Generación de ratones transgénicos que reproducen la falta de procesamiento de neurexinas por presenilinas como modelo de la enfermedad de alzheimer.
Abstract
La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa asociada con el envejecimiento que se caracteriza por el deterioro progresivo de la memoria en los pacientes. El factor causal mayoritario responsable de casos de AD familiar (FAD) son mutaciones de pérdida parcial de función en los genes de Presenilina 1 (PS1) y Presenilina 2 (PS2). Las mutaciones en genes de PS1/2 asociadas a FAD tienen una herencia autosómica dominante y las personas portadoras presentan un inicio precoz de la enfermedad. Las PS forman la subunidad catalítica del complejo γ-secretasa e intervienen en el procesamiento proteolítico de multitud de sustratos. Sin embargo, se desconocen los sustratos concretos de PS con efecto patogénico en AD. En los últimos años, nuestro grupo de investigación ha obtenido datos que apuntan a que el procesamiento impedido de Neurexinas (Nrxs) por PS podría mediar déficits asociados a AD. Las Nrxs son proteínas de membrana presináptica que regulan la función y el mantenimiento de las sinapsis mediante la adhesión con ligandos postsinápticos, como Neuroliguinas (Nlgns). La inhibición farmacológica o genética de la actividad de PS/γ-secretasa da lugar al acúmulo del fragmento C-terminal de Nrxs (NrxCTF) in vitro e in vivo. Mutaciones en PS1 asociadas con FAD impiden el procesamiento normal de Nrxs, resultando en el acúmulo de NrxCTF. In vivo, NrxCTF se acumula en los terminales presinápticos de ratones PS cDKO deficientes en los genes PS1/2 en neuronas principales del prosencéfalo, coincidiendo con la aparición de defectos en la transmisión sináptica y de establecimiento de LTP. Además, el acúmulo selectivo de NrxCTF reproduce los defectos en la liberación de neurotransmisor ocasionados por una falta de función de PS en cultivos de neuronas. Con la finalidad de estudiar in vivo el efecto causado por una falta de procesamiento de Nrxs sin afectar la actividad general de PS hacia el resto de sustratos, en esta Tesis Doctoral se han generado modelos de ratón transgénico que expresan de forma constitutiva o inducible NrxCTF exógena en neuronas principales del prosencéfalo. La caracterización de estos modelos de ratón se ha realizado mediante aproximaciones bioquímicas, celulares y de comportamiento, entre otras. Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral apuntan a un efecto deletéreo del acúmulo de Nrx-CTF in vivo y a la aparición de defectos de comportamiento. La posibilidad de poder controlar temporalmente el encendido y apagado de Nrx-CTF ofrece la oportunidad de estudiar los mecanismos responsables de la aparición de los síntomas y su posible reversión.
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TESIS DOCTORAL Generación de ratones transgénicos que reproducen la falta de procesamiento de Neurexinas por Presenilinas como modelos de la enfermedad de Alzheimer AnaCarmenSánchezHidalgo DirectordeTesis:Dr.FranciscoGómezScholl DepartamentodeFisiologíaMédicayBiofísica UniversidaddeSevilla Sevilla , 2018
Memoria presentada por Ana Carmen Sánchez Hidalgo para optar algradode DoctorporlaUniversidaddeSevilla. ElpresentetrabajodeinvestigaciónhasidorealizadoenelInstituto de BiomedicinadeSevilla(IBiS),bajoladireccióndelDoctorFranciscoGómezScholl. ElproyectodeinvestigaciónharecibidofinanciacióndelaJuntadeAndalucía(P11‐ CVI‐7599)ydelMinisteriodeEconomíayCompetitividad(BFU2015‐71464‐R).
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA MÉDICA Y BIOFÍSICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Dr.FranciscoGómezScholl,ProfesorTitulardeUniversidad,adscritoalDepartamento deFisiologíaMédicayBiofísicadelaUniversidaddeSevilla CERTIFICA: QueDoñaAnaCarmenSánchezHidalgoharealizadobajosudireccióneltrabajotitulado “Generación de ratones transgénicos que reproducen la falta de procesamiento de Neurexinas por Presenilinas como modelo de la Enfermedad de Alzheimer” que presentaparaoptaralgradodedoctorporlaUniversidaddeSevilla. Fdo.:FranciscoGómezScholl Sevilla,2018
RESUMEN La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa asociada con el envejecimiento que se caracteriza por el deterioro progresivo de la memoria en los pacientes. El factor causal mayoritario responsable de casos de AD familiar (FAD) son mutaciones de pérdida parcial de función en los genes de Presenilina 1 (PS1) y Presenilina 2 (PS2). Las mutaciones en genes de PS1/2 asociadas a FAD tienen una herencia autosómica dominante y las personas portadoras presentan un inicio precoz de la enfermedad. Las PS forman la subunidad catalítica del complejo γ-secretasa e intervienen en el procesamiento proteolítico de multitud de sustratos. Sin embargo, se desconocen los sustratos concretos de PS con efecto patogénico en AD. En los últimos años, nuestro grupo de investigación ha obtenido datos que apuntan a que el procesamiento impedido de Neurexinas (Nrxs) por PS podría mediar déficits asociados a AD. Las Nrxs son proteínas de membrana presináptica que regulan la función y el mantenimiento de las sinapsis mediante la adhesión con ligandos postsinápticos, como Neuroliguinas (Nlgns). La inhibición farmacológica o genética de la actividad de PS/γ-secretasa da lugar al acúmulo del fragmento C-terminal de Nrxs (NrxCTF) in vitro e in vivo. Mutaciones en PS1 asociadas con FAD impiden el procesamiento normal de Nrxs, resultando en el acúmulo de NrxCTF. In vivo, NrxCTF se acumula en los terminales presinápticos de ratones PS cDKO deficientes en los genes PS1/2 en neuronas principales del prosencéfalo, coincidiendo con la aparición de defectos en la transmisión sináptica y de establecimiento de LTP. Además, el acúmulo selectivo de NrxCTF reproduce los defectos en la liberación de neurotransmisor ocasionados por una falta de función de PS en cultivos de neuronas. Con la finalidad de estudiar in vivo el efecto causado por una falta de procesamiento de Nrxs sin afectar la actividad general de PS hacia el resto de sustratos, en esta Tesis Doctoral se han generado modelos de ratón transgénico que expresan de forma constitutiva o inducible NrxCTF exógena en neuronas principales del prosencéfalo. La caracterización de estos modelos de ratón se ha realizado mediante aproximaciones bioquímicas, celulares y de comportamiento, entre otras. Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral apuntan
a un efecto deletéreo del acúmulo de Nrx-CTF in vivo y a la aparición de defectos de comportamiento. La posibilidad de poder controlar temporalmente el encendido y apagado de Nrx-CTF ofrece la oportunidad de estudiar los mecanismos responsables de la aparición de los síntomas y su posible reversión.
ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 1 1. Enfermedad de Alzheimer ............................................................................................... 2 1.1. Antecedentes históricos de la enfermedad de Alzheimer ................................ 2 1.2. Marcadores patológicos de la enfermedad de Alzheimer ................................ 3 1.3. Tipos de enfermedad de Alzheimer ..................................................................... 3 1.4. Proteína precursora del péptido β-amiloide ....................................................... 4 2. Presenilinas ........................................................................................................................ 6 2.1. Mutaciones en Presenilinas en la enfermedad de Alzheimer .......................... 7 2.2. Presenilinas causan enfermedad de Alzheimer familiar por un mecanismo de pérdida de función ............................................................................................ 7 2.3. Funciones biológicas de Presenilinas ................................................................... 9 2.3.1.Funciones de Presenilinas independientes de actividad γ-secretasa ........... 10 2.3.2. Funciones de Presenilinas dependientes de actividad γ-secretasa ........... 11 2.4. Diferentes sustratos de Presenilinas .................................................................. 12 3. Neurexinas ....................................................................................................................... 15 3.1. Neuroliguinas como ligandos postsinápticos de Neurexinas ......................... 17 3.2. Antecedentes I: Neurexinas como sustrato de presenilinas ............................. 20 3.3. Antecedentes II: Neurexinas median los defectos sinápticos originados por la falta de función de Presenilinas .......................................................................... 24 4. Hipótesis de Neurexinas-Neuroliguina-1 en la enfermedad de Alzheimer ............ 31 II. OBJETIVOS ........................................................................................................... 33 III. MATERIALES ........................................................................................................ 35 1. Cultivo de células ................................................................................................... 36 1.1. Células N2a ................................................................................................... 36 1.1.1. Mantenimiento de la línea celular N2a ................................................. 36 1.1.2. Transfección de células N2a .................................................................. 36 1.2. Cultivo primario de neuronas de hipocampo de rata .................................. 37 1.2.1. Transfección de cultivos primarios ........................................................ 37 2. Generación de vectores de expresión de HA-NrxCTF ........................................... 38 2.1. Generación del transgén CaMKII-HA-NrxCTF ............................................... 38 2.2. Generación del transgén TRE-HA-NrxCTF .................................................... 38
2.3. Microinyección pronuclear ........................................................................... 39 3. Aspectos generales del trabajo con un modelo animal ........................................ 39 3.1. Normativa del uso de animales de experimentación ................................... 39 3.2. Población experimental del modelo animal CaMKII-HA-NrxCTF ................. 40 3.3. Población experimental del modelo animal TRE-HA-NrxCTF; CaMKII-tTA .. 40 3.4. Extracción de DNA y genotipado de ratones................................................ 40 4. Técnicas bioquímicas para el análisis de proteínas ............................................... 41 4.1. Análisis de proteínas mediante Western blot .............................................. 41 4.1.1. Obtención de lisados a partir de tejido ................................................. 41 4.1.2. Obtención de lisados a partir de cultivos celulares ............................... 42 4.1.3. Electroforesis de geles SDS-poliacrilamida y transferencia de proteínas ................................................................................................................ 42 4.1.4. Inmunodetección de proteínas en la membrana .................................. 43 4.1.5. Revelado, toma de imágenes y cuantificación ...................................... 43 4.2. Fraccionamiento subcelular de sinaptosomas ............................................. 44 5. Técnicas para el análisis histológico ...................................................................... 45 5.1. Perfusión transcardíaca y seccionado del tejido .......................................... 45 5.2. Inmunohistoquímica ..................................................................................... 46 5.3. Fluorescencia de tejido ................................................................................. 46 5.4. Tinción de Nissl ............................................................................................. 47 5.5. Toma de imágenes y cuantificación ............................................................. 47 6. Inmunofluorescencia de células de cultivo ........................................................... 47 7. Experimentos de comportamiento en líneas de ratón ......................................... 48 7.1. Cohorte de animales ..................................................................................... 48 7.2. Análisis SHIRPA ............................................................................................. 49 7.3. Evaluación de la locomoción exploratoria ................................................... 49 7.3.1. Test de campo abierto ........................................................................... 49 7.3.2. Laberinto elevado en cruz...................................................................... 50 7.4. Evaluación del aprendizaje motor: Rotarod ................................................. 51 7.5. Test de acicalamiento o self-grooming ........................................................ 51 7.6. Evaluación la memoria ................................................................................. 52 7.6.1. Reconocimiento de un nuevo objeto .................................................... 52 7.6.2. Evitación pasiva ...................................................................................... 53 7.6.3. Evitación activa ...................................................................................... 54
7.6.4. Condicionamiento al miedo ................................................................... 54 8. Anticuerpos utilizados ........................................................................................... 56 IV. RESULTADOS ........................................................................................................ 58 1. Modelos transgénicos de sobreexpresión del fragmento C-terminal de Neurexinas ....................................................................................................................... 59 1.1. Caracterización in vitro de vectores de expresión de HA-NrxCTF .................. 59 1.2. Generación de ratones transgénicos de sobreexpresión constitutiva o inducible de la proteína HA-NrxCTF ................................................................... 62 1.3. Caracterización de la expresión de HA-NrxCTF in vivo en el modelo constitutivo CaMKII-HA-NrxCTF .......................................................................... 63 1.4. Caracterización de la expresión de HA-NrxCTF in vivo en el modelo de ratón transgénico inducible NrxCTF .............................................................................. 66 1.4.1. Expresión de la proteína HA-NrxCTF in vivo en las líneas NrxCTF.B y NrxCTF.C .................................................................................................... 67 1.4.2. Control temporal de la expresión de HA-NrxCTF con doxiciclina en el ratón NrxCTF.B .................................................................................................... 71 1.4.3. Expresión sináptica de la proteína HA-NrxCTF en la línea NrxCTF.B .......... 72 1.4.4. Análisis de los niveles de expresión de proteínas relacionadas con PS en la línea NrxCTF.B ............................................................................................. 73 1.4.5. Análisis de los niveles de acúmulo de HA-NrxCTF de la línea NrxCTF.B en comparación con el modelo APPsw/PS1ΔE9 ................................................ 76 2. Caracterización general de las líneas NrxCTF.B y NrxCTF.C del modelo inducible de ratón transgénico ...................................................................................................... 78 2.1. Frecuencia genotípica en las líneas NrxCTF.B y NrxCTF.C ............................... 78 2.2. Índice de mortalidad de la línea NrxCTF.B ........................................................ 79 2.3. Curva de crecimiento de la línea NrxCTF.B ....................................................... 83 3. Caracterización conductual del ratón NrxCTF.B ......................................................... 85 3.1. Análisis fenotípico de una población de la línea NrxCTF.B con inicio de expresión temprana.............................................................................................. 87 3.1.1. Cohorte de ratones para comportamiento ................................................ 87 3.1.2. Evaluación general del estado del animal .................................................. 87 3.1.3. Análisis de locomoción exploratoria .......................................................... 88 3.1.3.1. Test de campo abierto ............................................................................... 88 3.1.3.2. Laberinto elevado en cruz ......................................................................... 90 3.1.4. Análisis de aprendizaje motor: Rotarod ..................................................... 93 3.1.5. Análisis de patrones repetitivos de comportamiento: test de acicalamiento ................................................................................................................... 95
3.1.6. Evaluación de la memoria .......................................................................... 95 3.1.6.1. Memoria de reconocimiento de un nuevo objeto................................. 96 3.1.6.2. Evitación pasiva .......................................................................................... 98 3.1.6.3. Evitación activa ......................................................................................... 101 3.1.6.4. Condicionamiento al miedo .................................................................... 102 3.1.7. Análisis del comportamiento en la línea NrxCTF.B con expresión temprana de HA-NrxCTF tras el tratamiento con Dox ............................................. 104 3.1.8. Resumen del comportamiento de la línea NrxCTF.B de expresión temprana de HA-NrxCTF........................................................................................... 106 3.2. Caracterización fenotípica del comportamiento en la línea NrxCTF.B con expresión adulta de HA-NrxCTF ........................................................................ 108 3.2.1. Cohorte de animales para comportamiento ........................................... 108 3.2.2. Evaluación general del estado del animal ............................................... 110 3.2.3. Análisis de locomoción exploratoria ....................................................... 110 3.2.3.1. Test de campo abierto ............................................................................. 110 3.2.3.2. Laberinto elevado en cruz ....................................................................... 111 3.2.4. Análisis de aprendizaje motor: Rotarod .................................................. 113 3.2.5. Análisis de patrones repetitivos de comportamiento: test de acicalamiento........................................................................................... 115 3.2.6. Evaluación de la memoria ....................................................................... 116 3.2.6.1. Memoria de reconocimiento de un nuevo objeto............................... 116 3.2.7. Resumen de los ensayos de comportamiento de la línea NrxCTF.B con expresión adulta ...................................................................................... 117 4. Caracterización conductual del ratón NrxCTF.C ....................................................... 119 4.1. Cohorte de animales para comportamiento ................................................... 119 4.2. Evaluación general del estado del animal ....................................................... 119 4.3. Análisis de locomoción exploratoria: test de campo abierto ....................... 119 5. Posibles mecanismos afectados en el modelo transgénico de ratón NrxCTF.B... 121 5.1. Análisis de neurodegeneración y pérdida neuronal ...................................... 121 5.1.1.Neurodegeneración ................................................................................... 121 5.1.2. Pérdida de neuronas ................................................................................ 124 5.2. Análisis de los niveles de proteínas sinápticas candidatas............................ 125 5.2.1. Corteza ...................................................................................................... 125 5.2.2. Hipocampo................................................................................................ 126 5.2.3. Estriado ..................................................................................................... 127 V. DISCUSIÓN .......................................................................................................... 131
I. Introducción 6 fibrilares que llegan a formar placas (Imbimbo et al., 2005; Armstrong, 2006; Drachman, 2006). 2. Presenilinas PS1 y PS2 son proteínas homólogas de unos 50 kDa que representan la subunidad catalítica del complejo γ-secretasa y tienen un papel principal en la progresión de AD (Gertsik et al., 2015; Stanga et al., 2018). El ensamblaje y activación del complejo γsecretasa ocurre gracias a la asociación de PS1 o PS2 con otras tres proteínas de membranas: Nicastrina, Aph-1 (Aph-1a o Aph-1b en humanos; Aph-1a, Aph-1b o Aph-1c en roedores) y Pen-2, dando lugar a cuatro y seis γ-secretasas diferentes en humanos y roedores, respectivamente (Serneels et al., 2005; Meckler y Checler, 2016; Stanga et al., 2018). El ensamblaje del complejo activo γ-secretasa tiene lugar en orden temporal definido. Primero, Aph-1 y Nicastrina forman un complejo al que se incorpora PS. Posteriormente, PS se une al dominio transmembrana de Nicastrina. Finalmente, se ensambla Pen2 a PS y tiene lugar la endoproteolisis de PS para formar el complejo activo PS/γ-secretasa (Thinakaran et al., 1996). Las procesos de endoproteolisis dan lugar a fragmentos NTF y CTF de PS de 27-30 kDa y 16-20 kDa, respectivamente (Ho y Shen, 2011). La actividad proteolítica de PS está mediada por dos residuos de aspartato en las posiciones aminoacídicas 257 y 385 en el sexto y séptimo dominio transmembrana, respectivamente (Wolfe et al., 1999; Kimberly et al., 2000) (Figura 2). Estudios recientes demuestran que la presencia de PS1 o PS2 en el complejo γsecretasa determina su localización subcelular. Cuando el complejo γ-secretasa contiene PS1 se localiza principalmente en la membrana plasmática. Sin embargo, cuando el complejo γ-secretasa contiene PS2 se dirige al sistema retículo endoplásmico-Golgi y a un subconjunto de compartimentos endosómicos (Meckler y Checler, 2016). Además, la distribución celular de los complejos que contienen PS2 difiere según el componente Aph1. Esta discriminación entre ambas proteínas puede tener implicaciones obvias para
I. Introducción 7 la especificidad de sustrato de los complejos γ-secretasa que contienen PS1 o PS2 (Meckler y Checler, 2016). Figura 2. Modelo topológico del complejo γ-secretasa. El complejo γ-secretasa está formado por 4 proteínas: Presenilina (PS), Nicastrina, Aph-1 y Pen-2. PS tiene 9 dominios transmembrana y dos aspartatos conservados, 257 y 385, en los dominios 6 y 7 de PS, respectivamente (marcados con una estrella). Tras el ensamblaje con otros miembros del complejo γ-secretasa, PS se somete a endoproteolisis dentro del bucle que conecta los dominios 6 y 7 para formar un fragmento N-Terminal (NTF) y un fragmento C-terminal (CTF). Cada subunidad de PS contribuye con un aspartato al sitio activo. 2.1. Mutaciones en Presenilinas en la enfermedad de Alzheimer Como se ha mencionado anteriormente, las mutaciones en PS1 conforman el 90% de los casos de FAD. Actualmente se conocen más de 180 mutaciones en PS1 asociadas a FAD (www.alzforum.org). Estas mutaciones se distribuyen por toda la molécula, con una localización principal en los dominios transmembrana altamente conservados y en los residuos hidrofóbicos del NTF o del dominio hidrofóbico situado entre los dominios transmembrana 6 y 7 (Tandon y Fraser, 2002) (Figura 3). Por otro parte, la mayoría de las más de 35 mutaciones en PS2 asociadas con FAD también se localizan en dominios transmembrana conservados y entre los dominios transmembrana 6 y 7 (www.alzforum.org). 2.2. Presenilinas causan enfermedad de Alzheimer familiar por un mecanismo de pérdida de función Existen dos opciones para explicar el tipo de herencia autosómica dominante de las mutaciones en genes de PS asociadas con FAD: i) que las mutaciones ocasionen una
I. Introducción 8 Figura 3. Muchas de las mutaciones descritas en PS1. Esta imagen muestra la distribución de mutaciones de cambio de sentido, pequeñas inserciones y deleciones en PS1. Rojo: mutaciones en PS1. Amarillo: los dos sitios Aspartato (D257 y D385) que actúan como residuos catalíticos de PS1. Adaptado de Shen y Kelleher, 2007. ganancia de función patogénica (Hardy y Selkoe, 2002) o ii) que las mutaciones en PS generen una pérdida de función (Shen y Kelleher, 2007). Resolver esta pregunta tiene consecuencias clínicas evidentes. En el caso de que las mutaciones en genes de PS asociadas a FAD causaran una ganancia de función, la inactivación de la actividad de PS podría aliviar los síntomas. Por el contrario, aproximaciones farmacológicas que inhibieran la acumulación de sustratos relevantes podrían detener o aliviar el desarrollo de AD en el caso de que las mutaciones en PS actuaran por un mecanismo de pérdida de función. Trabajos realizados a largo de los últimos años apoyan un mecanismo de pérdida de función de PS. Como se ha mencionado, las mutaciones en genes de PS asociadas con FAD se encuentran distribuidas por toda la proteína e incluyen deleciones, haciendo difícil reconciliar estos datos con una ganancia de función conferida por las mutaciones.
I. Introducción 9 Por otra parte, las mutaciones en PS1 asociadas con FAD resultan a menudo en el acúmulo de CTF de sus varios sustratos, de acorde con un mecanismo de pérdida de función. Además, evidencias in vivo apoyan una pérdida de función de PS como desencadenante de la cascada de eventos que conduce a AD. De forma interesante, la inactivación condicional de PS1 y PS2 (Beglopoulos et al., 2004; Saura et al., 2004; Wines- Samuelson et al., 2010) o de otro componente del complejo γ-secretasa como Nicastrina (Tabuchi, 2009) en el cerebro de ratón adulto producen pérdida progresiva de memoria, neurodegeneración, inflamación e hiperfosforilación de Tau generalizadas, indicando que la pérdida de función de PS/complejo γ-secretasa causa síntomas asociados a AD. La pérdida parcial de la función de PS en AD se ha visto reforzada en los últimos años por la generación de modelos de ratón Knock-In (KI) que reproduce mutaciones en PS1 asociadas a FAD (PS1 KI) y por la caracterización de los complejos γ-secretasa originados por 138 mutantes de PS1 causantes de FAD (Xia et al., 2015; Sun et al., 2017). En apoyo de un mecanismo patogénico de pérdida de función, ensayos clínicos en fase III con un número alto de pacientes tratados con inhibidores de la actividad PS/γ-secretasa se tuvieron que discontinuar debido al aumento de la incidencia de efectos adversos en los pacientes tratados, incluyendo un agravamiento cognitivo de los pacientes (Doody et al., 2013). El conjunto de estos y otros datos han llevado a postular la hipótesis de Presenilinas, según la cual la pérdida parcial de función de PS, con el probable acúmulo de CTFs de sus sustratos proteolíticos, supone un evento iniciador en AD que ocasiona defectos sinápticos y de memoria que preceden a la posterior neurodegeneración en los pacientes (Shen y Kelleher, 2007). 2.3. Funciones biológicas de Presenilinas Durante los últimos años se han identificado un buen número de rutas y sustratos asociados con la actividad de PS (Haapasalo y Kovacs, 2011), indicando que PS deben participar en una gran variedad de funciones a lo largo de la vida. Las funciones de PS se pueden dividir en funciones independientes y dependientes del complejo γ-secretasa.
I. Introducción 10 2.3.1. Funciones de Presenilinas independientes de actividad γ-secretasas Las funciones de PS independientes de la actividad del complejo γ-secretasa incluyen la estabilización de β-catenina en la ruta de señalización de Wnt y en la homeostasis de la regulación de Ca2+. β-catenina es una proteína transductora de señal de la ruta de señalización de Wnt y también participa como molécula de adhesión celular. β-catenina lleva a cabo dos funciones de acuerdo a su localización celular: i) en membrana forma complejos con el dominio citoplásmico de la molécula de adhesión E-cadherina y ii) en el citoplasma, βcatenina está implicada en la ruta de señalización de Wnt, traslocándose al núcleo para participar en procesos de regulación génica. La acción de la glucógeno sintasa quinasa- 3β (GSK3β) regula la fosforilación, ubiquitinación y degradación de β-catenina. La señalización de Wnt actúa como antagonista de la degradación de β-catenina, por tanto, en ausencia de Wnt la proteína de β-catenina se fosforila por acción de GSK3β y se degrada constitutivamente a través de la ruta ubiquitina-proteosoma (Huang y He, 2008; Zhang et al., 2013). Diferentes estudios han mostrado que hay tres secuencias de fosforilación consenso conservadas en PS1 (Twomey y McCarthy, 2006; Duggan y McCarthy, 2016). La fosforilación de PS1 en uno de estos sitios por GSK3β regula la interacción entre PS1 y β-catenina (Kirschenbaum et al., 2001; Prager et al., 2007; Duggan y McCarthy, 2016). En los últimos años, se ha mostrado que mutaciones en PS1 relacionadas con FAD inhiben la ruta de señalización de Wnt por aumento de la fosforilación y degradación de β-catenina (Kawamura et al., 2001; Duggan y McCarthy, 2016) e induce a la apoptosis en células neuronales (Zhang et al., 1998; Duggan y McCarthy, 2016). Por otro lado, también se ha propuesto que existe relación de las PS con la formación de canales de Ca2+ en el retículo endoplásmico y la regulación de la homeostasis de Ca2+ intracelular (Zhang et al., 2010, 2015). Se conoce que la interrupción en la señalización de Ca2+ precede a las patologías clásicas de AD como los ovillos neurofibrilares y las placas de Aβ, y se propone que contribuya a la muerte celular neuronal durante la enfermedad (Bezprozvanny y Mattson, 2008). En numerosos
I. Introducción 11 modelos de ratón de AD se han observado niveles basales elevados de Ca2+ y que las mutaciones relacionadas con FAD de PS producen cambios en los niveles de Ca2+ (Tu et al., 2006; Nelson et al., 2010; Zhang et al., 2010; Jung et al., 2011). Hay otras evidencias que respaldan el papel de PS independiente de la actividad γ-secretasa en la regulación de la homeostasis de Ca2+ de las reservas intracelulares. Las PS interactúan con varias proteínas funcionalmente implicadas en la señalización del calcio como sorcina, calmodulina, calsenilina, calmirina y calpaína (Shinozaki et al., 1998; Stabler et al., 1999; Pack-Chung et al., 2000). También, se ha demostrado que las PS regulan los niveles de Ca2+ a través de interacciones y activación de canales de Ca2+ como Ca- ATPasas (SERCA) (Green et al., 2008), el receptor de inositol trifosfato (InsP3R) (Cheung et al., 2008) y el receptor de Rianodina (RyR) (Hayrapetyan et al., 2008; Rybalchenko et al, 2008). Más recientemente, se ha descubierto que las PS modulan la regulación mediada por fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (PIP2) del potencial de receptor de transición de la melastatina relacionada con 7 (TRPM7) (Oh et al., 2012). 2.3.2. Funciones de Presenilinas dependientes de actividad γ-secretasa Las PS promueven la memoria y la supervivencia neuronal a través de un mecanismo dependiente de la actividad γ-secretasa, observación consistente con los descubrimientos que muestran que la inactivación condicional de Nicastrina, otro componente del complejo γ-secretasa, en corteza de cerebro adulto, también resultó en daño progresivo de la memoria, neurodegeneración e hiperfosforilación de Tau dependientes de la edad (Tabuchi et al., 2009). Los sustratos de PS/ γ-secretasa comparten varias características (Struhl y Adachi, 2000; Beel y Sanders, 2008). Estas características son i) la mayoría de los sustratos de PS/γ-secretasa son proteínas transmembrana de tipo I (Haapasalo y Kovacs, 2011), ii) actúan como proteínas de señalización y regulación celular (Bossy-Wetzel et al., 2004; Querfurth y LaFerla, 2010), iii) escinden preferentemente la proteína después del desprendimiento del ectodominio (Beel y Sanders, 2008), iv) la actividad del complejo PS/γ-secretasa tiene lugar en o cerca del límite de los dominios transmembrana y citoplásmico (Weihofen y Martoglio, 2003), v) la escisión mediada por PS/γ-secretasa
I. Introducción 12 libera el dominio intracelular (ICD) de las proteínas sustrato al citosol (Okochi et al., 2002; Araki et al., 2004), vi) la inhibición de la actividad PS/γ-secretasa mediante inhibidores farmacológicos o por falta de función de PS, previenen la generación del ICD y da como resultado el acúmulo del CTF de manera análoga a βAPP-CTFs (Haapasalo y Kovacs, 2011). 2.4. Diferentes sustratos de Presenilinas Existe una gran variedad de sustratos de PS/γ-secretasa en base a su estructura, localización y funciones fisiológicas. Hasta el momento se han encontrado más de 90 sustratos de PS/γ-secretasa (Haapasalo y Kovacs, 2011). Éstos tienen funciones de señalización y regulación celular, interviniendo en procesos de determinación del sitio celular, adhesión, migración, crecimiento de neuritas y guía axonal y formación y mantenimiento de la sinapsis. De forma interesante, muchos de estos eventos son interrumpidos durante la neurodegeneración ocurrida en AD (Bossy-Wetzel et al., 2004; Querfurth y LaFerla, 2010). EphA4, miembro de la familia del receptor de Efrina, se identificó como sustrato del complejo γ-secretasa y su proteólisis se potencia por actividad sináptica (Inoue et al., 2009; Ho y Shen, 2011). La sobreexpresión del dominio intracelular de EphA4 aumenta el número de espinas dendríticas a través de la activación de la vía de señalización de Rac (Inoue et al., 2009; Ho y Shen, 2011). Este hallazgo apoya los experimentos que muestran que los inhibidores del complejo γ-secretasa reducen la densidad de espinas in vivo. Entre los sustratos del complejo γ-secretasa se encuentran proteínas de adhesión. Las N-Cadherinas pertenecen a la familia de las Cadherinas, una gran familia de proteínas transmembranas (>100) que tienen un papel fundamental en adhesión celular y morfogénesis (Krauss et al., 2005; Halbleib y Nelson, 2006; Niessen et al., 2011). Las N-Cadherinas se encuentran flanqueando la zona activa en la sinapsis y tienen un papel crucial en el proceso de formación y mantenimiento de la sinapsis (Togashi et al., 2002; Giagtzoglou et al., 2009). El ICD de N-Cadherinas generado por el procesamiento mediado por γ-secretasa actúa como represor transcripcional que migra al núcleo y se
I. Introducción 13 une a la proteína CBP, promoviendo su degradación con la consecuente inhibición de la transcripción de genes implicados en la función y plasticidad del sistema nervioso mediado por CBP/CREB. De esta forma, la inhibición de la función de PS incrementa los niveles de CBP en el núcleo y la transcripción mediada por CREB-CBP (Marambaud et al., 2003). En células epiteliales, las PS se concentran en los sitios de contacto entre células, asociándose por el lado intracelular a las cateninas, β-catenina y γ-catenina, promoviendo la estabilización del complejo cadherina-catenina y su asociación al citoesqueleto de actina (Parisiadou et al., 2004). La escisión de E-Cadherina por el complejo γ-secretasa promueve el desensamblaje del complejo de adhesión Cadherina- Catenina. Otras proteínas de esta familia son también sustratos de PS/γ-secretasa como VE-cadherinas (Marambaud et al., 2002) y protocadherinas (Haas et al., 2005; Hambsch et al., 2005; Bonn, Seeburg et al., 2007). Otras de las proteínas sustrato del complejo PS/γ-secretasa son las proteínas Notch 1-4. Las proteínas de la familia Notch median la señalización de corto alcance controlando las decisiones del destino celular, el modelado de la expresión génica y mantenimiento de las poblaciones de células madre durante desarrollo. La señalización de Notch en estos eventos requiere la activación de Notch y la posterior liberación mediada por la actividad PS/γ-secretasa de Notch-ICD (NICD), que regula la transcripción de genes (Louvi y Artavanis-Tsakonas, 2006; Fiúza y Arias, 2007). La proteína que ha tenido más relevancia entre los diferentes sustratos de PS por su relación con AD es APP. El procesamiento de APP por PS da lugar a los péptidos Aβ que conforman las placas amiloides características de AD. Las mutaciones de PS asociadas a FAD mejoran selectivamente la producción de péptido Aβ42, a menudo a expensas de una menor generación de Aβ40 (Moehlmann et al., 2002; Schroeter et al., 2003). Estos datos han servido de apoyo para la teoría amiloidogénica que postula que la producción exacerbada por PS de formas largas del péptido A42 es responsable del desarrollo de AD (Hardy y Selkoe, 2002). Sin embargo, no está claro que PS promuevan los déficits de memoria y de supervivencia neuronal a través del procesamiento de APP, cuestionándose si es el único sustrato patogénico del complejo γ-secretasa. Por ejemplo, los pacientes de FAD que portan mutaciones en genes de PS desarrollan la enfermedad a una edad significativamente más temprana que aquellos pacientes que presentan
I. Introducción 14 mutaciones en APP (Ryman et al., 2014). Estudios de PET o análisis postmorten han mostrado que existen individuos de edad avanzada con una carga de placas amiloide elevada sin síntomas de demencia o síntomas muy leves. No se trata de un caso puntual, sino que puede corresponder entre un cuarto y un tercio de las personas ancianas con defectos cognitivos nulos o mínimos (Herrup, 2015). El hallazgo de depósitos de amiloide en cerebros de individuos sin demencia indica que el péptido A no es suficiente para causar AD. Además, la sobreproducción de Aβ incluyendo Aβ42 no produce neurodegeneración en ratones (Games et al., 1995; Hsiao et al., 1996; Mucke et al., 2000), sugiriendo que la sobreproducción de Aβ puede ser insuficiente para iniciar la neurodegeneración (Kim et al., 2013). Por otra parte, los ratones KI de mutaciones de PS1 asociadas a FAD reducen los niveles de A40 y A42, de acorde con un mecanismo de pérdida de función (Xia et al., 2015). Esta reducción es de mayor magnitud en las formas cortas (A40) que en las formas largas (A42), explicando el ligero aumento en el ratio A42/A40. En otras palabras, los niveles totales de A42 son mayores en cerebros de ratones control que en ratones PS1 KI. Estos estudios proponen dos rutas paralelas relacionadas con AD, una dependiente de la producción del péptido Aβ, que ocasiona la formación de placas, y otra independiente del péptido Aβ que causa la disfunción sináptica, el deterioro de la memoria y neurodegeneración dependiente de la edad. En resumen, los hallazgos en humanos y en ratón han puesto en entredicho que el papel lineal del acúmulo de A postulado por la teoría amiloidogénica sea suficiente para explicar la enfermedad (Herrup, 2015). Aunque de ninguna manera el posible papel patológico de A se pueda descartar por completo, el avance de la investigación en AD requiere la identificación de nuevos sustratos con un impacto en el desarrollo de la enfermedad. Por tanto, la identificación de los sustratos moleculares de PS responsables de la disfunción sináptica y la neurodegeneración causada por la pérdida de PS proporcionarán nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de AD (Ho y Shen, 2011). En los últimos años, nuestro grupo de investigación ha identificado un sustrato sináptico de PS/γ-secretasa con un papel potencial en AD, las Neurexinas (Nrxs) (Saura et al., 2011; Servián-Morilla et al., 2018).
I. Introducción 15 3. Neurexinas El veneno de la araña viuda negra contiene una toxina específica de vertebrados, la α-latrotoxina. La liberación de α-latrotoxina produce liberación masiva de neurotransmisores (Yuri et al., 2008). Las Nrxs se descubrieron originalmente como receptores para α-latrotoxina (Ushkaryov et al., 1992). Las Nrxs de mamíferos son proteínas de membrana de tipo I codificadas por 3 genes (Nrx1-3, en ratones y NRX1-3 en humanos) que expresan 2 isoformas principales, αNrxs y βNrxs (Ushkaryov et al., 1992, 1993, 1994) (Figura 4). Recientemente se ha descubierto un promotor alternativo situado 3’ que da lugar a una tercera isoforma sólo codificada por Nrx1, las γNrxs (Sterky et al., 2017) (Figura 4). Las distintas isoformas de Nrxs presentan diferentes secuencias extracelulares. Las αNrxs, isoforma larga, están compuestas por una región extracelular que contiene seis dominios de unión a laminina/neurexina/globina de unión a hormonas sexuales (LNS, del inglés lamininneurexin-sex hormone binding globulin) y tres dominios de factor de crecimiento epidermal (EGF, del inglés epidermal growth factor-like); mientras que la secuencia de la región extracelular de β-Nrxs, la isoforma corta, sólo incluye el último dominio LNS de αNrxs (Südhof, 2017). La región citoplasmática de los distintos genes de Nrxs está altamente conservada (Figura 4). Las Nrxs sufren splicing alternativo en seis sitios conservados (SS1-SS6) dando lugar a más de 1000 isoformas que son expresadas en el cerebro creando, de esta forma, la gran diversidad molecular que debe contribuir a la diversidad sináptica (Schreiner et al., 2014; Treutlein et al., 2014). Las αNrxs contienen los sitios de splicing SS1-SS6, mientras que las βNrxs sólo contienen los sitios de splicing SS4 y SS5 (Ushkaryov et al., 1992, 1994), y las γNrxs sólo el SS5 (Sterky et al., 2017). La incorporación o exclusión de los exones situados en estos sitios de splicing originan la formación de las isoformas SS+ o SS-, respectivamente. Los SS1-4 implican secuencias cortas (≤30 residuos) y están localizados en los dominios LNS o cercanos a éstos. Estos SS están conservados en las 3 Nrxs. Sin embargo, SS5 sólo implica 3 residuos en Nrx1, pero 191 residuos en Nrx2. En Nrx3, SS5 presenta
I. Introducción 22 Estos resultados se apoyan del estudio de otros grupos de investigación en los que muestran que el procesamiento de Nrx3β se ve alterado por varias mutaciones de PS1 en la subunidad catalítica del complejo γ-secretasa asociadas a FAD. De los diferentes mutantes de PS1 que analizan se observa que en PS1 L166P y PS1 P436Q hay un fuerte aumento en el acúmulo de CTFs de NrxCTF con respecto al control wild type, y con el Figura 7. Procesamiento secuencial de Nrxs por metaloproteasas y PS/γ-secretasa. A, Modelo del procesamiento secuencial de Nrxs. Están marcados los anticuerpos utilizados para la detección de la etiqueta HA en el extremo N-terminal (anti-HA) y para la detección del CTF (anti-Cyto-Nrx).B, Células HEK293 transfectadas con vector o con HA-βNrx1 y tratadas con DMSO (control), con GM6001 o con DAPT. Panel superior, Western blot de lisados celulares con el anticuerpo anti-Cyto-Nrx. Panel inferior, Western blot con un anticuerpo anti-HA de inmunoprecipitados anti-HA de medio condicionado de células transfectadas. Un lisado de células HEK293 transfectadas con HA-Nrx1 se incluye en el mismo inmunoblot para hacer notar la diferencia de peso molecular con el Full-Lenght del ectodominio liberado al medio. C, Células MEF PS+/+ o PS-/- transfectadas con vector o cotransfectadas con HA-βNrx1 y vector vacío, PS1 wild type o mutantes de PS1 relacionados con AD (PS1 M146L, PS1 H163R, PS1 C410Y o PS1 ΔE9. Análisis con Cyto-Nrx (Nrx), N- Cadherina (N-cadh), PS1 y Nicastrina (Nct). Paneles B, C, adaptados de Saura et al., 2011.
I. Introducción 23 mutante de deleción PS1 ΔE9 sólo hubo un ligero aumento de NrxCTF (Bot, 2011). El conjunto de estos resultados sugiere que PS regula la función sináptica y el procesamiento de Nrxs en las sinapsis glutamatérgicas y que el daño en el procesamiento de Nrxs por PS podría tener un papel clave en la FAD. Figura 8. Acúmulo de NrxCTF en neuronas hipocampales deficientes en actividad PS/γ-secretasa mediante experimentos de Western blot. Cultivo de neuronas hipocampales no infectados (control) e infectados con lentivirus GFP, PS1 o con el mutante dominante negativo PS1 D385A. Se analizaron los niveles totales de Nrxs, PS1, N-Cadherina (N-Cadh) y CASK. Adaptado de Saura et al., 2011. Como apoyo a estos resultados, en nuestro grupo de investigación se realizaron aproximaciones de genética humana en unos 3000 pacientes y controles de AD esporádico, seguido de un estudio de 1700 pacientes/controles españoles. Se identificó una asociación sugestiva con NRX3 en hombres con AD (Martinez-Mir et al., 2013). En otro estudio, identificamos una mutación en heterocigosis de cambio de pauta de lectura en NLGN1 (NLGN1 Thr271fs) en un caso familiar de AD. La paciente presentó neurodegeneración cortical por MRI y se descartó la presencia de otras mutaciones relacionadas con FAD en PS1, PS2 y APP. La expresión del mutante NLGN1 Thr271fs en neuronas de hipocampo en cultivo confirmó que el alelo mutante producía una proteína no funcional, indicando una reducción del 50% en los niveles de Nlgn1 en la paciente (Tristán-Clavijo et al., 2015). Estos datos demostraron por primera vez la presencia de mutaciones con efecto patogénico en AD en la ruta de Nrx-Nlgn1.
I. Introducción 24 Figura 9. Acúmulo de NrxCTF en fracciones sinápticas de ratones PS cDKO. A, Lisados de cerebro de embriones (E17.5) de ratones PS1+/+, PS1+/- y PS1-/- o ratones wild type (WT) y PS cDKO analizados por Western blot con anticuerpo anti-Cyto-Nrx (Nrx), anti-PS1 y anti-N-Cadherina (N-Cadh). El aumento de los niveles de N-Cadherina-CTF coincide con el descenso de la expresión de PS en los animales sin PS. B, Acúmulo de NrxCTF en purificaciones sinaptosomales y en fracciones sinápticas de ratón PS cDKO. Lisados de corteza cerebral y fracciones pre- y postsinápticas. Analizado mediante Western blot con anti-Cyto-Nrx (Nrx), PS1, sinaptofisina (SYP) (enriquecido en terminales presinápticos) y PSD95 (enriquecido en terminales postsinápticos). FL: proteína completa. Adaptado de Saura et al., 2011. 3.3. Antecedentes II: Neurexinas median los defectos sinápticos originados por la falta de función de Presenilinas Los resultados expuestos a continuación provienen de la publicación de nuestro grupo titulada “Proteolytic processing of Neurexins by Presenilins sustains synaptic vesicle release” en Journal of Neuroscience (Servián-Morilla et al., 2018). El estudio de la función de PS ha demostrado un papel esencial en la liberación de glutamato y la inducción de LTP (del inglés, Long Term Potentiation) en el hipocampo mediante un mecanismo esencialmente presináptico. De esta forma, se ha demostrado que la ablación genética de PS1/2 selectivamente en neuronas de la región CA3 del
I. Introducción 25 hipocampo reduce la liberación de glutamato e inhibe la inducción de LTP en las sinapsis de CA3-CA1 del hipocampo (colaterales de Schaeffer) (Zhang et al., 2009). Por el contrario, la ablación genética de PS1/2 en las neuronas CA1 no tuvo ningún efecto en las mismas sinapsis (Zhang et al., 2009). Estos datos han mostrado que PS ejerce una función principal en el terminal presináptico regulando los niveles de Ca2+, la liberación de neurotransmisor y la inducción posterior de LTP. Resulta evidente destacar que el acúmulo de sustratos de PS relevantes en AD debería recapitular total o parcialmente los defectos ocasionados por la falta de función de PS. Por tanto, es de esperar que el acúmulo de sustratos no procesados de PS en terminales presinápticos glutamatérgicos medie los defectos en la liberación de neurotransmisor y de plasticidad sináptica. Basados en la función de Nrxs, en la liberación de neurotransmisor y el acúmulo de NrxCTF en terminales presinápticos glutamatérgicos, en nuestro laboratorio postulamos que Nrxs podrían mediar los defectos en liberación glutamatérgica asociados a una pérdida de función de PS en FAD. Para analizar efectos en la función presináptica, en el grupo desarrollamos abordajes basados en expresión de sondas sinápticas fluorescentes que nos han permitido analizar los niveles de Ca2+ y la liberación de neurotransmisor en terminales glutamatérgicos mediados por Nrxs-Nlgn1 y adaptar estos métodos a neuronas de hipocampo que carecen de la función de PS (Figura 10). Mediante la aplicación de estos sistemas hemos demostrado que la adhesión trans-sináptica de Nrxs con Nlgn1 incrementa la entrada de Ca2+ y la probabilidad de liberación en terminales glutamatérgicos (Servián-Morilla et al., 2018) (Figura 10). Además, demostramos que el aumento en la probabilidad de liberación mediado por Nrxs requiere de la actividad de PS, ya que la inhibición farmacológica de PS o la escisión de PS1/2 en cultivos de neuronas de hipocampo produce el acúmulo de NrxCTF en los terminales presinápticos y reduce la probabilidad de liberación (Servián-Morilla et al., 2018) (Figura 10). La confirmación experimental de que NrxCTF es el sustrato de PS que media los defectos en la probabilidad de liberación, requiere simular la falta de procesamiento hacia Nrx sin afectar la actividad general de PS hacia el resto de sustratos, un reto experimental importante. Para ello, se generaron mutantes con deleciones crecientes en el dominio yuxtamembrana extracelular de βNrx1 y se analizaron los fragmentos
I. Introducción 26 NrxNTF y NrxCTF producidos por dichos mutantes en células HEK293T, mediante experimentos de inmunoprecipitación del medio condicionado y de Western blot de lisados totales, respectivamente (Figura 11B). De esta manera, comprobamos que una deleción que comprende selectivamente los residuos 386-393 inhibe la liberación al medio de NrxNTF y la acumulación de NrxCTF, de acuerdo con un procesamiento proteolítico secuencial. Estos resultados mostraron que el sitio responsable de la liberación del ectodominio y la consiguiente generación de NrxCTF está comprendido entre los residuos 386 y 393 de Nrx1 (Figura 11C). Trabajos recientes de otro grupo han demostrado una localización similar en el dominio yuxtamembrana para el corte del ectodominio de Nrx3 (Borcel et al., 2016). Una vez determinado el sitio de corte que produce NrxCTF, en el laboratorio se generó un vector de expresión HA-NrxCTF que codifica los 85 últimos residuos C- terminal de Nrx1 empezando en V388 (Figura 11D) y etiquetando el extremo N terminal con el epítopo HA. En paralelo, se generó la construcción HA-NrxCTF ΔPDZ, un mutante de HA-NrxCTF en el que están ausentes los 3 últimos residuos C-terminal, esenciales para la interacción de Nrxs con las proteínas sinápticas de unión a dominios PDZ (Butz et al., 1998; Grootjans et al., 2000), como CASK (Figura 12A). HA-NrxCTF mostró una movilidad similar a la presentada por las bandas correspondientes a NrxCTF producidas por Nrxs endógenas o por la expresión exógena de βNrx1 (Figura 12B,C). La menor movilidad de HA-NrxCTF respecto a NrxCTF endógena se debe probablemente a la incorporación de la etiqueta HA (Figura 12B,C). Estos datos demostraron que HA-NrxCTF es un sustrato de PS comparable a NrxCTF endógeno y nos ofrecieron una herramienta molecular para evaluar las consecuencias funcionales de simular el acúmulo selectivo de un único sustrato de PS, las Nrxs. De forma notable, el acúmulo por sí solo de NrxCTF en terminales presinápticos recapitula la inhibición en la probabilidad de liberación y en la entrada de Ca2+ provocados por la pérdida de función de PS (Servián-Morilla et al., 2018) (Figura 13). El efecto inhibidor de NrxCTF en la entrada de Ca2+ y la liberación de neurotransmisor requiere de la integridad del dominio citoplásmico, ya que el mutante que carece de los residuos que conforman el sitio de unión a dominios PDZ presenta un menor efecto (Figura 13).
I. Introducción 27 Figura 10. Inhibición de la liberación presináptica en sinapsis de Nlgn1 en neuronas de ratón PS cDKO. A, Diseño experimental. Neuronas de hipocampo fPS1/fPS1;PS2-/- fueron infectadas con lentivirus expresando sólo Synaptophysin-pHluorin (SypHy) o junto a Cre o ΔCre, seguido por la cotransfección de HA- Nlgn1 y DsRed. La misma población de axones forman puncta sináptica en dendritas que expresan Nlgn1 (flechas negras) y que no expresan (flechas blancas), las cuales representan el control interno. B, Las imágenes muestras la fluorescencia de SypHy de cultivos de hipocampo expresando sólo SypHy (control) o junto a ΔCre o Cre (neuronas PS cDKO). La respuesta de SypHy fue provocada con 40 y 300 potenciales de acción (APs). C-E, Cinética (C, D) y amplitudes de pico (E) de la fluorescencia de SypHy normalizada en sinapsis internas (D) e inducida por Nlgn1 (C). Adaptado de Servián-Morilla, 2018.
I. Introducción 28 Figura 11. Procesamiento proteolítico de mutantes de deleción de Nrx1-β. A, Secuencias de mutantes de deleción de la proteína con la región yuxtamembrana de humano Nrx1β. SP: péptido señal, HA: epítopo HA, LNS: dominio de unión a laminina/neurexina/globulina de unión a hormonas sexuales, TM: dominio transmembrana. B, Experimentos de Western blot con anticuerpo anti-HA de lisados de células o inmunoprecipitados de HA de medio condicionado de células HEK293T transfectadas con la construcción indicada. Se incluyó un lisado de células transfectadas con HA-βNrx1 para mostrar el peso más bajo de los ectodominios inmunoprecipitados, abajo, su cuantificacion. C, Detección (Continúa pie de figura →)
I. Introducción 29 (← Continúa pie de figura) de NrxCTF mediante experimentos de Western blot de células HEK293T transfectadas y usando un anticuerpo anti-Cyto-Nrx (Nrx). D, Secuencia de alineamiento de las proteínas NRX1-3 humanas. Muestran una alta conservación del sitio de escisión y NrxCTF. Los puntos indican aminoácidos idénticos. La flecha indica V388. Adaptado de Servián-Morilla et al., 2018. Figura 12. Procesamiento de HA-NrxCTF por PS. A, Esquema grafico que muestra las construcciones HA- NrxCTF y HA-NrxCTF ΔPDZ comparadas con HA-βNrx1 (HA-Nrx1-β). B, Western blot de células HEK293T transfectadas en presencia de DAPT. C, Lisados de neuronas de hipocampo infectadas con HA-βNrx1, HA- NrxCTF y HA-NrxCTF ΔPDZ e incubados con DAPT. Se analizó con los anticuerpos anti-HA y anti-Cyto-Nrx (Nrx). Adaptada de Servián-Morilla et al., 2018. HA-NrxCTF interacciona con CASK mediante el sitio de unión a dominios PDZ (Figura 14), sugiriendo que NrxCTF acumulada en terminales presinápticos puede asociarse y desplazar de los sitios de interacción natural componentes claves del terminal, afectando de esta manera a su función. Por tanto, estos datos indican que Nrxs es el sustrato concreto que media los defectos en la entrada de Ca2+ y liberación de neurotransmisor ocasionados por una falta de función de PS.
I. Introducción 30 Figura 13. La expresión de NrxCTF inhibe la liberación vesicular presináptica. A, HA-NrxCTF o HA-NrxCTF ΔPDZ fueron cotransfectadas con SypHy en neuronas de hipocampo y marcadas con anticuerpo anti-HA. Terminales presinápticos que expresan SypHy fueron detectados con fluorescencia GFP. B, Las imágenes muestran la respuesta de Syphy a 40 y 300 APs en axones que expresan HA-NrxCTF y HA-NrxCTF ΔPDZ. A la derecha, Amplitudes de pico de la fluorescencia de SypHy en axones. Test estadístico: Kruskal-Wallis seguido de post hoc Dunn’s test. p-value: ***p<0.001. Adaptado de Servián et al., 2018. Figura 14. Acúmulo de CASK en axones que expresan NrxCTF. Experimentos de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-HA y anti-CASK muestran acúmulo de CASK en axones que expresan HA-NrxCTF. A la derecha, cuantificación de CASK. Test estadístico: one-way ANOVA seguido de post hoc Bonferroni. p-value: **p<0.01, ***p<0.001. Adaptado de Servián-Morilla et al., 2018.
I. Introducción 31 4. Hipótesis de Neurexinas-Neuroliguina-1 en la enfermedad de Alzheimer El conjunto de los datos obtenidos de nuestros estudios sugieren que el acúmulo de NrxCTF en los terminales presinápticos puede desencadenar déficits sinápticos, de memoria y neuronales asociados con la pérdida de función de PS en FAD (Figura 15). Nuestra propuesta sostiene que el acúmulo de NrxCTF podría afectar a los niveles y/o la función de los componentes del sistema de Nrxs-Nlgn1 en una fase temprana, explicando los defectos en plasticidad sináptica y de memoria observada en pacientes. El mantenimiento crónico de estos defectos resultaría en la pérdida de sinapsis y neurodegeneración característicos de las fases tardías de la enfermedad. Nuestra hipótesis se basa en los siguientes hallazgos experimentales comentados arriba y resumidos a continuación. Hemos demostrado que la pérdida de función de PS resulta en el acúmulo del sustrato NrxCTF en terminales presinápticos de neuronas y de ratones modelos de la AD (Saura et al., 2011). Este acúmulo de NrxCTF aparece en una fase temprana asintomática que coincide con defectos en la liberación de neurotransmisor, pero que precede a los defectos de memoria y de neurodegeneración típicos de las fases tardías sintomáticas (Saura et al., 2011). Además, hemos demostrado recientemente que el acúmulo por si solo de NrxCTF, sin alterar el procesamiento del resto de sustratos de PS, reproduce los defectos en liberación de neurotransmisor debidos a la falta de función de PS en neuronas de hipocampo en cultivo (Servián-Morilla et al., 2018). Mutaciones en PS1 que ocasionan FAD impiden el procesamiento proteolítico de Nrxs, resultando en el acúmulo de NrxCTF (Bot et al., 2011; Saura et al., 2011). La asociación genética de genes de NRX (Martinez-Mir et al., 2013) y la identificación de mutaciones de pérdida de función en NLGN1 en pacientes de AD (Tristán-Clavijo et al., 2015) sugieren un papel de Nrx-Nlgn1 en pacientes. En conjunto, los datos del grupo sugieren que mutaciones en genes de PS causantes de FAD resultan en el acúmulo de NrxCTF en los terminales presinápticos de los pacientes. Dicho acúmulo podría ser la causa de los consiguientes defectos en la entrada de Ca2+, liberación de neurotransmisor y LTP característicos de las fases tempranas de falta de función de PS. Nuestra hipótesis postula que el mantenimiento crónico de la acumulación de NrxCTF en terminales
III. Materiales y Métodos 38 2. Generación de vectores de expresión de HA-NrxCTF 2.1. Generación del transgén CaMKII-HA-NrxCTF Esta construcción se creó para generar un modelo transgénico de ratón constitutivo. El transgén se generó a partir del vector pCDNA3 HA-NrxCTF, previamente producido en nuestro laboratorio (Servián-Morilla et al., 2018), siguiendo la siguiente estrategia de clonaje. El inserto HA-NrxCTF de 444 pb se liberó con digestión HindIII y EcoRI del vector pCDNA3 HA-NrxCTF y se clonó en el vector pNN265 (cedido por Dr. Ángel Barco, Instituto de Neurociencias de Alicante) en un sitio único EcoRV localizado en una posición 3’/5’ de un intrón 3’/señal de poliadelinación de SV40. El vector pNN265 se digirió con NotI y se aisló el fragmento que contiene HA-NrxCTF y el intrón 3’/señal de poliadenilación. Este fragmento se insertó en un sitio NotI localizado 3’ del promotor CaMKII en el vector pMM403 (11500 pb) (cedido por Dr. Ángel Barco, Instituto de Neurociencias de Alicante). Este plásmido contiene el promotor CaMKII (8500 pb), que será el que dirija la expresión de la proteína HA-NrxCTF. Para obtener el fragmento usado en la generación de ratones transgénicos, el vector pMM403-HA-NrxCTF se digirió con SfiI y se aisló el fragmento de 3500 pb que contiene el promotor CaMKII (7669 pb) y la secuencia codificante de HA-NrxCTF. 2.2. Generación del transgén TRE-HA-NrxCTF Esta construcción se creó para generar un modelo transgénico de ratón constitutivo. El transgén se generó a partir del vector pCDNA3 HA-NrxCTF, previamente producido en nuestro laboratorio (Servián-Morilla et al., 2018), siguiendo la siguiente estrategia de clonaje. Se amplificó la secuencia HA-NrxCTF de 452 pb por PCR con cebadores que contienen dianas para NheI y BsiWI. Este fragmento amplificado se incluye en pGEMT (Promega) y se liga con el plásmido LenLox Syn-Tet-off GFP (9143 pb)
III. Materiales y Métodos 39 (Gascón et al., 2008)que contiene el promotor inducible TRE y WPRE. De este plásmido eliminamos la secuencia correspondiente a GFP e incluimos en su lugar el inserto HA- NrxCTF con el uso de las enzimas NheI y BsrGI. Para obtener el fragmento usado en la generación de ratones transgénicos, el vector Syn-Tet-off-HA-NrxCTF se digerió con AvrII y PvuI y se aisló la secuencia objetivo que conforma el transgén y contiene el promotor TRE, WPRE y la secuencia codificante de HA-NrxCTF. 2.3. Microinyección pronuclear Los insertos TRE-HA-NrxCTF y CaMKII-HA-NrxCTF se insertaron en el genoma de ratones de la cepa FVB/N mediante microinyección pronuclear por el Servicio General de Producción y Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla. 3. Aspectos generales del trabajo con un modelo animal 3.1. Normativa del uso de animales de experimentación Todos los procedimientos con animales de experimentación realizados en esta Tesis Doctoral siguieron la normativa marcada por el Real Decreto 53/2013 en el que se establecen las normas básicas aplicables para la protección de los animales utilizados en experimentación y fueron llevados a cabo por personal cualificado. Los experimentos desarrollados se aprobaron por el Comité Ético para la Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla. La estabulación de animales se produjo en Centros de Experimentación Animal autorizados por la Consejería de Agricultura, Pesca y Medio Ambiente (ES410910008015 y ES410400008002). Los ratones se mantuvieron con una temperatura constante de 22±1°C, acceso ilimitado a comida y agua y en habitaciones con ciclos de luz/oscuridad de 12 horas cada uno, de acuerdo a las directrices europeas (Directiva 2010/63/EU).
III. Materiales y Métodos 40 Los animales destinados a la extracción de muestras de tejido se sacrificaron mediante dislocación cervical. En los casos indicados, el sacrificio se realizó mediante anestesia letal de Tiobarbital (Braun) por inyección intraperitoneal. 3.2. Población experimental del modelo animal CaMKII-HA-NrxCTF El modelo animal de ratones CaMKII-HA-NrxCTF procede del cruce de ratones transgénicos CaMKII-HA-NrxCTF con animales wild type, todos de la cepa FVB/N. Como control para los experimentos se utilizaron ratones wild type hermanos de camada. La identificación de los ratones se realizó mediante marcaje en los dedos. 3.3. Población experimental del modelo animal TRE-HA-NrxCTF; CaMKII- tTA El modelo animal inducible procede del cruce de ratones simples transgénicos TRE-HA-NrxCTF de la cepa FVB/N con ratones simples transgénicos CaMKII-tTA de la cepa C57BL/6J, generados estos últimos por Mayford et al. (1996) y cedidos a nuestro laboratorio por el Dr. Ángel Barco (Instituto de Neurociencias de Alicante). Estos ratones se cruzaron entre sí para obtener poblaciones de ratones dobles transgénicos TRE-HA- NrxCTF; CaMKII-tTA de la estirpe B6FVBF2/J. Como control se utilizaron ratones wild type, simples transgénicos TRE-HA-NrxCTF y simples transgénicos CaMKII-tTA hermanos de camada. La identificación de los ratones se realizó colocando micro-etiquetas codificadas en la oreja. 3.4. Extracción de DNA y genotipado de ratones El genotipado de los ratones se realizó mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, en sus siglas en inglés). Muestras de 1-2 mm del extremo de la cola o procedentes del marcaje en dedos, se incubaron durante 45 minutos a 95°C en 75 µl de solución A (25 mM NaOH, 0.2 mM EDTA) y, posteriormente, se neutralizaron con 75 µl de solución B (40 mM Tris-HCl, pH 5.5). Para la reacción de PCR se utilizaron
III. Materiales y Métodos 41 50 ng de DNA, la polimerasa GoTaq Flexi (Promega), nucleótidos (Promega) y las parejas de oligonucleótidos indicados en la Tabla 1. La reacción de PCR se realizó en el termociclador Veriti 96 well Thermal Cycler (Applied Biosystems), utilizando el siguiente programa: 3 minutos de desnaturalización a 94°C, 35 ciclos de desnaturalización (45 segundos a 94°C), hibridación (45 segundos a 58°C) y extensión (45 segundos a 72°C), con 7 minutos finales a 72°C. El producto resultante se migró en un gel al 1% de agarosa (Pronadisa) disuelta en TAE (40 mM Tris pH 7.6, 20mM ácido acético, 1 mM EDTA) teñido con 0.002% SYBR Safe DNA gel stain (Invitrogen), mediante electroforesis en el equipo Mupid-one (Takara). Tabla 1. Secuencias de las parejas de oligonucleótidos utilizadas para el genotipado de los ratones CaMKII- HA-NrxCTF, TRE-HA-NrxCTF y dobles transgénicos por PCR. 4. Técnicas bioquímicas para el análisis de proteínas 4.1. Análisis de proteínas mediante Western blot 4.1.1. Obtención de lisados a partir de tejido Los ratones se sacrificaron mediante dislocación cervical. Se separa la calota craneal para extraer el cerebro con una espátula. El tejido se introdujo en una placa de 6 cm de diámetro con tampón fosfato salino frío (PBS, por sus siglas en inglés) sobre hielo para inhibir la degradación del tejido. Bajo lupa se localizaron las estructuras
III. Materiales y Métodos 42 cerebrales de interés y se diseccionaron en el menor tiempo posible con pinzas de punta fina Dumont #5 (Fine Scientific Tools). El tejido diseccionado se guardó en tubos de microcentrífuga Eppendorf y se procesó inmediatamente o se congeló por inmersión en nitrógeno líquido. Las proteínas se extrajeron con buffer de lisis (Tris-HCl 50 mM pH 7.4, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM, Tritón X-100 1%, SDS 0.1%) suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (Complete Mini EDTA-free tablets, Roche). El volumen de buffer utilizado dependió de la estructura a lisar. Se realizó una disgregación mecánica del tejido utilizando un pistilo acoplado a un homogeneizador portátil a motor (VWR). Posteriormente, las muestras se homogeneizaron mediante 5-10 pases por una jeringa de insulina de 27G (BD). Los restos insolubles se descartaron mediante la centrifugación del lisado a 13000 rpm durante 10 minutos a 4°C. 4.1.2. Obtención de lisados a partir de cultivos celulares Las células sembradas en los pocillos se lavaron con PBS frío y tras retirarlo completamente se añadieron 100 µl de buffer de lisis (Tris-HCl 50mM pH7.4, NaCl 100mM, MgCl2 5mM, Tritón X-100 1%, SDS 0.1%) suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas. Tras 10 minutos en hielo, las muestras se homogeneizaron pasándolas 5-10 veces con una jeringa de insulina de 27G. Los restos insolubles se descartaron mediante la centrifugación del lisado a 13000rpm durante 10 minutos a 4°C. 4.1.3. Electroforesis de geles SDS-poliacrilamida y transferencia de proteínas Las muestras a analizar se equilibraron por concentración proteica total, cuantificada mediante el kit BCA (Thermo Fisher Scientific). El volumen de muestra necesario para obtener la cantidad de proteína requerida se diluyó en buffer de carga (concentración final: 180 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerol, 0.005% azul de bromofenol) y se añadió β-mercaptoetanol (BioRad) hasta una concentración final del 4% (568 mM). Las muestras se calentaron a 95°C durante 5 minutos para favorecer la desnaturalización de las proteínas. Los geles de SDS-Bis-Acrilamida para la separación de las proteínas se prepararon con un grosor de 1.5 mm y 10 carriles. Se usaron mezclas de acrilamida:bis-acrilamida
III. Materiales y Métodos 43 de 37.5:1 (BioRad) y 32:1 (Applichem). En la parte superior del gel se situó la solución apiladora (4% de acrilamida) y en la inferior la solución separadora (6-14% de acrilamida, según el peso molecular de las proteínas a testar). La electroforesis se realizó utilizando el sistema mini-Protean (Biorad) con buffer Tris-Glicina-SDS (25 mM tris, 192 mM glicina, 0.1% SDS) en el caso de la solución del ratio 37.5:1, con buffer Tris-Tricina-SDS (100 mM tricina, 0.1% SDS, pH 8.4) para el ratio 32:1. Las muestras preparadas y el marcador de peso molecular (bioBlu, gTPbio) se cargaron en los pocillos del gel y se aplicó una corriente constante de 100 V. Las proteínas separadas se transfirieron por transferencia húmeda (25 mM Tris, 192 mM Glicina, 20% metanol) a una membrana PVDF de 0.45 µm (Millipore) previamente activada con metanol puro, mediante la aplicación de una corriente de 300 mA durante 90 minutos. 4.1.4. Inmunodetección de proteínas en la membrana Para bloquear las uniones inespecíficas, se realizó una incubación durante 1 hora con 5% leche desnatada deshidratada en buffer Tris Salino-Tween (TBS-T) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 1% Tween, pH 7.4). Posteriormente, se incubó la membrana con el anticuerpo primario correspondiente diluido en solución de bloqueo (Apartado 8 de Materiales y Métodos) durante 1 hora a temperatura ambiente o toda la noche a 4°C, siempre en agitación. Tras realizar 3 lavados de 10 minutos con TBS-T, la membrana se incubó durante una hora con el anticuerpo secundario acoplado a la enzima peroxidasa HRP (Jackson Immunoresearch) (Apartado 8 de Materiales y Métodos) diluido 1:5000 en solución de bloqueo y, posteriormente, se lavó 3 veces durante 10 minutos. 4.1.5. Revelado, toma de imágenes y cuantificación La membrana se incubó con los reactivos Clarity (BioRad) o Supersignal-Femto (Thermo Fisher Scientific) durante 3-5 minutos y se detectó la quimioluminiscencia emitida utilizando el transiluminador IQ-LAS4000-mini Gold (GeneralElectrics). Se tomaron imágenes digitales seriadas con quimioluminiscencia acumulada cada 10 segundos hasta la saturación de la señal. Para cuantificar las imágenes obtenidas se usó el software Quantity-One (BioRad). Para ello, se seleccionaron tres imágenes no
III. Materiales y Métodos 44 saturadas con tiempo de exposición en incremento y se trazó un rectángulo del área de una banda a analizar. Esta área se clonó sobre las demás bandas de la imagen y sobre una región correspondiente a la señal inespecífica. Se cuantificó la suma de la intensidad de los píxeles dentro de cada área ajustada al fondo inespecífico. Este proceso se repitió para las exposiciones seleccionadas, clonando la disposición de las áreas de cuantificación y tomando como valor para hacer la estadística el promedio del valor de las tres imágenes seleccionadas. 4.2. Fraccionamiento subcelular de sinaptosomas Las muestras se mantuvieron en frío durante todo el proceso de la purificación. La región de interés (corteza, hipocampo, estriado) de 2-3 animales del mismo genotipo se homogeneizaron en 10 ml de buffer A (5 mM HEPES pH 7.4, 0.32 M sacarosa, 1 mM NaHCO3, 1 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2) suplementado con inhibidores de proteasas (Complete Mini EDTA-free tablets, Roche) y utilizando un homogeneizador de émbolo. Se reservó un 5% del volumen como lisado (fracción L). Tras centrifugar las muestras a 1400 g durante 10 minutos, se reservó el sobrenadante y se homogeneizó de nuevo el pellet con 4 ml de buffer A. El material homogeneizado se centrifugó a 710 g durante 10 minutos, se descartó el pellet y el sobrenadante se combinó con el volumen del paso anterior. La mezcla se centrifugó en un tubo de pared fina Ultra Clear de 17 ml (Beckman Coulter) durante 10 minutos a 13800 g en el rotor Sw32.1 Ti de la ultracentrífuga Optima L-100 XP (Beckman Coulter). Se guardó un 5% como sobrenadante (fracción SN) y se descartó el resto de la solución. El pellet se resuspendió en 3 ml de solución B (6 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.32 M sacarosa, 1 mM NaHCO3) suplementado con inhibidores de proteasas utilizando un homogeneizador de émbolo y, constituyendo la fase de membrana (fracción M). Se preparó un gradiente discontinuo de sacarosa en un tubo de pared fina Ultra Clear de 17 ml (Beckman Coulter), con concentraciones decrecientes de sacarosa (1.2M, 1 M y 0.85 M de sacarosa), sobre el que se vertió el homogeneizado obtenido en el paso previo. Se centrifugó a 82500g durante 2 horas en la ultracentrífuga. Se aspiró la banda correspondiente a los sinaptosomas entre las fases 1 y 1.2 M con un pipeteador automático acoplado a una pipeta pasteur de vidrio (Figura 16). Se guardó el 75% del volumen recuperado como fracción de sinaptosomas (fracción S). El 25%
III. Materiales y Métodos 45 restante se diluyó 1:1 en la solución C (12 mM Tris-HCl pH 8.0, 1% Tritón X-100) suplementado con inhibidores de proteasas, con la que se incubó durante 15 minutos para lisar los sinaptosomas. Las muestras se ultracentrifugaron a 32800g durante 1 hora. El sobrenadante obtenido supone la fracción presináptica (fracción Pre), mientras que el pellet, insoluble en Tritón X-100, se resuspendió mediante sonicación en buffer D (12 mM Tris-HCl pH 8.0, 1% NP-40) suplementado con inhibidores de proteasas, constituyendo la fracción postsináptica (fracción Post). Figura 16. Gradiente discontinuo de sacarosa en el que se indica la fracción de sinaptosomas purificada (S). 5. Técnicas para el análisis histológico 5.1. Perfusión transcardíaca y seccionado del tejido Los animales se anestesiaron con una dosis letal de Tiobarbital (Braun) mediante inyección intraperitoneal. Cuando alcanzaron una anestesia profunda, se realizó una perfusión transcardial con 50 ml de PBS y 50 ml de solución de fijación PFA (4% paraformaldehído en PBS, pH 7.4). El cerebro se extrajo y post-fijó mediante inmersión en solución PFA a 4°C durante una noche. En el caso de la inclusión en bloques de OCT, el cerebro fijado se deshidrató por inmersión en una solución del 30% de sacarosa en PBS durante 48-72 horas a 4°C. Posteriormente, se incluyó el cerebro en OCT líquido (Tissue-Tek, VWR) y se congeló sobre nieve carbónica. Los bloques se cortaron a 20 µm en criostato (Leica) y se mantuvieron hasta su uso en el congelador a -20°C incluidos en solución crioprotectora
III. Materiales y Métodos 46 (30% etilenglicol, 10% PBS 10X, 30% glicerol). En el caso de la inclusión en gelatina, el cerebro se mantuvo tras la extracción en etanol 70% hasta su procesamiento en el vibratomo haciendo secciones de 20 µm) y se mantuvieron a 4°C en PBS hasta su uso. 5.2. Inmunohistoquímica Primero, se realizó el desenmascaramiento antigénico por calor con solución de citrato sódico (10 mM citrato sódico, pH 6) a 80⁰C en un baño (TW 2.03, ELMI, cedido por el laboratorio del Dr. David Cano, Instituto de Biomedicina de Sevilla. El bloqueo de la actividad de la peroxidasa endógena se realizó incubando los cortes de tejido con 0.006% H2O2 y 0.02% metanol en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras 3 lavados de 5 minutos con PBS, se aplicó una solución de permeabilización-bloqueo (0.3% tritón X-100, 5% suero de cabra en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo primario anti-HA se diluyó en solución de bloqueo (0.1% tritón X-100, 5% suero de cabra, 1% BSA en PBS) y se incubó a 4°C durante toda la noche. Tras 3 lavados de 10 minutos con PBS, el tejido se incubó con el anticuerpo secundario biotinilado diluido en PBS-T (0.1% Tritón-X100 en PBS) durante 2 horas a temperatura ambiente (Apartado 6 Materiales y Métodos). Se realizaron 3 lavados de 10 minutos con PBS y el tejido se incubó 1 hora con avidina/biotina-HRP mediante el kit de tinción peroxidasa ABC (Vectastain). Se lavó 2 veces durante 15 minutos con PB 0.1 M pH 7.5 (81 mM HNa2O4P, 19 mM H2NaO4P) y se aplicó el sustrato diaminobenzidina (DAB) con potenciación de níquel (1% DAB, 0.05% sulfato amónico de níquel, 0.033% H2O2 en PB 0.1M pH7.5). Los tiempos de revelado fueron establecidos para cada anticuerpo en base al fondo y la señal de cada uno. Por último, las muestras se deshidrataron en una cadena de etanol (50-100%) y xilol, y se montaron con medio de montaje DPX (Merck). 5.3. Fluorescencia de tejido Los cortes de tejido se incubaron directamente con DAPI durante 15 minutos a una dilución de 1:1000 y a temperatura ambiente. Tras 3 lavados con PBS, las preparaciones se montaron con medio de montaje acuoso, Fluoromont-G (Southern Biotech).
III. Materiales y Métodos 47 5.4. Tinción de Nissl Para esta tinción se usó azul de toluidina (2g/L) en alcohol 70%. Cortes de tejidos montados en portaobjetos Superfrost Plus se dejan secar durante 12-14 horas. Los cortes se someten a deshidratación mediante una cadena ascendente de alcoholes (50% - 70% - 96% - 100%) y xilol, seguida de la hidratación del tejido mediante una cadena descendente de alcoholes (100% - 96% - 70% - 50%) y agua. La tinción con azul de toluidina se realiza durante 1.5 minutos. Los cortes teñidos se incuban con una nueva secuencia ascendente de alcoholes (50% - 70% - 96% - 100%) y xilol, y finalmente, se montan con medio de montaje DPX. En la adquisición y análisis de imágenes colaboraron Ana Santos, estudiante de grado, y Celia Cuevas, miembro actual del laboratorio. 5.5. Toma de imágenes y cuantificación Para la adquisición de imágenes de inmunohistoquímica se usó el microscopio BX- 61 (Olympus) con objetivos de 40x a 100x, dispuesto por el Servicio de Microscopía del Instituto de Biomedicina de Sevilla. Para la adquisición de superimágenes se empleó el microscopio BX-61 NewCAST (Olympus) con objetivos de 2 a 10x. Todas las imágenes se analizaron y cuantificaron con ayuda del software ImageJ, desarrollado por el National Institute of Health (NIH). 6. Inmunofluorescencia de células de cultivo Las células crecidas sobre cubreobjetos se fijan empleando una solución de tampón fosfato 0.1 M pH 7.4 con 4% paraformaldehído y 4% glucosa. Seguidamente, se realizan 3 lavados con PBS. Las muestras se permeabilizan y bloquean con PBS con 5% de suero de cabra y 0.05% Tritón X-100 durante 1 hora. Tras el bloqueo, las células se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos primarios diluidos en la misma solución de bloqueo (Apartado 8 Materiales y Métodos). Pasado este periodo de incubación se realizan tres lavados con PBS y se incuban las muestras durante 1 hora
III. Materiales y Métodos 54 7.6.3. Evitación activa El test consta de dos compartimentos de las mismas características que el descrito en el apartado 7.6.2., pero con la salvedad de que ambas habitaciones se presentan con paredes negras e iluminación ambiente. Tras un minuto de exploración libre por el aparato con la puerta comunicante abierta, el ratón se expone a 30 presentaciones de un estímulo luminoso y sonoro de 70 dB y 3000 Hz de 5 segundos. Si el ratón no cambia de compartimento en este tiempo, recibe una descarga eléctrica de 0.2 mA durante 25 segundos o hasta que se produzca el cambio de compartimento. El intervalo entre presentaciones es de 30 segundos y la prueba se realiza diariamente durante 5 días consecutivos. Se considera respuesta condicionada cuando el animal cambia de compartimento antes de recibir la descarga eléctrica, respuesta no condicionada cuando el animal cambia de compartimento tras recibir la descarga y respuesta nula cuando el animal no cambia de compartimento incluso después de recibir la descarga eléctrica (Figura 23). 7.6.4. Condicionamiento al miedo Para la realización de este test se adaptó el aparato usado en evitación pasiva y activa (apartados 7.6.2 y 7.6.3 de Materiales y métodos). Para ello se colocó una cámara en un ángulo en el que fuese visible todo el cubículo y que permitiera la cuantificación del test. El encargado de adaptar el test fue Francisco Martín, encargado del Servicio de Fenotipaje del Centro de Producción y Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla. Este test consta de tres fases (Figura 24). En una primera fase de condicionamiento se coloca al animal en la habitación durante dos minutos y se presenta un estímulo sonoro de 30 segundos, acompañado en los últimos 5 segundos de un descarga eléctrica de 0.2 mA. Este protocolo se repite tres veces. A las 24 horas, se coloca al ratón en la misma habitación por espacio de 5 minutos. Seguidamente, se extrae al ratón y se cambia el color de las paredes y la forma de la habitación empleando distintos paneles. Se re-introduce al ratón en la habitación y se presentan los tres estímulos sonoros, sin descarga eléctrica, de la fase de condicionamiento. El tiempo de freezing se cuantifica de imágenes grabadas como el tiempo en que el ratón permanece
III. Materiales y Métodos 55 inmóvil, a excepción del movimiento producido por la respiración. En el caso de realizar repeticiones del test en la misma población de ratones en tiempos distintos, el contexto y el estímulo sonoro se modificó en cada repetición. En el caso del estímulo sonoro, se empleó 80 dB a 3000 Hz en un caso y 65 dB a 2000 Hz en otro. El choque eléctrico siempre se mantuvo a 0.2 mA. Figura 23. Evitación activa. Esquema del protocolo usado en nuestras poblaciones de animales.
III. Materiales y Métodos 56 Figura 24. Test de condicionamiento al miedo. Esquema del protocolo que se siguió para nuestras poblaciones de animales. 8. Anticuerpos utilizados Durante esta Tesis Doctoral se han utilizado los siguientes anticuerpos: Tabla 3-1. Lista de anticuerpos primarios utilizados.
III. Materiales y Métodos 57 Tabla 3-2. Lista de anticuerpos primarios utilizados. Tabla 4. Listado de anticuerpos secundarios utilizados.
IV.RESULTADOS
IV. Resultados 59 1. Modelos transgénicos de sobreexpresión del fragmento C-terminal de Neurexinas Las PS, componentes catalíticos del complejo γ-secretasa, están mutadas con frecuencia en FAD. Las mutaciones en PS asociadas a FAD causan una pérdida parcial de actividad del complejo γ-secretasa, dando lugar al acúmulo de sus sustratos. En nuestro grupo se demostró que Nrxs es sustrato de PS y que su procesamiento tiene lugar en la sinapsis in vivo. Como consecuencia, el sustrato NrxCTF se acumula en terminales presinápticos de ratones PS cDKO que carecen de los genes PS1 y PS2 (Saura et al., 2011). Con el objetivo de evaluar selectivamente el impacto del acúmulo del NrxCTF in vivo sin afectar la función de PS hacia el resto de sustratos, diseñamos aproximaciones experimentales para la generación de modelos de ratón transgénicos de sobreexpresión de NrxCTF. La escisión del gen de PS1 en los ratones PS cDKO ocurre por una actividad Cre dependiente del promotor CaMKII. Por tanto, para dirigir la expresión exógena de NrxCTF a las mismas sinapsis de las mismas regiones cerebrales donde ocurre el acúmulo endógeno de NrxCTF en los ratones PS cDKO, nuestros diseños de transgénesis se basaron en expresión regulada por el promotor CaMKII. 1.1. Caracterización in vitro de vectores de expresión de HA-NrxCTF Previamente en el laboratorio se había generado un cDNA codificante para HA- NrxCTF que contiene un péptido señal en el extremo N-terminal, seguido de un epítopo HA y de la secuencia del C-terminal de Nrx1 humana desde el residuo 386 (Figura 25). Esta construcción simula el sustrato NrxCTF procesado por PS y recapitula los déficits en liberación presináptica producidos por la pérdida de actividad de PS en cultivos de neuronas (Servián-Morilla et al., 2018). El cDNA de HA-NrxCTF se clonó bajo el control del promotor CaMKII del vector
IV. Resultados 60 pMM403 (construcción CaMKII-HA-NrxCTF). El éxito de nuestra estrategia de transgénesis se basa en alcanzar niveles de expresión de HA-NrxCTF que sobrepasen la capacidad proteolítica de PS hacia este sustrato, resultando en su acúmulo. Debido a la actividad relativamente baja de los promotores específicos de tejido, como CaMKII, se podía prever desde un inicio unos niveles bajos de expresión por la construcción CaMKII- HA-NrxCTF. Por ese motivo, quisimos evaluar en paralelo los niveles de acúmulo de un sistema que, manteniendo la expresión neuronal, amplificase los niveles de expresión. Por ello, la secuencia HA-NrxCTF se clonó bajo el control del promotor inducible TRE del vector dual Syn-Tet-off (Gascón et al., 2008). El promotor TRE es inactivo en células eucariotas y necesita de la co-expresión del factor de transcripción tTA, que en el caso del vector dual Syn-Tet-off está regulada por el promotor neuronal de Sinapsina (Gascón et al., 2008). La expresión de HA-NrxCTF por los vectores CaMKII-HA-NrxCTF y Syn-Tet- off HA-NrxCTF se analizó en cultivos de células N2a y de neuronas hipocampales de rata (Figura 26). Como control positivo, los cultivos se transfectaron con el vector pCAG HA- NrxCTF que contiene el potente promotor de β-actina. En todos los casos, los cultivos se co-transfectaron con GFP. En experimentos de inmunofluorescencia con el anticuerpo anti-HA observamos mayores niveles de expresión de HA-NrxCTF con la construcción Syn-Tet-off HA-NrxCTF que con el vector CaMKII-HA-NrxCTF (Figura 26). Los niveles de HA-NrxCTF alcanzados por el vector Syn-Tet-off HA-NrxCTF fueron similares a los alcanzados por el vector pCAG HA-NrxCTF en las neuronas transfectadas. Por el contrario, los niveles de HA-NrxCTF con el vector CaMKII-HA-NrxCTF fueron muy bajos o prácticamente indetectables en estos experimentos (Figura 26). Figura 25. Esquema de la detección de la proteína HA-βNrx1 y HA-NrxCTF con los anticuerpos anti-HA y anti-Cyto-Nrx. SP: péptido señal, LNS: dominio homólogo a laminina/neurexina/globina de unión a hormonas sexuales, DTM: dominio transmembrana, HA: etiqueta HA con la que están marcadas las construcciones.
IV. Resultados 61 Figura 26. Detección de la proteína HA-NrxCTF en células transfectadas mediante inmunofluorescencia. A, Células N2a cotransfectadas con GFP y pCAG HA-NrxCTF como control, con CaMKII-HA-NrxCTF y con Syn- Tet-off HA-NrxCTF. Inmunoflurescencia con anticuerpo anti-HA. Escala de tamaño: 50 µm. B, Células de cultivo de neuronas hipocampales de rata cotransfectadas con GFP y pCAG HA-NrxCTF como control, y vectores CaMKII-HA-NrxCTF y Syn-Tet-off HA-NrxCTF. Inmunofluorescencia con anticuerpo anti-HA. Escala de tamaño: 200 µm, imagen magnificada: 25 µm. Resultados similares se obtuvieron en experimentos de Western blot de lisados de células N2a transfectadas con pCAG HA-βNrx1, pCAG HA-NrxCTF, CaMKII-HA-NrxCTF y Syn-Tet-off HA-NrxCTF. El vector Syn-Tet-off HA-NrxCTF produjo unos niveles de expresión de HA-NrxCTF de mayor magnitud que los niveles producidos por CaMKII-HA- NrxCTF, siendo éstos prácticamente indetectables con los dos anticuerpos ensayados
IV. Resultados 62 (anti HA y anti-Cyto-Nrx) (Figura 27). Figura 27. Expresión de la sobreexpresión de la proteína HA-NrxCTF en células N2a mediante Western blot. Western blot de células N2a transfectadas con pCAG HA-βNrx1, pCAG HA-NrxCTF, CaMKII-HA-NrxCTF y Syn-Tet-off HA-NrxCTF, tratadas o no con el inhibidor de la actividad γ-secretasa DAPT (5 µM). Los lisados se analizaron con los anticuerpos anti-HA y anti Cyto-Nrx. 1.2. Generación de ratones transgénicos de sobreexpresión constitutiva o inducible de la proteína HA-NrxCTF Los resultados obtenidos en cultivos celulares indicaron mayores niveles de expresión de HA-NrxCTF mediante el empleo de sistemas de amplificación. Por tanto, decidimos emplear una estrategia doble de transgénesis para asegurar el éxito de la sobreexpresión de NrxCTF in vivo (Figura 28). Un primer modelo de transgénesis simple basado en la construcción CaMKII-HA-NrxCTF. Un segundo modelo basado en la construcción TRE-HA-NrxCTF, que requiere generar ratones dobles transgénicos que coexpresen el factor de transcripción tTA. En este último caso, se decidió usar ratones transgénicos CaMKII-tTA desarrollados previamente por otros autores y usados en otros proyectos en nuestro grupo (Mayford et al., 1996). Una ventaja adicional de la expresión regulada por tTA es que permite controlar la expresión temporal del transgén con antibióticos del grupo de las tetraciclinas, como la Dox. Por tanto, la especificidad de tejido está determinada en ambos modelos por el promotor CaMKII, si bien el sistema de expresión inducible ofrece la posibilidad teórica de controlar el momento temporal
IV. Resultados 63 de inicio de la expresión y de revertir la expresión del transgén en la vida adulta. Figura 28. Esquema de la estrategia doble de transgénesis para la sobreexpresión de NrxCTF. A, Expresión constitutiva mediante la construcción CaMKII-HA-NrxCTF. B, Expresión inducible de HA- NrxCTF mediante el sistema Tet-off dirigido por el promotor CaMKII. Tras la generación de un primer ratón transgénico TRE-HA-NrxCTF se obtienen ratones dobles transgénicos mediante el cruce con ratones CaMKII-tTA. El factor de transcripción tTA se une al promotor TRE y activa la expresión de HA-NrxCTF. En cambio, en presencia de Dox esta unión se bloquea y la expresión de HA-NrxCTF se inhibe. El diseño de las construcciones para la generación de los modelos constitutivo e inducible de HA-NrxCTF basados en el promotor CaMKII está detallado en el apartado 2 de Materiales y Métodos de esta Tesis Doctoral. Los ratones transgénicos se generaron mediante microinyección en cigotos de ratones FVB/N y fue llevado a cabo por el Servicio de Producción Animal del Centro de Producción y Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla. En los apartados siguientes se describe la caracterización inicial de cada una de las líneas generadas en esta Tesis Doctoral. 1.3. Caracterización de la expresión de HA-NrxCTF in vivo en el modelo constitutivo CaMKII-HA-NrxCTF La presencia del transgén CaMKII-HA-NrxCTF en las líneas fundadoras se estudió mediante genotipación por PCR con dos parejas de cebadores que amplifican secuencias específicas dentro del transgén (Figura 29). Las parejas de cebadores utilizadas están contenidas en la tabla T1 del apartado 3.4. de Materiales y Métodos. Del total de los ratones obtenidos tras la microinyección, 4 fueron positivos para
IV. Resultados 70 Tabla 7. Regiones positivas para la expresión de la proteína HA-NrxCTF en ratones de las líneas NrxCTF.B y NrxCTF.C. *La amígdala forma parte del sistema límbico, junto con el hipocampo. Figura 34. Detección de la proteína HA-NrxCTF en la línea NrxCTF.B mediante inmunohistoquímica. A, Visión general de un corte de tejido de ratón control y un ratón NrxCTF.B. Escala: 500 µm. B, Hipocampo de un ratón NrxCTF.B. C, Vista magnificada de CA1 de hipocampo. D, Vista magnificada de CA3 de hipocampo. E, Vista magnificada del giro dentado de hipocampo. CA1, CA2, CA3: capas del hipocampo, GD: giro dentado, LMol: Stratum lacunosum moleculare, Rad: capa radiatum, Ctx: corteza, Slu: Stratum lucidum.
IV. Resultados 71 1.4.2. Control temporal de la expresión de HA-NrxCTF con doxiciclina en el ratón NrxCTF.B La expresión postnatal de HA-NrxCTF se analizó mediante experimentos de Western blot con el anticuerpo anti-HA. Observamos que el inicio de la expresión postnatal de HA-NrxCTF en lisados de corteza e hipocampo de la línea NrxCTF.B tiene lugar en la segunda semana tras el nacimiento y alcanza un nivel máximo de expresión en la tercera semana que se mantiene en la vida adulta (Figura 35A). Este patrón temporal de expresión postnatal es similar al observado para otra línea inducible generada en nuestro grupo (Rabaneda et al., 2014). Una de las grandes ventajas de usar el sistema inducible Tet-off es que permite el control temporal de la expresión del transgén. En nuestro interés por testar la posibilidad de apagar la expresión de la proteína exógena HA-NrxCTF, alimentamos a ratones adultos NrxCTF.B con dieta con Dox durante 9 días y analizamos el apagado del transgén mediante Western blot. Este tratamiento resultó en el apagado de la expresión de HA-NrxCTF en las diferentes regiones analizadas (corteza, hipocampo y estriado) (Figura 35B). Además, observamos que ratones adultos alimentados con Dox durante 9 días re-expresaban HA-NrxCTF al retirar la dieta con Dox (datos no mostrados). Estos datos mostraron la posibilidad de apagar y volver a encender la expresión de HA-NrxCTF en el cerebro adulto. Los experimentos anteriores mostraron el inicio de la expresión postnatal de HA- NrxCTF en los primeros días tras el nacimiento. Para analizar si podíamos retrasar el punto inicial de expresión de HA-NrxCTF en el cerebro adulto, se establecieron cruces entre ratones transgénicos simples alimentados con dieta con Dox. La dieta con Dox se mantuvo tras el parto en la madre lactante hasta el primer mes postnatal (P30). De este modo, la descendencia se mantuvo con dieta con Dox durante la vida embrionaria y postnatal temprana. En experimentos de Western blot de lisados obtenidos de estos ratones observamos que la expresión postnatal temprana del transgén se inhibe en las diferentes regiones de la línea NrxCTF.B. Sin embargo, la expresión de HA-NrxCTF se reestableció 15 días (P45) después de retirar la dieta a niveles similares de los ratones adultos NrxCTF.B mantenidos en ausencia de Dox (Figura 35C). Esta estrategia de
IV. Resultados 72 expresión temprana (No Dox, expresión temprana de HA-NrxCTF) o de expresión adulta (On Dox P<30, Off Dox P>30, expresión adulta de HA-NrxCTF) se empleará a lo largo de esta Tesis Doctoral para controlar el inicio temporal de la expresión de HA-NrxCTF. Figura 35. Control temporal de la expresión de HA-NrxCTF con Dox en la línea NrxCTF.B. A, Expresión postnatal en corteza e hipocampo analizados con el anticuerpo anti-HA mediante Western blot. B, Apagado de la expresión del transgén con Dox en corteza, hipocampo y estriado. C, Inicio de la expresión de HA- NrxCTF en el cerebro adulto tras el tratamiento con Dox desde el estado embrionario (E0) hasta el inicio del segundo mes de vida (P30) analizado con el anticuerpo anti-HA mediante Western blot. 1.4.3. Expresión sináptica de la proteína HA-NrxCTF en la línea NrxCTF.B Las Nrxs participan en la formación y función sinápticas a través de un mecanismo presináptico (Dean et al., 2003). Además, el acúmulo endógeno de NrxCTF ocurre en terminales presinápticos (Saura et al., 2011). Por ello, una vez que comprobamos la expresión de HA-NrxCTF en regiones cerebrales, quisimos analizar la localización subcelular de HA-NrxCTF in vivo. Para ello decidimos aplicar un protocolo de fraccionamiento subcelular. Este proceso consiste en la purificación de los terminales nerviosos (sinaptosomas) para posteriormente separar los componentes del terminal presináptico y postsináptico mediante técnicas bioquímicas. Analizamos por Western blot las diferentes fracciones obtenidas de ratones control y NrxCTF.B de muestras de corteza, hipocampo y estriado, normalizadas por igual cantidad de proteína. El
IV. Resultados 73 enriquecimiento de SNAP25 y de PSD95 en el terminal presináptico y postsináptico, respectivamente, confirmó la correcta separación de los dos terminales (Figura R36). Utilizando el anticuerpo anti-HA observamos un enriquecimiento selectivo de la proteína HA-NrxCTF en la fracción presináptica comparado con la postsináptica (Figura R36). Por tanto, la localización presináptica de HA-NrxCTF muestra la misma distribución que NrxCTF endógena (Saura et al., 2011). Además, estos resultados obtenidos mediante fraccionamiento de sinaptosomas van en la línea del patrón de expresión sináptica que observamos en experimentos previos por inmunohistoquímica (Figura 34). Figura 36. Localización presináptica de HA-NrxCTF en la línea NrxCTF.B. Fraccionamiento subcelular de sinaptosomas y análisis de HA-NrxCTF.B por Western blot con el anticuerpo anti-HA. Se muestran SNAP25 y PSD95 como marcadores de la fracción presináptica y postsináptica, respectivamente. Las fracciones analizadas son: L: lisado total, SN: material descartado, Mb: fracción de membrana, S: fracción de sinaptosomas, Pre: enriquecimiento presináptico, Post: enriquecimiento postsináptico. 1.4.4. Análisis de los niveles de expresión de proteínas relacionadas con PS en la línea NrxCTF.B Uno de los objetivos principales de nuestros modelos transgénicos es reproducir el acúmulo de NrxCTF sin afectar PS ni ningún otro componente del complejo γsecretasa. Del mismo modo, también se pretendía que el procesamiento de otros sustratos de PS no se viera afectado por el acúmulo selectivo de HA-NrxCTF. Para descartar un efecto del acúmulo de HA-NrxCTF en componentes del complejo γsecretasa, se realizaron experimentos de Western blot en muestras de corteza de
IV. Resultados 74 animales control (N=4) y animales de la línea NrxCTF.B (N=4) de 3 meses de edad. La presencia de HA-NrxCTF en estos lisados se confirmó con los anticuerpos anti-HA y anti- Cyto-Nrx. (Figura 37A). Los resultados muestran la presencia de una doble banda de misma movilidad con estos dos anticuerpos, siendo mayoritaria la banda de mayor movilidad frente a la banda de menor movilidad. La detección de una doble banda con cada anticuerpo sugiere que la misma secuencia del transgén HA-NrxCTF da lugar a dos bandas por mecanismos postraduccionales (Figura 37A). Con el fin de evaluar los niveles de expresión de proteínas asociadas al complejo γ-secretasa en estos ratones, decidimos analizar mediante Western blot los niveles de expresión de proteínas como Nicastrina y de las propias PS. Nicastrina es uno de los componentes del complejo γ-secretasa. Es una proteína transmembrana de tipo I que aparece para estabilizar a PS/γ-secretasa (Haapasalo y Kovacs, 2011). Los resultados obtenidos a partir de estos experimentos mostraron que no había diferencias significativas entre ratones control y ratones NrxCTF.B (Control: 1 ± 0.2249; NrxCTF.B: 1.196 ± 0.2935, p=0.6156) (Figura 37B). Para detectar PS1 usamos un anticuerpo que reconoce el NTF de PS1, de unos 30 kDa. No se observaron cambios en los ratones NrxCTF.B con respecto a los controles (Control: 1 ± 0.12; NrxCTF.B: 0.87 ± 0.07, p=0.4087) (Figura 37B). Esto indica que en nuestra línea inducible NrxCTF.B los componentes del complejo γ-secretasa como PS1 y Nicastrina no se ven afectados, cumpliendo así una de las premisas de nuestro modelo. Para testar si otros sustratos de PS se pudieran ver afectados por la sobrexpresión de HA-NrxCTF, evaluamos la expresión de N-Cadherina. De entre los distintos sustratos de PS seleccionamos N-Cadherina ya que, de forma similar a Nrxs, es de una proteína de adhesión que participa en la formación y mantenimiento de la sinapsis. En experimentos de Western blot con un anticuerpo que reconoce el dominio citoplásmico de N- Cadherina se observaron dos bandas, una de aproximadamente unos 120kDa, que correspondía a la proteína completa, y otra de 35 kDa, correspondiente al CTF de N- Cadherina. Las cuantificaciones no mostraron diferencias significativas en los niveles normalizados de N-Cadherina-CTF entre los ratones NrxCTF.B y los ratones control de la línea (FL, Control: 1.000 ± 0.0711; NrxCTF.B: 0.8777 ± 0.1602, p=0.5117. N-Cadherina- CTF, Control: 1.000 ± 0.01097; NrxCTF.B: 0.7390 ± 0.1228, p=0.1640. N-Cadherina-
IV. Resultados 75 CTF/FL: Control: 1.000 ± 0.1239; NrxCTF.B: 0.8554 ± 0.0718, p=0.3516) (Figura 37C). En conjunto, estos resultados indicaron que los niveles y la actividad general del complejo γ-secretasa hacia sus sustratos no está afectada en los ratones NrxCTF.B. Figura 37. Análisis de la expresión de proteínas relacionadas con PS en corteza de la línea NrxCTF.B de expresión temprana mediante Western blot. A, Análisis de la expresión de HA-NrxCTF con los anticuerpos anti-HA y anti-Cyto-Nrx. B, Análisis de la expresión de los componentes del complejo de la γ-secretasa, Nicastrina y PS1, y su cuantificación. C, Análisis de la expresión de la proteína sustrato de PS, N-Cadherina (N-Cadh), y su cuantificación. FL: proteína completa. CTF: fragmento C-terminal. Como control de carga se usó actina. N=4 controles, N=4 NrxCTF.B. Edad de los ratones: 3 meses. Análisis estadístico: t-test. Todas las barras de error son SEM.
IV. Resultados 76 1.4.5. Análisis de los niveles de acúmulo de HA-NrxCTF de la línea NrxCTF.B en comparación con el modelo APPsw/PS1ΔE9 A continuación nos interesó analizar si el nivel de acúmulo de HA-NrxCTF en nuestros modelos transgénicos se encuentra a niveles comparables del acúmulo endógeno de NrxCTF que ocurre en modelos de pérdida de función de PS. Aunque el acúmulo endógeno de NrxCTF lo habíamos analizado previamente en ratones PS cDKO (Saura et al., 2011), estos ratones no estaban a nuestra disposición en los momentos de realización de estos experimentos. Por ello, decidimos emplear ratones de la línea APPsw/PS1ΔE9 que sobreexpresan un mutante de deleción de PS1, además de la mutación sueca en APP asociada a AD (Jankowsky et al., 2004). Estos ratones se han empleado extensamente por la comunidad científica como modelo animal de AD. Para la realización de estos experimentos contamos con la colaboración del Dr. Javier Vitorica, catedrático de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Sevilla e investigador del IBiS, quien nos cedió las muestras de la línea APPsw/PS1ΔE9. Analizamos lisados de hipocampo de ratones APPsw/PS1ΔE9 y sus propios controles de 6, 12 y 18 meses y los comparamos con una muestra representativa de hipocampo de ratones NrxCTF.B de 6 meses. Cada muestra de la línea APPsw/PS1ΔE9 es un conjunto de 2-5 animales. Para poder comparar los niveles de acúmulo entre NrxCTF endógeno y exógeno se empleó el anticuerpo anti-Pan-Nrx que reconoce el dominio citoplásmico de ambas proteínas. De forma notable, NrxCTF se detecta en el hipocampo de ratones control de 18 meses, pero no de 6 meses, indicando que NrxCTF se acumula durante el envejecimiento normal (Figura 38). Además, el acúmulo endógeno de NrxCTF se incrementa 2-3 veces en lisados de hipocampo de ratones APPsw/PS1ΔE9 de 12 y 18 meses comparados con los controles de la misma edad (Control de la línea APPsw/PS1ΔE9: 6m: 1.000, 12m: 1.222, 18m: 2.791; APPsw/PS1ΔE9: 6m: 0.734, 12m: 2.663, 18m: 10.410; Control de la línea NrxCTF.B: 6m: 2.007; NrxCTF.B: 38.651) (Figura 38). El acúmulo de HA-NrxCTF en ratones adultos de la línea NrxCTF.B es 3.71 veces superior a los niveles de acúmulo presentados por ratones de 18 meses de la línea APPsw/PS1ΔE9 (Figura 38). El péptido Aβ se acumula masivamente en los ratones APPsw/PS1ΔE9 pero no en los
IV. Resultados 77 ratones NrxCTF.B, de acuerdo con que el procesamiento de PS hacia sus sustratos, APP en este caso, no se afecta en presencia de HA-NrxCTF (Figura 38). Por tanto, estos datos indican que nuestros abordajes resultan en un acúmulo moderado (3-4 veces) de HA- NrxCTF exógena comparado con el acúmulo endógeno producido por la pérdida de función de PS. Una comparación definitiva con los niveles y las regiones de acúmulo de NrxCTF requerirá el análisis de modelos de pérdida de función que no sobreexpresen alelos de PS1, como por ejemplo ratones PS cDKO (Saura et al., 2004, 2011). Figura 38. Comparación del acúmulo de HA-NrxCTF de la línea NrxCTF.B con el modelo transgénico APPsw/PS1ΔE9 mediante Western blot en lisados de hipocampo. Anticuerpos utilizados: anti-Pan-Nrx, anti- 82E1 (reconoce el péptido Aβ). Como control de carga se usó actina. Como conclusión general de estos abordajes podemos decir que hemos generado con éxito ratones transgénicos que acumulan selectivamente el sustrato de PS, NrxCTF, en el cerebro adulto sin actuar sobre la actividad general del complejo γ-secretasa. La localización subcelular en terminales presinápticos y los niveles de acúmulo de HA- NrxCTF se asemejan al acúmulo endógeno producido por la pérdida de función de PS/γsecretasa in vivo. El acúmulo selectivo de HA-NrxCTF y su control temporal con Dox hizo de los ratones NrxCTF un modelo ideal para ensayar los efectos en comportamiento y en supervivencia neuronal asociados a AD, como se menciona en los apartados siguientes.
IV. Resultados 78 2. Caracterización general de las líneas NrxCTF.B y NrxCTF.C del modelo inducible de ratón transgénico 2.1. Frecuencia genotípica en las líneas NrxCTF.B y NrxCTF.C Durante la caracterización de las líneas NrxCTF se observó una menor frecuencia de ratones dobles transgénicos, especialmente de la línea NrxCTF.C. Por ello, se decidió analizar en detalle la frecuencia genotípica de cada línea, NrxCTF.B y NrxCTF.C. De éstas se esperaban cuatro posibles genotipos con una frecuencia del 25%: wild type, simple transgénico TRE-HA-NrxCTF, simple transgénico CaMKII-tTA y doble transgénico NrxCTF (contiene ambos transgenes, TRE-HA-NrxCTF y CaMKII-tTA, dando lugar a la expresión de la proteína HA-NrxCTF). Para la línea NrxCTF.B de expresión temprana (ratones mantenidos en ausencia de Dox) (Figura 35A), se observó que la frecuencia de los ratones dobles transgénicos NrxCTF.B era inferior a la esperada, obteniéndose un 16 % y 17 % de ratones dobles transgénicos, en machos y hembras, respectivamente (N total mayor a 500 animales) (Figura 39B). El resto de genotipos presentó una frecuencia ligeramente superior a la esperada (Figura 39B). Esto datos nos sugirieron un posible efecto prenatal debido a la expresión del transgén que impedía que todos los ratones NrxCTF.B llegaran a término, reduciendo así a la frecuencia de ratones NrxCTF.B nacidos. Con el fin de analizar un posible impacto de la expresión prenatal del transgén, se establecieron cruces de ratones simples transgénicos (TRE-HA-NrxCTF; CAMKII-tTA) alimentados con Dox desde la gestación hasta el primer mes de vida del animal nacido (P30). En contraposición a los ratones de expresión temprana mantenidos en ausencia de Dox, el mantenimiento de la dieta con Dox durante la gestación y el desarrollo postnatal temprano induce el inicio de la expresión de HA-NrxCTF en el cerebro adulto (Figura 35C). Cuando estudiamos las frecuencias genotípicas en una población amplia de ratones (N total mayor a 190), observamos una recuperación de la frecuencia de los dobles transgénicos NrxCTF.B, incluso a valores ligeramente superiores a los esperados,
IV. Resultados 79 en detrimento de los ratones simples transgénicos (Figura 39B). Cuando se testó la frecuencia genotípica en una población de 54 animales de la línea NrxCTF.C, se observó un número de ratones dobles transgénicos muy inferior a la frecuencia esperada, siendo 0 % en machos y 8 % en hembras, y con una frecuencia anormalmente alta de los ratones wild type para ambos sexos (Figura 39C). Por tanto, se decidió seguir el mismo protocolo que con la línea NrxCTF.B y generar ratones NrxCTF.C de expresión adulta tratando a la población en cruce con Dox desde la gestación hasta P30. Este abordaje resultó en la recuperación de las frecuencias esperadas, incluso con una presencia de ratones NrxCTF.C machos más alta de la esperada en detrimento de nuevo de los ratones simples transgénicos. Debido a que la frecuencia de ratones NrxCTF.C con expresión temprana fue extremadamente baja, decidimos indagar la causa de la muerte prenatal. En una primera exploración para detectar el momento en el que tiene lugar la muerte en los ratones NrxCTF.C se genotiparon embriones a E16 (16 días de gestación). Se observó que de una camada de 8 embriones, 3 embriones fueron NrxCTF.C. Esta frecuencia es mucho más alta (37.5%) que la obtenida en animales nacidos con expresión temprana y presenta una frecuencia similar a la obtenida en la línea NrxCTF.C de expresión adulta (datos no mostrados). Por tanto, la muerte prenatal debe tener lugar entre E17 y P0. A partir de estos resultados, podemos concluir que posiblemente debe haber un efecto deletéreo de la expresión de HA-NrxCTF en el estado prenatal que hace que no toda la población de embriones dobles transgénicos NrxCTF.B y NrxCTF.C llegue a nacer, siendo un efecto mucho más acusado en la línea NrxCTF.C. La inhibición, por tanto, de la expresión prenatal de HA-NrxCTF evita la muerte embrionaria de los ratones NrxCTF de las dos líneas. 2.2. Índice de mortalidad de la línea NrxCTF.B Debido al descenso en la frecuencia de ratones NrxCTF al nacimiento, indicativo de una posible muerte embrionaria, decidimos estudiar la tasa de mortalidad tras el nacimiento.
IV. Resultados 86 Figura 42. Curvas de crecimiento de las líneas de inicio de la expresión temprana y adulta del ratón NrxCTF.B. A, Curva de crecimiento de ratones de la línea NrxCTF.B de expresión temprana. B, Curva de crecimiento de ratones de la línea NrxCTF.B de expresión adulta. (Continúa pie de figura →)
IV. Resultados 87 (←Continúa pie de figura) C, Representación de puntos de peso concreto. C1, Machos con 18 días de edad (P18) de expresión temprana donde ya se observan diferencias de peso del grupo NrxCTF.B con sus controles. C2 y C3, Puntos concretos de peso, comunes entre la línea NrxCTF.B con expresión temprana (C2) y adulta (C3). Test estadístico: One-way ANOVA, post-hoc Bonferroni. p value: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Todas las barras de error son SEM. 3.1. Análisis fenotípico de una población de la línea NrxCTF.B con inicio de expresión temprana 3.1.1. Cohorte de ratones para comportamiento En todas las pruebas de comportamiento que se exponen a continuación, utilizamos una población común de entre 10-15 ratones control y 9-10 ratones dobles transgénicos NrxCTF.B de expresión temprana. A esta población de ratones se le evaluó fenotípicamente en varios puntos de su vida desde los 3 hasta los 20 meses de edad. La diferencia de edad existente en la población estaba comprendida en un rango de 1 mes y medio. Cada vez que se realizan pruebas conductuales en serie en un mismo momento de edad, éstas se ordenaron de menos a más agresivas. 3.1.2. Evaluación general del estado del animal Para evaluar las funciones sensoriales autonómicas y musculares del ratón NrxCTF.B de expresión temprana, se realizaron una serie de pruebas primarias conocidas como batería de tests SHIRPA (Rogers et al., 1997) y recogidas en el apartado 7.2. de Materiales y Métodos de esta Tesis. En dicho análisis no se detectaron problemas asociados a los ratones dobles transgénicos NrxCTF.B al compararlos con sus controles hermanos de camada (no mostrado). Las pruebas de análisis general SHIRPA se repitieron previamente a cada batería de test, asegurándonos así de que los animales no presentaban ningún problema que causara un perjuicio en la realización de las pruebas y, por tanto, que pudiera dar lugar a errores en la caracterización fenotípica de la población.
IV. Resultados 88 3.1.3. Análisis de locomoción exploratoria 3.1.3.1. Test de campo abierto En esta prueba, el ratón a analizar se introdujo en una caja vacía de 45 x 45 cm y paredes opacas de metacrilato por un tiempo limitado. Este espacio abierto, permitió evaluar distintos parámetros relacionados con la locomoción del animal y con la ansiedad. Relacionados con la locomoción se analizaron la distancia total recorrida y la velocidad, mientras que relacionados con la ansiedad se registraron datos como el tiempo de estancia en el área central de la caja (25 x 25 cm) (véase protocolo en apartado 7.3.1. Materiales y Métodos). El test se repitió a la misma población de ratones desde los 3 a los 20 meses. Observamos que los ratones NrxCTF.B recorrían una distancia dos veces superior a la recorrida por los ratones control. Este efecto se observó en cada uno de los tiempos analizados, 3, 6, 12 y 20 meses (3 meses, Control: 4354.00 ± 479.10; NrxCTF.B: 9900.00 ± 1222.00, p=0.0001. 6 meses, Control: 5601.00 ± 586.00; NrxCTF.B: 10480.00 ± 1847.00, p=0.0108. 12 meses, Control: 5078.00 ± 547.00; NrxCTF.B: 9214.00 ± 1088.00, p=0.0017. 20 meses, Control: 5791.00 ± 506.80; NrxCTF.B: 10391.00 ± 1720.00, p=0.0061. Unidades: cm) (Figura 43D). El aumento en la distancia recorrida por los ratones NrxCTF.B se acompañó de un aumento de dos veces en la velocidad media (3 meses, Control: 8.25 ± 0.83; NrxCTF.B: 16.35 ± 1.31, p<0.0001. 6 meses, Control: 8.90 ± 1.07; NrxCTF.B: 15.40 ± 2.11, p=0.0080. 12 meses, Control: 5.58 ± 0.60; NrxCTF.B: 10.12 ± 1.19, p=0.0017. 20 meses, Control: 6.41 ± 0.56; NrxCTF.B: 11.49 ± 1.91, p=0.0062. Unidades: cm/s) (Figura 43E). Asimismo, los ratones NrxCTF.B permanecieron menos tiempo parados que los ratones control, al menos a los 3 meses de edad, el único punto analizado (Control: 52.23 ± 3.23; NrxCTF.B: 31.28 ± 4.22, p=0.0006. Unidades: porcentaje de tiempo parado respecto del tiempo total de test) (Figura 43F).
IV. Resultados 89 Figura 43. Test de campo abierto en la población NrxCTF.B de expresión temprana. A, Esquema de realización del test a lo largo de la vida de la población. Edad: 3, 6, 12 y 20 meses. B, Vista aérea del test. C, Recorrido representativo del ratón control y del ratón NrxCTF.B a 3 y 20 meses de edad. D, Distancia total recorrida. E, Velocidad media. F, Porcentaje de tiempo total de duración del test que el ratón permanece parado a 3 meses de edad. N=12-15 ratones control; N=9-10 ratones NrxCTF.B. Análisis estadístico utilizado: t-test. p value: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Todas las barras de error son SEM. Test realizado por: 3 meses, FM; 6; 12, 20 meses, ACSH; extracción de datos y análisis de los datos en todos los casos: ACSH. Por otro lado, debido a que los espacios abiertos generan ansiedad en los roedores, analizamos el número de entradas y el tiempo en el área central. En general no se observaron cambios en los ratones NrxCTF.B con respecto a los controles. El
IV. Resultados 90 número de entradas al centro no fue significativamente distinta a los 3, 6, 12 y 20 meses, observándose una tendencia al aumento en los ratones NrxCTF.B de 6, 12 y 20 meses (3 meses: Control: 32.69 ± 6.76, NrxCTF.B: 30.80 ± 7.12, p=0.8507; 6 meses: Control: 41.25 ± 6.12, NrxCTF.B: 82.22 ± 22.41, p=0.0603; 12 meses: Control: 35.75 ± 4.68, NrxCTF.B: 61.89 ± 15.52, p=0.0851; 20 meses: Control: 39.80 ± 5.80, NrxCTF.B: 60.10 ± 20.36, p=0.2693) (Figura 44A). El tiempo pasado en el centro fue similar entre los ratones control y los ratones NrxCTF.B, a excepción de una reducción a los 3 meses (3 meses, Control: 4.78 ± 0.82; NrxCTF.B: 2.26 ± 0.45, p=0.0218. 6 meses, Control: 9.54 ± 1.94; NrxCTF.B: 8.50 ± 1.91, p=0.7123. 12 meses, Control: 5.68 ± 0.54; NrxCTF.B: 8.02 ± 1.60, p=0.1370. 20 meses, Control: 5.94 ± 0.82; NrxCTF.B: 5.35 ± 1.55, p=0.7195. Unidades: porcentaje de tiempo en el centro respecto del total de duración del test) (Figura 44B). Estos datos sugieren que los ratones NrxCTF.B presentan hiperactividad motora en el test de campo abierto. Esta hiperactividad podría explicar la tendencia a incrementar el número de entradas al centro a partir de los 3 meses, que de esta forma normalizaría el tiempo total en el centro a pesar de la mayor velocidad que presentan los ratones NrxCTF.B. La robustez de los valores en las repeticiones del test indica que el aumento en la actividad motora es un hecho que acontece y se mantiene a lo largo de la vida del animal, fruto de la expresión del transgén HA-NrxCTF en el cerebro. 3.1.3.2. Laberinto elevado en cruz El laberinto elevado en cruz está conformado por cuatro brazos colocados en cruz, dos brazos abiertos enfrentados entre sí y dos cerrados enfrentados de igual forma. Los dos brazos abiertos crean un ambiente hostil para los roedores donde se sienten desprotegidos y los brazos cerrados otorgan un ambiente protector (protocolo en apartado 7.3.2. de Materiales y Métodos).
IV. Resultados 91 Figura 44. Test de campo abierto en la población NrxCTF.B de expresión temprana. A, Número de entradas a la zona central del campo abierto a 3, 6, 12 y 20 meses de edad en ratones NrxCTF.B de expresión temprana. B, Porcentaje de tiempo total que el animal pasa en la zona central del test. N=12-15 ratones control; N=9-10 ratones NrxCTF.B. Análisis estadístico utilizado: t-test. p value: *p<0.05. Todas las barras de error son SEM. Test realizado por: 3 meses: FM; 6, 12, 20 meses: ACSH; extracción y análisis de los datos: ACSH. Este test se realizó en la población NrxCTF.B con expresión temprana del transgén a los 3 meses de edad. A diferencia de los ratones control que entran más a los brazos cerrados, el número de entradas a los brazos abiertos está incrementado en los ratones NrxCTF.B al mismo nivel que las entradas a los brazos cerrados (Control: 21.05 ± 3.85; NrxCTF.B: 55.15 ± 8.66, p=0.0008. Unidades: porcentaje de entradas en los brazos abiertos respecto del total de entradas) (Figura 45C,D). En ratones NrxCTF.B el tiempo de estancia en los brazos abiertos fue mayor en comparación con sus hermanos de camada control (Control: 6.83 ± 1.97; NrxCTF.B: 42.07 ± 10.00, p=0.0008. Unidades: porcentaje de tiempo en los brazos abiertos respecto del total). Los ratones control pasan un mayor tiempo de estancia en los brazos cerrados. Los ratones NrxCTF.B presentan un tiempo de estancia similar en brazos abiertos
IV. Resultados 92 y cerrados mostrando la ausencia de preferencia por alguno de ellos. Sin embargo, los ratones control sí manifiestan una mayor preferencia por los brazos cerrados (Brazos abiertos, Control: 6.83 ± 1.97; NrxCTF.B: 42.07 ± 10.00. Brazos cerrados, Control: 93.17 ± 1.97; NrxCTF.B: 57.93 ± 10.00; p<0.0001. Unidades: porcentaje de tiempo en los brazos abiertos respecto del total) (Figura 45E). Sin embargo, la distancia total recorrida (Control: 1119.00 ± 79.75; NrxCTF.B: 899.10 ± 145.20, p=0.1743. Unidades: cm) (Figura 45F) y la velocidad (Control: 3.45 ± 0.30; NrxCTF.B: 3.04 ± 0.42, p=0.4115. Unidades: cm/s) (Figura 45G) fueron similares en ratones control y ratones NrxCTF.B, posiblemente debido al espacio tan restringido para el movimiento de este test comparado con el test de campo abierto. El incremento en el número de entradas y el tiempo transcurrido en los brazos abiertos, sin una afección en paralelo en parámetros motores, como distancia recorrida y velocidad, sugieren que los ratones NrxCTF.B presentan una menor aversión hacia los espacios abiertos. Figura 45. Laberinto elevado en cruz en la población NrxCTF.B de expresión temprana. A, Esquema con los momentos de la vida de la población en los que se realizó el test. Edad: 3 (Continúa pie de figura→)
IV. Resultados 93 (← Continúa pie de figura) meses. B, Vista superior del test durante una sesión. Se representa la zona de análisis del test: en amarillo, brazos cerrados; en rojo, brazos abiertos; en azul, zona central. C, Número de entradas en la zona abierta y a la zona cerrada. D, Entradas en los brazos abiertos con respecto del total de entradas. Expresado en porcentaje del total de entradas. E, Porcentaje de tiempo total en la zona abierta y cerrada. F, Distancia total recorrida. G, Velocidad media. N=13 ratones control; N=10 ratones NrxCTF.B. Análisis estadístico utilizado: C, E, one-way ANOVA con post-hoc Bonferroni; C, F, G, t-test. p-value: **p<0.01; ***p<0.001. Todas las barras de error son SEM. Test: FM; extracción de datos: FM y ACSH; análisis estadístico: ACSH. 3.1.4. Análisis de aprendizaje motor: Rotarod En este test se coloca al ratón en una barra conectada a un motor giratorio que rota a una velocidad creciente desde 4 a 40 rpm. El aprendizaje motor del animal se evalúa mediante 2-3 ensayos cada día repetidos durante 3-4 días. El tiempo de permanencia de los ratones sobre el cilindro constituye una medida de su coordinación y aprendizaje motor. Se midió la latencia de caída del animal como el valor promedio de las repeticiones de cada día o como la mejor medida diaria (protocolo en 7.4. de Materiales y Métodos). Este test se realizó a la edad de 3 y 6 meses en esta población NrxCTF.B de expresión temprana. Los resultados obtenidos mostraron una mayor latencia de caída en ratones NrxCTF.B con respecto a los controles, siendo significativo a los 3 meses de edad en los días 2 y 3 de test (3 meses, medida promedio, Día 1: Control: 68.49 ± 7.90; NrxCTF.B: 79.11 ± 5.91, p=0.334. Día 2, Control: 68.82 ± 8.89; NrxCTF.B: 104.44 ± 13.88, p=0.034. Día 3, Control: 80.90 ± 11.39; NrxCTF.B: 117.78 ± 12.18, p=0.043. Mejor medida, Día 1, Control: 80.54 ± 9.21; NrxCTF.B: 102.00 ± 7.21, p=0.105. Día 2: Control: 82.69 ± 13.04; NrxCTF.B: 130.67 ± 15.74, p=0.017. Día 3, Control: 99.31 ± 16.40; NrxCTF.B: 151.67 ± 13.82, p=0.017. Unidades: s) (Figura 46C,D). A 3 meses, los ratones NrxCTF.B muestran una mejora diaria significativa en la latencia de caída, mientras los controles presentaron una tendencia que no alcanzaba significancia. A la edad de 6 meses los ratones control presentaron una mejora significativa entre el primer y el cuarto día del test, mientras los ratones NrxCTF.B presentaron tiempos de latencia incrementados que no aumentaban más con las repeticiones del test (6 meses, Medida promedio, Día 1, Control: 159.96 ±
IV. Resultados 94 16.49; NrxCTF.B: 213.00 ± 24.72, p=0.079. Día 2, Control: 187.38 ± 22.72; NrxCTF.B: 235.39 ± 16.66, p=0.126. Día 3, Control: 186.96 ± 90.01; NrxCTF.B: 243.39 ± 20.63, p=0.123. Día 4, Control: 203.00 ± 25.86; NrxCTF.B: 219.89 ± 45.14, p=0.623. Mejor medida, Día 1, Control: 177.92 ± 17.03; NrxCTF.B: 246.78 ± 21.71, p=0.020. Día 2, Control: 202.58 ± 24.47; NrxCTF.B: 264.11 ± 12.49, p=0.057. Día 3, Control: 197.17 ± 88.87; NrxCTF.B: 264.33 ± 18.44, p=0.061. Día 4, Control: 213.58 ± 25.58; NrxCTF.B: 255.44 ± 45.14, p=0.212. Unidades: s) (Figura 46C,D). Aunque la interpretación de este test presentó limitaciones debido a la mejora no significativa del grupo control a 3 meses, los resultados apuntan a un aumento en la latencia de caída en los ratones NrxCTF.B. El hecho de que las repeticiones del test produzcan un incremento en la latencia de caída en los ratones NrxCTF.B sólo a 3 meses se podría deber a un “efecto techo” a los 6 meses. Figura 46. Test de Rotarod en la población NrxCTF.B de expresión temprana. A, Esquema donde se representan las edades a las que se realizó el test. Edad 3 y 6 meses. B, Imagen (Continúa pie de figura →)
IV. Resultados 95 (← Continúa pie de figura) del test Rotarod durante la realización del mismo. C, Latencia de caída media de los ensayos por día de la población a los 3 y 6 meses. D, Latencia de caída de la mejor medida del total de ensayos de cada día. N=12-13 ratones control; N=9-10 ratones NrxCTF.B. Análisis estadístico utilizado: twoway ANOVA con post-hoc Bonferroni. p value: *p<0.05; **p<0.01. Todas las barras de error son SEM. Test y extracción de datos, 3 meses: FM; 6 meses: ACSH. Análisis estadístico, 3 y 6 meses: ACSH. 3.1.5. Análisis de patrones repetitivos de comportamiento: test de acicalamiento En el test de acicalamiento (self-grooming) se cuantificó el tiempo que los ratones invierten realizando secuencias estereotipadas de acicalamiento y el número de eventos realizados. Un decremento de tiempo o eventos de acicalamiento denota una pérdida de estereotipias en el ratón. Este test se realizó a los 12 y 20 meses de edad. El ratón NrxCTF.B de expresión temprana presenta un decremento tanto en tiempo (12 meses, Control: 103.15 ± 20.90; NrxCTF.B: 33.01 ± 7.34, p=0.016. 20 meses: Control: 63.43 ± 12.00; NrxCTF.B: 30.05 ± 6.19, p=0.0436. Unidades: s) (Figura 47D) como en número de eventos (12 meses, Control: 3.83 ± 0.44; NrxCTF.B: 2.11 ± 0.35, p=0.009. 20 meses, Control: 3.33 ± 0.47; NrxCTF.B: 2.40 ± 0.40, p=0.176) (Figura 47E) de acicalamiento con respecto a los observados en los ratones control. También se detectó una reducción en el tiempo por evento de acicalamiento de los ratones NrxCTF.B en las dos edades ensayadas (12 meses, Control: 26.47 ± 3.31; NrxCTF.B: 13.64 ± 2.51, p=0.009. 20 meses: Control: 19.45 ± 2.89; NrxCTF.B: 12.14 ± 1.12, p=0.064. Unidades: s) (Figura 47C). Los resultados de este ensayo sugieren que los ratones NrxCTF.B reducen la frecuencia y la duración de comportamientos estereotipados como el acicalamiento. 3.1.6. Evaluación de la memoria Dentro del contexto de la AD, la evaluación de la memoria de los ratones NrxCTF.B era un aspecto importante. Para ello, se realizaron diversas pruebas a lo largo de la vida del animal, desde los 3 a los 20 meses, en las que se evaluó memoria a corto (MCP) y largo plazo (MLP) de diferentes tipos de memoria: memoria de trabajo, memoria
IV. Resultados 102 de las 5 sesiones se realiza un protocolo de 30 repeticiones consecutivas. En cada una de estas repeticiones se expone al animal al estímulo neutro durante 5 segundos, seguido inmediatamente de una descarga eléctrica que se presenta junto con el estímulo neutro durante 25 segundos adicionales o hasta que el animal cambia de compartimento. Los tipos de respuesta esperada son: respuesta condicionada, el animal cambia de compartimento antes de la descarga eléctrica; respuesta no condicionada, el animal cambia de compartimento tras la descarga; respuesta nula, el ratón no cambia de compartimento (protocolo en el apartado 7.6.3. de Materiales y métodos). La realización de este test a los 3 meses de edad mostró que el número de respuestas condicionadas aumentan de forma similar en los ratones control y NrxCTF.B (Día 1, Control: 4.38 ± 1.21; NrxCTF.B: 1.56 ± 0.52, p=0.1342. Día 2, Control: 13.23 ± 3.67, NrxCTF.B: 10.78 ± 3.59, p=0.4880. Día 3, Control: 19.15 ± 5.31; NrxCTF.B: 11.78 ± 3.93, p=0.0667. Día 4, Control: 17.00 ± 4.71; NrxCTF.B: 17.33 ± 5.78, p=0.9320. Día 5, Control: 22.08 ± 6.12; NrxCTF.B: 20.00 ± 6.67, p=0.5119) (Figura 51). Por tanto, los resultados obtenidos que los ratones NrxCTF.B a 3 meses de edad no presentaban defectos en el aprendizaje asociativo y en memoria emocional. 3.1.6.4. Condicionamiento al miedo Esta prueba es realizada para evaluar memoria contextual, aprendizaje asociativo entre un estímulo neutro y uno aversivo, y memoria emocional. En una primera fase de condicionamiento el animal se mantiene en un compartimento durante 2 minutos. Tras este tiempo recibe un estímulo sonoro de 30 segundos, acompañado en los últimos 5 segundos por descarga eléctrica, repitiéndose la presentación de este par de estímulos tres veces consecutivas. A las 24 horas se coloca al animal durante 5 minutos en el mismo contexto pero sin recibir ningún tipo de estímulo. Inmediatamente, se cambia el contexto del habitáculo, se reintroduce al animal y se le somete a las mismas tres presentaciones del estímulo sonoro pero sin descarga eléctrica. El tiempo de ausencia de movimientos (freezing) se cuantifica en cada ratón durante la habituación, la exposición al mismo contexto y al estímulo sonoro (protocolo en apartado 7.6.4. de Materiales y Métodos).
IV. Resultados 103 Figura 51. Test de evitación activa. A, Esquema de los momentos de la vida de la población en la que se realizó el test. B, Cuantificación del número de respuestas condicionadas. N=12 ratones control, N=9 ratones NrxCTF.B. Análisis estadístico: two-WAY ANOVA de medidas repetidas, post-hoc Bonferroni. p-value: ***p<0.0001. Todas las barras de error son SEM. Test y extracción de datos: FM; Análisis de datos: ACSH. Realizamos esta prueba en la población de animales de expresión temprana de la línea NrxCTF.B a los 20 meses de edad. El tiempo de freezing basal (representado en Figura 52B, tono 1) no presentó cambios entre los ratones control y NrxCTF.B (Control: 13.05 ± 3.46; NrxCTF.B: 19.46 ± 4.67, p=0.2732. Unidades: porcentaje de tiempo de freezing del total previo al choque eléctrico (25s)). La cuantificación del tiempo de freezing durante la fase del test dependiente de contexto mostró una tendencia hacia un menor freezing (38% menos) de los ratones NrxCTF.B con respecto a los controles (Control: 36.92 ± 5.82; NrxCTF.B: 22.90 ± 4.52, p=0.0936. Unidades: porcentaje de tiempo de freezing del total de la duración del test) (Figura 52C). Con respecto a la fase del test dependiente del estímulo sonoro observamos un tiempo de freezing significativamente menor en los ratones NrxCTF.B de 20 meses (50% menos) que sus hermanos controles (Control: 49.96 ± 7.84; NrxCTF.B: 25.05 ± 5.52, p=0.0282. Unidades: porcentaje de tiempo de freezing del total de la duración del test) (Figura 52D). Estos resultados evidenciaron deterioro en la memoria emocional, aprendizaje asociativo y memoria contextual en ratones NrxCTF.B de 20 meses.
IV. Resultados 104 Figura 52. Prueba de condicionamiento al miedo en una población NrxCTF.B de expresión temprana. A, Esquema de los momentos de la vida de esta población en los que se realizó el test. Edad: 20 meses. B, Fase de condicionamiento. El tono 1 de esta fase se considera como freezing basal, ya que es el propio del animal antes de haber recibido ningún estímulo aversivo. C, Cuantificación del freezing total en la fase de test de memoria contextual. D, D1, Cuantificación del freezing del animal en los tonos 1, 2, 3 y D2, freezing total en las 3 repeticiones (tonos 1+2+3) durante la fase de test dependiente de sonido. N=13 controles, N=9 dobles transgénicos NrxCTF.B. Análisis estadístico: t-test. p-value: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Todas las barras de error son SEM. Test realizado por FM. Extracción de datos: CMC. Análisis de datos: ACSH. 3.1.7. Análisis del comportamiento en la línea NrxCTF.B con expresión temprana de HA-NrxCTF tras el tratamiento con Dox Tras realizar esta batería de test de comportamiento a los ratones control y a los ratones NrxCTF.B de expresión temprana, decidimos evaluar en esta misma población los efectos del apagado del transgén HA-NrxCTF. Para ello, los ratones control y NrxCTF se alimentaron con Dox y se realizaron diferentes pruebas de comportamiento que se
IV. Resultados 105 iniciaron a los 25 días de tratamiento y se extendieron durante 30 días adicionales, manteniendo siempre la dieta con Dox. La inhibición de la expresión de HA-NrxCTF en la distintas regiones cerebrales se confirmó por Western blot en ratones NrxCTF.B de la misma edad tratados en paralelo a los animales de la población de comportamiento (Figura 53). Figura 53. Apagado de la expresión tras el tratamiento con Dox mediante Western blot. Se analizaron los niveles de expresión con los anticuerpos anti-HA y anti-Cyto-Nrx. Para la realización de las pruebas, se seleccionaron aquéllas en las que habíamos obtenido resultados relevantes en locomoción (test de campo abierto), estereotipias (test de acicalamiento) y memoria (prueba de condicionamiento al miedo). Para intentar evitar un efecto de la repetición en la prueba de condicionamiento al miedo, se modificó el contexto y la intensidad y frecuencia del sonido (detallado en apartado 7.6.4. de Materiales y Métodos). La mayor actividad motora de los ratones NrxCTF.B con respecto a los controles se mantuvo tras el tratamiento con Dox, mostrando un aumento al doble en la distancia recorrida (Control: 3822 ± 585.80; NrxCTF.B: 9411 ± 1676, p=0.0023. Unidades: cm) y en velocidad media (Control: 4.23 ± 0.65; NrxCTF.B: 10.43 ± 1.86, p=0.0023. Unidades: cm/s) (Figura 54B). El número de entradas (Control: 27.58 ± 6.43; NrxCTF.B: 54.11 ± 18.80, p=0.1523) y el tiempo de estancia en la zona central del test (Control: 4.93 ± 1.11; NrxCTF.B: 7.68 ± 1.89, p=0.2008. Unidades: porcentaje de tiempo del total de la duración del test en la zona central) mostraron una tendencia al incremento en los ratones NrxCTF.B (Figura 54B). Con respecto al test de acicalamiento, se observó una tendencia al descenso en el tiempo total y en el tiempo por evento, así como una normalización en el número de eventos en los ratones NrxCTF.B respecto a los ratones control (Figura 54C). Al comparar
IV. Resultados 106 estos datos con los datos obtenidos de ratones de 20 meses, el punto ensayado más cercano previo al tratamiento, observamos valores similares en los ratones control (Figura 47). Sin embargo, las diferencias de los ratones NrxCTF.B tratados con Dox respecto a los controles fueron de menor magnitud tras el tratamiento (Figura 54C). La repetición del test de condicionamiento al miedo tras el tratamiento con Dox mostró valores similares de freezing en los ratones control y NrxCTF durante el condicionamiento (latencia basal, Control: 31.88 ± 4.74; NrxCTF.B: 21.06 ± 3.99, p=0.1068. Unidades: porcentaje de freezing del tiempo total previo al choque (25s)). En la fase de memoria contextual, no hubo diferencias significativas entre los ratones control y NrxCTF.B, aunque se mantuvo la misma tendencia a la reducción previa al tratamiento (Control: 37.18 ± 6.15; NrxCTF.B: 28.54 ± 6.62, p=0.3527. Unidades: porcentaje de freezing del tiempo total de estímulo sonoro) (Figura R33D). Además, el porcentaje de freezing fue similar en ambos grupos respecto a la misma fase previa al tratamiento con Dox. En la fase de test dependiente de sonido obtuvimos que los ratones NrxCTF.B presentaron una tendencia a la reducción en el porcentaje de freezing respecto al de sus hermanos control, sin alcanzar significancia (Control: 39.34 ± 7.68; NrxCTF.B: 27.89 ± 5.74, p=0.2605. Unidades: porcentaje de tiempo total de estímulo sonoro). Al comparar estos valores con los obtenidos en la misma fase antes de tratamiento, se observó que no había diferencias significativas entre los animales antes y después del tratamiento con Dox. Estos datos iniciales sugieren que la resolución del acúmulo de NrxCTF en edades avanzadas no supone una mejora en los distintos aspectos estudiados. 3.1.8. Resumen del comportamiento de la línea NrxCTF.B de expresión temprana de HA-NrxCTF A continuación se exponen de manera resumida los datos obtenidos a lo largo del tiempo en las pruebas más relevantes realizadas en la población NrxCTF.B de expresión temprana (Figura 55). Los datos obtenidos a partir de la realización de esta batería de pruebas indicaron que la expresión de NrxCTF en el cerebro desde las etapas más iniciales del desarrollo favorece la aparición de alta locomoción en el ratón, una reducción en el tiempo de acicalamiento, un mayor tiempo en los brazos abiertos del
IV. Resultados 107 Figura 54. Batería de test realizada a la población NrxCTF.B de expresión temprana tras el tratamiento con Dox. A, Esquema de los momentos de la vida de esta población en los que (Continúa pie de figura →)
IV. Resultados 108 (←Continúa pie de figura) se realizaron los tests. Edad: 25 meses. B, Test de campo abierto. De izquierda a derecha: cuantificación de la distancia total recorrida, de la velocidad media, del número de entradas a la zona central del test y del porcentaje de tiempo pasado en la zona central respecto de la duración total del test. C, Prueba de acicalamiento. De izquierda a derecha: cuantificación del tiempo de acicalamiento por evento, cuantificación del tiempo y cuantificación del número de eventos de acicalamiento ocurridos durante el test. D, Prueba de condicionamiento al miedo. D1, Cuantificación del freezing durante la fase de condicionamiento. D2, Cuantificación del freezing durante la fase dependiente de contexto comparado con el freezing presentado antes del tratamiento con Dox. D3, Cuantificación del freezing del animal en los tonos 1, 2, 3 en la fase de test dependiente de sonido. D4, Freezing total en las 3 repeticiones (tonos 1+2+3) durante la fase de test dependiente de sonido comparado con el freezing presentado antes del tratamiento con Dox. N=11 controles, N=9 dobles transgénicos NrxCTF.B. Análisis estadístico: t-test. p-value: p*<0.05. Todas las barras de error son SEM. Test de campo abierto y de acicalamiento: Realizado por: ACSH, Extracción y análisis de datos: ACSH. Condicionamiento al miedo: Realizado por: FM, Extracción de datos: CMC, Análisis de datos: ACSH. laberinto elevado en cruz y defectos en la memoria dependiente del sonido evaluada en el test de condicionamiento al miedo. Sin embargo, los ratones no presentaron defectos en MCP y MLP en el test de reconocimiento de objetos. En ratones envejecidos, el tratamiento de Dox no produce una mejora en las pruebas evaluadas a pesar del apagado efectivo del acúmulo de NrxCTF. 3.2. Caracterización fenotípica del comportamiento en la línea NrxCTF.B con expresión adulta de HA-NrxCTF 3.2.1. Cohorte de animales para comportamiento En todas las pruebas de comportamiento que se exponen a continuación utilizamos una población común de la línea NrxCTF.B de inicio de expresión adulta (P>30). Los grupos experimentales estaban compuestos de 10-12 ratones control y 10 ratones NrxCTF.B. Esta población de ratones se caracterizó fenotípicamente en varios puntos de su vida desde los 3 hasta los 16 meses de edad. El rango de edad de la población fue de 3 meses. Para poder comparar entre experimentos, las pruebas realizadas en esta población de animales siguieron el mismo protocolo que las realizadas
IV. Resultados 109 Figura 55. Tabla resumen de los test de mayor relevancia realizados en la población NrxCTF.B de expresión temprana. A, Momentos de la vida de la población en la que se realizó (Continúa pie de figura →)
IV. Resultados 110 (← Continúa pie de figura) algún test. B, Distancia y velocidad en el Test de campo abierto a 3, 6, 12, 20 (sin tratamiento con Dox) y 25 meses (con tratamiento con Dox). C, Entradas en brazos abiertos del total de entradas (%) del laberinto elevado en cruz a 3 meses. D, Tiempo invertido por evento de acicalamiento en el test de acicalamiento. E, Porcentaje de freezing dependiente de contexto y de sonido en la prueba de condicionamiento al miedo. F, Tabla resumen de los test que se realizaron a cada edad a la población de ratones. para la caracterización fenotípica de la población NrxCTF.B de expresión temprana. El objetivo general de estos experimentos fue doble. Por una parte, determinar si los efectos producidos por NrxCTF en la vida adulta dependían del momento de inicio de su acúmulo. En segundo lugar, nos interesó determinar la posible existencia de una fase asintomática tras iniciar el acúmulo de NrxCTF en el cerebro adulto. 3.2.2. Evaluación general del estado del animal Al igual que con la población NrxCTF.B de expresión temprana, las funciones sensoriales autonómicas y musculares del ratón se evaluaron por una batería de pruebas primarias SHIRPA (Rogers et al., 1997) recogidas en el apartado 7.2. de Materiales y Métodos de esta Tesis Doctoral. En dicho análisis no se detectaron problemas asociados a los ratones control o a los ratones NrxCTF.B de expresión adulta. 3.2.3. Análisis de locomoción exploratoria 3.2.3.1. Test de campo abierto En el análisis de este test en la población NrxCTF.B de expresión adulta no observamos diferencias entre grupos en ninguno de los parámetros evaluados a los 4 meses de edad, pero sí aparecieron diferencias en animales de 7 meses de edad. Los ratones NrxCTF.B de 7 meses presentaron un aumento significativo de 1.65 veces en distancia (4 meses, Control: 6263 ± 342.70; NrxCTF.B: 6588 ± 1181, p=0.7779. 7 meses, Control: 5593 ± 352; NrxCTF.B: 9227 ± 1367, p=0.0112. Unidades: cm) y un aumento similar de 1.65 veces en la velocidad (4 meses, Control: 6.96 ± 0.38; NrxCTF.B: 7.32 ± 1.32, p=0.7780. 7 meses, Control: 6.20 ± 0.39; NrxCTF.B: 10.22 ± 1.52, p=0.0115.
IV. Resultados 111 Unidades: cm/s) (Figura 56C,D) con respecto a sus controles. Cuando se evaluó a la población a 13 meses de edad se observó una tendencia al incremento en la distancia y velocidad de los ratones NrxCTF.B (Distancia, Control: 6554 ± 650; NrxCTF.B: 9652 ± 1958, p=0.1351. Unidades: cm. Velocidad, Control: 7.20 ± 0.72; NrxCTF.B: 10.60 ± 2.17, p=0.1380. Unidades: cm/s). Con respecto a las visitas a la zona central del test y el tiempo de estancia en este área, a los 4 meses no hubo diferencias entre grupos, pero sí aparecieron a partir de los 7 meses (Visitas a la zona central: 4 meses, Control: 48.50 ± 4.94; NrxCTF.B: 50.00 ± 7.75, p=0.8677. 7 meses, Control: 47.83 ± 5.72; NrxCTF.B: 98.10 ± 17.41, p=0.0078. 13 meses, Control: 58.00 ± 9.87; NrxCTF.B: 101.7 ± 32.64, p=0.1978. Tiempo en el centro: 4 meses, Control: 8.55 ± 1.20; NrxCTF.B: 14.21 ± 4.50, p=0.2024. 7 meses, Control: 7.00 ± 1.23; NrxCTF.B: 15.11 ± 2.83, p=0.0113. 13 meses, Control: 9.51 ± 1.79; NrxCTF.B: 14.35 ± 3.37, p=0.2096. Unidades: porcentaje de tiempo en la zona central respecto de la duración total del test) (Figura 56E,F). Mientras los animales control mantuvieron valores parecidos en distancia recorrida y velocidad a 4, 7 y 13 meses, los ratones NrxCTF.B presentaron a 7 meses un aumento de 1.4 veces en distancia y velocidad con respecto a los valores que ellos mismos presentaron a 4 meses de edad (Figura 56C,D). Debido a que los ratones NrxCTF.B de expresión adulta comienzan a acumular NrxCTF en el cerebro a partir del segundo mes de vida, estos datos indican una fase asintomática de al menos 3 meses que precede a la hiperactividad motora de estos animales. Estos resultados apuntan a que el tratamiento con Dox para apagar la expresión de HA-NrxCTF en la edad más temprana del desarrollo tiene como consecuencia un retraso en la aparición del fenotipo de alta actividad característico de los ratones NrxCTF.B con expresión temprana (Figura 43). 3.2.3.2. Laberinto elevado en cruz Esta prueba se realizó a los 16 meses de edad en la población NrxCTF.B de inicio de la expresión adulta. Como era de esperar, los ratones control entraron más veces en los brazos cerrados del test. Sin embargo, los ratones NrxCTF.B perdieron esa preferencia y presentaron un número de entradas similar a los brazos abiertos y cerrados del mismo (Control: 37.46 ± 4.74; NrxCTF.B: 50.59 ± 5.04, p=0.0720. Unidades:
IV. Resultados 118 Figura 60. Prueba de memoria de reconocimiento de objetos. A, Esquema de las edades a las que se realizó el test en la población NrxCTF.B de expresión adulta (4 y 7 meses). B, Visión superior del test durante las tres fases: presentación del objeto familiar, memoria a corto plazo (3 horas), memoria a largo plazo (24 horas). C, Índice de memoria a corto plazo. D, Índice de exploración a corto plazo. Suma de la interacción total con los dos objetos. E, Índice de memoria a largo plazo. F, Índice de exploración a largo plazo. N=12 ratones control; N=10 ratones NrxCTF.B. Análisis estadístico utilizado: t-test. p-value: *p<0,05; **p-value<0.01. Todas las barras de error son SEM. Test, extracción y análisis de datos: ACSH.
IV. Resultados 119 4. Caracterización conductual del ratón NrxCTF.C 4.1. Cohorte de animales para comportamiento Para hacer una primera exploración del fenotipo de esta línea, se utilizó una población común de 7 ratones control y 7 ratones dobles transgénicos NrxCTF.C de expresión adulta. El rango de edad de la población estaba comprendido en 3 semanas. 4.2. Evaluación general del estado del animal Para evaluar el estado general del animal, al igual que se hizo en poblaciones anteriores, se realizó una batería de pruebas SHIRPA (Rogers et al., 1997) recogidas en el apartado 7.2. de Materiales y Métodos de esta Tesis. En dicho análisis no se detectaron problemas asociados a los ratones NrxCTF.C de expresión adulta. 4.3. Análisis de locomoción exploratoria: test de campo abierto En una primera aproximación quisimos testar si en la línea NrxCTF.C de expresión adulta se observaban los mismos efectos que en la línea NrxCTF.B de expresión adulta. Por ello, realizamos el test de campo abierto a 3 meses de edad. Los datos obtenidos mostraron valores similares entre el grupo control y los ratones NrxCTF.C en distancia (Control: 5016 ± 362; NrxCTF.C: 5751 ± 1196, p=0.5675. Unidades: cm) y velocidad media (Control: 5.57 ± 0.41; NrxCTF.C: 6.39 ± 1.33, p=0.5683. Unidades: cm/s). También se observaron valores similares en el número de entradas a la zona central (Control: 43.71 ± 4.53; NrxCTF.C: 35.29 ± 7.22, p=0.3424) y el tiempo de estancia en la zona central (Control: 9.98 ± 1.36; NrxCTF.C: 6.29 ± 1.20, p=0.0646. Unidades: porcentaje de tiempo en la zona central con respecto a la duración total del test) (Figura 62). Al comparar estos resultados con los resultados obtenidos en el test de campo abierto en la población NrxCTF.B de expresión adulta de edad parecida (4 meses), observamos que los valores en todos los parámetros analizados son prácticamente idénticos para las líneas NrxCTF.B y NrxCTF.C. Debido a que las regiones de expresión de HA-NrxCTF en las líneas NrxCTF.B
IV. Resultados 120 y NrxCTF.C son diferentes, sería interesante continuar el fenotipaje de esta población y estudiar la evolución en el comportamiento tanto en este test como en una más amplia batería de pruebas conductuales. Figura 61. Tabla resumen de los test de mayor relevancia realizados en la población NrxCTF.B de expresión adulta. A, Momentos de la vida de la población en la que se (Continúa pie de figura →)
IV. Resultados 121 (←Continúa pie de figura) realizaron las pruebas (4, 7, 13 y 16 meses). B, Distancia y velocidad en el test de campo abierto a 4, 7 y 13 meses. C, Entradas en brazos abiertos del total de entradas (%) del laberinto elevado en cruz a 16 meses. D, Tiempo invertido por evento de acicalamiento en el test de acicalamiento a 4, 7 y 13 meses. E, Tabla resumen de los test que se realizaron a cada edad en esta población de ratones. Figura 62. Test de campo abierto en la población NrxCTF.C. A, Esquema mostrando el momento de la vida del ratón de realización del test (3 meses). B, Vista superior de la arena. C, Distancia total recorrida. D, Velocidad media durante el test. E, Número de entradas a la zona central del test. F, Tiempo pasado por el ratón en la zona central expresado en porcentaje de tiempo total. N=7 controles, N=7 ratones NrxCTF.C. Análisis estadístico: t-test. Todas las barras de error son SEM. Test, extracción y análisis de datos: ACSH. 5. Posibles mecanismos afectados en el modelo transgénico de ratón NrxCTF.B 5.1. Análisis de neurodegeneración y pérdida neuronal 5.1.1.Neurodegeneración El cerebro adulto (3 meses) de ratones NrxCTF.B de expresión temprana presentó una reducción de peso de un 14% (Figura 63A). Debido a esto, se decidió ahondar en el estudio de la morfología del cerebro de la línea de ratones NrxCTF.B de expresión
IV. Resultados 122 temprana y adulta. Para ello se usó la tinción de Nissl. Esta técnica permite adquirir medidas morfológicas de diversas regiones del cerebro donde tiene expresión el transgén HA-NrxCTF. Por la relevancia en memoria y en la AD, nos interesamos por el hipocampo y las subregiones que lo componen, Cornu Ammonis (CA: CA1, CA2, CA3) y GD. En la población NrxCTF.B de expresión temprana observamos una reducción significativa en el área total del hipocampo a los 3 meses de edad (Control: 2.98·106 ± 0.10·106; NrxCTF.B: 2.20·106 ± 0.03·106, p=0.0175. Unidades: µm2). Esta reducción estaba asociada a una tendencia a la disminución en el área del GD de los ratones NrxCTF.B, mientras que el área de la región CA no presentó cambios (GD, Control: 0.80·106 ± 0.07·106; NrxCTF.B: 0.40·106 ± 0.09·106, p=0.0698. CA, Control: 1.83·106 ± 0.08·106; NrxCTF.B: 1.60·106 ± 0.10·106, p=0.2069. Unidades: µm2) (Figura 63D). Al tratarse AD de una condición asociada al envejecimiento, nos resultó interesante estudiar la evolución temporal de los efectos visualizados en el hipocampo de ratones NrxCTF.B de 3 meses. Para ello, analizamos la morfología del hipocampo de ratones de la línea NrxCTF.B de expresión temprana y de expresión adulta a 16-18 meses de edad. El grupo control incluyó ratones wild type y simples transgénicos TRE-HA- NrxCTF y CaMKII-tTA. Los resultados obtenidos a partir de la cuantificación de las áreas del hipocampo total, de CA y de GD indicaron una reducción en cada una de las áreas analizadas en los ratones NrxCTF.B de 16-18 meses de expresión temprana con respecto a sus hermanos controles (Hipocampo, Control: 6.50·107 ± 0.17·107; NrxCTF.B: 4.82·107 ± 0.15·107, p<0.0001. CA, Control: 3.98·107 ± 0.12·107; NrxCTF.B: 3.46·107 ± 0.13·107, p<0.0083. GD, Control: 1.43·107 ± 0.05·107; NrxCTF.B: 0.47·107 ± 0.02·107, p<0.0001. Unidades: µm2) (Figura 64A). En los ratones de la línea NrxCTF.B de 16-18 meses de edad y expresión adulta, se observó una reducción estadísticamente significativa en el área total de hipocampo y de GD con respecto a los ratones control (Hipocampo, Control: 6.14·107 ± 0.16·107; NrxCTF.B: 5.72·107 ± 0.07·107, p<0.0100. GD, Control: 1.19·107 ± 0.05·107; NrxCTF.B: 0.64·107 ± 0.02·107, p<0.0001. Unidades: µm2) (Figura 64B).
IV. Resultados 123 Figura 63. Análisis de la morfología del hipocampo de la línea NrxCTF.B de expresión temprana a 3 meses de edad mediante la tinción de Nissl. A, Peso del cerebro de ratones control (N=11) y NrxCTF.B (N=9). B, Imágenes representativas de la tinción de Nissl de un ratón control y un ratón NrxCTF.B. C, Imágenes magnificadas del hipocampo de la tinción de Nissl mostrados en B. D, Cuantificación de las áreas hipocampo (HP), CA (capas CA1, CA2, CA3) y giro dentado (GD). N=2 ratones control, N=2 ratones NrxCTF.B. Cortes cuantificados: N=16 cortes control, N=14 cortes NrxCTF.B. Test estadístico: t-test. p-value: *p<0.05. Todas las barras de error son SEM. Escala: 500 µm. De forma interesante, la reducción observada en GD en ratones NrxCTF.B de inicio temprano fue de mayor magnitud que la presentada por los ratones NrxCTF.B de inicio de expresión adulta (67 vs 46 en porcentaje de reducción). Este dato podría indicar que la expresión de NrxCTF en la etapa más temprana de la vida del animal o la expresión por un espacio de tiempo más prolongado incrementa los efectos neurodegenerativos causados por su acúmulo en el cerebro envejecido.
IV. Resultados 124 Figura 64. Análisis morfológico del hipocampo de la línea NrxCTF.B de expresión temprana a 16-18 meses de edad mediante la tinción de Nissl. A, Cuantificación para las áreas de hipocampo (HP), capas CA1-CA3 (CA) y giro dentado (GD). N=3 ratones control, N=2 ratones NrxCTF.B; hipocampos cuantificados: N=50 de ratones control, N=26 de ratones NrxCT.B. B, Cuantificación para las áreas de hipocampo (HP), capas CA1- CA3 (CA) y giro dentado (GD). N=3 ratones control, N=4 ratones NrxCTF.B; hipocampos cuantificados: N=47 de ratones control, N=70 de ratones NrxCT.B. Test estadístico: t-test. p-value: **p<0.01, ***p<0.0001. Todas las barras de error son SEM. Escala: 500 µm. 5.1.2. Pérdida de neuronas Como consecuencia de los resultados morfológicos observados mediante la tinción de Nissl, se decidió estudiar el número de neuronas en CA1 y en GD como medio para detectar un posible efecto en el número de células en estas áreas. Para ello se cuantificó el número de células positivas para DAPI (marcador del núcleo celular). En ratones de 3 meses de la línea NrxCTF.B de expresión temprana se observó una reducción en el GD del número de células DAPI positivas de un 45% (Control: 246.2 ± 8.00; NrxCTF.B: 134.5 ± 4.60; p<0.0001) (Figura 65). En el momento de escritura de esta Tesis Doctoral no se pudo contar con los datos definitivos obtenidos de animales de 16- 18 meses de expresión temprana y expresión adulta, pero observaciones preliminares indican una reducción en la densidad celular en las mismas áreas de dichos ratones (datos no mostrados). Estos resultados junto con los anteriores obtenidos mediante la tinción de Nissl, sugieren que el acúmulo de NrxCTF tiene como consecuencia la pérdida de neuronas en el GD desde una edad temprana.
IV. Resultados 125 Figura 65. Conteo del número de células DAPI positivas en una región acotada de las regiones CA1 y GD en ratones de la línea NrxCTF.B de expresión temprana. A, Imágenes representativas de CA1 y GD de un ratón control y un ratón NrxCTF.B. B, Cuantificación del número de células DAPI positivas en CA1 y GD. N=3 ratones control, N=3 ratones NrxCTF.B. Cortes: CA1: N=8 control; N=15 NrxCTF.B; GD: N=13 control, N=15 NrxCTF.B. Test estadístico: t-test. p-value: ***p<0.0001. Todas las barras de error son SEM. 5.2. Análisis de los niveles de proteínas sinápticas candidatas NrxCTF en el terminal presináptico podría interaccionar con determinados ligandos, produciendo un desplazamiento de su lugar natural de interacción que afectara a la estabilidad de las proteínas sinápticas afectadas. Para intentar estudiar esta posibilidad, seleccionamos una batería de proteínas sinápticas candidatas implicadas en la adhesión transináptica (NLGN1, NLGN2, NLGN3), proteínas de andamiaje del terminal postsináptico (PSD95) y del terminal presináptico (CASK), asociadas con vesículas sinápticas (vGLUT, vGAT), receptores de glutamato (NR1) y de la señalización de calcio (CaMKII). Las cuantificaciones se analizaron con anticuerpos específicos por Western blot en lisados totales de hipocampo, estriado y corteza de ratones control y ratones NrxCTF.B. Con el fin de evaluar la posible progresión temporal, analizamos la expresión de estas proteínas en animales jóvenes de expresión temprana y en animales envejecidos de expresión adulta. 5.2.1. Corteza En el análisis de proteínas candidatas en la corteza de ratones NrxCTF.B, no observamos cambios significativos en ninguna de las proteínas evaluadas, salvo en CASK (Figura 66).
IV. Resultados 126 Los niveles de CASK se reducen alrededor de un 25% en la corteza de los ratones NrxCTF.B de 3 meses, el único punto evaluado en este caso (Control: 1.00 ± 0.08; NrxCTF.B: 0.728 ± 0.07; p=0.0414). También se observó una tendencia al doble de expresión en vGAT de los ratones NrxCTF.B con respecto a los ratones control (Control: 1.00 ± 0.26; NrxCTF.B: 1.98 ± 0.41; p=0.0905). Figura 66. Análisis de los niveles de expresión de proteínas sinápticas candidatas en la corteza de la línea de ratón NrxCTF.B de expresión temprana mediante Western blot. A, Expresión de distintas proteínas en la línea NrxCTF.B de expresión temprana. B, Cuantificación de la expresión normalizada de diferentes marcadores sinápticos. PSD95 no está normalizado con un control de carga, sólo con respecto a los controles. Proteínas analizadas: NLGN1, NLGN2, PSD95, vGLUT, vGAT y CASK. N=3 control, N=3 NrxCTF.B. Anticuerpos utilizados: anti-NLGN1, anti-NLGN2, anti-PSD95, anti-vGLUT, anti-vGAT y anti-CASK. Como control de carga se empleó actina. Análisis estadístico: t-test. p-value: *p<0.05. Todas las barras de error son SEM. Técnica realizada por: ACSH y Ana Santos. Cuantificación y análisis: ACSH. 5.2.2. Hipocampo El análisis de proteínas candidatas en ratones de 3 meses de la línea NrxCTF.B de inicio de la expresión temprana no reveló cambios significativos en ninguna de las proteínas evaluadas (Figura 67A). Sin embargo, se observó una tendencia al aumento del 38% en la expresión de vGAT en ratones NrxCTF.B con respecto a los ratones control (Control: 1.00 ± 0.15; NrxCTF.B: 1.38 ± 0.14; p=0.1491). De la misma forma, no se
IV. Resultados 127 observaron cambios estadísticamente significativos en el caso de animales NrxCTF.B de 16 meses de expresión adulta. Sin embargo, los niveles de NLGN1 mostraron una tendencia a la reducción de un 24% (Control: 1.00 ± 0.08; NrxCTF.B: 0.763 ± 0.05; p=0.0667), acompañado de una tendencia a una reducción del 19% para NLGN2 en los mismos ratones (Control: 1.00 ± 0.07; NrxCTF.B: 0.81 ± 0.06; p=0.0976) (Figura 67B). 5.2.3. Estriado En el análisis de proteínas candidatas en ratones NrxCTF.B de 3 meses de expresión temprana, observamos una reducción significativa de NLGN1 de un 66% (Control: 1.00 ± 0.04; NrxCTF.B: 0.3391 ± 0.04, p=0.0002) (Figura 68A). La reducción en los niveles estriatales de NLGN1 también se observó en ratones NrxCTF.B de 16 meses de expresión adulta, aunque con una menor magnitud (reducción del 24%) (Control: 1.00 ± 0.06; NrxCTF.B: 0.66 ± 0.09, p=0.0348). El descenso en NLGN1 en el estriado de los ratones NrxCTF.B de 3 y 16 meses estuvo acompañado de una tendencia a un incremento en NLGN3 en ratones NrxCTF.B de 3 meses (Control: 1.00 ± 0.15; NrxCTF.B: 1.45 ± 0.10, p=0.0697) y de 16 meses (Control: 1.00 ± 0.14; NrxCTF.B: 1.34 ± 0.07, p=0.0871). También se observó una reducción pronunciada del 65% de NLGN2 al menos a los 16 meses y expresión adulta, el único punto analizado en estriado para esta proteína (Control: 1.00 ± 0.12; NrxCTF.B: 0.35 ± 0.10, p=0.0348) (Figura 68B). Para demostrar que el efecto causado en proteínas candidatas como NLGN1 era debido al acúmulo de HA-NrxCTF en ratones NrxCTF.B y no a efectos de los ratones simples transgénicos, se analizaron mediante Western blot los niveles de expresión de NLGN1 en ratones wild type (N=2), ratones NrxCTF.B (N=2) y en ratones simples transgénicos CaMKIIa-tTA (N=2) y TRE-HA-NrxCTF (N=1) (Figura 69). Los resultados obtenidos en nuevas muestras independientes confirmaron que la reducción en NLGN1 observada en el estriado de ratones NrxCTF.B de tres meses de edad se debe a la expresión de HA-NrxCTF, ya que no se observó en ratones simples transgénicos TRE-HA- NrxCTF o CaMKII-tTA.
V. Discusión 134 NrxCTF. En las líneas NrxCTF.B y NrxCTF.C la expresión exógena de HA-NrxCTF depende del sistema Tet-off regulado por el promotor CaMKII (Mayford et al., 1996). Estos datos indican un efecto amplificador del activador transcripcional tTA que incrementa los niveles de la proteína por encima de la actividad de PS, produciéndose el acúmulo de HA-NrxCTF en los ratones. Por tanto, los estudios realizados durante esta Tesis se centraron mayoritariamente en las líneas doble transgénicas NrxCTF.B y NrxCTF.C. Si bien en un futuro se podría explorar incrementar los niveles moderados de expresión de los ratones CaMKII-HA-NrxCTF de la línea C generando ratones con dos copias del transgén. El patrón de expresión y la localización de la proteína HA-NrxCTF en el cerebro se analizó mediante experimentos de Western blot y de inmunohistoquímica en las líneas NrxCTF.B y NrxCTF.C. En la línea NrxCTF.B, HA-NrxCTF se expresa en el hipocampo, la corteza y el estriado, mientras que en la línea NrxCTF.C, HA-NrxCTF se restringe a una región limitada de la corteza y al estriado. La expresión de HA-NrxCTF en el hipocampo parece corresponder a proyecciones hacia esa zona, ya que no se detectaron células positivas en el hipocampo. Una vez obtenidas líneas que acumulan HA-NrxCTF en el cerebro, nos interesó analizar si el acúmulo ocurría en terminales presinápticos, como ocurre con NrxCTF endógena en ratones PS cDKO (Saura et al., 2011). Mediante experimentos de fraccionamiento celular, hemos demostrado que HA-NrxCTF se localiza en los terminales presinápticos de las diferentes regiones analizadas en la línea NrxCTF.B. De igual forma, se observó un patrón de expresión sináptico por inmunohistoquímica en el hipocampo de ratones NrxCTF.B, como son las proyecciones axonales hacia las neuronas piramidales de CA1 provenientes de neuronas piramidales de CA3 (vía colateral de Schaffer) y las terminaciones de las fibras musgosas en el stratum lucidum provenientes de las células granulares de GD. Los mecanismos de localización presináptica deben ser diferentes para el sustrato exógeno y endógeno. Mientras que la localización de NrxCTF endógena depende de la distribución de las proteínas encargadas de su procesamiento, la localización presináptica de HA-NrxCTF depende de su propia secuencia. Estos datos indican que el dominio citoplásmico común de Nrxs podría contener secuencias para su localización presináptica (Fairless et al., 2008). Por otra parte, datos previos de nuestro grupo han demostrado una localización
V. Discusión 135 presináptica in vivo de un mutante de deleción de Nrx1 que carece del dominio citoplásmico (Rabaneda et al., 2014). En conjunto, estos resultados sugieren que la localización presináptica de Nrxs podría estar gobernada por secuencias en los dominios extracelular y citoplásmico. NrxCTF endógena se detecta como un doble banda en experimentos de Western blot con anticuerpos contra el dominio citoplásmico (Saura et al., 2011). La identificación de los sitios de procesamiento del ectodominio en Nrx1 y Nrx3 han sugerido la existencia de dos sitios de corte, uno mayoritario más cercano al segmento transmembrana, y otro minoritario al 5’ de éste (Borcel et al., 2016; Servián-Morilla et al., 2018). La secuencia de Nrx1 codificada por HA-NrxCTF comienza a partir del residuo producido por el sitio de corte mayoritario y carece de secuencias adicionales de Nrx1 al 5’. Sin embargo, HA- NrxCTF produce una doble banda detectada con anticuerpos anti-Cyto-Nrx y anti-HA, aunque la detección de la banda de menor movilidad con este anticuerpo es mas débil. Estos datos sugieren que en la generación de la doble banda de NrxCTF podrían también intervenir mecanismos postraduccionales (glicosilación, fosforilación) que afectaran la movilidad de un único sustrato. La generación de las líneas dobles transgénicas NrxCTF nos ofrecía la posibilidad de regular la expresión temporal de la proteína exógena mediante el uso de Dox. En ratones NrxCTF.B, la expresión postnatal de HA-NrxCTF comienza en la segunda semana y se mantiene por el resto de la vida del animal. Hemos podido demostrar que el tratamiento con Dox en la fase embrionaria y postnatal temprana evita la expresión de HA-NrxCTF en ratones NrxCTF.B. De igual forma, el tratamiento con Dox en ratones NrxCTF.B adultos apaga la expresión del transgén a los pocos días. En la línea NrxCTF.C no se ha estudiado tan exhaustivamente el encendido y apagado con Dox, aunque la recuperación al nacimiento de la frecuencia genotípica en ratones tratados con Dox, hace sospechar el mismo efecto. La generación de líneas inducibles de expresión de HA- NrxCTF tiene repercusiones interesantes. Por una parte, se pueden evaluar los efectos ocasionados por el inicio del acúmulo de HA-NrxCTF a edades diferentes. Por otra parte, se puede examinar el posible efecto de detener el acúmulo de NrxCTF en la reversión de síntomas. Estas dos posibilidades se han comenzado a explorar en esta Tesis.
V. Discusión 136 Para gran parte de nuestros estudios se emplearon dos aproximaciones de inicio de la expresión de la proteína HA-NrxCTF. Una aproximación que denominamos expresión temprana, que permite la expresión de HA-NrxCTF dependiente del promotor CaMKII desde etapas postnatales tempranas, sin descartar por completo la expresión en etapas embrionarias (véase a continuación). Otra aproximación de expresión adulta, que evita la expresión temprana y acumula HA-NrxCTF en el cerebro adulto, mediante el tratamiento con Dox desde la gestación hasta el primer mes de vida. Esta segunda aproximación reproduce más fielmente la pérdida de procesamiento de Nrxs selectivamente en la vida adulta e imita la pérdida de función de PS en ratones PS cDKO, en los que la escisión de PS1 ocurre a partir de P30 (Saura et al., 2011). Además, el inicio del acúmulo de NrxCTF en la vida adulta es una situación más cercana a AD. Otro de los objetivos relevantes de nuestro diseño experimental consistía en acumular NrxCTF, sin afectar la actividad del complejo γ-secretasa ni el procesamiento de otros sustratos. Por experimentos de Western blot en ratones de la línea NrxCTF.B con expresión temprana de 3 meses de edad observamos que los niveles de expresión de proteínas componentes del complejo γ-secretasa como Nicastrina y la propia no estaban afectados. Por otro lado, tampoco se observó defectos en otros sustratos de la actividad PS/γ-secretasa como N-Cadherina. De forma similar a Nrxs, trabajos posteriores demuestran que Nlgn1 se procesa proteolíticamente por metaloproteasas y PS/γ-secretasa (Peixoto et al., 2012; Suzuki et al., 2012). El empleo de anticuerpos que reconocen el dominio citoplásmico de Nlgn1 no detectó un acúmulo de Nlgn1-CTF en los ratones NrxCTF.B (no mostrado). Por tanto, los resultados obtenidos con esta selección de candidatos apoyan que el complejo γ-secretasa y su actividad general no se afectan por el acúmulo selectivo de HA-NrxCTF. Un último aspecto que decidimos abordar como parte de la caracterización, fue la comparación de los niveles de acúmulo de HA-NrxCTF generado por los ratones transgénicos con el acúmulo endógeno de NrxCTF. Para ello, elegimos la línea transgénica con mayor nivel de expresión, NrxCTF.B, y la comparamos con un modelo de AD ya establecido como APPsw/PS1ΔE9 (Jankowsky et al., 2004). Observamos que los niveles de acúmulo en el hipocampo de HA-NrxCTF de ratones NrxCTF.B jóvenes triplica los niveles de acúmulo de ratones APPsw/PS1ΔE9 envejecidos. Además, observamos que
V. Discusión 137 los niveles endógenos NrxCTF incrementan con la edad en ratones control y en ratones APPsw/PS1ΔE9, alcanzando incrementos de 2-3 veces en ratones APPsw/PS1ΔE9 comparados con ratones control en cada edad analizada. Estos datos indican que los ratones NrxCTF.B presentan niveles moderados de sobreexpresión. Además, muestran que NrxCTF se acumula durante el envejecimiento en el cerebro de ratones control y, en mayor magnitud, de ratones APPsw/PS1ΔE9 modelo de AD. Una comparación definitiva con los niveles y las regiones de acúmulo de NrxCTF requerirá el análisis de modelos de pérdida de función que no sobreexpresen alelos de PS1, como por ejemplo ratones PS cDKO. Los ratones PS cDKO se encuentran ahora disponibles en el grupo gracias a la cesión de la Dra. Jie Shen (Harvard Medical School). 2. Posible efecto deletéreo en el modelo de ratón NrxCTF debido al acúmulo de HA-NrxCTF a edades tempranas En la población NrxCTF.B de expresión temprana encontramos un ligero descenso en la frecuencia genotípica, asociado con mortalidad temprana y un decremento en el peso corporal comparado con la población de ratones control (ratones wild type y ratones simples transgénicos TRE-HA-NrxCTF y CaMKII-tTA). Estos efectos son más acuciados en machos. De forma similar, en estudios de frecuencia genotípica en la línea NrxCTF.C en una población relativamente pequeña de expresión temprana se observó que la frecuencia de aparición de ratones NrxCTF.C se reducía hasta el 0% y 8% en machos y hembras, respectivamente. El reducido número de ratones NrxCTF.C nacidos no nos permitió analizar otros parámetros, como peso y mortalidad perinatal. Estudios iniciales sugieren que la muerte embrionaria de los ratones NrxCTF.C de expresión temprana debe ocurrir entre E17 y E21. La menor frecuencia de ratones NrxCTF al nacimiento sugirió un efecto embrionario de HA-NrxCTF. En consonancia, observamos que la frecuencia de ratones NrxCTF.B y NrxCTF.C se recuperaba en ocasiones hasta valores por encima de los esperados (>25%) en poblaciones de expresión adulta. De forma similar, las diferencias en peso y la mortalidad temprana de la línea NrxCTF.B se recuperaba por completo en la población de expresión adulta. Cabe indicar que no
V. Discusión 138 observamos una mayor mortalidad tras el encendido de HA-NrxCTF en el cerebro adulto. Estos datos indican una fase embrionaria o postnatal temprana de mayor susceptibilidad para el acúmulo de NrxCTF. En este sentido, NrxCTF se acumula en el cerebro de embriones KO de PS1, que presentan mortalidad perinatal y un menor tamaño (Shen et al., 1997; Saura et al., 2011). Ratones PS1 KI también presentan una reducción en peso desde el inicio de la vida (Xia et al., 2015). Este conjunto de resultados sugieren que el acúmulo de NrxCTF tiene un efecto deletéreo en la supervivencia tanto prenatal como postnatal temprana del ratón que puede contribuir al fenotipo de los ratones PS1 KO. 3. Evaluación fenotípica de los ratones NrxCTF.B y su asociación con AD Una parte importante del diagnóstico de pacientes de AD depende de la evaluación de una serie de parámetros clínicos relacionados con el deterioro global y progresivo de la memoria y con una serie de pautas conductuales que presentan las personas que sufren la patología. Los pacientes de AD presentan alteraciones en la locomoción como agitación psicomotriz, trastornos en el estado de ánimo como ansiedad, estereotipias y, principalmente, se caracterizan por un deterioro progresivo de la memoria (American Psychiatric Association, 2013). Por estos motivos nos interesó evaluar el fenotipo de las líneas NrxCTF en tests de comportamiento a diferentes edades a lo largo de la vida. Una de las características presentes en pacientes de AD es la alteración en la locomoción y en estereotipias (American Psychiatric Association, 2013). Los ratones NrxCTF.B presentan hiperactividad motora en el test de campo abierto, que se manifiesta por un incremento al doble de la distancia recorrida y la velocidad, en comparación con sus hermanos controles. Sin embargo, este efecto aparece a edades diferentes dependiendo del momento de inicio del acúmulo de HA-NrxCTF. En los ratones NrxCTF.B de expresión temprana, la hiperactividad motora es patente desde los 3 meses y se mantiene hasta el último punto testado, los 20 meses. En ratones NrxCTF.B de expresión adulta, la actividad motora en el test de campo abierto es normal a los 4 meses y se
V. Discusión 139 duplica a partir de los 7 meses. Por el contrario, los ratones NrxCTF.B de expresión adulta de 4 meses de edad presentaron un descenso apreciable en el tiempo de acicalamiento que se mantuvo hasta los 13 meses. Un descenso similar en este comportamiento estereotipado se observó también en ratones NrxCTF.B de expresión temprana a los 12 y 20 meses, los únicos puntos analizados. La hiperactividad presente en los ratones NrxCTF.B se encuentra en modelos establecidos de AD como APPswPS1M146L (Holcomb et al., 1999) y APPswPS1ΔE9 (Filali et al. ,2011). La presencia de efectos similares en los tests de campo abierto y de acicalamiento en ratones adultos NrxCT.B de expresión temprana y de expresión adulta, sugiere que la hiperactividad motora y el descenso en comportamientos estereotipados no dependen de un acúmulo preferencial de NrxCTF durante etapas concretas del desarrollo. De forma similar, los ratones NrxCTF.B de expresión temprana y adulta presentan una menor aversión por los espacios abiertos en el test del laberinto en cruz elevado. La aparición de hiperactividad motora en el test de campo abierto ocurre con una latencia de meses desde el acúmulo HA-NrxCTF, que se inicia a partir del segundo mes en el cerebro de ratones NrxCTF.B de expresión adulta. En este sentido, se ha publicado que los ratones PS cDKO presentan un comportamiento normal en el test de campo abierto a los dos meses, pero presentan defectos motores y de comportamientos estereotipados a partir del sexto mes (Saura et al., 2004). Por otra parte, el descenso en el tiempo de acicalamiento en ratones NrxCTF.B de expresión adulta precede a la aparición de hiperactividad motora. Estos datos sugieren que la caracterización en mayor profundidad del inicio temporal de defectos de comportamiento ocasionados por el acúmulo de NrxCTF en el cerebro podría resultar en la identificación de patrones conductuales con potencial interés clínico en fases tempranas de AD. Una de las características más relevantes de AD es el deterioro de la memoria. Por ello realizamos diferentes tests de comportamiento que analizan memoria de trabajo a corto y largo plazo, memoria contextual, emocional y aprendizaje asociativo. De forma general, no observamos efectos de memoria en el test de reconocimiento de objeto nuevo en los ratones NrxCTF.B de expresión temprana o adulta. Además, los ratones NrxCTF.B de 3 meses de edad no mostraron diferencias con los controles en la prueba de evitación activa. Sin embargo, en la prueba de evitación pasiva, los ratones NrxCTF.B que cambiaron de compartimento mostraron tiempos de latencia menores que los
V. Discusión 140 ratones control, indicando un posible descenso en memoria contextual a esa edad. La evaluación de la memoria en el test de condicionamiento al miedo en la misma población a los 20 meses de edad mostró un menor porcentaje de freezing en los ratones NrxCTF.B durante la fase de memoria contextual, sin alcanzar significancia estadística. En la fase del test dependiente de sonido, un tipo de memoria asociada con la amígdala, los ratones NrxCTF.B de 20 meses mostraron un descenso significativo respecto a los controles. Los ratones PS cDKO presentan defectos en la memoria contextual y espacial, que progresan con la edad. Por ejemplo, el porcentaje de freezing en la fase contextual del test de condicionamiento de miedo presenta una reducción mayor en ratones PS cDKO de 6 meses que de 2 meses (Saura et al., 2004). Por tanto, nuestros datos apoyan la hipótesis de que el acúmulo de NrxCTF podría participar en los defectos progresivos en memoria contextual causados por una pérdida de función de PS. La asociación de los síntomas de AD con el envejecimiento plantea la pregunta de si los síntomas se pueden recuperar o aliviar tras su debut en edades avanzadas. El control temporal de la expresión de HA-NrxCTF en los ratones transgénicos de las líneas NrxCTF permite abordar esta pregunta. Por ello, en un experimento piloto tratamos con Dox ratones NrxCTF.B de 24 meses y los sometimos a ensayos de comportamiento. El tratamiento con Dox apagó la expresión de HA-NrxCTF eficientemente. Los resultados obtenidos en el test de campo abierto, test de acicalamiento y memoria de miedo condicionada no permitieron obtener resultados concluyentes, pero se observó una tendencia a la reversión en el test de memoria de miedo condicionada. El establecimiento de estas aproximaciones nos permitirá analizar en estudios futuros el efecto de detener el acúmulo de NrxCTF a diferentes edades tras la aparición de los primeros síntomas. Los resultados obtenidos de la caracterización fenotípica de las líneas NrxCTF nos permitieron obtener las siguientes conclusiones. Los efectos causados por HA-NrxCTF se pueden dividir según la edad de inicio de su acúmulo en efectos dependientes de la expresión temprana y efectos independientes del inicio de la expresión. Así, la muerte temprana y el descenso en el peso y tamaño corporal dependen exclusivamente de la expresión probablemente prenatal y postnatal temprana de HA-NrxCTF. Por otra parte, la hiperactividad motora, el descenso en la estereotipia y en la aversión por los espacios abiertos, son independientes del momento de inicio de expresión de HA-NrxCTF,
V. Discusión 141 aunque puede existir un tiempo de latencia distinto según el déficit concreto. La finalización de tests de memoria en ratones NrxCTF.B de expresión adulta nos permitirá concluir respecto al origen temporal del efecto en esta prueba. Basado en estos datos, se puede especular que la expresión en el cerebro embrionario de NrxCTF en ratones KO de PS1 (Saura et al., 2011) podría participar en la muerte perinatal de estos animales principalmente atribuida a una falta de señalización de Notch (Artavanis-Tsakonas et al., 1995; Shen et al., 1997). Por otra parte, el acúmulo progresivo que hemos detectado de NrxCTF durante al envejecimiento de ratones wild type y aumentado en los ratones APPsw/PS1ΔE9 podría desencadenar defectos conductuales y cognitivos asociados con el envejecimiento normal y con AD. 4. Posibles mecanismos afectados por el acúmulo de NrxCTF Mediante la cuantificación del área del hipocampo, pudimos detectar una reducción entorno al 50% en GD en ratones NrxCTF de expresión temprana de 3 a 16- 18 meses de edad. El área de GD en ratones NrxCTF de expresión adulta de 16-18 meses también estaba reducida, aunque la reducción fue de menor magnitud que la de ratones NrxCTF.B de la misma edad de expresión temprana. Este dato podría indicar que la expresión de NrxCTF en la etapa más temprana de la vida del animal o la expresión por un espacio de tiempo más prolongado incrementa los efectos neurodegenerativos causados por su acúmulo en el cerebro envejecido. En ratones PS cDKO y en ratones PS1L435F se ha mostrado neurodegeneración cortical dependiente de la edad, observándose en edades avanzadas (Saura et al., 2004; Wines-Samuelson et al., 2010; Xia et al., 2015). La reducción de GD en los ratones NrxCTF.B estaba asociada a una disminución del 50% en el número de neuronas, al menos en ratones de 3 meses de expresión temprana. Observaciones preliminares realizadas en el momento de escritura de esta Tesis Doctoral apuntan a una reducción en la densidad celular en el GD de ratones NrxCTF.B de 16-18 meses de expresión temprana y expresión adulta. El conjunto de estos resultados sugiere que el acúmulo de NrxCTF tiene como consecuencia la pérdida de neuronas en GD desde una edad temprana. Además de la
V. Discusión 142 neurodegeneración, otra de las características clínicas más notables en AD es la aparición de la hiperfosforilación de la proteína Tau. En colaboración con el grupo del Dr. Javier Vitorica (Instituto de Biomedicina de Sevilla) hemos observado hiperfosforilación de Tau en lisados de hipocampo de ratones NrxCTF.B de expresión adulta de 16 meses, coincidente con la neurodegeneración en GD. De forma notable, la hiperfosforilación de Tau no aparece en ratones NrxCTF.B de 12 meses de edad (datos no mostrados). La pérdida de función de PS produce hiperfosforilación de Tau en los ratones PS cDKO (Saura et al., 2004). Estos datos sugieren que el acúmulo crónico de NrxCTF causado por una falta de función de PS podría ser responsable de la hiperfosforilación de Tau asociada a AD. Una posible consecuencia de la hipótesis planteada de Nrxs-Nlgn1 es que la función o los niveles de Nlgn1 en los terminales postsinápticos de neuronas glutamatérgicas se vean afectados por el acúmulo de NrxCTF. Por ello, se realizaron experimentos de análisis de diferentes proteínas sinápticas candidatas en ratones de la línea NrxCTF.B de inicio de la expresión temprana a 3 meses de edad y de expresión adulta a 16 meses de edad en hipocampo, corteza y estriado. El resultado más relevante de estos experimentos fue la reducción en los niveles del ligando de Nrxs en sinapsis glutamatérgicas, Nlgn1. Los datos más prominentes se obtuvieron en el estriado de ratones NrxCTF.B tanto de expresión temprana como de expresión adulta, donde se observó una reducción del 50% en los niveles de Nlgn1 con respecto a los controles. Esta reducción está presente desde los 3 meses, indicando que el descenso en los niveles de Nlgn1 pudiera ser un marcador temprano de AD. Estos datos adquieren especial relevancia junto con los resultados recientemente publicados que muestran un descenso en los niveles de Nlgn1 y Nrx2 en el plasma de pacientes con AD (Goetzl et al., 2018). La reducción en los niveles estriatales de Nlgn1 desde los 3 meses de edad en ratones NrxCTF.B de expresión temprana coincide con la aparición de la hiperactividad motora en campo abierto y la menor aversión por los brazos abiertos en el test de laberinto elevado en cruz, sugiriendo un efecto causal. Por ello sería interesante analizar en experimentos futuros si el descenso en Nlgn1 precede a la aparición de los defectos encontrados en comportamiento de ratones NrxCTF.B.
V. Discusión 143 Estudios recientes han indicado un efecto en el comportamiento y la neurotoxicidad de ratones que expresan el transactivador de tetraciclina tTA regulado por CaMKII, dependiente de las estirpes de ratón (Han et al., 2012). En estos estudios, uno de los fondos genéticos estudiado fue B6FVBF1, similar los ratones B6FVBF2/J usados en nuestros experimentos con las líneas NrxCTF. Por ello decidimos segregar los distintos experimentos realizados en las líneas NrxCTF.B y NrxCTF.C en los 4 genotipos posibles (wild type, simples transgénicos TRE-HA-NrxCTF, simples transgénicos CaMKII- tTA y dobles transgénicos NrxCTF.B). Observamos que la frecuencia genotípica al nacer, mortalidad, peso corporal y del cerebro no están afectados en los ratones simples transgénicos TRE-HA-NrxCTF y CaMKII-tTA. En la evaluación de pruebas conductuales, los ratones simples transgénicos TRE-HA-NrxCTF y CaMKII-tTA de entre 3 y 12 meses mostraron un comportamiento similar a los ratones wild type (Anexo 1). En la prueba de condicionamiento al miedo, observamos que los ratones simples transgénicos CaMKII- tTA presentaron un descenso en freezing en memoria contextual similar a los ratones NrxCTF.B, no ocurriendo así para memoria dependiente de sonido. Estas observaciones van en contra de resultados previos obtenidos con poblaciones más amplias de ratones CaMKII-tTA, donde no se observaron cambios en memoria contextual en la misma prueba (Han et al., 2012). Por otro lado, el análisis del área del GD en ratones simples transgénicos CaMKII-tTA y TRE-HA-NrxCTF de edad avanzada (16-18 meses) no nos permitió alcanzar resultados concluyentes, debido al número reducido de ratones (N=1). Se ha demostrado que los efectos producidos por CaMKII-tTA en el área de GD se evitan con el tratamiento con Dox de P1 a P40 (Han et al., 2012). Por último, los ratones simples transgénicos TRE-HA-NrxCTF y CaMKII-tTA mostraron niveles estriatales de Nlgn1 similares a los ratones wild type, demostrando un efecto específico de la expresión de HA-NrxCTF en la reducción de Nlgn1. La reducción en los niveles de Nlgn1 ocasionado por el acúmulo de NrxCTF es intrigante, pero apoya nuestra hipótesis de un desmantelamiento del sistema de Nrx- Nlgn1 en AD. Debido a la función del complejo mediado por Nrx-Nlgn1 (Song et al., 1999; Scheiffele et al., 2000; Dean et al., 2003; Chih et al., 2005) el descenso en los niveles de Nlgn1 podría afectar al funcionamiento o mantenimiento de las sinapsis glutamatérgicas. En la misma línea, se ha mostrado que el descenso en el número de