Seguridad de la vacuna de la gripe en el receptor de trasplante de órgano sólido

TESIS DOCTORAL SEGURIDAD DE LA VACUNA DE LA GRIPE EN EL RECEPTOR DE TRASPLANTE DE ÓRGANO SÓLIDO Ángel Bulnes Ramos Licenciado en Biología Directoras de la Tesis Dra. Pilar Pérez Romero, Dra. Elisa Cordero Matía. Tutor de la Tesis Dr. Jerónimo Pachón Díaz "Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica" Departamento de Medicina Universidad de Sevilla Por fin el esperado momento, y al final del camino, es fundamental agradecerlo a todas las personas que en mayor o menor medida lo han hecho posible. En primer lugar a Jerónimo Pachón, que me ha permitido formar parte de este grupo de investigación durante todo este tiempo. Y como no a mis directoras de tesis, Elisa y Pilar, por ayudarme a crecer profesionalmente. Especialmente a ésta última, que me ha ayudado a formarme como investigador, dándome la oportunidad cuando pensaba que todos mis trenes ya habían pasado. Espero haber estado a la altura. Me gustaría agradecer a mi familia, mis padres, mis hermanos, mi hermana, mi sobrino y mi perro. Gracias por ayudarme y estar siempre ahí, soy lo que soy gracias a vosotros. Gracias a Marta, la mujer de mi vida, por estar siempre a mi lado, por tu apoyo y comprensión, por animarme y hacerme sentir afortunado cada día. Por supuesto todo este trabajo no hubiese sido posible sin todos y cada uno de los compañeros del laboratorio, todos ellos han aportado algún granito de arena en esta tesis. Javi, Menia y Younes, por sus consejos de Post-Doc. El brillante Mike, al que tengo que confesar que también he imitado en más de una ocasión. Gracias al consejo de sabias del 217: Mery, de las mejores personas con las que me haya cruzado nunca; Malu con su risa y expresiones contagiosas y Marina por supuesto, siempre dispuesta a ayudar y además recompensarte con un sincero abrazo. Patri, siempre servicial y Ani, la última gran incorporación A "la gente de bacterias": Rafa, bohemio y sincero, Rachel por su alegría, la risueña Marta, Tania sin quien todo esto no hubiese sido lo mismo, sin su alegría y "sandungueo", la constante Gema y Andrea, que en poco tiempo se ha convertido en una más. Al "Adenogrupo", No me voy a olvidar de los fantásticos ratos que hemos pasado delante de "una marinera", los mejores. Con el ocurrente Josan, que siempre tiene la respuesta perfecta para todo, mi compañero y gran amigo Pablo y Ana Serna, que no se imagina lo importante que es para mí en el grupo, por su ayuda, por su visión particular de la ciencia y sus consejos más allá del trabajo. A los compañeros del 208, a Bea por los increíbles ratos en cultivos a deshoras y a Damián por todos los buenos momentos que hemos pasado, gracias al sabio Juan, y a Tere, sin su ayuda con la estadística, este trabajo hubiese sido mucho más imposible. Cecilia por animarme siempre y Ale, que es mejor cuanto más lo conoces. Y por supuesto Pili, mi amiga, mi compañera de fatigas y alegrías, hemos formado un equipo perfecto dentro y fuera del laboratorio, lástima que tenga que acabarse. Solo espero que esta amistad sea para siempre y que nuestros caminos se crucen muchas veces en la vida. A todos los alumnos de prácticas, seguro que yo he aprendido más cosas de vosotros que vosotros de mí, Alba, Carmen, Antonio, Venancio y Pejenaute. En un mundo perfecto, estaría siempre trabajando al lado de todos y cada uno de vosotros. Gracias por todos los buenos momentos que hemos pasado en estos años. Y gracias a todas las personas que, no han tenido la suerte de dedicarse al a la ciencia, y sin saberlo han formado parte de ella empujándome en el camino, desde J. Antonio Arenas, quien me inculcó la pasión por la Biología, hasta mis amigos de siempre, Ana, Carlos, Sara, Kike, Ana O., Santi, Javi, David, a todos, gracias por estar siempre ahí. "La fórmula del éxito es un viaje de obstáculos donde la inteligencia no camina sola. El esfuerzo es su mejor aliado". R. Ayerbe FINANCIACIÓN  Estudio multicéntrico de la infección por el virus de la influenza A(H1N1)v en pacientes receptores de trasplante de órgano sólido en España. Instituto de Salud Carlos III - Investigación Comisionada. Expediente: GR09/0041  Influencia de la vacunación gripal en la producción de anticuerpos donanteespecíficos anti-HLA y su posible implicación en eventos de rechazo en pacientes con trasplante de órgano sólido. Consejería de Salud y Bienestar Expediente: PI0119-2012. Red Española de Investigación en Patología Infecciosa. Instituto de Salud Carlos III Expediente: RD12/0015/0001.  Ensayo clínico prospectivo aleatorizado comparativo de la eficacia y seguridad de una dosis de vacuna estacional respecto a dos dosis de vacunas como prevención de la gripe en receptores de trasplante de órgano sólido. Ministerio de Sanidad, Política Social e Igualdad – Dirección General de Farmacia y Productos Sanitarios. Expediente: EC11-456.  Red Española de Investigación en Patología Infecciosa. Instituto de Salud Carlos III Expediente: RD12/0015/0001. Introducción 19 1.1 Biología del virus influenza. El virus influenza pertenece a la familia Orthomyxoviridae es un virus esférico de hasta 120 nm y presenta una envuelta derivada de la célula huésped en la que se encuentran las proteínas neuraminidasa (NA), hemaglutinina (HA) y la proteína M2. La familia Orthomyxoviridae está compuesta por cinco géneros, Influenza virus A, Influenza virus B, Influenza virus C, Thogotovirus e Isavirus. Los virus influenza A se clasifican en función de la composición y antigenicidad de las proteínas de membrana, con 16 subtipos de hemaglutinina (H1 a H16) y 9 subtipos de neuraminidasa. Figura 1. Estructura del virus influenza. Representación esquemática de la estructura del virus influenza. HA: Hemaglutinina; NA Neuraminidasa, PB1, PB2 y PA: complejo polimerasa; NS, NS2: ribonucleoproteínas. Modificado de Beckel et al. Science 2006 El genoma del virus influenza A está compuesto por 8 segmentos de ARN lineal, de una sola cadena y sentido negativo, conteniendo entre 10 y 11 pautas abiertas de lectura (ORFs) que codifican 11 proteínas, entre las que se encuentran las proteínas de superficie HA, NA y las proteínas de la cápsida M1 y M2; el complejo polimerasa PB2, Introducción 20 PB1 y PA y las ribonucleoproteínas (RNP) y NS1, NS2 y PB-1-F2; todas esenciales para que se pueda completar el ciclo de vida del virus (Figura 1) (1). La polimerasa de ARN viral no posee el mecanismo de corrección de errores, lo que provoca que algunas proteínas no esenciales como la proteína HA tengan una elevada tasa de mutación, generando un cambio de base en cada progenie viral producida durante la infección (2). Los cambios genotípicos originados en las proteínas HA y NA por este fenómeno son conocidos con el término de deriva génica, que define la variación genética en la cepas virales de los virus influenza A y la infectividad, ya que estas proteínas son reconocidas por el ácido siálico de la membrana de la célula huésped, por lo que cambios en la estructura de estas proteínas pueden generan cambios en la infectividad del virus (3). Es importante conocer el ciclo de vida del virus durante la infección para entender la patogenicidad, y para trabajar en la prevención y tratamiento del virus de la gripe. El ciclo de vida del virus comienza con la unión del virus a la superficie celular, mediante el reconocimiento de los receptores de ácido siálico de la célula por parte de la hemaglutinina viral y se produce la entrada en la célula por endocitosis mediada por receptor. Posteriormente, el dominio terminal de la proteína HA queda expuesto en la cara citosólica del endosoma, y media la fusión con el endosoma celular (Figura 2). El interior de la partícula vírica se acidifica por la acción del canal iónico viral M2, lo que provoca la disociación de la proteína de la matriz M1 del complejo de ribonucleoproteína vRNP. La proteína M1 sale al citoplasma y es transportada al núcleo celular, donde comienza la replicación del ARN viral (ARNv). La replicación y transcripción del ARNv es catalizado por la polimerasa de ARN del virus. El ARN mensajero (ARNm) sintetizado es traslocado al citoplasma, donde la maquinaria celular de la célula hospedadora lo traducirá a proteína. Las nuevas proteínas virales sintetizadas, HA, NA, y M2 son transportadas e insertadas en la membrana plasmática. La membrana del virus procede de la membrana plasmática de la célula huésped donde las proteínas virales se agrupan en balsas lipídicas de colesterol y esfingolípidos. Esta asociación podría favorecer la liberación de las nuevas partículas de la célula hospedadora y la adhesión a la nueva célula. Por otra parte, la proteína M1participa en el ensamblaje de los nuevos viriones, la proteína M2 mantiene el correcto pH del retículo endoplásmico para la correcta conformación de la HA durante su síntesis. La Introducción 21 proteína NA es la segunda proteína más abundante de la superficie del virus y es esencial para la liberación de los nuevos viriones de la membrana de la célula huésped, mediado también por la acción de M2 (4, 5). Figura 2. Representación esquemática del ciclo de vida del virus influenza. Ciclo de vida del virus influenza. El ciclo comienza con la internalización del virus en la célula hospedadora mediante endocitosis. Las ribonucleoproteínas virales se liberan al citoplasma y son transportadas al núcleo celular, donde tiene lugar la replicación y la transcripción. El ARNm viral se exporta al citoplasma donde se traduce a proteínas. El ensamblaje de los nuevos viriones se produce en la membrana plasmática de la célula hospedadora y las nuevas partículas se liberan por gemación. Neumann et al. Nature 2010. Introducción 22 1.2 Variabilidad genética del virus de la gripe. Los cambios que se generan en las cepas de virus influenza se deben a la deriva antigénica o cambio de antigenicidad de las proteínas superficiales utilizadas (HA, NA) por la elevada tasa de mutación generada por la polimerasa viral. Si los cambios genéticos originados modifican la estructura de las proteínas NA y HA, pueden tener un importante efecto en el reconocimiento del virus por el sistema inmunológico del hospedador, ya que pueden afectar al reconocimiento de éstas por parte del sistema inmune. Estos cambios genéticos en las proteínas HA y NA generan nuevas cepas de virus influenza capaces de originar diferencias en la tasa de infección anual e incluso producir brotes epidémicos. Estos cambios pueden ser de dos tipos, cambios menores generados por deriva antigénica, o cambios mayores generados por un cambio antigénico. 1.2.1 Deriva génica. Este proceso genera pequeños cambios que afectan generalmente a las proteínas superficiales del virus HA y NA. Se producen por acumulación de mutaciones que producen cambios en los aminoácidos de las regiones antigénicas de las proteínas. Debido a estos cambios, los anticuerpos producidos en una infección previa no son capaces de reconocer al nuevo virus generado, seleccionándose de esta manera una nueva variante de cepa viral para la siguiente temporada gripal (3). Esta teoría ha sido demostrada in vitro generando nuevas cepas de virus mediante la selección por cantidades limitantes de anticuerpos monoclonales en varios ciclos de infección del virus (6). 1.2.2 Cambio antigénico. Son cambios mayores en el que se generan cepas de influenza A con proteínas completas diferentes a las anteriores. Es un mecanismo menos frecuente y por el que se generan las pandemias de gripe. Este proceso se realiza por medio de una zoonosis, bien porque dos o más cepas virales infecten simultáneamente la misma célula hospedadora generando una nueva cepa por reordenamiento genético ya que se intercambian segmentos completos de ARN, o bien por la selección de una mutación que permita a un virus de la gripe animal infectar a un humano y transmitirse de persona a persona. Introducción 23 Son fenómenos que se ven favorecidos por el carácter segmentado del genoma de los virus influenza. En ambos casos, se genera una cepa viral, con una nueva glicoproteína HA o con una nueva combinación de las proteínas HA y NA, contra las que la mayoría de la población no tienen inmunidad previa, no han generado anticuerpos previos y serán susceptibles de infección. Si además, esta nueva cepa obtiene alguna ventaja en la propagación de persona a persona, podría extenderse rápidamente a nivel mundial, generando epidemias y pandemias, como ya ha ocurrido varias veces a lo largo de la historia, la última en la pandemia de gripe A(H1N1)pdm en el año 2009 (7, 8). Concretamente, la cepa de influenza pandémica A(H1N1)pdm se originó por una recombinación triple de genes nunca descritos en cepas humanas (Figura 3). La cepa pandémica se originó a partir de tres eventos de reordenación genética. El primero de ellos ocurrió entre 1997 y 1998, con la generación de un virus H3N2 triple recombinante (trH3N2) que partió de la combinación de un virus H1N1 porcino (H1N1 tipo clásico relacionado con la cepa causante de la pandemia de 1918), un virus aviar perteneciente al linaje norteamericano y un virus humano H3N2 estacional. En esta reordenación cada uno de ellos aportó distintos segmentos del genoma. El segundo evento generan dos virus triple recombinantes (H1N1 y H1N2) a partir de la introducción de la proteína NA y/o la HA del virus H1N1 porcino al virus H3N2 aviar norteamericano. Finalmente, cerca del año 2009 se produjo el tercer evento de reordenación entre el virus H1N2 y el virus H1N1 porcino “tipo aviar” (aviar-like) (H1N1) euroasiático, el cual aporta los genes de la NA y la matriz. Con esta última reordenación se generó la cepa A(H1N1)pdm que se transmitió al ser humano en abril de 2009 iniciando la pandemia (4). Introducción 24 Figura 3. Generación de la cepa de virus influenza A(H1N1)pdm Representación esquemática de la generación de la cepa de virus influenza A(H1N1)pdm, por reordenamiento genético. Las características genéticas del virus de la gripe, que hacen que se den fácilmente estos procesos de cambio genético, ya sean leves o abruptos, provocan que las cepas de virus circulantes sean diferentes cada año, limitando la capacidad de reconocimiento del sistema inmune de los individuos infectados. Por ello, la composición de las vacunas antigripales recomendadas por la OMS debe revisarse y reformularse prácticamente todas las emporadas gripales. Neumann et al. Nature 2010. Introducción 25 1.3 Respuesta inmune frente al virus influenza. La respuesta inmune frente a las infecciones víricas es un proceso complejo que engloba tanto a la respuesta innata inespecífica cómo a la respuesta específica adaptativa humoral y celular. 1.3.1 Respuesta innata inespecífica. La respuesta innata frente al virus influenza incluye procesos físicos y celulares que protegen frente a cualquier patógeno invasor. Esta respuesta se produce a través del reconocimiento de dominios conservados en los patógenos que no se encuentran normalmente en el huésped. Un claro ejemplo de este proceso es la producción de interferón de tipo I (α y β) (9) en respuesta a la infección, con propiedades antivirales que inhiben la replicación viral (10). En la respuesta innata frente al virus de la gripe participan además otros componentes del sistema inmune como los macrófagos y las células natural killer (NK) (11, 12). 1.3.2 Respuesta celular. La respuesta específica de células T se produce cuando las células T naïve reconocen a antígenos presentados por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I o clase II en las células infectadas por el virus influenza (13, 14). Durante la infección, la degradación de las proteínas virales por parte de la célula infectada facilita la carga de los antígenos en los MHC que son presentados a las células T circulantes (15, 16). El reconocimiento de los antígenos por parte de los linfocitos T naïve promueve la proliferación y diferenciación a linfocitos T efectores y de memoria. Esta unión específica al antígeno es fundamental para que se desencadene la respuesta inmune específica y posteriormente de memoria (17). El papel principal de las células T citotóxicas es el reconocimiento y posterior eliminación de las células infectadas por el virus influenza, de modo que la respuesta celular es capaz de reducir los síntomas derivados de la infección, pero no evitar la infección inicial (18). Los linfocitos TCD8+ específicos son los encargados del reconocimiento de las células infectadas por el virus influenza que reconocen antígenos intracelulares del virus presentados por el sistema HLA, en particular, las proteínas M1 y NP, altamente Introducción 26 expresadas durante las primeras etapas de la infección (17, 19, 20). Recientemente también se ha descrito una relación entre el aumento de linfocitos TCD4+ y una menor replicación viral y menor gravedad de enfermedad en pacientes infectados (21, 22). 1.3.3 Respuesta humoral. La respuesta inmune mediada por anticuerpos juega un papel crucial en el control y reducción de la gravedad de la infección por el virus influenza, evitando así la infección primaria en infecciones posteriores. Esta respuesta mediada por anticuerpos se genera frente al virus de la gripe tras la infección o la vacunación y consiste en la producción de anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes. Los anticuerpos no neutralizantes no son funcionales en su mayoría sin embargo, los anticuerpos no neutralizantes funcionales, se unen específicamente a proteínas superficiales como HA y NA y proteínas internas como M1, M2 y NP y aunque no evitan la infección de la célula huésped, participan en el aclaramiento viral y el control de la enfermedad (23-25). También participan en la activación de las células NK, que promueven la eliminación de las células infectadas, mediante un mecanismo denominado citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (26, 27) Por otro lado, los anticuerpos neutralizantes tienen un dominio de unión específico frente a proteínas superficiales del virus e impiden la unión del virus a la célula huésped, y/o la liberación de la progenie vírica de la célula infectada. En el caso de los anticuerpos neutralizantes que reconocen específicamente a la hemaglutinina de la envuelta viral bloquean la unión a los receptores de ácido siálico de la superficie de la célula huésped, que constituye el primer paso de la adhesión del virus con el hospedador (Figura 4). El bloqueo de esta proteína viral por parte de los anticuerpos neutralizantes generados por el huésped evita la infección primaria y la reinfección del virus de la gripe (26, 28). Los anticuerpos neutralizantes específicos frente a la proteína NA, evitan la liberación de la nueva progenie vírica de la célula hospedadora, y aunque no previenen la infección primaria, contribuyen a controlar la gravedad de la infección disminuyendo los casos de reinfección (29). Introducción 27 Figura 4. Representación esquemática del mecanismo de acción de los anticuerpos neutralizantes. Mecanismo de acción de los anticuerpos neutralizantes frente al virus influenza. A. Los anticuerpos neutralizantes se unen a la proteína HA1, bloqueando el reconocimiento del receptor celular. B. Los anticuerpos específicos anti-HA2 bloquean la fusión de la membrana del virus con la del endosoma, impidiendo la liberación en el citoplasma. C. Los anticuerpos que reconocen a la proteína NA superficial bloquean la liberación de los nuevos viriones de la célula huésped. Modificado de Han, T. et al. Science, 2011. 1.4 Epidemiología del virus influenza. 1.4.1 Prevalencia. El resfriado común y la gripe son las enfermedades infecciosas más frecuentes en la población mundial. El diagnóstico es fundamentalmente clínico, siendo los síntomas más comunes fiebre, malestar, escalofríos, dolor de cabeza y dolores musculares (30). La infección por el virus influenza causa la enfermedad gripal, una enfermedad infecciosa leve, que se caracteriza por el inicio súbito de fiebre, intenso malestar, dolores musculares y articulares, dolor de cabeza y garganta, tos, y secreción nasal. El periodo de incubación suele ser de dos días, y los síntomas desaparecen al cabo de dos semanas aproximadamente, sin necesidad de intervención clínica ni originando complicaciones graves en la mayoría de los casos. En las poblaciones de riesgo, como Introducción 34 Además, se ha sugerido que la administración de oseltamivir previa a la infección, podría generar una disminución del riesgo de progresión de enfermedad a neumonía en pacientes inmunodeprimidos (81). Por otra parte, en la población general, la quimioprofilaxis administrada antes de la exposición al virus ha demostrado una eficacia en la prevención de la infección del 84% para oseltamivir y del 82% para zanamivir. Sin embargo, no hay estudios concluyentes sobre la eficacia de la quimioprofilaxis previa a la exposición con el virus en los pacientes receptores de TOS (82, 83). - Vacunación. La vacunación anual frente al virus influenza es la medida más eficaz para evitar la infección. En la población adulta sana, la vacunación proporciona protección frente a la infección por el virus de la gripe en el 70-90% de los casos, siendo la vacunación gripal una medida costo-efectiva óptima, especialmente en niños y población anciana (84, 85). La vacuna de la gripe estacional está compuesta por las proteínas HA y NA derivadas de las tres cepas de virus influenza, A(H1N1)pdm, A/H3N2 e influenza B. Como se ha comentado anteriormente, la OMS estableció en 1947 la Red Mundial de Vigilancia de Gripe para monitorizar el desarrollo y migración de las variantes del virus de la gripe circulante en cada temporada gripal. En base a los resultados de vigilancia se revisa anualmente la composición vacunal, para adaptarse a los cambios en función de los virus circulantes detectados. Este organismo cuenta en la actualidad con 125 centros repartidos en 96 países para la vigilancia mundial de la infección por el virus influenza. Para realizar el seguimiento, los centros locales recogen muestras de pacientes con gripe y las envían a uno de los cuatro centros de referencia mundiales de la OMS localizados en Atlanta, Londres, Melbourne y Tokio (86, 87). En cada centro se realizan pruebas de similitud antigénica basadas en ensayos de hemaglutinación de los antisueros y los datos se envían al Centro de Evolución de Patógenos de la universidad de Cambridge para la cartografía y mapeo antigénico. En función de los resultados obtenidos, la OMS recomienda una nueva composición vacunal para la gripe para la temporada siguiente, adaptando semestralmente la composición en el Hemisferio Norte y el Hemisferio Sur. Introducción 35 Es muy importante la correcta elección de las cepas que componen la vacuna por parte de los organismos encargados, ya que el proceso de fabricación de la vacuna de la gripe requiere entre seis y ocho meses, desde que se selecciona la cepa mayoritaria circulante que será añadida a la vacuna hasta la fabricación final de la misma. En algunos casos puede ocurrir que en este lapso de tiempo se produzcan cambios genéticos de las cepas circulantes no contemplados en la elección de los candidatos, provocando una reducción en la eficacia de la vacuna en esa temporada. Un ejemplo claro de este hecho ocurrió en la temporada gripal 2007-2008, en la que se recomendó la incorporación de la cepa A/Wisconsin/67/2005(H3N2)-like, pero la cepa predominante fue A/Brisbane (H3N2)- like. Más recientemente, en la temporada 2013-2014 la vacuna administrada incluía la cepa B/Yamagata, y la cepa mayoritaria circulante fue la B/Victoria y en la temporada 2014-2015, en la que el 66.8% de las cepas de A/H3N2 circulantes no coincidieron con la cepa A/Texas/50/2012(H3N2)-like incluida en la composición vacunal (88). En todo caso, aunque la vacuna vea reducida su eficacia por este hecho, sigue aportando beneficios a los pacientes, como la prevención de síntomas graves (89-91). Tipos de vacuna y recomendaciones de administración. - Vacuna trivalente de virus inactivados. La vacuna trivalente de virus inactivados es una vacuna que consta de las proteínas HA y NA fragmentadas de las tres cepas de virus influenza incluidas en la composición vacunal. Para producir la vacuna, cada cepa del virus influenza por separado se propaga en huevos de gallina embrionados (92), y posteriormente son purificados e inactivados con formalina. Los virus inactivados son fraccionados para aislar las proteínas HA y NA de cada cepa. Cada dosis de la formulación vacunal está compuesta por 15 µg de las proteínas HA y NA de cada una de las cepas. -Vacuna de virus vivos atenuados. La vacuna de virus vivos atenuados de influenza se consigue por recombinación entre cada una de las cepas de referencia con una cepa adaptada al frío, produciéndose una Introducción 36 reorganización genómica. Como resultado, se obtiene una cepa recombinante que contiene la información genética de las proteínas NA y HA de la cepa de referencia propuesta, y los seis genes de adaptación a baja temperatura de la cepa resistente. Para su producción, cada una de las tres cepas adaptadas se propaga en sucesivos pases de infección a 25ºC y posteriormente en huevos de gallina embrionados. Se consigue de esta manera, una cepa del virus que no es capaz de completar su ciclo de infección a temperaturas fisiológicas de 37ºC, por lo que el paciente puede estimular su respuesta inmune sin desarrollar síntomas gripales ni enfermedad (93, 94). El uso de esta vacuna no está aprobado en España y por tanto no se comercializa y no está recomendada para el receptor de TOS. -Recomendaciones para la vacunación. El comité de buenas prácticas e inmunización (ACIP) del CDC revisa anualmente las recomendaciones y establece los grupos de riesgo en los que se debe administrar la vacuna de la gripe. Actualmente el Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e igualdad recomienda la vacuna para los siguientes grupos de población: 1. Personas de edad mayor o igual a 65 años, haciendo especial énfasis en aquellas personas que conviven en instituciones. 2. Personas menores de 65 años que presentan un riesgo elevado de complicaciones derivadas de la gripe.  Niños de mayores de seis meses de edad y adultos con enfermedad crónica cardiovascular (excluyendo hipertensión arterial aislada) o pulmonar, incluyendo displasia bronco-pulmonar, fibrosis quística y asma.  Niños mayores de seis meses y adultos con: -Enfermedades metabólicas, incluida la diabetes mellitus. -Obesidad mórbida (índice de masa corporal ≥ 40 en adultos, ≥ 35 en adolescentes, o ≥ 3 DS en la infancia). -Insuficiencia renal. -Hemoglobinopatías y anemias. -Asplenia. -Enfermedad hepática crónica. -Enfermedades neuromusculares graves. Introducción 37 -Inmunosupresión, incluida la originada por la infección de VIH, por fármacos o en los receptores de trasplante. -Implante coclear o en espera del mismo. -Trastornos y enfermedades que conllevan disfunción cognitiva: Síndrome de Down, demencia y otras. En este grupo se hará especial énfasis en aquellas personas que precisen seguimiento médico periódico o que hayan sido hospitalizadas en el año precedente.  Residentes en instituciones cerradas, de cualquier edad a partir de seis meses, que padezcan procesos crónicos.  Niños y adolescentes, de entre seis meses y 18 años, que reciben tratamiento prolongado con ácido acetil salicílico, por la posibilidad de desarrollar un síndrome de Reye tras la gripe.  Mujeres embarazadas en cualquier trimestre de gestación. 3. Personas que puedan transmitir la gripe a aquellas que tienen un alto riesgo de presentar complicaciones:  Trabajadores de los centros sanitarios, tanto de atención primaria como especializada y hospitalaria; pública y privada. Se hará especial énfasis en aquellos profesionales que atienden a pacientes de algunos de los grupos de alto riesgo anteriormente descritos.  Personas que por su ocupación trabajan en instituciones geriátricas o en centros de atención a enfermos crónicos, especialmente los que tengan contacto continuo con personas vulnerables.  Personas que proporcionen cuidados domiciliarios a pacientes de alto riesgo o ancianos.  Personas que conviven en el hogar, incluidos niños/as, con personas que pertenecen a algunos de los grupos de riesgo, por su condición clínica especial (citados en el apartado 2). 4. Otros grupos en los que se recomienda la vacunación: Introducción 38  Personas que trabajan en servicios públicos esenciales con especial énfasis en los siguientes subgrupos: -Fuerzas y cuerpos de seguridad del Estado, con dependencia nacional, autonómica o local. - Bomberos. - Servicios de protección civil. - Personas que trabajan en los centros de emergencia sanitaria. - Trabajadores de instituciones penitenciarias y de otros centros de internamiento por disposición judicial.  Personas que, por su ocupación, pueden estar en contacto con aves con sospecha o confirmación de infección por virus de la gripe aviar altamente patogénico, especialmente: - Las personas que están directamente involucradas en las tareas de control y erradicación de los brotes (destrucción de los animales muertos, limpieza y desinfección de áreas infectadas). -Las personas que viven y/o trabajan en granjas de aves donde se han notificado brotes, o se sospecha de su existencia. Estas recomendaciones deben actualizarse en función de las evidencias epidemiológicas sobre el patrón de presentación y difusión de la infección por virus de gripe aviar Por el contrario, no se recomienda la vacunación gripal en los siguientes casos:  En personas con alergia al huevo, con hipersensibilidad a las proteínas de huevo o que hayan tenido una reacción alérgica severa a una vacuna de la gripe anterior.  Los niños menores de seis meses.  Si se tiene una enfermedad aguda con fiebre alta debe esperarse hasta que esta situación remita. 1.6 Medidas para evaluar la respuesta a la vacunación. 1.6.1 Hemaglutinación. Tradicionalmente, la titulación de anticuerpos neutralizantes frente al virus influenza se ha basado en experimentos que evalúan la capacidad de una muestra de suero de inhibir la hemaglutinación. La proteína HA de la superficie viral, tiene la capacidad de producir Introducción 39 la hemaglutinación de los eritrocitos, mediante unión específica de la superficie de éstos. Ante una concentración viral fija, y en presencia de una molécula de unión a la proteína HA, como los anticuerpos neutralizantes específicos de HA, la inhibición de la hemaglutinación observada será proporcional a la concentración de anticuerpos (95). Aunque esta técnica se convirtió en un protocolo relativamente universal para la titulación de anticuerpos neutralizantes frente al virus de la gripe presentes en el suero de los pacientes, y ha sido empleada en multitud de estudios (96-98), el hecho de que el análisis de los resultados de la hemaglutinación sea visual junto con otras limitaciones técnicas en el desarrollo del protocolo, han conducido a que sea desplazada por otras técnicas más sensibles, más sencillas y más objetivas de cuantificar, como la microneutralización, basada en la técnica de ELISA. 1.6.2 Microneutralización. La técnica de microneutralización es una herramienta eficaz para evaluar la respuesta a la vacunación mediante la titulación de los anticuerpos neutralizantes presentes en el suero del paciente, capaces de bloquear la infección del virus de la gripe de células en cultivo. En esta técnica, se emplea una cantidad fija de virus influenza para infectar células en cultivo en presencia de cantidades decrecientes del suero de pacientes. La inhibición de la infección observada será proporcional a la cantidad de anticuerpos neutralizantes presentes en el suero. Este ensayo, de más fácil manejo que la hemaglutinación, y mayor fiabilidad en la cuantificación, ha sustituido en gran medida a la hemaglutinación y se ha convertido en la técnica de referencia para la cuantificación de anticuerpos neutralizantes frente a la gripe (99). 1.6.3 Variables de cuantificación de la respuesta inmune frente a la vacunación. Según los estándares internacionales (100), los parámetros para medir la respuesta inmune a la vacunación son: - Geometric mean titer (GMT): media de títulos de anticuerpo en el grupo de individuos vacunados. - Tasa de seroprotección: porcentaje de sujetos con título de anticuerpo 1:40. Introducción 40 - Tasa de seroconversión: porcentaje de sujetos con un incremento de cuatro veces en el título de anticuerpo basal. - Geometric mean ratio (GMR) o factor de seroconversión: número de veces que incrementa el GMT desde basal a postvacunal. Una vacuna se considera eficaz cuando el individuo está seroprotegido tras la vacunación con valores de seroprotección ≥40 y ha seroconvertido con un aumento de 4 veces el título de anticuerpos basales (101, 102). 1.7 Eficacia de la vacuna de la gripe en pacientes receptores de TOS. La vacunación estacional frente a la gripe está especialmente recomendada en la población trasplantada, ya que como se ha comentado anteriormente, tiene un mayor riesgo de desarrollar complicaciones derivadas de la infección por el virus influenza y es el mejor método para evitar la infección (31). Sin embargo, la eficacia de la vacuna de la gripe en la población trasplantada es menor que en la población general, existiendo un porcentaje de pacientes que varía entre el 15% y un 90%, en función de la cohorte estudiada, que no desarrolla una respuesta inmune de anticuerpos neutralizantes y por tanto no está seroprotegido frente a la infección (99, 103-112), por lo que sigue habiendo un margen para mejorar la eficacia vacunal. Otro aspecto importante que se ha debatido ampliamente en relación a la eficacia de la vacuna de la gripe es cuándo administrarla tras el trasplante. Las recomendaciones actuales, que se basan en opiniones de expertos y trabajos realizados con series pequeñas de pacientes (113), recomiendan vacunar a partir del tercer al sexto mes tras el trasplante. Debido a la estacionalidad de la vacunación, que se realiza entre Octubre y Diciembre, a diferencia de otras vacunas que pueden aplicarse durante todo el año y a las complicaciones asociadas a la infección por influenza en esta población, es fundamental determinar el momento más adecuado tras el trasplante en el que es seguro y efectivo administrar la vacuna. Existen pocos datos experimentales al respecto, pero se argumenta en la literatura que la administración de la vacuna durante los primeros meses desde el trasplante podría tener una menor eficacia, debido posiblemente a la Introducción 41 mayor inmunosupresión a la que están sometidos los pacientes en este periodo. Por tanto, sería esencial realizar estudios que respondan a este aspecto sobre la vacunación gripal en series de pacientes con mayor potencia estadística y a lo largo de diferentes temporadas gripales para llegar a conclusiones sólidas. 1.8 Seguridad de la vacunación. 1.8.1 Seguridad de la vacunación en el receptor de TOS. Aunque se ha demostrado que la vacunación gripal es el método más eficaz para proteger de la infección gripal al receptor de TOS, minimizando los riesgos directos e indirectos provocados por el virus influenza, algunos autores han alertado sobre el riesgo teórico de que la vacunación pudiera generar una respuesta de rechazo del injerto debido a la hiperestimulación a través de la producción de anticuerpos anti-HLA donante específico (DSA). 1.8.2 Sistemas de histocompatibilidad. Una de las principales herramientas del sistema inmunitario para la defensa del organismo frente a las agresiones externas es el sistema de histocompatiblidad encargado de reconocer a los antígenos. Una vez reconocidos los antígenos como elementos extraños, el sistema de histocompatiblidad se encarga de presentarlos a los linfocitos T. El sistema más conocido es el complejo principal de histocompatiblidad (HLA). Las moléculas HLA (antígeno leucocitario humano), son un grupo de receptores celulares presentes en todos los tipos celulares. Un importante aspecto en la función del sistema HLA es su relación con el reconocimiento en los trasplantes (114). El sistema HLA contribuye a diferenciar la respuesta inmune según el antígeno reconocido, gracias a su alto grado de polimorfismo, que contribuye a las diferencias en la respuesta inmunitaria entre individuos, jugando un papel importante en la susceptibilidad a ciertas enfermedades y en el trasplante de órgano (115). Introducción 42 Figura 5. Representación esquemática de las molécula HLA de clase I y II. A. Estructura de una molécula de clase I. B. Estructura de una molécula de clase II. Abreviaciones: NH2, amino terminal; COOH, carboxilo terminal; S-S, puente disulfuro; PO4, fosfato. El rechazo del aloinjerto se produce cuando el sistema HLA reconoce antígenos presentes en el injerto y ausentes en el receptor, y reacciona desencadenando una respuesta inmune frente a él (116). Respecto a sus características estructurales y funcionales, los genes y moléculas de HLA se clasifican en clase I y clase II según su estructura, función y distribución celular. Las moléculas de HLA clase I se expresan constitutivamente en prácticamente todas las células del organismo y funcionan como moléculas presentadoras de péptidos a las células T CD8+ y controlan la actividad NK, mientras que las moléculas de HLA de clase II, se expresan de manera constitutiva sólo en células presentadoras de antígenos y presentan péptidos a los linfocitos T CD4+ (117, 118). También existe expresión diferencial de las moléculas de HLA, de forma que HLA-DR es más abundante que HLA-DP y DQ. La expresión de estas moléculas también puede verse alterada en situaciones clínicas concretas, como en el caso del rechazo de trasplante, en las que se alcanza una expresión considerable de las moléculas de HLA de clase II, siendo las moléculas HLADR mayormente expresadas que las HLA-DP y HLA-DQ. Introducción 43 Para determinar la compatibilidad antes del trasplante, en determinados órganos como riñón y corazón, se procede al tipaje de HLA tanto de donante como del receptor, a partir de muestras de ganglio inguinal, bazo o sangre periférica, en las que se procede a la separación de células T y B. 1.8.3 Producción de anticuerpos citotóxicos. Tras el trasplante, se pueden producir anticuerpos frente a moléculas HLA del donante si éstas son diferentes a las del receptor. En el caso de los trasplantes, el órgano trasplantado presenta multitud de antígenos diferentes, lo que origina una reacción inmediata por parte del sistema inmune del receptor. Además, este tipo de pacientes puede presentar autoanticuerpos derivados de la propia patología o del tratamiento. Se calcula que los anticuerpos anti-HLA se producen en un 75 - 90% de los receptores que pierden el órgano. Por otro lado en algunos episodios de rechazo, se ha descrito la presencia de anticuerpos que reaccionan sólo con antígenos específicos de tejido, son los anti-HLA donante-específicos o DSA, expresados en células endoteliales y monocitos, pero no en la membrana de linfocitos. Se ha demostrado que podrían ser la razón para algunos rechazos observados en pacientes con prueba cruzada negativa. Esta respuesta se puede producir durante el embarazo, por transfusiones sanguíneas o por trasplantes (119, 120). En algunos trabajos, se establece la posibilidad de que la vacuna de la gripe, puede contener epítopos que generen esta respuesta aloinmune (106, 121, 122). Introducción 50 En un estudio más reciente publicado por Cohet et al. en 2016, analizaron la producción de anticuerpos anti-HLA de novo en 184 pacientes receptores de TOS después de recibir la vacuna de la gripe adyuvantada con AS03. En este trabajo, los autores no encontraron evidencias que relacionen la vacunación gripal con el rechazo mediado por anticuerpos anti-HLA (141). Por otra parte debido a que los primeros meses tras el trasplante es un periodo en que el paciente es especialmente lábil inmunológicamente debido a la intensidad del régimen inmunosupresor, se han generado dudas acerca de si la vacunación podría promover la inducción de rechazo, debido a que la vacuna está asociada a la hiperactivación del sistema inmune (60). Es importante destacar que en la literatura, no encontramos estudios que profundicen en la producción de anticuerpos anti-HLA en los pacientes vacunados en los primeros meses tras el trasplante, siendo éste un aspecto esencial de la seguridad de la vacunación, ya que tanto la circulación del virus, como los periodos de vacunación están sujetos a temporalidad. De forma que si se demora la vacunación de la gripe, para esperar que haya transcurrido más tiempo desde el trasplante, puede suponer que no haya tiempo de vacunar al paciente antes de que la epidemia de la gripe haya comenzado y el enfermo esté expuesta a la misma. Tampoco existen estudios que evalúen el aumento del número de dosis de la vacuna gripal y su relación con la producción de anticuerpos anti-HLA que puedan desencadenar un rechazo de órgano. Sin embargo, siguiendo el razonamiento de la sobre estimulación del sistema inmune que produce la vacuna de la gripe, un aumento de dosis podría también agravar este efecto. En base a lo expuesto anteriormente, los resultados de estos estudios, además de ser controvertidos, están basados en series de pacientes poco numerosas, por lo que no son concluyentes. Por tanto, sería necesario realizar nuevos estudios de cohortes más numerosas de receptores de TOS que reciben la vacuna de la gripe y que sean seguidos de forma prospectiva, que permitan analizar este aspecto de la seguridad de las estrategias de mejora para obtener una mejor respuesta de la vacuna de la gripe en el receptor de TOS y que permitan obtener resultados concluyentes. 2 JUSTIFICACIÓN Justificación 53 Los receptores de trasplante de órgano sólido son un grupo de alto riesgo de infección gripal por su estado de inmunosupresión. Se han descrito complicaciones graves relacionadas con el desarrollo de gripe en estos pacientes, como neumonía viral y neumonía bacteriana primaria y secundaria, enfermedad pulmonar, rechazo del órgano trasplantado e incluso muerte, especialmente en los primeros tres meses desde el trasplante, en los que la probabilidad de infección y la gravedad de las complicaciones descritas se multiplican por cinco. La administración de la vacuna de la gripe es el método más eficaz para prevenir la infección en este grupo de riesgo y por tanto para minimizar las complicaciones mencionadas anteriormente. Sin embargo, aunque se ha descrito que la vacuna en el receptor de TOS es eficaz y consigue evitar la infección en la mayoría de los pacientes, la respuesta observada es menor comparada con la población inmunocompetente, existiendo un porcentaje variable de pacientes, entre el 15 y el 45% que no responde correctamente a la inmunización frente al virus influenza, y no alcanza los valores de seroprotección necesarios para evitar la infección. Por tanto sería necesario adoptar medidas para aumentar la eficacia vacunal en estos pacientes y dada nuestra experiencia previa en el estudio de la infección gripal en el receptor de TOS, y la gran cantidad de estudios al respecto disponibles en la literatura, planteamos que implementar distintas estrategias de mejora como la administración precoz de la vacuna en los primeros meses desde el trasplante, la utilización de una composición vacunal adyuvantada, o la administración de una segunda dosis, podrían mejorar la respuesta a la vacunación en estos pacientes. Sin embargo, en la práctica clínica existen reticencias acerca de que la vacunación gripal podría estar asociada a la hiperactivación del sistema inmune en estos pacientes, pueda propiciar una respuesta aloinmune cruzada, generando una respuesta frente al órgano trasplantado. Este proceso podría resultar en el rechazo del injerto mediado por un aumento de anticuerpos anti-HLA frente al donante, y que este efecto pudiera estar potenciado especialmente en los primeros meses tras el trasplante. Hasta el momento no hay muchos estudios que profundicen en este importante aspecto de la vacuna de la gripe y las recomendaciones de las guías clínicas al respecto están basadas en opiniones de expertos y el análisis de series de pacientes poco numerosas y no diseñadas, en la mayoría de los casos, para analizar este aspecto del efecto de la vacuna en el paciente trasplantado. Es esencial por tanto platear nuevos estudios para Justificación 54 evaluar la efectividad y la seguridad de las diferentes estrategias de mejora de la inmunización frente al virus influenza en el receptor de TOS, empleando una cohorte de pacientes lo suficientemente numerosa como para obtener conclusiones firmes. 3. HIPÓTESIS Hipótesis 57  La respuesta a la vacunación en los receptores de trasplante es menor a la observada en la población general.  La vacuna de la gripe en el receptor de TOS es eficaz desde el primer mes post trasplante, con una eficacia similar a la esperada a partir del sexto mes posttrasplante.  La vacuna de la gripe en el receptor de TOS no está relacionada con el aumento de anticuerpos anti-HLA.  La vacunación gripal no está relacionada con un aumento de rechazo en pacientes trasplantados.  La vacuna de la gripe en los primeros meses post trasplante no está relacionada con el aumento de la producción de anticuerpos anti-HLA.  El uso de adyuvante en la formulación de la vacuna de la gripe no está relacionado con un aumento de anticuerpos anti-HLA en el receptor de TOS.  La administración de una segunda dosis de vacuna no está relacionada con el aumento de anticuerpos anti-HLA. 4. OBJETIVOS 6. RESULTADOS Resultados 69 Resultados 70 Resultados 71 Resultados 72 Resultados 73 Resultados 74 Resultados 75 Resultados 83 Resultados 84 Resultados 85 Resultados 86 Resultados 87 Resultados 88 Resultados 89 Resultados 90 Resultados 91 Resultados 98 Resultados 99 Resultados 100 Resultados 101 Resultados 102 Resultados 103 Resultados 104 Resultados 105 Resultados 106 Resultados 107 Resultados 114 Resultados 115 Supplementary Table 1. Clinical parameters of patients developing DSA. Months from transplantation Organ HLA Subtype Time from baseline to anti-HLA determination Increase in MFI from baseline (%) Rejection Outcome 57 Combined Liver-Kidney Class I HLA I-A 01:01 5 Weeks -83.1 % No Favorable 14 Kidney Class II HLA II DRB1*01:03 10 Weeks -40.2 % No Favorable 52 Lung Class II HLA II DR52 1 Year 37.4 % No Favorable 49 Lung Class II HLA II DQ9, DQ2 1 Year 83.55% No Favorable 6 Kidney Class II HLA DQ7, DQ4 1 Year * Indetectable at baseline No Favorable 7. RESUMEN DE RESULTADOS Resumen de resultados 119 A continuación, se presenta un resumen de los resultados de los artículos incluidos en esta tesis doctoral. 6.1 Artículo 1. Título. Influenza vaccination during the first 6 months after solid organ transplantation is efficacious and safe. Introducción. La infección por influenza en los pacientes receptores de trasplante de órgano sólido (TOS) se ha asociado con altas tasas de morbilidad y mortalidad, especialmente en los primeros tres meses tras el trasplante (31, 99). La vacunación de la gripe se ha propuesto como una medida eficaz para la prevención de la infección en estos pacientes (60, 66, 67). Sin embargo, las recomendaciones de las guías clínicas establecen que la vacunación en el paciente trasplantado debe realizarse a partir del sexto mes post-trasplante y nunca antes del tercer mes, para evitar las posibles complicaciones tras la vacunación que se pueden producir por las alta inestabilidad del sistema inmunológico de los pacientes en este periodo, en el que se teoriza la posibilidad de que la inmunización pueda generar eventos de rechazo en los pacientes (60, 142). Además se plantea que podría tener una baja eficacia, basado en pocos estudios en los que se demuestra que los pacientes vacunados en los primeros 6 meses desde el trasplante, tienen una menor respuesta que aquellos que se vacunan más tarde (135, 143). Dada la experiencia previa del grupo sobre la infección y vacunación frente al virus influenza en el receptor de trasplante de órgano sólido, en este estudio hipotetizamos que la vacuna de la gripe administrada en los primeros seis meses tras el trasplante es segura, y presenta una eficacia comparable a la de los pacientes vacunados más tardíamente. Resumen de resultados 120 Objetivo. El objetivo por tanto fue determinar la respuesta a la vacunación en los receptores de TOS vacunados en los primeros seis meses tras el trasplante y compararla con la respuesta de los pacientes vacunados a partir del sexto mes. Metodología. Diseñamos un estudio de cohortes multicéntrico, prospectivo, en el que incluimos receptores de trasplante de órgano sólido que recibieron la vacunación gripal a partir del primer mes post-trasplante. La inclusión de pacientes se realizó durante cuatro temporadas gripales consecutivas, entre el año 2009 y 2013. Se incluyeron receptores de TOS, mayores de 15 años, que recibieron una dosis de la vacuna frente a la gripe entre Noviembre de 2009 y Enero de 2013, en 12 hospitales españoles pertenecientes a la Red Española de Investigación en Patologías Infecciosas (REIPI). Los pacientes fueron excluidos en caso de presentar alergia al huevo o algún componente de la vacuna antigripal, si fueron vacunados durante el primer mes post-trasplante o en caso de embarazo. Se recogieron muestras de suero en el momento de la vacunación (basal), y cinco semanas después para la determinación de anticuerpos neutralizantes, que se realizó mediante ensayos de microneutralización (104). Al final del estudio, incluimos 798 receptores de trasplante hepático, renal, cardíaco, pulmonar o combinado hepáticorenal, 130 de los cuales habían recibido la vacuna de la gripe en los primeros seis meses desde el trasplante. Resultados y discusión. Los resultados de este trabajo muestran que la vacunación frente a influenza en los receptores de TOS vacunados en los primeros seis meses desde el trasplante es segura y eficaz, observándose una respuesta e incidencia de eventos adversos similar a la de los pacientes vacunados a partir del sexto mes post-trasplante. La respuesta la vacunación en los receptores de TOS es variable, con rangos de seroprotección post-vacunal variables, entre el 15 y el 90% (99, 103, 104), y se ha descrito que diversos factores cómo el tipo de trasplante o el uso de medicación inmunosupresora como micofenolato o mTOR, están relacionados con una menor Resumen de resultados 121 respuesta a la vacunación (99, 105, 143). Sin embargo, no hay evidencias concluyentes de cómo afecta el estado inmunológico del receptor de TOS en los primeros meses desde el trasplante en la respuesta a la vacuna de la gripe y si está aumentando el riesgo de rechazo. Las recomendaciones actuales de no inmunizar a los receptores de TOS frente a la gripe, están basadas en opiniones de expertos y en el análisis de series de pacientes pequeñas y con pocos pacientes vacunados en los primeros seis meses desde el trasplante. En este estudio, analizamos la mayor cohorte diseñada hasta la fecha para determinar la respuesta humoral tras la vacunación en los receptores de TOS, con 798 pacientes receptores de trasplante hepático, renal, cardíaco, pulmonar o combinado, 130 de los cuales habían recibido la vacuna antigripal entre el primer y el sexto mes posttrasplante. El análisis de los resultados revela que la vacunación en los seis primeros meses desde el trasplante no está asociada con una peor respuesta humoral en estos pacientes, ni siquiera en aquellos que fueron vacunados en los tres primeros meses desde el trasplante, ya que no observamos diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de pacientes seroprotegidos, 73,1% vs. 76,5% para A(H1N1)pdm (p= 0,49), 67,5% vs. 74,1% para A/H3N2 (p= 0,17) and 84,2% vs. 85,2% para influenza B (p= 0,80), respectivamente, ni en el título de anticuerpos en el suero, después de la vacunación 117.32 (intervalo de confianza (IC) al 95%, 81.52 - 168.83) vs. 87.43 (95% IC, 72,87 - 104,91) para A(H1N1)pdm, 120,45 (95% IC 82,17- 176,57) vs. 97,86 (95% CI 81,34 - 117,44) para A/H3N2 y 143.32 (95% CI 103.46 - 198.53) vs. 145.54 (95% CI 122.35- 174.24) para influenza B respectivamente. Incuso observamos, al estratificar el grupo de pacientes con vacunación temprana, que los pacientes que recibieron la vacuna en los tres primeros meses post-trasplante, presentaban mayores títulos prevacunales frente a influenza, posiblemente por la proximidad con el estado inmunocompetente y menor tiempo de exposición a la medicación inmunosupresora. Este grupo de pacientes desarrolló una mejor respuesta vacunal que los que recibieron la vacuna entre el cuarto y el sexto mes post-trasplante. Este hecho no había sido descrito anteriormente, y pone de manifiesto una buena capacidad de respuesta inmunológica a la vacuna de la gripe de los receptores de TOS en los primeros seis meses desde el trasplante. Resumen de resultados 122 Los análisis multivariantes realizados, en los que se tuvieron en cuenta, tanto las variables con relación estadísticamente significativa en el bivariante, y aquellas con significado clínico para nuestro estudio, como el tipo de trasplante, la medicación inmunosupresora recibida, las comorbilidades de los pacientes, la vacunación previa y otros datos demográficos, revelaron para las tres cepas de estudio, que el único factor asociado con una mejor respuesta a la vacunación es la presencia de títulos de anticuerpos detectables en el suero de los pacientes en el momento de la vacunación. Observamos que los pacientes con títulos detectables, desarrollaron una mejor respuesta post-vacunal, tanto en mayores niveles de anticuerpos como en el porcentaje de pacientes seroprotegidos tras la vacunación y que el tiempo transcurrido desde el trasplante a la vacunación no se relacionaba con la respuesta cuando se ajustaba por otros posibles factores de confusión. Durante el seguimiento de los pacientes, no se detectaron efectos adversos ni eventos de rechazo del injerto relacionados con la administración de la vacuna de la gripe en función del tiempo de administración. En resumen y como conclusión final, a la vista de los resultados obtenidos, podemos afirmar que la vacuna de la gripe en los primeros seis meses desde el trasplante, es tan segura y efectiva como a partir del sexto mes. Por tanto, pensamos que la inmunización frente a influenza en los receptores de TOS debería estar recomendada desde el primer mes post-trasplante. Además, se recomienda la vacunación frente a la gripe estacional anual previa al trasplante en pacientes con enfermedad de órgano terminal con el fin de promover una mejor protección inmunológica temprana después del trasplante. . Resumen de resultados 123 6.2 Artículo 2. Título. Influenza vaccination does not induce donor-specific anti-HLA antibodies or rejection in solid organ transplant recipients. Introducción. Los receptores de trasplante de órgano sólido (TOS), debido a su estado de inmunosupresión permanente, son un grupo de riesgo del desarrollo de complicaciones y mortalidad debidas a la infección por el virus de la gripe (58). La vacunación anual frente a influenza se ha propuesto como el método más eficaz para prevenir la infección y por tanto minimizar estas complicaciones (43, 44, 62, 144, 145). La mayoría de los estudios realizados para evaluar la eficacia de la vacunación en este grupo de pacientes han reflejado una respuesta humoral óptima en el receptor de TOS tras la vacunación (103, 109, 126, 146, 147), aunque inferior a la descrita en la población inmunocompetente (99), con un porcentaje variable de pacientes, entre el 1 y el 47% que no responde a la vacunación (58, 99, 129). En base a estos resultados se han propuesto diferentes estrategias para aumentar la efectividad de la vacunación en este grupo como la utilización de una vacuna adyuvantada, la administración de la vacuna en los primeros meses desde el trasplante o la administración de una segunda dosis de vacuna. Aunque la vacunación antigripal ha demostrado aportar efectos beneficiosos en la protección frente a la infección en estos pacientes receptores de TOS, algunos autores se mantienen reticentes a la vacunación, debido al riesgo hipotético de que la vacunación pudiera producir una hiperactivación del sistema inmune generando una respuesta aloinmune, incrementando la producción de anticuerpos anti-HLA frente al órgano trasplantado y desencadenando el rechazo (43, 124, 148, 149). La escasa información disponible en la literatura sobre este aspecto de la seguridad de la vacunación gripal en el paciente trasplantado, está basada en opiniones de expertos y análisis de cohortes pequeñas. Discusión 131 La infección por influenza es una causa principal de morbilidad y mortalidad en el receptor de TOS. Se han descrito complicaciones graves tras la infección en estos pacientes, como neumonía viral y bacteriana primaria y secundaria, enfermedad pulmonar, rechazo del órgano trasplantado e incluso la muerte (99). En las guías de práctica clínica se propone la vacuna de la gripe como la medida más eficaz para prevenir la infección en estos pacientes. Aunque la vacunación en el receptor de TOS protege al paciente de las complicaciones de la gripe (99, 104) su eficacia es variable, con una proporción de receptores de TOS seroprotegidos tras la vacunación entre el 15% y el 90%, (13, 26, 31, 67, 112, 143) , valores en todo caso inferiores a los alcanzados por los individuos inmunocompetentes. Por ello, es fundamental adoptar medidas para mejorar la eficacia vacunal en la población trasplantada especialmente vulnerable a la infección por el virus de la gripe. Se han propuesto distintas medidas para aumentar la efectividad de la vacuna frente a la infección por influenza en el receptor de TOS, como la vacunación temprana tras el trasplante, acortando el tiempo desde el trasplante a la vacunación, la administración de una vacuna adyuvantada o el aumento del número de dosis para conseguir un efecto "booster". Aunque se ha sugerido que la vacunación durante los primeros seis meses del trasplante puede afectar a la seguridad de la vacuna, no existen evidencias experimentales de que la vacunación en este periodo no sea segura, y actualmente las recomendaciones están basadas en opiniones de expertos que se fundamentan en resultados obtenidos en series pequeñas de pacientes (60, 135, 143, 154). También se ha planteado la hipótesis de que una estimulación excesiva del sistema inmune en estos pacientes, sometidos a medicación inmunosupresora, pueda generar una respuesta aloinmune inespecífica mediada por anticuerpos anti-HLA que resulte en el rechazo del órgano trasplantado, especialmente en los primeros meses tras el trasplante. Este hecho podría además magnificarse al adicionar un compuesto adyuvante a la vacuna o el aumentar el número de dosis administradas (121, 155, 156). Hasta la fecha, existen pocos estudios que hayan evaluado estos importantes aspectos de la seguridad de la vacunación gripal en relación con el tiempo de administración y su relación con el rechazo de órgano en estos pacientes. Los resultados al respecto en los Discusión 132 que se basan las recomendaciones de las guías de práctica clínica actuales son en muchos casos discordantes o provienen del análisis de series cortas de pacientes, no diseñadas específicamente para evaluar estos aspectos. En este trabajo analizamos una serie de pacientes receptores de TOS con un tamaño muestral elevado, la mayor publicada hasta la fecha, con carácter prospectivo, lo cual ha permitido obtener resultados concluyentes acerca de la eficacia y la seguridad de la vacunación gripal en estos pacientes, teniendo en cuenta las estrategias de mejora mencionadas. Discutimos a continuación los resultados obtenidos al respecto. 8.1 Vacunación gripal en pacientes receptores de TOS. La vacunación estacional frente al virus de la gripe es el método más eficaz para evitar las complicaciones derivadas de la infección por el virus y en las guías clínicas se recomienda la administración de la vacuna antigripal anualmente a los receptores de TOS a partir de los tres-seis meses del trasplante (60). En un estudio publicado por Horst et al. se analizó la evolución clínica durante un año tras la vacunación gripal en 9.678 pacientes receptores de riñón, inmunizados entre seis meses y un año después del trasplante. La vacunación se asoció con un menor riesgo de infección por influenza, rechazo del injerto y complicaciones graves o muerte, al compararlos con 42.052 receptores de TOS que no recibieron la vacuna de la gripe (125). Sin embargo, la vacuna de la gripe ha demostrado una eficacia variable en pacientes con TOS que oscila entre el 15 y el 90% (58, 99, 103, 105-112, 126), en función de la clínica del paciente, la composición de la vacuna y la estrategia de vacunación, con ratios de seroprotección de entre un 40% y un 80% para los pacientes con trasplante renal, por encima del 80% en los receptores hepáticos y hasta el 46% en los pacientes que reciben un trasplante pulmonar. En distintos estudios multicéntricos coordinados por nuestro grupo, en los que se midieron el título de anticuerpos neutralizantes tras recibir una dosis de la vacuna pandémica en 2009-2010 o la vacuna estacional en 2010- 2011, observamos una eficacia dentro de los mínimos exigidos internacionalmente (100), aunque inferior a la descrita para la población inmunocompetente, con tasas de seroconversión de entre el 73,1 y el 82,9% y seroprotección entre el 73 y el 90% (99, 104). En estas cohortes en el 1.1% de pacientes que recibieron la vacuna de la gripe Discusión 133 A(H1N1)pdm en la temporada 2009-2010 y en el 3.1% de aquellos vacunados en la temporada 2010-2011, fracasó a la vacunación ya que desarrollaron gripe confirmada microbiológicamente tras la vacunación. Sin embargo, a pesar de que los pacientes vacunados desarrollaron infección gripal, la vacuna de la gripe redujo en un 70% el riesgo de desarrollar neumonía (58). En esta tesis analizamos la respuesta humoral frente a influenza A(H1N1)pdm, influenza A/H3N2 e influenza B, tras la vacunación en una cohorte de 798 receptores de trasplante de órgano sólido, durante 4 temporada gripales consecutivas. Nuestros resultados muestran que aunque la respuesta a la vacunación de seroprotección y seroconversión está por encima del 70% de para las tres cepas estudiadas, esta respuesta es menor a la observada en la población inmunocompetente, que sería la deseable de alcanzar en nuestros pacientes por tener mayor riesgo de complicaciones tras la infección. 8.2 Factores relacionados con la respuesta a la vacuna de la gripe. 8.2.1 Relación de las comorbilidades y la respuesta a la vacunación en el receptor de TOS. Aunque algunos estudios han mostrado que los receptores de TOS que han recibido la vacuna de la gripe que presentan otras patologías o comorbilidades en el momento de la vacunación desarrollan una peor respuesta de anticuerpos frente a la vacuna, entre ellos los pacientes con diabetes mellitus o aquellos con enfermedad hepática crónica (135, 147), nuestros resultados muestran una respuesta similar a la vacunación independientemente de las comorbilidades del paciente en el momento de la administración de la misma. De hecho en el análisis multivariante de los posibles factores confusores que puedan afectar a la respuesta humoral tras la vacunación no observamos relación entre las comorbilidades estudiadas: diabetes mellitus, hepatopatía, nefropatía y cardiopatía. Discusión 134 8.2.2. Relación entre la inmunosupresión y la respuesta a la vacunación en el receptor de TOS. Otro de los factores que se ha relacionado con una peor respuesta a la vacunación gripal es la medicación inmunosupresora que es administrada al paciente tras el trasplante Recientemente, un metanálisis empleando datos de 947 receptores de TOS, obtenidos de 15 ensayos clínicos, mostró menores ratios de seroprotección frente al virus influenza en los pacientes que recibieron micofenolato mofetilo como medicación inmunosupresora, y no se describían diferencias en los que recibieron tacrólimus, sirólimus, ciclosporina o azatioprina (157). En un estudio previo realizado en nuestro grupo, en el que analizamos una cohorte de 346 pacientes que recibieron una dosis de la gripe pandémica adyuvantada, encontramos que aquellos pacientes que habían recibido inhibidores del mTOR como medicación inmunosupresora, desarrollaban una respuesta humoral frente a influenza A(H1N1)pdm inferior que los pacientes que recibieron una inmunosupresor distinto (OR 0.90, IC95% 0,8 - 1,1) como micofenolato, ciclosporina o tacrólimus (99). Sin embargo en el presente estudio, con una cohorte de pacientes mucho mayor, de 798 receptores de TOS, vacunados en cuatro temporadas gripales consecutivas, entre 2009 y 2013, no observamos diferencias estadísticamente significativas en relación a la medicación inmunosupresora y el porcentaje de seroprotección frente a A(H1N1)pdm, A/H3N2 o influenza B. Este resultado aunque puede resultar contradictorio a lo observado anteriormente, podría justificarse por el hecho de que la mayoría de los pacientes que recibieron m-TOR tenían títulos de anticuerpos en el momento de la vacunación, y como también hemos demostrado previamente la respuesta vacunal es mejor en pacientes con títulos prevacunales (104). 8.2.3. Relación entre el tipo de órgano trasplantado y la respuesta a la vacunación en el receptor de TOS. Como se ha comentado anteriormente la incidencia y complicaciones por la infección gripal varía en función del tipo de órgano. Algunos trabajos proponen que la eficacia de la vacunación en los pacientes con TOS puede variar también en función del tipo de injerto. A modo de ejemplo, se ha descrito una menor respuesta a la vacunación gripal en los pacientes con trasplante pulmonar que puede variar en un rango 8-46%, mientras Discusión 135 que los pacientes con trasplante renal o hepático la eficacia de la vacunación puede alcanzar entre el 80 y el 90% (44, 59, 61, 126, 158). Esta diferencia en la respuesta podría estar influida por el diferente estado neto de inmunosupresión en función del tipo de trasplante y/o por las comorbilidades asociadas a los distintos tipos de trasplante, como son la insuficiencia renal o hepática, la cardiopatía o enfermedad pulmonar. En el presente trabajo, en la cohorte de 798 pacientes con trasplante renal, hepático, cardíaco y/o pulmonar incluidos durante cuatro temporadas gripales consecutivas, observamos una menor respuesta de anticuerpos neutralizantes frente a influenza A(H1N1)pdm y H3N2 en los receptores de trasplante renal, y frente a influenza B en los trasplantados cardíacos, con respecto a los observados en los receptores de trasplante hepático. Sin embargo, en todos los casos, más del 80% de los pacientes estaban seroprotegidos tras la vacunación. 8.2.4. Vacunación en los primeros meses tras el trasplante. Durante los primeros meses tras el trasplante, los receptores de TOS tienen cinco veces más riesgo de desarrollar complicaciones graves derivadas de la infección por influenza (31). Sin embargo, las guías actuales de práctica clínica recomiendan la administración de la vacuna de la gripe a partir de los primeros tres a seis meses desde el trasplante (143). Como se ha comentado con anterioridad, el nivel de evidencias de estas recomendaciones es bajo. Sin embargo el beneficio de la vacunación aunque sea pequeño, siempre que sea segura y no se asocie a un aumento de riesgo de rechazo para el paciente, dadas las complicaciones derivadas de una posible infección por influenza hace que debiera recomendarse la vacunación precoz tras el trasplante. Estudios previos de nuestro grupo observaron en una cohorte de 346 pacientes, de los cuales 58 habían sido vacunados en los primeros seis meses del trasplante, que la respuesta a la vacuna no se asociaba con el tiempo transcurrido desde el trasplante (99). En este trabajo hemos ampliado el número de pacientes incluidos en los que hemos estudiado la eficacia y seguridad tras la vacunación en una cohorte de 798 receptores de TOS de los cuales 130 pacientes habían sido vacunados en los primeros seis meses posttrasplante respecto a los 668 vacunados más de seis meses tras el trasplante, siendo la Discusión 136 mayor serie de pacientes publicada hasta la fecha. Nuestros datos demuestran que la vacunación es segura y no encontramos diferencias estadísticamente significativas en la respuesta de anticuerpos neutralizantes entre ambos grupos de pacientes para ninguna de las cepas de influenza analizadas. Al estratificar el grupo de pacientes que recibió la vacuna en los primeros seis meses post-trasplante en < tres meses, cuatro meses, cinco meses y seis meses tampoco observamos diferencias en la respuesta inmune entre los grupos analizados. Los resultados obtenidos fueron similares, e incluso en los pacientes que recibieron la vacuna en los tres primeros meses tras el trasplante observamos la respuesta de anticuerpos neutralizantes tendió a ser mayor y con mayores tasas de seroprotección tras la vacunación. La justificación de esta observación probablemente esté en relación con la presencia de títulos basales previos a la vacunación, que si bien no son protectores si promueven una mejor respuesta a la vacunación (104). En esta tesis, confirmamos este aspecto ya que al analizar 798 pacientes vacunados la presencia de títulos previos a la vacunación, fue el único factor asociado significativamente a una mejor respuesta de anticuerpos neutralizantes frente a las tres cepas de influenza analizadas. En la cohorte estudiada tan sólo un paciente, receptor de trasplante renal, vacunado 118 meses tras el trasplante tuvo un episodio de rechazo tras la vacunación. Sin embargo, este paciente tuvo otras posibles causas que podrían explicar el rechazo ya que tenía niveles bajos de inmunosupresores por interacción con rifampicina, que le fue administrada para tratar un episodio de tuberculosis, por lo que sugiere que el rechazo crónico detectado durante el seguimiento no estuvo relacionado con la administración de la vacunación gripal. Por este motivo consideramos importante vacunar a todos los pacientes con enfermedad de órgano terminal que esté en la lista de espera para el trasplante para promover la presencia de títulos de anticuerpos en el post-trasplante. Otros estudios han demostrado que aunque el mantenimiento de la respuesta inmune humoral frente a influenza es inferior a la desarrollada en los pacientes Discusión 137 inmunocompetentes, la presencia de anticuerpos neutralizantes en el suero, previos a la vacunación, mejora la respuesta a inmune humoral (26, 104). Una forma de promover la presencia de títulos de anticuerpos previos a la vacunación que puedan promover una respuesta “booster” es la administración de una segunda dosis de vacunación gripal para los receptores de TOS, que pueda emular el efecto sumatorio en la respuesta que hemos observado en los pacientes que mantenían títulos de anticuerpos basales. 8.3 Vacunación de la gripe y rechazo. En la población general, la vacuna de la gripe es segura y reduce la incidencia de efectos adversos graves(159). En el receptor de TOS, se ha planteado la posibilidad teórica de que la vacunación de la gripe pueda desencadenar un rechazo del injerto (40, 125, 160). Este aspecto se ha analizado en diversos estudios en los que se incluyeron receptores de trasplante tras recibir la vacuna de la gripe. La mayoría de ellos no muestran relación entre la vacunación gripal y el desarrollo de una respuesta de rechazo del injerto en receptores de trasplante renal (105, 107, 145), o cardíaco (124, 161, 162). Sin embargo, David et al., en una serie de 130 receptores de trasplante hepático, observaron el desarrollo de rechazo agudo un mes después de la administración de la vacuna de la gripe aunque sólo en dos de los pacientes (160). Una producción de novo de anticuerpos anti-HLA DSA podría explicar esta hipótesis, (121, 148). Sin embargo, se ha postulado que la adición de un adyuvante a la composición vacunal, que aumenta la inmunogenicidad de la misma, pueda simultáneamente incrementar el riesgo de rechazo del injerto al promover el aumento de anticuerpos anti-HLA, como en el caso del estudio realizado por Katerinis et al., en el que un 17,3% de receptores renales vacunados seis semanas tras el trasplante y un 11,9% de los vacunados seis meses tras el trasplante, aumentaron sus niveles de anticuerpos anti-HLA tras recibir la vacuna adyuvantada (121). En esta tesis se han analizado en una cohorte prospectiva de receptores de TOS la presencia de rechazo y la producción de novo de anticuerpos anti-HLA tras la Discusión 138 vacunación gripal, en 490 receptores de trasplante hepático, renal, cardíaco y pulmonar, centrándonos en la influencia de las distintas estrategias mencionadas para mejorar la respuesta inmune con el rechazo del injerto. A continuación se discuten cada una de estas estrategias. 8.4 Relación de la vacunación gripal durante los primeros seis meses del trasplante con el rechazo y la producción de anticuerpos anti-HLA de novo. La seguridad de la vacunación de la gripe en los primeros meses del trasplante es un aspecto fundamental para establecer la indicación de la misma. En la presente tesis demostramos que la vacunación de la gripe es segura a partir del primer mes posttrasplante. Como se ha comentado anteriormente el tiempo tras el trasplante a partir del cual administrar la vacuna antigripal es un aspecto no consensuado en la literatura. La recomendación actual propone vacunar a la población con TOS tras tres a seis meses del trasplante (31) Los datos de la presente tesis confirman que el tiempo transcurrido desde el trasplante no se relaciona con la aparición de rechazo en los pacientes. Además, el tiempo desde el trasplante no se relacionó con la producción de novo de anticuerpos anti-HLA DSA o no DSA. Es por ello, que dada la respuesta inmunológica, la falta de efectos adversos y la alta tasa de complicaciones producidas como consecuencia de la infección por influenza en los primeros seis meses tras el trasplante, consideramos que la administración de la vacuna antigripal debe ser recomendada a partir primer mes post-trasplante. 8.5 Adición de un adyuvante a la composición vacunal. Para producir una respuesta inmunológica rápida y eficaz frente a la gripe pandémica, que se extendió rápidamente y con gran virulencia en varios países en el último trimestre de 2009, se llevó a cabo una formulación de la vacuna pandémica en la que se incorporó un adyuvante a su composición. El efecto del adyuvante es promover un aumento inespecífico de la respuesta inmune, que puede tener efectos positivos en la Discusión 139 respuesta alcanzada por los pacientes (131). El mecanismo exacto por el que determinados compuestos alumínicos como el MF59 y ASO3 causan este efecto activador no se conoce, pero se ha comprobado que atrae de forma inespecífica a células del sistema inmune hacia el lugar de la inyección (131, 151). Aunque no hay resultados concluyentes de que la vacunación antigripal mediante la formulación adyuvantada mejore significativamente la respuesta en comparación con la vacuna no adyuvantada en la población trasplantada en general, hay estudios que muestran una mejor respuesta en determinados grupos de edad (151). En un estudio previo realizado por nuestro grupo, analizamos la respuesta a la vacunación gripal en una cohorte de 346 receptores de TOS que recibieron una dosis de la vacuna antigripal pandémica adyuvantada en 2009, observamos una respuesta adecuada a la vacunación en todos los grupos de edad, y una mejor respuesta en aquello pacientes con títulos detectables de anticuerpos neutralizantes en el momento de la vacunación (99). Sin embargo, algunos estudios sugieren que la vacuna adyuvantada podría desencadenar una respuesta de rechazo del injerto mediada por la producción de anticuerpos anti-HLA donante específicos, debido probablemente a la activación inespecífica del sistema inmune que provoca el adyuvante (121). Posteriormente, en un ensayo clínico reciente publicado por Kumar et al., con un ensayo clínico en el que compara la respuesta de los pacientes que reciben la fórmula adyuvantada y la no adyuvantada, no encontraron relación entre la vacunación adyuvantada y el rechazo del injerto (151). Aunque en este estudio únicamente se analiza la seguridad de la vacunación en pacientes receptores de trasplante renal. Los datos de la presente tesis muestran que no hay diferencias en la producción de anticuerpos anti-HLA entre los receptores de TOS que recibieron la vacuna adyuvantada y los que recibieron la vacuna no adyuvantada. Y aunque uno de los 110 pacientes que recibieron una dosis de vacuna adyuvantada desarrolló anti-HLA DSA, no tuvo ningún evento de rechazo durante el seguimiento, por lo que no encontramos relación entre la composición de la vacuna y el desarrollo de eventos de rechazo del injerto en los receptores de TOS. Conclusiones 146 12. La adición de un compuesto adyuvante a la composición vacunal, no está relacionada con el aumento de anticuerpos anti-HLA en el receptor de TOS. 13. La administración de una segunda dosis de vacuna en el receptor de TOS aumenta la producción de anticuerpos anti-HLA clase I aunque no se relacionan con el rechazo del injerto. 14. La administración de una segunda dosis de vacuna de la gripe en el receptor de TOS no está relacionada con el aumento de anticuerpos anti-HLA clase II y con el rechazo del injerto. 147 10. BIBLIOGRAFÍA 148 Bibliografía 149 1. Aras S, Aiyar A, Amedee AM, Gallaher WR. Molecular character of influenza A/H1N1 2009: Implications for spread and control. Indian journal of microbiology 2009;49(4):339-347. 2. Webster RG, Bean WJ, Gorman OT, Chambers TM, Kawaoka Y. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiological reviews 1992;56(1):152-179. 3. Wilson IA, Cox NJ. Structural basis of immune recognition of influenza virus hemagglutinin. Annual review of immunology 1990;8:737-771. 4. Neumann G, Noda T, Kawaoka Y. Emergence and pandemic potential of swineorigin H1N1 influenza virus. Nature 2009;459(7249):931-939. 5. Shepherd J, Jones J, Takeda A, Davidson P, Price A. Adefovir dipivoxil and pegylated interferon alfa-2a for the treatment of chronic hepatitis B: a systematic review and economic evaluation. Health Technol Assess 2006;10(28):iii-iv, xi-xiv, 1-183. 6. Webster RG, Laver WG. Determination of the number of nonoverlapping antigenic areas on Hong Kong (H3N2) influenza virus hemagglutinin with monoclonal antibodies and the selection of variants with potential epidemiological significance. Virology 1980;104(1):139-148. 7. Watts G. A/H1N1 influenza virus: the basics. BMJ 2009;339:b3046. 8. Zimmer SM, Burke DS. Historical perspective--Emergence of influenza A (H1N1) viruses. The New England journal of medicine 2009;361(3):279-285. 9. Waffarn EE, Baumgarth N. Protective B cell responses to flu--no fluke! J Immunol 2011;186(7):3823-3829. 10. Vincent AL, Ma W, Lager KM, Janke BH, Richt JA. Swine influenza viruses a North American perspective. Advances in virus research 2008;72:127-154. 11. Braciale TJ, Sun J, Kim TS. Regulating the adaptive immune response to respiratory virus infection. Nature reviews Immunology 2012;12(4):295-305. 12. Achdout H, Meningher T, Hirsh S, Glasner A, Bar-On Y, Gur C et al. Killing of avian and Swine influenza virus by natural killer cells. Journal of virology 2010;84(8):3993-4001. 13. Yewdell JW, Schubert U, Bennink JR. At the crossroads of cell biology and immunology: DRiPs and other sources of peptide ligands for MHC class I molecules. Journal of cell science 2001;114(Pt 5):845-851. Bibliografía 150 14. Pamer E, Cresswell P. Mechanisms of MHC class I--restricted antigen processing. Annual review of immunology 1998;16:323-358. 15. Leone P, Shin EC, Perosa F, Vacca A, Dammacco F, Racanelli V. MHC class I antigen processing and presenting machinery: organization, function, and defects in tumor cells. Journal of the National Cancer Institute 2013;105(16):1172-1187. 16. Germain RN, Margulies DH. The biochemistry and cell biology of antigen processing and presentation. Annual review of immunology 1993;11:403-450. 17. Valkenburg SA, Rutigliano JA, Ellebedy AH, Doherty PC, Thomas PG, Kedzierska K. Immunity to seasonal and pandemic influenza A viruses. Microbes and infection / Institut Pasteur 2011;13(5):489-501. 18. Kreijtz JH, Fouchier RA, Rimmelzwaan GF. Immune responses to influenza virus infection. Virus research 2011;162(1-2):19-30. 19. Wu C, Zanker D, Valkenburg S, Tan B, Kedzierska K, Zou QM et al. Systematic identification of immunodominant CD8+ T-cell responses to influenza A virus in HLA-A2 individuals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2011;108(22):9178-9183. 20. Shaw ML, Stone KL, Colangelo CM, Gulcicek EE, Palese P. Cellular proteins in influenza virus particles. PLoS pathogens 2008;4(6):e1000085. 21. Wilkinson TM, Li CK, Chui CS, Huang AK, Perkins M, Liebner JC et al. Preexisting influenza-specific CD4+ T cells correlate with disease protection against influenza challenge in humans. Nature medicine 2012;18(2):274-280. 22. Sridhar S, Begom S, Bermingham A, Hoschler K, Adamson W, Carman W et al. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza. Nature medicine 2013;19(10):1305-1312. 23. Webster RG, Laver WG. Preparation and properties of antibody directed specifically against the neuraminidase of influenza virus. J Immunol 1967;99(1):49-55. 24. Nimmerjahn F, Ravetch JV. Antibody-mediated modulation of immune responses. Immunological reviews 2010;236:265-275. 25. DiLillo DJ, Tan GS, Palese P, Ravetch JV. Broadly neutralizing hemagglutinin stalkspecific antibodies require FcgammaR interactions for protection against influenza virus in vivo. Nature medicine 2014;20(2):143-151. Bibliografía 151 26. Lofano G, Kumar A, Finco O, Del Giudice G, Bertholet S. B Cells and Functional Antibody Responses to Combat Influenza. Frontiers in immunology 2015;6:336. 27. Jegerlehner A, Schmitz N, Storni T, Bachmann MF. Influenza A vaccine based on the extracellular domain of M2: weak protection mediated via antibody-dependent NK cell activity. J Immunol 2004;172(9):5598-5605. 28. Stanekova Z, Vareckova E. Conserved epitopes of influenza A virus inducing protective immunity and their prospects for universal vaccine development. Virology journal 2010;7:351. 29. Han T, Marasco WA. Structural basis of influenza virus neutralization. Annals of the New York Academy of Sciences 2011;1217:178-190. 30. Eccles R. Understanding the symptoms of the common cold and influenza. The Lancet Infectious diseases 2005;5(11):718-725. 31. Cordero E, Perez-Romero P, Moreno A, Len O, Montejo M, Vidal E et al. Pandemic influenza A(H1N1) virus infection in solid organ transplant recipients: impact of viral and non-viral co-infection. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 2012;18(1):67-73. 32. Review of the 2015 influenza season in the southern hemisphere. Releve epidemiologique hebdomadaire / Section d'hygiene du Secretariat de la Societe des Nations = Weekly epidemiological record / Health Section of the Secretariat of the League of Nations 2015;90(48):645-660. 33. Schaffer FL, Soergel ME, Straube DC. Survival of airborne influenza virus: effects of propagating host, relative humidity, and composition of spray fluids. Archives of virology 1976;51(4):263-273. 34. Lowen AC, Mubareka S, Steel J, Palese P. Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature. PLoS pathogens 2007;3(10):1470-1476. 35. Monto AS, Kioumehr F. The Tecumseh Study of Respiratory Illness. IX. Occurence of influenza in the community, 1966--1971. American journal of epidemiology 1975;102(6):553-563. 36. Jost S, Quillay H, Reardon J, Peterson E, Simmons RP, Parry BA et al. Changes in cytokine levels and NK cell activation associated with influenza. PloS one 2011;6(9):e25060. Bibliografía 152 37. III SdVdlGeESIdSC. Desde la Semana 40/2015 hasta la semana 20/2016.http://www.isciii.es/ISCIII/es/contenidos/fd-servicios-cientificotecnicos/fdvigilancias-alertas/fd-enfermedades/gripe.shtml. 2016. 38. Schepetiuk S, Papanaoum K, Qiao M. Spread of influenza A virus infection in hospitalised patients with cancer. Australian and New Zealand journal of medicine 1998;28(4):475-476. 39. Billings JL, Hertz MI, Savik K, Wendt CH. Respiratory viruses and chronic rejection in lung transplant recipients. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation 2002;21(5):559-566. 40. Briggs JD, Timbury MC, Paton AM, Bell PR. Viral infection and renal transplant rejection. British medical journal 1972;4(5839):520-522. 41. Garantziotis S, Howell DN, McAdams HP, Davis RD, Henshaw NG, Palmer SM. Influenza pneumonia in lung transplant recipients: clinical features and association with bronchiolitis obliterans syndrome. Chest 2001;119(4):1277-1280. 42. Keane WR, Helderman JH, Luby J, Gailiunas P, Hull AR, Kokko JP. Epidemic renal transplant rejection associated with influenza A victoria. Proceedings of the Clinical Dialysis and Transplant Forum 1978;8:232-236. 43. Vilchez RA, McCurry K, Dauber J, Lacono A, Griffith B, Fung J et al. Influenza virus infection in adult solid organ transplant recipients. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons 2002;2(3):287-291. 44. Kumar D, Michaels MG, Morris MI, Green M, Avery RK, Liu C et al. Outcomes from pandemic influenza A H1N1 infection in recipients of solid-organ transplants: a multicentre cohort study. The Lancet Infectious diseases 2010;10(8):521-526. 45. Kusne S, Dummer JS, Singh N, Iwatsuki S, Makowka L, Esquivel C et al. Infections after liver transplantation. An analysis of 101 consecutive cases. Medicine 1988;67(2):132-143. 46. Wendt CH. Community respiratory viruses: organ transplant recipients. The American journal of medicine 1997;102(3A):31-36; discussion 42-33. Bibliografía 153 47. Kaiser L, Fritz RS, Straus SE, Gubareva L, Hayden FG. Symptom pathogenesis during acute influenza: interleukin-6 and other cytokine responses. Journal of medical virology 2001;64(3):262-268. 48. Smud A, Nagel CB, Madsen E, Rial Mdel C, Barcan LA, Gomez AA et al. Pandemic influenza A/H1N1 virus infection in solid organ transplant recipients: a multicenter study. Transplantation 2010;90(12):1458-1462. 49. Low CY, Kee T, Chan KP, Oon LL, Tan CK, Tee NW et al. Pandemic (H1N1) 2009 infection in adult solid organ transplant recipients in Singapore. Transplantation 2010;90(9):1016-1021. 50. Ng BJ, Glanville AR, Snell G, Musk M, Holmes M, Chambers DC et al. The impact of pandemic influenza A H1N1 2009 on Australian lung transplant recipients. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons 2011;11(3):568- 574. 51. Mauch TJ, Bratton S, Myers T, Krane E, Gentry SR, Kashtan CE. Influenza B virus infection in pediatric solid organ transplant recipients. Pediatrics 1994;94(2 Pt 1):225-229. 52. Seville MT, Blair JE, Vikram HR, Kusne S. 2009 H1N1 influenza in hospitalized transplant recipients. Transplantation 2010;90(5):571-574. 53. Aschan J, Ringden O, Ljungman P, Andersson J, Lewensohn-Fuchs I, Forsgren M. Influenza B in transplant patients. Scandinavian journal of infectious diseases 1989;21(3):349-350. 54. Viasus D, Pano-Pardo JR, Pachon J, Riera M, Lopez-Medrano F, Payeras A et al. Pneumonia complicating pandemic (H1N1) 2009: risk factors, clinical features, and outcomes. Medicine 2011;90(5):328-336. 55. Jain S, Benoit SR, Skarbinski J, Bramley AM, Finelli L. Influenza-associated pneumonia among hospitalized patients with 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus--United States, 2009. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America 2012;54(9):1221-1229. 56. Metersky ML, Masterton RG, Lode H, File TM, Jr., Babinchak T. Epidemiology, microbiology, and treatment considerations for bacterial pneumonia complicating Bibliografía 154 influenza. International journal of infectious diseases : IJID : official publication of the International Society for Infectious Diseases 2012;16(5):e321-331. 57. Garcia-Vidal C, Barba P, Arnan M, Moreno A, Ruiz-Camps I, Gudiol C et al. Invasive aspergillosis complicating pandemic influenza A (H1N1) infection in severely immunocompromised patients. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America 2011;53(6):e16-19. 58. Perez-Romero P, Aydillo TA, Perez-Ordonez A, Munoz P, Moreno A, Lopez- Medrano F et al. Reduced incidence of pneumonia in influenza-vaccinated solid organ transplant recipients with influenza disease. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 2012;18(12):E533-540. 59. Helantera I, Anttila VJ, Lappalainen M, Lempinen M, Isoniemi H. Outbreak of Influenza A(H1N1) in a Kidney Transplant Unit-Protective Effect of Vaccination. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons 2015;15(9):2470- 2474. 60. Danzinger-Isakov L, Kumar D. Guidelines for vaccination of solid organ transplant candidates and recipients. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons 2009;9 Suppl 4:S258-262. 61. Kumar D, Husain S, Chen MH, Moussa G, Himsworth D, Manuel O et al. A prospective molecular surveillance study evaluating the clinical impact of community-acquired respiratory viruses in lung transplant recipients. Transplantation 2010;89(8):1028-1033. 62. Gottlieb J, Schulz TF, Welte T, Fuehner T, Dierich M, Simon AR et al. Communityacquired respiratory viral infections in lung transplant recipients: a single season cohort study. Transplantation 2009;87(10):1530-1537. 63. Martin ST, Torabi MJ, Gabardi S. Influenza in solid organ transplant recipients. The Annals of pharmacotherapy 2012;46(2):255-264. 64. Milstone AP, Brumble LM, Barnes J, Estes W, Loyd JE, Pierson RN, 3rd et al. A single-season prospective study of respiratory viral infections in lung transplant recipients. The European respiratory journal 2006;28(1):131-137. Bibliografía 155 65. Murphy BR, Kasel JA, Chanock RM. Association of serum anti-neuraminidase antibody with resistance to influenza in man. The New England journal of medicine 1972;286(25):1329-1332. 66. Kumar D, Morris MI, Kotton CN, Fischer SA, Michaels MG, Allen U et al. Guidance on novel influenza A/H1N1 in solid organ transplant recipients. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons 2010;10(1):18-25. 67. Lopez-Medrano F, Cordero E, Gavalda J, Cruzado JM, Marcos MA, Perez-Romero P et al. Management of influenza infection in solid-organ transplant recipients: consensus statement of the Group for the Study of Infection in Transplant Recipients (GESITRA) of the Spanish Society of Infectious Diseases and Clinical Microbiology (SEIMC) and the Spanish Network for Research in Infectious Diseases (REIPI). Enfermedades infecciosas y microbiologia clinica 2013;31(8):526 e521-526 e520. 68. Struijk GH, Lammers AJ, Brinkman RJ, Lombarts MJ, van Vugt M, van der Pant KA et al. Immunization after renal transplantation: current clinical practice. Transplant infectious disease : an official journal of the Transplantation Society 2015;17(2):192- 200. 69. Dong G, Peng C, Luo J, Wang C, Han L, Wu B et al. Adamantane-resistant influenza a viruses in the world (1902-2013): frequency and distribution of M2 gene mutations. PloS one 2015;10(3):e0119115. 70. Yen HL. Current and novel antiviral strategies for influenza infection. Current opinion in virology 2016;18:126-134. 71. Colman PM. Neuraminidase inhibitors as antivirals. Vaccine 2002;20 Suppl 2:S55- 58. 72. Spagnuolo PJ, Zhang M, Xu Y, Han J, Liu S, Liu J et al. Effects of antiviral treatment on influenza-related complications over four influenza seasons: 2006-2010. Current medical research and opinion 2016:1-9. 73. Heneghan CJ, Onakpoya I, Jones MA, Doshi P, Del Mar CB, Hama R et al. Neuraminidase inhibitors for influenza: a systematic review and meta-analysis of regulatory and mortality data. Health Technol Assess 2016;20(42):1-242. 74. Moscona A. Global transmission of oseltamivir-resistant influenza. The New England journal of medicine 2009;360(10):953-956.