Evaluación de nuevas estrategias para el desarrollo de terapias anticancerosas selectivas

FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMETO DE FARMACOLOGÍA Evaluación de nuevas estrategias para el desarrollo de terapias anticancerosas selectivas Memoria presentada por José Manuel Calderón Montaño para aspirar al Doctorado Internacional Dirigida por Dr. Miguel López Lázaro Sevilla, 2013 1. ÍNDICE - 1 - 1. ÍDICE 1. ÍNDICE - 2 - 1. ÍNDICE - 3 - 1. ÍDICE. PAG -1- 1.1. ÍDICE DE FIGURAS . PAG -6- 1.2. ÍDICE DE TABLAS . PAG -10- 2. RESUME/ ABSTRACT. PAG -13- 3. ATECEDETES. PAG -23- 3.1. CÁCER: GEERALIDADES . PAG -25- 3.2. CÁCER DE PULMÓ. ECESIDAD DE FÁRMACOS ATICACEROSOS SELECTIVOS . PAG -31- 3.3. POSIBLES ESTRATEGIAS PARA EL DESARROLLO DE FÁRMACOS ATICACEROSOS SELECTIVOS . PAG -39- 3.3.1. Utilización de los defectos en la reparación del daño en el AD como nueva diana terapéutica anticancerosA. PAG -44- 3.3.2. Utilización de las alteraciones metabólicas de las células cancerosas como herramienta en la búsqueda de fármacos selectivos contra el cáncer. PAG -117- 3.3.2.1. Utilización de agentes prooxidantes para la inducción de muerte selectiva de células cancerosas. PAG -119- 3.3.2.2 Utilización de inhibidores de glicólisis para matar de forma selectiva células cancerosas. PAG -147- 4. OBJETIVO. PAG -161- 5. MATERIALES Y MÉTODOS. PAG -165- 5.1. COMPUESTOS EVALUADOS. PAG -167- 5.2. PREPARACIÓ DE EXTRACTOS VEGETALES. PAG -170- 5.3. DETERMIACIÓ DEL COTEIDO E HETERÓSIDOS CARDIOTÓICOS. PAG -170- 5.4. LÍEAS CELULARES. PAG -171- 5.5. AÁLISIS DE LA CITOTOXICIDAD MEDIATE EL ESAYO MTT. PAG -172- 5.6. EVALUACIÓ DE LA VIABILIDAD CELULAR MEDIATE EL ESAYO XTT. PAG -174- 5.7. DETERMIACIÓ DE LA VIABILIDAD CELULAR MEDIATE EL ESAYO DE SULFORRODAMIA B. PAG -174- 5.8. AÁLISIS DE LA SUPERVIVECIA CELULAR CO EL ESAYO CLOOGÉICO. PAG -175- 5.9. DETECCIÓ DE APOPTOSIS MEDIATE AEXIA V-FITC Y CITOMETRÍA DE FLUJO. PAG -176- 5.10. EVALUACIÓ DEL DAÑO E EL AD MEDIATE LA ELECTROFORESIS E GEL DE CÉLULAS IDIVIDUALES (ESAYO COMETA). PAG -177- 1. ÍNDICE - 4 - 5.11. DETECCIÓ DE ROTURAS DE AD DE DOBLE CADEA MEDIATE EL ESAYO IMUOCITOQUÍMICO DE FORMACIÓ DE FOCOS DE γ-H2AX. PAG - 179- 5.12. AÁLISIS DE LA FORMACIÓ DE COMPLEJOS DE ROTURA AD- TOPOISOMERASAS MEDIATE LA TÉCICA TARDIS. PAG -180- 5.13. EVALUACIÓ DE LA ACTIVIDAD GLICOLÍTICA CELULAR. PAG -182- 5.14. AÁLISIS DE LA COMBIACIÓ DE FÁRMACOS. PAG -183- 5.15. AÁLISIS ESTADÍSTICO. PAG -184- 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ. PAG -185- 6.1 EPOXIALQUIL GALACTOPIRAÓSIDOS. PAG -187- 6.1.1. Actividad anticancerosa selectiva de epoxialquil galactopiranósidos en células de cáncer de pulmón. PAG -188- 6.1.2. Epoxialquil galactopiranósidos inducen daño en el AD. PAG -190- 6.1.3. La reparación por escisión de nucleótidos participa en la reparación del daño en el AD inducido por el epoxialquil galactopiranósido 35. PAG -192- 6.1.4. Epoxialquil galactopiranósido 35: formación de EROs e inhibición de la glicólisis. PAG -193- 6.1.5. El epoxialquil galactopiranósido 35 posee actividad anticancerosa selectiva in vitro frente a células cancerosas de mama y de melanoma. PAG -195- 6.2. AZIRIDIIL GALACTOPIRAÓSIDOS. PAG -198- 6.2.1. Actividad anticancerosa selectiva de derivados galactopiranósidos aziridínicos . PAG -199- 6.2.2. El compuesto 22 induce daño en el AD que es reparado mediante escisión de nucleótidos. PAG -202- 6.2.3. Análisis del compuesto 22: formación de EROs e inhibición de la glicólisis. PAG - 205- 6.2.4. Evaluación de la combinación del compuesto aziridínico 22 con 5-fluorouracilo y oxaliplatino. PAG -207- 6.2.5. El compuesto 22 mata de forma selectiva células cancerosas de mama y células de melanoma. PAG -209- 6.3. FEILGLIOXAL. PAG -211- 6.4. EXTRACTO ACUOSO DE TÉ VERDE Y SUS PRICIPALES COMPOETES. PAG -227- 6.5. ÁCIDO CLOROGÉICO. PAG -231- 6.6. ALQUILÉTERES DE HIDROXITIROSILO. PAG -238- 6.7. EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE HOJAS DE ERIUM OLEADER L. PAG -273- 1. ÍNDICE - 5 - 6.8. HETERÓSIDOS CARDIOTÓICOS DIGITOXIA, DIGOXIA Y OUABAÍA. PAG -297- 6.8.1. Digitoxina, digoxina y ouabaína tienen actividad anticancerosa selectiva frente células cancerosas de pulmón A549. PAG -298- 6.8.2. Evaluación de los posibles mecanismos de selectividad anticancerosa de los heterósidos cardiotónicos. PAG -300- 6.8.3. Estudio de la combinación de digitoxina con agentes prooxidantes. PAG -306- 6.8.4. Evaluación del efecto combinatorio de heterósidos cardiotónicos y cisplatino. PAG -308- 6.8.5. Evaluación de la actividad anticancerosa de heterósidos cardiotónicos frente a diferentes tipos de células cancerosas. PAG -312- 6.9. LACTOAS ALFA, BETA-ISATURADAS 2-FURAOA Y 2-PIROA. PAG - 323- 6.10. IHIBIDORES DE GLICÓLISIS 2-DEOXIGLUCOSA, DICLOROACETATO Y BROMOPIRUVATO. PAG -347- 6.10.1. Evaluación de la actividad anticancerosa de 2-deoxiglucosa, dicloroacetato y bromopiruvato. PAG -348- 6.10.2. Evaluación de la combinación de inhibidores de la glicólisis y agentes prooxidantes. PAG -352- 6.11. ATAGOISTAS DEL RECEPTOR EUROKIIA-1 (K-1). PAG -353- 6.11.1. Evaluación de la actividad anticancerosa de una nueva serie de antagonistas del receptor K-1. PAG -354- 6.11.2. Implicación de otros mecanismos en la actividad anticancerosa de una nueva serie de antagonistas del receptor K-1. PAG -360- 6.11.3. El antagonista del receptor K-1 IKB300b muestra actividad anticancerosa selectiva frente a cáncer de mama y melanoma. PAG -363- 6.12. OTROS. PAG -365- 6.12.1. Cribado de agentes prooxidantes. PAG -365- 6.12.2. Análogos de glicoglicerolípidos y derivados de urea. PAG -370- 6.13. DISCUSIÓ GLOBAL. PAG -372- 7. COCLUSIOES/ COCLUSIOS PAG -379- 8. ABREVIATURAS PAG -385- 9. AGRADECIMIETOS PAG -389- 10. BIBLIOGRAFÍA PAG -393- 11. AEXOS PAG -413- 11.1 AEXO I. COTROLES POSITIVOS Y EGATIVOS. PAG -415- 1. ÍNDICE - 6 - 1.1. ÍDICE DE FIGURAS. Figura 1. Habilidades adquiridas por células cancerosas. PAG -29- Figura 2. Distribución de defunciones por causas, hombres y mujeres, a nivel mundial. PAG -30- Figura 3. Muerte por causas, todas las edades, España, 2002. PAG -30- Figura 4. Localización del tumor y supervivencia más de 5 años desde el diagnóstico. PAG -38- Figura 5. Supervivencia más de 5 años desde el diagnóstico (1995-1999) de cáncer en Europa y España. PAG -39- Figura 6. Principales efectos adversos producidos por los fármacos antineoplásicos utilizados en la terapéutica. PAG -41- Figura 7. Lugar y mecanismo de acción de algunos de los fármacos anticancerosos utilizados en terapéutica. PAG -42- Figura 8. Habilidades de las células cancerosas. PAG -44- Figura 9. Principales agentes que dañan el AD y las principales rutas de reparación que están implicadas. PAG -46- Figura 10. Relación entre los niveles de EROs y cáncer. PAG -120- Figura 11. Efecto del aporte exógeno de EROs. PAG -122- Figura 12. Papel de la glicólisis en la detoxificación de H 2 O 2 . PAG -151- Figura 13. Protocolo seguido para la realización del ensayo MTT. PAG -173- Figura 14. Ejemplo del aspecto de las colonias tras 7 días de incubación sin tratamiento. PAG -175- Figura 15. Ejemplo de cometa (núcleo celular dañado) y de las partes que lo constituyen. PAG -178- Figura 16. Ejemplo del aspecto que presenta una célula con daño en el AD evaluado mediante la técnica inmunocitoquímica de focos de γ-H2AX. PAG -180- Figura 17. Ejemplo de imagen de células no tratadas y células tratadas con un veneno de topoisomerasa. PAG -182- Figura 18. Estructura química de los compuestos epoxialquil galactopiranósidos evaluados. PAG -188- Figura 19. Actividad citotóxica de derivados epoxialquil galactopiranósidos 32, 35 y 37 en células normales MRC-5 y células cancerosas A549 de pulmón. PAG -189- Figura 20. Estudio del daño en el AD mostrado por el epoxialquil galactopiranosido 35 mediante ensayo cometa. PAG -191- Figura 21. Papel de la vía de reparación por escisión de nucleótidos (ER) en la reparación del daño en el AD inducido por el epoxialquil galactopiranósido 35. PAG -193- 1. ÍNDICE - 7 - Figura 22. La citotoxicidad del compuesto 35 no es debida a la generación de EROs. PAG -194- Figura 23. El compuesto 35 no induce inhibición de la glicólisis en células A549. PAG - 195- Figura 24. Células de cáncer de mama MCF7 y de melanoma UACC-62 son más sensibles que células normales de mama MCF10 y piel VH10 a la actividad citotóxica del epoxialquil galactopiranósido 35. PAG -196- Figura 25. El epoxialquil galactopiranósido posee actividad citotóxica sobre células de cáncer colorrectal HTC116. PAG -197- Figura 26. Estructura química de los compuestos galactopiranósidos aziridínicos evaluados. PAG -199- Figura 27. Actividad citotóxica mostrada por derivados galactopiranósidos aziridínicos. PAG -200- Figura 28. Actividad citotóxica mostrada por derivados galactopiranósidos con el grupo aziridinil abierto. PAG -201- Figura 29. Generación de daño en el AD por el compuesto aziridínico 22 mediante el ensayo cometa. PAG -203- Figura 30. La vía de reparación por escisión de nucleótidos (ER) está implicada en la reparación del daño en el AD por el compuesto 22. PAG -205- Figura 31. Papel de la generación de EROs en el mecanismo de citotoxicidad del compuesto 22. PAG -206- Figura 32. El compuesto 22 no induce inhibición de la glicólisis. PAG -207- Figura 33. Actividad citotóxica del compuesto 22 en combinación con 5-fluorouracilo u oxaliplatino. PAG -208- Figura 34. El compuesto 22 mostró actividad anticancerosa selectiva frente a células de cáncer de mama y células de melanoma. PAG -209- Figura 35. El compuesto 22 posee actividad citotóxica sobre células de cáncer colorrectal HTC116. PAG -210- Figura 36 (Figura 6 artículo adjunto). Muerte de células cancerosas por fenilglioxal. PAG -222- Figura 37 (Figura 2 artículo adjunto). Evaluación del daño en el AD inducido por fenilglioxal en células K562 por ensayo cometa. PAG -219- Figura 38 (Figura 3 artículo adjunto). Evaluación del daño en el AD inducido por fenilglioxal en células K562 y AA8 por el ensayo de inmunofluorescencia de focos de γ-H2AX. PAG -219- Figura 39 (Figura 4 artículo adjunto). Fenilglioxal induce complejos AD- topoisomerasas en células K562 mediado por peróxido de hidrógeno. PAG -220- 1. ÍNDICE - 8 - Figura 40 (Figura 5 artículo adjunto). Papel de los mecanismos de reparación del daño en el AD en la reparación del daño inducido por fenilglioxal. PAG -221- Figura 41. Estructura química de epigalocatequina-3-galato, ácido gálico y pirogalol. PAG -227- Figura 42. Evaluación de la citotoxicidad sobre células normales y cancerosas de pulmón de un extracto acuoso de té verde, ácido gálico (AG) y pirogalol (PG). PAG -228- Figura 43. Evaluación de las vías implicadas en la reparación del daño en el AD inducido por PG. PAG -230- Figura 44. Evaluación de la citotoxicidad sobre células normales y cancerosas de pulmón de café y café verde solubles comerciales. PAG -232- Figura 45. Estructura química del ácido clorogénico. PAG -233- Figura 46. Papel de la generación de EROs en el mecanismo de citotoxicidad del ácido clorogénico. PAG -233- Figura 47. El ácido clorogénico mostró mayor actividad citotóxica sobre células de cáncer de pulmón que sobre células normales de pulmón. PAG -234- Figura 48. Evaluación del daño en el AD inducido por el ácido clorogénico (ACG) en células K562. PAG -235- Figura 49. Evaluación del daño en el AD inducido por el ácido clorogénico (ACG) en células K562 y células AA8 mediante la técnica de inmunofluorescencia de focos de γH2AX. PAG -236- Figura 50. Ácido clorogénico induce complejos AD-topoisomerasas en células K562 mediado por peróxido de hidrógeno (ensayo TARDIS). PAG -237- Figura 51. Inducción de muerte en células cancerosas por el ácido clorogénico. PAG - 238- Figura 52 (Figura 2 del artículo adjunto). Citotoxicidad selectiva de hidroxitirosol y varios derivados alquil hidroxitirosil éter. PAG -269- Figura 53 (Figura 3 del artículo adjunto). Posibles mecanismos de acción involucrados en la citotoxicidad de dodecil hidroxitirosil éter. PAG -270- Figura 54 (Figura 4 del artículo adjunto). Actividad citotóxica de dodecil hidroxitirosil éter en combinación con el fármaco anticanceroso 5-fluorouracilo. PAG -271- Figura 55 (Figura 5 del artículo adjunto). Células de cáncer de mama MCF7 son más sensibles que células normales de mama MCF10 a la actividad citotóxica de dodecil hidroxitirosil éter. PAG -272- Figura 56 (Figura 1 del artículo adjunto). Células de cáncer de pulmón A549 son más sensibles que fibroblastos de pulmón no malignos humanos MRC-5 a la actividad citotóxica del extracto de erium oleander. PAG -293- 2. RESUME - 15 - Evaluación de nuevas estrategias para el desarrollo de terapias anticancerosas selectivas El cáncer es una enfermedad muy común y difícil de tratar. En países desarrollados, se estima que una de cada tres personas desarrolla esta enfermedad a lo largo de sus vidas y que únicamente la mitad de los afectados logra sobrevivir más de 5 años. A pesar de la implementación de campañas de diagnóstico precoz, un gran número de cánceres se diagnostican cuando células de un tumor primario ya han invadido tejidos cercanos y se han diseminado a través de la sangre o la linfa a otros tejidos del organismo. En esta fase de la enfermedad, denominada metástasis, las células del tumor ya no están localizadas y, por tanto, ya no pueden eliminarse mediante la cirugía o la radioterapia. La principal forma de tratamiento en esta fase de la enfermedad es la quimioterapia, que consiste en administrar fármacos de forma sistémica con el objetivo de que alcancen y maten a las células tumorales. Pero la gran mayoría de estos fármacos son tóxicos tanto para las células tumorales como para las células sanas, lo que causa una alta toxicidad en el paciente y hace necesario reducir las dosis de estos fármacos a niveles que son poco efectivos. La poca eficacia de la terapia anticancerosa en el tratamiento de pacientes con metástasis se refleja en los bajos porcentajes de supervivencia en estos pacientes. Por ejemplo, las estadísticas indican que el cáncer que más se diagnostica y más muertes causa a nivel mundial es el cáncer de pulmón, que en países desarrollados aproximadamente el 50% de los cánceres de pulmón se diagnostican cuando el paciente ya tiene metástasis distantes, y que únicamente el 3% de estos pacientes logra sobrevivir más de 5 años. Estos datos indican que es necesario buscar nuevas estrategias selectivas para el tratamiento de cánceres con metástasis, y especialmente para el cáncer de pulmón. En la búsqueda de estrategias anticancerosas selectivas es importante encontrar diferencias entre las células cancerosas y las células normales que puedan explotarse desde el punto de vista terapéutico. Datos recientes indican que las células tumorales tienen defectos en la reparación de determinados tipos de daño genético. La utilización de compuestos que induzcan daños específicos en el ADN causaría la muerte de las células tumorales que carezcan de los mecanismos necesarios para repararlos. Las células normales, que no tienen esos defectos en la reparación del daño genético, repararían el daño y sobrevivirían al tratamiento con esos compuestos. También se ha demostrado recientemente que el metabolismo de las células cancerosas está alterado. A diferencia de las células normales, las células cancerosas activan la glicólisis de forma mantenida incluso cuando los niveles de oxígeno son adecuados (efecto Warburg), y generan niveles elevados de especies reactivas de oxígeno de forma constitutiva. Estas diferencias metabólicas hacen que las células cancerosas puedan ser más susceptibles que las células normales al tratamiento con inhibidores de la glicólisis y/o con compuestos prooxidantes. 2. RESUME - 16 - Tras revisar brevemente información general sobre el cáncer y aspectos básicos sobre el cáncer de pulmón, este trabajo analiza la literatura que sugiere que es posible matar células tumorales de forma selectiva explotando sus defectos en la reparación del daño en el ADN y sus alteraciones metabólicas. Fruto de este análisis se seleccionaron más de 100 compuestos (o estrategias), y su posible actividad anticancerosa selectiva se evaluó mediante el ensayo MTT en células cancerosas de pulmón (A549) y células no cancerosas de pulmón (MRC5). Posteriormente se evaluó la posible implicación de la inducción de daño en el ADN, de la inhibición de la glicolisis y de la capacidad de generar especies reactivas de oxígeno (capacidad prooxidante) en la actividad anticancerosa de los compuestos más selectivos. El daño en el ADN se evaluó mediante el ensayo del cometa y mediante las técnicas de inmunofluorescencias TARDIS y focos de γH2AX. El tipo de daño genético y la implicación de dicho daño en la citotoxicidad de los compuestos activos se evaluaron mediante la utilización de líneas celulares deficientes en las principales rutas de reparación del daño en el ADN (VC8, EM9, EM9-V, UV4, UV5, UV61, KO40 y V3-3) y sus correspondientes líneas celulares no deficientes (VC8- B2, EM9-XH y AA8). La inhibición de la glicólisis se evaluó midiendo los niveles de glucosa (producto inicial de la glicólisis) y de lactato (producto final de la glicólisis) en el medio extracelular tras el tratamiento con el compuesto ensayado. La capacidad prooxidante se analizó evaluando si la actividad citotóxica del compuesto se reducía en presencia de compuestos antioxidantes (catalasa, -acetilcisteína y MnTMPyP). También se emplearon los ensayos XTT, SRB, clonogénico y Anexina V-FITC para profundizar en los mecanismos citotóxicos de algunos compuestos activos. Finalmente, para confirmar la selectividad anticancerosa de los compuestos más activos, se utilizaron células cancerosas de mama (MCF7), piel (UACC62) y colon (HTC116) frente a células normales de mama (MCF10) y piel (VH10). Varios compuestos demostraron una selectividad anticancerosa destacable. El epoxialquil galactopiranósido (2S,3S)-2,3-Epoxidecil 4,6-O-(S)-bencilideno-β-D-galactopiranósido (compuesto 35) mostró actividad anticancerosa selectiva en células de cáncer de pulmón, mama y melanoma. Este compuesto indujo daño genético, en cuya reparación estuvo involucrada la vía de reparación por escisión de nucleótidos (NER). La aziridina derivada de galactosa 2-Metil- 2,3-[N-(4-metilbencenosulfonil)imino]propil 2,3-di-O-bencil-4,6-O-(S)-bencilideno-β-D- galactopiranósido (compuesto 22) también indujo selectividad anticancerosa en células de pulmón, mama y melanoma, que puede estar mediada por su capacidad de inducir daño genético que requiere NER para su reparación. Es de destacar que las dosis de esta nueva aziridina requeridas para matar células de cáncer de mama fueron aproximadamente 50 veces inferiores a las necesarias para matar células normales de mama. El compuesto dicarbonílico fenilglioxal presentó actividad anticancerosa selectiva sobre células cancerosas de pulmón. Esta actividad fue debida, al menos en parte, a la inducción de daño en el ADN y a la generación de peróxido 2. RESUME - 17 - de hidrógeno. Células deficientes en NER, recombinación homóloga (HR) y unión de extremos no homólogos (NHEJ) fueron más sensibles al efecto citotóxico de este compuesto. Estos datos indican que fenilglioxal produce aductos en el ADN y roturas de doble cadena, y sugieren que tumores con defectos en estas vías de reparación pueden ser hipersensibles al efecto citotóxico de este compuesto. Las lactonas α,β-insaturadas 2-furanona y 2-pirona mostraron actividad citotóxica selectiva sobre células de cáncer de pulmón, e indujeron daño en el ADN que requiere HR para su reparación. El nuevo antagonista del receptor de neurokinina-1 INKB300b demostró una selectividad anticancerosa marcada sobre células de cáncer de pulmón, mama y melanoma. Resultados preeliminares sugieren que esta selectividad anticancerosa puede deberse, en parte, a su capacidad de inducir daño genético reparado por HR. Los compuestos fenólicos pirogalol (presente en el compuesto mayoritario del té verde epigalocatequina-3-galato), ácido clorogénico (presente en el café) y dodecil hidroxitirosil éter (derivado sintético del compuesto presente en el aceite de oliva hidroxitirosol) también mostraron selectividad frente a células cancerosas de pulmón. La citotoxicidad de estos compuestos estuvo mediada, al menos en parte, por la producción de especies reactivas de oxígeno y por la generación de daño en el ADN. Las vías de reparación HR, NHEJ y Anemia de Fanconi (FA) estuvieron implicadas en la reparación del daño inducido por pirogalol, y la vía de reparación por escisión de bases (BER) en la de dodecil hidroxitirosil éter. La combinación de este derivado de hidroxitirosol con 5-fluorouracilo indujo un efecto sinérgico en células de cáncer de pulmón y un efecto antagónico en células normales de pulmón. Este compuesto también demostró actividad anticancerosa selectiva frente a células de cáncer de mama. Debido a la posible implicación del transportador Na + -K + -ATPasa en la elevada capacidad glicolítica de las células cancerosas, y sabiendo que los heterósidos cardiotónicos son conocidos inhibidores de este transportador, se evaluó la actividad anticancerosa selectiva de varios heterósidos cardiotónicos (digitoxina, digoxina y ouabaína) y de un extracto hidroalcohólico de las hojas de una planta rica en heterósidos cardiotónicos (erium oleander). Los 3 heterósidos cardiotónicos y el extracto vegetal mostraron una elevada selectividad frente a células cancerosas de pulmón e indujeron una marcada inhibición de la glicólisis en estas células. También potenciaron la citotoxicidad de cisplatino en células de cáncer de pulmón al administrarse tras este fármaco anticanceroso. El extracto de erium oleander indujo daño en el ADN que requiere HR para su reparación. Cabe destacar que digitoxina inhibió el crecimiento de células cancerosas de pulmón a concentraciones más bajas que las presentes en el plasma de pacientes que utilizan este fármaco para el tratamiento de su enfermedad cardiaca. En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo indican que es posible matar células cancerosas de forma selectiva explotando sus defectos en la reparación del daño en el ADN y sus alteraciones metabólicas. La marcada selectividad anticancerosa mostrada por 2. RESUME - 18 - algunos de los compuestos ensayados requiere confirmación en modelos animales de cáncer. La actividad anticancerosa selectiva de digitoxina en células de cáncer de pulmón a concentraciones terapéuticas apoya la posible realización de ensayos clínicos en pacientes con este tipo de cáncer. 2. RESUME - 19 - Evaluation of new strategies for the development of selective anticancer therapies Cancer is a very common and difficult-to-treat disease. It has been estimated that one out of three people in developed countries will develop cancer at some point in their lifetime, and that only half of the people diagnosed with cancer will manage to survive more than 5 years. Despite the implementation of early detection campaigns, many cancers are still diagnosed when cells from a primary tumor have already metastasized to other parts of the body. At this stage of disease, tumor cells are no longer localized and can no longer be eliminated by surgery or radiotherapy. The main form of treatment at this point is chemotherapy, which consists of delivering drugs systemically so that they can reach and kill the tumor cells. But most of these drugs are toxic to both tumor and normal cells, cause severe side effects in patients and, therefore, need to be used at suboptimal levels. The low efficacy of chemotherapy in patients with advanced cancers is reflected in the low 5-year survival rates observed in these patients. For instance, cancer statistics show that the most commonly diagnosed cancer in the world is lung cancer, that approximately 50% of patients diagnosed with lung cancer have distant metastasis, and that only 3% of these patients manage to survive more than 5 years. The low efficacy of cancer therapy for the treatment of patients with metastasis makes the development of selective anticancer strategies necessary. In the search for selective anticancer strategies, it is important to identify differences between cancer cells and normal cells and that these differences can be exploited therapeutically. Recent data suggest that tumor cells commonly have defects in DNA repair genes which make them vulnerable to the cytotoxic activity of specific DNA-damaging compounds. Unlike tumor cells, normal cells have an intact DNA damage response that would allow them to repair the DNA damage and therefore to survive treatment with these DNA- damaging compounds. Recent evidence also suggests that the metabolism of tumor cells is altered. Unlike normal cells, cancer cells keep sustained glycolytic rates despite the presence of an adequate oxygen supply (Warburg effect), and generate high levels of reactive oxygen species constitutively. These metabolic differences may make cancer cells more vulnerable than non-malignant cells to treatment with glycolysis inhibitors and/or prooxidant agents. After briefly reviewing basic concepts of cancer and general aspects of lung cancer, this work analyzes the literature suggesting that cancer cells can be selectively killed by exploiting their DNA repair defects and their metabolic alterations. This analysis was used to select over 100 compounds (and strategies), and their possible selective anticancer activity was evaluate against lung cancer cells (A549) and lung non-malignant cells (MRC5) using the MTT assay. Then, it was evaluated whether the most selective compounds induced DNA damage, inhibited 2. RESUME - 20 - glycolysis and generated reactive oxygen species (prooxidant activity). The induction of DNA damage was assessed by the comet assay, the gamma-H2AX focus assay and the TARDIS assay. The type of DNA damage and the involvement of such damage in the cytotoxicity of the most active compounds was evaluated by using cell lines deficient in the main DNA repair pathways (VC8, EM9, EM9-V, UV4, UV5, UV61, KO40 y V3-3) and their corresponding parental cell lines (VC8-B2, EM9-XH y AA8). Glycolysis inhibition was assessed by measuring concentrations of glucose (initial product of glycolysis) and lactate (final product of glycolysis) in supernatants of control and treated cells. The prooxidant activity was evaluated by assessing whether the cytotoxicity of the compound was reduced in cells pre-treated with specific antioxidants (catalase, -acetylcisteine and MnTMPyP). Other assays (i.e., XTT, SRB, clonogenic and Annexin V flow cytometry assays) were used to further study the cytotoxic mechanisms of several active compounds. Finally, compounds with a high selective cytotoxicity towards lung cancer cells were also assessed against breast cancer cells (MCF7), melanoma cells (UACC62) and colon cancer cells (HTC116) vs. breast normal cells (MCF10) and skin normal cells (VH10). Several compounds exhibited a remarkable selective cytotoxicity towards cancer cells. The epoxyalkenyl galactopyranoside (2S,3S)-2,3-epoxydecyl 4,6-O-(S)-benzylidene-β-D- galactopyranoside (compound 35) induced selective cytotoxic activity against lung cancer cells, breast cancer cells and melanoma cells. This compound induced DNA damage, which may require a functional nucleotide excision repair (NER) pathway for repair. The new aziridine 2- methyl-2,3-[--(4-methylbenzenesulfonyl)imino]propyl 2,3-di-O-benzyl-4,6-O-(S)-benzylidene- β-D-galactopyranoside (compound 22) induced a outstanding selective cytotoxic activity against lung cancer cells, breast cancer cells and melanoma cells, which may be mediated by its ability to induce DNA damage that requires NER for repair. It is worth noting that this aziridine killed breast cancer cells at concentrations 50-fold lower than those required to kill non-malignant breast cells. The guanidine-reactive agent phenylglyoxal induced selective cytotoxic activity against lung cancer cells. This activity was mediated, at least in part, by its ability to induce DNA damage and to generate hydrogen peroxide. Cells defective in NER, homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ) were more sensitive to phenylglyoxal than parental cells. These data suggest that phenylglyoxal may induce bulky distortions in the shape of the DNA double helix (which are repaired by the NER pathway) and DNA double-strand breaks (which are repaired by HR and NHEJ), and that tumor cells with defects in NER, HR and NHEJ may be hypersensitive to the cytotoxic activity of phenylglyoxal. The alpha, beta-unsaturated lactones 2-furanone and 2-pyrone displayed selective cytotoxicity towards lung cancer cells, and induced DNA damage that required HR for repair. The new neurokinin 1 (NK-1) receptor antagonist INKB300b induced a marked selective cytotoxicity 2. RESUME - 21 - against lung cancer cells, breast cancer cells and melanoma cells. Preliminary data suggest that this selectivity may be mediated, in part, by its ability to induce DNA damage that requires HR for repair. The phenolic compounds pyrogallol (a molecule present in the chemical structure the major green tea constituent epigallocatechin-3-gallate), chlorogenic acid (a major coffee constituent) and hydroxytyrosyl dodecyl ether (a synthetic derivative obtained from the virgin olive oil constituent hydroxytyrosol) displayed selective cytotoxic activity towards lung cancer cells. This cytotoxicity was mediated, at least in part, by their prooxidant activity and by their ability to induce DNA damage. Data suggest that the DNA repair pathways HR, NHEJ and Fanconi anemia (FA) were involved in the repair of pyrogallol-induced DNA damage, and that the base excision repair (BER) pathway played a role in the repair of the DNA damage induced by hydroxytyrosyl dodecyl ether. The combination of this hydroxytyrosol derivative with the anticancer drug 5-flurouracil induced a synergistic cytotoxicity in A549 cancer cells but not in non-malignant MRC5 cells. This compound also displayed selective cytotoxicity against MCF7 breast cancer cells vs. MCF10 normal breast. Since the Na + -K + -ATPasa pump may be involved in the high glycolytic activity of cancer cells, and since cardiac glycosides are known inhibitors of this pump, we next evaluated the possible selective anticancer activity of several cardiac glycosides (i.e., digitoxin, digoxin and ouabain) and of a hydroalcoholic extract from the leaves of the cardiac glycoside-containing plant erium oleander. All three cardiac glycosides and the plant extract displayed a high selective cytotoxic activity towards lung cancer cells and induced a marked inhibition of glycolysis in these cells. These drugs also increased the cytotoxicity of cisplatin when administered after this commonly used anticancer agent. The erium oleander extract induced DNA damage that required HR for repair. It is worth noting that digitoxin inhibited the growth of lung cancer cells at concentrations below those commonly found in the plasma of cardiac patients treated with this drug. In conclusion, this work supports the idea that cancer cells can be killed selectively by exploiting their DNA repair defects and their metabolic alterations. The marked selective cytotoxicity displayed by some compounds towards cancer cells warrants further evaluation in animal models. The anticancer activity of digitoxin in lung cancer cells at therapeutic concentrations supports its possible advancement into clinical trials for the treatment of patients with lung cancer. 2. RESUME - 22 - 3. ATECEDETES - 23 - 3. ATECEDETES 3. ATECEDETES - 24 - 3. ATECEDETES - 31 - Estas elevadas tasas de mortalidad se deben a que en el momento del diagnóstico, la mayoría de los cánceres se encuentran en un estado muy avanzado. En este estado, la terapia actual no es suficientemente efectiva, siendo necesaria la búsqueda de tratamientos más efectivos. Teniendo en cuenta el total de muertes causadas por cada tipo de cáncer, es el cáncer de pulmón el líder de las defunciones por cáncer, siendo el causante del 18,2 % de las muertes debidas a cáncer y del 2,3% del total de defunciones estimadas ocurridas en el mundo durante el 2008 9 . Estas cifras dejan claro que el cáncer de pulmón es un grave problema de salud que no se ha podido resolver con la terapia actual, siendo necesaria la búsqueda de tratamientos más efectivos para el cáncer de pulmón. 3.2. EL CÁCER DE PULMÓ. ECESIDAD DE FÁRMACOS ATICACEROSOS SELECTIVOS. El cáncer de pulmón se origina en los tejidos de las vías respiratorias, al producirse la transformación maligna de células que forman parte del epitelio del árbol respiratorio, desde la tráquea a los alvéolos pulmonares. Las causas de esta transformación maligna pueden ser difíciles de establecer pero se conoce una serie de factores de riesgo (controlables o no) que aumentan la probabilidad de padecer cáncer de pulmón 2,3 . Entre los factores de riesgo controlables se encuentran: * El tabaco: es el factor de riesgo más importante de cáncer de pulmón. La gran mayoría de los cánceres de pulmón diagnosticados se produce en personas fumadoras, ya sea de forma activa o pasiva. Es el factor principal a evitar para disminuir el riesgo de padecer cáncer de pulmón. * Radón: es un gas radiactivo invisible, inodoro e insaboro presente de forma natural en ciertos suelos y rocas, por lo que se puede encontrar en el material de construcción de casas. La exposición a este gas se ha visto asociada a un aumento del riesgo de cáncer de pulmón, al ser el pulmón el principal órgano dañado por este gas. Los mineros son el principal grupo de riesgo debido a la exposición a este gas durante su trabajo. * Asbesto: es un mineral que a menudo es utilizado en la construcción. Personas expuestas a él (mineros, constructores navales, etc.) tienen un mayor riesgo de padecer cáncer de pulmón. La prevención de la exposición a estos factores de riesgo disminuye el riesgo a padecer cáncer. 3. ATECEDETES - 32 - Entre los factores de riesgo no controlables destacan los antecedentes familiares de cáncer de pulmón y el haber padecido enfermedades crónicas del pulmón como la tuberculosis o bronquitis. En el caso de producirse el cáncer, su detección precoz puede aumentar su pronóstico favorable. Sin embargo, en la actualidad no existe ninguna prueba eficaz y no invasiva de detección precoz para el cáncer de pulmón. Esta falta de métodos para la detección precoz junto con la falta de síntomas durante el inicio del cáncer, es lo que hace que la gran mayoría de los pacientes con cáncer de pulmón sean diagnosticados cuando el cáncer está muy avanzado. Los síntomas y signos suelen aparecer en un estado avanzado como resultado de la invasión local primaria o una compresión de estructuras torácicas adyacentes. Cuando un tumor pulmonar adquiere un tamaño que comienza a interferir con las estructuras cercanas o a generar líquidos que se acumulan en el pulmón o alrededores, se va a obstaculizar el intercambio de oxígeno y dióxido de carbono en los pulmones, que será lo que origine los posibles síntomas por cáncer de pulmón: cansancio, tos con o sin sangre, disnea y dolor. Por otra parte, el tumor puede comprimir estructuras torácicas adyacentes como el esófago, los nervios de la laringe o la vena cava superior, originando disfagia, irritación de la garganta y edema facial dependiendo de la zona afectada. Estos síntomas son muy inespecíficos porque otras patologías también pueden originarlos. También pueden aparecer síntomas debidos a metástasis, destacando defectos neurológicos y cambios en la personalidad debido a metástasis cerebral o dolores óseos debido a metástasis ósea. La presencia de estos síntomas junto con la exposición a los factores de riesgos comentados anteriormente, pueden hacer sospechar la posible presencia de cáncer de pulmón. Para poder confirmar si se trata de cáncer de pulmón, lo primero que se realiza es el diagnóstico clínico mediante la historia clínica y exploración física del paciente, acompañado de pruebas diagnósticas como analíticas, radiografías de tórax y tomografía computarizada. Sin embargo, la única forma de realizar un correcto diagnóstico de cáncer de pulmón es mediante una biopsia para el análisis en ella de la presencia de células cancerosas por un patólogo. Esta biopsia puede realizarse mediante una citología del esputo (análisis del esputo recogido tras inducir la tos), toracentesis (análisis del líquido pleural), broncoscopia (examen de las vías respiratorias con un broncoscopio y análisis de las muestras tomadas), punción transtorácica (análisis del tejido pulmonar o líquido pleural tomado mediante la punción con una aguja del posible tumor detectado mediante una radiografía), toracentesis (inyección de líquido en un área entre el pulmón y la pared torácica para su posterior recuperación y análisis), toracoscopia (observación de los pulmones mediante una cámara especial insertada a través de incisiones pequeñas en el pecho del paciente), toracotomía (estudio directo del pulmón mediante cirugía) o mediastinoscopia (análisis de los ganglios linfáticos en el centro del tórax mediante una pequeña incisión en el esternón). Tras la toma de la biopsia, se realiza su estudio microscópico para 3. ATECEDETES - 33 - verificar la presencia de células cancerosas. Este estudio permite clasificar el cáncer de pulmón teniendo en cuenta el aspecto de las células en: * Cáncer de pulmón de células pequeñas (CPCP): presenta células cancerosas muy pequeñas, de forma ovalada que presentan un ritmo de proliferación elevado y una gran capacidad de invadir otros órganos del cuerpo. * Cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP): presenta células de mayor tamaño y de menor capacidad invasiva que las células del CPCP. El CPCNP es el tipo más común, representando el 87% de los casos de cáncer de pulmón diagnosticados. Por otro lado, el CPCNP es más resistente a la quimioterapia que CPCP. Estos dos factores hacen necesaria la búsqueda de nuevas estrategias selectivas para el tratamiento de CPCNP. El CPCNP se origina en las células epiteliales pulmonares del bronquio central al alvéolo terminal. Dependiendo de la localización original de las células cancerosas se puede clasificar el CPCNP en los siguientes subtipos principales: * Carcinoma de células escamosas: este cáncer se suele originar cerca del bronquio central y representa el 25% de los casos de CPCNP. Es el CPCNP más fuertemente relacionado con el tabaco como factor de riesgo. * Adenocarcinoma: se suele originar en el tejido periférico del pulmón y representa el 40% de los casos de CPCNP. Suele presentar una gran heterogeneidad histológica. La línea celular A549 (utilizadas en este trabajo) derivan de un paciente con este tipo de cáncer. * Carcinoma de células grandes: suele empezar en el tejido periférico del pulmón y representa el 10% de los casos de CPCNP. * Existen numerosos subtipos adicionales a estos tres anteriores, pero su frecuencia es muy reducida, llegando solamente al 5% de los casos de CPCNP en total. Una vez que se ha clasificado el tipo de cáncer de pulmón, se continúa con el diagnóstico porque es necesario establecer cuál es la etapa o estadio de la enfermedad. La estadificación es una manera de describir el cáncer, analizando dónde se encuentra ubicado y si se ha diseminado a otras partes del cuerpo. El conocimiento del estadio es fundamental para que poder establecer cuál es el mejor tratamiento y para predecir el pronóstico del paciente. Generalmente, un estadio más bajo es asociado con mejores resultados clínicos. Para la estatificación puede ser necesario realizar otras pruebas adicionales a las comentadas anteriormente, como son: * Tomografía computarizada (TAC): esta prueba produce imágenes que permite detectar la localización de los tumores en el pulmón y/o las metástasis del cáncer pulmonar. 3. ATECEDETES - 34 - * Resonancia Magnética Nuclear (RMN): este examen produce imágenes detalladas de un tejido mediante el uso de un imán, permitiendo observar la localización de los tumores en un tejido. * Gammagrafía ósea: esta prueba se basa en el uso de un marcador radiactivo que se acumulará en los huesos que se encuentren dañados por la presencia de una metástasis ósea. * Tomografía por emisión de positrones (PET): esta prueba está basada en el hecho de que las células cancerosas presentan mayor consumo de glucosa que las células normales. Mediante la utilización de glucosa marcada con un isótopo radiactivo, se consigue elaborar imágenes computarizadas en donde se pueden observar los tumores debido a su mayor rapidez para consumir dicho azúcar. Con todas estas pruebas adicionales junto con los datos obtenidos con las pruebas iniciales que fueron comentadas anteriormente, se realiza la clasificación del CPCNP siguiendo el sistema de clasificación TNM creado por Pierre Denoix en 1944. Este sistema permite clasificar el estadio de un cáncer para realizar el pronóstico del paciente, permitiendo establecer el tratamiento terapéutico más adecuado para el paciente y valorando la posible supervivencia del paciente según la extensión inicial del tumor. El sistema TNM se basa en la evaluación de tres parámetros con todos los datos obtenidos mediante las pruebas clínicas realizadas al paciente. Estos 3 parámetros o categorías son: la extensión/tamaño del tumor primario (T), la ausencia o presencia de metástasis en los ganglios regionales (N) y la ausencia o presencia de metástasis a distancia (M). El cáncer es clasificado según las características que presente para cada una de estas categorías. De esta forma, con estos 3 parámetros se puede establecer la estadificación, que en el caso de CPNCP es la siguiente: * Estadio oculto: las células cancerosas son detectadas en el esputo o líquido procedentes de lavados bronquiales durante la broncoscopia pero, sin embargo, no se observa ningún tumor en el pulmón. * Estadio 0: Las células cancerosas son localizadas solamente en la capa de células más internas del pulmón. También se le puede denominar carcinoma in situ o cáncer no invasor. * Estadio I: las células cancerosas han crecido a través del revestimiento más interno del pulmón hacia el tejido más profundo del mismo, pero no han llegado a invadir los ganglios linfáticos vecinos. Si el tumor es menor de 3 cm es estadio IA, pero si es mayor de 3 cm, ha invadido el bronquio principal y la pleura se considera estadio IB. En ambos estadios es posible la cirugía completa del tumor. * Estadio II: Se diferencia del estadio I en que las células cancerosas sí han invadido los ganglios linfáticos vecinos o algún otro tejido. Si el tamaño del tumor es menor de 3 cm es estadio IIA, pero si es mayor de 3cm y ha invadido ganglios linfáticos vecinos, pleura, 3. ATECEDETES - 35 - diafragma, bronquio principal o el tejido que rodea al corazón se denomina estadio IIB. En ambos estadios es posible la cirugía completa del tumor. * Estadio III: en este estadio el tumor puede tener cualquier tamaño pero ha invadido otros tejidos adyacentes distintos de los mencionados en el estadio II, por lo que es muy difícil su extirpación completa mediante cirugía. Se clasifica en: - Estadio IIIA: las células cancerosas han invadido los ganglios linfáticos en el centro del tórax pero en el mismo lado del pulmón en el que se originó. - Estadio IIIB: las células cancerosas han invadido los ganglios linfáticos del lado opuesto del tórax, pudiendo también haber invadido estructuras cercanas al tórax como vasos sanguíneos, vértebras, esófago o corazón. * Estadio IV: las células cancerosas se han diseminado por distintos lóbulos del mismo pulmón o por el otro pulmón o pueden encontrarse en otras partes del cuerpo, formando lo que se conoce como tumor metastásico. El cáncer de pulmón se disemina con mayor frecuencia al cerebro, los huesos, el hígado y las glándulas suprarrenales. Las células de los nuevos tumores son del mismo tipo celular que las del tumor original y, por tanto, han de ser tratadas del mismo modo. Una vez clasificado el estadio de cáncer que presenta el paciente y teniendo en cuenta el estado de salud general del paciente, es posible iniciar el tratamiento. El CPCNP puede ser tratado mediante cirugía, radioterapia, quimioterapia o terapia dirigida. La combinación de estos tratamientos suele ser muy frecuente. La cirugía y la radioterapia son terapias locales porque van a ir enfocadas a destruir un cáncer localizado en una zona concreta del organismo. Mientras que la quimioterapia y la terapia dirigida son tratamientos sistémicos porque se basan en la utilización de fármacos que pueden llegar al torrente sanguíneo y afectar a células cancerosas que estén diseminadas por el organismo. La cirugía intenta la eliminación del tumor mediante su extirpación total junto con la de los ganglios linfáticos cercanos al tórax. La extirpación puede ser desde una pequeña parte del pulmón hasta un pulmón entero. Se ha comprobado que la extirpación del lóbulo pulmonar en su totalidad es el tipo de cirugía más eficaz. El periodo de recuperación después de una cirugía de pulmón va a depender de la cantidad extirpada de pulmón y del estado del paciente antes de someterse a ella. No es útil cuando el cáncer está diseminado por el cuerpo. La radioterapia consiste en el uso de rayos de alta energía dirigidos a destruir las células cancerosas. En el cáncer de pulmón suele ser radiación externa y se realiza mediante ciclos de radiación de días. Los efectos secundarios van a depender de la dosis de radiación y de las zonas 3. ATECEDETES - 36 - irradiadas. Los más comunes son: dificultad al tragar, piel irritada, fiebre, tos, etc. Por eso es importante que la radiación se dirija a reducir al mínimo la extensión de tejido pulmonar normal expuesto. La quimioterapia se basa en el uso de medicamentos para la destrucción de las células cancerosas, las cuales pueden estar localizadas en cualquier parte del cuerpo. Estos medicamentos suelen ser administrados por vía intravenosa, diseminándose por todo el organismo a través del torrente sanguíneo. Se suele administrar por ciclos que dependerán del fármaco utilizado. Los agentes anticancerosos usados actualmente actúan sobre células con alto ritmo de proliferación, como son las células cancerosas. Sin embargo, las células cancerosas no son las únicas células con elevado ritmo proliferativo sino que existen células normales que también se dividen rápidamente como son los linfocitos, células en las raíces del pelo, células del epitelio digestivo, etc., que también se ven afectadas por estos fármacos. Esto explica la mayoría de los efectos secundarios provocados por la quimioterapia como pueden ser infecciones por la depresión del sistema inmune, anemias, vómitos, diarreas, pérdida del pelo, etc. Algunos de estos síntomas pueden ser paliados mediante el uso de otros medicamentos como los antieméticos. En la quimioterapia del CPCNP los fármacos anticancerosos más utilizados son cisplatino y carboplatino que suelen combinarse con gemcitabina, paclitaxel, docetaxel, vinorelbina, irinotecan y pemetrexed. En los últimos años, el estudio comparativo de tejidos cancerosos y no cancerosos ha revelado que las células cancerosas tienen diferencias (por ejemplo en la expresión y niveles de proteínas) respecto a las células no cancerosas. Se conocen con el nombre de terapias dirigidas a las terapias que pretenden explotar estas diferencias con el fin de matar o inhibir el crecimiento de las células cancerosas afectando lo menos posible a las células no cancerosas. Los principales fármacos que se incluyen en estas terapias son los inhibidores de proteínas kinasas y los anticuerpos monoclonales. Dentro de este tipo de terapias destaca el uso del anticuerpo monoclonal bevacizumab con actividad antiangiogénica para el tratamiento de determinados carcinomas escamosos. Otro ejemplo es el erlotinib que es un inhibidor de la tirosina-quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano tipo 1 (EGFR), el cual está involucrado en el crecimiento y propagación de determinados tipos de tumores. Como se ha comentado anteriormente la utilización de una terapia u otra dependerá del estadio del cáncer y del protocolo establecido en el hospital de diagnóstico y tratamiento del paciente. Seguidamente se comenta de forma breve los tratamientos más frecuentes dependiendo del estadio del cáncer: * Estadio oculto y estadio 0: no se suele realizar tratamiento, simplemente un seguimiento mediante broncoscopia de la evolución del tumor. En algunos casos se llega a cirugía. 3. ATECEDETES - 37 - * Estadio I: en general se trata con cirugía acompañada en ocasiones con radioterapia. En algunos casos se llega a tratar con radiofrecuencia, que consiste en el uso de ultrasonidos a través de un vector que se introduce en el tumor. No se suele recomendar el uso de quimioterapia en este estadio. * Estadio II: el tratamiento de primera elección es la cirugía del tumor y los ganglios cercanos. Esta cirugía puede ir acompañada por quimioterapia preoperatoria y postoperatoria con cisplatino, combinado o no con vinorelbina. La radioterapia solamente se utiliza en el caso de intolerancia a la cirugía. * Estadio III: en este estadio la cirugía y la radioterapia por sí solas no son efectivas puesto que las células cancerosas se encuentran más diseminadas. Por esa razón, como primera elección los pacientes reciben quimioterapia y como adyuvante reciben cirugía y/o radioterapia (secuencial o simultánea). * Estadio IV: debido a la diseminación de las células cancerosas por todo el organismo, la cirugía y la radioterapia son, generalmente, inútiles en este estadio. El tratamiento de primera elección es la quimioterapia con un compuesto de platino (cisplatino o carboplatino) combinado con un segundo fármaco antitumoral (docetaxel, paclitaxel, gemcitabina, vinorelbina o pemetrexed). Rara vez la quimioterapia puede lograr eliminar a todas las células cancerosas, por lo que el principal objetivo consiste en aumentar la supervivencia y mejorar la calidad de vida del paciente. En muchas ocasiones, los medicamentos utilizados son cambiados por otros de distinto mecanismos para intentar mejorar el estado del paciente, ya sea por los efectos secundarios o por la baja efectividad de los fármacos. Actualmente, se ha comenzado a utilizar la terapia dirigida sola o en combinación con la quimioterapia para tratar cánceres con una histología determinada. A pesar de la existencia de todas estas estrategias terapéuticas, la mayoría de los pacientes no suelen superar los 5 años de vida desde el momento del diagnóstico del cáncer de pulmón. Esto se debe a que en el momento del diagnóstico, la gran mayoría de los pacientes presentan cáncer de pulmón en estadio IIIB/IV. En estos estadios la supervivencia más de 5 años desde el diagnóstico es de solamente un 3-15% de los pacientes debido a que los tratamientos actuales no son lo suficientemente efectivos para erradicar completamente las células tumorales, las cuales en esos estadios se encuentran diseminadas por el organismo. En EEUU se estima que durante el 2013 serán diagnosticados más de 1,5 millones de nuevos casos de cáncer, de los cuales el 14% serán cáncer de pulmón 13 . Aproximadamente, de los diagnosticados con cáncer de pulmón, el 56% presentará estadios avanzados (III/IV) y, de éstos, solamente un 4% sobrevivirá más de 5 años desde el momento del diagnóstico (Figura 4). 3. ATECEDETES - 38 - Figura 4. Localización del tumor y posibilidad de sobrevivir más de 5 años tras el diagnóstico. Datos estimados en EEUU para el 2013. Gráfica elaborada con los datos obtenidos del artículo “Cancer Stadistic, 2013” 13 . En España la situación no se diferencia mucho con respecto a EEUU. La posibilidad de sobrevivir más de 5 años tras el diagnóstico de cáncer de pulmón no supera el 11% de los pacientes y está cifra no se diferencia mucho con respecto a la encontrada en el resto de Europa según los datos estadísticos disponibles hasta el momento (Figura 5). Como se ha comentado anteriormente, el cáncer es la segunda causa de defunción en España y se estima que en el 2015 sean diagnosticados más de 220000 nuevos casos de cáncer de los cuales el 10% serán cáncer de pulmón. Todos estos datos dejan claro la necesidad de la búsqueda de nuevos fármacos que sean más selectivos hacia células cancerosas para poder eliminarlas cuando se encuentran diseminadas por el organismo (metástasis). 3. ATECEDETES - 39 - Figura 5. Supervivencia más de 5 años desde el diagnóstico (1995-1999) de cáncer en Europa y España. Gráfica adaptada desde informe elaborado por la SEOM 12 . 3.3. POSIBLES ESTRATEGIAS PARA EL DESARROLLO DE FÁRMACOS ATICACEROSOS SELECTIVOS. Como se ha comentado anteriormente, el elevado número de defunciones debidas a cáncer ocurridas cada año en el mundo deja de manifiesto la falta de efectividad de los tratamientos actuales anticancerosos. Por un lado, la cirugía y la radioterapia solamente son útiles cuando las células tumorales se encuentran localizadas en una zona muy concreta. Por otro lado, la quimioterapia y las terapias dirigidas utilizadas en casos de diseminación de los tumores fallan debido a la falta de selectividad por células cancerosas y/o al desarrollo de resistencias. 3. ATECEDETES - 40 - Hasta el momento, la mayoría de los antineoplásicos utilizados en terapéutica tienen acción antiproliferativa, es decir, actúan en la división celular. Por lo tanto, afectan a células que se estén dividiendo, especialmente si lo hacen a un ritmo acelerado como es en el caso de las células cancerosas. La mayoría de estos fármacos van a causar la muerte celular mediante la generación de daño en el ADN, como es el caso de los agentes alquilantes, los antibióticos citotóxicos, los venenos de topoisomerasas y los antimetabolitos. Aunque la base para la actividad selectiva anticancerosa de estos fármacos que atacan el ADN aún está escasamente entendida 6 , se piensa que la elevada inestabilidad genética de las células cancerosas podría explicar el por qué células tumorales son a menudo más vulnerables que células normales a estos fármacos 14,15 . Sin embargo, los fármacos antineoplásicos actuales no solamente afectan a células cancerosas, sino que también afectan a células normales con elevado ritmo proliferativo (como las células del sistema inmune), siendo la causa de sus efectos adversos (Figura 6). Esta falta de selectividad hace que las dosis de los fármacos antineoplásicos deban reducirse hasta niveles que no son suficientemente efectivos. Como se ha comentado anteriormente, la mayoría de los fármacos anticancerosos actúan dañando el ADN, de forma directa o indirecta (Figura 7), para lo cual necesitan que las células se encuentren dividiéndose. Por otro lado, al afectar solamente a células en estado de división, hace que estos fármacos no sean capaces de actuar sobre células cancerosas que se encuentran en fase G0 o G1 (fases de reposo replicativo), siendo uno de los motivos de resistencia a estos fármacos, debido a que no todas las células de un tumor se encuentran en fase replicativa. Otro motivo de resistencia es la existencia de mecanismos celulares que reparan el daño en el ADN generado por los fármacos antineoplásicos, disminuyendo el efecto tóxico de estos fármacos. En los últimos años, estos mecanismos de reparación del daño en el ADN están siendo considerados como una posible diana terapéutica en la lucha contra el cáncer. 3. ATECEDETES - 47 - La principal conclusión a la que se llegó en esta revisión fue que las deficiencias en alguna de las proteínas implicadas en la reparación del daño en el ADN alteran el efecto de numerosos fármacos anticancerosos utilizados en terapéutica. De los 66 fármacos antineoplásicos de los que se disponen datos, la citotoxicidad de 60 de ellos se vio alterada en células deficientes en proteínas reparadoras del ADN específicas. Los restantes 6 fármacos (ifosfamida, valrubicina, daunorubicina, tenipósido, dexametasona y vorinostat) no se vieron afectados, posiblemente porque no han sido suficientemente estudiados. Cabe destacar que las deficiencias en proteínas implicadas en la reparación del daño en el ADN no solamente pueden alterar la citotoxicidad de fármacos cuya diana terapéutica es el ADN, sino que también la de otros fármacos cuya diana terapéutica principal no es el ADN. Esto puede ser explicado porque estos fármacos dañen el ADN de una forma indirecta o por la participación de algunas de las proteínas reparadoras del ADN en vías de supervivencia o de inducción de apoptosis por estos fármacos. Las deficiencias específicas en proteínas o vías reparadoras del daño en el ADN pueden alterar la citotoxicidad de fármacos relacionados entre sí de forma muy distinta. Por este motivo, no se puede generalizar diciendo que las deficiencias en vías específicas de la reparación del daño en el ADN modifican la citotoxicidad de un grupo particular de fármacos anticancerosos. Aunque se ha podido obtener algunas conclusiones generales (ver revisión para mayor detalle), los resultados pueden cambiar cuando una proteína específica de la vía de la reparación del daño en el ADN o un fármaco concreto del grupo es estudiado. Por otra parte, la información que presenta esta revisión podría ayudar a entender el mecanismo citotóxico de algunos fármacos. Por ejemplo, el principal mecanismo de los antimetabolitos es la inhibición de la síntesis de nucleótidos, pero no está claro cómo esta inhibición conduce a la muerte celular. Analizando los datos en esta revisión parece ser que las células deficientes en HR son muy sensibles a la citotoxicidad de los antimetabolitos testados, lo que puede indicar que la formación de roturas de doble cadena del ADN (la cual es reparada por HR) juega un papel importante en la actividad citotóxica de estos fármacos. La depleción de nucleótidos inducida por estos antimetabolitos podría resultar en una parada de la horquilla de replicación, que desencadenaría roturas de doble cadena que si no son reparadas, acabarían generando muerte celular. Por otro lado, la información recopilada por esta revisión podría ayudar a la predicción de la respuesta de fármacos anticancerosos en pacientes con tumores con defectos específicos en las vías de reparación del daño en el ADN, que mejoraría la eficacia de sus tratamientos. 3. ATECEDETES - 48 - Finalmente, esta revisión pone de manifiesto que los defectos en los mecanismos de reparación del daño en el ADN son una nueva diana terapéutica adecuada en la lucha contra el cáncer. 3. ATECEDETES - 49 - Effect of DA repair deficiencias on the cytotoxicity of drugs used in cancer therapy-A review. Calderón-Montaño J.M., Burgos-Morón E., Orta M.L., López-Lázaro M. Artículo en revisión en la revista Current Cancer Drug Targets. 3. ATECEDETES - 50 - 3. ATECEDETES - 51 - 3. ATECEDETES - 52 - 3. ATECEDETES - 53 - 3. ATECEDETES - 54 - 3. ATECEDETES - 55 - 3. ATECEDETES - 56 - 3. ATECEDETES - 63 - 3. ATECEDETES - 64 - 3. ATECEDETES - 65 - 3. ATECEDETES - 66 - 3. ATECEDETES - 67 - 3. ATECEDETES - 68 - 3. ATECEDETES - 69 - 3. ATECEDETES - 70 - 3. ATECEDETES - 71 - 3. ATECEDETES - 72 - 3. ATECEDETES - 79 - 3. ATECEDETES - 80 - 3. ATECEDETES - 81 - 3. ATECEDETES - 82 - 3. ATECEDETES - 83 - 3. ATECEDETES - 84 - 3. ATECEDETES - 85 - 3. ATECEDETES - 86 - 3. ATECEDETES - 87 - 3. ATECEDETES - 88 - 3. ATECEDETES - 95 - 3. ATECEDETES - 96 - 3. ATECEDETES - 97 - 3. ATECEDETES - 98 - 3. ATECEDETES - 99 - 3. ATECEDETES - 100 - 3. ATECEDETES - 101 - 3. ATECEDETES - 102 - 3. ATECEDETES - 103 - 3. ATECEDETES - 104 - 3. ATECEDETES - 111 - 3. ATECEDETES - 112 - 3. ATECEDETES - 113 - 3. ATECEDETES - 114 - 3. ATECEDETES - 115 - 3. ATECEDETES - 116 - 3. ATECEDETES - 117 - 3.3.2. Utilización de las alteraciones metabólicas de las células cancerosas como herramienta en la búsqueda de fármacos selectivos contra el cáncer. Desde principios del s. XX se sabe que las células tumorales poseen un metabolismo distinto al que presentan las células normales. Las primeras observaciones de esta diferencias fueron llevadas a cabo por el premio Nobel Otto Warburg 21 . Sin embargo, las primeras hipótesis que se desarrollaron no aclaraban el proceso de carcinogénesis. Al mismo tiempo, empezaron a surgir varias teorías sobre el origen del cáncer como un proceso de adquisición de mutaciones genéticas. Todo esto hizo que las investigaciones en cáncer dejaran de lado el metabolismo y se centraran en las alteraciones genéticas como las posibles dianas terapéuticas contra el cáncer. Desde entonces, las investigaciones en cáncer han demostrado que las características que definen una célula tumoral provienen de la adquisición de un fenotipo originado por una serie de alteraciones genéticas. Estas alteraciones génicas consisten en mutaciones, translocaciones, amplificaciones o eliminación de genes que van a contribuir al desarrollo del cáncer. En las últimas décadas, la investigación se ha centrado en la búsqueda de terapias encaminadas a corregir o aprovechar estas alteraciones genéticas para eliminar células cancerosas. Sin embargo, el descubrimiento de nuevos genes implicados en el cáncer no deja de aumentar cada día, a lo que se le suma que las alteraciones genéticas pueden variar según el tipo de cáncer y la persona afectada. Esto ha hecho que se empiece a replantear otras posibles dianas terapéuticas contra el cáncer. En la búsqueda de estas nuevas dianas, en la última década se ha vuelto a reiniciar las investigaciones sobre el metabolismo celular y el microambiente de los tumores 25- 29 . Durante años se ha estado pensando que el metabolismo alterado que presentan las células cancerosas se debe a las alteraciones genéticas de éstas y que el metabolismo no tenía un papel fundamental en el proceso carcinogénico, sino que era una consecuencia final. Sin embargo, con el reinicio de las investigaciones en el metabolismo del cáncer, se ha podido relacionar que ciertas alteraciones genéticas que se producen durante el inicio del proceso de carcinogénesis tienen como consecuencia directa la reprogramación del metabolismo celular que no solamente va a estar destinado a la síntesis de macromoléculas para el soporte de la proliferación y la supervivencia celular, sino que también va a participar en la inestabilidad genética, contribuyendo al proceso de carcinogénesis 25-29 . La reprogramación del metabolismo celular durante el inicio de la carcinogénesis es fundamental para poder mantener saciadas las tres necesidades básicas que se producen durante una rápida proliferación celular como es la que presentan las células cancerosas: una rápida generación de ATP para poder mantener el estatus energético, una incrementada biosíntesis de macromoléculas y el mantenimiento del equilibrio redox celular 4,26,27,29-32 . Por todo ello, esta reprogramación del metabolismo va a afectar a las cuatro principales clases de macromoléculas: carbohidratos, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Se sabe que las células cancerosas tienen alterado el metabolismo de todas estas 3. ATECEDETES - 118 - macromoléculas 26 , con lo que fármacos que tengan como diana el metabolismo celular podrían ser efectivos. De hecho, este tipo de fármacos tienen precedentes históricos como son los antimetabolitos análogos de nucleósidos (como el 5-fluorouracilo) y los antifolatos (como el metrotexato) que inhiben la síntesis de los ácidos nucleicos 26 . Aunque estos fármacos no fueron clasificados como moléculas que alterasen el metabolismo sino como fármacos que dañan el ADN, claramente tienen el metabolismo celular como una de sus dianas. Para poder desarrollar nuevas estrategias terapéuticas teniendo como base el metabolismo celular, lo primero que se tuvo que tener en cuenta fue los motivos de la necesidad de la reprogramación del metabolismo celular por parte de las células cancerosas. La proliferación celular consiste en un proceso celular por el cual una célula acaba dividiéndose en dos células hijas. La división en dos células requiere que la célula original duplique todos los componentes necesarios para la formación de las nuevas células. Durante este proceso de duplicación, se consume una gran cantidad de energía para poder sintetizar todas las nuevas macromoléculas. La gran mayoría de los cánceres dependen de la glucosa y la glutamina como las principales fuentes energéticas y precursoras del resto de macromoléculas. El metabolismo de la glucosa se ha convertido en los últimos años en una posible nueva diana terapéutica, debido a que gran parte de los cánceres dependen de la glicólisis, ruta catabólica de la glucosa, como su principal vía para la generación de energía y como precursora de otras macromoléculas 25 . Por otra parte, uno de los productos del metabolismo celular es la generación de radicales libres (especies reactivas de oxígeno o ERO, entre otros). Como consecuencia de la reprogramación celular que sufren las células cancerosas, éstas presentan mayores niveles basales de EROs que las células normales 33,34 . En los últimos años, se ha comenzado a estudiar esta diferencia de los niveles de EROs como una nueva estrategia terapéutica para el desarrollo de fármacos anticancerosos selectivos. A continuación se explicarán con más detalles las dos estrategias basadas en el metabolismo celular utilizadas durante esta tesis para la búsqueda de nuevos fármacos para el tratamiento del cáncer de pulmón: la utilización de agentes prooxidantes e inhibidores de glicólisis. 3. ATECEDETES - 119 - 3.3.2.1. Valoración de la utilización de agentes prooxidantes para la inducción de muerte selectiva de células cancerosas. Un radical libre es una molécula química (orgánica o inorgánica) que posee un electrón desapareado, con lo que es inestable y reaccionará con moléculas de su alrededor para poder conseguir la estabilidad. En biología, los radicales libres más importantes son las Especies Reactivas de Oxígeno (EROs) y las Especies Reactivas de Nitrógeno. ERO es un término que agrupa radicales de oxígeno (incluyendo radical hidroxilo y radical superóxido) y derivados no radicales de oxígeno (como el peróxido de hidrógeno) 35,36 . En las células, las EROs pueden ser originadas por fuentes endógenas o por fuentes exógenas. Las fuentes exógenas pueden ser de naturaleza muy variada, como por ejemplo elementos de la polución, el humo del tabaco, la radiación, etc. Al igual que las fuentes exógenas, los mecanismos endógenos de generación de EROs también pueden ser muy variados. Algunas de los mecanismos endógenos son la fosforilación oxidativa (OXPHOS), los peroxisomas y la activación de células inflamatorias (estas células utilizan la producción de EROs para la eliminación de agentes patógenos). En las células, la principal fuente de EROs es la mitocondria. Durante la OXPHOS, la mayoría del oxígeno consumido es reducido a agua; sin embargo, sobre un 5% de las moléculas de oxígeno es convertido en anión superóxido debido a un fallo del acoplamiento de los electrones y los protones en la cadena respiratoria. Este anión superóxido puede ser convertido en otras EROs, como radicales hidroxilo y peróxido de hidrógeno 34,36,37 . Las EROs son consideradas una “espada de doble filo”. Por un lado, las EROs son esenciales para determinadas funciones biológicas. Bajas concentraciones de EROs van a ser necesarias para la supervivencia, el crecimiento y la diferenciación celular. Esto se debe a la intervención de las EROs en la regulación de vías de transducción de señales y sobre la actividad de determinadas enzimas, al modificar la estructura de proteínas y genes con las que reaccionan directa o indirectamente 36 . Por otro lado, excesivas cantidades de EROs pueden desencadenar daño oxidativo irreversible sobre biomoléculas (como el ADN, proteínas y lípidos). Destaca el daño que las EROs pueden producir sobre el ADN. Se ha descrito que las EROS pueden directamente producir roturas de las cadenas de ADN (tanto roturas simples como dobles), modificaciones sobre las bases nitrogenadas que componen el ADN (destacando la oxidación de la guanina, dando lugar a la 8-hidroxiguanosina) e intercruzamientos entre las cadenas de ADN. Este daño oxidativo puede acabar desencadenando la muerte celular o favoreciendo el desarrollo de condiciones patológicas como inflamación, aterosclerosis, envejecimiento y cáncer (Figura 10) 33,34 . 3. ATECEDETES - 120 - Figura 10. Relación entre los niveles de EROs y cáncer. El efecto biológico de las EROs dependerá de sus niveles intracelulares. iveles bajos de EROs (amarillo) tienen efectos beneficiosos sobre la proliferación y supervivencia celular. Sin embargo, niveles excesivamente altos (morado) causan muerte celular. Las células utilizan los antioxidantes para prevenir el alcance de niveles elevados de EROs. Las células cancerosas presentan niveles de EROs más elevados de lo normal (azul) pero por debajo de los niveles que inducirían muerte celular. Fuente original: Targeting cancer cells by ROS-mediated mechanisms: a radical therapeutic approach? 36 Por tanto, mantener un equilibrio de los niveles de EROs es crucial para el crecimiento y la supervivencia celular. Por este motivo las células han desarrollado un sistema de defensa contra las EROs, incluyendo enzimas antioxidantes y vías de reparación del daño generado por las EROs. Las enzimas antioxidantes incluyen superóxido dismutasas (encargadas de la eliminación de anión superóxido), glutatión peroxidasa (se encarga de la eliminación de peróxido de hidrógeno mediante la utilización de glutatión), catalasa (encargada de la eliminación de peróxido de hidrógeno), entre otros 34,36 . Dentro de las vías de reparación de los daños generados por las EROs destacan las vías de reparación del daño en el ADN, principalmente la vía de reparación por escisión de bases o BER. Cuando el balance redox se desequilibra por una insuficiencia de los mecanismos de defensa, por una excesiva producción de EROs o por ambas, se produce lo que se conoce como estrés oxidativo. Elevados niveles de EROs y de estrés oxidativo han sido ampliamente observados en las células cancerosas. Este incrementado estrés oxidativo parece jugar un papel fundamental en la carcinogénesis. Aunque los mecanismos que generan un aumento del estrés 3. ATECEDETES - 127 - 3. ATECEDETES - 128 - 3. ATECEDETES - 129 - 3. ATECEDETES - 130 - 3. ATECEDETES - 131 - 3. ATECEDETES - 132 - 3. ATECEDETES - 133 - 3. ATECEDETES - 134 - 3. ATECEDETES - 135 - 3. ATECEDETES - 136 - 3. ATECEDETES - 143 - 3. ATECEDETES - 144 - 3. ATECEDETES - 145 - 3. ATECEDETES - 146 - 3. ATECEDETES - 147 - 3.3.2.2. Utilización de inhibidores de glicólisis para matar de forma selectiva células cancerosas. Todas las células requieren ATP para poder llevar a cabo los procesos celulares, incluyendo la división celular. La mayoría de las moléculas del ATP son producidas en la mitocondria a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS), que es un proceso de oxidación de NADH y FADH2 (generados durante la glicólisis, la oxidación de los ácidos grasos y el ciclo de ácidos tricarboxílicos) acoplado a la fosforilación del ADP hasta ATP, siendo el O 2 el aceptor final de electrones. Las células también pueden producir ATP mediante la glicólisis, que tiene lugar en el citosol y no requiere oxígeno. La glicólisis es una ruta catabólica de la glucosa en la cual una molécula de glucosa es transformada en dos moléculas de piruvato, resultante en la producción de ATP y en el consumo de NAD + . El piruvato generado puede ser convertido a lactato mediante la lactato deshidrogenasa, regenerando en el proceso al NAD + que es necesario para poder repetir el proceso de glicólisis. Porque la OXPHOS es sobre 10 veces más efectiva que la glicólisis generando ATP, es comprensible que las células generen ATP mayoritariamente a través de OXPHOS cuando los niveles de oxígeno son los adecuados. Mientras que en ausencia de oxígeno, las células dependerán de la glicólisis para la generación de ATP. Esto se conoce como efecto Pasteur 39 , en honor a Pasteur que observó que la glicólisis solamente se encontraba activa en ausencia de oxígeno. Para la generación de energía, las células deben tomar nutrientes desde la sangre. Estos nutrientes también son utilizados para la síntesis de macromoléculas y componentes celulares requeridos para la formación de las nuevas células durante la división celular. Dentro de los nutrientes más importantes para la proliferación celular se encuentra la glucosa porque su metabolización a través de la glicólisis es requerida para la obtención de numerosos precursores de otras macromoléculas. Por ello, no es de extrañar que las células cancerosas (y células normales con elevada proliferación) tengan un elevado ritmo de absorción de glucosa y de glicólisis, debido a la elevada tasa de proliferación de la que se caracterizan. Sin embargo, junto a los nutrientes, a las células cancerosas les llega también oxígeno, el cual según el efecto Pasteur debería inactivar a la glicólisis. Esto implica que la proliferación celular se vería comprometida si la glicólisis estuviese siempre inhibida en presencia de oxígeno como explica el efecto Pasteur. Esta activación de la glicólisis en presencia de oxígeno es lo que se conoce como glicólisis aeróbica o efecto Warburg. El mecanismo de cómo las células cancerosas pueden cambiar la OXPHOS a glicólisis aeróbica no está muy claro todavía y existen numerosas posibles explicaciones 31 . Otto Warburg fue el primero en describir está activación de la glicólisis en las células cancerosas 21 . Él explicaba que el cambio de OXPHOS a glicólisis aeróbica se debía a que las células cancerosas presentaban daños irreversibles en las proteínas que conforman la 3. ATECEDETES - 148 - OXPHOS 21 . Esta hipótesis solamente puede explicar ese cambio metabólico en algunos tipos de cáncer que han demostrado tener disminuida la funcionalidad de la OXPHOS por presentar mutaciones en el ADN mitocondrial, con lo que tienen disminuida la expresión o presentan defectos en alguno de los componentes de la OXPHOS, dependiendo de la glicólisis para la producción de energía 40 . Sin embargo, hay otros tumores cuyas células han demostrado conservar la funcionalidad de OXPHOS, aunque ésta se encuentra disminuida 27,29 . Pero independientemente del estado funcional de OXPHOS, el 60% de la energía en las células cancerosas proviene de la glicólisis aeróbica. La elección de la glicólisis como fuente principal de energía puede ser debido a que la glicólisis genera ATP de forma más rápida que la OXPHOS, permitiendo mantener la alta demanda energética de las células cancerosas. Aunque la glicólisis es menos eficiente en la producción de moléculas de ATP que la OXPHOS, esta desventaja es compensada por las células cancerosas con una elevada absorción de glucosa 26-28 . Esta elevada absorción de glucosa se ha visto asociada con mutaciones ocurridas en las células cancerosas 29 . Estas mutaciones también han sido relacionadas con un aumento en la expresión de enzimas glicolíticas. Tanto el aumento de la absorción de glucosa como de la expresión de enzimas glicolíticas originan la activación de la glicólisis. Entre algunas de las mutaciones genéticas que pueden originar este cambio metabólico se encuentran: * Activación de la vía fosfoinositol 3-quinasa (PI3K) por la mutación en genes supresores de tumores que en condiciones normales la inactivarían. La activación de esta vía no solo va a inducir la generación de señales de crecimiento, sino que va a aumentar la expresión de transportadores de glucosa y de enzimas participantes en la glicólisis, con la consecuente activación de la glicólisis. * Activación del factor de transcripción inducible por hipoxia (HIF1). Este factor en condiciones normales solamente se ve activado en presencia de hipoxia, situación en la que se pueden encontrar muchos tumores en algún momento de su desarrollo. Algunos estudios proponen que la activación de la glicólisis se debe a una adaptación a las condiciones de hipoxia durante las fases iniciales del desarrollo del tumor, permitiendo la producción de ATP en ausencia de oxígeno. Sin embargo, ha sido demostrado que HIF1 también puede ser activado en condiciones de normoxia por determinados oncogenes. La activación de HIF1 va a inducir la expresión de genes que codifican transportadores de glucosa y/o enzimas glicóliticas, favoreciendo la activación de la glicólisis. * Pérdida del gen p53. Este gen no solamente está involucrado en la respuesta a la reparación del daño en el ADN e inducción de apoptosis, sino que es capaz de regular la glicólisis por la inactivación de la vía PI3K. 3. ATECEDETES - 149 - * Inactivación de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) por mutaciones en el gen. La AMPK es un regulador esencial del estado energético que actúa inhibiendo el crecimiento celular cuando el ratio AMP/ATP está aumentado, como es en el caso de estrés metabólico por falta de nutrientes. En la activación de la glicólisis también se ha visto que el pH intracelular juega un papel fundamental 41,42 . Cuando se activa la glicólisis, una molécula de glucosa es degradada hasta dos moléculas de piruvato. En presencia de oxígeno, ese piruvato entraría en la mitocondria en donde la Piruvato deshidrogenasa (PDH) lo transformaría en acetil-CoA, permitiendo que entre en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CAT) y generando los sustratos de la OXPHOS. Sin embargo, las células cancerosas han demostrado tener un elevado nivel de Proteína deshidrogenasa quinasa (PDK), enzima inhibidora de PDH, como resultado de la activación del HIF1. De esta forma, en las células cancerosas el piruvato no puede entrar a formar parte del CAT y es transformado por la lactato deshidrogenasa en lactato 25,29 . Este lactato disminuiría el pH intracelular, que podría llegar a inducir una parada del ciclo celular o incluso inducir apoptosis. Sin embargo, las células cancerosas tienen aumentada la expresión y actividad de transportadores de membrana encargados de expulsar protones y lactato fuera de la célula (como la bomba H + -ATPasa, intercambiadores de Na + -H + , etc.), provocando una alcalinización del pH intracelular y una acidificación del pH extracelular 41 . La alcalinización del pH intracelular incrementa la proliferación celular, evita la apoptosis; mientras que la acidificación del pH extracelular favorece la invasión debido a que la acidez degrada la matriz extracelular, favorece la activación de proteasas que también contribuirán a la degradación de la matriz e impide la entrada de compuestos que sean bases débiles como algunos fármacos antineoplásicos (como doxorubicina, mitoxentrona y vincristina) provocando resistencias a estos fármacos. Por otra parte, la alcalinización del citosol también facilita que las células cancerosas mantengan activada la glicólisis. Durante la elaboración de esta tesis se ha realizado el trabajo titulado “Role of the Intracellular pH in the Metabolic Switch between Oxidative Phosphorylation and Aerobic Glycolysis - Relevance to Cancer” con el objetivo de conocer los motivos por los que la alcalinización del pH intracelular favorece el fenotipo glicolítico. La OXPHOS depende de la diferencia de concentración de H + entre la matriz mitocondrial y el espacio intermembrana de la mitocondria. En la membrana externa de la mitocondria existen unos canales de aniones dependientes de voltajes (VDAC). Si estos canales se encuentran abiertos, las concentraciones de H + en el espacio intermembrana de la mitocondria y el citosol van a ser similares. Esto quiere decir que una alcalinización del citosol, como se ha comentado que ocurre en las células cancerosas por activación de la glicólisis, también disminuiría los H + en el espacio intermembrana mitocondrial, con lo que la OXPHOS se vería reducida por la disminución del gradiente de H + . Por otro lado, un pH alcalino del citosol también provocaría que la hexoquinasa 3. ATECEDETES - 150 - se uniera a los canales VDAC, impidiendo el funcionamiento normal de la mitocondria, con lo que la OXPHOS también quedaría reducida. Debido a esta disminución de la actividad de la OXPHOS, las células cancerosas deberían mantener activa la glicólisis para poder cubrir las necesidades energéticas. Además, la glicólisis también se vería estimulada por la activación de la fosfofructoquinasa, enzima clave en la regulación de la glicólisis, debido a la alcalinización intracelular. Por otra parte, el piruvato formado como producto de la glicólisis no podría penetrar en la mitocondria debido a la reducción del gradiente de H + , el cual es necesario para el transporte de piruvato al interior de la mitocondria, con lo que el piruvato se acumularía en el citosol. Esta acumulación de piruvato activaría al HIF1 que aumentaría la expresión de transportadores de glucosa y enzimas glicolíticas, con lo que la glicólisis seguiría activa. Todos estos eventos podrían explicar que la alcalinización del citosol participe en mantener activa la glicólisis en las células cancerosas. Está claro que una glicólisis activa permite a las células cancerosas poder mantener el estado energético y al aporte de los precursores necesarios para la biosíntesis de macromoléculas. Pero la glicólisis tiene otra función vital para las células cancerosas: el mantener la homeostasis del balance redox. Como se ha comentado en el apartado anterior, las células cancerosas presentan unos elevados niveles de EROs fruto de su elevado metabolismo celular. Aunque las EROs pueden inducir muerte celular, las células tumorales han desarrollado mecanismos para prevenir que las EROs alcancen niveles citotóxicos. La glicólisis forma parte de uno de estos mecanismos de defensa contra el estrés oxidativo. Por un lado, la activación de la glicólisis incrementa la formación de piruvato, el cual es un eficiente atrapador de peróxido de hidrógeno. Por otro lado, el metabolismo de la glucosa a través del ciclo de la pentosa fosfato va a regenerar NADPH desde NAD + . La regeneración del NADPH es necesaria para la detoxificación de EROs a través de los sistemas de antioxidantes glutatión y tioredoxin (Figura 12) 25 . Estas funciones de la glicólisis aeróbica explican su papel clave en el desarrollo del cáncer. La posible reversión metabólica de la glicólisis aeróbica a OXPHOS podría ser importante para el desarrollo de estrategias preventivas y terapéuticas contra el cáncer. Existen numerosos estudios en donde se ha visto que la utilización de inhibidores de la glicólisis disminuye la producción de ATP en las células cancerosas, induciendo la muerte celular 25,43-45 . Por otro lado, la combinación de inhibidores de glicólisis junto con agentes prooxidantes podría presentar sinergismo, potenciando el efecto citotóxico sobre células cancerosas 25 . Este sinergismo se debería a que la inhibición de la glicólisis podría hacer a las células cancerosas más susceptibles al aporte exógeno de EROs. Todo esto hace pensar que la inhibición de la glicólisis podría ser una herramienta útil en el tratamiento del cáncer. 3. ATECEDETES - 151 - Figura 12. Papel de la glicólisis en la detoxificación de H 2 O 2 . La glicólisis ayudaría a detoxificar H 2 O 2 al incrementar las concentraciones de piruvato y por regeneración de los sistemas antioxidantes glutatión y tioredoxin. Fuente original: “López-Lázaro, M. A new view of carcinogenesis and an alternative approach to cancer therapy. Mol. Med. 2010, 16 (3-4); 144- 153” 25 . 3. ATECEDETES - 152 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 255 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 256 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 257 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 258 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 259 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 260 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 261 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 262 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 263 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 264 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 271 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 272 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 273 - 6.7. EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE HOJAS DE ERIUM OLEADER L. En la búsqueda de nuevos fármacos anticancerosos más selectivos, las plantas y productos naturales siguen siendo una fuente de investigación importante. En los últimos años, se ha empezado a valorar el uso de los heterósidos cardiotónicos como compuestos de origen natural con posible potencial anticanceroso 134-136 . Los heterósidos cardiotónicos han sido aislados de numerosas especies vegetales. Entre ellas destaca erium oleander por su elevado contenido en heterósidos cardiotónicos 137,138 . . oleander ha sido utilizada en la medicina tradicional para el tratamiento de numerosas enfermedades, incluyendo el tratamiento de tumores sólidos 137 . La posible actividad antitumoral de . oleander se debe a su contenido en heterósidos cardiotónicos (como la oleandrina) y triterpenos que han demostrado actividad anticancerosa en varios estudios in vitro 137,139-141 . En la actualidad existen dos extractos de . oleander patentados, “Anvirzel” y “Breastin”. La administración de “Anvirzel” es segura en humanos 142 y se encuentra en ensayos clínicos en fase I para el tratamiento del cáncer. Durante esta tesis se ha valorado la posible actividad selectiva de un extracto hidroalcohólico de . oleander en un modelo in vitro de cáncer de pulmón y los posibles mecanismos implicados en la selectividad de este extracto. Los resultados obtenidos se encuentran recogidos en el manuscrito titulado A hydroalcoholic extract from the leaves of erium oleander L. inhibits glycolysis and induces selective killing of lung cancer cells, el cual se encuentra en revisión en la revista Planta Medica, que se comenta y adjunta a continuación. En primer lugar se preparó el extracto hidroalcohólico de erium oleander (NOE) y se determinó su contenido en heterósidos cardiotónicos totales mediante la reacción de Kedde, que fue de un 4,8% ± 0,3%. Una vez elaborado el extracto, se realizó el ensayo MTT para evaluar su posible actividad anticancerosa selectiva. NOE demostró tener mayor actividad citotóxica frente a células cancerosas de pulmón A549 que frente a células normales de pulmón MRC-5 (Figura 1 artículo adjunto (Figura 56)). Aunque esta actividad anticancerosa selectiva de NOE fue similar a la mostrada por cisplatino (fármaco anticanceroso utilizado de referencia), el valor de IC50 de NOE fue casi 10 veces menor que el valor de IC50 de cisplatino para células A549, siendo 0,27 µg/ml y 3,52 µg/ml respectivamente. También se evaluó la actividad citotóxica de NOE en otras líneas celulares cancerosas: células de cáncer colorrectal HT29 y células de melanoma UACC-62. Ambas líneas demostraron ser más resistentes que las células cancerosas de pulmón A549, siendo la IC50 casi 15 veces mayor para HT29 y 6 veces mayor para UACC-62 que la IC50 mostrada para A549. Estos datos indican que NOE inhibe selectivamente el crecimiento de células cancerosas A549. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 274 - El siguiente paso fue la evaluación de los posibles mecanismos involucrados en la citotoxicidad selectiva de NOE. Como se ha comentado en apartados anteriores, se sabe que las células cancerosas son más susceptibles al aporte exógeno de EROs que las células normales, al tener las células tumorales mayores niveles basales de EROs, por lo que con un aporte exógeno de EROs específico se alcanzará niveles citotóxicos para células cancerosos sin alcanzar estos niveles en las células normales. La generación de estrés oxidativo está involucrada en el efecto citotóxico de oleandrina, un heterósido cardiotónico que se encuentra en . oleander 140 . Para valorar si la formación de EROs estaba involucrada en la citotoxicidad de NOE, células A549 fueron tratadas con NOE en presencia o ausencia de antioxidantes (catalasa y n-acetilcisteína). La Figura 2 del artículo adjunto (Figura 57) demuestra que la citotoxicidad de NOE fue ligeramente reducida, pero de forma significativa, por la presencia de ambos antioxidantes. Estos datos quieren decir que aunque no sea el mecanismo principal, la generación de EROs participa en la citotoxicidad de NOE. Otro posible mecanismo de la actividad anticancerosa selectiva demostrada por NOE podría ser la generación de un tipo de daño específico en el ADN. Compuestos que dañan el ADN han demostrado actividad anticancerosa selectiva debido a que ciertos tumores presentan alteraciones en las vías de reparación del daño inducido por estos compuestos, por lo que son más sensibles a ellos que las células normales 15 . Estudios previos han demostrado que algunos heterósidos cardiotónicos inducen daño en el ADN 143,144 . Para evaluar si la generación de daño en el ADN estaba involucrado en el mecanismo citotóxico de NOE, células VC8 (deficientes en HR) y células VC8-B2 (con HR funcional) fueron expuestas 48 h a varias concentraciones de NOE y medida su viabilidad mediante MTT. Debido a que estas líneas celulares son de origen murino, las concentraciones de NOE tuvieron que ser aumentadas puesto que se sabe que las células de roedores son más de 100 veces más resistentes a los heterósidos cardiotónicos que las células humanas 145 . Las células deficientes en HR fueron ligeramente, pero significativamente, más sensibles a la citotoxicidad inducida por NOE (Figura 3A del artículo adjunto (Figura 58)). Esta mayor sensibilidad de las células deficientes también pudo observarse mediante el ensayo inmunofluorescente de focos de γH2AX. Las células deficientes en HR presentaron mayores roturas de doble cadena (señalizados por la γH2AX) que las células con HR funcional tras 24 horas de tratamiento con NOE, debido a su incapacidad para reparar el daño en el ADN inducido por NOE (Figuras 3B y 3C del artículo adjunto (Figura 58)). Por tanto, la generación de daño en el ADN está involucrada en la citotoxicidad de NOE. En los últimos años se ha empezado a barajar la glicólisis como diana terapéutica contra el cáncer, puesto que se sabe que las células cancerosas dependen de la glicólisis en mayor medida que las células normales 25,76,146 . Algunos heterósidos cardiotónicos son capaces de inhibir la glicólisis en células no cancerosas 147,148 . Todo esto hizo pensar que quizás NOE 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 275 - pudiera estar inhibiendo la glicólisis. Para comprobar esta posibilidad, células A549 fueron expuestas a distintas concentraciones de NOE durante 8 h. Finalizado el tratamiento, las concentraciones de glucosa (producto inicial de la glicólisis) y de lactato (producto final de la glicólisis) fueron medidas. NOE demostró una marcada disminución de producción de lactato y de consumo de glucosa (Figura 4 del artículo adjunto (Figura 59)), comparable al observado en las células que fueron expuestas al control positivo dicloroacetato (inhibidor de la glicólisis). Por tanto, NOE indujo una marcada inhibición de la glicólisis en las células A549. Esta inhibición de la glicólisis puede participar en la citotoxicidad de NOE, pero no está claro si es la responsable de la selectividad mostrada sobre células cancerosas. Esto se debe a que la inhibición de la glicólisis puede ser una consecuencia de la inhibición de la bomba Na + /K + - ATPasa por los heterósidos cardiotónicos que contiene NOE 149 . La expresión de la bomba Na + /K + -ATPasa es diferente según el tipo celular. Hay estudios que sugieren que la diferencia de susceptibilidad a la citotoxicidad de heterósidos cardiotónicos se debe a esas diferencias en la expresión y localización celular de la bomba Na + /K + -ATPasa 150,151 . Por tanto, para poder conocer si la inhibición de la glicólisis mostrada por NOE es la responsable de la actividad citotóxica selectiva, es necesario un estudio de la posible asociación entre la expresión de la bomba Na + /K + -ATPasa y la habilidad de los heterósidos cardiotónicos para inhibir la glicólisis. En la terapia del cáncer, la combinación de fármacos es una herramienta terapéutica muy utilizada. La combinación se debe hacer entre fármacos que no presenten antagonismo entre ellos. Para poder evaluar la compatibilidad de NOE con cisplatino, fármaco de primer línea en el tratamiento del cáncer de pulmón, se estudió el efecto sobre la viabilidad celular en A549 tras la combinación de estos dos compuestos. El análisis del efecto combinatorio se realizó con el software Compusyn, con el que se calculó el parámetro de Indice de Combinación o CI. Células que fueron expuestas previamente a NOE antes que a cisplatino mostraron un moderado efecto antagónico, mientras que el tratamiento previo con cisplatino seguido de NOE presentó un moderado sinergismo (Tabla 1 del artículo adjunto (Tabla 8)). El moderado efecto antagónico observado cuando células fueron tratadas con NOE antes que con cisplatino podría deberse a la implicación en la acumulación intracelular de cisplatino por la bomba Na + /K + -ATPasa 152 . En conclusión, NOE ha demostrado actividad citotóxica selectiva frente a células de cáncer de pulmón. En el efecto citotóxico de NOE están involucradas la formación de EROs, la generación de daño en el ADN y la inhibición de la glicólisis. Estos datos junto con el efecto sinérgico observado con la combinación con cisplatino apoyan la posible utilización de extractos de las hojas de erium oleander en ensayos clínicos para el tratamiento de cáncer de pulmón. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 276 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 277 - Planta Medica 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 278 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 279 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 280 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 287 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 288 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 289 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 290 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 291 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 292 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 293 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 294 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 295 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 296 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 303 - Figura 63. Posible mecanismo del papel de la bomba a + /K + -ATPasa en la activación de la glicólisis. Las células necesitan la bomba a + /K + -ATPasa para poder mantener activa la glicólisis. Una inhibición de la bomba a + /K + -ATPasa por los heterósidos cardiotónicos podría provocar la reducción de la actividad del cotransportador glucosa/a + (SGLT), la disminución de la actividad del intercambiador a + /H + y la inactivación de la enzima glicolítica fosfofructoquinasa (PFK). Figura adaptada del artículo “López-Lázaro, M. Digitoxin as an anticancer agent with selectivity for cancer cells: possible mechanisms involved. Expert. Opin. Ther. Targets. 2007. 11 (8): 1043-1053” 149 . Para comprobar si los heterósidos cardiotónicos pueden inhibir la glicólisis, células A549 fueron tratadas con varias concentraciones de digitoxina, digoxina y ouabaína durante un tiempo de exposición de 8 h. Transcurrido el tiempo de tratamiento, se midieron las concentraciones de glucosa (producto de partida de la glicólisis) y de lactato (producto final de la glicólisis) presentes en el medio de las células. El tiempo de exposición escogido fue de 8 h puesto que un tiempo mayor de exposición con heterósidos cardiotónicos disminuiría la viabilidad celular, interfiriendo en los resultados (a menor viabilidad celular, menor producción de lactato y menor consumo de glucosa). Los resultados obtenidos con los tres heterósidos están recogidos en la Figura 64. Los tres heterósidos disminuyeron la producción de lactato y el consumo de glucosa de manera concentración-dependiente. Digitoxina disminuyó de manera más significativa los niveles de lactato producido y de glucosa consumida que digoxina a las mismas concentraciones testadas. A la concentración de 100 nM, Digitoxina disminuyó de forma estadísticamente significativa la producción de lactato hasta casi la mitad respecto a las células no tratadas. Este mismo efecto se observó en los niveles de glucosa, las células tratadas con digitoxina 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 304 - consumieron el 50% menos de glucosa que las células sin tratar. Ouabaína fue el heterósido más potente de los tres, produciendo los mismos efectos sobre los niveles de lactato y glucosa a concentraciones 10 veces más bajas que digitoxina y digoxina. Estos datos demuestran que estos heterósidos cardiotónicos inhiben la glicólisis y se sabe que la inhibición de ésta produce citotoxicidad, al ser una ruta necesaria para la producción de ATP y macromoléculas para la biosíntesis. Sin embargo, no se sabe si esta inhibición de la glicólisis es la responsable de la selectividad de estos heterósidos cardiotónicos frente a células cancerosas A549. Figura 64. Heterósidos cardiotónicos inhiben la glicólisis en células A549. Porcentaje de producción de lactato (A, C y E) y porcentaje de consumo de glucosa (B, D y F) en células A549 expuestas 8 h a digitoxina, digoxina y ouabaína, respectivamente, con respecto a células no tratadas. A) E) C) B) D) F) 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 305 - Con el objetivo de evaluar si esta inhibición de la glicólisis por los heterósidos cardiotónicos participaba en su actividad citotóxica selectiva, se midieron los niveles de glucosa y lactato tras el tratamiento con digitoxina durante 8 h de células normales MRC-5 y células cancerosas A549 (Figura 65). Se escogió digitoxina porque, como se comentó anteriormente, fue el heterósido con mayor actividad selectiva. Figura 65. Heterósidos cardiotónicos inhiben la glicólisis de células MRC-5 y células A549. Porcentaje de producción de lactato (A) y porcentaje de consumo de glucosa (B) en células MRC-5 y A549 expuestas 8 h a digitoxina y 5-FU (control negativo) con respecto a células no tratadas Digitoxina disminuyó de forma más acusada la producción de lactato y el consumo de glucosa en células cancerosas A549 que en células normales MRC-5 a las concentraciones de 32 y 100 nM tras un tiempo de exposición de 8 h. A la concentración de 100 nM, digitoxina disminuyó la producción de lactato en A549 hasta casi el 50% con respecto a las células sin tratar, mientras que la disminución en células MRC-5 fue de aproximadamente un 20% con respecto a las células sin tratar. Sin embargo, a pesar de que estos resultados demuestran que estos heterósidos son capaces de inhibir la glicólisis, no se puede asegurar que esta inhibición sea la responsable directa de la actividad anticancerosa selectiva de estos compuestos. De hecho, existen estudios que sugieren que la expresión y la localización celular de las subunidades alfas de la bomba Na + /K + -ATPasa en diferentes tipos de células podría explicar el por qué diferentes células son más o menos sensibles a la actividad citotóxica de heterósidos cardiotónicos 150,151 . Mijatovic y cols. 150 observaron que varias células cancerosas de pulmón presentaron mayores niveles de expresión de la bomba Na + /K + -ATPasa, en concreto subunidad A) B) 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 306 - α1, que células normales de pulmón. Ellos observaron que un nuevo cardenólido, el UNBS1450, presentó mayor actividad citotóxica sobre células cancerosas que sobre células normales, posiblemente debido a la mayor expresión de la ATPasa diana en las células cancerosas. Por tanto, es necesario realizar un estudio de la relación entre la expresión y la localización celular de las subunidades alfa de la bomba Na + /K + -ATPasa y la capacidad de los heterósidos cardiotónicos para inhibir la glicólisis para poder comprobar si la inhibición de la glicólisis por estos compuestos realmente juega un papel en su actividad anticancerosa selectiva. 6.8.3. Estudio de la combinación de digitoxina con agentes prooxidantes. Aunque no esté claro el papel de la inhibición de la glicólisis en la actividad selectiva de estos heterósidos cardiotónicos, sí que se sabe que esta inhibición contribuye a su efecto citotóxico, puesto que es conocido la importancia de la glicólisis para el mantenimiento de los niveles de ATP y de macromoléculas requeridas para la proliferación y viabilidad de las células cancerosas. Otro papel fundamental de la glicólisis es ayudar a mantener las EROs dentro de niveles no tóxicos para las células cancerosas, por lo que la inhibición de la glicólisis hace a las células cancerosas más susceptibles al estrés oxidativo. Por este motivo, se piensa que la combinación de inhibidores de glicólisis con agentes prooxidantes podría presentar un efecto sinérgico de la citotoxicidad de estos compuestos 25 . Como se ha comentado anteriormente, los heterósidos cardiotónicos aquí evaluados son capaces de inhibir la glicólisis. Para comprobar si podría existir sinergismo entre estos heterósidos cardiotónicos como inhibidores de glicólisis y agentes prooxidantes, se estudió la combinación de digitoxina (el heterósido cardiotónico con mayor actividad selectiva de los aquí ensayados) con varios de los agentes prooxidantes estudiados en esta tesis (pirogalol, fenilglioxal y vitamina C). Con este objetivo, células normales MRC-5 y células cancerosas A549 fueron tratadas durante 8 h con diferentes concentraciones de digitoxina y estos prooxidantes solos o en combinación. Después de las 8 h, el tratamiento fue retirado y las células fueron incubadas libres de tratamiento durante 40 h. Finalizado el tiempo de incubación, la viabilidad celular fue estimada mediante ensayo MTT y el efecto combinatorio fue expresado mediante el parámetro de Índice de Combinación (CI), el cual fue calculado con el software CompuSyn. El parámetro CI,basado en el método de Chou- Talalay, permite dar un valor al efecto combinatorio de dos fármacos, estableciéndose como un efecto aditivo cuando el valor es 1, sinergismo cuando el valor es < 1, y antagonismo cuando el valor > 1 59 . Los resultados que se obtuvieron son recogidos en la Tabla 9. De forma general se puede decir que la combinación de los prooxidantes fenilglioxal, pirogalol y vitamina C con digitoxina presentó un efecto sinérgico sobre células cancerosas mientras que presentó un ligero efecto antagónico sobre células normales. En otras palabras, la combinación de digitoxina con un agente prooxidante mató de forma más selectiva células cancerosas que células normales. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 307 - Estos datos sugieren que la inhibición de la glicólisis inducida por digitoxina puede provocar un aumento de la sensibilidad de las células al aporte exógeno de EROs por agentes prooxidantes, potenciando la actividad anticancerosa selectiva mostrada por estos compuestos. Digitoxina Prooxidante Combinación Célula Conc. % Viab. Celular Compuesto Conc. % Viab. Celular % Viab. Celular CI Efecto 300 µM 102,7 ± 5,4 96,1 ± 5,4 0,9 ± Vitamina C 500 µM 83,9 ± 3,8 62,9 ± 14,3 1,2 - 32 µM 67,6 ± 8,8 72,2 ± 7,5 1,7 --- Pirogalol 50 µM 63,3 ± 6,4 66,5 ± 7,4 1,5 --- 32 nM 100,3 ± 3,4 Fenilglioxal 100 µM 92,6 ± 5,6 92,1 ± 3,6 2,3 --- 300 µM 102,7 ± 5,4 94,5 ± 4,7 1,5 --- Vitamina C 500 µM 83,9 ± 3,8 70,5 ± 8,3 1,7 --- 32 µM 67,6 ± 8,8 67,1 ± 8,6 1,6 --- Pirogalol 50 µM 63,3 ± 6,4 61,4 ± 9,9 1,6 --- MRC-5 100 nM 100,8 ± 4,3 Fenilglioxal 100 µM 92,6 ± 5,6 69,1 ± 8,1 ˃10 ----- 300 µM 95,3 ± 4,8 80,2 ± 1,5 1,4 -- Vitamina C 500 µM 39,4 ± 12,5 44,25 ± 7 1,2 - 32 µM 37,8 ± 5,3 30,2 ± 6,9 0,7 ++ Pirogalol 50 µM 31 ± 5,3 22,5 ± 4,7 0,6 +++ 32 nM 86,6 ± 5,6 Fenilglioxal 100 µM 81,9 ± 1,2 66,2 ± 2,4 0,7 +++ 300 µM 95,3 ± 4,8 55,2 ± 3,2 1,4 -- Vitamina C 500 µM 39,4 ± 12,5 18,6 ± 5,8 1,0 ± 32 µM 37,8 ± 5,3 17,8 ± 3,9 0,4 +++ Pirogalol 50 µM 31 ± 5,3 11,9 ± 3,3 0,3 +++ A549 100 nM 65,4 ± 5,7 Fenilglioxal 100 µM 81,9 ± 1,2 43,7 ± 5,0 0,6 +++ Tabla 9. Actividad citotóxica de digitoxina en combinación con varios agentes prooxidantes. Las células cancerosas A549 y las células normales MRC-5 fueron expuestas 8 h a los heterósidos cardiotónicos, solos o en combinación con alguno de los agentes prooxidantes. Tras ese tiempo, se retiró el tratamiento y las células fueron incubadas 40 h más. El porcentaje de viabilidad celular (media ± SEM) fue determinada mediante ensayo MTT y el parámetro de Índice de Combinación (CI) fue calculado con el software Compusyn. Un valor de CI <1 es considerado sinergismo y se representa con “+++++” para sinergismo muy fuerte (CI<0.1), “++++” para sinergismo fuerte (CI=0.1-0.3), “+++” para sinergismo (CI=0.3- 0.7), “++” para sinergismo moderado (CI=0.7-0.85) y “+” para sinergismo ligero (CI=0.85- 0.9). Un valor de CI entre 0.9 y 1.1 se considera efecto aditivo y es indicado con “±”. Un valor de CI >1 es considerado antagonismo y es representado por “-” para antagonismo ligero (CI=1.1-1.2), “--” para antagonismo moderado (CI=1.2-1.45), “---” para antagonismo (CI=1.45-3.3), “----” para antagonismo fuerte (CI=3.3-10) y “-----” para antagonismo muy fuerte (CI>10). 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 308 - 6.8.4. Evaluación del efecto combinatorio de heterósidos cardiotónicos y cisplatino. Anteriormente se comentó que algunos heterósidos cardiotónicos, como digitoxina y digoxina, han entrado en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer. Muchos de estos ensayos estudian la combinación de un heterósido cardiotónico con algún fármaco anticanceroso utilizado en clínica, puesto que el tratamiento combinado de fármacos es una herramienta muy utilizada en el tratamiento del cáncer. Existen estudios que sugieren que los heterósidos cardiotónicos podrían ejercer un efecto antagónico sobre el efecto de determinados fármacos anticancerosos 144,152 . Por este motivo, se decidió evaluar el efecto de la combinación de los heterósidos cardiotónicos aquí ensayados con cisplatino, el fármaco anticanceroso más utilizado en el tratamiento del cáncer de pulmón. Para ello, células cancerosas A549 fueron expuestas durante 4 horas a cisplatino o a lo heterósidos cardiotónicos. Transcurrido ese tiempo, se añadieron los heterósidos cardiotónicos o el cisplatino, en función del tratamiento inicial. Después de un tratamiento en combinación de 44 horas, la viabilidad de las células fue medida con el ensayo MTT. Los datos obtenidos se encuentran en las Tablas 10-13. A concentraciones bajas de cisplatino (1 y 3 µM), el efecto general de las combinaciones fue aditivo, sin importar si cisplatino se añadiese antes o después que los heterósidos cardiotónicos (Tabla 13). Sin embargo, a mayores concentraciones de cisplatino (10 y 32 µM), el efecto de las combinaciones se vió influenciado por el orden del tratamiento. Cuando cisplatino fue añadido 4 h previamente al tratamiento con los heterósidos cardiotónicos, el efecto de la combinación fue un moderado sinergismo, a excepción de ouabaína que continúo siendo un efecto aditivo. Pero cuando los heterósidos cardiotónicos fueron añadidos 4 h previamente al tratamiento con cisplatino, el efecto de la combinación continuó siendo aditivo o, en el caso de la ouabaína, fue incluso antagónico. Esta diferencias del efecto combinatorio dependiendo del orden del tratamiento podría explicarse porque se ha visto que la bomba Na + /K + -ATPasa puede jugar un papel en la acumulación intracelular de cisplatino. La inhibición de esta bomba ha sido asociada con una reducción de la acumulación intracelular de cisplatino 152 . Esto podría explicar que la administración de estos heterósidos cardiotónicos antes que cisplatino presentara un efecto combinatorio entre aditivo y un ligero antagonismo, mientras que la administración de estos heterósidos después de cisplatino presentara un efecto sinérgico. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 309 - Primer compuesto añadido Segundo compuesto añadido Combinación Conc. % Viab. Celular Conc. % Viab. Celular % Viab. Celular CI Efecto 1 nM digitoxina 83,7 ± 2,8 76,9 ± 1,6 1,1 ± 3 nM digitoxina 66,2 ± 2,7 63,4 ± 1,1 1,1 ± 1 µM cisplatino 85,9 ± 2,3 10 nM digitoxina 32,1 ± 1,3 29,9 ± 4,2 0,9 + 1 nM digitoxina 83,7 ± 2,8 64,5 ± 0,1 0,9 + 3 nM digitoxina 66,2 ± 2,7 56,8 ± 1,2 1,1 ± 3 µM cisplatino 72,6 ± 2,8 10 nM digitoxina 32,1 ± 1,3 30,7 ± 3,4 1,0 ± 1 nM digitoxina 83,7 ± 2,8 45,7 ± 2,2 0,8 ++ 3 nM digitoxina 66,2 ± 2,7 36,7 ± 2,1 0,7 ++ 10 µM cisplatino 53,8 ± 0,2 10 nM digitoxina 32,1 ± 1,3 23,6 ± 3,5 0,8 ++ 1 nM digitoxina 83,7 ± 2,8 31,1 ± 0,1 1,0 ± 3 nM digitoxina 66,2 ± 2,7 25,8 ± 0,0 0,8 ++ 32 µM cisplatino 33,0 ± 2,6 10 nM digitoxina 32,1 ± 1,3 16,84 ± 0,2 0,7 ++ 1 nM digitoxina 83,0 ± 1,5 83,3 ± 1,9 1,2 - 3 nM digitoxina 63,0 ± 2,7 63,1 ± 1,0 1,2 - 10 nM digitoxina 23,9 ± 0,7 1 µM cisplatino 96,3 ± 2,6 23,9 ± 2,3 1,0 ± 1 nM digitoxina 83,0 ± 1,5 69,2 ± 3,1 0,8 ++ 3 nM digitoxina 63,0 ± 2,7 57,5 ± 7,2 1,2 - 10 nM digitoxina 23,9 ± 0,7 3 µM cisplatino 84,7 ± 3,8 14,2 ± 0,1 0,6 +++ 1 nM digitoxina 83,0 ± 1,5 57,1 ± 1,0 1,0 ± 3 nM digitoxina 63,0 ± 2,7 45,6 ± 1,4 1,1 ± 10 nM digitoxina 23,9 ± 0,7 10 µM cisplatino 59,8 ± 2,4 13,2 ± 3,0 0,6 +++ 1 nM digitoxina 83,0 ± 1,5 35,0 ± 0,7 1,1 ± 3 nM digitoxina 63,0 ± 2,7 30,8 ± 1,5 1,2 - 10 nM digitoxina 23,9 ± 0,7 32 µM cisplatino 40,7 ± 2,8 15,7 ± 0,6 1,0 ± Tabla 10. Actividad citotóxica de digitoxina en combinación con cisplatino dependiendo del orden del tratamiento. Células cancerosas A549 fueron expuestas durante 4 horas a cisplatino o a digitoxina. Después de este tiempo, se añadió digitoxina o cisplatino, en función del tratamiento inicial. Después de un tratamiento en combinación de 40 horas, la viabilidad de las células fue medida con el ensayo MTT y el parámetro de Índice de Combinación (CI) fue calculado con el software Compusyn. Ver Tabla 9 para el significado de los símbolos que representan el efecto de la combinación. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 310 - Primer compuesto añadido Segundo compuesto añadido Combinación Conc. % Viab. Celular Conc. % Viab. Celular % Viab. Celular CI Efecto 1 nM digoxina 88,8 ± 2,6 87,3 ± 2,6 1,9 --- 3 nM digoxina 75,6 ± 4,8 78,4 ± 9,2 1,7 --- 1 µM cisplatino 85,9 ± 2,3 10 nM digoxina 45,1 ± 3,9 46,0 ± 5,9 1,1 ± 1 nM digoxina 88,8 ± 2,6 72,2 ± 1,9 1,2 - 3 nM digoxina 75,6 ± 4,8 61,7 ± 1,1 1,1 ± 3 µM cisplatino 72,6 ± 2,8 10 nM digoxina 45,1 ± 3,9 41,1 ± 1,3 1,0 ± 1 nM digoxina 88,8 ± 2,6 52,2 ± 0,2 1,0 ± 3 nM digoxina 75,6 ± 4,8 45,0 ± 0,8 0,9 ± 10 µM cisplatino 53,8 ± 0,2 10 nM digoxina 45,1 ± 3,9 35,1 ± 0,7 1,0 ± 1 nM digoxina 88,8 ± 2,6 28,7 ± 0,2 0,3 +++ 3 nM digoxina 75,6 ± 4,8 29,5 ± 0,0 0,4 +++ 32 µM cisplatino 33,0 ± 2,6 10 nM digoxina 45,1 ± 3,9 21,4 ± 0,1 0,4 +++ 1 nM digoxina 91,8 ± 2,8 91,2 ± 0,0 1,4 -- 3 nM digoxina 79,9 ± 1,2 70,23 ± 0,1 0,7 ++ 10 nM digoxina 51,8 ± 7,8 1 µM cisplatino 96,3 ± 2,6 45,41 ± 0,2 0,8 ++ 1 nM digoxina 91,8 ± 2,8 76,3 ± 1,8 0,8 ++ 3 nM digoxina 79,9 ± 1,2 60,8 ± 0,9 0,7 ++ 10 nM digoxina 51,8 ± 7,8 3 µM cisplatino 84,7 ± 3,8 50,4 ± 4,8 1,1 ± 1 nM digoxina 91,8 ± 2,8 58,2 ± 1,0 0,9 + 3 nM digoxina 79,9 ± 1,2 47,1 ± 0,2 0,7 ++ 10 nM digoxina 51,8 ± 7,8 10 µM cisplatino 59,8 ± 2,4 41,7 ± 6,7 1,1 ± 1 nM digoxina 91,8 ± 2,8 36,1 ± 2,5 1,0 ± 3 nM digoxina 79,9 ± 1,2 36,6 ± 1,1 1,2 - 10 nM digoxina 51,8 ± 7,8 32 µM cisplatino 40,7 ± 2,8 26,1 ± 1,4 1,0 ± Tabla 11. Actividad citotóxica de digoxina en combinación con cisplatino dependiendo del orden del tratamiento. Células cancerosas A549 fueron expuestas durante 4 horas a cisplatino o a digoxina. Después de este tiempo, se añadió digoxina o cisplatino, en función del tratamiento inicial. Después de un tratamiento en combinación de 40 horas, la viabilidad de las células fue medida con el ensayo MTT y el parámetro de Índice de Combinación (CI) fue calculado con el software Compusyn. Ver Tabla 9 para el significado de los símbolos que representan el efecto de la combinación. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 311 - Tabla 12. Actividad citotóxica de ouabaína en combinación con cisplatino dependiendo del orden del tratamiento. Células cancerosas A549 fueron expuestas durante 4 horas a cisplatino o ouabaína. Después de este tiempo, se añadió ouabaína o cisplatino, en función del tratamiento inicial. Después de un tratamiento en combinación de 40 horas, la viabilidad de las células fue medida con el ensayo MTT y el parámetro de Índice de Combinación (CI) fue calculado con el software Compusyn. Ver Tabla 9 para el significado de los símbolos que representan el efecto de la combinación. Primer compuesto añadido Segundo compuesto añadido Combinación Conc. % Viab. Celular Conc. % Viab. Celular % Viab. Celular CI Efecto 1 nM ouabaina 79,4 ± 0,5 72,0 ± 2,9 1,0 ± 3 nM ouabaina 47,4 ± 4,0 46,1 ± 4,5 1,2 - 1 µM cisplatino 85,9 ± 2,3 10 nM ouabaina 5,9 ± 0,8 4,8 ± 0,5 0,8 ++ 1 nM ouabaina 79,4 ± 0,5 60,3 ± 0,5 1,0 ± 3 nM ouabaina 47,4 ± 4,0 42,9 ± 5,0 1,3 -- 3 µM cisplatino 72,6 ± 2,8 10 nM ouabaina 5,9 ± 0,8 3,8 ± 0,4 0,7 ++ 1 nM ouabaina 79,4 ± 0,5 45,1 ± 0,2 1,0 ± 3 nM ouabaina 47,4 ± 4,0 34,0 ± 1,6 1,2 - 10 µM cisplatino 53,8 ± 0,2 10 nM ouabaina 5,9 ± 0,8 4,3 ± 0,3 0,7 ++ 1 nM ouabaina 79,4 ± 0,5 26,7 ± 0,0 0,9 ± 3 nM ouabaina 47,4 ± 4,0 22,9 ± 3,3 1,2 - 32 µM cisplatino 33,0 ± 2,6 10 nM ouabaina 5,9 ± 0,8 3,1 ± 1,0 0,6 +++ 1 nM ouabaina 93,6 ± 0,9 80,6 ± 4,8 0,7 ++ 3 nM ouabaina 65,6 ± 4,5 59,6 ± 3,2 1,0 ± 10 nM ouabaina 12,6 ± 4,9 1 µM cisplatino 96,3 ± 2,6 8,7 ± 2,0 0,9 + 1 nM ouabaina 93,6 ± 0,9 74,3 ± 3,0 0,9 + 3 nM ouabaina 65,6 ± 4,5 56,0 ± 1,8 1,1 ± 10 nM ouabaina 12,6 ± 4,9 3 µM cisplatino 84,7 ± 3,8 13,0 ± 8,0 1,0 ± 1 nM ouabaina 93,6 ± 0,9 53,2 ± 1,8 0,9 + 3 nM ouabaina 65,6 ± 4,5 46,4 ± 1,0 1,2 - 10 nM ouabaina 12,6 ± 4,9 10 µM cisplatino 59,8 ± 2,4 17,0 ± 1,0 1,3 -- 1 nM ouabaina 93,6 ± 0,9 38,2 ± 0,7 1,3 -- 3 nM ouabaina 65,6 ± 4,5 32,0 ± 1 1,3 -- 10 nM ouabaina 12,6 ± 4,9 32 µM cisplatino 40,7 ± 2,8 15,4 ± 2,5 1,4 -- 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 312 - Tabla 13. Media de los Índices de Combinación (CI), con un Intervalo de confianza del 95%, de las combinaciones de heterósidos cardiotónicos y cisplatino, según las concentraciones de éste último. 6.8.5. Evaluación de la actividad anticancerosa de heterósidos cardiotónicos frente a diferentes tipos de células cancerosas. Finalmente, se decidió evaluar si la selectividad demostrada por estos tres heterósidos cardiotónicos sobre células de cáncer de pulmón también se producía en otros tipos de cáncer. Para cumplir este objetivo, diferentes líneas celulares cancerosas (MCF7, UACC-62, HT29 y HTC116) y células no malignas (MCF10 y VH10) fueron expuestas a diferentes concentraciones de los heterósidos cardiotónicos durante 48 h. La viabilidad celular fue cuantificada mediante el ensayo MTT. Los valores de IC50 obtenidos para las diferentes líneas se encuentran recogidos en la Tabla 14. Como control positivo fue utilizado el fármaco anticanceroso 5-fluorouracilo (5-FU). IC50 (media ± SEM; nM) Células Digitoxina Digoxina Ouabaína 5-FU (µM) MRC-5 77,5 ± 12,4 65,1 ± 13,2 29,4 ± 4,5 ˃1000 MCF10 61,3 ± 5,0 67,1 ± 22,0 41,4 ± 2,7 ˂0,1 o malignas VH-10 165,4 ± 52,4 200,8 ± 62,7 60,8 ± 11,1 ˃1000 A549 7,39 ± 0,6 8,0 ± 1,3 5,3 ± 0,4 52 ± 45 MCF7 36,8 ± 1,6 32,9 ± 8,7 39,3 ± 1,0 0,1 ± 0 UACC-62 143,9 ± 6,3 171,5 ± 0,6 57,4 ± 1,9 196 ± 190 HT29 77,6 ± 4,9 ˃ 100 74,3 ± 2,3 285 ± 62,9 Cancerosas HTC116 22,8 ± 1,6 - - - Tabla 14. Valores de IC50 (media ± SEM; µM) de los heterósidos cardiotónicos digitoxina, digoxina y ouabaína en diferentes líneas celulares tras 48 horas de tratamiento por el ensayo MTT. Heterósido cardiotónico Digitoxina Digoxina Ouabaína Conc. cisplatino Orden de tratamiento CI (Intervalo confianza 95%) Efecto CI (Intervalo confianza 95%) Efecto CI (Intervalo confianza 95%) Efecto Cisplatino + Heterósidos 1,3 (1,1- 1,6) Antag. 1,0 (0,9- 1,1) Aditivo 1,0 (0,8- 1,2) Aditivo Bajas (1-3 µM) Heterósidos + Cisplatino 0,9 (0,7-1) Aditivo 1,0 (0,8- 1,2) Aditivo 0,9 (0,8- 1,0) Aditivo Cisplatino + Heterósidos 0,7 (0,4- 0,9) Sinerg. 0,8 (0,8- 0,9) Sinerg. 0,9 (0,8- 1,1) Aditivo Altas (10-32 µM) Heterósidos + Cisplatino 1,0 (0,8- 1,1) Aditivo 1,0 (0,8- 1,2) Aditivo 1,2 (1,1- 1,4) Antag. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 319 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 320 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 321 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 322 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 323 - 6.9. LACTOAS ALFA, ΒETA-ISATURADAS 2-FURAOA Y 2-PIROA. En el apartado anterior se ha discutido la actividad anticancerosa selectiva demostrada por los heterósidos cardiotónicos. Estos heterósidos están formados por un núcleo esteroideo con un azúcar en la posición 3 y una lactona en posición 17. Esta lactona es la que permite clasificar a estos compuestos en dos clases: cardenólidos (con la lactona 2-furanona) y bufadienólidos (con la lactona 2-pirona). Estas lactonas α,β-insaturadas no solamente se encuentran formando parte de la estructura de los heterósidos cardiotónicos, sino que se pueden encontrar en otros compuestos. Otros compuestos importantes que contienen la lactona 2-furanona en su estructura son: acetogeninas Annonaceous 178 , vitamina C 179 , 3-cloro-4-(diclorometil)-5-hidroxi-2(5H)- furanona (producto originado de la desinfección clorada del agua potable) 180 y 5-metilen-2- furanona (producto de descomposición de las lesiones generadas por una gran variedad de agentes inductores de daño en el ADN) 181 . Mientras que dentro de otros compuestos que contienen a la 2-pirona en su estructura se encuentran las cumarinas, fusapironas, bigepironas, peripironas y estirilpironas 182 . Al igual que los heterósidos cardiotónicos, varios de los compuestos que contienen estas lactonas poseen actividad anticancerosa 178,183,184 . Para evaluar si estas lactonas estaban implicadas en la actividad anticancerosa de estos compuestos y teniendo en cuenta que esta tesis tiene como objetivo la búsqueda de nuevos fármacos para el tratamiento del cáncer de pulmón, se estudió la actividad anticancerosa in vitro de estas lactonas en células normales de pulmón MRC-5 y células de adenocarcinoma de pulmón A549 (Figura 7 del artículo adjunto (Figura 66)). Estas lactonas demostraron tener mayor efecto citotóxico sobre células cancerosas que sobre las células normales. La actividad anticancerosa de estas lactonas podría estar relacionada con la generación de daño en el ADN, ya que se ha descrito que ciertos herterósidos cardiotónicos, como la ouabaína 143 , y otros compuestos que contienen a estas lactonas son capaces de inducir lesiones en el ADN 143,180,184 . Para evaluar si estas lactonas eran capaces de generar daño en el ADN, se llevó a cabo el ensayo cometa, con el que se demostró que ambas lactonas indujeron daño en el ADN. Cabe destacar que la 2-pirona indujo mayores niveles de daño en el ADN que la 2- furanona (Figura 2 del artículo adjunto (Figura 67)). Para confirmar esta capacidad para inducir lesiones en el ADN, se realizó también el ensayo de inmunofluorescencia de focos de γH2AX. Ambas lactonas indujeron focos de γH2AX (indicador de daño en el ADN) en ambas líneas celulares (Figura 3 del artículo adjunto (Figura 68)). En esta técnica, también la 2-pirona indujo mayor número de lesiones en el ADN que la 2-furanona. La γH2AX es una histona que se encarga de señalizar lesiones en el ADN que se producen por roturas de doble cadena, para reclutar los componentes de las vías de reparación 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 324 - necesarios para restauración de dichas lesiones. De entre estas vías, la recombinación homóloga (HR) es una de las más importantes. Para comprobar si esta vía estaba implicada en la reparación del daño sobre el ADN inducido por estas lactonas, se realizó el ensayo de viabilidad celular MTT en células VC8 (células deficientes en HR por mutación en el gen BRCA2) y células VC8B2 (células VC8 complementadas con el gen BRCA2, por lo que tienen una HR funcional). Los resultados obtenidos de este ensayo (Figura 4 del artículo adjunto (Figura 69)) demuestran que ambas lactonas inducen un daño en el ADN que es reparado por HR, destacando la importancia del gen BRCA2 en la citotoxicidad de estas lactonas. Se sabe que determinados tumores poseen mutaciones en el gen BRCA2 15 , por lo que las células cancerosas de estos tumores podrían ser más sensibles a compuestos que llevasen en su estructura a estas lactonas, especialmente la 2-pirona que demostró una mayor implicación de la HR en la reparación de lesiones inducidas por esta lactona. Una vez establecido que estas lactonas generaban daño en el ADN mediante la generación de roturas de doble cadena, el siguiente paso a seguir fue establecer cuál podría ser el mecanismo de acción implicado en este daño en el ADN. La capacidad de generar daño en el ADN por alguno de los compuestos que contienen a estas lactonas se ha visto asociada a su interacción con las enzimas topoisomerasas (topo) 144,185,186 . Esto quiere decir que estas lactonas podrían estar induciendo la formación de complejos ADN-topo, que serían los responsables de la generación de roturas de doble cadena. Para evaluar esta posibilidad, se realizó el ensayo TARDIS (Figura 5 del artículo adjunto (Figura 70)). No se observó la formación de complejos ADN-topo a las 2 h de exposición, pero sí cuando el tiempo de exposición fue más prolongado (24h). Teniendo en cuenta que estudios recientes han observado que las topos juegan un papel importante en la fragmentación del ADN durante la apoptosis 91,92 y que estas lactonas solamente indujeron complejos ADN-topo cuando el tiempo de exposición fue prolongado, hizo pensar que estos complejos podrían deberse a la inducción de apoptosis por estas lactonas. Para valorar esta posibilidad, se realizó un experimento de citometría de flujo usando el ensayo de Anexina V-FITC (Figura 6 del artículo adjunto (Figura 71)). Los resultados obtenidos fueron muy distintos según la lactona a la que fueron expuestas las células. Aproximadamente el 50% de las células expuestas 24h a 2-pirona sufrieron apoptosis, por tanto, los complejos ADN-topo observados a ese mismo tiempo de exposición podrían haberse debido principalmente a la participación de las topoisomerasas en la fragmentación del ADN durante la apoptosis. Sin embargo, la exposición a 2-furanona indujo una muerte celular mayoritariamente por necrosis, lo que descartó que la apoptosis estuviese involucrada en la formación de los complejos ADN- topo demostrada por 2-furanona. A pesar de que estas lactonas tienen capacidad de dañar el ADN y actividad anticancerosa, es necesario tener en cuenta que las concentraciones a las que mostraron dichas 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 325 - actividades fueron del rango milimolar para poder entender la participación de estas lactonas en la actividad de los compuestos que las contienen en su estructura. Un ejemplo de la importancia de este hecho son los heterósidos cardiotónicos. En el apartado anterior se puede ver como estos compuestos tienen actividad anticancerosa a rangos de concentraciones nanomolares, por lo que se puede decir que la actividad de estos heterósidos no está mediada por sus lactonas. De todas formas, saber que estas lactonas inducen daño en el ADN y presentan actividad anticancerosa podría ayudar a predecir la actividad de compuestos que las contengan en sus estructuras y que no hayan sido estudiados todavía. En conclusión, las lactonas α,β-insaturadas 2-furanona y 2-pirona mostraron mayor actividad citotóxica sobre células de cáncer que sobre células normales de pulmón. Estas lactonas indujeron daño en el ADN, que podría estar mediado en parte por las enzimas ADN topoisomerasas. Este daño en el ADN puede ser reparado por la recombinación homóloga. Estos resultados pueden ayudar a entender la actividad anticancerosa y/o de dañar el ADN de aquellos compuestos que las contengan en su estructura, ayudando a la predicción de estas actividades en los compuestos que no hayan sido estudiados todavía. Todos estos resultados se han incluido en el artículo titulado Alpha, beta-unsaturated lactones 2-furanone and 2-pyrone induce cellular DA damage, formation of topoisomerase I- and II-DA complexes and cancer cell death, el cual se encuentra en fase de revisión en la revista Toxicology Letters, y que es adjuntado a continuación. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 326 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 327 - Toxicology Letters 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 328 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 335 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 336 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 337 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 338 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 339 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 340 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 341 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 342 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 343 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 344 - 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 351 - Por tanto, BrP estaría actuando impidiendo la síntesis de ATP tanto a nivel de la glicólisis como a nivel de la fosforilación oxidativa, lo que explicaría que este compuesto haya resultado tan citotóxico en las cuatro líneas celulares aquí ensayadas. IC50 (media ± SEM; mM) Compuesto MRC-5 A549 VH10 UACC-62 2DG 2,63 ± 1,24 6,97 ± 2,63 ˃32 0,97 ± 0,13 DCA 40,67 ± 7,55 46,07 ± 7,15 ˃100 20,82 ± 0,93 BrP 0,21 ± 0,04 0,27 ± 0,06 0,05 ± 0,00 0,06 ± 0,00 Tabla 17. Valores de IC50 (media ± SEM; mM) de las diferentes líneas celulares tras 48 h de exposición a los distintos inhibidores de glicólisis. La diferencia de selectividad de 2DG y DCA dependiendo del tipo de línea celular podría deberse a la capacidad de cada línea para resistir el cambio metabólico inducido por estos compuestos, así como a la dependencia de la glicólisis de cada línea celular. Para comprobar esto último, se midieron las concentraciones de lactato (producto final de la glicólisis) y de glucosa (producto inicial de la glicólisis) en las cuatro líneas celulares. Los resultados obtenidos están recogidos en la Figura 75, en la que se puede observar como UACC-62 fue la línea celular que produjo mayores niveles de lactato y consumió mayores niveles de glucosa, por tanto, fue la línea con mayor actividad glicolítica. Esta mayor actividad glicolítica podría explicar el por qué las células UACC-62 fueron también las células con mayor sensibilidad a los inhibidores de la glicólisis, presentando los menores valores de IC50 para ambos compuestos (Tabla 17). Figura 75. Concentraciones (mM) de lactato producido y de glucosa consumida por las diferentes líneas celulares. Esta figura recoge las concentraciones de lactato producido y glucosa consumida durante 8 horas por las cuatro líneas celulares. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 352 - 6.10.2. Evaluación de la combinación de inhibidores de la glicólisis y agentes prooxidantes. Los resultados obtenidos en el apartado anterior sugieren que la inhibición de la glicólisis por si sola no es suficiente para causar una muerte selectiva de células cancerosas, salvo en aquellos cánceres más sensibles al cambio metabólico inducido por la inhibición de la glicólisis. Sin embargo, estos inhibidores podrían ser útiles en combinación con otros compuestos. Se sabe que uno de los papeles de la glicólisis es ayudar a mantener el nivel de las EROs. Las células cancerosas tienen elevados niveles basales de EROs por lo que dependen de la glicólisis, entre otros mecanismos, para poder mantenerlos dentro del umbral no tóxico. La inhibición de la glicólisis podría hacer a las células cancerosas más susceptibles al estrés oxidativo, por lo que la combinación de inhibidores de glicólisis con agentes prooxidantes podría presentar un efecto sinérgico 25 . Por tanto, aunque los inhibidores de glicólisis evaluados aquí no han mostrado una actividad anticancerosa selectiva frente a células de cáncer de pulmón, podrían contribuir a aumentar la selectividad de agentes prooxidantes, como el pirogalol. Para comprobar esta posibilidad, fibroblastos normales de pulmón MRC-5 y células de adenocarcinoma de pulmón A549 fueron expuestos a los inhibidores de glicólisis (DCA y 2DG) durante 4 horas, tras las cuales fue adicionado el agente prooxidante pirogalol (PG). Tras 4 horas de tratamiento en combinación, se retiró el tratamiento y las células fueron incubadas durante 40 horas más. Finalmente, la viabilidad celular fue medida mediante el ensayo MTT. Los resultados están recogidos en la Figura 76. Tanto DCA como 2DG aumentaron, a concentraciones ligeramente citotóxicas, el efecto anticanceroso selectivo de PG. Figura 76. Actividad citotóxica de los inhibidores glicólisis DCA y 2DG en combinación con el agente prooxidante PG. Las células cancerosas A549 y las células normales MRC-5 fueron expuestas 4 h a los inhibidores de glicólisis. Tras ese tiempo, PG fue adicionado a las células. Finalmente, tras 4 horas de tratamiento combinado, éste fue retirado y las células fueron incubadas 40 h libres de compuestos (ensayo MTT). 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 353 - En conclusión, aunque la glicólisis es una posible nueva diana terapéutica, los inhibidores de glicólisis más conocidos actualmente (bromopiruvato, 2-deoxiglucosa y dicloroacetato) no poseen la misma actividad anticancerosa selectiva frente a todos los tipos de células cancerosas, tanto en las utilizadas durante esta tesis, como en otros estudios 45,195 . Por tanto, la utilidad de estos inhibidores se limita a tipos específicos de cáncer. Sin embargo, la combinación de estos inhibidores con agentes prooxidantes podría potenciar el efecto anticanceroso selectivo de estos últimos. 6.11. ATAGOISTAS DEL RECEPTOR EUROKIIA-1 (K-1). En la búsqueda de nuevos fármacos anticancerosos más selectivos, la comprensión de la biología y el microambiente de los tumores es una herramienta básica para la identificación de nuevas dianas terapéuticas. Fruto de esta investigación ha sido el descubrimiento del papel que juegan determinados péptidos, como la sustancia P, en el cáncer 197,198 . La sustancia P (SP) es un undecapéptido de origen natural que pertenece a la familia de las taquicininas 197 . La acción biológica de esta familia de taquicininas está mediada por los receptores de neurokinina (NK) que están asociados a proteína G. Existen tres tipos de receptores: NK-1, NK-2 y NK-3; teniendo la SP mayor afinidad por el receptor NK-1. El receptor NK-1 se encuentra distribuido en el sistema nervioso central, el sistema nervioso periférico y el sistema circulatorio de los mamíferos. La activación de este receptor por la SP está involucrada en la regulación de diversos procesos biológicos (como el dolor y la inflamación), participando en la regulación de condiciones inflamatorias (como migraña, asma, etc.), del reflejo nauseoso y de determinados desórdenes del sistema nervioso central (como la ansiedad y la depresión). Como consecuencia, la industria farmacéutica ha empezado a desarrollar antagonistas de receptores NK-1 para el tratamiento de los desórdenes fisiológicos en los que están involucrados. El primer antagonista de los receptores NK-1 comercializado fue el Aprepitant cuyo uso está indicado para el tratamiento de los vómitos y náuseas provocados por la quimioterapia 199 . Recientemente se ha descubierto que los receptores NK-1 juegan un papel importante en el desarrollo y mantenimiento de un microambiente favorable para los tumores 197,198 . La activación de estos receptores ha sido asociada con procesos de mitogénesis, angiogénesis, migración celular y metástasis. De hecho, datos recientes indican que los receptores NK-1 están sobreexpresados en una gran variedad de tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, de pulmón, de ovario, de próstata, leucemias, entre otros 197,198,200,201 . Incluso se ha llegado a establecer una posible correlación entre la expresión de estos receptores y el grado de 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 354 - malignidad de las células tumorales. Todos estos datos sugieren que los receptores NK-1 podrían ser una nueva diana terapéutica en el tratamiento del cáncer. Con este objetivo, el grupo de investigación de la Dra. Inmaculada Fernández Fernández del departamento de Química Orgánica y Farmacéutica de la Universidad de Sevilla junto con el grupo de investigación del Dr. Noureddine Khiar del Centro Superior de Investigaciones Científicas de Sevilla han elaborado una librería de antagonistas del receptor NK-1 a partir de modificaciones del que se piensa es el farmacóforo de este tipo de receptor, el 2-amino-4H- pirano (Figura 77). Durante esta tesis se ha realizado un cribado o screening de la posible actividad anticancerosa selectiva de 26 nuevos antagonistas del receptor NK-1. La síntesis de estos compuestos se encuentra en proceso de ser patentado. Por este motivo, el nombre químico de los compuestos no es recogido en este texto, sino que a cada compuesto se le otorga un nombre en clave. Como control fue utilizado el primer antagonista no peptídico del receptor NK-1, el compuesto CP-96345. Figura 77. Estructura base para la elaboración de los antagonistas de receptores K-1 ensayados durante esta tesis. 6.11.1. Evaluación de la actividad anticancerosa de una nueva serie de antagonistas del receptor K-1. Puesto que el objetivo de esta tesis es la búsqueda de fármacos más selectivos en el tratamiento de cáncer de pulmón, el screening de estos nuevos antagonistas fue realizado mediante el ensayo de viabilidad celular MTT en células pulmonares: células cancerosas A549 y células no malignas MRC-5. Ambos tipos celulares fueron expuestos a distintas concentraciones de los antagonistas durante 48 h. Los resultados obtenidos son recogidos en las Figuras 78-80. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 355 - Figura 78. Actividad citotóxica mostrada por antagonistas del receptor K-1. Células cancerosas A549 (-■-) y células no malignas MRC-5 (-○-) fueron tratadas durante 48 h y su viabilidad celular medida mediante el ensayo MTT. A) B) C) D) E) F) G) H) I) J) K) L) 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 356 - Figura 79. Actividad citotóxica mostrada por antagonistas del receptor K-1. Células cancerosas A549 (-■-) y células no malignas MRC-5 (-○-) fueron tratadas durante 48 h y su viabilidad celular medida mediante el ensayo MTT. A) B) C) D) E) F) G) H) I) J) K) L) 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 357 - Figura 80. Actividad citotóxica mostrada por antagonistas del receptor K-1. Células cancerosas A549 (-■-) y células no malignas MRC-5 (-○-) fueron tratadas durante 48 h y su viabilidad celular medida mediante el ensayo MTT. Teniendo en cuenta las IC50 para ambas líneas celulares (Tabla 18) y el perfil de la curva de viabilidad celular (Figuras 78-80) se pueden clasificar a los antagonistas de receptores NK-1 aquí ensayados en función de su actividad citotóxica selectiva frente a células cancerosas A549 en 4 categorías: * No selectivos: los compuestos INKA1(R) (Figura 78B), INKA1.ona (Figura 78D) e INKA2(S) (Figura 78F) no mostraron una mayor actividad citotóxica frente a células cancerosas que frente a células normales, por lo que fueron igual de citotóxicos para ambas líneas celulares. Cabe destacar que la citotoxicidad de estos compuestos fue menor que la del compuesto referencia CP-96345, siendo el compuesto INKA2(S) el que presentó menor actividad citotóxica. * Ligera selectividad: los compuestos INKA1.AcF3 (Figura 78C), INKA1(S).Ac (Figura 78E), INKA9 (Figura 78J), INKA23 (Figura 79A), INKA57 (Figura 79B), INKA85 (Figura 79D), INKA116 (Figura 79E) e INKB117 (Figura 79K) mostraron una ligera actividad citotóxica selectiva sobre células cancerosas, al igual que el compuesto referencia CP-96345. La actividad citotóxica sobre células cancerosas A549 de los compuestos INKA1.AcF3, INKA1(S).Ac, INKA9 e INKA57 fue menor que la actividad citotóxica del compuesto referencia CP-96345, destacando que el compuesto INKA9 fue el compuesto con la menor actividad citotóxica de todos los antagonistas testados. Los compuestos INKA23, INKA85, INKA116 e INKB117 mostraron una actividad citotóxica sobre células A549 similar al compuesto de referencia. El compuesto INKB117 fue el compuesto que presentó mayor actividad anticancerosa selectiva en este grupo de compuestos. A) B) C) 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 358 - * Modesta selectividad: los compuestos INKA2(R) (Figura 78G), INKA3(R) (Figura 78I), INKA3(S) (Figura 78H), INKA10 (Figura 78K), INKA11 (Figura 78L), INKA59 (Figura 79C), INKB21d (Figura 79G) e INKB72 (Figura 79J) mostraron una modesta actividad anticancerosa selectiva frente a células cancerosas A549, siendo mayor que la selectividad demostrada por el compuesto referencia CP-96345. Sin embargo, la actividad citotóxica frente a células A549 de los compuestos INKA2(R), INKA3(R), INKA3(S), e INKB21d fue menor que la del compuesto de referencia, mientras que la citotoxicidad de los compuestos INKA10, INKA11 e INKB72 fue superior. El compuesto INKA59 demostró un perfil citotóxico frente a células A549 similar al del compuesto de referencia. * Notable selectividad: los compuestos INKB21c (Figura 79F), INKB30a (Figura 79H), INKB30b (Figura 79I), INKB222a (Figura 79L), INKB222b (Figura 80A), INKB300a (Figura 80B), e INKB300b (Figura 80C) mostraron una notable actividad citotóxica selectiva sobre células cancerosas, siendo bastante mayor que la selectividad observada para el compuesto referencia CP-96345. Al igual que ocurría con alguno de los compuestos del párrafo anterior, a pesar de la mayor selectividad demostrada por estos compuestos, los compuestos INKB21c, INKB30b, INKB222a e INKB222b presentaron una menor actividad citotóxica sobre células A549 que el compuesto de referencia. Sin embargo, los compuestos INKB30a, INKB300a e INKB300b presentaron mayor actividad citotóxica sobre células A549 que el compuesto de referencia. Como se ha comentado anteriormente, datos recientes demuestran que las células cancerosas presentan mayores niveles de receptores NK-1 que las células normales 198,200 . Muñoz y cols 200 observaron que varias líneas celulares de cáncer de pulmón presentaban entre 30-60 veces mayores niveles de expresión del receptor NK-1 que células normales y que la activación de estos receptores era necesaria para la proliferación y viabilidad de estas células cancerosas. Esto puede explicar la mayor actividad citotóxica frente a células cancerosas de pulmón que frente a células normales demostrada por algunos de los antagonistas aquí testados. Sin embargo, la diferencia de selectividad demostrada entre los antagonistas ensayados hizo pensar que quizás estos compuestos también pudiesen inducir efectos citotóxicos selectivos por mecanismos distintos a la antagonización del receptor NK-1. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 359 - Tabla 18. Valores de IC50 de los antagonistas del receptor K-1 evaluados. IC50 (media ± SEM; µM) Compuestos MRC-5 A549 p CP-96345 57,9 ± 8,1 46,8 ± 8,9 - INKA1(R) 204,5 ± 5,2 162,6 ± 8,8 * INKA1.AcF3 130,2 ± 6,4 76,5 ± 6,5 * INKA1.ona 140,4 ± 20,6 148,3 ± 12,9 - INKA1(S).Ac 136,2 ± 16,2 107,7 ± 11,5 - INKA2(S) 112,1 ± 17,1 136,5 ± 21,9 - INKA2(R) 424,7 ± 55,1 195,6 ± 2,3 - INKA3(S) 429,7 ± 29,8 156,4 ± 2,1 ** INKA3(R) ˃ 1000 507,8 ± 12,8 - INKA9 824,6 ± 181,2 536,2 ± 31,4 - INKA10 58,3 ± 6,5 22,7 ± 0,7 * INKA.11 67,4 ± 6,3 29,4 ± 3,9 ** INKA.23 44,3 ± 4,4 23,6 ± 1,3 * INKA.57 82,9 ± 6,9 52,0 ± 4,1 * INKA.59 112,5 ± 15,4 53,1 ± 2,3 * INKA.85 59,9 ± 3,7 49,7 ± 7,1 - INKA.116 48,9 ± 0,4 35,0 ± 3,5 * INKB21c 192,2 ± 27,9 42,9 ± 9,2 ** INKB21d 134,4 ± 8,7 49,9 ± 3,0 * INKB30a 131,6 ± 16,8 42,7 ± 3,5 * INKB30b 159,7 ± 8,7 50,6 ± 5,3 ** INKB72 50,4 ± 3,3 20,8 ± 4,0 ** INKB117 56,2 ± 2,4 31,4 ± 5,6 ** INKB222a 501,0 ± 62,0 133,5 ± 35,2 * INKB222Bb ˃ 1000 59,3 ± 11,0 - INKB300a 141,2 ± 1,8 28,0 ± 6,9 ** INKB300b 120,1 ± 3,5 19,3 ± 7,9 ** 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 360 - 6.11.2. Implicación de otros mecanismos en la actividad anticancerosa de una nueva serie de antagonistas del receptor K-1. La generación de EROs y la inhibición de la glicólisis son posibles mecanismos de selectividad anticancerosa 25 . Para comprobar si los antagonistas del receptor NK-1 pueden inducir la generación de EROs y/o la inhibición de la glicólisis como efectos citotóxicos, se escogió el compuesto INKB300b para la realización de los experimentos. Se escogió este compuesto debido a que destacó sobre los demás antagonistas por ser el que presentó mejor relación selectividad/citotoxicidad, con un valor de IC50 que fue 6 veces menor para células cancerosas que para las células no malignas. Para valorar si la formación de EROs estaba involucrada en el efecto citotóxico de INKB300b, células A549 fueron expuestas a este antagonista en presencia o ausencia de antioxidantes (MnTMPyP, NAC y catalasa) durante 48 h (Figura 81). La viabilidad celular fue medida mediante el ensayo MTT. Ninguno de los antioxidantes redujo la citotoxicidad de INKB300b, lo que sugiere que la generación de EROs no está involucrada en el mecanismo citotóxico de este compuesto. La evaluación de la capacidad de inhibir la glicólisis por INKB300b fue realizada mediante la medición de los niveles de glucosa (producto inicial de la glicólisis) y lactato (producto final de la glicólisis) en células A549 que fueron expuestas 8 h a 32 µM de INKB300b. Como control positivo se utilizó el inhibidor de la glicólisis dicloroacetato. INKB300b no demostró actuar inhibiendo la glicólisis, como se puede observar en la Figura 81. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 367 - Figura 85. Screening de la actividad anticancerosa selectiva de una serie de compuestos prooxidantes. Células cancerosas A549 (-■-) y células normales MRC-5 (-○-) fueron expuestas a un rango de concentraciones de compuestos conocidos (A-E) y de una serie de nuevos derivados sintéticos del sulforafano (F-K) durante 48 h. La viabilidad celular fue medida mediante el ensayo MTT. A) B) C) D) E) F) G) H) I) J) K) 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 368 - La curcumina es un polifenol que se obtiene de la planta Curcuma longa. El rizoma pulverizado de esta planta es un ingrediente muy común en la cocina asiática y también es muy utilizado en la medicina tradicional asiática. En los últimos años, se ha empezado a valorar la posible actividad anticancerosa de la curcumina debido a su actividad prooxidante 204-210 . Sin embargo, durante el screening llevado a cabo durante esta tesis, curcumina no demostró tener actividad citotóxica selectiva, siendo igual de citotóxico para ambas líneas celulares (Figura 85B). Esta falta de citotoxicidad también fue observada por miricetina (Figura 85C), otro compuesto polifenólico que posee actividad prooxidante 53,211 . Por otra parte, tanto el ácido ascórbico como resveratrol demostraron actividad citotóxica selectiva sobre células cancerosas A549 (Figuras 85A y 85D respectivamente). El ácido ascórbico o vitamina C es una vitamina hidrosoluble esencial en numerosas reacciones metabólicas y es uno de los principales antioxidantes presentes en la dieta. En los últimos años se le ha asociado actividad anticancerosa debido a su capacidad de generar estrés oxidativo 35,212,213 . Por este motivo, numerosos ensayos clínicos han sido iniciados para determinar la utilidad de esta vitamina en el tratamiento del cáncer, incluyendo estudios en cáncer de colon, mieloma múltiple y leucemias 214,215 (para más detalles: www.clinicaltrials.gov). En el screening aquí realizado, vitamina C demostró ser más citotóxico frente a células de cáncer de pulmón que frente a células normales, siendo su IC50 aproximadamente 2,5 veces menor para células cancerosas que para células normales, destacando que a la concentración de 1 mM, la viabilidad celular de las células cancerosas fue del 10% mientras que la viabilidad de las células normales apenas se vio afectada. Cabe destacar que aunque esta selectividad se ha observado a concentraciones elevadas (1 mM) de vitamina C, estas concentraciones se pueden alcanzar en plasma cuando se administra de forma intravenosa 213 . Estos resultados sugieren que vitamina C podría ser útil en el tratamiento del cáncer de pulmón, pudiendo justificar su entrada en ensayos clínicos en este tipo de cáncer. Por otro lado, el resveratrol es un estilbenoide natural, que se encuentra en la uva y sus derivados, que en los últimos años tiene numerosas actividades biológicas 216 , incluyendo actividad antitumoral 217-219 . De hecho, existen varios ensayos clínicos con esta molécula para el tratamiento de cáncer colorrectal y mieloma múltiple (para más detalles: www.clinicaltrials.gov). Esta posible actividad anticancerosa de resveratrol ha sido asociada a su capacidad de generar EROs 217-219 . Como ya se ha comentado, resveratrol demostró una actividad anticancerosa selectiva en el screening aquí realizado (Figura 85D), mostrando una IC50 para células cancerosas 4 veces menor que para células normales, posiblemente debida a su acción como agente prooxidante. Finalmente, otra molécula cuya actividad anticancerosa fue evaluada en este screening fue el sulforafano, y una serie de derivados sintéticos de él, cuya síntesis fue realizada por el grupo de investigación de la Dr. Inmaculada Fernández Fernández 51 . El sulforafano es un compuesto 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 369 - organosulfurado que se puede encontrar en las crucíferas, como el brócoli. Varios estudios han demostrado la actividad anticancerosa de este compuesto organosulfurado 220-222 y se encuentra en varios ensayos clínicos de cáncer de próstata y melanoma (para mayor detalle consultar: www.clinicaltrials.gov). Uno de sus posibles mecanismos de acción es la generación de EROs 221 y por ese motivo fue incluido en este screening. Aunque sulforafano demostró tener actividad citotóxica selectiva sobre células cancerosas de pulmón, esta selectividad fue menor que la mostrada por resveratrol y vitamina C (Figura 85). Los derivados sintéticos de sulforafano (Figuras 85F-85K) demostraron mayor actividad citotóxica que sulforafano, a excepción del compuesto nombrado como sulforafano.42 que mostró la misma actividad. Sin embargo, estos derivados fueron menos selectivos que sulforafano, a excepción de los compuestos sulforafano.42 y sulforafano.52 que mostraron una actividad anticancerosa selectiva similar a la del sulforafano. IC50 (media ± SEM; µM) Compuesto MRC-5 A549 p Ác. Ascórbico 1700,0 ± 100,0 700,0 ± 100,0 * Curcumina 16,4 ± 0,3 16,5 ± 0,7 - Miricetina 38,7 ± 3,1 53,6 ± 5,1 - Resveratrol 209,0 ± 37,9 48,1 ± 5,9 * Sulforafano 46,6 ± 2,2 19,6 ± 2,3 ** Sulforafano.42 40,8 ± 2,0 19,8 ± 0,1 ** Sulforafano.52 17,6 ± 1,4 7,5 ± 0,8 ** Sulforafano.58 16,9 ± 0,4 10,1 ± 1,7 * Sulforafano.71 18,5 ± 0,8 9,6 ± 1,3 ** Sulforafano.72 20,3 ± 0,4 12,0 ± 1,5 * Sulforafano.119 17,4 ± 0,4 9,8 ± 0,6 *** Tabla 20. Valores de IC50 (media ± SEM; µM) obtenidos del screening de agentes prooxidantes mediante el ensayo MTT. En conclusión, los compuestos prooxidantes ácido ascórbico, resveratrol, sulforafano y una serie de derivados sintéticos de sulforafano mostraron mayor citotoxicidad hacia células cancerosas de pulmón A549 que hacia células normales de pulmón MRC-5. El resveratrol fue el compuesto que presentó la mayor actividad anticancerosa selectiva. Para confirmar la actividad anticancerosa de resveratrol es necesario realizar estudios in vivo. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 370 - 6.12.2. Análogos de glicoglicerolípidos y derivados de urea. En colaboración con el Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, durante esta tesis se ha realizado un cribado o screening de la actividad anticancerosa de una nueva serie de compuestos químicos derivados de glicoglicerolípidos y de urea. Los glicoglicerolípidos son una clase de glicolípidos que forman parte de las membranas celulares vegetales y de la pared celular de bacterias. Consisten en la unión de uno o más monosacáridos y ácidos grasos a través de una molécula de glicerol. Numerosos glicoglicerolípidos tienen actividad farmacológica, incluyendo actividad antirretroviral, antiinflamatoria y antitumoral 50,223,224 . Por otra parte, compuestos químicos con grupos urea o tiourea han sido descritos con aplicación como insecticidas, antitumorales, antimicrobianos y antifúngicos 48 . Para evaluar la posible actividad anticancerosa de 6 nuevos análogos glicoglicerolípidos 50 y 5 nuevos derivados de urea 48 , se realizó un screening de estas moléculas mediante el ensayo de viabilidad celular MTT. Células normales MRC-5 y células cancerosas A549 fueron expuestas a diferentes concentraciones de estos compuestos durante 48 horas, tras las cuales se realizó el ensayo MTT (Figura 86 y Tabla 21. Los resultados obtenidos con los derivados glicoglicerolípidos se encuentran publicados en el artículo Stereoselective Dihydroxylation Reaction of Alkenyl β-D-Hexopyranosides: A Methodology for the Synthesis of Glycosylglycerol Derivatives and 1-OAcyl-3-O-β-D-glycosyl- sn-glycerol Analogues, en la revista European Journal of Organic Chemistry (2012) 50 . De estos glicoglicerolípidos ensayados, los compuestos 59 y 63 demostraron el mismo efecto citotóxico sobre ambas líneas celulares (Figuras 86D y 86F, respectivamente). Sin embargo, el compuesto 60, que solamente se diferencia de estos dos compuestos en la presencia de un grupo oleil, sí que presentó una ligera actividad citotóxica selectiva frente a células cancerosas, aunque su citotoxicidad fue menor (Figura 86E). El análogo glicoglicerolípido 58 demostró una ligera actividad citotóxica que fue ligeramente mayor frente a células cancerosas que frente a células normales (Figura 86C). También fueron evaluados dos análogos de glicoglicerol, compuestos 27 y 36 (Figuras 86A y 86B, respectivamente). El compuesto 27 fue el compuesto con mayor actividad anticancerosa selectiva de estos análogos ensayados, mientras que el compuesto 36 apenas demostró tener actividad citotóxica en ninguna de las líneas ensayadas. De los derivados de urea 48 , ninguno demostró tener actividad citotóxica selectiva sobre células cancerosas, demostrando igual citotoxicidad sobre ambas líneas celulares (Figuras 86G- 86K). Sin embargo, su actividad citotóxica fue mayor que la demostrada por los análogos glicoglicerolípidos comentados en el párrafo anterior. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 371 - Figura 86. Porcentaje de viabilidad celular de células A549 y MRC-5 expuestas a una serie de nuevos glicolípidos y derivados de ureas. A) B) C) D) E) F) G) H) I) J) K) 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 372 - IC50 (media ± SEM; µM) Compuesto MRC-5 A549 27 125,9 ± 15,1 63,58 ± 6,4 36 - - 58 - - 59 46,6 ± 2,7 44,8 ± 1,3 60 573,8 ± 13,9 362,0 ± 14,4 Derivados glicerolípidos 63 66,8 ± 11,1 82,0 ± 14,5 45 1,2 ± 0,1 1,0 ± 0,3 46 1,9 ± 0,3 4,0 ± 0,6 47 2,0 ± 0,6 4,3 ± 0,2 50 1,3 ± 0,1 2,7 ± 0,8 Derivados de urea 85 3,1 ± 0,2 3,9 ± 0,3 Tabla 21. Valores de IC50 (media ± SEM; µM) obtenidos mediante el ensayo MTT tras 48 h de exposición a los diferentes compuestos. A excepción del compuesto 27, los análogos de glicoglicerolípidos y derivados de urea aquí evaluados no presentaron actividad anticancerosa selectiva, por lo que no tienen una posible utilidad en el tratamiento del cáncer de pulmón. 6.13. DISCUSIÓ GLOBAL. El cáncer es una enfermedad con una gran tasa de mortalidad debido a que un porcentaje elevado de cánceres se diagnostican cuando células de un tumor primario ya se han diseminado a través de la sangre o la linfa a otros tejidos del organismo. La principal forma de tratamiento en esta fase de la enfermedad es la quimioterapia, que consiste en administrar fármacos de forma sistémica con el objetivo de que alcancen y maten a las células tumorales. Pero la gran mayoría de estos fármacos son tóxicos tanto para las células tumorales como para las células sanas, lo que causa una alta toxicidad en el paciente y hace necesario reducir las dosis de estos fármacos a niveles que son poco efectivos 8,10,12 . Esta falta de selectividad de los fármacos anticancerosos hace que generalmente no se puedan alcanzar las concentraciones necesarias para conseguir la erradicación completa de las células cancerosas. Por ejemplo, el cisplatino es un fármaco anticanceroso utilizado en el tratamiento de numerosos tipos de cáncer, como el de pulmón y el de mama. Cisplatino se administra por vía intravenosa, alcanzándose concentraciones plasmáticas en el rango 10-50 µM 225,226 . En la Figura I del Anexo I (datos obtenidos con el ensayo in vitro MTT) puede observarse que cisplatino, en ese rango de concentraciones, disminuye la viabilidad de células cancerosas de pulmón y mama hasta aproximadamente un 20-40%, pero también la de células no cancerosas hasta aproximadamente 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 373 - un 40-60%. Este ejemplo muestra la poca selectividad de los fármacos antineoplásicos actuales, principal responsable de que el cáncer siga siendo un problema grave de salud sin resolver. El objetivo principal de esta tesis ha sido contribuir a la búsqueda de fármacos anticancerosos selectivos utilizando posibles estrategias que exploten los defectos en la reparación del daño en el ADN y las alteraciones metabólicas de las células cancerosas. Tras un análisis bibliográfico se seleccionaron más de 100 compuestos, y su posible actividad anticancerosa selectiva se ensayó en células cancerosas de pulmón y células no cancerosas de pulmón. Posteriormente se evaluaron posibles mecanismos implicados en la selectividad de los compuestos más activos y, finalmente, se utilizaron células cancerosas y no cancerosas de otros tejidos para confirmar la selectividad anticancerosa de los compuestos más prometedores. Una de las estrategias estuvo basada en la utilización de los defectos en los mecanismos de reparación del daño en el ADN para el tratamiento del cáncer de pulmón. Se sabe que determinados tipos de cáncer presentan defectos en algunas de las proteínas involucradas en los mecanismos de reparación del daño en el ADN 24,84 . Estos defectos hacen a estos tumores más sensibles a daños específicos en el ADN al no ser capaz de repararlos. Fármacos anticancerosos que generan daño en el ADN son más citotóxicos en células que presentan defectos en algunas de estas vías reparación. El cisplatino es un buen ejemplo de ello. Este fármaco actúa generando aductos en el ADN que son reparados por la vía NER. Se sabe que existen cánceres de pulmón que presentan defectos en alguna de las proteínas de NER, siendo éstos más sensibles al efecto de cisplatino 84,227 . Cisplatino no es el único caso. De hecho, en esta tesis se ha realizado una revisión bibliográfica que muestra que la actividad citotóxica de más de 60 fármacos antineoplásicos utilizados en clínica se altera cuando existían deficiencias en específicas proteínas reparadoras del ADN (ver revisión en Antecedentes). Esto ha hecho que en los últimos años se empiecen a considerar los defectos en las proteínas implicadas en las vías de reparación del daño en el ADN como importantes dianas terapéuticas anticancerosas. Estudios clínicos han demostrado que existen tipos de cáncer de pulmón que presentan defectos en los mecanismos de reparación de las rutas NER, BER, HR, NHEJ o FA 24,84 . Estos tumores serían más sensibles a fármacos cuyo daño producido en el ADN solamente pudiese ser reparado por este tipo de mecanismos, mientras que las células normales no se verían afectadas al tener los mecanismos de reparación funcionales 15,24,84 . Esta posible selectividad anticancerosa basada en los defectos en los mecanismos de reparación ha sido utilizada en esta tesis para la búsqueda de fármacos selectivos. De los compuestos que demostraron actividad anticancerosa selectiva, se estudió la implicación de los mecanismos de reparación de aquellos que presentaron capacidad para generar daño en el ADN. Tanto fenilglioxal (FG) como los derivados galactopiranósidos 22 y 35 fueron más citotóxicos en células deficientes en NER, por lo que la actividad anticancerosa selectiva de estos compuestos podría ser mayor en el caso de 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 374 - cánceres con deficiencias en NER. FG también demostró mayor actividad citotóxica sobre células deficientes en las vías NHEJ y HR, al igual que el agente prooxidante pirogalol, por lo que cánceres deficientes en estas vías podrían ser más sensibles a estos compuestos. Estos compuestos no fueron los únicos que demostraron mayor citotoxicidad sobre células deficientes en HR, sino que el extracto de erium oleander, las lactonas α,β insaturadas (2-furanona y 2- pirona) y el nuevo antagonista del receptor NK-1 INKB300b también demostraron mayor citotoxicidad sobre líneas deficientes en esta ruta de reparación. El papel de HR en la reparación del daño inducido por estos compuestos sugiere que cánceres con defectos en esta vía podrían ser más sensibles al efecto de estos compuestos. Únicamente el compuestos dodecil hidroxitirosil éter demostró mayor actividad citotóxica sobre líneas deficientes en BER, por lo que este compuesto podría ser útil en cánceres de pulmón deficiente en esta ruta de reparación del daño en el ADN. Es necesario realizar más estudios para poder confirmar que las deficiencias en estas vías aumentarían la selectividad de estos compuestos sobre células cancerosas. Estos estudios se han contemplado para la continuación del trabajo defendido en esta tesis. Células de cáncer de pulmón A549 serían transfectadas con siARN para el silenciamiento de los genes que codifican las proteínas que participan en las vías de reparación comentadas anteriormente. De esta manera, se podrá ver cómo se ve influenciada la actividad citotóxica de los compuestos comentados anteriormente sobre células cancerosas de pulmón deficientes en las vías de reparación. Otra de las estrategias utilizadas en la búsqueda de nuevos fármacos anticancerosos selectivos fue la generación de estrés oxidativo mediante la utilización de agentes prooxidantes. Las células cancerosas poseen mayores niveles basales de especies reactivas de oxígeno (EROs) que las células normales 36,37 . Se piensa que un aporte exógeno específico de EROs podría elevar los niveles de estrés oxidativo hasta efectos citotóxicos en las células cancerosas, sin que las células normales se viesen afectadas 33,35,36,72 . De hecho, estudios recientes sugieren que las EROs participan en la actividad anticancerosa de muchos fármacos anticancerosos utilizados en clínica, como cisplatino, paclitaxel y doxorubicina 72 . Por este motivo, se ha empezado a estudiar la generación de estrés oxidativo como una nueva diana terapéutica. Esta generación de estrés oxidativo podría llevarse a cabo mediante la utilización de compuestos prooxidantes. Estos compuestos a bajas concentraciones suelen actuar como antioxidantes, pero a altas concentraciones son capaces de generar EROs como el peróxido de hidrógeno. En esta tesis se ha evaluado la posible actividad anticancerosa selectiva de varios agentes prooxidantes. En primer lugar, se comprobó si realmente células cancerosas de pulmón eran más sensibles a un aporte exógeno de EROs que células normales. En la Figura II del Anexo I se puede observar que las células cancerosas fueron más sensibles al tratamiento con peróxido de hidrógeno que las células normales. Posteriormente se evaluó la posible actividad anticancerosa de varios 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 375 - compuestos prooxidantes. Estos compuestos fueron seleccionados con la ayuda de la revisión bibliográfica “Prooxidant natural products as anticancer agents” comentada e incluida en el apartado de Antecedentes. No todos los compuestos prooxidantes evaluados mostraron actividad citotóxica selectiva frente a las células cancerosas, lo que sugiere que el modo de generación de EROs es importante para la posible actividad anticancerosa selectiva. Por ejemplo, miricetina y ácido gálico son compuestos que generan EROs debido a la molécula de pirogalol que contienen en su estructura 53 . Sin embargo, miricetina no demostró actividad anticancerosa selectiva mientras que el ácido gálico sí presentó mayor actividad citotóxica frente a las células cancerosas. El ácido clorogénico (ACG), el hidroxitirosol (y sus derivados sintéticos) y el resveratrol demostraron una marcada selectividad citotóxica sobre células cancerosas de pulmón, que puede explicarse por su capacidad prooxidante. La generación de EROs también participó ligeramente en la citotoxicidad del extracto de . oleander y la del heterósido cardiotónico oubaína. Aunque la generación de EROs por algunos de estos compuestos solamente se observó a concentraciones elevadas, estas concentraciones podrían alcanzarse mediante administración intravenosa. Un ejemplo es el caso de la vitamina C. Los resultados obtenidos en esta tesis muestran que la vitamina C posee una elevada actividad anticancerosa selectiva a la concentración de 1 mM; concentración que podría alcanzarse en plasma mediante infusión intravenosa 213 . Formulaciones galénicas, como la encapsulación del compuesto en micro- y nanopartículas, también podrían ayudar a alcanzar las concentraciones de los compuestos en el tumor. Por ejemplo, Lemarie y cols. 228 observaron que la administración intravenosa de epigalocatequina-3-galato encapasulada resultó en la supresión de tumores en un modelo animal de cáncer. Por otra parte, la potencia de estos compuestos prooxidantes podría aumentarse mediante modificaciones químicas, como han demostrado algunos de los derivados semisintéticos de hidroxitirosol evaluados en este trabajo. Algunos de éstos derivados generan EROs a concentraciones más bajas que las mostradas por hidroxitirosol, por lo que pueden ser más citotóxicos y selectivos. Estos datos sugieren que determinados compuestos prooxidante podrían tener utilidad para el tratamiento del cáncer de pulmón. La tercera estrategia seguida en esta tesis estuvo basada en que las células cancerosas tienen una mayor dependencia de la glicólisis que las células normales 25,26,29 . Esta dependencia se debe a que las células cancerosas necesitan activar la glicólisis para el aporte de los elevados niveles de energía y de macromoléculas necesarios para poder mantener el elevado ritmo proliferativo que presentan estas células 31 . Se piensa que la inhibición de la glicólisis provocaría un cambio metabólico en las células cancerosas que no podrían soportar, mientras que las células normales se verían menos afectadas por su menor dependencia de esta ruta metabólica para su supervivencia. El cáncer de pulmón, al igual que otros cánceres, depende de la glicólisis mayoritariamente para el mantenimiento energético necesario para la supervivencia y la 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓ - 376 - proliferación 32 . Por este motivo, durante esta tesis se ha estudiado la posible utilidad de la inhibión de la glicólisis en el tratamiento del cáncer de pulmón. Por un lado, los heterósidos cardiotónicos y el extracto de . oleander inhibieron la glicólisis de células cancerosas de pulmón. Por otro lado, tres inhibidores de glicólisis conocidos, dicloroacetato, 2-deoxiglucosa y bromopiruvato, no mostraron actividad citotóxica selectiva, siendo igual de citotóxicos para células normales como para células cancerosas de pulmón. Estas diferencias en actividad anticancerosa selectiva entre los heterósidos cardiotónicos y estos tres inhibidores de glicólisis ponen de manifiesto que la inhibición de la glicólisis puede no ser suficiente para poder generar actividad citotóxica selectiva frente a células cancerosas, o que el mecanismo de inhibición de la glicolisis sea importante para conseguir selectividad. Por otra parte, la glicólisis no solamente es necesaria para el aporte energético y de macromoléculas, sino que también juega un papel fundamental en el mantenimiento del estado redox de la célula. Como se ha comentado anteriormente, debido al elevado ritmo metabólico de las células cancerosas, éstas presentan elevados niveles de EROs. Para poder mantener estos niveles dentro de concentraciones no citotóxicas, las células cancerosas han desarrollado mecanismos de defensas, incluyendo la glicólisis. Por este motivo, se ha propuesto que la combinación de inhibidores de glicólisis junto con agentes prooxidantes podría producir un sinergismo citotóxico sobre células cancerosas 25 . Esta combinación de compuestos originaría un aporte exógeno de EROs (por los agentes prooxidantes) que no podría ser controlado al encontrarse inhibida la glicólisis (por los inhibidores de la glicólisis). Durante esta tesis también se ha evaluado la combinación de inhibidores de glicólisis y agentes prooxidantes. Aunque los inhibidores de la glicólisis dicloroacetato y 2-deoxiglucosa, no presentaron actividad anticancerosa selectiva sobre células de cáncer de pulmón, cuando fueron combinados con el agente prooxidante pirogalol, se produjo una potenciación de la actividad anticancerosa selectiva. El heterósido cardiotónico digitoxina, que actuó como un potente inhibidor de la glicólisis, también potenció el efecto citotóxico selectivo de los agentes prooxidantes vitamina C y pirogalol. Estos datos sugieren que la inhibición de la glicólisis puede potenciar la actividad anticancerosa selectiva de agentes prooxidantes. Algunos de los compuestos que mostraron una elevada actividad anticancerosa selectiva fueron evaluados en combinación con fármacos anticancerosos utilizados en clínica. La combinación de fármacos anticancerosos es una de las herramientas más utilizadas para el tratamiento del cáncer. En esta combinación, es importante que los fármacos utilizados no presenten un efecto antagónico entre ellos. La combinación del derivado galactopiranósido 22, del dodecil hidroxitirosil éter o de los heterósidos cardiotónicos (digoxina, digitoxina y ouabaína) con un fármaco anticanceroso utilizado en clínica (cisplatino, oxaliplatino o 5- fluorouracilo) mostró un modesto efecto sinérgico sobre células cancerosas. Estos datos 7. COCLUSIOES - 383 - COCLUSIOS 1. This work has analyzed the literature suggesting that cancer cells can be selectively killed by exploiting their DNA repair defects and their metabolic alterations. This analysis has been used to select over 100 compounds (and strategies), and their possible selective anticancer activity has been evaluated against lung cancer cells (A549) and lung non-malignant cells (MRC5). Then, it has been evaluated whether the most selective compounds induced DNA damage, inhibited glycolysis and generated reactive oxygen species. Compounds with a high selective cytotoxicity towards lung cancer cells have been also assessed against breast cancer cells (MCF7), melanoma cells (UACC62) and colon cancer cells (HTC116) versus breast normal cells (MCF10) and skin normal cells (VH10). 2. The epoxyalkenyl galactopyranoside (2S,3S)-2,3-epoxydecyl 4,6-O-(S)-benzylidene-β- D-galactopyranoside (compound 35) induces selective cytotoxic activity against lung cancer cells, breast cancer cells and melanoma cells. This compound induces DNA damage, which may require a functional NER pathway for repair. 3. The new aziridine 2-methyl-2,3-[--(4-methylbenzenesulfonyl)imino]propyl 2,3-di-O- benzyl-4,6-O-(S)-benzylidene-β-D-galactopyranoside (compound 22) induces a remarkable selective cytotoxic activity against lung cancer cells, breast cancer cells and melanoma cells, which may be mediated by its ability to induce DNA damage that requires NER for repair. It is worth noting that this aziridine kills breast cancer cells at concentrations 50-fold lower than those required to kill non-malignant breast cells. 4. The guanidine-reactive agent phenylglyoxal induces selective cytotoxicity against lung cancer cells. This activity is mediated, at least in part, by its ability to induce DNA damage and to generate hydrogen peroxide. Cells defective in the DNA repair pathways NER, HR and NHEJ are more sensitive than parental cells to the cytotoxic activity of phenylglyoxal. These data suggest that tumor cells with defects in these DNA repair pathways may be hypersensitive to the cytotoxic activity of phenylglyoxal. 5. Pyrogallol, a molecule present in the chemical structure of the major green tea constituent epigallocatechin-3-gallate, kills lung cancer cells selectively. This selective cytotoxicity is mainly mediated by its ability to generate hydrogen peroxide. Pyrogallol may also induce DNA double strand breaks that require HR, NHEJ and FA for repair. 6. The coffee constituent chlorogenic acid induces selective killing of lung cancer cells, generates cellular DNA damage and induces the formation of topoisomerases-DNA complexes in cells. These activities are largely mediated by its ability to generate hydrogen peroxide. 7. A new series of alkyl ether derivatives of the olive oil constituent hydroxytyrosol displays selective cytotoxicity against lung cancer cells. Hydroxytyrosyl dodecyl ether (HTDE), 7. COCLUSIOES - 384 - the most selective derivative, can moderately inhibit glycolysis, induce oxidative stress and cause DNA damage in A549 cells. The combination of HTDE with the anticancer drug 5- flurouracil induces a synergistic cytotoxicity in lung cancer cells but not in lung non-malignant cells. HTDE also displays selective cytotoxicity against breast cancer cells. 8. The cardiac glycosides digitoxin, digoxin and ouabain, and a hydroalcoholic extract from the leaves of the cardiac glycoside-containing plant erium oleander L. (Apocynaceae) display a high selective cytotoxicity towards lung cancer cells and induce a marked inhibition of glycolysis in these cells. These drugs also increase the cytotoxicity of cisplatin when administered after this commonly used anticancer agent. It is worth noting that digitoxin inhibits the growth of lung cancer cells at concentrations below those commonly found in the plasma of cardiac patients treated with this drug. 9. The alpha, beta-unsaturated lactones 2-furanone and 2-pyrone, which are present in the chemical structure of cardiac glycosides, induce selective cytotoxicity towards lung cancer cells. These lactones generate cellular DNA damage that requires HR for repair. 10. The selective cytotoxic activity of other compounds has been assessed; the high selective cytotoxicity against lung, melanoma and breast cancer cells shown by the new neurokinin 1 receptor antagonist INKB300b is worth noting. 11. The conclusions listed above support the idea that cancer cells can be killed selectively by exploiting their DNA repair defects and their metabolic alterations. The marked selective cytotoxicity displayed by some compounds towards cancer cells warrants further evaluation in animal models. The anticancer activity of digitoxin in lung cancer cells at therapeutic concentrations supports its possible advancement into clinical trials for the treatment of patients with lung cancer. 8. ABREVIATURAS. - 385 - 8. ABREVIATURAS 8. ABREVIATURAS. - 386 - 8. ABREVIATURAS. - 387 - 2-DG: 2-deoxiglucosa 5-FU: 5-fluororuacilo ACG: ácido clorogénico ADN: ácido desoxirribonucléico AG: ácido gálico AMP: adenosín monofosfato AMPK: proteína quinasa activada por AMP (AMP-activated protein kinase) Antag.: antagonismo ATCC: American Type Culture Collection ATP: adenosín trifosfato BB: solución tampón de unión (binding buffer) BER: reparación por escisión de bases (Base Excision Repair) BrP: bromopiruvato BSA: albúmina de suero bovino (bovine serum albumin) CAT: ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ciclo de Krebs Cat: catalasa CI: índice de combinación (combination index) Conc.: concentración CPCNP: cáncer de pulmón de células no pequeñas CPCP: cáncer de pulmón de células pequeñas Cpt: camptotecina DCA: dicloroacetato DMSO: dimetilsulfóxido DMEM: Dulbecco's modified Eagle's medium ECACC: European Collection of Cell Cultures EEUU: Estados Unidos EGCG: epigalocatequina-3-galato EGFR: receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (epidermal growth factor receptor) ERO: especies reactivas de oxigeno Etop: etopósido FADH2: flavín adenín dinucleótido FG: fenilglioxal FITC: fluoresceína isotiocianato. H 2 O 2 : peróxido de hidrógeno HIF1: factor de transcripción inducible por hipoxia-1 (hypoxia-inducible factors) HR: recombinación homóloga (Homologous recombination) HTY: hidroxitirosol (hydroxytyrosol) HTDE: hidroxitiroxil dodecil éter NHEJ: reparación por unión de extremos no homólogos (non-homologous end joining) IC50: concentración inhibitoria (inhibitor concentration 50) IP: yoduro de propidio MAPK: proteína quinasa activada por mitógeno (mitogen-activated protein kinases) MMR: reparación de desapareamiento de bases (Mismatch repair) MnTMPyP: manganeso (III) tetrakis (1-metil-4-piridil) porfirina NAC: n-acetilcisteína NAD + : nicotinamida adenina dinucleótido en su forma oxidada NADH: nicotinamida adenina dinucleótido en su forma reducida NER: reparación por escisión de nucleótidos (Nucleotide Excision Repair) NK: neurokinina NOE: Extracto de erium oleander (erium oleander extract) OCT1: factor de transcripción unido a octámero (octamer-binding transcription factor) OXPHOS: fosforilación oxidativa (Oxidative phosphorylation) PBS: tampón fosfato salino (phosphate-buffered saline) PDH: piruvato deshidrogenasa 8. ABREVIATURAS. - 388 - PDK: piruvato deshidrogenasa kinasa PET: tomografía por emisión de positrones (positron emission tomography) PFK: fosfofructoquinasa (phosphofructokinase) PG: pirogalol PI3K: fosfoinositol 3-quinasa (phosphoinositida 3-kinase) RMN: resonancia magnética nuclear Sinerg.: sinergismo SEM: error estándar de la media (standar error mean) SGLT: cotransportador glucosa/Na + (sodium-glucose transport protein) SIDA: Síndrome de InmunoDeficiencia Adquirida SP: sustancia P SRB: sulforrodamina B TAC: tomografía computarizada TCA: ácido tricloroacético (trichloroacetic acid) Topo: topoisomerasa UV: ultravioleta VDAC: canales de aniones dependientes de voltaje (voltage dependent anion channels) 9. AGRADECIMIETOS - 389 - 9. AGRADECIMIETOS - 390 - 9. AGRADECIMIETOS - 391 - 9. AGRADECIMIETOS - 392 - 10. BIBLIOGRAFÍA - 399 - (58) Cao X, Bloomston M, Zhang T et al. Synergistic antipancreatic tumor effect by simultaneously targeting hypoxic cancer cells with HSP90 inhibitor and glycolysis inhibitor. Clin Cancer Res. 2008;14:1831-1839. (59) Chou TC. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Res. 2010;70:440-446. (60) Hartley JA, O'Hare CC, Baumgart J. DNA alkylation and interstrand crosslinking by treosulfan. Br J Cancer. 1999;79:264-266. (61) Regan JD, Francis AA, Dunn WC et al. Repair of DNA damaged by mutagenic metabolites of benzo(a)pyrene in human cells. Chem Biol Interact. 1978;20:279- 287. (62) Pashin YV, Bakhitova LM. Mutagenic and carcinogenic properties of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ Health Perspect. 1979;30:185-9.:185-189. (63) Gao D, Luo Y, Guevara D et al. Benzo[a]pyrene and its metabolites combined with ultraviolet A synergistically induce 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine via reactive oxygen species. Free Radic Biol Med. 2005;39:1177-1183. (64) Szeliga J, Amin S. Quantitative reactions of anti 5,9-dimethylchrysene dihydrodiol epoxide with DNA and deoxyribonucleotides. Chem Biol Interact. 2000;128:159-172. (65) Meschini R, Berni A, Marotta E et al. DNA repair mechanisms involved in the removal of DBPDE-induced lesions leading to chromosomal alterations in CHO cells. Cytogenet Genome Res. 2010;128:124-130. (66) Spencer WA, Singh J, Orren DK. Formation and differential repair of covalent DNA adducts generated by treatment of human cells with (+/-)-anti- dibenzo[a,l]pyrene-11,12-diol-13,14-epoxide. Chem Res Toxicol. 2009;22:81- 89. (67) Lee KM, Kim JC, Kang P et al. Chiral Aziridine-2-carboxylates: Versatile Precursors for Functionalized Tetrahydroisoquinoline (THIQ) Containing Heterocycles. Tetrahedron. 2012;68:883-893. (68) Dolence EK, Roylance JB. Optically active diethyl N-( p-toluenesulfonyl)- aziridine 2-phosphonates as chiral synthons for the synthesis of ß-substituted aamino phosphonates. Tetrahedron: Asymmetry. 2004;15. (69) Maanen MJ, Smeets CJ, Beijnen JH. Chemistry, pharmacology and pharmacokinetics of N,N',N" -triethylenethiophosphoramide (ThioTEPA). Cancer Treat Rev. 2000;26:257-268. (70) Ishizeki S, Ohtsuka M, Irinoda K et al. Azinomycins A and B, new antitumor antibiotics. III. Antitumor activity. J Antibiot (Tokyo). 1987;40:60-65. (71) Jeong JU, Tao B., Sagasser I, Henniges H, Sharpless KB. Bromine-Catalyzed Aziridination of Olefins. A Rare Example of Atom-Transfer Redox Catalysis by 10. BIBLIOGRAFÍA - 400 - a Main Group Element. Journal of the American Chemical Society. 1998;120:6844-6845. (72) Martin-Cordero C, Leon-Gonzalez AJ, Calderon-Montano JM, Burgos-Moron E, Lopez-Lazaro M. Pro-oxidant natural products as anticancer agents. Curr Drug Targets. 2012;13:1006-1028. (73) Alexandre J, Hu Y, Lu W, Pelicano H, Huang P. Novel action of paclitaxel against cancer cells: bystander effect mediated by reactive oxygen species. Cancer Res. 2007;67:3512-3517. (74) Dekhuijzen PN. Antioxidant properties of N-acetylcysteine: their relevance in relation to chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. 2004;23:629- 636. (75) Zafarullah M, Li WQ, Sylvester J, Ahmad M. Molecular mechanisms of N- acetylcysteine actions. Cell Mol Life Sci. 2003;60:6-20. (76) Gatenby RA, Gillies RJ. Glycolysis in cancer: A potential target for therapy. Int J Biochem Cell Biol. 2007;39:1358-1366. (77) Atmaca A, Al Batran SE, Werner D et al. A randomised multicentre phase II study with cisplatin/docetaxel vs oxaliplatin/docetaxel as first-line therapy in patients with advanced or metastatic non-small cell lung cancer. Br J Cancer. 2013;108:265-270. (78) Shi SB, Hu RH, Qi JL et al. Treatment of stage IIIb/IV non-small cell lung cancer with Pemetrexed plus Oxaliplatin after failure of Erlotinib as second-line treatment. Med Oncol. 2013;30:550-0550. (79) Mir O, Boudou-Rouquette P, Giroux J et al. Pemetrexed, oxaliplatin and bevacizumab as first-line treatment in patients with stage IV non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 2012;77:104-109. (80) Lee DH, Choi CM, Kim SW, Suh C, Lee JS. Phase II study of pemetrexed plus oxaliplatin for platinum-resistant advanced or metastatic non-small cell lung cancer patients. Med Oncol. 2012;29:640-643. (81) Mitchell PL, Broad A, Rosenthal MA et al. Randomized phase 2 sequencing and pharmacokinetic study of gemcitabine and oxaliplatin in advanced non-small cell lung cancer. Asia Pac J Clin Oncol. 2011;7:376-384. (82) Shiroyama T, Kijima T, Komuta K et al. Phase II tailored S-1 regimen study of first-line chemotherapy in elderly patients with advanced and recurrent nonsmall cell lung cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 2012;70:783-789. (83) Gruber G, Greiner RH, Hlushchuk R et al. Hypoxia-inducible factor 1 alpha in high-risk breast cancer: an independent prognostic parameter? Breast Cancer Res. 2004;6:R191-R198. (84) Curtin NJ. DNA repair dysregulation from cancer driver to therapeutic target. Nat Rev Cancer. 2012;12:801-817. 10. BIBLIOGRAFÍA - 401 - (85) Andressoo JO, Hoeijmakers JH, de Waard H. Nucleotide excision repair and its connection with cancer and ageing. Adv Exp Med Biol. 2005;570:45-83. doi: 10.1007/1-4020-3764-3_3.:45-83. (86) Wei Q, Cheng L, Hong WK, Spitz MR. Reduced DNA repair capacity in lung cancer patients. Cancer Res. 1996;56:4103-4107. (87) Park YS, Koh YH, Takahashi M et al. Identification of the binding site of methylglyoxal on glutathione peroxidase: methylglyoxal inhibits glutathione peroxidase activity via binding to glutathione binding sites Arg 184 and 185. Free Radic Res. 2003;37:205-211. (88) Nitiss JL. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nat Rev Cancer. 2009;9:338-350. (89) Pommier Y. Topoisomerase I inhibitors: camptothecins and beyond. Nat Rev Cancer. 2006;6:789-802. (90) Binaschi M, Zagotto G, Palumbo M et al. Irreversible and reversible topoisomerase II DNA cleavage stimulated by clerocidin: sequence specificity and structural drug determinants. Cancer Res. 1997;57:1710-1716. (91) Lopez-Lazaro M, Willmore E, Elliott SL, Austin CA. Selenite induces topoisomerase I and II-DNA complexes in K562 leukemia cells. Int J Cancer. 2008;123:2217-2221. (92) Sordet O, Goldman A, Pommier Y. Topoisomerase II and tubulin inhibitors both induce the formation of apoptotic topoisomerase I cleavage complexes. Mol Cancer Ther. 2006;5:3139-3144. (93) Yang CS, Wang X, Lu G, Picinich SC. Cancer prevention by tea: animal studies, molecular mechanisms and human relevance. Nat Rev Cancer. 2009;9:429-439. (94) Khan N, Afaq F, Saleem M, Ahmad N, Mukhtar H. Targeting multiple signaling pathways by green tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate. Cancer Res. 2006;66:2500-2505. (95) Khan N, Mukhtar H. Multitargeted therapy of cancer by green tea polyphenols. Cancer Lett. 2008;269:269-280. (96) Clement Y. Can green tea do that? A literature review of the clinical evidence. Prev Med. 2009;49:83-87. (97) Akagawa M, Shigemitsu T, Suyama K. Production of hydrogen peroxide by polyphenols and polyphenol-rich beverages under quasi-physiological conditions. Biosci Biotechnol Biochem. 2003;67:2632-2640. (98) Liu KC, Ho HC, Huang AC et al. Gallic acid provokes DNA damage and suppresses DNA repair gene expression in human prostate cancer PC-3 cells. Environ Toxicol. 2011;10. 10. BIBLIOGRAFÍA - 402 - (99) Moran JF, Klucas RV, Grayer RJ, Abian J, Becana M. Complexes of iron with phenolic compounds from soybean nodules and other legume tissues: prooxidant and antioxidant properties. Free Radic Biol Med. 1997;22:861-870. (100) Mazzei JL, de Souza LJ, Felzenszwalb I. The influence of pH on the inhibition of DNA cleavages induced by pyrogallol. Redox Rep. 2008;13:208-212. (101) Prise KM, Davies S, Michael BD. Cell killing and DNA damage in Chinese hamster V79 cells treated with hydrogen peroxide. Int J Radiat Biol. 1989;55:583-592. (102) Dahm-Daphi J, Sass C, Alberti W. Comparison of biological effects of DNA damage induced by ionizing radiation and hydrogen peroxide in CHO cells. Int J Radiat Biol. 2000;76:67-75. (103) Harper JV, Anderson JA, O'Neill P. Radiation induced DNA DSBs: Contribution from stalled replication forks? DNA Repair (Amst). 2010;9:907- 913. (104) Orta ML, Calderon-Montano JM, Dominguez I et al. 5-Aza-2'-deoxycytidine causes replication lesions that require Fanconi anemia-dependent homologous recombination for repair. Nucleic Acids Res. 2013. (105) Higdon JV, Frei B. Coffee and health: a review of recent human research. Crit Rev Food Sci Nutr. 2006;46:101-123. (106) Arab L. Epidemiologic evidence on coffee and cancer. Nutr Cancer. 2010;62:271-283. (107) Long LH, Halliwell B. Coffee drinking increases levels of urinary hydrogen peroxide detected in healthy human volunteers. Free Radic Res. 2000;32:463- 467. (108) Hiramoto K, Kida T, Kikugawa K. Increased urinary hydrogen peroxide levels caused by coffee drinking. Biol Pharm Bull. 2002;25:1467-1471. (109) Hegele J, Munch G, Pischetsrieder M. Identification of hydrogen peroxide as a major cytotoxic component in Maillard reaction mixtures and coffee. Mol Nutr Food Res. 2009;53:760-769. (110) Kono Y, Kobayashi K, Tagawa S et al. Antioxidant activity of polyphenolics in diets. Rate constants of reactions of chlorogenic acid and caffeic acid with reactive species of oxygen and nitrogen. Biochim Biophys Acta. 1997;1335:335- 342. (111) Zheng LF, Dai F, Zhou B, Yang L, Liu ZL. Prooxidant activity of hydroxycinnamic acids on DNA damage in the presence of Cu(II) ions: mechanism and structure-activity relationship. Food Chem Toxicol. 2008;46:149-156. 10. BIBLIOGRAFÍA - 403 - (112) Daroui P, Desai SD, Li TK, Liu AA, Liu LF. Hydrogen peroxide induces topoisomerase I-mediated DNA damage and cell death. J Biol Chem. 2004;279:14587-14594. (113) Sofi F, Abbate R, Gensini GF, Casini A. Accruing evidence on benefits of adherence to the Mediterranean diet on health: an updated systematic review and meta-analysis. Am J Clin Nutr. 2010;92:1189-1196. (114) Kontou N, Psaltopoulou T, Panagiotakos D, Dimopoulos MA, Linos A. The mediterranean diet in cancer prevention: a review. J Med Food. 2011;14:1065- 1078. (115) Urpi-Sarda M, Casas R, Chiva-Blanch G et al. Virgin olive oil and nuts as key foods of the Mediterranean diet effects on inflammatory biomakers related to atherosclerosis. Pharmacol Res. 2012;65:577-583. (116) Visioli F, Bernardini E. Extra virgin olive oil's polyphenols: biological activities. Curr Pharm Des. 2011;17:786-804. (117) Psaltopoulou T, Kosti RI, Haidopoulos D, Dimopoulos M, Panagiotakos DB. Olive oil intake is inversely related to cancer prevalence: a systematic review and a meta-analysis of 13,800 patients and 23,340 controls in 19 observational studies. Lipids Health Dis. 2011;10:127. doi: 10.1186/1476-511X-10-127.:127- 10. (118) Sanchez-Fidalgo S, Sanchez d, I, Cardeno A, Alarcon dlL. Influence of extra virgin olive oil diet enriched with hydroxytyrosol in a chronic DSS colitis model. Eur J Nutr. 2012;51:497-506. (119) Granados-Principal S, Quiles JL, Ramirez-Tortosa CL, Sanchez-Rovira P, Ramirez-Tortosa MC. Hydroxytyrosol: from laboratory investigations to future clinical trials. Nutr Rev. 2010;68:191-206. (120) Cornwell DG, Ma J. Nutritional benefit of olive oil: the biological effects of hydroxytyrosol and its arylating quinone adducts. J Agric Food Chem. 2008;56:8774-8786. (121) Hagiwara K, Goto T, Araki M, Miyazaki H, Hagiwara H. Olive polyphenol hydroxytyrosol prevents bone loss. Eur J Pharmacol. 2011;662:78-84. (122) Ragione FD, Cucciolla V, Borriello A et al. Hydroxytyrosol, a natural molecule occurring in olive oil, induces cytochrome c-dependent apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 2000;278:733-739. (123) Granados-Principal S, Quiles JL, Ramirez-Tortosa C et al. Hydroxytyrosol inhibits growth and cell proliferation and promotes high expression of sfrp4 in rat mammary tumours. Mol Nutr Food Res. 2011;55 Suppl 1:S117-26. doi: 10.1002/mnfr.201000220. Epub;%2010 Dec 1.:S117-S126. (124) Fabiani R, Sepporta MV, Rosignoli P et al. Anti-proliferative and pro-apoptotic activities of hydroxytyrosol on different tumour cells: the role of extracellular production of hydrogen peroxide. Eur J Nutr. 2012;51:455-464. 10. BIBLIOGRAFÍA - 404 - (125) Zrelli H, Matsuka M, Araki M, Zarrouk M, Miyazaki H. Hydroxytyrosol induces vascular smooth muscle cells apoptosis through NO production and PP2A activation with subsequent inactivation of Akt. Planta Med. 2011;77:1680-1686. (126) Han J, Talorete TP, Yamada P, Isoda H. Anti-proliferative and apoptotic effects of oleuropein and hydroxytyrosol on human breast cancer MCF-7 cells. Cytotechnology. 2009;59:45-53. (127) Fabiani R, Fuccelli R, Pieravanti F, De Bartolomeo A, Morozzi G. Production of hydrogen peroxide is responsible for the induction of apoptosis by hydroxytyrosol on HL60 cells. Mol Nutr Food Res. 2009;53:887-896. (128) Warleta F, Quesada CS, Campos M et al. Hydroxytyrosol protects against oxidative DNA damage in human breast cells. Nutrients. 2011;3:839-857. (129) Bernini R, Merendino N, Romani A, Velotti F. Naturally occurring hydroxytyrosol: synthesis and anticancer potential. Curr Med Chem. 2013;20:655-670. (130) Svilar D, Goellner EM, Almeida KH, Sobol RW. Base excision repair and lesion-dependent subpathways for repair of oxidative DNA damage. Antioxid Redox Signal. 2011;14:2491-2507. (131) Jemal A, Bray F, Center MM et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin. 2011;61:69-90. (132) Pereira-Caro G, Sarria B, Madrona A et al. Digestive stability of hydroxytyrosol, hydroxytyrosyl acetate and alkyl hydroxytyrosyl ethers. Int J Food Sci Nutr. 2012;63:703-707. (133) Munoz-Marin J, De La Cruz JP, Guerrero A et al. Cytoprotective effect of hydroxytyrosyl alkyl ether derivatives after oral administration to rats in a model of glucose-oxygen deprivation in brain slices. J Agric Food Chem. 2012;60:7659-7664. (134) Mijatovic T, Van Quaquebeke E, Delest B et al. Cardiotonic steroids on the road to anti-cancer therapy. Biochim Biophys Acta. 2007;1776:32-57. (135) Prassas I, Diamandis EP. Novel therapeutic applications of cardiac glycosides. Nat Rev Drug Discov. 2008;7:926-935. (136) Winnicka K, Bielawski K, Bielawska A. Cardiac glycosides in cancer research and cancer therapy. Acta Pol Pharm. 2006;63:109-115. (137) Rashan LJ, Franke K, Khine MM et al. Characterization of the anticancer properties of monoglycosidic cardenolides isolated from Nerium oleander and Streptocaulon tomentosum. J Ethnopharmacol. 2011;134:781-788. (138) Wong SK, Lim YY, Abdullah NR, Nordin FJ. Antiproliferative and phytochemical analyses of leaf extracts of ten Apocynaceae species. Pharmacognosy Res. 2011;3:100-106. 10. BIBLIOGRAFÍA - 405 - (139) Smith JA, Madden T, Vijjeswarapu M, Newman RA. Inhibition of export of fibroblast growth factor-2 (FGF-2) from the prostate cancer cell lines PC3 and DU145 by Anvirzel and its cardiac glycoside component, oleandrin. Biochem Pharmacol. 2001;62:469-472. (140) Newman RA, Yang P, Hittelman WN et al. Oleandrin-mediated oxidative stress in human melanoma cells. J Exp Ther Oncol. 2006;5:167-181. (141) Sreenivasan Y, Raghavendra PB, Manna SK. Oleandrin-mediated expression of Fas potentiates apoptosis in tumor cells. J Clin Immunol. 2006;26:308-322. (142) Mekhail T, Kaur H, Ganapathi R et al. Phase 1 trial of Anvirzel in patients with refractory solid tumors. Invest New Drugs. 2006;24:423-427. (143) Jornada LK, Valvassori SS, Arent CO et al. DNA damage after intracerebroventricular injection of ouabain in rats. Neurosci Lett. 2010;471:6-9. (144) Lopez-Lazaro M, Pastor N, Azrak SS et al. Digitoxin, at concentrations commonly found in the plasma of cardiac patients, antagonizes etoposide and idarubicin activity in K562 leukemia cells. Leuk Res. 2006;30:895-898. (145) Gupta RS, Chopra A, Stetsko DK. Cellular basis for the species differences in sensitivity to cardiac glycosides (digitalis). J Cell Physiol. 1986;127:197-206. (146) Chen Z, Lu W, Garcia-Prieto C, Huang P. The Warburg effect and its cancer therapeutic implications. J Bioenerg Biomembr. 2007;39:267-274. (147) Paul RJ, Bauer M, Pease W. Vascular smooth muscle: aerobic glycolysis linked to sodium and potassium transport processes. Science. 1979;206:1414-1416. (148) James JH, Fang CH, Schrantz SJ et al. Linkage of aerobic glycolysis to sodiumpotassium transport in rat skeletal muscle. Implications for increased muscle lactate production in sepsis. J Clin Invest. 1996;98:2388-2397. (149) Lopez-Lazaro M. Digitoxin as an anticancer agent with selectivity for cancer cells: possible mechanisms involved. Expert Opin Ther Targets. 2007;11:1043- 1053. (150) Mijatovic T, Roland I, Van Quaquebeke E et al. The alpha1 subunit of the sodium pump could represent a novel target to combat non-small cell lung cancers. J Pathol. 2007;212:170-179. (151) Yang P, Cartwright C, Efuet E et al. Cellular location and expression of Na(+) , K(+) -ATPase alpha subunits affect the anti-proliferative activity of oleandrin. Mol Carcinog. 2012;10. (152) Kishimoto S, Kawazoe Y, Ikeno M et al. Role of Na+, K+-ATPase alpha1 subunit in the intracellular accumulation of cisplatin. Cancer Chemother Pharmacol. 2006;57:84-90. (153) Hauptman PJ, Garg R, Kelly RA. Cardiac glycosides in the next millennium. Prog Cardiovasc Dis. 1999;41:247-254. 10. BIBLIOGRAFÍA - 406 - (154) Rahimtoola SH, Tak T. The use of digitalis in heart failure. Curr Probl Cardiol. 1996;21:781-853. (155) Stenkvist B. Is digitalis a therapy for breast carcinoma? Oncol Rep. 1999;6:493- 496. (156) Lopez-Lazaro M, Pastor N, Azrak SS et al. Digitoxin inhibits the growth of cancer cell lines at concentrations commonly found in cardiac patients. J Nat Prod. 2005;68:1642-1645. (157) Johansson S, Lindholm P, Gullbo J et al. Cytotoxicity of digitoxin and related cardiac glycosides in human tumor cells. Anticancer Drugs. 2001;12:475-483. (158) Ramirez-Ortega M, Maldonado-Lagunas V, Melendez-Zajgla J et al. Proliferation and apoptosis of HeLa cells induced by in vitro stimulation with digitalis. Eur J Pharmacol. 2006;534:71-76. (159) Zhang H, Qian DZ, Tan YS et al. Digoxin and other cardiac glycosides inhibit HIF-1alpha synthesis and block tumor growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105:19579-19586. (160) Bielawski K, Winnicka K, Bielawska A. Inhibition of DNA topoisomerases I and II, and growth inhibition of breast cancer MCF-7 cells by ouabain, digoxin and proscillaridin A. Biol Pharm Bull. 2006;29:1493-1497. (161) Perne A, Muellner MK, Steinrueck M et al. Cardiac glycosides induce cell death in human cells by inhibiting general protein synthesis. PLoS One. 2009;4:e8292. (162) Hallbook H, Felth J, Eriksson A et al. Ex vivo activity of cardiac glycosides in acute leukaemia. PLoS One. 2011;6:e15718. (163) Joshi AD, Parsons DW, Velculescu VE, Riggins GJ. Sodium ion channel mutations in glioblastoma patients correlate with shorter survival. Mol Cancer. 2011;10:17. doi: 10.1186/1476-4598-10-17.:17-10. (164) Newman RA, Yang P, Pawlus AD, Block KI. Cardiac glycosides as novel cancer therapeutic agents. Mol Interv. 2008;8:36-49. (165) Huang YT, Chueh SC, Teng CM, Guh JH. Investigation of ouabain-induced anticancer effect in human androgen-independent prostate cancer PC-3 cells. Biochem Pharmacol. 2004;67:727-733. (166) Lynch RM, Balaban RS. Coupling of aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase in renal cell line MDCK. Am J Physiol. 1987;253:C269-C276. (167) Pellerin L, Magistretti PJ. Glutamate uptake into astrocytes stimulates aerobic glycolysis: a mechanism coupling neuronal activity to glucose utilization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91:10625-10629. (168) Scholnick P, Lang D, Racker E. Regulatory mechanisms in carbohydrate metabolism. IX. Stimulation of aerobic glycolysis by energy-linked ion transport and inhibition by dextran sulfate. J Biol Chem. 1973;248:5175. 10. BIBLIOGRAFÍA - 407 - (169) Hiyoshi H, Abdelhady S, Segerstrom L et al. Quiescence and gammaH2AX in neuroblastoma are regulated by ouabain/Na,K-ATPase. Br J Cancer. 2012;106:1807-1815. (170) Tailler M, Senovilla L, Lainey E et al. Antineoplastic activity of ouabain and pyrithione zinc in acute myeloid leukemia. Oncogene. 2012;31:3536-3546. (171) Badr CE, Wurdinger T, Nilsson J et al. Lanatoside C sensitizes glioblastoma cells to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and induces an alternative cell death pathway. Neuro Oncol. 2011;13:1213-1224. (172) Xie XB, Yin JQ, Wen LL et al. Critical role of heat shock protein 27 in bufalininduced apoptosis in human osteosarcomas: a proteomic-based research. PLoS One. 2012;7:e47375. (173) Zhang DM, Liu JS, Deng LJ et al. Arenobufagin, a natural bufadienolide from toad venom, induces apoptosis and autophagy in human hepatocellular carcinoma cells through inhibition of PI3K/Akt/mTOR pathway. Carcinogenesis. 2013. (174) Zhang DM, Liu JS, Tang MK et al. Bufotalin from Venenum Bufonis inhibits growth of multidrug resistant HepG2 cells through G2/M cell cycle arrest and apoptosis. Eur J Pharmacol. 2012;692:19-28. (175) Weidemann H. Na/K-ATPase, endogenous digitalis like compounds and cancer development -- a hypothesis. Front Biosci. 2005;10:2165-76.:2165-2176. (176) Mijatovic T, Dufrasne F, Kiss R. Cardiotonic steroids-mediated targeting of the Na(+)/K(+)-ATPase to combat chemoresistant cancers. Curr Med Chem. 2012;19:627-646. (177) Felth J, Rickardson L, Rosen J et al. Cytotoxic effects of cardiac glycosides in colon cancer cells, alone and in combination with standard chemotherapeutic drugs. J Nat Prod. 2009;72:1969-1974. (178) Liaw CC, Wu TY, Chang FR, Wu YC. Historic perspectives on Annonaceous acetogenins from the chemical bench to preclinical trials. Planta Med. 2010;76:1390-1404. (179) Colin SJ. The naturally occurring furanones: formation and function from pheromone to food. Biol Rev Camb Philos Soc. 1999;74:259-276. (180) Yuan J, Liu H, Zhou LH, Zou YL, Lu WQ. Oxidative stress and DNA damage induced by a drinking-water chlorination disinfection byproduct 3-chloro-4- (dichloromethyl)-5-hydroxy-2(5H)-furanone (MX) in mice. Mutat Res. 2006;609:129-136. (181) Roginskaya M, Razskazovskiy Y, Bernhard WA. 2-Deoxyribonolactone lesions in X-ray-irradiated DNA: quantitative determination by catalytic 5-methylene-2- furanone release. Angew Chem Int Ed Engl. 2005;44:6210-6213. 10. BIBLIOGRAFÍA - 408 - (182) McGlacken GP, Fairlamb IJ. 2-Pyrone natural products and mimetics: isolation, characterisation and biological activity. Nat Prod Rep. 2005;22:369-385. (183) Lacy A, O'Kennedy R. Studies on coumarins and coumarin-related compounds to determine their therapeutic role in the treatment of cancer. Curr Pharm Des. 2004;10:3797-3811. (184) Lee SH, Oe T, Blair IA. Vitamin C-induced decomposition of lipid hydroperoxides to endogenous genotoxins. Science. 2001;292:2083-2086. (185) Lopez-Lazaro M, Martin-Cordero C, Bermejo A, Cortes D, Ayuso MJ. Cytotoxic compounds from Annonaceus species as DNA topoisomerase I poisons. Anticancer Res. 2001;21:3493-3497. (186) Bielawski K, Winnicka K, Bielawska A. Inhibition of DNA topoisomerases I and II, and growth inhibition of breast cancer MCF-7 cells by ouabain, digoxin and proscillaridin A. Biol Pharm Bull. 2006;29:1493-1497. (187) Vander Heiden MG, Cantley LC, Thompson CB. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 2009;324:1029- 1033. (188) Wondrak GT. Redox-directed cancer therapeutics: molecular mechanisms and opportunities. Antioxid Redox Signal. 2009. (189) Zhang Q, Pan J, North PE et al. Aerosolized 3-bromopyruvate inhibits lung tumorigenesis without causing liver toxicity. Cancer Prev Res (Phila). 2012;5:717-725. (190) Lea MA, Qureshi MS, Buxhoeveden M et al. Regulation of the proliferation of colon cancer cells by compounds that affect glycolysis, including 3- bromopyruvate, 2-deoxyglucose and biguanides. Anticancer Res. 2013;33:401- 407. (191) Maschek G, Savaraj N, Priebe W et al. 2-deoxy-D-glucose increases the efficacy of adriamycin and paclitaxel in human osteosarcoma and non-small cell lung cancers in vivo. Cancer Res. 2004;64:31-34. (192) Giammarioli AM, Gambardella L, Barbati C et al. Differential effects of the glycolysis inhibitor 2-deoxy-D-glucose on the activity of pro-apoptotic agents in metastatic melanoma cells, and induction of a cytoprotective autophagic response. Int J Cancer. 2012;131:E337-E347. (193) Sun RC, Fadia M, Dahlstrom JE et al. Reversal of the glycolytic phenotype by dichloroacetate inhibits metastatic breast cancer cell growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Res Treat. 2010;120:253-260. (194) Olszewski U, Poulsen TT, Ulsperger E et al. In vitro cytotoxicity of combinations of dichloroacetate with anticancer platinum compounds. Clin Pharmacol. 2010;2:177-83. doi: 10.2147/CPAA.S11795. Epub;%2010 Sep 14.:177-183.