El centro de reacción fotosintético: Un sistema biológico convertidor de energía lumínica en energía química

EL CENTRO DE REACCIÓN FOTOSINTÉTICO: UN SISTEMA BIOLÓGICO CONVERTIDOR DE ENERGÍA LUMÍNICA EN ENERGÍA QUÍMICA por el prf. Dr. D. JOSÉ MARÍA ORTEGA RODRÍGUEZ, Profesor Titular del "Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis" (Universidad de Sevilla y Consejo Superior de Investigaciones Científicas) y Premio "Real Maestranza de Caballería de Sevilla de 1996" Conferencia pronunciada en la Academia el día 17 de febrero de 1998 INTRODUCCIÓN La fotosíntesis es el conjunto de reacciones físicas y químicas mediante las cuales las plantas y otros organismos fotosintéticos captan la energía luminosa proveniente del Sol y la transforman en energía química utilizable en todos sus procesos vitales. Los pasos iniciales de la fotosíntesis se desarrollan en unos complejos proteicos de membrana denominados centros de reacción fotosintéticos y consisten en la absorción de luz por pigmentos especiales tipo clorofila y en la posterior transferencia de electrones entre diferentes cofactores del complejo. Anaerobic photophosphorylation Fig. lor anaerobic cyclic photophosphorylation catalyzad by o, FMN. Details in the 155 Real Academia Sevillana de Ciencias Me1norias 1998-2001 Las reacciones de transferencia de electrones no comenzaron a considerarse procesos fundamentales en biología hasta la década de los años 60. En esa época, Mitchel en su famosa Teoría Quimiosmótica (Mitchell, 1961) propuso un modelo mediante el cual la transferencia de electrones estaría asociada a los procesos de conversión de energía en los sistemas biológicos. En 1961 Arnon y Losada formularon la reacción básica de la fotosíntesis, en la que por primera vez se establecía que la luz induce un transporte de electrones en este proceso (Arnon, 1961; Losada et al. 1961: ver figura adjunta). La teoría de Marcus ha establecido un modelo teórico cuantitativo para la comprensión de los parámetros que determinan la velocidad de las reacciones de transferencia de electrones en los sistemas químicos y biológicos (Marcus, R. A. y Suttin N. ( 1985) Biochim. Biophys. Acta 811, 265-322). Los parámetros variables son básicamente cuatro: distancia, diferencia de energía libre entre los estados inicial y final (-óG), energía de reorganización y temperatura. Gran parte de la investigación actual en este campo se centra en dos aspectos:(]) determinar si el modelo de Marcus es adecuado a los sistemas biológicos; (2) comprender cómo controla físicamente una proteína redox los parámetros -óG, y distancia en función de la constante de velocidad que requiera la reacción. Las bacterias fotosintéticas anoxigénicas constituyen un importante grupo de procariotas fototróficos que, a diferencia de plantas, algas y cianobacterias, no utilizan el agua como donador último de electrones sino compuestos reducidos de azufre o compuestos orgánicos. Los centros de reacción <le estos organismos se están utilizando como sistemas modelos ideales para avanzar en la comprensión de los mecanismos que gobiernan las reacciones de transferencia electrónica, ya que ofrecen las siguientes ventajas: i) se conoce a nivel atómico la estructura del centro de reacción en dos especies de bacterias purpúreas: Rhodopseudomonas (Rps.) viridis y Rhodobacter sphaeroides; ii) presentan al menos ocho reacciones redox diferentes que ocurren en una amplia gama de distancias (3 a 24 Á) y que poseen constantes de velocidad que van desde los picosegundos a los segundos y -i'.G de 1 a 30 kcal/mol: muchas de ellas ocurren además en un amplio intervalo de temperaturas (300-4 K): iii) mediante mutagénesis dirigida es posible modificar sus propiedades; iv) las citadas reacciones pueden estudiarse con extrema precisión mediante espectroscopía cinética utilizando láseres pulsados para iniciar la reacción. Los científicos alemanes Michel, Deisenhofer y Huber recibieron en 1988 el premio Nobel de Química por la resolución de la estructura del centro de reacción de Rps. viridis en virtud del inmenso avance que esto supuso para el conocimiento de los mecanismos de conversión de la energía de la luz en energía química (Deisenhofer, J., Epp, O., Miki, K., Huber, R. y Michel H. (1985) Nature 318, 618-624). El centro de reacción de Rps. viridis está compuesto de tres polipéptidos llamados L, M y H, una cuarta subunidad C, que es un citocrorno de cuatro hemos fuertemente asociado al complejo, y catorce cofactores redox (ver figura adjunta): cuatro hemos, cuatro bacterioclorofilas b, dos bacteriofeofitinas b, dos quinonas, un carotenoide y un hierro no hemínico). Los cuatro hemos están covalentemente ligados a la subunidad C, mientras que el resto se asocia no covalentemente a las subunida<les L y M. El citocromo es una 156 José María Ortega Rodríguez lipoproteína y está anclada en la membrana mediante su parte lipídica, un diglicérido con 18 áto1nos de carbono en cada cadena asociado al citocron10 a través de un enlace tioéster entre la cisteína N-terminal y el tercer hidroxilo del glicerol. El complejo posee 11 a-hélices que atraviesan la membrana, 5 en L, 5 en M y 1 en H. La mayor parte de las subunidades L y M, así como sus cofactores, presentan un eje de simetría rotacional doble perpendicular al plano de la membrana (Deisenhofer et al. 1995). Tan sólo una de las dos ramas de cofactores es fotoquítnicamente activa. La luz es absorbida por los complejos antena que rodean al centro de reacción y es transferida en forma de energía de excitación al dímero de bacterioclorofila, denominado par especial (P), que pasa a un estado excitado. Este estado cae a su estado basal transfiriendo un electrón vía la bacterioclorofila accesoria y la bacteriofeofitina hasta el aceptor primario, la quinona QA (una menaquinona-9). P en su estado oxidado (P+) es reducido entonces por el citocromo c. Finalmente QA cede su electrón a QB (una ubiquinona-9). Después de un segundo acto fotoquímico como el descrito, un segundo electrón llega a QB que toma dos protones del medio externo. El ubiquinol QB H2 abandona el centro de reacción y dona sus dos electrones al complejo be, proceso conco1nitante con la translocación de protones a través de la membrana responsable de la generación de un gradiente electroquín1ico que será utilizado por las ATP sintetasas para sintetizar ATP. En la exposición se resumirán los principales resultados que hemos obtenidos en el estudio de varios de los procesos de transferencia de electrones que ocurren en los centros de reacción de bacterias purpúreas. Especial atención se dedicará a la reacción 157 Real Academia Sevillana de Ciencias -Memorias /998-2001 redox entre el citocromo e tetrahémico y el par especial de bacterioclorofilas en Rps. viridis. En 1966 DeVault y Chance estudiando la fotooxidación de un citocromo eparecido en Chromatium vinosum, otra bacteria purpúrea, describieron el primer caso de reacción biológica cuya tasa no dependía de la temperatura; el llamado Túnel Cuántico. Estos experimentos han sido fundamentales en la elaboración de las teorías de la transferencia biológica de electrones. Nosotros hemos investigado en profundidad la misma reacción en una especie, como Rps. viridis, cuya estructura tridimensional se conoce a nivel atómico. En concreto se expondrán los resultados obtenidos en relación a cuatro aspectos: i) ¿Por qué la mayor parte de las bacterias fotosintéticas utilizan citocromos multihémicos?; ii) ¿cuál es el efecto de la temperatura en la velocidad y en rendimiento de la reacción; iii) ¿hay aminoácidos específicos que afecten a la reacción?; iv) ¿cuál es la funcionalidad de las moléculas de agua que aparecen estructuralmente asociadas entre ambos centros redox? Experimentos de mutagénesis dirigida en los que se ha alterado el potencial de óxido-reducción del par especial de bacterioclorofila en Rhodobacter sphaeroides han permitido investigar la adecuación de la teoría de Marcus para describir una de las reacciones de transferencia electrónica de este sistema. METODOLOGÍA La transferencia de electrones entre el citocromo tetrahémico y el par especial de bacterioclorofila (P) se ha estudiado observando los cambios en el estado de óxido-re- ducción de los hemos y de P tras la incidencia de un fotón de luz. Los cambios rápidos en el estado de óxido-reducción se pueden detectar mediante la técnica denominada espectroscopía cinética de excitación mediante láser observando los cambios en los espectros de absorción característicos de los cofactores. Así, los hemos del citocromo en su estado reducido poseen una banda de absorción llamada a con máximos entre 550 y 560 nm, que en estado oxidado desaparece. Por otra parte, P posee en su estado oxidado (P+ una banda con un pico de absorción a 1300 nm que no existe en su estado basal (P). El Dr. Paul Mathis (Sección de Bioenergética, CEA de Saclay, Francia) y yo mismo hemos diseñado y construido dos sistemas espectroscópicos con el objetivo de poder medir con suficiente resolución temporal los cambios de absorción en ambas zonas del espectro (Ortega y Mathis 1992; 1993; ver figura adjunta). El fundamento de ambos sistemas es el mismo: se hace pasar por la muestra un haz de la luz que absorbe el cofactor que vamos a estudiar (un haz láser de 1283 nm para P; luz blanca filtrada mediante filtros ópticos de banda estrecha con coincidentes con el máximo de absorción del hemo a estudiar). Un sistema de fotodetección rápido (un diodo de germanio para P; un fotomultiplicador para los hemos) recibirá la luz no absorbida por la muestra. Mediante un láser se inicia la reacción, siendo detectados los cambios de absorción con suficiente resolución temporal por el fotodetector, que enviará la señal a un osciloscopio donde se digitaliza y registra; la señal se analiza finalmente en ordenador con un programa de ajuste a exponenciales diseñado por el Dr. Pierre Sétif de Saclay. El sis- 158 _____ José María_Ortega Rodríguez tema consta también de varias lentes ópticas para focalizar y conducir adecuadamente la luz desde la fuente de emisión al fotodetector. Los experimentos se han realizado normalmente bajo condiciones controladas de potencial redox y de temperatura. 1 láser fotodetector F luz de análisis L cubeta L RESULTADOS Y DISCUSIÓN Función de los cuatro hemos del citocromo e El primer aspecto en que centré mis investigaciones fue establecer la función de los cuatro hemos del citocromo tetrahémico en el centro de reacción. Se conoce el potencial redox medio de los cuatro hemos (Dracheva et al. 1988), así como la posición de cada uno de ellos (Alegria y Dutton 1991; Dracheva et al. 1988; Nitschke y Rutherford 1989; Verméglio et al. 1989). En relación a P sería: c559 (+380 mV), c552 (+20 mV), c556 (+310 mV) y c554 mV). La denominación de cada hemo viene del máximo de absorción en la banda a (Dracheva et al. 1986; 1988). Por tanto se trata de una secuencia de hemos de alto y bajo potencial alternativos, ordenación que constituye otro de los aspectos oscuros en relación a este citocromo. A un potencial redox del orden de +250 m V los dos hemos de alto potencial (HP) se encuentran completamente reducidos. Tras la incidencia de un fotón de luz P transfiere un electrón a través de la bacteriofeofitina a QA. P en su estado oxidado, P+, es reducido por el hemo proximal c559 con un tiempo de vida medio (1 112 ) de 190 ns. Este hemo una vez fotooxidado recibe un electrón del hemo c556 con un 1 112 de 1,7 µs. El hemo c559 es por tanto el donador final de electrones a P (Ortega y Mathis 1992; 1993). El hemo c556 suministra a c559 un electrón posibilitando dos actos fotoquímicos relativamente rápidos en el sistema. Como resultado Q8 se recibirá dos electrones y tomará dos protones saliendo del centro de reacción y contactando con el complejo bc1 a través de la membrana. Tras el paso de los electrones por el citado complejo, proceso acoplado a la translocación de protones, los electrones vuelven al centro de 159 Real Acade,nia Sevillana de Ciencias Memorias 1998-2001 reacción en un flujo cíclico a través del citocromo soluble c2 (Knaff et al. 1991; García et al. 1993). Hemos establecido que el citado citocromo reacciona con el tetrahemo mediante un mecanismo colisional en el que las fuerzas de atracción electrostática juegan un papel fundamental (Ortega et al. 1999). Para explicar el carácter monofásico de la reacción se ha postulado un mecanismo por el cual la vida media del complejo formado es extremadamente corta siendo necesarias varias interacciones para que se llegue a transferir el electrón. Cuando el potencial redox del medio permite además la reducción del primer hemo de bajo potencial (LP) c552, la transferencia de un electrón desde c559 se ve sustancialmente acelerada (t 112 de 115 ns). c552 cede entonces un electrón a c559 con una cinética más rápida que el tiempo de resolución de aparato(< 40 ns). Esta aceleración de la reacción se debe en nuestra opinión a un fenómeno de interacción electrostática interhémica, mediante el cual la presencia de un electrón en los hemos adyacentes al c559 determinaría un cambio en su potencial redox haciéndolo más reductor. Aumentaría por tanto la de la reacción y consiguientemente la constante de velocidad (Ortega y Mathis 1993; Mathis et al. 1994). Este fenómeno había sido predicho previamente de forma teórica por otros autores (Gunner y Honig 1991) que mediante cálculos basado en la estructura del centro de reacción de Rps. viridis habían postulado que la de la transferencia del hemo c559 a P se incrementa en 14 me V cuando el hemo c5S6 está reducido y en 77 meV si también lo está el hemo cSS2. Estos cálculos fueron confirmados completamente por nuestros datos experimentales y permiten ratificar como buenos los parámetros físicos utilizados por los citados autores para describir cómo la proteína modula el potencial redox de los cuatro hemos: interacción de los hemos con sus propionatos y aminoácidos cargados, ligandos axiales y hemos previamente oxidados. ¿Por qué el citocromo posee cuatro hemos? Ha quedado establecido que los dos hemos de HP participan en el flujo cíclico de electrones mediante el cual se genera el gradiente electroquímico de protones base de la síntesis de ATP. Un sistema de dos hemos permitiría la reducción rápida de Q8 con dos electrones y por tanto su protonación y salida del centro de reacción. ¿Para qué sirven entonces los dos hemos de LP? Se ha postulado que podrían suministrar electrones provenientes de donadores de bajo potencial redox, lo que podría ser relevante en determinadas condiciones metabólicas y/o ambientales (Nitschke y Dracheva 1995). Nuestra hipótesis es que estos hemos podrían servir para separar físicamente los hemos de HP estableciendo la distancia apropiada entre ellos para obtener la velocidad de la reacción adecuada para el proceso. La existencia de dos hemos de HP a 5 Á de distancia alteraría el funcionamiento normal del citocrorno en dos sentidos: i) provocaría una interacción electrostática muy fuerte con cS59; ii) el segundo electrón enviado por el citocromo llegaría a QA antes de haber cedido el primero a Q8; esto provocaría una vuelta atrás del electrón, reacción improductiva por tanto, y que además puede generar especies dañinas. Existe la propuesta de una doble duplicación génica como origen de los cuatro hemos (Nitschke y Dracheva l 995). La presión evolutiva habría obligado a la proteína a establecer el potencial redox adecuado en cada hemo. 160 José María Ortega Rodríguez Inhibición de la reacción a baja temperatura En los últimos 30 años diferentes grupos de investigación han estudiado el efecto de la temperatura en la fotooxidación de citocromos por centros de reacción en diversas especies de bacterias fotosintéticas (DeVault y Chance 1966; Kihara y Chance 1969). Los resultados permitieron establecer dos conclusiones: i) la reacción se inhibe a baja temperatura cuando se fotooxida un citocromo de alto potencial; ii) esta inhibición no ocurre si se fotooxida un hemo de bajo potencial. Estudiando este último tipo de reacción en la bacteria Chromatium vinosum, DeVault y Chance observaron un doble comportamiento de la constante de velocidad con la temperatura. Entre 300 K y 100 K la reacción se ralentizaba considerablemente, mientras que entre 100 K y 4 K no había efecto de la temperatura (DeVault y Chance 1966). Este segundo fenómeno resultó ser el primer caso documentado de reacción biológica independiente de temperatura y llevó a estos investigadores a proponer el mecanismo de Túnel Cuántico para explicar la transferencia electrónica entre proteínas. Estos experimentos han sido fundamentales en la elaboración de la teoría de la transferencia biológica de electrones. Sin embargo, con10 no se conoce la estructura del centro de reacción de la citada bacteria, todos los modelos se han referido a la estructura tridimensional conocida de Rps. viridis. Resultaba por tanto de gran interés investigar la misma reacción en esta especie para clarificar dos aspectos: i) ¿por qué se bloquea la reacción a baja temperatura?; ii) ¿se pueden generalizar los resultados de DeVault y Chance?; en otras palabras, ¿el túnel cuántico puede explicar la transferencia electrónica entre proteínas? Los experünentos realizados con Rps. viridis confirmaron el fenómeno ya descrito de la inhibición de la transferencia de electrones entre el citocromo y el centro de reacción. Pusieron de manifiesto, además, que la citada inhibición era afectada considerablemente por el número de hemos reducidos, comportamiento que es posible explicar en función de la interacción electrostática interhémica descrita anteriormente. Así, el efecto de inhibición de la baja temperatura sería parcialmente compensado por el aumento considerable de la de la reacción conforme hay un mayor número de hemos reducidos. Parecía por tanto que la inhibición estaba relacionada con la de la reacción. A temperaturas en que la reacción de transferencia de un electrón entre el hemo c559 y P está bloqueada, P+ es reducido por un electrón proveniente de QA- con un t 112 de 2,5 ms cuando sólo hay dos hemos reducidos; si está además reducido el hemo de bajo potencial e 552, este cede un electrón a P+ con un t 112 de l, 1 ms. Esta reacción es sumamente interesante puesto que la velocidad de la reacción parece ser extremadamente rápida para la distancia a la que se encuentran ambos cofactores redox (24 Á). En efecto; recientemente el grupo del profesor Leslie Dutton ha propuesto que la distancia entre los cofactores redox sería la variable fundamental utilizada por las proteínas redox a la hora de obtener la constante de velocidad deseada para la reacción, pudiendo generar cambios de hasta 10 12 veces (Moser et al. 1992). Según su modelo, la reacción entre el hemo c552 y P+ debería poseer una t 112 del orden de 200 veces superior a la detectada experimentalmente por nosotros. Se trata en consecuencia del 161 Real Acadenúa Sevillana de Ciencias Memorias 1998-2001 primer caso de reacción fotosintética descrito que se aleja significativamente del modelo anterior. Un solapamiento de orbitales entre los hemos c559 y c552 podría explicar una velocidad superior a la esperada. Hemos elaborado una hipótesis que intenta explicar el fenómeno de bloqueo de la transferencia de electrones entre el hemo c559 y p+ a baja temperatura (Ortega y Mathis 1993; Mathis et al. 1994, Ortega et al. 1997; Ortega et al. 1998). Según la propuesta, el descenso en la temperatura induciría la transición de un estado del centro de reacción en que la citada transferencia es rápida (SHT) hacia otro estado en que la reacción es muy lenta o no puede medirse (SLT). ¿Cuál es la naturaleza física de esa transición? Una oxidación de los hemos a baja temperatura no parece ser la explicación puesto que se ha comprobado que su estado redox no se modifica con la temperatura. Un cambio en el estado físico del solvente (agua-glicerol) o en la distancia entre los cofactores no parece poder explicar tampoco el efecto redox en la inhibición. A medio camino entre ambos cofactores existe un residuo de tirosina LI 62 que está conservado en todas las especies en que se ha secuenciado el centro de reacción (Williams et al. 1983; Youvan et al. 1984; Shiozawa et al. 1989). Numerosos autores han propuesto que la transferencia de electrones desde el heme c559 hasta p+ es rápida a temperatura alta porque el residuo de tirosina LI 62, situado entre ambos cofactores, puede adoptar una orientación adecuada para la reacción (Knapp y Fischer 1987; Knapp y Nilsson 1990; Cartling 1991, 1992 y 1993). A baja temperatura podría quedar congelado en una posición desfavorable bloqueando la reacción. En el laboratorio del profesor Dieter Oesterhelt se ha establecido el primer sistema para obtener mutantes específicos en Rps. viridis, lo que ha permitido reemplazar la tirosina LI 62 por diversos aminoácidos (Laussermaier y Oesterhelt 1992; Dohse et al. 1995). Mediante electroporación se introduce en la estirpe silvestre un plásmido que posee el operón puf, que codifica para las subunidades M, L y C del centro de reacción, con una detección ( que incluye un inserto de resistencia a kanamicina). Se trata de un vector suicida por habérsele eliminado el origen de replicación. Los mutantes delectivos con fenotipo phor se seleccionan bajo condiciones de microaerofilia en medio N con kanamicina. Mediante conjugación con células donadoras de E. coli S17-I se complementa la estirpe phor con plásmidos pRKMutx en los que se ha reemplazado por mutagénesis dirigida la tirosina L162Y por varios aminoácidos aromáticos y no aromáticos. Los mutantes específicos se seleccionan en medio con kanamicina y tetraciclina. Utilizando los mutantes específicos obtenidos mediante este método (L 162F, W, M, L, G y T) hemos investigado el papel de la tirosina L162 en la transferencia electrónica entre el hemo c559 y p+ (Dohse et al. 1995; Ortega et al. 1997; Ortega et al. 1998). Los datos cinéticos permiten concluir que ni la tirosina ni el carácter aromático son requeridos en la posición LI 62 para que la reacción sea rápida. ¿ Cuál es en ese caso la función de este residuo altamente conservado? En los mutantes no aromáticos L162G, L162T y L162L se observó que el porcentaje de centros de reacción en el que la reacción es rápida es bajo en relación a las otras estirpes. Sin embargo, presentan una segunda transferencia electrónica entre el c559 y p+ de cinética 10 veces más lenta, que aunque también aparece en el resto, en estos tres mutantes ocurre en un porcentaje 162 José María Ortega Rodríguez - -- - -- -- -------------- -- --- -- mucho mayor de centros de reacción (20-30% ). Hemos interpretado este fenómeno asumiendo que el papel de la tirosina sería estabilizar la formación de un complejo entre el citocromo y el centro de reacción que permitiría una reacción rápida. Los complejos con residuos no aromáticos en esa posición podrían adoptar otra conformación menos eficiente con el resultado de una transferencia 1nás lenta. La tirosina Ll 62 no es responsable de la inhibición a baja temperatura de la transferencia de electrones desde el hemos c559 hasta P+, ya que este fenómeno también ocurre en todos los mutantes estudiados (Ortega et al. 1997; Ortega et al. 1998). Los mutantes no aromáticos presentan, sin embargo, una mayor proporción de centros de reacción en los que ocurre la reacción rápida a baja temperatura. Esto parece sugerir que la sustitución del residuo en la posición Ll 62 afecta al parámetro físico responsable de la transición entre los dos estados propuestos. ¿ Cuál es en consecuencia la causa de la transición? Nuestra hipótesis establece que el descenso de la temperatura induce una congelación progresiva de la proteína que afecta fundamentalmente a las moléculas de agua incluidas en la estructura del centro de reacción (Ortega y Mathis 1993; Ortega et al. 1997; Ortega et al. 1998). La inhibición de la reacción vendría originada por la congelación de determinadas redes de moléculas de agua Jo que bloquearía los cambios estructurales de la proteína asociados norn1almente a la reacción. Un efecto similar al de inhibición a baja temperatura de la reacción se ha observado en centros de reacción parcialmente deshidratados (Chamorovsky et al. 1986) ¿Por qué la reacción se inhibe de manera diferente en algunos mutantes? En la estructura del centro de reacción de Rps. viridis es posible observar la presencia de siete moléculas de agua organizadas en una red de puentes de hidrógeno que incluye la tirosina Ll62, y que conecta el hemo c559 y p+ a través de los residuos de histidina C248 y de tirosina MI 95. Esta podría ser la red que participa en los cambios estructurales. La sustitución de la tirosina Ll62 por aminoácidos más pequeños (los no aromáticos) alteraría la red de moléculas de agua, en número o en posición, lo que modificaría el perfil de la inhibición. El agua interna podría ser por tanto ser un factor fundamental en el control de la oxidación del citocromo, contribuyendo posiblemente en la y final del proceso. Efecto de la temperatura en la velocidad de la reacción Una vez investigada la inhibición de la reacción provocada por las bajas temperaturas interesaba conocer el efecto de este parámetro en la velocidad de la reacción. Pretendíamos, por una parte, determinar si el experimento pionero de De Vault y Chance en Chromatium vinosum (De Vault y Chance 1966, De Vault et al. 1967) se repetía en Rps. viridis y, en segundo lugar, establecer si el propuesto túnel cuántico era un mecanismo general para este tipo de procesos. Nuestros experimentos pusieron de manifiesto que la temperatura afectaba muy levemente a la velocidad de la oxidación del hemo c559 en cualquiera de las condiciones redox utilizadas (Ortega y Mathis 1992; 1993). La oxidación del hemo c552, detectada a bajo potencial redox, era además completamente 163