Impacto de la antibioterapia sobre la microbiota y metaboloma intestinal en el niño menor de dos años

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA Título Impacto de la antibioterapia sobre la microbiota y metaboloma intestinal en el niño menor de dos años Trabajo que presenta la licenciada María Dolores Falcón Neyra para optar al grado de Doctora en Medicina y Cirugía. Sevilla, febrero de 2023 D. JOSÉ LÓPEZ BARNEO, PROFESOR DEL DEPARTAMENTO DE MEDICINA DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA. CERTIFICA: Que Doña María Dolores Falcón Neyra, Licenciada en Medicina y Cirugía ha realizado bajo nuestra dirección el trabajo titulado Impacto de la antibioterapia sobre la microbiota y metaboloma intestinal en el niño menor de dos años . Revisado el presente trabajo estimamos que reúne las condiciones necesarias para ser presentado como Tesis Doctoral. Directores de la tesis, Dra. Beatriz Espín de Jaime Dra. Isabel Delgado Pecellín Dr. Olaf Neth Tutor de la tesis, Dr. José López Barneo Doctorando, María Dolores Falcón Neyra Sevilla, febrero 2023 Es copia auténtica de documento electrónico Informe Dictamen Favorable Proyecto Investigación Biomédica C.P. LFN - C.I. 0586-M2-18 02 de diciembre de 2022 CEI de los Hospitales Universitarios Virgen Macarena y Virgen del Rocío CEI de los Hospitales Universitarios Virgen Macarena – Virgen del Rocío de Sevilla Avda. Dr. Fedriani, 3 - Unidad de Investigación 2ª planta Sevilla 41071 Sevilla España Página 1 de 3 Tel. 955 043 127 Fax. Correo electrónico [email protected] D. Carlos García Pérez Secretario del CEI de los Hospitales Universitarios Virgen Macarena y Virgen del Rocío CERTIFICA Que el CEI de los Hospitales Universitarios Virgen Macarena y Virgen del Rocío en su reunión del día 01/12/2022, acta CEI_10/2022 ha evaluado la propuesta del promotor referida al estudio: Título: Evaluación del impacto de la antibioterapia sobre la microbiota y metaboloma intestinal en el niño menor de dos años Código Promotor: LFN Código Interno: 0586-M2-18 Promotor: Investigador Monitor/CRO: Investigador Versión Protocolo Evaluada: 09/09/2022 Versión Hoja Información al Paciente Evaluada: HIP / 09/09/2022 1º. Considera que - El estudio se plantea siguiendo los requisitos de la Ley 14/2007, de 3 de julio, de Investigación Biomédica y su realización es pertinente. - Se cumplen los requisitos necesarios de idoneidad del protocolo en relación con los objetivos del estudio y están justificados los riesgos y molestias previsibles para el sujeto. - Son adecuados tanto el procedimiento para obtener el consentimiento informado como la compensación prevista para los sujetos por daños que pudieran derivarse de su participación en el estudio. - El alcance de las compensaciones económicas previstas no interfiere con el respeto a los postulados éticos. - La capacidad de los Investigadores y los medios disponibles son apropiados para llevar a cabo el estudio. 2º. Por lo que este CEI emite un DICTAMEN FAVORABLE. 3º. Este CEI acepta* que dicho estudio sea realizado en los siguientes CEI/Centros por los Investigadores: CEI de los Hospitales Universitarios Virgen Macarena y Virgen del Rocío MARIA DOLORES FALCON NEYRA (Neurología) Hospital Universitario Virgen del Rocío *Al ejecutar este proyecto, el investigador contrae una serie de compromisos con respecto al Comité, que se detallan en el Anexo I.* Lo que firmo en Sevilla, en la fecha reseñada en la firma electrónica. Fdo: D. Carlos García Pérez Secretario del CEI de los Hospitales Universitarios Virgen Macarena y Virgen del Rocío FIRMADO POR JOSE CARLOS GARCIA PEREZ 05/12/2022 11:30:29 PÁGINA 1/3 VERIFICACIÓN UUM32VD5JHRQMH5KF4D4HMCVBYG3LA https://ws050.juntadeandalucia.es/verificarFirma/ Agradecimientos Gracias a los directores, Isabel Delgado Pecellín, Olaf Neth y Beatriz Espín y al tutor de esta tesis, José López-Barneo por su apoyo, enseñanza y confianza en mi para el desarrollo del proyecto. Gracias a las familias que entre el escepticismo y la ilusión aceptaron participar en este estudio. A Olaf, por sus ideas, por todos los años de trabajo compartidos, por crear equipo y proyectarnos al mundo de la Infectología, Reumatología e Inmunología Pediátrica. Gracias por la amistad. A Dagmar Alber, Eloisa Rubio y Henry Andrade, por toda la paciencia, la ayuda desinteresada, los consejos y las sonrisas. A los pediatras que me enseñaron a ser pediatra, a amar esta profesión y sentirme afortunada y agradecida cada día, gracias a Segundo López-Ros, Juan Antonio León, Teresa Charlo, Cristóbal Toro, Manolo Begara, Esther Díaz y Lola Arenas, ……esta lista no tendría fin, …. gracias con mayúsculas. A mis compañeros Walter Goycochea, Chere Muñoz, Laura Fernández y Peter Olbrich, por tantas horas compartidas, tantos diagnósticos y tanto aprendizaje. Al Dr. Ignacio Obando, pediatra, maestro y, sobre todo, amigo. Gracias por tener respuesta a todas las preguntas. A mis amigas y compañeras Cristina Montero, Isabel Delgado y a Marisol Camacho, por estar presente en todos los momentos. Por ser referentes, ejemplos de bienhacer y pilares fundamentales en mi día a día. A Ángela Algarrada y Paco Carmona, Fernando de la Fuente, Manuel Carlos Menchón y Paula Sánchez por haberme regalado vuestra amistad, por acompañarme siempre, por vuestro cariño. GRACIAS. A la comunidad Vaskia, a Gorka Etxebarria y Cristina Sevillano por contagiar ilusión todos los días. A Juan García, Vicente González-Prida y Mar Murillo, a mi equipo, Hayat Heluani, Pedro Capitán y a Manuel Jesús López Calle, por habernos encontrado, porque nunca es tarde, por todo el cariño, las palabras de ánimo, la confianza y la amistad; gracias por creer en mi. A Jorge Borreguero, por todos los momentos compartidos. A mis amigas del alma, Eva Cuevas y Lucía González, no hay palabras de agradecimiento y amor hacia vosotras. A Jose, mi compañero durante tantos años. Por saber seguir caminando juntos. A mis hermanos y mi sobrino, por su apoyo constante. A mis padres que me pusieron en el camino y me enseñaron a vivir. A mi sobrina Carolina, por su cariño incondicional. A mis hijos Jose y Tinsae, el regalo que me ha dado la vida, el motor de todo. Dedicatoria A Jose y Tinsae A mi padre, referente de vida Debes amar la arcilla que va en tus manos, debes amar su arena hasta la locura. Tabla de contenido I. Definiciones y abreviaturas ................................................................. 1 A. Definiciones .......................................................................................... 1 B. Abreviaturas ......................................................................................... 2 III. Antecedentes........................................................................................ 4 A. Microbiota intestinal: composición y desarrollo .................................... 4 1. Composición de la microbiota ................................................................. 6 2. Desarrollo de la microbiota ...................................................................... 8 B. Factores modificadores de la microbiota intestinal ............................... 9 1. Edad ......................................................................................................... 9 2. Dieta ....................................................................................................... 15 3. Modo de parto ....................................................................................... 29 4. Número de convivientes ........................................................................ 31 5. Convivencia con mascotas con pelo ...................................................... 31 6. Asistencia a guardería ............................................................................ 33 7. Duración de la gestación........................................................................ 33 8. Localización geográfica .......................................................................... 35 9. Sexo ....................................................................................................... 36 10. Uso de antibióticos ................................................................................ 37 C. Métodos de estudio de la microbiota ................................................. 40 1. Técnicas cultivo-dependiente ................................................................ 40 2. Técnicas cultivo-independiente.............................................................. 41 3. Técnicas de secuenciación masiva ......................................................... 41 D. Metaboloma intestinal: composición y desarrollo ............................... 42 1. Composición de la metaboloma intestinal ............................................. 43 2. Desarrollo de la metabolómica intestinal ............................................... 49 E. Factores que determinan la metabolómica ......................................... 50 1. Edad ....................................................................................................... 50 2. Dieta ....................................................................................................... 51 3. Modo de parto ....................................................................................... 57 4. Número de convivientes ........................................................................ 57 5. Localización geográfica .......................................................................... 57 6. Sexo ....................................................................................................... 58 7. Uso de antibióticos ................................................................................ 58 F. Métodos de estudio de la metabolómica ............................................ 60 1. Espectrometría de masas ....................................................................... 60 2. Espectrometría por resonancia magnética ............................................ 60 G. Efectos de la microbiota intestinal sobre el huésped .......................... 61 IV. Hipótesis y objetivos ...........................................................................64 V. Metodología de análisis y proceso estadístico de los datos. ................66 1. Tipo de estudio .................................................................................. 66 2. Ámbito de estudio ................................................................................ 66 1. Población diana ...................................................................................... 66 2. Muestra .................................................................................................. 66 3. Criterios de inclusión y exclusión ........................................................... 66 3. Recogida de datos ................................................................................ 67 4. Variables estudiadas, metodología de estudio. ..................................... 68 1. Variables principales............................................................................... 68 2. Variable primaria modificadora de efecto: exposición a antibióticos. ... 70 3. Variables secundarias modificadoras de efecto ..................................... 72 5. Recogida y procesamiento de muestras ................................................ 75 1. Recogida de muestras ............................................................................ 75 2. Procesamiento de microbiota y metabolómica ..................................... 75 3. Análisis estadístico y base de dato ........................................................ 75 VI. Resultados ..........................................................................................78 A. Muestras recogidas y procesadas ....................................................... 78 B. Análisis de las variables modificadoras de efecto secundarias sobre las variables principales .................................................................................. 80 C. Análisis de la antibioterapia sobre la microbiota y metabolómica ....... 101 VII. Discusión .........................................................................................118 VIII. Observaciones y conclusiones ..........................................................134 IX. Aspectos éticos .................................................................................137 X. Limitaciones del estudio ....................................................................138 XI. Bibliografía .......................................................................................139 XII. Anexos ............................................................................................163 Anexo 1. HOJA INFORMATIVA ............................................................... 163 Anexo 2: FORMULARIO DE CONSENTIMIENTO INFORMADO DEL PACIENTE ............................................................................................... 166 Anexo 3: ENCUESTA DE VARIABLES I ..................................................... 167 Anexo 4: ENCUESTA DE VARIABLES II .................................................... 168 Anexo 5: Procesamiento de microbiota y metabolómica ......................... 169 1. Procesamiento de microbiota .............................................................. 169 2. Procesamiento de metabolómica ........................................................ 174 Tabla 29. Valores de p significativos de diferencias en metabolómica entre grupo de muestras no expuestas a ABº, expuestas actualmente a ABº y expuestas previamente a ABº en rango de edad 2. Mediana y rango intercuartílico. ........ 108 Tabla 30. Tabla de contingencia de asociación entre exposición a antibióticos en los últimos 30 días y edad en el análisis de la microbiota. ................................. 110 Tabla 31. Valores de p significativos de diferencias en diversidad y composición de microbiota entre grupo de muestras no expuestas a ABº, expuestas a ABº en los últimos 30 días y expuestas a ABº previa a últimos 30 días en rango de edad 2. Mediana y rango intercuartílico. ......................................................................... 110 Tabla 32. Valores de p significativos de diferencias en diversidad y composición de microbiota entre grupo de muestras no expuestas a ABº, expuestas a ABº en los últimos 30 días y expuestas a ABº previa a últimos 30 días en rango de edad 3. Mediana y rango intercuartílico. ......................................................................... 111 Tabla 33. Tabla de contingencia de asociación entre exposición a antibióticos en los últimos 30 días y edad en el análisis de la metabolómica. ........................... 113 Tabla 34. Valores de p significativos de diferencias en perfil metabolómico entre grupo de muestras no expuestas a ABº, expuestas a ABº en los últimos 30 días y expuestas a ABº previo a últimos 30 días en rango de edad 3. Mediana y rango intercuartílico. ..................................................................................................... 113 Tabla 35. Tabla de contingencia de asociación entre exposición a antibióticos más o menos de 14 días y edad en el análisis de la microbiota. ............................... 115 Tabla 36. Valores de p significativos de diferencias en perfil metabolómico entre grupo de muestras no expuestas a ABº, expuestas a ABº durante menos de 14 días y expuestas a ABº durante más de 14 días en rango de edad 2. Mediana y rango intercuartílico. ..................................................................................................... 115 Tabla 37. Valores de p significativos de diferencias en perfil metabolómico entre grupo de muestras no expuestas a ABº, expuestas a ABº durante menos de 14 días y expuestas a ABº durante más de 14 días en rango de edad 3. Mediana y rango intercuartílico. ..................................................................................................... 116 Resumen Impacto de la antibioterapia sobre la microbiota y metaboloma intestinal en el niño menor de dos años Introducción La microbiota intestinal es un órgano vivo fundamental en el metabolismo y absorción de nutrientes, la resistencia a organismos patógenos, desarrollo y maduración del sistema inmunológico. La actividad metabólica de la microbiota colónica contribuye, por tanto, al estado de salud de su huésped. El proceso de colonización, establecimiento y maduración de la microbiota se extiende hasta la adolescencia, pero es máximo en los dos primeros años de vida periodo en el que muestra gran variabilidad y está afectado por numerosos factores intrínsecos y ambientales. La dieta es, junto a la edad, el factor más determinante en la composición de la microbiota; el modo de parto moldea el establecimiento de la microbiota en las primeras semanas de vida. La exposición a antibióticos supone cambios profundos en la microbiota durante un periodo no bien establecido, su uso se ha relacionado con patologías asociadas al desarrollo inadecuado de la microbiota intestinal. La multifuncionalidad de las poblaciones microbianas intestinales permite cierta resiliencia metabolómica, sin embargo, los factores que modulan la microbiota producen cambios en su metabolómica. Objetivos Describir los posibles cambios producidos por la edad, alimentación con lactancia materna, modo de parto, el sexo y la exposición a antibióticos (actual, en los últimos 30 días y acumulada) sobre la microbiota y metabolómica intestinal en niños menores de 24 meses. Metodología Estudio observacional de niños menores o iguales a 24 meses, reclutados en un hospital de tercer nivel. Se recogieron datos de las variables edad, sexo, modo de parto, alimentación con lactancia materna y exposición a antibioterapia en encuestas realizadas en cada visita. Se recogió muestra de heces y se analizó la microbiota por secuenciación de 16S rARN y la metabolómica por espectrometría por resonancia magnética. Resultados Se recogieron 101 muestras pertenecientes a 30 participantes. Se analizaron 95 muestras para microbiota y 87 muestras para metabolómica. Los lactantes menores de 7 meses presentaron menor alfa diversidad que los lactantes ≥13 - 19 meses (p= 0,001) y lactantes ≥ 19 meses (p 0,004); menor abundancia de Firmicutes que los lactantes ≥ 7 meses (p=0,038) y mayor abundancia de Proteobacterias que los lactantes ≥ 7 meses - 13 meses (p=0,003), los lactantes ≥13 - 19 meses (p<0,001) y lactantes ≥ 19 meses (p=0,001). Se comprobó una relación directa entre la edad y la abundancia de los metabolitos butirato, histidina, metilamina, tiramina, N-metilnicotinamida y uracilo y una relación inversa en la abundancia de los metabolitos, glicina, lactato, succinato, malonato, p-cresol-sulfato y etanol. La lactancia materna produjo mayor abundancia de la familia Lachnospiraceae (p=0,011) y géneros Clostridium XIVa (p=0,026) y Anaerostipes (p=0,017). El parto por cesárea se asoció a mayor riqueza del género Clostridium XIVa (p=0,034). El sexo femenino presentó mayor abundacia del género Clostridium XIVa (p=0,014). La exposición actual a antibióticos se asoció de forma significativa a menor diversidad (p=0,012) y menor abundancia de la familia Lachnospiraceae (p=0,004), géneros Clostridium XIVa (p= 0,009), Anaerostipes (p=0,038), Lachnospiraceae no clasificadas (p=0,021); familia Veillonellaceae (p=0,048), familia Bifidobacteriaceae (p=0,026) y su género Bifidobacterium (p=0,026) en lactantes ≥7- 13 meses. Se observó en este grupo menor abundancia significativa de los metabolitos leucina (p=0,007), isoleucina (p=0,007), valina (p=0,009), tiramina (p=0,013) y p-cresol (p=0,012). La exposición previa a antibióticos más de 14 días se asoció a menor abundancia significativa de Actinobacteria (p=0,010), familia Bifidobacteriaceae (p=0,010) y género Bifidobacterium (p=0,010) en lactantes ≥13-19 meses. Conclusiones En este estudio la microbiota y metabolómica intestinal sufre cambios profundos asociados a la edad, especialmente en los primeros meses de la vida. La exposición a leche materna o fórmula para lactantes, el modo de parto o el sexo produce efectos menores en la microbiota y metabolómica. La exposición a antibióticos induce cambios en la diversidad, composición de la microbiota intestinal y su metabolómica muy acusados durante su uso, este impacto se mantiene parcialmente en los 30 días posteriores, existe un efecto en la composición de la microbiota secundario a la exposición acumulada a antibioterapia. 1 I. Definiciones y abreviaturas Microbioma : hábitat, incluyendo microorganismos (bacterias, arqueas, eucariotas y virus), sus genes y las condiciones ambientales (1). Microbiota : comunidad ecológica de microorganismos comensales, simbióticos y patógenos que comparten el espacio del organismo humano (2). Metabolómica : identificación y caracterización del conjunto de metabolitos presentes en una comunidad (metaboloma) (1). Metagenoma : conjunto de genoma y genes de los miembros de la microbiota. La metagenómica es el proceso de caracterización de la metagenoma (1). Metataxonomía : caracterización por técnicas de alto rendimiento de la composición y cantidad relativa de las diferentes comunidades de una microbiota y su evolución, en función de diferentes variables (1). Biología de sistemas : definición surgida de la aparición de las tecnologías "ómicas" que caracterizan la actividad molecular orgánica a diferentes niveles: la expresión génica (transcriptómica), la expresión de proteínas (proteómica) y la expresión de metabolitos (metabonómica/metabolómica) con el objetivo de integrar la funcionalidad de un sistema biológico. 2 Figura 1. Relación interniveles biológicos Modelo sobre la interacción de transcriptómica proteómica y metabonómica / metabolómica (3) ABº: antibiótico ADN: ácido desoxirribonucleico. ARN: ácido ribonucleico. AACR: aminoácidos de cadena ramificada. AGCC: ácidos grasos de cadena corta. AGCR: ácidos grasos de cadena ramificada. COV: compuestos orgánicos volátiles. DBP: displasia broncopulmonar. dNTPs: deoxinucleótidos. ECN: enterocolitis necrosante. FOS: fructooligosacáridos. GOS: galactooligosacáridos. HMO: oligosacáridos de la leche humana (del inglés human maternal oligossacharides). ADN genómica Homeostásis molecular Proteínas Proteómica genómica Metabolitos metabolómica ARN transcriptómica 3 qPCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. LM: lactancia materna. LPS: lipopolisacáridos. PAMPS: patrones moleculares asociados a patógenos. PCR: reacción en cadena de la polimerasa. OPLS: del inglés ortogonal partial least square UCI-NN: unidad de cuidados intensivos neonatales. UFC: unidades formadoras de colonias. VS: versus 4 III. Antecedentes La microbiota es la comunidad de microorganismos que habitan en la anatomía humana. Formada por 100 trillones de gérmenes con un genoma 100 veces superior al humano (4). Engloba bacterias, hongos, arqueas, virus y parásitos formando un complejo ecosistema que ha evolucionado con su huésped mamífero a lo largo del tiempo (5). El aparato digestivo contiene la mayor población de gérmenes, en el colon existen de 10 a 100 billones de microorganismos pertenecientes a unas 1100 especies más prevalentes; cada individuo porta al menos 160 de estas especies (6), supone aproximadamente 1,5 kg de biomasa. La microbiota intestinal contiene una media de 600000 genes microbianos, la mitad de estos son comunes a la mayoría de individuos existiendo gran variabilidad en el resto (7), se han identificado unas 20.000 funciones biológicas relacionadas que moldean la fisiología humana (6). La microbiota intestinal es fundamental en el metabolismo y absorción de nutrientes, en la resistencia a organismos patógenos y en el desarrollo y maduración del sistema inmunológico del individuo (8). Las alteraciones en el desarrollo y composición de la microbiota están relacionadas con un número creciente de patologías como la enfermedad inflamatoria intestinal, la obesidad, la diabetes, el asma y las alergias (9). La microbiota adulta presenta alta capacidad de resiliencia y estabilidad a lo largo del tiempo (10), recupera su estatus natural original conocido como eubiosis tras los cambios inducidos por factores externos (11). En el niño pequeño, la microbiota muestra un alto grado de dinamismo y variabilidad interpersonal, no alcanzando su madurez hasta los 2-3 años de vida, estableciéndose entonces un patrón que se 5 mantendrá en la edad adulta. Este proceso de colonización, establecimiento y maduración de la microbiota humana en las primeras etapas de la vida se ve afectado por numerosos condicionantes externos que determinan su calidad (12), (Figura 2). El estilo de vida moderno como la vida urbana, dietas ricas en grasas y azúcares, la lactancia con fórmula para lactantes, hábitos de higiene extremos, cesáreas, vacunas o el uso de antibióticos, han llevado a una adaptación excesivamente rápida de la microbiota intestinal junto a una menor estimulación de la inmunidad de mucosas que podría originar un aumento en las enfermedades autoinmunes en el mundo desarrollado (13). Figura 2 Factores que modulan la microbiota del recién nacido y sus efectos Adaptado de (14). ANTECEDENTES NACIMIENTO Modo de parto Antibioterapia CONSECUENCIAS POSTNATAL Ingreso UCI-NN Fórmula vs LM Antibióticos PRENATAL Dieta materna Coriamnionitis Antibióticos CORTO PLAZO ECN Sepsis DBP LARGO PLAZO Asma, alergias Obesidad Autoinmunidad Enfermedad psiquiátrica 12 diversa y con menor abundancia de Lactobacillus (29). Así mismo, la prematuridad conlleva una colonización más lenta, menor diversidad, aumento de bacterias con mayor poder patógeno (Clostridium species, E. coli, Enterococcus, Streptococcus, Klebsiella, Staphylococcus) y mayor diversidad interpersonal que en neonatos nacidos a término (30). 2. Periodo perinatal Tras el parto la microbiota intestinal está caracterizada por una baja diversidad de especies (31). Durante los tres primeros días los filos Proteobacterias y Firmicutes son los más abundantes (32); las bacterias anaerobias facultativas como Escherichia coli y otros miembros de la familia Enterobacteriaceae; Staphylococcus y Streptococcus son los primeros colonizadores intestinales. Estos grupos consumen oxígeno y crean un ambiente anaerobio que permite el crecimiento y reemplazamiento en pocos días por anaerobios estrictos principalmente Actinobacteria (bifidobacterias) y Firmicutes (Lactobacilus y Clostridium) (33). Entre los días 15 y 30, a medida que la ingesta de leche es mayor, aumenta la abundancia de Actinobacteria y de su género Bifidobacterium (34), (Figura 7). Figura 7 Progresión de primeros colonizadores intestinales. Los recién nacidos por vía vaginal presentan una microbiota más diversa, con mayor abundancia de Bifidobacterium y Bacteroides sp. y E. coli y menor de Clostridium difficile que los nacidos por cesárea Ambiente aerobio Consumo de oxígeno Nutrientes (leche) Baja diversidad Anaerobios facultativos (E. coli, Staphilococcus, Streptococcus) Anaerobios estrictos Actinobacteria y Firmicutes Actinobacteria (Bifidobacterium) 13 Durante las primeras semanas, la microbiota del recién nacido se asemeja a la microbiota de vaginal y de la piel de la madre, dominada por familias Enterococcaceae, Streptococcaceae, Lactobacillaceae, Clostridiaceae y Bifidobacteriaceae. El canal del parto posee un ecosistema dominado por Lactobacillus spp y Prevotella spp. que constituyen más del 50% de las bacterias vaginales transferidas de la madre al neonato (35). Este inóculo primario ocupa nichos y guía la adquisición progresiva de otras especies de bacterias comensales reduciendo la colonización de patógenos, incluyendo S. aureus, C. difficile y C. perfrigens (36). La proximidad del ano al canal vaginal juega un papel importante en la transmisión de gérmenes de la madre al neonato. Se ha observado que los niños nacidos por vía vaginal tienen mayor diversidad de colonias y mayor densidad de Bifidobacterium y Bacteroides sp. y E. coli y menor abundancia de Clostridium difficile que los niños nacidos por cesárea en los que abundan gérmenes propios de la piel como Staphylococcus, Corynebacterium y Propionibacterium. Estas diferencias pueden permanecer incluso años después (37). 3. Primer año De forma general, con la introducción de la alimentación complementaria, la diversidad aumenta y se produce un reemplazamiento de los filos Proteobacteria y Actinobacteria por Firmicutes y Bacteroidetes. Entre los 9 y 18 meses, aumenta la abundancia relativa de familias como Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Eubacteriaceae, Rikenellaceae o Sutterellaceae y disminuyen Bifidobacteriaceae, Fase de desarrollo (3-14 meses) Actinobacteria (Bifidobacterium). Fase de transición (15-30 meses) Proteobacteria y Bacteroidetes. Fase de estabilización (> 30 meses) Firmicutes 14 Actinomycetaceae, Veillonellaceae, Enterobacteriaceae, Lactobacillaceae, Enterococcaceae, Clostridiales y Fusobacteriaceae (37). Este periodo podría dividirse en tres etapas marcadas por la dinámica de los filos más abundantes y la alfa diversidad de la microbiota: fase de desarrollo: 3-14 meses, dominado por el filo Actinobacteria y su género Bifidobacterium spp, y una diversidad creciente; fase de transición entre los 15-30 meses en la que los filos Bacteroidetes y Proteobacteria continúan su desarrollo y la diversidad continúa aumentando y fase de estabilización, a partir de los 30 meses, el filo Firmicutes se establece como el más abundante y la diversidad detiene su desarrollo (38). 4. Estabilización de la microbiota A partir de los dos-tres años de vida la progresión de la diversidad se estabiliza y se mantiene más baja que la de los adultos. La microbiota está principalmente representada por Bacteroidetes, Firmicutes y, en menor proporción, Actinobacteria, Proteobacterias y Verrucomicrobia (12). El 60-70% de esta microbiota se mantiene estable a lo largo de la vida. Las tasas de Bacteroidetes y Actinobacteria son mucho más estables que las de Firmicutes y Proteobacterias (39). Entre 1-4 años la microbiota es más rica en Actinobacteria, Bacilli, Ruminococcaceae, Bacteroidetes que la del adulto y más pobre en Clostridium Periodo 1-4 años: mayor riqueza de Actinobacteria, Bacteroidetes, Bacilli y Ruminococcaceae que adultos. Periodo 7-12 años: mayor riqueza de Firmicutes y Actinobacteria que adultos. Periodo 11-18 años: mayor abundancia de Clostridium y Bifidobacterium que adultos. 15 XIVa. Los niños entre 3-4 años aún tiene menor diversidad y mayor abundancia de Bifidobacterium (40) que la de los adultos. Entre los 7 y 12 años se asimila a la adulta, con amplia representación de Firmicutes y Bacteroidetes. Sin embargo, presenta mayor representación de Firmicutes y Actinobacteria, existe, además, mayor riqueza de los taxones Lachnospiraceae, Anaerovorax, Bifidobacterium y Faecalibacterium. La microbiota de los adolescentes (11-18 años) presenta mayor abundancia de los géneros Clostridium y Bifidobacterium que la de los adultos (44,45). No está establecido cuando se completa la maduración de la microbiota. 2. DIETA El perfil de microbiota intestinal de lactantes nacidos a término por vía vaginal y alimentados con lactancia materna exclusiva se ha considerado el estándar de microbiota saludable (43). Ningún factor parece ser tan determinante para el desarrollo de la microbiota como la dieta. La lactancia materna induce una microbiota intestinal “saludable” dominada por Bifidobacterium y Lactobacillus spp., los lactantes alimentados con fórmula presentan una microbiota más diversa con mayor representación de poblaciones patógenas como algunos miembros de la clase Clostridia y de la familia Enterobacteriaceae (44). La composición química de la leche materna influye sobre la composición de la microbiota por su riqueza en HMO que actúan como prebióticos y promueven el crecimiento y proliferación de las Bifidobacterias spp. Se ha observado que los lactantes alimentados con fórmula suplementada con HMO y GOS/FOS presentan niveles más cercanos a los lactantes alimentados con Factor fundamental en el desarrollo y composición de la microbiota 16 leche de madre de Bifidobacterias. Sin embargo, los lactantes alimentados con fórmula no suplementadas presentan hasta un 20% menos de Bifidobacterium (45). Tras la introducción de la alimentación complementaria la diversidad de la microbiota aumenta con un perfil que se acerca cada vez más al del adulto, aumentando las poblaciones de Bacteriodes spp. y Clostridium cluster IV y XIV (46). La microbiota de sociedades que siguen un estilo de alimentación occidental, rico en grasas y proteínas, es más rica en Bacteroides y Actinobacteria, mientras que el enterotipo Prevotella es más común en poblaciones que consumen más fibra (47) (Figura 8). Figura 8 Composición de la microbiota intestinal según alimentación. Feto Recién nacido Lactante Primer año Niño Vaginal: Lactobacillus, Prevotella Cesárea: Staphylococcus, Propionibacterium, Corynebacterium Leche materna: Lactobacillus, Bifidobacterium Lactancia con fórmula no suplementada: Bacteroides Clostridium Alimentos sólidos: carbohidratos complejos Dieta rica en fibra Dieta rica en carne Enterobacteriacea Bifidobacterium Firmicutes Bacteroides Prevotella Modificado de (48). 17 1. Leche materna La leche humana es un fluido biológico complejo que no sólo cumple una función nutricional en el lactante, también ejerce un papel inmunomodulador y confiere cierta protección contra organismos patógenos (49). La función extranutricional del calostro y leche materna se realiza gracias a la presencia de sustancias bioactivas: inmunoglobulinas, ácidos grasos, poliaminas, oligosacáridos, lisozima, lactoferrina, péptidos antimicrobianos que actúan de forma individual o sinérgica como agentes prebióticos (50) y colina que ayuda al desarrollo cerebral. Lejos de ser un compuesto estéril, la leche humana es una de las principales fuentes de bacterias para la microbiota intestinal resultando una fuente de prebióticos y probióticos por su contenido en microrganismos y oligosacáridos (51). Con una ingesta media de 800 ml diarios, un lactante consume entre 104 y 108 UFC, produciéndose una transferencia de bacterias al intestino del lactante (52), siendo la segunda gran fuente de microrganismos tras el canal del parto (53). La leche humana contiene además oligosacáridos HMO, que representan su tercer componente sólido y actúa como prebiótico. Dada su compleja estructura los HMOs no son digeribles por el lactante, pero sí por las enzimas hidrolíticas de la microbiota intestinal (54). Los HMOs potencian el crecimiento de determinadas poblaciones de bacterias de la microbiota intestinal del lactante aumentando su diversidad (efecto bifidogénico) (55). Función nutricional y función extranutricional. Contiene prebióticos y microbiota, siendo la segunda fuente de colonizadores intestinales tras el canal del parto. 18 (1) COMPOSICIÓN BACTERIANA DE LA LECHE HUMANA La composición de la microbiota de la leche materna es muy diferente de la observada en otras mucosas, incluida la piel, el intestino, la boca o la vagina (56). Se han identificado organismos típicamente asociados a la microbiota de la piel (Staphylococcus y Streptococcus) y a la microbiota entérica (Escherichia, Enterococcus, Veillonella, Prevotella, Pseudomonas, Clostridium) (57). Los géneros más comúnmente aislados en el calostro incluyen lactobacilos (Leuconostoc, Weissella, Lactococcus), Staphylococcus y Streptococcus; posteriormente se produce un incremento significativo de Veillonella, Prevotella y Leptotrichia (56) así como de Bifidobacterium spp. y Enterococcus spp. (58). Existen diferentes factores que modifican la composición bacteriana de la leche dependientes de la madre y otros postnatales (57) (Tabla 1). La duración de la gestación modifica la microbiota de la leche humana, particularmente la abundancia de Bifidobacterium spp. es más alta en la leche de madres con gestaciones a término. El parto por cesárea altera también la microbiota de la leche con una diversidad más alta pero menor abundancia de bifidobacterias (61, 62). Las madres obesas presentan mayor concentración de bacterias sobre todo de estafilococos spp. y lactobacilos, pero un menor número de bifidobacterias (60). La leche humana contiene un core de microrganismos compartido que supone aproximadamente el 50% de su microbiota. Existen factores dependientes de la madre y del ambiente que modifican la composición microbiana. 19 Tabla 1 Factores modificadores de la microbiota de la leche materna. Factores maternos Factores postnatales Obesidad Atopia Dieta Estado inmunológico Modo de parto Edad gestacional Uso materno de antibióticos Estadio de la lactancia Fuente (57). A pesar de su complejidad, la leche materna comparte un core de microrganismos. Diferentes estudios han analizado las poblaciones predominantes en ese core bacteriano presentes en todas las muestras analizadas (Tabla 2), aunque con una amplia variabilidad en su abundancia relativa. Las diferencias halladas pueden ser debidas en parte a la técnica de caracterización. Este core representa aproximadamente la mitad de la comunidad bacteriana observada. La estabilidad contrasta con la microbiota intestinal o vaginal en la que no existen grupos bacterianos altamente abundantes compartidos por todos los individuos (47,64,65,66). Tabla 2 Composición de la microbiota de la leche materna. Filo Géneros Firmicutes Streptococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Enterococcus Bacteroidetes Flavobacterium Proteobacteria Serratia, Pseudomonas, Ralstonia, Sphingomonas, Bradyrhizobiaceae, Burkholderia, Enterobacter, …. Actinobacteria Bifidobacterium, Rothia, Propionibacterium Corynebacteria Fuentes (47,64,65,66). 20 (2) ESTABLECIMIENTO Y EVOLUCIÓN DE LA MICROBIOTA DE LA LECHE HUMANA La microbiota mamaria se modifica durante la gestación y lactancia. Su desarrollo se inicia en el tercer trimestre de gestación, alcanza su máxima complejidad al final de la gestación, con una alta diversidad de organismos típicos de la piel y de origen entérico en el calostro, evolucionando hacia una menor diversidad de la microbiota a medida que la lactancia progresa con una microbiota rica en gérmenes de la piel y de la boca del lactante, finalmente se produce su involución cuando no hay leche en la glándula mamaria y el proceso de apoptosis comienza (64). El origen de las bacterias presentes en la leche materna es múltiple. El flujo retrógrado que ocurre durante la succión desde la boca del lactante hacia los conductos mamarios (68,69) supone una ruta de intercambio de bacterias. Parece existir también una vía de colonización entero-mamaria a través de interacciones entre las células epiteliales, inmunológicas y la microbiota intestinal materna (67), (68). La microbiota de la piel también contribuye a la composición de la microbiota de la leche, esto podría explicar la predominancia de Staphylococcus spp. (S. epidermidis) y Streptococcus spp. (S. salivarius), comensales típicos de la piel (69) y cavidad oral respectivamente. Los Lactobacillus spp. de la leche materna podrían ser transferidos también desde la boca del neonato colonizada durante el parto a partir de la microbiota vaginal (44). Iniciada en tercer mes de gestación. Originada a partir de la microbiota bucal del neonato, microbiota intestinal materna y microbiota de la piel de la madre. 21 (3) OLIGOSACÁRIDOS DE LA LECHE MATERNA Los HMO de la leche materna son un grupo de azúcares complejos no conjugados formados por galactosa, glucosa, N-acetilglucosamina, fucosa y ácido siálico (70). Tienen un papel fundamental en la composición y modelado de la microbiota intestinal del lactante (Figura 9). Numerosos estudios han demostrado que la leche humana contiene una concentración mayor de HMOs, así como una diversidad estructural más alta con un grado de fucosilación mayor que los oligosacáridos de leche de otras especies, particularmente la bovina usada para la producción de las fórmulas para lactantes (71). Los HMOs constituyen el tercer componente más abundante de la leche tras la lactosa y los lípidos. La leche humana contiene 5 - 23 g/L de oligosacáridos (~20-25 g/L en el calostro; 5 – 15 g/L en la leche madura) con más 200 tipos estructuralmente diferentes (72). Los HMO son resistentes al pH ácido del estómago, a la degradación pancreática y a las enzimas del borde en cepillo intestinal por lo que la mayoría (>90%) alcanzan el colon (73), donde sirven de substrato para el crecimiento de determinadas subpoblaciones bacterianas. Muy pocas bacterias son capaces de digerir todos los tipos de HMO, en general, es necesario la asociación de diferentes grupos de bacterias especializadas en digerir un tipo u otro de HMO. En otras ocasiones cada grupo bacteriano realiza un paso dentro de la digestión completa del HMO creando “banquetes comunitarios” para diferentes grupos bacterianos que actúan de forma sinérgica (74). Es decir, el perfil de HMO de la leche materna, define el tipo de microbiota intestinal del lactante. Los géneros bacterianos predominantes de esta microbiota, Bifidobacterium y Bacteroides spp., poseen el repertorio genético necesario para el metabolismo de un amplio rango de HMOs. Por otra parte, el metabolismo de Papel fundamental en composición de la microbiota intestinal. Tercer componente más abundante de la leche tras lactosa y lípidos. 28 (2) MICROBIOTA Y PROTEÍNAS DE LA DIETA Un 10% de las proteínas ingeridas llegan al colon. La microbiota intestinal actúa en la digestión, absorción y transformación de las proteínas en el tracto intestinal. Los microorganismos con actividad proteolítica son Bacteroides, Propionibacterium, Streptococcus, Fusobacterium, Clostridium y Lactobacillus (88). El origen proteico, su concentración y el balance de aminoácidos de la dieta moldean la composición, estructura y función de la microbiota intestinal. La proteínas de origen vegetal son menos digeribles que las animales por la pared celular de las plantas, pero tienen un papel beneficioso sobre la composición microbiana aumentando su diversidad y la abundancia relativa de Bifidobacterium y reduciendo la de Clostridium perfringens (89). La concentración proteica de la dieta es otro factor que perfila la composición microbiana (90). Una alta concentración lleva al desarrollo de gérmenes patógenos, mientras que, dietas con baja concentración de proteínas inducen microbiotas con menor abundancia relativa de E. coli. Sin embargo, cuando la concentración de proteínas es excesivamente baja para los requerimientos del huésped también se produce un sobrecrecimiento de gérmenes patógenos (91). Otro factor que determina el procesamiento proteico es el balance de aminoácidos, las proteínas de alta calidad normalmente son muy digeribles gracias a su composición de aminoácidos. Además, los diferentes aminoácidos perfilan la composición de la microbiota intestinal (92). Los aminoácidos son transformados en numerosos metabolitos microbianos: AGCCs, ácidos grasos de cadena ramificada (isobutirato, isovalerato, 2- metilbutirato), componentes fenoles (fenilpropionato, fenilacetato, p-cresol, indolpropionato, indol-acetato), aminas, sulfuros y amonios que forman parte de vías metabólicas fisiológicas o patológicas (93). 29 (3) MICROBIOTA Y LÍPIDOS DE LA DIETA Las grasas de la dieta son absorbidas por el intestino delgado pero un 7% son excretadas en las heces (94). Las dietas ricas en grasas inducen un sobrecrecimiento de bacterias bilis-tolerantes que incluyen géneros del filo Bacteroidetes: Alistipes y Bacteroides, y Bilophila. Se produce una reducción de bacterias sacarolíticas como Roseburia, Eubacterium y Ruminococcus (95). Diversos estudios han concluido que el exceso de grasa en la dieta produce una reducción de la riqueza y diversidad de la microbiota. Sin embargo, los cambios producidos dependen de la cantidad y del tipo de grasa; así, los ácidos grasos polinsaturados no ejercen este papel negativo sobre la microbiota (96). El aceite de palma incrementa el cociente Firmicutes/Bacteroidetes y la abundancia de los Clostridium clusters XI, XVII y XVIII y reduce la diversidad de la microbiota, sin embargo los aceites de oliva o girasol no tienen este impacto. La ingesta de ácido linoleico, ácido graso esencial omega-6, o los polifenoles amortigua los efectos negativos de la dieta alta en grasas (97). Una ingesta de 4 gr/día de omega-3 durante 8 semanas indujo una mayor abundancia relativa de Bifidobacterium, Roseburia y Lactobacillus (98). En dietas cetogénicas se ha observado menor diversidad, menor abundancia relativa de Firmicutes y mayor de Bacteroidetes (99). 3. MODO DE PARTO El modo de parto es el factor más importante en el establecimiento de la microbiota en las primeras semanas de vida (100). El parto vaginal expone al neonato a un gran número de gérmenes cuando pasan por el canal del parto estimulando el asentamiento de una microbiota intestinal similar a la microbiota Factor más importante de colonización en primeras semanas. 30 vaginal materna (Prevotella, Sneathia, Lactobacillus spp.). Los neonatos nacidos por cesárea son expuesto a un ambiente más estéril, con una microbiota más parecida a la microbiota de la piel de la madre (Propionibacterium, Corynebacterium, Staphylococcus spp.) (101,102). La microbiota asociada al parto vaginal es más diversa que la asociada a cesárea. El parto vaginal se asocia a una mayor abundancia de Bifidobacterium, un filo Bacteroidetes más diverso, con mayor abundancia de Bacteroides. En el filo Firmicutes parece existir mayor abundancia de Lactobacillus en etapas precoces (103), la tabla 4 expresa las diferencias referidas. Tabla 4 Diferencias de microbiota intestinal asociada a modo de parto. Parto vaginal Cesárea Alfa diversidad Bifidobacterium Bacteroides Lactobacillus Propionibacterium Corynebacterium Staphylococcus spp • Cambios atenuados con la edad • Probable relación con uso de antibióticos y menor tasa de lactancia materna Existen datos contradictorios en cuanto a la duración de los cambios producidos en la microbiota por el tipo de parto; existen estudios que no encuentran diferencias a partir de los 6 meses y otros estudios que encuentran diferencias incluso a los 7 años de vida (104). Se han descrito dos factores que podrían contribuir a las diferencias de microbiota intestinal según el tipo de parto. Así, la menor abundancia de Bifidobacteria y Bacteroides y mayor concentración de Clostridios y Lactobacilos en lactantes nacidos por cesárea podría estar determinado en parte por el uso de antibióticos que es más probable en madres sometidas a cesárea (105). Sumado a esto, el parto por cesárea reduce la probabilidad de lactancia materna en las primeras horas de vida y su mantenimiento a largo plazo factor determinante en el perfil del establecimiento de la microbiota intestinal. 31 4. NÚMERO DE CONVIVIENTES El número de hermanos mayores guarda una relación lineal con la abundancia relativa de Bifidobacterium, habiéndose reportado un aumento de casi un 4% más de abundancia de este género con cada incremento en el número de hermanos mayores (106), también se ha documentado un aumento de Lactobacillus, Bacteroides y Staphylococcus aureus (113,114,115), además, existe una colonización retrasada de especies de Clostridium respecto a primogénitos (110). De forma inversa el número de Enterobactericeae (106) y de Clostridium (107) parece disminuir con el número de hermanos mayores. La tabla 5 resume las diferencias. Tabla 5 Taxones principales asociados a convivientes. Convivencia hermanos No convivencia con hermanos Bifidobacterium Lactobacillus Bacteroides Enterobacteriaceae Clostridium Lane et al. encontraron una relación entre la estructura doméstica de lactantes alimentados con lactancia materna y la composición de la microbiota intestinal, sugiriendo que un número mayor de convivientes facilita la transmisión de bacterias por el medio y por contacto físico (108). 5. CONVIVENCIA CON MASCOTAS CON PELO Diversos estudios describen una relación inversa entre la exposición a mascotas en los primeros años de vida y el desarrollo de alergia (111,112). Existe evidencia que demuestra que esta asociación podría estar mediada por los cambios que la convivencia con animales produce sobre la microbiota intestinal. La convivencia con animales domésticos parece moldear la microbiota intestinal de los lactantes con los que cohabitan creando un ambiente más saludable y tolerogénico (113) (Figura 12). Existen estudios que han reportado mayor riqueza 32 y diversidad en la microbiota intestinal de los lactantes convivientes en periodo prenatal o postnatal con mascotas de pelo (111). La transmisión de los microorganismos podría ocurrir a través de contacto directo o por reservorios intermedios en el ambiente doméstico (polvo doméstico o microbiota materna) (114). Se ha observado que la incorporación de un perro a una casa lleva a la introducción de nuevos gérmenes rápidamente detectables en el polvo doméstico alcanzando una alta abundancia relativa durante el primer año de convivencia (115). Existe una riqueza significativamente mayor de familias del filo Firmicutes como Clostridiaceae (Peptostreptococcaceae), Lachnospiraceae (Coprococcus), Veillonellaceae (especialmente en convivencia con perros) y Ruminococcaceae. De ésta última los géneros Ruminococcus y Oscillospira son más abundantes en lactantes expuestos de forma pre o postnatal, independientemente de otros factores como el tipo de parto (116). Se ha observado una menor representación de Bifidobacterium (especialmente convivencia con gatos), específicamente B. breve (111). Se ha documentado una mayor abundancia de dos bifidobacterias específicas de mascotas con pelo (B. pseudolongum y B. thermophilum) en lactantes convivientes de mascotas (113). Figura 12 Efecto de la convivencia con mascotas de pelo sobre la microbiota. Extraído y adaptado de (111). Mascotas Clostridiaceae Veillonellaceae Coprococcus Bifidobacteriaceae Eggerthella Riqueza Diversidad 33 6. ASISTENCIA A GUARDERÍA La asistencia a guardería supone una exposición de los niños menores de 3 años a un gran número de iguales durante periodos diarios más o menos prolongados. Se han publicado estudios que apoyan diferencias en la composición de la microbiota de niños cuidados en casa frente a niños que asisten a guardería. Éstos parecen tener una microbiota intestinal rica en taxones propios de una microbiota más madura. Las familias Bifidobacteriaceae, Lactobacillaceae, ambas propias de microbiota más inmadura; y Staphylococcaceae y Pasteurellaceae, resultaron más abundante en el grupo de niños cuidados en casa frente a una mayor abundancia de Prevotellaceae, Lachnospiraceae y Ruminococcaceae en niños que acudían a guardería (117). Mortensen et al. también demostró una mayor madurez y resiliencia de la microbiota intestinal de niños que acuden a guardería (118). 7. DURACIÓN DE LA GESTACIÓN Los recién nacidos pretérminos presentan una colonización bacteriana intestinal retrasada respecto al neonato a término con menor riqueza, menor diversidad y abundancia de especies (119). Dogra et al. observaron que la prematuridad, incluso con diferencias de una semana, conduce a un decalaje en la adquisición de patrones de microbiota propia de lactantes a término (22). A los pocos días de vida existe un crecimiento bacteriano rápido alcanzando niveles significativamente más altos de bacterias que en neonatos a término a partir del décimo día de vida (43). La colonización se produce por bacterias anaerobias facultativas con mayor potencial patogénico (Enterobacter, Escherichia, Klebsiella) en lugar de los gérmenes comensales anaerobios estrictos propios del recién Microbiota más madura y resiliente en niños que acuden a guardería que en niños cuidados en su domicilio. 34 nacido a término (Bifidobacterium, Bacteroides y Clostridium), este patrón se mantiene durante los primeros tres meses de vida (43). Además, existe una colonización tardía de Bifidobacterium con una mayor prevalencia de Staphylococcus, Enterococcaceae y otras bacterias ácido lácticas como Lactobacillus y Weisella (120). El patrón de sustitución de poblaciones en el lactante pretérmino pasa de comunidades de Bacillus a Gammaproteobacterias y a Clostridium sucesivamente (14). En el neonato pretérmino la composición global de la microbiota intestinal está fuertemente asociada con la edad gestacional. Según ésta, los grupos bacterianos que se suceden son Staphylococcus (pico de abundancia entre semana 25 y 30), Enterococcus (semana gestacional 30 a 35), Enterobacter (semana 35) y, finalmente, Bifidobacterium (semana 36) representado en la figura 13. La progresión es similar a la del lactante a término si se comparan según semanas gestacionales, incluso parece haber una progresión más rápida hacia la colonización por Bifidobacterium que en el nacido a término (a partir de la semana 36) (18). Figura 13 Taxones más abundantes según edad gestacional del prematuro. Staphylococcus semana 25-30 Enterococcus semana 30-35 Enterobacter semana 35 Bifidobacterium semana 36 35 La edad postgestacional es el determinante principal en la microbiota intestinal del neonato prematuro. Diferentes factores postnatales tienen un impacto en el desarrollo de esta microbiota reflejadas en tabla 6. Tabla 6 Factores modificadores de la microbiota del prematuro. Exposición precoz a microorganismos Mayor incidencia de cesáreas Exposición a ambiente hospitalario Antibioterapia de amplio espectro Retraso en inicio de alimentación Ayunas Alimentación con fórmula para lactantes Los cambios producidos por el parto por cesárea, que conlleva una menor abundancia de Bifidobacteria, Bacteroides y Lactobacilos y mayor presencia de Streptococcus y Staphylococcus, tienen un mayor impacto en los neonatos prematuros (121). La administración de antibióticos contribuye a un sobrecrecimiento de Proteobacterias y Enterococcus con menor abundancia de Bifidobacterias y Lactobacillus (122). Finalmente, la alimentación con leche de madre aumenta la abundancia de Bifidobacteria en la microbiota del prematuro y constituye una de las herramientas usadas actualmente para favorecer el restablecimiento de una microbiota sana en esta población. 8. LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA Los factores ambientales más que los genéticos son los responsables de las diferencias existentes en la composición de la microbiota de poblaciones geográficamente separadas (123). Yatsunenko et al. analizó la microbiota intestinal de 531 individuos sanos habitantes de aldeas del Amazonas (Venezuela), de Malawi Los factores culturales, más que biológicos marcan las diferencias entre la microbiota intestinal de las diferentes poblaciones. 36 y de grandes metrópolis de Estados Unidos. Ellos encontraron marcadas diferencias en la composición y funcionalidad de la microbiota entre los residentes en USA comparado con los otros dos países tanto en la infancia como en la edad adulta. Estos cambios son debidos fundamentalmente al tipo de dieta de las diferentes poblaciones: dieta rica en proteínas en Estados Unidos frente a dietas basadas en cereales propias de los habitantes del Amazonas o Malawi (87). Existen, además, estudios donde se relacionan diferencias puramente geográficas, altitud, con cambios en la diversidad y composición de la microbiota intestinal. Así, se ha descrito mayor riqueza y diversidad en la microbiota intestinal de personas que viven en regiones más altas, mayor abundancia de Faecalibacterium y de bacterias anaerobias estrictas como Bifidobacterium (124). 9. SEXO Existen pocos datos sobre el impacto que puede tener el género sobre la composición de la microbiota en los primeros meses de vida. Martin et al. observaron mayor abundancia bacteriana en las primeras heces de niños comparado con niñas, así como una mayor abundancia significativa de Lactobacillus ruminis, L. gasseri y L. reuteri en el periodo neonatal en niñas (46). En edades precoces las niñas presentan mayor abundancia de Firmicutes y menor de Bacteroidetes, con mayor presencia de las familias Lactobacillus y Bifidobacterium (125). En niños existen cambios sutiles en la microbiota intestinal con mayor abundancia de Firmicutes, de las familias Lactobacillus y Bifidobacterium y menor de Bacteroidetes en niñas. 37 En la población adulta se ha sugerido una interrelación entre el sistema endocrino y la microbiota intestinal basado en las diferencias existentes en el perfil de ácidos grasos o en el sistema inmunológico entre ambos sexos. El término “microgenderoma” hace referencia al papel de la microbiota en las diferencias de género observada en algunas patologías (126). 10. USO DE ANTIBIÓTICOS El impacto de la administración de antibióticos sobre la microbiota en desarrollo del lactante puede producir un efecto profundo a largo plazo al alterar el desarrollo metabólico e inmunológico del niño (127). Se ha descrito un incremento en la incidencia alergias , asma (128), trastornos funcionales digestivos (cólicos del lactante, dolor abdominal recurrente, colon irritable), enfermedad inflamatoria intestinal, celiaquía, obesidad (129) y patología mental o neurocognitiva (130), artritis idiopática juvenil (131) o diabetes mellitus tipo 1 (132) asociados a la administración de antibióticos durante los primeros años de vida. En general, la microbiota resiliente del adulto recupera su estado basal funcional días o semanas después de un ciclo antibiótico, sin embargo, algunos filos alterados no se recuperan incluso meses después del tratamiento y, en general, se observa una disminución de la diversidad microbiana mantenida largo tiempo (133). 1. Cambios producidos sobre la diversidad de la microbiota La riqueza y diversidad (alfa y beta diversidad) de la microbiota intestinal se ve afectada por el uso de antibióticos. Ambos parámetros se reducen durante su uso, aunque no está definido la duración de esta perturbación (142,143). 44 producción de metabolitos está condicionada por la dieta y características intrínsecas del individuo. Estos metabolitos son sintetizados a partir de: (i) nutrientes no digeridos y absorbidos en el tracto digestivo superior, (ii) transformación de metabolitos sintetizados por el huésped en la luz intestinal, (iii) metabolitos de células epiteliales intestinales y (iv) metabolitos sintetizados de novo (148), por tanto, la metabolómica intestinal de un individuo está formada por una amplia variedad de moléculas (pequeñas y grandes) moldeada por factores internos y externos como factores genéticos, dieta, microbiota o estilo de vida. La base de datos de metabolómica fecal humana (HFMDB) contiene unos 2000 metabolitos fecales identificados actualmente (6000 incluyendo los isómeros de metabolitos, principalmente lípidos) que abarcan la mayoría de clases de metabolitos conocidos. Está compuesta básicamente de ácidos grasos de cadena corta, media y ramificada (AGCC, AGCM y AGCR), aminoácidos y derivados, aminas biogénicas, gases (CO2, CH4), alcoholes, fenoles y polifenoles derivados, indoles y sulfuros (149) (Tabla 8). Algunos de los metabolitos producidos por la microbiota intestinal son moléculas bioactivas como los AGCC, las N-acil-amidas derivadas de los lípidos y otros productos derivados de aminoácidos y ácidos biliares primarios (Figura 17). Estas moléculas bioactivas interactúan con el huésped a través de receptores hormonales y parecen estar involucradas en la prevención de patología cardiovascular, diabetes, enfermedad inflamatoria intestinal o el autismo (150). 45 Tabla 8 Metabolitos más comunes de la metaboloma fecal. Origen Metabolitos generados Carbohidratos AGCC (acetato, propionato, butirato, valerato), AGCR (iso-butirato, isovalerato), gases (CO2 y CH4), oligómeros (disacáridos, oligosacáridos), ácidos orgánicos (succinato, lactato), metanol, etanol Proteínas AGCC (acetato, propionato, butirato, valerato), AGCR (iso-butirato, isovalerato), gases (CO2 y CH4), aminas biogénicas, aminoácidos, fenoles, p-cresoles, índoles, gases (CO2, H2S, NH4 y CH4) Lípidos Ácidos grasos conjugados, acilgliceroles, esfingomielina, colesterol, fosfatidilcolinas, fosfoetanolaminas, triglicéridos Colinas Metilamina, dimetilamina, trimetilamina (TMA) Pared cellular bacteriana Lipopolisacárido A, peptidoglicano, esfingomielina, fosfoetanolamina Ácidos biliares Colato, hiocolato, deoxicolato, quenodesoxicolato, alfa/beta/muricolato, taurocolato, etc Vitaminas Vitamina K, B12, biotina, folato, tiamine, riboflavina, piridoxina Polifenoles Ácido hidroxifenil-propiónico, pirocatecol, enterodiol, etc. Poliaminas Putrescina, cadaverina, espermidina Compuestos orgánicos volátiles Aldehídos, cetonas, alcanos, benzenoides, organosulfuros, etc Endocannabinoides N-palmitoiletanolamina, 2-araquidonoilglicerol, N-oleoiletanolamina Compuestos N- acetilo N-acetiltriptófano, N-acetilcisteína, N-acetilglucosamina Otros Ácido g-aminobutírico (GABA), exopolisacáridos, fenólico, benzoil y fenil derivados, hormonas. Modificado de (151) Ácidos grasos de cadena corta Los AGCC son la expresión de la relación simbiótica entre microbiota y huésped. Son los metabolitos fecales más abundantes, producidos por la fermentación bacteriana de carbohidratos no digeribles (almidones resistentes y fibras de la dieta) y, en menor proporción, de aminoácidos y ácido láctico (152). Otra fuente de producción de AGCC es la capa mucosa colónica externa. Los principales AGCC son el ácido acético (36 +/- 17 μmol/g heces húmedas), ácido propiónico (11 +/- 5 μmol/g heces húmedas) y el ácido butírico (6 +/- 3 μmol/g heces húmedas) que 46 constituyen el 95% de los AGCC, manteniendo esta relación 3:1:1 (153). El ácido valérico está presente en concentraciones ligeramente menores (154). El butirato es la principal fuente de energía de los colonocitos. El acetato es el AGCC más abundante a nivel local y en la circulación sistémica. Afecta, además, a la acumulación de grasa y el apetito. El propionato es usado como substrato para la gluconeogenesis y la lipogenesis en hígado y tejidos periféricos (155) (Tabla 9). La fermentación proteica produce una pequeña porción de AGCC, incluyendo acetato, propionato, butirato y AGCC ramificados. Los AGCC ramificados son el ácido isobutírico y ácido isovalérico, son minoritarios, 5% del total, y derivan principalmente de AACR (valina, leucina e isoleucina). Tabla 9 Tipos y funciones de ácidos grasos de cadena corta. Ácido graso de cadena corta Funciones 95% de AGCC 3/1/1 Acetato Acumulación de grasa y apetito Butirato Fuente de energía de colonocito Propionato Substrato gluconeogénesis y lipogénesis Valerato 5% AGCC ramificados Isobutirato, isovalerato Metabolismo proteico Aminoácidos de cadena ramificada. Las dietas ricas en proteínas producen una metaboloma intestinal con mayor proporción de AACR y AGCR (156). Los más abundantes son valina, isoleucina y leucina. Son aminoácidos esenciales sintetizados por plantas, hongos y bacterias, especialmente por algunos miembros de la microbiota intestinal. La microbiota intestinal produce AACR a través de rutas metabólicas conservadas presentes en hongos y plantas, pero ausentes en mamíferos; también suponen nutrientes importantes en la fisiología bacteriana asegurando múltiples funciones, por tanto, Aminoácidos esenciales sintetizados por plantas, hongos y bacterias, especialmente por algunos miembros de la microbiota intestinal 47 la microbiota intestinal juega un papel fundamental en la homeostasis de los niveles plasmáticos de AACR (157). Los AACR contribuyen a la homeostasis de metabolismo humano regulando la síntesis de proteínas, glucosa y lípidos. Además, ayudan al control de la termogénesis en el tejido adiposo pardo, son inmunomoduladores y estimulan la proliferación de los hepatocitos. Por otro lado, niveles plasmáticos elevados se han reaccionado con aumento de resistencia a la insulina (158). Polifenoles Son compuestos vegetales procedentes de frutas, cereales, té, café o vino. Presentan estructuras muy diversas y se agrupan en varias familias: flavonoides, lignanos, ligninas, cumarinas y estilbenos. Debido a su alto peso molecular y su complejidad, solo el 10% de los polifenoles son metabolizados y absorbidos en los tramos proximales intestinales, el 90% restante es metabolizado por la microbiota que incrementa su biodisponibilidad. Los polifenoles tienen propiedades antiinflamatorias, antioxidantes y antimicrobianas con efectos beneficiosos sobre la enfermedad cardiovascular, el cáncer, la enfermedad metabólica, Alzheimer y la enfermedad inflamatoria intestinal (159). Compuestos orgánicos volátiles La metaboloma fecal es particularmente rica en COV, representan el 20% de los 1890 compuestos identificados. En personas sanas hay más de 20 COV fecales ubicuos, que incluyen etanol, AGCC, compuestos sulfurados, cetonas y aldehídos, metilos de furano y fenol (160). 48 Lípidos Metabolitos fecales menos abundantes, los más abundantes son las fosfatidilcolinas (0.02 +/- 0.01 nmol/g heces húmedas) y las acilcarnitinas (161). Ácidos biliares secundarios Producidos por el metabolismo de los ácidos biliares primarios (ácido quenodeoxicólico y ácido cólico) que escapan del circuito enterohepático y pasan al colon y sufren diversas modificaciones por las enzimas de la microbiota intestinal obteniendo ácido tauroursodeoxicólico (0.30 +/- 0.37 nmol/gr de heces húmedas) y litocoliltaurina (0.51 +/- 0.40 nmol/gr de heces húmedas) y el ácido deoxicólico con propiedades antiinflamatorias (162). Lipopolisacáridos/patrones moleculares asociados a patógenos Los lipopolisacáridos son el prototipo de los patrones moleculares asociados a patógenos, potentes moléculas derivadas de bacterias que inducen inflamación sistémica. El lipopolisacárido es una endotoxina que forma parte de la membrana celular de los Gram-negativos. Endocannabinoides Moléculas lipídicas del grupo de los terpenofenoles. Producida en el organismo por metabolismo de membranas celulares y el metabolismo lipídico provenientes de fitoestructuras el cannabis. 49 Figura 17 Moléculas y metabolitos producidos por la microbiota intestinal. Modificado de (163). 2. DESARROLLO DE LA METABOLÓMICA INTESTINAL La metabolómica intestinal depende, en líneas generales, de la composición de la microbiota y está modulada fundamentalmente por la dieta y otros factores ambientales (163) (Figura 18). Es importante destacar que no se puede establecer una relación directa entre abundancia de géneros bacterianos y riqueza de metabolitos intestinales dada la multifuncionalidad y relaciones cruzadas metabólicas de los diferentes grupos bacterianos. La redundancia funcional es el Toxinas LPS PAMPs Indol Triptófano Mediadores inmunomoduladores Esfingolípidos Muropéptdos Componentes bioactivos Enterosinas Endocannabinoides Ác. biliares primarios Ác. biliares secundarios Hidratos de carbono Aminoácidos Fitatos, mucus AGCC AGCR Degradación aminoácidos Metabolismo ác. biliares Fermentación No existe una relación directa entre metabolómica y composición de la microbiota debido a la redundancia funcional de las poblaciones bacterianas 50 fenómeno por el que diferentes especies representan grupos taxonómicos que desempañan funciones similares que permiten la resiliencia del ecosistema. Existen estudios que establecen una mayor relación entre microbiota y metabolómica intestinal en los primeros meses de vida debido, en parte, a una dieta más simple (164). 1. EDAD El perfil metabólico fecal neonatal contiene menor número de metabolitos y menor concentración de los existentes que a edades más maduras. Las heces neonatales contienen menor concentración de VOCs, metabolitos sulfurados o compuestos aromáticos derivados del metabolismo de los aminoácidos, o AGCC derivados del metabolismo de polisacáridos (160). En los dos primeros días de vida el metabolismo de los primeros pobladores es bajo. Parece existir alto metabolismo proteico, con presencia de aminoácidos libres y ramificados y bajos niveles de acetato y butirato asociado a algunas familias de Proteobacterias y bajos niveles de Bifidobacterium. Posteriormente se inicia el metabolismo acetogénico correlacionado con el aumento de la familia Clostridium (32). El metabolismo de los AGCC es dinámico con muchas diferencias interindividuos, aunque parece seguir un patrón. La concentración de acetato aumenta hasta el sexto mes de vida estabilizándose posteriormente. En cambio, propionato y butirato presentan baja abundancia hasta los meses 8 y 10 respectivamente. La abundancia de los metabolitos intermedios succinato, lactato y formiato es alta durante los primeros meses de vida hasta el primer año descendiendo posteriormente (165). Los ácidos grasos de cadena ramificada (isobutirato, isovalerato) están presentes en concentraciones muy bajas hasta el 9 mes (155). 51 A los 12 meses, la metabolómica intestinal es más compleja con vías de degradación de hidratos de carbono complejos asociada a mayor abundancia de Bacteroides y vías relacionadas con la síntesis de vitaminas y xenobióticos en respuesta a la mayor diversidad en la dieta (12), Figura 18. Figura 18 Evolución de la metabolómica intestinal durante el primer año. 2. DIETA En un individuo sano la proporción de grasas, hidratos de carbono y proteínas que alcanza el colon es mínima. En general, los productos de la dieta en esta zona son fibra, almidones resistentes, una pequeña cantidad de hidratos de carbono simples, algunas proteínas, grasas y ácidos biliares liberados en el intestino delgado. Los productos terminales de la digestión de estos nutrientes tienen efectos positivos (AGCC) o negativos (trietilamina, amonio, sulfuro de hidrógeno) sobre el huésped (82). La figura 19 representa, de manera general, las funciones metabólicas más relevantes y las poblaciones bacterianas implicadas. Nacimiento metabolómica pobre Alto metabolismo proteico Baja producción de AGCC Aumento de AGCC 12 meses metabolómica compleja 52 Figura 19 Géneros microbianos y funciones metabólicas. Modificado de (93). Leche materna Se han reportado diferencias en la metabolómica intestinal de lactantes alimentados con leche materna o fórmula para lactantes. La leche materna conduce a una menor abundancia de AGCC (propionato, butirato, isobutirato, valerato e isovalerato), mayor abundancia en oligosacáridos fucosilados y de metabolitos intermedios (lactato y succinato); la metabolómica intestinal de niños alimentados con fórmula es más rica en productos de degradación de proteínas como AGCC y AACR, estos además presentan mayor abundancia de aminoácidos libres (166). Los niveles de propionato y butirato cambian en niños alimentados con lactancia materna, pero se mantienen estables en los alimentados con fórmula. Fermentación de aminoácidos Producción de butirato Producción de lactato Producción de propionato Escherichia- Shigella Streptococcus Clostridium Lactococcus Enterococcus Veillonella Prevotellaceae Bacteroidetes Faecalibacterium Lactobacillus Clostridium XIVa Anaerostipes Roseburia Prevotella Bifidobacterium Bacterias sacarolíticas Bacterias fermentadoras de proteínas 53 Figura 20 Perfil metabolómico inducido por la leche materna y fórmula para lactantes. Parece existir un patrón en la evolución de la concentración de los diferentes AGCC en niños alimentados con leche de madre, existe alta abundancia de acetato en las primeras semanas, probablemente relacionado con la alta concentración de HMO de la leche materna que induce una mayor presencia de Bifidobacterium (15). Se produce un incremento de propionato previo al cese de la lactancia y un aumento de butirato y descenso de lactato y formiato al suspender la lactancia (155). Figura 20. Alimentación completa y metabolómica La introducción de alimentación complementaria, unida a una inmadurez del páncreas exocrino, expone a la microbiota intestinal a nuevos nutrientes e induce el desarrollo de nuevas vías metabólicas para el procesamiento de almidones y proteínas. De forma general, se produce un fuerte aumento de los AGCC (acetato, butirato, propionato), asociado a un incremento de AACR (valina, isoleucina) y aromáticos (fenilalanina, tirosina), productos derivados de la fermentación proteica (β-alanina y 4-hidroxifenilalanina) y su catabolismo (AGCR), etanol, componentes de metilamina (trimetilamina, metilamina) y nicotinamida (34). Así mismo, se produce un aumento de ácidos biliares (ácido deoxicólico conjugado y no Propionato Butirato Isobutirato Valerato Oligosacáridos fucosilados Lactato/succinato AGCC AACR Aminoácidos libres Lactancia materna Fórmula para lactantes 60 metabolismo de hidratos de carbono, la pirimidina y la síntesis de biotina. La exposición a antibióticos aumenta las vías asociadas a la glucolisis y metabolismo de la pirimidina, sin embargo, se reduce la síntesis de folato o biotina (182). Las principales técnicas analíticas usadas para el estudio de la metabolómica son la espectrometría de masa (EM) y la espectrometría por resonancia magnética (RMN). Ambas técnicas se basan en las propiedades físicas de los compuestos, tienen un alto nivel de precisión y reproducibilidad, características que las hacen ideales para su uso en metabolómica (193). Existen dos estrategias para realizar el estudio metabolómico: método dirigido y método no dirigido, según se conozca o no la naturaleza del metabolito que se quiere identificar y/o cuantificar. Los métodos no dirigidos están optimizados para reconocer el mayor número de metabolitos de una muestra, los métodos no dirigidos cuantifican con precisión un conjunto conocido de metabolitos (194). 1. ESPECTROMETRÍA DE MASAS La espectrometría de masas (EM) precisa un paso previo al análisis metabólico de separación de componentes de la muestra, generalmente por cromatografía de separación, que alarga el tiempo de análisis. Sin embargo, presenta mayor sensibilidad que la RMN y detecta componentes con menor concentración o menor peso molecular. Existen varias técnicas: cromatografía de gases, cromatografía líquida, cromatografía líquida de alta resolución y la electroforesis capilar (146). 2. ESPECTROMETRÍA POR RESONANCIA MAGNÉTICA La espectrometría por resonancia nuclear magnética (RNM) mide propiedades mecánico-cuánticas de núcleos atómicos con número de spin diferente a 0, activos para RNM, sometidos al efecto de un campo magnético intenso, que incluyen 1H, 61 13C, 15N y 31P, presentes de forma natural en la materia orgánica. Cada compuesto presenta un espectro específico y las diferencias se deben a su naturaleza química. La RMN de protón (RMN 1H) es una herramienta no destructiva, mínimamente invasiva, rápida y semicuantitativa (146). Sus ventajas están reflejadas en la tabla 11. Tabla 11. Ventajas de la RNM para la caracterización de la metabolómica. Preparación sencilla de muestras Técnica no destructiva y no selectiva Alta capacidad para la identificación y concentración de metabolitos Caracterización de la estructura química de un metabolito Análisis de muestras líquidas y semisólidas Identificación de diferentes isómeros de un metabolito Reproducibilidad muy alta Asignación de compuestos a través de bases de datos de acceso público Inconveniente de la RNM Sensibilidad limitada, concentraciones de metabolitos del orden de μM Existen diferentes bases de datos de metabolómica que suponen una herramienta de actualización continua para la identificación y clasificación de los metabolitos identificados por espectrometría. Las más relevantes son la Human Metabolome Database (HMDB), la MassBank, la base de datos METLIN, la base de datos LIPID MAPS, la Madison metabolomics consortium database y la KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Para entender la relación de simbiosis de la microbiota intestinal con el huésped es necesario conocer cómo es una microbiota sana y sus diferencias con la microbiota relacionada con procesos patológicos (10). No existe una definición precisa de microbiota intestinal sana, sin embargo, están establecidas las características de una microbiota saludable: diversidad, resistencia, 62 resiliencia y estabilidad. La diversidad de la microbiota se mide en términos de riqueza (número de taxones presentes) y similitud (diferencias en la abundancia de diferentes especies). La baja diversidad es propia de enfermedades como la obesidad, la enfermedad inflamatoria intestinal y la diabetes tipo 1 y 2. La resistencia es la capacidad de la microbiota de resistir una perturbación (dieta, medicación, patógenos…) y la resiliencia es la capacidad de volver al estado basal, es decir, una microbiota sana es capaz de mantener un equilibrio dinámico (195). La disbiosis se ha asociado con numerosas patologías como enfermedades autoinmunes (enfermedad inflamatoria intestinal, artritis idiopática juvenil…), patología neurodegenerativa, psiquiátrica, metabólicas (obesidad, diabetes tipo 1 y 2), alergias, asma o cáncer. La microbiota “sana” presenta una colección de genes y vías metabólicas que promueven una asociación estable con el huésped. La microbiota realiza funciones de interacción con el huésped (componentes inmunoestimuladores), funciones metabólicas de nutrientes y fármacos, función de defensa ocupando nichos biológicos que impiden la colonización de gérmenes patógenos, estabiliza la barrera intestinal, además la microbiota intestinal coevoluciona con el sistema inmunitario contribuyendo a su competencia. La tabla 12 detalla las funciones de relación de la microbiota con el huésped. 63 Tabla 12. Funciones de relación de la microbiota con el huésped. Metabolismo de nutrientes Digestión de hidratos de carbono formando AGCC Mejora la hidrólisis de lípidos Metabolismo de aminoácidos a moléculas de señalización (histamina, GABA) y péptidos antimicrobianos. Síntesis de vitamina K y varios componentes de vitamina B. Metabolismo de polifenoles: biotransformación a componentes activos Metabolismo de fármacos y xenobióticos p-cresol: inhibe metabolismo hepático de paracetamol Eggerthella lenta: inactiva la digoxina Protección antimicrobiana Componentes estructurales y metabolitos microbianos inducen la síntesis de proteínas antimicrobianas por sistema inmune: catelicidinas, lectinas tipo C y (pro)defensinas. Estabilidad de barrera intestinal Bacteroides thetaiotaomicron: mantiene los desmosomas de los villus epiteliales. Péptidoglicano de pared cellular: mantiene las tight junctions. Lactobacillus rhamnosus GG: inhibe la apoptosis de células epiteliales. Sistema endocannabinoide: inhibe la endotoxemia. Inmunomodulación Tejido linfoide asociado con el intestino (GALT). Células T reguladoras y efectoras. Células B productoras de IgA Células linfoides innatas del grupo 3. Macrófagos y células dendríticas de la lámina propia. Extraído de (196). 64 IV. Hipótesis y objetivos Hipótesis 1. El conocimiento sobre la influencia de factores intrínsecos y ambientales en la diversidad y composición de la microbiota y en la metabolómica fecal es aún limitado. 1.1. La edad produce cambios en la microbiota y metabolómica intestinal. 1.2. El tipo de lactancia afecta la diversidad, composición y perfil metabolómico intestinal. 1.3. El modo de parto induce diferencias en la microbiota y metabolómica colónica. 1.4. El sexo determina cambios en la microbiota y metabolómica fecal del lactante. Hipótesis 2. La antibioterapia produce cambios inmediatos en la composición, maduración, diversidad y funcionalidad de la microbiota. Hipótesis 3. Los cambios producidos en la microbiota y metabolómica intestinal durante la exposición a antibióticos se mantienen durante un periodo de tiempo . Hipótesis 4. La exposición repetida o continuada a antibióticos produce cambios acumulativos en la microbiota y metabolómica intestinal. 65 Objetivos : Determinar y comparar alfa diversidad (índice de Shannon), composición y metaboloma de microbiota intestinal según: 1. Rangos de edad. 2. Exposición a lactancia materna o fórmula para lactantes. 3. Modo de parto. 4. Sexo. 5. Exposición actual a antibióticos. 6. Exposición a antibióticos en los 30 días previos. 7. Días de exposición previa a antibióticos. 66 V. Metodología de análisis y proceso estadístico de los datos. Estudio observacional, prospectivo y unicéntrico de cohorte de niños con una edad menor o igual a 24 meses expuestos o no expuestos a antibióticos. 1. POBLACIÓN DIANA Niños ingresados y/o atendidos en la consulta externa de Infecciosos de la Sección de Infectología, Reumatología e Inmunología Infantil del Hospital Universitario Virgen del Rocío. 2. MUESTRA Niños reclutados entre marzo de 2016 y agosto de 2017 con un periodo de seguimiento que se extendió hasta mayo de 2018. 3. CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y EXCLUSIÓN Criterios de inclusión Lactantes entre 1 y 24 meses nacidos a término, sanos, con consentimiento informado firmado por sus representantes legales. Criterios de exclusión Prematuridad, padecer cualquier enfermedad crónica que suponga tratamiento farmacológico y/o dietas especiales, profilaxis antibiótica o negativa de los representantes legales a la participación en el estudio. 67 Tabla 13. Cronograma de visitas del estudio. Visita 1 Visita 2 (3 meses) Visita 3 (6 meses) Visita 4 (9 meses) Visita 5 (12 meses) Visita 6 (15 meses) Criterios de inclusión X Criterios de exclusión X X X X X X Información estudio X X X X X X Consentimiento informado X Uso ABº actual X X X X X ABº en últimos 30 días X X X X X ABº gestacional X Edad X X X X X Sexo X Tipo de parto X Alimentación con LM X X X X X Recogida de muestra X X X X X En visita 1 se realizó entrevista con padres o representantes legales de los niños que cumplían todos los criterios de inclusión y no tenía ningún criterio de exclusión. En dicha visita se informó del tipo de estudio, del procedimiento y de los objetivos del mismo, tanto verbalmente como por escrito mediante una hoja escrita informativa (anexo 1). En esa visita, tras resolver las diferentes dudas, se procedió a recoger el consentimiento informado (anexo 2). En la visita 2 se realizó la encuesta I (anexo 3). En las visitas 3, 4, 5 y 6 se realizó la encuesta II (anexo 4) para la recogida de las variables analizadas. En las visitas 2, 3, 4, 5 y 6 se realizó recogida de muestras de heces. La tabla 11 resume el cronograma del estudio. 68 Figura 22. Variables principales y variables modificadores de efecto. 1. VARIABLES PRINCIPALES 1. Diversidad de microbiota Estudio de alfa diversidad con la determinación del índice de Shannon. 2. Composición de microbiota Se seleccionaron los filos, familias y géneros identificados con una abundancia relativa mayor del 1% en más del 25% de las muestras. En la figura 23 aparecen los filos, familias y géneros estudiados. Variables principales I. Diversidad microbiota II. Composición microbiota III. Perfil metabolómico Variable modificadora de efecto primaria: antibioterapia I. Exposición actual a antibióticos II. Exposición a antibióticos en 30 días previos III. Exposición antibióticos mayor o menor de 14 días. Variables modificadoras de efecto secundarias: I. Edad II. Lactancia materna III. Modo de parto IV. Sexo 69 Figura 23. Filos, familias y géneros estudiados. 3. Composición de metabolómica El perfil metabolómico analizado estuvo compuesto por 24 metabolitos identificados a partir de las señales espectroscópicas responsables de las diferencias principales entre grupos de las variables primarias y secundarias. La tabla 14 presenta los metabolitos estudiados. Firmicutes Ruminococcaceae Faecalibacterium Lachnospiraceae Clostridium XIVa Blautia Anaerostipes Lachnospiracea uncl. Roseburia Veillonellaceae Veillonella Bacteroidetes Bacteroidaceae Bacteorides Proteobacteria Enterobacteriaceae Enterobacteria unc. Escherichia/Shigella Actinobacteria Bifidobacteriaceae Bifidobacterium Filos Familias Géneros 76 Para representar la distribución de las muestras según las variables modificadoras de efecto primaria y secundarias en los conjuntos de muestras seleccionadas, se emplearon diagramas sectoriales (pastel), diagramas de barras y tablas, expresando las variables cualitativas a través de frecuencias absolutas y porcentajes y las variables cuantitativas con mediana y rango intercuartílico p50 (p25 – p75). Mediante gráficos de cajas y bigotes se representaron las comparaciones de los diferentes análisis. Se usaron gráficos de regresión lineal en el estudio de variables con probable relación de dependencia. Se empleó la prueba no paramétrica de U de Mann-Whitney para muestras independientes para el análisis de estudios con dos grupos muestrales. Se empleó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis para muestras independientes para el análisis de estudios con tres grupos muestrales. Los valores de significación (0,05) se ajustaron mediante la corrección de Dunn para varias pruebas. Para el análisis del perfil metabolómico se construyeron modelos de regresión de mínimos cuadrados parciales de análisis discriminante (OPLS-DA) para la variable modificadora de efecto primaria: antibioterapia y las variables modificadoras de efecto secundarias: edad, sexo, modo de parto, tipo de lactancia. Posteriormente, en aquellos modelos que resultaron robustos, se aplicó prueba U de Mann Whitney para confirmar las diferencias en los metabolitos hallados como responsables principales de las variaciones en el modelo OPLS-DA. Con el fin de homogenizar el estudio estadístico de la metabolómica con la microbiota, se realizó análisis univariante aplicando pruebas no paramétricas: U de Mann-Whitney o Kruskal-Wallis seguido de análisis post hoc (test de Dunn), con selección de muestras y grupos muestrales similares a los realizados en el análisis de la diversidad y composición de microbiota. 77 2. Diseño de base de datos Se han recogido el valor de las variables principales: índice de Shannon, abundancia relativa de los filos, familias y géneros analizados, valor de abundancia de cada metabolito. Se recogieron los valores valores continuos (edad) o dicotómicos (sexo, modo de parto, tipo de lactancia) de las variables modificadoras de efecto en una base de datos utilizando las aplicaciones informáticas Excel y IBM SPSS Statistics versión 26.0.0.0. 78 VI. Resultados Se recogieron 101 muestras pertenecientes a 30 participantes. La adherencia a las visitas y recogida de muestra fue del 67,3%. 4 niños acudieron a todas las visitas, 9 a 4 visitas, 13 sujetos a 3 visitas, 2 a 2 visitas y 2 participantes solo realizaron una visita. La media de tiempo de seguimiento fue 9,21 meses, rango (0 - 14,93 meses; DS 4,04 meses). La media de intervalo de tiempo entre recogida de muestras fue de 3,89 meses (rango 1,38 – 8,05 meses; DS 1,43 meses). No se obtuvo amplificación de ADN para filiar diversidad y composición de microbiota fecal en 6 de las 101 muestras. Para la filiación del perfil metabolómico, 10 muestras fueron excluidas por falta de material o por ausencia de datos en la espectrometría. Se creó un primer modelo de análisis de componentes principales (PCA) para observar las variaciones espectrales más importantes dentro de las 91 muestras y depurar las muestras agrupadas y los valores atípicos. Se identificaron 5 posibles outliers en la distribución T2 de Hotellings (figura 29 A) y 6 posibles outliers en la distribución T2 de Hotellings (figura 29 B); posteriormente se analizaron los datos espectrales de estas muestras y se encontraron 4 muestras outliers reales. La figura 30 muestra la pérdida de muestras durante el análisis. 79 Figura 29. Modelo PCA resaltando las muestras agrupadas y las atípicas (outliers). N=91, 4 componentes, distribución T2 de Hotellings, Q2=0.49. (A) Diagrama de PCA scores PC1v2, R2 = 0.46. (B) Diagrama de PCA scores PC3v4, R2= 0.62. Figura 30. Muestras recogidas, procesadas y analizadas para metabolómica. A B Resultado de PCA PC1v2 Resultado de PCA PC3v4 Muestras fecales (n 101) Espectrometría RMN (n 91) PCA (n 87) 80 Previo al estudio del efecto de los antibióticos sobre las variables principales, diversidad, composición de la microbiota y perfil metabolómico, se realizó el análisis del impacto de las variables secundarias: edad, sexo, modo de parto y exposición a lactancia materna sobre la cohorte de muestras recogidas. 1. Objetivo 1 : microbiota, metabolómica y edad. Para el análisis de la variable secundaria edad se estratificó la cohorte en cuatro rangos de edad: Rango 1: < 7 meses. Rango 2: ≥ 7 meses - < 13 meses. Rango 3: ≥ 13 meses - < 19 meses. Rango 4: ≥ 19 meses. Figura 31. Diagrama sectorial representando la distribución de la muestra (n=61) por rango de edad. 13 21% 19 31% 21 34% 9 14% Distribución de edad Rango 1 Rango 2 Rango 3 Rango 4 81 (1) ESTUDIO DE MICROBIOTA Tabla 15. Valores de p significativos de diferencias en diversidad y composición de microbiota entre rangos de edad para cada variable. Mediana y rango intercuartílico por rango. Edad n 61 Rango 1 Rango 2 Rango 3 Rango 4 p Mediana (RIQ) Diversidad (Shan.) 0,001 1,91 (1,56-2,28) 2,59 (2,09-3,00) 2,76 (2,50-3,02) 3,11 (2,37-3,20) Firmicutes 0,043 0,42 (0,14-0,55) 0,58 (0,43-0,81) 0,56 (0,46-0,69) 0,54 (0,38-0,76) Ruminococcaceae <0,001 0,00 (0,00-0,01) 0,07 (0,02-0,20) 0,20 (0,06-0,32) 0,20 (0,16-0,26) Faecalibacterium <0,001 0,00 (0,00-0,00) 0,03 (0,00-0,21) 0,20 (0,03-0,32) 0,19 (0,14-0,23) Blautia 0,002 0,00 (0,00-0,02) 0,02 (0,00-0,05) 0,03 (0,02-0,08) 0,06 (0,03-0,14) Anaerostipes <0,001 0,00 (0,00-0,00) 0,00 (0,00-0,03) 0,02 (0,00-0,04) 0,02 (0,00-0,05) Lachnos. uncls. 0,026 0,01 (0,00-0,04) 0,02 (0,01-0,05) 0,04 (0,02-0,09) 0,04 (0,02-0,08) Roseburia <0,001 0,00 (0,00-0,00) 0,00 (0,00-0,00) 0,02 (0,00-0,08) 0,01 (0,00-0,04) Proteobacteria <0,001 0,33 (0,16-0,43) 0,05 (0,02-0,10) 0,02 (0,01-0,06) 0,02 (0,00-0,10) Enterobacteriac. <0,001 0,33 (0,16-0,43) 0,04 (0,01-0,10) 0,01 (0,00-0,04) 0,01 (0,00-0,10) Enterobact. uncls. 0,010 0,03 (0,00-0,13) 0,00 (0,00-0,01) 0,00 (0,00-0,01) 0,00 (0,00-0,04) Eschir./shigella <0,001 0,30 (0,08-0,47) 0,02 (0,00-0,08) 0,00 (0,00-0,03) 0,00 (0,00-0,05) Valores de p obtenidos por prueba de Kruskal-Wallis para muestras independientes, diferencias significativas para p < 0,05. Representación de resultados previos en gráficos de cajas y bigotes representado mediana y rango intercuartílico de las diferencias significativas encontradas (Figuras 32-36). Figura 32. Gráfico de alfa diversidad por rango de edad. Los valores de significación se han ajustado mediante la corrección de Dunn para varias pruebas. 82 Figura 33. Gráfico de Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria y Actinobacteria por rango de edad. Los valores de significación se han ajustado mediante la corrección de Dunn para varias pruebas. Figura 34. Gráfico de familia Ruminococcaceae y género Faecalibacterium por rango de edad. Los valores de significación se han ajustado mediante la corrección de Dunn para varias pruebas 83 Figura 35. Gráfico de géneros Blautia, Anaerostipes, Lachnospiraceae uncls. y Roseburia por rango de edad. Los valores de significación se han ajustado mediante la corrección de Dunn para varias pruebas Figura 36. Gráfico de género Enterobacteriaceae uncl., Escherichia/Shigella por rango de edad. Los valores de significación se han ajustado mediante la corrección de Dunn para varias pruebas 84 El análisis del efecto de la edad sobre la diversidad y composición de la microbiota intestinal reveló diferencias significativas en la diversidad de la microbiota (índice de Shannon) siendo significativamente menor en el rango de edad 1 que en el rango de edad 3 (p 0,001) y el rango de edad 4 (p 0,004). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre otros rangos de edad. El filo Firmicutes presentó una abundancia relativa significativamente menor en rango de edad 1 que en el rango de edad 2 (p 0,038), rango de edad 3 (p 0,038) y rango de edad 4 (p 0,038). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre otros rangos de edad. El filo Proteobacteria presentó una abundancia relativa significativamente mayor en el rango de edad 1 que en el rango de edad 2 (p 0,003), rango de edad 3 (p 0,000) y rango de edad 4 (p 0,001). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre otros rangos de edad. No se encontraron diferencias significativas en los filos Bacteroidetes entre los diferentes rangos de edad, sin embargo, hay una tendencia a la mayor abundancia en los rangos 1, 2 y 3 estabilizándose, al igual que el filo Firmicutes en el rango de edad 4. El filo Actinobacteria no mostró diferencias significativas de abundancia entre los diferentes rangos de edad, pero se detectó una relación inversa entre abundancia y edad. La familia Ruminococcaeae (género Faecalibacterium), los géneros Blautia, Lachnospiraceae no clasificadas, Anaerostipes y Roseburia presentan, en general, una abundancia relativa significativamente menor en rango de edad 1 que en rangos de edad superiores. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre otros rangos de edad. Los géneros Enterobacteriaceae no clasificadas y Escherichia/Shigella presenta una abundancia relativa significativamente mayor en el rango de edad 1 que en 85 rangos de edad superiores. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre otros rangos de edad. (2) ESTUDIO DE METABOLÓMICA (a) Análisis de cohorte completa El efecto de la edad sobre el perfil metabolómico intestinal se realizó, en un primer paso, sobre el conjunto completo de muestras (n=87). La variable edad de los pacientes en el momento de la recogida de la muestra (semanas) se representó en eje Y para generar un modelo proyección ortogonal sobre estructuras latentes (OPLS) que resultó robusto (p=0,01). Figura 37. Gráficos de análisis OPLS de covarianza de la edad. 92 (b) Análisis del rango de edad 2 Tabla 17. Valores de p significativos de diferencias en diversidad y composición de microbiota en rango de edad 2 según tipo de lactancia. Mediana y rango intercuartílico. n 20 Lactancia con fórmula Lactancia materna ≥ 7 - < 16 m p Mediana (RIQ) Lachnospiraceae 0,006 0,20 (0,14-0,37) 0,09 (0,07-0,12) Anaerostipes 0,018 0,02 (0,00-0,04) 0,00 (0,00-0,00) Veillonellaceae 0,035 0,03 (0,00-0,10) 0,17 (0,05-0,41) Valores de p significativos obtenidos por prueba U de Mann-Whitney para muestras independientes Diferencias significativas para p < 0,05. Figura 42. Representación de resultados previos en gráficos: familia Lachnospiraceae, familia Veillonellaceae, género Anaerostipes. Los valores de significación se han ajustado mediante la corrección de Dunn para varias pruebas 93 (c) Análisis del rango de edad 3 Tabla 18. Valores de p significativos de diferencias en diversidad y composición de microbiota en rango de edad 3 según tipo de lactancia. Mediana y rango intercuartílico. n 12 Lactancia con fórmula Lactancia materna ≥ 16 m p Mediana (RIQ) Diversidad (Shannon) 0,051 2,73 (2,34-3,10) 3,22 (2,94-3,60) Roseburia 0,022 0,00 (0,00-0,01) 0,07 (0,02-0,15) Valores de p significativos obtenidos por prueba U de Mann-Whitney para muestras independientes. Diferencias significativas para p < 0,05. Figura 43. Representación de resultados previos en gráficos: alfa diversidad y género Roseburia. Los valores de significación se han ajustado mediante la corrección de Dunn para varias pruebas El estudio de la variable secundaria modificadora de efecto lactancia materna sobre la diversidad y composición de la microbiota se realizó sobre el conjunto 94 muestral completo (n 40) y en los tres rangos de edad. En el conjunto muestral completo se observaron diferencias significativas con menor abundancia de la familia Lachnospiraceae y de los géneros Clostridium XIVa y Anaerostipes en el grupo expuesto a lactancia materna. En el rango de edad 1 no se encontraron diferencias significativas. En el rango de edad 2 se observó igualmente menor abundancia de la familia Lachnospiraceae y del género Anaerostipes y mayor abundancia de la familia Veillonellaceae en el grupo expuesto a lactancia materna. Finalmente, en el grupo de edad 3 (≥16 meses) se observó una mayor alfa diversidad (índice de Shannon) en el grupo expuesto a leche materna y una menor abundancia del género Roseburia. 95 (2) ESTUDIO DE METABOLÓMICA (a) Análisis de cohorte completa Para estudiar el efecto de la exposición a lactancia materna sobre el perfil metabolómico intestinal se construyó un modelo OPLS que se descartó por no ser robusto (p=0,38). (b) Análisis de conjunto muestral El análisis del conjunto muestral y del rango de edad 3 no reveló diferencias significativas en ninguno de sus metabolitos. (i) Análisis del rango de edad 1 Tabla 19. Valores de p significativos de diferencias en perfil metabolómico en rango de edad 1 según tipo de lactancia. Mediana y rango intercuartílico. n 8 Lactancia con fórmula Lactancia materna < 7 m p Mediana (RIQ) Acetato 0,029 90,96(70,31-103,47) 140,25 (117,44-219,47) Malonato 0,029 8,21(6,58-19,96) 2,35 (1,83-3,01) Diferencias significativas para p < 0,05. (ii) Análisis del rango de edad 2 Tabla 20. Valores de p significativos de diferencias en perfil metabolómico en rango de edad 2 según tipo de lactancia. Mediana y rango intercuartílico. n 20 Lactancia con fórmula Lactancia materna ≥ 7 - < 16 m p Mediana (RIQ) 2-OH-3-metilvalerato 0,030 1,50 (1,02-2,52) 2,77 (2,70-5,63) Succinato 0,030 41,28 (16,05-152,15) 2,96 (2,88-11,85) Diferencias significativas para p < 0,05. El estudio de la variable secundaria modificadora de efecto lactancia materna sobre la metabolómica intestinal se realizó sobre la cohorte completa por análisis 96 multivariante sin hallar diferencias. El análisis univariante se realizó sobre el conjunto muestral completo (n 40) y en los tres rangos de edad. En el conjunto muestral y rango de edad 3 no se observaron diferencias significativas. En el rango de edad 1 se observó en el grupo alimentado con lactancia materna mayor abundancia significativa de acetato y menor de malonato que en el grupo alimentado con lactancia con fórmula. En el rango de edad 2 el grupo expuesto a lactancia materna presentó una mayor abundancia significativa de 2-OH-3- metilvalerato y menor abundancia de succinato que el grupo no expuesto. 97 3. Objetivo 3: microbiota, metabolómica y modo de parto Figura 44. Gráfico de distribución de muestras según modo de parto. (1) ESTUDIO DE MICROBIOTA Tabla 21. Valores de p significativos de diferencias en diversidad y composición de microbiota en menores de 6 meses según tipo de parto. Mediana y rango intercuartílico. n 16 Vaginal Cesárea p Mediana (RIQ) Clostridium XIVa 0,034 0,02 (0,00-0,11) 0,16 (0,07-0,30) Valor de p significativos obtenidos por prueba de U de Mann-Whitney para muestras independientes. Diferencias significativas para p < 0,05. Figura 45. Representación de resultados previos en gráfico: género Clostridium XIVa. Los valores de significación se han ajustado mediante la corrección de Dunn para varias pruebas 6 10 Cesárea Vaginal 98 Al analizar el efecto de la variable secundaria modificadora de efecto tipo de parto en muestras de menores de 6 meses sobre la diversidad y composición de la microbiota se observó menor abundancia relativa del género Clostridium XIVa en nacidos por vía vaginal que por en nacidos por cesárea. (2) ESTUDIO DE METABOLÓMICA Para estudiar el efecto del tipo de parto sobre el perfil metabolómico intestinal se construyó un modelo OPLS que se descartó por no ser robusto (p=0,36). En la prueba U de Mann-Whitney para muestras independientes comparando metabolitos según modo de parto no se obtuvieron diferencias significativas para ningún metabolito. 99 4. Objetivo 4: microbiota, metabolómica y sexo Figura 46. Gráfico de distribución de muestras por sexo. (1) ESTUDIO DE MICROBIOTA Tabla 22. Valores de p significativos de diferencias en diversidad y composición de microbiota según sexo. Mediana y rango intercuartílico. n 52 Mujer Hombre p Mediana (RIQ) Clostridium XIVa 0,014 0,07 (0,03-0,19) 0,03 (0,01-0,07) Valor de p significativo obtenido por prueba U de Mann-Whitney para muestras independientes. Diferencias significativas para p < 0,05. Figura 47. Representación de resultados previos en gráfico: género Clostridium XIVa. Los valores de significación se han ajustado mediante la corrección de Dunn para varias pruebas. El análisis de la variable secundaria modificadora de efecto sexo sobre la diversidad y composición de la microbiota mostró diferencias significativas en género Clostridium XIVa con una mayor abundancia relativa en mujeres que hombres. 26 26 Mujer Hombre 100 (2) ESTUDIO DE METABOLÓMICA (a) Análisis de cohorte completa Para estudiar el efecto del sexo sobre el perfil metabolómico intestinal se construyó un modelo OPLS que se descartó por no ser robusto (p=0,36). (b) Análisis de conjunto muestral Tabla 23. Valores de p significativos de diferencias en perfil metabolómico según sexo. Mediana y rango intercuartílico. n=52 Mujer Hombre p Mediana (RIQ) Tirosina 0,037 6,64 (4,87-9,17) 7,90 (6,08-16,28) p-cresol 0,035 7,66 (6,60-12,7) 7,01 (5,99-8,48) Valores de p significativos obtenidos por prueba U de Mann-Whitney para muestras independientes. Diferencias significativas para p < 0,05. El estudio del efecto de la variable secundaria sexo sobre el perfil metabolómico intestinal mostró diferencias significativas, el sexo femenino presentó una abundancia menor de tirosina y mayor de p-cresol que el sexo masculino. 101 1. Objetivo 5: microbiota, metabolómica y exposición actual a antibióticos (1) ESTUDIO DE MICROBIOTA Para obviar el efecto de la edad sobre la diversidad, composición de la microbiota y perfil metabolómico se estudió la existencia o no de relación entre la exposición actual a antibióticos y los rangos de edad. Tabla 24. Tabla de contingencia de asociación entre exposición actual a antibióticos y edad. p Rango 1 Rango 2 Rango 3 Rango 4 Exposición actual ABº 0,001 7 (43,8%) 6 (28,6%) 1 (5,5%) 1 (9,1%) Exposición previa ABº 2 (12,4%) 6 (28,6%) 12 (66,7%) 9 (81,8%) No exposición ABº 7 (43,8%) 9 (42,8%) 5 (27,8%) 1 (9,1%) n=66 16 21 18 11 Nivel de significación p<0,05. El análisis reveló una relación estadísticamente significativa entre mayor edad y mayor exposición previa a antibióticos, por tanto, se realizó estudio por rangos de edad. Los rangos de edad 3 y 4 resultaron no homogéneos; se realizó análisis de rango de edad 1 y rango de edad 2. 108 (d) Análisis del rango de edad 2 Tabla 29. Valores de p significativos de diferencias en metabolómica entre grupo de muestras no expuestas a ABº, expuestas actualmente a ABº y expuestas previamente a ABº en rango de edad 2. Mediana y rango intercuartílico. Valores de p significativos obtenidos por prueba de Kruskal Wallis para muestras independientes. Diferencias significativas para p < 0,05. InR9 Representación de resultados previos en gráficos de las diferencias estadísticamente significativas encontradas (Figuras 53-56). Figura 53. Gráfico de leucina, isoleucina, valina. Los valores de significación se han ajustado mediante la corrección de Dunn para varias pruebas. Rango 2 n 20 No ABº previos ABº actuales ABº previos p Mediana (RIQ) Leucina 0,007 3,61 (3,16-4,42) 1,86 (1,12-2,45) 3,70 (3,18-4,37) Isoleucina 0,007 4,19 (3,28-5,02) 2,32 (1,40-2,99) 3,98 (3,35-5,05) Valina 0,009 3,89 (3,01-4,93) 2,02 (1,27-2,86) 3,96 (3,28-5,00) 3-m-2-oxovalerato 0,026 2,81 (1,40-3,64) 0,76 (0,47-1,34) 1,60 (1,26-2,85) 3-m-2 OH-valerato 0,007 1,83 (0,94-3,10) 0,58 (0,52-0,99) 2,27 (1,56-2,81) 5-aminopentanoato 0,038 4,93 (3,32-11,10) 2,72 (1,90-3,73) 8,77 (5,02-9,05) Tiramina 0,013 2,20 (1,64-2,65) 1,20 (0,97-1,70) 2,45 (1,88-2,74) p-cresol-sulfato 0,012 0,87 (0,75-1,23) 0,60 (0,28-0,64) 0,71 (0,58-0,90) 109 Figura 54. Gráfico de 3-metil-2-oxovalerato y 3-metil-2-OH-valerato. Los valores de significación se han ajustado mediante la corrección de Dunn para varias pruebas. Figura 55. Gráfico de 5-aminopentanoato. Los valores de significación se han ajustado mediante la corrección de Dunn para varias pruebas. Figura 56. Gráfico de tiramina y p-cresol-sulfato. Los valores de significación se han ajustado mediante la corrección de Dunn para varias pruebas. En el rango de edad 2 se encontró diferencias significativas de 3-metil-2- oxovalerato y 3-metil-2-OH-valerato; leucina, isoleucina y valina; 5- aminopetanoato, tiramina y p-cresol-sulfato con una menor abundancia 110 significativa en el grupo de muestras expuestas actualmente a antibióticos que en el grupo expuesto previo o no expuesto. 2. Objetivo 6: microbiota, metabolómica y exposición a antibióticos en los últimos 30 días. (1) ESTUDIO DE MICROBIOTA Tabla 30. Tabla de contingencia de asociación entre exposición a antibióticos en los últimos 30 días y edad en el análisis de la microbiota. n 61 p Rango 1 Rango 2 Rango 3 Rango 4 Exposición ABº últimos 30 días 0,074 0 (0,0%) 3 (15,8%) 3 (16,7%) 1 (9,1%) Exposición ABº previa a 30 días 6 (46,2%) 7 (36,8%) 10 (55,6%) 9 (81,8%) No exposición a ABº 7 (53,8%) 9 (47,4%) 5 (27,8%) 1 (9,1%) 13 19 18 11 Nivel de significación p<0,05. No existe una relación estadísticamente significativa entre la edad y la exposición a antibióticos en los 30 últimos días, sin embargo, tiene relevancia la no homogeneidad de los rangos de edad 1 y 4. Se analizaron los conjuntos muestrales 2 y 3. (a) Análisis del rango de edad 2 Tabla 31. Valores de p diversidad y filos entre grupo de muestras no expuestas a ABº, expuestas a ABº en los últimos 30 días y expuestas a ABº previa a últimos 30 días en rango de edad 2. Mediana y rango intercuartílico. Valores de p significativos obtenidos por prueba de Kruskal Wallis para muestras independientes. Diferencias significativas para p < 0,05. 7-12 meses No ABº previos ABº últimos 30 días ABº previa a 30 días p Mediana (RIQ) Diversidad (Shan.) 0,829 2,63 (1,89-3,04) 2,59 (2,12-__) 2,36 (2,09-2,61) Firmicutes 0,664 0,64 (0,35-0,83) 0,43 (0,29-__) 0,56 (0,46-0,59) Bacteroidetes 0,638 0,06 (0,00-0,30) 0,36 (0,00-__) 0,23 (0,10-0,36) Proteobacteria 0,790 0,06 (0,02-0,11) 0,05 (0,02-__) 0,05 (0,04-0,18) Actinobacteria 0,938 0,08 (0,01-0,14) 0,03 (0,01-__) 0,09 (0,00-0,16) 111 (b) Análisis del rango de edad 3 Tabla 32. Valores de p diversidad y filos entre grupo de muestras no expuestas a ABº, expuestas a ABº en los últimos 30 días y expuestas a ABº previa a últimos 30 días en rango de edad 3. Mediana y rango intercuartílico. Valores de p significativos obtenidos por prueba de Kruskal Wallis para muestras independientes. Diferencias significativas para p < 0,05. En el estudio del impacto de la exposición a antibióticos en los 30 últimos días sobre la diversidad y composición de la microbiota intestinal no se encontraron diferencias significativas en los rangos de edad 2 y 3. 12-18 meses No ABº previos ABº últimos 30 días ABº previa 30 días p Mediana (RIQ) Diversidad (Shan.) 0,904 2,81 (2,48-3,16) 2,53(2,50-__) 2,73 (2,47-3,00) Firmicutes 0,619 0,55 (0,37-0,67) 0,48 (0,56-__) 0,64 (0,45-__) Bacteroidetes 0,790 0,37 (0,15-0,51) 0,35 (0,00-__) 0,31 (0,19-0,49) Proteobacteria 0,863 0,01 (0,00-0,09) 0,03 (0,01-__) 0,02 (0,01-0,05) Actinobacteria 0,069 0,07 (0,02-0,17) 0,00 (0,00-__) 0,02(0,01-0,04) 112 (2) ESTUDIO DE METABOLÓMICA (a) Análisis de cohorte completa Figura 57. Análisis multivariante OPLS de exposición a ABº en los últimos 30 días. n=78, 2 componentes Y-ortogonales, R2X = 0.89, Q2Y = 9.031e-04, p = 0.01. Se encontró una mayor abundancia de butirato, dimetilglicina, riboflavina y uracilo en las muestras expuestas a antibióticos en los últimos 30 días. Sin embargo, el bajo valor del Q2Y podría significar que el modelo sobreajusta los datos, así la mayoría de las regiones que superan el umbral de significancia de correlación fueron picos solo parcialmente resaltados. Butirato Dimetilglicina Riboflavina Uracilo 113 (b) Análisis de conjunto muestral Posteriormente, se analizó un conjunto muestral n=57 con una muestra por paciente por grupo de edad. Tabla 33. Tabla de contingencia de asociación entre exposición a antibióticos en los últimos 30 días y edad en el análisis de la metabolómica. n 57 p Rango 1 Rango 2 Rango 3 Rango 4 No exposición ABº 0,133 5 (50,0%) 7 (38,9%) 5 (27,8%) 1 (9,1%) Exposición ABº últimos 30 días 0 (0,0%) 4 (22,2%) 3 (16,7%) 1 (9,1%) Exposición ABº previa a 30 días 5 (50,0%) 7 (38,9%) 10 (55,6%) 9 (81,8%) 10 18 18 11 Nivel de significación p<0,05. No existe relación estadísticamente significativa entre la edad y la exposición a antibióticos en los últimos 30 días. Tiene relevancia la no homogeneidad de los rangos de edad 1 y 4, se analizaron los rangos de edad 2 y 3. (c) Análisis del rango de edad 2 La prueba de Kruskal-Wallis para muestras independientes no reveló diferencias significativas en ninguno de los metabolitos estudiados. (d) Análisis del rango de edad 3 Tabla 34. Valores de p significativos de diferencias en perfil metabolómico entre grupo de muestras no expuestas a ABº, expuestas a ABº en los últimos 30 días y expuestas a ABº previo a últimos 30 días en rango de edad 3. Mediana y rango intercuartílico. Rango 3 n No ABº previos ABº últimos 30 días ABº previa a 30 días p Mediana (RIQ) Leucina 0,028 2,79 (2,45 - 4,03) 3,52 (1,89 -_ ) 4,47 (3,78 - 4,87) Beta-alanina 0,036 3,25 (2,61 - 3,90) 3,95 (2,11 -_ ) 4,70 (3,90 - 5,54) Malonato 0,031 7,62 (5,21 – 8,57) 2,97 (1,54 - _ ) 2,51 (2,06 – 4,78) Tiramina 0,042 1,70 (1,45 – 2,49) 1,90 (1,26 - _ ) 2,78 (2,46 – 3,25) Fenilalanina 0,022 1,85 (1,47 – 2,39) 1,99 (1,58 - _ ) 2,84 (2,34 – 3,08) Valores de p significativos obtenidos por prueba de Kruskal Wallis para muestras independientes. Diferencias significativas para p < 0,05. 114 Figura 58. Representación de resultados previos en gráfico: leucina, malonato, tiramina, fenialanina, b-alanina. Los valores de significación se han ajustado mediante la corrección de Dunn para varias pruebas. En el rango de edad 3 se encontró mayor abundancia de leucina, fenilalanina, balanina, tiramina en el grupo expuesto previo a 30 días que en el grupo no expuesto. Malonato fue más abundante significativamente en el grupo no expuesto a antibióticos que en el expuesto previo a 30 días. 115 3. Objetivo 7: microbiota, metabolómica y días previos de exposición a antibióticos. (1) ESTUDIO DE MICROBIOTA Tabla 35. Tabla de contingencia de asociación entre exposición a antibióticos más o menos de 14 días y edad en el análisis de la microbiota. n 61 p Rango 1 Rango 2 Rango 3 Rango 4 Exposición previa a ABº > 14 días 0,010 0 (0,0%) 3 (15,8%) 7 (38,9%) 6 (54,5%) Exposición previa a ABº < 14 días 6 (46,2%) 7 (36,8%) 6 (33,3%) 4 (36,4%) No exposición a ABº 7 (53,8%) 9 (47,4%) 5 (27,8%) 1 (9,1%) Total 13 19 18 11 Nivel de significación p<0,05. Existe una relación estadísticamente significativa entre mayor edad y una mayor proporción de muestras expuestas a antibióticos > 14 días previamente. (a) Análisis del rango de edad 2 Tabla 36. Valores de p significativos de diferencias en perfil metabolómico entre grupo de muestras no expuestas a ABº, expuestas a ABº durante menos de 14 días y expuestas a ABº durante más de 14 días en rango de edad 2. Mediana y rango intercuartílico. Rango 2 No ABº previos < 14 d ABº previos > 14 d ABº previos p Mediana (RIQ) Diversidad 0,403 2,63 (1,89-3,04) 2,59 (2,19-3,35) 2,12 (1,83-_ ) Firmicutes 0,647 0,64 (0,35-0,83) 0,49 (0,34-0,59) 0,58 (0,43-_ ) Bacteroidetes 0,220 0,06 (0,00-0,30) 0,25 (0,16-0,51) 0,02 (0,00-_ ) Proteobacteria 0,790 0,06 (0,02-0,11) 0,05 (0,04-0,10) 0,12 (0,02-_ ) Actinobacteria 0,493 0,08 (0,01-0,14) 0,09 (0,03-0,16) 0,01 (0,00-_ ) n 19 9 7 3 Valores de p significativos obtenidos por prueba de Kruskal Wallis para muestras independientes. Diferencias significativas para p < 0,05. 116 (b) Análisis del rango de edad 3 Tabla 37. Valores de p significativos de diferencias en perfil metabolómico entre grupo de muestras no expuestas a ABº, expuestas a ABº durante menos de 14 días y expuestas a ABº durante más de 14 días en rango de edad 3. Mediana y rango intercuartílico. Rango 3 No ABº previos < 14 d ABº previos > 14 d ABº previos p Mediana (RIQ) Actinobacteria 0,010 0,06 (0,02-0,17) 0,03(0,01-0,05) 0,00 (0,00-0,02) Bifidobacteriaceae 0,010 0,06 (0,02-0,17) 0,03(0,01-0,05) 0,00 (0,00-0,01) Bifidobacterium 0,010 0,06 (0,02-0,19) 0,04 (0,02-0,06) 0,01 (0,00-0,02) n 18 5 6 7 Valores de p significativos obtenidos por prueba de Kruskal Wallis para muestras independientes. Diferencias significativas para p < 0,05. Figura 59. Representación de resultados previos en gráfico: filo Actinobacteria, familia Bifidobacteriaceae, género Bifidobacterium. Los valores de significación se han ajustado mediante la corrección de Dunn para varias pruebas. 117 El análisis del efecto de los días acumulados de exposición a antibióticos sobre la diversidad y composición de la microbiota intestinal no se encontraron diferencias significativas o tendencias en el rango de edad 2. En el rango de edad 3 se observó mayor abundancia relativa del filo Actinobacteria, familia Bifidobacteriaceae, género Bifidobacterium en el grupo no expuesto a antibióticos que en el grupo expuesto más de 14 días. (2) ESTUDIO DE METABOLÓMICA Para estudiar el efecto del número de días previos de antibióticos sobre el perfil metabolómico intestinal se construyó un modelo OPLS que se descartó por no ser robusto (p=0,27). La prueba de Kruskal-Wallis para muestras independientes no reveló diferencias significativas en ninguno de los metabolitos estudiados. 124 bacterias productora de butirato) en los niños que iniciaron el consumo de carne (205). Koenig et al. encontraron que la introducción de legumbres a la dieta del lactante está asociada a un aumento de Bacteroidetes, así como a un incremento en la funcionalidad microbiana en el procesamiento de los carbohidratos y de la síntesis de vitaminas (206). Finalmente, en el grupo de edad 3 se observó una mayor diversidad alfa (índice de Shannon) en el grupo expuesto a leche materna. Diferentes estudios coinciden en que la diversidad de la microbiota intestinal de lactantes de leche humana es menor que los alimentados con fórmula (82,41); sin embargo, esta diferencia se atenúa en fases posteriores, en probable relación con un menor aporte de esta a medida que se consolida la alimentación complementaria (38). En este subgrupo también se encontró una mayor abundancia del género Roseburia en niños lactantes de leche materna. El género Roseburia ha sido identificado junto a otros anaerobios estrictos, Bifidobacterium, Bacteroides,Blautia, Clostridium, Collinsella y Veillonella, propios de la microbiota intestinal, de forma simultánea en la microbiota de heces maternas, leche materna y heces neonatales (52). Su abundancia aumenta a medida que aumenta la proporción de alimentación complementaria (207). Las diferencias en la microbiota intestinal de niños alimentados con leche materna respecto a los alimentados con fórmula para lactantes, inducen diferencias en su metabolómica. Existe una menor abundancia de AGCC y un mayor número de oligosacáridos fucosilados y de metabolitos intermedios (lactato y succinato) en lactantes alimentados con leche humana. Además, los cambios producidos de forma fisiológica en la leche humana, hacen que la concentración de los diferentes metabolitos siga un patrón cambiante (155). En cambio, los lactantes de fórmula presentan más productos de degradación de proteínas como AGCC, AACR y aminoácidos libres (166). 125 En nuestro estudio el análisis multivariante con modelo OPLS de la cohorte completa construido se descartó por no ser robusto. El análisis univariante no paramétrico del conjunto muestral (n 40; 14 vs 26) no reveló diferencias significativas. El pequeño tamaño muestral podría ser responsable de este resultado. Tampoco se encontraron diferencias en el estudio del rango de edad 3 (n 12, 4 vs 8) probablemente en relación con las mismas limitaciones. El rango de edad 1, lactantes menores de 7 meses, expresó una mayor abundancia significativa de acetato en el grupo de niños alimentados con leche humana. El acetato es el AGCC más abundante en la metaboloma intestinal (206), y, como el resto de los AGCC, su abundancia es cambiante. Tsukuda et al. demostraron un aumento progresivo en la concentración de acetato desde las primeras semanas de vida hasta el sexto mes donde se alcanza la estabilidad (155). La proporción de AGCC es inferior en lactantes alimentados con leche humana. Sin embargo, la metabolómica de estos niños se caracteriza por una mayor proporción relativa de acetato (208) reflejando la dominancia de Bifidobacterias y Lactobacillus (15). En este grupo se encontró, además, una menor abundancia de malonato en lactantes de leche materna, acorde a los datos publicados, que revelan una relación inversa entre la abundancia de Bifidobacterium y la riqueza de aminoácidos ramificados y sus metabolitos, glutamato y malonato (32), aumentando su riqueza con la introducción de la alimentación complementaria (34) que no correspondería a este rango de edad. Se encontraron datos discordantes con la literatura publicada en los resultados obtenidos en el rango de edad 2 (n 20; 6 vs 14). El grupo expuesto a lactancia materna presentó mayor abundancia significativa de 2-OH-3-metilvalerato, metabolito intermedio de catabolismo de aminoácidos ramificados isoleucina y valina. Conta et al. demostraron un aumento de aminoácidos ramificados con la introducción de la alimentación complementaria (34). Sin embargo, el aporte 126 proteico en lactantes de leche humana es menor que en aquellos alimentados con fórmula con una abundancia relativa significativamente menor de leucina, isoleucina y valina a la edad de 3, 6 y 9 meses, incluso tras el establecimiento de la alimentación complementaria (166). En el grupo analizado además se observó una menor abundancia significativa de succinato, metabolito intermedio de la glucolisis aeróbica en el ciclo de Krebs. Este hallazgo es contrario a lo publicado ya que el alto contenido de HMO en la leche humana, sobre todo en etapas precoces, induce una mayor abundancia relativa de metabolitos secundarios como lactato y succinato (163,215). Ambos hallazgos podrían estar en relación a la composición de la alimentación complementaria de los lactantes, variables no medida en nuestro estudio. Existen diferentes estudios que ponderan el modo de parto (3º objetivo) como factor principal en la composición y establecimiento de la microbiota intestinal en los primeros meses de vida (104). En líneas generales los lactantes nacidos por vía vaginal presentan una microbiota intestinal más diversa con mayor abundancia de Bifidobacterium, Bacteroides y Lactobacillus (103). Los lactantes nacidos por cesárea presentan mayor abundancia de especies patógenas relacionadas con el ambiente hospitalario (100). En nuestro estudio encontramos una diferencia significativa del género Clostridium XIVa, más abundante en lactantes nacidos por cesárea, acorde con la bibliografía revisada. Según los estudios publicados, las diferencias referidas en la composición de la microbiota, parecen conducir a diferencias en varias vías metabólicas: metabolismo de biotina, catabolismo de glicosaminoglicanos y AGCC (182). En el presente estudio no hallamos diferencias en el perfil metabolómico, en probable relación con el escaso número de muestras. En adultos se han descritos diferencias en la microbiota influenciada por el ambiente hormonal y, quizás, por patrones dietéticos diferentes asociados al sexo 127 (126). En niños existen pocos datos sobre el impacto de la variable sexo (4º objetivo) sobre la microbiota. Diferentes estudios coinciden en que existe mayor abundancia del filo Firmicutes y su género Lactobacillus en niñas, así como mayor abundancia de Bifidobacterium y menor de Bacteroidetes (132,49). También se ha descrito mayor abundancia de Clostridiales no clasificados en lactantes mujeres (210). En línea con este estudio, en el análisis de la variable sexo sobre la diversidad y composición de la microbiota, nuestro estudio mostró diferencias significativas en género Clostridium XIVa, con una mayor abundancia relativa en mujeres que hombres. No existen estudios en niños que analicen el efecto del sexo en la metabolómica intestinal. En adultos se han descrito diferencias en el metabolismo de los AGCC con una mayor abundancia de ácido butírico, valérico, propiónico e isovalérico en hombres (186). En nuestro estudio observamos una abundancia relativa significativamente inferior de tirosina y superior de p-cresol sulfato en mujeres, que podría estar relacionado con las diferencias encontradas en el efecto de la variable sexo sobre la microbiota con mayor abundancia del género Clostridium XIVa en el sexo femenino. El metabolito p-cresol es producto de la fermentación microbiana de la tirosina producido por grupos bacterianos de los géneros Coriobacteriaceae y clusters Clostridium XI y XIVa (211). Está bien establecido en la literatura el efecto temporal de la exposición a antibióticos (5-7ºobjetivo) sobre la diversidad y composición de la microbiota, con la pérdida de taxones importantes que altera su función metabólica. Existen menos datos acerca del tiempo que tarda en restablecerse ésta. Los cambios producidos por la antibioterapia parecen ser mayores en niños menores de 18 meses (38). 128 En nuestro estudio los lactantes menores de 13 meses presentaron menor alfadiversidad durante la exposición a antibióticos (5º objetivo). Este efecto fue significativo en los lactantes entre 7 y 13 meses y no significativo en los menores de 7 meses. Además, se observó menor abundancia de los filos Firmicutes y Actinobacteria en los menores de 7 meses. En el grupo de muestras pertenecientes a lactantes entre 7 y 13 meses los filos más afectados fueron igualmente Firmicutes y Actinobacteria en grupo de niños que recibían antibióticos en el momento de la recogida de muestras. Se observó menor abundancia significativa de la familia de Lachnospiraceae y sus géneros Clostridium XIVa, Anaerostipes y Lachnospiraceae no clasificadas y de la familia Veillonellaceae dentro del filo Firmicutes, así como, de la familia Bifidobacteriaceae y su género Bifidobacterium dentro del filo Actinobacteria. Estos cambios han sido previamente descritos por otros autores (37,40,142,144,145). Además, se ha encontrado una relación con el tipo de antibiótico recibido (135); los macrólidos parecen ejercer un efecto más profundo que los betalactámicos. La duración, el espectro y la vía de administración del antibiótico son aspectos importantes en el grado de disbiosis producido (212). Debido al pequeño tamaño muestral, en nuestro estudio no analizamos el efecto por tipo de antibióticos, sin embargo, un 95% de los ciclos de antibióticos recibidos por los pacientes fueron betalactámicos. Los filos Proteobacteria y Bacteroidetes no mostraron diferencias significativas entre los grupos analizados. La literatura publicada hasta la fecha muestra resultados contradictorios en los cambios de abundancia de estas poblaciones secundarios a la exposición a antibióticos (40,142). Como hemos referido en párrafos anteriores, no hemos encontrado diferencias significativas en alfa diversidad entre estos grupos etarios, aunque sí una tendencia a mayor alfa diversidad a medida que aumenta la edad. Este efecto ha sido descrito en literatura previa (142,143). 129 A nivel metabolómico, en lactantes pequeños (< 7 meses) se observó menor abundancia significativa de butirato en muestras expuestas actualmente a antibióticos. El butirato es uno de AGCC más abundantes, fuente de energía principal de los colonocitos; presenta baja abundancia hasta los 10 meses de vida aproximadamente (161,163). Las bacterias sacarolíticas (figura 19) de los filos Firmicutes (géneros Faecalibacterium, Clostridium XIVa, Anaerostipes, Roseburia, Lactobacillus) y Actinobacteria (Bifidobacterium) son los grupos responsables de su síntesis. Los filos Firmicutes y Actinobacteria mostraron una menor riqueza relativa durante la exposición a antibióticos, hecho que podría motivar el descenso en la abundancia de butirato en menores de 7 meses. En lactantes de 7-13 meses se encontraron diferencias significativas en vías metabólicas proteicas en el grupo de muestras expuestos a antibióticos en el momento actual. Se observó una menor abundancia significativa de los AACR (valina, leucina e isoleucina) y metabolitos intermedios de su síntesis (3-metil-2- oxopentanoato y 2-hidroxi-3-metil-pentanoato); menor abudancia de 5- aminopetanoato, metabolito de la vía de degradación de la lisina; de tiramina, amina biogénica y el p-cresol-sulfato, metabolito derivado de la fermentación de la tirosina. Los AACR son aminoácidos esenciales no sintetizados por mamíferos. El humano los adquiere a través de la dieta y mediante su síntesis por algunos taxones de la microbiota intestinal que conservan las vías metabólicas al igual que las plantas y hongos (157). Numerosas bacterias intestinales poseen vía metabólicas que permiten la síntesis de AACR, como Prevotella copri y Bacteroides vulgatus (filo Bacteroidetes) y otras que los consumen como Butyrivibrio crossotus (Lachnospiraceae sp.) y Eubacterium siraeum, ambos de filo Firmicutes (158). La menor abundancia de los AACR detectada en nuestro estudio podría deberse a un menor aporte dietético debido a la limitación de ingesta que presentan 130 muchos lactantes durante los procesos febriles; sin embargo, la menor abundancia de los metabolitos 3-metil-2-oxopentanoato y 2-hidroxi-3-metil-pentanoato implicados en su síntesis podría indicar una menor síntesis de AACR por parte de poblaciones intestinales productoras. Esta menor producción podría ser debida a la disbiosis producida por la exposición actual a antibióticos. La fermentación de los AACR está relacionada con el filo Bacteroidetes: Prevotella spp., Bacteroides ovatus, Bacteroides thetaiotamicron y Clostridium spp. (213). Por otra parte, numerosas bacterias intestinales poseen vía metabólicas que permiten la síntesis de AACR, tales como Prevotella copri y Bacteroides vulgatus (filo Bacteroidetes) y otras que los consumen como Butyrivibrio crossotus (Lachnospiraceae sp.) y Eubacterium siraeum, ambos de filo Firmicutes (158). Existen estudios en animales que demuestran una mayor abundancia de AACR en heces expuestas a antibióticos donde se demostró una mayor abundancia relativa de Bacteroidetes (214). En el estudio actual no estudiamos el nivel filogenético especie, pero no observamos cambios significativos en el género Bateroides o Prevotella. El 5-aminopetanoato (o 5-aminovalerato) es un metabolito de la vía de degradación del aminoácido lisina por metabolismo endógeno o de la microbiota. La lisina es metabolizada a cadaverina y esta a L-piperidina que se transforma a 5- aminopentaonato. Niveles altos de de 5-aminopentanoato traducen sobrecrecimiento bacteriano o necrosis de tejidos (215). La menor abundancia significativa en heces expuestas a antibióticos podría estar en relación a la menor ingesta del lactante durante el periodo de enfermedad o a la disbiosis producida. Los grupos bacterianos relacionados con el metabolismo de la lisina y formación de 5-aminopentanoato son Proteobacterias (E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas spp.), Clostridium perfringens y Veillonella spp. (216). 131 En nuestro estudio no observamos diferencias significativas en las familias Enterobacteriaceae, sin embargo, sí encontramos menor abundancia significativa de la familia Veillonellaceae en el grupo de muestras expuestas actualmente a antibióticos. Se ha observado, además, una menor abundancia significativa, en heces actualmente expuestas a antibióticos, de tiramina, amina biogénica con actividad simpaticomimética, y p-cresol-sulfato. Tiramina y p-cresol son productos derivados de la fermentación del aminoácido tirosina. La tiramina es un neurotransmisor producido por la dexcarboxilación de la tirosina por algunos taxones bacterianos como Enterococcus y Enterobacteriaceae. El p-cresol es un fenol, metabolito microbiano producto de la fermentación de la tirosina, producido por grupos bacterianos de los géneros Coriobacteriaceae y clusters Clostridium XI y XIVa (211). La menor abundancia del género Clostridium XIVa hallada en nuestro estudio podría, en parte, justificar este hallazgo. No existe homogeneidad en los artículos sobre la duración de los cambios producidos en la microbiota y metabolómica intestinal tras la exposición a antibióticos (6º objetivo). Existen estudios que limitan estos cambios a días o pocas semanas (140,145). Sin embargo, otros han encontrado un efecto más prolongado, que se extiende hasta 12 o 24 meses según el antibiótico usado (136). Los macrólidos parecen tener un impacto más duradero sobre la microbiota (20). No encontramos diferencias significativas en diversidad o composición de microbiota entre grupos de muestras expuestas o no a antibióticos en los últimos 30 días. Sin embargo, en lactantes de 7 a 18 meses, observamos una menor abundancia de Firmicutes y Actinobacteria, sin diferencia en los filos Bacteroidetes y Proteobacteria, es decir, cambios similares a los descritos durante la exposición a la antibioterapia, por lo que podría concluirse que dentro de los primeros 30 días 132 se mantienen cambios disbióticos producidos por los antibióticos, pero no después. En el estudio metabolómico, se encontraron diferencias significativas en la abundancia de los aminoácidos fenilalanina, leucina y de los metabolitos intermedios de la fermentación de aminoácidos beta-alanina (fermentación de leucina) y tiramina (fermentación de tirosina) en el grupo de muestras expuestas a antibióticos antes de 30 días comparadas con las muestras no expuestas a antibióticos. Los escasos estudios existentes sobre el impacto de la antibioterapia sobre la metabolómica fecal refieren un aumento de abundancia de aminoácidos fecales con la exposición a antibióticos explicado por la inhibición de vías metabólicas de la fermentación de estos al disminuir los grupos bacterianos responsables (195,196). Este efecto no lo hemos observado en nuestro estudio. Como hemos referido en párrafos anteriores, esta discordancia podría deberse a la menor ingesta de los lactantes durante el periodo de enfermedad. Al normalizarse la ingesta, si se mantuviera la disbiosis pasados 30 días, podría ocurrir este aumento de abundancia de ciertos aminoácidos tal y como documenta la literatura. Existen pocos estudios que hayan investigado el impacto de la duración del ciclo de antibióticos o días acumulados de antibioterapia (7º objetivo) sobre la microbiota y metabolómica intestinal. Leo et al. demostraron que ciclos cortos de antibióticos (≤ 7 días) producen el mismo efecto sobre la alfa-diversidad que ciclos largos (≥ 14 días) en adultos (217). En nuestro estudio observamos menor abundancia de los filos Firmicutes y Actinobacteria en lactantes entre 7 y 13 meses en muestras expuestas > 14 días a antibióticos frente a muestras no expuestas o expuestas un menor número de días. En lactantes entre 13 y 18 meses encontramos menor abundancia significativas del filo Actinobacteria, familia Bifidobacteriaceae y su género Bifidobacterium en el grupo expuesto > 14 días. Como se ha expuesto previamente, estos filos son los más afectados durante la 133 exposición a antibióticos y que parecen mantenerse los primeros 30 días tras esta exposición. Este efecto de ciclos largos de antibióticos (betalactámicos) sobre el género Bifidobacterium ha sido descrito por Zwittink et al. en neonatos prematuros (218). Es importante aclarar que en nuestro estudio medimos días acumulados de antibióticos en lugar de cursos de antibióticos prolongados, es decir, microbiota expuesta a sucesivos ciclos de antibióticos, restauración parcial o total de la disbiosis producida y nueva exposición. No hemos hallado diferencias en el perfil metabolómico asociados a número de días previos de antibióticos.