Estudio de NTRC en semillas de cereales

Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Universidad de Sevilla – CSIC ESTUDIO DE NTRC EN SEMILLAS DE CEREALES Trabajo realizado para optar al grado de Doctora por la Universidad de Sevilla Mª Victoria Armario Nájera Directores de la Tesis Dr. Fco Javier Cejudo Fernández Dra. Maricruz González García Catedrático en Bioquímica y Profesora Titular Biología Molecular Sevilla 2017 A mis padres AGRACECIMIENTOS La realización de esta Tesis Doctoral ha sido posible gracias a una beca pre-doctoral adjunta al proyecto de excelencia P10-CVI-5919, concedida por la Junta de Andalucía durante el periodo comprendido entre Febrero del 2012 y Enero del 2016. En primer lugar, quisiera a agradecer a mi director de tesis, el Dr. Francisco Javier Cejudo, la posibilidad que me ha dado de formar parte de su grupo de investigación, así como la confianza depositada en mí al brindarme la oportunidad de llevar a cabo esta nueva línea de trabajo. Reconociendo su implicación, su disponibilidad, paciencia, así como por la libertad con la que me ha permitido trabajar estos años. Gracias también a mi co-directora de tesis, la Dra MariCruz González, por su atención, sus consejos, por transmitirme los conocimientos necesarios para encaminarme en este mundo de la biología molecular, así como por su apoyo cuando nada parecía fácil. Gracias a ambos han hecho posible la realización de esta tesis. También quisiera agradecer su colaboración a todos aquellos que han participado directamente en la obtención de los resultados presentados en este trabajo. A los miembros del grupo de Dra Pilar Carbonero, de la Universidad Politécnica de Madrid, por proporcionarnos los protocolos necesarios para iniciar las transformaciones de Brahypodium. A V. Thole y P. Vain del John Innes Center, Norwich, por cedernos los vectores pBrachyTAG-G217 y pBrachyTAG-G210 con el que finalmente se desarrolló este trabajo. Por supuesto, agradecer su colaboración al personal técnico del IBVF: a Pablo por hacer siempre un hueco para cuidar mis Brachypodium y Rocío Rodríguez por su colaboración en los análisis de proteínas. Agradecer enormemente a mis compañeros de laboratorio haber hecho tan confortables estos años. A Anna por su ayuda cada vez que he tenido dudas a la hora de realizar algún protocolo de proteínas y por preocuparse siempre por cómo iban las cosas. A Juan por prestarme su ayuda cada vez que he necesitado algo. A Leo, Julia y Bea por su ayuda a manejarme en el laboratorio durante los primeros años. A mis dos pollitos, la ya doctora Belén y mi futura doctora Valle, para vosotras… no tengo palabras suficientes que puedan agradecer lo que habéis hecho durante estos años. Han sido tantas horas juntas y tantos momentos, dentro y fuera del laboratorio, que a veces creo que hasta os voy a echar un poco de menos, sobre todo, vuestra mala costumbre de llevarme la contraria. Y finalmente a Víctor, por su constante predisposición a echarme una mano, por animarme tanto durante este último año y contagiarme su positividad cada vez que me veía agobiaba. No cambies nunca ese buen rollo que transmites y por favor, no dejes que te conviertan en el tercer pollito. A mis amigos, Miri, Camas, Mon, Manu y Anita, por estar ahí incondicionalmente, haberme cuidado y ayudado tanto durante estos últimos años, sin vosotros nada habría sido igual. A Sonia, responsable de que acabase haciendo la tesis: gracias por haberme obligado. Después de tantos años no hay nada que te pueda decir que no sepas. A Luismi y Patri, por ser, para lo bueno y lo malo, esos dos hermanos mayores que nunca he tenido, gracias por mimarme tanto. A todos vosotros, gracias por haberos convertido en mi familia Sevillana. Por otra parte, me gustaría agradecer a Alberto, mi alter ego masculino, no sólo su ayuda en el diseño de la portada de este trabajo, sino su más sincera y absoluta amistad desde que éramos dos adolescentes. Gracias por tu apoyo, tu cariño y tu confianza que tanto me anima. Ya sabes que aunque estemos lejos para mí siempre estás presente. Me gustaría también agradecer a mis padres todo el amor y dedicación absoluta e infinita que siempre me han dado. Gracias por la educación que me habéis proporcionado, por vuestro apoyo en cada una de mis elecciones, por enseñarme que el trabajo y esfuerzo siempre ofrecen recompensa. Espero que estéis orgullosos porque todo esto ha sido posible gracias a vosotros. Gracias también a ti, Sofi, por tu apoyo y por animarme siempre a continuar, por tu infinita paciencia y comprensión ante un trabajo que no entiende ni de días ni de horas. Y sobre todo, gracias por tu cariño, tu confianza y por cuidarme tanto día a día, haciendo que todo sea más sencillo. Gracias también a todos mis “Nájera´s family” por ser como sois y hacerme sentir siempre tan cerca a pesar de estar tan lejos. ÍNDICE ÍNDICE .......................................................................................................................... 7 ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS .................................................................................... 11 ABREVIATURAS .......................................................................................................... 17 I. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 21 I.1. LA SEMILLA DE CEREALES ...................................................................................... 23 I.1.1. Estructura y composición de la semilla de cereales ......................................... 24 I.1.2. Desarrollo y germinación de la semilla de cereales ......................................... 29 I.1.2.1. Desarrollo ................................................................................................ 29 I.1.2.1. Germinación ............................................................................................ 31 I.1.3. Generación y función de las especies reactivas de oxígeno en semillas .......... 33 I.1.4. Regulación redox en plantas ........................................................................... 38 I.1.4.1. Tiorredoxinas .......................................................................................... 39 I.1.4.2. NADPH-tiorredoxina reductasa C ............................................................. 44 I.1.5. Metabolismo del almidón en el endospermo de cereales ............................... 46 I.1.5.1. Síntesis de almidón .................................................................................. 47 I.1.5.2. Estructura y regulación de la AGPasa ....................................................... 51 I.1.5.3. Degradación del almidón ......................................................................... 53 I.2. BRACHYPODIUM DISTACHYON COMO ORGANISMO MODELO EN EL ESTUDIO DE CEREALES .................................................................................................................... 54 I.2.1. Estructura de la semilla de Brachypodium ...................................................... 56 I.3. OBJETIVOS ............................................................................................................ 59 II. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................... 61 II.1. MATERIAL VEGETAL ............................................................................................. 63 II.1.1. Esterilización de semillas .............................................................................. 63 II.1.2. Germinación de semillas y condiciones de cultivo ......................................... 64 II.2. BACTERIAS ........................................................................................................... 65 II.2.1. Bacterias empleadas ...................................................................................... 65 I.2.2. Cultivos de bacterias en medio líquido y sólido .............................................. 66 II.2.3. Obtención de bacterias competentes ............................................................ 66 II.2.4. Transformación de células ............................................................................. 67 II.3. OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ........................................... 67 II.3.1. Aislamiento de DNA plasmídico ..................................................................... 67 II.3.2. Extracción de DNA genómico de tejidos vegetales ......................................... 68 II.3.3. Extracción de RNA de tejidos vegetales y retrotranscripción ......................... 68 II.3.3.1. Tratamiento del RNA con DNasa y electroforesis de RNA ........................ 69 II.3.3.2. Retrotranscripción .................................................................................. 70 II.3.4. Cuantificación de ácidos nucleicos ................................................................. 70 II.4. MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ............................................................... 70 II.4.1. Técnica de PCR .............................................................................................. 70 II.4.1.1. Oligonucleótidos empleados para PCR convencional .............................. 72 II.4.1.2. PCR cuantitativa a tiempo real ................................................................ 74 II.4.2.1. Oligonucleótidos para PCR cuantitativas ................................................. 74 II.4.3. Visualización de DNA en geles de agarosa ..................................................... 75 II.4.4. Purificación de fragmentos de DNA de geles de agarosa ................................ 75 II.4.5. Digestión con enzimas de restricción ............................................................. 76 II.4.6. Ligaciones ...................................................................................................... 76 II.4.7. Escrutinio de colonias mediante PCR ............................................................. 77 II.4.8. Secuenciación automática de DNA ................................................................ 77 II.5. PREPARACIÓN Y ANÁLISIS DE PROTEÍNAS ............................................................. 78 II.5.1. Obtención de extractos totales de proteínas ................................................. 78 II.5.2. Fraccionamiento de proteínas de endospermo de semillas de Brachypodium 78 II.5.3. Cuantificación de proteínas ........................................................................... 79 II.5.4. Electroforesis de proteínas: SDS-PAGE........................................................... 79 II.5.5. Electroforesis bidimensional .......................................................................... 80 II.5.6. Tinción de proteínas en geles de poliacrilamida............................................. 80 II.5.7. Espectrometría de masas e identificación de proteínas ................................. 81 II.5.8. Análisis de proteínas mediante Western-blot ................................................ 81 II.6. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN ALMIDÓN Y β-GLUCANOS ......................... 82 II.7. TRANSFORMACIÓN DE BRACHYPODIUM DISTACHYON MEDIADA POR AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ................................................................................ 84 II.8. HERRAMIENTAS BIOINFÓRMATICAS ..................................................................... 86 III. RESULTADOS ......................................................................................................... 89 III.1. CARACTERIZACIÓN DE LA FAMILIA GÉNICA DE NTRC ........................................... 91 III.1.1. Estructura del gen NtrC ................................................................................ 91 III.1.2. Estudio filogenético de NTRC ........................................................................ 93 III.2. NTRC EN SEMILLAS DE CEREALES......................................................................... 97 III.2.1. Clonación del cDNA de NtrC de Brachypodium distachyon............................ 98 III.2.2. Estudio de procesos de splicing alternativo del gen NtrC ............................ 100 III.2.3. Caracterización del mensajero alternativo .................................................. 102 III.2.3.1. Mecanismo de formación del mensajero alternativo .......................... 102 III.2.3.2. Conservación del proceso de splicing alternativo en genes NtrC de plantas y expresión diferencial en tejidos fotosintéticos y heterotróficos .......... 103 III.2.3.3. Efecto de factores ambientales sobre el splicing alternativo del gen NtrC .......................................................................................................................... 107 III.2.3.4. El producto del mensajero alternativo del gen NtrC codificaría para una proteína truncada ............................................................................................. 109 III.3. GENERACIÓN DE PLANTAS DE BRACHYPODIUM CON NIVELES ALTERADOS DE NTRC EN SEMILLAS .................................................................................................... 112 III.3.1. Construcción del transgén .......................................................................... 113 ABREVIATURAS 3-PGA 3-Fosfoglicerato A Absorbancia ABA Acido Abscísico ADP Adenosín-5’-difosfato ADP-Glu ADP-glucosa AGPasa ADP-glucosa pirofosforilasa ATP Adenosín-5´-trifosfato BLAST Búsqueda de similitud de secuencias BE Enzima ramificante (Branching enzyme) cDNA Ácido desoxirribonucleico complementario DAF Días tras fertilización (Days after fetilization) DEPC Dietilpirocarbonato DNA Ácido desoxirribonucleico DNAsa Desoxirribonucleasa dNTP Desoxirribonucleosido 5´-trifosfato DO Densidad óptica DTT Ditiotreitol EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EMS Metanosulfonato de etilo FAD Flavín adenín dinucleotido Fd Ferredoxina FNR Ferredoxina NADP+ oxidoreductasa FTR Ferredoxina tiorredoxina reductasa g Gravedad estándar g Gramos GAs Giberelinas GBSS Almidón sintasa unida a gránulo (Granule Bound Starch Synthase) Glu-1-P Glucosa-1-fosfato Glu-6-P Glucosa-6-fosfato h Hora HSP Proteína de choque térmico (Heat Shock Protein) IBVF Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis ISA Isoamilasas IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosido Kb Kilobase kDa Kilodalton l Litro LB Medio Luria-Bertani LDA Pululanasas (Limit Dextrinase) LEA Late Embriogenesis Abundant Protein LS Medio Linsmaier-Skoog MS Medio Murashige-Skoog mRNA Ácido ribonucleico mensajero NAD(P)+ Nicotinamida-adenín-dinucleotido-fosfato NAD(P)H Nicotinamida-adenín-dinucleotido-fosfato reducido NMD Nonsense-mediated mRNA decay NTR NADPH tiorredoxina reductasa p/v Relación peso/volumen PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida pb Pares de bases PCR Reacción en cadena de la polimerasa PGI Glucosa-6-fosfato isomerasa (Phosphoglucose Isomerase) PGM Fosfoglucomutasa (Phosphoglucose Mutase) Pi Fosfato inorgánico pI Punto isoeléctrico PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo PPi Pirofosfato Prx Peroxirredoxina PCD Muerte celular programada (Programmed Cell Death) qPCR PCR cuantitativa en tiempo real RNA Ácido ribonucleico RNAsa Ribonucleasa ROS Especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxigen Species) r.p.m. Revoluciones por minuto RT Retrotranscripción s Segundo SBE Enzima ramificante del almidón (Starch Branching Enzyme) SDE Enzima desramificante del almidón (Starch Debranching Enzyme) SDS Sodio dodecil sulfato SS Almidón sintasa SSS Almidón sintasa soluble SUS Sacarosa sintasa Taq polimerasa Polimerasa de Thermus aquaticus TBE Tampón de electroforesis Tris-borato/EDTA TBS Tampón Tris-NaCl TCA Acido tricloro acético TE Tampón Tris-borato/EDTA TEMED N,N,N´,N´-Tetra-metil-etil-diamida TGM Tampón Tris-Glicina-Metanol Tris Tris-(hidroximetil) aminometano Tritón X-100 t-Octilfenoxipolietilensorbitano Trx Tiorredoxina Tween-20 Monolaurato de polioxietilensorbitano UDP Uridín-5’-difosfato UDP-Glu UDP-glucosa UDPGP UDP-glucosa pirofosforilasa UV Ultravioleta V Voltio v/v Relación volumen/volumen X-gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido λ Longitud de onda °C Grados centígrados BASES NITROGENADAS A Adenina C Citosina G Guanina T Timina AMINOÁCIDOS A Ala Alanina L Leu Leucina R Arg Arginina K Lys Lisina N Asn Asparragina M Met Metionina D Asp Ácido Aspártico F Phe Fenilalanina C Cys Cisteína P Pro Prolina E Glu Ácido Glutámico S Ser Serina Q Gln Glutamina T Thr Treonina G Gly Glicina W Trp Triptófano H His Histidina Y Tyr Tirosina I Ile Isoleucina V Val Valina I. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 23 I.1. LA SEMILLA DE CEREALES Las semillas son la unidad de propagación empleada por las plantas superiores para la perpetuación de la especie y, a su vez, constituyen la forma en la que la planta comienza su ciclo de vida. Su aparición, hace aproximadamente 360 millones de años, marcó la evolución de las plantas terrestres haciendo posible la expansión de estos organismos a multitud de hábitats, incluyendo los más extremos, gracias a su tolerancia a la desecación y a su capacidad de controlar la germinación bajo condiciones ambientales óptimas. Las reservas acumuladas en las semillas garantizan el aporte energético a la nueva planta hasta que adquiera una completa capacidad fotosintética. Semillas como las de cereales, leguminosas y oleaginosas almacenan compuestos ricos en hidratos de carbono, proteínas y lípidos, respectivamente, considerándose una fuente importante para la alimentación humana y para la ganadería. En concreto, las semillas de cereales han sido el principal componente de la dieta humana a lo largo de la historia. Desde su domesticación hasta la actualidad, han jugado un papel importante tanto en el origen de las civilizaciones (el hombre pasó de nómada a sedentario cuando se hizo agricultor) como en la evolución de las mismas. En la actualidad, los cereales constituyen la principal fuente de calorías de la población mundial, siendo uno de los cultivos más importantes con una producción anual de semillas que supera los 2.300 millones de toneladas (Mt) en comparación con los 241 Mt de semillas de leguminosas (Glemin and Bataillon, 2009). Según los últimos datos recogidos por la FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations), del conjunto de cereales cultivados actualmente, el maíz (872 Mt), arroz (738 Mt), trigo (631 Mt) y cebada (132 Mt) son los que presentan una mayor importancia económica, siendo con diferencia los cereales más extendidos mundialmente. La base de la importancia económica que representan los cereales reside en el alto contenido de almidón que acumulan en sus semillas, llegando en algunos casos a representar hasta el 78% de su peso seco (Hannah and James, 2008; Nagai et al., 2009). Además de servir como alimento, el almidón tiene importantes aplicaciones INTRODUCCIÓN 24 industriales: fabricación de pegamentos, emulsionantes, papel, uso en las industrias farmacéutica, textil, aplicaciones médicas, etc (Ellis et al., 1998). En la actualidad, el uso de almidón como materia prima para la producción tanto de biopolímeros como de bioalcoholes (Ariel et al., 2009), presenta gran interés como alternativa energética, ante la creciente preocupación por la dependencia de las fuentes de energía no renovables (Gray et al., 2006). Asimismo, los cereales acumulan una cantidad considerable de proteínas por lo que también son una importante fuente de nitrógeno. Esto incrementa su valor nutricional y económico ya que estas proteínas poseen también utilidad industrial, como por ejemplo el gluten de trigo que es de gran utilidad en la fabricación de pan, harinas o pastas (Shewry and Halford, 2002; Larre et al., 2010). I.1.1. Estructura y composición de la semilla de cereales Los cereales pertenecen a la familia de las gramíneas (Poaceae). Se caracterizan por ser plantas anuales o perennes, con raíces numerosas, fasciculadas y poco profundas. Los tallos son cilíndricos, por lo común huecos, a excepción de los nudos donde se insertan las hojas de tipo lineal o lanceolada. Sus flores son hermafroditas (excepto la del maíz) y presentan una estructura floral muy característica en inflorescencias, denominadas espigas o panículas. Los frutos son por lo general grandes, llamados granos o cariópsides, y sus cubiertas se encuentran soldadas a las semillas. Estos granos constan principalmente de un embrión situado en un extremo y un endospermo que contiene las sustancias de reserva energética necesarias durante la germinación. Cubriendo al endospermo se encuentran una serie de capas con distinto origen celular, de más interna a más externa se localizan la aleurona, el tejido nucelar, la testa y el pericarpo (Figura I. 1). En la espiga, los granos se encuentran además protegidos por dos cubiertas adicionales, denominadas lema y palea. INTRODUCCIÓN 25 A continuación, se describe en mayor profundidad cada una de las partes que conforman el grano, así como su composición:  Embrión. El embrión es el resultado de la fertilización de la ovocélula del saco embrionario por uno de los núcleos espermáticos del tubo polínico. Es la parte del grano capaz de convertirse en una nueva planta. Está definido por el eje embrionario, el cual es diferente al de dicotiledóneas. En este caso, el único cotiledón se encuentra muy reducido y modificado formando el escutelo. La envoltura basal del cotiledón se encuentra alargada formando el coleoptilo, que cubre a la primera hoja. Tras el coleoptilo se encuentra el mesocotilo y en el otro extremo del embrión se halla la radícula protegida por la coleorriza (Figura I. 2). El escutelo se localiza entre el eje embrionario y el endospermo. Posee un epitelio capaz de secretar enzimas hidrolíticas al endospermo y, a su vez, de absorber los productos procedentes de la degradación de las sustancias de reserva y transportarlas hasta el embrión. El embrión junto con el escutelo contienen la concentración de lípidos más alta del grano, además de vitaminas liposolubles y, en más bajas concentraciones, algunos azúcares solubles (Evers and Millar, 2002). Debido a esta composición, durante el inicio de la germinación las células del escutelo pueden comenzar rápidamente la biosíntesis de proteínas. Figura I. 1. Composición histológica del grano de trigo. Adaptado de Encyclopaedia Britannica (1996) (https://global.britannica.com). INTRODUCCIÓN 32 celulares, permitiendo a las cubiertas seminales soportar la expansión del embrión. Esta fase finaliza con la emergencia de la radícula.  Fase III: Fase post-germinativa. Durante esta última fase se produce la movilización total de las reservas para soportar el crecimiento de la plántula hasta que sea fotosintéticamente activa. El proceso de la germinación está altamente regulado por hormonas, en el que los niveles de giberelinas (GAs) y ABA juegan un papel importante. Ambas hormonas poseen papeles antagónicos: mientras que el ABA inhibe la germinación, mediante la inhibición de la síntesis de enzimas hidrolíticas y la emergencia radicular (Bewley, 1997; Hoecker et al., 1999; Moreno-Risueno et al., 2007), las GAs son activadoras. El balance final de los niveles de ambas hormonas determina el potencial germinativo de la semilla (Finkelstein et al., 2002). Durante las etapas tempranas de la germinación, las GAs son liberadas por el embrión al endospermo de reserva y, al ser detectadas por las células de aleurona, inducen la síntesis de novo y liberación de enzimas hidrolíticas (α-amilasas, glucanasas y proteasas) al endospermo (Figura I. 6). Estas enzimas producen la degradación de los compuestos de reserva que serán absorbidos por el embrión como fuente de energía para el desarrollo de la nueva plántula (Fincher, 1989). A lo largo de esta etapa se produce también una acidificación del endospermo que favorece la solubilización de los compuestos de reserva (Hamabata et al., 1988) y a su vez, es necesaria para una óptima actividad de las proteasas que participan en su movilización (Jacobsen and Varner, 1967; Mikola and Mikola, 1980; Domínguez and Cejudo, 1999). Además, la acidificación favorece el transporte de los azúcares y aminoácidos hacia el embrión (Sopanen et al., 1980; Hardy and Payne, 1991). Una vez que finaliza la movilización de los compuestos de reserva, las GAs inducen la muerte de las células de la aleurona (Domínguez and Cejudo, 1999; Fath et al., 2002; Domínguez et al., 2004). INTRODUCCIÓN 33 Ya que muchos de los genes de respuesta a GAs codifican proteínas implicadas en las rutas de señalización de hormonas como etileno, jasmonato, brasinoesteroides y auxinas, se ha sugerido la posible participación de estas hormonas en el proceso de germinación (Kegui and and Yong-Qiang, 2006). I.1.3. Generación y función de las especies reactivas de oxígeno en semillas Las especies reactivas de oxígeno o ROS (Reactive Oxygen Species) son un grupo de radicales libres y moléculas reactivas que derivan del oxígeno (O2) y cuya acumulación puede tener efectos tóxicos en la célula. La reducción del O2 (Figura I. 7) conduce a la formación de anión superóxido (O2-), el cual posee un electrón desapareado que puede reaccionar con otras moléculas para estabilizarse, constituyendo una molécula con un fuerte carácter oxidante. A pesar de ello, se considera una molécula moderadamente reactiva ya que posee un tiempo de vida corto y una baja tasa de difusión. El O2-, en presencia de H+ o por acción de la superóxido dismutasa, da lugar a peróxido de hidrógeno (H2O2), una molécula moderadamente reactiva, con un tiempo de vida de aproximadamente 1 ms y con capacidad de difundir a través de las membranas al ser eléctricamente neutra, lo que le permite actuar a distancia de su sitio de producción. Mediante las reacciones de Haber-Weiss y Fenton, en las que participan tanto O2- como el H2O2, se genera en presencia de metales de transición (especialmente hierro) el radical hidroxilo •OH, que Figura I. 6. Representación de los procesos asociados a la germinación de las semillas de cereales. 1. Liberación de GAs por el embrión. 2. Estimulación de la síntesis de hidrolasas. 3. Degradación de las reservas. 4. Transporte de nutrientes al embrión. INTRODUCCIÓN 34 es el más reactivo de todos los radicales de oxígeno y tiene un tiempo de vida muy corto (Sharma et al., 2012). Las ROS son producidas continuamente en las plantas como subproductos del metabolismo aerobio que tiene lugar en diferentes compartimentos celulares: cloroplastos, mitocondrias y peroxisomas. Además, se producen por actividades enzimáticas localizadas en membranas plasmáticas y paredes celulares, entre otros (Gill and Tuteja, 2010). Para controlar los niveles internos de ROS las células han desarrollado eficientes mecanismos antioxidantes que incluyen a sistemas enzimáticos como superóxido dismutasa, catalasas, peroxirredoxinas, ascorbato peroxidasa, monodehidroascorbato reductasa, dehidroascorbato reductasa y glutatión reductasa, y sistemas no enzimáticos formados por moléculas con capacidad antioxidante como ascorbato, glutatión, carotenoides, tocoferoles y compuestos fenólicos (Apel and Hirt, 2004). En condiciones normales, en la célula existe un equilibrio entre la producción de ROS y su eliminación, pero este equilibrio puede verse alterado por diversos factores de estrés como sequía, salinidad, temperaturas extremas, radiación UV, Figura I. 7. Representación esquemática de la producción de ROS en plantas. La activación del O2 puede tener lugar por dos mecanismos diferentes. Por una parte, la transferencia de energía al O2 conduce a la formación de 1O2. Por otra, la reducción monovalente del O2 conduce secuencialmente a la formación de O2-, H2O2 y •OH. La formación de H2O2 puede ocurrir de forma espontánea o mediante la actuación de la superóxido dismutasa (SOD). El H2O2 es convertido en H2O por acción de las ascorbato peroxidasas (APX), catalasas (CAT) y peroxirredoxinas (PRX), entre otras enzimas. Adaptado de Sharma et al. (2012). INTRODUCCIÓN 35 presencia de metales pesados o ataque por patógenos, que incrementan su producción. Cuando los niveles de estas moléculas en la célula son elevados, ésta entra en estado de estrés oxidativo en el que se produce la oxidación de proteínas, inactivación de enzimas, peroxidación de lípidos y daños en el DNA, desencadenando finalmente la activación de los programas de muerte celular (Sharma et al., 2012). Además de su efecto tóxico, las ROS ejercen una importante función como mensajeros secundarios. Por ejemplo, la función señalizadora del H2O2 se relaciona con procesos como la activación de muerte celular programada (Fath et al., 2002; Pellinen et al., 2002), el cierre estomático mediado por ABA (Pei et al., 2000), la respuesta al gravitropismo en raíces mediada por auxinas, y la regulación de la expresión génica (Joo et al., 2001). Así pues, los sistemas antioxidantes presentes en las células no sólo deben proteger frente al daño oxidativo generado por la acumulación de ROS sino también ser capaces de equilibrar los procesos de producción y retirada de los mismos, con la finalidad de conservar la función señalizadora de estas especies (Mittler et al., 2004). Las ROS están presentes y son necesarias durante el ciclo de vida de la semilla. Desde el desarrollo hasta la germinación el contenido hídrico y la actividad metabólica de la semilla varían considerablemente, por lo que las principales fuentes de producción de estas moléculas difieren en cada etapa. En el caso de semillas ortodoxas, como las de cereales, la respiración mitocondrial es muy intensa durante la embriogénesis y va decayendo a medida que la semilla madura inicia la fase de desecación, hasta convertirse en nula al entrar en estado quiescente. Una vez que la semilla se embebe en agua y comienza la germinación, la respiración se reanuda. De este modo, las mitocondrias constituyen una de las mayores fuentes de ROS durante el desarrollo y la germinación, de forma que del 2 al 3 % del oxígeno utilizado en la respiración genera O2- y H2O2 (Bailly et al., 2008). Los cloroplastos también constituyen una importante fuente de ROS pero sólo en etapas muy tempranas del desarrollo, ya que rápidamente se convierten en no funcionales. Las otras dos fuentes de producción a considerar son las formadas por los peroxisomas y las NADPH oxidasas presentes en las membranas plasmáticas. Una vez que las semillas entran en estado de dormición, la actividad enzimática cesa casi en su totalidad y probablemente la producción de ROS INTRODUCCIÓN 36 sea debida a procesos oxidativos no enzimáticos como las reacciones de Amadori y Maillard (Bailly et al., 2008; Edeas et al., 2010). En semillas, la producción de este tipo de moléculas se ha asociado durante mucho tiempo con procesos perjudiciales que generan su pérdida de viabilidad (El- Maarouf-Bouteau and Bailly, 2008). Sin embargo, estudios recientes han puesto de manifiesto la importancia de las ROS en los procesos de desarrollo y germinación de la semilla (Figura I. 8). Durante el desarrollo, la producción de ROS juega un papel primordial tanto en la embriogénesis como en el correcto llenado de la semilla, participando además en la deposición de lignina en las paredes celulares (Bailly, 2004; Karkonen and Kuchitsu, 2015). Por otra parte, se ha demostrado que la aplicación exógena de H2O2 en semillas maduras de cereales favorece la ruptura de la dormición y promueve la germinación (Naredo et al., 1998), generando una disminución en los niveles endógenos de ABA (Wang et al., 1995). Estos resultados sugieren que la salida del estado de dormición estaría relacionada con los niveles de estas moléculas oxidantes. Se ha propuesto que durante el desarrollo de la semilla el ABA contribuiría a mantener los niveles de enzimas antioxidantes elevados, generando como consecuencia bajos niveles de ROS. Una vez que la semilla alcanzase la madurez se produciría una acumulación de ROS de origen no enzimático, que contribuiría a disminuir los niveles de ABA e incrementar los de GAs. A su vez, esta situación provocaría la oxidación de proteínas y activación de factores de trascripción que participan en la germinación. En este sentido, se ha propuesto la necesidad de un nivel óptimo de ROS, denominado “ventana oxidativa de la germinación”, para alcanzar con éxito la germinación, ya que su acumulación en exceso generaría un daño oxidativo que tendría un efecto contraproducente. Así, se ha descrito que la acumulación de un exceso de ROS debido a la pérdida de función de la principal ascorbato peroxidasa de semillas (APX6), en Arabidopsis, produce una disminución de la tasa de germinación, debido al aumento de los niveles de ABA y el consiguiente efecto sobre rutas de señalización que regulan la dormición (Chen et al., 2014). INTRODUCCIÓN 37 En la fase de germinación, la reactivación del metabolismo provoca cambios celulares y moleculares que van acompañados de una importante producción de ROS. La presencia de radicales hidroxilo en las paredes celulares sugiere su participación en la degradación de las mismas, debilitando la estructura del endospermo durante la germinación, proceso necesario para el crecimiento de los nuevos tejidos (Liszkay et al., 2004). Además estas moléculas estarían implicadas en la movilización de compuestos de reserva mediante la carbonilación de proteínas, un proceso de oxidación irreversible que incrementa la susceptibilidad de las proteínas a la rotura proteolítica (Job et al., 2005). También se ha propuesto que las ROS podrían participar en el crecimiento polar a través de su efecto sobre los canales de calcio (Gapper and Dolan, 2006) y que las auxinas podrían promover el crecimiento celular mediante la producción de superóxido y la consiguiente generación de radicales hidroxilos (Schopfer et al., 2002; Kawano, 2003). Por otra parte, las células que componen la capa de aleurona, una vez que cumplen su función, experimentan un proceso de muerte celular programada regulado hormonalmente por giberelinas (Domínguez et al., 2004) en el que también participa el peróxido de hidrógeno originado en los glioxisomas y mitocondrias tras la activación del metabolismo lipídico y la respiración celular (Fath et al., 2001; Fath et al., 2002). Figura I. 8. Funciones de las ROS en semillas de cereales. Diferentes estímulos externos (estrés biótico y abiótico) e internos (señales del desarrollo y metabolismo celular) inducen la formación de ROS (negro). Estas ROS pueden actuar como moléculas señalizadoras capaces de promover diferentes procesos en respuesta a dichos estímulos (azul) o generar daños oxidativos irreparables que conducen a la muerte celular (rojo). INTRODUCCIÓN 38 Finalmente, se ha propuesto que la acumulación de ROS intracelular podría constituir un mecanismo de defensa frente a la infección por microorganismos, ya sea por el efecto tóxico que ejerce sobre ellos o por la activación de la respuesta hipersensible y muerte celular programada. Este mecanismo es importante porque la fase de emergencia de raíz y cotiledón es uno de los momentos de mayor susceptibilidad al ataque por patógenos (Lamb and Dixon, 1997; Grant and Loake, 2000). I.1.4. Regulación redox en plantas Situaciones ambientales que generan estrés, tanto biótico como abiótico, junto con la actividad metabólica celular generan ROS que pueden alterar el estado redox de la célula y provocar estrés oxidativo. Con el objetivo de evitar o minimizar posibles daños celulares, las plantas han desarrollado un complejo sistema de regulación redox que engloba a múltiples componentes, capaces de actuar a distintos niveles: a corto plazo, mediante regulación de actividades enzimáticas, y a largo plazo, mediante el control de los procesos de transcripción y traducción (Oelze et al., 2008). El principal mecanismo de regulación redox de la actividad enzimática se basa en la reducción u oxidación reversible de los grupos tiólicos de residuos de cisteína (Cys), permitiendo el control rápido de la actividad de enzimas sensibles a regulación redox (Jacob et al., 2006). Los residuos de Cys pueden encontrarse en distintos estados de oxidación. El grupo sulfidrilo (-SH) se puede oxidar a sulfénico (-SOH), sulfínico (-SO2H) o sulfónico (-SO3H). Además, puede participar en la formación de puentes disulfuro intra o intermoleculares, experimentar S-glutationilación o S-nitrosilación (-SNO) (Michelet et al., 2013). En condiciones fisiológicas, aunque el potencial redox del citoplasma celular sea favorable para mantener los grupos sulfhidrilos en estado reducido, estos grupos tienden a oxidarse a sulfénico y sulfínico o a formar puentes disulfuro (intra o intermoleculares). Estos estados de oxidación son reversibles, pudiendo volver las Cys a la forma reducida. Cuando las condiciones son altamente oxidantes, los grupos tioles pueden oxidarse hasta sulfónico, un estado irreversible que provoca la inactivación de la proteína y, eventualmente, favorece su degradación (Montrichard et al., 2009). INTRODUCCIÓN 39 Estos cambios en el estado de oxidación de los residuos de Cys tienen un efecto importante sobre la conformación de las proteínas afectando por tanto a su actividad, solubilidad o susceptibilidad a proteasas (Balsera et al., 2014). En la actualidad, se sabe que la regulación redox de proteínas constituye un mecanismo de regulación universal, que opera en todo tipo de organismos desde bacterias a animales y plantas, y afecta a multitud de procesos biológicos como la fotosíntesis, transcripción, división celular, señalización, destoxificación de ROS o germinación de semillas (Montrichard et al., 2009). El mantenimiento del estado redox de las proteínas es por tanto de gran importancia y en el mismo participan diferentes intermediarios entre los que se encuentran tiorredoxinas (Trx) y glutarredoxinas (Grx), proteínas pequeñas con actividad disulfuro reductasa (Rouhier et al., 2015). I.1.4.1. Tiorredoxinas Las Trx son proteínas pertenecientes a una gran familia de enzimas con actividad disulfuro reductasa, que están presentes en todos los tipos de organismos. Poseen un pequeño tamaño (12-14 KDa) y comparten una estructura característica denominada plegamiento tiorredoxina, compuesta por 3 α-hélices que rodean a 4 hojas β antiparalelas (Figura I. 9A). Su centro activo está compuesto por dos Cys, que forman parte de una secuencia consenso muy conservada, WCGPC (Schurmann and Jacquot, 2000). Mientras los organismos heterotróficos contienen un bajo número de Trxs, normalmente dos, las plantas tienen una compleja familia génica para estas proteínas codificadas por al menos 25 genes (Meyer et al., 2005). Esta variedad de Trxs de plantas se clasifican atendiendo a sus características y localización celular. El cloroplasto contiene un elevado número de Trxs, que se clasifican en distintos tipos. En el caso de Arabidopsis, las Trxs cloroplastídicas son de tipo f (f1 y f2), m (m1, m2, m3 y m4), y (y1, y2), x y z, de las que hay sólo una isoforma (Meyer et al., 2002). Las Trxs de tipos f y m están implicadas en la regulación de la actividad de enzimas del metabolismo primario del carbono, como el ciclo de Calvin-Benson, así como otras vías metabólicas (Schurmann and Buchanan, 2008). Las Trxs tipo y y x participan en la defensa frente a estrés oxidativo (Collin et al., 2003; Collin et al., 2004) y la Trx z INTRODUCCIÓN 40 participa en la transcripción de genes plastídicos (Arsova et al., 2010; Meng et al., 2010). Además, las plantas tienen Trxs en otros compartimentos celulares. Entre éstas se encuentran las de tipo h, que fueron inicialmente clasificadas como citosólicas pero que muestran también localización nuclear (Serrato and Cejudo, 2003), apoplástica (Zhang et al., 2011), y en la membrana plasmática (Meng et al., 2010). En mitocondrias se han descrito Trxs de tipo o (o1, o2) (Gelhaye et al., 2004). Por último, se ha identificado un nuevo tipo de Trx, tipo s, localizada en retículo endoplasmático y presente exclusivamente en los nódulos de leguminosas, donde ejerce un papel primordial en la simbiosis (Alkhalfioui et al., 2008). La actividad disulfuro reductasa de las Trxs permite la reducción de puentes disulfuro en proteínas diana, modulando así la actividad de las mismas. Además, esta actividad es también importante en mecanismos de destoxificación de ROS, lo que contribuye al mantenimiento del equilibrio redox celular (Michelet et al., 2013). En la Figura I. 9B se describe el mecanismo de acción de las Trxs: una de las Cys de su sitio activo está desprotonada en forma de tiolato y lleva a cabo un ataque nucleofílico sobre uno de los átomos de azufre que se encuentra formando un puente disulfuro en la proteína diana, formándose un disulfuro mixto, que es inestable. Posteriormente, el Figura I. 9. Estructura terciaria de la Trx h1 de cebada (A) (Hagglund et al., 2016). Mecanismo de reacción de las Trxs (B). La primera Cys del sitio activo realiza un ataque nucleofílico sobre uno de los átomos de azufre que forma parte del puente disulfuro de la proteína diana, generándose un complejo intermediario inestable. Un segundo ataque nucleofílico por parte de la segunda Cys del sitio activo rompe este complejo, liberando la Trx oxidada y la proteína diana reducida. Adaptado de Balsera et al. (2014). INTRODUCCIÓN 41 grupo tiol de la segunda Cys del sitio activo de la Trx ataca a este disulfuro intermediario, provocando la liberación de la Trx en forma oxidada y de la proteína diana reducida (Balsera et al., 2014). Para que se produzca un nuevo ciclo catalítico, la Trx oxidada debe ser nuevamente reducida. En plantas, la reducción de las Trxs se lleva a cabo por dos sistemas (Figura I. 10): el que utiliza el poder reductor de la Ferredoxina (Fd) reducida por la cadena fotosintética transportadora de electrones, que utiliza una Trx reductasa dependiente de Fd (FTR) exclusiva del plastos y el que depende de NADPH, que utiliza la reductasa dependiente de NADPH (NTR), presente en citosol y mitocondria (Montrichard et al., 2009). El sistema FTR/Trx utiliza Fd como donador de poder reductor. En el caso de los cloroplastos la Fd reducida es generada por la cadena fotosintética de transporte de electrones, mientras que en el caso de amiloplastos es generada por la Fd-NADP+ reductasa (FNR) a partir del NADPH procedente del metabolismo de azúcares. Posteriormente, la FTR, una proteína heterodimérica compuesta por una subunidad variable y otra catalítica, transfiere el poder reductor a las Trxs (Schurmann and Jacquot, 2000; Balmer et al., 2006). En el segundo sistema, las Trxs citosólicas, nucleares y mitocondriales son reducidas por NTRs, unas flavoproteínas pertenecientes a la familia de las piridín nucleótido oxidorreductasas. Estas proteínas poseen FAD como grupo prostético, de forma que los electrones son transferidos Figura I. 10. Sistemas de reducción de Trxs. El sistema Fd/FTR/Trx se encuentra tanto en cloroplastos, donde las Fd son reducidas a partir del fotosistema I (PSI), como en amiloplastos, donde las Fd son reducidas a partir de ferredoxinas NADP+ reductasas (FNR) (A); mientras que el sistema NTR/Trx se ha descrito en el citosol y mitocondrias (B). Adaptado de Balmer et al. (2006) INTRODUCCIÓN 48 almidón. A pesar de esta diferencia, en ambos tipos de tejidos se distinguen 4 pasos básicos que consisten en: activación del sustrato, elongación, ramificación y desramificación del polímero (Jeon et al., 2010; Pfister and Zeeman, 2016).  Activación del sustrato. En plantas, la ADP-glucosa (ADP-Glu) constituye el donador de residuos de glucosa al polímero de almidón en crecimiento. Este metabolito se sintetiza a partir de ATP y glucosa-1-fosfato (Glu-1-P) mediante una reacción catalizada por la enzima AGPasa. Aunque in vitro esta reacción es reversible, in vivo la degradación del pirofosfato desplaza la reacción hacia la formación de ADP-Glu garantizando de este modo la irreversibilidad del proceso (Tiessen et al., 2011). Esta reacción se considera un paso limitante de la síntesis de almidón y constituye un punto clave de regulación del proceso. El endospermo de semillas de cereales presenta una peculiaridad respecto a otros órganos sumideros y es la existencia de dos isoformas distintas de AGPasa, una citosólica y otra plastidial. La ADP-Glu sintetizada en el citosol es importada al plasto a través de un tipo de transportador de nucleótidos de adenina específico de este tipo de tejido. El estudio de mutantes afectados en la isoforma citosólica de la AGPasa (Johnson et al., 2003) o en el transportador de ADP-Glu (Patron et al., 2004), ha demostrado que en el endospermo la síntesis de ADP-Glu tiene lugar mayoritariamente en el citosol.  Elongación del polímero de almidón. Durante este paso, la almidón sintasa (SS, Starch Synthase) se encarga de transferir el grupo glucosilo de la ADP-Glu al extremo no reductor del polímero de almidón en crecimiento, formando enlaces glucosídicos α-1,4. Se han identificado distintas isoformas de SS codificadas por diferentes genes. Las SS solubles (SSI, SSII, SSIII y SSIV) están implicadas en la síntesis de amilopectina (Hirose and Terao, 2004; Tetlow et al., 2004) mientras que la SS asociada a gránulo (GBSS, Granule Bound Starch Synthase) participa en la síntesis de amilosa (Tetlow et al., 2004). Además, se ha comprobado que en el endospermo de cereales existen varias isoformas para algunas INTRODUCCIÓN 49 de las SS y que su patrón de expresión varía a lo largo del desarrollo de la semilla, agrupándose en SS de expresión temprana, tardía o constitutiva.  Ramificación del polímero de almidón. Las enzimas ramificantes (BE, Branching Enzyme) catalizan la ramificación del polímero de amilopectina rompiendo enlaces glucosídicos -1,4 por el extremo no reductor de la cadena de poliglucano y uniéndolo al C6 de una molécula de glucosa de la misma u otra cadena mediante un enlace glucosídico α-1,6. En plantas se han descrito dos tipos de enzimas ramificantes, con diferencias en la secuencia de aminoácidos, especificidad y patrón de expresión. Además, estás enzimas también presentan un patrón de expresión espacio-temporal específico (Tetlow et al., 2004).  Desramificación del polímero de almidón. Las enzimas desramificantes (DBE, Debranching Enzyme), isoamilasas (ISA) y dextrinasas límite o pululanasas (LDA), catalizan la hidrólisis de enlaces glucosídicos α-1,6 característicos de la amilopectina (Le et al., 2010). Aunque estas enzimas se han relacionado con el proceso de degradación del almidón, estudios de plantas mutantes deficientes en esta actividad han puesto de manifiesto su participación en la síntesis del gránulo de almidón (Fujita et al., 1999; Dinges et al., 2003; Li et al., 2009). En concreto, de las tres isoformas de isoamilasas presentes en plantas, ISA1 e ISA2 están implicadas en la desramificación durante la síntesis de amilopectina. Aunque el modelo de biosíntesis de almidón descrito anteriormente es el más aceptado, se ha propuesto un modelo alternativo según el cual la sacarosa sintasa cataliza en el citosol la síntesis de novo de ADP-Glu (Baroja-Fernández et al., 2003). La ADP-Glu es transportada al plasto por medio de un translocador específico y, una vez en el interior, es sustrato del conjunto de enzimas y reacciones descritas anteriormente. Sin embargo, aunque se ha demostrado in vitro que la SUS puede producir ADP-Glu y fructosa a partir de sacarosa y ADP, se considera que in vivo su función es la producción de UDP-Glu y fructosa (Streb et al., 2009; Stitt and Zeeman., 2012). INTRODUCCIÓN 50 Figura I. 12. Rutas de síntesis de almidón en células fotosintéticas (A) y heterotróficas (B). La reacción resaltada en el triángulo verde es exclusiva del endospermo de cereales. Las flechas punteadas en azul indican una posible reacción catalizada por la SUS en células heterotróficas, según lo descrito por Baroja-Fernández et al. (2003). Imagen adaptada de Tuncel and Okita (2013). Las abreviaturas corresponden a: PGI, fosfoglucosa isomerasa; PGM, fosfoglucomutasa; AGPasa, ADP-glucosa pirofosforilasa; SUS, sacarosa sintasa; UGPasa, UDP-glucosa pirofosforilasa; SSs, almidón sintasa; SBEs, enzimas ramificantes; DBE, enzimas desramificantes; FK, fructoquinasa. INTRODUCCIÓN 51 I.1.5.2. Estructura y regulación de la AGPasa La AGPasa cataliza el paso limitante de la síntesis de almidón, por este motivo esta enzima ha sido objeto de estudio y de múltiples aproximaciones biotecnológicas destinadas a la alteración de los niveles de almidón. En plantas superiores la AGPasa tiene localización plastidial aunque en el endospermo de cereales existe también una isoforma citosólica con algunas propiedades diferentes. La presencia en este tejido de ambas isoformas podría suponer una ventaja para la semilla, ya que de este modo se asegura la canalización del carbono hacia la formación de almidón (Comparot-Moss and Denyer, 2009). Estructuralmente, se trata de una enzima heterotetramérica (α2β2) compuesta por dos subunidades grandes y dos subunidades pequeñas, codificadas cada una de ellas por más de un gen (Saripalli and Gupta, 2015). Las subunidades pequeñas mantienen un elevado grado de identidad entre ellas (85 – 95 %), mientras que las grandes están menos conservadas (50 – 60 %) (Smith-White and Preiss, 1992). Además, en el endospermo de semillas de cereales se ha demostrado que los distintos tipos de subunidades se expresan con patrones espacio-temporales diferentes asociados al estado de desarrollo (Lee et al., 2007). Tanto las subunidades grandes como las pequeñas son necesarias para la óptima actividad de la enzima. Tradicionalmente se ha descrito que la actividad catalítica de la enzima reside en las subunidades pequeñas, mientras que la función reguladora reside en las subunidades grandes (Ballicora et al., 1995). Sin embargo, estudios más recientes rompen, en parte, con esta visión proponiendo que ambas subunidades son necesarias para la correcta regulación y actividad de la enzima actuando de forma sinérgica (Cross et al., 2004; Tuncel et al., 2014). La AGPasa está sujeta a un complejo mecanismo de regulación que actúa a diferentes niveles. De este modo, la célula asegura una actividad enzimática acorde a sus necesidades. Los principales mecanismos de regulación son: regulación transcripcional, regulación alostérica por medio de metabolitos y control redox post-traduccional (Geigenberger, 2011) (Figura I. 13). INTRODUCCIÓN 52  Regulación transcripcional. Se trata de un mecanismo de control a largo plazo sobre los niveles de expresión de los genes que codifican para la AGPasa. Aunque se desconocen el mecanismo y la cascada de señalización que conducen a esta regulación, se ha comprobado que el incremento de azúcares provoca un aumento en los niveles de mRNA de algunos de los genes que codifican para esta enzima (Muller-Rober et al., 1990; Sokolov et al., 1998; Crevillen et al., 2005). Por el contrario, los niveles elevados de nitrato o fosfato producen una disminución de los mismos (Nielsen et al., 1998). Mediante este mecanismo de regulación, puede controlarse la acumulación de almidón en respuesta a cambios en las condiciones ambientales o nutricionales.  Regulación alostérica. A nivel post-traduccional, la AGPasa se regula alostéricamente por metabolitos intermediarios de las diferentes vías de asimilación del carbono, que actúan como indicadores del estado energético de la célula. Así, se ha demostrado que el 3-fosfoglicerato (3-PGA) actúa como activador de la AGPasa mientras que el PPi actúa como inhibidor (Ghosh and Preiss, 1966). Las isoformas citosólicas de la enzima presentes en el endospermo de cereales son en gran medida Figura I. 13. Mecanismos de regulación de la AGPasa plastidial. La regulación alostérica permite un ajuste rápido de la actividad de la AGPasa en función de los niveles de intermediarios fosforilados. Mediante la regulación redox se producen cambios graduales en la actividad de la AGPasa. La regulación transcripcional ejerce el control a largo plazo, permitiendo el ajuste de la tasa de síntesis de almidón. En hojas de Arabidopsis las subunidades APS1 y APL1 han sido identificadas como posibles dianas de fosforilación reversible, sin embargo, aún se desconoce la relevancia de dicho mecanismo en la regulación de la AGPasa in vivo. En azul se resaltan los elementos activadores de la AGPasa y en rojo los inhibidores. Adaptado de Geigenberger (2011). INTRODUCCIÓN 53 insensibles a estos efectores (Doan et al., 1999; Gómez-Casati and Iglesias, 2002; Ballicora et al., 2004).  Regulación redox. Las AGPasas plastidiales de plantas están sujetas a este mecanismo de regulación post-transduccional. La reducción de un puente disulfuro formado entre dos Cys de las subunidades pequeñas provoca su monomerización y la consiguiente activación de la enzima. La reducción de la enzima provoca un cambio drástico en sus propiedades cinéticas, debido a un incremento de la afinidad por el sustrato y de mayor sensibilidad al activador alostérico 3-PGA e insensibilidad al inhibidor PPi (Tiessen et al., 2002 ). Se ha demostrado que tanto las Trxs como NTRC están implicadas en la regulación redox de la AGPasa en plastos. Estudios recientes en arroz han puesto de manifiesto que, aunque la AGPasa citosólica de cereales no conserva la Cys reguladora de la subunidad pequeña, sí podría estar sometida a regulación redox a través de dos Cys (Cys47 y Cys58 en arroz) presentes en la subunidad grande L2. Se ha demostrado mediante ensayos in vitro que mutantes de AGPasa alterados en estos residuos poseen menor actividad catalítica y menor sensibilidad al 3-PGA, abriendo también la posibilidad de la posible regulación alostérica de la isoforma citosólica de la AGPasa (Tuncel et al., 2014). I.1.5.3. Degradación del almidón Durante la germinación de la semilla, el almidón almacenado en el endospermo de reserva se degrada para aportar a la nueva plántula la energía necesaria al inicio de su crecimiento y desarrollo. Como se ha descrito anteriormente, el proceso de germinación se encuentra altamente regulado por hormonas. Cuando los niveles de GA aumentan, el escutelo y la aleurona liberan al endospermo las enzimas hidrolíticas necesarias para la degradación del almidón. Además, la liberación de proteasas desde la capa de aleurona provoca la activación de β-amilasas acumuladas en el endospermo durante el desarrollo de la semilla. El principal producto de la degradación del almidón es la glucosa que es transferida al embrión (Zeeman et al., 2010). INTRODUCCIÓN 54 En el endospermo se han identificado diferentes enzimas relacionadas con la degradación del almidón: α-amilasas, β-amilasas, α-glucosidasas (maltasas) y DBE, en concreto LDA. Sin embargo, la importancia de cada una de estas enzimas durante este proceso es poco conocida. Se cree que las α-amilasas juegan un papel principal en la degradación de almidón en el endospermo debido a que su síntesis tiene lugar de forma masiva durante la germinación y a que su supresión en endospermo de arroz provoca el retraso de la misma (Fincher, 1989; Asatsuma et al., 2005; Zeeman et al., 2010). Estas enzimas inician la degradación del gránulo de almidón por sitios específicos de su superficie y liberan glucanos lineales y ramificados. Estos fragmentos son posteriormente degradados por las α y βamilasas y DBE generando maltosas y malto-oligosacáridos que, por medio de las α-glucosidasas, son degradados hasta glucosa (Zeeman et al., 2010). I.2. BRACHYPODIUM DISTACHYON COMO ORGANISMO MODELO EN EL ESTUDIO DE CEREALES El uso de organismos modelo no sólo permite estudiar procesos que resultan difíciles de analizar en otras especies, sino que también contribuye al desarrollo de nuevas herramientas que permiten avanzar significativamente en el conocimiento de dichos procesos. Arabidopsis thaliana ha sido designada como el principal organismo modelo en el estudio de plantas. Sin embargo, su uso se encuentra limitado a la hora de analizar procesos característicos de un grupo concreto de plantas como las monocotiledóneas, que incluye especies de gran importancia agronómica. Tanto el arroz (Oryza sativa) como el maíz (Zea mays) han sido empleados como sistemas modelo en el estudio de cereales. El hecho de que estas especies presenten algunas desventajas, como el gran tamaño de la planta, largos tiempos de generación y requerimientos complejos para su crecimiento (Jung et al., 2008), llevó a proponer en 2001 el uso de Brachypodium distachyon como sistema modelo para el estudio de cereales (Draper et al., 2001). Brachypodium distachyon es una gramínea anual, nativa del sur de Europa, norte de África y suroeste asiático, perteneciente a la familia Poaceae, subfamilia INTRODUCCIÓN 55 Figura I. 14. Esquema de la relación filogenética de Brachypodium con otras especies de cereales. Adaptado de Draper et al. (2001). Pooideae, a la cual pertenecen cereales de gran importancia agronómica como el trigo o la cebada. A pesar de que los análisis filogenéticos han determinado que esta especie es evolutivamente más cercana a los cereales de clima templado que a los tropicales (Figura I. 14), estudios estructurales de su genoma han demostrado que tanto el contenido como la organización de sus genes son más similares al de cereales tropicales, colocándolo en un punto intermedio entre ambos grupos de cereales. La utilidad de Brachypodium como organismo modelo (Draper et al., 2001) se basa en el pequeño tamaño de su genoma ( 272 Mb), con un bajo contenido de secuencias de DNA repetidas ( 28%) (Brkljacic et al.), y la disponibilidad de la secuencia completa del genoma de la línea Bd21 desde 2010. Además, es fácil de cultivar, es autógama, de pequeño tamaño, tiene un ciclo de vida corto, de 3 a 4 meses, y es transformable por el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens (Vogel et al., 2006). En la Tabla I. 1 se resumen algunas de las principales características de Brachypodium en comparación con otras especies modelo de cereales. Tras la secuenciación de su genoma, se ha desarrollado una gran batería de herramientas, tanto bioinformáticas como moleculares, que han facilitado el uso de Brachypodium como organismo modelo: acceso a la secuencia completa del genoma, mapa genético de alta resolución, colecciones de germoplasma, colecciones de líneas mutantes por inserción de T-DNA y mutagénesis química con EMS (metanosulfonato INTRODUCCIÓN 56 de etilo), además de estudios detallados relacionados con procesos del desarrollo de la planta (Mur et al., 2011; Shan et al., 2013). Tabla I. 1. Comparación de organismos modelo de cereales. Adaptado de Brkljacic et al. (2011). Numerosos estudios realizados en los últimos años han confirmado la validez de esta especie como modelo para el estudio de diferentes procesos en cereales, incluyendo la formación radicular (Chochois et al., 2012), desarrollo y germinación de la semilla (Opanowicz et al., 2011; Guillon et al., 2012), floración (Christopher J. Schwartz et al., 2010; Higgins et al., 2010), transporte de cobre en raíces (Ha-il Jung et al., 2014), interacción planta patógeno (Routledge et al., 2004; Peraldi et al., 2011), respuesta hipersensible (Ayliffe et al., 2013; Figueroa et al., 2013), y tolerancia a sequía (Luo et al., 2011; Verelst et al., 2013). Además, se ha utilizado en estudios de mejora genética destinados a la producción de biocombustibles de segunda generación (Bevan et al., 2010; Bouvier d'Yvoire et al., 2013). I.2.1. Estructura de la semilla de Brachypodium La estructura de la semilla de Brachypodium es la de una cariópside típica similar a la de cereales como trigo y cebada. Sus semillas son relativamente grandes en comparación con el pequeño porte de la planta. En general poseen una longitud no superior a los 6 mm, una anchura de 1,3 - 1,6 mm y un peso medio que oscila entre los Brachypodium Cebada Trigo Arroz Maíz Familia Pooideae Pooideae Pooideae Oryzoideae Panicoideae Nº Cromosomas y ploidía 10 2x 14 2x 42 6x 24 2x 20 2x Tamaño Genoma (Mpb) 272 5.500 16.000 382 2.300 Fertilización Autógama Autógama Autógama Autógama Cruzada Ciclo de vida (semanas) 8-12 10-20 10-20 12-24 8-15 Nº semillas por planta 100-1.000 150-200 50-150 >1.000 200-1.000 Requerimiento crecimiento Simple Intermedio Intermedio Exigente Exigente Genoma secuenciado Secuenciado Secuenciado En progreso Secuenciado Secuenciado Eficiencia transformación Muy eficiente Eficiente Ineficiente Muy eficiente Eficiente INTRODUCCIÓN 57 3,5 a 6 mg/semilla (Trafford et al., 2013; Tyler et al., 2014), por lo que en comparación con algunas semillas de gran interés agronómico, como arroz o trigo, son aproximadamente un 60-80% más pequeñas que estas últimas (Figura I. 15). Estudios recientes han puesto de manifiesto diferencias en la composición del endospermo de Brachypodium respecto a la mayoría de cereales domésticos. Así, mientras que en la mayoría de cereales el almidón es el principal carbohidrato de reserva, con un 50-70% del peso seco total de la semilla madura, en Brachypodium el almidón representa tan sólo del 6 al 12% del peso total seco de la semilla madura (Guillon et al., 2011; Tanackovic et al., 2014). En su semilla el almidón se dispone formando un gradiente, siendo más abundante en la parte proximal de la semilla (cerca del embrión) que en la parte distal. Sus gránulos de almidón, aplanados y de pequeño tamaño, son de tipo B (2,5-10 µm) y C (0,5-2,5 µm), y carece de gránulos tipo A (≥ 10 µm), típicos de la mayoría de cereales (Opanowicz et al., 2011; Chen et al., 2014; Tanackovic et al., 2014). Ambos tipos de polímeros, amilosa y amilopectina, están presentes en estos gránulos en una proporción similar a la de cebada. Sin embargo, el nivel de fosforilación de los gránulos de almidón en Brachypodium es la mitad del determinado en cebada, lo que sugiere diferencias en su movilización (Tanackovic et al., 2014). La carencia de almidón en las semillas de Brachypodium se ve compensada por un mayor depósito de (1,3;1,4)-β-glucanos en las paredes celulares de sus granos, siendo el responsable del engrosamiento de estas paredes tanto en el endospermo como en las células de aleurona. A diferencia de otros cereales, como la avena o Figura I. 15. Comparación de semillas maduras de distintos cereales. Brachypodium distachyon (Bd), Triticum aestivum (Ta), Oryza sativa (Os) y Hordeum vulgare (Hv). MATERIALES Y MÉTODOS 64 II.1.2. Germinación de semillas y condiciones de cultivo A) Semillas de Brachypodium Para la realización de experimentos de germinación, las semillas de Brachypodium se esterilizaron e incubaron en placas Petri provistas de papel de filtro estéril humedecido con agua destilada estéril. Las placas se incubaron durante 2 días en frío (4ºC) y oscuridad. Posteriormente, se mantuvieron a temperatura ambiente (22-25ºC) y oscuridad durante 2 días más. De esta forma, se logra sincronizar la germinación y se obtiene una mayor tasa de germinación. Finalmente, según el tipo de experimento a realizar, las placas se expusieron a un fotoperiodo de día largo (16 h de luz/8 h oscuridad) o se mantuvieron en oscuridad a temperatura ambiente. El material obtenido se diseccionó, se congeló en nitrógeno líquido y se conservó a -80ºC hasta su uso. Para la obtención de plantas adultas, las semillas se germinaron de igual forma que en el caso anterior. Tras 3 días en luz, los brotes se trasplantaron a macetas conteniendo turba vegetal y se cultivaron en condiciones de día largo, a una temperatura de 22-25ºCy una humedad relativa aproximada del 60%. Las plantas se regaron cada 2 días con agua y una vez por semana con medio Hoagland compuesto por:  Macronutrientes (NH4)H2PO4 5 mM; KNO3 3 mM; Ca(NO3)2 · 4H2O mM; MgSO4 · H2O 1 mM.  Micronutrientes: H3BO3 23,12 µM; MnCl2 · 4H2O 4,57 µM; ZnSO4 · 7H2O 0,38 µM; CuSO4 · 5H2O 0,16 µM; Na2MoO4 · 2H2O 0,05 µM.  Fe clafwer-600 (Azko Chemical) 0,0005 % (p/v). B) Semillas de Arabidopsis Las semillas estériles de Arabidopsis se sembraron en medio sólido estéril Murashige y Skoog (MS, Duchefa) 4,4 g/l, suplementado con sacarosa 5 g/l y MES 0,5 g/l. El pH se ajustó a 5,7 con KOH 1 M. Para su solidificación se empleó Gelrite (Duchefa) 3 g/l. Las placas, una vez sembradas, se mantuvieron en oscuridad y frío (4ºC) durante 3 días para promover y sincronizar la germinación. Tras este tiempo, se incubaron en posición vertical en condiciones de día largo y 22ºC. El material vegetal MATERIALES Y MÉTODOS 65 obtenido se diseccionó, se congeló en nitrógeno líquido y se conservó a -80ºC hasta su uso. C) Semillas de tomate Para la obtención de plántulas de tomate, las semillas se esterilizaron e incubaron en placas Petri provistas de papel de filtro estéril humedecido con agua destilada estéril. Las placas se mantuvieron durante 2 días en frío (4ºC) y oscuridad. A continuación, se cambiaron a temperatura ambiente y se mantuvieron en oscuridad durante 2 días. Finalmente, se crecieron en condiciones de día largo durante 5 días. El material vegetal obtenido se diseccionó, se congeló en nitrógeno líquido y se conservó a -80ºC hasta su uso. II.2. BACTERIAS II.2.1. Bacterias empleadas Las estirpes de bacterias empleadas durante este trabajo, junto con algunas de sus características genotípicas, se describen en la Tabla II. 1. Para la clonación y conservación de plásmidos se empleó la estirpe DH5α de Escherichia coli. Para los experimentos de transformación de callos de Brachypodium se empleó la estirpe AGL1 de Agrobacterium tumefaciens. La conservación de las bacterias se realizó en medio LB con glicerol 25% (v/v) a -80ºC. En el caso de las bacterias transformadas, este medio se suplementó con el antibiótico correspondiente. Tabla II. 1. Cepas bacterianas empleadas en este trabajo y sus correspondientes genotipos. Bacteria Genotipo Escherichia coli (DH5α) supE44 ΔlacU169 (φ80lacZ ΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 Agrobacterium tumefaciens (AGL1) F- gyrA462 endA1 glnV44 Δ (sr1-recA) mcrB mrr hsdS20 (rB-, mB-) ara14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20 (Smr) xyl5 Δleu mtl1 MATERIALES Y MÉTODOS 66 I.2.2. Cultivos de bacterias en medio líquido y sólido Las bacterias se cultivaron a 37ºC (E. coli) o 28ºC (Agrobacterium), en estufas (medios sólidos) o incubadores con agitación a 200 r.p.m. (medios líquidos). En ambos casos, se empleó como medio de cultivo Luria-Bertani (LB) (Sambrook et al., 1989). Este medio se compone de triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l y, cuando el medio requería ser solidificado, agar 15 g/l. Los medios LB se suplementaron con los antibióticos necesarios tanto para la selección de cepas portadoras del plásmido deseado, como para el posterior cultivo de las mismas. Las concentraciones normales de uso para cada antibiótico quedan recogidas en la Tabla II. 2. Tabla II. 2. Concentraciones de los antibióticos empleados en este trabajo según vector o estirpe bacteriana*. Antibiótico Concentración Vector Ampicilina (Amp) 100 µg/ml pGemT Kanamicina (Kan) 50 µg/ml pBrachyTAG-G210 Rifampicina (Rif) 50 µg/ml *AGL1 Tetraciclina (Tet) 5 µg/ml pSoup II.2.3. Obtención de bacterias competentes Las bacterias competentes de E. coli DH5α fueron suministradas por el servicio de cultivos del Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis (IBVF). La obtención de Agobacterium AGL1 electro-competente se realizó siguiendo el protocolo descrito a continuación. A partir de colonias aisladas de Agrobacterium, se tomó una colonia y se creció un pre-inóculo en 10 ml de medio LB suplementado con rifampicina durante 2 días a 28ºC y con agitación. A continuación, se añadió el preinóculo a un matraz con 500 ml de medio LB fresco sin antibiótico y se dejó crecer hasta que alcanzó una DO600 de 0,5-1, momento en el que el cultivo se centrifugó durante 20 min a 1.500 g y se descartó el sobrenadante. El precipitado se resuspendió en 250 ml de agua milliQ estéril fría y se centrifugó de nuevo a 1.500 g durante 20 min. Este paso se repitió 2 veces más, disminuyendo en cada caso a la mitad el volumen de agua empleado. Tras el último lavado, el precipitado se resuspendió en 1 ml de glicerol MATERIALES Y MÉTODOS 67 10 % (v/v) estéril frío y se distribuyó en alícuotas que se conservaron a -80ºC hasta su uso. II.2.4. Transformación de células La transformación de células competentes de E. coli DH5α con el plásmido deseado se realizó mediante choque térmico. Para ello, se mezclaron 100 μl de células competentes, previamente descongeladas, con un volumen inferior a 10 µl que contenía como máximo 100 ng del DNA plasmídico. La mezcla se homogeneizó y se incubó en hielo 15 min. Posteriormente, se sometió a un choque térmico de 42°C durante 90 s seguido de una incubación en hielo durante 10 min. Las células se cultivaron, tras añadir 800 μl de medio LB, durante 1 h a 37°C con agitación. Finalmente, las bacterias se sembraron en medio LB sólido suplementado con el antibiótico adecuado para conseguir la selección de las colonias positivas. En aquellos casos en los que se pretendía seleccionar transformantes del vector pGEM-T por color (Sambrook et al., 1989), el medio sólido se suplementó además con IPTG 0,2 mg/ml y X-Gal 0,04 mg/ml. Este método permite identificar clones portadores de moléculas recombinantes gracias a la inactivación de la actividad β-galactosidasa por la inserción en el gen lacZ. Las colonias con plásmidos recombinantes mostrarían color blanco, frente al color azul de las que no fuesen portadoras. La transformación mediante electroporación de células competentes AGL1 con el vector deseado se llevó a cabo en cubetas de 2 mm (Cell projects) con el equipo Easyject optimo (EQUIBIO) con un pulso de 2.500 V durante 19,1 ms. De inmediato, se añadió LB a las bacterias y se cultivaron durante 1 h a 37°C con agitación. Posteriormente, las bacterias se sembraron en placas con medio LB sólido suplementado con los antibióticos adecuados. II.3. OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS II.3.1. Aislamiento de DNA plasmídico Para la obtención de DNA plasmídico a pequeña escala se utilizó el kit DNA spin Plasmid DNA purification (iNtRON Biotechnology) según las instrucciones del MATERIALES Y MÉTODOS 68 fabricante. En general, la cantidad y calidad del DNA plasmídico obtenido mediante este método fueron adecuadas para su posterior uso. II.3.2. Extracción de DNA genómico de tejidos vegetales Para el aislamiento del DNA genómico el material vegetal, previamente congelado y triturado con ayuda de nitrógeno líquido, se mezcló con 300 μl de tampón de extracción 2x CTAB [bromuro de cetiltrimetilamonio 2% (p/v); NaCl 1,4 M; TrisHCl 100 mM pH 8; EDTA 20 mM] (Lukowitz et al., 2000), se homogeneizó con ayuda de un vórtex y se transfirió a tubo Eppendorf. A continuación, se incubó a 65°Cdurante al menos 10 min. Una vez enfriado, se añadió 300 μl de cloroformo y, tras mezclar en vórtex, se centrifugó durante 10 min a 16.000 g a 4ºC. La fase acuosa se transfirió a un nuevo tubo y se mezcló con 1 volumen de etanol absoluto frío. A continuación, se centrifugó a 16.000 g durante 15 min a 4ºC para precipitar el DNA. El sobrenadante se descartó y el precipitado se lavó con etanol 70% (v/v). Tras centrifugar, se eliminó el sobrenadante y el precipitado se dejó secar a temperatura ambiente. Una vez seco, el DNA se resuspendió en agua milliQ estéril y se almacenó a -20ºC hasta su uso. II.3.3. Extracción de RNA de tejidos vegetales y retrotranscripción A) Aislamiento de RNA de hojas y raíces La extracción de RNA total de hojas y raíces se llevó a cabo con el reactivo Trisure (Bioline). El material vegetal previamente congelado y triturado se colocó en un tubo Eppendorf al que se le añadió 1 ml de Trisure. Tras homogeneizar en vórtex e incubar 5 min a temperatura ambiente, se añadió 200 μl de cloroformo, se agitó vigorosamente durante 15 s y se centrifugó a 12.500 g durante 15 min. Al sobrenadante se le añadió 500 µl de isopropanol frío y se incubó durante 15 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se centrifugó a 4ºC durante 10 min a 16.000 g. Se eliminó el sobrenadante y el precipitado se lavó mediante centrifugación con 500 µl de etanol 85% (v/v). Se eliminó el sobrenadante y el precipitado se dejó secar a temperatura ambiente. Una vez seco, el RNA se resuspendió en agua tratada con DEPC estéril. MATERIALES Y MÉTODOS 69 B) Aislamiento de RNA de endospermo de semillas de Brachypodium La presencia de almidón en el endospermo de semillas de cereales interfiere con el reactivo Trissure por lo que en este tipo de tejidos, para la extracción de RNA, se siguió el método descrito por Baulcombe and Buffard (1983). Las semillas se trituraron en un mortero con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino que se transfirió a tubo Eppendorf. A cada tubo se le añadió 500 µl de tampón de extracción [NaCl 0,1 M; Tris-HCl 50 mM pH 9; EDTA 10 mM pH 8; SDS 2% (p/v) y β-mercaptoetanol 14 mM] y, tras mezclar por inversión, se incubó 10 min en hielo. Posteriormente, las proteínas de la muestra se extrajeron con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1). Para ello, se añadió 1 volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico, se agitó en vórtex y se centrifugó a 800 g durante 5 min a 4ºC. La extracción se repitió para la fase acuosa hasta un total de 3 veces. Tras la última extracción, se tomó las fase acuosa, se le añadió 2 volúmenes de etanol absoluto frío y se incubó a -20ºC durante 1 h, con objeto de precipitar los ácidos nucleicos. Posteriormente, se centrifugó a 4.500 g durante 10 min a 4ºC, se descartó el sobrenadante y el precipitado se lavó con 500 µl de etanol 70% (v/v). Una vez seco, el precipitado se resuspendió en 250 µl de agua DEPC estéril a la que se le adicionó 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M (con objeto de precipitar el almidón pero no los ácidos nucleicos), se agitó por inversión y se centrifugó a 16.000 g durante 10 min a 4ºC. El sobrenadante se precipitó de nuevo con 2 volúmenes de etanol absoluto y se incubó durante 1 h a -20ºC. Una vez centrifugado, a 16.000 g durante 10 min a 4ºC, el precipitado obtenido se resuspendió en 250 µl de LiCl 3 M y se incubó en hielo durante 60 min. A continuación, se centrifugó a 16.000 g durante 15 min a 4ºC, se descartó el sobrenadante y el precipitado se lavó con 100 µl etanol 70% (v/v). Una vez seco, el precipitado de RNA se resuspendió en agua tratada con DEPC estéril. II.3.3.1. Tratamiento del RNA con DNasa y electroforesis de RNA Las muestras de RNA se trataron con DNasaI libre de RNasas antes de ser usadas, con objeto de eliminar el DNA genómico contaminante. Para ello, se utilizó el kit comercial DNA-free™ DNA Removal Kit (Ambion). Para comprobar la integridad del RNA de las muestras se tomaron 250 – 500 ng de las mismas y se analizaron mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa al MATERIALES Y MÉTODOS 70 1,5% (p/v) en tampón 1x TAE [Tris 40 mM; acetato 20 mM, EDTA 1 mM pH 8]. Las muestras, antes de ser cargadas en el gel, se suplementaron con tampón de carga 10x [azul de bromofenol 0,125% (p/v); SDS 0,625% (p/v) y glicerol 62,5% (v/v)]. Para la detección del RNA se añadió bromuro de etidio a los geles a una concentración final de 0,5 μg/ml, y se visualizaron mediante el uso de un transiluminador de luz utravioleta. Cuando el RNA no está degradado se observan dos bandas mayoritarias y definidas correspondientes a los rRNA 18S y 28S. II.3.3.2. Retrotranscripción La retrotranscripción (RT) del RNA total aislado de distintos tejidos vegetales se realizó con el kit Maxima first strand cDNA synthesis for RT-qPCR (Thermo Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante. La reacción se llevó a cabo con 1 μg de RNA en un volumen de reacción de 20 μl. II.3.4. Cuantificación de ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos se cuantificaron utilizando un espectrofotómetro Nanodrop ND-100 (Agilent Technologies) midiendo la absorbancia a 260 nm y a 280 nm. La absorbancia a 260 nm es una medida de la cantidad de ácidos nucleicos presente en las muestras, mientras que la absorbancia a 280 nm indica la posible contaminación por proteínas o compuestos fenólicos. Por este motivo, es importante observar el valor DO260/DO280 que da una idea de la integridad de las muestras. Para el DNA se considera óptimo un valor de 1,8, mientras que para el RNA, un valor de 2. II.4. MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS II.4.1. Técnica de PCR A) Amplificación de fragmentos de DNA Para la amplificación de fragmentos de DNA mediante PCR convencional, se utilizó la polimerasa GoTaq® DNA polimerase (Promega) y los reactivos suministrados por su fabricante. Cada reacción se preparó en un volumen final de 25 µl, tal y como se describe en la Tabla II. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 71 Tabla II. 3. Reactivos y volúmenes empleados para PCR convencional. Componentes Volumen 5x Colorless GoTaq® Flexi Buffer 5 µl MgCl2 25 mM 1,5 µl dNTP mix 10 mM 0,5 µl Forward primer 50 µM 0,5 µl Reverse primer 50 µM 0,5 µl Polymerase GoTaq® (5 U/µl) 0,125 µl DNA/cDNA X µl* H2O2 Hasta 25 µl * El volumen final de las soluciones de DNA empleadas fue variable según el caso. Las condiciones de amplificación fueron las recomendadas por el fabricante, variando el tiempo de extensión en función del tamaño de los fragmentos a amplificar (30 s por cada 500 pb) y la temperatura de alineamiento según la pareja de oligonucleótidos empleada. B) Clonación de cDNAs Para el caso de clonaciones de cDNAs completos, la amplificación de los fragmentos se realizó usando la polimerasa de alta fidelidad iProof™ High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad). En este caso cada reacción se preparó en un volumen final de 50 µl según se describe en la Tabla II. 4. Tabla II. 4. Reactivos y volúmenes para PCR con la polimerasa iProof. * El volumen final de las soluciones de DNA empleadas fue variable según el caso. Las condiciones de amplificación fueron las recomendadas por el fabricante, variándose el tiempo de extensión en función del tamaño de los fragmentos a Componentes Volumen 5x iProof HF Buffer 10 µl MgCl2 25 mM 3 µl dNTP mix 10 mM 1 µl Forward primer 50 µM 0,5 µl Reverse primer 50 µM 0,5 µl Polymerase iProof (2 U/µl) 0,5 µl DNA X µl* H2O2 Hasta 50 µl MATERIALES Y MÉTODOS 72 amplificar (15 s por cada 500 pb) y la temperatura de alineamiento según la pareja de oligonucleótidos empleada. II.4.1.1. Oligonucleótidos empleados para PCR convencional Los oligonucleótidos utilizados para el análisis del procesamiento alternativo de los intrones del gen NtrC se describen en la Tabla II. 5. Tabla II. 5. Oligonucleótidos empleados para el análisis del procesamiento alternativo de los intrones del gen NtrC de Brachypodium distachyon. Nombre oligonucleótido Secuencia 5’-3’ Intrón BdNTRC-I1-F BdNTRC-I1-R CCTCCAAGCCCCTACACG CACCTGGTACCCTTCGAAGA 1 BdNTRC-I2-F BdNTRC-I2-R TCTTCGAAGGGTACCAGGTG CATCCTCCTGGTGAAGCTC 2 BdNTRC-I3-F BdNTRC-I3-R GAGCTTCACCAGGAGGATG CAAATATATCGCTTCCTCCG 3 BdNTRC-I4-F BdNTRC-I4-R CGGAGGAAGCGATATATTTG CTGTTTGGAGTATGCCCTATC 4 BdNTRC-I5-F BdNTRC-I5-R CAACAACCCCAACATAACAG CAGATCCAGCTGCAGTAACG 5 BdNTRC-I6-F BdNTRC-I6-R CGTTACTGCAGCTGGATCTG CCATCTCAACATCTTTGCCTG 6 BdNTRC-I7-F BdNTRC-I7-R CAGGCAAAGATGTTGAGATGG GAATACAGAACACAAATGAGACG 7 BdNTRC-I8-F BdNTRC-I8-R CGTCTCATTTGTGTTCTGTATTC CCTCCTCGATGTCAATTTC 8 BdNTRC-I9-F BdNTRC-I9-R GAAATTGACATCGAGGAGG CTCCCGATATTCCTTCTTC 9 En la Tabla II. 6 se describen los oligonucleótidos empleados para la caracterización del procesamiento alternativo en el intrón 4 del gen NtrC de Arabidopsis thaliana y en el mismo intrón para las dos copias del gen en tomate. MATERIALES Y MÉTODOS 73 Tabla II. 6. Oligonucleótidos empleados para el análisis del procesamiento alternativo del intrón 4 del gen NtrC de Arabidopsis thaliana y tomate. Nombre oligonucleótido Secuencia 5’-3’ Intrón F-I4AtNTRC R-I4AtNTRC GCTTGTTCGCAGAGATCAGTTG CGAGTTCGACTTGGCCTTCC 4 AtNtrC F-I4NTRC4c_S.L. R-I4NTRC4c_S.L. GGACCAACTAAGGGCATCATAGG CGAGCACAGACTCTTCTCCTG 4 SlNtrC_04 F-I4NTRC10c_S.L. R-I4NTRC10c_S.L. GGACCAACTAAGAGCATCAAGAG CAAAATTCCCGACATCTGGC 4SlNtrC_10 Para la clonación de los cDNAs completos de NTRC y del promotor del gen GLU1 de Brachypodium en pGEM-T se emplearon los oligonucleótidos recogidos en la Tabla II. 7. Tabla II. 7. Oligonucleótidos empleados para clonaciones en pGEM-T. Nombre oligonucleótido Secuencia 5’-3’ Producto F-BdcNTRC R2-BdcNTRC ATGGCGGTCACGCGC CTGCAACGAACACTGAGCTC Gen BdNtrC F-PromotGLU1 R-PromotGLU1 ACCGACGATGGTGTTGAGC AATTGTTTGAAGAGAAGAGAGAAGC Promotor BdGLU1 En la Tabla II. 8 se incluyen las parejas de oligonucleótidos empleadas para la clonación del promotor GLU1, el cDNA completo del gen NtrC de Brachypodium, el cDNA completo para el gen NtrC de arroz y el terminador NOS del vector pBrachyTAG-G210 (G210). Tabla II. 8. Oligonucleótidos empleados para clonaciones en G210. Nombre oligonucleótido Secuencia Producto F-PGlu1 _StuI R-PGlu1_ApaI CGAGGCCTACCGACGATGGTGTTGAGC CAGGGCCCAATTGTTTGAAGAGAAGAGAGAAGC Promotor BdGLU1 F-BdcNTRC_BsiwI R-BdcNTRC_SacI CTATCGTACGATGGCGGTCACGCGC CCGAGCTCCTATTTGTTCGATTCGATGA Gen BdNtrC F-OscNTRC_ApaI R-OscNTRC_SacI GAGGGCCCATGGCGGTCACGCGC GGGAGCTCTCATTTGTTTGACTCGATAAAC Gen OsNtrC F-NosT_SacI R-NosT_BsiwI GAGAGCTCGATCGTTCAAACATTTGG GGTTCGTACGGATCTAGTAACATAGATGACACC Terminador Nos * En rojo se resalta la diana reconocida por la enzima de restricción empleada en cada caso. MATERIALES Y MÉTODOS 80 II.5.5. Electroforesis bidimensional Para este tipo de electroforesis, debido a que las muestras empleadas procedían de extractos totales, se necesitó un paso previo de precipitación de las proteínas con TCA para eliminar sales y otras sustancias que pudiesen interferir en la movilidad de las muestras durante el isoelectroenfoque. Para ello, se añadió a cada muestra TCA a una concentración final del 10% (v/v) y se homogeneizó. Tras incubar 30 min en hielo, se centrifugó en frío a 16.000 g durante 20 min. El precipitado proteico se lavó dos veces con 400 µl de acetona fría, centrifugándose a 16.000 g a 4ºC, 20 min. Una vez seco, el precipitado se resuspendió en tampón de rehidratación (Bio-Rad). En función del punto isoeléctrico (pI) de la proteína de interés, se emplearon tiras IPG de Bio-Rad de 11 cm del rango de pH adecuado para cada caso. Las tiras se rehidrataron de forma pasiva con 200 μl de tampón de rehidratación durante 12 h a 20°C. El isoelectroenfoque se realizó en el equipo Protean IEF Cell (Bio-Rad) según las indicaciones del fabricante. La segunda dimensión se realizó mediante SDS-PAGE. En primer lugar, cada tira se incubó en tampón de equilibrado I [Tris-HCl 375 mM pH 8,8; urea 6 M, glicerol 20% (v/v) y SDS 2% (p/v)] suplementado con DTT 130 mM durante 10 min en agitación suave. Posteriormente, se lavó con tampón de equilibrado II (tampón de equilibrado I suplementado con iodoacetamida 135 mM) durante 10 min en agitación suave. Finalmente, tras lavar la tira con tampón 1x Tris-glicina, se colocó sobre el gel y se cubrió con PROTEAN® Plus Overlay Agarose (Bio-Rad) para fijarla al gel concentrador. II.5.6. Tinción de proteínas en geles de poliacrilamida Las proteínas se visualizaron rutinariamente mediante tinción con azul de Coomassie. Los geles se incubaron 30 min en agitación con solución de tinción de Coomassie [etanol 40% (v/v); ácido acético 10% (v/v); agua destilada 50% y azul Coomassie R-250 0,01% (p/v)]. Posteriormente, se destiñeron en una solución de etanol 40% (v/v) y ácido acético 10% (v/v) en agitación, hasta la adecuada visualización de las bandas. MATERIALES Y MÉTODOS 81 En aquellos casos en los que se requirió una mayor sensibilidad de la tinción se empleó Coomassie G-250. Esta tinción presenta algunas diferencias respecto a la tinción rutinaria con Coomassie R-250. Primero, las proteínas se fijaron mediante incubación de los geles durante toda la noche en una solución de fijación, compuesta por metanol 40% (v/v) y ácido acético 10% (v/v). Posteriormente, los geles se incubaron durante 24 h a temperatura ambiente y en agitación, con una solución de tinción compuesta por una solución A [ácido ortofosfórico 2% (p/v) y sulfato de amonio 10% (p/v)] y una solución B [azul de Coomassie G-250 5% (p/v)] a la que se añadió previamente 1/4 de volumen de metanol. Los geles se destiñeron mediante lavados sucesivos con agua milliQ hasta que las proteínas fueron visibles. II.5.7. Espectrometría de masas e identificación de proteínas Una vez teñidas las proteínas en los geles de acrilamida, se procedió a la obtención de las bandas de interés con la ayuda del picador automático EXQuest Spot cutter (Bio-Rad). Posteriormente, y de forma automatizada, las proteínas se sometieron a un proceso de digestión con tripsina en una estación robotizada de Bruker previamente a su análisis por espectrometría de masas MALDI-TOF (Bruker Daltonics). El procesamiento de las muestras y su posterior análisis mediante espectrometría de masas MALDI-TOF estuvo a cargo del Servicio de Proteómica del cicCartuja. II.5.8. Análisis de proteínas mediante Western-blot Tras la electroforesis en gel de poliacrilamida, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Towbin et al., 1979). Antes de la transferencia, el gel se sumergió en tampón de transferencia Tris-glicina metanol (TGM) [Tris-HCl 48 mM; glicina 39 mM; SDS 0,037% (p/v) y metanol 20% (v/v)] durante 10 min. La transferencia de los péptidos a la membrana de nitrocelulosa (Amersham Biosciences) se realizó utilizando tampón TGM en el sistema de transferencia semi-seco Pierce Power station (Thermo Scientific). Una vez finalizada la transferencia, y tras comprobar su eficiencia mediante tinción de la membrana con Rojo Ponceau 0,1% (p/v), la membrana se sometió a los siguientes tratamientos: MATERIALES Y MÉTODOS 82 1. Bloqueo. 2 incubaciones de 30 min cada una con leche desnatada 4% (p/v) preparada en tampón TBS [Tris-HCl 20 mM; NaCl 150 mM], para saturar los sitios de unión no específicos. 2. Incubación con anticuerpo primario. Tras el bloqueo, la membrana se incubó durante 12-16 h a 4°C con agitación en tampón TBS-T [TBS con Tween®20 0,1% (v/v)] y en algunos casos con leche al 2% (p/v), conteniendo el anticuerpo primario a la dilución adecuada según el caso. 3. Primer lavado. Los anticuerpos unidos inespecíficamente se eliminaron mediante 3 lavados de 10 min en tampón TBS-T. 4. Incubación con anticuerpo secundario. La membrana se incubó con anti-inmunoglobulinas de conejo marcadas con peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina. El anticuerpo secundario se empleó a una dilución 1:20.000 en TBS con leche 2% (p/v). La incubación se realizó durante al menos 1 h a temperatura ambiente y agitación. 5. Segundo lavado. La membrana se lavó 3 veces, 10 min, con tampón TBS-T. 6. Tercer lavado. Los restos de detergente se eliminaron con un lavado de 10 min en tampón TBS. 7. Revelado. Las bandas de la membrana se revelaron con el revelador BCIP/NBT Alkaline phosphatase (Millipore), cuando el anticuerpo secundario iba marcado con fosfatasa, o bien con el revelador Luminata™ Forte Western HRP-Substrate (Millipore), cuando el anticuerpo secundario iba marcado con la peroxidasa, en cuyo caso las imágenes se visualizaron mediante el uso del detector de quimioluminiscencia Chemidoc (Bio-Rad), con ayuda del programa Quantity One. II.6. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN ALMIDÓN Y β-GLUCANOS El contenido de almidón y β-glucanos en semillas maduras de Brachypodium se determinó mediante el uso de los kits Total Starch and Mixed-Linkage Beta-Glucan (Megazyme International), de acuerdo con las instrucciones del fabricante pero con MATERIALES Y MÉTODOS 83 modificaciones en el procedimiento de extracción para su ajuste a pequeña escala y al tipo de semillas empleada (Trafford et al., 2013). Aproximadamente 20 semillas se pesaron y se incubaron en 0,5 ml de metabisulfito de sodio 0,3% (p/v) y ácido láctico 1% (v/v) pH 3,8 a 52ºC durante toda la noche, tras lo cual se descartó la solución. Una vez secadas y cortadas las semillas, se machacaron y homogeneizaron en un mortero con 0,5 ml de tampón de extracción [tampón fosfato sódico 20 mM pH 6,5]. El extracto obtenido se diluyó con tampón de extracción hasta una concentración de 0,1 ml tampón/mg de tejido. Se tomó una alícuota de 0,8 ml y se autoclavó a 121ºC durante 15 min para solubilizar almidón y β-glucanos. Posteriormente, a partir de la alícuota autoclavada, se tomaron 3 alícuotas de 50 µl que se sometieron a digestión con distintas enzimas con objeto de determinar el contenido en almidón y β-glucanos de la muestra inicial. A la alícuota 1, utilizada para la determinación de almidón, se le añadió 50 µl de tampón de digestión de almidón [acetato de sodio 100 mM pH 5,2; CaCl2 5 mM; 0,3 U de α-amilasa y 1 U de amiloglucosidasa]. A la alícuota 2, utilizada como blanco para la determinación de la glucosa libre en la muestra, se le añadió 50 µl de tampón acetato de sodio 100 mM pH 5,2. A la alícuota 3, utilizada para la determinación de β-glucanos, se le añadió 0,1 U de liquenasa y, tras incubar a 37ºC 1 h, se le añadió 50 µl de tampón de digestión de β-glucanos [acetato de sodio 50 mM pH 4 y 0,1 U de β-glucosidasa]. Las tres alícuotas se incubaron toda la noche a 37ºC. Al día siguiente, se realizaron las determinaciones de glucosa usando el reactivo glucosa oxidasa peroxidasa (GOPOD) suministrado por los kits. Los ensayos para glucosa se realizaron en un volumen final de 0,8 ml (conteniendo 0,75 ml de reactivo GOPOD, extracto y agua hasta completar los 0,8 ml) que se incubaron a 50ºC durante 20 min. Una vez enfriados, se realizaron las medidas de absorbancia a 510 nm. Para la determinación de glucosa se generó una recta de calibrado a partir de la medida de absorbancia de muestras con cantidades conocidas de glucosa (2, 5, 10, 15, 20, 30, y 50 mg) en reactivo GOPOD. MATERIALES Y MÉTODOS 84 II.7. TRANSFORMACIÓN DE BRACHYPODIUM DISTACHYON MEDIADA POR AGROBACTERIUM TUMEFACIENS El método seguido para la transformación de Brachypodium por Agrobacterium tumefaciens en este trabajo se basó en modificaciones de protocolos publicados por Christiansen et al. (2005), Vogel et al. (2006) y Vogel y Hill (2008). Las etapas de la transformación de B. distachyon fueron las siguientes: a) Aislamiento de embriones. b) Generación de callos embriogénicos. c) Transformación de los callos embriogénicos con Agrobacterium. d) Selección de callos embriogénicos transformados. e) Regeneración de las plantas de Brachypodium transformadas. A) Aislamiento de embriones Para el aislamiento de embriones en el estado adecuado de desarrollo, se recogieron las espigas de Brachypodium en el momento en que las semillas comenzaron a rellenarse. Tras eliminar manualmente la lema, las semillas se conservaron en agua con unas gotas de Tritón X-100, para evitar su deshidratación, hasta su uso. Una vez recolectadas, las semillas se esterilizaron en una solución NaOCl 2% (v/v) y Tritón X-100 0,1% (v/v), durante 4 min con agitación suave, seguido de 5 lavados con agua destilada estéril. Mediante el uso de pinzas, aguja y con ayuda de una lupa, se aislaron los embriones de las semillas con cuidado de no dañar el escutelo. Tanto el proceso de esterilización como los pasos sucesivos, se realizaron en condiciones de esterilidad en campana de flujo laminar. B) Inducción de callos embriogénicos Los embriones aislados se colocaron con la cara escutelar hacia abajo, en placas Petri que contenían medio inductor de callos (CIM) [medio Linsmaier & Skoog (LS) 4,44 g/l; sacarosa 30 g/l; CuSO4 0,6 mg/l; ácido 2,4-diclorofenoxiacético 2,5 mg/l y phytagel 2 g/l, pH 5,8]. La inducción de formación de callos embriogénicos se realizó durante un periodo de 6 semanas, manteniendo las placas en oscuridad a 25ºC. Tras la primera semana, se eliminaron los tallos o raíces desarrollados y posteriormente, cada 2 MATERIALES Y MÉTODOS 85 semanas, los callos se dividieron en 3 ó 4 porciones y se transfirieron a medio CIM fresco. C) Transformación mediada por Agrobacterium Como paso previo a la transformación, se cultivó la cepa de Agrobacterium transformada en medio LB sólido, suplementado con los correspondientes antibióticos, durante 3 días a 28ºC. El día de la transformación, el cultivo se recogió con un asa estéril y se resuspendió en medio CIM líquido, suplementado con acetosiringona 200 µM y 10 µl/ml de medio, de 10% synperonic PE/F68, hasta una DO600 0,6. Las bacterias se incubaron durante 45 - 60 min a temperatura ambiente y agitación suave antes de ser utilizadas. Los callos embriogénicos se transfirieron a tubos conteniendo la suspensión de Agrobacterium previamente preparada y se incubaron en agitación suave durante al menos 5 min a temperatura ambiente. Tras la incubación, los callos se dejaron secar unos minutos y se transfirieron a placas Petri con papel de filtro estéril donde se incubaron durante 5 días en oscuridad a 25ºC. D) Selección de callos embriogénicos transformados Transcurridos 5 días, los callos transformados se transfirieron a placas Petri con medio de selección, medio CIM suplementado con timentina 150 mg/l (para inhibir el crecimiento de Agrobacterium) e higromicina 50 mg/l (antibiótico de selección). Las placas se incubaron durante 1 semana en oscuridad a 25ºC. Posteriormente, los callos se transfirieron a medios de selección fresco, disminuyendo la concentración de higromicina a 25 mg/l y manteniéndose las condiciones de incubación. Este paso se repitió cada 2 semanas para la selección de los callos resistentes que, por tanto, habían sido transformados. E) Regeneración de plantas de Brachypodium transformadas Los callos seleccionados se transfirieron a placas Petri con medio sólido de regeneración [medio LS 4,44 g/l; maltosa 30 g/l; kinetina 0,2 mg/l; phytagel 2g/l; pH 5,8]. Este medio se suplementó con timentina 150 mg/l e higromicina 25 mg/l. Los callos se incubaron en condiciones de día largo (16 h luz /8 h oscuridad) a 25ºC durante 3-4 semanas. Tras este periodo, los callos que habían desarrollado brotes se MATERIALES Y MÉTODOS 86 transfirieron a tubos de cultivo con medio para el desarrollo de raíces [MS con vitaminas 4,44 g/l; maltosa 30 g/l; phytagel 2 g/l; pH 5,8]. En este caso, el medio se suplementó sólo con timentina 150 mg/l. Los brotes se incubaron en las mismas condiciones de luz y temperatura hasta que el sistema radicular estuvo bien desarrollado. Finalmente, aquellos brotes que desarrollaron sistema radicular se trasplantaron a semilleros con turba vegetal y se crecieron en ciclo de día largo a 22ºC hasta completar su ciclo. II.8. HERRAMIENTAS BIOINFÓRMATICAS Para el procesamiento de los resultados se emplearon distintos programas informáticos: La búsqueda de secuencias se realizó a través de la base de datos de las páginas web National Center for Biotechnology Information (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov), Phytozome v.11 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html), Sol Genomics Network (https://solgenomics.net) y CyanoBase-Genome Database Resources (http://genome.microbedb.jp/cyanobase), disponibles a través de internet. Para la búsqueda de similitud de secuencias se utilizó el algoritmo BLAST, accesible en las bases de datos. Los análisis de traducción de secuencias de nucleótidos a aminoácidos, la conversión de secuencias a la secuencia complementaria reversa, así como el estudio de las propiedades o características de una proteína a partir de su secuencia de aminoácidos, se llevaron a cabo mediante herramientas disponibles en EXPASY (www.us.expasy.org). El alineamiento múltiple de secuencias se realizó con el programa Clustal Omega disponible en el servidor del Instituto Europeo de Bioinformatica (EBI) (www.ebi.ac.uk). Tanto para procesar estos alineamientos como los resultados de las secuenciaciones se empleó el programa BioEdit v.7.1.3.0 y para la visualización de los arboles filogenéticos TreeView v.3.2. El diseño a escala de genes se realizó mediante el programa Fancygene, disponible en línea (http://bio.ieo.eu/fancygene/) y para los diseños de vectores, MATERIALES Y MÉTODOS 87 construcción de transgenes, búsquedas y localización de dianas y enzimas de restricción se empleó el programa pDRAW32. Finalmente, para la cuantificación relativa de la cantidad de proteínas y productos de PCR se empleó el programa Scion Image. MATERIALES Y MÉTODOS 88 III. RESULTADOS RESULTADOS 96 El análisis filogenético de NTRC mostró tres grupos bien diferenciados, que se representan con distintos colores en la Figura III. 4, correspondientes a cianobacterias, algas verdes y plantas. Dentro del grupo de las plantas se pueden distinguir 3 subgrupos; los constituidos por musgos, helechos y plantas con semilla. Dentro de este último grupo, se observa claramente la separación de monocotiledóneas y dicotiledóneas. Este análisis permite también estudiar la relación filogenética de las NTRCs en organismos que tienen dos copias para el gen NtrC, sugiriendo que las duplicaciones han tenido lugar de forma independiente a lo largo de la evolución. Figura III. 4. Árbol filogenético de NTRCs de diversos organismos. El árbol filogenético se construyó a partir de las secuencias completas de aminoácidos de NTRCs disponibles en las bases de datos. El alineamiento de las distintas secuencias se realizó usando el programa Clustal Omega y la construcción del árbol mediante el uso del programa TreeView. Los números de acceso para cada proteína se muestran entre paréntesis: Anabaena sp PCC 7120 (BAB72694.1); Tolypothrix sp PCC 7601 (WP_045869140.1); Synechocystis sp PCC 7509 (WP_009632856.1); V. carteri (XP_002948592.1); C. reinhardtii (XP_001689807.1); C. vulgaris (BAH29954.1); O. lucimarinus (XP_001422184.1); P. patens Cr20 y 23 (XP_001753500.1 y XP_001785248.1); Sp. fallax (Sphfalx0006s0389.1.p); S. moellendorffii (XP_002990200.1); V. vinifera (XP_010653766.1); T. cacao (XP_007028668.1); G. max Cr 02 y 10 (XP_003519084.1 y XP_003535866.1); A. thaliana (NP_565954.1); S. pennellii Cr04 y 10 (XP_015071469.1 y XP_015055743.1); S. tuberosum Cr 04 y 10 (XP_006350177 y XP_006351311.1); S. lycopersicum Cr04 y 10 (XP_010319181.1 y XP_004249259.1); O. sativa (XP_006658913.1); B. distachyon (XP_003562531.1); Z. mays (NP_001136660.1). RESULTADOS 97 III.2. NTRC EN SEMILLAS DE CEREALES Estudios iniciales, basados en fraccionamientos a partir de hojas de arroz, mostraron que NTRC se localiza en el estroma de los cloroplastos (Serrato et al., 2004). Trabajos posteriores realizados también por nuestro grupo, usando como modelo la planta Arabidopsis thaliana transformada establemente con el gen reportero GUS bajo control del promotor del gen NtrC y fusiones NTRC-GFP, pusieron de manifiesto que la expresión del gen NtrC tiene lugar tanto en tejidos fotosintéticos como no fotosintéticos y que la proteína presenta localización en cualquier tipo de plasto, no sólo en cloroplastos de células fotosintéticas (Kirchsteiger et al., 2012). Estos resultados sugieren la posibilidad de que NTRC pueda estar también localizada en plastos de tejidos heterotróficos en otras especies vegetales, como los amiloplastos del endospermo de semillas de cereales. Dado que el principal objetivo de este trabajo consistía en generar plantas transgénicas de cereales con niveles alterados de NTRC en el endospermo de semillas, con el fin de estudiar su efecto sobre la síntesis de almidón y otros compuestos de reserva, se consideró de interés un estudio previo de la presencia de NTRC en semillas de cereales, empleando para ello el cereal modelo Brachypodium distachyon. Debido a que el genoma de este cereal se encuentra secuenciado, se ha podido llevar a cabo una aproximación bioinformática para la caracterización del gen que codifica para NTRC en esta planta. Como se ha descrito a lo largo del apartado III. 1, Brachypodium contiene una única copia del gen NtrC, como el resto de las monocotiledóneas para las que se dispone de secuencias. Como en otras plantas, la estructura del gen NtrC de Brachypodium está conservada y consta de 10 exones separados por 9 intrones, teniendo un tamaño total de 4.737 pb (Tabla III. 1 y Figura III. 1). La proteína NTRC de Brachypodium está formada por 523 aminoácidos, con un peso molecular de 56,8 kDa y un alto grado de similitud con las NTRCs de otras especies. El grado de conservación es total para los sitios de unión del FAD y NADPH, al igual que las Cys que forman parte de los sitios activos de los dominios NTR y Trx (Figura III. 2). RESULTADOS 98 [1-720] BdNTRC_semilla TATTTGACAAAATATGCCTGTCATGTTCATTTACTTGTTCGAAGGGATCAGCTACGAGCA BdNTRC_hoja TATTTGACAAAATATGCCTGTCATGTTCATTTACTTGTTCGAAGGGATCAGCTACGAGCA BdNTRC_db TATTTGACAAAATATGCCTGTCATGTTCATTTACTTGTTCGAAGGGATCAGCTACGAGCA ************************************************************ BdNTRC_semilla TCCAAAGCTATGCAGGATCGGTTGATTATGGCGAATGCTTCAGAGTACTCAACAACCCCA BdNTRC_hoja TCCAAAGCTATGCAGGATCGA-----------------------GTACTCAACAACCCCA BdNTRC_db TCCAAAGCTATGCAGGATCGA-----------------------GTACTCAACAACCCCA ******************** **************** BdNTRC_semilla ACATAACAGTACATTTCAATACAGAAGCTGTGGATGTTGTCAGCAATCCCAAAGGCCAGA BdNTRC_hoja ACATAACAGTACATTTCAATACAGAAGCTGTGGATGTTGTCAGCAATCCCAAAGGCCAGA BdNTRC_db ACATAACAGTACATTTCAATACAGAAGCTGTGGATGTTGTCAGCAATCCCAAAGGCCAGA ************************************************************ [901-1572] III.2.1. Clonación del cDNA de NtrC de Brachypodium distachyon Como un primer paso en el estudio de NTRC en el endospermo de semillas de Brachypodium, se clonó el cDNA correspondiente para el gen BdNtrC mediante una estrategia de RT-PCR utilizando los oligonucleótidos específicos F-BdcNTRC y R2-BdcNTRC (Tabla II. 7) diseñados a partir de la secuencia disponible en la base de datos. Se utilizaron RNAs aislados de dos tipos de tejidos, hojas y semillas maduras. Los productos de estas reacciones se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, se purificaron y se clonaron en el vector pGEM-T para su secuenciación. Al comparar las secuencias de estos cDNAs con la procedente de la base de datos se comprobó que, mientras el cDNA de hoja era idéntico al depositado en dicha base de datos, el de semilla era mayor debido a una inserción de 23 pb adicionales que no alineaban con ninguna región de las otras dos secuencias. En la Figura III. 5 se muestra el fragmento de alineamiento correspondiente a la región donde se localiza el inserto de 23 pb. El alineamiento completo de las secuencias se muestra en el Anexo I. Figura III. 5. Fragmento del alineamiento de las secuencias de los cDNAs de NTRC de hoja (BdNTRC_hoja) y semilla (BdNTRC_semilla) con la secuencia proveniente de la base de datos (BdNTRC_db). El alineamiento de las secuencias de nucleótidos se realizó mediante el programa Clustal Omega. RESULTADOS 99 Cuando se compararon las secuencias del cDNA aislado de semilla con la del gen BdNtrC (Figura III. 6) se observó que la secuencia adicional de 23 pb correspondía al final del intrón 4. Estos datos sugirieron la posibilidad de que el mensajero que codificaba para NTRC en semilla se procesase de forma diferente al de hoja, de este modo, se obtendrían dos mensajeros distintos para NTRC según el tipo de tejido. Para testar si estos dos tipos de transcritos podrían identificarse mediante electroforesis en estudios de RT-PCR, se diseñó una pareja de oligonucleótidos localizados al final del exón IV y principio del V (BdNTRC-I4-F y BdNTRC-I4-R; Tabla II. 5), de forma que flanquease al intrón 4 (Figura III. 7A). En aquellos casos donde se conservasen los 23 pb, el tamaño de la secuencia amplificada sería ligeramente mayor. El análisis de distintos clones de cDNA de NtrC obtenidos a partir de RNA aislado de semillas de Brachypodium (Figura III. 7B) mostró que en este tejido coexistían los dos tipos de mensajeros, a los que denominamos estándar (SS) y alternativo (AS), siendo el mensajero alternativo el que se obtuvo en tres de los cuatro clones analizados. gBdNtrC_Db TGTTAGCTCCTCTTCAGTTGCATGATGTATTAATGAAGTAAAATTTCAAT BdNTRC_semilla -------------------------------------------------- gBdNtrC_Db TCCCTGGATGTTTGGTTAACAGGTTGATTATGGCGAATGTTTCAGAGTAC BdNTRC_semilla ---------------------GGTTGATTATGGCGAATGCTTCAGAGTAC ****************** ********** gBdNtrC_Db TCAACAACCCCAACATAACAGTACATTTCAATACAGAAGCTGTGGATGTT BdNTRC_semilla TCAACAACCCCAACATAACAGTACATTTCAATACAGAAGCTGTGGATGTT ************************************************** gBdNtrC_Db GTCAGCAATCCCAAAGGCCAGATGTCGGGTATTCAATTGAGGAGAATCGA BdNTRC_semilla GTCAGCAATCCCAAAGGCCAGATGTCGGGTATTCAATTGAGGAGAATCGA ************************************************** Figura III. 6. Comparación de secuencias de la región del gen NtrC entre el final del intrón 4 y principio del exón V con el cDNA clonado de semillas (BdNTRC_semilla). La secuencia del gen NtrC se obtuvo de la base de datos (gBdNtrC_Db). En verde se resalta la secuencia intrónica, correspondiente al final del intrón 4, y en negro, la secuencia exónica (exón V). Subrayada se resalta la secuencia conservada de 23 pb. El alineamiento de las secuencias de nucleótidos se realizó mediante el programa Clustal Omega. RESULTADOS 100 III.2.2. Estudio de procesos de splicing alternativo del gen NtrC Los resultados obtenidos en el apartado anterior, mostrando la presencia de mensajeros alternativos del gen BdNtrC, sugirieron la posibilidad de que se produjeran diversos procesos de splicing alternativo en la expresión de este gen. El hecho de haberse identificado en cDNAs de semillas sugirió también que estos procesos podían estar asociados al tipo de tejido. Para abordar el estudio de posibles eventos de splicing alternativo se utilizó el siguiente diseño experimental. Se diseñaron distintas parejas de oligonucleótidos en las secuencias que flanquean a cada intrón (Tabla II. 5), como se indica en la Figura III. 8A, de modo que mediante análisis de RT-PCR podrían identificarse los casos donde hubiese retenciones totales o parciales del intrón, que darían lugar a la aparición de más de una banda en electroforesis en geles de agarosa. Para este estudio se empleó cDNA sintetizado a partir de RNAs aislados de 3 tejidos diferentes: cotiledón, raíz y semilla madura de Brachypodium. Los cotiledones y raíces se diseccionaron de semillas germinadas durante 5 días. Como control negativo se empleó RNA sin retrotranscribir procedente de cada uno de los tejidos analizados. Figura III. 7. A, Esquema de la estructura del gen NtrC de Brachypodium y posición de los oligonucleótidos utilizados. Las flechas indican la zona en la cual se diseñó la pareja de oligonucleótidos, rojo (sentido) y azul (anti-sentido). B, Fragmentos obtenidos mediante PCR con clones de cDNA de NtrC. Como controles se emplearon los clones de NtrC de semilla (01) y hoja (01) que habían sido previamente secuenciados. RESULTADOS 101 Los resultados obtenidos (Figura III. 8B) mostraron la existencia de dos poblaciones de mensajeros para NTRC asociados a la retención de la secuencia de 23 pb correspondientes al final del intrón 4. Ambas poblaciones de mensajeros estaban presentes tanto en tejidos fotosintéticos como heterotróficos pero existían diferencias entre los niveles de expresión según el tejido: en tejidos fotosintéticos el mensajero SS era mucho más abundante que el AS, mientras que en tejidos heterotróficos (tanto raíz como semilla) el nivel de expresión de ambos mensajeros era similar. No se observaron otros fenómenos de splicing alternativo ni en hoja ni semilla, pero sí en raíces. Tanto en el intrón 1, como en los intrones 3 y 7 se observaron dos bandas, una inferior de mayor intensidad, que se correspondería con el mensajero estándar y otra superior, de intensidad muy débil, que correspondería con el tamaño esperado para la retención total del correspondiente intrón. Así pues, de estos Figura III. 8. A, Esquema del gen NtrC de Brachypodium y diseño de los oligonucleótidos para el estudio de splicing alternativo. Cada oligonucleótido sentido (rojo) va acompañado de su oligonucleótido anti-sentido (azul) que se encuentra en el exón contiguo. B, Identificación de eventos de splicing alternativo del gen NtrC. Para la correcta visualización de los productos de las PCRs se realizaron geles al 2,5% en todos los casos, salvo para la región del intrón 4, donde se utilizaron geles del 3,5% de agarosa. RESULTADOS 102 resultados se concluye que la expresión del gen NtrC se encuentra sujeta a fenómenos de splicing alternativo y que al menos uno de estos fenómenos se produce en todos los tejidos estudiados. III.2.3. Caracterización del mensajero alternativo III.2.3.1. Mecanismo de formación del mensajero alternativo El mensajero alternativo del gen NtrC observado en los distintos tejidos de Brachypodium correspondería a la retención de una secuencia de 23 pb al final del intrón 4. El análisis de la secuencia retenida en dicho mensajero muestra la presencia de un dinucleótido canónico “AG”, 23 nucleótidos aguas arriba del aceptor que genera el transcrito normal, y que podría ser utilizado como aceptor alternativo por la maquinaria del espliceosoma. La adición de estos 23 nucleótidos resulta en un cambio en la fase de lectura, provocando la aparición de un codón de parada prematuro en el mensajero (Figura III. 9). Figura III. 9. Esquema de splicing alternativo y formación de dos tipos de mensajeros de NtrC. Se muestra la estructura del gen NtrC de Brachypodium señalándose las regiones que componen cada dominio. En la representación se muestra la secuencia de los exones IV y V (en negro) así como, la secuencia intrónica que los separa (en verde), resaltándose las 2 parejas de dinucleótidos “AG” aceptores para el proceso de escisión de intrones y ensamblaje de exones. El mensajero alternativo contiene 23 nucleótidos adicionales que provocan la aparición de un codón de parada prematuro (estrella amarilla). RESULTADOS 103 III.2.3.2. Conservación del proceso de splicing alternativo en genes NtrC de plantas y expresión diferencial en tejidos fotosintéticos y heterotróficos La presencia del mensajero alternativo, debido a la retención de 23 nucleótidos correspondientes al final del intrón 4, identificado aquí para el gen NtrC de Brachypodium, se había observado previamente en el gen de arroz (Pérez-Ruiz, 2006). Este resultado sugería la posibilidad de que se tratara de un fenómeno conservado en más organismos. Para comprobar esta posibilidad se realizó el alineamiento de esta región del gen NtrC de distintas plantas. La Figura III. 10 muestra que, aunque la composición de este intrón es muy variable entre los organismos comparados, la secuencia final correspondiente a los 23 nucleótidos del evento de splicing alternativo se encuentra muy conservada, manteniendo además todas ellas el dinucleótido canónico “AG” necesario para el procesamiento alternativo. G. max10 ACTCCCTGAATGTTTGTTTAACAGGTTGATTATCACGAATGTTTCAGAGTGTTTGACAAT G. max02 ACTCCCTGAATGTTTGTTTAACAGGTTGATTATCACGAATGTTTCAGAGTGTTTGACAAT T. cacao ACTCCCTGAATGTTTGTTTAACAGGTTAATTATCGCGAATGTTTCAGAGTTTACAACAAT V. vinifera ACTCCTTGAATGTTTGTTTAACAGGTTGATTATGGCGAATGTTTCAGAGTTCACAACAAT S. lycopersicum04 CTCCCTG-CATGGTTGTTTAACAGGTTGATTATCGCGAATGTTTCAGAGTTTTTAACAGT S. lycopersicum10 CTCCCTGAAATGTTTGTTTAACAGGTTGATTATGGGGAATGTTTCAGAGTTTTCAACAAT S. tuberosum10 CTCCCTGAAATGTTTGTTTAACAGGTTGATTATGGGGAATGTTTCAGAGTTTTCAACAAT A. thaliana ACACCCTGAGTGTTTTTTTAACAGGTTGGTTATGGCGAATGTTTCAGAGTGATCAACAAT Z. mays ATTCGCTGGATGTTTGGTTAACAGGTTGATTATGGCGAATGTTTCAGAGTACTCAACAAC O. sativa ATTCCCTGGATGTTTGGTTAACAGGTTGATTATGGCGAATGTTTCAGAGTACTCAACAAT B. distachyon ATTCCCTGGATGTTTGGTTAACAGGTTGATTATGGCGAATGTTTCAGAGTACTCAACAAC * ** ** ********** **** ************** *** G. max10 CCCAATGTCACTGTGCACTTCAATACAGA G. max02 CCCAATGTCGCTGTGCACTTCAATACAGA T. cacao CCAAATATCACATTGCACTTCAATACAGA V. vinifera CCGAATATCACCTTGCACTTCAATACAGA S. lycopersicum04 TCAAACATCACTGTGCATTTCAACACTGA S. lycopersicum10 CCAAACATCACTGTGCATTTCAACACTGA S. tuberosum10 CCAAACATCACTGTGCATTTCAACACTGA A. thaliana CCAAACATCACAGTGCATTACAACACGGA Z. mays CCCAACATAACAGTACATTTCAATACAGA O. sativa CCCAACATAACAGTACATTTCAATACAGA B. distachyon CCCAACATAACAGTACATTTCAATACAGA * ** * * * ** * *** ** ** Figura III. 10. Alineamiento de la secuencia de nucleótidos correspondientes al final del intrón 4 y principio del exón V del gen NtrC de plantas. En verde se muestra la secuencia correspondiente al final del intrón 4, en negro la secuencia correspondiente al exón V y subrayada la secuencia de 23 nucleótidos correspondientes al final del intrón. En el recuadro rojo se señala la conservación del dinucleótido aceptor “AG” alternativo, necesario para la formación del nuevo mensajero. El alineamiento de las secuencias se realizó mediante el programa Clustal Omega. Los números de acceso para cada secuencia son los mostrados entre paréntesis: G. max Cr 02 y Cr 10 (GeneID:100794561 y GeneID:100819254); T. cacao (GeneID:18598885); V. vinifera (GeneID:100262307); S. lycopersicum Cr 04 y 10 (GeneID:101266017 y GeneID:101254347); S. tuberosum (GeneID:102585390); A. thaliana (GeneID:818766); Z. mays (GeneID:100216789); O. sativa (GeneID:102716057); B. distachyon (GeneID:100829068). RESULTADOS 104 Por el contrario, cuando se incorporaron a este análisis las secuencias correspondientes al gen NtrC para el alga verde Chlamydomonas reinhardtii y el musgo Physcomitrella patens (Figura III. 11) no se encontró la secuencia de 23 nucleótidos en la región comparada. Estos datos indican, por tanto, que el procesamiento alternativo del gen NtrC está altamente conservado en plantas superiores y ausente en el resto de organismos fotosintéticos. Una vez identificada la presencia de la secuencia de 23 pb que sufre splicing alternativo en genes NtrC de distintas especies vegetales, se utilizó la técnica de RTPCR para comprobar la presencia de ambos mensajeros en algunas de estas especies. Para ello se diseñaron oligonucleótidos flanqueando la región de interés para los genes NtrC de la planta modelo Arabidopsis thaliana y también para las dos copias del gen presentes en tomate (Figura III. 12A y Tabla II. 6). En este último caso, los oligonucleótidos se diseñaron de modo que permitiesen discernir entre la amplificación de las dos copias del gen en tomate. En el caso de esta planta, al proceder las muestras de semillas germinadas durante 5 días, se pudieron analizar los tres tipos de tejido presentes en esa fase de desarrollo: cotiledones, hipocotilo y C. reinhardtii TGTGCCCTCCCTCTCT----CGCTCTCGCTCTCCCTGCTCCCCCT-CCTCCTCCTCCTCC P. patens20 TTCTGTTTGCTGATCTGAATGTTTAATGATCATTTTTGTGATGGAATTCCAGAGTTCTTA P. patens23 TTGTGGATGTTTATTTTTTTTCCTGATGAACGTTCTTGTTATGGAATTTCAGAGTTATCA B. distachyon TTTCAATTCCCTGGATGTTTGGTTAACAGGTTGATTATGGCGAATGTTTCAGAGTACTCA A. thaliana TTTCAACACCCTGAGTGTTTTTTTAACAGGTTGGTTATGGCGAATGTTTCAGAGTGATCA S. lycopersicum10 TTTCAACTCCCTGCATGGTTGTTTAACAGGTTGATTATCGCGAATGTTTCAGAGTTTTTA * * * * * * * C. reinhardtii TCAGGCGGAGCGCTGGGGCAGCGAGCTGTACACTGAGGACGTGGAGCAGGTGGACCTGTC P. patens20 ACAATCCAAATATT--ACAGTCCACTTCAACACAGAGACAGTGGATGTCGAGGCTGACGA P. patens23 ATAATCCAAATATT--ACTGTCCACTTCAACACAGAGACAGTGGATATCGAGGCTGATGA B. distachyon ACAACCCCAACATA--ACAGTACATTTCAATACAGAAGCTGTGGATGTTGTCAGCAATCC A. thaliana ACAATCCAAACATC--ACAGTGCATTACAACACGGAAACCGTGGACGTATTGAGCAACAC S. lycopersicum10 ACAGTTCAAACATC--ACTGTGCATTTCAACACTGAGACTGTTGACGTTGTCAGCAACTC * * * * ** ** ** ** Figura III. 11. Alineamiento de la secuencia de nucleótidos correspondientes al final del intrón 4 y principio del exón V del gen NtrC en organismos eucarióticos fotosintéticos. En verde se muestra la secuencia correspondiente al final del intrón 4, en negro la secuencia correspondiente a la región exónica V y subrayada la secuencia de 23 nucleótidos correspondientes al final del intrón, presente tan sólo en el grupo de plantas con semillas. El alineamiento de las secuencias se realizó mediante el programa Clustal Omega. Los números de acceso para cada secuencia son los siguientes: C. reinhardtii (GeneID:5715808); P. patens Cr 20 y 23 (GeneID:5916755 y GeneID:5948454); S. lycopersicumCr10 (GeneID:101254347); A. thaliana (GeneID:818766); B. distachyon (GeneID:100829068). RESULTADOS 105 raíces. Para el caso de Arabidopsis se analizaron las hojas y raíces procedentes de plántulas de 15 días crecidas en medio MS con sacarosa. Los resultados de este análisis (Figura III. 12B y 12C) revelaron que, efectivamente, este fenómeno de splicing alternativo se producía también en otras plantas, y que en organismos con dos copias para el gen NtrC ambas se expresaban y sufrían este tipo de procesamiento alternativo. Los resultados también mostraron que en estas plantas, al igual que en Brachypodium, existían diferencias entre los niveles de un tipo de mensajero u otro según el tejido analizado, y que en el caso de tomate existían también diferencias entre los niveles de ambos transcritos del gen NtrC de los dos cromosomas. Acorde a lo observado mediante RT-PCR, los niveles de proteína NTRC tanto en Arabidopsis como en tomate resultaron ser inferiores en raíces que en hipocotilo y cotiledón, presentando este último los niveles más elevados. Estos resultados, sugieren que este evento de splicing alternativo, que afecta a la expresión de los genes NtrC de plantas, Figura III. 12. Identificación de procesos de splicing alternativo del gen NtrC en Arabidopsis y tomate. (A) Las flechas sobre el gen indican la zona donde se diseñaron los oligonucleótidos, sentido (rojo) y anti-sentido (azul). Análisis de los productos de RT-PCR obtenidos a partir de RNA total aislado de los tejidos indicados de Arabidopsis (B) y tomate (C). Para el caso de tomate se indica el cromosoma (04 ó 10) en el que se encuentra la copia del gen NtrC. Para ambos casos se determinó la proporción AS/SS mediante la cuantificación de la intensidad de las bandas con el programa Scion Image. El contenido de proteína NTRC en estos tejidos se determinó mediante Western-blot a partir de extractos proteicos totales de cada uno de los tejidos estudiados (12,5 µg para hojas y cotiledones, 25 µg para hipocotilo y raíces) usando el anticuerpo primario anti-NTRC. H, hoja; C, cotiledón; R, raíz; Hc, hipocotilo. RESULTADOS 112 III.3. GENERACIÓN DE PLANTAS DE BRACHYPODIUM CON NIVELES ALTERADOS DE NTRC EN SEMILLAS El descubrimiento de la presencia de NTRC en plastos de tejidos fotosintéticos y no fotosintéticos, como la raíz (Kirchsteiger et al., 2012), sugirió la posibilidad de que esta enzima pudiese estar también presente en plastos de otros tejidos heterotróficos como los amiloplastos del endospermo de semillas de cereales. En este tipo de tejido el almidón constituye el principal polisacárido de reserva. Una de las enzimas claves en el proceso de síntesis de almidón es la AGPasa que cataliza la conversión de Glu-1-P en ADP-Glu, forma activada de la glucosa que se incorpora al polisacárido. La reacción catalizada por la AGPasa constituye un paso limitante en la ruta de síntesis de almidón y está sometida a regulación por diferentes mecanismos. Entre estos se encuentra la regulación redox de la AGPasa plastidial, mediada por Trx f y NTRC (Lepisto et al., 2013; Thormahlen et al., 2013; Geigenberger and Fernie, 2014). En este sentido, cabe Figura III. 18. Identificación de la posible forma truncada de NTRC mediante electroforesis bidimensional de extractos proteicos de semillas maduras. Se emplearon 500 µg de extracto proteico para la electroforesis bidimensional. Para la primera dimensión se emplearon tiras de IPTG de rango pH 3 a 10 lineal. En la segunda dimensión se utilizaron geles de acrilamida al 11%. Arriba, resultado del Western-blot usando como anticuerpo anti-NRTB. Abajo, tinción del gel con azul de Coomasie. En rojo se señalan las manchas candidatas a ser la proteína de interés. RESULTADOS 113 destacar que los mutantes de Arabidopsis carentes de NTRC muestran alteración del estado redox de la AGPasa, que presenta menor nivel de reducción en respuesta a luz o azúcares lo que se relaciona con el menor contenido de almidón en hojas y raíces de estas plantas (Michalska et al., 2009). Resultados previos obtenidos por nuestro grupo mostraron que NTRC está presente en el endospermo de semillas de cereales como el arroz y el trigo (Cano, 2013). Aunque se desconocen los mecanismos de regulación de la AGPasa en endospermo de cereales, el estudio de proteínas diana de NTRC de este tejido, mediante cromatografía de afinidad e inmunoprecipitación, permitió identificar diversas proteínas implicadas en la síntesis de almidón, como la AGPasa, el transportador de ADP-Glu y enzimas ramificantes, entre otras, que serían por tanto posibles proteínas reguladas por NTRC (Cano, 2013). Estos resultados plantearon la posibilidad de que el proceso de síntesis de almidón en el endospermo esté sujeto a control redox, donde NTRC podría jugar un papel central regulando enzimas que participan de forma directa o indirecta en la síntesis de este polisacárido. Dada la importancia económica del almidón, no sólo por ser el principal aporte de carbohidratos de la dieta humana y del ganado, sino también como combustible y aditivo en numerosos procesos industriales, las estrategias biotecnológicas encaminadas a mejorar el contenido de almidón en cereales son de gran relevancia. Basándonos en los datos previamente descritos que indican la posible función de NTRC en el proceso de regulación de su síntesis, otro de los objetivos de este trabajo ha consistido en analizar en mayor profundidad la participación de NTRC en la regulación redox de la síntesis de almidón en semillas de cereales y su posible aplicación biotecnológica. Para abordar este objetivo se eligió como planta modelo el cereal Brachypodium distachyon y se desarrollaron estrategias para generar plantas transgénicas de este cereal con niveles alterados de NTRC en endospermo de semillas. III.3.1. Construcción del transgén Para la generación de plantas transgénicas de Brachypodium se utilizó un vector de expresión basado en el vector binario pBrachyTAG-G210 (G210), cedido por V. Thole y P. Vain del John Innes Center, Norwich (Reino Unido). Este vector posee un tamaño total de 5.848 pb, proporciona resistencia a kanamicina en bacterias y RESULTADOS 114 contiene como marcador de selección de las plantas transformadas el gen de resistencia a higromicina. Respecto al diseño del transgén, como nuestro objetivo consistía en expresar NtrC específicamente en endospermo de semillas de Brachypodium, se abordó una búsqueda de genes de este cereal con alto nivel de expresión en endospermo. Como resultado de esta búsqueda se identificó el gen GLU1, que codifica para una glutenina y que, efectivamente, muestra un alto nivel de expresión específicamente en endospermo de semillas sin que se detecte un nivel significativo de expresión en el embrión ni en otros órganos de la planta (Coussens et al., 2012). Por tanto, se eligió el promotor del gen GLU1 para expresar NtrC. La clonación del promotor GLU1 se realizó por PCR a partir de DNA genómico de hoja utilizando la pareja de oligonucleótidos F-PromotGlu1 y R-PromotGlu1 (Tabla II. 7). Los productos procedentes de la amplificación se clonaron en el vector pGEM-T y se secuenciaron. Ya que en nuestro grupo se había caracterizado el gen NtrC de arroz, se utilizaron tanto el cDNA de NTRC de arroz como el de Brachypodium, previamente clonados en pGEM-T, para la generación de plantas transgénicas. El cDNA completo del gen NtrC de Brachypodium se amplificó mediante RT-PCR a partir de mRNA total de hoja, usando las parejas de oligonucleótidos F-BdcNTRC y R2-BdcNTRC (Tabla II. 7). Los productos obtenidos se clonaron en el vector pGEM-T y se secuenciaron. Para completar la estructura del transgén se añadió el terminador NosTer, que se clonó a partir del vector G210. La construcción del transgén se llevó a cabo de forma secuencial empleando las dianas de restricción StuI, ApaI y BsiwI presentes en el T-DNA del vector G210 y situadas aguas abajo de p35S::Hyg. El promotor GLU1 se amplificó a partir de la secuencia ya clonada en el vector pGEM-T utilizando una nueva pareja de oligonucleótidos (F-PGlu1_StuI y R-PGlu1_ApaI; Tabla II. 8) que añadían las secuencias dianas de StuI y ApaI a los extremos 5’ y 3’ del promotor, respectivamente. Para la clonación en G210 del cDNA de NtrC y el terminador NosTer se siguió la siguiente estrategia. Las secuencias de cDNA del gen NtrC se amplificaron a partir de las ya clonadas en pGEM-T, empleando los oligonucleótidos F-BdNTRC_BsiwI y RESULTADOS 115 R-BdNTRC_SacI para el cDNA de Brachypodium y F-OsNTRC_ApaI y R-OsNTRC_SacI para el cDNA de arroz, que añadieron las correspondientes dianas de restricción (Tabla II. 8). El terminador Nos se amplificó a partir del vector G210, empleando los oligonucleótidos F-NosT_SacI y R-NosT_BsiwI (Tabla II. 8). Los productos obtenidos se digirieron con la enzima SacI que permitió la posterior ligación del terminador con el cDNA de NtrC. Los productos de esta ligación, NtrC::NosTer, se clonaron en un vector G210 que ya contenía el promotor GLU1. Las construcciones finales (Figura III. 19) se secuenciaron para comprobar la total integridad del transgén así. Finalmente, el vector G210::pGLU1::NtrCBd/Os::NosTer se co-transfirió junto al plásmido pSoup, mediante electroporación, a la cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens. III.3.2. Generación de plantas de Brachypodium con niveles alterados de NTRC en endospermo de semillas Para la generación de plantas transgénicas de Brachypodium se transformaron callos embriogénicos compactos (CECs) con la cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens portadora de las construcciones descritas en el apartado anterior. Para ello se optimizó un protocolo de transformación de callos de Brachypodium mediante modificaciones de protocolos ya publicados (Christiansen et al., 2005; Vogel et al., 2006; Vain et al., 2008; Vogel and Hill, 2008), que se explica con detalle en el apartado II. 7 de Materiales y métodos. A continuación se describe de manera esquemática cada Figura III. 19. Representación esquemática de la construcción pGLU1::NtrC::NosTer introducida en el vector pBrachyTAG-G210. La clonación se realizó en dos pasos, primero la inserción del promotor GLU1 y luego la inserción del cDNA del gen NtrC (de arroz o de Brachypodium) fusionada a NosTer. Esquema a escala indicando los sitios de restricción empleados en la clonación. Diseño realizado con el programa pDraw32. RESULTADOS 116 uno de los pasos de dicho protocolo, resaltando los principales puntos críticos en cada uno de ellos. a) Obtención de embriones. Los embriones inmaduros se aislaron de semillas en desarrollo que presentaban un endospermo flexible y blando al tacto. Durante la extracción y manipulación del embrión se evitó dañar el escutelo, ya que a partir de éste se originan los callos embriogénicos compactos (CECs). La adecuada selección del embrión supone el primer paso crítico de la transformación. No todos los embriones son capaces de generar CECs. Los embriones pequeños y translúcidos, como el mostrado en la Figura III. 20, son los que generaron callos de mejor calidad y rendimiento. A medida que el embrión madura la tasa de formación de CECs decae. b) Generación de CECs. Los embriones aislados se colocaron con la cara del escutelo hacia abajo en medio CIM, durante un periodo total de 6 semanas. Como se observa en la Figura III. 21, tras la primera semana cada embrión generó un brote que se eliminó tan pronto como fue posible ya que su crecimiento afecta a la formación del callo. A partir del escutelo se observó la formación de distintos tipos de tejidos, por un lado callos blanquecinos de aspecto acuoso, no compactos, que se descartaron y, por otro lado, callos de color amarillo compactos, que se transfirieron y sub-cultivaron en medio CIM fresco hasta que estos CECs estuvieron listos para ser transformados. Durante esta etapa se comprobó que existe una estrecha relación entre el estado de desarrollo del embrión y la proporción de la formación de ambos tipos de callos. Figura III. 20. Producción de embriones inmaduros. Las espigas se obtuvieron de plantas de Brachypodium distachyon Bd21 tras 10 semanas de crecimiento. Las flechas azules señalan la localización en la espiga de las semillas de interés para el aislamiento de embriones (A). En el panel B se muestran distintos estadíos de desarrollo de embriones aislados, de más inmaduro (izquierda) a más maduro (derecha). RESULTADOS 117 Cuanto más maduro es el embrión mayor es la proporción de callos no compactos generados. c) Transformación. Los CECs se transfirieron a tubos que contenían la suspensión de Agrobacterium portadora del vector G210 con el transgén y se incubaron a temperatura ambiente con agitación suave durante al menos 5 min, pudiendo prolongarse este tiempo hasta 30-45 min. Se comprobó que tiempos superiores de incubación afectaban a la integridad de los callos, complicando su posterior manipulación. Tras la incubación, se descartó la suspensión de bacterias y los CECs se transfirieron a placas Petri con papel de filtro estéril, consiguiendo así eliminar el excedente de Agrobacterium. Los callos se dejaron secar unos minutos y, a diferencia de lo descrito en los protocolos empleados como referencia, se transfirieron a nuevas placas Petri con papel de filtro estéril y seco, en vez de humedecerlo con medio CIM y acetosiringona. Posteriormente, se incubaron por un periodo de 5 días en oscuridad a temperatura ambiente. El secado de los callos tras la incubación con Agrobacterium supone el principal punto crítico del proceso de transformación. A través de este paso se promueve la transformación del callo y se limita el sobre-crecimiento de Agrobacterium, evitando posteriores problemas de contaminación del medio por esta bacteria. d) Selección de callos transformados. La selección de callos transformados se realizó en medio CIM suplementado con timentina, que inhibe el crecimiento de Agrobacterium, e higromicina, que inhibe el crecimiento de los callos no Figura III. 21. Producción de callos embriogénicos compactos (CECs) en medio CIM. Eliminación de brotes durante la primera semana y selección de callos embriogénicos compactos (A). Selección y multiplicación de callos tras 4 semanas en medio CIM (B). Callos tras 6 semanas en medio CIM, antes de ser transformados (C). RESULTADOS 118 transformados. En la Figura III. 22 se observa como durante la primera semana de selección los callos experimentaron un rápido crecimiento y se comenzó a distinguir dos grupos, uno formado por callos de color amarillo y con aspecto saludable, y otro formado por callos de color más oscuro, que mostraron menor crecimiento. El proceso de selección no debe ser superior a 5 semanas, ya que pasado este tiempo los callos van perdiendo capacidad de regeneración. Siempre que las condiciones lo permitieron, se estableció 4 semanas como el tiempo óptimo de selección. Durante el proceso de optimización de este protocolo se comprobó que la exposición continua a elevadas concentraciones de higromicina terminaba generando daños bien a los callos al final del proceso de selección, o bien a los callos o brotes durante el proceso de regeneración, provocando una importante pérdida de eficiencia en la aparición de posibles transformantes. Con el fin de evitar este problema, y a diferencia de lo descrito en los protocolos de referencia utilizados, la concentración de higromicina se redujo a la mitad tras la primera semana de selección, manteniéndose esta nueva concentración durante las siguientes fases. e) Regeneración de plantas transformadas. Los callos de aspecto saludable se transfirieron a medio de regeneración suplementado con timentina e higromicina y se incubaron en luz en condiciones de día largo, durante un periodo máximo de 4 semanas. Posteriormente, los brotes se trasplantaron a tubos que contenían medio inductor de raíces suplementado con timentina y se incubaron en las condiciones anteriores hasta que se desarrolló completamente el sistema radicular. Es importante Figura III. 22. Transformación de CECs y selección de callos transformados en medio CIM. Los callos no transformados (flechas azules) mueren durante las primeras semanas en medio de selección (A). Los callos de aspecto saludable (B) se transfieren a medios de regeneración RESULTADOS 119 que durante el traspaso de los brotes a los tubos se arrastre la menor cantidad posible de restos del callo ya que éstos pueden dar lugar a una nueva plántula completa que es difícil de separar de la ya regenerada a partir del brote. Finalmente, las plántulas se transfirieron a semilleros con turba vegetal y se aclimataron a las nuevas condiciones de crecimiento en fitotrones a 22-25ºC y humedad relativa del 70%, por un periodo de dos semanas, antes de ser transferidas las cámaras de cultivo donde se crecieron hasta completar su ciclo. Durante el desarrollo y adecuación de este protocolo se co-cultivaron con Agrobacterium un total de 1.129 callos embriogénicos, consiguiéndose regenerar completamente 37 plantas, de las cuales 22 procedían de transformaciones con la construcción de cDNA de NtrC de Brachypodium y 15 de la de arroz. La determinación de la presencia del transgén en las plantas transformadas se llevó a cabo mediante PCR a partir de DNA genómico de hoja, tomando dos muestras independientes por cada planta. Para dicho objetivo se emplearon 3 parejas diferentes de oligonucleótidos recogidos en la Tabla III. 2, cuyas se secuencias se muestran en las Figura III. 23. Regeneración de plántulas. Los callos transformados se transfieren a medios de formación de tallos hasta que generan brotes sanos (4 semanas) (A) que se transfieren a medios de enraizamiento (B) hasta que desarrollan un sistema radicular adecuado para su transferencia a tierra (3 semanas) (C). Plantas transformadas crecidas en tierra hasta completar su ciclo. Fotografía de planta tras 2 (D) y 8 semanas (E) en tierra. RESULTADOS 120 Tablas II. 5, 8 y 9, que amplifican distintas regiones del T-DNA, de forma que se comprobase la integración completa del mismo en el genoma de la planta (Figura III. 24A). Tabla III. 2. Parejas de oligonucleótidos empleados para determinar la presencia del transgén en las plantas transformadas y tamaño del producto esperado. Parejas Oligonucleótidos Tamaño amplicón Sentido Anti-sentido BdNTRC P1 F3tf-PromotGlu1 BdNTRC-I1-R 952 pb P2 BdNTRC-I7-F R-NosT_BsiwI 606 pb OsNTRC P1 F3tf-PromotGlu1 R-TransOsNTRC 839 pb P2 Os_F6 R-NosT_BsiwI 724 pb Hyg F-Hyg R-Hyg 390 pb De las 37 plantas analizadas, 16 contenían la construcción pGlu1::BdNTRC::NosTer mientras que 4 contenían la construcción pGlu1::OsNTRC::NosTer (Figura III. 24B y C). Figura III. 24. Análisis de la presencia del transgén en las plantas seleccionadas como posibles transformantes. A, Esquema mostrando la posición de las parejas de oligonucleótidos empleados (P1, P2 y P3). Análisis de los fragmentos de DNA en plantas portadoras de la construcción BdNTRC (B) y OsNTRC (C). Como control positivo se utilizó el vector portador de la construcción y como control negativo DNA genómico procedente de hojas de plantas de Brachypodium no transformadas. El análisis de la presencia del transgén se realizó por duplicado a partir de DNA genómico procedente de dos hojas individuales por cada planta seleccionada. En el caso de que varias plantas se originaran a partir del mismo callo, se nombraron con el mismo número y el superíndice ‘ para distinguirlas (por ejemplo, 1 y 1’). Visualización en geles de agarosa al 1,5%. RESULTADOS 121 A continuación se resumen los resultados obtenidos durante las distintas fases del proceso de transformación de Brachypodium (Tabla III. 3). De un total de 1.129 callos embriogénicos infectados únicamente 623 lograron superar la selección por higromicina, a partir de los cuales se generaron 58 posibles líneas transformantes. Varias de estas líneas no sobrevivieron al ser trasplantadas a tierra descendiendo su número hasta 36, de las cuales sólo 16 resultaron ser portadoras del transgén. Tabla III. 3. Resultados de la transformación de callos embriogénicos de Brachypodium distachyon mediada por Agrobacterium. Nº Callos infectados Nº Callos resistentes Líneas Sobreviven Positivas Eficiencia transformación (%) BdNTRC OsNTRC 662 467 384 239 30 28 21 15 12 4 1,81 0,85 Total 1.129 623 58 36 16 1,42% La eficiencia total de transformación (calculada como número de plantas positivas x 100 / nº callos transformados), fue del 1,42%. Sin embargo, este resultado no muestra la eficiencia real del protocolo descrito anteriormente. Puesto que en nuestro grupo nunca antes se había realizado transformación de cereales, parte de este trabajo ha consistido en la optimización de un protocolo de transformación acorde a las condiciones de trabajo y materiales disponibles. En la Tabla III. 4 se recoge la evolución de los resultados obtenidos desde las primeras transformaciones, aplicando los protocolos descritos en la bibliografía empleada, hasta las transformaciones realizadas finalmente con el protocolo descrito en este trabajo. A continuación se describe las modificaciones realizadas en cada evento de transformación:  E1, recoge los resultados obtenidos tras aplicar el protocolo cedido por el grupo de la Dra Pilar Carbonero (González-Calle, 2014).  E2, recoge los resultados obtenidos al incrementar hasta 400 µM la concentración de acetosiringona en el médio CIM para la resuspensión de las células de Agrobacterium utilizadas en la transformación. RESULTADOS 128 III.3.4. Caracterización de semillas procedentes de plantas T1 Una vez establecidos los contenidos de NTRC en las líneas transgénicas seleccionadas en la generación de plantas T0, se seleccionaron las líneas BdNTRC#28 y #29, como posibles candidatas a ser sobre-expresoras de NTRC, así como una de las posibles líneas supresoras, BdNTRC#1, para la posterior caracterización de las semillas T2. Las semillas T1, obtenidas a partir de las plantas transgénicas T0, incluyen tanto semillas silvestres como transgénicas. Por este motivo, se determinó la presencia del transgén en las plantas T1 del mismo modo descrito anteriormente. En la Tabla III. 5 se muestra un resumen del número de semillas T1 germinadas y la proporción de plantas generadas que presentaron el transgén para cada línea. La segregación obtenida para las líneas BdNTRC#1 y #28 sugiere que estas líneas podrían tener más de una copia del transgén. Tabla III. 5. Resumen de la segregación del transgén en las líneas BdNTRC#29, BdNTRC#28 y BdNTRC#1 en la generación T1. Líneas Nº de semillas a germinar Total semillas germinadas Nº plántulas genotipadas Nº plántulas transgénicas Segregación (%) BdNTRC#29 20 13 12 9 75% BdNTRC#28 23 18 17 14 82,4% BdNTRC#1 24 20 20 18 90% NT 13 13 - - - Así, las plantas generadas de las líneas transgénicas de las que se había confirmado la presencia del transgén se cultivaron en invernadero, junto a plantas NT, hasta completar su ciclo de vida con la consiguiente producción de una nueva generación de semillas. No se observaron diferencias significativas durante el desarrollo de las plantas transgénicas seleccionadas en relación con las NT (Figura III. 30). Ambos grupos de plantas completaron su ciclo de vida en un periodo total de 4 meses. Tampoco se observaron diferencias respecto al porte de la planta, número de espigas y estructura de las mismas, siendo por tanto indistinguibles fenotípicamente. Todas las espigas secas de plantas que completaron su ciclo fueron recogidas y almacenadas para su posterior estudio. RESULTADOS 129 El número de semillas obtenidas por línea fue suficiente para poder analizar los efectos de la alteración de los niveles de NTRC en el endospermo. Se obtuvo un total de 15 plantas transgénicas de las cuales 3 procedían del parental BdNTRC#29, 5 plantas del parental BdNTRC#28 y 7 procedentes del parental BdNTRC#1. III.3.4.1. Caracterización fenotípica de semillas transgénicas T2 Semillas representativas de las distintas líneas seleccionadas mostraron diferencias fenotípicas en comparación con las procedentes de plantas NT, siendo el rasgo más característico el menor grosor de las mismas, sin que se observasen cambios significativos en su longitud (Figura III. 31). Figura III. 30. Fenotipo de plántulas T1 generadas a partir de los parentales BdNTRC#29, BdNTRC#28 y BdNTRC#1 en comparación con plantas no transformadas (NT). T, planta positiva para el inserto; -, planta negativa para el inserto. Imagen tomada a los 30 días de la germinación. A la derecha, se muestra el aspecto de las espigas de algunas de las líneas representativas de cada parental. RESULTADOS 130 El análisis del peso medio de las distintas líneas de semillas obtenidas mostró que las semillas procedentes de plantas transgénicas poseen un peso medio significativamente inferior al de semillas de plantas NT (Figura III. 32), siendo estas diferencias más acusadas en las tres líneas procedentes del parental BdNTRC#29 y en las líneas BdNTRC#28.3 y BdNTRC#1.7. Figura III. 32. Análisis del peso medio de semillas maduras de la generación T2. Las barras de error indican desviación estándar (SD). Las distintas letras representan diferencias estadísticas significativas al P≤0,05 acorde al test de Tukey (ANOVA). Figura III. 31. Fenotipo de las semillas maduras T2 procedentes de las distintas líneas transgénicas cultivadas. En los extremos, enmarcadas en rojo, se muestran semillas procedentes de plantas NT. RESULTADOS 131 III.3.4.2. Análisis de la expresión del gen NtrC en las semillas T2 Con objeto de comprobar si las semillas T2 obtenidas presentaban niveles alterados de expresión de NtrC, se analizaron los niveles de mensajeros de dicho gen mediante PCR cuantitativa empleando los oligonucleótidos recogidos en la Tabla II. 11. En la Figura III. 33 se representa la expresión relativa del gen NtrC en semillas de cada una de las líneas analizadas, así como de semillas NT. Los niveles de mensajeros de NtrC se normalizaron frente a la los niveles de transcritos de la gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y ubiquitina 18 (Ubq18) y se representaron los niveles relativos frente al nivel de expresión en semillas NT, al que se les asignó el valor de 1. En comparación con las semillas silvestres, todas las líneas transgénicas mostraron un incremento de los niveles de mensajero NtrC, a excepción de la línea BdNTRC#1.4 que mostró un nivel de expresión similar al de semillas NT. Por otra parte, como se describió en el capítulo anterior, en Brachypodium, como en otras plantas, el gen NtrC sufre un proceso de splicing alternativo por lo que en las semillas maduras de plantas NT coexisten dos poblaciones de mensajeros, siendo el mensajero AS predominante frente al mensajero SS. Debido a que el transgén introducido contiene el cDNA completo, portador de la secuencia canónica (mensajero SS) del gen NtrC, sería de esperar que la expresión de dicha construcción provocase alteración de las proporciones AS/SS. Con objeto de analizar esta Figura III. 33. Análisis mediante qPCR de los niveles de expresión del gen NtrC en semillas maduras de las distintas líneas transgénicas y de plantas NT. RESULTADOS 132 posibilidad, se analizaron mediante RT-PCR los niveles de transcritos estándar y alternativos en las semillas T2. Los resultados mostraron que las semillas de plantas transgénicas presentaban una reversión en las proporciones AS/SS, con niveles superiores de mensajero estándar respecto al alternativo, salvo en el caso de la línea BdNTRC#1.4 cuyo comportamiento fue similar al de las semillas de plantas NT (Figura III. 34). A partir de los resultados obtenidos, se seleccionaron para los análisis posteriores, por cada parental, las dos líneas que mostraron los niveles más elevados de transcritos: BdNTRC#29.2 y #29.4, BdNTRC#28.3 y #28.7 y BdNTRC#1.7 y #1.8. III.3.4.3. Análisis de los niveles de proteína NTRC en el endospermo de semillas de las líneas seleccionadas Mediante análisis de Western-blot se analizaron los niveles de proteína NTRC en el endospermo de semillas de las 6 líneas seleccionadas. Estos resultados mostraron una mayor acumulación de NTRC en el endospermo de las semillas transgénicas respecto a las plantas transformadas, a excepción de la línea BdNTRC#29.4 que mostró niveles inferiores en comparación a los de las otras líneas transgénicas. Sin embargo, las diferencias en los niveles de proteína NTRC fueron inferiores a las observadas a nivel de transcrito. Figura III. 34. Análisis de los niveles de mensajero estándar y alternativo en semillas maduras de las distintas líneas transgénicas y de plantas NT. Los contenidos de mensajeros estándar (SS) y alternativo (AS) se determinaron mediante análisis de RT-PCR utilizando como molde cDNA sintetizado a partir de RNA total aislado de las semillas que se indican. Los fragmentos se separaron en geles de agarosa al 3,5%. La cuantificación de las bandas se realizó con el programa Scion Image. El ratio entre estos mensajeros se indica debajo de cada muestra. A la izquierda se muestra el tamaño del marcador. RESULTADOS 133 III.3.4.4. Determinación de los niveles de almidón y β-glucanos en las semillas T2 Como se ha descrito anteriormente, resultados previos sugerían la participación de NTRC en la regulación redox de la biosíntesis de almidón en endospermo de semillas de cereales. La estrategia de generar plantas transgénicas de Brachypodium con niveles alterados de NTRC en endospermo de semillas tenía el objetivo de alterar los niveles de almidón y otros polisacáridos de reserva, así como analizar el efecto que pudiera producirse sobre el contenido de proteínas de reserva, ya que las semillas de los cereales constituyen también una importante fuente de proteínas. Así pues, una vez seleccionadas las líneas transgénicas descritas en el apartado anterior se procedió a la caracterización de su contenido en estos compuestos de reserva. Los análisis del contenido en almidón no mostraron diferencias significativas entre las semillas de las líneas BdNTRC#29.2, #28.3, #28.7 y #1.8 y las semillas de plantas NT. Sin embargo, las semillas de las líneas BdNTRC#29.4 y #1.7 mostraron una disminución de en torno al 50% del contenido en almidón (Figura III. 36A). Los análisis de los niveles de β-glucanos mostraron que las semillas de las líneas transgénicas presentaban en general mayor contenido de estos polisacáridos, siendo las diferencias significativas en el caso de las líneas BdNTRC#28.3 y BdNTRC#1.8 (Figura III. 36B). El análisis de la proporción en los contenidos de almidón/β-glucanos en las semillas mostró una disminución de dicha relación en todas las líneas transgénicas con respecto a las semillas NT, siendo estas diferencias mucho más acusadas en las líneas BdNTRC#29.4 y #1.7 con una disminución aproximada del 50% (Figura III. 36C). Figura III. 35. Análisis del contenido de NTRC en semillas de las líneas transgénicas seleccionadas de la generación T2. Se obtuvieron extractos proteicos de semillas maduras de las líneas transgénicas que se indican, así como de plantas no transformadas (NT). Alícuotas de estos extractos se fraccionaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a membranas y la proteína NTRC se detectó mediante el anticuerpo anti-NTRC. La flecha indica la banda correspondiente a NTRC. La transferencia y el nivel de carga se comprobaron mediante tinción con Ponceau. RESULTADOS 134 Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la existencia de un patrón común en el comportamiento de las distintas líneas transgénicas analizadas, que se caracteriza por un ligero incremento en los niveles de β-glucanos y una disminución de la proporción almidón/-glucanos. Estos resultados sugieren que NTRC podría estar implicada en la regulación de la síntesis o partición de carbohidratos en el endospermo durante el desarrollo de la semilla. III.3.4.5. Análisis de los niveles de proteínas de reserva en el endospermo de las semillas T2 Para estudiar en mayor profundidad las posibles alteraciones bioquímicas de las semillas transgénicas se analizó su contenido en proteínas de reserva. Para ello, se fraccionaron las proteínas del endospermo en base a su solubilidad diferencial. Mediante este proceso, se obtuvieron las fracciones de proteínas solubles en sal (tampón fostato sódico y NaCl), solubles en alcohol y la fracción UCT (Urea, CHAPS y Tiourea). Además, en paralelo, se llevaron a cabo extracciones de proteína total. Las Figura III. 36. Contenido de polisacáridos de reserva en semillas maduras de las líneas transgénicas seleccionadas y de plantas NT. La determinación de almidón (A) y β-glucanos (B) se llevó a cabo como se indica en Materiales y métodos. A partir de estos datos se analizó y la proporción almidón/β-glucanos (C). Las letras indican diferencias estadísticas significativas al P≤0,05 obtenidas con el test de Tukey (ANOVA). RESULTADOS 135 distintas fracciones obtenidas se separaron mediante electroforesis vertical en geles de acrilamida. No se observaron diferencias significativas en el patrón de proteínas obtenido del análisis de los extractos crudos ni de las fracciones solubles en sal de las distintas líneas (Figura III. 37A y 37B). Por el contrario, sí se observaron cambios en los niveles de algunas proteínas en las fracciones solubles en alcohol y UCT entre las distintas líneas transgénicas analizadas y respecto a las semillas de plantas NT (Figura III. 38A y Figura III. 39A). Con objeto de analizar dichos cambios con mayor detalle, las bandas de los geles correspondientes a las fracciones solubles en alcohol y UCT se identificaron con los números 1 a 22 (en rojo) y se cuantificó su intensidad. Las Figura III. 38B y Figura III. 39B, muestran los valores relativos de cada una de estas bandas normalizadas frente al valor obtenido para la banda 3, en el caso de las fracciones solubles en alcohol, y la Figura III. 37. Análisis de los extractos crudos y fracciones de proteínas solubles en sal de semillas maduras de las líneas transgénicas seleccionadas y de plantas NT. A partir de semillas de las líneas que se indican se obtuvieron extractos crudos (A) y fracciones solubles en sal (B). Alícuotas de estas fracciones, 80 µg de proteínas de extracto crudo y fracción soluble en sal, se precipitaron con TCA y se resuspendieron en Tris-HCl 100 mM pH 7,9. A todas las muestras se les añadió tampón de carga suplementado con β-ME 14 mM y DTT 10 mM y se analizaron en geles al 12% de acrilamida RESULTADOS 136 banda 18, en el caso de las fracciones UCT, ya que estas bandas no mostraron diferencias entre las distintas líneas. A los valores obtenidos para las semillas procedentes de plantas NT se les asignó arbitrariamente el valor 100%. Figura III. 38. Análisis de las fracciones solubles en alcohol de semillas maduras procedentes de las distintas líneas transgénicas seleccionadas y de plantas NT (A) y nivel relativo de las proteínas de las fracciones soluble en alcohol (B). Alícuotas de estas fracciones, 100 µg, se precipitaron con TCA y se resuspendieron en Tris-HCl 100 mM pH 7,9. A todas las muestras se les añadió tampón de carga suplementado con β-ME 14 mM y DTT 10 mM y se analizaron en geles al 12% de acrilamida. Las proteínas correspondientes a la fracción soluble en alcohol se cuantificaron mediante el programa Scion Image y se normalizaron frente a los niveles de proteína de la banda 3. RESULTADOS 137 Los resultados de las cuantificaciones mostraron, efectivamente, diferencias en los niveles relativos de algunas de estas proteínas en semillas de las líneas transgénicas indicando que la alteración del contenido de NTRC tiene efectos notables sobre estas semillas. Con el fin de determinar a qué proteína se correspondía cada una de las bandas observadas en los geles se procedió a su identificación mediante MALDI-TOF. Figura III. 39. Análisis de las fracciones UCT de semillas maduras procedentes de las distintas líneas transgénicas seleccionadas y de plantas NT (A) y análisis de los niveles relativos de las proteínas de las fracciones (B). Alícuotas de 80 µg se precipitaron con acetona fría y se resuspendieron en tampón Urea 4 M. A todas las muestras se les añadió tampón de carga suplementado con β-ME 14 mM y DTT 10 mM y se analizaron en geles al 12% de acrilamida. Las proteínas correspondientes a la fracción soluble en alcohol se cuantificaron mediante el programa Scion Image y se normalizaron frente a los niveles de proteína de la banda 18. DISCUSIÓN 144 en los cromosomas 2 y 10. La alejada posición filogenética que existe entre el musgo Physcomitrella, G. max y ambas especies del género Solanum, sugieren que la adquisición de la segunda copia del gen NtrC debió tener lugar mediante eventos de duplicación génica independientes a lo largo de la evolución. En este trabajo hemos analizado la expresión de las dos copias del gen NtrC de tomate (S. lycopersicum) encontrando mensajeros de ambos (Fig. III. 12), lo que indica que ambos genes permanecen transcripcionalmente activos y es un dato más a favor de la importancia de NTRC en la evolución de la función cloroplastídica de las plantas. Por otra parte, los resultados procedentes de la comparación de la estructura de los diferentes genes NtrC en distintos tipos de organismos mostraron una gran variabilidad respecto a su tamaño incluso entre las dos copias de las especies que presentaban duplicaciones (Tabla III. 1). Tanto el tamaño de la secuencia codificante como el de la proteína deducida presentaron una mayor homogeneidad entre ellos, por lo que las diferencias encontradas en el tamaño de los genes eran debidas a la gran heterogeneidad presente en las regiones intrónicas. La representación de la estructura génica de algunos de los genes NtrC de estos organismos demostró que se encuentra muy conservada entre los distintos grupos de organismos analizados, estando constituido en todos ellos por 10 exones y 9 intrones (Figura III. 1). En todos los organismos comparados, la secuencia de aminoácidos de la proteína y, por tanto, su estructura bimodular se encuentran altamente conservadas, presentando las mayores diferencias en el extremo N-terminal, correspondiente a la secuencia del péptido de tránsito (Figura III. 2). La reconstrucción del árbol filogenético generado en este trabajo (Figura III. 4) agrupó las NTRCs en tres grupos principales: cianobacterias, algas y plantas terrestres. Este análisis mostró una mayor proximidad entre las NTRCs de cianobacterias y algas, quedando las enzimas de plantas terrestres más alejadas. Entre las NTRCs de plantas terrestres el análisis filogenético estableció 3 subgrupos: briofitas (musgos), licofitas (helechos) y eufilofitas (plantas con semillas). A su vez, este último grupo separó claramente las NTRCs correspondientes a monocotiledóneas de las de dicotiledóneas. De nuevo, la reconstrucción del árbol filogenético apoya la hipótesis de que las duplicaciones halladas para el gen NtrC han debido tener lugar de forma independiente y que en el caso de las especies DISCUSIÓN 145 seleccionadas de Solanum la copia correspondiente al cromosoma 10 presenta menor divergencia respecto a las NTRCs de otros organismos que la copia localizada en el cromosoma 4. Este análisis filogenético apoya también la idea del origen cianobacteriano de este gen y su éxito en la evolución de los organismos fotosintéticos eucarióticos. IV.2. EL GEN NtrC SE ENCUENTRA SOMETIDO A UN PROCESO DE SPLICING ALTERNATIVO En organismos eucarióticos la transcripción del DNA da lugar a un transcrito primario denominado pre-mRNA. Este mensajero incluye en su secuencia fragmentos de secuencias no codificantes (intrones), que son eliminadas durante la maduración del RNA. Durante este proceso de maduración, un mismo pre-mRNA puede ser procesado de diferentes maneras. Este fenómeno, denominado splicing alternativo, incrementa en gran medida la plasticidad del transcriptoma, ampliando la capacidad codificante de los genes y la complejidad del proteoma. En plantas se estima que más del 60% de los genes producen diferentes transcriptos debido a fenómenos de splicing alternativo (Márquez et al., 2012; Syed et al., 2012). En particular, los análisis realizados en Arabidopsis mostraron que al menos el 42% de los genes que contienen intrones se encuentran sometidos a splicing alternativo (Filichkin et al., 2010). Por otro lado, los estudios realizados hasta el momento en cereales, a partir de marcadores de secuencias expresadas y de las secuencias de mRNA disponibles, han identificado un total de 8.734 eventos de splicing alternativo en Oryza sativa subespecie japonica, 2.657 en O. sativa subespecie indica, 3.971 en Sorghum bicolor, 10.687 en Zea mays y 1.219 en Brachypodium distachyon (Walters et al., 2013; Min et al., 2015). Se ha propuesto que estos fenómenos de splicing alternativo constituyen un mecanismo adicional de regulación de la expresión génica durante el desarrollo de la planta y su adaptación al entorno (Mastrangelo et al., 2012; Leviatan et al., 2013; Seo et al., 2013; Staiger and Brown, 2013; Filichkin et al., 2015). DISCUSIÓN 146 La primera evidencia de que el gen NtrC podría sufrir splicing alternativo se obtuvo mediante el análisis de clones de cDNA obtenidos a partir de RNAs aislados de diferentes tejidos de arroz (Pérez-Ruiz, 2006). Entre los clones obtenidos la mayoría presentaba la secuencia correspondiente a la proteína completa, sin embargo, se obtuvieron también clones que presentaban un codón de parada prematura dando por tanto lugar a una hipotética forma truncada de la proteína. En el desarrollo de este trabajo, la clonación de los cDNAs del gen NtrC de Brachypodium, a partir de mRNAs aislados de hojas y semillas maduras, confirmó la presencia de dos tipos de mensajeros para NTRC (Figura III. 5). Mientras que los cDNAs obtenidos a partir de tejidos fotosintéticos correspondían mayoritariamente a la secuencia anotada para esta especie en las bases de datos, que codifica una NTRC completa, entre los clones de cDNA obtenidos a partir de semilla madura se observó con mayor frecuencia la presencia de clones que presentaban una secuencia adicional de 23 pb que provoca la aparición de un codón de parada prematuro (Figura. III. 7B). La comparación de este cDNA con la correspondiente secuencia génica permitió determinar que estos 23 pb correspondían con el final del intrón 4 (Figura III. 6). Por tanto, estos resultados sugieren que el gen NtrC de Brachypodium, como el de arroz, estaría sometido a un proceso de splicing alternativo que afecta al intrón 4 del gen y que este proceso ocurre con más frecuencia en semilla que en tejidos fotosintéticos. La identificación de este mensajero alternativo del gen NtrC nos llevó a realizar un análisis en mayor profundidad de los mensajeros del gen con el fin de detectar otros posibles eventos de splicing alternativo. Este estudio se realizó a partir del RNA total procedente de tres tejidos diferentes: hoja, raíz y semilla (Figura III. 8 B). Los resultados mostraron la retención total de los intrones 1, 3 y 7 en mensajeros procedentes de raíces pero no en los de hojas o semillas. La retención de estos intrones introducía en todos los casos un condón de parada prematuro. Tan sólo la retención de la secuencia final del intrón 4 se encontró conservada en los tres tejidos analizados, mostrando diferencias en las proporciones de ambos transcritos según el tipo de tejido. Este análisis mostró que de todos los procesos de splicing observados en el gen NtrC de Brachypodium, el que afecta a la retención de 23 pb del intrón 4 es el más abundante, por lo que nos centramos en el análisis en profundidad del mismo. DISCUSIÓN 147 La formación del mensajero alternativo para NtrC se encuentra conservada en plantas con semillas y es dependiente del tejido analizado La primera evidencia de la importancia de este evento de splicing alternativo se puso de manifiesto tras comprobar su elevado grado de conservación dentro del grupo de plantas con semillas (Figura III. 10). La comparación de la secuencia correspondiente al final del intrón 4 – inicio del exón V del gen NtrC de diferentes organismos eucarióticos fotosintéticos demostró que, pese a existir una alta heterogeneidad en la secuencia del intrón 4 (como en el resto de los intrones), los últimos 23 pb mostraron un alto grado de conservación en el caso de plantas con semilla, incluyendo las dos copias del mismo en los organismos que las presentan. En todos los casos analizados se mantenía el aceptor alternativo “AG” necesario para la formación del mensajero alternativo. En cambio, no se pudo identificar esta conservación de secuencia al incluir en los análisis los genes NtrC de Chlamydomonas reinhardtii y Physcomitrella patens como organismos representativos del grupo de las algas verdes y musgos, respectivamente (Figura III. 11). Por tanto, este análisis muestra que el splicing alternativo que se produce por la retención de 23 pb del intrón 4 es un proceso que afecta exclusivamente a los genes NtrC de plantas con semilla pero no a los de algas y briofitas. Tras la demostración in silico de la conservación de la secuencia de 23 pb en los genes NtrC de plantas con semillas, se procedió a analizar si efectivamente se producía splicing alternativo del gen NtrC en distintas especias de plantas, así como el patrón de expresión de ambos mensajeros en diferentes tipos de tejidos. Para abordar este estudio se seleccionaron las especies A. thaliana y B. distachyon, como organismos representativos de dicotiledóneas y monocotiledóneas, respectivamente. Además, se incluyó a S. lycopersicum, una de las especies identificadas como portadora de dos copias del gen NtrC. Mediante RT-PCR, a partir de RNA de tejidos fotosintéticos y heterotróficos, generados tras la germinación de las semillas, se determinaron los niveles relativos de mensajeros SS y AS (Figuras III. 12B y 12C y Figura III. 13). Estos resultados mostraron en primer lugar que, acorde a lo esperado, el procesamiento alternativo del gen NtrC tiene lugar en todos los tejidos analizados de las distintas especies seleccionadas. En segundo lugar, se demostró que en tomate ambas copias DISCUSIÓN 148 del gen se expresan activamente en todos los tejidos y que además ambas están sujetas a este mecanismo de splicing alternativo. Por otra parte, la comparación de la proporción de mensajeros AS y SS mostró una dependencia del tipo de tejido analizado, siendo la proporción de mensajero alternativo mayor en tejidos heterotróficos que en tejidos fotosintéticos. Así pues se observó que en raíces de Arabidopsis, tomate y Brachypodium la proporción de ambos mensajeros era aproximadamente 1:1, sin embargo, en tejidos fotosintéticos la proporción de mensajeros AS/SS disminuía drásticamente, indicando por tanto una mayor predominancia del mensajero SS. En el caso de tomate se encontró una peculiaridad en los tejidos fotosintéticos analizados (hoja e hipocotilo), ya que se comprobó que la copia del gen NtrC localizada en el cromosoma 4 presentó una proporción para ambos mensajeros similares a las observadas en raíces (1:1), mientras que la copia del gen localizada en el cromosoma 10 mostró mayor proporción del mensajero SS en tejidos fotosintéticos, comportándose como los equivalentes de Arabidopsis y Brachypodium. La posibilidad de incluir en este estudio semillas de Brachypodium en distintas fases del desarrollo y germinadas, demostró que durante los primeros estadíos del desarrollo el mensajero SS predomina sobre el alternativo, sin embargo, conforme se avanza hacia la madurez de la semilla el mensajero AS prevalece sobre el SS, y que tras la germinación de la semilla los niveles de ambos mensajeros se equilibran (Figura III. 13). En conjunto, la conservación de los 23 pb del intrón 4 de los genes NtrC en plantas con semillas, junto con la expresión diferencial de ambos transcritos según el tejido analizado y su variación durante el desarrollo de la semilla sugirieron la posibilidad de que este mecanismo de splicing alternativo pudiese influir, al menos parcialmente, en los niveles finales de la proteína NTRC en los diferentes tejidos de plantas. Los análisis tipo Western-blot, empleando el anticuerpo anti-NTRC, realizados en paralelo a los experimentos de RT-PCR, demostraron que en raíces los niveles de NTRC eran más reducidos en comparación a los detectados en tejidos fotosintéticos, acorde a la abundancia de ambos mensajeros en dichos tejidos y como ya había sido descrito con anterioridad (Kirchsteiger et al., 2009). En el caso de semillas de Brachypodium se comprobó de nuevo que los niveles de NTRC eran también inferiores DISCUSIÓN 149 en comparación a tejidos fotosintéticos. Estos resultados sugieren que este mecanismo de splicing alternativo constituye un componente adicional en la regulación de los niveles de NTRC en los distintos tejidos de plantas, en las que este mecanismo está muy conservado. Además, la carencia en los genes NtrC de algas y briofitas de dicho mecanismo de regulación, sugiere su aparición durante la evolución de las plantas superiores que se reproducen mediante la formación de semillas. El frío y la luz alteran la relación de mensajeros AS/SS que codifican para NTRC Los estudios transcriptómicos realizados en plantas durante los últimos años han demostrado que el splicing alternativo afecta a muchos más transcritos de lo que inicialmente se había asumido. La gran mayoría de estos eventos se han relacionado con mecanismos de respuesta a estrés biótico y abiótico, además de funciones esenciales de la planta como fotosíntesis, floración, regulación del ciclo circadiano o calidad de los granos (Reddy, 2007). Por ello, en este trabajo se ha analizado la posibilidad de que este evento de splicing alternativo esté sometido a regulación por variaciones ambientales, entre las cuales se han seleccionado el estrés por frío y el estrés salino. Las bajas temperaturas tienen un gran impacto en el crecimiento y desarrollo de plantas, lo cual limita significativamente la distribución geográfica de las distintas especies vegetales. El frío disminuye la actividad biosintética de las plantas, e inhibe funciones normales implicadas en diversos procesos fisiológicos pudiendo llegar a causar lesiones permanentes e incluso la muerte celular (Xu et al., 2014). Para evitar estos problemas las plantas han desarrollado distintos mecanismos de adaptación alterando sus procesos fisiológicos y bioquímicos por medio de modificaciones transcripcionales, post-transcripcionales y post-traduccionales (Chinnusamy et al., 2007; Miura et al., 2011). Entre las modificaciones post-transcripcionales más comunes en respuesta al frío, destaca el procesamiento alternativo de mensajeros que introduce en la mayoría de casos codones de parada prematura de la traducción (Leviatan et al., 2013; Lee et al., 2016). De igual modo, el estrés salino supone en gran parte del mundo una grave amenaza para la agricultura. Los elevados niveles de sal DISCUSIÓN 150 producen alteraciones osmóticas e iónicas que afectan la homeostasis celular y pueden provocar daños en las plantas debido a la desorganización de estructuras celulares, toxicidad metabólica y generación de ROS, que finalmente acaba comprometiendo la fotosíntesis y agotando la energía celular disponible, conduciendo a un crecimiento anormal e incluso la muerte celular (Zhang et al., 2016). Las plantas muestran una gran variedad de respuestas frente al estrés salino entre las que se encuentran modificaciones de la cromatina, modificaciones epigenéticas e inducción de la expresión de genes que codifican entre otros para factores de transcripción, proteínas implicadas en la homeostasis iónica o en la biosíntesis de osmolitos y proteínas implicadas en procesos de destoxificación, chaperonas, proteasas y enzimas implicadas en el marcaje de otras proteínas mediante ubiquitinación (Feng et al., 2015). Aunque la mayoría de los estudios anteriores se han centrado en la regulación de la expresión génica a nivel transcripcional, se ha demostrado que también existe una regulación a nivel post-transcripcional donde la formación de mensajeros alternativos, al igual que para el frío, juega un papel fundamental (Ding et al., 2014). Los resultados obtenidos en este trabajo han demostrado que existen condiciones ambientales que pueden alterar la relación de mensajeros AS/SS para el gen NtrC en plántulas de Brachypodium. Mediante análisis de RT-PCRs se comprobó que en las dos condiciones de estrés estudiadas ambos tipos de mensajeros están siempre presentes tanto en los cotiledones como en las raíces de muestras tratadas y sin tratar. El análisis de la relación AS/SS en plántulas etioladas sometidas a tratamiento a baja temperatura mostró una disminución de esta relación de 5 y 5,6 veces en cotiledones y raíces, respectivamente (Figura III. 14). Sin embargo, según lo observado en los resultados el motivo de esta disminución diferiría según el tejido analizado, mientras que en cotiledones se observa una disminución del mensajero alternativo respecto al control, en raíces se produce una inversión en los patrones de expresión de ambos mensajeros donde el mensajero canónico se ve incrementado respecto al alternativo. Del mismo modo, los análisis del nivel de proteína NTRC realizados por Western-blot mostraron un incremento de los niveles de la enzima en raíces pero no así en cotiledones (Figura III. 14). Por otra parte, los resultados obtenidos tras el tratamiento con NaCl de plántulas crecidas en luz, han mostrado que DISCUSIÓN 151 este estrés no afecta en gran medida a la relación AS/SS en cotiledones ni raíces, siendo los cambios obtenidos de 2 y 1,2 veces respectivamente, sin contemplarse además variaciones en los niveles totales de proteína NTRC en ninguno de los tejidos analizados (Figura III. 15). Además de estos resultados, la comparación entre la proporción de mensajeros AS/SS obtenida para los cotiledones y raíces de las muestras no tratadas de los experimentos de frío y salinidad, ha puesto de manifiesto la existencia de una tercera condición ambiental capaz de modificar dicha proporción, la luz. De manera que se observa como en cotiledones la proporción de los mensajeros AS/SS es 2,5 veces mayor en muestras etioladas que en no etioladas, característica que se mantiene en raíces, donde esta proporción se ve incrementada hasta 4,7 veces. La comparación de los niveles de NTRC muestra una disminución en el contenido de esta proteína en las raíces procedentes de plántulas etioladas, que concuerda con el incremento de la relación AS/SS observada en este tejido como consecuencia de la reducción de los niveles de mensajero estándar. A pesar de que la información relativa a los mecanismos de regulación de expresión del gen NtrC en plantas es muy limitada, los hallazgos aquí recogidos sugieren que el splicing alternativo del gen NtrC puede constituir un mecanismo adicional en la regulación de los niveles de NTRC y que este mecanismo tiene más relevancia a la hora de regular la cantidad de NTRC en tejidos que poseen un bajo contenido de la enzima, como en raíces, que en tejidos fotosintéticos, donde NTRC es más abundante (Serrato et al., 2004; Kirchsteiger et al., 2012), y otros factores pueden ser más importantes. El mensajero alternativo codificaría para una proteína truncada Como ya se ha descrito, el mensajero alternativo para NtrC se caracteriza por la presencia de un aceptor “AG” adicional, localizado 23 nucleótidos aguas arriba del aceptor que genera el mensajero estándar (Figura III. 9). En plantas, este tipo de procesamiento que supone la retención parcial de un intrón representa el segundo más abundante tras la retención completa del intrón, que es el tipo de splicing alternativo más abundante (Chamala et al., 2015; Min et al., 2015). La retención de estos 23 pb produce un cambio en la fase de lectura del mensajero, originando un DISCUSIÓN 152 codón de parada prematuro que, en el caso de ser traducido, generaría una proteína NTRC truncada (Figura IIII. 16). Esta versión truncada de NTRC tendría un tamaño de 29,8 KDa, perdería por completo el dominio Trx y parte del dominio NTR pero conservaría las Cys del sitio activo y motivos de unión del FAD y NADPH de dicho dominio. Mediante distintas aproximaciones, en este trabajo se ha tratado de comprobar la posibilidad de que la versión truncada de NTRC producida a partir del mensajero alternativo fuera estable. Por una parte, haciendo uso del anticuerpo anti-NTRB, que reconoce el dominio NTR de NTRC, se realizaron análisis tipo Western-blot de extractos proteicos de tejidos que presentaban diferentes niveles de mensajero alternativo. Estos resultados identificaron la presencia de una banda adicional del tamaño esperado para la NTRC truncada, además de las NTRs A y B, en las muestras procedentes de semillas maduras y germinadas (Figura III. 17A). Sin embargo, en cotiledones y semillas en desarrollo sólo se obtuvo señal para las NTRs A y B (Figura III. 17B). Estos resultados apoyaron inicialmente la posibilidad de la presencia de una NTR alternativa, cuya señal era identificada en tejidos donde los niveles de transcrito AS eran predominantes frente a los mensajeros SS y que su no detección en cotiledones y semillas en desarrollo se explicaría por los bajos niveles de dicho mensajero. En una segunda aproximación, mediante electroforesis bidimensional y MALDI-TOF, se procedió a la identificación de la posible NTRC truncada usando como muestra extracto proteico de semillas maduras. Aunque los análisis tipo Western-blot con anti- NTRB realizados a partir de electroforesis bidimensional detectaron 3 manchas de las cuales dos se corresponderían con las NTRs A y B y la tercera con la posible proteína truncada, los geles empleados para la tinción con Coomasie presentaron una gran abundancia de proteínas en la región de interés que interfirieron en la identificación de la posible NTRC truncada, por lo que la identidad de dicha señal no pudo ser confirmada (Figura III. 18). Aunque los resultados obtenidos sugieren la posible participación de este splicing alternativo como un mecanismo adicional en la regulación de los niveles totales de NTRC en plantas con semilla, debido a la imposibilidad de confirmar la presencia de una versión truncada de NTRC, el mecanismo de acción por el cual este DISCUSIÓN 153 mensajero alternativo es capaz de regular dichos niveles no ha podido ser esclarecido, quedando abiertas distintas posibilidades. Según lo recogido en la bibliografía reciente, la opción más probable es que el mensajero alternativo al contener un codón de parada prematuro sea reconocido y degradado por un mecanismo de control denominado NMD (Nonsense Mediated mRNA Decay) regulando así los niveles totales de proteína. Por otra parte, estudios realizados en mutantes ntrc de Arabidopsis donde se ha expresado exclusivamente el dominio NTR de NTRC, demostraron que a pesar de que la proteína estaba presente y no era degradada, la presencia exclusiva del dominio NTR no era suficiente para revertir el fenotipo ntrc (Toivola et al., 2013). Atendiendo a estos resultados, en el caso de que el mensajero alternativo fuese insensible al NMD y codificase para una proteína NTRC truncada, esta versión de la proteína posiblemente carecería de actividad y sería degradada. Sin embargo, recientemente se ha descrito que, al menos en plantas, genes que codifican para proteínas que son funcionales como homodímeros son capaces de generar mensajeros alternativos en cuya secuencia se originan codones de parada prematuros. Estos mensajeros alternativos son traducidos y generan una versión truncada de la proteína que mantiene la capacidad de unirse a la proteína canónica, inhibiendo de este modo su actividad (Graeff and Wenkel, 2012; Seo et al., 2013). Por lo que, teniendo en cuenta que NTRC es funcional como homodímero, otra opción posible sería que el mensajero alternativo fuese traducible y generase una versión truncada de NTRC capaz de interaccionar con la versión canónica e inhibir así su actividad. Figura IV. 2. Representación esquemática de las posibles vías seguidas por el mensajero alternativo del gen NtrC.