Dispositivo electrónico para la preparación de gel de agarosa y realización de electroforesis
Abstract
Como todos conocemos, la reciente pandemia provocada por el SARS-CoV-2 ha dado lugar a que la población en su mayoría conozca o haya escuchado alguna vez a lo largo de la pandemia el término PCR (reacción en cadena de polimerasa), hasta entonces desconocido para la gran mayoría. Esta situación ha mostrado a la sociedad española la importancia de la investigación y como el campo de la medicina junto con la biología está íntimamente relacionado con la electrónica, concretamente con el desarrollo de tecnologías para el diagnóstico de enfermedades víricas a nivel mundial. Este proyecto abarca todo lo relacionado con la detección de PCR, desde los conceptos más básicos como en que consiste la propia PCR hasta el método de detección, en el cual se va a centrar todo el proyecto, la electroforesis. Posteriormente, se diseña y se fabrica un dispositivo capaz de realizar la detección del resultado de la PCR unificando todos los procesos en un solo dispositivo. La finalidad de este proyecto es la fabricación de un dispositivo compacto y modular con facilidad para su montaje y que permita ser transportado de forma sencilla.
Full text
Equation Chapter 1 Section 1 Trabajo Fin de Grado Grado en Ingeniería de las Tecnologías de Telecomunicación Dispositivo electrónico para la preparación de gel de agarosa y realización de electroforesis Autor: Juan Antonio Ocaña Guerrero. Tutor: Francisco Antonio Perdigones Sánchez. Dpto. Ingeniería Electrónica y Microsistemas Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2022
iii Trabajo de Fin de Grado Grado en Ingeniería de las Tecnologías de Telecomunicación Dispositivo electrónico para la preparación de gel de agarosa y realización de electroforesis. Autor: Juan Antonio Ocaña Guerrero Tutor: Francico Antonio Perdigones Sánchez Profesor titular Dpto. Ingeniería Electrónica y Microsistemas Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2022
v Trabajo Fin de Grado: Dispositivo electrónico para la preparación de gel de agarosa y realización de electroforesis. Autor: Juan Antonio Ocaña Guerrero. Tutor: Francisco Antonio Perdigones Sánchez. El tribunal nombrado para juzgar el Proyecto arriba indicado, compuesto por los siguientes miembros: Presidente: Vocales: Secretario: Acuerdan otorgarle la calificación de: Sevilla, 2022 El Secretario del Tribunal
vii Agradecimientos Llegados a este punto, voy a dar por concluida una de las etapas más duras de mi vida, a la vez que una de las más felices y gratificantes vividas hasta el día de hoy. Principalmente porque me doy cuenta que todo esfuerzo y dedicación acaba teniendo su recompensa tarde o temprano y la mía gracias a Dios me va a permitir alcanzar uno de mis sueños de pequeño y una de mis metas de presente, como es ser Ingeniero. En este punto, me acuerdo de todas aquellas personas que en algún momento me han acompañado a lo largo del camino, algunas siguen presentes a día de hoy y otra por cosas de la vida a día de hoy ya no están, pero me han ayudado a seguir adelante en los momentos más duros de la carrera y me han acompañado en los momentos más felices de la misma. Me considero una persona muy agradecida con todo lo que me ocurre en la vida y aquí no iba a ser menos con todos aquellas personas que en algún momento me han apoyado. Con todo esto, GRACIAS a todos por confiar en mí y ser pilares sobre los que se ha conseguido sustentar uno de mis sueños. Me gustaría agradecer de manera más personal a algunas de esas personas que han hecho posible todo esto: A Francisco, mi tutor del TFG. Gracias por haber hecho posible este proyecto, ha sido un proyecto bastante entretenido, en el cual he podido poner en práctica todos aquellos conocimientos que he ido adquiriendo a lo largo de la carrera. No han sido pocas las horas dedicadas en el laboratorio a desarrollar el dispositivo y los problemas que han ido surgiendo a lo largo del mismo, pero gracias a su ayuda y dedicación hemos podido sacar adelante el proyecto y cumplir con los objetivos que nos marcamos al comienzo. A mis padres, sin su sacrificio y su apoyo a lo largo de este duro camino nada de esto habría sido posible. Ellos han sido siempre los primeros que han estado ahí en los momentos más duros, en los que pierdes la confianza en ti mismo y no te vez capaz de lograrlo, los que conseguían que me volviese a levantar y no me diese por vencido nunca. Gracias mamá por estar ahí cuando te necesitaba, apoyándome y confiando siempre en que alcanzaría mi sueño. Gracias papá por escucharme siempre fuese la hora que fuese y creer en mi sin ninguna duda, sin tu apoyo no lo hubiera conseguido. Soy un afortunado de tener los padres que tengo y de ser vuestro hijo, os quiero mucho. A mi hermano, por estar ahí en los momentos complicados, escuchándome, apoyándome y alegrándote de mis éxitos. Se que te sientes orgulloso de poder ver a tu hermano conseguir aquello que tanto le ha costado. Gracias de corazón, te quiero mucho. A toda mi familia en general, por los consejos que me habéis dado a lo largo de estos años. Sé que os sentís orgullosos de ver que uno de mis objetivos en la vida se ha cumplido. A mis amigos, por estar siempre. Fernando Jesús (Ferchu) desde pequeños nos conocemos y los dos a día de hoy podemos decir que somos Ingenieros de Telecomunicaciones, más que un amigo eres un hermano para mí. Gracias por tu ayuda, tus consejos y tu compañía a lo largo de la carrera, sin ti todo hubiese sido mucho más duro. Jose Ramón (Serra) llegaste sin esperarlo a lo largo de la carrera y a día de hoy eres un hermano más para mí, me aportaste el punto de diversión a mi vida y gracias a tu compañía y amistad el camino ha sido mucho más ameno y divertido. Gracias por estar siempre que se te necesita, eres un pilar importante para mí. Y por último agradecer a Fernando, otro amigo que me ha dado la carrera, su ayuda, compañía y amistad a lo largo de la carrera, en la cual ayudándonos mutuamente en la especialidad hemos conseguido hacer lo complicado mucho más ameno. Juan Antonio Ocaña Guerrero Sevilla, 2022
ix Resumen Como todos concocemos, la reciente pandemia provocada por el SARS-CoV-2 ha dado lugar a que la población en su mayoría conozca o haya escuchado alguna vez a lo largo de la pandemia el término PCR (reacción en cadena de polimerasa), hasta entonces desconocido para la gran mayoría. Esta situación ha mostrado a la sociedad española la importancia de la investigación y como el campo de la medicina junto con la biología está íntimamente relacionado con la electrónica, concretamente con el desarrollo de tecnologías para el diagnóstico de enfermedades víricas a nivel mundial. Este proyecto abarca todo lo relacionado con la detección de PCR, desde los conceptos más básicos como en que consiste la propia PCR hasta el método de detección, en el cual se va a centrar todo el proyecto, la electroforesis. Posteriormente, se diseña y se fabrica un dispositivo capaz de realizar la detección del resultado de la PCR unificando todos los procesos en un solo dispositivo. La finalidad de este proyecto es la fabricación de un dispositivo compacto y modular con facilidad para su montaje y que permita ser transportado de forma sencilla.
xvii ÍNDICE DE ANEXOS Anexo A: Pruebas realizadas para los distintos sensores de conductividad: 69 Anexo B: Microcalentador previo al definitivo: 81 Anexo C: Programación de Arduino UNO: 83 Anexo D: Proceso fotolitográfico para la fabricación de las placas electrónicas del proyecto: 87 Anexo E: Pruebas realizadas con ADN: 90
xix ÍNDICE DE FIGURAS Ilustración 1: Proceso de replicación del ADN. 2 Ilustración 2: Componentes de la reacción de PCR. 3 Ilustración 3: Elementos empleados en el proceso de la electroforesis. 6 Ilustración 4: Cámaras de electroforesis. 7 Ilustración 5: Preparación de un gel de agarosa. 8 Ilustración 6: Transiluminador ultravioleta (UV) 10 Ilustración 7: Fuente de tensión. 10 Ilustración 8: Buffer de corrimiento y buffer de carga. 11 Ilustración 9: Movilidad de fragmentos de ADN. 11 Ilustración 10: LAB-ON-PCB en el que se muestra el resultado del amasado y curado después de retirar la estructura. 17 Ilustración 11: Sistema típico para realizar la electroforesis. 18 Ilustración 12: Invitrogen E-Gel Power Snap. 18 Ilustración 13: MyGel Instaview. 19 Ilustración 14: MyGel Mini. 20 Ilustración 15: MBE-150. 21 Ilustración 16: Mupid One. 21 Ilustración 17: Rotiphorese Proffesional RunView. 22 Ilustración 18: Diseño máscara sensor de condutividad Klayout. 15 Ilustración 19: Máscaras de los diversos sensores de conductividad. 16 Ilustración 20: Placa de los sensores de conductividad. 17 Ilustración 21: Montaje definitivo en PCB, para el sensor de conductividad. 18 Ilustración 22: Montaje real, basado en el esquemático, llevado a cabo para realizar las pruebas. 19 Ilustración 23: Montaje sensor 1cmX1cm. 20 Ilustración 24: Resultado sensor 1cmX1cm 20 Ilustración 25: Montaje sensor 5mmX5mm 21 Ilustración 26: Resultado sensor 5mmX5mm 21 Ilustración 27: Montaje sensor 4mmX4mm 22 Ilustración 28: Resultado sensor 4mmX4mm 22 Ilustración 29: Montaje sensor 2mmX2mm 23 Ilustración 30: Resultado sensor 2mmX2mm 23 Ilustración 31: Sensor de conductividad fabricado en PCB. 24 Ilustración 32: Resultado sensor 2mmX2mm. 25 Ilustración 33: Curva característica NTC. 26
Ilustración 34: NTC en la misma placa que el microcalentador. 27 Ilustración 35: Microcalentador fabricado. 28 Ilustración 36: Máscara microcalentador. 28 Ilustración 37: Esquema eléctrico control de temperatura. 30 Ilustración 38: Temperatura de la mezcla intentando alcanzar la temperatura de referencia establecida en 100º. 34 Ilustración 39: Temperatura de la mezcla controlada en 100º por el controlador PID. 34 Ilustración 40: Temperatura de la mezcla inferior a los 100º, porque ha terminado el periodo de calentado y la muestra se comienza a enfriar. 35 Ilustración 41: Esquema eléctrico LEDS. 37 Ilustración 42: Arduino UNO empleado en el proyecto. 38 Ilustración 43: Gel de agarosa fabricado para prueba. 38 Ilustración 44: Molde metacrilato (Vista lateral). 39 Ilustración 45: Molde metacrilato (Vista frontal). 39 Ilustración 46: Molde metacrilato (Vista superior). 39 Ilustración 47: Molde metacrilato peine (Vista frontal). 40 Ilustración 48: Molde metacrilato peine (Vista lateral). 40 Ilustración 49: Molde metacrilato peine (Vista superior). 40 Ilustración 50: Diseño máscara 2mmX2mm Klayout. 40 Ilustración 51: Máscara para fabricar sensor de conductividad más marco metacrilato. 41 Ilustración 52: Diseño del sensor de conductividad en KICAD más marco metacrilato. 41 Ilustración 53: Resultado sensor de conductividad en PCB. 41 Ilustración 54: Diseño microcalentador en KICAD más NTC. 42 Ilustración 55: Máscara fabricada del microcalentador más NTC. 42 Ilustración 56: Máscara para fabricar microcalentador más NTC. 42 Ilustración 57: Microcalentador fabricado más NTC (Primer plano). 43 Ilustración 58: Sensor de conductividad con marco de metacrilato sobre microcalentador. Molde con peines sin colocar aún. 43 Ilustración 59: Sensor de conductividad con marco de metacrilato sobre microcalentador. Molde con peines colocado en la parte superior del otro marco. (Vista lateral). 44 Ilustración 60: Sensor de conductividad con marco de metacrilato sobre microcalentador. Molde con peines colocado en la parte superior del otro marco. (Vista superior). 44 Ilustración 61: Sensor de conductividad con molde pegado solo con pegamento. 45 Ilustración 62: Sensor de conductividad con molde pegado con pegamento y silicona. 45 Ilustración 63: Sensor de conductividad con el que vamos a trabajar. 46 Ilustración 64: Placa del sensor de conductivida cortada. 46 Ilustración 65: Nuevo molde más molde para peines. 47 Ilustración 66: Nuevo molde fabricado. 47 Ilustración 67: Unión de los moldes en una misma estructura. 47 Ilustración 68: Montaje alternativo completo. (Vista lateral). 47 Ilustración 69: Montaje alternativo completo. (Vista superior). 48
xxi Ilustración 70: Esquema eléctrico selección de agarosa/electroforesis. 49 Ilustración 71: Resultado circuito final para la selección de agarosa/electroforesis. 51 Ilustración 72: Dispositivo preparado para comenzar a funcionar. 52 Ilustración 73: Interruptor hacia la derecha. 53 Ilustración 74: Todos los LEDS se apagan porque comienza a funcionar el microcalentador. 53 Ilustración 75: Vertimos TAE sobre el molde. Sensor de concuctividad, detecta la presencia de líquido. 53 Ilustración 76: LED rojo encendido, se ha alcanzado una temperatura de calentado muy elevada. 54 Ilustración 77: Burbujas en la mezcla cuando se alcanzan temperaturas cercanas a la de referencia. 54 Ilustración 78: LED amarillo encendido, el microcalentador se ha apagado, pero la mezcla sigue estando muy caliente. 55 Ilustración 79: LED verde encendido, la temperatura de la mezcla ha alcanzado los 35ºC. 55 Ilustración 80: Pocillos creados en el proceso de fabricación del gel de agarosa. 56 Ilustración 81: Electrodos introducidos en el gel de agarosa. 56 Ilustración 82: TAE sobre gel de agarosa para llevar a cabo la electroforesis. 57 Ilustración 83: Tinta recien vertida en los pocillos. 57 Ilustración 84: Interruptor hacia la izquierda. 58 Ilustración 85: Después de 2 minutos del proceso de electroforesis. 58 Ilustración 86: Después de 4 minutos del proceso de electroforesis. 59 Ilustración 87: Después de 6 minutos del proceso de electroforesis. 59 Ilustración 88: Después de 8 minutos del proceso de electroforesis. 60 Ilustración 89: Después de 10 minutos del proceso de electroforesis. 60 Ilustración 90: Después de 12 minutos del proceso de electroforesis. 61 Ilustración 91: Imagen del proceso de migración de ADN después de aplicarle luz ultravioleta. 62
1 1 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS DEL TFG l presente documento con título “Dispositivo electrónico para la preparación de gel de agarosa y realización de electroforesis.” se encuentra dentro de la normativa referente al Trabajo Fin de Grado de la Escuela Técnica Superior de Ingeniería de Sevilla para la obtención de los créditos ECTS de la asignatura Trabajo Fin de Grado, y así conseguir el titulo de Ingeniero de las Tecnologías de Telecomunición. Dicho trabajo de fin de Grado se ha llevado a cabo en el Departamento de Ingeniería Electrónica y Microsistemas, tutelado por el profesor D. Francisco Antonio Perdigones Sánchez. El desarrollo de nuestro trabajo se ha centrado en el proceso de la detección del resultado de la PCR (reacción en cadena de polimerasa) que actualmente tiene un gran peso en nuestra sociedad debido a la gran pandemia que está afrontando el mundo. Investigaremos como podremos integrar todos los componentes necesarios para realizar la detección de ADN resultado de una PCR en un solo dispositivos lo más compacto posible. En definitiva, con este trabajo, lo que se busca es facilitar el proceso para preparar la agarosa y realizar la electroforesis con un dispositivo compacto como se detallará en este documento. 1.1 Introducción El Desarrollo de este trabajo se encuentra dentro del grupo de investigación (Grupo de Dispositivos y Sistemas Electrónicos) TIC:267 perteneciente al Departamento de Ingeniería Electrónica y que trata varias lineas de investigación como: • Diseño de Dispositivos y Sistemas Electrónicos para su Aplicación en Telemedicina • Microsistemas Sensoriales, Microfluidicos, Rf-MEMS y Microópticos. En particular nuestro Trabajo fin de Grado se encuentra dentro de la línea de investigación de “diseño de sistemas electrónicos para su aplicación en la biomedicina” particularizando este proyecto en la detección de los resultados de la PCR. Como introducción para este proyecto es importante destacar las numerosas aplicaciones que tiene la PCR que van desde la arqueología, la medicina forense hasta la medicina clínica. Para este trabajo se va a utilizar la PCR con fines médicos clínicos, pero no se va a centrar en el proceso de realización de la PCR sino en la detección y es en estos momentos donde entra en acción la electroforesis. Las circunstancias actuales producidas por la pandemia han provocado que la sociedad al completo o al menos en su gran mayoría hayan escuchado el término PCR y todo lo que eso conlleva. E
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS DEL TFG 2 Este proyecto comprende todo lo relacionado con la detección de los resultados de la PCR, desde los conceptos más básicos, para una correcta comprensión, hasta el diseño y la fabricación de un dispositivo compacto donde se integran todos los procesos necesarios para la realización de la detección. 1.2 Conceptos fundamentales Para poder tener una visión mucho más completa del proyecto y facilitar así la comprensión del objetivo final se van a definir detalladamente los conceptos más importantes y esenciales como es el propio concepto de la PCR y el método de detección que se va a utilizar para observar los resultados. 1.2.1 PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la técnica más importante y revolucionaria en biología molecular, ya que permite obtener millones de copias de un fragmento de ácido desoxirribonucleico (ADN) a partir de una sola molécula. La PCR se basa en la replicación celular en la que actuan varias proteinas para sintetizar dos nuevas hebras de ADN a partir de otra que funciona como molde. Estas proteinas actuan en diferentes actividades como: • La identificación del sitio de origen de la replicación. • El desenrollamiento de la doble hélice. • La estabilización de la estructura desenrollada. En la ilustración 1, podemos apreciar el proceso de replicación del ADN donde la enzima más importante en la replicación es la polimerasa, comunmente conocida como ADN polimerasa, porque es la encargada de incorporar nucleótidos durante la sintesis de las nuevas cadenas de ADN. Ilustración 1: Proceso de replicación del ADN.
3 3 Dispositivo electrónico para la preparación de gel de agarosa y realización de electroforesis. En la PCR, se simula en un tubo lo que ocurre durante la replicación celular. La síntesis de nuevas cadenas de ADN se lleva a cabo mezclando: 1. El ADN que contiene el fragmento ó los fragmentos que se van a amplificar. 2. La polimerasa. 3. Los iniciadores (fragmento de ADN de 15-30 nucleótidos que flanquean la región a amplificar). 4. Desoxinucleótidos. 5. Cloruro de magnesio u otro co-factor necesario para que trabaje la polimerasa. Esta mezcla se somete a la repetición de varios ciclos a diferentes temperaturas que sustituye a la mayoría de las proteínas que actúan en la replicación celular. La realización de la PCR contiene los siguientes pasos: 1. Inicio de desnaturalización. 2. Ciclos de amplificación. a. Temperatura de desnaturalización. b. Temperatura de alineamiento. c. Temperatura de extensión. 3. Amplificación final. 4. Almacenamiento temporal. Ilustración 2: Componentes de la reacción de PCR.
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS DEL TFG 10 1.2.2.1.6 Fuente de tensio n Nos encontramos ante uno de los componentes más importante en el proceso de la electroforesis. Gracias a la fuente de tensión conseguimos que las moléculas del ADN se desplacen del cátodo al ánodo. Esta fuente de tensión debe ser capaz de dar una tensión de salida constante cuyo rango de valor recomendado oscila entre los 75V y 100V. Este rango de tensión está determinado para el caso concreto que nos vamos a encontrar en el proyecto, el cual es la detección de PCR utilizando gel de agarosa, ya que el voltaje aplicado viene determinado por el peso molecular de las moléculas de ADN que se van a separar; para el caso de productos de PCR el peso molecular se encuentra entre 100pb y 1.5kpb. Ilustración 6: Transiluminador ultravioleta (UV) Ilustración 7: Fuente de tensión.
11 11 Dispositivo electrónico para la preparación de gel de agarosa y realización de electroforesis. 1.2.2.1.7 Buffer de corrimiento y buffer de cárgá El buffer de corrimiento proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza el corrimiento. El buffer de carga tiene como objetivo brindar peso, densidad y color a la muestra, lo que facilita su deposito en el pocillo y evita su salida del gel. Se emplean en relación 1:3 para ácido nucléicos. 1.2.3 Proceso de la electroforesis El método más común para la electroforesis de ADN es elaborar un gel horizontal de agarosa, con una concentración de 0.5 a 2%. La carga eléctrica de la molécula de ADN la otorgan sus grupos fosfato, de carga negativa, y cuyo número es igual al doble del número de pares de bases. Dado que la forma de la molécula de ADN siempre es la misma, la movilidad de la electroforesis dependerá únicamente de la longitud del ADN (pb) y se representará en bandas (Ilustración 9). Ilustración 8: Buffer de corrimiento y buffer de carga. Ilustración 9: Movilidad de fragmentos de ADN.
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS DEL TFG 12 El corrimiento se realiza a voltajes de entre 25V y 100 V; a mayor voltaje mayor velocidad de corrimiento. El avance electroforético se monitorea a través de la visualización de los colorantes contenidos en el buffer de carga con el que se mezcló con la muestra previa a su colocación en el pocillo. Como se ha comentado con anterioridad, la agarosa es ideal para preparar geles analíticos de productos procedentes de técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El volumen de agarosa depende del tamaño de la cámara de electroforesis. Inmediatamente después de vaciar la agarosa a la cámara, debe insertarse el o los peines necesarios. La agarosa tarda en solidificar alrededor de 20 minutos. Una vez solidificado el gel, se añade el buffer de corrimiento (TAE o TBE), cubriendo perfectamente el gel y se retiran los peines. Las muestras se mezclan con el buffer de carga y se depositan cuidadosamente en los pocillos, evitando que se salgan y puedan entrar en otros pozos contaminando el pocillo contiguo. Una vez depositadas las muestras en los pocillos se procede a la transmisión de la corriente eléctrica. Se conectan los cables de la fuente de energía de cada polo eléctrico a la cámara de electroforesis en el electrodo que le corresponda y se aplica un voltaje de acuerdo con el peso molecular de las moléculas de ADN que se va a separar. Para el caso de productos de PCR se recomienda usar voltajes comprendidos entre 75 y 100 V. Durante el corrimiento se monitorea la migración de la muestra con colores que contiene el buffer de carga. La electroforesis se detiene cuando se considera que la muestra se localiza en la posición deseada, o bien cuando la muestra ha corrido por lo menos tres cuartas partes del gel. Hay múltiples factores que pueden afectar la migración del ADN, como la concentración del gel utilizado, el tamaño de la molécula de ADN muestra, el empaquetamiento del ADN, el voltaje, la temperatura del buffer de corrimiento (que puede aumentar demasiado si el voltaje es muy alto), la contaminación con agentes intercalantes en la muestra, la composición del buffer de corrimiento, etcétera. Una vez finalizada la etapa de aplicación del campo eléctrico, se debe colocar el gel sobre un transiluminador y encender la lampara de luz ultravioleta (𝜆 = 300𝑛𝑚). Al aplicar la luz ultravioleta el ADN se visualizará como banda de color anaranjado. [3] Para finalizar este apartado se incluye un esquema a modo de resumen con el único objetivo de facilitar la comprensión de las diferentes etapas que se realizan en la electroforesis:
13 13 Dispositivo electrónico para la preparación de gel de agarosa y realización de electroforesis. Obtención de muestras de ADN Preparar gel de agarosa Mezclar las muestras a analizar con un buffer de carga adecuado Carga de las muestras en el gel Corrida del gel al voltaje pertinente Visualización del gel con luz ultravioleta y análisis de resultados
15 2 ESTADO DEL ARTE n este capítulo vamos a tratar algunas de las investigaciones relacionadas con el proceso de la electroforesis en gel de agarosa, con el objetivo de tener una visión más amplia del desarrollo tecnológico que se está experimentado en todo lo relacionado con la unión de la biomedicina y la electrónica. Además, detallaremos cuales son los dispositivos comerciales que actualmente más se asemejan en funcionalidad al dispositivo que estamos desarrollando en nuestro proyecto. Y finalmente, se comentarán las características básicas de estos dispositivos y sus componentes con el objetivo de poder visualizar las diferentes opciones que existen en la actualidad. 2.1 Investigaciones relacionadas con el proceso de electroforesis en gel de agarosa Debido a la situación sanitaria que ha estado golpeando a la sociedad durante los últimos años, provocada por la pandemia COVID-19 se ha desarrollado de forma rápida y sorprendente el campo de la investigación, dando lugar a nuevas soluciones y mejoras de aquellas que ya existían. Para este apartado vamos a tratar un artículo científico, desarrollado por la Universidad de Sevilla concretamente en el Departamento de Ingeniería Electrónica titulado “Semi-Automatic Lab-on- PCB System for Agarose Gel Preparation and Electrophoresis for Biomedical Applications”. [4] Antes de entrar a detallar el artículo científico, es necesario explicar brevemente en que consiste un Lab-on-PCB para poder comprender por completo el documento. Los Lab-on-PCB han sido objeto de una creciente investigación en los últimos años. Estos dispositivos surgieron como una evolución prometedora de los dispositivos lab-on-chip y la tecnología PCB-MEMS. Comparten propiedades importantes con los dispositivos de laboratorio en chip, por ejemplo, un volumen de líquido pequeño y un tiempo de respuesta rápido. En particular, el núcleo de estos dispositivos es la integración de sensores para medir los resultados de una reacción y para controlar los parámetros de las muestras; y la integración de actuadores para acondicionar las muestras y para mover esas muestras a través de la plataforma microfluídica. La necesidad de micromezclado, microcalentamiento y detección en diferentes partes de las plataformas de microfluidos hace que el control de líquidos sea obligatorio. Por esta razón, la conducción de flujo y la manipulación de fluidos en una red de microcanales es uno de los temas más importantes para los dispositivos y plataformas de laboratorio en chip (LoC), y particularmente para laboratorio en PCB. E
Aunque lab-on-chip y lab-on-PCB tienen características en común, y lab-on-PCB puede considerarse como una especie de lab-on-chip, son plataformas diferentes. Por ejemplo, a diferencia de los laboratorios en chips, los laboratorios en PCB son interesantes debido a la fácil integración de la microfluídica y la electrónica en la misma plataforma, hacia sistemas autónomos para aplicaciones microfluídicas. Además de la integración, el interés en los dispositivos lab-on- PCB radica en la disponibilidad comercial del sustrato de PCB con dimensiones muy razonables a bajo costo. Gracias a esta característica, los dispositivos lab-on-PCB pueden ser desechables a bajo costo. Como se ha dicho anteriormente, los dispositivos lab-on-PCB son una opción muy interesante por su bajo coste. Esta es una diferencia importante con respecto a los dispositivos lab-on-chip, y hace que los dispositivos lab-on-PCB sean una opción atractiva desde el punto de vista del mercado. Las principales características que diferencian los lab-on-chip de los lab-on-PCB se resumen en: [5] Una vez detallado en que consiste un lab-on-PCB y sus diferencias pertinentes con los lab-on-chip, vamos a continuar con la explicación del artículo mencionado previamente, para que se pueda llegar a Tabla 2: Diferencias entre LAB-ON-PCB y LAB-ON-CHIP.
17 comprender de una manera más eficiente las investigaciones que se llevan hoy en día a cabo en materia de electroforesis en gel de agarosa. En el artículo se desarrolla un prototipo de laboratorio semiautomático en PCB para la preparación de gel de agarosa y electroforesis. El prototipo incluye un sensor de conductividad para detectar el tampón TAE, un microcalentador para aumentar la solubilidad de la agarosa, un termistor de coeficiente de temperatura negativo (NTC) para controlar la temperatura, un sensor de resistencia dependiente de la luz (LDR) para medir la transparencia de la mezcla y dos electrodos para realizar la electroforesis. Las funciones de preparación de agarosa están gobernadas por un microcontrolador. Este dispositivo está diseñado para integrarse como parte de un sistema de laboratorio en PCB más grande para la amplificación y detección de ADN. Sin embargo, puede usarse para migrar ADN amplificado en termocicladores convencionales. Además, el dispositivo se puede modificar para preparar geles de agarosa más grandes y realizar electroforesis. Hemos elegido este artículo científico porque al igual que en nuestro proyecto, en él se realiza la electroforesis en gel de agarosa. Básicamente, el artículo que estamos detallando es la base sobre la que se va a sustentar nuestro proyecto, ya que el objetivo es mejorar los resultados conseguidos en dicha investigación. El objetivo fundamental de este apartado es mostrar el proyecto inicial sobre el que se basa nuestro proyecto y demostrar que la ciencia avanza a pasos agigantados y de una forma muy rápida, gracias a la cual se pueden desarrollar proyectos que mejoren de manera eficiente a los primeros prototipos que fueron creados. Gran parte del desarrollo tecnológico basado en este campo vino propiciado por la pandemia que ha azotado al mundo durante este tiempo. Ilustración 10: LAB-ON-PCB en el que se muestra el resultado del amasado y curado después de retirar la estructura.
2.2 Dispositivos comerciales A continuación, vamos a hablar de los distintos dispositivos comerciales que tienen una funcionalidad parecida al proyecto que nosotros estamos desarrollando. Actualmente, en los laboratorios se suelen utilizar sistemas formados por una fuente de alimentación, junto con una cámara de electroforesis y un sistema de iluminación (para observar los resultados), todos ellos independientes entre sí y que no están integrados en un mismo dispositivo. En la ilustración anterior, podemos observar un sistema típico en el que se suele realizar la electroforesis y que suele estar presente en la mayoría de laboratorios de las universidades. En la actualidad, debido al gran auge tecnológico que estamos viviendo en la sociedad, ya que estamos en constante desarrollo de productos y dispositivos electrónicos, se están llevando a cabo la creación de nuevos instrumentos que integran todos los procesos necesarios para obtener los resultados de la detección de la PCR. El objetivo es tener en un solo dispositivo todo lo necesario para ello, permitiendo así una manejabilidad más simple. A continuación, se van a mostrar una serie de dispositivos comerciales que realizan funciones similares a la que vamos a desarrollar en nuestro proyecto. 1. Invitrogen E-Gel Power Snap Electrophoresys System Ilustración 11: Sistema típico para realizar la electroforesis. Ilustración 12: Invitrogen E-Gel Power Snap.
19 El dispositivo “Invitrogen E-Gel Power Snap Electrophoresys System” es un sistema todo en uno diseñado para realizar electroforesis en gel de agarosa E-Gel™ rápidas y cómodas, desde la carga de muestras de ADN hasta la captura de imagen del gel. La agarosa debe ser previamente fabricada, ya que el propio sistema no es capaz de realizarla. El sistema de electroforesis integral “Invitrogen E-Gel Power Snap” está diseñado para realizar electroforesis en gel de agarosa E-Gel rápidas y cómodas, desde la carga de muestras de ADN hasta las imágenes de gel. Gracias a la tecnología de gel de agarosa prefabricado en seco E- Gel, podrá procesar muestras de ADN en tan solo 10 minutos y observar la separación de muestras en tiempo real. Es el único sistema de sobremesa que integra a la perfección la separación de muestras de ADN y la adquisición de imágenes de gel en un mismo flujo de trabajo. [6] El precio de este dispositivo electrónico es de 2700 €. 2. MyGel Instaview El sistema “myGel InstaView” viene completo con todo lo necesario para moldear, ejecutar y visualizar mini geles de electroforesis, incluyendo una fuente de alimentación integrada. El dispositivo se encarga de realizar la agarosa, por tanto, no es necesario tenerla fabricada previamente, a su vez, el depósito de gel tiene capacidad para un gel grande o pequeño. Los geles se vierten fácilmente utilizando las bandejas, los peines y el soporte de vaciado a prueba de fugas suministrados. La fuente de alimentación se conecta directamente al depósito de gel, sin necesidad de cables. Se garantiza que la conexión es correcta, siempre. La tensión de salida puede ajustarse a 35V, 50V o 100V y el tiempo de funcionamiento puede ajustarse hasta 99 minutos. Un enclavamiento magnético entre el depósito de gel y la tapa impide que la corriente circule por el sistema cuando la tapa no está bien colocada. Una vez que el sistema “myGel InstaView” está configurado, basta con deslizar el mini transiluminador LED en su lugar bajo el tanque y en cualquier momento encenderlo para ver la ejecución en tiempo real. Un conjunto de LEDs azules emite luz azul brillante a una longitud de onda de 465 nm para una excitación óptima de las tinciones fluorescentes verdes más comunes, como SmartGlow™, SYBYR™ Green y Gel Green, sin dañar el ADN. [7] El precio de este dispositivo electrónico es de 950 €. Ilustración 13: MyGel Instaview.
12 3.2 Esquema general del proyecto Para facilitar la comprensión del objetivo principal de nuestro proyecto, se va a mostrar a continuación, un diagrama de bloques en el que se refleja cada una de las partes que componen el sistema, indicándose cuales son los elementos que intervienen en cada bloque y su funcionalidad. 3.2.1 Detección de Líquido (TAE) La funcionalidad principal de dicho bloque es la de detectar la presencia de líquido en el molde que tenemos preparado para ello. Para ello contaremos con la presencia de ciertos elementos fundamentales entre los cuales destacaremos: AGAROSA CONTROL DE TEMPERATURA ELECTROFORESIS Controlamos la temperatura de la mezcla de agarosa-TAE, hasta que llega a su temperatura óptima. A medida que la mezcla de agarosa-TAE se calienta y llega a su temperatura adecuada, pasamos a controlar la temperatura para ver como se va enfriando la mezcla. Una vez la mezcla se ha vuelto sólida y transparente, pasamos a realizar la electroforesis. DETECCIÓN DE LÍQUIDO (TAE) Tenemos un sensor de conductividad que es el encargado de comprobar cuando se ha vertido el líquido sobre el molde preparado para ello. En el momento en el que dicho sensor detecta la presencia de líquido, manda una señal al Arduino y éste activa el microcalentador para calentar el líquido vertido, pasando, por tanto, a la fase de agarosa.
13 • Molde para gel y molde para peine: En el primer molde se vertirá la mezcla de la agarosa con el TAE y el segundo es básicamente para formar los pocillos donde posteriormente trataremos las muestras de ADN. • Sensor de conductividad: Dicho elemento sirve para detectar cuando la muestra se ha vertido sobre el molde para gel. En ese momento, envía una señal al Arduino y éste comienza el proceso de calentado de la muestra. 3.2.2 Agarosa El bloque de agarosa está formado por un elemento esencial para su fabricación, el cual es el siguiente: • Microcalentador: Dicho elemento sirve para calentar la mezcla de agarosa con el TAE, hasta conseguir que la mezcla se vea totalmente transparente, en ese momento se dejará de calentar y se dejará enfriar hasta conseguir que la mezcla se solidifique. 3.2.3 Control de Temperatura El objetivo de dicho bloque es ir controlando la temperatura como su propio nombre indica para que la fabricación de la agarosa se haga de manera eficiente. Dicho bloque está formado principalmente por el sensor de temperatura NTC y el Arduino con su correspondiente programación, para conseguir la funcionalidad que vamos buscando. 3.2.4 Electroforesis El bloque de electroforesis está formado por varios elementos, entre los cuales cabe destacar: • Cámara de electroforesis: Es un dispositivo que permite la generación de un campo eléctrico alrededor de la mezcla (agarosa con TAE), donde se depositan las muestras. 3.2.5 Funcionamiento del Proyecto a desarrollar Como podemos observar en el diagrama de bloques del apartado anterior, nuestro Proyecto está formado por cuatro grandes bloques que son: Detección de líquido (TAE), Agarosa, Control de temperatura y Electroforesis. Estos cuatro grandes bloques estarán conectados formando un solo bloque compacto. La funcionalidad del sistema que estamos desarrollando va a ser la siguiente: • En color rojo los procesos que se llevan a cabo de manera manual. • En color azul los procesos que se llevan a cabo de manera automática.
14 Una vez explicado el proceso de funcionamiento que se va a llevar a cabo en nuestro proyecto, pasamos al siguiente punto que son los desarrollos y las pruebas que hemos ido llevando a cabo hasta obtener todos los elementos necesarios para ponerlo en funcionamiento de manera eficiente. Mezcla agarosa + TAE Detección de la mezcla por el sensor de conductividad Activación del microcalentador Alcance de la temperatura de referencia Tiempo de espera para calentado Apagamos microcalentador Cargar muestras de ADN en los pocillos que se han fabricado Aplicamos corriente eléctrica para llevar a cabo la electroforesis Activación del sistema transiluminador para excitar el ADN Filtrar luz ultravioleta para ver el ADN exitado
15 4 SENSOR DE CONDUCTIVIDAD n este capítulo, una vez puesto en contexto de lo que trata este proyecto, pasamos a la parte de la electrónica. En él, vamos a tratar el tema del sensor de conductividad, uno de los componentes electrónicos que hemos tenido que diseñar y posteriormente fabricar y caracterizar para obtener una de las funciones de las que queremos dotar a nuestro dispositivo. 4.1 Fabricación del sensor de conductividad La idea principal es hacer el sensor lo más pequeño posible y que a su vez tenga la sensibilidad suficiente como para detectar cuando la cavidad está llena de líquido. Gracias al programa “Klayout” hemos creado las máscaras del sensor de conductividad que vamos a incluir en nuestro proyecto. [12] La estructura que va a tener el sensor es una estructura interdigitada y a su vez, tiene unos PADS asociados para poder soldarle un par de cables que nos servirán para realizar las pruebas posteriormente. [13] A continuación, vamos a mostrar una imagen de la estructura que va a presentar nuestro sensor de conductividad: Para el diseño de las máscaras hemos realizado 5 prototipos (cada prototipo tenía 5 modelos iguales por si en la fabricación alguno salía defectuoso), de mayor a menor tamaño para comprobar si a medida que hacíamos las pruebas tenían la sensibilidad suficiente como para poder optimizar el tamaño lo máximo posible. E Ilustración 18: Diseño máscara sensor de condutividad Klayout. Cada PADs tiene un tamaño de 5mmX 3mm. La anchura de cada una de las pistas es de 500µm. El tamaño del sensor de conductividad va a variar en función de los distintos tipos que vamos a diseñar previamente, para ver cual cumple mejor los requisitos que necesitamos. El ancho y la separación de cada una de las pistas del sensor de conductividad será de 150µm.
16 Las 5 máscaras realizadas, tienen los siguientes tamaños: - 1cmX1cm - 5mmX5mm - 4mmX4mm - 2mmX2mm - 1mmX1mm Una vez diseñadas según las especificaciones recomendadas, se fabricaron, junto con la cavidad que va a recubrir cada uno de los sensores para hacer las pruebas vertiendo el líquido. Una vez en el laboratorio, con mínimo un prototipo de cada tamaño de sensor realizado, soldamos un cable a cada uno de los PADS de los sensores creados, para realizar las pruebas pertinentes. Comenzamos realizando las pruebas de mayor a menor, ya que, si el mayor no tenía la sensibilidad suficiente como para detectar el líquido, no servirían los demás, al tener un tamaño mucho más pequeño. Ilustración 19: Máscaras de los diversos sensores de conductividad.
17 4.2 Procedimiento a seguir para la toma de muestras Lo primero que hacemos es comprobar que el circuito está abierto, cogemos para ello un multímetro, colocamos los cocodrilos tanto negativo como positivo a los cables que hemos soldado en los PADS del sensor correspondiente y comprobamos que el mensaje que sale por la pantalla del multímetro es OL (Open Loop) que viene a decir lo mismo que circuito abierto (lazo abierto traducción exacta), eso quiere decir que inicialmente el circuito se encuentra abierto y no está conduciendo, perfecto, justo lo que debía mostrarnos. Seguidamente, lo que hacemos es comprobar la conductividad (la corriente), para ello lo que hacemos es cambiar los cocodrilos que teníamos inicialmente en el multímetro y poner unas puntas de prueba con negativo y positivo (al igual que los cocodrilos). Colocaremos posteriormente una punta en un extremo de uno de los cables (que previamente ya dijimos que estaban soldados a los PADS del sensor correspondiente) y con la otra iremos tocando la fila del sensor correspondiente asociada a dicho PADS para ver si existe conductividad, si la hay, el multímetro empezará a pitar cada vez que toquemos en esa fila. En nuestro caso, lo hace correctamente para todos los sensores, señal de que los sensores están bien diseñados y fabricados. Una vez probado en una fila, pasaremos a comprobar lo mismo en la otra fila del sensor, siguiendo el mismo procedimiento. En nuestro caso, lo hace correctamente también en la otra fila de cada uno de los sensores, señal de que los sensores están bien diseñados y fabricados. Pasamos seguidamente a la caracterización de la resistencia necesaria a emplear en el circuito que nosotros vamos a diseñar posteriormente, para ver si el sensor es capaz de detectar cuando tiene líquido en su superficie. Ilustración 20: Placa de los sensores de conductividad.
18 Para ello lo primero que haremos será colocar el multímetro de nuevo con los bananas cocodrilo que empleamos anteriormente, cada uno conectado a un cable de los que soldamos a cada uno de los PADS del sensor correspondiente y vertimos el TAE, que es el líquido que vamos a emplear en el proceso de pruebas, ya que dicho líquido tiene iones que permiten la conductividad. Esto lo que hace es que te proporciona un valor determinado de resistencia, que aparece medido con el multímetro, ese determinado valor de resistencia nos delimitará el valor que nosotros tenemos que poner de resistencia en el circuito posteriormente, generalmente el valor de resistencia que vamos a emplear es de 22kΩ, esto es así, debido a que este valor experimental es igual al medido para tener unos 2.5V a la salida de un futuro divisor de tensión. Excepto para el sensor de 1mmX1mm que necesitará un valor de resistencia de aproximadamente unos 6MΩ y que como veremos más adelante no vamos a poder emplear debido a que su sensibilidad es bastante deficiente y es incapaz de detectar cuando se vierte líquido sobre él. Tabla 3: Valores de resistencia para cada sensor. DIMENSIONES DEL SENSOR DE CONDUCTIVIDAD RESISTENCIA NECESARIA 1cmX1cm 22kΩ 5mmX5mm 22kΩ 4mmX4mm 22kΩ 2mmX2mm 22kΩ 1mmX1mm 6MΩ A modo de esquemático, se va a mostrar a continuación cual va a ser el montaje definitivo que se colocará en la placa PCB que vamos a diseñar. Ilustración 21: Montaje definitivo en PCB, para el sensor de conductividad. Aquí colocamos la tierra de la sonda, junto con la tierra del sensor de conductividad. Aquí colocamos la sonda del osciloscopio, para medir a la salida de la resistencia, en el mismo punto que la entrada al sensor de conductividad.
19 Una vez hallado el valor de resistencia que necesitamos, cogemos la resistencia de 22kΩ y la montamos en una placa de prueba, ponemos en serie con dicha resistencia uno de los cables del sensor de conductividad que vayamos a probar y el otro lo ponemos a tierra. Utilizaremos la sonda del osciloscopio para medir a la salida de la resistencia, justamente en el punto donde se encuentra la entrada del sensor de conductividad y la tierra de la sonda que va junto con la tierra del sensor de conductividad, tal y como se ha indicado en la ilustración previa (Ilustración 21). Una vez colocado todo el montaje requerido, pulsamos el botón de “Single Seq”, utilizamos los cursores para marcar el comienzo de la señal y que una vez se llegue al punto donde se cruzan el cursor vertical con el horizontal, se empezará a dibujar la señal que percibe la sonda. Pues bien, hemos ido tomando diversas pruebas sobre cada uno de los sensores fabricados para comprobar que su funcionamiento es óptimo y que no es fruto de una simple casualidad. Para todas las pruebas realizadas sobre los distintos sensores, el procedimiento a seguir ha sido el mismo: 1. Pulsamos el botón de “Single Seq”. 2. Esperamos que el osciloscopio nos muestre un mensaje que diga “Ready”, señal de que está preparado para recibir una señal determinada. 3. Vertimos con el uso de una jeringa el líquido TAE sobre el sensor de conductividad con el que estemos trabajando en ese momento. 4. Observamos la respuesta del osciloscopio a la salida. 5. Si el osciloscopio ha detectado cuando se ha vertido el líquido, mostrará una señal hacia abajo. Inicialmente se encontraba sin conducir y cuando se vertió el líquido, la señal se va hacia abajo como muestra de que ha percibido algo (en nuestro caso el líquido sobre el sensor que estemos comprobando). Salida de la resistencia conectada a la entrada del sensor de concudctividad. La tierra de la sonda va conectada a la tierra del sensor de conductividad. Ilustración 22: Montaje real, basado en el esquemático, llevado a cabo para realizar las pruebas.
20 4.3 Resultados de las pruebas para los distintos sensores de conductividad 4.3.1 Resultados sensor tamaño 1cmX1cm Montaje empleado para la comprobación del sensor de conductividad: Resultado obtenido para el sensor de conductividad: Ilustración 24: Resultado sensor 1cmX1cm Ilustración 23: Montaje sensor 1cmX1cm.
21 4.3.2 Resultados sensor tamaño 5mmX5mm Montaje empleado para la comprobación del sensor de conductividad: Resultado obtenido para el sensor de conductividad: Ilustración 25: Montaje sensor 5mmX5mm Ilustración 26: Resultado sensor 5mmX5mm
28 5.2 Empleo de un microcalentador Llegados a este punto, vamos a detallar inicialmente como se fabricó el microcalentador y su principal funcionalidad dentro del proyecto que estamos llevando a cabo. Cabe resaltar también la relación directa que existe entre el microcalentador y el sensor de conductividad del que hablamos en el capítulo anterior. 5.2.1 Fabricación del microcalentador La idea principal es hacer el calentador lo más pequeño posible y que a su vez presente la resistencia suficiente como para llegar a las temperaturas necesarias que va a requerir la mezcla para la fabricación eficiente del gel de agarosa. Gracias al programa “KICAD” hemos creado la máscara del microcalentador que vamos a emplear en nuestro proyecto. [15] La estructura que va a tener el microcalentador es una estructura a modo de serpentín y a su vez, tiene unos PADS asociados para poder soldarle un par de cables que nos servirán para conectarlo finalmente al circuito completo. A continuación, vamos a mostrar una serie de imágenes en las que se verá la máscara que se diseñó para la fabricación del microcalentador y la placa que se obtuvo como resultado. A continuación, después de visualizar las imágenes previas, vamos a detallar el tamaño del microcalentador en sí, a la vez que el tamaño de cada una de las pistas y los PADS que forman dicho elemento. Ilustración 36: Máscara microcalentador. Ilustración 35: Microcalentador fabricado.
29 El tamaño del microcalentador concreto es de 3.5cmX3.5cm, las pistas que forman dicho elemento tienen un grosor de 250µm y una separación entre pistas del mismo valor, es decir, de 250µm y el tamaño de los PADS es de 5mmX3mm. Vamos a resaltar también que el valor resistivo del mismo es de 19.5Ω y las corrientes que pasan por él tienen un valor máximo de 1.02A. Finalmente, hay que destacar la relación directa que existe entre el microcalentador y el sensor de conductividad como resaltamos al principio de este apartado. Básicamente, para comenzar a calentar la mezcla es necesario que el microcalentador esté activado, por tanto, como comentamos en el capítulo anterior del sensor de conductividad, cuando éste detecta la presencia de líquido en su superficie, envía una señal al Arduino, para que éste ponga en funcionamiento el microcalentador, siendo dicha señal el comienzo por así decirlo del control de temperatura, ya que hay que regular la temperatura máxima de calentado del microcalentador y su apagado cuando se haya alcanzado el tiempo máximo de calentado de la mezcla.
30 6 CONTROL DE TEMPERATURA n este capítulo, vamos a detallar como se ha realizado el control de temperatura, el cual tiene una gran importancia a la hora de conseguir la fabricación del gel de agarosa. Es importante detallar de manera precisa los tiempos de calentado y enfriado de la muestra para conseguir que ésta se realice de manera correcta. 6.1 Circuito eléctrico del control de temperatura E Ilustración 37: Esquema eléctrico control de temperatura. Conector donde va conectado el calentador. Conector donde va conectado el sensor de temperatura (NTC). Driver TC4427 Mosfet tipo N Pin para conectar con Arduino y que este vaya leyendo en todo momento los valores de temperatura. Pin mediante el cual Arduino activa/desactiva el microcalentador.
31 Observando dicho esquema, vamos a entrar en detalle de dos componentes sobre los que no hemos hablado previamente sobre su funcionalidad, como son el driver TC4427 y el transistor Mosfet tipo N. 6.1.1 Driver TC4427 El driver controlador de puerta que hemos empleado en el circuito es el TC4427, el cual tendrá dos funcionalidades principales. En primer lugar, una de sus funcionalidades será cargar y descargar rápidamente la capacidad de puerta del transistor mosfet y que éste tenga una rápida apertura y cierre. En segundo lugar, dicho driver nos servirá para proteger el microcontrolador, en nuestro caso el Arduino UNO, por si hubiera alguna corriente de descarga de la puerta hacia atrás. En otros casos, que no es el que presentamos en nuestro proyecto, se usa porque la tension necesaria de puerta es mayor que la que proporciona Arduino. En ese caso, se alimenta el driver a la tension necesaria (mayor que la de Arduino) y cuando el propio Arduino manda 5V, el driver manda su alimentación a la puerta del mosfet. En nuestro caso como hemos comentado anteriormente no va a ser necesario porque el driver está alimentado a 5V, que es la misma tension que porporciona Arduino y la tensión Vth del transistor mosfer está por debajo de dicho valor. 6.1.2 Transistor mosfet tipo N Como se puede apreciar en el esquemático del circuito, tenemos un transistor mosfet tipo N a la salida del driver controlador de puerta. Dicho mosfet, se utilizará como interruptor, de tal forma que el Arduino manda una señal PWM para que nuestro interruptor esté un determinado periodo abierto y otro cerrado. Con estos tiempos se consigure controlar la corriente, de forma que si el interruptor estuviera siempre cerrado, la corriente que dejaría pasar sería máxima. Todo esto regido por la siguiente formula: 𝐼 = 𝑉𝑓𝑢𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑅𝑐𝑎𝑙𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜𝑟 Y si estuviera siempre abierto, la corriente que dejaría pasar sería cero. Todos estos valores y el resto de valores intermedios lo ajusta el PID por sí mismo a la salida del pin 11 de Arduino, con el duty cycle de la señal PWM, de manera que si el duty cycle es del 50%, se tendrá la mitad de corriente máxima.
32 6.2 Esquema general del control de temperatura NTC como sensor de temperatura Encendido del microcalentador Temperatura máxima de calentado de la mezcla Empleo de un controlador PID Definición de los intervalos de funcionamiento del microcalentador Señalización de la temperatura alcanzada mediante LEDS Arduino como cerebro electrónico del proceso. Resultado de la muestra obtenida
33 6.3 Explicación detallada de cada una de las partes del control de temperatura En este apartado vamos a hablar detalladamente de cada una de las partes que intervienen en el control de temperatura y que han sido referenciadas en el esquema del apartado anterior. 6.3.1 NTC como sensor de temperatura Como hemos visto en el capítulo anterior, el empleo de una NTC se va a llevar a cabo para medir la temperatura a la que se encuentra la mezcla en todo momento y así conseguir con ese control tan exhaustivo de la misma un gel de agarosa óptimo para llevar a cabo la migración de ADN de manera eficiente. 6.3.2 Encendido del microcalentador Para llevar a cabo el control de temperatura de la mezcla, es necesario calentarla, para ello debemos encender el calentador y calentar la mezcla de agarosa más TAE, y como bien detallamos en capítulos previos, el Arduino será el que active dicho elemento una vez reciba la confirmación por parte del sensor de conductividad de que la mezcla está depositada en la cavidad. 6.3.3 Temperatura máxima de calentado de la mezcla En este apartado, vamos a detallar la temperatura máxima de calentado que necesita la mezcla para conseguir la trasparencia completa. Después de la realización de numerosas pruebas, se ha llegado a la conclusión de que la temperatura máxima de calentado de la mezcla debe rondar los 100ºC-102ºC, por el simple hecho de que cuando el microcalentador es capaz de llegar a dichas temperaturas, la mezcla comienza a burbujear de manera más rápida, permitiendo con ello que la trasparencia sea palpable a simple vista. También cabe resaltar que probamos con temperaturas máximas más bajas y el resultado no era el esperado, porque se requería mucho tiempo para que comenzaran a aparecer las primeras burbujas y eso provocaba una sobreexposición de calentado que como consecuencia tenía que la mezcla fuese perdiendo líquido y el resultado final del gel de agarosa no era el esperado por su baja cantidad.
34 6.3.4 Empleo de un controlador PID Este apartado, nos sirve como continuación del anterior, ya que hacemos uso de un controlador PID programado en Arduino, para que la temperatura de calentado del microcalentador no siga aumentado y se mantenga estabilizada en valores próximos a los 100ºC. Es importante también comentar, que el controlador programado realiza el control de manera muy eficiente, ya que se queda clavado en el valor deseado de 100ºC de manera muy rápida. A continuación, se muestran una serie de imágenes del control realizado en la que se puede apreciar el buen funcionamiento del controlador. Ilustración 38: Temperatura de la mezcla intentando alcanzar la temperatura de referencia establecida en 100º. Ilustración 39: Temperatura de la mezcla controlada en 100º por el controlador PID.
35 6.3.5 Definición de los intervalos de funcionamiento del microcalentador En este apartado, vamos a centrarnos en detallar cuando el microcalentador está activado y cuando cesa su funcionamiento, para permitir con ello que la mezcla se enfríe y pase a un estado sólido. En primer lugar, cuando el sensor de conductividad manda una señal a Arduino, éste inmediatamente comprende que se ha detectado líquido y activa el funcionamiento del microcalentador. El microcalentador, se encontrará activo aproximadamente unos 10 minutos. En los primeros 5 minutos, la mezcla se va a ir calentando pero sin alcanzar temperaturas desorbitadas, ya que se quedará aproximadamente en unos 62ºC-65ºC, que es el momento en el que empiezan a aparecer las primeras burbujas en la mezcla. En los 5 minutos finales, el microcalentador llega a una temperatura máxima aproximadamente de unos 102ºC, los cuales serán controlados por el PID. Consiguiendo dicho controlador posteriormente mantener constante la temperatura en torno a los 100ºC, permitiéndonos con ello que las burbujas sean cada vez más abundantes y que la mezcla se convierta totalmente en transparente. Una vez finalizado ese intervalo de 10 minutos destinados al calentado de la mezcla, el Arduino desonecta el funcionamiento del microcalentador y deja que la muestra se vaya enfriando hasta obtener un estado sólido, lo cual nos permitirá posteriormente retirar el molde con los peines y podrémos apreciar los pocillos en el gel de agarosa solidificado, donde seguidamente vertiremos las distintas muestras de ADN y finalmente, pasaríamos a realizar la electroforesis. Ilustración 40: Temperatura de la mezcla inferior a los 100º, porque ha terminado el periodo de calentado y la muestra se comienza a enfriar.
36 6.3.6 Señalización de la temperatura alcanzada mediante LEDS En este apartado, vamos a entrar a comentar que empleamos una serie de LEDS para avisar a la persona encargada de la realización del proceso cuando puede retirar el gel de agarosa del molde sin tener problemas. Básicamente, porque la temperatura de calentado del microcalentador va a ser muy elevada para conseguir la fabricación eficiente del gel de agarosa que queremos y, por tanto, queremos evitar cualquier tipo de accidente por quemaduras. En primer lugar, se encenderá un LED rojo cuando la temperatura de la mezcla sea superior a los 98ºC, para indicar al igual que hace un semáforo que hay que estar parado, no se puede tocar la mezcla ni el microcalentador en ese momento por motivos evidentes, ya que pueden llegar a provocar lesiones por quemaduras. En segundo lugar, cuando ya han transcurrido los diez minutos de calentado con el microcalentador activado, apagamos el mismo y pasamos a dejar enfriar la mezcla realizada. Cuando la temperatura se encuentre comprendida entre los 35ºC y los 98ºC, se encenderá un LED amarillo, indicando que hay que tener precaución, ya que el microcalentador está apagado pero la mezcla aún esta demasiado caliente como para intentar retirarla. Y finalmente, cuando la temperatura se encuentre entre valores menores de 35ºC, se encencerá un LED verde, que nos advertirá de que ya podemos retirar la muestra si así lo deseamos sin ningún peligro aparente y además el gel ya se habrá solidificado. A modo resumen, el funcionamiento de los LEDS acorde a la temperatura será el siguiente: • LED ROJO: Se enciende cuando la temperatura es igual o superior a los 98ºC. • LED AMARILLO: Se enciende cuando la temperatura se encuentra comprendida entre los 98ºC y los 35ºC. Después de los 10 minutos de calentado. • LED VERDE: Se enciende cuando la temperatura es menor de 35ºC. Después de los 10 minutos de calentado. A continuación, se va a mostrar el esquemático empleado para los LEDS:
37 Se pueden apreciar en el esquemático una serie de resistencias que van unidas en serie a una serie de LEDS que son los que determinan si la muestra y el microcalentador están calientes o fríos, en función del que se encienda. Las resistencias presentan un valor de 330Ω para que su corriente sea de unos 9mA aproximadamente. La cuenta que se aplica es la siguiente: 𝑉𝑐𝑐 − 𝑉𝑡ℎ 𝑅 Donde la Vcc tiene un valor de 5V proveniente de Arduino, la Vth son unos 2V aproximadamente de los LEDS y la R tiene un valor de 330Ω como hemos detallado previamente. La corriente, por tanto, que pasa por cada uno de los LEDS tiene un valor admisible para que éstos iluminen de forma correcta. 6.3.7 Arduino como cerebro electrónico de la placa En este apartado, vamos a hablar del cerebro electrónico que llevará a cabo todas las funcionalidades de manera automática, que no es más que una placa de Arduino UNO. Dicha placa está programada principalmente para llevar a cabo todas las funciones relacionadas con el control de temperatura y el funcionamiento de manera automática de todos los elementos que intervienen en el proceso de fabricación del gel de agarosa. A continuación se muestra la placa de Arduino que interviene en el proyecto. Ilustración 41: Esquema eléctrico LEDS. LEDS, cada uno de un color (Rojo, Amarillo, Verde). Resistencias de protección para los LEDS.
44 En dichas imágenes se puede apreciar como el sensor de conductividad tiene pegado un molde de metacrilato a su alrededor, que es donde se vertirá la mezcla, seguidamente, podemos ver como el sensor de conductividad se encuentra justamente encima del microcalentador. Hay que tener en cuenta que la PCB del sensor de conductividad es doble cara, es decir, tiene dos partes de cobre, siendo la de atrás en su totalidad cobre, lo que nos permite transferir el calor de una manera más eficiente del microcalentador a la mezcla. A su vez, la parte del sensor de temperatura vemos que no está tapada por la PCB del sensor de conductividad, ya que esto provocaría un fallo de exactitud en la toma de valores de temperatura. Y finalmente, podemos apreciar como el molde de metacrilato que tiene los peines, va colocado encima del molde en el que se vertirá la agarosa con el TAE. 7.5 Problema presentado con el montaje anterior A la hora de llevar a cabo las pruebas con el dispositivo nos apareció un problema, que nos llevó a buscar una solución alternativa a la primera propuesta de montaje planteada, para alcanzar los objetivos que íbamos buscando. Ilustración 60: Sensor de conductividad con marco de metacrilato sobre microcalentador. Molde con peines colocado en la parte superior del otro marco. (Vista superior). Ilustración 59: Sensor de conductividad con marco de metacrilato sobre microcalentador. Molde con peines colocado en la parte superior del otro marco. (Vista lateral).
45 El problema que nos apareció en la realización de los diversos procesos fue una importante pérdida de líquido cada vez que la mezcla de TAE con agarosa alcanzaba una determinada temperatura gracias al calentador. Nos dimos cuenta que dicha pérdida aparecía porque el metacrilato no pegaba bien en las dos finas pistas de cobre que unian el sensor de conductividad con los PADS donde se soldaban los cables. En primer lugar, simplemente para pegar el molde a la placa usamos pegamento, pero como bien hemos indicado, la pérdida era parpable a simple vista. Entonces, decidimos emplear silicona para pegar el marco por dentro y por fuera y ver si conseguíamos eliminar esa pérdida de líquido que estábamos teniendo cada vez que la mezcla alcanzaba cierto grado de temperatura. Pistas de cobre que no permitían que la estructura quedase bien pegada y aparecieran pérdidas de líquido. Ilustración 61: Sensor de conductividad con molde pegado solo con pegamento. Ilustración 62: Sensor de conductividad con molde pegado con pegamento y silicona.
46 Como se puede apreciar, existe una diferencia notoria entre la primera imagen y la segunda, ya que la silicona es un poco más basta que el pegamento y afeaba un poco lo que viene a ser la estructura final en sí. Probamos a realizar de nuevo las sucesivas pruebas y ni por esas conseguimos evitar la pérdida de líquido en el molde. Por tanto, no nos quedó más remedio que fabricar una nueva placa con un nuevo molde. Teniendo en cuenta esta vez que la placa no tuviera nada de cobre en la superficie para conseguir que el marco quedase totalmente pegado de manera eficiente y así no tener pérdidas. Vamos a resaltar también que solo empleamos pegamento para pegar el nuevo molde a la placa, en la que el cobre solo está en la parte de abajo para conseguir transferir el calor desde el microcalentador de manera más eficiente. 7.6 Montaje alternativo del sistema completo sin electrónica (Microcalentador + sensores) Debido al problema que se nos presentó a la hora de realizar las pruebas con el montaje previo, no tuvimos más remedio que buscar una alternativa que nos permitiera seguir con el dispositivo hacia delante y esa solución no era otra que cortar el sensor de conductividad e incluirlo en uno de los laterales del nuevo molde que fabricamos para hacer las pruebas posteriores. Ilustración 64: Placa del sensor de conductivida cortada. Ilustración 63: Sensor de conductividad con el que vamos a trabajar.
47 En las imágenes previas, se puede ver como hemos cortado el sensor de conductividad de su placa original y como le hemos soldado dos cables a cada una de sus pistas, ya que no tenemos los PADS que teníamos en el diseño original para colocar los cables. A continuación, se va a mostrar cual es el nuevo molde que vamos a emplear en el dispositivo para realizar la mezcla y cual será el montaje completo de esta parte. Ilustración 66: Nuevo molde fabricado. Ilustración 65: Nuevo molde más molde para peines. Ilustración 67: Unión de los moldes en una misma estructura. Ilustración 68: Montaje alternativo completo. (Vista lateral).
48 En las imágenes previas del montaje alternativo completo, se puede apreciar que el microcalentador se coloca con el cobre para abajo, es decir, dado la vuelta. Esto es así, para evitar que se haga un cortocircuito con la parte inferior de cobre de la placa donde pegamos el molde y que a su vez tendrá colocado en su superficie el sensor de conductividad. Ilustración 69: Montaje alternativo completo. (Vista superior).
49 8 CIRCUITOS ELECTRÓNICOS n este capítulo, vamos a hablar principalmente del circuito electrónico que es necesario para realizar todas las funciones que se deben llevar a cabo en el proyecto, como son la fabricación del gel de agarosa y la electroforesis. 8.1 Selección de Agarosa/Electroforesis A continuación, vamos a hablar del circuito electrónico que empleamos para llevar a cabo la fabricación del gel de agarosa o en su defecto para llevar a cabo el proceso de electroforesis. El circuito estará gobernado por un interruptor de tres posiciones, en función de la posición del mismo, el circuito llevará a cabo el proceso de agarosa o el de electroforesis. En la posición central de dicho interruptor, no se realizaría ninguno de los dos procesos comentados previamente. A continuación, vamos a mostrar un esquema del circuito en cuestión para facilitar su comprensión e indicaremos a su vez que son cada una de las partes que componen dicho circuito. 8.1.1 Esquemático del circuito completo Procedemos a continuación a mostrar una imagen del esquemático desarrollado para la fabricación de la placa electronica. E Parte del sensor de conductividad. Parte de los LEDS. Parte control de temperatura más Arduino. Ilustración 70: Esquema eléctrico selección de agarosa/electroforesis. Conector para el interruptor. Pines para conectar los electrodos de la electroforesis.
50 8.1.2 Elementos empleados en el circuito En este apartado, vamos a comentar cada uno de los elementos/componentes que son empleados para la fabricación de la placa. 8.1.2.1 Conectores y pines En el esquemático del apartado anterior, se puede apreciar que hay multitud de conectores y pines que sirven para conectar a la placa multitud de elementos externos, como pueden ser el Arduino (que es el otro circuito electrónico empleado, que servirá como cerebro para la automatización de los procesos), la fuente de alimentación que será la encargada de alimentar el circuito, el microcalentador que será el encargado de calentar la mezcla de agarosa con TAE, el sensor de temperatura NTC que será el encargado de medir la temperatura a la que se encuentra la mezcla comentada previamente, el interruptor que será el encargado de determinar que proceso debe llevar a cabo la placa y el sensor de conductividad que será el encargado de indicar cuando se ha detectado líquido en el molde preparado para ello. 8.1.2.2 LEDS Tenemos tres LEDS colocados en la placa, uno de color rojo, otro de color amarillo y otro de color verde, como comentamos en capítulos previos, estos LEDS se encuentran colocados en la placa para tener un feedback visual con el sistema y saber en que momento podemos retirar el molde con el gel de agarosa del microcalentador sin provocarnos una lesión debido a una quemadura. Su función principal es ayudar al operario que trabaja con el dispositivo para que éste no tenga ningún percance debido a las altas temperaturas a las que va a trabajar el microcalentador y a las que va a llegar el gel de agarosa. 8.1.2.3 Interruptor Vamos a emplear el uso de un interruptor para poder tener las dos funcionalidades necesarias en una misma PCB y no tener distintos circuitos para ejercer las funciones que necesitamos. El interruptor que vamos a emplear es un interruptor de tres posiciones como ya se comentó en apartados previos y cada posición de dicho interruptor va a tener una funcionalidad determinada. En primer lugar, debemos colocar el interruptor hacia la derecha para llevar a cabo el proceso de fabricación del gel de agarosa y seguidamente, cuando todo este proceso haya finalizado, vamos a colocar el interruptor hacia la izquierda para continuar con el proceso de la electroforesis. 8.1.2.4 Electrodos electroforesis Continuando con lo último detallado en el apartado anterior, para llevar a cabo el proceso de electroforesis, son necesarios el empleo de una serie de electrodos, dichos electrodos son de acero, ya que tienen una conductividad eléctrica muy buena.
51 Uno será el electrodo positivo y el otro el negativo. Su principal funcionalidad será la de migrar el ADN del electrodo negativo al electrodo positivo, ya que los fragmentos tienen carga negativa. Teniendo en cuenta que todos los fragmentos de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa, los fragmentos pequeños atraviesan el gel de agarosa más rápido que los grandes. 8.1.3 Prototipo final de la placa fabricado En este apartado, vamos a mostrar el resultado definitivo de la placa que se ha fabricado para este circuito electrónico, detallando la funcionalidad de sus pines y conectores. Ilustración 71: Resultado circuito final para la selección de agarosa/electroforesis. Conector sensor de temperatura. Conector de alimentación de Arduino. Conector de alimentación de la placa. Conector del microcalentrador. Conector para LEDS amarillo y verde. Conector sensor de conductividad. Pin para LED rojo. Pin para salida A0 de Arduino. Pin para salida A5 de Arduino. Pin para salida A11 de Arduino. Pines para conectar a los electrodos (positivo/negativo) que llevan a cabo la electroforesis.
52 9 MONTAJE EXPERIMENTAL Y RESULTADOS n este capítulo, vamos a mostrar los resultados del dispositivo final que hemos realizado, explicando en cada imagen que se está representando y en que momento del proceso nos encontramos, para que visualmente podamos hacernos una idea de que está ocurriendo en todo momento. En primer lugar, antes de poner en funcionamiento el dispositivo, podemos apreciar que al cargarse el código del programa en la placa de Arduino UNO y tener la placa alimentada a los 20V necesarios, se enciende el LED verde, para indicarnos que el dispositivo se encuentra preparado para comenzar a funcionar. E Ilustración 72: Dispositivo preparado para comenzar a funcionar.
53 Seguidamente, lo que hacemos es mover el interruptor hacia la posición de la derecha (hacia el cable rojo). Con esta acción lo que estamos haciendo es que comience el proceso de fabricación del gel de agarosa. Una vez colocado el interruptor hacia la derecha, vertimos en primer lugar el TAE, del cual echaremos aproximadamente unos 9 mililítros, teniendo en cuenta que la concentración de gel de agarosa que queremos es del 2%, en el molde que tenemos fabricado para ello y a su vez debemos tener previamente ya colocado el sensor de conductividad. Seguidamente echamos la agarosa en el mismo molde, teniendo en cuenta que la concentración de gel con la que vamos a trabajar es del 2%, medimos en un peso específico 0.18 gramos de agarosa y lo echamos en el molde de manera bien distribuida, para que no se queden zonas del gel con baja cantidad y nos den lugar a un gel descompensado. Podremos apreciar en ese momento como se apaga el LED verde de la placa, porque el dispositivo ya está en funcionamiento. Ilustración 73: Interruptor hacia la derecha. Ilustración 75: Vertimos TAE sobre el molde. Sensor de concuctividad, detecta la presencia de líquido. Ilustración 74: Todos los LEDS se apagan porque comienza a funcionar el microcalentador.
60 Empezamos a ver pasados seis minutos, como el color verde se empieza a descomponer en dos colores primarios, amarillo y azul. En la ilustración anterior, podemos ver como ya están prácticamente separados en su totalidad el color azul y el amarillo que formaban la tinta verde y apreciamos también como en la tinta azul pura, no se descompone en ningún color, porque es básicamente un color primario. Ilustración 88: Después de 8 minutos del proceso de electroforesis. Ilustración 89: Después de 10 minutos del proceso de electroforesis.
61 Sigue corriéndose la tinta a lo largo del gel de agarosa, como llevamos viendo a lo largo de esta sucesión de imágenes mostradas previamente. Y finalmente, la tinta o el ADN migrado se puede apreciar en esta última imagen, ya que vemos que no nos queda restos de nada en los pocillos. Cabe destacar una cosa importante en todo este proceso. Como se puede apreciar, después de doce minutos de proceso de electroforesis, la tinta amarilla baja más rápido que la tinta azul ya que ambas componen en general la tinta verde que teníamos al principio vertida en el primer pocillo. Esto es así, debido a que las partículas más pequeñas circulan más rápido que las partículas más grandes a través del gel de agarosa. En los otros dos pocillos, no podemos apreciar ninguna separación de colores porque el color azul es un color primario puro y no se descompone en otros como bien comentamos previamente. A continuación, vamos a mostrar una imagen con ADN migrado vista con luz ultravioleta en uno de los experimentos realizados, que se podrá ver con más detalle en el Anexo E de la memoria: Ilustración 90: Después de 12 minutos del proceso de electroforesis.
62 Ahí se puede apreciar como la banda de ADN a medida que se va migrando, va hacia abajo. Ilustración 91: Imagen del proceso de migración de ADN después de aplicarle luz ultravioleta.
63 10 CONCLUSIONES l principal objetivo de desarrollo de este proyecto es el diseño de un dispositivo electrónico capaz de preparar gel de agarosa y de realizar la electroforesis para hacer pruebas relacionadas con la migración de ADN. Este sistema incluye diversos procesos que deben interactuar entre sí, para llevar a cabo el desarrollo del mismo de una forma eficiente. Siguiendo la línea que se tenía planteada, se han realizado los diversos diseños y se han fabricado todos y cada uno de los circuitos electrónicos que componen el sistema final y el sensor de conductividad, así como la comprobación del correcto funcionamiento de cada uno de ellos. Teniendo en cuenta lo comentado previamente, podemos decir que se han cumplido todos los objetivos que nos habíamos marcado al principio de este documento, como eran: • Diseño Simple: Como se puede apreciar en todos y cada uno de los diseños de los circuitos electrónicos que hemos llevado a cabo, ya que son diseños muy simples y lo más optimizados posibles. • Diseño compacto: Uno de los objetivos básicos del proyecto, es agrupar en un solo dispositivo todo lo referente a la fabricación del gel de agarosa y al proceso de electroforesis, por lo que optamos por hacer un diseño compacto de todas las partes que intervienen en el proyecto, para así ocupar el mínimo espacio posible y tenerlo todo unido en un mismo dispositivo. Para ello, fue necesario el uso de un interruptor, que gobernará el dispositivo, indicando en todo momento que funcionalidad debe llevar a cabo el sistema. • Diseño modular: Con el objetivo de poder tener un dispositivo de fácil acceso para todos y cada uno de los diferentes procesos en caso de fallo, se decidió realizar un diseño modular dividiendo en diversos bloques el dispositivo. Para ello, en la placa general, colocamos multitud de conectores para conectar todos y cada uno de los circuitos electrónicos externos que van a proporcionarle una cierta funcionalidad al sistema. Con ello, lo que conseguimos es que en caso de fallo, tan solo tengamos que desconectar de los conectores el circuito electrónico conflictivo y solventar el problema que en él ocurra, sin necesidad de desmontar todo el sistema. • Dispositivo portátil: Otro de los objetivos que habíamos planteado previamente en nuestro proyecto, era la construcción de un dispositivo que fuera fácil de transportar y de montar en unos minutos. Esto se ha conseguido gracias a la estructura que le hemos dado a nuestro dispositivo y al sistema de conexión que se le ha diseñado para integrar todos los procesos que lleva a cabo. • Dispositivo autónomo: Por último, otro objetivo que nos marcamos al comienzo del proyecto, fue conseguir que el sistema fuese lo más independiente posible gracias a la ayuda de Arduino. Finalmente, dicho objetivo fue cumplido para la mayoría de las tareas que no requieren de la participación de un operario, como es el caso de la mezcla de agarosa con TAE o del relleno de los pocillos con ADN o tinta como se ha usado en multitud de pruebas. E
64 Desde el punto de vista personal, el hecho de haber realizado este proyecto, me ha supuesto comprobar todos los conocimientos de electrónica que he ido adquiriendo con el paso de los años en el Grado y además poder ampliar mis conocimientos en un campo tan importante como es hoy en día la unión de la electrónica con la medicina. También he conseguido adquirir una visión más general y amplia de lo que supone la electrónica en su conjunto, ya que en el proyecto he ido avanzando desde el diseño de los circuitos electrónicos hasta su fabricación. Gracias a la labor desempeñada en este proyecto, puedo decir que hoy en día tengo las ideas más claras de como desarrollar un dispositivo desde cero y de la importancia que hay que darle a la comprobación de todos los componentes y todos los circuitos de manera exhaustiva, ya que un simple fallo de comprobación con las partes del dispositivo por separado, te puede ahorrar un fallo enorme con el circuito montado en su totalidad, ya que el tiempo que se tarda en averiguar de donde proviene el fallo es aún mayor que si haces la comprobación detalladamente de cada uno de los componentes o de las pistas que se han diseñado para cada uno de los circuitos.
65 11 TRABAJOS FUTUROS-MEJORAS l siguiente capítulo lo vamos a destinar a comentar las futuras ampliaciones destinadas a mejorar el proyecto y a optimizar su funcionamiento. Para ello, a continuación, vamos a resaltar algunas de las cosas que hemos detectado que pueden ser objeto de mejora en un futuro: ➢ Empleo de un ventilador: El empleo de un ventilador, nos permitiría reducir los tiempos de espera del enfriado del gel de agarosa. A día de hoy en el proyecto, son necesarios 20 minutos para conseguir que la muestra se cure en su totalidad y se consigan unos pocillos óptimos. Gracias a la ayuda de dicho ventilador, podríamos enfriar la muestra de una manera más rápida y conseguir, por tanto, resultados más rápidos. ➢ Empleo de mosfets como interruptores: Gracias al empleo de dos mosfets, podemos sustituir el uso del interruptor y nos quedaría un diseño más optimizado. La idea sería tener dos mosfets inicialmente abiertos ambos, cuando quisiéramos llevar a cabo el proceso de fabricación del gel de agarosa mediante software programado en Arduino cerraríamos uno de ellos y cuando dicho proceso ya hubiese finalizado, por medio de software también cerraríamos el otro mosfet a medida que abrimos el que cerramos en primer lugar, para dar paso de esta forma al proceso de la electroforesis. ➢ Introducir Arduino en la placa general: Para disminuir el tamaño del dispositivo, podríamos introducir la placa de Arduino en la placa general del sistema. Tan solo tendríamos que hacer mediante diseño, las conexiones pertinentes para introducir dicho Arduino en la placa que engloba el sistema. ➢ Carcasa para electrodos: Fabricar una carcasa que contenga de manera fija los electrodos que se van a llevar a cabo en el proceso de la electroforesis, así tan solo tendríamos que retirar una vez fabricado el gel de agarosa el molde con los peines y colocar la carcasa con los electrodos para llevar a cabo la electroforesis. De la manera que está ahora implementado, es necesario ponerte manualmente a colocar los electrodos de manera correcta para que no haya ningún problema. ➢ Estructura para incluir el sistema: Fabricar una estructura, para incluir todas y cada una de las partes y que se viera un sistema estéticamente más llamativo, ocultando la unión de los cables, que en este primer prototipo van situados visiblemente en el montaje. E
66 ➢ Máscara de soldadura sobre la placa del sensor de conductividad: Para conseguir con ello que el molde de metacrilato quede bien pegado y no tenga fugas de líquido a causa de que el pegamento no se adhiere bien sobre las dos pistas de cobre que van del sensor de conductividad a los PADS. ➢ Eliminar fuente de alimentación de laboratorio: La idea es sustituir dicha fuente de alimentación por otra más pequeña, que proporcione los 20V para todo el proceso y la corriente necesaria de 1 Amperio, que nos permita hacer el dispositivo más manejable y poder emplearlo en cualquier lugar.
67 REFERENCIAS [1] A. S. R. & J. A. B. Adirana Salazra Montes, Fundamentos y Aplicaciones en las ciencias de la salud, vol. 53, McGraw Hill, 2013. [2] Salazar Montes A, Sandoval Rodríguez A, Armendáriz Borunda J., Preparación de un gel de agarosa, McGraw-Hill, 2017. [3] Electroforesis en gel (artículo) | Khan Academy, https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/geneexpression-and-regulation/biotechnology/a/gel-electrophoresis. [4] URBANO-GÁMEZ, Jesús David; PERDIGONES, Francisco; QUERO, José Manuel. Semi-Automatic Lab-on-PCB System for Agarose Gel Preparation and Electrophoresis for Biomedical Applications. Micromachines, 2021, vol. 12, no 9, p. 1071. [5] PERDIGONES, Francisco. Lab-on-PCB and flow driving: A critical review. Micromachines, 2021, vol. 12, no 2, p. 175. [6] E-Gel Power Snap System for Routine Agarose Gel Electrophoresis, https://www.thermofisher.com/es/es/home/life-science/dna-rna-purification-analysis/nucleic-acid-gel- electrophoresis/e-gel-electrophoresis-system/e-gel-routine-na- electrophoresis.html?ef_id=EAIaIQobChMI85GawuO2-AIVk- d3Ch37KAlHEAAYASAAEgKwwfD_BwE:G:s&s_kwci. [7] Sistema de electroforesis para ADN myGel InstaView™, https://www.medicalexpo.es/prod/benchmarkscientific/product-99480-1001941.html. [8] Sistema de electroforesis MyGel Mini, https://accuris-usa.com/Products/mygel-mini-electrophoresis/. [9] Sistema de electroforesis en gel de agarosa MBE-150, https://www.medicalexpo.es/prod/majorscience/product-108304-747057.html. [10] Aparato completo del sistema de electroforesis Mupid® One, https://www.eurogentec.com/en/catalog/mupid-one-electrophoresis-system-complete- apparatus~e60c900e-ad89-45fc-a4a1-a9a8ead4859d. [11] Sistema completo de electroforesis ROTIPHORESE ® PROfessional runVIEW, https://www.carlroth.com/fr/en/rotiphorese-professional/complete-electrophoresis-system-rotiphorese- professional-runview/p/4849.1. [12] Klayout, https://www.klayout.de/. [13] Nadia E Tolouei , Roya Mazrouei y Mohammad Shavezipur, Sensores tridimensionales basados en impedancia para la detección de productos químicos en soluciones acuosas, https://www.vibgyorpublishers.org/content/ijabm/ijabm-2-012.php?jid=ijabm, 2020.
68 [14] Termistores, https://es.omega.com/prodinfo/termistores.html#:~:text=facilitar%20la%20soldadura.- ,Resistencia%20base,55%20%C2%B0C%20a%20aprox.. [15] KiCAD, https://www.kicad.org/.
69 ANEXOS n siguiente capítulo, vamos a mostrar una serie de anexos al proyecto, en el que se recalcarán, por ejemplo, algunos de los modelos y pruebas previos al circuito electrónico definitivo, se indicará en otro anexo el código de Arduino desarrollado para la correcta implementación de las funcionalidades de nuestro proyecto y a su vez, hablarémos en otro anexo del proceso de fabricación llevado a cabo en el laboratorio para la fabricación de todas y cada una de las placas y finalmente, acabarémos mostrando en un último anexo, las pruebas realizadas con ADN de verdad en nuestro dispositivo. Anexo A: Pruebas realizadas para los distintos sensores de conductividad: En este primer anexo, vamos a mostrar todas y cada una de las pruebas que se realizaron a cada uno de los sensores de conductividad, para mostrar que su funcionamiento es óptimo y que no es fruto de una simple prueba realizada. Resultados sensor tamaño 1cmX1cm: Primera prueba: E
76 Tercera prueba: Cuarta prueba:
77 Quinta prueba:
78 Resultados sensor tamaño 2mmX2mm: Primera prueba: Segunda prueba:
79 Tercera prueba: Cuarta prueba:
80 Quinta prueba: Resultados sensor tamaño 1mmX1mm: No se muestran resultados del sensor de 1mmX1mm porque no era lo suficientemente sensible como para detectar cuando recibía el líquido TAE en su superficie.
81 Anexo B: Microcalentador previo al definitivo: En este anexo, vamos a hablar del modelo de microcalentador diseñado y fabricado previamente al modelo definitivo del mismo. En dicho modelo, podemos apreciar que la resistencia del calentador es inferior a la del modelo definitivo, porque tiene un menor recorrido a la par que unas pistas demasiado gruesas y por esa causa, la corriente que circula por dicho calentador es mucho mayor, provocando con ello un mal control de temperatura. Se necesitaba a su vez una resistencia en serie bastante grande que también calentaba bastante. Gracias al programa “KICAD” creamos la máscara del microcalentador que probamos en primer lugar antes del definitivo. La estructura que va a tener el microcalentador es una estructura a modo de serpentín y a su vez, tiene unos PADS asociados para poder soldarle un par de cables que nos servirán para conectarlo finalmente al circuito completo. A continuación, vamos a mostrar una serie de imágenes en las que se verá la máscara que se diseñó para la fabricación del microcalentador y la placa que se obtuvo como resultado. En dichas imágenes, podemos apreciar en primer lugar, la máscara que se empleó para su fabricación, en segundo lugar, el microcalentador resultante que obtuvimos a la hora de fabricar la placa y finalmente el microcalentador completo con la NTC soldada y con los cables soldados a cada uno de los PADS. A continuación, después de visualizar las imágenes anteiores, vamos a detallar el tamaño del microcalentador en sí, a la vez que el tamaño de cada una de las pistas y los PADS que forman dicho elemento.
82 El tamaño del microcalentador concreto es de 3.5cmX3.5cm, las pistas que forman dicho elemento tienen un grosor de 500µm con una separación entre las mismas de 500µm y el tamaño de los PADS es de 5mmX3mm. Vamos a resaltar también que el valor resistivo del mismo es de 1.9Ω y las corrientes que pasan por él tienen un valor máximo de 1.44A. Para calcular la resistividad, del microcalentador, tan solo tenemos que medir con el multímetro entre sus dos PADS y ver el valor obtenido. Una vez obtenido dicho valor y teniendo la tensión que suministra la fuente sacamos la corriente por la ley de Ohm. Otra manera de hallar los valores es aplicando directamente la ley de Ohm, viendo los valores de tensión y de corriente que entrega la fuente de alimentación y viendo el valor máximo al que podemos alimentar a la par que el valor de corriente que nos está pidiendo, podemos sacar el valor de la resistencia del calentador. La imagen superior, muestra el conexionado que empleamos para comprobar el funcionamiento del calentador. Una vez comprobado los valores y los resultados que obteníamos de gel de agarosa, decidimos modificar el microcalentador, para hacerlo más eficiente y que gracias a ello, alcanzase las temperaturas de una forma más rápida y a su vez no relentizase tanto el proceso de fabricación. El estar un tiempo más elevado calentando, provoca que la mezcla se evapore, quedando muy poco gel de agarosa para llevar a cabo el procedimiento completo. Ante esta tesitura, decidimos diseñar un nuevo microcalentador más eficiente, que aplicaremos en el circuito y que funcionará mucho mejor.
83 Anexo C: Programación de Arduino UNO: En este anexo, vamos a mostrar el código que hemos diseñado para programar el Arduino UNO, con el fin de llevar a cabo todo el funcinamiento del dispositivo de la manera más autónoma que se nos permite. No vamos a entrar mucho en detalle a la hora de comentar las líneas de código, puesto que en el desarrollo del mismo hay multitud de comentarios que sirven al lector para saber que se está haciendo en todo momento y para que sirve cualquier línea determinada del código. #include <PID_v1.h> ///TIEMPOS/// unsigned long T_agar = 600; //Tiempo de calentado de la agarosa. Alrededor de los 10 minutos. 10min X (60seg / 1min) = 600seg //TEMPERATURAS/// double Temp_agar = 100; //Temperatura de la Agarosa double Setpoint, Input, Output; double Kp=200,Ki=20,Kd=0; //(Para LoC: 150/10/0)(Previo-PCB-TFG: 80/5/0) float alfa = 0.05; //Inicialmente este valor va bien, podemos variarlo durante los experimentos. float error = 0; int i = 0; double medida; double medidaf = 0; int R80 = 1330; //Mismos valores que para R95, ya que son muy próximos y no existe gran diferencia entre R80 y R95 float beta80 = 3445.0; //Mismos valores que para beta95, ya que son muy próximos y no existe gran diferencia entre beta80 y beta95 float To = 298.15; int Vcc = 5; int Ro = 10000; //Se deja así para todos los casos, Ro es fija //Variables para leer la tensión del sensor de corriente float lectura_Vsens; //Necesitamos una primera variable de tipo float para guardar la lectura que haremos en el pin analógico A5. (Nos dará un valor entre 0 y 1023). float Vsens_current; //La segunda variable, también será de tipo float y nos servirá para gurdar la conversión de la medida en voltios. //Variable para evitar que el programa se ejecute indefinidamente int PARO = 1; //Variables que se utilizan para cronomentrar el tiempo de funcionamiento del microcalentador unsigned long InicioTiempo = 0; unsigned long TomaMedidaTiempo = 0; unsigned long DiferenciaTiempo; unsigned long INTERVALO_CALENTADO = 600000; //Si 1 min son 60000 milisegundos, 10 min serán 600000 milisegundos. Ponemos el tiempo en milisegundos para trabajar con la función "millis()" int FijarInicioTiempo = 1; //Para que la variable inicio tiempo no se esté actualizando continuamente, si vale 1 se acutaliza, pero si vale 0 deja de hacerlo.
84 PID myPID(&Input, &Output, &Setpoint, Kp, Ki, Kd, DIRECT); //The setup routine runs once when you press reset: void setup() { myPID.SetSampleTime(10); myPID.SetMode(AUTOMATIC); Setpoint = Temp_agar; //Initialize serial communication at 9600 bits per second: Serial.begin(9600); // msp430g2231 must use 4800 (Inicializamos puerto serie). pinMode(7, OUTPUT); //Para encender LED Rojo. pinMode(8, OUTPUT); //Para encender LED Verde. pinMode(9, OUTPUT); //Para encender LED Amarillo. pinMode(11, OUTPUT); } void loop() { //El ADC interno del microcontrolador tiene una resolución de 10 bits, esto significa que la tensión analógica de entrada se convierte en un valor numérico entre 0 y 1023. lectura_Vsens = analogRead(A5); Vsens_current = lectura_Vsens / 1023 * 5.0; //Serial.println(Vsens_current); if(Vsens_current <= 3.5 && PARO == 1) //Si la tensión del sensor de corriente es menor o igual que 3.5V y la variable PARO vale 1, comenzará a funcionar el calentador, ya que eso quiere decir que se ha detectado líquido y el código aún no se había ejecutado. { digitalWrite(8, LOW); //Apagamos LED Verde cuando comenzamos a calentar. if(FijarInicioTiempo == 1) { InicioTiempo = millis(); FijarInicioTiempo = 0; //Para que no se cumpla la condición y no se siga actualizando InicioTiempo. } TomaMedidaTiempo = millis(); DiferenciaTiempo = TomaMedidaTiempo - InicioTiempo; //Serial.print( "La función tardó:" ); //Serial.print( DiferenciaTiempo ); // Serial.println( " ms " ); float ADC80 = analogRead(A0); //Leemos temperatura80, valor VNTC // //Calculos para 80ºC float Vout80=ADC80*5/1023; float VNTC80=Vout80; float RNTC80 = (VNTC80*R80)/(Vcc-VNTC80); float alfa80 = (1000/To)+((1000/beta80)*(log(RNTC80/Ro))); float T80 = 1000/alfa80 - 273.15; if(T80 >= Temp_agar-2) { digitalWrite(7, HIGH); //Encendemos LED Rojo cuando la temperatura ha llegado a los 98 grados. }
85 else { digitalWrite(7, LOW); //No encendemos LED Rojo porque la temperatura no ha llegado a los 98 grados. } medida = T80; //Medida va a guardar el valor de temperatura calculado previamente en unidades de temperatura y no de ADC medidaf = medida*alfa + (1-alfa)*medidaf; Input = medidaf; error = Setpoint - medidaf; myPID.Compute(); analogWrite(11, Output); // Serial.print(81); // Serial.print(","); // Serial.print(80); // Serial.print(","); // Serial.print(T80-2.44); // Serial.print(","); // Serial.print(79); Serial.print(Setpoint); Serial.print(","); // Serial.print(error); // Serial.print(","); Serial.println(Input); delay(10); if(DiferenciaTiempo >= INTERVALO_CALENTADO) { //digitalWrite(11, LOW); //Después de 10 minutos de calentado, apagamos el microcalentador. myPID.SetMode(MANUAL); Output = 0; if (T80 > 35 && T80 <= Temp_agar-2) { digitalWrite(9, HIGH); //Encendemos LED amarillo cuando la temperatura se encuentra entre 35 y 98 grados. } else if (T80 <= 35) { PARO = 0; digitalWrite(9, LOW); //Apagamos LED amarillo cuando la temperatura baja de 35 grados. while(PARO == 0) { digitalWrite(8, HIGH); //Encendemos LED Verde después de los 10 minutos de calentado, cuando la temperatura empieza a bajar y a aproximarse a los 25 grados. } } Serial.print(Setpoint); Serial.print(","); Serial.print(PARO); Serial.print(","); Serial.println(Input); } } else //En caso de que la tensión del sensor no sea menor o igual a 3.5V, no ocurrirá nada y el calentador seguirá apagado.
92 Imagen del ADN después de 8 minutos de electroforesis: Imagen del ADN después de 10 minutos de electroforesis:
93 Imagen del ADN después de 12 minutos de electroforesis: Imagen final del proceso después de aplicarle luz ultravioleta: Para concluir, se ve como a lo largo del tiempo, en las sucesivas imágenes, la migración se realiza de forma eficiente y en la última imagen con la indicencia de la luz ultravioleta, podemos apreciar bandas hacia abajo del gel, de un color fosforescente, señal de que el ADN se ha estado migrando del polo negativo al positivo del gel, teniendo una mayor velocidad las partículas pequeñas que las grandes, ya que estas encuentran una mayor dificultad para atravesar el gel. Ahí se puede apreciar como la banda de ADN a medida que se va migrando, va hacia abajo.