin, S. Rudaz, J. Schappler, Dynamic-electromembrane extraction: a technical development for the extraction of neuropeptides, Anal. Chem. 88 (2016) 5308-5315. [18] A. Slampová, P. Kubán, P. Bocek, Additional considerations on electrolysis in electromembrane extraction, J. Chromatogr. A 1429 (2016) 364-368. [19] P. Kubán, P. Bocek, The effects of electrolysis on operational solutions in electromembrane extraction: the role of acceptor solution, J. Chromatogr. A 1398 (2015) 11-19. [20] A. Slampová, P. Kubán, P. Bocek, Quantitative aspects of electrolysis in electromembrane extractions of acidic and basic analytes, Anal. Chim. Acta 887 (2015) 92–100. [21] J.N. Miller, J.C. Miller, Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 4th ed., Prentice Hall, London, 2000. [22] L. Cuadros-Rodrıguez, A.M. Garcıa-Campaña, J.M. Bosque-Sendra, Statistical Estimation of Linear Calibration Range, Anal. Lett. 29 (1996) 1231- 1239. [23] S.P. Kaur, R. Rao, S. Nanda, Amoxicillin: a broad spectrum antibiotic, Int. J. Pharm. Pharm. Sci. 3 (2011) 30-37. CAPÍTULO 4. Membranas de inclusión polimérica (PIMs) 121 SUMMARY In this section, polymer inclusion membranes (PIMs) are proposed as supports in electromembrane extraction (EME). Synthesis of PIMs was optimized to a composition of 29% (w/w) of cellulose triacetate (CTA) as base polymer and 71% (w/w) of Aliquat®336 as cationic carrier. Membranes of different thickness were synthesized and tested. EME procedure using these PIMs was implemented for the first time, to our knowledge, for the simultaneous extraction of four non-steroidal antiinflammatory drugs (NSAIDs) (salicylic acid (SAL), ketoprofen (KTP), naproxen (NAX) and ibuprofen (IBU)) and four highly polar acidic drugs (nicotinic acid (NIC), amoxicillin (AMX), hippuric acid (HIP) and anthranilic acid (ANT)). Posterior HPLC separation of the extracted analytes was developed with diode array detection (UV-DAD). Influence on the EME procedure of the organic solvent used as SLM, volume and pH of donor and acceptor solutions, voltage and extraction time was investigated. Optimal conditions were established with PIMs (29% (w/w) of CTA and 71% (w/w) of Aliquta®336) of 25 μm thickness and 6 mm diameter as support of 1-octanol liquid membrane. Recoveries in the 81–34% range were obtained when target analytes were extracted from an aqueous donor solution (pH 4) into an aqueous acceptor solution (pH 10) applying 50 V for 30 minutes. Finally, the EME procedure was applied successfully to the analysis of human urine samples. 123 4.1. DESCRIPCIÓN DEL SOPORTE Las membranas de inclusión polimérica (Polymer inclusion membranes, PIMs) son membranas homogéneas y consistentes, compuestas, generalmente, por un agente extractante (carrier), un polímero base, comúnmente cloruro de polivinilo (PVC) o triacetato de celulosa (CTA), y un plastificante o modificador. La fuerza mecánica de la membrana, así como su resistencia difusiva, la proporciona el polímero base. Por otro lado, el carrier o transportador actúa, esencialmente, como intercambiador de iones o agente complejante, al unirse a las especies de interés y transportarlas a través del PIM. El gradiente de concentración del complejo especies-carrier o pares iónicos formados en la membrana es el responsable del transporte de las especies a través de la misma. Por su parte, el plastificante proporciona no sólo elasticidad y flexibilidad a la membrana, sino que también actúa como disolvente. La presencia del plastificante contribuye, además, a mejorar la compatibilidad de los diferentes componentes de la membrana [1, 2]. Asimismo, el carrier puede actuar también como plastificante y, en ese caso, no se necesita el uso de un plastificante adicional. De forma ocasional, se puede añadir otro componente a la membrana, llamado modificador, con objeto de mejorar la solubilidad de la especie extraída en la fase líquida de la membrana. En los últimos años sus aplicaciones se han centrado fundamentalmente en la detección química, actuando como electrodos selectivos de iones (ion-slective electrodes, ISEs) [3]. La composición de los PIM es esencial en sus propiedades físicas y químicas, así como en la selectividad de la membrana. Varios investigadores han estudiado la eficiencia del transporte a través del PIM. Así, se sabe que la naturaleza y los componentes del PIM pueden mejorar el transporte de las especies de interés a través de la membrana, haciéndolo más rápido [4]. Estas características, junto con la simplicidad de operación, el uso mínimo de sustancias químicas peligrosas y la flexibilidad, hacen de los PIMs una más que interesante alternativa frente a los soportes tradicionales 124 para las membranas líquidas. De esta forma, pueden encontrarse en la literatura varios trabajos donde se describe el uso de PIMs como membranas alternativas en sistemas de extracción por electromembrana (EME). Así, se han empleado eficazmente en la extracción de aniones orgánicos e inorgánicos, como propanosulfonato, heptanosulfonato, decanosulfonato, tetraetilamonio, tetrabutilamonio y tetrapentilamonio) [4-8]. 4.2. SÍNTESIS La preparación de los PIMs se llevó a cabo, con algunas modificaciones, siguiendo el procedimiento propuesto por See et al. [5, 6]. Así, la síntesis se realizó disolviendo 0,6 g de triacetato de celulosa (CTA) en 30 ml de diclorometano (DCM) e introduciendo la mezcla en un baño de ultrasonidos hasta disolución total. Por otra parte, se pesa la cantidad de Aliquat®336 deseada y se añade a la disolución anterior. Tras la homogenización de la disolución resultante, se vierte un determinado volumen (en función del espesor que se desee) sobre una placa Petri de vidrio de 90 mm. Una vez evaporado el disolvente, se obtienen films de diferente espesor y contenido en CTA que se separan fácilmente de la placa de vidrio. 4.3. DISPOSITIVO EXPERIMENTAL El proceso de extracción por electromembrana con membranas de inclusión polimérica se llevó a cabo siguiendo el mismo procedimiento y dispositivo experimental descritos anteriormente para los tejidos nanoestructurados (apartado 3.2). El esquema del dispositivo experimental empleado se representa en la Figura 4.1. 125 Fuente de voltaje +  Agitador magnético Fase donadora Fase aceptora Soporte (PIM) Placa de agitación magnética Microvial de inyección Electrodos de platino (0.25 mm) Tapón de microvial PIM Figura 4.1. Dispositivo experimental empleado en el procedimiento EME con PIMs. Al igual que con los soportes anteriores, se estudió la influencia en el procedimiento de extracción de factores como la composición del PIM, el espesor de la membrana, el disolvente orgánico empleado como SLM, el pH, el voltaje, el tiempo y el volumen de fases aceptora y donadora. En todos los casos, el procedimiento EME se aplicó a la extracción simultánea de antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) y compuestos ácidos de elevada polaridad. Una vez finalizada la extracción, se recogió la fase aceptora con una microjeringa y se inyectaron 20 μL en el sistema cromatográfico. 126 4.4. COMPUESTOS ESTUDIADOS Y DETERMINACIÓN CROMATOGRÁFICA Las membranas de inclusión polimérica (PIMs) se emplearon en la determinación simultánea de dos familias de compuestos. Se seleccionaron cuatro antiinflamatorios no esteroideos, AINEs, (ácido salicílico (SAL), ketoprofeno (KTP), naproxeno (NAX) e ibuprofeno (IBU)) y cuatro compuestos ácidos de elevada polaridad (ácido nicotínico (NIC), amoxicilina (AMX), ácido hipúrico (HIP) y ácido antranílico (ANT)), cuyas características se han descrito ya en las secciones 2.6 y 3.3, respectivamente. En este caso, además, se incorpora un nuevo compuesto ácido de carácter polar, como es el ácido antranílico (ANT), cuya estructura y características químicas se indican en la Tabla 4.1. El ácido antranílico es un aminoácido aromático con un importante papel en determinados procesos químicos y bioquímicos. Se emplea en la síntesis de medicamentos biológicamente activos, así como en la fabricación de colorantes azoicos y en la determinación de iones metálicos [9]. Asimismo, se trata de un intermediario en el metabolismo del triptófano, por lo que constituye un metabolito endógeno del ser humano [10]. Tabla 4.1. Estructura y características del ácido antranílico. Ácido antranílico 2-aminobenzoic acid C7H7NO2 PM= 137.138 g/mol Número CAS: 118-92-3 pKa= 2.11 log P= 1.2 Se trata de la primera vez, según nuestro conocimiento, que se desarrolla un procedimiento EME para la extracción simultánea de ambas familias de compuestos, lo cual supone un hecho destacable, dada las diferentes características y propiedades que presentan los analitos seleccionados. 127 La determinación de dichos compuestos se llevó a cabo, al igual que con los soportes anteriores, mediante cromatografía líquida de alta resolución con detector ultravioleta de diodos en fila (HPLC-DAD). En este caso, se empleó un cromatógrafo líquido de alta resolución LabChrom® VWR-Hitachi (Barcelona, España) equipado con una bomba cuaternaria L- 7100 y un detector UV-Visible de diodos en fila L-7455, con inyección automática de la muestra (20 μL) empleando un automuestreador L-2200. Para la separación cromatográfica se empleó una columna LiChroCART® 75-4 Purospher® STAR RP-18e 3 µm (75 mm x 4 mm d.i.) (VWR, Darmstadt, Alemania) equipada con una precolumna Kromasil® 100 Å, C18, 5 µm (15 mm×4.6 mm d.i.) (Scharlab S.L., Barcelona, España) y termostatizada a 20ºC. Se llevó a cabo una elución en gradiente a flujo constante de 0.8 mL min-1 empleando una fase móvil consistente en una mezcla de ácido fórmico al 0.05% (v/v) (componente A) y acetonitrilo (componente B). Las condiciones cromatográficas para la separación simultánea de las dos familias de compuestos seleccionadas se indican en la Tabla 4.2. Tabla 4.2. Condiciones cromatográficas para la elución en gradiente de los compuestos seleccionados. A: ácido fórmico 0.05% (v/v), B: Acetonitrilo (ACN). Tiempo (min) % A % B 0 99 1 3 90 10 4 90 10 4,1 60 40 12 60 40 17 0 100 19 0 100 Haciendo uso de las condiciones de separación recogidas en la Tabla 4.2, se obtiene el cromatograma que se representa en la Figura 4.2. 134 Figura 4.6. Influencia del potencial aplicado. Como puede observarse, las recuperaciones aumentan considerablemente de 10 a 50 V para todos los compuestos. A partir de 50 V, los valores disminuyen ligeramente o se mantienen constantes hasta 100 V. Por tanto, se seleccionó 50 V como el voltaje óptimo en el procedimiento EME. 4.5.4. Influencia del tiempo de extracción Para llevar a cabo la optimización del tiempo de extracción, se realizaron extracciones durante tiempos variables (5, 10, 15, 20, 25, 30 y 40 minutos). En todas estas extracciones se aplicó un potencial de 50 V, valor óptimo obtenido anteriormente. Las recuperaciones obtenidas para los compuestos estudiados se muestran en la Figura 4.7. 0 10 20 30 40 50 60 70 020 40 60 80 100 Recuperación (%) Voltaje (V) NIC AMX HIP ANT SAL KTP NAX IBU 135 Figura 4.7. Influencia del tiempo de extracción. Se observa que de 5 a 10 min, las recuperaciones aumentan para todos los compuestos. Entre 10 y 30 min, la tendencia de los compuestos es variable, aunque las recuperaciones aumentan en todos los casos hasta un valor máximo para 30 min. Por encima de este tiempo, las recuperaciones disminuyen, por lo que se eligieron 30 minutos para el proceso de extracción por electromembrana. 4.5.5. Influencia del volumen de las fases donadora y aceptora Por último, se llevó a cabo la optimización del volumen de las fases aceptora y donadora, para ver su influencia en la eficacia de extracción, en términos de recuperaciones y factores de enriquecimiento de los compuestos analizados. Dada las características del dispositivo experimental empleado para llevar a cabo los procedimientos de extracción, el volumen de la fase aceptora no podía ser superior ni inferior a 300 μL, por lo que únicamente se estudió el volumen de fase donadora. Así, fijando el volumen de fase aceptora a 300 μL, se probaron 5, 10, 25 y 50 mL de disolución donadora. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Recuperación (%) tiempo (min) NIC AMX HIP ANT SAL KTP NAX IBU 136 Se observó que, a medida que aumentaba el volumen de la fase donadora, se incrementaban los factores de enriquecimiento de los compuestos como consecuencia del incremento en la relación de volúmenes de fases. Sin embargo, por encima de 10 mL, las recuperaciones de los analitos empeoraban entre un 20% y un 50% cuando se empleaban 25 y 50 mL, respectivamente. Una posible explicación podría ser que a mayor volumen de disolución donadora, la cantidad de analito disponible es también mayor (para una misma concentración), por lo que la SLM podría saturarse impidiendo el transporte de los compuestos y, en consecuencia, provocando un descenso en las recuperaciones de los mismos. Por tanto, se seleccionó un volumen de 10 mL para la fase donadora como volumen óptimo, al observarse mejores resultados en términos de recuperaciones. 4.5.6. Validación y aplicación a muestras reales Una vez optimizados los distintos parámetros operacionales que afectan al proceso de extracción, las condiciones experimentales seleccionadas como óptimas consistían en 1-octanol como SLM, 10 mL de disolución donadora acuosa conteniendo los compuestos de interés (pH 4), 300 μL de disolución tampón NH3/NH4+ a pH 10 como fase aceptora y un voltaje de 50 V durante 30 minutos con agitación constante a 300 rpm. En estas condiciones experimentales óptimas se llevó a cabo la validación del método propuesto, evaluando la linealidad, sensibilidad, repetibilidad y precisión intermedia, así como su aplicación en el análisis de muestras reales. Para ello, se emplearon muestras de orina humana procedentes de voluntarios saludables que fueron microfiltradas (0.22 µm), diluidas convenientemente y sometidas al procedimiento EME/HPLC-DAD propuesto. Se observó la existencia de efecto matriz debido a la presencia de muestras de orina, por lo que en primer lugar se llevó a cabo un calibrado por adición patrón. En la Tabla 4.3 se muestran el rango lineal y los límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) para cada uno de los analitos estudiados, de acuerdo a la recuperación efectiva. Los límites de detección 137 y cuantificación se calculan como la relación señal/ ruido (3 veces para el LOD y 10 para el LOQ, respectivamente) [14]. Tabla 4.3. Datos de calibración, límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) y recuperación (%) para los analitos estudiados. Analito Rango lineal (µg L-1) Linealidad LOD* (µg L-1) LOQ* (µg L-1) R (%) (%) (R2) NIC 96-500 97.0 0.995 29.0 96.0 81 AMX 333-500 96.9 0.993 100.0 333.0 52 HIP 71-500 97.8 0.997 21.0 71.0 78 ANT 207-500 97.1 0.997 62.0 207.0 34 SAL 61-500 98.0 0.998 18.0 61.0 50 KTP 131-500 96.0 0.993 39.0 131.0 35 NAX 124-500 96.6 0.998 37.0 124.0 48 IBU 62-500 97.7 0.998 19.0 62.0 37 Como puede observarse, se obtiene buena linealidad para todos los compuestos, con valores entre 96.0 para el KTP y 98.0 para SAL, expresados como % de linealidad. Los LODs obtenidos se encuentran entre 18.0 μg L−1 para SAL y 100.0 μg L−1 para AMX, mientras que los LOQs presentan valores entre 61.0 μg L−1 para SAL y 333.3 μg L−1 para AMX. Por último, para evaluar la repetibilidad y la precisión intermedia, se realizaron extracciones en un sólo día, así como en dos días a la semana durante tres semanas, respectivamente. De esta forma, se obtuvieron valores para el %RSD entre 1-8% para la repetibilidad y entre 2-12% para la precisión intermedia. 138 Así, atendiendo a los parámetros de validación, se puede decir que los PIMs pueden emplearse de manera exitosa como soporte de la membrana líquida para la extracción simultánea de AINEs y compuestos ácidos muy polares. Adicionalmente, se analizaron cuatro de los fármacos estudiados como son NAX, AMX, IBU y SAL para su determinación en muestras de orina humana. Atendiendo a la bibliografía, el 60% de la dosis de AMX ingerida se excreta en la orina en un periodo comprendido entre 6 y 8 horas [15]. En el caso del NAX, aproximadamente el 95% de este fármaco se excreta en la orina, siendo entre 66-92% como conjugados, <1% como 6-0-desmetil naproxeno y <1% como naproxeno [16]. La dosis habitual de IBU, suministrada como comprimidos, está entre 400 y 800 mg, tres veces al día. Este fármaco se elimina completamente 24 horas después de la última dosis. En un periodo entre 6 y 8 horas después de la ingesta de IBU, aproximadamente el 10% se excreta en la orina y más del 90% de la dosis ingerida se excreta como metabolitos o conjugados, siendo los metabolitos mayoritarios los compuestos hidroxilados y carboxilados [17, 18]. Por otra parte, después de la administración de ácido acetilsalicílico (ASA), se genera ácido salicílico (SAL) por hidrólisis [19], encontrándose los niveles habituales de SAL en orina en el rango de las centenas de μg mL−1 [20]. Las muestras de orina en este caso fueron suministradas por voluntarios saludables tras la administración de diferentes dosis de NAX, AMX, ASA e IBU. Las muestras fueron microfiltradas (0.22 μm), diluidas con agua ultrapura (1:500, v/v) y sometidas al procedimiento EME propuesto. La Figura 4.8, muestra los cromatogramas correspondientes a una muestra de orina humana dopada con una mezcla de los compuestos estudiados de 500 µg L-1 de concentración (a); una muestra de orina humana recogida 3 horas después de la ingesta de 550 mg de naproxeno (b); una muestra de orina humana recogida 7 horas después de la ingesta de 600 mg de ibuprofeno (c); una muestra de orina humana recogida 7 horas 139 después de la ingesta de 750 mg de amoxicilina (d) y una muestra de orina humana recogida 4 horas después de la ingesta de 500 mg de ácido acetilsalicílico (e). Todos los cromatogramas muestran buena línea base y picos bien definidos para todos los analitos estudiados. tiempo de retención (min) (a) tiempo de retención (min) (b) tiempo de retención (min) (c) 140 tiempo de retención (min) (d) tiempo de retención (min) (e) Figura 4.8. Cromatogramas del método de separación HPLC de muestras de orina humana sometidas al procedimiento EME. (a) orina dopada; (b) orina 3h después de la ingesta de NAX; (c) orina 7h después de la ingesta de IBU; (d) orina 7h después de la ingesta de AMX; (e) orina 4h después de la ingesta de ASA. Los resultados obtenidos, una vez llevado a cabo el procedimiento EME en las muestras de orina, se recogen en la Tabla 4.4. Teniendo en cuenta el volumen de orina recogido, así como la recuperación efectiva del procedimiento EME para cada uno de los fármacos analizados (Tabla 4.3), las concentraciones de NAX, AMX, IBU y SAL encontradas en las muestras de orina humana se corresponden con las cantidades habituales excretadas indicadas en la literatura. 141 Tabla 4.4. Aplicación del procedimiento EME propuesto a muestras reales de orina humana. Analito Dosis ingerida (mg) Tiempo de excreción (h) Concentración en la orinaa (mg L-1) AMX 750 7 165 IBU 600 7 259 NAX 550 3 319 SAL 500b 4 711 aRSD < 7% bComo ácido acetilsalicílico. Aunque no se dispuso de muestras de orina que contuviesen HIP, ANT, KTP o NIC, los valores obtenidos para el LOQ en el procedimiento EME propuesto son mucho más bajos que los valores habituales de esos compuestos en muestras de orina humana. Según la bibliografía, estos niveles son aproximadamente 5 mg L−1 para ANT, 160 mg L−1 para KTP y 300–500 mg L−1 para HIP [21-24]. Consecuentemente, se puede decir que el procedimiento EME propuesto podría aplicarse también de forma satisfactoria a la determinación de estos analitos en muestras reales de orina. REFERENCIAS [1] M.I. Vázquez, V. Romero, C. Fontàs, E. Anticó, J. Benavente, Polymer inclusion membranes (PIMs) with the ionic liquid (IL) aliquat 336 as extractant: effect of base polymer and IL concentration on their physicalchemical and elastic characteristics, J. Membr. Sci. 455 (2014) 312-319. [2] M.I.G.S. Almeida, R.W. Cattrall, S.D. Kolev, Recent trends in extraction and transport of metal ions using polymer inclusion membranes (PIMs), J. Membr. Sci. 415-416 (2012) 9-23. 142 [3] R.W. Cattrall, Chemical sensors, in: R.G. Compton (Ed.), Oxford Chemistry Primers, 52 Oxford University Press, New York, 1997. [4] H.H. See, P.C. Hauser, Electro-driven extraction of low levels of lipophilic organic anions and cations across plasticized cellulose triacetate membranes: effect of the membrane composition, J. Membr. Sci. 450 (2014) 147-152. [5] H.H. See, P.C. Hauser, Automated electric-field-driven membrane extraction system coupled to liquid chromatography-mass spectrometry, Anal. Chem. 86 (2014) 8665-8670. [6] H.H. See, P.C. Hauser, Electric field-driven extraction of lipophilic anions across a carrier-mediated polymer inclusion membrane, Anal. Chem. 83 (2011) 7507-7513. [7] H.H. See, S. Stratz, P.C. Hauser, Electro-driven extraction across a polymer inclusion membrane in a flow-through cell, J. Chromatogr. A 1300 (2013) 79-84. [8] J. Schimdt-Marzinkowski, H.H. See, P.C. Hauser, Electric field driven extraction of inorganic anions across a polymer inclusion membrane, Electroanalysis 25 (2013) 1879-1886. [9] L. Zapala, J. Kalembkiewicz, E. Sitarz-Palczak, Studies on equilibrium of anthranilic acid in aqueous solutions and in two-phase systems: aromatic solvent-water, Biophys. Chem. 140 (2009) 91-98. [10] Safety evaluation of certain food additives. World Health Organization, Geneva, 2006. [11] N.A. Mamat, H.H. See, Development and evaluation of electromembrane extraction across a hollow polymer inclusion membrane, J. Chromatogr. A. 1406 (2015) 34-39. [12] C. Román-Hidalgo, M. Ramos-Payán, J.A. Ocaña-González, M.J. Martín-Valero, M.A. Bello-López, Agar films containing silver nanoparticles 143 as new support for electromembrane extraction, Anal. Bioanal. Chem. 407 (2015) 1519-1525. [13] M. Ramos-Payán, M.A. Bello-López, R.M. Fernández-Torres, M. Villar- Navarro, M. Callejón-Mochón, Electromembrane extraction (EME) and HPLC determination of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in wastewater samples, Talanta 85 (2011) 394-399. [14] J.N. Miller, J.C. Miller, Statistics and chemometrics for Analytical Chemistry, 4th ed., Prentice Hall, London, 2000. [15] S.P. Kaur, R. Rao, S. Nanda, Amoxicillin: a broad spectrum antibiotic, Int, J. Pharm. Pharm. Sci. 3 (2011) 30-37. [16] R. Runkel, M. Chaplin, G. Boost, E. Segre, E. Forchiell, Absorption, distribution, metabolism and excretion of naproxen in various laboratory animals and human subjects, J. Pharm. Sci. 61 (1972) 703-708. [17] E.J. Antal, C.E. Wright, B.L. Brown, K.S. Albert, L.C. Aman, N.W. Levin, The influence of hemodialysis on the pharmacokinetics of ibuprofen and its major metabolites, J. Clin. Pharmacol. 26 (1986) 184-190. [18] B.G. Katzung, D.E. Furst, Nonsteroidal anti-inflammatory drugs, disease-modifying antirheumatic drugs, nonopioid analgesics, drugs used in gout, in: Basic and clinical pharmacology, 7th Ed., Appliton and Lang Stamford, Connecticut, 1998. [19] B.E. Cham, J.H.M. Dykman, F. Bochner, Urinary excretion of aspirin, Br. J. Clin. Pharmac. 14 (1982) 562-564. [20] A.P. Pagani, G.A. Ibañez, Second-order multivariate models for the processing of standard-addition synchronous fluorescence–pH data. Application to the analysis of salicylic acid and its major metabolite in human urine, Talanta 122 (2014) 1-7.