Otimização da determinação e previsão da extensão das reações de Maillard em suplementos proteicos

Universidade do Minho Escola de Ciências Teresa da Conceição Martins Nogueira outubro 2019 Otimização da determinação e previsão da extensão das reações de Maillard em suplementos proteicos Teresa da Conceição Martins Nogueira Otimização da determinação e previsão da extensão das reações de Maillard em suplementos proteicos UMinho|2019 Universidade do Minho Escola de Ciências Teresa da Conceição Martins Nogueira outubro 2019 Otimização da determinação e previsão da extensão das reações de Maillard em suplementos proteicos Trabalho efetuado sob a orientação da Engenheira Elisabete Cristina Neiva Araújo e da Professora Doutora Sílvia Manuela Monteiro Alves Pereira Lima Dissertação de Mestrado Mestrado em Técnicas de Caracterização e Análise Química II DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição CC BY https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ III Agradecimentos “O querer e o trabalho transformam um sonho em realidade”. Contudo, sem a ajuda imprescindível dos muitos que me acompanharam neste último ano, este sonho não teria chegado ao fim. Começo por agradecer à minha orientadora, professora doutora Sílvia Lima, pela sua compreensão e disponibilidade para me receber e ouvir ao longo de todo o ano de tese. Agradeço ainda à minha supervisora na Prozis, Elisabete Araújo. Agradeço ainda ao Professor António Vicente e em particular ao Pedro Silva, da Escola de Engenharia Biológica, pela excelente forma como me receberam no LIP e pelos equipamentos cedidos. Aos meus colegas de laboratório Marta e o Luís por todo o apoio, paciência, transmissão de confiança e partilha de conhecimentos que se revelaram fundamentais para continuar este percurso. Agradeço ainda aos responsáveis e colaboradores da Prozis pela excelente forma como me acolheram e apoiaram e pelos conhecimentos que me transmitem diariamente. Aos meus pais e irmãos que estiveram sempre presentes, pelo apoio incondicional, pelos ensinamentos de vida e por sempre me incentivarem a continuar e nunca desistir. Por último, mas não menos importante, um obrigada especial a todos os meus amigos que sempre estiveram lá nos bons e maus momentos. IV Declaração de Integridade Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. V Resumo Otimização da determinação e previsão da extensão das reações de Maillard em suplementos proteicos O soro de leite é um subproduto da coagulação do leite, sendo atualmente muito procurado por parte das indústrias de suplementação alimentar por ser altamente rico em proteínas e lactose que fortificam os alimentos de modo a aumentar o seu valor nutricional. O soro de leite no estado líquido não é muito utilizado, no entanto, a sua produção excede as 140 milhões de toneladas, sofrendo posteriormente processos de desidratação e separação por membrana para produção de soro de leite em pó, soro de leite concentrado (WPC com teor proteico entre 35 e 80%) e soro de leite isolado (WPI com teor proteico superior a 90%). Estes produtos são sensíveis quando sujeitos a diferentes temperaturas e a condições adversas de humidade, iniciando um conjunto de processos e reações que levam à formação de compostos corados e à sua degradação. Como o soro de leite contém um elevado teor de proteínas e de aminoácidos como a lisina, que reagem com açúcares redutores como a lactose, pode ocorrer a formação de produtos da reação de Maillard, a principal via de degradação do soro de leite. Esta reação é responsável pelo desenvolvimento de cor ( browning ) quando os produtos são sujeitos a um longo período de armazenamento. Neste trabalho, foram analisadas amostras de soro de leite concentrado e isolado com diferentes períodos de armazenamento. Foi seguido o aumento da humidade e da atividade da água, cuja presença é responsável por um aumento da degradação do soro de leite. A extensão da degradação foi medida recorrendo a testes de alteração de cor. A quantificação da reação de Maillard foi conseguida seguindo a formação de um dos produtos da reação, o 5hidroximetilfurfural, usando métodos espetrofotométricos, e seguindo a diminuição do teor de lisina e de lactose por cromatografia iónica. Palavras-chave: Browning, Reação de Maillard, Soro de leite, WPC, WPI VI Abstract Optimization of quantification and prediction of the extension of Maillard reaction in protein supplements Whey powder is a milk coagulation by-product, which is currently persued by food supplementation industries due to is high protein and lactose concentration that increases food’s nutritional value. Liquid whey is not widely used though, its production exceeds 140 million tonnes. This product is subsequently dehydrated and submited to membrane separation processes in order to produce whey powder, concentrated whey (WPC with protein content between 35 and 80%) and isolated whey (WPI with protein contente greater than 90%). These products are sensitive to different temperatures and adverse humidity conditions, that initiate a set of processes and reactions that lead to the formation of coloured compounds and subsequent degradation. Whey powder is made up of a high content of proteins and amino acids, such as lysine, which reacts with reducing sugars like lactose. This process leads to the formation of Maillard reaction products, the main pathway of whey degradation. Maillard reaction is responsible for browning when products are subjected to a long storage period. In this work, concentrated and isolated whey samples with different storage periods were analysed. The increase of moisture and water activity were followed, which are parameters that aggravate whey degradation. The extent of the degradation was measured using color change tests. The quantification of the Maillard reaction was achieved by analysing one of the reaction products, 5-hydroxymethylfurfural, using spectrophotometric methods, and following the decrease in lysine and lactose content by ion chromatography. Key words: Browning, Maillard Reaction, Whey, WPC, WPI VII Índice DECLARAÇÃO .................................................................................................................................... I AGRADECIMENTOS .......................................................................................................................... III DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE ........................................................................................................ IV RESUMO........................................................................................................................................... V ABSTRACT ....................................................................................................................................... VI ÍNDICE DE FIGURAS ......................................................................................................................... IX ÍNDICE DE TABELAS ......................................................................................................................... XI LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................................................ XIII 1. CONTEXTUALIZAÇÃO ............................................................................................................... 1 2. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 2 2.1. SORO DE LEITE ....................................................................................................................... 2 2.1.1. Composição do soro de leite ........................................................................................... 5 2.1.2. Degradação do soro de leite ............................................................................................ 6 2.2. REAÇÕES DE MAILLARD ............................................................................................................ 7 2.2.1. Reação de Maillard no soro de leite ................................................................................. 9 2.3. MÉTODOS ANALÍTICOS ........................................................................................................... 13 2.3.1. Método de Dumas para determinação de proteína......................................................... 13 2.3.2. Método colorimétrico para avaliação das propriedades organoléticas ............................. 14 2.3.3. Cromatografia iónica ..................................................................................................... 15 3. MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................................... 18 3.1. MATERIAL DE TRABALHO ......................................................................................................... 18 3.2. DETERMINAÇÃO DE HUMIDADE ................................................................................................. 20 3.3. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROTEÍNA ...................................................................................... 20 3.4. DETERMINAÇÃO DA COR .......................................................................................................... 21 3.5. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA ÁGUA, AW ................................................................................. 21 3.6. DETERMINAÇÃO DE HMF POR ESPETROFOTOMETRIA ..................................................................... 22 3.7. DETERMINAÇÃO DE LACTOSE POR CROMATOGRAFIA IÓNICA ............................................................. 22 3.8. DETERMINAÇÃO DE LISINA POR CROMATOGRAFIA IÓNICA ................................................................ 24 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................. 26 4.1. DETERMINAÇÃO DE HUMIDADE ................................................................................................. 26 4.2. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROTEÍNA ...................................................................................... 29 VIII 4.3. DEGRADAÇÃO DO SORO DE LEITE PELA ALTERAÇÃO DA COR ............................................................. 31 4.4. ESTUDO DA ATIVIDADE DE ÁGUA AO LONGO DO TEMPO ................................................................... 36 4.5. DETERMINAÇÃO DE HMF ........................................................................................................ 43 4.6. ANÁLISE DE AMOSTRAS POR CROMATOGRAFIA IÓNICA .................................................................... 44 4.6.1. Determinação de lactose............................................................................................... 44 4.6.2. Determinação de lisina ................................................................................................. 49 5. CONCLUSÃO ......................................................................................................................... 54 6. BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................... 56 2 2. Introdução O soro de leite é um subproduto da produção de queijo e de caseína, com um elevado valor nutricional e energético.1 Durante muitos anos, o soro de leite não foi valorizado, sendo utilizado em ração para animais e descartado para cursos de água e terra. A sua eliminação deliberada para o meio ambiente causa graves danos, uma vez que este é considerado um produto altamente poluente, com um BOD ( Biochemical Oxygen Demand) entre 30000 - 50000 mg/L e um COD ( Chemical Oxygen Demand ) entre 60000 - 80000 mg/L. Este subproduto provoca eutrofização do meio aquático, uma vez que a elevada concentração de nutrientes presentes no soro, favorece a proliferação de microrganismos, que por sua vez, consomem elevadas quantidades de oxigénio, causando um desequilíbrio entre o oxigénio presente no meio e a procura deste pelos seres vivos, alterando a fauna e flora locais.2 Por esse motivo, o Conselho da União Europeia catalogou, a 24 de setembro de 1996, o soro de leite como sendo um resíduo contaminante, proibindo o seu escoamento para o ecossistema. Esta decisão levou muitas empresas a desenvolver processos de conversão do soro lácteo em produtos alimentares reconhecidos como tendo um elevado valor nutricional e funcional.3 Deste modo, com o reaproveitamento do soro de leite é possível diminuir o seu impacto a nível ambiental e facultar às indústrias uma matéria prima de elevado valor nutricional, tendo sido desenvolvidos novos métodos para separação, concentração e purificação dos seus constituintes. Podem ser obtidos produtos tão variados como fórmulas infantis, gelados, produtos de higiene, assim como suplementos proteicos para regeneração muscular em desportistas.4 2.1. Soro de leite O soro de leite é uma substância aquosa produzida após coagulação da caseína no leite (ácida ou enzimática) durante a produção de queijo, cuja composição varia de acordo com a origem do leite e os processos envolvidos na sua produção (Figura 1).5 3 Figura 1 – Representação esquemática do processo de produção do soro de leite.5 Após produção do soro de leite, este é sujeito a diferentes processos como a remoção da água, aumento da proporção de proteína e alteração da sua composição mineral, havendo assim um maior aproveitamento deste subproduto. O primeiro processo é denominado de secagem por pulverização e consiste na remoção de água do soro de leite, sujeitando-o a elevadas temperaturas por um curto período de tempo, obtendo o soro de leite em pó. Anualmente, por 140 milhões de toneladas de soro de leite produzidos, 20% é seco correspondendo a 1,8 milhões de toneladas de pó.6 De seguida, o soro de leite em pó, pode ser sujeito a processos de separação por membrana, que permitem a separação, concentração e fracionamento das proteínas do soro e da lactose. Osmose reversa, nanofiltração, ultrafiltração e microfiltração são algumas das técnicas disponíveis para tal.4,7,8 A ultrafiltração é o processo mais utilizado para aumentar a concentração de proteína nos produtos de soro de leite, produzindo concentrados proteicos de soro de leite, também denominados de WPC’s – Whey Protein Concentrate . Este método consiste na filtração do soro de leite através de uma membrana porosa, permitindo a passagem de componentes de baixo peso molecular, como a lactose e sais minerais, e retendo componentes de maior peso molecular, como 4 as proteínas. Assim, o produto retido na membrana de ultrafiltração vai ser mais rico em proteínas que o soro de leite original e o produto que atravessou a membrana é mais rico em lactose e sais. Os concentrados proteicos são produzidos a partir de uma elevada variedade de soros de leite e a sua concentração proteica varia entre 35% e 90%, sendo estes últimos os mais procurados pela indústria alimentar, uma vez que são caraterizados pelas suas propriedades funcionais desejáveis de gelatinização, emulsificação e retenção de água.3 Podem ser distinguidos diferentes tipos de concentrados proteicos de soro de leite, este projeto dedicou-se à análise dos tipos: concentrado (WPC) e isolado (WPI – Whey Protein Isolate ), estes diferem principalmente na sua composição, uma vez que o WPI tem uma concentração de proteína de 90 % e, proporcionalmente, menor concentração de lactose e minerais, que o WPC, que tem cerca de 80% de proteína (Tabela 1).1 Tabela 1 – Composição do soro de leite concentrado (WPC) e isolado (WPI) 1 O processamento do soro de leite para produção do soro de leite em pó permite que a manutenção da sua qualidade seja prolongada, o teor de sólidos do produto seco seja constante e as variações sazonais sejam minimizadas. Sendo possível encontrar produtos alternativos que sejam atrativos para os consumidores, a partir de tecnologia alternativa de baixo custo mais atrativa para os produtores. Componentes WPC (%) WPI (%) Humidade 4,14 - 6,01 2,4 - 5,57 Proteína 72,0 - 76,6 88,6 - 92,7 Lactose 2,13 - 5,75 0,42 - 0,46 Cinza 2,52 - 6,04 1,37 - 2,15 Sódio 0,15 - 1,71 0,36 - 0,42 Potássio 0,07 - 0,46 0,10 - 0,16 Cálcio 0,23 - 1,05 0,20 - 0,24 Magnésio 0,02 - 0,40 0,02 - 0,03 Fósforo 0,20 - 1,30 0,05 5 2.1.1. Composição do soro de leite Do ponto de vista nutricional o soro de leite carateriza-se por ser uma excelente fonte de lactose, proteínas, péptidos e aminoácidos funcionais, assim como certos lípidos, vitaminas e minerais, que permitem a produção de alimentos com elevado valor nutricional, comparativamente a outros produtos do mercado.9 Apresenta um menor teor de caseínas e lípidos, comparativamente ao leite, e um elevado teor de proteína uma vez que as proteínas do soro de leite não coagulam aquando da produção do queijo, permanecendo em solução. As proteínas do soro compreendem 50% de βlactalbumina, 25% de αlactalbumina e 25% proteínas como imunoglobulinas, lactoferrinas, entre outras (Tabela 2 e 3).3 Tabela 2 - Constituintes do leite e do soro de leite bovino 9 Componentes Teor % (p/v) Leite Soro de leite Caseína 2,8 < 0,1 Proteína do soro 0,7 0,7 Lípidos 3,7 0,1 Cinza 0,7 0,5 Lactose 4,9 4,9 Sólidos totais 12,8 6,3 Tabela 3 – Principais aminoácidos presentes no soro de leite (WPC) Aminoácido m/100 g de proteína (g) Aminoácido m/100 g de proteína (g) Ácido Glutâmico 13,9 Alanina 3,8 Ácido Aspártico 10,2 Fenilalanina 2,6 Leucina 7,8 Tirosina 2,3 Lisina 6,5 Cistina 2,2 Treonina 5,3 Metionina 1,9 Isoleucina 4,7 Triptofano 1,8 Prolina 4,5 Arginina 1,8 Valina 4,4 Glicina 1,4 Serina 3,8 Histidina 1,4 6 O soro lácteo pode ser classificado em soro de leite doce ou ácido e as suas principais diferenças residem na concentração de minerais presente, na acidez e na composição das frações proteicas do soro (Tabela 4).3 Tabela 4 - Composição e proporções dos constituintes do soro de leite ácido e doce 10 O soro de leite ácido, apresenta um pH inferior a 5 e resulta de processos que recorrem à fermentação, à adição de ácidos orgânicos ou adição de minerais para coagulação da caseína. Este soro é formado na produção de queijos Cottage e Ricotta , por exemplo. O soro de leite doce é o mais comum e resulta da produção de queijos como o Cheddar e o Mozzarella. Neste a coagulação da caseína ocorre pela ação da quimosina, com baixos níveis de acidez, possuindo um pH entre 5,8 e 6,6. 2.1.2. Degradação do soro de leite A produção do soro de leite em pó envolve uma série de processos contínuos como o tratamento térmico, a evaporação e a secagem por pulverização. A estes processos estão associadas variáveis que afetam a eficiência do processo e a qualidade do produto, uma vez que causam inúmeras interações físicas e químicas nos constituintes do leite. Os processos físicos envolvendo a gordura e a lactose, juntamente com reações químicas, diminuem o tempo de vida útil do soro de leite em pó assim como de outros produtos derivados do leite. Longos períodos de armazenamento levam à perda do seu valor nutricional, por perda de Componentes Soro de leite ácido (g/L) Soro de leite doce (g/L) Total de sólidos 63,0-70,0 63,0-70,0 Lactose 44,0-46,0 46,0-52,0 Proteína 6,0-8,0 6,0-10,0 Cálcio 1,2-1,6 0,4-0,6 Fosfato 2,0-4,5 1,0-3,0 Lactato 6,4 2,0 Cloreto 1,1 1,1 7 lisina e das qualidades sensoriais, bem como das propriedades funcionais e físicas que são importantes para o uso do soro de leite como ingrediente em produtos alimentares. A qualidade do soro de leite em pó é influenciada por diversos fatores durante o seu processamento e armazenamento, entre os quais, os parâmetros e técnicas adotadas durante a produção, as técnicas e condições de secagem do soro de leite e as condições de armazenamento. Existem três processos principais de deterioração do soro de leite que determinam o seu tempo de vida útil, sendo elas a cristalização da lactose, a oxidação lipídica e as reações de Maillard (reação não enzimática de escurecimento).11 A reação de Maillard é o nome genérico de uma classe importante de reações deteriorativas em produtos derivados de leite. Esta inicia-se com a condensação da lactose com um grupo amino livre das cadeias laterais da lisina presente nas proteínas do leite. 2.2. Reações de Maillard O soro de leite representa uma elevada porção do comércio de produtos lácteos, uma vez que é utilizado diretamente pelos consumidores e como ingrediente numa elevada variedade de produtos alimentares produzidos. Estes têm um baixo teor de humidade e gordura e, quando armazenado em condições secas e arrefecidas, têm um tempo de vida que excede os dois anos. No entanto, este produto possui uma concentração relativamente elevada de lactose (50%) e de proteínas (8%) com lisina na sua constituição, que na presença de humidade rapidamente participam na reação de Maillard, conhecida como o principal mecanismo de deterioração ativo durante o armazenamento deste tipo de produtos. Resulta na diminuição da qualidade proteica e na alteração indesejada das propriedades organoléticas. Esta reação não enzimática é afetada por fatores químicos como a concentração das espécies iniciais, o pH, teor de água e presença de substâncias humidificadoras ou bissulfito, e por fatores físicos como a temperatura e tempo de processamento e armazenamento. Para além de levar à diminuição do valor nutricional do soro de leite, leva também ao desenvolvimento de sabores atípicos, cor indesejada, diminuição da solubilidade, mudança de textura, destruição de vitaminas e aumento da acidez.12 8 As reações de Maillard são reações que ocorrem de uma forma espontânea e natural, envolvendo uma rede complexa de reações não enzimáticas reversíveis em determinadas condições de temperatura e atividade da água. Podem ser dividias em três fases: reações de Maillard iniciais, intermédias e finais. Esta divisão permite sistematizar as reações. Na fase inicial um grupo amino de um aminoácido, péptido ou proteína reage, por condensação, com uma variedade de compostos que contenham um grupo carbonilo, tipicamente com açúcares redutores (glucose, frutose ou lactose) ou seus derivados. Esta reação forma uma base de Schiff, uma glicosilamina (imina) instável, que sofre rearranjo formando uma aminodesoxicetose, um produto de Amadori (Figura 2).13 Figura 2 -- Fase inicial da reação de Maillard, da condensação entre o açúcar e o grupo amino à formação do produto de Amadori.14 As reações de Maillard intermédias consistem na quebra do produto de Amadori com formação de diversos produtos que seguem diferentes processos dependendo do pH do meio. Por fim, as reações de Maillard finais levam ao desenvolvimento de melanoidinas (Figura 3), compostos de elevado peso molecular, que são responsáveis pelo aparecimento da cor acastanhada nos produtos. 9 Figura 3 - Estrutura base das melanoidinas (R=H; glc=glucose).15 2.2.1. Reação de Maillard no soro de leite No soro de leite, a reação de Maillard, ocorre entre o grupo amino da cadeia lateral dos resíduos de lisina e o grupo carbonilo redutor da lactose. Na forma aberta, o aldeído deste açúcar, forma uma base de Schiff com a lisina que sofre rearranjo via Amadori, formando um produto de Amadori ligado à proteína, 1-desoxi-1-amino-lactulosillisina. Este composto é estável, desde que as condições de temperatura não sofram variações drásticas e o tempo de reação não seja prolongado. Nesta fase há perda de valor nutritivo do soro de leite, devido ao bloqueio dos resíduos de lisina que deixam de estar disponíveis para a digestão (Figura 4).12 Com a formação do produto de Amadori as reações começam a ser mais complexas, uma vez que a sua degradação gera uma grande variedade de subprodutos de baixo peso molecular, alguns dos quais responsáveis pelo desenvolvimento de mau sabor. Figura 4 - Esquema inicial da reação de Maillard entre a lactose e a lisina. (gal= galactose, R= cadeia proteica). 16 10 Na fase intermédia, o produto de Amadori é sujeito a quebra por três vias principais originando a 3-desoxiosona, por meio da 1,2-enolisação a pH ácido, a 1-desoxiosona por 2,3enolisação a pH neutro ou alcalino, e a 4-desoxiosona, sendo esta última mais importante em dissacarídeos em condições ligeiramente alcalinas. Todas as vias levam à formação de desoxiosonas, que são intermediários muito reativos, facto que dificulta a sua quantificação. A enolisação, ciclização e eliminação de água representam as principais etapas de reação para transformação de desoxiosonas.17 A via da 3-desoxiosona (Figura 5, via A) leva à formação de hidroximetilfurfural (HMF) e pirralina, que são produtos formados em aquecimento, mas em pequenas quantidades.16 A formação da 1-desoxiosona (Figura 5, via B) é a via mais importante a pH neutro. A ciclização e enolização da 1-desoxiosona leva à formação de β-piranona e 3-furanona, que são compostos instáveis, enquanto que a fragmentação resulta em redutonas e α-dicarbonilos.16 A terceira via de degradação do produto de Amadori, a via da 4-desoxiosona (Figura 5, via C) é importante para dissacarídeos, sob condições alcalinas. Os dois produtos que são formados, a 4-desoxiaminoreductona e 5,6-dihidro-3-hidroxipiridona são degradados após um aquecimento prolongado.16 11 Figura 5 - Quebra do produto de Amadori no estado avançado da reação de Maillard, sob condições ácidas, neutras e básicas (gal=galactose, R=cadeia proteica).16 A fase final da reação de Maillard ainda não está bem caracterizada do ponto de vista químico. No entanto, sabe-se que são formados pigmentos acastanhados, que provêm da formação de melanoidinas. Estes compostos têm um elevado peso molecular e contêm azoto na sua constituição. No entanto, os pigmentos castanhos são também formados sem a presença de azoto, pela degradação do açúcar. Os resíduos de lisina devem estar envolvidos na formação das melanoidinas, uma vez que a perda de lisina aumenta durante a fase final.16 Do ponto de vista analítico, são muitos os intermediários da reação de Maillard que possuem um papel fundamental na segurança alimentar e na perda nutricional, alguns dos quais estão associados à formação do produto de Amadori. Existem três métodos diretos que permitem quantificar o produto de Amadori. Pela determinação de furosina, um aminoácido artificial que se forma por hidrólise ácida do produto de 18 3. Materiais e Métodos 3.1. Material de trabalho Para a realização deste trabalho foi utilizado como material de estudo dois tipos de soro de leite, o WPC e o WPI (Figura 7). Este material foi adquirido pela Prozis a diferentes fornecedores. Assim para o WPC foram utilizadas amostras de quatro fornecedores diferentes (A, B, C e D) e para o WPI foram utilizadas amostras apenas do fornecedor A. As amostras analisadas correspondem a lotes diferentes, tendo sido produzidas em diferentes meses do ano. Figura 7 – Aspeto de uma amostra de WPC (à esquerda) e de uma amostra de WPI (à direita). O material de análise chegou à empresa em sacos selados para manter a integridade do soro de leite, sendo as amostras analisadas posteriormente colocadas em embalagens de abertura fácil (zip) que serão denominados ao longo da tese como WPC-z e WPI-z, e em embalagens seladas, que corresponderá a WPC-s. Estas embalagens foram armazenadas numa sala de ambiente controlado, com temperatura de 21°C e 69,3 % de humidade relativa, até à data de análise. Para cada amostra foi criado um código de referência de acordo com o que consta nas Tabelas 5, 6 e 7. 19 Tabela 5 – Designação das amostras de WPC em embalagens zip de diferentes fornecedores com diferentes tempos de armazenamento Soro de leite Embalagem Fornecedor tA* Designação WPC Zip A 7 WPC-zA7 WPC Zip A 11 WPC-zA11 WPC Zip A 14 WPC-zA14 WPC Zip A 15 WPC-zA15 WPC Zip A 17 WPC-zA17 WPC Zip A 18 WPC-zA18 WPC Zip A 19 WPC-zA19 WPC Zip A 21 WPC-zA21 WPC Zip A 24 WPC-zA24 WPC Zip A 26 WPC-zA26 WPC Zip A 27 WPC-zA27 WPC Zip A 29 WPC-zA29 WPC Zip A 31 WPC-zA31 WPC Zip A 34 WPC-zA34 WPC Zip A 40 WPC-zA40 WPC Zip A 43 WPC-zA43 WPC Zip B 9 WPC-zB9 WPC Zip C 16 WPC-zC16 WPC Zip C 23 WPC-zC23 WPC Zip D 43 WPC-zD43 *tA corresponde ao tempo de armazenamento das amostras, em meses Tabela 6 . Designação das amostras de WPI em embalagens zip do fornecedor A com diferentes tempos de armazenamento Soro de leite Embalagem Fornecedor tA* Designação WPI Zip A 13 WPI-zA13 WPI Zip A 15 WPI-zA15 WPI Zip A 16 WPI-zA16 WPI Zip A 17 WPI-zA17 WPI Zip A 18 WPI-zA18 WPI Zip A 19 WPI-zA19 WPI Zip A 21 WPI-zA21 WPI Zip A 23 WPI-zA23 WPI Zip A 24 WPI-zA24 WPI Zip A 25 WPI-zA25 WPI Zip A 26 WPI-zA26 WPI Zip A 27 WPI-zA27 WPI Zip A 30 WPI-zA30 WPI Zip A 31 WPI-zA31 *tA corresponde ao tempo de armazenamento das amostras, em meses 20 Tabela 7 - Designação das amostras de WPC em embalagens seladas do fornecedor A com diferentes tempos de armazenamento Soro de leite Embalagem Fornecedor tA* Designação WPC Selada A 7 WPC-sA7 WPC Selada A 16 WPC-sA16 WPC Selada A 17 WPC-sA17 WPC Selada A 20 WPC-sA20 WPC Selada A 25 WPC-sA25 WPC Selada A 28 WPC-sA28 WPC Selada A 29 WPC-sA29 WPC Selada A 31 WPC-sA31 WPC Selada A 34 WPC-sA34 WPC Selada A 40 WPC-sA40 WPC Selada A 43 WPC-sA43 *tA corresponde ao tempo de armazenamento das amostras, em meses 3.2. Determinação de humidade Para análise da humidade foi seguido o método 935.29 da AOACMétodos Oficias de Análise - Official Methods of Analysis .29,30 Começou-se por pesar 3,00±0,01 g de amostra, para placas de Petri de peso conhecido. As placas foram colocadas numa estufa Venticell a 105 °C, durante 2 h. Após esse tempo, foram retiradas e colocadas num exsicador durante 30 minutos a arrefecer. De seguida, foram pesadas e colocadas por mais 1 h na estufa, sendo este processo repetido até que a variação de peso, em medições sucessivas, fosse inferior a 0,002 g. A diferença entre o peso inicial e o peso final permite obter o valor de humidade na amostra. Cada amostra foi analisada em duplicado, sendo que os resultados apresentados correspondem à média entre esses valores. 3.3. Determinação do teor de proteína Para determinação do teor de proteína foi utilizado o método de Dumas, seguindo a norma ISO 14891:2002.30 Começou por se fazer uma reta de calibração, usando como padrão de calibração, o ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), em quantidades entre 10 e 400 mg. A massa de cada padrão foi pesada num papel de filtro e em seguida foi colocada num analisador elementar LECO. A reta de calibração foi obtida usando o programa do equipamento. 21 Para as amostras, foi pesado 0,285±0,005 g de cada amostra para uma folha de alumínio. De seguida, foram colocadas no analisador elementar LECO. Este ensaio permite determinar o teor de nitrogénio que, como descrito anteriormente, multiplicado por um fator de 6,38, permite obter o teor proteico de cada amostra. 3.4. Determinação da cor A determinação da cor das amostras de soro de leite foi realizada em triplicado recorrendose a um colorímetro CHROMA METER CR-400/410 MINOLTA da AQUATEKNICA, S.A. no Laboratório para Indústria e Processos da Universidade do Minho. Os resultados foram obtidos, inicialmente, no sistema da Comissão Internacional de lluminação L*a*b* sendo, de seguida, transformados em códigos RGB codificados de 8 bits recorrendo à ferramenta matemática, Matlab, utilizando a função lab2rgb (por exemplo: lab2rgb([86,6 -0,17 21],’OutputType’,’uint8’)). Por último, os códigos RGB obtidos foram convertidos em códigos de cor, com recurso ao site “ RGB to Hex color conversion ”.31 3.5. Determinação da atividade da água, aw A medição da atividade da água, aw foi realizada a 23 °C num medidor de atividade de água DewPoint Water Activity Meter 4TE, da AQUALAB, no Centro de Engenharia Biológica da Universidade do Minho. Foi pesado aproximadamente 1,000 g de amostra para uma cápsula, que foi colocada num medidor de atividade de água. Fechou-se, em seguida, a tampa da câmara e esperou-se pelo equilíbrio do vapor. Durante este período um raio infravermelho focado num espelho determina o ponto de orvalho da amostra, que é traduzido em atividade de água. Este ensaio foi realizado em triplicado em cada amostra. 22 3.6. Determinação de HMF por espetrofotometria Para quantificar o HMF formado começou por se pesar 1,000 g de amostra para um tubo de falcon de 15 mL, ao qual se adicionou 10 mL de água destilada. A solução foi colocada num banho a 63 °C durante 30 minutos. De seguida, foram centrifugados 5 mL da suspensão anterior, numa centrifuga MPW-260R a 6000 rpm, durante 20 minutos. Transferiu-se 4,5 mL do sobrenadante para um tubo novo e centrifugou-se novamente, nas condições anteriores. A 4 mL de sobrenadante obtido, adicionou-se 500 μL de Carrez I (solução aquosa de K4Fe(CN)6, 15% (p/v)) e 500 μL de Carrez II (solução aquosa de acetato de zinco, 30% (p/v)). A suspensão obtida foi centrifugada nas mesmas condições. Para se proceder à análise por espetrofotometria foi necessário preparar a amostra e um branco de referência. De modo a preparar a amostra, foi colocado num balão volumétrico de 25 mL, 1 mL do sobrenadante anterior e perfez-se o volume com água destilada. Para o branco o volume foi perfeito com uma solução bissulfito de sódio 2% (o bissulfito de sódio degrada o HMF eliminando a sua absorção). A absorvância das soluções foi lida num espetrofotómetro photoLab 7600 UV-VIS ao comprimento de onda de 284 nm, comprimento de onda no qual o HMF apresenta um pico de absorção máximo e a 336 nm, comprimento de onda ao qual o HMF não absorve. A concentração de HMF foi determinada pela diferença de absorvância entre os dois comprimentos de onda, usando a Equação 7.22 [𝐻𝑀𝐹](mg kg) = (Abs284−Abs336)×149,7×5×factor de diluição massa amostra (g) (Equação 7) Este ensaio foi repetido duas vezes para cada amostra analisada, sendo que os resultados apresentados correspondem à média dos resultados obtidos. 3.7. Determinação de lactose por cromatografia iónica Para determinação de lactose no soro de leite, foi utilizado um cromatógrafo iónico sistema Dionex™ ICS-6000 Capillary HPIC™ da Thermo Scientific™. Usou-se uma coluna CarboPAC SA10 à temperatura de 45 °C. Como eluente usou-se uma solução aquosa de hidróxido de potássio 100 mM com um fluxo de 0,250 μL/min. Foi utilizado um detetor de deteção integrada por pulso 23 amperométrico, com um elétrodo de trabalho de ouro, descartável e com um elétrodo de referência de Ag/AgCl. O volume de injeção das amostras e dos padrões foi de 10 μL e a corrida teve uma duração de 25 minutos. Associado ao equipamento utilizou-se o programa Chromeleon para identificação e quantificação dos picos dos cromatogramas dos açúcares. A determinação da lactose nas amostras de WPC e WPI foi realizada em simultâneo com as restantes análises efetuadas no laboratório da Prozis. Para servir do interesse geral do laboratório foi construída uma reta de calibração genérica, com vários açúcares. De modo a ser possível identificar os picos nos cromatogramas da reta de calibração, foram corridos individualmente os cinco padrões de açúcar, a sacarose, a glucose, a frutose, a lactose e a maltose. Foram preparadas soluções de concentração 400 mg/L de cada um dos açúcares. Estas soluções foram colocadas em vials e injetadas no cromatógrafo (10 μL). Para a reta preparou-se uma solução aquosa de concentração 400 mg/L, com uma mistura dos cinco açúcares, tendo sido pesado 0,008 g de cada um deles para um balão volumétrico de 100 mL, cujo volume foi perfeito com água ultrapura. A partir desta, por diluição, foram feitas 7 soluções padrão de concentrações 200, 100, 75, 50, 25, 10 e 5 mg/L. Estas soluções foram colocadas em vials e injetadas no cromatógrafo (10 μL). Com recurso ao Chromeleon , e com base no tempo de retenção de cada açúcar, foi identificado cada sinal obtido nos espetros dos padrões de calibração. Ainda no programa foram construídas as curvas de calibração para cada açúcar, selecionando os pontos correspondentes à área do sinal do açúcar e eliminando 1-2 pontos de forma a que o coeficiente de correlação fosse superior a 0,995. Este processo foi repetido para cada açúcar, tendo cada um deles uma curva de calibração de função exponencial. As amostras foram analisadas em duplicado e tiveram uma preparação diferente das soluções padrão. Começou-se por pesar 1,000 g de cada amostra. Em seguida foram colocadas em balões volumétricos de 100 mL aos quais se adicionou 10 mL de água ultrapura, 200 μL de Carrez I e 200 μL de Carrez II, agitando entre cada adição. De seguida, o perfez-se o volume com água ultrapura. Das suspensões obtidas, foram transferidos cerca de 10 mL para tubos de falcon e centrifugou-se a 6000 rpm, durante 20 minutos. 24 Para garantir a inexistência de partículas em suspensão o sobrenadante foi filtrado com um filtro de 20 μm antes de ser injetado no cromatógrafo. 3.8. Determinação de lisina por cromatografia iónica Para determinação da lisina utilizou-se um cromatógrafo iónico da Thermo Scientific™, um sistema Dionex™ ICS-6000 Capillary HPIC™. A pré-coluna e coluna foram aminoPAC PA10, funcionando a uma temperatura de 30 °C, o volume de injeção foi de 10 μL, o fluxo foi de 0,250 μL/min, o tempo de corrida foi de 40 minutos e a temperatura do compartimento 25 °C. O detetor usado tinha deteção integrada por pulso amperométrico, com elétrodo de trabalho de ouro (elétrodo descartável) e com elétrodo de referência de Ag/AgCl. O eluente foi uma mistura de água ultrapura, hidróxido de sódio 0,25 M e de acetato de sódio 1 M, sendo a composição da mistura controlada pelo método do equipamento. A separação dos aminoácidos na coluna ocorreu por diferença de gradiente, iniciando a corrida com 16% de hidróxido de sódio e 0% de acetato de sódio, passando este para 40% aos 25 minutos de corrida ocorrendo assim separação dos aminoácidos carregados. Tal como no caso dos açúcares também para os aminoácidos foi construída uma reta de calibração genérica começando por preparar uma solução mãe de concentração total 0,002 mol/L, com uma mistura dos vinte aminoácidos (a prolina, o ácido glutâmico, a cisteína, a arginina, o ácido aspártico, a fenilalanina, a valina, a tirosina, o triptofano, a glicina, a serina, a treonina, a asparagina, a isoleucina, a alanina, a lisina, a metionina, a histidina, a glutamina e a leucina), cada um com uma concentração de 0,0001 mol/L. A partir desta solução aquosa, foram feitas nove soluções padrão de concentrações 2;1,5; 1,0; 0,75; 0,50; 0,30; 0,10; 0,075 e 0,020 nmol/μL. Estas soluções foram filtradas antes de serem injetadas no cromatógrafo. Para identificar os picos nos cromatogramas da reta de calibração, foram corridos individualmente os vinte aminoácidos. Foram preparadas soluções de concentração de 2 nmol/μL de cada um dos aminoácidos. Estas soluções foram colocadas em vials e injetadas no cromatógrafo. Recorrendo ao Chromeleon , e com base no tempo de retenção de cada aminoácido, foi identificado cada sinal obtido no cromatograma dos padrões de calibração. Ainda no programa foram construídas as curvas de calibração para cada aminoácido, selecionando os pontos 25 correspondentes à área do sinal respetivo e eliminando 1-2 pontos de forma a que o coeficiente de correlação fosse superior a 0,995. Este processo foi repetido para cada aminoácido, tendo cada um deles uma curva de calibração de função exponencial. A preparação da amostra difere da preparação das soluções padrão. Começou-se por pesar 0,500 g de WPC ou WPI, em duplicado, que foi transferida para um tubo de Falcon de 15 mL, ao qual se adicionou 5 mL de água ultrapura. De seguida, o falcon foi colocado no vortex durante 10 segundos a 40 Hz. Posteriormente, foi adicionado 2,5 mL de ácido sulfossalicílico 5%, ficando a solução a repousar durante 30 minutos a 5 °C. Por fim, a solução foi centrifugada durante 15 minutos a 6000 rpm. Recolheu-se 5 mL do sobrenadante e diluiu-se 10 vezes com água ultrapura antes de injetar no cromatógrafo. 26 4. Resultados e Discussão Atendendo aos objetivos propostos para a realização da tese, foram analisadas amostras de soro de leite em pó, WPC e WPI provenientes de diferentes fornecedores, com um tempo de armazenamento entre os 7 e os 43 meses. Estas amostras foram fornecidas pela Prozis e mantidas nas mesmas condições de armazenamento, à temperatura de 21°C e humidade relativa de 69,3%. 4.1. Determinação de humidade Os produtos em pó, que são armazenados em ambientes húmidos, podem adsorver, espontaneamente, água à superfície. Em casos extremos, isto pode levar à aglomeração do pó, reduzindo ou impedindo o fluxo das partículas de água, ocorrendo uma diminuição da qualidade e desempenho do produto final e, consequentemente, da satisfação e confiança do cliente.32 Para avaliar o comportamento das amostras armazenadas, foi determinada a humidade de amostras de WPC e WPI, com diferentes tempos de armazenamento. Para esta análise foram utilizadas amostras de WPC armazenadas em sacos de abertura zip, do fornecedor A com tempos de armazenamento de 7 a 31 meses, do fornecedor B com 11 meses, do fornecedor C com 16 meses e do fornecedor D com 40 meses de armazenamento (Tabela 8). Foram também analisadas amostras de WPI em sacos de zip do fornecedor A com tempos de armazenamento de 15 a 31 meses. Pela análise do gráfico da Figura 8, verifica-se um aumento da humidade com o aumento do tempo de armazenamento. As amostras analisadas não apresentam uma variação significativa até ao mês 9 de armazenamento, apesar de já apresentam valores de humidade superiores ao valor de referência inicial, após produção (Tabela 8). A partir deste mês, ocorre um aumentosignificativo até ao mês 21, não apresentando depois um aumento significativo até ao mês 40. Provavelmente as amostras já absorveram o máximo de água possível. 27 O único resultado que não segue o comportamento esperado é o WPC-zA19, pois apresenta um teor de humidade inferior ao do mês anterior. Este pode ter resultado de um acondicionamento da amostra melhor, encontrando-se o saco de abertura zip mais fechado. Tabela 8 - Valores de humidade obtidos na análise de WPC (%H2O) e valores referentes à humidade inicial (%H2Oi), assim como a variação do teor de humidade (Δ%H2O) e respetivos desvios padrão (σ) Amostra tA* %H2O %H2Oi Δ%H2O 𝛔 WPC-zA7 7 4,84 4,40 0,44 0,013 WPC-zB9 9 5,73 5,30 0,43 0,010 WPC-zA14 14 5,39 4,70 0,69 0,001 WPC-zA15 15 6,18 4,80 1,38 0,051 WPC-zC16 16 6,87 5,28 1,59 0,000 WPC-zA17 17 6,41 4,50 1,91 0,004 WPC-zA18 18 7,18 4,40 2,78 0,016 WPC-zA19 19 6,76 4,70 2,06 0,063 WPC-zA21 21 8,42 4,70 3,72 0,006 WPC-zA24 24 8,75 4,90 3,85 0,001 WPC-zA29 29 7,95 4,50 3,45 0,013 WPC-zA31 31 8,43 4,70 3,73 0,010 WPC-zD40 40 8,40 4,70 3,70 0,001 *tA corresponde ao tempo de armazenamento das amostras, desde que foram produzidas, em meses Figura 8 - Gráfico da variação da humidade em amostras de WPC dos fornecedores A (preto), B (cinzento claro), C (amarelo torrado) e D (azul) em função do tempo de armazenamento. 34 Figura 12 - Gráfico da variação do b*, do “ chroma ”, do YI (índice de amarelo) e do Br (índice de browning ) em amostras de WPI armazenadas em sacos de abertura zip do fornecedor A em função do tempo de armazenamento das amostras. Foi também analisada, em triplicado, a variação total de cor das amostras de WPI do fornecedor A, em sacos de abertura zip, com tempo de armazenamento de 13 a 31 meses, correspondendo os resultados apresentados no gráfico da Figura 12 à média dos valores obtidos para cada amostra. Pela análise do gráfico, pode-se verificar um comportamento semelhante ao do WPC, no qual a intensidade da cor amarela aumentou com o aumento do tempo de armazenamento. Podese diferenciar duas fases na qual esta alteração é mais evidente, dos 13 até aos 21 meses de armazenamento e dos 23 até aos 31 meses, o que corrobora os dados anteriores nos quais as maiores alterações nas amostras ocorrem entre os 17 e os 21 meses. Observa-se ainda que as amostras de WPC têm uma tonalidade mais amarela que o WPI. Para amostras com o mesmo tempo de armazenamento é possível verificar que o WPC tem valores de YI e de b* superiores aos do WPI. O que pode dever-se ao facto de o WPI sofrer diferentes processos de separação por membrana para aumentar a concentração proteica que eventualmente eliminem ou inibam a formação de produtos corados. 35 Figura 13 - Gráfico da variação total de cor, ΔE, das amostras de WPI de saco de abertura zip do fornecedor A nos diferentes tempos de armazenamento. À semelhança do que foi feito para as amostras de WPC foi também determinada a diferença de cor entre amostras de WPI, usando a amostra com menor tempo de armazenamento, 13 meses, como cor padrão (Figura 13). Neste caso o comportamento observado não foi tão regular, sendo detetadas algumas amostras com tempo de armazenamento baixo e bastante diferença de cor (amostras com 17 e 19 meses de armazenamento), ao contrário do esperado pela análise da Figura 12. Analisando os valores de L*, a* e b* que nos permitem calcular o ΔE destas amostras verifica-se que a diferença observada se deve a uma maior diferença do valor de L* (Luminosidade) entre estas amostras e a amostra padrão (13 meses). Muito provavelmente já deveria haver uma diferença de luminosidade inicial associada ao processo de produção. Para as amostras com mais de 24 meses, o valor de ΔE encontra-se entre o 3,5 e o 5, havendo uma clara diferença entre a cor das amostras, sendo facilmente distinguidas como pode ser comprovado observando a Figura 14. Estes resultados sugerem que, à semelhança do observado para os resultados com amostras de WPC, há medida que o tempo de armazenamento aumenta, há um aumento da formação de compostos corados, que podem resultar da reação de Maillard, mas que as amostras de WPI são mais estáveis, uma vez que o desenvolvimento de cor é mais tardio. 36 Figura 14 – Panton de cor das amostras de WPC (imagem de cima) e das amostras de WPI (imagem de baixo) em função do tempo de armazenamento. Observando o panton criado (Figura 14) pode-se corroborar os dados obtidos anteriormente, uma vez que se observa que as amostras de WPC têm uma tonalidade mais escura em relação ao WPI. Apesar de existirem outliers, como indicado pelos valores de YI e Br, nota-se um escurecimento da tonalidade ao longo do tempo de armazenamento que corresponde a um aumento da quantidade das melanoidinas. 4.4. Estudo da atividade de água ao longo do tempo Os produtos alimentares em pó, são compostos suscetíveis de sofrer alterações físicas e/ou químicas, durante o processo de produção e de armazenamento. Estas ocorrem ao longo do tempo e estão dependentes de diversos fatores como a temperatura e a humidade relativa. Numa fase inicial, estes produtos encontram-se num estado vítreo amorfo, com uma reduzida quantidade de água na sua constituição. No entanto, quando este teor aumenta, as moléculas de água presentes alteram a estrutura física do produto, adquirindo uma forma “plástica”. Esta alteração é suficiente para que ocorra uma diminuição da qualidade do produto, com mudanças organoléticas facilmente detetáveis pelos clientes. Para quantificar este efeito, foi determinada a atividade da água para amostras de WPC de saco com abertura zip de do fornecedor A com 7 a 40 meses de armazenamento; do fornecedor B com 9 meses; do fornecedor C com 16 e 23 meses e do fornecedor D com 43 meses de armazenamento, Tabela 12. Os ensaios foram realizados em triplicado correspondendo os resultados apresentados à média dos resultados obtidos. Tempo 37 Tabela 12 - Valores de atividade de água (aw) de amostras de WPC dos fornecedores A, B, C e D em sacos de abertura zip e respetivos coeficientes de variação (CV%) Amostra tA* aw CV (%)** WPC-zA7 7 0,229 3,602 WPC-zB9 9 0,321 1,479 WPC-zA11 11 0,261 2,687 WPC-zA14 14 0,264 0,738 WPC-zC16 16 0,303 0,033 WPC-zA17 17 0,277 0,376 WPC-zA21 21 0,442 0,113 WPC-zC23 23 0,375 0,228 WPC-zA26 26 0,422 0,760 WPC-zA27 27 0,539 0,093 WPC-zA29 29 0,551 0,428 WPC-zA34 34 0,525 0,211 WPC-zA40 40 0,470 0,404 WPC-zD43 43 0,467 1,179 *tA corresponde ao tempo de armazenamento das amostras, desde que foram produzidas, em meses **CV corresponde ao coeficiente de variação De acordo com o gráfico da Figura 15, ocorre um aumento da atividade de água com o aumento do tempo de armazenamento das amostras. Estes dados vão de encontro aos resultados obtidos anteriormente para a humidade relativa, uma vez que o aumento da atividade da água está relacionado com o aumento da humidade.35 Figura 15 - Gráfico da atividade da água de amostras de WPC de sacos de abertura de zip dos fornecedores A, B, C e D, em função do tempo de armazenamento. 38 Pode ainda verificar-se que para o fornecedor A, a atividade da água não varia significativamente até ao mês 17, seguindo-se um aumento abrupto entre este mês e o mês 21, a partir do qual a atividade da água se mantém elevada. Quando se compara fornecedores, pode-se verificar que há algumas diferenças apesar de seguirem a mesma tendência. A amostra WPC-zB9, apresenta uma maior atividade da água que uma amostra de WPC-zA7, apesar de apresentar um valor de humidade semelhante (Figura 8). Isto pode indicar que a amostra tinha uma maior atividade de água desde a sua produção, uma vez que o seu processo de desidratação e concentração pode ter ocorrido em diferentes condições. Verifica-se que as alterações mais significativas ocorrem entre os meses 17 e 21, o que vem corroborar o tempo de vida útil do WPC de 18 meses, e confirmar dados anteriores. De seguida, foram analisadas as amostras de WPC fornecedor A em sacos selados com 7 a 43 meses de armazenamento, utilizando a mesma abordagem que para a análise das amostras de WPC em sacos zip (Tabela 13). Com esta análise foi possível aferir em que medida o acondicionamento das amostras por parte dos clientes (geralmente em sacos com abertura zip) determina o tempo de vida útil do produto. Tabela 13 - Valores de atividade de água de amostras de WPC, do fornecedor A, em sacos selados e respetivos coeficientes de variação (CV%). Amostra tA* aw CV (%) WPC-sA7 7 0,282 0,646 WPC-sA16 16 0,254 0,952 WPC-sA17 17 0,311 0,252 WPC-sA20 20 0,171 4,275 WPC-sA25 25 0,399 0,928 WPC-sA28 28 0,244 1,630 WPC-sA29 29 0,407 0,307 WPC-sA31 31 0,277 2,804 WPC-sA34 34 0,229 0,977 WPC-sA40 40 0,220 2,712 WPC-sA43 43 0,272 2,011 *tA corresponde ao tempo de armazenamento das amostras, desde que foram produzidas, em meses **CV corresponde ao coeficiente de variação. 39 O gráfico da Figura 16 compara os resultados das amostras WPC-sA com os WPC-zA e permite verificar que a atividade da água para as amostras de WPC em sacos selados com maior tempo de armazenamento é inferior à atividade da água em amostras de saco de zip equivalentes. Isto é determinante a longo prazo, uma vez que para longos períodos de armazenamento a atividade de água em sacos selados se mantém próxima de 0,20, mantendo melhor a integridade dos produtos, assim como as suas propriedades físicas e nutricionais. O mesmo não se verifica em amostras zip uma vez que a atividade da água aumenta com o tempo, atingindo valores críticos a partir dos 25 meses de armazenamento. Figura 16 - Gráfico da atividade da água de amostras de WPC do fornecedor A armazenadas em sacos selados e em sacos de abertura zip. Foram ainda analisadas amostras de WPI do fornecedor A, com tempos de armazenamento de 13 a 31 meses (Tabela 14) seguindo o mesmo esquema de análise. 40 Tabela 14 - Valores de atividade de água de amostras de WPI do fornecedor A, em sacos de abertura zip e respetivos coeficientes de variação (CV%) Amostra tA* aw CV (%) WPI-zA13 13 0,219 4,088 WPI-zA15 15 0,309 2,036 WPI-ZA16 16 0,332 0,933 WPI-ZA17 17 0,257 0,507 WPI-zA19 19 0,382 0,246 WPI-zA21 21 0,323 0,249 WPI-zA23 23 0,375 0,025 WPI-zA24 24 0,477 0,317 WPI-zA25 25 0,415 0,120 WPI-zA26 26 0,44 0,992 WPI-zA27 27 0,427 0,264 WPI-zA29 29 0,421 0,245 WPI-zA31 31 0,396 0,477 *tA corresponde ao tempo de armazenamento das amostras, desde que foram produzidas, em meses **CV corresponde ao coeficiente de variação. Pelo gráfico da Figura 17, pode-se observar um aumento gradual da atividade da água com o aumento do tempo de armazenamento. O facto de, para o mesmo fornecedor, o comportamento não ser 100% regular deve estar relacionado com o acondicionamento das amostras. Apesar de as amostras terem sido armazenadas todas nas mesmas condições de humidade e temperatura, podem ter estado sujeitas a condições diferentes durante o processo de embalamento podendo absorver mais ou menos água. Curiosamente pode observar-se a existência de amostras (WPI-zA15 e WPI-zA13), entre as quais se observa um aumento da atividade da água apesar de possuir um teor de humidade inferior (Figura 9). Isto pode ser resultado dos processos de produção do WPI. 41 Figura 17 - Gráfico da atividade da água de amostras de WPI do fornecedor A em função do tempo de armazenamento. Para além da alteração física do produto, a atividade da água também funciona como indicador do estado de degradação do produto, uma vez que a reação de browning tem início a uma atividade de 0,38 e uma taxa máxima entre atividades de 0,5 e 0,75 (Figura 18).36 Figura 18 - Diagrama da atividade da água, com descrição das taxas de reação.11 No entanto, a reação de Maillard tem início quando a atividade da água é baixa, desde 0,38 até aos 0,8. Assim, pela análise do gráfico das Figuras 15 e 17, verifica-se que as amostras 42 com armazenamento superior a 17 meses podem ter já começado a sofrer degradação por reação de Maillard, com diminuição do teor de lisina. Para o WPI este tempo pode ser alargado para os 21 meses, uma vez que a sua atividade de água antes dessa data, é inferior ao valor crítico. A partir do mês 26, observou-se que tanto o WPC como o WPI, atingem uma atividade de água máxima de, aproximadamente, 0,50. Embora não tenha sido atingida a aw onde a taxa de browning é máxima, o produto pode já estar degradado. A par desta reação, têm lugar outras reações enzimáticas que aumentam a taxa de degradação do produto. Figura 19 - Gráfico do índice de browning do WPC e WPI em função da atividade da água. Pela análise do gráfico da Figura 19, observa-se que existe um comportamento semelhante no WPC e no WPI. No entanto verifica-se a presença de amostras que não seguem o comportamento previsto. Isto pode dever-se ao facto do valor calculado para o índice de “browning” ser baseado na cor da amostra. Uma vez que alterações nos processos de desidratação e de separação por membrana condicionam a cor final da amostra, estas podem facilmente adquirir uma cor mais amarelada ou mais esbranquiçada. Neste sentido, estes comportamentos diferentes, podem não significar um estado avançado de degradação da amostra, mas sim diferenças na produção. 43 4.5. Determinação de HMF Para a determinação de HMF a nível laboratorial seguiu-se, inicialmente, um método de extração por Sohxlet. Utilizou-se 15 g de amostra, 150 mL de uma mistura de acetato de etilo com clorofórmio (1:1, v/v) como solvente de extração e refluxou-se durante 4 h. De seguida, evaporouse o solvente num evaporador rotativo. Ao extrato adicionou-se 0,5 mL de solução de Carrez I e 0,5 mL de solução de Carrez II. Por fim, diluiu-se o extrato para 50 mL com água destilada e filtrou-se.22 No entanto, observou-se que a amostra saía do cartucho durante a extração, devido à porosidade do cartucho ou ao volume de solvente de extração. Decidiu-se então seguir um segundo método de extração, que recorre à utilização de água destilada a 60 °C. Este método provou ser mais rápido, com uso de menos recursos e mais eficaz. Os resultados obtidos apresentam-se na Tabela 15. Uma vez que não houve tempo para fazer um estudo exaustivo de todas as amostras, foram analisadas as amostras de WPC que apresentavam diferenças mais significativas entre si nos testes anteriores, sendo elas a WPC-zA7, WPC-zA14, WPC-zA24 e WPC-zA43. A quantificação do HMF presente nas amostras foi realizada espetrofotometricamente, lendo as absorvências a 284 e 336 nm e calculando a [HMF] usando a Equação 7. Tabela 15 – Concentração média de HMF obtido para amostras de WPC armazenadas em sacos de abertura fácil do fornecedor A, para diferentes tempos de armazenamento Amostra tA* λ284 (nm) λ336 (nm) [HMF] (mg/100 mg de WPC) WPC-zA7 7 0,006 0,001 0,147 WPC-zA14 14 0,128 0,111 0,253 WPC-zA24 24 0,632 0,451 2,700 WPC-zA43 43 0,796 0,533 3,935 *tA corresponde ao tempo de armazenamento das amostras, desde que foram produzidas, em meses As moléculas de HMF surgem quando a reação de Maillard está num estado avançado, no qual o composto de Amadori, a pH inferior a 7, quebra originando diferentes produtos, um dos 50 Nos resultados iniciais (Figura 20) não se observou uma boa linha de base, tendo-se posteriormente verificado que tinha ocorrido uma quebra no elétrodo de ouro e dano da gasket, na unidade de deteção. O elétrodo de ouro é responsável pela oxidação dos aminoácidos e permite a sua deteção à saída da coluna. A gasket é responsável por aumentar o contacto entre a coluna e o elétrodo, para que não ocorra perda de amostra. Este problema foi facilmente resolvido com a sua substituição. Figura 24 – Cromatograma inicial das soluções padrão dos 20 aminoácidos. Após substituição do material foi possível repetir a análise das soluções padrão de aminoácidos, tendo sido obtidos cromatogramas como o da Figura 24. Figura 25 – Cromatograma final das soluções padrão dos 20 aminoácidos. 51 Com os dados obtidos para a determinação da lisina (Tabela 20) foi construída a curva de calibração (Figura 26). Tabela 20 – Valores médios da área do sinal obtidos para as diferentes concentrações de solução padrão de lisina [Lisina] (nmol/μL) Área do sinal Tempo de retenção (min) 0,020 0,096 4,190 0,075 0,337 4,210 0,10 0,421 4,220 0,30 1,373 4,200 0,50 2,072 4,220 0,75 3,076 4,210 1,0 3,759 4,220 1,5 4,946 4,230 2,0 5,734 4,210 Figura 26 - Curva de calibração da lisina, obtida pelo equipamento cromatográfico (Área do sinal = (- 0,9248) * [Lactose]2 + 4,7110 * [Lactose] – 0,0058; r2=0,9996) Foram, posteriormente, analisadas amostras de WPI, tendo sido obtidos cromatogramas como os da Figura 27. Na Tabela 21 estão sumariados os resultados obtidos para todas as amostras de WPI analisadas. 52 Tabela 21 – Valores médios do teor de lisina obtidos experimentalmente (mAA) em amostras de WPI ao longo do tempo de armazenamento Amostra tA* Área do sinal [Lisina] (nmol/μL) mAA (g/100 g) CV (%) WPI-zA15 15 0,301 1,33 2,85 2,01 WPI-zA17 17 0,139 0,629 1,38 2,03 WPI-zA18 18 0,211 0,972 2,13 3,14 WPI-za19 19 0,229 1,03 2,25 2,58 WPI-zA23 23 0,324 1,42 3,12 1,95 WPI-zA27 27 0,446 1,91 4,19 2,60 *tA corresponde ao tempo de armazenamento das amostras, desde que foram produzidas, em meses **CV corresponde ao coeficiente de variação Figura 27 – Exemplo de cromatograma da deteção de aminoácidos em amostras de WPI. A análise dos resultados obtidos nas amostras de WPI não nos permite tirar conclusões relativamente à alteração da quantidade de lisina presente. Foram analisadas amostras de WPC, com tempos de armazenamento entre 15 e 43 meses de forma semelhante (Tabela 22 e Figura 28). 53 Tabela 22 - Valores do teor de lisina obtidos experimentalmente (mAA) em amostras de WPC ao longo do tempo de armazenamento Amostra tA* Área do sinal [Lisina] (nmol/μL) mAA (g) CV (%) WPC-zA15 15 1,32 4,60 10,4 4,49 WPC-zA16 16 0,770 3,07 6,73 1,41 WPC-zA17 17 1,54 5,05 11,1 1,59 WPC-za18 18 1,49 4,95 10,9 3,75 WPC-za19 19 2,39 5,70 12,6 2,01 WPC-za40 40 0,894 3,46 7,59 4,83 WPC-za43 43 1,58 5,12 11,2 2,01 *tA corresponde ao tempo de armazenamento das amostras, desde que foram produzidas, em meses **CV corresponde ao coeficiente de variação Figura 28 – Exemplo de cromatograma de deteção de aminoácidos em amostras de WPC. Também neste caso os resultados obtidos não foram conclusivos, isto é, não se observou diminuição da concentração de lisina. Comparativamente, verificou-se que a quantidade de lisina nas amostras de WPC era superior à das amostras de WPI. Este resultado não era esperado uma vez que o teor de proteína das amostras de WPI é superior. Estes testes terão de ser repetidos para afinar melhor as condições de deteção do aparelho. 54 5. Conclusão Este trabalho foi realizado com o intuito de estudar a reação de Maillard e a sua extensão nos produtos de soro de leite concentrados e isolados, WPC e WPI, respetivamente. Para tal, as amostras foram armazenadas num espaço de ambiente controlado com temperatura (21°C) e humidade relativa (69,3%) até à data da análise. Um dos principais fatores de degradação dos produtos em pó é a absorção de água, que altera as propriedades físicas das amostras e dá inicio a reações químicas como é o caso da reação de Maillard. Pela determinação da humidade pode-se verificar um aumento desta quanto maior o tempo de armazenamento, havendo um aumento abrupto entre os meses 19 e 21, corroborando o prazo de validade destes produtos que é de 18 meses. Verificou-se ainda que para amostras com o mesmo tempo de armazenamento, o WPI tem um maior teor de humidade que o WPC, que se pode dever ao facto do WPI possuir um maior teor proteico, o que torna a produto mais higroscópico. Foi também determinado o teor proteico uma vez que, a reação de Maillard é responsável pela degradação destes compostos. No entanto, o método utilizado não se revelou eficiente uma vez que determina o teor total de nitrogénio na amostra. Como a reação mantem o nitrogénio no produto apenas formando novos compostos, é esperado que o teor de proteína assim determinado não mude. O ideal seria realizar esta determinação usando um método como o método de Bradford. Para o consumidor uma das primeiras formas de determinar as condições de um produto é pela sua cor. O que se verificou é que para um mesmo fornecedor o comportamento é o esperado, o aumento da cor com o aumento do tempo de armazenamento, uma vez que são formados produtos com cor durante a reação de browning . No entanto, quando se comparava com outros fornecedores a intensidade de cor era superior o que indica que as amostras podem ter uma intensidade de amarelo superior desde a sua produção, estando a cor associada aos métodos de produção do soro de leite. Observou-se ainda que a tonalidade do WPC é mais amarela que a do WPI, o que estará associado aos métodos de separação por membrana usados na sua produção, e que ocorre uma variação mais acentuada da cor aos 21 meses de armazenamento. 55 Foi ainda feita a análise à atividade da água dos produtos de WPC e WPI, na qual com o aumento do tempo de armazenamento ocorreu um aumento da atividade da água corroborando os dados obtidos anteriormente. Concluiu-se também que quando os produtos são armazenados em sacos selados a integridade destes é mantida, sem grande perda das caraterísticas e, consequentemente, do valor nutricional. De modo a aferir a extensão da reação de Maillard foi quantificada a formação de HMF, um dos produtos finais da reação. Verificou-se que, para amostras de WPC, existe um aumento da concentração com o tempo de armazenamento, comprovando que as amostras já se encontravam em degradação por este processo. No entanto nas amostras de WPI não se observou degradação, uma vez que o HMF não foi detetável. Concluiu-se que o WPC se degrada mais rapidamente que o WPI. Uma das consequências da reação de Maillard é a diminuição do valor nutricional das amostras, com degradação da lactose e da lisina. Foi verificado que para amostras de WPI o valor de lactose não varia significativamente entre os meses 15 e 31, corroborando os dados obtidos na determinação de HMF. Os restantes resultados da análise por cromatografia iónica não foram conclusivos, pelo que se deverá continuar a afinar as condições de deteção do equipamento e de preparação de amostras. De uma forma geral os resultados obtidos permitiram confirmar que a degradação dos produtos de soro de leite aumenta com o tempo de armazenamento. Esta degradação é mais significativa para o WPC, observando-se uma alteração significativa nos valores obtidos, aos 17 meses, enquanto que para o WPI, esta diferença significativa ocorre entre os meses 17 e 21. Verificou-se também que produtos armazenados em sacos selados mantêm a qualidade da amostra por um maior período de tempo. Nesse sentido, este estudo deverá ser repetido utilizando amostras guardadas em sacos selados e um maior número de amostras com o mesmo tempo de armazenamento. 56 6. Bibliografia (1) Morr, C. V; Ha, E. Y. W. Whey Protein Concentrates and Isolates : Processing and Functional Properties. Crit. Rev. Food Sci. 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