Planta resistente a medios con metales pesados

k 19 OFICINA ESPA˜ NOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPA˜ NA k 11 N´umero de publicaci´on: 2 176 117 k 21 N´umero de solicitud: 200100590 k 51 Int. Cl.7:C12N 15/82 C12N 15/29 C12N 15/52 C07K 14/415 B09C 1/10 k 12 PATENTEDEINVENCION B1 k 22 Fecha de presentaci´on: 14.03.2001 k 73 Titular/es: Consejo Superior de Investigaciones Cient´ıficas c/ Serrano, 117 28006 Madrid, ES Universidad de Sevilla k 43 Fecha de publicaci´on de la solicitud: 16.11.2002 Fecha de concesi´on: 16.01.2004 k 72 Inventor/es: Dom´ınguez Solis, Jos´eRam´on; Gotor Mart´ınez, Cecilia y Romero Gonz´alez, Luis Carlos k 45 Fecha de anuncio de la concesi´on: 16.02.2004 k 45 Fecha de publicaci´on del folleto de patente: 16.02.2004 k 74 Agente: No consta k 54 T´ıtulo: Planta resistente a medios con metales pesados. k 57 Resumen: Planta resistente a medios con metales pesados. La presente invenci´on se refiere a una planta con una elevada capacidad de acumular metales pesados en su parte a´erea y su empleo en la recuperaci´on de medios contaminados con metales pesados. Las plantas han sido modificadas gen´eticamente para ser resistentes a medios contaminados por metales pesados y para en esos medios contaminados tener la capacidad de absorber los metales pesados, acumul´andolos en sus hojas, para recuperar el medio contaminado. La modificaci´on gen´etica se ha basado en la identificaci´on de genes de plantas implicados en los procesos de detoxificaci´on de metales pesados y la sobreexpresi´on de los mismos dando lugar a plantas transformadas susceptibles de ser utilizadas en procesos de fitorremediaci´on. Aviso: Se puede realizar consulta prevista por el art. 37.3.8 LP. Ventadefasc´ıculos: Oficina Espa˜nola de Patentes y Marcas. C/Panam´a, 1 – 28036 Madrid ES 2 176 117 B1 1ES 2 176 117 B1 2 DESCRIPCION Planta resistente a medios con metales pesados. Campo de la invenci´on El campo de la presente invenci´on se encuentra dentro del ´area de la biolog´ıa molecular de plantas, y en particular en la implicaci´on de genes de plantas en los procesos de detoxificaci´on de metales pesados, el uso de plantas transformadas sobre-expresando estos genes y m´etodos de fitorremediaci´on para la recuperaci´on de medios contaminados con distintos metales pesados haciendo uso de estas plantas transformadas. Objeto de la invenci´on El objeto de la presente invenci´on es una planta con una elevada capacidad de acumular metales pesados en su parte a´erea y su empleo en la recuperaci´on de medios contaminados con metales pesados. Las plantas han sido modificadas gen´eticamente para ser resistentes a medios contaminados por metales pesados y para en esos medios contaminados tener la capacidad de absorber los metales pesados, acumul´andolos en sus hojas, para recuperar el medio contaminado. Estado de la t´ecnica La contaminaci´on de la biosfera con metales pesados, se ha acelerado dr´asticamente desde el comienzo de la revoluci´on industrial. Las principales fuentes de esta contaminaci´on son la combusti´on de f´osiles, fertilizantes, pesticidas etc. Esto ha llevado a que uno de los problemas medioambientales y de salud m´as significativos en los ´ultimos a˜noseslacontaminaci´on de suelos y aguas por residuos industriales y en particular por residuos de metales pesados (Salt et al 1995). Considerando el bajo coste efectivo, el uso de plantas para la descontaminaci´on de residuos org´anicos e inorg´anicos ha impulsado el estudio de t´ecnicas de fitorremediaci´on (Raskin 1996; Salt et al, 1998). Aunque la idea de usar las plantas para la biorremediaci´on es antigua, en la actualidad presenta importantes ventajas en la protecci´on medioambiental. La t´ecnica de fitorremediaci´on cubre diferentes aspectos del uso de las plantas como agente descontaminante como por ejemplo el uso de plantas para la degradaci´on de compuestos org´anicos en asociaci´on con microorganismos (fitodegradaci´on); la absorci´on de contaminantes a trav´es de las ra´ıces (rizofiltraci´on) y la reducci´on de la biodisponibilidad de los contaminantes en el medio (fitoestabilizaci´on). Sin embargo de todas las ´areas que presenta esta t´ecnica, es quiz´as la fitoextracci´on, la m´as extendida e importante. La fitoextracci´on est´a enfocada al uso de plantas para acumular y concentrar los contaminantes en sus partes a´ereas y a la posterior eliminaci´on de los metales pesados o agentes org´anicos t´oxicos del suelo mediante la cosecha de esas plantas. En Espa˜na, casos como la rotura de la balsa de las Minas de Aznalc´ollar han planteado la necesidad de disponer de metodolog´ıas baratas para la eliminaci´on de una bater´ıa amplia de elementos inorg´anicos altamente t´oxicos. Tambi´en, una extensa contaminaci´on en aguas subterr´aneas por compuestos de ars´enico, considerado como uno 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 de los elementos m´as t´oxicos, ha recibido mucha atenci´on en Bangladesh y otros lugares (Kaiser, 1998; Dhar et al, 1997). Por consiguiente, utilizar un agente biol´ogico, como sugiere la fitorremediaci´on con el uso de plantas, ya sean naturales o modificadas gen´eticamente, tolerantes a uno o varios metales pesados y que son capaces de acumular esos metales en sus partes a´ereas, parece ser la t´ecnica m´as prometedora para la recuperaci´on de suelos contaminados por varios metales pesados. Una de las opciones para esta recuperaci´on se presenta con el uso de plantas hiperacumuladoras, plantas que se encuentran en la naturaleza y que son capaces de crecer en suelos con alto contenido en metales pesados (Baker et al 1989). Sin embargo, estas especies naturales como ocurre con los microorganismos y las algas, presentan serias limitaciones para la recuperaci´on de suelos contaminados con metales pesados. Ejemplos de estas limitaciones en las plantas hiperacumuladoras son que tienen una baja biomasa, crecen muy lentamente y que no existen especies adecuadas para acumular los elementos contaminantes m´as importantes (plomo, cadmio, ars´enico, uranio, etc.). La soluci´on proporcionada por esta Invenci´on al problema de la contaminaci´on por metales pesados en suelos, se basa en los mecanismos desarrollados por los organismos, y en particular por las plantas, con el objeto de reducir la toxicidad de metales pesados y metaloides en la c´elula, gracias a la capacidad de reducir la concentraci´on efectiva del mismo mediante la formaci´on de complejos con ligandos org´anicos Esto es posible porque casi todos los metales pesados, como ocurre por ejemplo con el cadmio, mercurio y plomo, o metaloides como el arseniato, tienen una propiedad com´un: son altamente reactivos con grupos sulfih´ıdrilos (-SH) de mol´eculas org´anicas. En las plantas, se han identificado dos tipos de p´eptidos capaces de quelar metales pesados y ambos, son p´eptidos ricos en ciste´ına: metalotioneinas y fitoquelatinas. Las metalotioncinas (MTs) son prote´ınas de bajo peso molecular, ricas en ciste´ına, capaces de enlazar metales pesados y se encuentran presentes en una gran variedad de organismos, incluyendo hongos, invertebrados, insectos, plantas y mam´ıferos (Riordan y Vallee, 1991). Las MTs de plantas tienen una gran afinidad por Cu y se inducen fuertemente por la presencia de este metal. Genes codificando MTs han sido aislados de una gran variedad de plantas y la expresi´on del gen MT2 en Arabidopsis ha sido correlacionada con tolerancia a cobre (Murphy y Taiz, 1995). Las fitoquelatinas (PCs) son tambi´en p´eptidos ricos en ciste´ına que no est´an codificados gen´eticamente y se sintetizan enzim´aticamente a partir de mol´eculas de glutati´on (Steffens, 1990). Su s´ıntesis se inicia o induce por la presencia de metales pesados, como el cadmio, con el concurso de la enzima PC sintasa que utiliza glutati´on (GSH) como substrato para formar el p´eptido [γ-Glu- Cys]n=2−11-Gly. El aislamiento en Arabidopsis del mutante cad1, deficiente en PC sintasa, claramente demuestra la importancia de las fitoquelatinas en la tolerancia al metal (Zenk, 1996). Tanto MTs como PCs forman complejos con el 2 3ES 2 176 117 B1 4 metal a trav´es del grupo -SH de la ciste´ına. Otros elementos, como sulfuro inorg´anico, tambi´en forman parte del complejo metal-PC, originando un complejo temario m´as estable. El GSH es una mol´ecula esencial para la c´elula, cuya ruta de bios´ıntesis est´a finamente regulada en las plantas (Noctor et al, 1998). Esta mol´ecula se sintetiza mediante la acci´on sucesiva de dos enzimas: la γ-glutamilcisteinil sintetasa (γ-ECS) y la glutati´on sintetasa (GS) De igual manera. el precursor ciste´ına tambi´en se sintetiza mediante un complejo bienzim´atico compuesto por las enzimas O-acetilserina(tiol)liasa (OASTL) y serina acetiltransferasa (SAT) (Barroso et al, 1997). La inducci´on de los agentes quelantes, MTs y PCs, por la presencia de metales pesados, dispara la bios´ıntesis de sus mol´eculas precursoras. Por ejemplo, en Arabidopsis thaliana,lapresencia de Cd induce la expresi´on de los genes implicados en la bios´ıntesis de ciste´ına y glutati´on, mol´eculas precursoras donadoras de azufre reducido en la planta (Barroso et al, 1999; Xiang y Oliver, 1998). La acci´on concertada en la expresi´on de estos genes es necesaria para generar las mol´eculas ti´olicas esenciales para la bios´ıntesis de MTs y PCs. Existen en las plantas otros tipos de genes, que en casos particulares tambi´en pueden participar en procesos de biorremediaci´on: un ejemplo es el gen que codifica liasas organomet´alicas, descrito en la patente americana US 5.965.796, que involucradas en procesos de reducci´on enzim´atica de iones met´alicos, puede mediar en la remediaci´on de compuestos organomet´alicos, como el metilmercurio, de suelos contaminados. Explicaci´on de la invenci´on Constituye un objeto de la presente invenci´on una planta resistente a medios con metales pesados, en la que se ha introducido por manipulaci´on gen´etica la sobre-expresi´on de un gen que aumenta la capacidad de la planta para sintetizar la enzima O-acetilserina(tiol)liasa (OASTL) que cataliza la reacci´on de s´ıntesis de la ciste´ına. En dicha planta se ha incrementado hasta 4 veces la actividad OASTL para la s´ıntesis de ciste´ına y por extensi´on la capacidad de s´ıntesis de p´eptidos ricos en ciste´ına. En particular, las mol´eculas y p´eptidos cuya s´ıntesis se ha incrementado son la ciste´ına, el glutati´on, las fitoquelatinas y las metalotione´ınas. Los metales pesados y metaloides que la planta acumula en sus tejidos se seleccionan entre Ag,As,Cd,Co,Cr,Cu,Hg,Ni,Pb,Pd,Pt,Te, Tl, Sb, Se, Sn y Zn, sus especies i´onicas correspondientes y sus mezclas, particularmente entre As, Cd, Cu, Hg, Ni, y Zn, sus especies t´onicas correspondientes y sus mezclas y m´as particularmente entre As, Cd y Hg, sus especies i´onicas correspondiente y sus mezclas. La planta acumula los metales pesados preferentemente en sus partes a´ereas, tallos y hojas, acumulando hasta un 72 % m´as de metales que las correspondientes plantas silvestres. Las semillas de dichas plantas son capaces de germinar en medios que contienen concentraciones t´oxicas de metales pesados para las semillas de las correspondientes plantas silvestres (250 µMdeCd,1.3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 mM de Zn, 30 µM de Hg, 100 µM de Cu, 250 µM de Ni, 180 µM de As(V), 40 µM de As(III)). Se trata de una planta diploide, en particular perteneciente a la familia de las Brassicaceae o Cruciferae. En el caso concreto de una planta del g´enero Arabidopsis,enparticularArabidopsis thaliana, ecotipo columbia, el gen sobreexpresado para aumentar la resistencia y acumulaci´on de metales pesados y metaloides, que se ha introducido por manipulaci´on gen´etica, es el gen Atcys-3A,elcual se encuentra bajo el control de una secuencia regulatoria transcripcional funcional en planta, particularmente bajo control del promotor 35 S del virus del mosaico de la coliflor. Constituye otro objeto de la presente invenci´on un procedimiento para obtener plantas resistentes a medios con metales pesados y acumuladoras de dichos metales pesados, que comprende los siguientes pasos: a- Construcci´on de un pl´asmido que contenga el gen Atcys-3A b- Introducci´on de dicho pl´asmido en la planta amodificar c- Identificaci´on de las plantas modificadas mediante selecci´on con antibi´otico d- Sobre-expresi´on del gen controlada por una secuencia regulatoria transcripcional funcional en planta. Constituye asimismo otro objeto de la presente invenci´on un m´etodo para recuperar un suelo contaminado por metales pesados y metaloides mediante las plantas objeto de la invenci´on que comprende las siguientes etapas: a) plantar entre 250.000 y 2.500-000 plantas por hect´area de suelo contaminado. b) cultivar las plantas durante un periodo comprendido entre 15 y 40 d´ıas. c) recolectar las partes a´ereas, tallos y hojas de dichas plantas en las cuales se han acumulado los metales pesados y metaloides. Descripci´on de las figuras En la figura 1A se muestran las caracter´ısticas mas importantes del pl´asmido que fue utilizado para la transformaci´on de las plantas de Arabidopsis thaliana. Para dicho proceso, se realizo una construcci´on, denominada pBIOAS, donde un fragmento de 1332 pb correspondiente al cDNA Atcys-3A, conteniendo la regi´on codificante del gen, fue insertado en orientaci´on sentido en el pl´asmido pBI121 bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y del terminador de la nopalina sintasa (NOS-ter). El pl´asmido tambi´en presenta un gen de resistencia al antibi´otico kanamicina, que servir´a para la posterior identificaci´on de las plantas que han sido modificadas gen´eticamente. La figura 1B muestra el caso particular de la identificaci´on de una de las plantas transformadas, por medio de su resistencia al antibiotico kanamicina, pudiendo observarse con claridad que s´olo aquellas plantas que hayan incorporado el pl´asmido dentro del genoma, son resistentes a kanamicina. La fotograf´ıa mostrada fue realizada 3 5ES 2 176 117 B1 6 conunmicroscopioest´ereo Olympus SZ4045TR, 14 d´ıas despu´es de sembrar las semillas obtenidas de las plantas transformadas, en un medio s´olido MS (Murashige and Skoog, 1962) con una concentraci´on de 50 µ/ml de kanamicina. La figura 2 muestra el experimento realizado para calcular la concentraci´on t´oxicaparalagerminaci´on de semillas silvestres de Arabidopsis thaliana a distintos metales pesados, mostrando el caso particular, del c´alculo de la concentraci´on t´oxica de arsenito a semillas silvestres de Arabidopsis thaliana. En la figura 2A se muestran fotograf´ıas, obtenidas con un microscopio est´ereo Olympus SZ4045TR, de semillas silvestres de Arabidopsis thaliana que despu´es de ser esterilizadas, fueron sembradas en medio s´olido de MS, con concentraciones crecientes de arsenito. El compuesto a˜nadido al medio s´olido fue NaAsO2. Las fotograf´ıas fueron tomadas, 14 d´ıas despu´es de sembrar las semillas. En la figura 2B se muestra una tabla con los resultados obtenidos en la cuantificaci´on de germinaci´on de las semillas silvestres a las concentraciones de NaAsO2. La tolerancia, calculada como el porcentaje de supervivencia, ha sido obtenida como el resultado del cociente del n´umero de semillas silvestres que han sido capaces de germinar, entre el n´umero total de semillas sembradas. La figura 3 representa los experimentos realizados, en un caso particular con el metal pesado cadmio, para averiguar la tolerancia de las semillas transformadas de la l´ınea 10, a las concentraciones t´oxicas de los distintos metales, obtenidas en los experimentos anteriores. En la figura 3A se muestran fotograf´ıas, una vez transcurridos 14 d´ıas de sembrar las semillas transformadas, de la l´ınea 10 en un medio s´olido MS que ten´ıa una concentraci´on de 250 µMdeCdCl 2ylacompa- raci´on con las semillas silvestres y controles de transformaci´on en las mismas condiciones. En la figura 3B se muestra el resultado de la tolerancia, de la l´ınea 10 a la concentraci´on t´oxica de 30 µMdeHgCl 2, tanto en las semillas silvestres como en las transformadas, calculada como el cociente del n´umero de semillas que son capaces de adaptarse a esa concentraci´on t´oxica de mercurio por el n´umero total de semillas sembradas. La figura 4 muestra el resultado del c´alculo de la cantidad de metales pesados que se acumulan en las hojas de las plantas, tanto silvestres como transformadas, cuando se pon´ıan en contacto con medios que conten´ıan los distintos metales pesados a sus correspondientes concentraciones t´oxicas, demostr´andose aqu´ı, que las plantas transformadas, adem´as de ser resistentes a los metales pesados, son capaces de acumularlos al crecer en esos medios contaminados. La figura 4A muestra los valores absolutos de acumulaci´on mientras que la figura 4B refleja el porcentaje de incremento de acumulaci´on de las hojas de la l´ınea transformada 10 con respecto a las hojas de las silvestres. Todas las medidas se realizaron mediante espectroscopia de emisi´on at´omica. Descripci´on detallada de la invenci´on La invenci´on proporciona una planta modificada gen´eticamente con capacidad de absorber metales pesados, caracterizada porque es una planta adaptada y resistente a una bater´ıa de me- 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 tales pesados y que es capaz de acumular cantidades superiores que las plantas silvestres en las mismas condiciones. En el sentido utilizado en esta descripci´on, la expresi´on “planta modificada gen´eticamente, resistente y acumuladora de metales pesados” se refiere a que la planta ha sido transformada con la finalidad de aumentar su capacidad para adaptarse a suelos contaminados en los cuales las plantas silvestres se ven muy afectadas, y que estas plantas modificadas sean capaces de absorber los metales pesados existentes en el medio contaminado, acumul´andolos preferentemente en sus partes a´ereas, tallos y hojas, en mayor cantidad que las plantas silvestres. Las caracter´ısticas tanto de tolerancia como de acumulaci´on mostradas por las plantas transformadas, son debidas principalmente al aumento de su capacidad para sintetizar mol´eculas ricas en ciste´ına, que se encuentran involucradas en el proceso de detoxificaci´on de las plantas a metales pesados, gracias a la modificaci´on gen´etica realizada en las plantas silvestres de Arabidopsis thaliana, sobre-expresando el gen que codificaparalaisoformacitos´olica de la enzima O- acetilserina(tiol)liasa. Gracias a esta modificaci´on gen´etica, por la que el metal pesado no afecta al crecimiento de la planta, y gracias a que la acumulaci´on de los distintos metales pesados se produce en las partes a´ereas, en mayor cantidad que las silvestres, estas plantas transformadas se convierten en unas herramientas muy ´utiles para su utilizaci´on en la recuperaci´on de suelos contaminados mediante la recogida de estas plantas tolerantes y acumuladores. En una realizaci´on particular, la planta de la invenci´on procede de una estirpe silvestre de Arabidopsis thaliana, ecotipo columbia, planta t´ıpicamente diploide de la familia Brassicaceae. Este tipo de planta fue utilizado en la invenci´on debido principalmente a su r´apido tiempo de generaci´on, de 5 a 6 semanas bajo condiciones normales de crecimiento (Meyerovich, 1994) cualidad muy importante debido a la reducci´on de tiempo que se tiene que emplear para la recuperaci´on del suelo contaminado. El t´ermino “metales pesados” tal como se utiliza en esta descripci´on incluye una serie de metales y metaloides de la Tabla Peri´odica con propiedades met´alicas y potencialmente t´oxicos. En un caso particular, dentro de todos los metales pesados de car´acter t´oxico, se encuentran As, Cd, Cu,Hg,NiyZnencualquierformaqu´ımica que puedan estar presentes en un medio s´olido. El principal responsable de la tolerancia y acumulaci´on de estos metales pesados son las fitoquelatinas, que debe de unir al menos un metal pesado, incluyendo, pero no limitando los metales nombrados anteriormente. La capacidad de estas secuencias pept´ıdicas en unirse a metales pesados est´a muy extendida, como ocurre en casos particulares con el Ni (Kr¨amer et al, 1996), Zn (Shen et al, 1997), As, que se encuentra en las plantas en forma de arsenito y arseniato (Grill, 1987; Maltani, 1996) y sobre todo el metal pesado Cd (Zenk, 1996) que est´a considerado como uno de los metales en los que la fitorremediaci´on es parti- 4 7ES 2 176 117 B1 8 cularmente favorable, a causa de que es f´acilmente transportado y acumulado en las hojas de muchas especies de plantas (Wagner, 1993). Para el proceso de modificaci´on gen´etica de las plantas con el fin de aumentar la tolerancia a medios contaminados por metales pesados ytambi´en la acumulaci´on de dichos metales pesados mediante su absorci´on de los medios contaminados, se realiz´o una construcci´on, denominada pBIOAS, donde un fragmento de 1332 pb correspondiente al cDNA Atcys-3A, conteniendo la regi´on codificante del gen, fue insertado en orientaci´on sentido en el pl´asmido pBI121 bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y del terminador de la nopalina sintasa (NOS-ter) (Fig. 1). El pl´asmido tambi´en presenta un gen de resistencia al antibi´otico kanamicina, que servir´a para la posterior identificaci´on de las plantas que han sido modificadas gen´eticamente. La sobreexpresi´on del gen Atcys- 3A se obtiene por los altos niveles de transcripci´on que produce el promotor 35S del CaMV de forma constitutiva en todos los tejidos de la planta. En el proceso de transformaci´on se utilizaron plantas que hab´ıan estado creciendo durante tres semanas en c´amaras de crecimiento con fotoperiodo largo (16 horas luz y 8 de oscuridad) y a unas temperaturas de 20◦Cy18 ◦C respectivamente. Estas plantas hab´ıan sido sembradas en tierra y regadas con agua. Una vez transcurridas esas tres semanas, las plantas de Arabidopsis thaliana fueron transformadas mediante infiltraci´on avac´ıo con una soluci´on de Agrobacterium CV50 que llevaba el pl´asmido pBIOAS. Despu´es del proceso de transformaci´on, las plantas eran devueltas alasc´amaras de crecimiento en las mismas condiciones, hasta que se secaban y daban semillas, algunas de las cuales estaban transformadas. El proceso de selecci´on de las semillas transformadas se realiz´o gracias al gen de resistencia al antibi´otico kanamicina que ten´ıa el pl´asmido construido pBIOAS, consistiendo este proceso, en plaquear las semillas obtenidas de las diferentes plantas que hab´ıan sido transformadas, en un medio s´olido MS, que conten´ıa una concentraci´on de 50 µ/ml del antibi´otico kanamicina. Mediante este proceso, se obtuvieron 10 l´ıneas independientes de plantas transformadas. Como control de que el m´etodo utilizado para la modificaci´on gen´eticanoproduc´ıa ning´un cambio en el comportamiento normal de las plantas, procesos de transformaci´on equivalentes fueron llevados a cabo con los mismos tipos de plantas, Arabidopsis thaliana, y en las mismas condiciones, usando el pl´asmido original pBI121 sin ninguna modificaci´on. Una vez que estas plantas dieron de nuevo semillas y por el m´etodo de selecci´on de estas semillas con el uso de la kanamicina, se obtuvieron 4 l´ıneas independientes de estos controles de transformaci´on que fueron usados, adem´as de las plantas silvestres, como controles en los distintos experimentos que se llevaron a cabo con las plantas transformadas con el pl´asmido pBIOAS. Una vez conseguidas l´ıneas homozigotas, se empez´o el estudio de caracterizaci´on de las plantasmodificadasgen´eticamente. An´alisis mediante Southem y Northern blot han mostrado la presencia de distintas copias del gen Atcys-3A 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 dentro del genoma de la planta y tambi´en unos niveles de transcrito superiores al de las plantas transformadas controles en algunas de las l´ıneas. Los estudios de la cantidad de prote´ına, mediante an´alisis de Western blot, y de la actividad en estas plantas mostraron unos niveles de actividad OASTL con una elevada similitud con respecto a los niveles de transcrito obtenidos mediante Northern. En las plantas transformadas se midi´ounincremento de hasta 4 veces la actividad OASTL para la s´ıntesis de ciste´ına. Una concentraci´on elevada de ciste´ına favorece la s´ıntesis de p´eptidos ricos en este amino´acido (glutati´on, fitoquelatinas y metalotione´ınas). Tambi´en se midieron, mediante cromatograf´ıa l´ıquida de alta resoluci´on (HPLC) y utilizando un detector de fluorescencia, los niveles de ciste´ına y glutati´on intracelular en hojas de las distintas l´ıneas de las plantas transformadas en condiciones normales de crecimiento, es decir sin presencia de uno o varios metales pesados, no obteni´endose diferencias significativas con respecto a las plantas controles. A continuaci´on y con objeto de dilucidar la capacidad de tolerancia, de las plantas de Arabidopsis thaliana que han sido modificadas gen´eticamente, a medios contaminados con uno o varios metales pesados, calculamos en primer lugar cu´al es la concentraci´on m´ınima de cada uno de los metales a la cual las semillas de Arabidopsis thaliana sin modificar, eran incapaces de germinar Para ello, semillas silvestres de Arabidopsis thaliana fueron esterilizadas siguiendo el protocolo del ejemplo 1. Una vez esterilizadas, las semillas fueron plaqueadasenunmedios´olido MS conteniendo concentraciones crecientes de cada uno de los metales del estudio. Cd, As (en sus dos estados de oxidaci´on arsenito y arseniato), Cu, Hg, Ni y Zn. Las placas obtenidas se dejaron durante 24 horas a4 ◦C para inducir la germinaci´on. Transcurridas 24 horas se trasladaron a la c´amara de crecimiento. El programa de la c´amara, se muestra en el ejemplo 1. Las semillas se dejaron en la c´amara de crecimiento durante 14 d´ıas en contacto con el medio s´olido que ten´ıa las distintas concentraciones de los metales. Las cantidades t´oxicas de cada uno de los metales para las semillas silvestres obtenidas fueron las siguientes: Metal Pesado Concentraci´on T´oxica Cd (II) 250 µM Zn (II) 1.3 µM Hg (II) 30 µM Cu (II) 100 µM Ni (II) 250 µM As (V) 180 µM As (III) 40 µM Como caso particular de este experimento, se estudi´olavariaci´on de la tolerancia de las semillas de Arabidopsis thaliana no modificadas gen´eticamente a concentraciones crecientes del 5 9ES 2 176 117 B1 10 metaloide arsenito (Fig. 2). El compuesto usado para el ejemplo fue NaAsO2. Una vez obtenidas las concentraciones t´oxicas para las pl´antulas de Arabidopsis thaliana silvestres, se comprob´o si las plantas transformadas sobreexpresando el gen Atcys-3A,eranresistentes a los distintos metales a las correspondientes concentraciones t´oxicas, que fueron obtenidas con anterioridad. Semillas de plantas silvestres y de las l´ıneas transformadas fueron sembradas, despu´es de esterilizarlas siguiendo el modelo anterior, en placas con medio s´olido de MS conteniendo en cada caso la concentraci´on t´oxica de cada uno de los metales pesados de este estudio: cadmio, arsenito, arseniato, mercurio, zinc, cobre y n´ıquel. Despu´es de 14 d´ıas en la c´amara de crecimiento en las mismas condiciones que en el experimento del c´alculo de la concentraci´on t´oxica de semillas de Arabidopsis thaliana sin transformar, se observ´o que tanto las semillas silvestres como las modificadas gen´eticamente conteniendo el pl´asmido pBI121, control del proceso de transformaci´on, casi ninguna era capaz de germinar en el medio y las pocas que lo hac´ıan, no desarrollaban el primer par de hojas y mor´ıan a los 5-7 d´ıas tras ser embebidas. Por otro lado, todas las l´ıneas sobre-expresando el gen Atcys-3A eran capaces de germinar y crecer en los distintos medios de cultivo. Como caso particular se muestra en el ejemplo 2 el resultado obtenido con las semillas transformadas de la l´ınea 10, que fue de todas las l´ıneas de plantas transformadas de Arabidopsis thaliana la que mostr´o una mejor adaptaci´on al tratamiento con los distintos metales pesados. Unavezquesehademostradoquelasplantasmodificadasgen´eticamente sobre-expresando el gen Atcys-3A son tolerantes a medios contaminados con distintos metales pesados, se analiza en las distintas l´ıneas transformadas si se produce una acumulaci´on de los distintos metales pesados en las partes a´ereas, tallos y hojas, de la planta, cuando se ponen en contacto con los medios contaminados que contienen los distintos metales. Para este estudio, se utilizan plantas, tanto silvestres como modificadas gen´eticamente, de Arabidopsis thaliana, crecidas en condiciones ´optimas de crecimiento durante tres semanas. Pasado este tiempo, las plantas son irrigadas con medio l´ıquido contaminado de metal a las concentraciones t´oxicas, menos para el arsenito donde la concentraci´on usada fue de 100 µM. Despu´es de los 14 d´ıas de tratamiento con los distintos metales pesados, se procedi´oalc´alculo de la cantidad de metal acumulada en cada caso. Las muestras fueron analizadas mediante espectroscopia de emisi´on at´omica (ICP-AES) usando un secuenciador multi-elemento Fisons- ARL 3410. Los resultados obtenidos en la medici´on del contenido de los distintos metales revelaron que todas las plantas de Arabidopsis thaliana que hab´ıan sido modificadas gen´eticamente acumulaban mayor cantidad de metal en sus hojas que las plantas silvestres en todos los casos analizados (72 % m´as de Cd, 31 % de As(V), 32 % de As(III), y 11 % de Hg). Como caso particular, se muestra en el ejem- 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 plo 3, el procedimiento y los resultados obtenidos cuando el experimento se realiz´oconlal´ınea 10 en el caso particular en el que dicha planta hab´ıa estado en contacto con un medio contaminado con distintos metales pesados como Cd, As (en sus dos estados de oxidaci´on arsenito y arseniato) y Hg. Estos metales son mostrados con mayor profundidad debido a que son los metales pesados, de los utilizados, m´as t´oxicos y con los que m´as problemas existen. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invenci´on y no deben ser considerados en sentido limitativo del alcance de la misma. Ejemplo 1 C´alculo de las concentraciones t´oxicas de arsenito a plantas silvestres de Arabidopsis thaliana Como ejemplo particular del c´alculo de las concentraciones t´oxicas de metales pesados a plantas silvestres, se muestra el experimento que se realiz´o para determinar cual era la concentraci´on m´ınima de arsenito que imped´ıa la germinaci´on de semillas silvestres de Arabidopsis thaliana. Para ello, semillas silvestres de Arabidopsis thaliana fueron esterilizadas siguiendo el siguiente protocolo: 1.- Etanol 96 % durante 1-2 minutos. 2.- Lej´ıa 30% durante 5 minutos. 3.- Lavado de las semillas con agua est´eril. 5-6 veces. Una vez esterilizadas, las semillas son plaqueadas en un medio s´olido MS conteniendo concentraciones crecientes de arsenito, exactamente 10, 20, 30 y 40 µMdeNaAsO 2. Las placas obtenidas se dejan durante 24 horas a 4◦C para inducir la germinaci´on de las semillas. Una vez transcurridas 24 horas a 4◦C, los medios s´olidos con las semillas silvestres se introducen en c´amaras de crecimiento. El programa de crecimiento programado en las c´amaras fueron las siguientes: Fotoperiodo: 16 horas luz/8h oscuridad Temperaturas: 20◦C en el periodo de luz y 18◦C en el periodo de oscuridad. Humedad: 70 % Las semillas se dejan en la c´amara de crecimiento en esas condiciones durante 14 d´ıas. En la figura 2 se observa la variaci´on en la tolerancia de las semillas de Arabidopsis thaliana no modificadas gen´eticamente a concentraciones crecientes del metaloide arsenito. Las fotos mostradas, fueron realizadas con un microscopio est´ereo Olympus SZ4045TR. Ejemplo 2 Estudios de tolerancia de las plantas transformadas a concentraciones t´oxicas de cadmio y mercurio En este ejemplo se muestra el estudio de tolerancia de las semillas de la l´ınea 10, a concentraciones t´oxicas del metal cadmio. El experimento consist´ıa en poner en contacto, semillas esterilizadas de la l´ınea transformada n´umero 10, con las concentraciones de este metal que inhib´ıa la germinaci´on de las semillas silvestres de Arabidopsis thaliana. Semillas de plantas silvestres y de la l´ınea transformada 10 fueron sembradas en placas con medio s´olido MS, conteniendo la concentraci´on 6 11 ES 2 176 117 B1 12 t´oxica del metal pesado de este estudio. La figura 3 muestra el resultado del experimento despu´es de 14 d´ıas en la c´amara de crecimiento en las mismas condiciones que en el experimento del ejemplo 1. Se puede observar en la figura 3A que tanto las semillas silvestres y las que proced´ıan de los controles de transformaci´on no eran pr´acticamente capaces de germinar en un medio s´olido que conten´ıa una concentraci´on de 250 µMdeCdCl 2, y las pocas que germinaban, no desarrollaron las primeras hojas, muriendo a los pocos d´ıas. Por el contrario, tanto la germinaci´on como el crecimiento posterior de las pl´antulas transformadas en esas condiciones se produc´ıa sin aparente dificultad. La figura 3B muestra la cuantificaci´on de la tolerancia al metal mercurio (30 µM) de las semillas transformadas de la l´ınea 10 con respecto a las silvestres. Los resultados obtenidos son el cociente de las semillas que eran capaces de germinar por el n´umero total de semillas sembradas en cada caso. Mirando los valores de tolerancia, puede observarse que las plantas transformadas eran 10 veces m´as tolerantes a este metal pesado que las silvestres. Ejemplo 3 Recuperaci´on de suelos de la toxicidad de los distintos metales pesados Para el estudio de la recuperaci´on de suelos t´oxicos en distintos metales pesados, semillas, tanto silvestres como de la l´ınea 10 de las modificadas gen´eticamente, de Arabidopsis thaliana se sembraron en vermiculita (soporte inerte). Despu´es de 24 horas a 4◦C, se introdujeron en las c´amaras de crecimiento en las mismas condiciones que las descritas en el ejemplo 1, y se dejaron crecer durante tres semanas. Medio Hoagland fue utilizado para proporcionar a las plantas los nutrientes necesarios para su id´oneo crecimiento. Despu´es de estas tres semanas, las plantas se irrigaron con medio Hoagland contaminado con los distintos metales, a las concentraciones que anteriormente fueron calculadas como t´oxicas para las plantas silvestres de Arabidopsis thaliana,menos para el arsenito donde la concentraci´on usada fue de 100 µM. En este ejemplo, mostramos los casos particulares del CdCl2a 250 µM, NaAsO2a 100 µM, NaH2AsO4a 180 µMyHgCl 230 µM. Despu´es de los 14 d´ıas de tratamiento con los distintos metales pesados, se procedi´oaltratamiento de las muestras de hoja para el posterior an´alisis elemental. Para dicho an´alisis, hojas de las plantas en las distintas condiciones fueron recogidas y secadas a 65◦C durante 5 horas. El material ya seco fue digerido por una mezcla ´acida compuesta de HNO3-HClO47:1 (v/v) a 65◦C hasta que el volumen de la disoluci´on se reduc´ıa por evaporaci´ondesde20a2ml.Finalmentelas muestras, fueron analizadas mediante espectroscopia de emisi´on at´omica (ICP-AES) usando un secuenciador multi-elemento Fisons-ARL 3410. En la figura 4 se muestran los resultados obtenidos cuando el experimento se realiz´oconla l´ınea 10 de las modificadas gen´eticamente con los metales pesados Cd, As (en sus dos formas arsenito y arseniato) y Hg. Como caso particular destacamos el resultado obtenido cuando el medio contaminado conten´ıa 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 cadmio a la concentraci´on de 250 µM. Puede observarse que la cantidad de metal absorbido del suelo por la planta modificada gen´eticamente es un 72 % superior que la cantidad absorbida por las plantas silvestres (Fig. 4B). El nivel de absorci´on medio obtenido por esta planta fue de 670 mg de Cd/Kg de peso seco de planta, en las condiciones descritas anteriormente. Este fen´omeno se produjo sin ninguna variaci´on significativa en la velocidad de crecimiento de las plantas transformadas, lo que indica que el aumento de absorci´on de metales no tuvo efectos apreciables sobre las plantas. Referencias bibliogr´aficas Baker AJM, Brooks RR (1989) Terrestrial higuer plants which hyperaccumulate metal elements-a review of their distribution, ecology and phytochemistry. Biorecovery 1: 81-126 Barroso C, Vega JM, Gotor C, (1995). 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Planta resistente a medios con metales pesados, manipulada gen´eticamente, seg´un la reivindicaci´on 1, caracterizada porque en dicha planta la sobre-expresi´on de dicho gen se encuentra bajo el control de una secuencia regulatoria transcripcional funcional en planta, particularmente bajo control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor. 3. Planta resistente a medios con metales pesados, manipulada gen´eticamente, seg´un las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque dicha planta, mediante la sobre-expresi´on de dicho gen, presenta incrementada hasta 4 veces la s´ıntesis de mol´eculas responsables de secuestrar metales pesados y metaloides. 4. Planta resistente a medios con metales pesados, manipulada gen´eticamente, seg´un la reivindicaci´on 3, caracterizada porque las mol´eculas y p´eptidos cuya s´ıntesis se ha incrementado son la ciste´ına, el glutati´on, la fitoquelatina y la metalotione´ına. 5. Planta resistente a medios con metales pesados, manipulada gen´eticamente, seg´un las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque acumula en sus tejidos metales pesados y metaloides seleccionados entre Ag, As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg,Ni,Pb,Pd,Pt,Te,Tl,Sb,Se,SnyZn,sus especies i´onicas correspondientes y sus mezclas. 6. Planta resistente a medios con metales pesados, manipulada gen´eticamente, seg´un la reivindicaci´on 5 caracterizada porque los metales pesados y metaloides acumulados por la planta se seleccionan particularmente entre As, Cd, Cu, Hg, Ni, y Zn, sus especies i´onicas correspondientes y sus mezclas y m´as particularmente entre As, Cd y Hg, sus especies i´onicas correspondiente y sus mezclas. 7. Planta resistente a medios con metales pesados, manipulada gen´eticamente, seg´un las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque la planta acumula los metales pesados y metaloides preferentemente en sus partes a´ereas: tallos y hojas.8. Planta resistente a medios con metales pesados, manipulada gen´eticamente, seg´un las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque acumula metales pesados y metaloides en sus tejidos a´ereos hasta un 72 % m´as que las correspondientes plantas silvestres (sin modificaci´on gen´etica) de la misma especie. 9. Planta resistente a medios con metales pesados, manipulada gen´eticamente, seg´un las reivindicaciones 1-8 caracterizada porque contiene semillas capaces de germinar en medios que contienen concentraciones t´oxicas de metales pesados para las semillas de las correspondientes plantas 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 silvestres. 10. Planta resistente a medios con metales pesados, manipulada gen´eticamente, seg´un la reivindicaci´on 9 caracterizada porque dichas semillas son capaces de germinar en medios que contienen concentraciones de Cd superiores a 250 µM, concentraciones de Zn superiores a 1.3 mM, concentraciones de Hg superiores a 30 µM, concentraciones de Cu superiores a 100 µM, concentraciones de Ni superiores a 250 µM, concentraciones de As(V) superiores a 180 µM, o concentraciones de As(III) superiores a 40 µM. 11. Planta resistente a medios con metales pesados, manipulada gen´eticamente, seg´un las reivindicaciones 1-10, caracterizada porque es una planta diploide. 12. Planta resistente a medios con metales pesados, manipulada gen´eticamente, seg´un la reivindicaci´on 11, caracterizada porque es una planta perteneciente a la familia de las Brassicaceae o Cruciferae. 13. Planta resistente a medios con metales pesados, manipulada gen´eticamente, seg´un la reivindicaci´on 12, caracterizada porque es una planta del g´enero Arabidopsis. 14. Planta resistente a medios con metales pesados, manipulada gen´eticamente, seg´un la reivindicaci´on 13, caracterizada porque es una planta de la especie Arabidopsis thaliana. 15. Planta resistente a medios con metales pesados, manipulada gen´eticamente, seg´un la reivindicaci´on 14, caracterizada porque es una planta de la especie Arabidopsis thaliana, ecotipo columbia. 16. Procedimiento para obtener plantas resistentes a medios con metales pesados y acumuladoras de dichos metales pesados, seg´un las reivindicaciones 1-15, que comprende los siguientes pasos: a- Construcci´on de un pl´asmido que contenga el gen Atcys-3A b- Introducci´on de dicho pl´asmido en la planta amodificar c- Identificaci´on de las plantas modificadas mediante selecci´on con antibi´otico d- Sobre-expresi´on del gen controlada por una secuencia regulatoria transcripcional funcional en planta. 17. Utilizaci´on de una planta resistente a medios con metales pesados seg´un las reivindicaciones 1-15 para recuperar un suelo contaminado por metales pesados y metaloides que comprende las siguientes etapas: a) plantar entre 250.000 y 2.500.000 plantas por hect´area de suelo contaminado. b) cultivar las plantas durante un periodo comprendido entre 15 y 40 d´ıas. c) recolectar las partes a´ereas, tallos y hojas de dichas plantas en las cuales se han acumulado los metales pesados y metaloides. 9