La flotilina y su importancia en el ensamblaje del sistema de secreción de tipo VI y del flagelo en Pseudomonas putida

Facultad de Biología Departamento de Microbiología Grado en Biología La flotilina y su importancia en el ensamblaje del sistema de secreción de tipo VI y del flagelo en Pseudomonas putida Trabajo de Fin de Grado Javier de la Peña Noya Tutora / Directora: Patricia Bernal Guzmán 1 ÍNDICE Resumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2. Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 3. Materiales y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 3.1. Lista de acrónimos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 3.2. Bacterias, plásmidos, cebadores y medios de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 3.3. Análisis in sílico de la proteína FloA en Pseudomonas . . . . . . . . . . . . . . . 12 3.4. Construcción del mutante floA por deleción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 3.2.1. Digestión y ligación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 3.5. Ensayo de competición . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 3.6. Ensayo de secreción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 3.6.1. Preparación muestras de secreción y de células completas . . . . . 14 3.6.2. Western-Blot. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 3.7. Ensayo de motilidad flagelar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15 4. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 4.1. Identificación de la proteína FloA en P. putida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 4.2. Construcción de la cepa ΔfloA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 4.2.1. Construcción del fragmento ΔfloA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 4.2.2. Subclonación del fragmento ΔfloA en pSEVA612. . . . . . . . . . . . 18 4.2.3. Generación del mutante floA usando la técnica SceI . . . . . . . . . . 18 4.3. La ausencia de FloA no disminuye la capacidad de eliminar E. coli . . . . . 21 4.4. La ausencia de FloA no interfiere en la capacidad de secretar Hcp1 . . . . . 22 4.5. El ensamblaje del flagelo no se ve afectado en ausencia de FloA . . . . . . . 24 5. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 6. Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 7. Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 2 RESUMEN Pseudomonas putida es una bacteria colonizadora de la rizosfera de plantas de interés agrícola. Esta bacteria utiliza los flagelos para desplazarse lo que le permite una correcta localización en la planta desde donde puede llevar a cabo su función como agente de control biológico, eliminando patógenos de plantas. Uno de los principales mecanismos que utiliza P. putida para eliminar fitopatógenos y otras bacterias competidoras es el sistema de secreción de tipo VI (T6SS). Tanto el flagelo como el T6SS son complejos macromoleculares que se ensamblan en la envoltura celular traspasando tanto la membrana interna como la externa en bacterias gram-negativas. Las proteínas y lípidos de la bicapa lipídica son fundamentales para que las proteínas de membrana de sistemas macromoleculares se inserten de forma correcta y puedan llevar a cabo su función. En procariotas, se han descrito recientemente unos dominios específicos denominados microdominios funcionales de membrana (MFM) que parecen ser responsables de proporcionar el ambiente necesario para el ensamblaje de macrocomplejos proteicos. En los últimos años, se ha descrito la presencia de una proteína de andamiaje presente en los MFM en Staphylococcus aureus denominada FloA y que facilita el correcto ensamblaje de algunos sistemas multiproteicos, que se insertan en la membrana, como el T7SS. En este trabajo hemos identificado en P. putida la proteína homóloga de FloA de S. aureus. Esta proteína está codificada por el locus PP_0199 denominado qmcA (nombre del gen original) y que hemos rebautizado como su homóloga en S. aureus, FloA. En este proyecto hemos estudiado el papel de FloA de P. putida en el ensamblaje y la actividad del T6SS y del flagelo. Nuestros datos indican que FloA no es determinante para el correcto funcionamiento de ninguno de estos complejos multiproteicos de P. putida. 3 1. Introducción Pseudomonas putida es una bacteria gram-negativa, saprofita y ubicua del suelo que es utilizada como agente de control biológico para la protección de cultivos (Volke et al., 2020). P. putida tiene una gran capacidad de desplazamiento gracias a que posee entre cinco y siete flagelos lo que le permite ser una excelente colonizadora de la rizosfera. Esta rápida y eficiente colonización es clave para sus funciones como agente de control biológico, ya que al colonizar la raíz puede eliminar patógenos de plantas (fitopatógenos) que llegan a la misma evitando la infección (Harwood et al., 1989; Ho et al., 2014). La cepa utilizada en este trabajo, KT2440R, está muy bien caracterizada y es utilizada como modelo en muchos laboratorios debido, entre otros factores, a su alta versatilidad metabólica (Volke et al., 2020) y sus propiedades de biocontrol. El mecanismo principal que utiliza P. putida para eliminar fitopatógenos es el sistema de secreción de tipo VI o T6SS (de sus iniciales en inglés Type VI Secretion System) (Bernal et al., 2017). El sistema de secreción de tipo VI es una nanomáquina molecular que se encuentra en más del 25% de bacterias gram-negativas. Este sistema es un complejo macromolecular que secreta efectores / toxinas al interior de bacterias competidoras inhibiendo su crecimiento o incluso matándolas (Ho et al., 2014). Su función principal es la competencia interbacteriana, pero también participa en la interacción de las bacterias con sus hospedadores y en la adquisición de nutrientes (Lin et al., 2017). El T6SS es un complejo macromolecular que se ensambla a nivel de envoltura celular y que lo forman tres componentes principales: el complejo de membrana (TssJLM) dónde las proteínas TssL y TssM son proteínas transmembrana de la membrana interna y TssJ es una lipoproteína que ancla el complejo a la membrana externa; la placa base (TssEFGK); la vaina contráctil (TssBC); la proteína TssA, encargada de reclutar a las proteínas que componen la placa base y de promover la polimerización de la cola; y por último la cola formada por un tubo interno de anillos hexaméricos de proteínas Hcp que termina en una estructura en forma de punta formada por las proteínas VgrG y PAAR. Los efectores se encuentran asociados a los diferentes componentes de la cola (Figura 1) (Aschtgen et al., 2010; Brunet et al., 2015; Wang et al., 2017; Zoued et al., 2016; Planamente et al., 2016). 4 Figura 1. Representación esquemática del sistema de secreción tipo VI. Componentes de la placa base (TssEFGK) en color naranja, componentes del complejo de membrana (TssJLM) en color beige, componentes de la vaina (TssBC) en color azul, componentes del tubo interno (Hcp) en color verde oscuro, naranja (VgrG) y morado (PAAR) la punta del sistema. Anillo hexamérico de proteínas TssA en color verde claro. Las bacterias utilizan el flagelo para su locomoción a través de medios líquidos y superficies húmedas, además de para la adhesión, la colonización de raíces y la formación de biopelículas (Kirov, 2003). El flagelo es un filamento helicoidal externo de gran longitud cuyo ensamblaje ocurre a nivel de envoltura celular (Erhardt et al., 2010). Dependiendo de la especie bacteriana, los flagelos varían en número y posición dentro de la célula distribuyéndose alrededor de la superficie celular. Por lo general, más de 50 genes están involucrados en la producción de flagelos, un proceso complejo que requiere coordinación en el espacio y en el tiempo y para ello los promotores y los genes que codifican los diferentes componentes del flagelo se organizan jerárquicamente y se regulan temporalmente durante el ensamblaje (Leal-Morales et al., 2022). El T6SS y el flagelo son nanomáquinas moleculares que se ensamblan a nivel de envoltura celular expandiéndose a través de la membrana interna, el periplasma y la membrana externa. Estas membranas celulares definen un límite dinámico que está constituido por un conjunto específico de lípidos y proteínas cuya correcta organización influye en todos los procesos celulares (Grecco et al., 2011). En 1972, Singer y Nicolson describieron el modelo pionero del mosaico fluido en el que se describe que los lípidos y 5 componentes de la membrana difunden libremente siendo distribuidos homogéneamente por la membrana teniendo, de esta manera, movilidad lateral (Singer y Nicolson, 1972). Este modelo dio pie a nuevas investigaciones en células eucariotas sobre la composición de la membrana y se definieron nuevos compartimentos formados por esfingolípidos, colesterol y glicolípidos a los que denominaron balsas lipídicas (Figura 2) (Simons e Ikonen, 1997). Figura 2. Balsa lipídica. Esquema de un dominio de membrana en células de mamífero considerado como plataforma de señalización compuesto por proteínas transmembranas y complejos multiméricos involucrados en procesos de señalización. También contiene fosfolípidos, esfingolípidos y colesterol que confieren fluidez a estos dominios (Adaptado de Lopez y Koch, 2017). Estas regiones en la bicapa lipídica organizan una variedad de proteínas relacionadas con la transducción de señales y el tráfico de membranas en los propios dominios. También poseen una serie de proteínas específicas que varían con el tiempo y se encuentran embebidas en la membrana. Una de las proteínas asociadas a estos dominios de membrana es la flotilina que se define como una proteína de andamiaje (Morrow y Parton, 2005; Simons e Ikonen, 1997). Las flotilinas son chaperonas que se encuentran exclusivamente en estas balsas lipídicas unidas a la membrana. Aquí, reclutan las proteínas que deben localizarse en estos dominios para estar activas y facilitar su interacción y oligomerización, desempeñando un papel central en la organización de éstas (Babuke y Tikkanen, 2007; Zhao et al., 2011). La actividad de la flotilina es importante para la correcta funcionalidad de numerosos procesos celulares asociados a estos dominios como el tráfico de membranas, la transducción de señales y la polarización celular. En consecuencia, la perturbación de estas proteínas de ensamblaje provoca graves defectos en esos procesos (Babuke y Tikkanen, 2007; Zhao et al., 2011). 6 La existencia de dominios de membrana no es una característica exclusiva de las células eucariotas, también existen en bacterias y arqueas (Lopez y Kolter, 2010; Bramkamp y Lopez, 2015). La organización de la membrana es particularmente importante en los organismos unicelulares ya que representa el límite entre el organismo y el medio ambiente y, por lo tanto, dirige muchos procesos celulares que son esenciales para la vida, como la división celular o la transducción de señales (Barak y Muchová, 2013; Matsumoto, et al., 2006). Son los llamados microdominios funcionales de membrana (MFM) los que realizan esta función, los cuales son muy similares funcional y estructuralmente a las balsas lipídicas de células eucariotas (Figura 3). Los MFM fueron descubiertos originalmente en estudios de regulación de la formación de biopelículas por el sensor quinasa KinC asociado a la membrana de Bacillus subtilis (Lopez y Kolter, 2010). Figura 3. Microdominio funcional de membrana. Esquema de un dominio de membrana de bacterias con diferentes lípidos que funciona como sitio de ensamblaje de complejos multiproteicos cuya oligomerización está facilitada por las flotilinas (Adaptado de Lopez y Koch, 2017). Estructuralmente, estos microdominios están compuestos a nivel lipídico por farnesol y/o lípidos poliisoprenoides derivados de farnesol, (Feng et al., 2014); hopanoides, lípidos estructuralmente similares al colesterol eucariótico que son importantes para la integridad de la membrana y la adaptación a las condiciones de estrés (Sáenz et al., 2015); y los carotenoides, que tienen propiedades químicas análogas a las 7 de los hopanoides y también regulan la rigidez de la membrana bacteriana (Cvetkovic et al., 2013). Las flotilinas bacterianas (Figura 4) son proteínas estructuralmente similares a las de los eucariotas, con dos dominios transmembrana en el extremo amino terminal, un dominio SPFH o PHB y un sitio de interacción con otras proteínas compuesto por repeticiones de ácido glutámico y/o alanina. Se destacan tres funciones principales de estas proteínas: la primera es la regulación de la fluidez de la membrana ya que la falta de flotilina reduce la heterogeneidad de los tipos de lípidos de membrana (Bach y Bramkamp, 2013); la segunda es facilitar de forma eficiente el ensamblaje de complejos proteicos, ya que la actividad de andamiaje estabiliza estos complejos al unir otras moléculas que interactúan y aumentan la capacidad de interacción entre proteínas (Good et al., 2011); la tercera es evitar la agregación de proteínas no específicas y guiar el ensamblaje de los complejos proteicos de forma productiva (Daley, 2008). Figura 4. Esquema de la estructura de la flotilina. Posee dos dominios transmembrana (TM1 y TM2) en su parte N-terminal, un dominio PHB o SPFH (Stomatin, Prohibitin, Flotillin y HflK/C) y un sitio de interacción proteico compuesto por repeticiones de ácido glutámico y alanina en el extremo C-terminal. En general, las flotilinas bacterianas han sido muy poco estudiadas y esto es especialmente cierto en bacterias gram-negativas. Los primeros estudios en bacterias gram-positivas indican que tienen un papel clave en el ensamblaje de estructuras macromoleculares que se localizan en la envoltura celular. En la bacteria gram-positiva 8 Staphylococcus aureus se ha descrito que la ausencia de FloA (SA_1402), una flotilina bacteriana, evita la correcta oligomerización de proteínas asociadas a los microdominios funcionales de membrana. La ausencia de FloA provoca que los complejos multiproteicos no puedan ensamblarse correctamente en estos microdominios, cómo por ejemplo el sistema de secreción de tipo VII (T7SS) (Mielich-Süss et al., 2017). El T7SS es un complejo multiproteico, que se encuentra anclado en la envoltura celular de bacterias gram-positivas y que al igual que el T6SS en gram-negativas, es un mecanismo de competición interbacteriana (Cao et al., 2016). Por tanto, el ensamblaje de estas nanomáquinas moleculares; como los sistemas de secreción bacterianos, parece asociarse a los MFM, aunque hasta el momento son escasos los estudios realizados. Con el fin de aumentar el conocimiento actual del papel de las flotilinas asociadas a MFM en bacterias gram-negativas, nos planteamos el siguiente objetivo en este proyecto: estudiar el papel de la flotilina en el ensamblaje de complejos multiproteicos (T6SS y flagelo) usando como bacteria modelo el agente de biocontrol Pseudomonas putida KT2440R. 2. Objetivos El objetivo general de este proyecto es conocer el papel de la flotilina en el ensamblaje de complejos multiproteicos que se localizan en la envoltura celular como el sistema de secreción de tipo VI (T6SS) y el flagelo en Pseudomonas putida. Para desarrollar este objetivo principal se han planteado los siguientes objetivos específicos: 1. La construcción de un mutante por deleción del gen floA (PP_0199) en P. putida KT2440. 2. La realización de ensayos de competición para determinar la eficiencia del mutante floA para eliminar a una presa (Escherichia coli). 3. La realización de ensayos de secreción para determinar la capacidad del mutante floA de ensamblar y disparar el sistema de secreción de tipo VI. 4. La realización de ensayos de motilidad flagelar para determinar la capacidad del mutante floA para ensamblar y utilizar el flagelo. 15 3.6.2. Western-Blot Las muestras previamente preparadas se cargan en geles de electroforesis SDSPAGE que contienen 7,5% y 15% de acrilamida para separar las proteínas (80 V, 15 min; 100 V, 1 h 45 min). Se utiliza el gel de 7,5% para detectar la subunidad β de la ARN polimerasa (155 KDa), y el gel de 15% para la detección de la proteína Hcp1 (18 KDa). Los geles de acrilamida se transfieren a una membrana de nitrocelulosa utilizando un sistema de transferencia Trans-Blot Turbo (Bio-Rad). Posteriormente se bloquean en leche desnatada al 5% (p/v) para prevenir uniones no específicas del anticuerpo. Se retira la leche lavando con una solución de TBS-T. Las membranas se incuban con el anticuerpo primario, se realizan 3 lavados de 10’ con TBST-T de nuevo y se incuban con el anticuerpo secundario. Los anticuerpos primarios son el anticuerpo anti-Hcp1 de conejo (Bernal et. al, 2021) y el anticuerpo anti-β-ARN polimerasa de E. coli (BioLegend, #W0023). Los anticuerpos secundarios son el IgG-HRP anti-conejo de cabra (Sigma Aldrich, #12-348) y el IgG-HRP anti-ratón de cabra (Sigma Aldrich, #AP127P). Las membranas se lavan tres veces durante 5’ con TBS-T antes del revelado. El revelado de los anticuerpos se realiza con el sustrato Immobilon Forte Western HRP (Millipore) y el sistema de imágenes Odyssey® FC (LI-COR BioSciences). Se realizaron dos experimentos independientes. 3.7. Ensayo de motilidad flagelar. En los ensayos de motilidad flagelar se estudia la funcionalidad y actividad del flagelo de las diferentes cepas observando el halo de crecimiento que generan al sembrarlos en un medio en el que pueden desplazarse. El medio para observar movilidad contiene una concentración de agar muy por debajo a los medios tradicionales de crecimiento para el aislamiento de colonias. Para preparar 600 mL del medio de agar triptona con un 0,3% de agar se necesita: 6 g de Bactotriptona, 3 g de NaCl, 1,8 g de agar y se enrasa con H2O destilada hasta alcanzar los 600 mL. Tras ser autoclavado, se extiende en placas de Petri de 90 mm de diámetro y se dejan secar durante 4 h en condiciones de esterilidad. Posteriormente se inocula una colonia aislada en el centro de la placa con un palillo de punta redonda y se incuba a 30ºC durante 12 h. Para evaluar los resultados de movilidad, se miden los halos de crecimiento. 16 4. Resultados 4.1. Identificación de la proteína FloA en P. putida La proteína homóloga a FloA (SA_1402) de S. aureus en P. putida fue identificada mediante BlastP como se describe en materiales y métodos. Está proteína se denomina QmcA y está codificada por el gen qmcA (cuyo locus es PP_0199). QmcA de P. putida presenta un 88% de aminoácidos idénticos y un 9% de aminoácidos similares (de alta similitud físicoquímica) con la proteína FloA de S. aureus, como se muestra en la Figura 6. Dada la alta homología entre ambas proteínas, en este proyecto hemos renombrado a la proteína QmcA como FloA, así como también al gen qmcA como floA. Figura 6. Alineamiento entre las proteínas FloA de S. aureus (“Query”) y QmcA de P. putida (Sbjct). 4.2. Construcción de la cepa ΔfloA Para estudiar el papel de la flotilina en el ensamblaje de complejos multiproteicos como el T6SS o el flagelo se construyó un mutante limpio del gen floA por recombinación homóloga. En este proceso, la región génica que rodea al gen floA se intercambia por una copia mutante que tiene delecionado el gen floA (fragmento ΔfloA) y se introduce en la bacteria en un vector suicida que no replica en Pseudomonas. Para que se lleve a cabo el intercambio génico de forma completa, se tienen que dar dos eventos de recombinación, aguas arriba y aguas debajo de la región que se quiere intercambiar (Figura 7). El primer evento da lugar a la inserción del vector suicida que lleva el fragmento ΔfloA y flanqueado por sitios de restricción SceI, formando merodiploides con la copia silvestre y mutante de floA en el cromosoma. El segundo evento de recombinación resuelve esta estructura con dos posibles resultados: si la recombinación ocurre por el mismo lugar que el primer 17 evento, se obtiene una cepa silvestre. Si el segundo evento de recombinación ocurre por el sitio contrario, el fragmento mutante se habrá intercambiado por el silvestre y se obtendrá como resultado una cepa mutante con el gen floA delecionado. Para inducir la segunda recombinación, se induce la expresión de la endonucleasa SceI con 3-metil benzoato. Figura 7. (A) Primer evento de recombinación homóloga y (B) Segundo evento de recombinación homóloga. 4.2.1. Construcción del fragmento ΔfloA Para la construcción del fragmento ΔfloA se realizan una serie de PCRs con el objetivo de amplificar las regiones aguas arriba y aguas abajo del gen floA y seguidamente solapar los fragmentos tal y como se describe en Materiales y Métodos (Figura 5). El fragmento ΔfloA se inserta en un vector comercial linear (pTOPO) para su secuenciación y posterior subclonación en el plásmido de destino (pSEVA612) dando lugar a la construcción pTOPO_ΔfloA. Ésta se transforma en E. coli DH5α y se realiza un cribado por PCR para identificar a las bacterias que hayan incorporado el pTOPO con el fragmento ΔfloA. Entre los candidatos positivos, se selecciona uno de ellos para extraer el plásmido y confirmar por secuenciación que la construcción es correcta. 18 4.2.2. Subclonación del fragmento ΔfloA en pSEVA612 Para la subclonación del fragmento ΔfloA en el vector suicida, se realiza una digestión de los vectores pTOPO_ΔfloA y pSEVA612 con las enzimas de restricción XbaI y BamHI. Posteriormente, el fragmento ΔfloA y el plásmido suicida pSEVA612 con extremos compatibles se ligan según se indica en Materiales y Métodos dando lugar al vector pSEVA612_ΔfloA. En esta construcción, el fragmento ΔfloA queda comprendido entre dos sitios de corte de la endonucleasa SceI, cómo se muestra en la Figura 8. El producto de la ligación se transforma en E. coli λpir y se realiza un cribado por PCR para identificar los candidatos que han incorporado el fragmento en el plásmido suicida. Entre los candidatos positivos se selecciona uno para extraer el vector que se va a utilizar en el siguiente paso. Figura 8. (A) Vector lineal pTOPO con el fragmento ΔfloA y (B) subclonación en el vector suicida pSEVA612 4.2.3. Generación del mutante floA usando la técnica SceI El vector suicida con el fragmento ΔfloA (pSEVA612_ΔfloA) se introduce en P. putida mediante electroporación. Esto permite que se dé el primer evento de recombinación homóloga formando cepas merodiploides, bacterias con la versión silvestre y la versión delecionada del gen floA. Posteriormente, se electropora el plásmido pSEVA428 (un vector con el gen de la endonucleasa SceI y un marcador de Sm) en las cepas merodiploides para inducir el segundo evento de recombinación. Este segundo evento, originado gracias a la actividad de la endonucleasa SceI, puede dar lugar a cepas 19 silvestres o mutantes según el sitio donde se dé la recombinación tal y como se describe en Materiales y Métodos y se ilustra en la Figura 7. Tras la inducción del segundo evento de recombinación por la endonucleasa SceI, se aíslan colonias que posteriormente se siembran en medio selectivo (Gm) para comprobar que han llevado a cabo el proceso de recombinación (pérdida del vector suicida) (Figura 9). En la Figura 9 se pueden ver las estrías en placa de LB Rif (Figura 9B) donde deben crecer todas las estrías y en LB Rif Gm (no han llevado a cabo el segundo evento de recombinación). Las colonias que no crecen en la placa de LB Rif Gm pero sí en la placa de LB Rif son los candidatos a mutante. Figura 9. Placas para determinar los candidatos a mutantes. (A) Placa de Rif20 Gm20 dónde sólo crecen los merodiploides ya que poseen el marcador de resistencia a Gm del vector suicida y (B) placa de Rif20 que sirve de control de biomasa para recuperar los candidatos a mutante. La PCR para identificar las cepas mutantes se realiza con los cebadores floA-5 y floA-6 los cuales se unen a secuencias aguas arriba y aguas abajo del fragmento ΔfloA, amplificando una región de 1622 pb en el caso del mutante y una región de 2351 pb en el caso del silvestre (Figura 10). 20 Figura 10. Región adyacente al fragmento ΔfloA donde se unen los cebadores floA- 5 y floA-6. (A) Fragmento esperado en la cepa silvestre (B) y en la cepa mutante. De los 12 candidatos analizados, los candidatos #9 y #12 amplifican el tamaño esperado para la cepa mutante (Figura 11). Los candidatos #1, #3, #4, #5, #7, #8 y #10 amplifican el tamaño esperado de las cepas silvestre y en el carril 2, 6 y 11 la reacción de PCR no produjo ningún producto. Figura 11. PCR de cribado para identificar las cepas mutantes floA. El tamaño del fragmento amplificado por PCR para las cepas mutantes es de 1622 pb y de 2351 pb para las cepas silvestres. 21 Tras confirmar los candidatos mutantes por PCR, se cura el plásmido pSEVA428 como se describe en Materiales y Métodos y se guardan las cepas en glicerol a -80 ºC para su conservación hasta la realización de los estudios fenotípicos. Ambos candidatos han sido utilizados en los experimentos realizados a continuación. 4.3. La ausencia de FloA no disminuye la capacidad de eliminar E. coli P. putida es un eficiente agente de biocontrol que utiliza el T6SS para matar a sus competidores (Bernal et al., 2017). Con el objetivo de estudiar el papel de la proteína FloA en la funcionalidad del sistema de secreción tipo VI, hemos realizado ensayos de competición entre P. putida (cepa silventre y mutante isogénico floA) y E. coli. Como control negativo utilizamos la cepa mutante ΔtssA1 que no ensambla el T6SS. En la Figura 12 se muestra la supervivencia de E. coli después de la competición con P. putida. Los resultados indican que el mutante floA elimina a E. coli con la misma eficacia que la cepa silvestre, mientras que la cepa ΔtssA1 disminuye 10 veces su eficiencia. Figura 12. Supervivencia de E. coli tras competir con P. putida. En esta figura se muestra el crecimiento de E. coli después de 5h compitiendo con las cepas de P. putida. En las columnas crece E. coli después de competir con: 1ª y 2ª columna: cepa silvestre KT2440R; 3ª y 4ª columna: ΔfloA (A); 5ª y 6ª columna: ΔfloA (B); 7ª y 8ª columna: ΔtssA1. En la figura 13 se representa el logaritmo en base 10 del índice de competitividad (IC) que indica la capacidad de P. putida para matar E. coli. 22 Figura 13. Índice de competitividad de las cepas de P. putida contra E. coli. Se muestra el log10 del índice de competitividad de P. putida KT2440 frente a E. coli. Los dos mutantes floA tienen un IC similar entre ellos y al de la cepa silvestre (IC = 1,6). Sin embargo, todos ellos tienen diferencias significativas con la cepa ΔtssA1 (IC = 0,9). Estos resultados demuestran que la proteína FloA no está implicada en el ensamblaje del T6SS en P. putida. 4.4. La ausencia de FloA no interfiere en la capacidad de secretar Hcp1 De forma complementaria, estudiamos la funcionalidad del sistema de secreción de tipo VI detectando la presencia de la proteína Hcp1 mediante Western-Blot. La secreción de Hcp1 depende del correcto funcionamiento del T6SS por lo que es un buen marcador para evaluar la funcionalidad del sistema (Pukatzki et al., 2006). En este ensayo se detecta la presencia de Hcp1 en 4 cepas: la cepa silvestre como control positivo, los dos mutantes floA (A y B) y el mutante tssA1 como control negativo. La proteína Hcp1 se detecta en el sobrenadante de la cepa silvestre (sistema funcional) pero no en un mutante tssA1 ya que el sistema no puede ensamblarse. 23 Figura 14. Producción y secreción de Hcp1 en la cepa silvestre KT2440, las cepas ΔfloA y la cepa ΔtssA1. La proteína Hcp1 se detecta mediante Western-Blot usando un anticuerpo anti-Hcp1. La detección de la subunidad β de la ARN polimerasa se usa como control de carga (células completas) y control de lisis celular (secreción) al ser una proteína citosólica. En la Figura 14 se puede observar cómo los mutantes floA secretan Hcp1 de manera similar a la cepa silvestre. La cepa ΔtssA1 es incapaz de ensamblar el T6SS y por tanto no secreta Hcp1. Estos resultados indican que los mutantes floA sí ensamblan correctamente el sistema de secreción de tipo VI siendo capaces de secretar la misma cantidad de Hcp1 que la cepa silvestre. Por tanto, dado los resultados de los ensayos de competición y de secreción, podemos afirmar que la ausencia de FloA no afecta al ensamblaje ni a la funcionalidad del T6SS. 24 4.5. El ensamblaje del flagelo no se ve afectado en ausencia de FloA En el experimento de motilidad flagelar estudiamos el correcto ensamblaje y funcionamiento del flagelo. En este experimento se siembran las cepas a estudiar en un medio semilíquido (ver Materiales y Métodos) que permite a las bacterias con flagelos desplazarse. En este medio, las bacterias móviles que tienen un flagelo funcional forman un halo de crecimiento, mientras que las bacterias sin flagelo funcional no forman halo (Figura 15). En este trabajo estudiamos la movilidad debida a flagelo de las cepas: silvestre, mutantes floA (A y B) y del mutante fleQ. FleQ es una proteína encargada de la regulación de la síntesis del aparato flagelar y la maquinaria de quimiotaxis, la cual se encuentra en la parte superior de la jerarquía transcripcional (Leal-Morales et al., 2022), por lo que en ausencia de FleQ no se oligomeriza ni se ensambla el flagelo. Figura 15. Ensayo de motilidad flagelar. Las cepas ΔfloA (A) y ΔfloA (B) forman un halo de crecimiento similar a la cepa silvestre. La cepa ΔfleQ no forma halo de crecimiento ya que su flagelo no es funcional. Nuestros datos indican que el mutante floA es capaz de ensamblar correctamente los flagelos ya que puede formar un halo de crecimiento en la placa similar al de la cepa silvestre. Por ello podemos afirmar que la ausencia de la proteína FloA no es determinante para el correcto ensamblaje y funcionamiento del flagelo. 31 Zhao, F., Zhang, J., Liu, Y. S., Li, L., y He, Y. L. (2011). Research advances on flotillins. Virology Journal, 8(1), 1-6. Zoued, A., Durand, E., Brunet, Y. R., Spinelli, S., Douzi, B., Guzzo, M., ... y Cascales, E. (2016). Priming and polymerization of a bacterial contractile tail structure. Nature, 531(7592), 59-63. Foto de la portada: C.S.I.C. (2015) Mis agradecimientos al Departamento de Microbiología de la Facultad de Biología y a mi tutora y directora, Patricia Bernal Guzmán, por permitirme llevar a cabo este trabajo de investigación. También me gustaría agradecer al grupo de investigación de Fernando Govantes Romero y Aroa López Sánchez (Universidad Pablo de Olavide) por su asistencia a la hora de llevar a cabo los estudios de movilidad.