Estudio de la incidencia de la infección por adenovirus, su cinética de replicación, y la respuesta inmune celular: impacto en la progresión clínica de pacientes adultos receptores de TPH

Estudio de la incidencia de la infección por adenovirus, su cinética de replicación, y la respuesta inmune celular: impacto en la progresión clínica de pacientes adultos receptores de TPH TESIS DOCTORAL José Antonio Marrugal Lorenzo Departamento de Medicina Universidad de Sevilla 2019 2 4 5 AGRADECIMIENTOS En primer lugar, me gustaría agradecer a Jerónimo Pachón haberme permitido formar parte de su grupo de investigación y darme la oportunidad de formarme durante este tiempo, y a Javi, mi director de tesis, quien me ha visto crecer personal y profesionalmente y a quién le agradezco haberme introducido en el micromundo que nos rodea. Por supuesto todo este trabajo no hubiese sido igual sin mis compañeros de laboratorio, todos han aportado algún granito de arena en esta tesis. A los Post-Doc Menia y Younes, por estar ahí para resolver mis dudas y calmar mis nervios. A Damián, Marina, Mery y Raquel gracias por acogerme con tanto cariño cuando me incorporé. A Pablo, por abrirme el camino para que mi transcurso fuese más fácil. A Ángel, por alegrarme los desayunos que nos daban fuerzas para seguir. A Pili, comer en el IBiS nunca fue lo mismo sin ti. A Malu, por estar siempre dispuesta a ayudar y a organizar algún plan y a Marta, por tu sonrisa diaria tan contagiosa. A los futuros Doctores. Tania, gracias por ser tan auténtica y alegre. A Gema, por transmitir tranquilidad en los días más duros y a Rafa y Andrea, los compañeros perfectos para ese par de cervezas tan necesarias a veces. A Judith, por ayudarme tanto en esta última etapa, eres un sol. Y a Ana, que además de ser el Google Molecular del laboratorio y la relaciones públicas del IBiS, es la compañera perfecta que se puede tener y yo tengo el lujo de llamarla amiga. A mis chicas Laura, Marigon, Vera y Mari, gracias por hacer de mi vida una performance, “The show must go on”. A Jorge, por aguantar tan bien la convivencia con un doctorando y hacerme desconectar al llegar al piso. A mis amigos Dani, Ale, Luis y José, después de todo lo que estamos viviendo, podemos decir que en la carrera nos quejabamos por gusto. A Richi y Luisma, gracias por darle a mi vida ese toque de locura y postureo. A mi hermana Ángela, por ser mi referencia. Este año marcará nuestras vidas y me siento muy afortunado de poder compartir todos estos altibajos pre-tesis contigo. Y a mi cuñado Arga, muchas gracias por cuidarla. A mi madre, gracias por exigirme tanto y hacer de mi la persona que soy hoy. A mi padre, gracias por hacerme comprender que rendirse no es una opción. Sois lo más 6 importante de mi vida, espero que estéis tan orgullosos de mí como yo de vosotros, siento que jamás podré devolveros todo lo que me habéis dado (suerte que no soy un Lannister). Al resto de mi familia, especialmente a mis abuelas, por hacerme sentir tan querido y especial. Y por último a Ángel, mi compañero de vida y de viajes. Gracias por tu apoyo incondicional, por tus “he visto un vuelo barato” y tus “te traigo sushi”. Nos queda mucho mundo por descubrir juntos. 7 FINANCIACIÓN Este trabajo ha sido financiado por el subprograma de proyectos de Investigación en Salud, correspondiente a la convocatoria 2015 de concesión de ayudas de la Acción Estratégica en Salud (número de expediente PI15/00489), Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación, Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad. 8 9 ÍNDICE Página I. INTRODUCCIÓN 17 1. Características del adenovirus humano (HAdV) 19 2. Epidemiología 20 3. Impacto clínico de las infecciones por adenovirus 25 3.1. Infección y enfermedad en pacientes inmunodeprimidos 25 3.2. Infección y enfermedad en pacientes inmunocompetentes 29 4. Respuesta inmune frente al adenovirus humano 31 4.1. Respuesta innata 33 4.2. Respuesta adaptativa 34 5. Tratamientos antivirales frente al adenovirus humano 35 II. JUSTIFICACIÓN 41 III. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 49 1. Hipótesis 51 2. Objetivos 52 IV. MATERIAL Y MÉTODOS 53 1. Diseño del estudio 55 2. Ámbito del estudio 55 3. Sujetos de estudio y criterios de inclusión y de exclusión 55 4. Definiciones 55 5. Monitorización y seguimiento de los pacientes 56 6. Recogida de datos clínicos 56 7. Determinación de la carga viral de HAdV 57 8. Clasificación por secuenciación de las muestras positivas para HAdV 57 9. Determinación de la inmunidad celular específica frente a HAdV 58 10. Células y virus 59 11. Ensayo de citotoxicidad 59 16 PCR Reacción en cadena de la polimerasa PML Proteína de la leucemia promielocítica ppm Partes por millón pTP Precursor de la proteína terminal pVIc Péptido de la región C-terminal de la proteína precursora pVI qPCR PCR en tiempo real cuantitativa IS Índice de selectividad TCID50 Dosis infectiva media en cultivo celular TNF Factor de necrosis tumoral TOS Trasplante de órgano sólido TPH Trasplante de progenitores hematopoyéticos VIH Virus de la inmunodeficiencia humana 17 I. INTRODUCCIÓN 18 19 1. Características del adenovirus humano El adenovirus humano (HAdV) es un virus sin envuelta, perteneciente al género Mastadenovirus de la familia Adenoviridae. Los HAdV engloban a más de 60 tipos diferentes clasificados en siete subgrupos o especies (de la A a la G) basadas en sus características biológicas, inmunológicas y bioquímicas [1, 2] (Tabla 1). En la tabla 1 se muestran así mismo las preferencias en cuanto a tropismo tisular de las diferentes familias. La especie A está relacionada principalmente con el tracto gastrointestinal [3], mientras que los subgrupos B y C son más comunes en enfermedades del aparato respiratorio [4]. HAdV-D es el mayor causante de conjuntivitis [5-7], y el HAdV-E está asociado a infecciones oculares (conjuntivitis) y respiratorias [8]. Finalmente, las especies F y G son agentes causales, principalmente, de gastroenteritis [3, 9, 10]. Además, el HAdV-36 se ha asociado con la obesidad, y existen estudios que sugieren que los HAdV tienen un papel relevante en el desarrollo de la misma [11, 12]. Figura 1. Estructura la partícula viral del HAdV. La estructura de la partícula vírica del HAdV, con un diámetro de entre 70 a 100 nm, se compone de dos elementos principales: el núcleo o core que contiene el genoma de ADN lineal de doble cadena, y la cápside externa. La cápside posee simetría icosaédrica y está formada por tres componentes principales: el hexón, proteína mayoritaria y localizada en las caras y bordes de la cápside; la base pentón, situada en los vértices; y la fibra unida a la base pentón (Figura 1). La fibra es una proteína 20 trimérica con un dominio globular en la parte distal, responsable de la unión del virus al receptor de la célula hospedadora[13]. La longitud de estas fibras varía entre los distintos tipos de HAdV, en función del número de repeticiones en la secuencia de aminoácidos del eje de la fibra, que va desde 6 repeticiones en HAdV3 hasta las 22 en los HAdV2 y HAdV5 [14, 15]. Las proteínas menores de la cápside, IIIa, VI, VIII, y IX confieren estabilidad a la a la estructura del virión [16], y juegan papeles fundamentales en los procesos que ocurren tras la internalización, tales como la penetración del endosoma, la activación transcripcional, y la reorganización nuclear (proteína IX) [17, 18]. El core de la estructura del HAdV consiste en el ADN genómico de doble cadena y 6 proteínas. El genoma se encuentra condensado y asociado a las proteínas V, VII y μ [19], y con el extremo terminal unido covalentemente a dos copias de la proteína terminal (TP) [20]. La proteína VII, una proteína de características similares a las histonas, organiza el genoma viral en estructuras similares al nucleosoma, permitiendo la condensación del ADN del HAdV [21, 22]. La proteína V interviene en la unión del ADN viral con la cápside, a través de interacciones con la proteína VII y la base pentón [22, 23]. Los viriones completamente maduros contienen también la proteína IVa2, que interactúa de manera específica con el promotor mayor tardío del genoma de HAdV, necesario para el empaquetamiento del ADN del virus [24, 25]. Además en el núcleo se encuentra la proteasa del HAdV (AVP), esencial en el proceso de maduración de las nuevas partículas víricas [26]. El genoma del HAdV es una molécula de ADN de doble cadena linear, con un tamaño de entre 34 a 37 kb y que porta unos 40 genes [5]. Flanqueando ambos extremos del genoma se encuentran las repeticiones terminales invertidas (ITRs) que actúan como origen de replicación junto con la secuencia de empaquetamiento (Ψ). La organización del genoma es similar en los distintos tipos de HAdV, pudiendo dividirlo en tres regiones: temprana (E1A, E1B, E2, E3, E4), intermedia (IX e IVa2) y tardía (L1-L5). Cada una de estas regiones se corresponde con los distintos patrones/etapas de expresión duranteel ciclo de infección del virus (Figura 2). 21 Figura 2. Esquema del genoma de HAdV5. Las flechas indican la dirección de la transcripción. Adaptada de Bratati S. et al., 2014 [27]. La infección de la célula hospedadora es un proceso que se inicia con la unión de la fibra de HAdV a sus receptores celulares; mayoritariamente el receptor de coxsackie-adenovirus (CAR) y el receptor CD46, y en menor medida la desmogleína 2 (DSG-2) son los receptores empleados por HAdV para el reconocimiento de su célula diana [28-32]. De manera alternativa, algunos miembros pertenecientes a HAdV-D reconocen el ácido siálico como receptor en lugar de CAR o CD46 y en los tipos de HAdV-2 y 5, el heparán sulfato de proteoglicanos (HSPGs) puede mediar la infección cuando la unión a los receptores CAR no es posible [17]. Tras la fase de unión, ocurre una interacción entre la base pentona del virus con las integrinas αvβ3 y αvβ5 celulares, permitiendo la internalización de las partículas virales a través de endocitosis mediada por clatrina [33]. Una vez dentro del endosoma, la partícula viral sufre una decapsidación parcial debida en parte a la acidificación del endosoma, causando la liberación de varias proteínas virales, entre ellas la proteína VI, cuya actividad lítica media el escape del virus al citoplasma [34, 35]. Posteriormente, el virión parcialmente decapsidado es transportado mediante la red microtubular hasta la envoltura nuclear, donde se ancla al complejo de poro nuclear, a través del cual el ADN viral junto con la proteína VII (estabilizadora del ADN) se introducen en el núcleo de la célula huésped [36] (Figura 3). 22 Figura 3. Representación esquemática del ciclo de vida del adenovirus. Adaptada de Martínez-Aguado P. et al., 2015 [37]. Una vez en el núcleo, el genoma viral se transcribe a ARNm temprano cuyas proteínas resultantes son esenciales para el siguiente proceso, la replicación del ADN viral (comenzando entre las 6 y 8 horas post-infección), y finalmente el ARNm tardío es sintetizado. Las nuevas proteínas de la cápsida y el core que han sido sintetizadas son importadas del citosol al núcleo celular para el ensamblaje de las nuevas partículas víricas. Un ciclo replicativo completo conlleva entre 24 y 36 horas y genera unos 104 viriones por célula infectada [38]. 2. Epidemiología Las infecciones más comunes causadas por HAdV son las respiratorias, oculares (faríngeo-conjuntival, queratoconjuntivitis) y gastrointestinales. En los huéspedes inmunocomprometidos pueden presentarse infecciones severas o diseminadas, pero esto ocurre rara vez en pacientes inmunocompetentes [39]. Cabe destacar además la creciente importancia que, como agente causal de la neumonía adquirida en la 23 comunidad, ha adquirido HAdV gracias al uso cada vez más extendido de herramientas moleculares de diagnóstico [40]. HAdV presenta una distribución global y la mayoría de las epidemias que provoca ocurren en el invierno o principios de la primavera, pero las infecciones ocurren durante todo el año sin una clara estacionalidad [41]. La mitad de los casos de infecciones por HAdV son asintomáticos, y por ello la mayoría de ellas no están documentadas, así que la información epidemiológica deriva generalmente de estudios e investigaciones de vigilancia de brotes esporádicos. Las especies B y D de HAdV, principales responsables de las infecciones oculares, generan casos de queratoconjuntivitis y conjuntivitis hemorrágica aguda que predominan en el continente asiático durante el invierno y primavera, mientras que la fiebre faríngeo-conjuntival circula en su mayoría en China, Australia y Estados Unidos durante el verano [39]. En el caso de las infecciones respiratorias, causadas generalmente por las especies B y C de HAdV, son endémicas en la mayoría de países a nivel mundial, y suelen ocurrir en invierno, primavera y principios de verano. La gran mayoría de enfermedades gastrointestinales de HAdV que están causadas por la especie F, ocurren durante todo el año, y su incidencia varía entre el 1 y el 8% en países desarrollados, mientras que en países en vías de desarrollo se encuentra entre el 2 y el 31% [38, 39]. La transmisión del HAdV se produce fácilmente de persona a persona a través de fluidos corporales, incluyendo heces y secreciones respiratorias de las personas infectadas[38]. El HAdV es resistente a las secreciones gástricas y biliares, por lo que puede alcanzar la mucosa intestinal y replicarse. Se trata de un virus muy resistente en el medio externo, llegando a sobrevivir hasta 3 semanas en ambientes secos. Además, al tratarse de un virus sin envuelta, son resistentes a la mayoría de desinfectantes [39]. Por ello, una correcta desinfección en las unidades de trasplantes y cuidados intensivos es fundamental para evitar la transmisión del HAdV en pacientes inmunosuprimidos. El período de incubación varía de 2 a 14 días. Es importante destacar que el HAdV puede residir latente en el tejido linfoide, parénquima renal, u otros tejidos durante años [42]. Por otro lado la reactivación del virus puede ocurrir en pacientes 24 severamente inmunodeprimidos [43]. El transporte asintomático del HAdV puede persistir durante semanas o meses. Debido a la estabilidad que presentan estos virus y su fácil transmisión, se han descrito importantes brotes de infección que pueden llegar a provocar epidemias que pueden propagarse rápidamente entre poblaciones cerradas (por ejemplo, hospitales, guarderías, orfanatos o piscinas públicas [39, 42]. Tabla 1. Especies, tipos y tropismos tisulares de HAdV. Adaptada de T. Lion, 2014 [1] Especies Tipos (serotipos/genotipos) Tropismo A 12, 18, 31, 61 Entérico y respiratorio B 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50, 55, 66 Respiratorio, ocular y renal C 1, 2, 5, 6, 57 Respiratorio, ocular, hepático y linfoide D 8-10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39, 42-49, 51, 53, 54, 56, 58-60, 63-67 Ocular y entérico E 4 Respiratorio y ocular F 40,41 Entérico G 52 Entérico 25 3. Impacto clínico de las infecciones por adenovirus El HAdV se ha considerado durante muchos años el agente causal de enfermedades que iban desde infecciones respiratorias y oculares agudas a enfermedades gastrointestinales más severas, pero en cualquiera de los casos nunca se le asociaba a sintomatologías clínicas graves [44]. Sin embargo, hoy sabemos que el HAdV es una de las causas más comunes de enfermedades víricas asociadas con el trasplante, presentando además una elevada morbilidad y mortalidad [1, 3]. Además, el uso cada vez más generalizado de nuevas técnicas moleculares de diagnóstico ha permitido identificar al HAdV como agente causal tanto de casos aislados como de brotes de neumonía adquirida en la comunidad (NAC) en individuos inmunocompetentes [40, 45, 46]. La infección respiratoria por HAdV en individuaos sanos ocurren más frecuentemente en niños sanos (en particular, menores de 4 años) o en adultos en entornos cerrados en condiciones de hacinamiento (escuelas, hospitales, instalaciones militares) [47-49]. La gran mayoría de los casos de infección cursan de manera autolimitada. Las infecciones diseminadas y fatales son raras en huéspedes inmunocompetentes [50, 51]. 3.1. Infección y enfermedad en pacientes inmunodeprimidos Las enfermedades más graves producidas por HAdV son sin duda las que afectan a los pacientes inmunodeprimidos, en los cuales la infección representa una seria amenaza para la supervivencia. Las deficiencias en el sistema inmune pueden estar causadas por deficiencias manifestadas desde la infancia (inmunodeficiencias primarias o congénitas) o al empleo de medicación inmunosupresora en el caso de pacientes receptores de trasplantes de progenitores hematopoyéticos (TPH) o de órgano sólido (TOS). En el caso de las inmunodeficiencias congénitas, particularmente en las inmunodeficiencias combinadas severas, son frecuentes las infecciones pulmonares graves y recurrentes causadas por HAdV, las cuales pueden llegar a ser letales con tasas de mortalidad de hasta el 55% [3, 52]. Actualmente, el número de TPH y TOS han aumentado espectacularmente debido a los avances de las terapias inmunosupresoras, esenciales para la prevención de 32 IFN-α/β in vivo porque se replican de forma incontrolable en ratones que recibieron anticuerpos neutralizantes contra IFN-α/β [101] o que fueron genéticamente deficientes para el receptor de IFN-α/β [102-104] o IFN-γ [104]. Sin embargo, en la mayoría de estos estudios in vivo, es difícil determinar si el IFN-α/β contribuyó a la eliminación viral mediante mecanismos antivíricos directos o inmunorreguladores indirectos. Sin embargo, se demostró que in vivo IFN-α/β inhibía la replicación de ciertos virus no citopática [105] y, por lo tanto, que éstos no respondían a la actividad inmunorreguladora de la citoquina. Finalmente, es importante tener en cuenta que los diferentes virus pueden ser sensibles al IFN-α/β [96]. De hecho, incluso diferentes cepas del mismo virus pueden ser sensibles al IFN-α/β [105]. Además de sus actividades antivirales directas, IFN-α/β puede inhibir la división celular, estimular las funciones efectoras de las células NK, CTL y macrófagos, regular la expresión de las moléculas MHC de clase I y MHC de clase II, inducir la síntesis de Ig en las células B [102], y estimular la proliferación de células T con fenotipo de memoria [106]. Todas estas funciones sugieren que IFN-α/β puede controlar las infecciones virales no solo por sus actividades antivirales directas, sino también por la modulación de la respuesta inmune innata y adaptativa [107]. Las poblaciones derivadas de células T son las encargadas de migrar el tejido infectado, reconocer el antígeno viral y realizar sus funciones efectoras, donde se incluye la producción de citoquinas antivirales, especialmente IFN-γ, IL-2 y TNF-α [98]. Tanto IFN-γ, IL-2como TNF-α pueden jugar un papel crítico en el control de la infección viral en varios niveles diferentes. Primero, pueden reclutar y activar macrófagos, células NK y células T para realizar sus funciones efectoras, incluida la producción de monoquinas y citoquinas inmunorreguladoras y antivirales [98, 104]. En segundo lugar, pueden polarizar la respuesta de las células T hacia el desarrollo de funciones efectoras antivirales necesarias para el control de las infecciones virales. En tercer lugar, pueden regular el procesamiento de antígenos, el transporte y la expresión de MHC localmente en las células infectadas [107]. Finalmente, pueden ejercer actividad antiviral directa. Los efectos antivirales de las citoquinas inflamatorias están mediadas por las vías celulares inducidas que interfieren con una o más etapas en el ciclo de replicación 33 viral que acaba en la eliminación completa o parcial del virus en la célula mientras que mantiene su integridad funcional [106]. Los anticuerpos antivirales acaban siendo detectables relativamente tarde en la mayoría de las infecciones cuando se piensa que son los principales responsables de la prevención en la diseminación célula-célula y en la resistencia a la reinfección [102]. Sin embargo, en ciertos casos, los anticuerpos antivirales también pueden controlar la producción o liberación de virus de las células infectadas, y pueden actuar sinérgicamente con las citoquinas antivirales en este sentido [98, 102]. Al igual que otros virus, la replicación de HAdV está controlada por las respuestas inmunitarias innata y adaptativa [98]. La secreción rápida de citoquinas antivirales, como interferón gamma (IFN-γ), factor de necrosis tumoral (TNF), interleukina-1 (IL-1), IL-2, y proteína inflamatoria de los macrófagos, es desencadenada por HAdV y se dirige a diferentes pasos en el ciclo viral, lo que limita la amplificación y propagación del virus. Además, las células efectoras innatas, en particular las natural killer, que pueden destruir las células infectadas por virus de forma inespecífica, son reclutadas y activadas [98, 108]. El efecto de las citocinas inducidas por la infección es contrarrestado por productos virales como la proteína de 55 kDa E1B, codificada por HAdV. Esta proteína media la represión transcripcional de los genes inducibles por IFN, lo que facilita la replicación viral [1, 109]. 4.1. Respuesta innata La respuesta innata contra HAdV implica factores intrínsecos presentes a niveles constantes y factores innatos dirigidos por la célula huésped ante la exposición viral. Estos factores ejercen efectos antivirales al unirse directamente al virus o a componentes virales [110]. Los anticuerpos, en particular las Ig, protegen contra las infecciones letales causadas por virus, incluidos los HAdV [110]. Surgen principalmente de células plasmáticas y otras células B innatas, y se dirigen contra epítopos específicos de 34 proteínas virales u otros productos biológicos. Las Ig normalmente reconocen sus dianas en el espacio extracelular, bloquean sus funciones biológicas y los dirigen a la degradación en las células inmunitarias para la presentación de antígenos [91]. Por otro lado, los péptidos antimicrobianos son efectores inmunes innatos potentes que se han conservado a través de la evolución. En la infección por HAdV, la inhibición por las α-defensinas ocurre temprano durante la entrada, y estudios detallados identificaron la penetración del endosoma como el paso específico bloqueado por las mismas [111]. Además de proporcionar la primera línea de defensa, el sistema inmune innato apoya la proliferación y la diferenciación de la respuesta inmune adaptativa mediada por los linfocitos T y B. La generación de linfocitos T específicos contra HAdV facilita la lisis de las células infectadas mediante un mecanismo dependiente de perforina [1, 112]. 4.2. Respuesta adaptativa Aunque la gran cantidad de tipos existentes de HAdV implica que puede esperarse que la expresión de antígenos que representan potenciales dianas de los linfocitos T sea altamente polimórfica, las células T producidas contra HAdV, incluyendo los subconjuntos CD4 y CD8, mostraron una reactividad cruzada con diferentes especies de adenovirus [113]. Estas observaciones indican que dichos linfocitos T reconocen secuencias conservadas de residuos de aminoácidos de una proteína estructural de HAdV [114]. De hecho, una de las dianas inmunodominantes más importantes de las células T es la proteína hexón adenoviral, que contiene componentes antigénicos genéricos comunes a todas las especies de adenovirus [115]. Por lo tanto, se cree que la exposición a los HAdV durante la infancia y la consiguiente generación de linfocitos T citotóxicos con reacción cruzada conducen a una amplia inmunidad frente a HAdV en adultos [116-118]. Las personas sanas suelen portar linfocitos T específicos contra HAdV, que pueden identificarse por diversos métodos, como los ensayos de secreción de interferón gamma, la citometría de flujo de citoquinas o la detección de multímeros de clase I del 35 complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) [115, 119, 120]. La ausencia de células T específicas contra HAdV tiene un impacto negativo en el curso de las infecciones por HAdV y, de igual modo, la reconstitución de la respuesta de linfocitos T específicos contra HAdV se correlaciona con el control de la infección [119, 121]. El hecho de que los epítopos reconocidos por los linfocitos T CD4 y CD8 sean compartidos entre diferentes especies y tipos de HAdV sugiere que las células T con estas especificidades pueden proteger contra la mayoría, si no todos, los HAdV, y este hecho puede ser utilizado para la inmunoterapia mediante la utilización de la transferencia de células T adoptiva o basada en vacunas para tratar infecciones por estos virus. A pesar de esta reactividad cruzada significativa entre los diferentes serotipos de HAdV en las respuestas de células T que parecen reconocer epítopos recientemente caracterizados en la proteína hexón, se ha visto que los HAdV presentan genes que codifican para proteínas inmunorreguladoras que pueden atenuar las respuestas inmunitarias innatas o adquiridas [43].Muchas de estas proteínas están codificadas por los genes de la región de transcripción temprana E3 y no son esenciales para la replicación viral en el cultivo celular. Por ejemplo, E3-gp19K bloquea el transporte de antígenos MHC de clase I a la superficie de la célula infectada mediante su unión a la tapasina, una proteína transmembrana de tipo I que ayuda a las moléculas MHC de clase I a permanecer en su estado de péptido receptivo. Estos procesos conducen a la inhibición de señales para la activación de las células T citotóxicas [115, 121]. Otros genes E3 antiapoptóticos, como los que codifican para el complejo de proteínas RID/ (internalización y degradación del receptor), inhiben la muerte celular inducida por TNF-. También se ha demostrado que las proteínas E3 inhiben la estimulación por TNF- de la síntesis de citoquinas (IL-8, MCP 1 e IP-10)[114]. Estos y otros mecanismos inmunomoduladores, así como las propiedades citolíticas del virus en sí, pueden ser responsables de las manifestaciones de la enfermedad adenoviral [43, 121]. 5. Tratamientos antivirales frente al adenovirus humano El tratamiento de la infección por HAdV solo se recomienda en pacientes inmunocomprometidos, especialmente en pacientes sometidos a alo-TPH, que tienen el mayor riesgo de infección grave [1, 37].Actualmente no se dispone de una terapia 36 antiviral eficaz y segura para el tratamiento de las infecciones por HAdV. Se han reportado resultados muy variables en cuanto a su eficacia para varios agentes antivirales [122, 123]. Entre los fármacos antivirales disponibles en el mercado, solo el ganciclovir (GCV), la ribavirina y el cidofovir (CDV) mostraron una eficacia in vitro contra diferentes serotipos de HAdV (Figura 4) [124]. Figura 4. Estructura de los fármacos antivirales de amplio espectro de uso común para el tratamiento de infecciones por HAdV [37]. Cidofovir es un análogo de nucleótido de la citosina que inhibe la replicación del ADN viral mediante una incorporación competitiva más eficiente en el ADN (Figura 5). Muestra eficacia contra varios virus de ADN, pero solo está aprobado por las autoridades sanitarias para su uso en el tratamiento de la retinitis por HCMV en pacientes con SIDA [125, 126]. Cidofovir exhibe actividad antiviral contra todas las especies de HAdV, pero tiene una biodisponibilidad oral baja y una toxicidad significativa (necrosis tubular), además de no conferir protección a largo plazo [127]. Además, en 2014, Gilead Sciences, el fabricante de cidofovir (Vistide®), solicitó formalmente la cancelación de la autorización para comercializar cidofovir en Europa, alegando problemas con su producción y la disponibilidad de terapias alternativas para las indicaciones para las que fue aprobado (retinitis por HCMV) [37]. Actualmente, e incluso con su baja biodisponibilidad y nefrotoxicidad, el cidofovir es el fármaco anti- HAdV de elección para la terapia preventiva [128] o en aquellos casos más graves donde la infección ya se ha identificado [129]. La eficacia clínica informada de 37 cidofovir frente al HAdV en el contexto del alo-TPH es altamente variable, ya que algunos estudios muestran una baja o completa falta de eficacia, mientras que otros muestran tasas de éxito superiores al 70% [37]. Figura 5. Mecanismo de acción del CDV. Brincidofovir (CMX001), un conjugado lipídico biodisponible por vía oral de cidofovir, utiliza proteínas de la membrana plasmática celular (flipasas) para una rápida entrada en las células, lo que resulta en concentraciones intracelulares más altas [130]. Se ha demostrado que es eficaz para erradicar la infección diseminada por HAdV cuando se evalúan en el modelo de hámster sirio, que es permisivo para la replicación de HAdV5. En este modelo, los hámsteres sirios están inmunosuprimidos con ciclofosfamida, lo que aumenta la replicación del virus en varios órganos (principalmente en el hígado) y la patología HAdV. La eficacia y seguridad mostrada por brincidofovir en el tratamiento de infecciones por HAdV en este modelo animal de infección impulsó su estudio en posteriores ensayos clínicos para evaluar su eficacia y seguridad como parte de su desarrollo clínico [131].La administración de brincidofovir ha demostrado ser segura en voluntarios sanos [132, 133]. En 2016finalizó un estudio 38 multicéntrico de Fase III para evaluar la eficacia de brincidofovir en el tratamiento de la infección por HAdV del que lamentablemente no se han reportado resultados hasta el momento (NCT02087306) [133]. La ribavirina es un agente antiviral de amplio espectro que muestra actividad in vitro contra los virus de ADN y ARN. Es un análogo de nucleósido de la guanosina, pero su mecanismo de acción es incierto y aún controvertido, con diferentes mecanismos propuestos para explicar su actividad [124, 134, 135]. La ribavirina tiene actividad variable contra diferentes tipos de HAdV, mostrando una actividad máxima contra el subgrupo C, aunque las concentraciones plasmáticas alcanzadas por la ribavirina son 10 veces más bajas que el valor IC50 requerido [136]. El GCV es otro análogo de nucleósido que se ha utilizado para el tratamiento de infecciones por HAdV, con resultados variables [61]. El trifosfato de GCV es un inhibidor eficaz de la ADN polimerasa de HAdV in vitro (Figura 6) [124]. Sin embargo, debido a que HAdV carece de la timidina quinasa viral, y las quinasas celulares son ineficientes para la fosforilación de GCV, su actividad anti-HAdV es pobre (Figura 6). Figura 6. Mecanismo de acción del GCV frente HCMV y HAdV. Algunos estudios retrospectivos han mostrado una menor incidencia de infección por HAdV en pacientes que reciben GCV como profilaxis frente a HCMV 39 [137]. Sin embargo, GCV no mostró una reducción significativa de la infección cuando se usó para tratar las infecciones por el HAdV y, además, indujo neutropenia, lo cual es especialmente crítico en pacientes que reciben TPH [137]. Según estos datos, no hay justificación para usar este medicamento para el tratamiento de HAdV; sin embargo, un artículo reciente demostró que el GCV fue eficaz en el tratamiento de la infección por HAdV en un modelo de Hámster sirio, lo que devolvió el GCV al repertorio opcional de medicamentos anti-HAdV [37]. Además, un profármaco de éster valílico de GCV, valganciclovir (VGCV), ha mostrado una actividad anti-HAdV significativa en el mismo modelo animal de infección [138]. El hámster sirio es permisivo para la replicación de HAdV en órganos y tejidos y la infección causa una patología similar a la observada en humanos [132]. 40 41 II. JUSTIFICACIÓN 48 49 III.HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 50 51 1. Hipótesis 1.1. En los pacientes adultos receptores de trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos (alo-TPH) existe una replicación de HAdV que puede monitorizarse a través de la determinación de la carga viral en sangre periférica. 1.2. La infección asintomática de HAdV en los pacientes adultos con alo-TPH despierta una respuesta inmune específica, la cual se relaciona con linfocitos T CD4+ y CD8+. 1.3. El conocimiento de la interrelación entre la carga viral plasmática de HAdV y la respuesta inmunitaria específica, permitiría conocer el riesgo de infección persistente por adenovirus en los pacientes adultos receptores de alo-TPH. 1.4. La actividad in vitro de ganciclovir frente a HAdV está aumentada en condiciones de co-infección con HCMV. 52 2. Objetivos 2.1. Objetivo general: El objetivo general del presente estudio es evaluar la incidencia e impacto clínico de la infección por HAdV en los pacientes receptores de TPH alogénico (alo-TPH) y determinar el papel de la inmunidad celular específica en la evolución de la misma. 2.2. Objetivos específicos: 1. Determinar la incidencia y la cinética de replicación del HAdV en los pacientes adultos receptores de alo-TPH mediante la determinación de la carga viral en sangre, durante los 100 primeros días postrasplante. 2. Evaluar la respuesta inmune celular específica frente a la infección por HAdV en pacientes adultos receptores de alo-TPH, y su relación con la presencia y evolución de la infección. 3. Determinar los factores de riesgo y las variables clínicas asociados a la infección y enfermedad de HAdV en pacientes adultos receptores de alo-TPH, incluyendo la enfermedad subyacente, el grado de acondicionamiento (mieloablativo vs. intensidad reducida), y el tratamiento inmunosupresor utilizado. 4. Evaluación in vitro de la actividad de GCV frente a HAdV en condiciones de mono-infección y de co-infección con HCMV. 53 IV. MATERIAL Y MÉTODOS 54 55 1. Diseño del estudio Se realizó un estudio de cohortes prospectivo de casos consecutivos en el Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla, desde febrero de 2016 hasta mayo de 2018. Se incluyeron todos los pacientes mayores de 14 años que recibieron un TPH alogénico, diferenciando entre TPH alogénico de alto riesgo (haploidénticos o cordón no emparentado, depleción de células T, linfopenia severa (recuentos de células CD3+ < 300/μl) y pacientes con EICH) y TPH alogénico de bajo riesgo. 2. Ámbito del estudio El proyecto se realizó en el Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla, con la participación de investigadores de los Servicios de Hematología, Enfermedades Infecciosas y Microbiología, 3. Sujetos de estudio y criterios de inclusión y de exclusión - Criterios de inclusión: a) Pacientes adultos (mayores de 14 años) receptores de TPH alogénico. b) Haber firmado el consentimiento informado previa información del estudio al paciente (ANEXO I). - Criterios de exclusión: a) Pacientes que no hayan firmado el consentimiento informado. b) Pacientes en los que, debido a su estado clínico, no era posible realizar la extracción de las muestras sanguíneas. 4. Definiciones Debido al hecho de que técnicas altamente sensibles como la PCR se han convertido en el estándar para la detección y la monitorización de las infecciones por HAdV, la Conferencia Europea sobre Infecciones en Leucemia (ECIL) recomendó en 2011 las siguientes definiciones [151]: 56 i) Infección local: PCR positiva para HAdV, aislamiento del virus o detección del antígeno en biopsia o fluidos diferentes a la sangre periférica. ii) Infección sistémica (invasiva): PCR positiva para HAdV (Viremia/DNAemia), aislamiento del virus o detección del antígeno en sangre periférica. iii) Enfermedad probable: infección por HAdV más síntomas y signos correspondientes sin confirmación histológica. iv) Enfermedad comprobada: infección por HAdV más síntomas correspondientes relacionados con la infección, con confirmación histológica de la infección por HAdV en el lugar apropiado. A efectos del presente estudio, y con los conocimientos actuales, la infección local sería equivalente a la enfermedad probable localizada, en presencia de síntomas, tales como conjuntivitis o diarrea. 5. Monitorización y seguimiento de los pacientes El estudio se llevó a cabo durante los primeros 100 días posteriores al trasplante. En el momento de la admisión para el alo-TPH se solicitó el consentimiento informado. Durante el seguimiento se recolectaron muestras de sangre en tubos de EDTA para cuantificar la carga viral de HAdV semanalmente desde el día -7 al día +50 y cada dos semanas desde ese momento hasta el día +100 después del trasplante (un total de 13 muestras). Además, se recolectaron tres muestras de sangre en tubos de heparina, en los días +21, +56 y +100 post-trasplante, para evaluar el desarrollo de la respuesta inmune de células T específicas para HAdV. 6. Recogida de datos clínicos Durante el seguimiento de los pacientes incluidos se procedió a recoger de forma ordenada en el cuaderno de recogida de datos los datos demográficos, de enfermedades crónicas subyacentes, la enfermedad hematológica para la que se indicó el alo-TPH, el acondicionamiento previo al mismo, el tratamiento inmunosupresor, y los datos clínicos 57 evolutivos, incluyendo la mortalidad, la presencia de infección y/o enfermedad por HAdV, otras infecciones, y la mortalidad. Las variables incluidas en el cuaderno de recogida de datos se pormenorizan en el Anexo I. 7. Determinación de la carga viral de HAdV La carga viral de HAdV se determinó en plasma utilizando el kit ADENOVIRUS R-GENE® (bioMérieux, Madrid, España), con un límite de detección de 10 copias de ADN de HAdV por reacción de PCR. Las muestras de plasma se procesaron para la extracción del genoma viral utilizando el kit MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation (Roche, Madrid, España). El ADN extraído se usó como molde para la PCR cuantitativa en tiempo real, y se usó un control negativo sin ADN como control para la contaminación. La viremia por HAdV se analizó a cualquier nivel de DNAemia por HAdV en sangre periférica y, además, en el subgrupo de pacientes con DNAemia por HAdV superior o igual a 5x102 copias de ADN/mL [159]. Los episodios de viremia se clasificaron como transitorios (blips), cuando se detectó HAdV en una muestra aislada, o persistente cuando se detectó HAdV en al menos dos muestras consecutivas. 8. Clasificación por secuenciación de las muestras positivas para HAdV Las muestras positivas para HAdV por el kit ADENOVIRUS R-GENE® (bioMérieux) se amplificaron y secuenciaron siguiendo los cebadores y el protocolo previamente publicados por Okada M. et al. [160]. Para la determinación del tipo específico de HAdV, las secuencias de nucleótidos obtenidas de los productos de la PCR se compararon con las secuencias reportadas utilizando la herramienta para búsquedas de alineación (Basic Local Alignment Search Tool, BLAST, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). 64 65 1. Población de estudio Ciento diecisiete pacientes recibieron un alo-TPH desde febrero de 2016 hasta mayo de 2018. Noventa y cinco de ellos cumplieron con los requisitos del estudio y fueron incluidos después de firmar el consentimiento informado, mientras que no se incluyeron un total de veintidós pacientes que se trasplantaron en el periodo de estudio, por las siguientes causas: nueve pacientes no aceptaron firmar el consentimiento informado, cuatro pacientes participaban en otros estudios o en ensayos clínicos y los otros nueve fueron excluidos por motivos diversos (Figura 7). Figura 7. Diagrama de la inclusión/exclusión de los pacientes receptores de alo-TPH. De los 95 pacientes incluidos, el 41,1% son mujeres, y presentan una edad media de 47,8 años. La enfermedad hematológica más frecuente fue la leucemia mieloide aguda (n = 28, 29,5%), seguida del síndrome mielodisplásico (n = 20, 21,1%). Cuarenta y nueve (51,6%) pacientes recibieron TPH de donantes no emparentados. Setenta y dos pacientes (75,8%) recibieron un acondicionamiento de intensidad reducida. El tratamiento profiláctico para la EICH más utilizado fue la combinación de tacrólimus y sirolimus. Treinta de los 95 pacientes se consideraron de alto riesgo de enfermedad diseminada por HAdV: 22 desarrollaron EICH grado III-IV y 8 tuvieron donantes haploidénticos. Además, 29 (30,5%) presentaron infección por HCMV de los Receptores TPH Febrero 2016-Mayo 2018 N=117 Pacientes incluidos N=95 Pacientes excluidos N=22 No firma Consentimiento N=9 Participación en otro Estudio N=4 Motivos diversos N=9 66 cuales 4 (13,7%) desarrollaron enfermedad. Las características demográficas y clínicas de los pacientes se detallan en la Tabla 3. Tabla 3. Características clínicas y demográficas de los 95 pacientes receptores de TPH. Variable N (%) Mujer 39 (41,1) Edad, media años (SD) 47,8 (13,4) Enfermedad hematológica  Leucemia mieloide aguda 28 (29,5)  Síndrome mielodisplásico 20 (21,1)  Linfoma no-Hodgkin 12 (12,6)  Linfoma de Hodgkin 10 (10,5)  Leucemia linfoblástica aguda 11 (11,6)  Otras 14 (14,7) Donante  Donante no emparentado 49 (51,6)  Hermano HLA-idéntico 38 (40,0)  Donante haploidentico 8 (8,4) Acondicionamiento  Intensidad reducida 72 (75,8)  Mieloablativo 23 (24,2) ATG* administrada 10 (10,5) CD34+ (x106/kg), media (SD) 5,9 (1,6) Serología positiva de citomegalovirus  Donante / Receptor 54 (56,8) / 81 (85,3) Donante mujer a receptor hombre 17 (17,9) 67 Profilaxis EICH†  Tacrolimus + sirolimus 57 (60,0)  Tacrolimus + metotrexate 26 (27,4)  Otros§ 12 (12,6) Neutropenia febril 52 (54,7) EICH aguda 43 (45,3)  EICH III-IV 23 (24,2)  Corticosteroides sistémicos 25 (54,7) Infección por citomegalovirus 29 (30,5)  Enfermedad por citomegalovirus 4 (13,7) Mortalidad 10 (9,5) *ATG: globulina antitimocítica; †EICH, enfermedad injerto contra huesped;§Ciclosporina (CsA), metotrexato, ciclofosfamida más CsA y mofetil micofenolato (MMF), o tacrolimus más globulina antitimocítica (ATG) y metotrexate. 2. Infección por HAdV Cincuenta y ocho (61,1%) pacientes presentaron episodios de viremia por HAdV, todos los cuales pertenecían a la especie C de HAdV. La mayoría de los episodios fueron blips (59 de 80, 73,8%), con una mediana de un episodio por paciente. La viremia por HAdV se identificó en la mayoría de los casos de forma temprana en relación con el trasplante (semanas -1 a +7) y los blips ocurrieron antes que los episodios persistentes (mediana 3 [1-5] vs. 7 [0-10] semanas, respectivamente). Las cargas virales mostraron una gran variabilidad, con niveles más bajos en los blips que en los episodios persistentes (1,5x102 [8,1x101-5,4x102] en comparación con 9,8x102 [2,1x102-8,3x104] copias/ml], y una mediana de duración de 14 días en los episodios persistentes (Tabla 4). 68 Tabla 4. Caracterísiticas de los episodios de viremia por HAdV. N (%) Pacientes 58 (61,1) Episodios por paciente (mediana, IQR) 1 (1-2) Episodios Blips 59 (73,8) - - Semana de seguimiento (mediana, IQR) 3 (1-5) - - Carga viral máxima (copias/ml; mediana, IQR) 1,5x102 (8,1x101-5,4x102) - Episodios Persistentes 21 (26,3) - - Semana de seguimiento (median, IQR) 7 (0-10) - - Duración de la viremia (días; mediana, IQR) 14 (7-14) - - Carga viral máxima (copias/ml; mediana, IQR) 9,8x102 (2,1x102-8,3x104) IQR: rango intercuartílico. Treinta y seis (37,9%) pacientes presentaron viremia por HAdV inferior a 5x102 copias/ml y 22 (23,2%) igual o superior a 5x102 copias de DNA/ml. Las diferencias de los episodios de viremia entre ambos grupos se detallan en la Tabla 5. Seis (27.3%) de los 22 pacientes con viremia igual o superior a 5x102 copias/ml presentaron blips previamente. 69 Tabla 5. Características de los episodios de viremia por HAdV según el nivel de DNAemia. Baja DNAemia* N (%) Alta DNAemia** N (%) Pacientes 36 (37,9) 22 (23,2) Episodios por paciente (mediana, IQR) 1 (1-2) 1 (1-1) Episodios Blips 59 (73,8) 18 (75,0) - Semana de seguimiento (mediana, IQR) 3 (1-5) 5 (2-8) - Carga viral máxima (copias/ml; mediana, IQR) 1,3x102 (7,9x101-2,1x102) 3,2x103 (1,1x103-2,1x104) Episodios Persistentes 15 (26,8) 6 (25,0) - Semana de seguimiento (median, IQR) 6 (-1-11) 7 (1-8) - Duración de la viremia (días; mediana, IQR) 14 (7-14) 14 (14-14) - Carga viral máxima (copias/ml; mediana, IQR) 1,9x102 (8,1x101-2,6x102) 2,0x104 (1,8x103-7,3x105) *DNAemia < 5x102 copias/ml; ** DNAemia ≥ 5x102 copias/ml;IQR: rango intercuartílico. 3. Factores de riesgo asociados a la infección por HAdV y resultados clínicos No encontramos asociación entre el desarrollo de la viremia por HAdV y el género, el régimen de acondicionamiento, el uso de globulina anti-timocítica (ATG) o las características del donante. La presencia de EICH aguda de grado III-IV o EICH refractaria a los esteroides no se relacionó con el desarrollo de ningún nivel de viremia por HAdV. Además, no hubo una mayor frecuencia de la viremia por HAdV en pacientes considerados con alto riesgo de infección por HAdV (Tabla 6). 70 En este estudio, ningún paciente desarrolló enfermedad sintomática o diseminada por HAdV, ni recibió tratamiento antiviral específico para el HAdV durante el seguimiento. Además, no hubo una asociación cronológica entre la detección de viremia por HAdV y la presencia de otros episodios de infección bacteriana, fúngica, viral o de infección de etiología desconocida. Respecto a la mortalidad, diez pacientes fallecieron durante el seguimiento por diferentes causas: i) causas directamente relacionadas con el trasplante (n = 5; dos EICH, dos microangiopatía trombótica y una enfermedad veno-oclusiva), ii) otras infecciones (n = 3, dos pacientes con shock séptico por neumonía e infección por Clostridioides difficile y un paciente con neumonía invasiva por Aspegillus fumigatus), iii) un paciente por recaída de la enfermedad hematológica y, iv) otro por fibrosis pulmonar multifactorial. Por último, no hubo diferencia en la mortalidad entre los pacientes con (n = 5, 8.6%) o sin (n = 5, 13.5%) viremia por HAdV (Tabla 6). Tabla 6. Características clínicas, del trasplante y datos demográficos de pacientes con y sin viremia post-trasplante. Variable Pacientes con viremia, N = 58 Pacientes sin viremia, N = 37 p Mujer 24 (41,4%) 15 (40,5%) 0,94 Acondicionamiento (intensidad reducida) 41 (70,7%) 30 (81,1%) 0,15 Globulina antitimocítica 5 (8,6%) 5 (13,5%) 0,44 Donante mujer / Receptor hombre 10 (17,2%) 8 (21,6%) 0,59 Donante no emparentado 28 (48,3%) 21 (56,8%) 0,42 Alto riesgo de TPH (Haploidéntico & EICH† IIIIV) 21 (36,2%) 9 (24,3%) 0,22 EICH 29 (50,0%) 13 (35,1%) 0,16 EICH (III-IV) 16 (27,6%) 6 (16,2%) 0,20 Profilaxis EICH (Tacrolimus y Sirolimus) 33 (56,9%) 24 (64,9%) 0,44 Infección por Citomegalovirus 17 (31,5%) 12 (32%) 0,46 Mortalidad 5 (8,6%) 5 (13,5%) 0,45 71 Con respecto al nivel de viremia por HAdV, superior o inferior a 5x102 copias/ml, no hubo tampoco asociación con ninguno de los datos demográficos, las características del trasplante o las características clínicas anteriores (Tabla 7). Tabla 7. Características clínicas, del trasplante y datos demográficos de pacientes con viremia ≥5x102 y sin viremia post-trasplante. Variable Pacientes con viremia ≥5x102, N=22 Pacientes sin viremia, N=37 p Mujer 9 (40,9%) 15 (41,7%) 0.95 Acondicionamiento (intensidad reducida) 17 (81,0%) 23 (63,9%) 0.15 Globulina antitimocítica 3 (13,6%) 2 (5,6%) 0.29 Donante mujer / Receptor hombre 4 (18,2%) 6 (16,7%) 0.88 Donante no emparentado 10 (45,5%) 18 (50,0%) 0.74 Alto riesgo de TPH (Haploidéntico & EICH IIIIV) 9 (40,9%) 12 (33,3%) 0.56 EICH 12 (22,7%) 13 (35,1%) 0,61 EICH (III-IV) 7 (31,8%) 9 (15,0%) 0.57 Profilaxis EICH (Tacrolimus y Sirolimus) 14 (73,7%) 19 (52,8%) 0.51 Infección por Citomegalovirus 2 (9,1%) 0 (0,0%) 0.07 Mortalidad 3 (13,6%) 2 (9,6%) 0.29 4. Respuesta inmune de células T específicas de HAdV La respuesta inmune de células T específicas de HAdV se evaluó en 90 de los 95 pacientes (en cinco pacientes hubo pérdida de seguimiento en puntos de tiempo específicos). A lo largo del trasplante, se observó un aumento en el porcentaje de pacientes que expresan las distintas citoquinas. En la Tabla 8 se muestra como este 72 aumento es mayor en aquellos pacientes con viremia que en aquellos que no presentaban viremia por HAdV, destacando el aumento de la expresión de las citoquinas IL-2 y TNF-α por los linfocitos T CD4+ así como el de la expresión de IFN-γ por los linfocitos T CD8+. El número de pacientes con respuesta inmunitaria específica de células T específicas de HAdV aumentó durante el seguimiento: 30 (33,3%), 65 (72,2%) y 78 (86,7%) de los 90 pacientes en los días +21, +56 y +100 posteriores al trasplante, respectivamente, presentaron respuesta de células T específicas frente a HAdV. Doce (13,3%) de los 90 pacientes no desarrollaron una respuesta inmune de células T específicas de HAdV durante el seguimiento; tres (25,0%) de ellos tuvieron un episodio de viremia (blip) por HAdV. El número de pacientes con células T CD4+ que expresaron IL-2 en el día +56 (p <0,05) y células T CD8 + que expresaron IL-2 (p <0,05) y TNFα (p <0,05) en el día +21, fue mayor en aquellos con viremia por HAdV (Tabla 8). Tabla 8. Respuesta inmune de células T específicas para HAdV. Porcentajes de pacientes con/sin viremia por HAdV que expresan IL-2, TNF-α e IFN-γ en los días +21, +56 y +100 después del trasplante, en células T CD4+ y CD8+ específicas de HAdV (*p<0.05). CD4+ CD8+ IL-2 TNF-α INF-γ IL-2 TNF-α INF-γ +21 5,3/6,0 23,6/12,1 12,7/6,0 12,7/0,0* 20,0/3,0* 12,7/6,0 +56 26,8/5,0* 58,5/45,0 36,6/35,0 21,6/20,0 31,7/35,0 34,1/20,0 +100 41,5/20,8 75,6/62,5 36,6/41,6 24,4/25,0 26,8/50,5 43,9/41,7 Si observamos el porcentaje de expresión de citoquinas en la cohorte completa, en el día +21 los porcentajes medios de células T CD4 + y CD8 + que expresaron IL-2 fueron 0,007%±0,03 y 0,01%±0,04, respectivamente. Para TNF-α estos porcentajes fueron 0,03%±0,06 y 0,02%±0,04, y para INF-γ 0,02%±0,6 y 0,02%±0,05, respectivamente. En el día +56, la media de células T CD4+ y células T CD8+ que 73 expresan IL-2 fue 0,02%±0,05 y 0,03%±0,06, respectivamente, y para TNF-α fue 0,07%±0,07 y 0,05%±0,09 así como 0,06%±0,09 y 0,04%±0,06 para INF-γ, respectivamente. Por último, al final del seguimiento (día +100) la media de las células T CD4 + y CD8 + que expresan IL-2 fue 0,05%±0,07 y 0,03%±0,05, respectivamente, para TNF-α fueron 0,13% ± 0,11 y 0,05% ± 0,08 y para INF-γ 0,05%±0,07 y 0,06%±0,09, respectivamente (Tabla 9). El pico máximo medio de expresión de citoquinas fue del 0,13% registrado para las células T CD4+ que expresaron TNF-α en el día +100 (Tabla 8). Doce (11,1%) de los 90 pacientes evaluados no desarrollaron una respuesta inmune de células T específica para HAdV durante el seguimiento, 3 (25,0%) de los cuales presentaron al menos un episodio de viremia blip de HAdV. Table 9. Porcentajes de células T CD4 + y CD8 + específicas para HAdV que producen IL-2, TNF-α e IFN-γ en los días +21, +56 y +100 después del trasplante. Los resultados se muestran como media±SD. CD4+ CD8+ IL-2 TNF-α INF-γ IL-2 TNF-α INF-γ +21 0,007±0,03 0,03±0,06 0,02±0,6 0,01±0,04 0,02±0,04 0,02±0,05 +56 0,02±0,05 0,07±0,07 0,06±0,09 0,03±0,06 0,05±0,09 0,04±0,06 +100 0,05±0,07 0,13±0,11 0,05±0,07 0,03±0,05 0,05±0,08 0,06±0,09 Cuando evaluamos el porcentaje de linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ y la relación de la linfocitos T CD4+/CD8+ para cada día en los que se cuantificó la respuesta inmune durante el trasplante en aquellos pacientes sin viremia, con viremia o con viremia por encima o por debajo de 5x102 copias/ml, podemos ver que no hubo diferencias significativas en cuanto a los porcentajes de células T CD4+ y CD8+ ni en cuanto a la relación de células T CD4+/CD8+ en pacientes con y sin viremia por HAdV o en aquellos con más o menos de 5x102 copias/ml de ADN (Figura 8). 80 Figura 12. Respuesta de células T CD4+ (A) y células T CD8+ (B) durante el seguimiento para pacientes con episodios blips de viremia por HAdV posteriores al trasplante (de días +7 a +100). Respuesta de células T CD4+ (C) y células T CD8+ (D) durante el seguimiento para pacientes con episiodios de viremia persistente por HAdV posteriores al trasplante. -7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 0 200 400 600 800 1000 2000 4000 6000 8000 10000 5.0×106 1.0×107 1.5×107 2.0×107 2.5×107 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Días post-trasplante Copias/ml 4 5 6 8 11 12 16 22 23 24 27 28 29 30 31 33 34 37 38 42 43 48 57 59 60 71 77 79 CD4-IL2 % CD4-IL2 -7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 0 200 400 600 800 1000 2000 4000 6000 8000 10000 5.0×106 1.0×107 1.5×107 2.0×107 2.5×107 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Días post-trasplante Copias/ml 4 5 6 8 11 12 16 22 23 24 27 28 29 30 31 33 34 37 38 42 43 48 57 59 60 71 77 79 CD8-IL2 % CD8-IL2 -7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 0 200 400 600 800 1000 2000 4000 6000 8000 10000 5.0×106 1.0×107 1.5×107 2.0×107 2.5×107 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Days after transplantation Copias/ml 4 5 6 8 11 12 16 22 23 24 27 28 29 30 31 33 34 37 38 42 43 48 57 59 60 71 77 79 CD4-TNFα % CD4-TNFα -7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 0 200 400 600 800 1000 2000 4000 6000 8000 10000 5.0×106 1.0×107 1.5×107 2.0×107 2.5×107 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Días post-trasplante Copias/ml 4 5 6 8 11 12 16 22 23 24 27 28 29 30 31 33 34 37 38 42 43 48 57 59 60 71 77 79 CD8-TNFα % CD8-TNFα -7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 0 200 400 600 800 1000 2000 4000 6000 8000 10000 5.0×106 1.0×107 1.5×107 2.0×107 2.5×107 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Días post-trasplante Copias/ml 4 5 6 8 11 12 16 22 23 24 27 28 29 30 31 33 34 37 38 42 43 48 57 59 60 71 77 79 CD4-IFNγ % CD4-IFNγ -7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 0 200 400 600 800 1000 2000 4000 6000 8000 10000 5.0×106 1.0×107 1.5×107 2.0×107 2.5×107 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Días post-trasplante Copias/ml 4 5 6 8 11 12 16 22 23 24 27 28 29 30 31 33 34 37 38 42 43 48 57 59 60 71 77 79 CD8-IFNγ % CD8-IFNγ A B -7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 0 200 400 600 800 1000 2000 4000 6000 8000 10000 5.0×106 1.0×107 1.5×107 2.0×107 2.5×107 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Días post-trasplante Copias/ml 32 35 36 40 41 44 45 49 58 63 65 75 78 86 91 CD4-IL2 % CD4-IL2 -7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 0 200 400 600 800 1000 2000 4000 6000 8000 10000 5.0×106 1.0×107 1.5×107 2.0×107 2.5×107 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Días post-trasplante Copias/ml 32 35 36 40 41 44 45 49 58 63 65 75 78 86 91 CD8-IL2 % CD8-IL2 -7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 0 200 400 600 800 1000 2000 4000 6000 8000 10000 5.0×106 1.0×107 1.5×107 2.0×107 2.5×107 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Días post-trasplante Copias/ml 32 35 36 40 41 44 45 49 58 63 65 75 78 86 91 CD4-TNFα % CD4-TNFα -7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 0 200 400 600 800 1000 2000 4000 6000 8000 10000 5.0×106 1.0×107 1.5×107 2.0×107 2.5×107 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Días post -trasplante Copias/ml 32 35 36 40 41 44 45 49 58 63 65 75 78 86 91 CD8-TNFα % CD8-TNFα -7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 0 200 400 600 800 1000 2000 4000 6000 8000 10000 5.0×106 1.0×107 1.5×107 2.0×107 2.5×107 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Días post-trasplante Copias/ml 32 35 36 40 41 44 45 49 58 63 65 75 78 86 91 CD4-IFNγ % CD4-IFNγ -7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 0 200 400 600 800 1000 2000 4000 6000 8000 10000 5.0×106 1.0×107 1.5×107 2.0×107 2.5×107 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Días post-trasplante Copias/ml 32 35 36 40 41 44 45 49 58 63 65 75 78 86 91 CD8-IFNγ % CD8-IFNγ C D 81 En un siguiente paso comparamos la respuesta inmune de células T específicas de HAdV en pacientes con viremia superior o inferior a 5x102 copias/ml en sangre. Al igual que en el caso del porcentaje de pacientes, observamos que existe una tendencia donde el porcentaje de citoquinas que se expresan aumentan a lo largo del trasplante (Tabla 10). Tabla 10. Respuesta inmunitaria de células T específica para HAdV en pacientes con viremia ≥5x102 copias/ml (A) o <5x102copias/ml (B). Células T CD4+ y CD8+ específicas para HAdV que expresan (%) IL-2, TNF-α e IFN-γ en los días +21, +56 y +100 después del trasplante. Los resultados se muestran como media ± SD (pacientes con viremia ≥5x102 copias/ml vs. <5x102 copias/ml, *p<0,05). A CD4+ CD8+ IL-2 TNF-α INF-γ IL-2 TNF-α INF-γ +21 0,005±0,02 0,03±0,05 0,005±0,02 0,02±0,07 0,02±0,04 0,03±0,07 +56 0,03±0,6 0,07±0,07 0,04±0,09 0,03±0,06 0,04±0,08 0,04±0,06 +100 0,1±0,09* 0,2±0,1* 0,06±0,08 0,03±0,05 0,05±0,09 0,1±0,1* B CD4+ CD8+ IL-2 TNF-α INF-γ IL-2 TNF-α INF-γ +21 0,008±0,03 0,03±0,06 0,03±0,09 0,02±0,05 0,02±0,05 0,01±0,04 +56 0,03±0,06 0,09±0,08 0,08±0,1 0,04±0,08 0,08±0,1 0,05±0,07 +100 0,03±0,06* 0,13±0,1* 0,05±0,08 0,02±0,04 0,04±0,08 0,05±0,08* 82 Como se muestra en la Tabla 10 existe una mayor expresión de citoquinas en aquellos pacientes con una carga viral superior o igual a 5x102 copias/ml. La máxima expresión de citoquinas se vio en las células T CD4+ que expresan TNF-α en el día +100 (0,2% vs 0,13%, p <0,05). Además, las expresiones más altas de IL-2 por las células T CD4+ (0,1% vs 0,03%, p <0,05) e INF-γ por las células T CD8+ (0,1% vs 0,05%, p<0,05) fueron observadas en el día +100 posterior al trasplante, en los pacientes con viremia por HAdV superior o igual a 5x102 copias de ADN/ml (Tabla 10 y Figura 13). En cuanto a los pacientes con una viremia inferior a 500 copias/ml, la mayor expresión se vio en las células T CD4+ que expresaron TNF-α, mientras que la expresión de IL-2 por las células T CD4+ y la de INF-γ por las células T CD8+ se mantuvieron estables y con valores bajos, cercanos al 0.05% (Tabla 10 y Figura 13). Finalmente, comparamos la respuesta inmune de células T específicas de HAdV en pacientes con viremia persistente de HAdV pre-trasplante (días -7 y 0) (n=4) frente a aquellos con blips (n=12) antes del trasplante (Figura 14). Observamos un aumento más temprano de la expresión de citoquinas en los pacientes con episodios persistentes en comparación de aquellos que presentaron blips pre-trasplantes, además, este aumento y rapidez en la expresión de citoquinas pacientes con episodios persistentes pretrasplantes coincidía con la disminución en el número de episodios de infección por HAdV durante el seguimiento de los mismos. Estos pacientes con viremia persistente tenían expresión de CD4+ de INF-γ (p=0,05) y expresión de CD8+ de IL-2, TNF-α e INF-γ (p <0,05) más alta y/o más temprana (a +21 y +56 días) en comparación con los que tienen señales intermitentes, y esta respuesta inmunitaria fue paralela a la desaparición casi completa de los episodios de viremia (Figura 14). 83 Figura 13. Respuesta inmunitaria de células T específicas para HAdV en pacientes con viremia ≥5x102 copias/ml (A) o <5x102 copias/ml (B). Células T CD4+ específicas para HAdV (%) que expresan IL-2 y TNF-α y células T CD8+ (%) que expresan IFN-γ, en los días +21, +56 y +100 después del trasplante. -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415 0 1×103 2×103 1×104 2×104 3×104 1.0×106 1.5×106 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Semanas post-trasplante Media de carga viral (Copias/ml) Viremia CD4+ IL2 Porcentaje de expresión de citoquina (%) -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415 0 1×103 2×103 1×104 2×104 3×104 1.0×106 1.5×106 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Semanas post-trasplante Media de carga viral (Copias/ml) Viremia CD4+ TNFa Porcentaje de expresión de citoquina (%) -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415 0 1×103 2×103 1×104 2×104 3×104 1.0×106 1.5×106 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Semanas post-trasplante Media de carga viral (Copias/ml) Viremia CD8+ IFNg Porcentaje de expresión de citoquina (%) -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415 0 1×101 2×101 3×101 4×101 5×101 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Semanas post-trasplante Media de carga viral (Copias/ml) Viremia CD4+ IL2 Porcentaje de expresión de citoquina (%) -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415 0 1×101 2×101 3×101 4×101 5×101 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Semanas post-trasplante Media de carga viral (Copias/ml) Viremia CD4+ TNFa Porcentaje de expresión de citoquina (%) -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415 0 1×101 2×101 3×101 4×101 5×101 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Semanas post-trasplante Media de carga viral (Copias/ml) Viremia CD8+ IFNg Porcentaje de expresión de citoquina (%) A B 84 Figura 14. Respuesta inmunitaria de células T específicas de HAdV en pacientes con blips o viremia persistente en los días -7 y/o 0 antes del trasplante. Células T CD4+ específicas para HAdV que expresan (%) IL-2, TNF-α e IFN-γ, en los días +21, +56 y +100 después del trasplante en pacientes con blips (A) y viremia persistente (B). Células T CD8+ específicas para HAdV que expresan (%) IL-2, TNF-α e IFN-γ, en los días +21, +56 y +100 después del trasplante en pacientes con blips (C) y viremia persistente (D). -7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 0 2×102 4×102 6×102 8×102 1×103 2×103 4×103 6×103 8×103 1×104 5.0×106 1.0×107 1.5×107 2.0×107 2.5×107 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Días post-trasplante Copias/ml CD4-IL2 Porcentaje de expresión de citoquina (%) CD4-TNFa CD4-IFNg -14 -7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 0 2×102 4×102 6×102 8×102 1×103 2×103 4×103 6×103 8×103 1×104 5.0×106 1.0×107 1.5×107 2.0×107 2.5×107 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Días post-trasplante Copias/ml CD4-IL2 Porcentaje de expresión de citoquina (%) CD4-TNFa CD4-IFNg -14 -7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 0 2×102 4×102 6×102 8×102 1×103 2×103 4×103 6×103 8×103 1×104 5.0×106 1.0×107 1.5×107 2.0×107 2.5×107 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Días post-trasplante Copias/ml CD8-IL2 Porcentaje de expresión de citoquina (%) CD8-TNFa CD8-IFNg -14 -7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 0 2×102 4×102 6×102 8×102 1×103 2×103 4×103 6×103 8×103 1×104 5.0×106 1.0×107 1.5×107 2.0×107 2.5×107 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Días post-trasplante Copias/ml Porcentaje de expresión de citoquina (%) CD8-IL2 CD8-TNFa CD8-IFNg AA B C D 85 5. Actividad antiviral de GCV frente a HAdV en condiciones de co-infección con CMV Nuestros resultados in vitro mostraron que, aunque CDV y GCV mostraron una actividad anti-HAdV dosis-dependiente utilizando qPCR, la actividad antiviral de GCV contra HAdV se observó en concentraciones mucho más altas (Tabla 11, Figura 15), como se reportó anteriormente por Ying et al. [165], mostrando una IC50 para GCV de 25 µg/ml [165]. A diferencia de HAdV, y tal y como se esperaba, ambos fármacos mostraron actividad anti-HCMV dosis-dependiente a bajas concentraciones (Tabla 11 y Figura 15). Figura 15. Actividad inhibitoria de CDV y GCV. Actividad dosis-dependiente contra HAdV (A) y HCMV (B) por qPCR. El control DMSO es un control positivo con células infectadas con la misma MOI pero en ausencia de fármacos. Los resultados muestran la media ± SD de muestras por triplicado de tres experimentos independientes. DMSO 40 20 10 5 2.5 0 50 100 150 Concentración de CDV (mg/ml) % del número de copias de ADN HAdV vs. número de copias del gen de GAPDH DMSO 80 40 20 10 5 0 50 100 150 Concentración de GCV (mg/ml) % del número de copias de ADN HAdV vs. número de copias del gen de GAPDH AA DMSO 10 5 2.5 1.2 0.6 0 50 100 150 Concentración de CDV (mg/ml) % del número de copias de ADN HCMV vs. número de copias del gen de GAPDH DMSO 10 5 2.5 1.2 0.6 0 50 100 150 Concentración de GCV (mg/ml) % del número de copias de ADN HCMV vs. número de copias del gen de GAPDH B 86 Mientras que CDV fue activo frente a ambos virus en concentraciones micromolares bajas (valores de IC50 entre 3,7 y 8,8 µg/ml), GCV solo fue activo en concentraciones bajas contra HCMV (IC50 frente HCMV de 2,1 µg/ml vs. 21,4 µg/ml frente a HAdV) (Tabla 11). La concentración citotóxica (CC50) para GCV varió entre 100 y 175 µg/ml, mientras que para el CDV mostró valores que oscilaron entre 41,5 y 50,6 µg/ml, en el rango de los reportados previamente [124]. En todos los casos, los índices selectivos (SI) calculados fueron bajos (Tabla 11) teniendo en cuenta que, en general, sólo las moléculas que muestran un SI superior a 100 in vitro son consideradas para su análisis posterior in vivo en el área de desarrollo de nuevos fármacos antimicrobianos. Tabla 11. Valores de IC50, CC50, e Índice Selectivo (IS) para CDV y GCV. HAdV HCMV IC50 µg/ml CC50 µg/ml SI IC50 µg/ml CC50 µg/ml SI CDV 8,8±2,3 50,6±9,8 5,8 3,7±1,5 41,5±6,5 11,2 GCV 21,4±1,4* 175,0±15,5 8,2 2,1±0,5 100,0±20,0 47,6 Los resultados representan la media±SD de muestras por triplicado de tres experimentos independiente. (*p<0,05). A continuación, se evaluó la eficiencia de replicación del ADN de HAdV y HCMV en presencia de CDV y GCV para evaluar el impacto de su co-infección en la síntesis de novo de cada ADN viral. Para los ensayos de co-infección, se seleccionaron concentraciones de 7 µg/ml y 30 µg/ml para CDV y GCV, respectivamente. Ambos, HAdV y HCMV fueron susceptibles a CDV en las concentraciones ensayadas con más de 2 log de reducción en su número de copias de ADN con respecto a un control positivo con DMSO (Figura 16A y Figura 16B). CDV mostró reducciones de 2 logs en el número de copias de ADN frente a HCMV, tanto en monocultivo como en co-infección con HAdV. Frente a HAdV CDV 87 mostró una inhibición que alcanzó reducciones de 4 log en el monocultivo y 3 log en la co-infección con HCMV (Figura 16). Del mismo modo, GCV mostró reducciones de 2 log en el número de copias de ADN de HCMV, tanto en monocultivo como en coinfección con HAdV (Figura 16A). Sin embargo, la actividad antiviral de GCV contra HAdV fue 1-log más baja que para CDV y lo que es más significativo, mejoró en 1-log su actividad contra HAdV en co-infección en comparación con su actividad en monocultivo, donde alcanzó la misma actividad de CDV con reducciones de 3 log en el número de copias de ADN de HAdV (Figura 16B). Figura 16. La actividad antiviral de CDV y GCV contra HCMV (A) y HAdV (B), por separado y en condiciones de co-infección, ambas determinadas por qPCR. Los C- C+ CDV GCV C- C+ CDV GCV 0 1×105 2×105 3×105 4×105 5×105 1×106 2×106 3×106 4×106 5×106 Nº de copias/ml de ADN HCMV HCMV Co-Infección C-C+ CDV GCV C-C+ CDV GCV 0.0 5.0×104 1.0×105 1.5×105 1×108 2×108 3×108 Nº de copias/ml de ADN HAdV HAdV Co-Infección A B 88 resultados muestran la media ± SD de muestras por triplicado de tres experimentos independientes La actividad antiviral de CDV y GCV se evaluó además utilizando un ensayo que determina la inhibición en la producción de nuevas partículas virales en presencia de dichos fármacos. El tratamiento con CDV se asoció con reducciones en el rendimiento de HAdV y HCMV de 82,5±21,4 y 110,7±12, respectivamente. Cuando se usó GCV, las reducciones en el rendimiento del virus fueron mayores para el HCMV y la co-infección que para el HAdV (145,2±35,5 vs. 116,4 vs. 23,0±10,0 respectivamente, p <0,05) (Tabla 12). Tabla 12. Actividad antiviral de CDV y GCV frente a HAdV, HCMV en condiciones de mono-infección y co-infección de ambos, determinada por la reducción de la producción viral y expresada como las veces que se reduce en comparación a un control tratado con DMSO. Los resultados fueron representados como la media ± SD de muestras por triplicado de tres experimentos independientes (*p<0,05). HAdV HCMV CO-I CDV 82,5±21,4 110,7±12,0 98,3±30,5 GCV 23,0±10,0* 145,2±35,5 116,4±27,3 89 VI. DISCUSIÓN 96 97 VII. CONCLUSIONES 98 99 1. La incidencia de la infección por HAdV en pacientes adultos receptores de alo-TPH es elevada. En nuestro estudio cincuenta y ocho pacientes (61%) presentaron carga viral detectable en sangre, de los cuales 22 (23.2%) mostraron niveles superiores a 5x102 copias/ml. La mayor parte de los episodios fueron blips, siendo 1 de cada 4 episodios persistentes. 2. La respuesta inmune de las células T específicas para HAdV aumenta constantemente después del alo-TPH, detectándose en tres de cada 10 pacientes durante los primeros 21 días, y hasta en nueve de cada 10 pacientes a los 100 días post-trasplante. 3. La expresión de IL-2 y TNF-α por las células T CD8 + se presentan como los marcadores más tempranos en pacientes con viremia por HAdV. Además, las respuestas inmunitarias específicas de las células T CD4+ y CD8+ aumentaron en aquellos casos en los que existía una mayor carga de HAdV en sangre. 4. Se ha comprobado la eliminación de la viremia por HAdV, a partir del día 14 posttrasplante, en los pacientes con viremia persistente pre-trasplante que poseían expresiones más altas de INF-γ por CD4+ y de IL-2, TNF-α e INF-γ por células T CD8+, aunque el pequeño número de casos solo permite sugerir esta asociación. 5. No se identificaron factores demográficos o clínicos asociados al desarrollo de viremia por HAdV durante los 100 días posteriores al alo-TPH. Las tasas de mortalidad fueron similares en pacientes con y sin viremia por HAdV. 6. La actividad antiviral in vitro de CDV frente a HAdV y HCMV es independiente de la presencia de uno o ambos virus. Sin embargo, la actividad antiviral in vitro de GCV contra HAdV mejora cuando existe una condición de co-infección con HCMV. 100 101 ANEXOS ANEXO I. CUADERNO DE RECOGIDA DE DATOS CLÍNICOS CUADERNO DE RECOGIDA DE DATOS PI15/00489: Estudio de la incidencia de la infección por adenovirus, su cinética de replicación, y la respuesta inmune celular: impacto en la progresión clínica de pacientes adultos receptores de TPH. CÓDIGO DE IDENTIFICACIÓN DEL CASO: (2 primeras letras de 1º apellido, 2º apellido y nombre, seguido de fecha de ingreso). Nº HISTORIA CLÍNICA: FECHA DE INCLUSIÓN (FIRMA CI): DATOS BASALES: - Fecha de nacimiento: (dd/mm/aaaa) Sexo (V/M): - Antecedente de TPH: S/N Tipo: Auto/Alo Fecha: (dd/mm/aaaa) FACTORES DE RIESGO DE LA INFECCIÓN POR HAd: - Hemopatía que motiva el Alo-TPH: - Estadío de la hemopatía: - Fecha Alo-TPH: (dd/mm/aaaa) - Tipo de Alo-TPH: o Tipo de fuente: Sangre periférica/ Médula Ósea/ Cordón o Tipo de donante: Donante no emparentado/ Hermano HLA idéntico/ Haploidéntico o Tipo de acondicionamiento: Intensidad reducida/ Mieloablativo o ATG: S/N - CD34+ (x106/Kg): - Donante: Sexo: F/M; Edad: EICH - Tipo profilaxis EICH (al alta): □ Ciclosporina □ Metotrexate □ Tacrolimus □ Ciclofosfamida □ Rapamicina □ Otros: describir - EICH Aguda: S/N Grado de EICH global: I/ II /III/ IV Fecha EICH: (dd/mm/aaaa) - Afectación EICH: Digestiva/ Cutánea/ Hepática 102 - Líneas de Tratamiento EICH: 1ª/2ª/3ª CMV - Infección previa por CMV: S/N; Fecha diagnóstico: (dd/mm/aaaa) - Missmath CMV (D/R): - Infección sintomática CMV: S/N - Tratamiento infección CMV (días): DATOS CLÍNICOS RELATIVOS A LA INFECCIÓN POR HAd: - Diagnóstico de infección por HAd: S/N; Fecha: (dd/mm/aaaa): - Tratamiento inmunosupresor al diagnóstico de la infección por HAd: - Presentación clínica de la infección: o Asintomático: S/N (0) o Fiebre: S/N (1) o Infiltrado pulmonar: S/N (2) o Diarrea: S/N (3) o Disfunción hepática: S/N (4) o Sepsis: S/N (5) o Sospecha de infección diseminada o fallo multiorgánico: S/N (6) o Otros (especificar a continuación): (7) - Otra infección concomitante: S/N Etiología: Bacteriana/Vírica/Fúngica/ Sin etiología - Tipo de infección concomitante: Fecha de diagnóstico: (dd/mm/aaaa) - Neutropenia febril: S/N; Fecha inicio/fin: (dd/mm/aaaa) - EVOH: S/N - Otras complicaciones (describir): VARIABLES DEPENDIENTES DE LA INFECCIÓN POR HAd: - Monitorización periódica de la carga viral: Día -7 Dia 0 Día +7 Día +14 Día +21 Fecha determ: --/---/---- Fecha determ: --/---/---- Fecha determ: --/---/---- Fecha determ: --/---/---- Fecha determ: --/---/---- Nº copias: Nº copias: Nº copias: Nº copias: Nº copias: Resp.IE: S/N 103 Tipo resp. IE: CD4+/CD8+ Día +28 Día + 35 Día +42 Día +49 Día +56 Fecha determ: --/---/---- Fecha determ: --/---/---- Fecha determ: --/---/---- Fecha determ: --/---/---- Fecha determ: --/---/---- Nº copias: Nº copias: Nº copias: Nº copias: Nº copias: Resp.IE: S/N Tipo resp. IE: CD4+/CD8+ Día + 70 Día +84 Día +100 Fecha determ: --/---/---- Fecha determ: --/---/---- Fecha determ: --/---/---- Nº copias: Nº copias: Nº copias: Resp.IE: S/N Tipo resp. IE: CD4+/CD8+ - Viremia HAd >500 copias/ml: S/N - Viremia HAd persistente: S/N - Otras muestras: S/N - Tipo de muestra: LBA/Orina/ Biopsia colon/Biopsia hepática/ LCR - Fecha de la muestra: (dd/mm/aaaa) - Diagnóstico de HAd: +/- EVOLUCIÓN: - Fracaso del implante: S/N - Recidiva hemopatía: S/N; Fecha recidiva: (dd/mm/aaaa) - Evolución: 1. Curación 2. Éxitus atribuible 3. Exitus no atribuible - Causa del éxitus: - Supervivencia a los 100 días post-Alo-TPH: S/N - Fecha éxitus: (dd/mm/aaaa) 104 105 ANEXO II. CONSENTIMIENTO INFORMADO Estudio de la incidencia de la infección por adenovirus, su cinética de replicación, y la respuesta inmune celular: impacto en la progresión clínica de pacientes adultos receptores de TPH (PI 15/00489). CONSENTIMIENTO INFORMADO - INFORMACIÓN AL PACIENTE Antes de proceder a la firma de este consentimiento informado, lea atentamente la información que a continuación se le facilita y realice las preguntas que considere oportunas. Naturaleza: El objetivo del estudio será determinar qué número de pacientes adultos que reciben un trasplante de progenitores hematopoyéticos pueden estar infectados por adenovirus, así como conocer la respuesta inmune del organismo ante dicha infección, con el objeto de conocer la trascendencia que este hecho en su evolución clínica. El estudio consistirá en el seguimiento protocolizado de los datos clínicos antes y tras la realización del trasplante, así como la extracción de sangre venosa, coincidiendo todo ello con las visitas clínicas y las extracciones de sangre que forman parte del seguimiento habitual de los pacientes trasplantados. También se estudiará la presencia de adenovirus en otras muestras obtenidas de endoscopia, broncoscopia, colonoscopia u otras muestras que estén indicadas clínicamente, en aquellos pacientes con procesos clínicos intercurrentes que puedan estar causados por adenovirus. De forma nueva para este virus, observaremos la respuesta inmunológica de los pacientes trasplantados para intentar dilucidar causas, factores de riesgo o de protección que agraven o atenúen los efectos de la infección. 112 113 REFERENCIAS 1. Lion, T., Adenovirus infections in immunocompetent and immunocompromised patients. Clin Microbiol Rev, 2014. 27(3): p. 441-62. 2. 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