Reacciones Clic y evaluación in situ para la identificación de inhibidores de glicosidasas

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA FACULTAD DE QUÍMICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA REACCIONES CLIC Y EVALUACIÓN IN SITU PARA LA IDENTIFICACIÓN DE INHIBIDORES DE GLICOSIDASAS Valeria Pingitore Sevilla, 2021 DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA FACULTAD DE QUÍMICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA REACCIONES CLIC Y EVALUACIÓN IN SITU PARA LA IDENTIFICACIÓN DE INHIBIDORES DE GLICOSIDASAS Memoria presentada por la Licenciada Valeria Pingitore para optar al grado de Doctora en Química Sevilla, 2021 DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA FACULTAD DE QUÍMICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA REACCIONES CLIC Y EVALUACIÓN IN SITU PARA LA IDENTIFICACIÓN DE INHIBIDORES DE GLICOSIDASAS Vº Bº de los Directores de la Tesis Fdo. Dr. Antonio J. Moreno Vargas Profesor Titular de Universidad Depto. de Química Orgánica Facultad de Química Universidad de Sevilla Fdo. Dra. Ana T. Carmona Asenjo Profesora Titular de Universidad Depto. de Química Orgánica Facultad de Química Universidad de Sevilla Per aspera sic itur ad astra AGRADECIMIENTOS El final de esta etapa de formación ha llegado y deseo agradecer a todas las personas que han contribuido a la realización de esta Tesis Doctoral. En primer lugar, deseo agradecer a mis directores de tesis, la Prof. Ana T. Carmona Asenjo y el Prof. Antonio J. Moreno Vargas por haber sido los mejores profesores que pudiera desear. Vuestra profesionalidad junto con vuestra amabilidad han sido determinantes para que me sintiera acogida en un nuevo ambiente laboral y para que pudiera desarrollar mis competencias profesionales. Además de ser profesores sois amigos y, por esto, os quiero agradecer por vuestra amistad que siempre llevaré en mi corazón en cualquier parte del mundo donde me encuentre. Muchísimas gracias a la Prof. Inmaculada Robina Ramírez por haberme acogido en su grupo de investigación. Gracias Inmaculada por tu cariño y por la sonrisa que te distingue. Los tres sois Profesores con la P mayúscula y unas grandes personas. Os quiero mucho. Gracias a Mari Jose por su simpatía y dulzura, a Macarena por su ayuda y precisión y a Enrique, Pili, Letizia y a todos mis compañeros de laboratorio por la ayuda y la alegría que día tras día me han empujado a seguir en este difícil camino. Deseo agradecer a todos los Profesores, investigadores y estudiantes del Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Sevilla y en particular a los Profesores José María Fernández-Bolaños, Inés Maya, Oscar López López, Miguel Ángel Rodríguez Carvajal, Francisca Cabrera Escribano, José Luis Jiménez Blanco, María Isabel García Moreno, Gonzalo de Gonzalo Calvo y Elena Sánchez Fernández y, además, a Lidia Cuesta Berrio y al Profesor Agustín Galindo del Pozo del Departamento de Química Inorgánica de la US. Gracias a Manolo, Miguel Ángel, Belén y Encarna del Servicio de Resonancia Magnética Nuclear de la Universidad de Sevilla y a todo el personal de la secretaría y de la conserjería de la facultad de Química de la US. Cada uno de vosotros me ha regalado momentos de alegría y, con su ayuda profesional o incluso solo con una palabra me hizo sentir bienvenida y a gusto. Gracias a la Universidad de Sevilla por la posibilidad de realizar mi sueño de defender esta Tesis Doctoral. Deseo agradecer, además, a Rubén Díaz López, Joanna Wandycz-Mejías, María de los Reyes de La Vega y Matilde Revuelta González del Centro Universitario Internacional de la Abreviaturas y acrónimos 4 ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS δ Desplazamiento químico µL Microlitro µM Micromolar Å Ángstrom Ac Acetilo anh. Anhidro (del inglés, “anhydrous”) ap. Apariencia aq. Acuoso (del inglés, “aqueous”) Asc Ascorbato br. Ancho (del inglés, “broad”) Bn Bencilo Boc terc-Butoxicarbonilo Bu Butilo tBu terc-Butilo calc. Calculado cat. Catalítico CAZy Carbohydrate-Active enZymes c.c.f. Cromatografía en capa fina cols. Colaboradores 5 Abreviaturas y acrónimos COSY Espectroscopía de correlación (del inglés, “COrrelated SpectroscopY”) Cq Carbono cuaternario CuAAC Cicloadición 1,3-dipolar azida-alquino catalizada por Cu(I) Cuant. Cuantitativo d Doblete DCM Diclorometano dd Doble doblete ddd Doble doble doblete DIPEA N,N-Diisopropiletilamina DMAP 4-(N,N-Dimetilamino)piridina DMF N,N-Dimetilformamida DMJ 1-Desoximanojirimicina DMP 2,2-Dimetoxipropano DMSO Dimetilsulfóxido DNJ 1-Desoxinojirimicina dt Doble triplete ELLA Ensayo competitivo enzima-lectina (del inglés, “Enzyme-Linked Lectin Assay”) eq. Equivalente Abreviaturas y acrónimos 6 ESIMS Espectrometría de masas de ionización por electrospray (del inglés, “ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry”) Et Etilo g Gramo h Hora HBTU Hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3- tetrametiluronio HRMS Espectrometría de masas de alta resolución (del inglés, “High Resolution Mass Spectrometry”) HSQC Correlación heteronuclear de nivel cuántico individual (del inglés, “Heteronuclear Single Quantum Correlation”) Hz Hercio (del inglés, “Hertz”) IC50 Concentración de inhibidor necesaria para inhibir la actividad enzimática en un 50% IR Infrarrojo J Constante de acoplamiento K Kelvin kDa Kilodalton Ki Constante de inhibición competitiva K’i Constante de inhibición incompetitiva 7 Abreviaturas y acrónimos LSD Enfermedad de almacenamiento lisosomal (del inglés, “Lysosomal Storage Disorder”) m Multiplete M Molar mayor. Mayoritario Me Metilo mg Miligramo MHz Megahercio min Minuto mL Mililitro mM Milimolar mmol Milimol Ms Mesilo MS Espectrometría de masas (del inglés, “Mass Spectrometry”) MW Microondas (del inglés, “MicroWave”) n Valencia nm Nanómetro nM Nanomolar NMR Nuclear Magnetic Resonance NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy Ph Fenilo (del inglés, “Phenyl”) Abreviaturas y acrónimos 8 ppm Partes por millón PTSA Ácido p-toluensulfónico Py Piridina (del inglés, “Pyridine”) q Cuartete (del inglés, “quartet”) Quant. Cuantitativo (del inglés, “quantitative”) quint Quintete RMN Resonancia Magnética Nuclear rp Potencia relativa (del inglés, “relative potency”) r.t. Temperatura ambiente (del inglés, “room temperature”) s Singulete sat. Saturado SAR Relaciones estructura-actividad (del inglés, “Structure-Activity Relationship”) SN2 Sustitución nucleofílica bimolecular soln. Disolución (del inglés, “solution”) T Temperatura t Triplete t.a. Temperatura ambiente TBAF Fluoruro de tetrabutilamonio TBDPS terc-Butildifenilsililo TBTA Tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina 9 Abreviaturas y acrónimos td Triple dobletes TFA Ácido trifluoroacético THF Tetrahidrofurano TLC Thin-Layer Chromatography TMS Trimetilsililo Ts Tosil tt Triple tripletes ν Frecuencia v Velocidad vs Versus RELACIÓN DE COMPUESTOS Relación de compuestos 11 RELACIÓN DE COMPUESTOS 1 Capítulo 1 1 En este índice se muestran todos los compuestos caracterizados en esta Tesis. El número entre paréntesis indica la página donde se puede encontrar la descripción del compuesto. 12 Relación de compuestos Capítulo 2 Relación de compuestos 13 Capítulo 2 (continuación) 20 Introducción y objetivos generales evitar su acumulación en los lisosomas. Así, el Miglustat, empleado en el tratamiento de la enfermedad de Gaucher (una de las LSDs de mayor prevalencia), actúa inhibiendo la glucosilceramida sintasa, enzima responsable de las primeras etapas de la síntesis de la mayoría de los glicoesfingolípidos. Como alternativa a estos tratamientos se encuentra la terapia basada en el uso de chaperonas farmacológicas que implica el uso de pequeñas moléculas que se unen a la enzima aumentando su estabilidad termodinámica o induciendo el correcto plegamiento de la misma. 19 Aunque pudiera parecer contradictorio, se ha observado que inhibidores competitivos de las enzimas implicadas en las LSDs, a concentraciones sub-inhibitorias, son capaces de actuar como chaperonas (ASSC, del inglés Active-Site Specific Chaperones, Figura 3). Estos compuestos, al unirse al sitio activo de la enzima, actúan como moldes para su plegamiento, logrando que la enzima adopte la estructura terciaria adecuada para una correcta función. El complejo inhibidor-enzima se traslada del retículo endoplasmático (RE) al lisosoma y una vez allí, se produce la disociación del complejo, quedando la enzima libre para hidrolizar el correspondiente sustrato, evitando así su acumulación en los lisosomas. 20 19 Parenti, G.; Andria, G.; Valenzano, K. J. Pharmacological chaperone therapy: preclinical development, clinical translation, and prospects for the treatment of lysosomal storage disorders. Mol. Ther. 2015, 23, 1138-1148. 20 Fan, J. –Q. A contradictory treatment for lysosomal storage disorders: inhibitors enhance mutant enzyme activity. Trends Pharmacol. Sci. 2003, 24, 355-360. Introducción y objetivos generales 21 Figura 3. Sistema de control de calidad del RE y función de chaperonas específicas del sitio activo (figura adaptada de Trends in Pharmacological Science, 2013, 24, 355-360). El Migalastat, 21 uno de los tres iminoazúcares que se comercializan como fármacos, actúa como chaperona farmacológica de la enzima -galactosidasa A lisosomal, la cual se encuentra implicada en otra de las LSDs de mayor prevalencia, la enfermedad de Fabry. Los iminoazúcares han mostrado además efectividad como chaperonas farmacológicas en otras enfermedades de almacenamiento lisosomal como la enfermedad de Gaucher, Gangliosidosis GM1, 22 Sandhoff y Tays-Sachs. 23 La primera de ellas está 21 Markham, A. Migalastat: first global approval. Drugs 2016, 76, 1147-1152. 22 Sánchez Fernández, E. M.; García Fernández, J. M.; Ortiz-Mellet, C. Glycomimetic-based pharmacological chaperones for lysosomal storage disorders: lessons from Gaucher, GM1- gangliosidosis and Fabry diseases. Chem. Commun. 2016, 52, 5497-5515. 23 a) Kato, A.; Nakagome, I.; Nakagawa, S.; Kinami, K.; Adachi, I.; Jenkinson, S. F.; Désiré, J.; Blériot, Y.; Nash, R. J.; Fleet, G. W. J.; Shuichi Hirono, S. In silico analyses of essential interactions of iminosugars with the Hex A active site and evaluation of their pharmacological chaperone effects for Tay–Sachs disease. Org. Biomol. Chem., 2017, 15, 9297-9304. b) Tropak, M. B.; Reid, S. P.; Guiral, M.; Withers, S. 22 Introducción y objetivos generales relacionada con la enzima β-glucocerebrosidasa (una β-glucosidasa lisosomal), la segunda con la β-galactosidasa y la última con β-N-acetilhexosaminidasas. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos realizados, su traslado a la clínica ha sido muy limitado debido, en parte, a su capacidad para inhibir la enzima en cuestión. Recientemente se han identificado chaperonas no inhibidoras capaces de aumentar la actividad de la enzima defectuosa actuando como ligandos de tipo alostérico. 24 Otro de los problemas más comunes encontrados en la búsqueda de chaperonas farmacológicas derivadas de iminoazúcares y, en general, en la aplicación de estos compuestos como fármacos, se encuentra relacionado con la limitada permeabilidad a través de las membranas, así como con la falta de selectividad, lo que origina efectos secundarios no deseados. 25 Estudios estructura-actividad llevados a cabo por nuestro grupo de G.; Mahuran, D. Pharmacological enhancement of β-hexosaminidase activity in fibroblasts from adult Tay-Sachs and Sandhoff patients. J. Biol. Chem. 2004, 279, 13478-13487. 24 Jung, O.; Patnaik, S.; Marugan, J.; Sidransky, E.; Westbroek, W. Progress and potential of noninhibitory small molecule chaperones for the treatment of Gaucher disease and its implications for Parkinson disease. Expert Review of Proteomics 2016, 13, 471-479. 25 Horne, G.; Wilson, F. X.; Tinsley, J.; Williams, D. H.; Storer, R. Iminosugars past, present and future: medicines for tomorrow. Drug Discovery Today 2011, 16, 107-118. Introducción y objetivos generales 23 investigación 26 y otros 27 han mostrado que la selectividad de los iminoazúcares frente a una determinada glicosidasa puede aumentar mediante la inserción de restos aromáticos y/o alifáticos que favorezcan interacciones adicionales de tipo alostérico con la enzima. En la Figura 4 se muestran algunos ejemplos de iminoazúcares procedentes de estos estudios, así como los correspondientes valores de la constante de inhibición Ki (ver anexo “Conceptos generales sobre inhibición enzimática”) que presentaron. 26 a) Moreno-Vargas, A. J.; Robina, I.; Demange, R.; Vogel, P. Synthesis and glycosidase inhibitory activities of 5-(1’,4’-dideoxy-1’,4’-imino-D-erythrosyl)-2-methyl-3-furoic acid (5-[(3S,4R)-3,4- dihydroxypyrrolidine-2-yl]-2-methylfuran-3-carboxylic acid) derivatives: new leads as selective α-L- fucosidase and β-galactosidase inhibitors. Helv. Chim. Acta 2003, 86, 1894-1913. b) Carmona, A. T.; Popowycz, F.; Gerber-Lemaire, S.; Rodríguez-García, E.; Schütz, C.; Vogel, P.; Robina, I. Synthesis and glycosidase inhibitory activities of 2-(aminoalkyl)pyrrolidine-3,4-diol derivatives. Bioorg. Med. Chem. 2003, 11, 4897-4911. c) Moreno-Vargas, A. J.; Carmona A. T.; Mora F.; Vogel, P.; Robina, I. Stereoselective synthesis of (2S,3S,4R,5S)-5-methylpyrrolidine-3,4-diol derivatives that are highly selective α-L-fucosidase inhibitors. Chem. Commun. 2005, 4949-4951. d) Moreno-Clavijo, E.; Carmona, A.T.; Vera-Ayoso, Y.; Moreno-Vargas, A.J.; Bello, C.; Vogel, P.; Robina, I. Synthesis of novel pyrrolidine 3,4-diol derivatives as inhibitors of α-L-fucosidases. Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 1192. e) Martínez- Bailén, M.; Carmona, A. T.; Patterson-Orazem, A. C.; Lieberman, R. L.; Ide, D.; Kubo, M.; Kato, A.; Robina, I.; Moreno-Vargas., A. J. Exploring substituent diversity on pyrrolidine-aryltriazole iminosugars: Structural basis of β-glucocerebrosidase inhibition. Bioorg. Chem. 2019, 82, 652. 27 a) Wu, C. –Y.; Chang, C. –F.; Chen, J. S. –Y.; Wong, C. –H.; Lin, C. –H. Rapid diversity-oriented synthesis in microtiter plates for in situ screening: discovery of potent and selective α-fucosidase inhibitors. Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 4661-4664. b) Ho, C. –W.; Popat, S. D.; Liu, T. –W.; Tsai, K. –C.; Ho, M. –J.; Chen, W. –H.; Yang, A. –S.; Lin, C. –H. Development of GlcNAc-inspired iminocyclitols as potent and selective N-acetyl-β-hexosaminidase inhibitors. Chem. Biol. 2010, 5, 489-497. c) Kotland, A.; Accadbeld, F.; Robeyns, K.; Behr, J.-B. Synthesis and fucosidase inhibitory study of unnatural pyrrolidine alkaloid 4-epi-(+)-codonopsinine. J. Org. Chem. 2011, 76, 4094-4098. d) Hottin, A.; Wright, D. W.; Davies, G. J.; Behr, J.-B. Exploiting the hydrophobic terrain in fucosidases with aryl-substituted pyrrolidine iminosugars. ChemBioChem 2015, 16, 277-283. 24 Introducción y objetivos generales Figura 4. Ejemplos representativos de derivados de iminoazúcares sintetizados en el grupo de investigación. Influencia del resto aromático en la inhibición. La síntesis de este tipo de derivados en ocasiones es compleja por lo que es deseable el desarrollo de estrategias sintéticas que puedan conducir de manera eficaz a inhibidores potentes y selectivos de glicosidasas que, además, posean características estructurales compatibles con una buena permeabilidad a través de las membranas biológicas. Las reacciones de tipo clic resultan ser una aproximación sintética eficiente para la unión de dos bloques de síntesis y es muy adecuada para la generación rápida de librerías químicas de conjugados, lo que es de gran interés para el establecimiento de relaciones estructura-actividad (SAR). 28 El concepto de la química clic fue introducido por el Prof. Sharpless 29 y colaboradores para definir una nueva metodología sintética que utiliza exclusivamente las transformaciones químicas más eficaces, que implican condiciones de reacción sencillas (insensibles al oxígeno o al agua) y que originan los correspondientes productos de forma cuantitativa tras procesos de purificación sencillos. Esta metodología 28 Thirumurugan, P.; Matosiuk, D.; Jozwiak, K. Click chemistry for drug development and diverse chemical-biology applications. Chem. Rev. 2013, 113, 4905-4979. 29 Kolb, H. C.; Finn, M. G.; Sharpless, K. B. Click chemistry: diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004-2021. Introducción y objetivos generales 25 resulta adecuada para la identificación y posterior modificación estructural de moléculas con potencial actividad biológica. La posibilidad de generar quimiotecas de compuestos mediante reacciones clic y llevar a cabo la evaluación biológica in situ, sin necesidad de purificación de cada uno de los componentes individuales, ha permitido el descubrimiento rápido de moléculas bioactivas de diversa índole. 30 La elección de la reacción clic a utilizar en este tipo de estrategias es crucial para el éxito de la metodología ya que los reactivos y subproductos que se generen no deben interferir en el posterior análisis biológico de los crudos de reacción. En este sentido, la reacción clic más utilizada ha sido la bien conocida reacción de cicloadición 1,3-dipolar de azidas y alquinos catalizada por Cu (I) (CuAAC) 31 desarrollada por Sharpless 32 y Meldal. 33 En el Esquema 2 se muestra la estrategia basada en reacciones paralelas CuAAC seguido de análisis biológico in situ para la identificación de moléculas bioactivas. 30 Brik, A.; Wu, C.-Y.; Wong, C.-H. Microtiter plate based chemistry and in situ screening: a useful approach for rapid inhibitor discovery. Org. Biomol. Chem. 2006, 4, 1446-1457. 31 Wang, X.; Huang, B.; Liu, X.; Zhan, P. Discovery of bioactive molecules from CuAAC click-chemistry- based combinatorial libraries. Drug Discov. Today 2016, 21, 118-132. 32 Rostovtsev, V. V.; Green, L. G.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B. A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599. 33 Tornøe, C. W.; Christensen, C.; Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 2002, 67, 3057–3064. 26 Introducción y objetivos generales Esquema 2. Esquema general para la identificación de moléculas bioactivas mediante la generación de librerías de triazoles mediante reacción CuAAC seguido de análisis biológico in situ. Nuestro grupo de investigación ha utilizado esta estrategia en los últimos años para la preparación de inhibidores de glicosidasas con estructura de dihidroxipirrolidina. Las Introducción y objetivos generales 27 pirrolidinas polihidroxiladas son iminoazúcares con actividad biológica potente que, en comparación con las piperidinas polihidroxiladas, poseen menor carácter hidrofílico. Además, la inserción de restos aromáticos contiguos a un núcleo de dihidroxipirrolidina aumenta el carácter hidrofóbico del iminoazúcar en conjunto, lo que facilitaría la permeabilidad a través de las membranas celulares. Esta estrategia nos ha permitido encontrar inhibidores potentes y selectivos de distintos tipos de α-fucosidasas, 34 βglucosidasas y α-galactosidasas (compuestos 12, 13, 14, Figura 5). 35 El aumento de potencia y selectividad en la inhibición puede deberse a interacciones no específicas en la proximidad del sitio activo por parte de los grupos aromáticos, algo que ya habíamos observado en un complejo cristalino α-fucosidasa bacteriana/inhibidor. 36 Figura 5. Estructuras de inhibidores de glicosidasas obtenidos en el grupo de investigación mediante evaluación in situ de una librería de compuestos. 34 a) Moreno-Vargas, A.J.; Carmona, A. T.; Mora, F.; Vogel, P.; Robina, I. Stereoselective synthesis of (2S,3S,4R,5S)-5-methylpyrrolidine-3,4-diol derivatives that are highly selective α-L-fucosidase inhibitors. Chem. Commun. 2005, 4949-4951. b) Elías-Rodríguez, P.; Moreno-Clavijo, E.; Carmona, A.T.; Moreno-Vargas, A. J.; Robina, I. Rapid discovery of potent α-fucosidase inhibitors by in situ screening of a library of (pyrrolidin-2-yl)triazoles. Org. Biomol. Chem. 2014, 12, 5898-5904. 35 Martínez-Bailen, M.; Carmona, A. T.; Moreno-Clavijo, E.; Robina, I.; Ide, D.; Kato, A.; Moreno-Vargas, A. J. Tuning of βglucosidase and α-galactosidase inhibition by generation and in situ screening of a library of pyrrolidine-triazole hybrid molecules. Eur. J. Med. Chem. 2017, 138, 532−542. 36 Wright, D. W.; Moreno-Vargas, A. J.; Carmona, A. T.; Robina, I.; Davies, G. J. Three dimensional structure of a bacterial α-L-fucosidase with a 5-membered iminocyclitol inhibitor. Bioorg. Med. Chem. 2013, 21, 4751-4754. 28 Introducción y objetivos generales Por otro lado, recientemente se ha observado que la presentación de múltiples copias de un iminoazúcar en plataformas multivalentes puede implementar considerablemente las propiedades de un inhibidor a través del fenómeno conocido como multivalencia. 37 Este concepto había sido ampliamente estudiado en los procesos de interacción carbohidrato-lectina, 38 observándose que los carbohidratos multivalentes lograban una afinidad extraordinaria en la interacción con lectinas, muy por encima de la esperada por simples efectos estadísticos. Aunque hay distintos mecanismos para explicar el efecto multivalente, el que origina los efectos más acusados es el conocido como “efecto quelato”, que consiste en la interacción simultánea de varios epítopos de un compuesto multimérico con distintos receptores adyacentes. Este efecto, factible en el caso de proteínas multiméricas como las lectinas, a priori no sería igual de factible con las glicosidasas que, en la mayoría de las ocasiones, solo poseen un sitio activo como receptor. Este hecho, unido a la dificultad sintética para la preparación de iminoazúcares multiméricos, retrasó enormemente el desarrollo de inhibidores multivalentes de glicosidasas, apareciendo el primer ejemplo representativo en el año 2009. 39 Sin embargo, a lo largo de la pasada década han sido numerosos los trabajos publicados relativos al estudio de inhibidores multivalentes de glicosidasas. 40 Los resultados más relevantes en términos de efecto multivalente 37 Pieters, R. J. Maximising multivalency effects in protein–carbohydrate interactions. Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 2013–2025. 38 a) Mueller, C.; Despras, G.; Lindhorst, T. K. Organizing multivalency in carbohydrate recognition. Chem. Soc. Rev. 2016, 45, 3275-3302. b) Cecioni, S.; Imberty, A.; Vidal, S. Glycomimetics versus multivalent glycoconjugates for the design of high affinity lectin ligands. Chem. Rev. 2015, 115, 525– 561. 39 Diot, J.; García-Moreno, M. I.; Gouin, S. G.; Ortiz Mellet, C.; Haupt, K.; Kovensky, J. Multivalent iminosugars to modulate affinity and selectivity for glycosidases. Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 357-363. 40 Revisiones destacadas: a) Compain, P.; Bodlenner, A. The multivalent effect inglycosidase inhibition: a new, rapidly emerging topic in glycoscience. ChemBioChem 2014, 15, 1239-1251; b) Gouin, S.G. Multivalent inhibitors for carbohydrate-processing enzymes: beyond the “lock-and-key” concept. Chem. Eur J. 2014, 20, 11616-11628; c) Zelli, R.; Longevial, J.-F.; Dumy, P.; Marra, A. Synthesis and biological properties of multivalent iminosugars. New J. Chem. 2015, 30, 5050-5074; d) Matassini, C.; Introducción y objetivos generales 29 observado han sido frente a la α-manosidasa de guisantes de Jack (JBα-man). 41 El efecto multivalente puede analizarse en base al parámetro conocido como rp/n, 42 que se define como la potencia de inhibición relativa (rp) por unidad monomérica, siendo n la valencia del multímero. La JBα-man, recientemente cristalizada en complejo con un inhibidor multimérico, 43 es una enzima con más de un sitio activo situados en una cavidad muy abierta y accesible, lo que facilita el acceso a moléculas inhibidoras de un tamaño considerable. Este hecho justificaría los altos valores de rp/n observados en la inhibición de esta enzima por parte de inhibidores multivalentes. En el caso de glicosidasas con sitios activos menos accesibles (como la maltasa de levadura, β-glucosidasa de almendras y α-galactosidasa de granos de café), el efecto multivalente podría explicarse en base a interacciones con sitios no catalíticos Parmeggiani, C.; Cardona, F.; Goti, A. Are enzymes sensitive to the multivalent effect? Emerging evidence with glycosidases. Tetrahedron Lett. 2016, 57, 5407-5415. e) Compain, P. Multivalent effect in glycosidase inhibition: The end of the beginning. Chem. Rec. 2020, 20, 10–22. 41 Ejemplos seleccionados: a) Compain, P.; Decroocq, C.; Iehl, J.; Holler, M.; Hazelard, D.; Mena Barragán, T.; Ortiz Mellet, C.; Nierengarten, J. –F. Glycosidase inhibition with fullerene iminosugar balls: a dramatic multivalent effect. Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 5753-5756. b) Decroocq, C.; Rodríguez-Lucena, D.; Russo, V.; Mena Barragán, T.; Ortiz Mellet, C.; Compain, P. The multivalent effect in glycosidase inhibition: probing the influence of architectural parameters with cyclodextrin-based iminosugar “click” clusters. Chem. Eur. J. 2011, 17, 13825-13831. c) Lepage, M. L.; Schneider, J. P.; Bodlenner, A.; Meli, A.; De Riccardis, F.; Schmitt, M.; Tarnus, C.; Nguyen- Huynh, N. –T.; Francois, Y. – N.; Leize-Wagner, E.; Birck, C.; Cousido-Siah, A.; Podjarny, A.; Izzo, I.; Compain, P. Iminosugarcyclopeptoid conjugates raise multivalent effect in glycosidase inhibition at unprecedented high levels. Chem. Eur. J. 2016, 22, 5151-5155. d) Mirabella, S.; D’Adamio, G.; Matassini, C.; Goti, A.; Delgado, S.; Gimeno, A.; Robina, I.; Moreno-Vargas, A. J.; Šesták, S.; Jiménez-Barbero, J.; Cardona, F. Mechanistic insight into the binding of multivalent pyrrolidines to α-mannosidases. Chem. Eur. J. 2017, 23, 14585- 14596 42 rp: potencia relativa de inhibición de un compuesto multimérico respecto a la de su monómero de referencia. Se puede determinar en base a la constante de inhibición Ki o al valor del IC50 [Ki (monómero)/ Ki (multímero)]; rp/n, es la potencia relativa de inhibición corregida con la valencia del multímero. Se considera que hay multivalencia cuando rp/n > 1.0. 43 Howard, E.; Cousido-Siah, A.; Lepage, M. L.; Schneider, J. P.; Bodlenner, A.; Mitschler, A.; Meli, A.; Izzo, I.; Alvarez, H. A.; Podjarny, A.; Compain, P. Structural basis of outstanding multivalent effects in Jack bean α-mannosidase inhibition. Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 8002 –8006. Antecedentes 36 CAPÍTULO 1: Síntesis y evaluación biológica in situ de iminoazúcares monovalentes como inhibidores de glicosidasas. 1.1 ANTECEDENTES 1.1.1. Incorporación de restos aromáticos en iminoazúcares como estrategia para mejorar la capacidad de inhibición. Una de las estrategias más utilizadas con el fin de mejorar las propiedades inhibidoras de los iminoazúcares consiste en la incorporación de restos aromáticos/alifáticos sobre el esqueleto pirrolidínico/piperidínico original. Estos restos permiten establecer nuevas interacciones alostéricas/secundarias con la enzima que frecuentemente mejoran la potencia y selectividad de inhibición. 53 En nuestro grupo de investigación, la incorporación de restos (hetero)aromáticos en núcleos de pirrolidina dihidroxilada ha permitido obtener inhibidores potentes y selectivos de diversas glicosidasas. 54 Esta estrategia permitió aumentar los valores de inhibición de estos derivados, mejorando la falta de selectividad típica de los inhibidores pirrolidínicos y, a la vez, aumentando el carácter lipofílico, y por lo 53 a) Wu, C. –Y.; Chang, C. –F.; Chen, J. S. –Y.; Wong, C. –H.; Lin, C. –H. Rapid diversity-oriented synthesis in microtiter plates for in situ screening: discovery of potent and selective α-fucosidase inhibitors. Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 4661-4664. b) Ho, C. –W.; Popat, S. D.; Liu, T. –W.; Tsai, K. –C.; Ho, M. –J.; Chen, W. –H.; Yang, A. –S.; Lin, C. –H. Development of GlcNAc-inspired iminocyclitols as potent and selective N-acetyl-β-hexosaminidase inhibitors. Chem. Biol. 2010, 5, 489-497. c) Hottin, A.; Wright, D.W.; Davies, G.J.; Behr, J.-B.; Exploiting the hydrophobic terrain in fucosidases with aryl-substituted pyrrolidine iminosugars. ChemBioChem, 2015, 16, 277–283.b) Kotland, A.; Accadbled, F.; Robeyns, K.; Behr, J.-B. Synthesis and fucosidase inhibitory study of unnatural pyrrolidine alkaloid 4-epi-(+)- codonopsinine. J. Org. Chem. 2011, 76, 4094−4098. 54 a) Moreno-Clavijo, E.; Carmona, A. T.; Vera-Ayoso, Y.; Moreno-Vargas, A. J.; Bello, C.; Vogel, P.; Robina, I. Synthesis of novel pyrrolidine 3,4-diol derivatives as inhibitors of α-L-fucosidases. Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 1192-1202. b) Moreno-Vargas, A. J.; Carmona, A. T.; Mora, F.; Vogel, P.; Robina, I. Stereoselective synthesis of (2S,3S,4R,5S)-5-methylpyrrolidine-3,4-diol derivatives that are highly selective α-L-Fucosidase inhibitors. Chem. Commun. 2005, 4949−4951. 37 Capítulo 1 tanto la permeabilidad a través de las membranas biológicas. Un ejemplo de lo expuesto puede observarse en los valores de inhibición frente a α-fucosidasa de los derivados de dihidroxipirrolidina 15-18 (Figura 7). Figura 7. Efecto de la presencia de sustituyentes aromáticos en la inhibición de α-fucosidasas. La diamina 15 es un inhibidor potente y selectivo de α-fucosidasa de epidídimo bovino (Ki = 1.8 µM), sin embargo, sus propiedades inhibidoras mejoran sensiblemente gracias a la introdución de un grupo fenilo en el derivado 16 (Ki = 0.24 µM). El efecto de la presencia de sustituyentes aromáticos resulta aún más beneficioso para los compuestos 17 (Ki = 40 nM) y 18 (Ki = 80 nM), obteniéndose valores para la constante de inhibición en el rango nanomolar. En los ultimos años las reacciones clic han captado notablemente la atención en el ámbito de la investigación farmacológica ya que representan una metodología eficiente para conectar dos bloques moleculares de manera estable y, por lo tanto, para la rápida preparación de librerías químicas de derivados útiles para estudios de relaciones estructuraactividad (SAR). 55 Entre las reacciones clic, la cicloadición 1,3-dipolar entre azidas y alquinos terminales catalizada por Cu(I) (CuAAC), es la que, sin duda, ha sido más utilizada para la síntesis de moléculas biológicamente activas en el campo de la química médica y, también 55 a) Thirumurugan, P.; Matosiuk, D.; Jozwiak, K. “Click” chemistry for drug development and diverse chemical-biology applications. Chem. Rev. 2013, 113, 4905−4979. b) Kolb, H. C.; Finn, M. G.; Sharpless, K. B. “Click” chemistry: diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem., Int. Ed. 2001, 40, 2004−2021. Antecedentes 38 en la búsqueda de inhibidores de glicosidasas. 56 La importancia de la reacción CuAAC desde el punto de vista químico-biológico se traduce en la posibilidad de mejorar las propiedades inhibidoras de los iminoazúcares gracias a la incorporación de un grupo 1,2,3-triazol cuya estructura es un mimético no hidrolizable del enlace peptídico 57 capaz de establecer enlaces de hidrógeno con los aminoácidos del sitio activo de la enzima. 58 En 2019 nuestro grupo de investigación ha publicado la síntesis de una quimioteca de pirrolidín-ariltriazoles obtenidos mediante reacción CuAAC entre dos azidometilpirrolidinas epiméricas dihidroxiladas y una colección de fenilacetilenos diferentemente sustituidos. Ambas familias de derivados epiméricos demostraron una elevada actividad de inhibición frente a la enzima β-glucocerebrosidasa de lisosoma humano (GCase), siendo los compuestos 3,5-disustituidos 19 y 20 los más activos (Figura 8). 59 56 Ver Introducción y objetivos generales, pág. 24. 57 a) Horne, W. S.; Yadav, M. K.; Stout, C. D.; Ghadiri, M. R. Heterocyclic peptide backbone modifications in an α-helical coiled coil. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15366-15367. b) Kolb, H. C.; Sharpless, K. B. The growing impact of “click” chemistry on drug discovery. Drug Discovery Today 2003, 8, 1128-1137. 58 Valverde, I. E.; Bauman, A.; Kluba, C. A.; Vomstein, S.; Walter, M. A.; Mindt, T. L. 1,2,3-Triazoles as amide bond mimics: triazole scan yields protease-resistant peptidomimetics for tumor targeting. Angew. Chem. Int. Ed., 2013, 52, 8957-8960. 59 Martínez-Bailén, M.; Carmona, A.T.; Patterson-Orazem, A. C.; Lieberman, R. L.; Ide, D.; Kubo, M.; Kato, A.; Robina, I.; Moreno-Vargas, A. J. Exploring substituent diversity on pyrrolidine-aryltriazole iminosugars: Structural basis of β-glucocerebrosidase inhibition. Bioorg. Chem. 2019, 86, 652-664. 39 Capítulo 1 Figura 8. Pirrolidín-ariltriazoles epiméricos inhibidores de β-glucocerebrosidasa de lisosoma humano. Los estudios de cristalización entre 20 (R= Cl) y la GCase han demostrado no sólo que la unidad de pirrolidina interacciona con los aminoácidos del sitio catalítico, sino también que el residuo de ariltriazol establece interacciones secundarias a lo largo de un surco superficial hidrofóbico de la enzima. Es importante destacar que algunos de estos compuestos actuaron como chaperonas farmacológicas aumentando la actividad enzimática de la GCase en fibroblastos de pacientes con enfermedad de Gaucher. La posibilidad de generar quimiotecas de derivados de iminoazúcares mediante reacciones clic, y llevar a cabo la evaluación biológica in situ, sin necesidad de purificación de cada uno de los componentes individuales, ha permitido el descubrimiento rápido de potentes inhibidores de glicosidasas. El primer ejemplo de utilización de esta aproximación en la identificación de nuevos inhibidores de glicosidasas fue descrito por Vogel y cols., en colaboración con nuestro grupo de investigación. 60 En este trabajo se llevó a cabo la 60 Gerber-Lemaire, S.; Popowycz, F.; Rodríguez-García, E.; Carmona Asenjo, A. T.; Robina, I.; Vogel, P. An efficient combinatorial method for the discovery of glycosidase inhibitors. ChemBioChem 2002, 3, 466-470. Antecedentes 40 formación y evaluación in situ de una librería química de iminas (Esquema 3), que presentaron inhibición frente a α-manosidasas. Esquema 3. Síntesis de iminas derivadas de dihidroxipirrolidinas como inhibidores de α-manosidasas. Posteriormente, C.-H. Wong llevó a cabo la reacción de amidación entre la 1- aminometilfuconojirimicina y una colección de ácidos carboxílicos comerciales seguido de evaluación biológica in situ de los crudos de reacción frente a α-fucosidasas (Esquema 4). 61 Este estudio permitió concluir que la enzima interaccionaba mejor con derivados que incorporaban un aglicón aromático que aquellos que presentaban uno de tipo alquílico. Esquema 4. Síntesis de amidas derivadas de la fuconojirimicina descrita por Wong y cols. como inhibidores de α-fucosidasas. Aunque ambas aproximaciones utilizan reacciones que no pueden considerarse estrictamente como reacciones clic, supusieron los primeros ejemplos de preparación de 61 Wu, C. –Y.; Chang, C. –F.; Chen, J. S. –Y.; Wong, C. –H.; Lin, C. –H. Rapid diversity-oriented synthesis in microtiter plates for in situ screening: discovery of potent and selective α-fucosidase inhibitors. Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 4661-4664. 41 Capítulo 1 librerías de compuestos seguido de evaluación in situ para la identificación de inhibidores potentes de glicosidasas. La reacción CuAAC seguido de evaluación biológica in situ se ha utilizado en nuestro grupo de investigación para la identificación de forma rápida de inhibidores potentes de una serie de glicosidasas. La estrategia se basó en la reacción clic entre azidometilpirrolidinas o alquinilpirrolidinas configuracionalmente diversas con una colección de alquinos o azidas comerciales (Esquema 5). 62 Esta aproximación permitió la identificación de los compuestos 12-14 (Figura 5, pág. 27) como inhibidores potentes de α-fucosidasa, β-glucosidasa y αgalactosidasa. 62 a) Elías-Rodríguez, P.; Moreno-Clavijo, E.; Carmona, A.T.; Moreno-Vargas, A. J.; Robina, I. Rapid discovery of potent α-fucosidase inhibitors by in situ screening of a library of (pyrrolidin-2-yl)triazoles. Org. Biomol. Chem. 2014, 12, 5898-5904. b) Martínez-Bailen, M.; Carmona, A. T.; Moreno-Clavijo, E.; Robina, I.; Ide, D.; Kato, A.; Moreno-Vargas, A. J. Tuning of βglucosidase and α-galactosidase inhibition by generation and in situ screening of a library of pyrrolidine-triazole hybrid molecules. Eur. J. Med. Chem. 2017, 138, 532−542. Antecedentes 42 Esquema 5. Estrategias sintéticas basadas en reacciones CuAAC seguidas de evaluación biológica in situ desarrolladas en el grupo de investigación. Aunque entre las ventajas de la reacción de CuAAC se encuentran los elevados rendimientos y la ausencia de subproductos que podrían interferir con la evaluación biológica, 63 no se puede ignorar que su principal limitación deriva del uso del catalizador de Cu (I) ya que los niveles permitidos en compuestos con potencial aplicación farmacológica son muy bajos (30 ppm). 64 Aunque el Cu(I) se utiliza de manera catalítica y los productos finales se purifican mediante técnicas convencionales, en ocasiones, las trazas de Cu(I) 63 Lallana, E.; Riguera, R.; Fernandez-Megía, E. Reliable and efficient procedures for the conjugation of biomolecules through Huisgen azide-alkyne cycloadditions. Angew. Chem., Int. Ed. 2011, 50, 8794−8804. 64 a) Ostrovskis, P.; Volla, C. M. R.; Turks, M.; Markovic, D. Application of metal free click chemistry in biological studies. Curr. Org. Chem. 2013, 17, 610−640. b) International conference on harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use: Guideline for elemental impurities (December 2014). Véase: www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/ Guidelines/Quality/Q3D/Q3D_Step_4.pdf. 43 Capítulo 1 pueden formar complejos con las propios productos bioactivos sintetizados dificultando su purificación. 65 Aparte de la CuAAC, el uso de otro tipo de reacciones clic en el ámbito de la química médica ha sido muy limitado. 66 Un caso interesante está representado por la serie de 1- desoxigalactonojirimicina-ariltioureas (DGJ-ArTioureas) derivadas de la 1- desoxigalactonojirimicina (DGJ) descritas por Ortiz-Mellet y cols. en 2014 (Figura 9). 67 Figura 9. Estructura general de la serie de DGJ-ArTioureas derivadas de la DGJ. En el artículo se investiga la capacidad de las DGJ-ariltioureas sintetizadas para actuar como chaperonas farmacológicas frente a α‑galactosidasa A humana y se comparan los 65 Billault, I.; Pessel, F.; Petit, A.; Turgis, R.; Scherrmann, M.-C. Investigation of the copper(I) catalyzed azide-alkyne cycloaddition reactions (CuAAC) in Molten PEG2000. New J. Chem. 2015, 39, 1986−1995. 66 a) Dondoni, A.; Marra, A. SuFEx: a metal-free click ligation for multivalent biomolecules. Org. Biomol. Chem. 2017, 15, 1549−1553. b) Petrelli, A.; Samain, E.; Pradeau, S.; Halila, S.; Fort, S. Efficient conjugation of oligosaccharides to polymer particles through furan/maleimide Diels-Alder reaction: application to the capture of carbohydrate-binding proteins. ChemBioChem 2017, 18, 206−212. c) Kanfar, N.; Tanc, M.; Dumy, P.; Supuran, C. T.; Ulrich, S.; Winum, J.-Y. Effective access to multivalent inhibitors of carbonic anhydrases promoted by peptide bioconjugation. Chem. - Eur. J. 2017, 23, 6788−6794. d) Ulrich, S.; Boturyn, D.; Marra, A.; Renaudet, O.; Dumy, P. Oxime ligation: a chemoselective click-type reaction for accessing multifunctional biomolecular constructs. Chem. - Eur. J. 2014, 20, 34−41. e) Dondoni, A.; Marra, A. Recent applications of thiolene coupling as a click process for glycoconjugation. Chem. Soc. Rev. 2012, 41, 573−586. 67 Yu, Y.; Mena-Barragan, T.; Higaki, K.; Johnson, J. L.; Drury, J. E.; Lieberman, R. L.; Nakasone, N.; Ninomiya, H.; Tsukimura, T.; Sakuraba, H.; Suzuki, Y.; Nanba, E.; Ortiz-Mellet, C.; García Fernandez, J. M.; Ohno, K.; Molecular basis of 1-deoxygalactonojirimycin arylthiourea binding to human αgalactosidase A: pharmacological chaperoning efficacy on Fabry disease mutants. ACS Chem. Biol. 2014, 9, 1460−1469. Antecedentes 44 resultados obtenidos con los datos relativos a la 1-desoxigalactonojirimicina (DGJ) que actualmente se comercializa con el nombre de Migalastat. Los estudios del complejo cristalino entre la 1-desoxigalactonojirimicina-p-fluorofeniltiourea (DGJ-pFPhT) y la α-Gal A evidenciaron una interacción entre el protón del -NH de la tiourea y el residuo catalítico de ácido aspártico-D231, confirmando el importante papel desempeñado por la tiourea como fuerte donador de enlaces de hidrógeno. De este modo, con la introducción de este grupo, se logra aumentar la afinidad enzima-inhibidor y, a la vez, mejorar su caracter lipofílico lo que se traduce en una mejora del perfil farmacocinético. 1.1.2. Modificaciones estructurales en derivados pirrolidínicos, pirrolizidínicos e indolizidínicos. Las pirrolizidinas y las indolizidinas polihidroxiladas son alcaloides con estructura bicíclica pertenecientes a la familia de los iminoazúcares. Ambos tipos de estructuras han sido objeto de estudio debido a su actividad inhibidora frente a las glicosidasas y consecuentemente a su posible uso farmacológico. 68 En este sentido, pirrolizidinas polihidroxiladas de origen natural como la casuarina, la australina y las hiacintacinas han presentado actividad como inhibidores de varias glicosidasas. Esto mismo sucede con derivados polihidroxilados de indolizidinas, como la castanospermina, lentiginosina y swainsonina (Figura 10). 69 68 a) Compain, P.; Martin, O. R. Iminosugars: from synthesis to therapeutic applications. Eds.; Wiley- VCH: Weinheim, 2007. b) Watson, A. A.; Fleet, G. W. J.; Asano, N.; Molyneux, R. J.; Nash, R. J. Polyhydroxylated alkaloids natural occurrence and therapeutic applications. Phytochemistry 2001, 56, 265−295. 69 a) Robertson, J.; Stevens, K. Pyrrolizidine alkaloids: occurrence, biology, and chemical synthesis. Nat. Prod. Rep. 2017, 34, 62−89. b) Michael, J. P. Simple indolizidine and quinolizidine alkaloids. The alkaloids: chemistry and biology 2016, 75, 1-498. c) Kato, A.; Hirokami, Y.; Kinami, K.; Tsuji, Y.; Miyawaki, S.; Adachi, I.; Hollinshead, J.; Nash, R. J.; Kiappes, J. L.; Zitzmann, N.; Cha, J. K.; Molyneux, R. 45 Capítulo 1 Figura 10. Ejemplos de pirrolizidinas e indolizidinas de origen natural con actividad como inhibidores de glicosidasas. La mayoría de pirrolizidinas e indolizidinas carecen de selectividad en la inhibición de glicosidasas, además de una escasa permeabilidad a través de las membranas biológicas lo que limita su uso como potenciales fármacos. Con el objetivo de obtener inhibidores de tipo pirrolizidínico e indolizidínico más potentes y selectivos, muchos grupos de investigación han propuesto varias modificaciones estructurales, siendo las más comunes las relacionadas con el cambio en la configuración de los centros quirales y en el número de grupos hidroxilos de la molécula. 70 Ejemplos de modificaciones estructurales de otro tipo son más escasos J.; Fleet, G. W. J.; Asano, N. Isolation and SAR studies of bicyclic iminosugars from castanospermum australe as glycosidase inhibitors. Phytochemistry 2015, 111, 124−131. d) Desvergnes, V.; Landais, Y. Structure, biological properties, and total synthesis of polyhydroxylated pyrrolizidines of the hyacinthacines family. Stud. Nat. Prod. Chem. 2014, 42, 373−419. e) Ritthiwigrom, T.; Pyne, S. G. Stud. isolation, biological activities, and synthesis of the natural casuarines. Stud. Nat. Prod. Chem. 2012, 36, 1−26. 70 a) Lieou Kui, E.; Kanazawa, A.; Behr, J.B.; Py, S. Ring‐junction‐substituted polyhydroxylated pyrrolizidines and indolizidines from ketonitrone cycloadditions. Eur. J. Org. Chem. 2018, 19, 2178- 2192. b) Martella, D.; D'Adamio, G.; Parmeggiani, C.; Cardona, F.; Moreno-Clavijo, E.; Robina, I.; Goti, A. Cycloadditions of sugar-derived-nitrones targeting polyhydroxylated indolizidines. Eur. J. Org. Antecedentes 52 a la familia CAZY GH20. 79 Cabe destacar que la dimerización es un requisito previo indispensable para la formación de hexosaminidasas lisosomales catalíticamente activas. 80 Una vez plegadas y ensambladas correctamente, las enzimas se transfieren rápidamente al aparato de Golgi y de aquí a los lisosomas donde el procesamiento final produce las enzimas maduras. 81 Mutaciones en cualquiera de los genes que codifican para las dos subunidades de las β-hexosaminidasas pueden causar enfermedades neurológicas muy severas que se dividen en dos categorías: 1) mutaciones en el gen HEXA, que originan defecto de las isoformas HexA y HexS y provocan la enfermedad de Tay-Sachs; 2) mutaciones en el gen HEXB conducen a una deficiencia de isoformas HexA y HexB y provocan la enfermedad de Sandhoff. Ambos trastornos genéticos pertenecen al grupo de las enfermedades de almacenamiento lisosomal (LSD) 82 y se caracterizan por una excesiva acumulación del gangliósido GM2 en los lisosomas neuronales que conduce a neurodegeneración grave y, en muchos casos, letal. 83 Se ha observado que inhibidores competitivos de estas enzimas pueden actuar como chaperonas farmacológicas para el tratamiento de estas LSDs. 84 A concentraciones 79 CAZY (Carbohydrate-Active enZYmes Database) es una base de datos donde las glicosidasas están clasificadas en base a las relaciones estructura-mecanismo catalítico o en base a los sustratos catalizados. 80 a) Sonderfeld-Fresko, S.; Proia, R. L. Synthesis and assembly of a catalytically active lysosomal enzyme, beta-hexosaminidase B, in a cell-free system. J. Biol. Chem. 1988, 263, 13463–13469. b) Proia, R. L.; d’Azzo, A.; Neufeld, E. F.; Association of alpha- and beta subunits during the biosynthesis of betahexosaminidase in cultured human fibroblasts. J. Biol. Chem. 1984, 259, 3350–3354. 81 Gravel, A.; Kaback, M.; Proia, R. L.; Sandhoff, K.; Suzuki, K. The GM2 gangliosidoses. In the metabolic and molecular bases of inherited diseases, 8th ed., 2001, 3, pp. 3827–3877, McGraw-Hill, New York. 82 Ver Introducción y objetivos generales, pág. 19. 83 a) Mark, B. L.; Mahuran, D. J.; Cherney, M. M.; Zhao, D.; Knapp, S.; James, M. N. G. Crystal structure of human β-hexosaminidase B: understanding the molecular basis of Sandhoff and Tay–Sachs disease. J. Mol. Biol. 2003, 327, 1093–1109. b) Maier, T.; Strater, N.; Schuette, C. G.; Klingenstein, R.; Sandhoff, K.; Saenger, W. The X-ray crystal structure of human β-hexosaminidase B provides new insights into Sandhoff disease. J. Mol. Biol. 2003, 328, 669–681. 84 Kato, A.; Nakagome, I.; Nakagawa, S.i; Kinami, K.; Adachi, I.; Jenkinson, S. F.; Desire, J.; Bleriot, Y.; Nash, R. J.; Fleet, G. W. J.; Hirono, S. In silico analyses of essential interactions of iminosugars with the 53 Capítulo 1 subinhibitorias, estas moléculas son capaces de unirse a las enzimas defectuosas, y favorecer su plegamiento adecuado solucionando el déficit de actividad enzimática. Por otro lado, la inhibición de estas enzimas también es relevante debido a la implicación de las mismas en trastornos articulares como la osteoartritis. 85 El cartílago articular de los pacientes con osteoartritis y artritis reumatoide se caracteriza por una disminución de la concentración y del tamaño de proteoglicanos y glicosaminoglicanos (GAG), fuentes importantes de resistencia hidráulica de las cavidades sinoviales. 86 Los GAG son cadenas largas y no ramificadas de heteropolisacáridos normalmente unidos a una proteína central para formar los proteoglicanos. Estructuralmente están representados por una unidad repetitiva de disacárido con la fórmula general (ácido urónico-aminoazúcar)n donde los aminoazúcares más habituales son la N-acetilglucosamina o la N- acetilgalactosamina. La unidad de aminoazúcar de los GAG puede estar sulfatada, como en el condroitín-sulfato, o no sulfatada como en el ácido hialurónico, uno de los GAG más conocido y abundante en el líquido sinovial (Figura 14). Hex A active site and evaluation of their pharmacological chaperone effects for Tay-Sachs disease. Org. Biomol. Chem. 2017, 15, 9297-9304. 85 a) Shikhman, A. R.; Brinson, D. C.; Lotz, M. Profile of glycosaminoglycan-degrading glycosidases and glycoside sulfatases secreted by human articular chondrocytes in homeostasis and inflammation. Arthritis Rheum. 2000, 43, 1307-1314. b) Lawrence, R. C.; Helmick, C. G.; Arnett, F. C.; Deo, R. A.; Felson, D. T.; Giannini, E. H.; Heyse, S. P.; Hirsch, R.; Hochberg, M. C.; Hunder, G. G.; Liang, M. H.; Pillemer, S. R.; Steen, V. D.; Wolfe, F. Estimates of the prevalence of arthritis and selected musculoskeletal disorders in the United States. Arthritis Rheum. 1998, 41, 778-799. 86 a) Inerot, S.; Heinegard, D.; Audell, L.; Olsson, S.E. Articular cartilage proteoglycan in aging and osteoarthritis. Biochem. J. 1978, 169, 143 156. b) Mankin, H. J.; Lippiello, L. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteoarthritic human hips. J. Bone Joint Surg. (Am.). 1970, 52, 424-434. Antecedentes 54 Figura 14. Estructuras del condroitín-sulfato y del ácido hialurónico. El proceso de degeneración de la matriz del cartílago es un proceso multifactorial, debido en parte a un catabolismo anormalmente elevado de los GAG. Shikhman y cols. 87 demostraron que, de las glicosidasas implicadas en la degradación de los GAG y liberadas por los condrocitos 88 al compartimento extracelular, las hexosaminidasas, eran las enzimas más abundantes, además de ser las glicosidasas predominantes en el fluido sinovial de los pacientes con osteoartritis. Las hexosaminidasas, como se ha comentado, son las enzimas responsables de la hidrólisis de los residuos terminales de N-acetilglucosamina y N- acetilgalactosamina de proteoglicanos. Es por ello, que el desarrollo de inhibidores de hexosaminidasas se presenta como una aproximación de interés para la prevención de la degradación del cartílago y el tratamiento de la osteoartritis. 89 El mecanismo para la hidrólisis de O-glicósidos catalizado por las hexosaminidasas de la familia GH20 es el conocido como mecanismo de retención, en el que se puede apreciar la participación del grupo acetamido en C-2 del sustrato natural (Esquema 6). 90 87 Shikhman, A. R.; Brinson, D. C.; Lotz, M. Profile of glycosaminoglycan-degrading glycosidases and glycoside sulfatases secreted by human articular chondrocytes in homeostasis and inflammation. Arthritis Rheum. 2000, 43, 1307-1314 88 Células del cartílago esenciales para la producción de colágeno y proteoglicanos, así como para el mantenimiento de la matriz cartilaginosa. 89 Liu, J.; Shikhman, A. R.; Lotz, M. K.; Wong, C. H. Hexosaminidase inhibitors as new drug candidates for the therapy of osteoarthritis. Chem. Biol., 2001, 8, 701-711. 90 a) Lai, E. C. K.; Withers, S. G.; Stereochemistry and kinetics of the hydration of 2-acetamido-D-glucal by beta-N-acetylhexosaminidases. Biochemistry 1994, 33, 14743–14749. b) Slámová, K.: Bojarová, P.; 55 Capítulo 1 Esquema 6. Mecanismo de retención correspondiente al proceso catalítico de la enzimas GH20. El sustrato natural interacciona por un lado con el residuo de Glu355 de HexB (Glu323 en HexA), que actúa como residuo ácido-base, y por otro con el de Asp354 (Asp322 en HexA), que ayuda a orientar al grupo acetamido en C-2 para que ataque como nucleófilo. La evolución del estado de transición resulta en la formación de un ion oxazolinio intermedio cuya carga positiva resulta estabilizada por el residuo de Asp354. 91 Un mecanismo similar es el utilizado por la enzima N-acetilglucosaminidasa humana (OGA, GH84) presente en el citosol y responsable de la hidrólisis de residuos de N-acetilglucosamina (GlcNAc) de glicoproteínas citoplasmáticas. La enzima OGA está implicada en una gran variedad de Petrásková, L.; Křen, V. β-N-acetylhexosaminidase: what's in a name…? Biotechnol. Adv. 2010, 28, 682– 693. 91 a) Mark, B. L.; Mahuran, D. J.; Cherney, M. M.; Zhao, D.; Knapp, S.; James, M. N. G. Crystal structure of human β-hexosaminidase B: understanding the molecular basis of Sandhoff and Tay–Sachs disease. J. Mol. Biol. 2003, 327, 1093–1109. b) Maier, T.; Strater, N.; Schuette, C. G.; Klingenstein, R.; Sandhoff, K.; Saenger, W. The X-ray crystal structure of human β-hexosaminidase B provides new insights into Sandhoff Disease. J. Mol. Biol. 2003, 328, 669–681. c) Rye, C. S.; Withers, S. G. Glycosidase mechanisms. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 573-580. d) Sinnott, M. Catalytic mechanism of enzymic glycosyl transfer. Chem. Rev. 1990, 90, 1171-1202. e) Vocadlo, D. J.; Davies, G. J.; Laine, R.; Withers, S. G. Catalysis by hen egg-white lysozyme proceeds via a covalent intermediate. Nature, 2001, 412, 835-838. f) Knapp, S.; Vocadlo, D. J.; Gao, Z.; Kirk, B.; Lou, J.; Withers, S. G. NAG-thiazoline, an N-acetyl- β-hexosaminidase inhibitor that implicates acetamido participation. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 6804-6805. Antecedentes 56 procesos celulares entre los que se encuentran el cáncer 92 y enfermedades neurodegenerativas. 93 Aunque las hexosaminidasas lisosomales (HexA y HexB) y la OGA pertenecen a diferentes familias CAZy y se localizan en diferentes compartimentos celulares, todas ellas son responsables de la hidrólisis de residuos de GlcNAc, por lo que los inhibidores de HexA/B frecuentemente inhiben también a la OGA. A pesar de que estas enzimas presentan una alta homología del sitio activo, se observan ligeras diferencias, lo que podría permitir la identificación de inhibidores selectivos. 94 Dentro de la diversidad de inhibidores de hexosaminidasas descritos en la bibliografía 95 centraremos nuestra atención en los iminoazúcares. Así, los iminoazúcares 92 Ferrer, C. M.; Lynch, T. P.; Sodi, V. L.; Falcone, J. N.; Schwab, L. P.; Peacock, D. L.; Vocadlo, D. J.; Seagroves, T. N.; Reginato, M. J. O-GlcNAcylation regulates cancer metabolism and survival stress signaling via regulation of the HIF-1 pathway. Mol. Cell 2014, 54, 820–831. 93 a) Yuzwa, S. A.; Shan, X.; Macauley, M. S.; Clark, T.; Skorobogatko, Y.; Vosseller, K.; Vocadlo, D. J. Increasing O-GlcNAc slows neurodegeneration and stabilizes tau against aggregation. Nat. Chem. Biol. 2012, 8, 393–399. b) Yuzwa, S. A.; Vocadlo, D. J. O-GlcNAc and neurodegeneration: biochemical mechanisms and potential roles in Alzheimer's disease and beyond. Chem. Soc. Rev. 2014, 43, 6839– 6858. 94 a) Cekic, N.; Heinonen, J. E.; Stubbs, K. A.; Roth, C.; He, Y.; Bennet, A. J.; McEachern, E. J.; Davies, G. J.; Vocadlo, D. J. Analysis of transition state mimicry by tight binding aminothiazoline inhibitors provides insight into catalysis by human O-GlcNAcase. Chem. Sci. 2016, 7, 3742-3750. b) Ho, C.-W.; Popa, S. D.; Liu, T.-W.; Tsai, K.-C.; Ho, M.-J.; Chen, W.-H.; Yang, A.-S.; Lin, C.-H. Development of GlcNAcinspired iminocyclitols as potent and selective N-acetyl-β-hexosaminidase inhibitors. ACS Chem. Biol. 2010, 5, 489-497. 95 Liu, T.; Duan, Y.; Yang, Q. Revisiting glycoside hydrolase family 20 β-N-acetyl-D-hexosaminidases: Crystal structures, physiological substrates and specific inhibitors. Biotechnol. Adv. 2018, 36, 1127– 1138. 57 Capítulo 1 naturales siastatina B 30, 96 pochonicina 31 97 y nagstatina 32, 98 (Figura 15) aislados de diversos cultivos bacterianos, son inhibidores de -N-acetilhexosaminidasas en el rango nanomolar. Figura 15. Estructuras de sistatina B (30), pochonicina (31) y nagstatina (32). En relación a los iminoazúcares sintéticos inhibidores de hexosaminidasas, tras la síntesis de la 2-acetamido-1,2-didesoxinojirimicina (DNJNAc, 33), 99 se han descrito una gran variedad de iminoazúcares de cuatro (azetidinas), 100 cinco (pirrolidinas), 101 seis 96 Umezawa, H.; Aoyagi, T.; Komiyama, T.; Morishima, H.; Hamada, M.; Takeuchi, T. Purification and characterization of a sialidase inhibitor, siastatin, produced by Streptomyces. J. Antibiot. 1974, 27, 963–967. 97 Usuki, H.; Toyo-oka, M.; Kanzaki, H.; Okuda, T.; Nitoda, T. Pochonicine, a polyhydroxylated pyrrolizidine alkaloid from fungus Pochonia suchlasporia var. suchlasporia TAMA 87 as a potent β-N- acetylglucosaminidase inhibitor. Bioorg. Med. Chem. 2009, 17, 7248–7253. 98 Aoyama, T.; Naganawa, H.; Suda, H.; Uotani, K.; Aoyagi, T.; Takeuchi, T. The structure of nagstatin, a new inhibitor of N-acetyl-β-D-glucosaminidase. J. Antibiot. 1992, 45, 1557–1558. 99 Fleet, G. W. J.; Smith, P. W.; Nash, R. J.; Fellows, L. E.; Parekh, R. B.; Rademacher, T. W. Synthesis of 2-acetamido-1,5-imino-1,2,5-trideoxy-D-mannitol and of 2-acetamido-1,5-imino-1,2,5-trideoxy-D- glucitol, a potent and specific inhibitor of a number of β-N-acetylglucosaminidases. Chem. Lett. 1987, 15, 1051–1054. 100 Ayers, B. J.; Glawar, A. F. G.; Martínez, R. F.; Ngo, N.; Liu, Z.; Fleet, G. W. J.; Butters, T. D.; Nash, R. J.; Yu, C.-Y.; Wormald, M. R.; Nakagawa, S.; Adachi, I.; Kato, A.; Jenkinson, S. F. Nine of 16 stereoisomeric polyhydroxylated proline amides are potent β-N-acetylhexosaminidase inhibitors. J. Org. Chem. 2014, 79, 3398–3409. 101 a) Tsou, E.-L.; Yeh, Y.-T.: Liang, P.-H.; Cheng, W.-C. A convenient approach toward the synthesis of enantiopure isomers of DMDPand ADMDP. Tetrahedron 2009, 65, 93–100; b) Crabtree, E. V.; Martínez, R. F.; Nakagawa, S.; Adachi, I.; Butters, T. D.; Kato, A.; Fleet, G. W. J.; Glawar, A. F. G. Synthesis of the enantiomers of XYLNAc and LYXNAc: comparison of β-N-acetylhexosaminidase inhibition by the 8 Antecedentes 58 (piperidinas) 102 y siete (azepanos) 103 miembros, que incorporan un grupo acetamido en su estructura (Figura 16). Figura 16. Estructuras de iminoazúcares sintéticos inhibidores de β-hexosaminidasas. En el año 2001, Wong y cols. analizaron la inhibición de hexosaminidasas de los iminoazúcares 34-41 y las tiazolinas 42 y 43, demostrando que el compuesto 37 era capaz de aumentar la concentración de GAG en cultivos de condrocitos y tejido cartilaginoso (Figura 17). 104 stereoisomers of 2-N-acetylamino-1,2,4-trideoxy-1,4-iminopentitols. Org. Biomol. Chem., 2014, 12, 3932–3943 102 Glawar, A. F. G.; Best, D.; Ayers, B.; Miyauchi, S.; Nakagawa, S.; Aguilar-Moncayo, M.; García Fernández, J. M.; Ortiz Mellet, C.; Crabtree, E. V.; Butters, T. D.; Wilson, F. X.; Kato, A.; Fleet, G. W. J. Scalable syntheses of both enantiomers of DNJNAC and DGJNAC from glucuronolactone: the effect of N‐alkylation on hexosaminidase inhibition. Chem. – Eur. J. 2012, 18, 9341–9359. 103 Li, H.; Marcelo, F.; Bello, C.; Vogel, P.; Butters, T. D.; Rauter, A. P.; Zhang, Y.; Sollogoub, M.; Blériot, Y. Design and synthesis of acetamido tri- and tetra-hydroxyazepanes: Potent and selective β-N- acetylhexosaminidase inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 2009, 17, 5598–5604. 104 Liu, J.; Shikhman, A. R.; Lotz, M. K.; Wong, C. H. Hexosaminidase inhibitors as new drug candidates for the therapy of osteoarthritis. Chem. Biol., 2001, 8, 701-711. 59 Capítulo 1 Figura 17. Inhibidores de β-hexosaminidasa descritos por Wong y cols. Todos los compuestos incorporan el grupo acetamido característico de los sustratos naturales de la enzima excepto las tiazolinas (neutra 42 y sulfatada 43) que representan un mimético estructural del ion oxazolinio intermedio desarrollado durante el proceso catalítico de hidrólisis enzimática. 105 Todos los compuestos de la Figura 17 demostraron ser inhibidores competitivos de las β-N-acetilhexosaminidasas de placenta humana. En general, las pirrolidinas no sulfatadas demostraron ser mejores inhibidores, siendo el compuesto 37 (Ki = 24 nM) el que más destacó por potencia de inhibición. Los autores destacaron que la potente actividad inhibidora de 37 podría atribuirse a la mayor flexibilidad y semejanza del anillo de cinco miembros con el ion oxazolinio intermedio de la hidrólisis enzimática respecto a los sistemas de seis eslabones. 106 Finalmente, el tratamiento de cultivos de condrocitos articulares humanos con el inhibidor 37 resultaron en la acumulación de ácido hialurónico y glicosaminoglicanos sulfatados en las células. De manera similar, la incubación de tejido de 105 a) Mark, B. L.; Vocadlo, D. J.; Knapp, S.; Triggs-Raine, B. L.; Withers, S. G.; James, M. N. G. Crystallographic evidence for substrate-assisted catalysis in a bacterial beta-hexosaminidase. J. Biol. Chem. 2001, 276, 10330–10337 b) Knapp, S.; Vocadlo, D.; Gao, Z.; Kirk, B.; Lou, J.; Withers, S. G. NAG- thiazoline, an N-acetyl-L-hexosaminidase inhibitor that implicates acetamido participation. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 6804-6805. 106 Takebayashi, M.; Hiraruma, S.; Kanie, Y.; Kajimoto, T.; Kanie, O.; . Wong, C. H.; A versatile synthetic strategy for the preparation and discovery of new iminocyclitols as inhibitors of glycosidases. J. Org. Chem. 1999, 64, 5280-5291. Antecedentes 60 cartílago humano con 37 resultó en una acumulación de glicosaminoglicanos en el compartimento pericelular. Estos datos confirman el papel fundamental desempeñado por las β-hexosaminidasas en la degradación de la matriz del cartílago y convierten las estructuras de este tipo en posibles fármacos para el tratamiento de la osteoartritis. Como extensión de este estudio, estos autores publicaron en 2004 la síntesis de tres librerías químicas de derivados pirrolidínicos con objeto de estudiar la relación entre la inhibición de las β-hexosaminidasas y la presencia de sustituyentes estructuralmente diferentes en el nitrógeno endocíclico (R1) y en el nitrógeno en posición C-1’ (R2) del núcleo de pirrolidina 44 (Figura 18). 107 Figura 18 En primer lugar, se llevó a cabo la síntesis de una familia de derivados donde las modificaciones estructurales en el nitrógeno endocíclico (R1) se introdujeron mediante reacción de aminación reductiva de 36 con un conjunto de aldehídos aromáticos (Esquema 7). 107 Liu,J.; Numa, M. M. D.; Liu, H.; Huang, S. G.; Sears, P.; Shikhman, A. R.; Wong, C. H.; Synthesis and high-throughput screening of N-acetyl-β-hexosaminidase inhibitor libraries targeting osteoarthritis. J. Org. Chem. 2004, 69, 6273-6283. 61 Capítulo 1 Esquema 7. Librería química obtenida por Wong y cols. por aminación reductiva entre 36 y un conjunto de aldehídos aromáticos. Todos los compuestos resultaron ser peores inhibidores que 37 (Figura 17) con valores de IC50 en el rango micromolar bajo, indicando en este caso que la introducción de un resto aromático próximo al nitrógeno endocíclico disminuye la capacidad inhibidora. El mejor inhibidor de esta primera librería química fue 45b, sugiriendo que la presencia de un grupo hidrofílico en esta posición podría mejorar la actividad inhibidora. Las siguientes librerías químicas se prepararon mediante reacción de cicloadición de Huisgen entre la azida 46 con una batería de 97 alquinos, y por reacción de amidación entre la amina 47 y una colección de 24 ácidos carboxílicos. Tanto los alquinos como los ácidos carboxílicos se utilizaron en sus variantes alifáticas y aromáticas. Cabe destacar que en la reaccion de formación de los pirrolidín-triazoles es necesario calentar a 80 °C, ya que transcurre sin catálisis de Cu(I), lo que conduce a una mezcla de los triazoles regioisoméricos 1,4- y 1,5-disustituidos (Esquema 8). Resultados y discusión 68 La retrosíntesis de 51a y 51b se describe en el Esquema 11. Esquema 11 La nitrona 55 110 se sintetizó a partir de 2,3-O-isopropilidén-D-eritrosa (56), 111 la cual se puede preparar fácilmente a partir de D-arabinosa (Esquema 12). Esquema 12 110 Cicchi, S.; Marradi, M.; Vogel, P.; Goti, A. One-pot synthesis of cyclic nitrones and their conversion to pyrrolizidines: 7a-epi-crotanecine inhibits α-mannosidases. J. Org. Chem. 2006, 71, 1614-1619. 111 Thompson, D. K.; Hubert, C. N.; Wightman, R. H. Hydroxylated pyrrolidines. Synthesis of 1,4- dideoxy-1,4-imino-L-lyxitol, 1,4,5-trideoxy-1,4-imino-D- and L-lyxo-hexitol, 2,3,6-trideoxy-3,6-imino-D- glycero-L-altro- and D-glycero-L-galacto-octitols, and of a chiral potential precursor of carbapenem systems. Tetrahedron 1993, 49, 3827-3840. 69 Capítulo 1 La reacción de cicloadición 1,3-dipolar de la nitrona 55 con el alqueno 57 112 siguiendo el procedimiento descrito por Wightman y cols., 113 originó el cicloaducto 58 como único diastereoisómero con un rendimiento del 86%. La desprotección del silil éter 58 con TBAF/THF originó el alcohol 54 con un rendimiento del 87%. El posterior tratamiento con cloruro de mesilo seguido de reacción de hidrogenólisis permitió obtener la indolizidina 59 (rto. 72%, dos etapas). La eliminación del grupo isopropilideno mediante hidrólisis ácida y la posterior purificación por resina Dowex 50WX8 condujo al indolizidín-alcohol 60, descrito previamente como clorhidrato por Wightman y cols. (Esquema 13). 114 Esquema 13 Posteriormente, la reacción de oxidación de Swern del alcohol 60 originó la cetona 61, que tras reacción de aminación reductiva con amoníaco en presencia de Ti(OiPr)4 condujo a una mezcla de indolizidín-aminas epiméricas en proporción 5:1, que pudieron separarse por columna de cromatografía en gel de sílice para originar el derivado mayoritario 62 con 112 Waser, J.; Gaspar, B.; Nambu, H.; Carreira, E. M. Hydrazines and azides via the metal-catalyzed hydrohydrazination and hydroazidation of olefins. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 11693-11712. 113 McCaig, A. E.; Meldrum, K. P.; Wightman, R. H. Synthesis of trihydroxylated pyrrolizidines and indolizidines using cycloaddition reactions of functionalized cyclic nitrones, and the synthesis of (+)- and (-)-lentiginosine. Tetrahedron 1998, 54, 9429-9446. 114 Thompson, D. K.; Hubert, C. N.; Wightman, R. H. Hydroxylated pyrrolidines. Synthesis of 1,4- dideoxy-1,4-imino-L-lyxitol, 1,4,5-trideoxy-1,4-imino-D- and L-lyxo-hexitol, 2,3,6-trideoxy-3,6-imino-D- glycero-L-altro- and D-glycero-L-galacto-octitols, and of a chiral potential precursor of carbapenem systems. Tetrahedron 1993, 49, 3827-3840. Resultados y discusión 70 un 62% de rendimiento. Con el objetivo de mejorar la diastereoselectividad de la reacción se llevaron a cabo ensayos de reducción a más baja temperatura, manteniéndose en todos los casos la proporción de diastereoisómeros previamente observada (Esquema 14). Esquema 14 Las configuraciones de C-7 y C-8a de la amina mayoritaria 62 han sido confirmadas mediante espectroscopía de RMN (experimento TOCSY-NOESY SELECTIVE) confirmando la relación espacial existente entre H-7 y H-8a (Figura 21). Figura 21. Estructura de 62 confirmada por TOCSY-NOESY SELECTIVE. La reacción de aminación reductiva de la cetona 61 se realizó mediante el procedimiento desarrollado por Miriyala y cols. 115 y consiste en el tratamiento de 61 con NH3 en presencia de Ti(OiPr)4, seguida por reducción in situ con NaBH4. Según el mecanismo propuesto por los autores, la reacción podría proceder a través de la reducción directa del 115 Miriyala, B.; Bhattacharyya, S.; Williamson, J. S. Chemoselective reductive alkylation of ammonia with carbonyl compounds: synthesis of primary and symmetrical secondary amines. Tetrahedron 2004, 60, 1463-1471. 71 Capítulo 1 complejo de Ti (IV) (63a) o por reducción de la imina (63b) con la que el complejo se encuentra en equilibrio (Esquema 15). Esquema 15. Propuesta de mecanismo de la reacción de aminación reductiva de la cetona 61 según el procedimiento de Miriyala y cols. En el caso en el que la reducción ocurriera a nivel de la imina intermedia, siendo ésta una estructura plana, el reductor atacaría preferentemente por la cara menos impedida estéricamente (en nuestro caso la cara re) obteniéndose mayoritariamente el diastereoisómero (7R)-62 y minoritariamente el diastereoisómero (7S)-62, lo que podría justificar la proporción de diastereoisómeros obtenida (7S:7R=1:5) (Figura 22). Figura 22. Ataque del agente reductor NaBH4 sobre la imina intermedia en la reacción de aminación reductiva. Resultados y discusión 72 Finalmente, tras la eliminación del grupo isopropilideno por hidrólisis ácida se obtuvo la indolizidín-amina 53. Dicho compuesto se utilizó directamente para la reacción con fenilisocianato y fenilisotiocianato, originando respectivamente la indolizidín-urea 51a y la indolizidín-tiourea 51b con rendimientos de moderados a buenos (Esquema 16). Esquema 16. Síntesis de las nuevas indolizidin-(tio)ureas 51a y 51b. Por otro lado la estrategia retrosintética elegida para la preparación de las indolizidinas 52a y 52b, diastereoisómeras de 51a y 51b, se describe en el Esquema 17. Esquema 17 73 Capítulo 1 La síntesis del derivado de pirrolidina 65 se llevó a cabo a partir de la D-arabinosa según una metodología desarrollada previamente. 116 Así, la reacción de la 2,3-O- isopropilidén-D-eritrosa 56 con etoxicarbonilmetiléntrifenilfosforano en CH2Cl2 a reflujo origina la mezcla de alquenos 66 y 67 en una proporción 66:67 = 5:1. Posteriormente, la mesilación del grupo hidroxilo libre en 66 seguida de tratamiento con amoníaco en etanol, lleva a la correspondiente pirrolidina 65 a través de una adición conjugada al doble enlace y desplazamiento SN2 intramolecular del grupo mesilato (Esquema 18). Esquema 18 La ruta sintética prosigue con la adición conjugada entre la pirrolidina 65 y el acrilato de metilo (Esquema 19) conduciendo a la formación de la N-alquil pirrolidina 69 que, posteriormente, se somete a una reacción de ciclación intramolecular vía condensación de Dieckmann en unas condiciones previamente optimizadas por el grupo de investigación. 117 116 a) Robina, I.; Gearing, R. P.; Buchanan, J. G.; Wightman, R. H. Diastereoselective conjugate addition of ammonia in the synthesis of chiral pyrrolidines. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1. 1990, 2622-2624. 117 Trabajo Fin de Master “Preparación de nuevos catalizadores bifuncionales derivados de iminociclitoles” (María Isabel Aguilar Téllez, Universidad de Sevilla 2012). Resultados y discusión 74 De este modo, el ataque del bis(trimetilsilil)amiduro de litio sobre las dos posiciones posibles en α al grupo carbonilo origina una mezcla de las indolizidinonas 70 (mayoritariamente en forma enólica) y 71 en una proporción 3:1 que pudo separarse mediante columna de cromatografía. El siguiente paso en la secuencia sintética es la formación de la indolizidinona 72, la cual podría obtenerse mediante descarboxilación del enol 70 o del β-cetoéster 71. En base a los trabajos previos de optimización llevados a cabo en el grupo de investigación, el procedimiento más adecuado para obtener la indolizidinona 72 implicó la reacción de descarboxilación del enol 70. Así, el tratamiento de 70 con LiCl en DMF a 140 °C durante 6 horas originó el derivado 72 con bajo rendimiento. Esquema 19 La posterior reacción de aminación reductiva de la indolizidinona 72 con amoníaco en presencia de Ti(OiPr)4 seguido de reducción con NaBH4 permitió obtener la indolizidínamina 73 como una mezcla de diastereoisómeros no separables por columna cromatográfica 75 Capítulo 1 en una proporción aproximada 7S:7R= 10:1. Finalmente, tras hidrólisis ácida del grupo isopropilideno, la mezcla de aminas desprotegidas 64 se utilizó para la reacción con fenilisocianato en DMF y fenilisotiocianato en MeOH originando respectivamente la indolizidin-urea 52a y la indolizidin-tiourea 52b (Esquema 20), separables de los correspondientes diasteroisómeros minoritarios por columna cromatográfica. Esquema 20 Cabe destacar que la configuración en C-7 de los diastereoisómeros mayoritarios ha sido asignada en base a un experimento NOESY efectuado sobre la indolizidin-tiourea protegida 74, donde se observa un NOE concluyente entre H-8a (dd, 3.75 ppm) y H-7 (dd, 3.75 ppm) (Figura 23). Figura 23. Estructura de 74 confirmada por NOESY. Resultados y discusión 76 Evaluación biológica. Se ha realizado un estudio de la capacidad inhibidora (% Inhibición a 1 mM) de las indolizidín-(tio)ureas 51a y 51b y de sus diastereoisómeros 52a y 52b frente a once glicosidasas comerciales (Sigma-Aldrich y Megazyme): α-fucosidasa de Homo sapiens, - galactosidasa de granos de café, -galactosidasa de Escherichia coli y Aspergillus oryzae, - glucosidasa de levadura de pan y de arroz, amiloglucosidasa de Aspergillus niger, - glucosidasa de almendras, -manosidasa de guisantes de Jack, -manosidasa de caracol y - N-acetilglucosaminidasa de guisantes de Jack. Los compuestos sintetizados no presentaron inhibición significativa frente a ninguna de las enzimas ensayadas. De este modo, se descartaron estas estructuras de tipo indolizidínico como modelos para la búsqueda de inhibidores potentes de glicosidasas. En este sentido, se eligieron como referencia los compuestos modelos de tipo pirrolizidínico que previamente habían sido identificados en nuestro grupo de investigación como potentes inhibidores de α-galactosidasa, para la preparación de una librería química de pirrolizidín- (tio)ureas, utilizando la metodología de síntesis paralela seguido de evaluación biológica in situ (Esquema 21). Esquema 21. Metodología a emplear para la búsqueda de inhibidores de α-galactosidasas. 77 Capítulo 1 Síntesis paralela de derivados pirrolizidínicos, seguida de evaluación biológica in situ. La ruta sintética para la preparación de la pirrolizidín-amina de partida 75 es análoga a la descrita para la preparación de la indolizidín-amina 62 (Esquema 14). Así, la reacción de cicloadición 1,3-dipolar de la nitrona 55 con el alcohol alílico protegido 76 118 en tolueno a reflujo origina el derivado 77 119 como único diastereoisómero con un 75% de rendimiento. Posteriormente, el tratamiento de 77 con TBAF/THF proporciona el alcohol 78 con un rendimiento del 91%. La tosilación del grupo hidroxilo libre de 78 origina el compuesto 79 cuya hidrogenación en presencia de Pd/C (10%) conduce a la pirrolizidina 28 con un rendimiento del 92% (Esquema 22). Esquema 22 La reacción de oxidación de Swern del alcohol 28 origina la cetona 80 que tras reacción de aminación reductiva con amoníaco en presencia de Ti(OiPr)4, da lugar a la mezcla de pirrolizidín aminas 81 en proporción 2:1 con un rendimiento del 71% (Esquema 23). Los ensayos de reducción con NaBH4 a baja temperatura no supusieron una mejora significativa de la estereoselectividad aunque sí una disminución drástica del rendimiento de la reacción. 118 Waser, J.; Gaspar, B.; Nambu, H.; Carreira, E. M. Hydrazines and azides via the metal-catalyzed hydrohydrazination and hydroazidation of olefins. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 11693-11712. 119 McCaig, A. E.; Meldrum, K. P.; Wightman, R. H. Synthesis of trihydroxylated pyrrolizidines and indolizidines using cycloaddition reactions of functionalized cyclic nitrones, and the synthesis of (+)- and (-)-lentiginosine. Tetrahedron 1998, 54, 9429-9446. Resultados y discusión 84 Figura 27: Efecto de la concentración de p-nitrofenil α-galactósido [S] (1/[S] en mM-1) en la velocidad de reacción enzimática (la velocidad V está relacionada directamente con la absorbancia, Abs) de la αgalactosidasa de granos de café en presencia de distintas concentraciones de 75i (se incluyen los gráficos secundarios para la determinación de Ki (0.12 µM) y K’i = 0.28 µM). [I] = concentración de inhibidor. -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 -0.15 0.05 0.25 0.45 Determinación del Ki Kmap/Vmax [I] en µM 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 1/Vmax ap [I] en µM Determinación del K'i 15.0 [I] = 0 13.0 [I] = 0.080 µM 11.0 [I] = 0.16 µM 9.0 [I] = 0.33 µM 7.0 5.0 -2 -1.0 0 10 Gráfica de Lineweaver-Burk 85 Capítulo 1 Con objeto de profundizar en el potencial inhibidor de 75i frente glicosidasas de origen humano, se llevaron a cabo los correspondientes experimentos frente a la αgalactosidasa y β-glucosidasa lisosomales en colaboración con el grupo de investigación del Dr. A. Kato (Universidad de Toyama, Japón). Es importante subrayar que la α-galactosidasa de granos de café presenta un 58% de homología con la α-galactosidasa de lisosoma humano 122 cuya implicación en la enfermedad de Fabry se encuentra documentada desde 1967. 123 Ambas enzimas pertenecen a la familia GH27. La estructura de rayos X de la α-Gal A humana se conoce desde 2004. 124 La enzima presenta una estructura homodimérica y cada unidad monomérica está compuesta por dos dominios. Los resultados de inhibición del compuesto 75i sobre las glicosidasas humanas indicaron actividad inhibidora solo frente a la α-galactosidasa lisosomal, con un valor de IC50 de 5.3 µM. El tipo de inhibición se determinó mediante el método de Lineweaver-Burk, mostrando una inhibición mixta y un valor de Ki de 4.2 µM. 125 Con el objetivo de confirmar la posible correlación entre la inhibición de la αgalactosidasa de granos de café y de la α-galactosidasa lisosomal, se procedió a determinar la inhibición de esta última enzima por el compuesto 25b ( Figura 13 ). La tiourea 25b , que había sido elegida como modelo para la generación de la librería de inhibidores, había mostrado ser claramente peor inhibidor de la α-galactosidasa vegetal que 75i , tal y como se muestra en la Figura 25 . La evaluación frente a la α-galactosidasa 122 Maranville, E.; Zhu, A. The carboxyl terminus of coffee bean α-galactosidase is critical for enzyme activity. Arch. Biochem. Biophys. 2000, 373, 225−230. 123 Brady, R. O.; Gal, A. E.; Bradley, R. M.; Martensson, E.; Warshaw, A. L.; Laster, L. Enzymatic defect in Fabry’s disease. ceramidetrihexosidase deficiency. N. Engl. J. Med. 1967, 276, 1163−1167. 124 Garman, S. C.; Garboczi, D. N. The molecular defect leading to Fabry disease: structure of human α-galactosidase. J. Mol. Biol. 2004, 337, 319−335. 125 Evaluación biológica llevada a cabo en colaboración con el Prof. A. Kato del Departamento de Farmacia Hospitalaria, Universidad de Toyama, Japón. Resultados y discusión 86 lisosomal efectivamente indicó una menor inhibición de 25b con respecto a 75i (IC 50 = 68 μM vs IC 50 = 5.3 μM). Estos resultados parecen indicar que ambas enzimas responden en el mismo sentido frente a nuestros inhibidores, pudiendo establecerse cierta correspondencia entre la enzima vegetal y la humana. Por tanto, la metodología de síntesis paralela seguida de evaluación biológica in situ frente a la α-galactosidasa vegetal resultó adecuada para la identificación de potentes inhibidores de αgalactosidasa de lisosoma humano. 1.3.2. Síntesis y evaluación in situ de pirrolidín-triazoles y pirrolidín-(tio)ureas como inhibidores monovalentes de β-N-acetilhexosaminidasas humanas. Estudio preliminar. Síntesis y elección de los cabezas de serie. En este apartado se llevó a cabo la funcionalización del grupo amino primario del inhibidor de β-hexosaminidasa 48 (Figura 28), 126 con el objetivo de incorporar restos aromáticos/alifáticos a este sistema, y estudiar el efecto sobre la inhibición de la βhexosaminidasa lisosomal humana (HexB) y de la β-N-acetilglucosaminidasa humana (OGA). Inicialmente se llevó a cabo la síntesis y evaluación biológica de los compuestos modelo 83 y 84 (Figura 28) para determinar si la incorporación de un resto aromático a través de una funcionalidad tipo triazol/tiourea mejoraba la inhibición enzimática de 48. Se han elegido estos dos tipos de funcionalidades conectoras, por ser dos grupos funcionales cuya formación se podría adaptar fácilmente a la metodología de síntesis en paralelo seguida de análisis biológico in situ. 126 Liang, P. H.; Cheng, W. C.; Lee, Y. L.; Yu, H. P.; Wu, Y. T.; Lin, Y. L.; Wong, C. H. Novel five-membered iminocyclitol derivatives as selective and potent glycosidase inhibitors: new structures for antivirals and osteoarthritis. ChemBioChem 2006, 7, 165-173. 87 Capítulo 1 Figura 28. Compuestos modelo sintetizados para el estudio preliminar de inhibición de HexB y OGA. El análisis retrosintético de 83 y 84 se describe en el Esquema 27. Esquema 27 La ruta sintética parte de la D-arabinosa que por tratamiento con AcCl en MeOH proporciona la mezcla de metil furanósidos 85 cuya perbencilación permite obtener el derivado protegido 86. 127 La posterior hidrólisis ácida a 100 °C condujo a la mezcla de anómeros 87 128 que se convirtieron en la oxima 88 por reacción con el hidrocloruro de 127 Suthagar,K.; Polson, M. I. J.; Fairbanks, A. J. Unexpected furanose/pyranose equilibration of N- glycosyl sulfonamides, sulfamides and sulfamates. Org. Biomol. Chem., 2015, 13, 6573-6579. 128 RvanRijssel, E.; Goumans, T.; Lodder, G.; Overkleeft, H. S.; Van der Marel, G.A.; Codée, J. D. C. Chiral pyrroline-based Ugi-three-component reactions are under kinetic control. Org. Lett., 2013, 15, 3026- 3029. Resultados y discusión 88 hidroxilamina en medio básico, con un rendimiento del 93%. 129 Finalmente, la sililación selectiva del grupo hidroxilo de la oxima 88 permitió obtener el derivado 89 con un rendimiento cuantitativo (Esquema 28). Esquema 28 La ruta sintética prosigue con la yodación del alcohol 89 en presencia de PPh3 originando el yododerivado 90, con un rendimiento global del 79%. 130 La nitrona 91, obtenida a partir del yododerivado mayoritario (E)-90 tras reacción con TBAF, se sometió a una reacción con cianuro de trimetilsililo en MeOH a 50 °C originando una mezcla diastereoisomérica de nitrilos (proporción 2R/2S = 19:1) cuya separación por columna cromatográfica permitió obtener el nitrilo mayoritario 92 con un rendimiento del 85% (Esquema 29). 131 129 Grant Buchanan, J.; Lumbard, K. W.; Sturgeon, R. J.; Thompson, D. K.; Wightman, R. H. Potential glycosidase inhibitors: synthesis of 1,4-Dideoxy-l,4-imino derivatives of D-glucitol, D- and L-xylitol, D- and L-allitol, D- and L-talitol, and D-gulitol. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1990, 3, 699-706. 130 Rossler, S. L.; Schreib, B. S.; Ginterseder, M.; Hamilton, J. Y.; Carreir, E. M.; Total synthesis and stereochemical assignment of (+)-broussonetine H. Org. Lett. 2017, 19, 5533−5536. 131 Tsou, E. L.; Yeh, Y. T.; Liang, P. H.; Cheng, W. C. A convenient approach toward the synthesis of enantiopure isomers of DMDP and ADMDP. Tetrahedron 2009, 65, 93–100. 89 Capítulo 1 Esquema 29 El nitrilo 92 se sometió posteriormente a una reacción de hidrogenación catalítica en condiciones ácidas seguida de acetilación selectiva del grupo amino primario mediante tratamiento con anhídrido acético en MeOH:H2O a 0 °C para originar el derivado pirrolidínico 93. 132 Finalmente, la aminación reductiva del crudo 93 con el 6-azidohexanal 94, 133 usando NaBH3CN como reductor, permitió obtener la N-azidopentilpirrolidina final 95 con un rendimiento del 49% para las tres etapas (Esquema 30). El 6-azidohexanal pudo obtenerse de manera sencilla en dos pasos a partir del 6-bromohexan-1-ol comercial. Esquema 30 132 a) Merino, P.; Delso, I.; Tejero, T.; Cardona, F.; Marradi, M.; Faggi, E.; Parmeggiani, C.; GotI, A. Nucleophilic additions to cyclic nitrones en route to iminocyclitols – total syntheses of DMDP, 6-deoxy- DMDP, DAB-1, CYB-3, nectrisine, and radicamine B. Eur. J. Org. Chem. 2008, 2929–2947. b) Shih, H. W.; Chen, K. T.; Chen, S. K.; Huang, C. Y.; Cheng, T. J. R.; Ma, C.; Wong, C. H.; Cheng, W. C. Combinatorial approach toward synthesis of small molecule libraries as bacterial transglycosylase inhibitors. Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 2586–2593. 133 a) Bühler, J.; Gietzen, S.; Reuter, A.; Kappel, C.; Fischer, K.; Decker, S.; Schäffel, D.; Koynov, K.; Bros, M.; Tubbe, I.; Grabbe, S.; Schmidt, M. Selective uptake of cylindrical poly (2-oxazoline) brush antiDEC205 antibody-OVA antigen conjugates into DEC-positive dendritic cells and subsequent T-Cell activation. Chem. Eur. J. 2014, 20, 12405–12410. Resultados y discusión 90 Con el objetivo de mejorar el rendimiento de la transformación de 93 en 95, el compuesto 93 se sometió a varios ensayos que implicaban tanto condiciones distintas de aminación reductiva como de alquilación directa del N-endocíclico de la pirrolidina (Esquema 31). Como se puede apreciar en el Esquema 31, ni la aminación reductiva en trifluoroetanol según el procedimiento descrito por Tajbakhsh y colls., 134 ni tampoco la alquilación directa con 1-azido-6-bromohexano consiguieron mejorar el rendimiento de 95 con respecto al procedimiento empleado en el Esquema 30. Esquema 31 Finalmente, la hidrogenación catalítica de N-azidohexilpirrolidina 95 condujo al correspondiente aminoderivado 96 con buen rendimiento. Paralelamente, la azida 95 se sometió a una reacción CuAAC con fenilacetileno en presencia de CuSO4 y ascorbato sódico parar originar el pirrolidín-triazol 83 con un 54% de rendimiento. Por otra parte, la reacción de la N-aminohexilpirrolidina 96 con fenilisotiocianato en MeOH dio lugar a la pirrolidíntiourea 84 con un 63% de rendimiento (Esquema 32). 134 Tajbakhsh, M.; Hosseinzadeh, R.; Alinezhad, H.; Ghahari, S.; Heydari, A.; Khaksar, S.; Catalyst-free one-pot reductive alkylation of primary and secondary amines and N,N-dimethylation of amino acids using sodium borohydride in 2,2,2-trifluoroethanol. Synthesis 2011, 3, 490-496. 91 Capítulo 1 Esquema 32 Evaluación biológica Se ha realizado un estudio de la capacidad inhibidora de los derivados 83 y 84 frente a once glicosidasas comerciales (Sigma-Aldrich y Megazyme) 135 y dos humanas, la β-N- acetilhexosaminidasa (HexB) y la -N-acetilglucosaminidasa (OGA), ambas aisladas y purificadas en el grupo del Prof. V. Kren (Academia Checa de Ciencias de Praga). Tanto 83 como 84 presentaron inhibición potente y selectiva frente a las hexosaminidasas ensayadas (98-100% de inhibición a una concentración 1.0 mM). Adicionamente se observó una inhibición débil de la amiloglucosidasa de A. Niger. Tras estos resultados preliminares, se eligieron los compuestos 83 y 84 como modelos para la síntesis paralela de una librería de 135 α-fucosidasa de Homo sapiens, -galactosidasa de granos de café, -galactosidasa de Escherichia coli y Aspergillus oryzae, -glucosidasa levadura de pan y de arroz, -amiloglucosidasa de Aspergillus niger, -glucosidasa de almendras, -manosidasa de guisantes de Jack, -manosidasa de caracol y - N-acetilglucosaminidasa de guisantes de Jack (JB-GlcNAc). Resultados y discusión 92 potenciales inhibidores de hexosaminidasa humana conteniendo estructuras de tipo triazol y (tio)urea. Síntesis paralela y evaluación biológica in situ La estrategia utilizada para la identificación rápida de nuevos inhibidores selectivos de β-hexosaminidasa (HexB) basados en la estructura de los compuestos modelo 83 y 84 implicó la preparación de dos librerías químicas de compuestos (librería IIA y IIB). Así, la reacción CuAAC entre la N-azidohexilpirrolidina 95 y una colección de alquinos (a-s) originó la librería IIA, constituida por los pirrolidín-triazoles 95a-s. Por otro lado, la reacción clic entre la N-aminohexilpirrolidina 96 y una batería de iso(tio)cianatos (A-S) permitió preparar la librería IIB de pirrolidín-(tio)ureas 96A-S. Las propiedades inhibidoras de ambas librerías se analizaron posteriormente mediante evaluación biológica in situ de los crudos de reacción frente a las enzimas humanas HexB y OGA (Esquema 33). 93 Capítulo 1 Esquema 33. Síntesis de las librerías IIA (95a-s) y IIB (96A-S). La síntesis de la librería IIA (95a-s) se llevó a cabo mediante reacciones paralelas CuAAC entre la pirrolidín-azida 95 (1 eq) y una batería de alquinos terminales a-s (2.4 eq), utilizando CuSO4 (0.44 eq) y ascorbato sódico (0.14 eq), en una mezcla tBuOH:H2O como disolvente. Tras 21 horas calentando a 50 °C, se observó conversión completa por c.c.f. y espectrometría de masas. Por otro lado, la síntesis de la librería IIB (96A-S) se llevó a cabo Antecedentes 100 El derivado 97 fue el primer multímero donde se cuantificó un efecto multivalente en la inhibición de glicosidasas (JBα-Man), con una potencia de inhibición relativa por unidad de iminoazúcar (rp/n) de 2.2 (Ki = 35 μM de 97 frente a Ki = 230 μM del correspondiente monómero de referencia). La JBα-Man ha sido desde entonces la glicosidasa más estudiada en el campo de los iminoazúcares multivalentes debido a su disponibilidad comercial, sus similitudes estructurales con las α-manosidasas humanas de Golgi (GManII) y lisosomal (LManII), por su naturaleza multimérica y por tener sus sitios activos en una cavidad muy abierta. La JBα-Man es una metaloenzima dimérica de alto peso molecular (230 kDa) formada por dos heterodímeros (LH)2 resultados de la asociación de monómeros de 49 (L) y 66 (H) kDa, respectivamente. Debido a la presencia de un bolsillo catalítico particularmente accesible, esta enzima interacciona fácilmente con estructuras multiméricas. El sitio activo se encuentra en la subunidad de tipo H. 139 Con el paso de los años se empezaron a sintetizar inhibidores multivalentes con una estructura cada vez más compleja como, por ejemplo, derivados de fullereno, plataforma utilizada previamente para la preparación de derivados multivalentes de carbohidratos. 140 En la Figura 31 se representa la estructura del inhibidor multivalente de JBα-Man sintetizado por Compain, Ortiz-Mellet y cols. 141 139 Compain, P. Multivalent effect in glycosidase inhibition: the end of the beginning. Chem. Rec. 2020, 20,10–22. 140 Nierengarten, J. –F.; Iehl, J.; Oerthel, V.; Holler, M.; Illescas, B. M.; Muñoz, A.; Martín, N.; Rojo, J.; Sánchez-Navarro, M.; Cecioni, S.; Vidal, S.; Buffet, K.; Durka, M.; Vincent, S. P. Fullerene sugar balls. Chem. Commun. 2010, 46, 3860-3862. 141 Compain, P.; Decroocq, C.; Iehl, J.; Holler, M.; Hazelard, D.; Mena Barragán, T.; Ortiz Mellet, C.; Nierengarten, J. –F. Glycosidase inhibition with fullerene iminosugar balls: a dramatic multivalent effect. Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 5753-5756. 101 Capítulo 2 Figura 31. Fullereno multimérico sintetizado por Compain, Ortiz-Mellet y cols. Los autores decidieron anclar la DNJ azidoalquil funcionalizada en una plataforma de fullereno dodecavalente via CuAAC. El compuesto 98 demostró no solo una elevada selectividad hacia JBα-Man sino también un elevado efecto multivalente (Ki = 0.15 µM, rp= 2147 y rp/n = 179). En el año 2013 los mismos autores sintetizaron los fullerenos multiméricos 99-102 mediante reacción CuAAC entre un fullereno funcionalizado con 12 grupos alquino y un iminoazúcar tipo sp2 con configuración DNJ, 99 y 100, o DMJ (1-desoximanojirimicina) 101 y 102 (Figura 32). 142 142 Rísquez-Cuadro, R.; García Fernández, J. M.; Nierengarten, J. –F.; Ortiz Mellet, C. Fullerene-sp2- iminosugar balls as multimodal ligands for lectins and glycosidases: a mechanistic hypothesis for the inhibitory multivalent effect. Chem. Eur. J. 2013, 19, 16791-16803. Antecedentes 102 Figura 32. Fullerenos multiméricos derivados de iminoazúcares sp2. Aunque el efecto multivalente observado para estos derivados fue inferior al obtenido para el compuesto 98, esta serie multimérica se utilizó para llevar a cabo ensayos competitivos enzima-lectina (ELLA, enzyme-linked lectin assay). Estos estudios fueron útiles para estudiar el mecanismo que origina el efecto multivalente observado y permitieron concluir que en la interación inhibidor/enzima, además del sitio activo de la JBα-Man, también son relevantes las interacciones no específicas con otros sitios de la enzima de manera análoga a lo que ocurre en las interacciones carbohidrato/lectina. Otras plataformas particularmente adecuadas para la preparación de iminoazúcares multivalentes son las β-ciclodextrinas debido a la posibilidad de poder controlar la valencia y la orientación espacial de las estructuras sintetizadas. En este sentido, en 2011, estos autores llevaron a cabo la síntesis de inhibidores multivalentes de glicosidasas a partir de β- 103 Capítulo 2 ciclodextrinas utilizadas como plataformas funcionalizadas con unidades de DNJ. 143 De los nuevos inhibidores sintetizados, con valencia comprendida entre 7 y 14, los mejores resultados en términos de inhibición enzimática se obtuvieron para la ciclodextrina tetradecavalente 103 representada en la Figura 33 (en azul) . El multímero 103 es, de hecho, un inhibidor de JBα-Man con una Ki = 0.022 μM y un valor de rp/n comprendido entre 610 y 662, dependiendo del derivado monovalente utilizado como referencia. Con el objetivo de investigar el efecto de la configuración del iminoazúcar y su disposición en la plataforma sobre los valores de inhibición enzimática, los mismos autores sintetizaron otra serie de ciclodextrinas funcionalizadas con 14 unidades de DNJ (en verde) o DMJ (en rojo) (Figura 33). 144 Los resultados obtenidos de los ensayos de inhibición enzimática hacia JBα-Man demostraron que tanto el cambio de la posición de las unidades de DNJ desde el exterior (compuesto 103) hacia el interior (compuesto 104) del anillo de ciclodextrina, así como el cambio de la configuración del iminoazúcar pasando de la DNJ (compuesto 103) a la DMJ (compuesto 105) resultaron en una disminución de los valores de rp/n. Estas observaciones confirmaron que, además de la valencia, también la configuración del iminoazúcar y su disposición en el molde tienen una influencia elevada en el efecto multivalente observado. 143 Decroocq, C.; Rodríguez-Lucena, D.; Russo, V.; Mena Barragán, T.; Ortiz Mellet, C.; Compain, P. The multivalent effect in glycosidase inhibition: probing the influence of architectural parameters with cyclodextrin-based iminosugar “click” clusters. Chem. Eur. J. 2011, 17, 13825-13831. 144 Decroocq, C.; Joosten, A.; Sergent, R.; Mena Barragán, T.; Ortiz Mellet, C.; Compain, P. The multivalent effect in glycosidase inhibition: probing the influence of valency, peripheral ligand structure, and topology with cyclodextrin-based iminosugar “click” clusters. ChemBioChem 2013, 14, 2038-2049. Antecedentes 104 Figura 33. Ciclodextrinas tetradecavalentes funcionalizadas con unidades de DNJ o DMJ. En el año 2014, Compain y cols. sintetizaron el derivado de valencia 21 por reacción CuAAC entre una ciclodextrina funcionalizada en C-6 con grupos alquino y un dendrímero 105 Capítulo 2 trivalente derivado de DNJ. El compuesto 106 resultó ser un inhibidor potente de JBα-Man con un valor de Ki = 19 nM y un valor de rp/n de 470 (Figura 34). 145 Figura 34. Iminoazúcar/ciclodextrina con valencia 21 descrita por Compain y cols. Por otra parte, el grupo de Goti 146 y Gouin 147 utilizaron plataformas de calixarenos para la síntesis de inhibidores multivalentes derivados de la DNJ (Figura 35). Los derivados 107 y 108 resultaron ser inhibidores de JBα-Man en el rango micromolar. 145 Joosten, A.; Schneider, J. P.; Lepage, M. L.; Tarnus, C.; Bodlenner, A.; Compain, P. A convergent strategy for the synthesis of second-generation iminosugar clusters using “clickable” trivalent dendrons. Eur. J. Org. Chem. 2014, 1866-1872. 146 Marradi, M.; Cicchi, S.; Sansone, F.; Casnati, A.; Goti, A. Low-generation dendrimers with a calixarene core and based on a chiral C2-symmetric pyrrolidine as iminosugar mimics. Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8, 951-957. 147 Brissonnet, Y.; Ortiz Mellet, C.; Morandat, S.; García Moreno, M. I.; Deniaud, D.; Matthews, S. E.; Vidal, S.; Šesták, S.; El Kirat, K.; Gouin, S. G. Topological effects and binding modes operating with multivalent iminosugar-based glycoclusters and mannosidases. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 18427- 18435. Antecedentes 106 Figura 35. Ejemplo de calixarenos tetravalentes derivados de la DNJ. Recientemente se ha descrito la síntesis de inhibidores multivalentes de glicosidasas basados en plataformas de fullereno (109) o ciclodextrinas (110) que incorporan iminoazúcares, glicósidos o una mezcla de ambos (heteromultímeros) (Figura 36). 148 Este estudio ha permitido comparar la afinidad de las glicosidasas hacia estructuras diferentes de los iminoazúcares como los O/C-glicósidos. Los resultados de inhibición enzimática han permitido concluir que, independientemente de la accesibilidad del sitio activo de la glicosidasa considerada, éstas siempre presentaron una mayor afinidad por los multímeros funcionalizados con iminoazúcares. En el caso de la JBα-Man, cuyo sitio activo es fácilmente accesible, el efecto multivalente observado puede ser debido a interacciones del multímero tanto con el sitio activo como con zonas no catalíticas de la enzima. Sin embargo, en glicosidasas cuyo sitio activo es menos accesible (como maltasa de levadura, β-glucosidasa 148 a) García-Moreno, M. I.; Ortega-Caballero, F.; Rísquez-Cuadro, R.; Ortiz Mellet, C.; García Fernández, J. M. The impact of heteromultivalency in lectin recognition and glycosidase inhibition: an integrated mechanistic study. Chem. Eur. J. 2017, 23, 6295-6304. b) Stauffert, F.; Bodlenner, A.; Trinh, T. M. N.; García-Moreno, M. I.; Ortiz Mellet, C.; Nierengarten, J. –F.; Compain, P. Understanding multivalent effects in glycosidase inhibition using C-glycoside “click” clusters as molecular probes. New. J. Chem. 2016, 40, 7421-7430. c) Abellán Flos, M.; García Moreno, M. I.; Ortiz Mellet, C.; García Fernández, J. M.; Nierengarten, J. –F.; Vincent, S. P. Potent glycosidase inhibition with heterovalent fullerenes: unveiling the binding modes triggering multivalent inhibition. Chem. Eur. J. 2016, 22, 11450-11460. 107 Capítulo 2 de almendras o α-galactosidasa de granos de café) dicho efecto se podría explicar en base a interacciones del multímero con sitios no catalíticos de la enzima. Figura 36. Multímeros funcionalizados con iminoazúcares, glicósidos o una mezcla de ambos. Compain y cols. han publicado la síntesis de multímeros obtenidos mediante reacción CuAAC entre un polialquinil-ciclopéptido y un azido-iminoazúcar trivalente derivado de la DNJ, originando inhibidores multivalentes de JBα-Man con valores excepcionales de rp/n (Figura 37). 149 149 Lepage, M. L.; Schneider, J. P.; Bodlenner, A.; Meli, A.; De Riccardis, F.; Schmitt, M.; Tarnus, C.; Nguyen- Huynh, N. –T.; Francois, Y. –N.; Leize-Wagner, E.; Birck, C.; Cousido-Siah, A.; Podjarny, A.; Izzo, I.; Compain, P. Iminosugar-cyclopeptoid conjugates raise multivalent effect in glycosidase inhibition at unprecedented high levels. Chem. Eur. J. 2016, 22, 5151-5155. Antecedentes 108 Figura 37. Ciclopéptidos multiméricos sintetizados por Compain y cols. El compuesto 112 (valencia 36), con un valor de rp/n de 4747, demostró ser no solo un potente inhibidor de JBα-Man sino también el derivado con mayor efecto multivalente hacia una glicosidasa descrito hasta el momento. Cabe destacar que el aumento de la valencia en estos derivados (112 vs 113-114) no supuso una mejora de la actividad inhibidora. Con el objetivo de explorar la actividad inhibidora de multímeros basados en iminoazúcares de tipo pirrolidínico, en 2017 Jiménez-Barbero, Cardona y cols. 150 sintetizaron multímeros derivados del 1,4-didesoxi-1,4-imino-D-arabinitol (DAB) con valencia 3, 4 y 9 (compuestos 115, 116 y 117, Figura 38). 150 Mirabella, S.; D’Adamio, G.; Matassini, C.; Goti, A.; Delgado, S.; Gimeno, A.; Robina, I.; Moreno- Vargas, A. J.; Šesták, S.; Jiménez-Barbero, J.; Cardona, F. Mechanistic insight into the binding of multivalent pyrrolidines to α-mannosidases. Chem. Eur. J. 2017, 23, 14585-14596. 109 Capítulo 2 Figura 38. Iminoazúcares multivalentes derivados de DAB. Todos los multímeros presentaron inhibición frente a JBα-Man, siendo el derivado nonavalente 117 el inhibidor más potente y con mayor efecto multivalente (rp/n = 1520). La relación entre el aumento de la valencia y el efecto multivalente también se mantuvo para la inhibición de la enzima α-manosidasa II de Golgi (115 rp/n= 42, 116 rp/n= 46 y 117 rp/n= 78). Este trabajo constituye el primer ejemplo de inhibición de JBα-Man por estructuras pirrolidínicas multiméricas en el que se observó un efecto multivalente considerable, pues hasta el momento siempre se habían utilizado derivados piperidínicos polihidroxilados como inhítopos. A pesar de que la mayoría de ejemplos sobre multivalencia en la inhibición de glicosidasas se restringen a las α-manosidasas, también hay que resaltar algún otro ejemplo sobre otras enzimas. Entre los más interesantes se encuentran los estudios de inhibición de hexosaminidasas con estructuras multiméricas, realizados por Bleriot, Gouin y cols. Estos autores publicaron en 2017 la síntesis de azepanos multiméricos que mostraron ser Objetivos 116 2.2. OBJETIVOS El trabajo que se desarrolla en este capítulo está relacionado con la puesta a punto de la metodología de síntesis en paralelo seguida de evaluación biológica in situ para la búsqueda rápida de inhibidores multivalentes de glicosidasas, y tiene tres objetivos principales:  Como extensión del trabajo previamente desarrollado en nuestro laboratorio sobre inhibidores monovalentes de α-fucosidasa de riñón bovino, en este capítulo se plantea la síntesis y el estudio preliminar de estructuras di- y trivalente modelo que nos permitan evaluar el posible efecto multivalente y plantear la creación de librerías químicas de nuevos inhibidores multivalentes de α-fucosidasas. La metodología a emplear para la generación de las nuevas librerías se basará en reacciones en paralelo de CuAAC seguidas de evaluación in situ de los compuestos obtenidos. Los mejores inhibidores se prepararán a mayor escala para llevar a cabo un estudio más detallado de su actividad inhibidora.  Siendo el compuesto 75i descrito en el capítulo 1 el primer ejemplo de inhibidor de tipo pirrolizidínico no solo potente sino también selectivo frente a la αgalactosidasa A humana, en este capítulo se plantea la síntesis de dos compuestos diméricos modelo análogos de 75i para evaluar el posible efecto multivalente en la inhibición y plantear la posibilidad de generar una librería de dímeros divalentes que pudiera ser evaluada in situ.  Con el objetivo de extender el estudio sobre los inhibidores monovalentes de HexB humana descrito en el capítulo 1, nos planteamos la síntesis de estructuras divalentes derivadas de pirrolidinas dihidroxiladas. La posterior generación de librerías químicas por reacciones clic, seguido de evaluación in situ frente a dos hexosaminidasas humanas, HexB y OGA, permitirá identificar no solo los compuestos más potentes, sino también los que presenten una mayor selectividad en la inhibición HexB/OGA. 117 Capítulo 2 2.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 2.3.1. Síntesis y evaluación in situ de estructuras multivalentes derivadas de pirrolidíntriazoles como inhibidores de αfucosidasas. Los excelentes resultados previamente obtenidos en nuestro grupo de investigación en relación a los inhibidores monovalentes de α-fucosidasas y los resultados preliminares sobre inhibidores multivalentes de esta enzima son la base para abordar el trabajo que se presenta en este apartado sobre derivados di- y trivalentes estructuralmente relacionados con los compuestos de tipo pirrolidin-triazol 127 y 123 (Figura 43). 160 Figura 43. Antecedentes relevantes de inhibidores de α-fucosidasas sintetizados en el grupo de investigación. 160 a) Elías-Rodríguez, P.; Moreno-Clavijo, E.; Carmona, A. T.; Moreno-Vargas, A. J.; Robina, I. Rapid discovery of potent α-fucosidase inhibitors by in situ screening of a library of (pyrrolidin-2-yl)-triazoles. Org. Biomol. Chem. 2014, 12, 5898-5904. b) Moreno-Clavijo, E.; Carmona, A. T.; Moreno- Vargas, A. J.; Molina, L.; Wright, D. W.; Davies, G. J.; Robina, I. Exploring a multivalent approach to α-L-fucosidase inhibition. Eur. J. Org. Chem. 2013, 7328-7336. c) Hottin, A.; Carrión-Jiménez, S.; Moreno-Clavijo, E.; Moreno-Vargas, A. J.; Carmona, A. T.; Robina, I.; Behr, J. B. Expanding the library of divalent fucosidase inhibitors with polyamino and triazole-benzyl bridged bispyrrolidines. Org. Biomol. Chem. 2016, 14, 3212-3220. Resultados y discusión 118 Con el objetivo de analizar si los valores de inhibición mejoraban al aumentar la valencia del derivado multivalente, nos planteamos la síntesis de una pequeña librería preliminar de análogos trivalentes. La estrategia sintética implica reacciones de CuAAC entre las pirrolidinas-alquino 128 y 128’y plataformas trivalentes funcionalizadas con grupos azido terminales (Esquema 36). La pirrolidina-alquino 128’ presenta un espaciador que incorpora una cadena de dietilenglicol para mejorar la solubilidad del compuesto en medios acuosos y que, a su vez, permitirá evaluar cómo afecta la distancia entre el inhítopo y la plataforma a los valores de inhibición. Esquema 36. Estrategia sintética para la preparación de iminoazúcares trivalentes. La síntesis de la alquinilpirrolidina 128 se ha llevado a cabo siguiendo un procedimiento previamente descrito en el grupo de investigación. 161 Así, la reacción de acetonación de la D-lixosa con 2,2-dimetoxipropano y PTSA catalítico seguida de tratamiento con cloruro de terc-butildifenilsililo originó el lactol protegido 129. La posterior reacción con hidrocloruro de hidroxilamina en medio básico originó la mezcla de oximas 130, las cuales se sometieron a un proceso de deshidratación/mesilación con cloruro de mesilo para originar 161 Elías-Rodríguez, P.; Moreno-Clavijo, E.; Carmona, A. T.; Moreno-Vargas, A. J.; Robina, I. Rapid discovery of potent α-fucosidase inhibitors by in situ screening of a library of (pyrrolidin-2-yl)-triazoles. Org. Biomol. Chem. 2014, 12, 5898-5904. 119 Capítulo 2 el compuesto 131 (Esquema 37). La reacción del compuesto organometálico MeMgBr con el nitrilo 131 transcurre mediante una adición nucleófila al grupo ciano seguida de ciclación mediante desplazamiento nucleofílico intramolecular que permite obtener la pirrolina 132. El tratamiento de 132 con TBAF/THF originó el derivado 5-hidroximetílico 133 cuya hidrogenación a alta presión (220 psi) en presencia del sistema catalítico Pd/C (10%) condujo al compuesto 134 de manera totalmente estereoselectiva (Esquema 37). Esquema 37. Síntesis de la alquinilpirrolidina 128. La protección del derivado 134 con Boc2O en MeOH seguido de reacción de oxidación de Swern dio lugar al aldehído 136, el cual, tras tratamiento con el reactivo de Bestmann- Resultados y discusión 120 Ohira, originó la alquinilpirrolidina 137. Finalmente, la reacción de desprotección con ácido trifluoroacético acuoso originó la pirrolidina 128. Por otra parte, la síntesis de la pirrolidina-alquino 128’ se llevó a cabo a partir del derivado protegido 137. La reacción CuAAC con la azida 138 162 seguido de reacción de propargilación originó el alquino derivado 140 que tras reacción de desprotección ácida dio lugar a 128’ (Esquema 38). Esquema 38. Síntesis de la pirrolidina-alquino 128’. Para la síntesis de los derivados trivalentes se utilizaron como plataformas el 1,3,5- tris(azidometil)benceno 141 y el 1,3,5-tris(azidometil)-2,4,6-trietilbenceno 142, preparados a partir de los correspondientes 1,3,5-tris(bromometil)-derivados comerciales por reacción con NaN3 (Esquema 39). 162 Aucagne, V.; Valverde, I. E.; Marceau, P.; Galibert, M.; Dendane, N.; Delmas, A. F. Towards the simplification of protein synthesis: iterative solid-supported ligations with concomitant purifications. Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 11320-11324. 121 Capítulo 2 Esquema 39. Síntesis de las plataformas trivalentes. Las reacciones CuAAC entre las pirrolidinas-alquino 128 y 128’ y las plataformas trivalentes 141 y 142 (Esquemas 40 y 41) se llevaron a cabo en presencia de CuSO4 y ascorbato de sodio en un sistema DMF:H2O (9:1). Las mezclas de reacción se dejaron evolucionar en un reactor de microondas (MW) a 90 °C hasta observar por c.c.f. (2-3 h) que la reacción había finalizado. Los iminoazúcares trivalentes 143-146 se obtuvieron con rendimientos de moderados a buenos (59-84%) tras purificación cromatográfica por exclusión de tamaño (Sephadex LH-20). Esquema 40. Síntesis de los iminoazúcares trivalentes 143 y 144. Resultados y discusión 122 Esquema 41. Síntesis de los iminoazúcares trivalentes 145 y 146. Con el objetivo de evaluar la posible existencia de efecto multivalente en la inhibición de α-fucosidasas, se tomaron como referencias el compuesto monovalente 147, previamente preparado en el grupo de investigación, 163 y el derivado 148 (Figura 44). 163 Elías-Rodríguez, P.; Moreno-Clavijo, E.; Carmona, A. T.; Moreno-Vargas, A. J.; Robina, I. Rapid discovery of potent α-fucosidase inhibitors by in situ screening of a library of (pyrrolidin-2-yl)-triazoles. Org. Biomol. Chem. 2014, 12, 5898-5904. 123 Capítulo 2 Figura 44. Iminoazúcares monovalentes de referencia 147 y 148. El compuesto 148 se obtuvo tras reacción CuAAC de la pirrolidina-alquino 128’ con bencilazida en presencia de CuSO4 y ascorbato de sodio en el disolvente tBuOH:H2O (2:1) (Esquema 42). Esquema 42. Síntesis del iminoazúcar monovalente de referencia 148. Evaluación biológica frente a glicosidasas Los derivados trivalentes 143-146 y el derivado monovalente 148 se evaluaron frente a un panel de 11 glicosidasas comerciales. Las enzimas comerciales (Sigma-Aldrich, Megazyme) utilizadas fueron las siguientes: α-fucosidasa de riñón de bovino, α-galactosidasa de granos de café, β-galactosidasa de Escherichia coli y Aspergillus oryzae, α-glucosidasa (maltasas) de levadura de pan y de arroz, amiloglucosidasa de Aspergillus niger, β-glucosidasa de almendras, α-manosidasa de guisantes de Jack, β-manosidasa de caracol y β-N- Resultados y discusión 124 acetilglucosaminidasa de guisantes de Jack. Todos los compuestos evaluados presentaron una inhibición potente y selectiva frente a la α-fucosidasa (>95% inhibición a una concentración 1 mM de inhibidor), no presentando inhibición significativa frente al resto de enzimas ensayadas. En la Tabla 2 se muestran los valores de IC50 de los compuestos 143-148 frente a α-fucosidasa de riñón de bovino. El monómero 147 se había preparado y evaluado con anterioridad en el grupo de investigación. 164 Tabla 2. Valores de IC50 (nM) para los derivados 143-148 frente a α-fucosidasa de riñón de bovino. Enzima 143 144 145 146 147 148 α-fucosidasa (riñón de bovino) 49 40 72 110 300 a 17 aDato extraido de la ref. 164 Todos los compuestos evaluados presentaron valores de IC50 en el rango nanomolar. Si se tienen en cuenta los IC50 determinados para las parejas de derivados triméricos 143/145 (49 y 72 nM respectivamente) y 144/146 (40 y 110 nM respectivamente), se puede concluir que no existe una diferencia significativa entre las dos plataformas utilizadas. Adicionalmente se observa que los derivados que presentan el fragmento de iminoazúcar más próximo a la plataforma aromática (143 y 144) resultaron ser ligeramente mejores inhibidores que sus análogos 145/146 (IC50 = 49 y 40 nM vs IC50 = 72 y 110 nM). Considerando que el monómero 147 es el más adecuado para analizar la multivalencia en el caso de los derivados trivalentes 143 y 144, obtendríamos unos valores 164 Elías-Rodríguez, P.; Moreno-Clavijo, E.; Carmona, A. T.; Moreno-Vargas, A. J.; Robina, I. Rapid discovery of potent α-fucosidase inhibitors by in situ screening of a library of (pyrrolidin-2-yl)-triazoles. Org. Biomol. Chem. 2014, 12, 5898-5904. 125 Capítulo 2 de rp/n de 2.0 y 2.5 respectivamente, lo que supone la existencia de un débil efecto multivalente (rp/n>1). En el caso de los trímeros 145 y 146, la comparación con el derivado monovalente de referencia 148 muestra que este compuesto es 4-6 veces mejor inhibidor que los correspondientes derivados triméricos, lo que descarta la existencia de efecto multivalente. Aunque los derivados trivalentes sintetizados resultaron ser inhibidores potentes y selectivos de α-fucosidasas, los valores de IC50 presentados (40-110 nM) son superiores a los mostrados por el análogo divalente (compuesto 123) previamente sintetizado en el grupo (Figura 45). 165 Figura 45. Comparación de la actividad inhibidora frente a α-fucosidasa de los derivados di- y trivalentes. A la vista de los resultados obtenidos se puede afirmar, que, en este caso, un aumento de la valencia del multímero no conduce a un aumento de la potencia de inhibición. De este modo, con el objetivo de llevar a cabo el análisis estructura-actividad de una forma rápida y eficaz, decidimos utilizar la metodología de síntesis paralela seguida de evaluación biológica in situ, previamente utilizada en el grupo a nivel monovalente, para la preparación 165 Hottin, A.; Carrión-Jiménez, S.; Moreno-Clavijo, E.; Moreno-Vargas, A. J.; Carmona, A. T.; Robina, I.; Behr, J.-B. Expanding the library of divalent fucosidase inhibitors with polyamino and triazole-benzyl bridged bispyrrolidines. Org. Biomol. Chem. 2016, 14, 3212-3220. Resultados y discusión 132 Esquema 46. Síntesis de los derivados monovalentes 149, 150 y 151. Los derivados divalentes 128b, 128j, 128i y los derivados monovalentes 149-151 se evaluaron frente a las dos α-fucosidasas en estudio (riñón bovino y Homo sapiens) y frente a otras ocho glicosidasas comerciales con el objetivo de determinar la potencia y selectividad de inhibición (Tabla 3). Todos los derivados resultaron ser inhibidores selectivos de αfucosidasas con mayor afinidad frente a la proveniente de riñón de bovino (IC50 en el rango nM). Si se analizan los valores de IC50 de los derivados diméricos 128b, 128j, 128i se puede confirmar la tendencia encontrada en las gráficas correspondientes a la evaluación in situ (Figuras 46, 47). Así, el dímero 128i presentó un valor de IC50 de 0.48 nM, siendo un inhibidor 100 veces más potente que el dímero 128b (IC50 = 47 nM) y 250 veces más potente que el 133 Capítulo 2 dímero 128j (IC50 = 0.12 µM), lo que confirma la validez de la metodología de análisis in situ utilizada para encontrar el mejor inhibidor dimérico. Tabla 3. IC50 (y Ki) en μM para la inhibición de α-fucosidasas por los dímeros 128b, 128j, 128i y los derivados monovalentes 149-151 al pH óptimo de cada enzima y 37 °C. 168 Compuesto α-fucosidasa (riñón bovino) α-fucosidasa (Homo sapiens) Monómero 149 1.0 (Ki = 0.30, K’i = 4.2) 70 (Ki = 18, K’i = 34) Monómero 150 0.019 (Ki = 0.0068, K’i = 0.066) 4.2 (Ki = 0.86, K’i = 5.5) Monómero 151 0.0011 (Ki = 0.0002, K’i = 0.001) 0.54 (Ki = 0.073, K’i = 0.58) Dímero 128i 0.00048 (Ki = 0.00015, K’i = 0.00052) 0.21 (Ki = 0.060, K’i = 0.15) Dímero 128b 0.047 (Ki = 0.015, K’i = 0.240) 6.8 (Ki = 2.5, K’i = 7.1) Dímero 128j 0.12 (Ki = 0.043, K’i = 0.132) 26 (Ki = 4.8, K’i = 11.1) 168 a) No se detectó inhibición (a 0.1 mM de inhibidor) frente a α-manosidasa (Jack bean), β-N- acetilglucosaminidasa (Jack bean), α-galactosidasa (granos de café), amiloglucosidasa (Aspergillus niger), α-glucosidasa (Saccharomyces cerevisiae), β-glucosidasa (almendras y arroz) y β-manosidasa (caracol). b) Se observó inhibición mixta para la inhibición de ambas α-fucosidasas de acuerdo con los gráficos de Lineweaver-Burk. Se representa la constante de inhibición (Ki) correspondiente a la inhibición de tipo competitivo; para la inhibición de tipo no competitivo, también se representa la correspondiente constante de inhibición aparente (Ki’). Resultados y discusión 134 Los derivados monovalentes 149 y 150 presentaron valores de IC50 frente a la αfucosidasa de riñón bovino de 1.0 y 0.019 µM respectivamente, lo que confirma la influencia del residuo aromático presente en 150 en la inhibición de esta enzima. Considerando el derivado de N-feniltriazol 150 como la referencia más apropiada para determinar el efecto multivalente de 128i, el valor de rp sería 39.6 (rp/n = 19.8), lo que indicaría la existencia de efecto multivalente. Sin embargo, la elevada inhibición presentada por el monómero 151 (IC50 = 1.1 nM) demuestra que el resto de sulfonildifenilo es fundamental en la inhibición de la enzima, siendo 151 17 veces mejor inhibidor que el derivado monovalente 150. Por ello, si se elige 151 como monómero referencia, se obtendría un valor de rp/n de 1.1, lo que descartaría la existencia de efecto multivalente en la inhibición del dímero 128i (el efecto multivalente se observa para rp/n > 1). Estos datos son un claro ejemplo de las discrepancias observadas en muchos casos en la determinación del efecto multivalente ya que los valores de rp/n dependen en gran medida de la estructura monovalente elegida como referencia (rp/n = 1.1, 19.8 o incluso 1042 eligiendo 151, 150 ó 149, respectivamente, como referencias). Aunque los derivados divalentes 128b, 128j, 128i y los derivados monovalentes 149-151 presentaron valores de inhibición peores frente a la α-fucosidasa de Homo Sapiens (Tabla 3) que los mostrados frente a la enzima de riñón de bovino, se observa un paralelismo en los resultados obtenidos frente a ambas enzimas. Con el objetivo de determinar el tipo de inhibición de estos compuestos, se procedió a la determinación de la constante de inhibición (Ki) utilizando para ello las representaciones de Lineweaver-Burk o de Dixon/Cornish-Bowden. Todos los compuestos resultaron ser inhibidores de tipo mixto tanto de la α-fucosidasa de riñón bovino como de la proveniente de Homo sapiens, predominando en todos los casos la componente competitiva. Como ejemplo de determinación del tipo de inhibición de los compuestos obtenidos se representan las gráficas de Dixon y Cornish-Bowden para el mejor dímero de la serie 128i (Figura 48). 135 Capítulo 2 Figura 48. Representación de Dixon (arriba) y Cornish-Bowden (abajo) para la inhibición del dímero 128i frente a α-fucosidasa de riñón bovino ([S] = concentración de sustrato; [I] = concentración de inhibidor; Abs = absorbancia; v = velocidad de la reacción enzimática). -1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 -0.35 0.15 0.65 1.15 [S] = 0.17 mM [S] = 0.33 mM [S]= 1.16 mM [S] = 1.75 mM Determinación del Ki(gráfica de Dixon) 1/v [I] en nM -1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 -0.8 -0.3 0.2 0.7 1.2 [S]/Abs [I] en nM Determinación del K'i (gráfica de Cornish-Bowden) [S] = 0.17 mM [S] = 0.33 mM [S] = 0.42 mM [S] = 1.16 mM Resultados y discusión 136 En la gráfica superior (Dixon), el corte de las líneas en el cuadrante superior izquierdo es indicativo de una inhibición competitiva o mixta; de esta gráfica puede obtenerse el valor del Ki (Ki = 0.15 nM). La gráfica inferior (Cornish-Bowden) nos permite distinguir entre una inhibición competitiva y una inhibición mixta. El hecho de que las líneas se corten en el cuadrante inferior izquierdo es indicativo de una inhibición mixta. De esta gráfica se puede obtener el valor de K’i (K’i = 0.52 nM). Al tratarse de una inhibición mixta, la enzima debe presentar un sitio alostérico (distinto al sitio activo) donde el inhibidor pueda interaccionar cuando el sustrato ocupa el sitio activo. Las α-fucosidasas de riñón bovino y de Homo sapiens pertenecen a la misma familia CAZy (GH29), lo que explicaría el comportamiento análogo que presentan los inhibidores sintetizados frente a ambas enzimas. Además, también pertenecen a la misma familia que las fucosidasas humanas FUCA1 y FUCA2, enzimas implicadas en el trastorno de almacenamiento lisosomal fucosidosis y en la adhesión y crecimiento de la bacteria Helicobacter pylori, respectivamente. En relación a los dímeros 128i y 128’i, la mayor inhibición presentada por 128i podría deberse a interacciones no específicas del espaciador difenilsulfona en la zona muy próxima al sitio activo de la enzima. Estas interacciones no serían posibles en el caso de 128’i, que presenta dicho grupo más alejado de la unidad de iminoazúcar. Esta situación se ajustaría bastante bien con una interacción secundaria de tipo alostérica (Figura 49) asumiendo que el núcleo de pirrolidina interacciona con el sitio activo (inhibición competitiva) mientras que el resto aromático establece interacciones con un sitio alostérico cercano. Este tipo de interacciones secundarias se habían observado previamente en el grupo de investigación, 137 Capítulo 2 mediante la cristalización del complejo formado por un derivado de pirrolidina-bencimidazol y una α-fucosidasa de origen bacteriano. 169 Figura 49. Uno de los posibles modos de interacción de un inhibidor divalente con la enzima. Por otra parte, si se comparan los términos de inhibición competitiva del derivado divalente 128i y el derivado monovalente 151 (Ki 0.15 and 0.20 nM, respectivamente), se observa que no hay una diferencia significativa, lo que sugiere que la presencia de la segunda unidad de iminoazúcar no es relevante en este tipo de inhibición, aunque pudiera serlo en la componente incompetitiva (K’i 0.52 and 1.0 nM para 128i y 151, respectivamente). 2.3.1. Síntesis y evaluación biológica de pirrolizidín-tioureas como inhibidores divalentes de αgalactosidasas. El estudio llevado a cabo en el capítulo anterior sobre inhibidores de glicosidasas con estructura pirrolizidínica permitió identificar al compuesto 75i (Figura 50) como un inhibidor potente y selectivo de la α-galactosidasa de origen vegetal y humana. 169 a) Wright, D. W.; Moreno-Vargas, A. J.; Carmona, A. T.; Robina, I.; Davies, G. J. Three dimensional structure of a bacterial α-L-fucosidase with a 5-membered iminocyclitol inhibitor. Bioorg. Med. Chem. 2013, 21, 4751-4754. Resultados y discusión 138 Figura 50. Estructura del mejor inhibidor de α-galactosidasa con estructura pirrolizidínica descrito en el capítulo 1. La enzima α-Gal A lisosomal es una glicosidasa que puede ser moderadamente sensible a los inhibidores multivalentes, como se demuestra en un trabajo previo de nuestro grupo de investigación en el que se prepararon derivados multivalentes de pirrolidinas que mostraron efecto multivalente relevante en la inhibición de la α-Gal A humana. 170 Con el objetivo de efectuar un estudio sobre la posible existencia de efecto multivalente en la inhibición de α-Gal A por parte de derivados multiméricos de pirrolizidinas, se planteó la síntesis de los compuestos modelo diméricos 152 y 153 (Figura 51). 170 Martínez-Bailen, M.; Carmona, A. T.; Cardona, F.; Matassini, C.; Goti, A.; Kubo, M.; Kato, A.; Robina, I.; Moreno-Vargas, A. J. Synthesis of multimeric pyrrolidine iminosugar inhibitors of human βglucocerebrosidase and α-galactosidase A: First example of a multivalent enzyme activity enhancer for Fabry disease. Eur. J. Med. Chem. 2020, 192, 112173. 139 Capítulo 2 Figura 51. C ompuestos diméricos modelo con estructura de pirrolizidín-ditiourea. La síntesis de estos compuestos podría abordarse según dos estrategias, tal y como se muestra en el análisis retrosintético (Esquema 47): (A) reacción del isotiocianato del derivado de pirrolizidina 154 con una diamina o (B) reacción de la pirrolizidín-amina 75 con el diisotiocianato correspondiente. Esquema 47. Posibles análisis retrosintéticos para la preparación de pirrolizidín-ditioureas. Los intentos de transformación del grupo amino de 75 en un grupo isotiocianato mediante distintos métodos no fueron efectivos para la obtención del pirrolizidínisotiocianato 154. Por este motivo, la sintesis de las pirrolizidín-ditioureas modelo 152 y 153 se realizó mediante reacción entre la pirrolizidín-amina 75 y los correspondientes diisotiocianatos utilizando como disolvente DMF (Esquema 48). Resultados y discusión 140 Esquema 48. Síntesis de los compuestos diméricos modelo 152 y 153. Con el objetivo de evaluar la posible existencia de un efecto multivalente en la inhibición de la α-Gal A para los compuestos 152 y 153, se han sintetizado los análogos monovalentes correspondientes (compuestos 155 y 156, Esquema 49). Esquema 49. Síntesis de los monómeros de referencia 155 y 156. Se ha realizado un estudio de la capacidad inhibidora de los compuestos divalentes modelo 152 y 153 y de los derivados monovalentes 155 y 156 frente a once glicosidasas comerciales (Sigma-Aldrich, Megazyme). 171 171 α-fucosidasa de Homo sapiens, -galactosidasa de granos de café, -galactosidasa de Escherichia coli y de hígado de bovino, -glucosidasa de levadura de pan y de arroz, -amiloglucosidasa de 141 Capítulo 2 En la Tabla 4 se representan los valores de IC50 obtenidos para los compuestos 152/153 y 155/156 frente a la α-galactosidasa de granos de café y la α-manosidasa de guisantes de Jack. La inhibición frente al resto de enzimas es baja o nula en todos los casos estudiados a una concentración 1 mM de inhibidor. Tabla 4. Valores de IC50 (en µM) para la inhibición de α-galactosidasa y α-manosidasa por las tioureas divalentes 152/153 y los derivados monovalentes 155/156 al pH óptimo de cada enzima y 37 °C. Compuesto -galactosidasa (granos de café) -manosidasa (guisantes de Jack) 152 2.0 29 153 1.2 102 155 2.5 47 156 2.4 46%a a % de inhibición a una concentración 1 mM de inhibidor; en este caso no se determina IC50. De los resultados obtenidos de las pruebas de inhibición se pueden hacer las siguientes observaciones: A) Los valores de IC50 de 152 y 153 demuestran que los compuestos divalentes modelo son inhibidores potentes de α-galactosidasa de granos de café y moderados de α-manosidasa de guisantes de Jack, confirmando el elevado perfil de potencia y selectividad de inhibición previamente observado para los análogos monoméricos descritos en el Capítulo 1. B) Los valores de IC50 de los derivados monoméricos 155 y 156 nos permiten cuantificar el posible efecto multivalente de los compuestos diméricos 152 y 153 mediante el cálculo del rp/n. Tanto para el compuesto 152 (rp/n = 0.63) como para el compuesto 153 (rp/n = 1) los Aspergillus niger, -glucosidasa de almendras, -manosidasa de guisantes de Jack, -manosidasa de caracol, -N-acetilglucosaminidasa de guisantes de Jack. 244 Experimental section 1,3-Bis(isothiocyanatomethyl)benzene (E’). 219 Reaction of 1,3-phenylenedimethanamine (485 mg, 2.20 mmol) following the general procedure and purification by chromatography column on silica gel (Cyclohexane → EtOAc:Cyclohexane, 1:40) afforded E’ (480 mg, 2.18 mmol, 99%) as a yellow solid. Generation of the dimeric libraries IVA and IVB followed by in situ biological screening (Figure 70). Library IVA: To a solution of 84 μL of the pyrrolidine-azide 95 (90 mM in tBuOH) in an eppendorf were added 35 μL of a solution of the corresponding dialkyne (a’-e’) (86 mM in tBuOH) followed by 15 μL of a solution of sodium ascorbate (200 mM in H2O) and 14 μL of a solution of CuSO4 (60 mM in H2O). The final concentration of the dialkynes (a’-e’) in each eppendorf was 20 mM. The resulting mixtures were shaken at 80 °C for 18 h and monitored for completion by TLC (AcOEt/Cy 2:1) and ESI-MS. Then, the reactions were diluted with water to the desired concentration and placed in a 96-well microtiter plate in order to perform the enzymatic assays against human hexosaminidase type OGA (O-GlcNAcase) and HexB (β-N-acetyl-hexosaminidase). In the preliminary screening of the resulting crude 95a’- e’, the percentage of inhibition was determined at 5 nM (HexB) and at 500 nM (OGA) of the corresponding dimeric compound on each well (assuming quantitative conversion in the click reaction). 219 Zepik, H. H., Benner, S. A.; Catalysts, anticatalysts, and receptors for unactivated phosphate diesters in water. J. Org. Chem. 1999, 64, 8080-8083. Experimental section 245 Library IVB: To a solution of 100 μL of the pyrrolidine-amine 96 (90 mM in DMSO) in an eppendorf, were added 88 μL of a solution of the corresponding isothiocyanates (A’-E’) (43 mM in DMSO). The final concentration of the diisothiocyanates (A’-E’) in each eppendorf was 20 mM. The resulting mixtures were shaken at r.t. for 19 h and monitored for completion by TLC (AcOEt/Cy 1:2) and ESI-MS. Then, the reactions were diluted with water to the desired concentration and placed in a 96-well microtiter plate in order to perform the enzymatic assays against human hexosaminidase type OGA (O-GlcNAcase) and HexB (β-N-acetyl- hexosaminidase). In the preliminary screening of the resulting crude 96A’-E’, the percentage of inhibition was determined at 5 nM (HexB) and at 500 nM (OGA) of the corresponding dimeric compound on each well (assuming quantitative conversion in the click reaction). 246 Experimental section Figure 70 Experimental section 247 Dimer 95a’. Pyrrolidin-azide 95 (43 mg, 0.13 mmol) was added to a solution of the dialkyne a’ (14.6 mg, 0.054 mmol) in tBuOH:H2O 4:1 (2.6 mL) followed by sodium ascorbate (10 mg, 0.05 mmol) and CuSO4 (2.4 mg, 0.015 mmol) and the reaction mixture was heated at 80°C for 24 h. After the solvent was removed under vacuum, the crude product was purified by chromatography column on silica gel (DCM:MeOH:NH4OH, 3:1:0.05 → 3:1:0.1) obtaining the final product 95a’ (25.9 mg, 0.028 mmol, 52%) as a yellow solid. [𝛼]𝐷 29 -17.5 (c 0.86, MeOH). 1H-NMR (300 MHz, CD3OD, δ ppm, J Hz) δ 7.98 (s, 2H, H triazol), 4.62 (s, 4H, triazol- CH2-O-), 4.40 (t, 4H, JH,H = 7.0, -CH2-triazol), 3.98 (br. t, JH,H = 2.0, H-3 or H- 4), 3.82 (br. t, 2H, H-4 or H-3), 3.77 (dd, 2H, 2JH,H = 11.5, JH,5 = 4.8, -CH2OH), 3.69 (dd, 2H, JH,5 = 3.7, -CH2OH), 3.67-3.62 (m, 16H, -OCH2CH2O-), 3.51 (dd, 2H, 2JH,H = 13.7, JH,2 = 3.4, -CH2NHAc), 3.24 (dd, 2H, JH,2 = 6.9, -CH2NHAc), 3.10-3.05 (m, 4H, H-2, H-5), 2.86-2.68 (m, 4H, -CH2N-), 1.95-1.87 (m, 10H, - CH2CH2-triazol, -CH3), 1.59-1.31 (m, 12H, CH2CH2CH2N-). 13C-NMR (75.4 MHz, CD3OD, δ ppm) δ 173.7 (-C=O), 145.9 (Cq triazol), 125.0 (CH triazol), 80.7, 80.6 (C-3, C-4), 71.5, 71.4 (-OCH2CH2O-), 70.7, 69.9 (C-2, C-5), 65.0 (triazol-CH2-O-), 60.5 (-CH2OH), 51.3 (-CH2-triazol), 48.2 (-CH2N-), 39.2 (-CH2NHAc), 31.2 (-CH2CH2-triazol), 28.6, 27.7, 27.2 (-CH2CH2CH2N-), 22.7 (- CH3). 248 Experimental section HRESIMS m/z found 951.5477, calc. for C42H76O13N10 [M+Na]+: 951.5486. Dimer 96D’. Pyrrolidine-amine 96 (30 mg, 0.099 mmol) was added to a solution of the diisothiocyanate D’ (14 mg, 0.042 mmol) in DCM:MeOH 1:10 (2.3 mL) and the mixture was stirred for 24 h at r.t. After evaporation to dryness, the crude was purified by chromatography column on silica gel (DCM:MeOH:NH4OH, 3:1:0.03) obtaining the final product 96D’ (32.1 mg, 0.034 mmol, 81%) as a white solid. [𝛼]𝐷 29 -21.0 (c 0.88, MeOH). 1H-NMR (300 MHz, CD3OD, δ ppm, J Hz) δ 7.85 (d, 4H, JH,H = 8.8, Ph), 7.70 (d, 4H, Ph), 3.99-3.96 (m, 2H, H-3 or H-4), 3.83-3.76 (m, 4H, H-4 or H-3, -CH2OH), 3.70 (dd, 2H, 2JH,H = 11.5, JH,5 = 3.6, -CH2OH), 3.57-3.49 (m, 6H, -CH2NH-, - CH2NHAc), 3.25 (dd, 2H, 2JH,H = 13.7, JH,2= 6.8, -CH2NHAc), 3.14-3.08 (m, 4H, H-2, H-5), 2.87-2.70 (m, 4H, -CH2N-), 1.95 (s, 6H, -CH3), 1.65-1.58 (m, 8H, - CH2CH2N-, -CH2CH2NH-), 1.43-1.33 (m, 8H, -CH2CH2). 13C-NMR (75.4 MHz, CD3OD, δ ppm) δ 182.0 (-C=S), 173.8 (-C=O), 145.6 (Cq Ph), 137.3 (Cq Ph), 129.4 (Ph), 123.2 (Ph), 80.7, 80.6 (C-3, C-4), 70.6, 69.6 (C-2, C-5), Experimental section 249 60.5 (-CH2OH), 48.3 (-CH2N-), 45.5 (-CH2NH-), 39.2 (-CH2NHAc), 29.7, 28.7 (- CH2CH2N-, -CH2CH2NH-), 28.0, 27.7 (-CH2CH2), 22.7 (-CH3). HRESIMS m/z found 939.4127, calc. for C42H66O10N8S3 [M+H]+: 939.4128. N-(((2R,3R,4R,5R)-3,4-Dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-1-(6-(4-(methoxymethyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)hexyl)pyrrolidin-2-yl)methyl)acetamide (157). To a solution of pyrrolidin-azide 95 (45.7 mg, 0.14 mmol) in DMF:H2O 9:1 (2 mL), methyl propargyl ether (0.016 mL, 0.18 mmol), sodium ascorbate (4 mg, 0.02 mmol) and CuSO4 (2 mg, 0.01 mmol) were added and the solution was stirred at r.t. for 19 h. After the solvent was removed under reduced pressure, the crude product was purified by chromatography column on silica gel (CH2Cl2:MeOH, 10:1 → 5:1) obtaining the final product 157 (34 mg, 0.085 mmol, 61%) as a yellow oil. [𝛼]𝐷 25 -32.4 (c 0.83, MeOH). 1H-NMR (300 MHz, CD3OD, δ ppm, J Hz) δ 7.98 (s, 1H, H triazol), 4.53 (s, 2H, - CH2OCH3), 4.41 (t, 2H, JH,H = 7.1, -CH2-triazol), 3.96 (t, 1H, JH,H = 2.0, H-3 or H-4), 3.80-3.72 (m, 2H, H-4 or H-3, -CH2OH), 3.67 (dd, 1H, 2JH,H = 11.4, JH,5 = 3.5, -CH2OH), 3.50 (dd, 1H, 2JH,H = 13.6, JH,2 = 3.2, -CH2NHAc), 3.37 (s, 3H, - OCH3), 3.19 (dd, 1H, JH,2 = 6.9, -CH2NHAc), 3.07-3.01 (m, 2H, H-2, H-5), 2.81- 250 Experimental section 2.62 (m, 2H, -CH2N-), 1.97-1.88 (m, 5H, -CH2CH2-triazol, -CH3), 1.59-1.34 (m, 6H, -CH2CH2CH2N-). 13C-NMR (75.4 MHz, CD3OD, δ ppm) δ 173.6 (-C=O), 145.8 (Cq triazol), 125.0 (CH triazol), 81.0, 80.9 (C-3, C-4), 70.4, 69.3 (C-2, C-5), 66.3 (-CH2OCH3), 60.6 (- CH2OH), 58.4 (-OCH3), 51.3 (-CH2-triazol), 47.8 (-CH2N-), 39.3 (-CH2NHAc), 31.2 (-CH2CH2-triazol), 28.8, 27.7, 27.2 (-CH2CH2CH2N-), 22.7 (-CH3). HRESIMS m/z found 400.2546, calc. for C18H34O5N5 [M+H]+: 400.2554. ANEXO I Conceptos básicos sobre inhibición enzimática 252 Anexo I ANEXO I: Conceptos básicos sobre la inhibición enzimática Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica capaces de catalizar los procesos biológicos. De forma análoga a los catalizadores, también las enzimas son capaces de disminuir la energía de activación (Ea) de una reacción acelerando su velocidad de una manera consistente. Una de las características peculiares de las enzimas en comparación con otros catalizadores está representada por su elevada especificidad por el sustrato. La actividad enzimática puede verse afectada por varios factores como el pH, la temperatura, la concentración del sustrato o por la presencia de sustancias químicas que interfieren en el proceso (inhibidores enzimáticos). 220 Gracias al modelo cinético de Michaelis-Menten, somos capaces de describir el comportamiento de la velocidad de una reacción catalizada por una enzima al variar la concentración de sustrato (S) y enzima (E). Recordando que el modelo en cuestión es válido sólo para las enzimas no alostéricas, podemos describir el modelo cinético de Michaelis- Menten con el siguiente esquema: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato (E-S) y en la segunda, el complejo E-S da lugar a la formación del producto (P), liberando la enzima libre (E). La velocidad de reacción se describe por la siguiente ecuación: 220 Waldrop, G. L. A qualitative approach to enzyme inhibition. Biochem. Mol. Biol. Educ. 2009, 37, 11- 15. Conceptos básicos sobre inhibición enzimática 253 Donde [S] es la concentración de sustrato y Vmáx es la velocidad máxima que describe el valor límite de velocidad alcanzable con una elevada concentración de sustrato. Km es la constante de Michaelis. La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v frente a [S]) es una hipérbola. La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la Km corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax. Reordenando los términos de la ecuación anterior se obtiene: Utilizando esta nueva ecuación, se puede establecer un método gráfico más adecuado para el cálculo de Km. Al representa 1/v frente a 1/[S] se obtiene una recta de pendiente Km/Vmáx , que corta al eje de ordenadas en 1/Vmáx y extrapolando, al eje de abcisas en -1/Km . Este es el método denominado de los dobles inversos o de Lineweaver-Burk (Figura 59). Figura 59. Representación de Lineweaver-Burk. 260 Anexo I Figura 66. Representación de Dixon y Cornish-Bowden en una inhibición de tipo mixta. 3. Inhibición incompetitiva o acompetitiva: para la inhibición incompetitiva las diferentes rectas de una representación de Dixon son paralelas entre sí, mientras que en la representación de Cornish-Bowden se cortan en el segundo cuadrante (abcisa negativa) (Figura 67). En este caso, el valor de Ki’ se obtiene a partir del punto de corte de las rectas de la representación de Cornish- Bowden. Figura 67. Representación de Dixon y Cornish-Bowden en una inhibición de tipo incompetitiva o acompetitiva. Conceptos básicos sobre inhibición enzimática 261 4. Inhibición no competitiva: en este tipo particular de inhibición mixta, las representaciones de Dixon y Cornish-Bowden conducen a gráficas análogas, en las que las rectas obtenidas se cortan en la zona negativa del eje de abscisas (Figura 68). En este caso, la constante de inhibición se puede obtener de ambas representaciones. Figura 68. Representación de Dixon y Cornish-Bowden en una inhibición de tipo no competitiva. ANEXO II Espectros representativos Espectros representativos 263 264 Anexo II Espectros representativos 265 266 Anexo II Espectros representativos 267 268 Anexo II Espectros representativos 269 276 Anexo II Espectros representativos 277 278 Anexo II Espectros representativos 279 280 Anexo II Espectros representativos 281 282 Anexo II Espectros representativos 283 284 Anexo II