Estudio de la arquitectura epitelial en 3D, su variación natural y la aparición de patrones morfológicos a nivel celular

El Dr. Luis María Escudero Cuadrado, profesor titular del Departamento de Biología Celular e investigador principal del Instituto de Biomedicina de Sevilla, la Dra. Valentina Annese, profesora asociada del Departamento de Biología Celular y el Dr. Manuel Antonio Muñiz Guinea, catedrático del Departamento de Biología Celular CERTIFICAN: Que la memoria titulada “Estudio de la arquitectura epitelial en 3D, su variación natural y la formación de patrones morfológicos a nivel celular”, desarrollada por Carmen María Gordillo Vázquez, graduada en Bimedicina Básica y Experimental y beneficiaria de la ayuda para contratos predoctorales para la formación de doctores 2017 por el Ministerio de Ciencia e Innovación (Ref. BES-2017-082306), ha sido realizada bajo su supervisión y reúne requisitos necesarios para optar al título de Doctora por la Universidad de Sevilla. En Sevilla, a 15 de mayo de 2023. Fdo: Luis M. Escudero Cuadrado Director de tesis Fdo: Valentina Annese Directora de tesis Durante la realización de la tesis doctoral presentada en esta memoria, se han publicado los siguientes artículos científicos en revistas internacionales: •Gómez-Gálvez, P.*, Vicente-Munuera, P.*, Anbari. S.*, Tagua, A.*, Gordillo- Vazquez, C., Palacios, Franco-Barranco, D., A.M., Velasco, A., Capitan-Agudo, C., Grima, C., Annese, V., Arganda-Carreras, I., Robles, R., Márquez, A., Buceta, J. # and Escudero, L.M. # (2022). A quantitative biophysical principle to explain the 3D cellular connectivity in curved epithelia. Cell Systems, 13 (8). (*These authors contributed equally, # Corresponding authors). •Andrés-San Román, J.A.*, Gordillo-Vázquez, C.*, Franco-Barranco, D.*, Morato, L., Tagua, A., Vicente-Munuera, P., Palacios, A.M., Gavilán, M.P., Annese, V., Gómez-Gálvez, P. #, Arganda-Carreras, I. # and Escudero, L.M. # (2023) CartoCell, a high-throughput pipeline for accurate 3D image analysis, unveils cell morphology patterns in epithelial cysts. bioRxiv: 2023.01.05.522724. (*These authors contributed equally, # Corresponding authors). Bajo revisión en Cell Reports Methods. ÍNDICE Í n d i c e ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS………………………………………………………………………I ABREVIATURAS………………………………………………………………………………………..…V RESUMEN……………………………………………………………………………………………….…IX ABSTRACT…………………………………………………………………………………………..……XIII 1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………………1 1.1. La variación natural ........................................................................................... 3 1.2. El tejido epitelial ................................................................................................ 5 1.3. Morfogénesis epitelial y empaquetamiento celular .......................................... 7 1.4. La cistogénesis como modelo de morfogénesis epitelial................................. 10 1.5. Herramientas para caracterizar el empaquetamiento epitelial en tres dimensiones ................................................................................................................ 12 2. OBJETIVOS……………………………………………………………………………………………19 3. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………………………..…23 3.1. Cultivos celulares ............................................................................................. 25 3.2. Tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal ................................ 25 3.3. Procesamiento de las imágenes ...................................................................... 26 3.3.1. Segmentación semiautomática .................................................................... 26 3.3.2. Segmentación automática en 3D .................................................................. 28 3.4. Corrección manual de la segmentación .......................................................... 30 3.5. Cuantificación de parámetros morfológicos y de empaquetamiento ............. 32 3.6. Cuantificación del error de las características biológicas en cistos segmentados sin corrección manual ................................................................................................. 33 3.7. Análisis de la distribución espacial de las características celulares: “single cell cartography” ............................................................................................................... 33 3.8. Descriptores estadísticos ................................................................................. 35 3.9. Análisis estadístico ........................................................................................... 35 3.10. Disponibilidad de los datos ............................................................................ 36 4. RESULTADOS…………………………………………………..……………………………………37 4.1. Los cultivos tridimensionales de células epiteliales presentan variación natural .................................................................................................................................... 39 4.2. Caracterización sistemática de los cistos MDCK .............................................. 40 VI A b r e v i a t u r a s VII AJ: Unión adherente (Adherens junction) AMIS: Sitios de iniciación de la membrana apical (Apical membraneinitiation sites) ANN: Redes neuronales artificiales (artificial neuronal network) BSA: Albúmina de suero bovino (Bovine serum albumin) CMVT: Teselacion de Voronoi construida con los centros de masas de los núcleos celulares (Voronoi tessellation built from centers of mass of cell nuclei) CNN: Red neuronal convolucional (Convolutional neural network) CO2: Dióxido de carbono CV: Coeficiente de variación DAMP: Patrón molecular asociado a daño (Damage associated molecular pattern) DAPI: 4',6-diamidino-2-fenilindol DL: Aprendizaje profundo (Deep learning) DNN: Red neuronal profunda (Deep neuronal network) DOI: Identificador de objeto digital (Digital object identifier) DPBS: Dubelcco’s phosphate buffered saline ECM: Matriz extracelular (Extracellular matrix) EHS: Engelbreth-Holm-Swarm. Sarcoma murino rico componentes de la membrana basal. FBS: Suero fetal bovino (Fetal bovine serum) GUI: Interfaz gráfica de usuario (Graphic user interface) HAS2: Sintasa de ácido hialurónico 2 (Hyaluronic acid synthase 2) HGF: Factor de crecimiento hepático (Hepatocyte growth factor) ID: Identidad JAM: Molécula de adhesión de unión (Junctional adhesion molecule) LimeSeg: Lipid Membrane Segmentation MDCK: Madin-Darby canine kidney ML: Aprendizaje automático (Machine learning) p: p-valor Pha: Faloidina (Phalloidin) PFA: Paraformaldehído ROI: Región de interés (Region of interest) RT: Temperatura ambiente (Room temperature) SLSL: Monocapa, monolumen (Singlelayer, single-lumen) SPAID: Enfermedad autoinflamatoria del shar-pei (Shar-pei autoinflammatory disease) SD: Desviación estándar (Standard deviation) T1: Transición temporal T1 TJ: Uniones estrechas (Tight junctions) A b r e v i a t u r a s VIII Intercalación A-B: Intercalación apicobasal 2D: Dos dimensiones 3D: Tres dimensiones 3D-ECM: Matriz extracelular tridimensional (3D extracellullar matrix) ⍴: Coeficiente de correlación de Spearman IX RESUMEN X R e s u m e n XI Una de las cuestiones más fascinantes de la Biología del desarrollo es entender cómo los tejidos y órganos adquieren su forma, crítica para su función, en un proceso que se denomina morfogénesis. La fiel ejecución del programa morfogenético requiere un control espacio-temporal bastante preciso de numerosos mecanismos, incluidos los cambios en la forma celular. Sin embargo, este control deja margen para pequeñas variaciones que no afectan a la viabilidad del órgano u organismo, lo cual da lugar al fenómeno de la variación natural. En este contexto de variación intrínseca a la morfogénesis, también debe haber mecanismos pasivos o reguladores que la controlen, ya que un exceso en la variación durante el desarrollo de los tejidos puede ser perjudicial para su función. Aquí, exploramos la estocasticidad en el crecimiento de los cistos MDCK (Madin-Darby canine kidney) para comprender las causas y consecuencias de la variación natural durante la morfogénesis epitelial. Con este objetivo, desarrollamos un método de segmentación automática para imágenes de epitelios en tres dimensiones (3D), denominado CartoCell, que permite el análisis de alto rendimiento de cientos de imágenes de cistos MDCK. Nuestro método detecta de un modo realista la morfología tridimensional del tejido completo, así como de las células que lo componen y de sus contactos a lo largo de la estructura. Así, CartoCell permite la cuantificación precisa de numerosas características geométricas y de empaquetamiento, tanto a nivel tisular como celular. De este modo, encontramos que los cistos pueden adoptar un rango de diferentes formas. Por otra parte, el análisis de la variación de las características geométricas y de empaquetamiento, según la forma del cisto o a lo largo de su desarrollo, reveló que la variación natural obedece una serie de restricciones y que existen características robustas que persisten a la variación para garantizar la estabilidad de la cistogénesis. Finalmente, completamos el estudio con el análisis de la distribución espacial de los valores de las características celulares (enfoque que denominamos “cartografía celular o single-cell cartography”) y descubrimos que existen patrones de morfología celular dentro de los cistos MDCK. En conjunto, pensamos que nuestro marco de estudio puede servir como referencia para identificar las restricciones geométricas que impulsan la autoorganización en el desarrollo de los tejidos epiteliales. XII XIII ABSTRACT XIV A b s t r a c t XV A fascinating question in Developmental Biology involves understanding how tissues and organs acquire the shape that is critical to their function, in a process called morphogenesis. The faithful execution of the morphogenetic program requires an accurate spatiotemporal control of several mechanisms, including changes in cell shape. However, this control allows for some variations that do not affect the viability of the organ or organism, resulting in the emergence of natural variation. In this context of intrinsic variation during morphogenesis, there must also be passive or regulatory mechanisms that control it because uncontrolled variation during development can be detrimental to tissue function. Here, we explore the stochasticity of MDCK (Madin-Darby canine kidney) cysts to understand the causes and consequences of natural variation during epithelial morphogenesis. To this aim, we have developed an automatic segmentation method for three-dimensional (3D) epithelial images called CartoCell, which allows high-throughput analysis of hundreds of MDCK cysts. Our method can detect, in a realistic way, the 3D morphology of the whole tissue, as well as the the individual cells constituting the cyst. Therefore, we can quantify geometric and packing features at tissue and cellular resolution. We found that cysts can adopt different shapes. Moreover, the analysis of geometric and packing features (depending on shape or time) revealed several constraints on the natural variation of cystogenesis and demonstrated that certain features are robust to ensure the stability of the process. Finally, we concluded this study with the implementation of the “single-cell cartography” approach that provides insights into the distribution of cellular feature values, revealing cell morphology patterns on MDCK cysts. Taken together, we believe that our strategy can serve as a reference to study how geometrical constraints drive self-organization of epithelial tissues. 1 . I n t r o d u c c i ó n 6 localizan en el dominio basal de la membrana plasmática (Giepmans & van IJzendoorn, 2009; Kozyrina et al., 2020). Las células epiteliales tienen una notable capacidad para adoptar una variedad de formas. Tradicionalmente, se han clasificado en tres grupos principales: a) células escamosas (cuando su anchura es mayor que su altura); b) células cuboidales (altura y anchura similares); y c) células columnares (altura superior a anchura) (Figura 2B). La forma adoptada está íntimamente relacionada con la función del tejido; por ejemplo, las células planas permiten una difusión rápida y, por ello, los alveolos pulmonares están formados por epitelios escamosos que posibilitan el intercambio de gases. Los epitelios cúbicos a menudo se localizan en los conductos de las glándulas como en los túbulos renales o en las glándulas salivales; mientras que los epitelios columnares, pueden encontrarse revistiendo el tracto digestivo para permitir la absorción y secreción de sustancias. Si bien muchos epitelios existen como monocapas (o epitelios simples), las células epiteliales también pueden disponerse en varias capas en el tejido, formando epitelios estratificados (Figura 2B). Además, existe una variante del epitelio simple llamada epitelio pseudoestratificado, que se caracteriza porque sus núcleos se disponen a diferentes alturas, y, aunque a primera vista parece estar estratificado, en realidad está formado por una sola capa de células con diferentes alturas (Lemke & Nelson, 2021). 1 . I n t r o d u c c i ó n 7 Figura 2. Formas e interacciones de las células epiteliales. A) Esquema que representa los principales tipos de interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular en epitelios de mamíferos. B) Representación esquemática y simplificada de las formas que adoptan las células que forman los tejidos epiteliales. Modificado de (Lemke & Nelson, 2021). 1.3. Morfogénesis epitelial y empaquetamiento celular La morfogénesis epitelial comprende los procesos a través de los cuales los epitelios contribuyen a la formación de estructuras tridimensionales como hendiduras, surcos, cavidades o tubos que llevan a la formación de los tejidos y órganos. Estos eventos juegan un papel crucial durante el desarrollo embrionario y la formación de los tejidos. Durante la morfogénesis epitelial, las células adquieren identidades posicionales, como en un sistema de coordenadas, determinadas por gradientes de morfógenos y otras señales bioquímicas y mecánicas que se propagan a través del tejido (Wolpert, 2016). Posteriormente, las células procesan y responden a este patrón de información posicional para participar de forma efectiva en la remodelación del tejido e impulsar el desarrollo del organismo (Lecuit & Lenne, 2007). La morfogénesis epitelial se puede comparar con el arte del origami (Osterfield et al., 2017; Zartman & Shvartsman, 2010), ya que en ambos procesos se modela (mediante pliegues o patrones de expresión génica) una hoja bidimensional (de células o de papel) hasta transformarla en una estructura en tres dimensiones (3D). Ahora bien, la morfogénesis epitelial es mucho más compleja. Implica cambios en el número, tamaño, forma y empaquetamiento de las células. Y, además, dado que la función de un órgano depende de que adquiera correctamente su forma, todos estos cambios deben estar finamente coordinados en el tiempo y en el espacio bajo el control de múltiples mecanismos físicos y moleculares, lo que añade complejidad al proceso (Aigouy et al., 2016). Cómo las células se empaquetan y dan forma a los tejidos durante la morfogénesis epitelial es una pregunta fundamental que aún no se ha resuelto, en gran parte, por la falta de métodos que permitan capturar y cuantificar la disposición en 3D de las células en el tejido. Tradicionalmente, el estudio del empaquetamiento epitelial se basó en el análisis en dos dimensiones (2D). Esta visión se reduce a una de las superficies celulares (generalmente, la superficie apical), asumiendo que, en el plano, las células se comportan como polígonos dentro de una teselación o mosaico; esto es, una disposición que no deja espacio vacío entre las unidades individuales (en este caso, las células epiteliales) (Sánchez-Gutiérrez et al., 2017). Esto permite identificar cada célula como un polígono de tantos lados como células vecinas tenga, donde las aristas representan la unión entre dos células vecinas y los vértices son el punto en el que se encuentran tres o más células. 1 . I n t r o d u c c i ó n 8 Se han desarrollado varias estrategias para encontrar una descripción matemática apropiada de tal mosaico celular. Un enfoque particularmente útil es el llamado “diagrama de Voronoi o teselación de Voronoi”, formado por polígonos convexos (llamados celdas de Voronoi) que no se superponen ni dejan huecos entre ellos. En un diagrama de Voronoi, cada celda emerge de un punto o semilla y se caracteriza porque todos los puntos que pertenecen a la celda están más cerca de su correspondiente semilla que de cualquiera otra (Voronoi, 1908). Los diagramas de Voronoi presentan un aspecto similar a la mayoría de las superficies epiteliales, con un patrón de contactos celulares que se ajusta de una manera bastante fiel a la organización del tejido cuando se utilizan los centros de masas de las células como semillas (Honda, 1978) (Figura 3). Figura 3. Diagrama de Voronoi y tejidos empaquetados. A) Imagen de microscopía de contraste de fase de células del epitelio pigmentario de la retina de embrión de pollo. B) Diagrama de Voronoi creado a partir de un conjunto de semillas, donde cada celda de Voronoi está formada por los puntos más cercanos a su semilla. Los puntos en la celda de Voronoi que emerge de la semilla azul están más cercanos a la semilla azul que a las semillas verdes que le rodean. Modificado de (Honda, 1978). La representación bidimensional de los epitelios como teselaciones poligonales, ha permitido emplear principios matemáticos al estudio del empaquetamiento epitelial, entre los que se incluyen: a) el Teorema de Euler, que establece que el número promedio de vecinos de una célula será próximo a seis (Euler, 1767.); b) la ley de Lewis, según la cual existe una relación lineal entre el área promedio de una célula y su número de lados; es decir, las células pequeñas tienden a tener menos lados (y por tanto, menos células vecinas) y las células grandes, tienden a tener un mayor número de lados (o vecinos) (Lewis, 1928); y c) la Ley de Aboav-Weaire, según la cual existe una relación inversa entre el número promedio de lados de una célula y el promedio de lados de sus células vecinas (Aboav, 1970; Chiu, 1995). Basándose en las observaciones de los estudios en 2D, las células epiteliales tradicionalmente se han representado en 3D como prismas con bases poligonales que simbolizan sus superficies apicales y basales (Figura 4A). Como consecuencia, bastaría conocer una de las superficies celulares para comprender la arquitectura tridimensional del tejido y la conectividad celular. Por otra parte, se ha descrito que, cuando el tejido se curva, ya sea por invaginación, plegamiento o tubulogénesis, las células reducen una de las superficies (apical o basal) y adoptan forma de pirámide truncada o “frustrum” 1 . I n t r o d u c c i ó n 9 (Barsky et al., 2003; Gómez-Gálvez et al., 2021) (Figura 4B). En ambos casos, se ha asumido que las células mantienen el mismo número de lados en las superficies apicales y basales, y, por lo tanto, están rodeadas por las mismas células vecinas. Sin embargo, en el tejido se producen reordenamientos celulares que implican intercambios de células vecinas. El intercambio de vecinos mejor descrito se conoce como transición T1, que provoca una intercalación de vecinos en el tiempo durante procesos morfogenéticos como la elongación de la banda germinal del embrión de Drosophila melanogaster (Kong et al., 2017). Aún en estas circunstancias, las células también se han representado mediante formas prismáticas, de manera que la identidad de vecinos en las superficies apical y basal se mantiene en un tiempo determinado (Figura 4C). Este paradigma, basado en representaciones simples de las células epiteliales como prismas, no es fiel a la realidad. Debe considerarse que, en los epitelios (predominantemente en los tejidos curvos), a menudo se producen intercalaciones apico-basales, que hacen que las células estén rodeadas por diferentes vecinos en las superficies apicales y basales. Este fenómeno minimiza la energía del tejido y hace que la célula adopte una forma geométrica diferente, denominada escutoide (en inglés, scutoid) (Gómez-Gálvez et al., 2018) (Figura 4D). Los escutoides pueden acomodar el cambio de vecinos en algún lugar a lo largo del eje apico-basal. En el caso particular de los prismatoides, el cambio de vecinos se experimentaría en una de las dos superficies (Gómez-Gálvez et al., 2021) . Las intercalaciones apico-basales permiten los reordenamientos dinámicos de las células dentro del tejido 3D. Este fenómeno es crucial para comprender cómo se produce la dinámica de la organización tisular durante los procesos morfogenéticos. Además, cuestiona algunos de los principios matemáticos que describen el empaquetamiento epitelial. En concreto, el número medio de vecinos celulares en 3D, una medida de la conectividad celular, no puede cumplir el Teorema de Euler (y ser seis) si se producen intercalaciones a lo largo del eje apico-basal. En este sentido, recientemente se ha descrito un principio cuantitativo que permite entender la conectividad celular en 3D. Según este principio, en epitelios tubulares, la media del número de vecinos en 3D 〈𝑛3𝐷〉 es directamente proporcional al promedio de intercalaciones apico-basales 〈𝑖〉 del tejido, de manera que: 〈𝑛3𝐷〉= 6 + 〈𝑖〉/2 (Gómez- Gálvez et al., 2022). En resumen, el descubrimiento de los escutoides dentro de los epitelios supone que la forma 3D de las células no pueda asumirse a partir de su dominio apical o basal. Esto significa que, para conocer de forma realista el empaquetamiento epitelial, es necesario desarrollar herramientas que permitan realizar reconstrucciones 3D del tejido. 1 . I n t r o d u c c i ó n 10 Figura 4. Formas celulares en 3D en monocapas epiteliales. A) Iluistración de un epitelio plano donde las células se representan como prisas. B) Cuando el epitelio se curva, las células adoptan forma de pirámide truncada o frustrum. C) Transición T1, que implica el intercambio de células vecinas a lo largo del tiempo. D) En tejidos curvos, las células epiteliales pueden adoptar forma de scutoid (izquierda). Los scutoids implica el intercambio de células vecinas a lo largo del eje apico-basal, denominado transición apicobasal (derecha). Modificado de (Blanchard, 2018). 1.4. La cistogénesis como modelo de morfogénesis epitelial Durante la morfogénesis epitelial se orquestan en el tiempo y en el espacio diferentes mecanismos celulares, como: migración, proliferación y muerte celular programada, así como cambios en la forma de las células y reordenamientos de los contactos celulares. Estos procesos morfogenéticos conservados dan lugar a estructuras tridimensionales complejas como hendiduras, túbulos o acinos, que se organizan para formar los órganos epiteliales. Para comprender los eventos celulares que subyacen a la organogénesis epitelial, se han desarrollado modelos de cultivo celular en 3D, que imitan la complejidad de la arquitectura epitelial de los tejidos in vivo y recapitulan muchas de las características de crecimiento de los órganos epiteliales (Engelberg et al., 2011). Una de las líneas celulares más empleadas en estudios in vitro son las células MDCK (Madin-Darby canine kidney), que proceden del epitelio del túbulo renal de perro (en 1 . I n t r o d u c c i ó n 11 concreto de la región del túbulo distal renal) (Taub et al., 1979). En modelos de cultivo celular en 2D, estas células crecen formando monocapas epiteliales adheridas a un soporte sólido. Sin embargo, en condiciones óptimas de cultivo en 3D, donde las células crecen en un sustrato de matriz extracelular (ECM), las MDCK se autoorganizan y establecen, de forma espontánea, estructuras tridimensionales denominadas cistos. Desde el punto de vista morfológico, los cistos son agregados formados por una capa de células epiteliales polarizadas que encierran un lumen central, donde el dominio apical de las células contacta con el lumen, el dominio basal, con la ECM y los dominios laterales, con las células vecinas (Wells et al., 2013; Willenborg & Prekeris, 2011) (Figura 5A). La polarización de las células es un proceso complicado y se inicia a través de señales bioquímicas y mecánicas que provienen de la matriz extracelular (contactos célula-ECM) y de las células adyacentes (contactos célula-célula) y que provocan cambios en la organización del citoesqueleto y del tráfico endosomal (Hamze-Komaiha et al., 2016). La formación de novo del lumen en los cistos puede producirse a través de dos mecanismos: vaciado (en inglés, hollowing) y cavitación (en inglés, cavitation) (Figura 5B). En el primer caso, el lumen surge debido a la exocitosis de vesículas apicales preformadas y separación de las membranas celulares para formar un espacio luminal en la interfaz célula-célula, llamado sitio de iniciación de la membrana apical (AMIS; del inglés apical membrane-initiation sites) (Bryant et al., 2010). En el segundo caso, el lumen es resultado de la apoptosis de las células que se encuentran en el interior de la estructura. Dependiendo del grado de polaridad alcanzado por las células, los mecanismos que participan en la formación de novo del lumen en los cistos de MDCK pueden fluctuar entre el vaciado y la cavitación. Cuando las células se polarizan lentamente (por ejemplo, cuando los cistos crecen sobre colágeno), el tráfico de vesículas ocurre más lentamente que la división celular, y a menudo, las vesículas que se dirigen hacia la membrana apical se fusionan en las uniones célula-célula, dando como resultado la formación de múltiples lúmenes. En este caso, la cavitación proporciona un mecanismo lento pero robusto para la formación de un único lumen. Sin embargo, cuando las células se polarizan rápidamente (por ejemplo, cuando crecen sobre Matrigel, una matriz de la membrana basal solubilizada secretada por las células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)), el lumen se forma sin apoptosis (Martín-Belmonte et al., 2008; Rodríguez-Fraticelli et al., 2011). Por otra parte, la exposición de los cistos al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF; del inglés hepatocyte growth factor) induce la formación de túbulos ramificados, similar a la que se produce durante la tubulogénesis renal in vivo (Figura 5C). Ambas estructuras, cistos y túbulos, constituyen los principales bloques de construcción durante el desarrollo y crecimiento de los tejidos epiteliales, tales como los riñones, los pulmones o las glándulas mamarias (Guo et al., 2008) (Figura 5D). Por ello, los cultivos en 3D de las células MDCK proporcionan un excelente modelo para explorar los mecanismos que subyacen la organogénesis epitelial. 1 . I n t r o d u c c i ó n 12 Figura 5. Cistos y túbulos constituyen los principales bloques de construcción de los órganos epiteliales. A) En cistos y túbulos, una capa de células epiteliales encierra un lumen central. Cada célula de esta monocapa presenta tres dominios de membrana especializado, con una distribución diferencial de lípidos proteínas y componentes del citoesqueleto: apical, lateral y basal. B) En los cistos, la formación de novo del lumen puede ocurrir a través de dos mecanismos: vaciado y cavitación. C) La exposición de los cistos a HGF induce la formación de túbulos ramificados. D) Los cistos y túbulos son los bloques de construcción básicos de los órganos epiteliales internos. Modificado de (O’Brien et al., 2002; Zegers, 2014). En otro orden de ideas, cabe destacar que, aunque se mantengan estables las condiciones de cultivo, de base, suele haber una gran variabilidad asociada a la cistogénesis en términos de morfología y arquitectura tisular (Beck et al., 2022); y, además, cambios en el protocolo de crecimiento de los cistos podrían alterar dicha variabilidad. En este sentido, queda por resolver la pregunta de qué aspectos de su morfología son inmutables (tienen mayor robustez) y cuáles permiten una mayor variación natural. 1.5. Herramientas para caracterizar el empaquetamiento epitelial en tres dimensiones Para comprender cómo varía la forma y la organización de las células durante la cistogénesis epitelial, se requieren métodos de análisis de imagen que permitan la identificación completa en 3D de las células que constituyen el tejido. En el procesamiento de imágenes digitales, se denomina segmentación al proceso mediante el cual una imagen se divide en regiones de interés específicas. En el caso de imágenes biológicas, estas regiones pueden ser, por ejemplo, núcleos, orgánulos celulares o células (Roeder et al., 2012). Por ello, la segmentación es la base de numerosos estudios relacionados con el conteo de células (detección de un número), la identificación de tipos 1 . I n t r o d u c c i ó n 13 celulares (formas), la cuantificación de la migración (morfodinámica), la interacción celular (organización tisular) y las estructuras intracelulares (organización celular) (Meijering, 2012). Los algoritmos de segmentación pueden clasificarse en: segmentación semántica y segmentación de instancias. La segmentación semántica consiste en asignar cada píxel de la imagen a una categoría (por ejemplo, células) mientras que la segmentación de instancias identifica objetos individuales dentro de esa categoría (por ejemplo, detectar por separado cada célula que se muestra en una imagen) (Wang et al., 2022). Se han desarrollado numerosos métodos de análisis de imagen para la segmentación de los tejidos epiteliales planos en 2D. Las operaciones fundamentales en las que se basan son dos: a) determinar la ubicación de las células en la imagen, y b) identificar los límites de las células individuales. Esta última tarea resulta complicada debido a que existen diferentes protocolos de tinción que hacen que el contorno de las células no sea homogéneo, y, además, la diferencia de intensidad entre el interior de la célula y el borde celular puede no ser muy pronunciada. Por estos motivos, a menudo la segmentación se basa en el reconocimiento nuclear, ya que los núcleos teñidos tienen una apariencia más uniforme, no solapan entre sí y la diferencia con respecto al fondo de la imagen es más notable. Desde este enfoque, los centros de masas de los núcleos celulares pueden utilizarse como “semillas” que se propagan para definir el citoplasma celular. Este tipo de segmentación se basa en los diagramas de Voronoi en 2D, pues de cada semilla emerge una célula que contiene todas las coordenadas más cercanas a su semilla que a cualquierg otra y forma una teselación de polígonos convexos que no se superponen (CMVT, del inglés Voronoi tessellation built from centers of mass of the cell nuclei) (Jones et al., 2005; Kaliman et al., 2016). Aunque la segmentación basada en el reconocimiento nuclear se ha convertido en un método aceptado y bastante común para la reconstrucción celular en 2D, a menudo este procedimiento no determina de un modo preciso la forma ni las interacciones celulares. Por ello, y aunque computacionalmente resulta más complicado, se han desarrollado herramientas de análisis de imagen que permiten detectar directamente los contornos celulares en tejidos en los que se ha utilizado un marcador de membrana (Lucchi et al., 2012; Mosaliganti et al., 2012). La mayoría de estos enfoques se han limitado a segmentaciones en 2D. Sin embargo, para conocer de un modo realista la forma y el empaquetamiento celular de los epitelios, es fundamentar llevar a cabo la segmentación celular en un contexto tridimensional. En este sentido, se han desarrollado varios métodos de segmentación en 3D, basados en el reconocimiento del núcleo (Boutin et al., 2018; Chen et al., 2013; Katzman et al., 2018; Lou et al., 2014) así como de los contornos celulares (Machado et al., 2019; Takko et al., 2020). Aunque los primeros no logran una segmentación precisa, se utilizan con más frecuencia que los segundos, ya que los núcleos son estructuras localizadas y bien separadas, a diferencia de los contornos celulares, que forman redes complicadas. Además, la atenuación del láser en los cortes 1 . I n t r o d u c c i ó n 14 más profundos del tejido, supone un desafío adicional para la segmentación. En estos casos, una mayor exposición o potencia del láser pueden mejorar la calidad de la imagen, pero esto puede suponer la destrucción fotoquímica del fluoróforo (en inglés, photobleaching). Por esta razón, durante la adquisición de las imágenes, es necesario un equilibrio cuidadoso entre la calidad de la imagen y el photobleaching (Cao et al., 2020). Por todo ello, y aunque en la última década se han realizado varios intentos para mejorar el rendimiento, la segmentación 3D basada en los contornos celulares continúa siendo un reto en la actualidad. Por otra parte, el estudio cuantitativo a gran escala de la cistogénesis implica la segmentación de un número considerable de muestras. Mientras que los microscopios de última generación permiten generar numerosas imágenes de forma relativamente rápida, la posterior segmentación de las imágenes obtenidas se ha convertido en el cuello de botella de este proceso. Por ello, en las últimas décadas se han desarrollado diferentes métodos para conseguir una segmentación automática de las imágenes. Muchos de estos métodos se basan en el aprendizaje automático (en inglés, machine learning, ML), que utiliza algoritmos matemáticos que “aprenden” de los datos introducidos. Así se genera un “modelo” que posteriormente utiliza ese conocimiento para sacar conclusiones de nuevos datos. Aplicado al campo del análisis de imagen, el usuario debe proporcionar un conjunto de imágenes segmentadas manualmente para el entrenamiento del modelo, a partir de las cuales extraerá un conjunto de características comunes que luego utilizará para discriminar objetos (como, por ejemplo, células) en las nuevas imágenes. Las técnicas de ML se utilizan de forma eficaz para la clasificación y segmentación de imágenes biológicas (Caicedo et al., 2017; Sommer & Gerlich, 2013). Más recientemente, se han desarrollado herramientas basadas en el aprendizaje profundo (en inglés, deep learning, DL), una técnica de ML que trabaja con “redes neuronales artificiales” (ANN; del inglés, artificial neuronal network) con múltiples capas para procesar la información y extraer datos de forma automática. Las ANN son algoritmos con una arquitectura inspirada en las conexiones neuronales del cerebro humano, con nodos de neuronas que se conectan en una red. Así, de la misma forma que una neurona del cerebro procesa y transmite la información, los nodos neuronales toman los datos de entrada (en inglés, input), los procesan y el resultado lo envían como salida (en inglés, output). Las redes neuronales convolucionales (CNN; del inglés, convolutional neural network) son el tipo de red DL más usado en el análisis de imagen y utilizan operaciones de convolución para procesar los datos de entrada. Entre las CNN más populares se encuentran las redes U-NET (Ronneberger et al., 2015) y RESUNET (Diakogiannis et al., 2019), cuya arquitectura ha demostrado ser eficaz en la segmentación automática de imágenes de diferentes tejidos epiteliales (Aigouy et al., 2020; Wolny et al., 2020). Existen varios softwares diseñados para la segmentación automática de imágenes en 3D, pero solo unos pocos son accesibles a usuarios no expertos en programación, como 1 . I n t r o d u c c i ó n 15 StarDist 3D (Weigert et al., 2020), CellPose (Stringer et al., 2021) o PlantSeg (Wolny et al., 2020). Además, el entrenamiento de las redes DL es computacionalmente costoso y a menudo se requiere disponer de un equipo potente capaz de soportarlos. Como alternativa, es posible utilizar ZeroCost, una plataforma en línea fácil de usar, que aprovecha la potencia computacional de Google Colaboratory (o Google Colab) para ofrecer una amplia variedad de tareas de DL; entre ellas, entrenar modelos con datos propios, validar su rendimiento o implementar modelos pre-entrenados con nuevos datos (von Chamier et al., 2021). Aunque los métodos de segmentación automatizados consiguen un mayor rendimiento del análisis, también toleran una frecuencia significativa de errores. Por este motivo, para conseguir unos resultados óptimos, la segmentación final a menudo requiere de una corrección manual costosa que precisa mucho tiempo (Bulten et al., 2019; Farrell et al., 2017; Heller et al., 2016). Por lo tanto, se requiere seguir diseñando herramientas computacionales sofisticadas que permitan segmentar, de forma automática y con precisión, células epiteliales en tejidos tridimensionales. En este sentido, nuestro grupo ha desarrollado un método de análisis de imagen basado en DL para la segmentación automática de cistos MDCK en 3D. Nuestro método proporciona herramientas para el procesamiento de las imágenes, la segmentación y la visualización de los datos de una forma totalmente automática, así como herramientas para inspeccionar y corregir errores de forma manual. De este modo, es posible obtener una segmentación precisa del tejido en un amplio número de muestras, para poder estudiar de forma óptima cómo actúa la variación natural durante la morfogénesis epitelial de los cistos MDCK. 24 3 . M a t e r i a l e s y M é t o d o s 25 3.1. Cultivos celulares La línea celular empleada ha sido MDCK II y fue cedida por la Dra. María de la Paz Gavilán Dorronzoro, del grupo de investigación liderado por la Dra. Rosa Ríos (CABIMER, Sevilla). Estas células derivan de cultivos de pase alto de la línea parental MDCK, procedente del túbulo renal de cocker spaniel adulto (Dukes et al., 2011). Las células se mantuvieron en medio esencial mínimo MEM-GlutaMAX™ Supplement (Gibco), que presenta GlutaMAX, un dipéptido de L-alanina y L-glutamina estable en solución acuosa. El medio fue suplementado con suero fetal bovino (FBS, del inglés fetal bovine serum; al 10% v/v) y penicilina/estreptomicina (1% v/v) (medio completo). Las células se incubaron a 37°C, en atmósfera al 5% de dióxido de carbono (CO2) y su manipulación se llevó a cabo en condiciones de esterilidad, trabajando en campana de flujo laminar. Para la formación de los cistos 3D, las células MDCK se tripsinizaron (en 0.25% tripsina- EDTA, Sigma) y se filtraron por una malla de nylon de 40 µm de poro (Becton Dickinson) para eliminar agregados celulares. Entonces, 500 µl de una suspensión celular, con una concentración de 500 células por cada 100 µl de medio completo adicionado con un 2% v/v de Matrigel (Corning), se sembraron en cada pocillo de un portaobjeto para cultivo celular de 4 cámaras (Corning), previamente cubierto con 16 µl de Matrigel sin diluir. Los cistos se mantuvieron en cultivo durante 4, 7, o 10 días a 37ºC, cambiando el medio cada 48 horas. 3.2. Tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal Los cistos crecidos en los portaobjetos para cultivo celular de 4 cámaras (Corning), se fijaron durante 20 minutos con paraformaldehído (PFA) al 4% (p/v) (Sigma) a temperatura ambiente (RT, del inglés, room temperature) y se trataron con una solución de Dubelcco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS), libre de Ca2+ y Mg2+ (Biowest) al 5% (v/v) de Tritón X- 100 (Sigma) durante 15 minutos a RT, para permeabilizar las membranas celulares. Posteriormente, se realizó un bloqueo de los sitios de unión no específicos de los anticuerpos con una solución de DPBS al 3% (p/v) de albúmina de suero bovino (BSA; del inglés, bovine serum albumin) (AppliChem) y al 0.02% (p/v) de Saponina (Sigma), durante 2 horas a RT. A continuación, los cistos se incubaron con los anticuerpos primarios diluidos en la solución de bloqueo durante toda la noche a 4ºC. Para marcar la membrana basal y basolateral de las células, se utilizó el anticuerpo policlonal anti-β-catenina producido en conejo (Sigma, Cat.# C2206) a 1:1000 y el anticuerpo monoclonal anti-β1- integrina producido en rata (Developmental Studies Hybridoma Bank, DSHB, Cat.# AIIB2) (concentración final: 1µg/ml). Tras tres lavados de 5 minutos con la solución de bloqueo de DPBS-BSA-Saponina, los cistos se incubaron durante 90 minutos a RT con los anticuerpos secundarios anti-IgG de conejo conjugado con el fluorocromo Alexa-568 (Invitrogen, Cat. # A11011) a una dilución final de 1:800 y con el anticuerpo anti-IgG de 3 . M a t e r i a l e s y M é t o d o s 26 rata conjugado con Alexa-488 (Invitrogen, Cat.# A11006) a 1:1000. Además, se añadió a esta solución, DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol; Sigma) a una dilución final de 1:1000 para el marcaje del núcleo celular y Faloidina (Pha, del inglés Phalloidin) conjugada con el fluorocromo Alexa-647 (Invitrogen, Cat.# A22287) a una concentración final de 0.08 µM, para marcar los filamentos de actina del citoesqueleto. Después de tres lavados con DPBS, se llevó a cabo el montaje en el medio acuoso Fluoromount-G (SouthernBiotech). Finalmente, se realizó la adquisición de imágenes, mediante el sistema de microscopía confocal de barrido de alta velocidad y resolución Nikon A1R+, con dos configuraciones diferentes, dependiendo del experimento (Tabla 1). Configuración 1 Configuración 2 Objetivo 40x 20x Zoom Variable, entre 3-6X 1 Formato 1024x1024 1024x1024 Velocidad de escaneo 0.25 ms 0.5 ms Promedio de línea Medio Medio Conteo 2 - Profundidad de sección 0.5 µm 0.7 µm Adquisición en el eje Z Top to bottom Top to bottom Resolución en XY 11.54-16.50 pixels/micron 1.6248 pixels per micron Tabla 1. Configuraciones utilizadas para la adquisición de imágenes de microscopía confocal. 3.3. Procesamiento de las imágenes 3.3.1. Segmentación semiautomática Imágenes de microscopía confocal, adquiridas según la Configuración 1 (Tabla 1), fueron utilizadas para la segmentación completa de las células que forman los cistos en 3D. Para ello, se utilizó LimeSeg (del inglés, Lipid Membrane Segmentation), un complemento del paquete de procesamiento de imágenes FIJI (Schindelin et al., 2012). LimeSeg es un método de contorno activo basado en partículas, capaz de segmentar objetos de imágenes en 3D, donde dichos objetos tienen marcados sus contornos (Machado et al., 2019). En el caso de los cistos, las células tienen marcadas sus membranas. Un contorno activo es un algoritmo de seguimiento de contorno en el que se establece una forma inicial próxima a los bordes del objeto, que actúa como una curva elástica deformándose como resultado de la actuación de fuerzas internas y externas, hasta delimitar la región de interés, en este caso, la membrana celular. Antes de realizar la segmentación, fue necesario un preprocesamiento de las imágenes en FIJI, en el que se combinaron los canales rojo (Pha) y verde (β-catenina) y se convirtieron en imágenes en escala de grises, donde aparecían los contornos celulares bien delimitados (Figura 6A y B). 3 . M a t e r i a l e s y M é t o d o s 27 A continuación, se dibujaron ROIs (del inglés, region of interest) circulares en el centro de cada una de las células, que sirvieron como semillas para inicializar la segmentación y que crecieron hasta llegar al límite celular, definido por el marcaje de las membranas (Figura 6C). Además de estas semillas de segmentación, LimeSeg requiere que se configuren de forma manual una serie de parámetros: - D_O: Su valor se mide en píxeles y varía entre 1 y 20. Un valor bajo permite la detección fina de los detalles, pero implica una reducción en la velocidad de segmentación. Un valor demasiado alto, hace que se pierdan detalles importantes. Para la segmentación de las imágenes de cistos, se utilizó un valor de entre 5-6 píxeles. - F-pressure: Es la presión predeterminada ejercida sobre la superficie, también denominada balloon force en los métodos de contorno activo. La curva elástica mencionada anteriormente, se imagina como un balón que se infla progresivamente. Cuando llega a los bordes, si estos están bien definidos, se detiene; si son débiles con respecto a la fuerza de inflación, sobrepasaría dichos bordes. Un valor positivo conduce a una expansión, mientras que un valor negativo conduce a contracción. El intervalo de valores que toma suele estar entre [-0.03..0.03]. En la segmentación de los cistos, se establecieron valores positivos que no superaban el valor de 0.02. - Z_scale: valor fijo en cada imagen que se calcula como la relación entre la profundidad del vóxel (espacio establecido dentro del eje Z) y el ancho del píxel (espacio establecido en el eje X o Y). - Range_D0: es un rango en píxeles para buscar una característica cuyo nivel de intensidad sea máximo. El intervalo de valores que toma se encuentra entre 0.5 y 10 y depende también del parámetro D_0. Por ejemplo, un valor de 2, con D_0 = 2, significa que se buscará un máximo en el rango [−4, +4] píxeles de alrededor. En este caso, se fijó un valor de 1. Una vez establecidos los parámetros, LimeSeg hace crecer las semillas colocadas manualmente en 3D, hasta que convergen en los límites celulares (Figura 6D-E). Figura 6. Segmentación en 3D mediante LimeSeg. A) Sección óptica de una imagen de microscopía confocal de un cisto de 7 días, teñido con Pha (rojo) y anti-β-catenina (verde). Barra de escala = 10 µm. B) Imagen convertida a escala de grises. C) ROIs circulares utilizadas como semillas para segmentar la imagen. D) Visualización de LimeSeg en ejecución en el visor 3D del programa. E) Representación tridimensional de la segmentación completa del cisto. 3 . M a t e r i a l e s y M é t o d o s 28 3.3.2. Segmentación automática en 3D El flujo de trabajo seguido para la segmentación automática de las imágenes en 3D fue el siguiente: 1) Preprocesamiento de las imágenes en FIJI Como conjunto de datos, se utilizaron imágenes de confocal de cistos MDCK, adquiridas según la Configuración 2 (Tabla 1), donde los contornos celulares se encontraban marcados con el anticuerpo β-catenina (verde) y la Faloidina (rojo). A partir de las imágenes, se extrajeron los cistos de interés que aparecían en ellas y sobre los que se realizaría la segmentación. Para ello, en FIJI se dibujó ROI con la herramienta “rectángulo” y se recortó la región seleccionada con el comando “Crop” o “Duplicate”. A continuación, con una combinación de macros de FIJI autoescritas, disponibles en el repositorio público del laboratorio (ver sección 3.10. Disponibilidad de los datos), se realizaron las siguientes acciones: - Separación de los canales rojo y verde. - Mejora del contraste de cada canal, utilizando el comando “Enhance contrast”, con un valor de saturated pixels de 0.3%. Este valor determina el número de píxeles de la imagen que pueden saturarse. Al aumentar este valor, aumenta también el contraste. - Mezcla de los canales rojo y verde. - Mejora del contraste. - Conversión a imagen de 8 bits. 2) CartoCell: Método de segmentación automática basado en deep learning El diseño y desarrollo del método de segmentación automática de las imágenes utilizadas como conjunto de datos fue desarrollado por los miembros del equipo Jesús Ángel Andrés San Román y Pedro Gómez Gálvez, en colaboración con el grupo de Ignacio Arganda, del Departamento de Informática e Inteligencia Artificial de la Universidad del País Vasco (UPV/EHU), bajo el nombre de “CartoCell”. A continuación, se describen brevemente las fases en las que se desarrolla el método (Figura 7): Fase 1: Descripción del set de entrenamiento. Se utilizaron 21 imágenes de cistos MDCK, adquiridas según la Configuración 1 (Tabla 1) y sus correspondientes etiquetas celulares obtenidas mediante la segmentación semiautomática realizada mediante LimeSeg (ver sección 3.3.1. Segmentación semiautomática) y corregidas de forma manual (ver sección 3.4. Corrección manual de la segmentación) como set de entrenamiento de una DNN. Fase 2: Reducción de la resolución de las imágenes (“donwnsampling”) y entrenamiento de la red. Las imágenes del set de entrenamiento se sometieron a un 3 . M a t e r i a l e s y M é t o d o s 29 proceso de “downsampling” para reducir su resolución y equipararla a la de las imágenes adquiridas según la Configuración 2 (Tabla 1). Así, la resolución de las imágenes pasó de 11.54-16.50 píxeles por micra (px/µm) en XY y 0.5 µm entre secciones en Z, a 1.6248 px/µm en XY y 0.7 µm entre secciones en Z. Este proceso fue realizado mediante el uso de una serie de macros de FIJI, disponibles en el repositorio público del laboratorio (ver sección 3.10. Disponibilidad de los datos). Posteriormente, las 21 imágenes transformadas y sus etiquetas celulares se utilizaron como set de entrenamiento de una red DNN que presenta una arquitectura basada en conexiones residuales (3D-ResU-Net) (Franco-Barranco et al., 2022). El modelo entrenado con los 21 cistos se denominó “modelo M1”. Fase 3: Extensión del set de entrenamiento con imágenes de baja resolución. Se obtuvieron 293 imágenes confocales de cistos MDCK de baja resolución (84 cistos de 4 días, 113 de 7 días y 96 de 10 días), adquiridas según la Configuración 2 (Tabla 1) y preprocesadas (ver apartado 1 de esta sección). Entonces, se utilizaron como set de entrada del “modelo M1” entrenado previamente para predecir: i) una máscara binaria de los límites del tejido (segmentación semántica), y ii) un mapa de probabilidad de los límites celulares (segmentación de instancias). A continuación, como paso de postprocesamiento de la inferencia, se realizó un diagrama de Voronoi en 3D, utilizando las instancias como semillas y la máscara como espacio a rellenar. Este paso fue necesario porque las instancias celulares de la salida de la red a menudo no contactaban entre sí, y esto podría suponer un problema a la hora de estudiar el empaquetamiento celular. Fase 4: Entrenamiento de la red con un amplio conjunto de datos. Las etiquetas celulares obtenidas en el paso anterior, así como las imágenes de baja resolución sin procesar (293 cistos), se utilizaron como set de entrenamiento de un nuevo modelo 3D- ResU-Net, denominado “modelo M2”, junto con el set utilizado en el primer entrenamiento del “modelo M1” (21 cistos). Así, en total se utilizaron 314 cistos (293 + 21). Gracias a este amplio set de entrenamiento, el “modelo M2” consiguió obtener mejores predicciones, ya que el rendimiento de los modelos basados en DL depende, en gran medida, de la cantidad de muestras utilizadas para el entrenamiento. Fase 5: Segmentación de alto rendimiento. El modelo M2 entrenado se utilizó para inferir la segmentación de nuevas imágenes de cistos MDCK de baja resolución (Configuración 2, Tabla 1). 3 . M a t e r i a l e s y M é t o d o s 30 Figura 7. CartoCell: Método para la segmentación automática de cistos en 3D. Fase 1: Las imágenes de confocal de alta resolución son segmentadas utilizando LimeSeg y una posterior corrección manual para obtener las imágenes etiquetadas de alta resolución. Las imágenes de confocal y las etiquetas forman el “set de entrenamiento de alta resolución”. N=21. Fase 2: Downsampling del “set de entrenamiento de alta resolución” para obtener el “set de entrenamiento de resolución reducida” y posterior entrenamiento del “modelo M1”. Fase 3: A la izquierda, las imágenes de baja resolución. N=293. A la derecha, la inferencia del “modelo M1” y post-procesamiento para obtener las instancias de las células individuales y la máscara binaria de los límites del tejido, seguido de la aplicación de un algoritmo de Voronoi en 3D. De este modo, se generan las imágenes de baja resolución etiquetadas. Fase 4: Entrenamiento del “modelo M2” con un amplio set de baja resolución. N=314. Fase 5: Segmentación de alto rendimiento de nuevas imágenes de baja resolución (que no han sido vistas por la red) utilizando el “modelo M2”. 3.4. Corrección manual de la segmentación A menudo, fue necesario corregir de forma manual los errores de la segmentación obtenida. Para facilitar este proceso, miembros del equipo desarrollaron un programa personalizado en MATLAB, disponible en el repositorio público del laboratorio (ver sección 3.10. Disponibilidad de los datos) que permite rastrear las células a lo largo del zstack desde una interfaz gráfica de usuario (GUI; del inglés graphic user interface) y realizar acciones sencillas para eliminar los errores de la segmentación; tales como: 3 . M a t e r i a l e s y M é t o d o s 31 modificar, añadir, eliminar, unir o interpolar las etiquetas celulares y del lumen (Figura 8). Figura 8. GUI utilizada para la corrección de etiquetas. (Izquierda) Z-stack de imágenes de confocal de un cisto (contorno celular marcado con Pha y anti-β-catenina) junto con las etiquetas celulares y del lumen. (Derecha) Acciones que permiten corregir posibles errores de segmentación. Dado que nuestro estudio se ha centrado en caracterización de cistos de una sola capa celular y un único lumen, el programa se puso a punto para detectar errores de segmentación relacionados con este propósito. Así, la GUI muestra la identidad de las células que no están en contacto con la superficie apical y/o basal del cisto. Por otra parte, el programa se diseñó para trabajar de forma rápida con grandes lotes de imágenes de cistos; de manera que, una vez que el usuario marca como solucionados los errores en la GUI, se muestra directamente el siguiente cisto para ser corregido en la GUI. El procedimiento llevado a cabo para la corrección de la segmentación comienza con la creación de 3 carpetas: una de ellas contiene las imágenes de confocal; otra, la predicción de las etiquetas celulares y del lumen; y la tercera es el destino de las etiquetas corregidas. Posteriormente, el software fusiona las imágenes de confocal con las etiquetas predichas y muestra el resultado en una GUI junto con información sobre posibles errores de segmentación. De este modo, el usuario puede revisar cuidadosamente la imagen, comparando las etiquetas con las imágenes sin procesar para comprobar que se ajustan de forma fiel a la realidad. 3 . M a t e r i a l e s y M é t o d o s 32 3.5. Cuantificación de parámetros morfológicos y de empaquetamiento Una vez obtenidas las anotaciones en 3D, se utilizó un script de MATLAB, desarrollado por otros miembros del grupo, para extraer las características que describen la forma, tamaño y organización de cistos MDCK (Tabla 2). El script utilizado es de código abierto y puede encontrarse en la plataforma GitHub (ver sección 3.10. Disponibilidad de los datos) Hay que destacar que, para las características celulares, se estimaron los valores promedio y desviación estándar de todas las células que componen el cisto. Nombre Objeto Unidad Medida Número de células Cisto - El número de células equivale al número de etiquetas en cada cisto (instancias). Longitud de los ejes Cisto, lumen, célula µm La longitud de los tres ejes principales se obtiene con la función regionprops3 de MATLAB. Relación de aspecto o aspect ratio Cisto, lumen, célula - Relación entre el eje mayor y menor. Área superficial Cisto, lumen, célula µm2 Se determina a partir número de píxeles de una región mediante la función regionprops de MATLAB. Relación de superficie o surface ratio Cisto, célula - Relación entre la superficie externa o basal y la superficie interna o apical. Volumen Cisto, monocap a epitelial, lumen, célula µm3 El volumen del objeto se calcula a partir del número de vóxeles de una región. Se determina con la función regionprops3 de MATLAB. Fracción del lumen Lumen % Relación entre el volumen del lumen y el volumen del cisto. Índice de convexidad o solidity Cisto, lumen, célula - Relación entre el volumen de la cáscara convexa que envuelve al objeto y el volumen del objeto. Para obtener este parámetro, se utiliza la función regionprops3 de MATLAB. Altura Célula µm Se calcula como la distancia que va del centroide de la superficie apical al centroide de la superficie basal de la célula, obtenidos con la función regionprops3 de MATLAB. Número de vecinos en una superficie Célula - El número de vecinos se calculó a partir de las etiquetas de las células de la superficie apical o basal. Número de vecinos en 3D Célula - El número de vecinos en 3D equivale a la suma de los vecinos de las superficies apical y basal sin que 3 . M a t e r i a l e s y M é t o d o s 33 haya solapamiento, es decir, si una célula es vecina de otra en ambas superficies, cuenta como una célula vecina y no como dos. Intercalaciones Apico-Basales Célula - Para que exista una transición apico-basal, debe darse un cambio en la identidad de los vecinos en las superficies apical y basal. Escutoides o scutoids Célula - Una célula se considera escutoide cuando experimenta algún cambio en la identidad de los vecinos de las superficies apical y basal. Tabla 2. Descripción de las características morfológicas y de empaquetamiento extraídas a partir de las imágenes segmentadas. 3.6. Cuantificación del error de las características biológicas en cistos segmentados sin corrección manual En primer lugar, se extrajeron las características geométricas y de empaquetamiento (Tabla 2) de los cistos corregidos de forma manual (ver sección 3.4. Corrección manual de la segmentación) y de los cistos sin corregir que se obtienen directamente al utilizar el método de segmentación automática (ver sección 3.3.2. Segmentación automática en 3D). Algunos de los cistos sin corregir presentaban defectos en la segmentación (13%, 46 cistos), que provocaron la apertura de la estructura completa del cisto. En estos “cistos abiertos” no se pudieron extraer las características biológicas. Por ello, para el cálculo del error, solo se consideraron los “cistos cerrados” (87%, 307 cistos). Teniendo en cuenta esto, para cada cisto, se compararon las medidas de cada característica antes (predicción) y después de la corrección (ground-thruth) y se calculó el error relativo como: 𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 = (𝑝𝑟𝑒𝑑𝑖𝑐𝑐𝑖ó𝑛−𝑔𝑟𝑜𝑢𝑛𝑑 𝑡𝑟𝑢𝑡ℎ) 𝑔𝑟𝑜𝑢𝑛𝑑 𝑡𝑟𝑢𝑡ℎ . En el caso particular de los scutoids, no fue posible calcular el error relativo, ya que, en algunos cistos, el valor de la característica fue del 0%. Por ello, para el cálculo de su error relativo, se definió el valor complementario de esta característica, como (100 − 𝑝𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑗𝑒 𝑑𝑒 𝑠𝑐𝑢𝑡𝑜𝑖𝑑𝑠), es decir, el porcentaje de células que no son escutoides. De este modo, no se encontró ningún cisto con el 100% de scutoids. Finalmente, se calculó el valor promedio y la desviación estándar de los errores relativos para cada característica. 3.7. Análisis de la distribución espacial de las características celulares: “single cell cartography” Realizamos un análisis de la distribución espacial de las características de más de 2x104 células de 353 cistos segmentados. Para ello, utilizamos diferentes herramientas computacionales, que, en conjunto denominamos “single-cell cartography o cartografía celular”, disponibles en el repositorio público del laboratorio (ver sección 3.10. Disponibilidad de los datos). 4 . R e s u l t a d o s 40 En consecuencia, decidimos aprovechar la estocasticidad de la cistogénesis para comprender cómo actúa la variación natural durante el desarrollo de los tejidos epiteliales. 4.2. Caracterización sistemática de los cistos MDCK Con el objetivo de estudiar la variación natural asociada a la cistogénesis, las células MDCK se sembraron en condiciones de cultivo 3D y se analizaron muestras fijadas en 3 puntos temporales, separados por el mismo intervalo de tiempo: 4, 7 y 10 días. El análisis comenzó en el día 4 para asegurar la polarización de las células y la formación del espacio luminal, procesos que ocurren durante los dos primeros días de cultivo (Engelberg et al., 2011). En los tres tiempos establecidos, se observó una variación en la forma, tamaño y número de lúmenes de los cistos MDCK (Figura 10A). Para poder analizar de forma cuantitativa tal variación, se realizó un muestreo del cultivo mediante microscopía confocal, utilizando la Configuración 2 para adquirir imágenes de cistos completos (ver Materiales y Métodos), presentes en al menos 30 campos no solapantes del pocillo. Para comprobar que no se hubieran cometido fallos técnicos que dificultaran el proceso de cistogénesis, antes de realizar la adquisición de las imágenes, se registró el número de cistos del cultivo mediante microscopia de fluorescencia convencional. Como se observa en la Figura 10B, no se encontraron diferencias significativas en el número de cistos presentes en las muestras de 4, 7 y 10 días. A continuación, en las imágenes confocales obtenidas se midió el diámetro de todos los cistos presentes mediante el software ImageJ (Schneider et al., 2012). Según esta medida, el tamaño de los cistos aumentó con el tiempo, siendo el valor medio del diámetro de los cistos de 4 días (47.56 ± 10.44 µm) menor que los de 7 días (57.76 ± 12.77 µm) y menor que los de 10 días (58,99 ± 12.04 µm) (Figura 10C). Además, haciendo uso de las imágenes de confocal, se realizó una clasificación de los cistos en función del número de lúmenes y capas celulares. Por una parte, se distinguieron aquellos cistos formados por una única capa de células y un único lumen (SLSL; del inglés single-layer, single-lumen), en los que todas las células se encuentran en contacto tanto con la matriz extracelular como con el lumen. El resto de los cistos, es decir, aquellos con un solo lumen donde algunas células no tocan la matriz extracelular o el espacio luminal; y aquellos que presentan múltiples lúmenes (2 o más) fueron englobados bajo la misma categoría, como Not SLSL (Figura 11A). El porcentaje de los cistos de cada grupo resultó ser similar (cercano al 50%) en las muestras de 4, 7 y 10 días (Figura 11B). 4 . R e s u l t a d o s 41 Figura 10. Cuantificación manual de la variación natural de cultivos 3D de células epiteliales. A) Imágenes representativas de secciones confocales de cultivos de 4, 7 y 10 días, obtenidas por microscopía confocal. Los colores reflejan la tinción de varios componentes: β-catenina (verde), Faloidina (Pha, rojo), y DAPI (azul). Barra de escala = 100 µm. B) Cuantificación del número de cistos/pocillo. C) Medida del diámetro de los cistos presentes en el cultivo. Se calculó el promedio a partir de ≈ 500 cistos procedentes de siete experimentos independientes. “*” y “****” indican significancia de p <0,05 y p <0,0001, respectivamente (test de Kruskal Wallis, seguido de la prueba de Dunn). Figura 11. Clasificación de los cistos según el número de lúmenes y capas celulares. A) Imágenes de secciones confocales de cistos de 7 días, representativos de cada categoría. Tinción para β-catenina (verde) y Faloidina (Pha, rojo). Barra de escala = 20 µm. B) Proporción de cistos con un solo lumen y una sola capa celular (SLSL) y de cistos con varios lúmenes o capas celulares (Not SLSL), calculado sobre el total de cistos cuantificados en cada experimento. Los datos se representan como media ± SD. N=6 experimentos independientes, 100-400 cistos analizados en cada. SLSL: Single-Lumen, Single-Layer; Not SLSL: Not Single-Lumen, Single-Layer. 4 . R e s u l t a d o s 42 Esta primera clasificación morfológica refleja un primer aspecto de la variación existente en la arquitectura de estos sistemas celulares. Sin embargo, para poder capturar de forma correcta cómo se organizan las células en los cistos 3D y cómo varía tal organización, se requiere un análisis más profundo de los parámetros morfológicos y de empaquetamiento que los describen; y para ello, es necesario la segmentación de las imágenes en 3D. 4.3. Desarrollo de un método automático para la segmentación de imágenes en tres dimensiones Un desafío importante para la cuantificación de las características que describen el empaquetamiento epitelial es que se requiere una segmentación muy precisa de las imágenes, para poder capturar de forma correcta los contactos celulares. Si bien los algoritmos de segmentación automática están mejorando, aún no existe un método óptimo para segmentar imágenes en 3D como las de los cistos. Estos problemas se agravan para los cistos Not SLSL, donde la organización celular es más compleja. Como primera aproximación, se optó por segmentar las imágenes de cistos SLSL mediante el uso de un complemento o plugin de segmentación semiautomática denominado LimeSeg (Machado et al., 2019), que se encuentra alojado en la plataforma computacional de análisis de imágenes FIJI (Schindelin et al., 2012) (ver Materiales y Métodos). Las imágenes confocales que se utilizaron fueron adquiridas a alta resolución según la Configuración 1 (Tabla 1, ver Materiales y Métodos). Sin embargo, el resultado de esta segmentación no era lo suficientemente preciso y requería una corrección manual muy costosa, que se llevó a cabo en una GUI de MATLAB, implementada en el laboratorio para facilitar la eliminación, inserción, fusión y creación de etiquetas celulares y del lumen (ver Materiales y Métodos). En promedio, el tiempo necesario para eliminar los defectos de la segmentación de un único cisto fue aproximadamente de 3-5 días completos de trabajo. Así, la revisión manual de la segmentación se convirtió en el factor limitante del proceso, ralentizando la consecución de los resultados. Siguiendo este procedimiento, se lograron segmentar 21 cistos SLSL: 7 cistos de 4 días y 14 cistos de 7 días. Sin embargo, en el estudio cuantitativo de la variación natural, tal número de muestras resultaba insuficiente para captar la complejidad real del fenómeno. Para superar este reto, fue necesario diseñar un método que permitiera la segmentación automática de numerosas imágenes de los cistos MDCK. El desarrollo de esta nueva metodología, que se ha denominado “CartoCell” (Andrés-San Román et al., 2023), fue liderada por los miembros de nuestro grupo de investigación, Pedro Gómez Gálvez y Jesús Ángel Andrés San Román, en colaboración con el grupo de Ignacio Arganda-Carreras, del Departamento de Informática e Inteligencia Artificial de la Universidad del País Vasco. Brevemente, consiste en la aplicación de algoritmos basados en DL, utilizando una DNN, en particular, una ResU-Net personalizada (Franco-Barranco 4 . R e s u l t a d o s 43 et al., 2022). CartoCell se subdivide en cinco fases consecutivas y comienza con el entrenamiento de la red utilizando como conjunto de datos las etiquetas de los 21 cistos segmentados anteriormente, así como sus imágenes (previamente procesadas para reducir su resolución y equipararla a la de las imágenes de Configuración 2 (Tabla 1, ver Materiales y Métodos)) (Andrés-San Román et al., 2023). Para más detalles acerca del desarrollo de CartoCell, ver sección 3.3.2. de Materiales y Métodos (Figura 7). CartoCell se utilizó para predecir la segmentación de imágenes de baja resolución de 353 cistos SLSL, adquiridas según la Configuración 2 (Tabla 1, ver Materiales y Métodos): 104 de cistos de 4 días, 133 de 7 días y 116 de 10 días. Pese a que la resolución de las imágenes utilizadas era baja, resultó ser suficiente para conseguir una buena segmentación. No obstante, también se realizó una corrección manual final para que el análisis del empaquetamiento fuera lo más realista y detallado posible. Esta corrección fue mucho más rápida que la realizada anteriormente, ya que el tiempo medio invertido fue de 12 ± 6 minutos por cisto. El conjunto de los 353 cistos corregidos formaron el ground-truth, es decir, la segmentación de referencia sobre la que validar el método desarrollado (Tablas Suplementarias 1-6). Para evaluar la bondad del método, se extrajeron las características (geométricas y de conectividad) de los cistos segmentados de forma automática por CartoCell (sin corrección manual) y se compararon con las de los cistos corregidos que formaban parte del ground-truth para así calcular el error de la segmentación automática (ver Materiales y Métodos) (Figura 12). Considerando todas las características geométricas extraídas en los cistos, el error relativo medio fue de 5.6 ± 4%. Sin embargo, en el caso de las características de empaquetamiento, las diferencias entre los cistos corregidos y los segmentados de forma automática fueron mayores (error relativo medio = 13.3 ± 14%) (Tabla Suplementaria 7). Figura 12. Posibles vías en la extracción de características. Después de la fase 5 de CartoCell (Figura 7, ver Materiales y Métodos), es posible obtener un conjunto de datos realistas (ground-truth) mediante la corrección manual final de la segmentación (12 ± 6 minutos por cisto). Por otro lado, existe una alternativa, en la que se obvia la corrección final y se extraen directamente las características, asumiendo un error. 4 . R e s u l t a d o s 44 En resumen, el error cometido por CartoCell en la segmentación automática de los cistos MDCK (sin ningún tipo de corrección manual), podría tolerarse si solamente se analizan las características geométricas. Sin embargo, proponemos que, para obtener resultados precisos de las características relacionadas con el empaquetamiento, se requeriría el paso final de corrección manual. 4.4. Análisis de la arquitectura del tejido epitelial durante la cistogénesis A partir de la segmentación realizada, se extrajeron una serie de medidas del tamaño y forma del cisto, lumen y de las células que lo componen, así como de su conectividad. En la Figura 13 se describen, de forma cualitativa, aquellos parámetros utilizados en el análisis llevado a cabo a lo largo de los siguientes apartados. 4 . R e s u l t a d o s 45 Figura 13. Definición de las características geométricas y de empaquetamiento que describen la arquitectura de los cistos. Los cistos MDCK se forman a partir de una única célula y crecen continuamente durante varias semanas hasta formar grandes estructuras 3D constituidas por cientos de células (Buchholz et al., 2011). A continuación, analizamos cómo las características morfológicas y de empaquetamiento varían con el tiempo y si las restricciones que dictan su organización se mantienen o se ven alteradas. Con este fin, en primer lugar, se compararon los valores de las características extraídas en los cistos de 4, 7 y 10 días (de Figura 14 a Figura 21). De acuerdo con observaciones previas de otros estudios (Martín-Belmonte et al., 2008; O’Brien et al., 2002), el tamaño de los cistos aumentó con el tiempo (Figura 14A-E) a medida que las células proliferaron (Figura 14F). En cuanto a su aspecto (Figura 15), observamos que, independientemente del tiempo, los cistos se mostraron más anchos que altos (Relación de aspecto > 1, Figura 15A), lo que cuestiona que tengan forma de esferas, tal y como se han considerado en investigaciones anteriores. (Beck et al., 2022; Cerruti et al., 2013; Elia & Lippincott‐ Schwartz, 2009; Guo et al., 2008). Además, la diferencia entre los dos ejes de simetría se hizo más pronunciada a los 10 días (Figura 15A). Este fenómeno podría ser explicado debido al efecto de la gravedad, que hace que, al aumentar el número de células, el cisto crezca más sobre el plano XY que en Z. También aumentó muy ligeramente en el tiempo el índice de convexidad (en inglés, solidity) de los cistos (Figura 15B), lo que indica que a los 4 días presentan una superficie con más protuberancias, por tanto, adquieren un aspecto más irregular. Con respecto al lumen, aumentó de tamaño con el tiempo (Figura 16A-E) y ocupó un mayor espacio dentro del sistema (Figura 16F). Por lo tanto, podemos concluir que, con los días, el cisto crece en su totalidad debido tanto al aumento de tamaño del componente epitelial como del lumen. Sin embargo, la tasa de crecimiento del lumen fue mayor que la del cisto, ya que el surface ratio, parámetro que cuantifica la relación entre la superficie externa e interna del cisto, disminuyó (a 4 días > a 7 días > a 10 días) (Figura 15C). Y, en cuanto a los descriptores relacionados con el aspecto del lumen, siguieron la misma tendencia que los del cisto completo (Figura 17). 4 . R e s u l t a d o s 46 Figura 14. Características geométricas que describen el tamaño de los cistos SLSL de 4, 7 y 10 días. A) Volumen del cisto. B) Área superficial del cisto. C) Longitud del eje de simetría mayor del cisto. D) Longitud del eje de simetría intermedio del cisto. E) Longitud del eje de simetría menor del cisto. F) Número de células en cada cisto. Cada punto representa el valor de la característica en un cisto y los diferentes puntos temporales aparecen en distintos colores. Más de 100 cistos analizados en cada tiempo, provenientes de 7 experimentos independientes. La barra negra representa la media del conjunto de datos. “*”, “**”, “***” y “****” indican significancia de p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001 y p < 0,0001, respectivamente. En todos los casos se utilizó el test de Kruskal-Wallis, seguido de la prueba de Dunn; salvo en E, que se utilizó ANOVA con corrección de Welch. Figura 15. Características geométricas que describen el aspecto de los cistos SLSL de 4, 7 y 10 días. A) Relación de aspecto del cisto. B) Índice de convexidad o solidity del cisto. C) Surface Ratio o relación entre el área de la superficie externa y el de la superficie interna del cisto. Cada punto representa el valor de la característica en un cisto y los diferentes puntos temporales aparecen en distintos colores. Más de 100 cistos analizados en cada tiempo, provenientes de 7 experimentos independientes. La barra negra representa la media del conjunto de datos. “*”, “**” y “****” indican significancia de p < 0,05, p < 0,01 y p < 0,0001, respectivamente (test de Kruskal-Wallis, seguido de la prueba de Dunn en A y C; ANOVA seguido de la prueba de Tukey en B). 4 . R e s u l t a d o s 47 Figura 16. Características geométricas que describen el tamaño del lumen de los cistos SLSL de 4, 7 y 10 días. A) Volumen del lumen. B) Área superficial del lumen. C) Longitud del eje de simetría mayor del lumen. D) Longitud del eje de simetría intermedio del lumen. E) Longitud del eje de simetría menor del lumen. F) Fracción del lumen o porcentaje del volumen del cisto ocupado por el lumen. Cada punto representa el valor de la característica en un cisto y los diferentes puntos temporales aparecen en distintos colores. Más de 100 cistos analizados en cada tiempo, provenientes de 7 experimentos independientes. La barra negra representa la media del conjunto de datos. “**” y “****” indican significancia de p < 0.01 y p < 0.0001, respectivamente (test de Kruskal-Wallis, seguido de la prueba de Dunn en A y B; ANOVA con corrección de Welch en C-F). Figura 17. Características geométricas que describen el aspecto del lumen los cistos SLSL de 4, 7 y 10 días. A) Relación de aspecto del lumen. B) Índice de convexidad o solidity del lumen. Cada punto representa el valor de la característica en un cisto y los diferentes puntos temporales aparecen en distintos colores. Más de 100 cistos analizados en cada tiempo, provenientes de 7 experimentos independientes. La barra negra representa la media del conjunto de datos. “****” indica significancia de p < 0,0001 (test de Kruskal-Wallis seguido de la prueba de Dunn). Por otra parte, cabe considerar que, a medida que las células proliferaron y aumentaron en número en el cisto, el tamaño celular se redujo; siendo similar entre las células de los cistos de 7 y 10 días (Figura 18 A-F). Así, con el tiempo, las células de los cistos se volvieron menos voluminosas (Figura 18D), con menor área de la superficie 4 . R e s u l t a d o s 48 externa o basal (Figura 18E) y más aplanadas (Figura 18F). Sin embargo, el área apical no disminuyó, siendo significativamente mayor en las células de los cistos de 10 días con respeto a las de 4 días (Figura 18G). Respecto a la forma celular, se mantuvo en el tiempo, aunque la relación de aspecto celular fue algo mayor a los 4 días (Figura 19). Figura 18. Características geométricas que describen el tamaño de las células de los cistos de 4, 7 y 10 días. A) Promedio de la longitud del eje de simetría mayor celular. B) Promedio de la longitud del eje de simetría intermedio celular. C) Promedio de la longitud del eje de simetría menor celular. D) Promedio del volumen celular. E) Promedio del área de la superficie basal o externa de la célula. F) Promedio de la altura celular. G) Promedio del área de la superficie apical o interna de la célula. Cada punto representa el valor de la característica en un cisto y los diferentes puntos temporales aparecen en distintos colores. Más de 100 cistos analizados en cada tiempo, provenientes de 7 experimentos independientes. La barra negra representa la media del conjunto de datos. “*”, “**” y “****” indican significancia de p < 0.05, p < 0.01 y p < 0.0001, respectivamente (test de Kruskal-Wallis, seguido de la prueba de Dunn en todos los casos salvo en C y F, que se utilizó ANOVA sin y con corrección de Welch, respectivamente). Figura 19. Características geométricas que describen el aspecto de las células de los cistos SLSL de 4, 7 y 10 días. A) Promedio de la relación de aspecto celular. B) Promedio del índice de convexidad o solidity celular. Cada punto representa el valor de la característica en un cisto y los diferentes puntos temporales aparecen en distintos colores. Más de 100 cistos analizados en cada tiempo, provenientes de 7 experimentos independientes. La barra negra representa la media del conjunto de datos. “*” indica significancia de p < 0,05 (test de Kruskal-Wallis seguido de la prueba de Dunn). 4 . R e s u l t a d o s 49 La Figura 20 muestra representaciones gráficas de tres cistos característicos de cada uno de los tiempos analizados, de acuerdo con los resultados descritos anteriormente. Figura 20. Representaciones esquemáticas de cistos SLSL característicos de 4, 7 y 10 días. Se muestran secciones transversales de las estructuras celulares, donde las líneas negras simbolizan los contornos celulares y el espacio central, el lumen. Top: parte superior; Bottom: parte inferior (cercana a la superficie de cultivo). Por último, en los parámetros relacionados con el empaquetamiento celular, se detectó que los cistos de 4 días presentaban un número intercalaciones a lo largo del eje apico-basal por célula significativamente mayor (0.35 ± 0.28) con respecto a los cistos de 7 (0.21 ± 0.19) y 10 (0.19 ± 0.17) días (Figura 21A). En concordancia con este dato, también se encontró un mayor porcentaje de células que son escutoides en los cistos más jóvenes (26.89 ± 18.05 %) (Figura 21B). En cuanto al número medio de vecinos celulares en 3D, en todos los tiempos el valor fue cercano a 6 (Figura 21C), siendo los cistos de 4 días los que presentaron un menos valor de manera significativa (5.85 ± 0.2). Esto se debió a que hubo un mayor porcentaje de células que contactan en 3D con 4 y 5 vecinos, y un menor porcentaje de células que contactan con 6 y 7 vecinos (Figura 21D). En resumen, pese a que las células de los cistos de 4 días tienen menos vecinos celulares, la conectividad celular es mayor (mayor número de intercalaciones apico-basales). 4 . R e s u l t a d o s 56 diferencias se acentuaron. La misma tendencia de variación siguió la relación de aspecto del cisto y del lumen. A nivel celular, se observó un efecto contrario. El tamaño de las células varió más entre los cistos de 4 días. Por otro lado, también cabe destacar que el empaquetamiento celular mostró una mayor variación entre los cistos de este punto temporal. Así mismo, la variación de la fracción del lumen y el surface ratio fue mayor a los 4 días. Ambos parámetros describen la relación entre el tamaño del cisto y del lumen. Por lo tanto, aunque son características que se correlacionan de forma inversa (cuando aumenta la fracción del lumen, disminuye el surface ratio y viceversa), variaron de la misma forma. Y, esta variación fue mayor entre los cistos de 4 días, lo que significa que, en este punto temporal, la relación entre el tamaño del cisto y del lumen era más heterogénea. Figura 25. Heat map que representa la comparación de la variación de las características morfológicas y de empaquetamiento entre los cistos de 4, 7 y 10 días. En rojo, se simboliza los valores altos de zscore del CV y en azul, valores bajos. La etiqueta numérica de cada celda se corresponde con el valor de la mediana de los valores de z-score de cada conjunto de datos (4, 7 y 10 días) (ver Materiales y Métodos). 4 . R e s u l t a d o s 57 4.6. Variación natural de la organización epitelial según la forma de los cistos MDCK La forma que adquieren los tejidos durante la morfogénesis está impulsada por la autoorganización de sus células. Por tanto, la geometría del tejido está relacionada con el empaquetamiento celular. A continuación, analizamos cómo varía la organización epitelial según la forma de los cistos MDCK. En primer lugar, se realizó una clasificación morfológica de los cistos SLSL en base a dos características geométricas: i) la longitud de los tres ejes de simetría, y, ii) el índice de convexidad de los cistos. Con ello, establecimos cinco categorías de forma (Figura 26A): esferas, esferoides prolatos, esferoides oblatos, elipsoides y cistos con curvatura negativa. Hay que tener en cuenta que los ejes de simetría se calificaron como similares cuando la diferencia entre sus longitudes era menor del 10%. Así, consideramos esferas a aquellos cistos que presentaron los tres ejes similares en longitud. Por otra parte, cuando 2 de los 3 ejes de simetría fueron similares, pero el otro diferente, se denominaron esferoides. Los esferoides eran prolatos cuando el eje que difería es el eje mayor (forma similar a un balón de rugby), y oblatos cuando era el menor (como la forma de la Tierra). Por otra parte, los cistos se consideraron elipsoides cuando los 3 ejes de simetría eran diferentes. Y, por último, cuando el índice de convexidad se encontraba por debajo del 0.9, los cistos fueron categorizados como curvatura negativa, independientemente de los valores de la longitud de los ejes. La curvatura negativa aparece cuando el epitelio se dobla en dos direcciones diferentes, y, como consecuencia de ello, surge una zona cóncava en el tejido. De acuerdo con esta clasificación, se cuantificó la frecuencia con la que aparecía cada una de las formas entre los cistos SLSL de 4, 7 y 10 días. En todos los tiempos, las formas más frecuentes fueron elipsoides y esferoides oblatos; si bien, con el tiempo, el porcentaje de cistos oblatos aumentó mientras que el de elipsoides se redujo. Seguidos de estas morfologías, se encontraron los esferoides prolatos; y, en una pequeña proporción, los cistos con curvatura negativa y las esferas (Figura 26B). Figura 26. Clasificación morfológica de los cistos SLSL y su distribución en el tiempo. A) Según su forma, los cistos SLSL se clasifican en 5 categorías: esferoides oblatos, esferoides prolatos, elipsoides y cistos con curvatura negativa. El panel superior muestra cistos de cada categoría representados como objetos 3D. El panel inferior, la representación esquemática de cada forma. B) Distribución (en porcentaje) de cada morfología en los cistos SLSL de 4, 7 y 10 días. >100 cistos analizados en cada tiempo, provenientes de 7 experimentos independientes. 4 . R e s u l t a d o s 58 A continuación, se llevó a cabo el análisis cuantitativo de los descriptores de tamaño, forma y empaquetamiento en las distintas categorías. Estos resultados se muestran en el heat map de la Figura 27, realizado con los valores de z-score (calculados de forma independiente para cada tiempo, tal y como se realizó en el análisis anterior, Figura 22) de las características en las diferentes formas (ver Materiales y Métodos). Y también se representan de forma más detallada mediante gráficos de dispersión en las Figuras Suplementarias 6-15. Es necesario subrayar que, el bajo número de cistos en forma de esfera y con curvatura negativa en cada grupo temporal, dificultó el análisis estadístico y no permitió realizar una estimación precisa de los resultados. Aún con ello, se encontraron diferencias significativas en parámetros relacionados con el aspecto del cisto, precisamente porque estos descriptores estaban implicados en el modo de realizar la clasificación. Conforme a esto, los cistos esféricos, mostraron un valor significativamente menor del aspect ratio o relación de aspecto, seguido de los prolatos, elipsoides, oblatos y, en último lugar, los de curvatura negativa (Figura 27 y Figura Suplementaria 6). Lo contrario se encontró en el caso del índice de convexidad (Figura 27 y Figura Suplementaria 6). Por otra parte, y, tal y como se describió anteriormente, la forma del lumen cambió según lo hizo la forma del cisto. En consecuencia, estos descriptores siguieron la misma tendencia tanto en el cisto como en el lumen (Figura 27 y Figura Suplementaria 9). Pese a las diferencias en el aspecto, el tamaño (tanto del cisto como del lumen) resultó ser similar en aquellos cistos del mismo tiempo (Figura 27 y Figuras Suplementarias 7, 8, 10 y 11). Tampoco se encontraron diferencias significativas en el tamaño medio de sus células entre las distintas formas de 7 y 10 días. Sin embargo, en los cistos de 4 días se observó que las células de mayor tamaño se encontraban en las esferas y, las de menor tamaño, en los cistos con curvatura negativa (Figura 27 y Figuras Suplementarias 12 y 13). Curiosamente, a este tiempo, el tamaño celular siguió la misma tendencia que la relación de aspecto y contraria a la del índice de convexidad del cisto, es decir, el tamaño celular fue mayor en esferas, seguido de prolatos, elipsoides, oblatos y curvatura negativa (Figura 27 y Figuras Suplementarias 6, 12 y 13). Lo mismo ocurrió para el índice de convexidad celular (Figura 27 y Figura Suplementaria 14). Por último, tampoco se obtuvieran diferencias en el empaquetamiento celular entre las diferentes categorías morfológicas de cada tiempo (Figura 27 y Figura Suplementaria 15). 4 . R e s u l t a d o s 59 Figura 27. Heat map que representa la comparación de las características morfológicas y de empaquetamiento en los cistos de distintas formas de 4, 7 y 10 días. En rojo, se simboliza los valores altos de z-score y en azul, valores bajos. La etiqueta numérica de cada celda se corresponde con el valor de la mediana de los valores de z-score de cada conjunto de datos (esferas, oblatos, prolatos, elipsoides y curvatura negativa) en cada tiempo (ver Materiales y Métodos). Llegados a este punto, ya sabríamos cuál es el valor de las características en cada una de las formas de cistos; faltaría por analizar pues, cómo actúa la variación natural en las diferentes categorías. Es decir: i) ¿cuáles son las características más robustas y las más sensibles a la variación natural?; y ii) ¿en qué forma la variación se encuentra más restringida y en cuál es mayor?, o bien, ¿la variación es independiente de la forma? Para responder a la primera pregunta, analizamos, del mismo modo que en el apartado anterior, el coeficiente de variación de las características en las distintas categorías de forma (mostrado como CVx100 en el heat map de la Figura Suplementaria 16). Sin 4 . R e s u l t a d o s 60 embargo, en este análisis, las conclusiones a las que se llegaron fueron similares a las extraídas en el estudio de la variación natural en el tiempo (Figura 24). Y es que, en todas las formas y en todos los tiempos, los parámetros que toleraron una mayor variación natural fueron: el número de intercalaciones A-B y el porcentaje de scutoids por cisto, seguidos de las características relacionadas con el tamaño del lumen y del cisto. Mientras que, para el promedio de vecinos en 3D, así como para las características relacionadas con el tamaño celular, se encontró un CV bajo, sugiriendo, de nuevo, que son características robustas durante la cistogénesis. Finalmente, para responder a la cuestión de si la variación actúa de diferente modo según la forma que adopte el cisto, o bien, si es independiente de la forma, se examinaron las puntuaciones z de los CV de las características en las diferentes categorías morfológicas y en los distintos tiempos (Figura Suplementaria 17). Conforme a estos resultados, no se observó un patrón claro, que se repitiera en el tiempo, entre las diferentes formas. Además, las diferencias puntuales observadas se relacionaron principalmente con las formas menos frecuentes (esferas y cistos con curvatura negativa), mientras que, entre las categorías más frecuentes (elipsoides, oblatos y prolatos), no se observó una diferencia clara en la variación. En resumidas cuentas, en un cultivo 3D, los cistos SLSL pueden adoptar diferentes formas. Sin embargo, aparentemente, entre las categorías morfológicas no se encontraron grandes diferencias en los parámetros más allá de los descriptores utilizados para su clasificación. En cuanto a la variación natural, scutoids e intercalaciones apicobasales continuaron siendo los parámetros que más variaron dentro de cada categoría. Y, por último, no se encontraron evidencias claras que apunten a que la variación de los parámetros se encuentre más restringida en unas formas que en otras. 4.7. Variación espacial de la morfología celular en los cistos MDCK (singlecell cartography) Durante la cistogénesis, las células deben organizarse en el espacio para generar una arquitectura óptima del tejido. En apartados anteriores, se ha puesto de manifiesto que los parámetros celulares pueden determinar el empaquetamiento celular (por ejemplo, una mayor altura en las células del cisto se relaciona con un mayor porcentaje de scutoids en él), así como el tamaño y forma del tejido (por ejemplo, las células de mayor tamaño se encuentran en cistos pequeños y esféricos) o viceversa. Sin embargo, aún no están claros los factores que hacen que una célula adquiera ciertas características geométricas dentro de la estructura tisular. En este sentido, nace una pregunta: ¿la disposición espacial puede determinar la “identidad geométrica” de la célula, o, por el contrario, no tiene ningún efecto sobre ella? A continuación, investigamos cómo la organización en el espacio influye sobre la morfología que adoptan las células que constituyen los cistos. 4 . R e s u l t a d o s 61 Para ello, analizamos la distribución de los valores de las características a nivel celular y determinamos si se encuentra conservada; o bien, si es aleatoria. Con este fin, diseñamos una estrategia para mapear los parámetros celulares dentro de los cistos, denominada “cartografía a nivel celular” (del inglés, single-cell cartography), e incluye: i) reconstrucciones en 3D de los cistos, y ii) gráficos en 2D que representan la posición de todas las células dentro de ellos (ver Materiales y Métodos). De este modo y, en primer lugar, los cistos se representaron como objetos 3D, donde las células aparecen en distintos colores, asignados según el valor de la característica testada (valor normalizado en cada cisto), y que van del amarillo (valor mínimo) al morado (valor máximo) (ver Materiales y Métodos). El análisis de estos mapas 3D reveló que algunas características presentaban un claro patrón de distribución espacial dentro de la estructura. Por ejemplo, en la altura celular, existía un gradiente en los valores, que crecía “de arriba a abajo”, es decir, desde la zona del cisto más alejada (arriba, Top) hacia la más cercana a la superficie del cultivo (abajo, Bottom). Así, las células con menor altura se encontraban localizadas en la parte superior del cisto y la altura aumentó progresivamente a medida que las células ocupaban posiciones inferiores. Sin embargo, el centro de la región inferior estaba formado por células con menor altura. Cabe destacar que esta distribución espacial de los valores de la altura es consistente a lo largo del desarrollo de los cistos, es decir, apareció en la mayoría de los cistos de tiempos diferentes (4, 7 y 10 días) (Figura 28A). Para confirmar la generalidad de este patrón de forma cuantitativa, se representaron todas las células de todos los cistos procesados (en total 353 cistos de 4, 7 y 10 días). Para ello, utilizamos un diagrama de dispersión polar, donde cada célula es un punto con una posición y ángulo (considerando el centroide de cada célula con respecto al centroide del cisto completo) y con un color (según el valor de la característica celular normalizada en cada cisto) que sigue el mismo código que el utilizado en la representación de los cistos como objetos 3D (ver Materiales y Métodos). En este diagrama fue posible visualizar, simultáneamente, cómo se distribuyen en el espacio los valores de la altura celular de todas las células de todos los cistos analizados (Figura 28B). Por otra parte, las células se separaron en 4 grupos según los valores de la altura celular (normalizada en cada cisto): 0-0.25, 0.25-0.5, 0.5-0.75 y 0.75-1. En cada rango, las células se representaron en un diagrama de dispersión polar (con la misma paleta de color que anteriormente) y en un histograma de coordenadas polares, que muestra el porcentaje de células en cada posición angular (Figura 28C). De esta manera, se confirmó el patrón observado anteriormente: las células con menor altura (en amarillo) se localizaron en la parte superior del cisto, pero también en el centro de la parte inferior, mientras que las células más altas (en morado) se encontraron en la zona inferior del cisto, alejadas del centro. 4 . R e s u l t a d o s 62 Figura 28. Distribución espacial de los valores de la altura celular en los cistos MDCK. A) Reconstrucciones 3D de tres cistos representativos de 4, 7 y 10 días. El color de las células simboliza el valor de la altura celular, en una gama que va de amarillo (valor mínimo) a morado (máximo). B) Diagrama de dispersión polar que muestra el radio y ángulo de los centroides celulares respecto al centroide del cisto, con una paleta de colores basada en los valores de la altura celular (normalizada por cisto). Se muestran 20361 células provenientes de 353 cistos segmentados de 4, 7 y 10 días. C) Clasificación celular según los valores de la altura celular (normalizada por cisto), de izquierda a derecha: 0-0.25, 0.25-0.5, 0.5-0.75, 0.75-1. En la parte superior, aparece un histograma de coordenadas polares, que representa la frecuencia de las posiciones de las células. En la parte inferior, se muestra un diagrama de dispersión polar, que representa el radio y ángulo de los centroides celulares respecto al centroide del cisto, con una gama de colores basada en los valores de la altura celular (normalizada por cisto). Top: parte superior; Bottom: parte inferior (cercana a la superficie de cultivo). 4 . R e s u l t a d o s 63 Un patrón similar, aunque no tan evidente, se observó en la distribución de los valores del área basal y volumen celular; según el cual, los valores menores se encuentran en la parte superior del cisto y los mayores, en la parte inferior (Figuras Suplementarias 18, para el área basal y Figura Suplementaria 19, para el volumen celular). También se encontraron algunas características en las que no se observaba ningún patrón, como, por ejemplo, la relación de aspecto o el índice de convexidad de las células (Figuras Suplementarias 20 y 21). Asimismo, al analizar la distribución de los valores del área apical, se observó un patrón diferente. En este caso, las células con mayor área apical se encontraron localizadas en la parte superior del cisto, pero también en el centro de la parte inferior; mientras que, las células de menor área apical se ubicaron en la región media del cisto (Figura 29). 4 . R e s u l t a d o s 64 Figura 29. Distribución espacial de los valores del área apical celular en los cistos MDCK. A) Reconstrucciones 3D de tres cistos representativos de 4, 7 y 10 días. El color de las células simboliza el valor del área apical, en una gama que va de amarillo (valor mínimo) a morado (máximo). B) Diagrama de dispersión polar que muestra el radio y ángulo de los centroides celulares respecto al centroide del cisto, con una paleta de colores basada en los valores del área apical (normalizada por cisto). Se muestran 20361 células provenientes de 353 cistos segmentados de 4, 7 y 10 días. C) Clasificación celular según los valores del área apical (normalizada por cisto), de izquierda a derecha: 0-0.25, 0.25-0.5, 0.5- 0.75, 0.75-1. En la parte superior, aparece un histograma de coordenadas polares, que representa la frecuencia de las posiciones de las células. En la parte inferior, se muestra un diagrama de dispersión polar, que representa el radio y ángulo de los centroides celulares respecto al centroide del cisto, con una gama de colores basada en los valores del área apical celular (normalizada por cisto). Top: parte superior; Bottom: parte inferior (cercana a la superficie de cultivo). 4 . R e s u l t a d o s 65 4.8. Variación espacial del empaquetamiento celular en los cistos MDCK Después de encontrar patrones espaciales en la distribución de los valores de características geométricas, nos preguntamos si también existían en características relacionadas con la conectividad celular. Con este fin, se analizó la posición de los scutoids dentro de los cistos. Cuando los cistos se representaron como objetos 3D, no se identificó un patrón claro en la posición de los scutoids dentro de ellos, en parte debido a la alta heterogeneidad en el número de scutoids por cisto y en su distribución (Figura 30A). Sin embargo, cuando se analizó la ubicación de las células a lo largo del eje Z y de los ejes XY, se observó que los scutoids se posicionaban de forma diferente que las células que no presentaban intercalaciones A-B. Para estudiar la posición en Z, las células de todos los cistos analizados se dividieron en 10 grupos, según la posición que ocupaban en el eje Z (normalizada en cada cisto con respecto al centroide de la célula inferior): 0-0.1, 0.1-0.2, 0.2-0.3, 0.3-0.4, 0.4-0.5, 0.5-0.6, 0.6-0.7,0.7-0.8 y 0.8-0.9. Posteriormente, se representó el porcentaje de células en cada rango en un diagrama de barras (scutoids en negro, células no escutoidales en gris) (Figura 30B). De este modo, se encontró que las distribuciones fueron diferentes entre los dos tipos de células: los scutoids tendían a situarse en la parte inferior del cisto, mientras que las células que no lo son, podían localizarse en cualquier parte a lo largo de eje Z. Esta diferencia en la distribución fue confirmada mediante la prueba estadística chi-square for trend o prueba de tendencia de Cochran-Armitage (p=0.03). Del mismo modo, se analizó la distribución en la posición de las células a lo largo del eje XY (considerando el centroide de la célula con respecto al centroide del cisto) (Figura 30C). En ese caso, no se encontraron diferencias entre las distribuciones de los scutoids y de las células que no lo son (p=0.18). En conjunto, estos resultados sugieren que las células se empaquetan siguiendo patrones de autoorganización en los cistos MDCK. 72 5 . D i s c u s i ó n 73 En este trabajo, hemos utilizado cistos de células MDCK para estudiar cuáles son las restricciones geométricas inherentes a la materia viva y cómo afectan a la organización tridimensional de los epitelios (Figura 33). A pesar de su simplicidad, los cistos MDCK, se han utilizado ampliamente en las últimas décadas como sistema modelo en el estudio del establecimiento de la polaridad celular (Bryant & Mostov, 2008; Dukes et al., 2011; Martín-Belmonte et al., 2008; Vidal-Quadras et al., 2017; Yonemura, 2014), morfogénesis epitelial (Alfonso-Pérez et al., 2022; Guo et al., 2008; Herranz & Martín‐Belmonte, 2022; Imai et al., 2015; O’Brien et al., 2002; Wells et al., 2013; Yu et al., 2007), tumorigénesis (Fessenden et al., 2018; Sakurai et al., 2012; Schmeichel & Bissell, 2003; L. Yan et al., 2021) y análisis bioquímicos (Enemchukwu et al., 2016; O’Brien et al., 2006). La cistogénesis es un proceso que conduce a la formación de cistos con diferentes formas, tamaños y número de lúmenes (Figura 9) (Beck et al., 2022; Engelberg et al., 2011; Mao et al., 2011). Aquí hemos aprovechado esta estocasticidad para comprender las causas y consecuencias de la variación natural en el desarrollo de los tejidos epiteliales. Estudios anteriores han tratado de abordar esta cuestión mediante la cuantificación de las características morfológicas que describen a los cistos MDCK (Beck et al., 2022); sin embargo, se limitan a un conjunto pequeño de parámetros que no capturan por completo la arquitectura y la organización celular de estos sistemas 3D. Uno de los principales retos en la búsqueda de estos parámetros es que se requiere una segmentación precisa de las imágenes, capaz de identificar de forma realista los límites de las células individuales, así como su ubicación en el tejido. Además, el estudio a gran escala de la variación natural, así como la búsqueda de patrones de morfología celular requieren que la segmentación se lleve a cabo en un elevado número de muestras. La necesidad de abordar estos desafíos, llevó al desarrollo de CartoCell, un método basado en DL para la segmentación automática de epitelios en 3D (Andrés-San Román et al., 2023) (Figura 7). CartoCell permite obtener buenos resultados de segmentación de forma rápida, con un error relativo medio de 5.6 ± 4.1 % para las características geométricas (en comparación con los cistos cuya segmentación fue corregida de forma semi-manual y que forman el ground-truth) (Tabla Suplementaria 7). Sin embargo, el error es mayor en el caso de las características de empaquetamiento (valor promedio de 9.4 ± 11.9%, Tabla Suplementaria 7), lo que sugiere que sea necesario un paso final de corrección para extraer este tipo de parámetros de forma precisa y realista. Con estos resultados, proponemos que otros laboratorios pueden utilizar CartoCell para analizar de forma automática las características geométricas de un gran número de muestras, asumiendo un bajo error (Figura 12). Sin embargo, en nuestro estudio, necesitamos comprobar la segmentación para eliminar posibles errores. No obstante, incluso en este caso, el uso de CartoCell reduce de manera significativa el tiempo de corrección, de 3-5 días a solamente 12 ± 6 minutos por cisto. Por lo tanto, en cada caso, cabe considerar cuál es el nivel de precisión en la segmentación que se requiere para responder a la pregunta en cuestión y así optar por el procesamiento totalmente automático de las imágenes o bien por incluir una revisión manual al final del proceso. 5 . D i s c u s i ó n 74 Con respecto a la utilidad por parte de la comunidad científica, CartoCell es una herramienta de código abierto, bien documentada y fácil de usar (no requiere conocimientos de programación) que puede ser utilizada por cualquier laboratorio de forma inmediata (DOI: doi:10.17632/7gbkxgngpm.1 y http://dx.doi.org/10.17632/7gbkxgngpm.1). Los usuarios pueden comenzar su propio análisis sin necesidad de generar previamente el set de entrenamiento del modelo. El único requisito para utilizar directamente los modelos pre-entrenados es que las imágenes de los cistos MDCK se adquieran con la misma resolución (1.62 px/µm en XY, 0.7 µm en Z, ver Materiales y Métodos) y los mismos marcadores (anti-β-catenina y Pha, ver Materiales y Métodos). No obstante, para otros epitelios u otros marcadores de membrana, es posible que el usuario deba generar su propio set de entrenamiento del modelo y seguir todos pasos descritos en el desarrollo de CartoCell (ver Materiales y Métodos). Otra gran ventaja de nuestro método es que infiere la segmentación de las células partiendo de imágenes obtenidas a baja resolución, lo cual resulta ventajoso por varios motivos: i) se ahorra tiempo durante la adquisición de las imágenes; ii) el uso de un objetivo de menor aumento permite capturar varios cistos a la vez; iii) reduce el tiempo de exposición y con ello, el fotoblanqueo (en inglés, photobleaching); y iv) acelera el procesamiento de las imágenes (segmentación y extracción de características). En definitiva, el uso de CartoCell permite minimizar el tiempo empleado tanto en la adquisición de las imágenes como en su procesamiento y análisis de una forma muy eficaz. La automatización en el procesamiento de imágenes nos ha permitido contar con un gran número de muestras, algo clave en el estudio de la variación natural. Así, gracias al desarrollo de CartoCell, fue posible analizar los descriptores morfológicos y de empaquetamiento (Figura 13) de 353 cistos: 104 de 4 días, 133 de 7 días y 116 de 10 días (Tablas Suplementarias 1-6). Hay que destacar que nuestro método de análisis solamente se aplicó a los cistos formados por una capa celular y un único lumen (SLSL). El fenotipo SLSL se considera como el correctamente polarizado, puesto que, cuando existen defectos en la polarización ápico-basal o en la orientación de la división celular se forman cistos con múltiples lúmenes o con varias capas celulares, que se describen como el fenotipo aberrante (Cerruti et al., 2013; Guo et al., 2008). Muchos trabajos afirman que, en un cultivo realizado en condiciones fisiológicas, este fenotipo suele encontrarse en un bajo porcentaje (en torno al 20% (Engelberg et al., 2011; Martín-Belmonte et al., 2008)). Sin embargo, nuestros resultados muestran un porcentaje similar entre los cistos SLSL y los cistos multilumen (Figura 11). Este fenómeno puede ser debido a diferencias técnicas del cultivo, relacionadas, por ejemplo, con la densidad celular, el modo de disponer las células en la matriz, la concentración de proteínas del Matrigel, etc (Enemchukwu et al., 2016; Hughes et al., 2010); o bien, a diferencias en los criterios utilizados a la hora de realizar la clasificación de estos sistemas 3D. A este último respecto, es posible que nuestra forma de clasificar los cistos SLSL sea bastante más restrictiva porque el proceso de segmentación requiere una selección muy rigurosa para reducir la posibilidad de 5 . D i s c u s i ó n 75 errores. En cualquier caso, descartamos el fenotipo multilumen y nos centramos solamente en los cistos SLSL como prueba de concepto en el estudio de la variación natural, ya que son los sistemas correctamente polarizados los que se observan típicamente en condiciones fisiológicas in vivo, como los folículos tiroideos, los acinos pancreáticos o los propios túbulos renales de donde procede la línea MDCK (Guo et al., 2008, Dukes et al., 2011). Por estas razones, consideramos que este fenotipo es el mejor sistema modelo para estudiar qué rasgos de la cistogénesis oscilan más de forma intrínseca y cuáles persisten robustamente para garantizar la estabilidad del proceso fisiológico. Con la cuantificación de las características geométricas y de conectividad que describen a los cistos SLSL hemos analizado cómo actúa la variación natural durante la cistogénesis, utilizando muestras fijadas en 3 puntos temporales: 4, 7 y 10 días (Figura 33). Nuestras observaciones se plasman de forma sencilla en las representaciones esquemáticas mostradas en la Figura 20. Comprobamos que, con el tiempo, el tamaño de los cistos aumenta (Figuras 14 y 22) y que dicho aumento está determinado por el incremento en el número de células a medida que proliferan (Figuras 14 y 22) y no por un mayor tamaño de las células que constituyen la estructura (Figuras 18 y 22). De hecho, al igual que ocurre en otros eventos morfogenéticos como, por ejemplo, en el desarrollo del disco imaginal del ala de Drosophila melanogaster (Mandaravally Madhavan & Schneiderman, 1977; Tripathi & Irvine, 2022) ), el tamaño celular se va reduciendo en el tiempo. También el lumen crece con los días (Figuras 16 y 22) incluso en mayor medida que lo hace el cisto completo (Figuras 14 y 22), ya que el valor del surface ratio, parámetro que cuantifica la relación entre la superficie externa e interna del cisto, disminuye con el tiempo (Figuras 15 y 22). Estas observaciones sugieren que el lumen en expansión es en el principal impulsor del tamaño del cisto, afirmación consistente con estudios previos (Engelberg et al., 2011). Tradicionalmente se ha asumido que la expansión del lumen se produce por su llenado debido a la presión la presión hidrostática intraluminal (Alvers et al., 2014; Dong et al., 2014; Gao et al., 2017); sin embargo, recientemente se ha propuesto la existencia de otro mecanismo independiente de la presión, en el que el lumen crece manteniendo la cantidad de membrana apical en cada célula a través del transporte vesicular (Vasquez et al., 2021). Nuestras observaciones podrían respaldar esta última idea, ya que el área apical promedio se mantiene (e incluso aumenta) en el tiempo (Figuras 18 y 22), siendo el único parámetro relacionado con el tamaño celular que no disminuye con los días. Por otra parte, gracias al desarrollo de CartoCell, extendemos el análisis de la conectividad celular a la tercera dimensión, algo que usualmente se ha visto obstaculizado por la dificultad para segmentar con precisión y reconstruir las células en 3D, especialmente en tejidos curvos. Esto permite considerar a los escutoides (en inglés, scutoids), capaces de modificar las propiedades de conectividad celular en un contexto 3D, debido a que implican cambios en la relación de los vecinos celulares a lo largo del 5 . D i s c u s i ó n 76 eje apico-basal (Gómez-Gálvez et al., 2018). En este sentido, Gómez-Gálvez et al., 2020, demostraron en tubos epiteliales, que los scutoids desafiaban principios matemáticos aplicados al empaquetamiento epitelial, como el teorema de Euler (según el cual cada célula, en promedio, contacta con un número cercano a 6 células vecinas). Revelaron que la presencia de intercalaciones apico-basales implicaba que el teorema no pudiera asumirse de forma automática en un marco tridimensional del tejido, ya que hacían aumentar la conectividad celular. Así, el número medio de vecinos en 3D 〈𝑛3𝐷〉 sería directamente proporcional al número de intercalaciones apico-basales 〈𝑖〉, es decir, 〈𝑛3𝐷〉= 6 + 〈𝑖〉/2 (Gómez-Gálvez et al., 2022). Con relación a nuestro análisis del empaquetamiento celular durante la cistogénesis, encontramos que, en todos los tiempos analizados, el promedio de vecinos celulares en 3D está en torno a 6, siendo el valor medio ligeramente menor en los cistos de 4 días (Figura 21 y 22), pese a que, en este punto temporal, el porcentaje de scutoids es mayor (Figura 21 y 22). Este hallazgo en la proporción de scutoids podría tener una explicación geométrica y guardar relación con el mayor valor del surface ratio y de la altura celular en los cistos de este tiempo. Ambas medidas equivalen a un mayor grosor del epitelio y, por lo tanto, a una mayor superficie de contacto lateral. Y esto, a su vez, se relaciona con una mayor probabilidad de que se produzca el intercambio de vecinos a lo largo del eje apico-basal, como ocurre durante el desarrollo del epitelio pulmonar de ratón (Gómez et al., 2021) o en modelos in silico de tubos epiteliales (Gómez-Gálvez et al., 2018). Por otro lado, el mayor porcentaje de scutoids en los cistos de 4 días también podría atribuirse a la mayor tasa de división celular que existe en este tiempo de cultivo. Como señala Engelberg et al., 2011, en los cistos MDCK el número de células aumenta exponencialmente hasta el día 5, posteriormente disminuye y aumenta a un ritmo constante a partir del sexto día de cultivo. En este contexto de crecimiento dinámico, las intercalaciones apico-basales aparecerían en una mayor proporción a los 4 días para acomodar a las nuevas células en el tejido. La relación entre la proliferación celular y la aparición de scutoids ha sido descrita anteriormente en el epitelio folicular de la cámara huevo de Drosophila. Durante el desarrollo de esta estructura, se encontró que el porcentaje de scutoids era mayor en una estructura casi esférica, pero con alta proliferación (etapa 4). Sin embargo, el valor de esta característica disminuía a medida que la estructura se volvía más alargada (etapa 8) posiblemente debido a que el tejido iba siendo más estático (Gómez-Gálvez et al., 2018). Por otra parte, también encontramos un valor ligeramente más bajo en el número medio de vecinos celulares 3D en los cistos de 4 días debido a la mayor proporción de células que contactan solo con 4 o 5 vecinos (Figura 21). Esta diferencia también podría ser consecuencia directa de los cambios asociados a la mayor tasa de división celular en los cistos más tempranos, pues la división altera los contactos celulares y con ello, puede disminuir el número de vecinos en un epitelio en proliferación (Gibson et al., 2006). Estos hallazgos abren nuevas direcciones de investigación prometedoras, en las que se incluya el análisis in vivo (mediante secuencias de imágenes de time-lapse) de los cambios en la topología celular en 3D durante la cistogénesis. 5 . D i s c u s i ó n 77 Descubrimos también que algunas de las características que describen a los cistos MDCK se encuentran acopladas. Este fenómeno reduce las dimensiones de la variación natural y refleja las restricciones biológicas de estos sistemas 3D. Así, cuando las características se correlacionan fuertemente, su variación puede ser explicada a través de una única variable. En cambio, cuando muestran falta de correlación, su variación es independiente y esto indica un grado de libertad adicional en el que la variación puede actuar (Beck et al., 2022). Por ejemplo, encontramos que el número de células se correlaciona con el tamaño del cisto (Figuras 23 y Figura Suplementaria 4). Y es que, lógicamente, los cambios en el tamaño de los órganos se deben a cambios en el número (Ryoo & Steller, 2003) o en el tamaño de sus células (Montagne et al., 1999; Partridge et al., 1994). En este caso, observamos que el primer mecanismo es el que determina el crecimiento de los cistos y que el incremento del número de células lleva a un menor tamaño celular (Figura 23 y Figura Suplementaria 4). Así mismo, el tamaño del lumen correlaciona con el del cisto (Figuras 23 y Figura Suplementaria 4). Esta relación también se ha descrito en cistos multilúmenes (al margen de este estudio), donde el espacio luminal aumenta con el tamaño del cisto a través de muchos lúmenes pequeños (Beck et al., 2022). Por otra parte, en relación con el empaquetamiento celular, descubrimos que el aumento del número de células hace aumentar el promedio de vecinos 3D y esto se correlaciona, a su vez, con un mayor porcentaje de scutoids (Figuras 23 y Figura Suplementaria 5), como se describe en estudios anteriores (Gómez-Gálvez et al., 2022). Por lo tanto, los cistos MDCK obedecen una serie de restricciones y gran parte de su variación podría explicarse por un número reducido de variables. Así, es importante tener en cuenta, por ejemplo, que cualquier perturbación que afecte al número de células (como la deprivación de nutrientes, fármacos que inducen la proliferación celular, etc.) podría repercutir directamente sobre el tamaño del cisto, el de su lumen, así como en el empaquetamiento celular. Siguiendo con el análisis de la variación natural asociada a la cistogénesis, identificamos cuáles son los descriptores morfológicos y topológicos más robustos y cuáles permiten un mayor grado de variación en este proceso, sin que se altere el equilibrio estructural del tejido (Figura 33). Observamos que, en todos los tiempos analizados, las características que más varían entre un cisto y otro son las intercalaciones apico-basales y el porcentaje de scutoids (Figura 24). Este fenómeno podría ser explicado si consideramos el intercambio entre células vecinas a lo largo del eje apico-basal como un proceso reversible, impulsado por la remodelación dinámica de los contactos célulacélula, al igual que ocurre en el caso de las transiciones T1, donde la intercalación de vecinos se produce en el tiempo para impulsar procesos morfogenéticos como la elongación de la banda germinal del embrión de Drosophila melanogaster (Kong et al., 2017; Lemke & Nelson, 2021; Rauzi, 2020). En este contexto fluctuante de la topología celular, los scutoids aparecerían de forma estocástica en los cistos MDCK para facilitar la autoorganización celular y el crecimiento de estas estructuras empaquetadas. No obstante, aún quedaría pendiente por resolver preguntas como: ¿cuál es la maquinaria 5 . D i s c u s i ó n 78 molecular implicada en la dinámica de las intercalaciones apico-basales? o ¿cómo hacen las células para pasar de una forma de scutoid a prisma y viceversa? Estas preguntas no se pueden responder con las muestras fijadas utilizadas en este estudio, si no que habría que realizar experimentos in vivo que permitieran hacer el seguimiento (en inglés, tracking) de las células a lo largo del tiempo. De este modo, abrimos camino a futuras investigaciones que permitan arrojar luz sobre los mecanismos implicados en la remodelación de la forma celular durante los eventos morfogenéticos. Por otra parte, y a pesar de la posible naturaleza dinámica de los scutoids, nuestros resultados reflejan que el promedio de los vecinos celulares en 3D es una característica robusta, puesto que la variación de este parámetro es mínima (Figura 24). Esto sugiere que, las configuraciones de empaquetamiento celular deben mantenerse estables para que no se rompa el equilibrio en la organización del tejido durante la morfogénesis epitelial (Gibson et al., 2006). También destaca que, después de los scutoids y las intercalaciones apico-basales, el volumen del lumen es la característica que presenta una mayor variación entre los cistos de mismo punto temporal (Figura 24). Esta variación puede ser explicada si tenemos en cuenta que la expansión del lumen es un proceso que depende de numerosos factores, como: la proliferación celular, los cambios en el volumen celular, el flujo de agua debido a la presión osmótica resultante de la diferencia en la concentración de iones entre el lumen y los compartimentos celulares, así como el crecimiento de la membrana apical celular mediado por el transporte vesicular (Gin et al., 2010; Vasquez et al., 2021). De manera que, son múltiples las variables que afectan al tamaño del espacio luminal, y, por consiguiente, contribuyen a que sea una característica muy sensible a la variación natural. También hemos analizado cómo cambia la variación de las características en el tiempo. Observamos que, conforme los cistos van desarrollándose, aumenta la variación en el tamaño de los cistos y también en el de su lumen (Figura 25). Sin embargo, la variación del tamaño celular decae, así como la variación del empaquetamiento celular (Figura 25), posiblemente debido a que la tasa de división celular se ralentiza en el tiempo (Engelberg et al., 2011). Una de las ventajas de nuestro novedoso abordaje es que ha permitido mostrar que los cistos MDCK no son esferas simétricas, como se asume en investigaciones previas (Beck et al., 2022; Cerruti et al., 2013), si no que pueden adoptar un rango variable de formas: esferas, esferoides oblatos, esferoides prolatos, elipsoides y cistos con curvatura negativa (Figura 26). Este hallazgo revela un nivel de complejidad superior, que debe tenerse en consideración puesto que la geometría global del tejido puede desvelar los mecanismos de auto-organización celular implicados en la morfogénesis epitelial. Sin embargo, no encontramos grandes diferencias en los descriptores morfológicos y de empaquetamiento celular entre las distintas formas (Figura 27). Y tampoco se hallaron evidencias claras que apunten a que la variación natural se encuentre más restringida en unas formas que en otras (Figura 33 y Figuras Suplementarias 16 y 17). 5 . D i s c u s i ó n 79 Hasta la fecha, desconocemos cuál es la maquinaria que controla la variación natural de los parámetros relacionados con la morfología y el empaquetamiento de los cistos MDCK. Podría considerarse una amplia gama de mecanismos físicos y moleculares implicados en la regulación del número, tamaño, forma y posición de las células durante la cistogénesis. Para explorar los mecanismos potencialmente implicados, se requeriría realizar un gran número de perturbaciones en el cultivo con el fin de establecer la causalidad de la variación. Sin embargo, es posible que la maquinaria molecular subyacente sea multivariable y no permita entender de una forma sencilla el proceso (Keenan & Shvartsman, 2017). En cualquier caso, aunque no hemos descifrado la bioquímica que restringe la variación natural, nuestros resultados revelan que hay características robustas (por ejemplo, el empaquetamiento celular), que no se alteran en nuestros cultivos y que, de hacerlo, podrían poner en juego la estabilidad de la cistogénesis. Pensamos que estos hallazgos también se podrían aplicar al cultivo de organoides para así mejorar su reproducibilidad, algo que continúa siendo un gran desafío en la actualidad (Beck et al., 2022; Huch et al., 2017). Una vez realizado todo el trabajo de esta tesis, pensamos que nuestro abordaje de “cartografía a nivel celular” es esencial para estudiar con detalle la arquitectura epitelial, así como su variación natural. Así, mediante la representación del valor de las características de todas las células que forman los 353 cistos segmentados (> 2x104 células) revelamos la presencia de patrones de morfología celular (Figura 33). El hecho de encontrar estos patrones en los cistos es, en sí, una restricción de la variación natural, ya que la disposición de los valores de determinadas características celulares se mantiene de forma robusta en todos los cistos analizados. Por una parte, características como “altura celular”, “área basal celular” o “volumen celular” muestran una distribución espacial similar dentro de los cistos, según la cual, los valores menores se encuentran en la parte superior, pero aumentan a medida que las células se aproximan a la base. No obstante, en el centro de la parte inferior, también aparecen los valores más bajos (Figura 28, Figuras suplementarias 18 y 19). Pero ¿a qué se debe esta distribución asimétrica de la geometría celular dentro de los cistos? A priori, todo parece indicar que es el modo en el que se disponen las células MDCK entre los componentes de la matriz extracelular tridimensional (3D-ECM, del inglés three-dimensional extracellullar matrix) el que determina la aparición de estos patrones de geometría celular. Está bien documentado que, para la formación de los cistos, no es esencial que las células se encuentren embebidas en la 3D-ECM (modo de cultivo denominado “in-3D”); si no que, un contacto parcial, en el que las células se encuentran sobre la 3D-ECM (“on-3D”), es suficiente para inducir la cistogénesis (Elia & Lippincott‐Schwartz, 2009; Enemchukwu et al., 2016; Guo et al., 2008). Esto puede ser debido, en parte, a que las células sembradas sobre la 3D-ECM rotan durante la cistogénesis sobre el plano XY, arrastrando proteínas del entorno que cubren la superficie del cisto (Chin et al., 2018). O bien, a que las células de los cistos polarizados secretan proteínas de la ECM hacia el exterior (Guo et al., 2008). 5 . D i s c u s i ó n 80 Dado que el modo de cultivo “on-3D” es suficiente para desencadenar la formación de los cistos, y a que es más idóneo para el inmunomarcaje y la adquisición de imágenes, optamos por esta opción, y cultivamos las células MDCK sobre una capa fina de Matrigel al 100% con una adición del 2% en el medio de cultivo; generándose así un gradiente no uniforme a lo largo del eje Z. Nuestros hallazgos sugieren que este gradiente de matriz extracelular influye sobre la polaridad celular y es responsable de los patrones de geometría celular observados en los cistos MDCK. De este modo, las células situadas en la base, que se encuentran en contacto con la lámina más concentrada de Matrigel, presentarían una mayor interacción célula-ECM que podría estimular el mayor crecimiento celular observado en esta región del cisto. No obstante, para confirmar esta hipótesis, sería necesario analizar si la distribución espacial de características celulares como “altura”, “volumen” o “área basal” es diferente en los cistos cultivados embebidos en la matriz extracelular (“in-3D-ECM”). Por otro lado, también postulamos que la fuerza de la gravedad podría ser la causa que determina el establecimiento de este patrón de morfología celular. Siguiendo esta hipótesis, las células localizadas en la base del cisto serían de mayor tamaño para poder sostener el peso de toda la estructura celular. No obstante, para confirmar esta sospecha y determinar si el patrón se sigue manteniendo, deberían realizarse experimentos que simulen un entorno de microgravedad 3D in vitro, por ejemplo, mediante el uso de un clinostato 3D (Choi et al., 2021; Kim et al., 2020); sin embargo, todo ello está fuera del alcance de nuestro estudio. Por otra parte, descubrimos un patrón espacial diferente en la distribución del “área apical celular”. En este caso, los valores más altos se localizan en las células ubicadas en la superficie y base del cisto, mientras que los valores más bajos, pertenecen a las células situadas en la región media (Figura 29). Estos resultados sugieren que las células de la región media, en las que el eje apico-basal se dispone perpendicular a la superficie de cultivo, presentan forma de cuña, ocasionado por la reducción en el ancho apical de la célula, pero no de su ancho basal (ya que los valores del área basal no siguen tal distribución (Figura Suplementaria 18)). Y, conforme la posición de las células se aleja de esta región y se aproxima a los polos, las células se estiran en su superficial apical. La reducción del área apical en las células acuñadas podría ser explicado por la constricción apical, mediada por la red de actomiosina de la corteza apical, mecanismo implicado en la remodelación del tejido en numerosos eventos morfogenéticos, entre los que se incluyen la gastrulación de C. elegans (Lee & Goldstein, 2003) o la formación del tubo neural de vertebrados (Hildebrand & Soriano, 1999; Nishimura et al., 2012). Aunque, también podría ser explicado a través de un mecanismo pasivo, relacionado con el modo en que la fuerza de la gravedad afecta a la morfología que adopta el lumen en los cistos MDCK. Siguiendo esta hipótesis, por efecto de la gravedad, la curvatura ecuatorial del lumen (curvatura dada por la circunferencia que mejor se ajusta a la superficie del lumen donde el radio es paralelo a la superficie de cultivo) sería mayor que la curvatura polar (de radio perpendicular al plano), tal y como se muestra en las representaciones esquemáticas de la Figura 20. Esto implicaría que las células que se localizan en la región 5 . D i s c u s i ó n 81 media, organizadas en el máximo radio de la curvatura ecuatorial, reduzcan su superficie apical para adaptarse a la geometría del lumen. Cabe destacar, que también encontramos parámetros de geometría celular sin patrón espacial claro (Figuras Suplementarias 20 y 21), lo que sugiere que las características geométricas son independientes unas de otras. Además, nuestro enfoque de “cartografía a nivel celular” nos ha permitido encontrar patrones ocultos en características relacionadas con el empaquetamiento, como es el caso de la distribución espacial de los scutoids. Y es que, aunque los mapas 3D de los cistos no desvelaron una clara disposición de las células escutoidales dentro de ellos, el análisis en 2D de la posición celular en el eje Z, reveló una clara acumulación de los scutoids en la parte inferior de los cistos, en comparación con las células que no son lo son (Figura 30). Este fenómeno también podría guardar relación con el gradiente de matriz extracelular presente en el cultivo de los cistos MDCK. Como apuntamos anteriormente, este gradiente podría ser el responsable de que las células localizadas en la base del cisto presenten una mayor altura celular y, por lo tanto, una mayor longitud del eje apico-basal. De este modo, sería más probable que se produjera en ellas el intercambio espacial de vecinos celulares. No obstante, pensamos que los scutoids son entidades dinámicas, y, por lo tanto, sería conveniente realizar su seguimiento en el tiempo a través de experimentos in vivo para poder llegar a conclusiones más sólidas. El descubrimiento de los patrones de morfología celular en los cistos MDCK pone de manifiesto que células genéticamente idénticas adquieran características geométricas y de empaquetamiento diferentes según su disposición espacial dentro de la estructura. Este fenómeno motiva el planteamiento de preguntas como: ¿los patrones celulares están presentes en los estadios más iniciales de la cistogénesis? o bien, ¿en qué momento las células dejan de ser similares en su forma? En este sentido, investigar el momento y el contexto ambiental que lleva a cada célula a determinar su propia identidad en uno de los modelos de organogénesis epitelial más simples, podría ser importante para comprender procesos más complejos como la “ruptura de simetría” que ocurre durante el desarrollo de los tejidos (en inglés, symmetry breaking). Brevemente, la ruptura de simetría es el punto espacio-temporal en el que células, que inicialmente son idénticas, se diferencian y establecen la segregación del linaje celular que lleva a la formación del órgano o del organismo completo (Chubb, 2017; de Medeiros et al., 2022; Munro & Bowerman, 2009). En este contexto, proponemos que nuestro enfoque de “cartografía a nivel celular” sería útil para detectar los primeros cambios celulares en la geometría y en el empaquetamiento que establecen el primer y más crucial evento de ruptura de simetría en el desarrollo de los tejidos. Finalmente, en relación con los patrones de morfología celular, descubrimos que la geometría del tejido puede influir sobre ellos y, por lo tanto, debe considerarse a la hora de estudiar parámetros celulares. En este sentido, encontramos que en los cistos de 10 días (de mayor tamaño y número de células), varía la distribución de los valores de ciertas características (como, por ejemplo, la altura celular y área basal) según la forma que 88 89 BIBLIOGRAFÍA 90 7 . B i b l i o g r a f í a 91 Aboav, D. A. (1970). The arrangement of grains in a polycrystal. Metallography, 3(4), 383– 390. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/0026-0800(70)90038-8 Aigouy, B., Cortes, C., Liu, S., & Prud’Homme, B. (2020). 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El rojo oscuro simboliza una correlación positiva perfecta (⍴=1), el azul oscuro, una correlación negativa perfecta (⍴=-1) y el blanco, ausencia de correlación (⍴=0). 8 . A n e x o s 107 Figura Suplementaria 3. Heat map que muestra los coeficientes de correlación de Spearman entre las características que describen la morfología y el empaquetamiento de los cistos MDCK de 10 días. El rojo oscuro simboliza una correlación positiva perfecta (⍴=1), el azul oscuro, una correlación negativa perfecta (⍴=-1) y el blanco, ausencia de correlación (⍴=0). 8 . A n e x o s 108 Figura Suplementaria 4. Relación entre las características morfológicas de los cistos (I). A) Volumen del cisto versus número de células por cisto. (Izquierda) Diagrama de dispersión donde se representan todos los cistos analizados, en diferente color dependiendo del tiempo de cultivo La línea de regresión lineal del conjunto de datos se muestra en negro sobre el diagrama. (Derecha) Diagramas de dispersión que muestran el volumen del cisto versus el número de células por cisto en cada punto temporal, manteniendo la misma escala en los ejes que en el diagrama izquierdo. B-E) Mismas representaciones que en A para explorar la relación entre diferentes características: volumen celular versus número de células por cisto (B), volumen lumen versus volumen cisto (C), relación de aspecto del lumen versus relación de aspecto del cisto (D) y altura celular versus Surface ratio (E). 8 . A n e x o s 109 Figura Suplementaria 5. Relación entre las características morfológicas y de empaquetamiento de los cistos (II). A-D) Mismas representaciones que en Figura Suplementaria 4 para explorar la relación entre diferentes características: porcentaje de scutoids versus altura celular (A), área apical celular versus volumen del lumen (B), número de vecinos en 3D versus número de células por cisto (C) y número de vecinos en 3D versus porcentaje de scutoids por cisto (D). 8 . A n e x o s 110 Figura Suplementaria 6. Características geométricas que describen el aspecto de los cistos de distintas formas de 4, 7 y 10 días. A) Relación de aspecto del cisto. B) Índice de convexidad del cisto. C) Surface Ratio o relación entre el área de la superficie externa y el de la superficie interna del cisto. Cada punto representa el valor de la característica en un cisto y las diferentes formas aparecen en distintos colores. Más de 100 cistos analizados en cada tiempo, provenientes de 7 experimentos independientes. La barra roja representa la media del conjunto de datos por cada forma. “*”, “**”, “***” y “****” indican significancia de p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001 y p < 0,0001, respectivamente (test de Kruskal Wallis seguido de la prueba de Dunn en todos los casos salvo en B-4d, que se utilizó o ANOVA seguido de la corrección de Welch). 8 . A n e x o s 111 Figura Suplementaria 7. Características geométricas que describen el tamaño de los cistos de distintas formas de 4, 7 y 10 días (I). A) Longitud del eje de simetría mayor del cisto. B) Longitud del eje de simetría intermedio del cisto. C) Longitud del eje de simetría menor del cisto. Cada punto representa el valor de la característica en un cisto y las diferentes formas aparecen en distintos colores. Más de 100 cistos analizados en cada tiempo, provenientes de 7 experimentos independientes. La barra roja representa la media del conjunto de datos por cada forma. “*” y “***” indican significancia de p < 0,05 y p < 0,001, respectivamente (ANOVA seguido de la prueba de Tukey en B-7d y test de Kruskal Wallis seguido de la prueba de Dunn en C-4d). 8 . A n e x o s 112 Figura Suplementaria 8. Características geométricas que describen el tamaño de los cistos de distintas formas de 4, 7 y 10 días (II). A) Volumen del cisto. B) Área superficial del cisto. C) Número de células en cada cisto. Cada punto representa el valor de la característica en un cisto y las diferentes formas aparecen en distintos colores. Más de 100 cistos analizados en cada tiempo, provenientes de 7 experimentos independientes. La barra roja representa la media del conjunto de datos por cada forma. 8 . A n e x o s 113 Figura Suplementaria 9. Características geométricas que describen el aspecto del lumen de los cistos de distintas formas de 4, 7 y 10 días. A) Relación de aspecto del lumen. B) Índice de convexidad del lumen. Cada punto representa el valor de la característica en un cisto y las diferentes formas aparecen en distintos colores. Más de 100 cistos analizados en cada tiempo, provenientes de 7 experimentos independientes. La barra roja representa la media del conjunto de datos por cada forma. “*”, “**” y “****” indican significancia de p < 0,05, p < 0,01 y p < 0,0001, respectivamente (test de Kruskal Wallis seguido de la prueba de Dunn en A y B-4d; ANOVA seguido de la prueba de Tukey en B-7d y B-10d). 8 . A n e x o s 120 Figura Suplementaria 16. Heat map que muestra los coeficientes de variación de las diferentes características para los cistos de las distintas formas de 4, 7 y 10 días. Los valores se expresan como CVx100, simbolizando el rojo valores elevados y el azul, valores bajos. 8 . A n e x o s 121 Figura Suplementaria 17. Heat map que representa la comparación de la variación de las características morfológicas y de empaquetamiento entre los cistos de diferentes formas de 4, 7 y 10 días. En rojo, se simboliza los valores altos de z-score del CV y en azul, valores bajos. La etiqueta numérica de cada celda se corresponde con el valor de la mediana de los valores de z-score de cada conjunto de datos (esferas, oblatos, prolatos, elipsoides y curvatura negativa) en cada tiempo (ver Materiales y Métodos). 8 . A n e x o s 122 Figura Suplementaria 18. Distribución espacial de los valores del área basal celular en los cistos MDCK. A) Reconstrucciones 3D de tres cistos representativos de 4, 7 y 10 días. El color de las células simboliza el valor del área basal celular, en una gama que va de amarillo (valor mínimo) a morado (máximo). B) Diagrama de dispersión polar que muestra el radio y ángulo de los centroides celulares respecto al centroide del cisto, con una paleta de colores basada en los valores del área basal celular (normalizada por cisto). Se muestran 20361 células provenientes de 353 cistos segmentados de 4, 7 y 10 días. C) Clasificación celular según los valores del área basal celular (normalizada por cisto), de izquierda a derecha: 0-0.25, 0.25-0.5, 0.5-0.75, 0.75-1. En la parte superior, aparece un histograma de coordenadas polares, que representa la frecuencia de las posiciones de las células. En la parte inferior, se muestra un diagrama de dispersión polar, que representa el radio y ángulo de los centroides celulares respecto al centroide del cisto, con una gama de colores basada en los valores del área basal celular (normalizada por cisto). Top: parte superior; Bottom: parte inferior (cercana a la superficie de cultivo). 8 . A n e x o s 123 Figura Suplementaria 19. Distribución espacial de los valores del volumen celular en los cistos MDCK. A) Reconstrucciones 3D de tres cistos representativos de 4, 7 y 10 días. El color de las células simboliza el valor del volumen celular, en una gama que va de amarillo (valor mínimo) a morado (máximo). B) Diagrama de dispersión polar que muestra el radio y ángulo de los centroides celulares respecto al centroide del cisto, con una paleta de colores basada en los valores del volumen celular (normalizada por cisto). Se muestran 20361 células provenientes de 353 cistos segmentados de 4, 7 y 10 días. C) Clasificación celular según los valores del volumen celular (normalizada por cisto), de izquierda a derecha: 0-0.25, 0.25-0.5, 0.5-0.75, 0.75-1. En la parte superior, aparece un histograma de coordenadas polares, que representa la frecuencia de las posiciones de las células. En la parte inferior, se muestra un diagrama de dispersión polar, que representa el radio y ángulo de los centroides celulares respecto al centroide del cisto, con una gama de colores basada en los valores del volumen celular (normalizada por cisto). Top: parte superior; Bottom: parte inferior (cercana a la superficie de cultivo). 8 . A n e x o s 124 Figura Suplementaria 20. Distribución espacial de los valores de la relación de aspecto celular en los cistos MDCK. A) Reconstrucciones 3D de tres cistos representativos de 4, 7 y 10 días. El color de las células simboliza el valor de la relación de aspecto celular, en una gama que va de amarillo (valor mínimo) a morado (máximo). B) Diagrama de dispersión polar que muestra el radio y ángulo de los centroides celulares respecto al centroide del cisto, con una paleta de colores basada en los valores de la relación de aspecto celular (normalizada por cisto). Se muestran 20361 células provenientes de 353 cistos segmentados de 4, 7 y 10 días. C) Clasificación celular según los valores de la relación de aspecto celular (normalizada por cisto), de izquierda a derecha: 0-0.25, 0.25-0.5, 0.5-0.75, 0.75-1. En la parte superior, un histograma de coordenadas polares, que representa la frecuencia de las posiciones de las células. En la parte inferior, un diagrama de dispersión polar, que representa el radio y ángulo de los centroides celulares respecto al centroide del cisto, con una gama de colores basada en los valores de la relación de aspecto celular (normalizada por cisto). Top: parte superior; Bottom: parte inferior (cercana a la superficie de cultivo). 8 . A n e x o s 125 Figura Suplementaria 21. Distribución espacial de los valores del índice de convexidad celular en los cistos MDCK. A) Reconstrucciones 3D de tres cistos representativos de 4, 7 y 10 días. El color de las células simboliza el valor del índice de convexidad celular, en una gama que va de amarillo (valor mínimo) a morado (máximo). B) Diagrama de dispersión polar que muestra el radio y ángulo de los centroides celulares respecto al centroide del cisto, con una paleta de colores basada en los valores del índice de convexidad celular (normalizado por cisto). Se muestran 20361 células provenientes de 353 cistos segmentados de 4, 7 y 10 días. C) Clasificación celular según los valores del índice de convexidad celular (normalizado por cisto), de izquierda a derecha: 0-0.25, 0.25-0.5, 0.5-0.75, 0.75-1. En la parte superior, un histograma de coordenadas polares, que representa la frecuencia de las posiciones de las células. En la parte inferior, un diagrama de dispersión polar, que representa el radio y ángulo de los centroides celulares respecto al centroide del cisto, con una gama de colores basada en los valores del índice de convexidad celular (normalizado por cisto). Top: parte superior; Bottom: parte inferior (cercana a la superficie de cultivo). 8 . A n e x o s 126 Figura Suplementaria 22. Distribución espacial de los valores del área basal celular en función de la morfología que adopten los cistos MDCK. A, D, G) Posición celular en Z (normalizada respecto al centroide celular inferior en cada cisto) versus área basal celular (normalizada en cada cisto). El color de los puntos indica la morfología del cisto al que cada célula pertenece. Se encuentran representadas las células de >100 cistos segmentados de 4 (A), 7 (D) y 10 días (G). B, E, H) Gráficos de dispersión donde se representa la posición en Z versus área basal celular (normalizada en cada cisto) de los cistos elipsoides, oblatos y prolatos de 4 (E), 7 (B) y 10 días (H). C, F, I) Proporción de las células con una posición Z normalizada <0.15 y un valor de área basal celular normalizada < 0.5 en los cistos elipsoides, oblatos y prolatos de 4 (C), 7 (F) y 10 días (I). El porcentaje celular fue calculado respecto a todas las células de los cistos de cada morfología y en cada experimento. Los datos se representan como media ± SD. “*” y “**” indica significancia de p<0.05 y p<0.01, respectivamente. Top: parte superior; Bottom: parte inferior (cercana a la superficie de cultivo). 8 . A n e x o s 127 Figura Suplementaria 23. Distribución espacial de los valores del volumen celular en función de la morfología que adopten los cistos MDCK. A, D, G) Posición celular en Z (normalizada respecto al centroide celular inferior en cada cisto) versus volumen celular (normalizado en cada cisto). El color de los puntos indica la morfología del cisto al que cada célula pertenece. Se encuentran representadas las células de >100 cistos segmentados de 4 (A), 7 (D) y 10 días (G). B, E, H) Gráficos de dispersión donde se representa la posición en Z versus volumen celular (normalizado en cada cisto) de los cistos elipsoides, oblatos y prolatos de 4 (E), 7 (B) y 10 días (H). C, F, I) Proporción de las células con una posición Z normalizada <0.15 y un valor de volumen celular normalizado < 0.5 en los cistos elipsoides, oblatos y prolatos de 4 (C), 7 (F) y 10 días (I). El porcentaje celular fue calculado respecto a todas las células de los cistos de cada morfología y en cada experimento. Los datos se representan como media ± SD. 8 . A n e x o s 128 Figura Suplementaria 24. Distribución espacial de los scutoids según la forma de los cistos MDCK. A, C, E) Proporción celular vs posición celular Z normalizada (respecto al centroide del cisto). Porcentajes celulares referidos a las células provenientes de > 100 cistos segmentados de 4 (A), 7 (C) y 10 días (E). B, D, F) Proporción celular vs posición celular XY normalizada (respecto al centroide celular más inferior del cisto). Porcentajes celulares referido a las células provenientes de >100 cistos segmentados de 4 (B), 7 (D) y 10 (F) días. 8 . A n e x o s 129 8.2. Tablas anexas Características geométricas del CISTO Características geométricas del LUMEN Características de Empaquetamiento ID Cisto Forma Cisto Nº de Células Volumen (µm3) Área Superficial (µm2) Longitud Eje 1 (µm) Longitud Eje 2 (µm) Longitud Eje 3 (µm) Relación de Aspecto Índice de Convexidad Surface Ratio Volumen (µm3) Área Superficial (µm2) Longitud Eje 1 (µm) Longitud Eje 2 (µm) Longitud Eje 3 (µm) Fracción Lumen (%) Relaciónde Aspecto Índice Convexidad Scutoids(%) Intercal. AB AB/ Nº total de células 4d.1 prolato 43.0 32544.3 5462.0 38.8 34.8 33.7 1.2 0.9 3.2 5585.0 1650.0 23.1 19.2 17.5 17.2 1.3 0.9 55.8 0.8 4d.2 elipsoide 26.0 23461.7 4338.2 33.5 32.8 30.0 1.1 0.9 2.8 4521.4 1474.4 21.7 18.3 16.4 19.3 1.3 0.9 50.0 1.2 4d.3 oblato 50.0 25038.4 5081.3 43.0 39.5 20.7 2.1 0.9 2.8 4718.6 1710.4 26.7 24.1 10.5 18.8 2.5 0.9 32.0 0.4 4d.4 elipsoide 40.0 38485.7 6201.3 43.6 38.7 32.7 1.3 0.9 2.7 8717.5 2235.0 26.2 24.8 18.8 22.7 1.4 0.9 32.5 0.5 4d.5 prolato 31.0 26826.1 4772.0 36.8 32.8 30.9 1.2 0.9 3.6 3290.3 1263.7 20.3 16.4 14.5 12.3 1.4 0.8 54.8 0.7 4d.6 elipsoide 24.0 18853.7 3851.8 35.5 30.7 24.6 1.4 0.9 3.3 2933.5 1089.8 20.5 16.8 12.0 15.6 1.7 0.9 45.8 0.5 4d.7 oblato 23.0 17420.2 3567.3 32.4 29.2 25.8 1.3 0.9 4.2 1646.3 809.2 15.5 14.2 11.1 9.5 1.4 0.8 17.4 0.2 4d.8 oblato 24.0 18426.1 3775.7 32.9 31.3 25.0 1.3 0.9 3.8 2224.4 923.8 16.7 15.2 12.5 12.1 1.3 0.9 54.2 0.8 4d.9 elipsoide 27.0 18326.9 3693.0 33.6 29.3 26.0 1.3 0.9 3.6 2253.9 968.1 19.9 13.4 12.0 12.3 1.7 0.8 29.6 0.3 4d.10 oblato 45.0 34358.7 5688.5 39.2 37.7 32.8 1.2 0.9 3.4 4459.9 1597.6 24.5 19.6 14.1 13.0 1.7 0.8 44.4 0.7 4d.11 prolato 31.0 27122.2 4809.7 36.9 33.0 31.0 1.2 0.9 3.6 3266.6 1275.7 20.2 16.6 14.3 12.0 1.4 0.8 54.8 0.7 4d.12 prolato 52.0 36885.9 5946.7 41.7 36.1 34.1 1.2 0.9 2.7 8353.9 2137.1 24.2 22.7 21.1 22.6 1.1 0.9 42.3 0.6 4d.13 esfera 25.0 20887.4 4000.4 32.4 30.3 29.8 1.1 0.9 3.4 2653.2 1091.8 18.5 15.0 13.8 12.7 1.3 0.8 16.0 0.2 4d.14 prolato 32.0 31832.8 5341.7 40.7 33.4 32.5 1.3 0.9 3.1 4837.7 1624.5 24.6 18.0 15.6 15.2 1.6 0.8 0.0 0.0 4d.15 oblato 30.0 17393.2 3649.4 33.4 30.9 23.8 1.4 0.9 3.2 2891.1 1107.3 19.4 16.7 12.6 16.6 1.5 0.9 53.3 0.6 4d.16 oblato 28.0 16815.8 3529.2 31.6 29.2 25.6 1.2 0.9 3.2 2722.6 1019.8 17.3 15.7 14.0 16.2 1.2 0.9 28.6 0.3 4d.17 curvNeg 34.0 18045.9 3830.2 34.5 31.6 23.5 1.5 0.9 3.0 3281.5 1199.4 18.6 18.1 13.8 18.2 1.3 0.9 0.0 0.0 Tabla Suplementaria 1. Características geométricas y de empaquetamiento que describen al cisto completo, extraídas de 104 cistos de 4 días.