Formación de biofilms por bacterias

FORMACIÓN DE BIOFILMS POR BACTERIAS TRABAJO DE FIN DE GRADO DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA GRADO DE BIOLOGÍA CRISTINA ANDREA ARAÚJO CUEVAS 1 ÍNDICE ➢ RESUMEN .................................................................................................................... 2 1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 2 2. ETAPAS DE FORMACIÓN DEL BIOFILM ........................................................... 3 3. MATRIZ EXTRACELULAR DEL BIOFILM ......................................................... 5 3.1. Sustancias poliméricas extracelulares .................................................................... 6 3.1.1. Exopolisacáridos ..................................................................................... 6 3.1.1.1. Pel ............................................................................................. 7 3.1.1.2. Psl ............................................................................................. 7 3.1.1.3. Alginato .................................................................................... 7 3.1.2. Proteínas .................................................................................................. 8 3.1.2.1. Proteínas estructurales .............................................................. 8 3.1.2.2. Proteínas enzimáticas................................................................ 8 3.1.3. ADN ........................................................................................................ 9 3.1.4. Lípidos .................................................................................................... 9 3.2. Apéndices ............................................................................................................. 10 3.3. Agua ..................................................................................................................... 10 4. MECANISMOS DE UNIÓN A SUPERFICIES ...................................................... 11 5. MECANISMOS DE DISPERSIÓN DEL BIOFILM .............................................. 12 6. REGULACIÓN DE LA FORMACIÓN DEL BIOFILM ....................................... 14 6.1. Regulación independiente de los sistemas de detección de quórum..................... 15 6.2. Regulación dependiente de los sistemas de detección de quórum ........................ 17 7. ENFERMEDADES HUMANAS RELACIONADAS CON BIOFILMS .............. 19 7.1. Enfermedades relacionadas con dispositivos médicos ........................................... 19 7.2. Enfermedades no relacionadas con dispositivos médicos ...................................... 20 8. ESTRATEGIAS ANTI-BIOFILMS ......................................................................... 21 9. CONCLUSIÓN Y PERSPECTIVAS FUTURAS.................................................... 24 10. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................ 24 Ilustración de la portada: Biofilm multiespecie cultivada en una superficie de acero inoxidable en un reactor de biofilm de agua potable durante 14 días (Donlan, 2002). 2 RESUMEN Los biofilms son comunidades de microorganismos protegidos por una matriz extracelular que viven adheridos a una superficie. En las últimas décadas, el estudio de la formación de los biofilms ha acaparado mucha atención debido a su importancia médica, ambiental e industrial. Para progresar en la investigación microbiológica y mejorar la compresión de esta forma de vida, esta revisión bibliográfica se centra en el estudio de las etapas de formación de los biofilms, de los componentes y su función dentro del biofilm. Se discuten además, los mecanismos de formación y dispersión de los biofilms y su regulación. Con respecto a la relación de los biofilms con las superficies bióticas, se explica su papel en las infecciones microbianas. Para finalizar, se comentan algunas estrategias para combatirlos. 1. INTRODUCCIÓN Desde los principios de la microbiología, se consideraba las bacterias como microorganismos planctónicos de vida libre y a partir de esta creencia se han definido morfológica y fisiológicamente. Sin embargo, la realidad es muy distinta ya que los microorganismos, en la gran mayoría de los medios naturales donde crecen, viven asociados a superficies como una comunidad multicelular (Singh et al., 2006). En las últimas décadas, es un hecho que el estudio de la formación de los biofilms es uno de los temas más predominantes en la comunidad microbiológica (Lasa, 2005). Y es que las implicaciones de los biofilms en el día a día hace que tengamos la necesidad de saber más de ellos. Antes de adentrarnos en el tema, es imprescindible preguntarnos ¿qué son los biofilms? Tal y como el nombre indica “bio” significa materia viva y “film” traducido al español se refiere a película, definiéndose como capa fina de naturaleza viva (Karatan & Watnick, 2009). En otras palabras, los biofilms son ecosistemas microbianos (monoespecie o multiespecie) protegidos por una matriz extracelular autoproducida compleja, adheridos de forma estable a las superficies bióticas o abióticas (O’Toole et al., 2000; Burmølle et al., 2014; Jamal et al., 2018). Al formarse los biofilms permiten a las bacterias crecer en un entorno protegido, y así, poder sobrevivir ante ambientes hostiles para después dispersarse hacia nichos más favorables (Wei & Ma, 2013). Su funcionalidad depende de las interacciones existentes entre los agregados celulares (Li & Tian, 2012). Esta forma de vida bacteriana abunda en la naturaleza afectando directamente a nuestra sociedad en los ámbitos ambientales, industriales y biomédicos. Se ha observado que se 3 producen grandes diferencias fisiológicas y del comportamiento cuando las bacterias que están en estado planctónico pasan a formar biofilms, o viceversa. Entre estas diferencias, lo más relevante para los científicos en el ámbito médico ha sido la elevada resistencia a antimicrobianos, tanto químicos como biológicos, que presentan las bacterias productoras de biofilms (Heindl et al., 2014). Actualmente, se sabe que más del 80% de las infecciones microbianas y crónicas provocadas por patógenos son causadas por bacterias formadoras de biofilms, según estudios de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) de Pakistán (Jamal et al., 2018). Además, se ha revelado que más del 65% de las infecciones nosocomiales mortales son también provocadas por bacterias formadoras de biofilms (Li & Tian, 2012). Hoy en día, el grupo de bacterias de mayor interés médico para su estudio son las llamadas ESKAPE (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter spp) debido a su alta patogenicidad (Rabin et al., 2015). Esto ha incitado a los científicos a explorar posibles estrategias anti-biofilms para hacerlos más susceptibles a los tratamientos antibióticos y así poder batallar contra estas infecciones (Jakobsen et al., 2017). Para progresar en la investigación microbiológica, es necesario estudiar detenidamente las etapas, composición, mecanismos y regulación de la formación de los biofilms que serán expuestos en los siguientes apartados. 2. ETAPAS DE FORMACIÓN DEL BIOFILM El desarrollo óptimo de los biofilms depende de una serie de factores, como los recursos y nutrientes presentes, las condiciones ambientales, las propiedades y metabolismo de las bacterias, la comunicación celular y la regulación genética (Sadekuzzaman et al., 2015). De este modo, se puede afirmar que los biofilms formados en diferentes ambientes diferirán morfológicamente entre sí (Singh et al., 2006). Las etapas de formación de los biofilms son el contacto con la superficie (unión reversible, unión irreversible), formación de microcolonia, maduración del biofilm y dispersión final (Heindl et al., 2014) (véase Figura 1). • Contacto inicial: Para que unas bacterias pasen de una vida planctónica a formar biofilms, es necesario la presencia de una superficie a la que adherirse. Este es el paso crucial para iniciar la primera etapa, la fijación a la superficie (Rabin et al., 2015). A partir de este contacto es cuando ocurre la síntesis inicial de las sustancias poliméricas extracelulares (SPE) (Jamal et al., 2018). 4 La adherencia puede diferir según bacterias Gram-negativas y Gram-positivas. Las Gramnegativas suelen utilizar apéndices como los flagelos y fimbrias a modo de mecanismo de contacto. Sin embargo, las bacterias Gram-positivas inmóviles usan proteínas de superficie como punto de unión (Lasa, 2005). Además, también influyen las fuerzas físicas, como las fuerzas de Van der Waals o las interacciones electrostáticas. Un factor que favorece este contacto es el nivel de hidrofobicidad de la superficie, ya que a más hidrófoba y no polar, menos repulsión bacteriana con la superficie (Jamal et al., 2018). La velocidad de adhesión se verá más o menos favorecida dependiendo de las propiedades del sustrato y de la superficie celular (Donlan, 2001). En definitiva, las bacterias planctónicas inician la unión con la superficie mediante contactos fisicoquímicos o proteínas de la matriz creando una monocapa celular (Singh et al., 2006). Al iniciar el contacto esta unión es reversible, es decir, las bacterias pueden desasociarse y continuar con una vida planctónica cuando las condiciones para formar biofilm no sean las óptimas (Kostakioti et al., 2013) (Figura 1.a). • Maduración: Una vez llegada a esta etapa surge una unión irreversible a la superficie, donde dará paso a la división celular, convirtiéndose la monocapa de células (Figura 1.b) en una microcolonia (Figura 1.c). La matriz extracelular comienza a producirse creando una comunidad más heterogénea. Al formarse el biofilm maduro, internamente existen comunicaciones genéticas que modifican la tasa de crecimiento y las expresiones génicas de las bacterias que forman los Figura 1: Ciclo de vida de los biofilms de Pseudomonas aeruginosa. a) Interacción inicial reversible con la superficie, b) Adhesión irreversible a la superficie, c) División celular y producción de la matriz generando las microcolonias, d) Maduración del biofilm e) Dispersión celular para volver a empezar el ciclo. (Modificado de Wei & Ma, 2013). 5 biofilms. A diferencia de la vida planctónica, las bacterias de los biofilms crecen más lentamente debido a la limitación de recursos (Donlan, 2001) (Figura 1.d). Además, en esta etapa aparecen propiedades como la menor susceptibilidad a antibióticos (O’Toole et al., 2000). • Dispersión: Tras condiciones adversas como la inanición, el escape de la matriz puede ser la opción más favorable. Aquí podemos diferenciar dos tipos de dispersión: la dispersión pasiva, que se produce por fuerzas fisicoquímicas, o la dispersión activa, que se origina al detectar señales de estrés ambiental por la comunidad bacteriana. Estas señales pueden ser debidas a la concentración de nutrientes, oxígeno y productos tóxicos del medio (Kostakioti et al., 2013). En esta etapa ocurren procesos como la muerte celular, la degradación de la matriz por enzimas y la recuperación de la movilidad que permite esta dispersión (Karatan & Watnick, 2009) (Figura 1.e). 3. MATRIZ EXTRACELULAR DEL BIOFILM Uno de los pasos esenciales para formalizar el biofilm es la autoproducción de la matriz extracelular por la comunidad bacteriana. Esto ocupa aproximadamente un 90% de la biomasa, siendo el 10% restante, el espacio habitado por las bacterias (Flemming & Wingender, 2010). La matriz está formada principalmente por agua, exopolisacáridos, proteínas y ADN (Lasa, 2005). A través de la matriz se absorben moléculas y nutrientes de la fase acuosa o del sustrato, que son capturados por unas enzimas digestivas extracelulares excretadas por la comunidad bacteriana. Se podría decir que la matriz es un sistema digestivo externo con función social, ya que los recursos se difunden dentro del biofilm (Flemming et al., 2016). Las matrices aportan propiedades a los biofilms, como la resistencia a la desecación, sirviendo como barrera contra la evaporación. Otra particularidad interesante es que los biofilms pueden sufrir una regeneración dinámica y continua ante cualquier condición ambiental adversa que se le presente (Flemming et al., 2016). Además, se ha demostrado que presentan características viscoelásticas, es decir, cuando alguna fuerza ejerce contra la matriz de SPE, el biofilm procesa una respuesta elástica hasta que supera un punto crítico, generando una deformación irreversible y comportándose como un fluido viscoso (Körstgens et al., 2001). 6 3.1. Sustancias poliméricas extracelulares Las sustancias poliméricas extracelulares son un conjunto de biomoléculas localizadas extracelularmente (como los exopolisacáridos, proteínas, ADN y lípidos) que componen el esqueleto de los biofilms, a partir del cual, se formará su estructura tridimensional. Estas sustancias son las encargadas de la fijación a las superficies y de la cohesión de los biofilms (Flemming & Wingender, 2010). En la matriz, son los componentes que más abundan ocupando entre un 50 y el 90% de la materia orgánica (Donlan, 2002). Este porcentaje y su constitución varía según la especie bacteriana, la antigüedad de los biofilms y el medio ambiente (Mayer et al., 1999). La organización arquitectónica de los biofilms depende de las interacciones entre los distintos componentes de las SPE, proporcionándole así, las propiedades mecánicas y fisiológicas de los biofilms (Flemming et al., 2016). En otras palabras, la estabilidad mecánica de la matriz se debe al entramado de SPE y a las fuerzas fisicoquímicas entre las moléculas. En concreto, las fuerzas que permiten esta estabilidad son las fuerzas electrostáticas, interacciones de Van der Waals y los enlaces de hidrógeno (Flemming & Wingender, 2010). Se ha demostrado que cuando se ejerce una tensión contra los biofilms, estos emiten una respuesta estructural sintetizando más SPE para mantener su estabilidad (Shaw et al., 2004). Las SPE influyen en la pegajosidad de la matriz ya que son capaces de capturar diferentes moléculas como cationes, aniones, elementos apolares y partículas del agua (Flemming & Wingender, 2010). Además de estas moléculas, los biofilms también pueden adoptar algunos componentes del hospedador, como el ADN, para favorecer la estabilidad estructural (Jakobsen et al., 2017). En algunos casos, además de interferir en la etapa de adhesión y agregación, reclutan agua e incluso sirven como fuente de alimentación (Flemming & Wingender, 2010). 3.1.1. Exopolisacáridos Los exopolisacáridos son unas cadenas de carbohidratos lineales o ramificadas sintetizados por las bacterias, que están localizadas en la superficie celular formando un entramado complejo (Flemming & Wingender, 2010). Tal y como su nombre indica, son sintetizados extracelularmente o intracelularmente para posteriormente secretarlos al exterior (Rabin et al., 2015). Las SPE están compuestas entre un 1-2% de polisacáridos (Jamal et al., 2018). Es importante aclarar que no todas las bacterias que viven dentro de los biofilms producen exopolisacáridos (Flemming & Wingender, 2010). 7 En esta revisión bibliográfica nos centraremos en el ejemplo de P. aeruginosa para explicar los exopolisacáridos, ya que es uno de los modelos mejor estudiados hasta la fecha. Esta bacteria Gram-negativa presenta los exopolisacáridos Pel, Psl y alginato, cuya labor es aumentar la tolerancia a los antibióticos y la conservación de la arquitectura de la matriz (Ryder et al., 2007). Se ha descubierto que la producción de estos polisacáridos están coordinados por la enzima AlgC, que actúa como punto de control (Ma et al., 2012). 3.1.1.1. Pel El polisacárido Pel producido por P. aeruginosa ayuda a la formación del biofilm, interviniendo en la adhesión, en la interacción intercelular y en el soporte de la estructura primaria, y por otro lado, se ha descubierto que también contribuye a la resistencia a los antibióticos aminoglucósidos (Flemming & Wingender, 2010; Colvin et al., 2011). Algunas investigaciones demuestran que en las cepas de P. aeruginosa que no presentan los pili tipo IV, el polisacárido Pel actúa como sustituyente, facilitando la adhesión (Vasseur et al., 2005). 3.1.1.2. Psl El polisacárido Psl está localizado en la superficie celular favoreciendo las interacciones intercelulares, la etapa de contacto inicial con las superficies abióticas y bióticas, el mantenimiento de la organización arquitectónica del biofilm y la dispersión, dejando unos rastros de Psl durante el desplazamiento (Ma et al., 2006; Ma et al., 2009; Zhao et al., 2013). Además, se ha demostrado que también influye en la protección contra el sistema inmune del hospedador y los antibióticos (Wei & Ma, 2013). En las diferentes etapas de formación de los biofilms, el Psl se va acumulando en diferentes áreas. En las etapas iniciales, se sitúa en las superficies celulares para realizar las comunicaciones célula-célula. Posteriormente durante la maduración, se deposita en la periferia de las microcolonias, conformando un espacio sin Psl en el centro para facilitar la dispersión (Ma et al., 2009) (véase Figura 1.e). 3.1.1.3. Alginato Este exopolisacárido es imprescindible para la nutrición de los biofilms, ya que interviene en la captación del agua y los nutrientes. Asimismo, el alginato presenta las mismas propiedades que Psl, en cuanto a la estabilidad estructural y la tolerancia al sistema inmunológico y a antibióticos (Leid et al., 2005; Wei & Ma, 2013). Además en algunos casos puede actuar como factor de virulencia (Pedersen et al., 1992). En investigaciones con cepas revertidas que no 14 En el caso de A. tumefaciens, regula la motilidad mediante unos reguladores transcripcionales denominados VisN-VisR, que inactiva la síntesis del PUP y de la celulosa. Esto lo produce al inhibir unas enzimas DGC, llamadas DgcA, DgcB y DgcC. DgcA es regulada postranscripcionalmente por VisN-VisR, mientras que DgcB y DgcC son reguladas transcripcionalmente por VisN-VisR. Al inhibir estas enzimas, disminuye la concentración de c-di-GMP intracelular, por lo que la bacteria deja de sintetizar PUP y celulosa. Simultáneamente, los reguladores VisN-VisR activan la expresión de un factor de transcripción llamado regulador del crecimiento exponencial de la motilidad (Rem), que desencadena la función flagelar y, por lo tanto, la motilidad bacteriana (Xu et al., 2013) (Figura 3). 6. REGULACIÓN DE LA FORMACIÓN DEL BIOFILM Generalmente, la formación de los biofilms está estimulada por señales nutricionales, mensajeros secundarios, señales procedentes del hospedador o por pequeñas concentraciones de antibióticos (Wei & Ma, 2013). Aquí se discutirá la regulación independiente y dependiente de los sistemas de detección de quórum (QS). Figura 3: Mecanismo de regulación VisN-VisR de A. tumefaciens. VisN/R son unos reguladores transcripcionales que inhibe unas enzimas DGC (DgcA, DgcB y DgcC). VisN/R regula transcripcionalmente a DgcB y DgcC, mientras que DgcA es regulado postranscripcionalmente. Al inhibir DGC, disminuye la concentración citoplasmática de c-di-GMP, por lo que la bacteria deja de sintetizar el polisacárido unipolar (PUP) y las fibras de celulosa. Simultáneamente, VisN/R activa la expresión del factor de transcripción Rem que promueve la motilidad bacteriana. (Modificado de Xu et al., 2013). 15 6.1. Regulación independiente de los sistemas de detección de quórum Las bacterias pueden reaccionar ante metabolitos secundarios, como los antibióticos e inducir la formación de biofilms. Esto ocurre cuando las concentraciones de los antibióticos son lo suficientemente bajas como para no matar a las bacterias, respondiendo estas, con modificaciones en su expresión génica. En S. aureus, la formación de los biofilm es inhibida cuando se activa el QS. Por lo tanto, cuando en el medio hay antibióticos que actúan contra el QS, se estimula la formación de los biofilms. (López et al., 2010). Por otro lado, hay evidencias de que la quimiotaxis también influye en la adhesión a las superficies (Kostakioti et al., 2013). La quimiotaxis es el desplazamiento que realizan las bacterias según los gradientes de nutrientes o químicos del medio, favoreciendo así, la búsqueda de las localizaciones óptimas para su desarrollo y supervivencia (Singh et al., 2006). Por ejemplo, P. aeruginosa además de utilizar los apéndices como mecanismo de unión, dispone de otro sistema llamado circuito regulador Wsp. Este sistema, dispone de proteínas que son homólogas a las implicadas en la quimiotaxis. En la membrana celular se localiza un quimiorreceptor llamado WspA, que detecta una señal de la superficie y activa a unas proteínas sensoras (WspB, WspD y WspE). WspE se autofosforila, transfiriéndole un grupo fosfato a la proteína reguladora de respuesta, WspR, que presenta el dominio activador de la enzima DGC para sintetizar c-di-GMP, dando lugar finalmente a la producción de los biofilms (Hickman et al., 2005) (Figura 4). Figura 4: Sistema de detección de superficie Wsp de P. aeruginosa. WspA es una proteína que detecta la superficie y activa a unas proteínas sensoras (WspB, WspD y WspE). WspE se autofosforila y transmite el grupo fosfato hasta la proteína WspR, desencadenando la formación del biofilm, al aumentar las concentraciones de c-di-GMP (Modificado de Belas, 2014). 16 Otro mecanismo de regulación comúnmente utilizado son los sistemas de dos componentes que participan en la formación de los biofilms. Su función es la detección de la información del medio ambiente mediante transferencias de grupos fosforilos. Básicamente, es un sensor histidina quinasa situado en la superficie celular que percibe una señal directa o indirectamente. Esta señal es transmitida a un regulador de respuesta mediante una fosforilación, generando finalmente, una respuesta fisiológica (Karatan & Watnick, 2009). Por ejemplo, P. aeruginosa utiliza el sistema GacS / GacA / RsmZ. GacS es el sensor histidina quinasa que, ante una señal del ambiente, transmite un grupo fosfato a una proteína reguladora llamada GacA. Esta, al recibir la información sensora, activa la transcripción de RsmZ y RsmY, que son unos pequeños ARN no codificantes. Estos se unen a RsmA, que es una proteína reguladora postranscripcional, que suprime la formación de los biofilms e incita la virulencia. Por lo tanto, al producirse esta unión, estos ARN inhiben el efecto negativo de RsmA, permitiendo la síntesis de las SPE y la formación de los biofilms (Kay et al., 2006; Jakobsen et al., 2017) (Figura 5). Figura 5: Sistema de dos componentes GacS / GacA / RsmZ de P. aeruginosa. GacS es una quinasa sensora de la membrana que, ante una señal ambiental, fosforila a una proteína reguladora llamada GacA. Esta proteína provoca la transcripción de pequeños ARN no codificantes (RsmY/Z), que se unen a una proteína reguladora (RsmA), encargada de inhibir la formación del biofilm y favorecer la virulencia (líneas rojas). Esta unión reprime RsmA, favoreciendo la formación de los biofilms y suprimiendo la virulencia (líneas azules). (Modificado de Wei & Ma, 2013). 17 6.2. Regulación dependiente de los sistemas de detección de quórum Las bacterias necesitan coordinar su expresión genética para poder producir los biofilms, y esto, lo realizan gracias a los sistemas de detección de quórum (Rabin et al., 2015). Este sistema es un mecanismo que utilizan varias especies bacterianas para comunicarse, regular la densidad celular y coordinar los comportamientos de la comunidad. El QS regula varios procesos como la bioluminiscencia, producción de biofilms, dispersión, tolerancia a antibióticos, la segregación de factores virulentos y la generación de canales o poros (Singh et al., 2006; Rabin et al., 2015; Whiteley et al., 2017). Para sincronizar la expresión génica, las bacterias utilizan autoinductores, que son pequeñas moléculas que se emplean como señal intra o intercelular, actuando como vía de comunicación (Rabin et al., 2015). Es decir, las bacterias detectan la presencia de otras al sintetizar, localizar y responder a los autoinductores (Li & Tian, 2012). Los sistemas QS actualmente se clasifican según las clases de bacterias, es decir, si son Gram-negativas o Gram-positivas. Los autoinductores son detectados por QS y sistemas reguladores específicos (Li & Tian, 2012). Es importante saber que las concentraciones de los autoinductores van a ser proporcionales con respecto a las densidades celulares de los biofilms. Es decir, conforme van aumentado las densidades, las concentraciones del autoinductor del medio van incrementándose hasta superar un umbral, que es cuando se producen las interacciones autoinductor-proteína reguladora (Rabin et al., 2015). Algunos estudios determinan que la actividad de los autoinductores depende de factores como la concentración, la forma de difusión, la accesibilidad de los receptores, la síntesis y la degradación de estas señales (Li & Tian, 2012). En las bacterias Gram-negativas, el sistema de detección de quórum es de tipo LuxI/LuxR, cuyo autoinductor es una acil-homoserina lactona (AHL). La proteína LuxI, que es una autoinductasa sintasa, media la producción de un autoinductor AHL específico, que se difunde al exterior fácilmente por la membrana celular. Solo cuando las concentraciones de AHL en el medio extracelular son grandes debido a la alta densidad celular, es cuando la AHL puede introducirse en las bacterias y ser reconocidas por unas proteínas tipo LuxR. Una vez que han establecido contacto, LuxR interactúa como un activador transcripcional y se une a unos elementos específicos del promotor de unos genes diana (véase Figura 6). Es importante aclarar que cada especie bacteriana sintetiza sus propios autoinductores, por lo tanto, la comunicación es intraespecífica (Li & Tian, 2012). 18 En las bacterias Gram-positivas, el sistema de detección de quórum es de dos componentes, que utilizan como autoinductor pequeños oligopéptidos modificados. En un principio, las señales se sintetizan internamente como péptidos precursores, y posteriormente, se modifican mediante un transportador de oligopéptidos para secretarse al exterior como un autoinductor. En la membrana celular hay un sensor histidina quinasa (SHK), que es una proteína de transducción de señales de dos componentes. Cuando esta proteína intercepta a los autoinductores extracelulares, se autofosforila, y se transmite el grupo fosfato hasta una proteína reguladora transcripcional. Esta proteína al fosforilarse se une a unos genes diana sensibles al quórum y activa su transcripción (Henke & Bassler, 2004) (Figura 7). Figura 6: Sistema de detección de quórum tipo LuxI/LuxR en bacterias Gram-negativas. La proteína LuxI cataliza un autoinductor AHL específico que se difunde al exterior a través de la membrana celular. La figura de la izquierda representa este proceso cuando las densidades celulares y la concentración de AHL del medio son bajas. La figura de la derecha simboliza cuando las concentraciones de AHL son altas, al aumentar las densidades celulares. Solo en este último caso, es cuando la proteína tipo LuxR reconocerá la AHL, que es interiorizada por difusión y se une a unos genes diana, activando su transcripción. (Modificado de Li & Tian, 2012). Figura 7: Sistema de detección de quórum en bacterias Gram-positivas. Se sintetiza un péptido precursor que es procesado y secretado al exterior. Este autoinductor es reconocido por un sensor histidina quinasa (SHK), que desencadena una serie de fosforilaciones, que activan a un regulador transcripcional de unos genes diana sensibles al quórum. (Modificado de Henke & Bassler, 2004). 19 Por último, el sistema de detección de quórum híbrido utilizado tanto en bacterias Grampositivas como Gram-negativa es de tipo luxS, mediado por Al-2. Este sistema se utiliza para facilitar las comunicaciones interespecie de la comunidad, a diferencia de los sistemas QS descritos anteriormente (Li & Tian, 2012). En este caso, las moléculas señal son AHL como en las Gram-negativas, pero las bacterias presentan un sistema de detección sensor histidina quinasa de dos componentes en la superficie celular. Además del AHL, también sintetiza otro autoinductor llamado Al-2, que es el que permite la comunicación interespecie (Karatan & Watnick, 2009). 7. ENFERMEDADES HUMANAS RELACIONADAS CON BIOFILMS Las infecciones relacionadas con los biofilms que son debidas a daños tisulares o por la implantación de algún cuerpo extraño en el hospedador, presentan una serie de características comunes (Lasa et al., 2005): - En primer lugar, las superficies son colonizadas por las bacterias formadoras de los biofilms. - Para producir una infección es necesaria la presencia de algún biomaterial, cuerpo extraño o tejido dañado. - La infección comienza con pequeñas inoculaciones bacterianas. - Resistencia de los biofilms ante el sistema inmune del hospedador y terapia antibiótica. - Las infecciones más frecuentes son por Staphylococcus epidermidis, S. aureus, y por P. aeruginosa. - Las infecciones son persistentes debido a esta resistencia antibacteriana. - Presencia de inflamación, daño tisular y necrosis en la interfase tejido-implante. - Perturbación de la respuesta inmune del hospedador por los biofilms. Las enfermedades humanas producidas por bacterias formadoras de biofilms son de dos tipos, infecciones relacionadas con dispositivos y las no relacionadas con dispositivos médicos. 7.1. Enfermedades relacionadas con dispositivos médicos Los implantes médicos son una de las fuentes más frecuentes de infección por biofilms. Esto es debido a contaminaciones bacterianas procedente de la piel del paciente, del personal sanitario o del ambiente. La adhesión del biofilm puede ser directamente al implante o indirectamente mediante biomoléculas. Esta fijación depende del flujo del líquido donde está 20 suspendido el implante, la concentración de bacterias y las características fisicoquímicas del implante. Por ejemplo, en las sondas urinarias, la contaminación procede de la bolsa recolectora y entra en el lumen del catéter, causando infecciones urinarias. En este caso, las bacterias se adhieren de forma directa al catéter. Una vez fijadas las bacterias pueden producir endotoxinas, que se pueden distribuir por el torrente sanguíneo y provocar la enfermedad (Lasa et al., 2005). Las bacterias formadoras de biofilms que suelen contaminar este dispositivo son, E. coli, E. faecalis, S. epidermidis, P. aeruginosa, K. pneumoniae, Proteus mirabilis y otras bacterias Gram-negativas (Jamal et al., 2018). Otra infección causada por dispositivos médicos puede ser debido a la implantación de los catéteres venosos centrales. Aquí, al contrario que las sondas urinarias, la adhesión es indirecta. Las bacterias se adhieren a las proteínas del plasma y otras proteínas de los tejidos que están recubriendo el catéter. Estas bacterias pueden ser S. epidermidis, S. aureus, P. aeruginosa, especies de Enterobacter y de Klebsiella (Jamal et al., 2018). La forma más eficaz de contrarrestar estas infecciones relacionadas con los implantes médicos es su extracción (Jakobsen et al., 2017). 7.2. Enfermedades no relacionadas con dispositivos médicos Por otro lado, tenemos las infecciones que no están relacionadas con dispositivos médicos, como la endocarditis de válvulas nativas (EVN). Es una inflamación provocada por la interacción de bacterias con el endotelio vascular y las válvulas pulmonares del corazón. Las bacterias culpables de esta enfermedad son los estreptococos, estafilococos y bacterias Gramnegativas. Estas acceden al corazón y al torrente sanguíneo desde el tracto gastrointestinal, el tracto urinario o desde la orofaringe. Las bacterias llegan al endotelio de la válvula y se adhieren a él, causando una lesión (Jamal et al., 2018). Las células endoteliales responden secretando fibronectina, que favorece más aún la adhesión de las bacterias ya que se unen a estas moléculas mediante adhesinas específicas. Finalmente, las bacterias se multiplican, produce el biofilm y se reproduce una enfermedad difícil de combatir con antibióticos (Lasa et al., 2005). Curiosamente, cuando se implanta una válvula cardiaca protésica también puede conllevar a una infección, originando una endocarditis de la válvula protésica (Rabin et al., 2015). La placa dental es una composición de biofilms mixtos. Generalmente, esta composición es beneficiosa para nuestra flora bucal pero cuando las condiciones del entorno oral cambian, se originan las enfermedades. Por ejemplo, cuando hay condiciones ácidas en la boca, las bacterias 21 inocuas no las toleran, y sin embargo, las patógenas son resistentes causando enfermedades como caries, periodontitis, gingivitis, etc (Rabin et al., 2015). La periodontitis es una infección de las encias que causa lesiones en los tejidos blandos y en los huesos de la mandíbula. Las bacterias acceden por una mala higiene bucal, y son capaces de formar biofilms tanto en los dientes como en las mucosas. Estas, alteran el flujo de calcio en las células epiteliales y dispersan endotoxinas. Finalmente, tras 2 o 3 semanas, se desarrolla una placa dental, que al mineralizarse con calcio e iones fosfatos, acaba generando el sarro. Las bacterias causantes de esto son Pseudomonas aerobicus y Fusobacterium nucleatum (Jamal et al., 2018). Una de las enfermedades que despierta más interés a los investigadores médicos es la fibrosis quística (FQ). Se trata de una enfermedad hereditaria del pulmón, donde se genera un moco espeso y pegajoso que bloquea las vías aéreas, perturbando así la respiración (Rabin et al., 2015). El patógeno oportunista P. aeruginosa es el responsable de provocar infecciones crónicas a los pacientes con FQ (Ma et al., 2009). Esta enfermedad provoca un gran deterioro pulmonar, afectando gravemente a la salud y pudiendo causar la muerte de los pacientes (Rabin et al., 2015). Diversos estudios han demostrado que P. aeruginosa forma los biofilms en los pulmones cuando las concentraciones de hierro del medio son bajas (Yang et al., 2007). Por otro lado, Perdersen y sus colaboradores detectaron que el alginato de las matrices celulares de P. aeruginosa actúa como factor de virulencia, ocasionando el daño pulmonar (Pedersen et al., 1992). Tras esto, es importante aclarar que los biofilms bacterianos no solo están relacionados con los procesos infecciosos, sino que también pueden tener función protectora. Por ejemplo, los biofilms inocuos que se forman en la superficie dental evitan la colonización de bacterias patógenas (Lasa et al., 2005). 8. ESTRATEGIAS ANTI-BIOFILMS Como se ha comentado, los biofilms son muy resistentes a los agentes antimicrobianos tradicionales, por lo que hay que buscar otras alternativas para poder erradicarlos. Actualmente, no existen medicamentos para el tratamiento concreto de los biofilms (Rabin et al., 2015). Básicamente, las estrategias anti-biofilms van dirigidas a la inhibición de la síntesis de la matriz y sus mecanismos reguladores (Wei & Ma, 2013). Se ha descubierto que diferentes extractos de plantas producen un efecto inhibitorio contra la formación de los biofilms (Sadekuzzaman et al., 2015). Por ejemplo, los extractos de corteza 22 de Melia dubia revelaron una fuerte inhibición de la hemolisis, hidrofobicidad, la motilidad y formación de los biofilms de E. coli uropatógena (Ravichandiran et al., 2012). Otra estrategia anti-biofilm es el empleo de bacteriófagos, que se puede usar como una alternativa potencial o combinado con antibióticos. Estos fagos tienen que traspasar la matriz de SPE para poder alcanzar los receptores de las bacterias. Para ello, utilizan unas enzimas procedentes de los fagos que degradan la matriz o pueden penetrar directamente mediante difusión. Este método es ventajoso debido a que tiene una afinidad altamente específica con el hospedador, no afecta a la microbiota normal y su producción es rápida, simple y barata. Sin embargo, es posible que los bacteriófagos generen endotoxinas o que disminuya su eficacia debido al sistema inmune del hospedador (Sadekuzzaman et al., 2015). Por ejemplo, el fago T4 infecta y se multiplica dentro de los biofilms de E. coli, causando la alteración de la matriz al lisar las bacterias (Meng et al., 2011). Ya se ha comentado que el QS interviene en la formación del biofilm. Por esto, muchas estrategias van encaminadas a su extinción. Los inhibidores de QS (QSI) se utilizan para inhibir la producción de señales, impedir la transferencia de los autoinductores, bloquear los receptores que detectan la señal y reprimir la respuesta de señalización. La mayoría de los QSI son obtenidos de la naturaleza. Principalmente, se emplean análogos de AHL o de los péptidos señal para inhibir el QS en algunas bacterias (Li & Tian, 2012). Por otro lado, también se usan enzimas que degradan el AHL. Actualmente, estas enzimas se clasifican como, acilasa de AHL, lactonasas de AHL y oxidorreductasas. Como punto a favor, los QSI bloquean la síntesis de los factores de virulencia de los biofilms sin provocar la muerte celular. No obstante, se ha comprobado que esto potencia la sensibilidad de los biofilms a los antibióticos, por lo tanto, para un efecto más eficaz, debe emplearse en combinación con antibióticos (Sadekuzzaman et al., 2015). Un ejemplo de QSI son las furanonas halogenadas naturales producidas por la macroalga marina Delisea pulchra, que forma un complejo inestable con la proteína LuxR anteriormente mencionada y la degrada, inhibiendo así, el QS (Manefield et al., 2002). Además, se ha demostrado que son efectivas contra las invasiones de P. aeruginosa en los pulmones de ratones con infección pulmonar (Hentzer et al., 2003). Como se ha comentado anteriormente, el óxido nítrico (NO) contribuye a la dispersión de los biofilms de P. aeruginosa cuando las concentraciones de este compuesto son bajas. Esto es debido a que se estimula la actividad de la enzima PDE, que degrada la formación de c-di-GMP, y por tanto, favorece la dispersión de los biofilms. Así pues, el NO se puede aplicar como una 23 estrategia anti-biofilm (Barraud et al., 2009). Otro enfoque podría ser la utilización de nuevas superficies en los ámbitos médicos, alimentarios y marinos para prevenir la formación de los biofilms, como nuevos materiales, modificaciones de la superficie o nuevos recubrimientos y pintura (Sadekuzzaman et al., 2015). Por ejemplo, algunos dispositivos médicos se han recubierto con un péptido inhibidor de ARN III (RIP), que evita la formación de los biofilms de S. aureus (Balaban et al., 2003). El uso de enzimas que degradan la matriz también es una buena estrategia anti-biofilm. Estas enzimas pueden ser desoxirribonucleasas, glicosidasas o proteasas, que intervienen en la dispersión de los biofilms maduros (Kaplan, 2010). Por ejemplo, la dispersina B producida por Actinobacillus actinomycetemcomitans es una enzima que degrada la poli-N-acetilglucosamina (PNAG), que es uno de los polisacáridos principales de las matrices extracelulares encargados de la adhesión intercelular, por lo que inhibe la formación de los biofilms (Kaplan et al., 2004). Como ventaja, el uso de estas enzimas no mata a las bacterias ni inhiben su crecimiento sino que solo degradan la matriz. Esto es favorable ya que evita las posibles resistencias evolutivas de las bacterias (Kaplan, 2010). Los biosurfactantes o tensioactivos microbianos (BS) son unos compuestos anfipáticos localizados en las superficies celulares o secretados extracelularmente por las bacterias. Se consideran agentes anti-biofilms ya que provocan una fuerte dispersión bacteriana, alteran la superficie celular y perturban la adhesión. En algunos casos también interfieren en el desarrollo de los biofilms y en la comunicación intercelular. Cuando se añade BS a una superficie se altera su hidrofobicidad, lo que afecta a la adherencia y la absorción bacteriana a dicha superficie (Sadekuzzaman et al., 2015). Por ejemplo, se ha usado la surfactina en catéteres uretrales para inhibir la formación de los biofilms de B. subtilis, E. coli, P. mirabilis y Salmonella enterica (Mireles et al., 2001). Las bacteriocinas son unos péptidos o proteínas antibacterianas de espectro estrecho que son sintetizadas por procariotas y actúan contra especies estrechamente relacionadas. Estas moléculas se usan para evitar la adhesión y la formación de los biofilms. Esta estrategia se suele emplear para la conservación de los alimentos y en el ámbito médico. Por ejemplo, una de las bacteriocinas más relevantes en el ámbito alimentario es la nisina producida por Lactococcus lactis, que es un péptido que tiene actividad antibacteriana hacia otras bacterias Gram-positivas, como B. subtilis (López et al., 2009; Sadekuzzaman et al., 2015). 30 Walker, TS., Tomlin, KL., Worthen, GS., Poch, KR., et al. 2005. Enhanced Pseudomonas aeruginosa biofilm development mediated by human neutrophils. Infection and Immunity, 73 (6): 3693-3701. doi:10.1128/IAI.73.6.3693–3701.2005. Wei, Q., & Ma, LZ. 2013. Biofilm matrix and its regulation in Pseudomonas aeruginosa. International Journal of Molecular Sciences, 14 (10): 20983-21005. doi:10.3390/ijms141020983. Whitchurch, CB., Tolker-Nielsen, T., Ragas, PC., & Mattick, JS. 2002. Extracellular DNA required for bacterial biofilm formation. Science, 295 (5559): 1487. doi:10.1126/science.295.5559.1487. Whiteley, M., Diggle, SP., & Greenberg, EP. 2017. Progress in and promise of bacterial quorum sensing research. 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