Desarrollo de un termociclador controlado electrónicamente para amplificación de ADN usando un microcalentador de temperatura fija

Trabajo de Fin de Grado Grado en Ingeniería de las Tecnologías Industriales Desarrollo de un termociclador controlado electrónicamente para amplificación de ADN usando un microcalentador de temperatura fija Autor: Alejandro Quintero Franco Tutor: Francisco Perdigones Sánchez Dpto. Ingeniería Electrónica, Microsistemas Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2020 aÍndice de TablasAA ii aÍndice de TablasAA iii Trabajo de Fin de Grado Grado en Ingeniería de las Tecnologías Industriales Desarrollo de un termociclador controlado electrónicamente para amplificación de ADN usando un microcalentador de temperatura fija Autor: Alejandro Quintero Franco Tutor: Francisco Perdigones Sánchez Profesor Titular de Universidad Dpto. Ingeniería Electrónica, Microsistemas Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2020 aÍndice de TablasAA iv aÍndice de TablasAA v Trabajo de Fin de Grado: Desarrollo de un termociclador controlado electrónicamente para amplificación de ADN usando un microcalentador de temperatura fija Autor: Alejandro Quintero Franco Tutor: Francisco Perdigones Sánchez El tribunal nombrado para juzgar el Proyecto arriba indicado, compuesto por los siguientes miembros: Presidente: Vocales: Secretario: Acuerdan otorgarle la calificación de: Sevilla, 2020 El Secretario del Tribunal aÍndice de TablasAA vi aÍndice de TablasAA vii Agradecimientos Hace 6 años me embarqué en una aventura, una aventura que me ha llevado a mis límites, pero de la que no me arrepiento lo más mínimo. Escribiendo estas líneas la doy por cerrada y me acuerdo de todos aquellos que me han acompañado durante este tiempo. Gracias a Alejandro Morón, mi fiel escudero. Aquel que conocí el primer día que entré en la escuela y con el que he recorrido este largo camino hombro con hombro. Sin duda mi mayor apoyo dentro de ese edificio rojo en el que hemos pasado tantas y tantas horas. Estoy seguro de que me llevo un amigo para toda la vida. Gracias a mis amigos, que me han hecho todo más fácil. Por todos esos días en los que me han liberado de todo el estrés que me inundaba evadiéndome de todo. El Ágora purifica. Gracias a mi familia. A mis abuelos, que tanto se enorgullecen de mí, a mis hermanas, que aunque no lo sepan han sido un gran estímulo y para las que siempre he querido ser un referente, y por supuesto a mis padres, las personas más importantes de mi vida, por su apoyo incondicional después de cada caída y por su aliento cuando más lo necesitaba. Nunca podré agradecerles todo lo que me han dado. También agradecer a mi tutor Fran, que con su simpatía y sentido del humor me ha hecho sentir en todo momento como en casa, por adaptarse y darme tantas facilidades ante la extraordinaria situación que nos ha tocado vivir. En definitiva, dar las gracias a todos aquellos que durante este largo camino me han aportado su granito de arena y han colaborado a que hoy dé un paso muy importante en mi vida. Alejandro Quintero Franco Sevilla, 2020 aÍndice de TablasAA viii aÍndice de TablasAA ix Resumen La reciente pandemia provocada por el COVID-19 ha puesto en boca de todos un término que hasta entonces era desconocido para una gran mayoría de la población, PCR. La crisis sanitaria en la que, parcialmente, aún seguimos inmersos, ha puesto de manifiesto la vital importancia de la microfluídica y del desarrollo de las tecnologías PCB-MEMS para el diagnóstico de enfermedades víricas a nivel mundial. En este proyecto se hace un repaso de estos conceptos, partiendo de la microfluídica, hasta llegar a nuestro tema de estudio concreto, los dispositivos Lab on PCB para pruebas PCR. Posteriormente, se diseña y desarolla un termociclador controlado electrónicamente para la amplificación de ADN de muestras de entre 25 µl y 50 µl, utilizando procesos de fabricación estandarizados y materiales de bajo coste. La extraordinaria situación provocada por el coronavirus nos privó de fabricar el sistema de manera íntegra, pero a nivel de diseño el proyecto se finalizó satisfactoriamente. aÍndice de FigurasAA xvi 1 1 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS os dispositivos microfluídicos posibilitan controlar los fluidos y analizarlos a una escala micrométrica, por lo que están revolucionando los campos del análisis químico y biológico. Estos microsistemas, que poseen las ventajas de requerir muestras muy pequeñas, tiempos de respuesta menores y ser portátiles, incorporan las operaciones de ensayo y la preparación de las muestras en un chip. Esto quiere decir, que llevan a cabo las funciones de un equipo de laboratorio convencional. Las aplicaciones existentes para este modelo de microsistemas son ya muy numerosas y abarca desde aplicaciones médicas para examinar fluidos corporales humanos, como sangre u orina, hasta aplicaciones en ingeniería ambiental para observar la concentración de algún contaminante o como un sensor usado en controles de calidad en procesos de producción. [1] 1.1 Introducción El desarrollo de este proyecto de fin de grado se enmarca en el grupo de investigación de Microsistemas, dentro del TIC 109-Grupo de Tecnología Electrónica, perteneciente al departamento de Ingeniería Electrónica. Este es un grupo de investigación consolidado dentro del plan andaluz de investigación de la Junta de Andalucía, cuya calificación en la última evaluación fue de excelente. Las actividades de investigación que se desarrollan en la línea de investigación de Microsistemas son: • Diseño de dispositivos y sistemas electrónicos para su aplicación en telemedicina. • Microsistemas sensoriales, microfluídicos, RF-MEMS y microópticos. Nuestro proyecto pertenece, más específicamente, a la línea de investigación en aplicaciones biomédicas en dispositivos PCR. Si hablamos de algunas de las aplicaciones de los dispositivos PCR, podemos, por ejemplo, nombrar su uso para la detección de la listeriosis. Gracias a los avances en la biotecnología, actualmente somos capaces de desarrollar nuevos métodos para detectar este tipo de microorganismo en alimentos de manera más eficiente, con mayor sensibilidad y disminuyendo los tiempos de detección. Estos métodos rápidos tienen la aptitud de ser altamente específicos y de determinar entre organismos muy parecidos genéticamente. Como es el caso de nuestro tema de estudio, la técnica de Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR), que se utiliza ampliamente como un método rápido de diagnóstico, mediante el cual, además, es posible identificar al mismo tiempo diferentes características genotípicas, como por ejemplo género y especie [2]. Además, la PCR, con su variante múltiple, es una técnica que posibilita determinar la presencia de Listeria spp. y verificar la especie de Listeria monocytogenes a la par, L aIntroducción y ObjetivosAA 2 reduciendo así el tiempo de detección e incrementando la especificidad del diagnóstico. Además, posee la ventaja de poder amplificar secuencias que codifiquen, por ejemplo, diferentes genes de una misma especie o de diferentes especies a la vez, lo que conlleva reducción del tiempo y del coste de la reacción [3] Figura 1.1 PCR múltiple para Listeria spp y Listeria monocytogenes Además, otra de las aplicaciones más actuales de estos dispositivos es para el diagnóstico de infección por SARS-CoV-2, el virus que causa la COVID-19, o más conocido coloquialmente como coronavirus, que tanto nos está afectando mundialmente desde hace unos meses. Las pruebas de PCR, como ya hemos dicho, son una forma bastante fiable de comprobar la existencia de enfermedades infecciosas. Se toman mediante una muestra respiratoria y detectan el ARN del virus, es decir, un fragmento del material genético de un patógeno o microorganismo. Su grado de sensibilidad es alto pero también tienen limitaciones. La primera es que llevan tiempo, ya que necesitan unas pocas horas para obtener los resultados. Esto implica un límite en la cantidad de pruebas que un solo laboratorio puede llevar a cabo en un día. Otra limitación es la disponibilidad de reactivos necesarios. La demanda mundial de estas pruebas a raíz de la pandemia ha provocado escasez. La contaminación o la degradación también pueden causar problemas por falsos positivos, cuando alguien no tiene el virus pero la prueba dice que sí lo tiene, o falsos negativos, cuando alguien tiene el virus pero la prueba dice que no lo tiene. Una última gran limitación de este tipo de pruebas es que solo pueden indicar si alguien tiene el virus en el momento de la prueba. No puede decirnos si ha tenido el virus pero se ha recuperado posteriormente antes de la prueba. Para esto último, se utilizan los test de detección de anticuerpos, que son mucho más rápidos ya que solo tardan unos 15 minutos en tener el resultado, aunque con una fiabilidad menor a la PCR. Estas pruebas detectan los anticuerpos generados por el sistema inmunitario de nuestro organismo cuando la infección ya ha pasado o nos estamos recuperando. Normalmente se recomienda utilizarlos de manera complementaria a la PCR, pero en situaciones como esta, en la que se hace necesaria la distribución masiva de pruebas, ambos son de gran ayuda para detectar casos de personas infectadas que no tienen síntomas o los sufren de manera muy leve. aIntroducción y ObjetivosAA 3 1.2 Esquema general del proyecto Para entender un poco mejor qué queremos hacer en este proyecto, construiremos un pequeño esquema que nos ayude a visualizarlo y comprenderlo. ! Figura 1.2 Esquema general del proyecto ! Básicamente, nuestro proyecto estará formada por un placa electrónica PCB donde estarán integrados los circuitos de control de temperatura y el motor, el motor, los microcanales y el microcalentador. Este sistema funcionará de la siguiente forma: el microcalentador se alimentará mediante una fuente externa a una temperatura fija de 120ºC. La placa PCB leerá los niveles de tensión de unos sensores NTC localizados en el LOC, esta encenderá el motor y este se encargará de mover el LOC con la muestra alejándolo o acercándolo del microcalentador según la temperatura que busquemos. El sistema pretende imitar el funcionamiento de un termociclador convencional como el de la figura 1.3. aIntroducción y ObjetivosAA 4 ! Figura 1.3 Termociclador convencional para pruebas PCR Desde su descubrimiento estos aparatos pueden tener dos formas de funcionar, la primera y más común es mediante un bloque de resistencia eléctrica. Este se encarga de distribuir la temperatura de manera constante en rangos de tiempo ajustables. Normalmente las temperaturas oscilan entre los 4ºC y los 96ºC. De esta manera se consigue separar las hebras del ADN necesarias para el estudio. La otra modalidad es la tecnología Peltier. Esta se refiere a un cambio de temperatura por voltaje eléctrico. Su principal función es generar electricidad que se transforma en temperaturas altas o bajas. Dentro del aparato se encuentran dos semiconductores por junturas de Peltier que hacen el proceso posible. Este método es el preferido por la gran mayoría debido a su eficiencia y precisión con respecto a las muestras y los resultados. En nuestro proyecto imitaremos la primera propuesta. Un calentador de pistas de cobre a temperatura fija se encargará de calentar la muestra a distintas temperaturas gracias a un motor que moverá el LOC donde se encuentra el fluido, acercándolo o alejándolo del calentador usando rangos de tiempo establecidos. 1.3 Objetivo principal El principal objetivo de este trabajo es el diseño y construcción de un termociclador controlado electrónicamente para amplificación de ADN mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando un microcalentador de temperatura fija. ! 1.4 Requisitos y tareas Los requisitos que de nuestro proyecto serán los siguientes: aIntroducción y ObjetivosAA 5 • Volumen de la muestra: entre 25 µl y 50 µl • Temperatura 1: 65ºC ± 7ºC • Temperatura 2: 95ºC ± 1ºC • Área del metacrilato: 2x2 cm2 • Área del PCB: entre 2x2 cm2 y 2,5x2,5 cm2 • Sección del microcanal: 1x1 mm2 El propósito es realizar dicho ensayo en un dispositivo modular y de tamaño limitado, por lo que sea tenido en cuenta como un dispositivo Lab-on-chip. El dispositivo tendrá dos temperaturas en lugar de tres como suelen tener los termocicladores de ensayos convencionales, aunque la particularidad de nuestro proyecto es que se pueden seleccionar también tres temperaturas. Las prioridades del dispositivo serán tanto la simplicidad del diseño de este, como que tenga el menor coste posible, usando materiales como cobre, PCB y metacrilato entre otros. Además de los materiales, se buscan también procesos de fabricación estándar. La condición final del trabajo es simplemente que realice la función para la que ha sido construido: la amplificación de muestras de ADN. Para la realización de esto se tienen que establecer unas condiciones y unas tareas asociadas. Para sacar adelante este proyecto, se comenzaron a realizar las tareas en el siguiente orden: Diseño del circuito electrónico para del control de temperatura: Se realizó la particularización de las resistencias para cada uno de los dos circuitos y la simulación de los resultados, todo mediante Microcap. Diseño del Lab-on-PCB: Lo que envuelve todo lo referido a diseño y fabricación de máscaras del microcalentador y microcanales, incluyendo los sensores NTC. Diseño del PCB del motor y control de temperatura: Incluyendo los circuitos de control anteriores, el motor y el microcontrolador. Programación del microcontrolador: Se encargará del movimiento del motor, encargado de acercar o alejar el fluido del calentador. Fabricación del circuito electrónico completo: Debido a las condiciones extraordinarias que vivimos resultó imposible la fabricación del dispositivo completo. Pruebas del dispositivo completo: Por el mismo motivo anterior, esta última parte también quedó pendiente. aEstado del arteAA 6 2 ESTADO DEL ARTE n este capítulo detallaremos más pausadamente diversos conceptos desde lo más general, la microfluídica, a lo más particular, el Lab-on-PCB para PCR, pasando previamente por los circuitos microfluídicos, Lab-on-Chip y Lab-on-PCB. 2.1 Microfluídica La microfluídica es una tecnología que permite la automatización y multiplexión de equipos de laboratorio, el desarrollo y prueba de fármacos y la generación de dispositivos para diagnósticos in vitro, además de buscar escalar y automatizar procedimientos de laboratorio en los campos de la biotecnología y la química [4]. Las minúsculas dimensiones de los canales hacen que se reduzca el consumo de reactivos y que se produzca una menor cantidad de desechos, lo que ahorra gastos y permite que las muestras puedan ser divididas en un mayor número de ensayos. Se pueden replicar reacciones idénticas o ensayos en un solo chip de microfluídica aprovechando un paralelismo y así aumentar el rendimiento, o se pueden integrar varias etapas en un chip complejo para mejorar su facilidad de uso y realizar diagnósticos médicos de manera portátil. Los microcanales también pueden mejorar la velocidad y la precisión de reacciones químicas, así como la velocidad, sensibilidad y repetitibilidad de varios ensayos [5]. Para el uso y fabricación de estos dispositivos microfluídicos se requiere el involucramiento de varias disciplinas de conocimiento. Además tienen muchas aplicaciones en el campo de la medicina, la investigación de biología celular y la cristalización de proteínas. Dependiendo de los materiales que se utilicen y de los requisitos necesarios para la aplicación a la que sean destinados, el proceso de fabricación de los dispositivos podrá variar. Los primeros dispositivos fueron fabricados por tecnologías desarrolladas por la industria de los semiconductores y de los sistemas electromecánicos (MEMS), utilizando materiales como el silicio y el vidrio. La principal razón de utilizar estos materiales es porque en la industria de la electrónica ya existía el equipo necesario, las técnicas de fabricación establecidas y un amplio conocimiento de cómo realizar los patrones micrométricos. Sin embargo, se empezaron a explorar materiales elastómeros moldeables como el polidimetilsiloxano (PDMS) o el polimetilmetacrilato (PMMA), con los cuales se pueden realizar prototipos rápidos o moldeados por inyección lo cual hace que su fabricación sea más barata [6]. Recientemente, en un intento por disminuir más los costos y explorar en los países en desarrollo se han realizado dispositivos en papel [7]. En este escenario, podemos concluir diciendo que la fabricación de dispositivos microfluídicos están dirigidos en dos direcciones: crear dispositivos baratos y fáciles de fabricar con elastómeros y papel, y por otro lado, desarrollar dispositivos de mayor calidad y resistencia, basados en silicio y vidrio, donde sus costes de fabricación están justificados. E aEstado del arteAA 7 2.2 Dispositivos microfluídicos Un circuito microfluídico básico lo componen los microcanales, a través de los cuales circulan los fluidos, y los puertos de acceso por donde se inyectan y extraen los fluidos. Opcionalmente, también pueden incorporar válvulas y bombas que permitan el movimiento y control de los mismos. El circuito mostrado en la figura 2.1 es una muestra de un dispositivo microfluídico de metacrilato, fabricado durante nuestro proyecto, en el que se distingue claramente los microcanales y los puertos de acceso. En este circuito, las bombas y válvulas pueden aplicarse externamente y no son tema de estudio en este proyecto. Figura 2.1 Circuito microfluídico de metacrilato Los circuitos microfluídicos, gracias a las peculiares características que poseen los fluidos a escala micromética, presentan novedosos beneficios que pueden ser aplicados en diferentes áreas. Por ejemplo, al reducir el tamaño de los componentes, utilizamos menor volumen de fluidos, es decir, un menor consumo de reactivos. A su vez, esto minimiza costes, permite que pequeñas cantidades de fluidos se exploten aún más y se aminora la producción de desechos. Además, la alta razón superficie - volumen de los pequeños componentes facilita una rápida transferencia de calor, lo que posibilita rápidos cambios de temperatura y el preciso control de ella, lo que nos beneficiará mucho en nuestro trabajo. Además, debido a las cortas distancias en los dispositivos microfluídicos, el mezclado por difusión es rápido, lo que aumenta la velocidad y la precisión de las reacciones. En los ensayos médicos que se han ido realizando, se han distinguido mejoras como tiempos de medición reducidos, sensibilidad mejorada y selectividad y repetitividad mayores. En los microcanales, el fluido se comporta de manera laminar, lo que permite nuevos procedimientos para llevar acabo intercambio de solventes y filtrado [8]. Uno de los mayores beneficios de la microfluídica es integrar procesos al fabricar dispositivos con múltiples elementos y funcionalidades. Un chip integrado puede realizar procesos químicos y biológicos desde el principio hasta el fin. Por ejemplo, el muestreo, pre-procesamiento, y medición, que implica un ensayo, llevó al empleo de los términos Lab-On-Chip y Micro Total Analysis System (μTAS) [9]. Realizar todas estas operaciones en un solo chip ahorra tiempo, no es necesario contar con equipos de laboratorios grandes y costosos, y reduce el riesgo de pérdida de muestras o contaminación de las mismas. aEstado del arteAA 8 En este ejemplo de la figura 2.2, se desarrolla un dispositivo microfluídico de alta densidad que contiene redes de fontanería con miles de válvulas micromecánicas y cientos de cámaras direccionables individualmente. Lo que se intenta en este dispositivo es construir el análogo microfluídico de una matriz de comparación y un dispositivo de almacenamiento de memoria microfluídica cuyo comportamiento se asemeja a la memoria de acceso aleatorio [10]. Figura 2.2 Dispositivo microfluídico Resumiendo, los dispositivos microfluídicos abarcan desde una simple unidad de operación como son mezcladores, separadores, manipulación de partículas, calentamiento, y detección, hasta la incorporación de múltiples unidades de operación formando sistemas complejos conocidos como Lab-on-Chip. aEstado del arteAA 9 2.3 Lab on Chip Los Lab-on-Chip son dispositivos complejos en el que se integran una o varias funciones de laboratorio. Los Lab-on-Chip pueden llegar a estar formados por millones de nanodispositivos que trabajen de forma conjunta y coordinada para llevar a cabo su función. Son fabricados para que en áreas, que vayan desde unos milímetros a pocos centímetros, se tengan las funciones de un laboratorio en un solo chip con canales, cámaras de difusión, bombas, válvulas y mucho más, con capacidad de manejar volúmenes de fluidos y muestras pequeñas [11]. Es por ello que su desarrollo va en aumento. Figura 2.3 Dispositivo Lab-On-Chip Estas unidades pueden estar compuestas por sistemas microfluídicos, micromecánicos y nanosensores. Son diseñados para manipular volúmenes del orden de los microlitros, nanolitros y hasta picolitros y como interfaces entre la industria médica, la biotecnología, la química y la bioingeniería [12]. Esta reducción en el tamaño hace de este tipo de laboratorio, un dispositivo portátil que facilita el proceso in situ de análisis de muestras de sangre, como en el caso de las ciencias de la salud [13], como también determinar la causa de infecciones. Las aplicaciones de estos dispositivos son tan amplias como se pueda imaginar, aunque principalmente están orientadas a aplicaciones en medicina para diagnosticar y tratar distintas enfermedades, así como análisis de ADN. Los dispositivos Lab-on-Chip tratan de acercar posturas entre la tecnología microfluídica y la biología molecular. Los microsistemas Lab-on-Chip presentan nuevas opciones para el control y manejo de células [14], pues son sistemas en los que pueden integrarse componentes fluídicos, ópticos, electrónicos y biológicos [15]. Por ello estos dispositivos han encontrado su espacio en diversos campos de la ciencia, evidenciado en la cantidad de trabajos realizados en las áreas de las ciencias de la salud, farmacéutica y la química [16]. aEstado del arteAA 16 Se espera que el mercado mundial de chips de microfluidos crezca a una tasa compuesta anual de aproximadamente 12.4% en los próximos cinco años, alcanzando 5450 millones de dólares en 2024, partiendo de 2700 millones de dólares en 2019. [37] Particularizando para dispositivos PCR, recientemente se han aprobado subvenciones a proyectos de investigación para paliar los efectos de la pandemia provocada por el coronavirus. A nivel autonómico, la Junta de Andalucía ha destinado un cuantía de casi 3 millones de euros para el desarrollo de herramientas que ayuden al diagnóstico de la enfermedad y al tratamiento de los pacientes infectados. Este es el caso de los test PCR y test de detección rápidos, gracias a los cuales se detecta el virus incluso entre la población asintomática. [38] El Gobierno de España, a través del BOE, también ha dedicado en el presupuesto de gasto una cantidad que ronda los 25 millones de euros al instituto de salud Carlos III para proyectos y programas de investigación del virus. [39] En cuanto a Europa, la Comisión Europea está impulsando la investigación que se necesita con urgencia sobre el coronavirus con 10 millones de euros de su programa de investigación e innovación, Horizonte 2020. [40] a3 Electrónica del sistemaAA 17 3 ELECTRÓNICA DEL SISTEMA ste capítulo tratará todo lo relacionado con la electrónica de nuestro sistema, es decir, el control de las temperaturas, el control del motor, y el diseño de la placa electrónica PCB donde irán integrados todos los circuitos de control. 3.1 Control de temperaturas En este apartado veremos todo lo que envuelve al control de la temperatura de nuestro trabajo. En primer lugar, realizaremos el diseño de los circuitos de control de temperaturas y a continuación los resultados que cosechan sus respectivas simulaciones. 3.1.1 Diseño y simulación de circuitos Nuestro objetivo será el diseño del circuito electrónico con el fin de controlar la temperatura. Para ello, partimos de este circuito sin particularizar dibujado en Microcap. El circuito sería el siguiente: Figura 3.1 Circuito de control de temperatura sin particularizar Desglosando el circuito por partes, de izquierda a derecha, primero observamos un divisor resistivo que está alimentado por una tensión de referencia a 5 V. Diferenciamos una resistencia fija que está conectada a dicha alimentación y a continuación el punto A. La particularidad de la NTC es que varía su valor de resistencia con respecto a la temperatura según nos indica la fórmula: 𝑉 !=𝑅"#$ 𝑅"#$ + 𝑅% %∙%𝑉& E a3 Electrónica del sistemaAA 18 La NTC la encontramos justo debajo del punto A. Para la simulación de la variación de temperatura que se realizará en el circuito real, se usa una fuente de tensión sinusoidal V1 con una Macro, en la cual el valor de la corriente continua se corresponde con la temperatura a la que está la NTC. Una vez tenemos la tensión variable VA según la temperatura, tenemos que adaptar el rango de tensiones para que sea apta a la entrada del microcontrolador. Para esto, usamos un amplificador operacional OA, concretamente un amplificador diferencial. También debemos intentar evitar al máximo las pérdidas de corriente por lo que utilizamos otro amplificador operacional conectado al punto A para que funcione como seguidor de tensión. Así, el circuito a la derecha del punto A está aislado del seguidor de tensión, logrando una fiable relación entre los niveles de tensión y la temperatura de la NTC. A continuación, nos encontramos con el circuito de amplificación. Este recibirá la tensión del punto A y amplificará la señal según la fórmula: 𝑉'() =% 𝑅* 𝑅+ %(1 + 𝑅+ 𝑅* ) 1 + 𝑅, 𝑅- %∙ (𝑉 !− 𝑉-) Si 𝑅*= 𝑅-%𝑦%𝑅+= 𝑅, 𝑉'() =𝑅* 𝑅+ %∙%(𝑉 !− 𝑉-) Ya que tenemos que controlar a 65ºC y 95ºC, esta señal de salida se conecta a un pin de entrada de nuestro microcontrolador para cada circuito. 3.1.2 Método resolutivo Para el diseño y particularización de los circuitos de control de temperatura a 65ºC y 95ºC llevaremos el cabo el siguiente procedimiento: 1. Determinar el valor de R1 para que la fuente de tensión V5 esté prefijada en el circuito 2. Determinar el valor de las resistencias para los casos extremos Tmáx y Tmín 3. Hallar VAmáx y VAmín en función de R1 4. Fijar la tensión V5 en la fórmula del amplificador 5. Adaptar la señal: -Vout = 0 para VAmín -Vout = 4’5 para VAmáx 6. Resolver sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas, R1 y !! !" a3 Electrónica del sistemaAA 19 Para llevar a cabo este procedimiento usaremos las fórmulas: 𝑅"#$ ( 𝑇 ) =&𝑅%∙ 𝑒& ' ( #)( #* + &&&&&&&&&&&&&&𝑉 ,=𝑅"#$ 𝑅"#$ + 𝑅(&∙&𝑉-&&&&&&&&&&&&&&&𝑉*./ =𝑅0 𝑅1&∙&(𝑉 ,− 𝑉2) 𝑅%=10 k y b = 3380 3.1.3 Diseño para 95ºC Para el diseño del circuito de control de temperaturas a 95ºC comenzaremos fijando en la DC de la fuente sinusoidal V1 el valor de la temperatura deseada. A su vez, introduciremos en la amplitud una tolerancia de ±1ºC. Fijamos para las fuentes V2 y V5 un valor de 5 V y 3’3 V respectivamente. Finalmente, resolveremos el circuito siguiendo el método resolutivo descrito en el apartado anterior quedando de la siguiente forma: Figura 3.2 Circuito de control de temperatura para 95ºC Se han tenido en cuenta el valor de las resistencias comerciales para que a la hora del montaje del circuito se utilicen el mínimo número de resistencias posibles. Realizando la simulación para esta configuración del circuito obtenemos estos resultados: a3 Electrónica del sistemaAA 20 Figura 3.3 Resultados de la simulación para 95ºC Temperatura VA Vout 96ºC 3’33 0’137 95ºC 3’33 2’384 94ºC 3’356 4’616 Tabla 3.1 Tensión en el punto A y en la salida conforme a la temperatura Si llevamos al límite nuestro rango de tensión, podemos saber hasta qué temperaturas se podría medir. Fijando una tensión de salida de 5V, obtenemos una temperatura ligeramente inferior a 94ºC, concretamente 93’78ºC. De igual manera, para una tensión de salida exacta de 0V, la temperatura será prácticamente idéntica a 96ºC, ya que la diferencia de tensión es minúscula, así obtenemos una temperatura de 96’007ºC. a3 Electrónica del sistemaAA 21 3.1.4 Diseño para 65ºC Para el diseño del circuito de 65ºC seguiremos el mismo procedimiento. Introducimos la temperatura en la DC de V1, colocamos en la amplitud una tolerancia, en este caso, de ±7ºC. Fijamos los mismos valores para las fuentes V2 y V5, y resolvemos el circuito siguiendo el mismo método resolutivo: Figura 3.4 Circuito de control de temperatura para 65ºC También se tuvieron en cuenta el valor de las resistencias comerciales para simplificar al máximo su montaje. La simulación de este circuito queda la siguiente manera: a3 Electrónica del sistemaAA 22 Figura 3.5 Resultados de la simulación para 65ºC Temperatura VA Vout 72ºC 3’30 0’019 65ºC 3’52 2’288 58ºC 3’73 4’517 Tabla 3.2 Tensión en el punto A y en la salida conforme a la temperatura Al igual que en el circuito anterior, aquí también llevamos al límite nuestro rango de tensión para saber qué temperaturas se alcanzan. Fijando la tensión de salida de 5V, se obtiene una temperatura de 56’36ºC. La tensión para 72ºC ya es prácticamente 0, por lo que no habrá una diferencia notable de temperatura, obtenemos así un valor de 72’008ºC. a3 Electrónica del sistemaAA 23 3.2 Control del motor Con respecto al motor, queremos controlar un motor paso a paso bipolar mediante Arduino. En particular, utilizamos este motor de conexión de dos pines con el integrado L293D de la figura 3.6 que es el más común. De esta manera, solo tenemos que usar dos pines de control e invertirlos. Para esto se encuentran los transistores NPN, que trabajan como un inversor de señal. De este modo, usaremos solo dos pines de Arduino y con los dos transistores NPN en modo inversor obtendremos los cuatro pines de control necesarios para atacar el integrado L293D. Figura 3.6 Circuito del motor paso a paso bipolar con conexión de dos pines a3 Electrónica del sistemaAA 24 3.3 Diseño y fabricación de la placa electrónica PCB El siguiente paso será el diseño de la placa electrónica PCB donde estarán integrados tanto los dos circuitos de control a temperatura a 65ºC y 95ºC, como el motor encargado de mover el LOC con el líquido. Para ello utilizamos KiCad, un software CAD de diseño de PCB. Vamos a diseñar la placa para que se le pueda acoplar el arduino MEGA. Para ello, abrimos KiCad, abrimos un nuevo proyecto y elegimos la opción “desde plantilla” y seleccionamos “MEGA”. A continuación, abrimos el esquemático y comenzamos a añadir componentes. Hemos de tener en cuenta la identificación de pines de Arduino Mega para no liar pines de control de temperatura con los del motor. Cada uno ha de tener sus propios pines. Las salidas de arduino que vayan conectadas al motor L293D son digitales, sin embargo, las NTC van conectadas a los pines analógicos. Figura 3.7 Esquemático del PCB de control de temperatura y motor 1. Circuito de control de temperatura a 95ºC 2. Circuito de control de temperatura a 65ºC 3. Motor L293D 4. Pines de Arduino MEGA 5. Pulsador y LED a3 Electrónica del sistemaAA 25 Tras el diseño del esquemático, pasaremos al diseño del PCB. El resultado del diseño final del PCB utilizando el mismo software es el siguiente: Figura 3.8 PCB de control de temperatura y motor en 2D A la hora de rutar, debemos tener en cuenta que se suelda por debajo de la placa, y por tanto, todo lo que se vaya a soldar debe estar asociado a una pista verde. En caso contrario, pista roja, el componente tapa el PAD y es imposible soldarlo. Sólo se podrá en el caso de las resistencias y transistores, que se pueden soldar tanto por arriba como por debajo. Esto se debe a que las pistas en verde representan la capa de abajo y las pistas rojas la capa de arriba. En las zonas que no sea posible acceder mediante una pista verde, se utilizarán vías, que hacen de conexiones entre la capa de arriba y de abajo del PCB. Habrá que evitar poner pistas que formen un ángulo de 90º, preferiblemente poniéndolas a 45º con el fin de eludir problemas en la fabricación. Las pistas tendrán un grosor de 0’6 mm. Los integrados 1 y 2 representan los amplificadores operacionales de los circuitos de control de temperatura. A su alrededor se encuentran las resistencias que van conectadas a estos particularizando cada circuito a 65ºC y 95ºC respectivamente. El conjunto 3 es el del motor L293D compuesto por un integrado al que van conectadas varias las resistencias y los transistores Q1 y Q2. La lista de componentes de nuestra placa electrónica PCB de control de temperatura y el motor es la siguiente: 1 2 3 a4 Lab on ChipAA 32 Figura 4.6 Máscara calentador 150 µm Figura 4.7 Máscara calentador 100 µm Figura 4.8 Máscara calentador 50 µm a4 Lab on ChipAA 33 4.3 Proceso de fabricación SU-8 Una vez tengamos ya las máscaras, procederemos a la fabricación del LOC comenzando el proceso de fabricación del SU-8. Este tiene como función crear el molde de SU-8 sobre la placa PCB rígida para posteriormente fabricar el LOC de PDMS. Figura 4.9 Proceso de fabricación del SU-8 1º Limpieza del sustrato: El primer paso consiste en limpiar el sustrato, en nuestro caso PCB, con acetona e isopropanol. 2º Spin Coating: Utilizamos una máquina llamada Spin Coater para depositar el SU-8 sobre el sustrato con un espesor definido. Para conseguir una capa a una altura específica, programamos el Spin Coater a unas determinadas revoluciones. En nuestro caso realizamos una multideposición, la primera de un espesor de 50 µm y posteriormente otra de espesor 150 µm, obteniendo un altura final de 200 µm. Figura 4.10 Spin Coater Figura 4.11 Gráfica revoluciones / espesor a4 Lab on ChipAA 34 3º Soft Bake: Usamos un hot plate para mediante calor eliminar el disolvente presente en el SU-8 consiguiendo que se solidifique. El soft bake se realiza durante un corto tiempo a 65ºC y luego durante un tiempo mayor a 95ºC. Los tiempos dependerán del espesor de la capa. Figura 4.12 Hot Plate 4º Exposición: La exposición del SU-8 se realiza iluminándolo con luz ultravioleta gracias a esta alineadora. Mediante una máscara, nosotros utilizamos la del microcanal de 200 µm, se iluminan las partes que se desean polimerizar y se tapan las que no. Para nuestro caso, haremos una multiexposición, una para cada una de las deposiciones. Figura 4.13 Alineadora / Insoladora 5º Post Exposure Bake (PEB): Volvemos a calentar en el hot plate para polimerizar el SU-8 iluminado. El tiempo de calentamiento depende del espesor de la capa. 6º Grabado: Último paso del proceso. Su objetivo es eliminar el SU-8 no polimerizado. Se puede hacer mediante inmersión, como en nuestro caso, o spray. Si es necesario usaremos acetona. Tras el grabado, aclaramos con isopropanol. a4 Lab on ChipAA 35 La figura 4.14 muestra el resultado final del proceso. Observamos la presencia de un par de burbujas que aparecieron durante la deposición del SU-8 y que no conseguimos hacer desaparecer tras someterlo a calor con el Hot Plate. Figura 4.14 Molde de SU-8 sobre PCB del microcanal de 200 µm a4 Lab on ChipAA 36 4.4 Proceso de fabricación PDMS Fabricado ya el molde necesario en SU-8, como hemos mostrado anteriormente, llegaremos al último paso, la fabricación del LOC en PDMS que utilizaremos finalmente para nuestro proyecto. 1º Preparación del PDMS: El proceso comienza haciendo una mezcla prepolímero y agente curador con una proporción 10:1 en peso, la más típica usada, y otra de proporción 20:1. La mezcla se realiza manualmente. 2º Desgasificado: Una vez hayamos terminado la mezcla, se mete en una campana de vacío durante unos 15 minutos para eliminar las burbujas que hayan aparecido durante la mezcla. Figura 4.15 Campana de vacío 3º Vertido y curado: La mezcla de proporción 10:1 se echa en el molde y la de 20:1 se deposita sobre una oblea de vidrio a unas determinadas revoluciones en función de la altura deseada usando el Spin Coater. Una vez acabado, se curan en el horno. En nuestro caso estuvieron 45 minutos a una temperatura de 65ºC. Figura 4.16 Vertido y curado 4º Desmoldado y perforación: Una vez curado, se desmolda y obtenemos una réplica del molde en negativo. A continuación, se le hacen agujeros de entrada y salida para poder inyectar fluidos mediante conectores. a4 Lab on ChipAA 37 Figura 4.17 Desmoldado y perforación 5º Bonding y curado final: Para terminar cerramos el circuito microfluídico con la otra lámina de PDMS que depositamos sobre la oblea de vidrio efectuando previamente el curado parcial de ambos PDMS a 65ºC durante 45 minutos (Bonding). Previamente, se desmolda el PDMS de nuestro circuito microfluídico y se le hace los agujeros en los puertos de entrada y salida. Finalmente se mete en el horno para que se suelde. Figura 4.18 Bonding y curado final a4 Lab on ChipAA 38 4.5 Fabricación del calentador Para llevar a cabo la fabricación del calentador, en primer lugar se recortó una placa PCB en forma cuadrada de aproximadamente 4 cm de lado donde cupiese sin problemas la máscara de pistas de 150 µm fabricada anteriormente. Figura 4.19 Máscara calentador 150 µm Se le aplicó una resina en spray y se calentó durante unos segundos en el Hot Plate. A continuación, se procedió a la alineación e insolación utilizando la máscara nombrada. Se le sometió a 7 ciclos de insolación de aproximadamente 20 segundos cada uno. Finalmente se llevó a cabo el revelado y el ataque químico del PCB por ambas caras. Tras soldar la NTC y los cables en los PADs orientados a conexión, el resultado es el que se muestra en la siguiente figura 4.20. Se observa como hubo que realizar un pequeño arreglo en las pistas con estaño debido a una discontinuidad que apareció durante el ataque químico. El color oscuro más notable en la parte central se debe a la alta temperatura a la que se sometió durante una de las pruebas realizadas en el laboratorio. Figura 4.20 Calentador de 150 µm después de la caracterización a4 Lab on ChipAA 39 4.3 Fabricación del Lab on Chip en PMMA Además de fabricar el LOC en PDMS, también fabricamos otro dispositivo en metacrilato (PMMA) utilizando el diseño en L-Edit de la máscara de los microcanales de espesor 500 µm. Figura 4.21 Diseño en L-Edit del microcanal de 500 µm Para el fresado de los microcanales en PMMA se utilizó la fresadora CNC del laboratorio de microsistemas de la escuela. Una vez finalizado se hicieron los agujeros en los puertos de entrada y salida. El LOC tiene unas dimensiones de 2x2 cm2. La figura 4.22 muestra el resultado final. Figura 4.22 LOC fabricado en PMMA Figura 4.23 PCB flexible con dos sensores NTC Posteriormente, este dispositivo LOC se iba a cubrir con un PCB flexible con dos sensores NTC como el de la figura 4.23. El pegado se realizaría con un pegamente biocompatible. Los PADs de 95ºC y 65ºC irían conectados a las lecturas que tenemos como entradas de Arduino, mientras que las resistencias asociadas a las NTC ya están en la placa electrónica PCB. El modelo de la NTC es “Termistor Murata, Resistencia 10kΩ, Compensación, Detección, Carcasa 0402, 100mW, 1 x 0.5 x 0.5mm”, y tiene un coste de 10 céntimos la unidad. a5 Programación del MicrocontroladorAA 40 5 PROGRAMACIÓN DEL MICROCONTROLADOR n este apartado explicaremos el desarrollo e implementación del microcontrolador para programar el movimiento del motor y el control de temperatura en el Lab-on-PCB. Para ello hemos utilizado Arduino, una plataforma de creación de electrónica de código abierto, basada en software y hardware libre. En primer lugar realizaremos un diagrama de bloques de funcionamiento. Una vez hecho esto, pasaremos a escribir el programa en Arduino. Con respecto al convertidor analógico-digital, ADC, su funcionamiento es muy sencillo. Los niveles del convertidor abarcan desde 0V hasta 5V. Eso, en el ADC, se corresponde con 0 a 1023, es decir, el 0 iría con los 0V, y el 1023 con los 5V. Sabemos que nuestras señales oscilan aproximadamente entre 0 y 5V. Para su transformación, habrá que saber su valor exactamente y simplemente hacer una regla de tres para pasarlo a 0-1023. 5.1 Diagrama de bloques de funcionamiento Para una mejor organización y limpieza se realizó un diagrama de bloques principal compuesto por otros sub-diagramas. 1. Si está dentro del rango pasa directamente a esperar el tiempo estipulado (continuación del diagrama principal). 2. Si está por debajo de la temperatura mínima de referencia, supongamos 80ºC, bajaremos el motor acercando así el fluido al calentador y en consecuencia aumentando su temperatura. 3. En caso contrario, puesto que no está ni dentro del rango ni por debajo de este, se encuentra a una temperatura por encima de la máxima de referencia. Supongamos 100ºC, subiremos el motor alejando así el fluido del calentador y en consecuencia disminuyendo su temperatura. E a5 Programación del MicrocontroladorAA 41 Figura 5.1 Diagrama de bloques de funcionamiento principal a7 AnexosAA 48 7 ANEXOS Lista de componentes extensa de la placa electrónica PCB "Component Count:","53" "Ref","Value","Footprint" "J1","Conn_01x02_Male","Connector_PinHeader_2.54mm:PinHeader_1x02_P2.54mm_Vertical" "J2","Conn_01x02_Male","Connector_PinHeader_2.54mm:PinHeader_1x02_P2.54mm_Vertical" "J3","Barrel_Jack_Switch","Connector_BarrelJack:BarrelJack_CUI_PJ-102AH_Horizontal" "J4","Conn_01x02_Male","Connector_PinHeader_2.54mm:PinHeader_1x02_P2.54mm_Vertical" "J5","Conn_01x02_Male","Connector_PinHeader_2.54mm:PinHeader_1x02_P2.54mm_Vertical" "J8","Conn_01x02_Male","Connector_PinHeader_2.54mm:PinHeader_1x02_P2.54mm_Vertical" "J9","Conn_01x02_Male","Connector_PinHeader_2.54mm:PinHeader_1x02_P2.54mm_Vertical" "J12","Conn_01x01_Male","Connector_PinHeader_2.54mm:PinHeader_1x01_P2.54mm_Vertical" "J19","Conn_01x02_Male","Connector_PinHeader_2.54mm:PinHeader_1x02_P2.54mm_Vertical" "P1","Digital","Socket_Arduino_Mega:Socket_Strip_Arduino_2x18" "P2","Power","Socket_Arduino_Mega:Socket_Strip_Arduino_1x08" "P3","Analog","Socket_Arduino_Mega:Socket_Strip_Arduino_1x08" "P4","Analog","Socket_Arduino_Mega:Socket_Strip_Arduino_1x08" "P5","PWM","Socket_Arduino_Mega:Socket_Strip_Arduino_1x10" "P6","PWM","Socket_Arduino_Mega:Socket_Strip_Arduino_1x08" "P7","Communication","Socket_Arduino_Mega:Socket_Strip_Arduino_1x08" "P8","CONN_01X01","Socket_Arduino_Mega:Arduino_1pin" "P9","CONN_01X01","Socket_Arduino_Mega:Arduino_1pin" "P10","CONN_01X01","Socket_Arduino_Mega:Arduino_1pin" "P11","CONN_01X01","Socket_Arduino_Mega:Arduino_1pin" "P12","CONN_01X01","Socket_Arduino_Mega:Arduino_1pin" "P13","CONN_01X01","Socket_Arduino_Mega:Arduino_1pin" "Q1","2N2219","Package_TO_SOT_THT:TO-18-3" "Q2","2N2219","Package_TO_SOT_THT:TO-18-3" "R1","0.1k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R2","1k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R3","0.022k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R4","0.56k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R5","0.47k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R6","0.1k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R7","0.1k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R8","0.47k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R9","6.8k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R10","1.2k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R11","4.7k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R12","0.22k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R13","6.8k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R14","0.1k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R15","4.7k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R16","1.2k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R17","0.22k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R18","0.1k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R19","R","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R20","R","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R21","R","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R22","R","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R23","1k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" a7 AnexosAA 49 "R24","10k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R25","1k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "R26","10k","Resistor_THT:R_Axial_DIN0207_L6.3mm_D2.5mm_P10.16mm_Horizontal" "U1","LM358","Package_DIP:DIP-8_W7.62mm" "U2","LM358","Package_DIP:DIP-8_W7.62mm" "U3","L293D","Package_DIP:DIP-16_W7.62mm" Código del programa del microcontrolador a7 AnexosAA 50 aBibliografíaAA 51 BIBLIOGRAFÍA [1] Barcelona, U.-. 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