Nuevas aplicaciones de los dendrímeros en el campo de la biomedicina

NUEVAS APLICACIONES DE LOS DENDRÍMEROS EN EL CAMPO DE LA BIOMEDICINA Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Macarena García Rivas TRABAJO FIN DE GRADO Macarena García Rivas Sevilla, Febrero 2018 NUEVAS APLICACIONES DE LOS DENDRÍMEROS EN EL CAMPO DE LA BIOMEDICINA Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Grado en Farmacia Departamento de Química Física Tutor: Elia María Grueso Molina TRABAJO FIN DE GRADO REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA RESUMEN Los dendrímeros son un tipo de macromoléculas poliméricas de tamaño nanométrico que constituyen la cuarta clase de las arquitecturas poliméricas y tienen cabida en el ámbito de la nanotecnología aplicada a la medicina. Se caracterizan por presentar una estructura muy bien definida, con baja polidispersidad y un exterior multivalente con posibilidad de funcionalización base de la interacción con multitud de especies. Sin embargo, lo más destacable es el elevado control que se posee sobre el diseño estructural, lo cual aporta versatilidad y gran potencialidad en diversos campos de aplicación. Así, en el campo de la medicina resultan prometedores agentes transportadores de fármacos y material genético para constituir nuevas formulaciones terapéuticas encaminadas a mejorar la eficacia y seguridad de moléculas activas. De acuerdo con ello, en este trabajo se recogen las propiedades fisicoquímicas más destacadas y que suponen factores determinantes en su interacción con diferentes sustratos. Asimismo, se detalla la naturaleza de los procesos de complejación con fármacos y material genético, así como los cambios conformacionales que dichas estructuras inducen en estos últimos y los factores de los que dependen. En virtud de sus numerosas aplicaciones en terapias in vivo es importante indagar sobre su toxicidad, muy relacionada con su estructura, la cual presenta buenas perspectivas y posibilidades tangibles de mejora. Por último, se recogerán algunas de las aportaciones más relevantes de los dendrímeros como transportadores de fármacos frente a la administración clásica de moléculas activas. Finalmente, se realiza una comparativa con otros agentes alternativos, como son las nanopartículas y los liposomas, los cuales se emplean también recientemente en nuevas formulaciones para la mejora de las características farmacocinéticas y farmacológicas de principios activos. Palabras clave: dendrímeros, biomedicina, toxicidad, transfección de ADN, transporte de fármacos INDICE GLOSARIO DE ABREVIATURAS ............................................................................................ 5 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 6 1.1 Nacimiento de una nueva clase de arquitectura macromolecular: los dendrímeros ........... 6 1.2 Tipos de dendrímeros ......................................................................................................... 8 1.3 Aplicaciones de los dendrímeros ...................................................................................... 10 1.4 Otros vectores empleados en la actualidad: liposomas y nanopartículas .......................... 11 1.4.1 Liposomas .................................................................................................................. 11 1.4.2 Nanopartículas de oro ................................................................................................. 12 2. OBJETIVOS DE LA REVISIÓN ......................................................................................... 12 3. METODOLOGÍA ................................................................................................................. 13 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................... 15 4.1 Toxicidad ......................................................................................................................... 15 4.1.1 In vitro: citotoxicidad, hemólisis y toxicidad hematológica .................................... 15 4.1.2 In vivo ....................................................................................................................... 19 4.1.3 Estrategias para minimizar los problemas de toxicidad ............................................ 21 4.2 Dendrímeros como sistemas transportadores de fármacos .............................................. 23 4.2.1 Estrategias del transporte de fármacos ...................................................................... 23 4.2.2 Factores que afectan al transporte y liberación de fármacos mediados por dendrímeros ......................................................................................................................... 26 4.3 Dendrímeros como transportadores de material genético: transfección a células ........... 28 4.3.1 Naturaleza de la interacción dendrímero-ADN .......................................................... 29 4.3.2 Factores determinantes en la interacción y formación del complejo dendrímero-ADN ............................................................................................................................................. 29 4.3.3 Cambios conformacionales ....................................................................................... 31 4.3.4 Termodinámica de la complejación .......................................................................... 33 4.4 Ventajas de los dendrímeros frente a la administración clásica de fármacos .................... 34 4.5 Análisis comparativo entre dendrímeros y otros vectores ................................................. 35 5. CONCLUSIONES ................................................................................................................ 37 6. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................... 38 5 GLOSARIO DE ABREVIATURAS ADN Ácido desoxirribonucleico AuNPs Nanopartículas de oro ssDNA ADN monocatenario dsDNA ADN bicatenario ARN Ácido ribonucleico Chol Colesterol DAB Diaminobutano DAE Diaminoetano DOPE Dioleoilfosfatidiletanolamina DC-Chol 3β-[N-(N',N'-dimetilaminoetano) carbamoil] colesterol EPC Fosfatidilcolina de huevo FDA Food and Drug Administration G Generación del dendrímero IgG Inmunoglobulina G i.v Vía intravenosa i.p Vía intraperitoneal LDH Lactato deshidrogensa OTC Over the counter (de venta libre) PAMAM Poliamidoamina PC Fosfatidilcolina PEG Polietilenglicol PEI Polietilenimina PLL Poli-L-lisina PPI Polipropilenimina PS Fosfatidilserina RES Sistema reticuloendotelian siRNA ARN pequeño de interferencia TGA Therapeutic Goods Administration VHS-2 Virus del Herpes Simple tipo 2 VIH Virus de la Inmunodeficiencia Humana 6 1. INTRODUCCIÓN 1.1 Nacimiento de una nueva clase de arquitectura macromolecular: los dendrímeros La primera inspiración para la síntesis de este tipo de estructuras surgió de Tomalia pero no fue hasta la década de los 70 cuando se produjo la primera síntesis exitosa de estos polímeros dendríticos. Requirió una importante disgresión de las estrategias hasta entonces conocidas de polimerización tradicional hacia nuevas perspectivas, al indagar en nuevos conceptos de síntesis (Tomalia y Fréchet, 2002). El primer concepto que vio la luz fue el propuesto por Buhleier allá por el 1978, denominando a este tipo de estructuras moléculas "cascada" debido a su ruta de síntesis en cascada (Tomalia y Fréchet, 2002). Pero fue en 1985 cuando Tomalia publicó el primer artículo usando el término "dendrímero" al describir en gran detalle la preparación del dendrímero poli(amidoamina) (PAMAM), y cuyo término deriva del griego "dendron" que viene a expresar una similitud con las ramificaciones de un árbol (Tomalia et al., 1985). De manera paralela en el mismo año, Newkome usó el término "arborol" (Newkome et al., 1985). En el campo de los polímeros, las estructuras dendríticas son reconocidas como la cuarta clase de las arquitecturas poliméricas, cuya mayor distinción es su gran repertorio de nuevas propiedades y aplicaciones (Tomalia, 2005). Los dendrímeros están emergiendo como prometedores sistemas para el transporte de agentes terapéuticos ya que se trata de un tipo de moléculas de naturaleza polimérica obtenidas por síntesis química, que poseen una estructura bien definida, muy ramificada y monodispersa (Jain et al., 2010), presentando una baja polidispersidad en comparación con los polímeros clásicos (Duncan y Izzo, 2005). Además, su tamaño se engloba en la escala nanoscópica y su superficie puede funcionalizarse de forma controlada (Abbasi et al., 2014) (Liu y Fréchet, 1999). Los dendrímeros difieren de las macromoléculas clásicas en que poseen 3 partes diferenciadas (Tomalia et al., 1985) (véase Figura 1):  Un core o núcleo.  Una zona intermedia que consta de unidades repetitivas de ramificación y en la que cada capa o unidad repetitiva supone una nueva generación (Tomalia y Fréchet, 2002). Esto hace aumentar el diámetro del dendrímero de manera linear y el número de grupos superficiales de manera exponencial, proporcionando una tendencia a adoptar una estructura globular (Sato y Anzai, 2013). Esta zona presenta unos espacios internos con 7 potencial de complejación al tiempo que supone un microambiente de protección frente al exterior (Abbasi et al., 2014).  Un exterior multivalente, que puede ser diseñado para contener diversidad de grupos funcionales que hacen al dendrímero muy reactivo (Tomalia, 2005). Según los grupos funcionales que posean en la superficie, podrán ser neutros o cargados (aniónicos o catiónicos), lo que le otorgará características diversas, y condicionará su comportamiento y aplicaciones. Figura 1. Representación de la estructura general de un dendrímero. Ilustración adaptada de (Garrido y Santana, 2016). Estos 3 componentes (centro, interior y grupos superficiales) van a determinar las propiedades fisicoquímicas del dendrímero, así como su tamaño, forma y flexibilidad, y pueden ser modificados y diseñados específicamente para conseguir un propósito concreto (Tomalia, 2005). El interior puede brindar un espacio ideal para el encapsulamiento de moléculas huésped, mientras que la superficie, gracias a su multivalencia, puede interaccionar con diversidad de sustratos (Svenson y Tomalia, 2005) y permitir una liberación controlada del material encapsulado (Duncan y Izzo, 2005). El tamaño y la rigidez del dendrímero suele aumentar con su generación. Así, conforme aumenta G, los grupos terminales de la superficie soportan una mayor congestión y rigidez y tenderán a adoptar una conformación más compacta y globular (Sato y Anzai, 2013). Esto condiciona las propiedades de encapsulación de los dendrímeros (accesibilidad y salida de moléculas huésped), ya que estructuras dendríticas más empaquetadas y rígidas poseen un acceso limitado al interior (Tomalia, 2005). Por otro lado, se ha observado que estas estructuras presentan cierto parecido con las proteínas, ya que los dendrímeros pueden adquirir una forma nativa (más compacta) o desnaturalizada (extendida), dependiendo del pH, fuerza iónica o polaridad del solvente (Esfand y Tomalia, 2001). 8 Varios factores son los que van a condicionar las propiedades fisicoquímicas de los dendrímeros, y van a inducir cambios conformacionales. Entre ellos cabe resaltar los efectos del crecimiento molecular, del pH, del tipo de disolvente, y el efecto salino (Dufès et al., 2005). En cuanto a la síntesis de los dendrímeros, suele ser muy complicada y a través de muchos pasos. Tiene lugar principalmente mediante 2 métodos: síntesis divergente y síntesis convergente (véase Figura 2). En la síntesis divergente el dendrímero comienza a crecer radialmente desde el núcleo hasta la superficie aumentando el número de capas (Esfand y Tomalia, 2001). Cada capa supone una nueva generación y con ella el aumento del diámetro de la molécula, de peso y grupos funcionales terminales (Tomalia et al., 1985). Con respecto a la síntesis convergente, se produce desde la periferia hacia un punto focal, lo cual lleva a la formación de dendrones reactivos, que posteriormente van a reaccionar para integrarse y formar el dendrímero (Esfand y Tomalia, 2001) (Duncan y Izzo, 2005) (Klajnert y Bryszewska, 2001). Sin embargo, la principal desventaja de este método es la dificultad de obtener dendrímeros de altas generaciones debido al impedimento estérico que se encuentran las ramificaciones en la unión con el punto central, estando limitado a la construcción de dendrímeros de baja generación (Svenson y Tomalia, 2005). Figura 2. Métodos de síntesis divergente y convergente (Garrido y Santana, 2016). 1.2 Tipos de dendrímeros Los dendrímeros más usados son los poliamidoamina (PAMAM), los polipropilenimina (PPI), y los poli-L-lisina (PLL), siendo los PAMAM los más ampliamente estudiados (Aillon et al., 2009). Los dendrímeros PAMAM (véase Figura 3) presentan normalmente un núcleo central de etilendiamina, aunque se pueden sintetizar con interiores más hidrofóbicos como 9 diaminobutano, diaminohexano y diaminododecano; las unidades de ramificación se basan en estructuras con grupos amida. Como grupos superficiales destacan los grupos amino (dendrímeros de generación entera) o grupos carboxilato (dendrímeros de media generación) (Palmerston Mendes et al., 2017). Los dendrímeros PPI (véase Figura 4) suelen tener núcleos de 1,4-diaminobutano (DAB) o diaminoetano (DAE) con propilenimina como unidades de ramificación por lo que el interior constará de aminas terciarias aportando mayor hidrofobicidad comparado con los PAMAM de igual generación; y grupos amino en la superficie (Kesharwani et al., 2014). Los dendrímeros PLL son un tipo de dendrímeros peptídicos, cuyo núcleo y unidades de ramificación se basan en el aminoácido lisina, y grupos amino terminales en superficie (Palmerston Mendes et al., 2017). Figura 3. Estructuras de dendrímeros PAMAM: a) G2; b) G3, donde los colores vienen a diferenciar las generaciones (azul: G0, verde: G1, negro: G2, rojo: G3). Ilustraciones de elaboración propia. Figura 4. Estructuras de dendrímero PPI, donde: a) core diaminobutano; b) PPI G0; c) PPI G1; d) PPI G2. Ilustraciones de elaboración propia. a) b) b) a) c) d) 16 La magnitud de los efectos citotóxicos va a depender de una serie de factores (Malik et al., 2000):  El peso molecular o generación del dendrímero. Esto dos términos están relacionados ya que el aumento en el peso molecular es función de la generación. Los dendrímeros PAMAM, al igual que los PPI y PLL, poseen grupos amino en superficie. Estos grupos amino se encontrarán protonados a pH fisiológico, aportando al dendrímero una densidad de carga positiva creciente con la generación del dendrímero, y que será la responsable de la interacción con las membranas celulares y componentes de la sangre. Como se puede observar a partir de los datos recogidos en la Tabla 3, los dendrímeros de mayor generación, al poseer un número más elevado de grupos amino y, en consecuencia, mayor densidad de carga positiva, presentan unos niveles de toxicidad superiores (valores de IC50 más bajos).  La densidad de carga del dendrímero. Como ya se ha comentado anteriormente, es la carga positiva global del dendrímero la responsable de los problemas de toxicidad. En el caso de dendrímeros de media generación (G1.5, G2.5, G3.5), que son aquellos que presentan grupos aniónicos en superficie (p.e -COO-), la densidad de carga negativa no interacciona de la misma manera con las membranas biológicas, suponiendo un menor grado de desestabilización. Esto se traduce en un nivel de toxicidad mucho menor, representado con valores más altos de IC50 (véase Tabla 3).  La concentración del dendrímero. Concentraciones crecientes de dendrímero suponen un mayor grado de toxicidad. Así, en la tabla 4 se refleja cómo la viabilidad celular decrece al aumentar la concentración de dendrímero.  El tiempo de exposición. De manera similar, la tabla 4 muestra la existencia de un descenso en la viabilidad celular con el tiempo.  El tipo de célula expuesta. La susceptibilidad varía según el tipo de célula ensayada (véase tabla 4). 17 Tabla 3. Características de dendrímeros PAMAM de varias generaciones y su citotoxicidad expresada en valores de IC50. Existe una relación inversa entre toxicidad e IC50, ya que valores altos de IC50 son indicativos de una menor toxicidad. Tabla 4. Citotoxicidad de dendrímeros PPI G5, en función de la concentración, tipo de célula y tiempo de exposición, expresada en términos de viabilidad celular (%). Hemólisis En cuanto a la toxicidad hemolítica, varios estudios han determinado que la exposición de polímeros dendríticos catiónicos a soluciones de hematíes de rata induce cambios morfológicos en los eritrocitos, cierto daño a sus membranas y lisis celular. Este comportamiento se evidencia con la medida del porcentaje de liberación de hemoglobina (Fischer et al., 2003). La capacidad de hemólisis depende de los mismos factores que la citotoxicidad, los cuales ya han sido comentados (Jain et al., 2010)(Duncan y Izzo, 2005). Dendrímero Peso molecular (Da) Nº grupos terminales Grupos terminales IC50 (mM) Referencias PAMAM G1 1430 8 -NH2 > 2,00 (Malik et al., 2000) PAMAM G2 3256 16 -NH2 > 1,00 (Malik et al., 2000) PAMAM G3 6909 32 -NH2 0,14 (Malik et al., 2000) PAMAM G4 14215 64 -NH2 0.13 (Malik et al., 2000) PAMAM G1.5 2935 16 -COO- Na+ > 2,00 (Malik et al., 2000) PAMAM G2.5 6267 32 -COO- Na+ > 1,00 (Malik et al., 2000) PAMAM G3.5 12931 64 -COO- Na+ > 1,00 (Malik et al., 2000) Concentración de PPI G5 (mg/ml) Tipo celular Tiempo de incubación (h) Viabilidad celular (%) Referencias 0,001 HepG2 24 66,8 (Jain et al., 2010) 0,001 COS-7 24 71,5 (Jain et al., 2010) 0,001 HepG2 72 16,8 (Jain et al., 2010) 0,001 COS-7 72 23,1 (Jain et al., 2010) 1,0 HepG2 24 7,6 (Jain et al., 2010) 1,0 COS-7 24 11,7 (Jain et al., 2010) 1,0 HepG2 72 1,7 (Jain et al., 2010) 1,0 COS-7 72 2,3 (Jain et al., 2010) 18 Figura 7. Actividad hemolítica inducida por dendrímeros PAMAM y PPI tipo DAB de diferente generación (indicado mediante el número de grupos terminales) a distintas concentraciones. La hemólisis vienen expresada en porcentaje de hemoglobina liberada (Malik et al., 2000). También se ha observado que el tipo de amina va a afectar a la toxicidad, presentando una menor toxicidad las aminas terciarias con respecto a las primarias o secundarias (Fischer et al., 2003). Esta afirmación es consistente con los datos de la Tabla 5, y de la que se deduce la siguiente tendencia a nivel de toxicidad: PLL≈PEI > PAMAM. Tabla 5. Relación entre el tipo de dendrímero, el tipo de amina que posee y su toxicidad Tipo de dendrímero Tipo de amina IC50 (mg/ml) Viabilidad celular (%) % Hemólisis Referencias PAMAM 1ª, 3ª >10 ~ 100 2,95 (Fischer et al., 2003) PLL 1ª 0,040 73,2 7,88 (Fischer et al., 2003) PEI 1ª, 2ª y 3ª 0,022 72,3 6,09 (Fischer et al., 2003) Con todo esto se puede resumir que la citotoxicidad y hemólisis es superior para los dendrímeros catiónicos que para los aniónicos, y que la toxicidad en general es dependiente del peso molecular (generación), carga superficial dada por los grupos terminales de la periferia y de la concentración (Jevprasesphant, 2003), así como también del tiempo de exposición y del tipo de célula sometida a ensayo (Duncan y Izzo, 2005). Toxicidad hematológica Los dendrímeros también son capaces de alterar los parámetros hematológicos debido a su naturaleza de policationes, entre ellos, el recuento de leucocitos, de glóbulos rojos, hemoglobina, hematocrito y hemoglobina corpuscular media. Se ha observado que los 19 catiónicos producen un descenso del recuento de glóbulos rojos, hemoglobina, hematocrito y hemoglobina corpuscular media, mientras que por otro lado hay un incremento significativo del recuento de leucocitos (Jain et al., 2010). A pesar de todo esto, los estudios in vitro no llegan a ser del todo concluyentes debido a que la toxicidad depende de muchos factores, y cada ensayo sólo establece unas pocas variables, por lo que es difícil generalizar. Estos estudios in vitro se consideran prácticamente la antesala para determinar si estaría justificada una evaluación in vivo preliminar (Duncan y Izzo, 2005). 4.1.2 In vivo Los ensayos de biocompatibilidad in vitro solo pueden proporcionar un idea relativa de la toxicidad potencial de un nuevo transportador polimérico. Por ello, es importante conocer el comportamiento in vivo, siendo necesario hablar de inmunogenicidad y biodistribución, con la posible acumulación en distintos órganos (Duncan y Izzo, 2005). Además, la administración in vivo de dendrímeros parece ser más optimista que la sugerida por las evaluaciones in vitro, ya que se da una menor citotoxicidad que la que se espera en ensayos in vitro (Kannan et al., 2014). Inmunogenicidad Los estudios existentes sobre inmunogenicidad son muy escasos, pero gran parte de ellos afirma que los dendrímeros no inducen inmunogenicidad o lo hacen de forma muy débil (Aillon et al., 2009) (Jain et al., 2010). Aún así, la mayoría se han realizado a corto plazo, por lo que se necesita más evidencia sobre el tema. Biodistribución Los conjugados dendríticos considerados para aplicaciones biomédicas deben presentar bajos perfiles de toxicidad con tiempos de circulación lo suficientemente largos para alcanzar la eficacia terapéutica y permitir la acumulación en los sitios de acción, como por ejemplo en las células tumorales. También deben ser fácilmente eliminados para evitar en la medida de lo posible la acumulación inespecífica a largo plazo (Liu y Fréchet, 1999). Los factores más determinantes en la eliminación o excreción de los dendrímeros (aclaramiento renal y/o aclaramiento hepático) y acumulación en órganos se detallarán a continuación:  El tamaño del dendrímero, que viene dado por la generación. Se considera que las nanopartículas con diámetros en el rango de 10-100nm tienen unas propiedades óptimas para aplicaciones in vivo. Tamaños inferiores a 10nm suponen extravasación a tejidos y un rápido aclaramiento renal, mientras que partículas de tamaños superiores a 100nm 20 sufren una rápida opsonización y eliminación de la circulación por parte de macrófagos del sistema reticuloendotelial (RES) (Wilczewska et al., 2012). Los dendrímeros son excretados mayormente por vía renal y su tasa de aclaramiento renal disminuye con el incremento de tamaño (generación). Así, los dendrímeros de mayor G presentarán una excreción renal más lenta y, en consecuencia, resultará en una retención prolongada en sangre (Kannan et al., 2014). Se ha observado que la excreción renal es mínima cuando el tamaño de PAMAM excede de los 10 nm (Aillon et al., 2009). La acumulación en hígado y riñón también es dependiente de la generación (Duncan y Izzo, 2005).  La densidad de carga de la superficie. Algunos autores evidencian que los dendrímeros catiónicos son rápidamente eliminados de la circulación y que se acumulan en cantidad significativa en el hígado; mientras que los aniónicos presentan mayor tiempo de circulación en sangre, y también se acumulaban en hígado pero en menor grado que los catiónicos (Malik et al., 2000). Los dendrímeros con superficies cargadas (catiónicos o aniónicos) o hidrofóbicas son eliminados rápidamente de la circulación, normalmente por el hígado; los dendrímeros con superficies hidrófilas, con grupos hidroxilo o PEG, evitan la rápida eliminación por lo que tienen mayores tiempos de circulación (McNerny et al., 2010). Los dendrímeros pegilados muestran un tiempo de residencia en sangre mayor y una menor acumulación en el hígado, bazo o riñón, pero se ha observado una mayor acumulación en tejido tumoral (Kannan et al., 2014).  Naturaleza hidrófila/lipófila del interior dendrimérico. Al comparar dendrímeros de generación y superficie equivalentes pero con interiores de carácter hidrófilo/lipófilo diverso se observó que aquellos con un interior más hidrofóbico se eliminaron más rápidamente de la circulación con 2 veces más acumulación en el hígado comparado con los de interiores más hidrofílicos (Kannan et al., 2014). Por ello, la estructura del núcleo del dendrímero debe ser biodegradable y fácilmente eliminado por vía renal o hepática. De lo contrario es difícil de predecir la toxicidad a largo plazo (Aillon et al., 2009). El núcleo tipo amida que poseen los dendrímeros tipo PAMAM y PPI no pueden sufrir hidrólisis o degradación enzimática, por lo que se está investigando sobre estructuras basadas en aminoácidos, oligonucleótidos o poliésteres que se sobrepongan a esa toxicidad (Aillon et al., 2009). Por tanto, es importante diseñar los dendrímeros para que, por un lado, se consigan aumentar los tiempos de circulación en sangre (aumentar vida media y por tanto efecto), al tiempo que se produzca una excreción significativa para evitar la acumulación a largo plazo en órganos (Kannan et al., 2014). Así, el transporte dirigido combinado con una eliminación rápida intrínseca de dendrímeros de baja y media generación pueden ayudar a minimizar la toxicidad (Kannan et al., 2014). 21 4.1.3 Estrategias para minimizar los problemas de toxicidad Poco a poco van surgiendo nuevas estrategias en la síntesis de los dendrímeros con el objetivo de atenuar la toxicidad y convertir los dendrímeros en compuestos más biocompatibles. Van encaminadas sobre todo a: i) la modificación de la superficie para reducir o enmascarar la carga global positiva responsable de dicha toxicidad (al neutralizar, reducir, proteger grupos aminos, o mediante la introducción de grupos aniónicos) (Palmerston Mendes et al., 2017); ii) el diseño de dendrímeros con una estructura biodegradable, cuyos monómeros en los que se divide tras la degradación puedan servir como sustratos para diversas rutas metabólicas y se impida así su acumulación y toxicidad (Jain et al., 2010). La idea es crear dendrímeros que favorezcan la retención en tejidos o células dianas al tiempo que minimizar la entrada o toxicidad en células sanas y reducir los efectos adversos. Entre las modificaciones de la superficie encaminadas a dicho fin cabe destacar: i) la pegilación, que además de disminuir la citotoxicidad y hemólisis (Jevprasesphant, 2003), aumenta la solubilidad, los tiempos de circulación y la acumulación selectiva en tumores (Palmerston Mendes et al., 2017); ii) la acetilación e hidroxilación de los grupos aminos para neutralizar la carga (Duncan y Izzo, 2005) iii) conjugados con carbohidratos, aminoácidos o péptidos. Como esqueletos dendríticos biodegradables destacar los dendrímeros poliéter, poliéster, triazina o melamina (Jain et al., 2010). Todas estas estrategias quedan recogidas en la Tabla 6, donde valores bajos de IC50 y hemólisis junto con valores altos de viabilidad celular demuestran esa minimización de la toxicidad. 22 Tabla 6. Recopilación de algunas de las técnicas empleadas para reducir la toxicidad. Los resultados recogidos en la tabla 6 son bastante similares de unas estructuras a otras, destacando los dendrímeros con esqueleto de poliéter por tener una viabilidad celular superior al 98% y los dendrímeros PPI G5 por su baja hemólisis. Además, cabe destacar que dentro de los dendrímeros funcionalizados con aminoácidos, la fenilalanina posee parámetros de toxicidad más ventajosos. Para concluir este apartado es importante remarcar que la experiencia clínica con dendrímeros aún es muy limitada, por lo que todavía es pronto para realizar generalizaciones sobre su seguridad. Sólo se puede hablar de dendrímeros seguros en relación con una aplicación Superficie Estrategia Tipo de dendrímero Citotoxicidad Hemólisis Referencias Pegilación PAMAM G4 PPI G5 IC50 = 0,79 ± 0,001 No toxicidad < 5 % ------- (Jevprasesphant, 2003) (Jain et al., 2010) Hidroxilación baja baja (Agashe et al., 2006) Acetilación baja baja (Agashe et al., 2006) Carbohidratos: - Galactosa - Manosa - Lactosa PLL G4 PPI G4 PPI G5 PPI G5 PPI G5 -------- -------- -------- Viabilidad celular 95,2% (C = 1mg/ml) Viabilidad celular 94,7 % (C = 1mg/ml) 7,3 ± 2,8 % 7,1 % 10 % 2,9 ± 0,6 % 2,2 ± 0,3 % (Jain et al., 2010) (Agashe et al., 2006) (Agashe et al., 2006) Aminoácidos: - Glicina - Fenilalanina PPI G5 PPI G5 Viabilidad celular 95,37% (C = 1mg/ml) Viabilidad celular 96,2% (C = 1mg/ml) 4,9 ± 0,2 % (C = 1 mg/ml tras 4h) 3,3 ± 0,4 % (C = 1 mg/ml tras 4h) (Agashe et al., 2006) (Agashe et al., 2006) Media generación (aniónicos, grupos COO-) PAMAM G3.5 No citotoxicidad hasta una C = 2 mg/ml Despreciable (Jain et al., 2010) Esqueleto dendrítico Poliéter Viabilidad celular > 98% hasta una C = 100 mg/ml ---------- (Jain et al., 2010) Poliéster No toxicidad hasta 250μg/ml ---------- (Jain et al., 2010) Triazina No toxicidad hasta 10 mg/Kg ---------- (Jain et al., 2010) Melamina No toxicidad hasta 10 mg/Kg ---------- (Jain et al., 2010) 23 específica que haya sido estudiada en profundidad. Aún quedan años de investigación para comprender a fondo su comportamiento, los mecanismos subyacentes, así como poder predecir posibles reacciones adversas. 4.2 Dendrímeros como sistemas transportadores de fármacos El alto nivel de control posible sobre el diseño de los dendrímeros hace que sean muy atractivos como sistemas de transporte y liberación controlada de fármacos (Palmerston Mendes et al., 2017) (Onoue et al., 2014). 4.2.1 Estrategias del transporte de fármacos Los fármacos pueden ser transportados por los dendrímeros usando estrategias diferentes, ya sea atrapados en las cavidades internas de su estructura o conjugados con los grupos superficiales, mediante interacciones físicas o químicas (Safari y Zarnegar, 2014). 4.2.1.1 Conjugados dendrímero-fármaco. Ventajas de la superficie Las superficies de los dendrímeros pueden ser funcionalizadas con una gran variedad de fármacos u otros agentes, los cuales se obtienen por unión covalente o coordinación mediante interacciones electrostáticas de los fármacos con los grupos funcionales de la superficie del dendrímero (Onoue et al., 2014). De esta manera se formarían profármacos dendriméricos, que en condiciones fisiológicas liberarían el fármaco (Kumari et al., 2014). Así, una misma molécula de dendrímero es capaz de transportar múltiples moléculas de fármaco conjugadas directamente con sus grupos superficiales o a través de "linkers" o espaciadores. Estos "linkers" consisten en grupos lábiles que van a facilitar la escisión del complejo y modular la tasa de liberación del fármaco. Como ejemplos de estos "linkers" cabría mencionar los grupos amida, grupos éster, enlaces disulfuro (S-S), hidrazona o cisaconitil, los cuales son lábiles a pH ácido o susceptibles de la acción de ciertas enzimas (Wu et al., 2015). Además de portar sobre la superficie moléculas de fármaco, también es posible la conjugación con otras especies tales como agentes de diagnóstico (agentes de contraste), grupos con el objetivo de mejorar la solubilidad (p.e PEG), así como diferentes ligandos (p.e. ácido fólico, anticuerpos) para dirigir el transporte y aumentar la especificidad. Todo ello es posible en la misma molécula dendrítica (véase Figura 8). Por tanto, seleccionando estratégicamente la superficie del dendrímero es posible construir conjugados dendrímero-fármaco con estructuras muy definidas y propiedades específicas, como dotarlos de selectividad o mejorar sus condiciones de solubilidad. 24 Figura 8. Representación esquemática de un dendrímero PAMAM G3 y la variedad de agentes que pueden interaccionar con él: fármacos (encapsulación o conjugación a la superficie), agentes de contraste, material genético (interacción electrostática), otros tipos de ligandos como agentes solubilizantes y aquellos destinados a aumentar la especificidad (ácido fólico, anticuerpos, etc.). Ilustración de elaboración propia. 4.2.1.2 Receptáculos nanoscópicos: capacidad de encapsulación Los dendrímeros poseen cavidades internas que suponen un nano ambiente protegido del exterior por la superficie del dendrímero, e ideales para la encapsulación de moléculas y su posterior liberación controlada (Kesharwani et al., 2014). Esta encapsulación del fármaco en el interior del dendrímero se debe a una asociación no covalente, que se puede producir por simple atrapamiento físico, puentes de hidrógeno, interacciones electrostáticas o hidrofóbicas (Onoue et al., 2014). Se ha observado que se produce la formación de puentes de hidrógeno entre los fármacos y los grupos amino del interior del dendrímero, así como puentes de hidrógeno e interacciones electrostáticas con los grupos amino de la superficie (Palmerston Mendes et al., 2017). Además, en el caso de dendrímeros con interiores hidrofóbicos y una periferia con cierto carácter hidrófilo se puede apreciar un comportamiento parecido al de las micelas, que se 25 aprovecha para atrapar fármacos de baja solubilidad (Esfand y Tomalia, 2001). Así, las moléculas activas hidrofóbicas se asocian con el núcleo dendrimérico de la misma naturaleza (Svenson y Tomalia, 2005) (Ambade et al., 2005). Este fenómeno de encapsulación fue denominado por Meijer como "caja dendrítica" o por Tomalia como "encapsulación unimolecular" (Svenson y Tomalia, 2005). Las cajas dendríticas, por tanto, se caracterizan por una cubierta superficial muy densa constituida por la formación de puentes de hidrógeno entre los grupos funcionales adyacentes del dendrímero, y unos espacios internos que albergarán las moléculas huésped (Kesharwani et al., 2014). La cantidad máxima de moléculas huésped que un dendrímero es capaz de albergar es directamente proporcional a la forma y tamaño de estas moléculas, así como de la cantidad, forma y tamaño de las cavidades internas disponibles en el dendrímero (Esfand y Tomalia, 2001). De esta manera, los dendrímeros de mayor G van a presentar un mayor número de cavidades internas, permitiéndole albergar una cantidad más elevada de moléculas. Sin embargo, el aumento en la generación trae consigo el incremento en la densidad de grupos superficiales, que dará lugar a una gran congestión estérica. Esto último permite proteger el interior dendrimérico del medio externo y favorecer una conformación del dendrímero más compacta (Wu et al., 2015). Este fenómeno se denomina como "deGennes dense packing" (empaquetamiento denso de deGennes) y suele ocurrir alrededor de la G7-10 (Choudhary et al., 2017). Los dendrímeros de menor generación (G0-3) tienen una estructura más abierta y flexible, y conforme aumenta G pasan por estructuras semirígidas con cierta permeabilidad (G4- 6) hasta estructuras de limitado acceso debido a una superficie más congestionada (G7-10) (Esfand y Tomalia, 2001). Este hecho, por tanto, va a condicionar el grado de accesibilidad y liberación de moléculas de fármacos, como puede observarse en la Figura 9. La estructura dendrítica, la fuerza de las interacciones intramoleculares entre los grupos funcionales adyacentes en el dendrímero y las condiciones del medio (pH, polaridad, fuerza iónica) juegan un papel importante en el fenómeno de empaquetamiento denso de de Gennes (Svenson y Tomalia, 2005). Estos factores se pueden modificar para modular la encapsulación y la tasa de liberación de las moléculas de fármaco (Choudhary et al., 2017), como se discutirá más adelante. Figura 9. Flexibilidad/congestiónen función de la generación del dendrímero (Tomalia, 2005) 32 penetración del ADN en el interior del dendrímero, lo que puede afectar y complicar la liberación de la molécula de ADN del complejo previa entrada al núcleo. Sin embargo, esta penetración puede controlarse por la relación de cargas dendrímero/ADN (Maiti y Bagchi, 2006). Como se puede observar en la Figura 10c, para dendrímeros de menor generación (G3 y G4), este enrollamiento o "wrapping" no se produce, sino una adsorción a la superficie del dendrímero, configurando una unión de carácter más débil debido al menor número de cargas positivas (R <1), y se observa que la cadena de ADN tiene una conformación más estirada (Nandy y Maiti, 2011). Además, presenta un menor grado de flexión y acortamiento de la cadena como puede observase en la Figura 11a y 12a. Figura 10. Cambios conformacionales durante la formación del complejo dendrímero-ADN en un intervalo de nanosegundos, para dendrímeros PAMAM: a) G5; b) G4; y c) G3 (Nandy et al., 2012). Figura 11. Flexión global de la molécula de ADN inducida por dendrímeros en función del tiempo, para dendrímeros PAMAM a) G3; b) G4; c) G5 (Nandy y Maiti, 2011). 33 Figura 12. Porcentaje de acortamiento de la cadena de ADN inducida por dendrímeros en función del tiempo, para dendrímeros PAMAM a) G3; b) G4; c) G5 (Nandy y Maiti, 2011). 4.3.4 Termodinámica de la complejación Tabla 7. Parámetros termodinámicos, obtenidos de dinámicas moleculares, de los complejos formados por dendrímeros PAMAM G3, G4 y G5 y una secuencia de ds-DNA de 38 pb. Como ya se ha comentado, el dendrímero va a compactar el ADN para su transporte. Esto se logra mediante la neutralización parcial de las cargas negativas del ADN por el dendrímero cargado positivamente. Durante la complejación, la carga del ADN se apantalla debido a la unión del dendrímero a su estructura. En la Tabla 7 se recogen las variaciones de entalpía (ΔH), entropía (ΔS) y energía libre (ΔG) correspondientes al proceso de complejación existente entre dendrímeros PAMAM de varias generaciones (G3, G4 y G5) y el ADN, obtenidos a partir de datos de dinámica molecular. A medida que la generación del dendrímero aumenta, y con ella la relación de cargas dendrímero/ADN, la interacción electrostática es más significativa. Como consecuencia, las energías libres de interacción toman valores cada vez más negativos y el proceso está más favorecido desde el punto de vista termodinámico (véase Tabla 7). Por otro lado, la tabla refleja una pérdida de entropía en el sistema debida a la naturaleza del proceso de complejación que limita los grados de libertad del sistema. Además, el Complejo Cargas dendrímero Cargas ADN Relación de cargas (R) ΔH (kcal/mol) - TΔS (kcal/mol) ΔG (kcal/mol) Referencias G3-ADN + 32 - 74 0,43 - 253,78 ± 5,75 7,506 - 246,27 (Nandy y Maiti, 2011) G4-ADN + 64 - 74 0,86 - 789,71 ± 10,78 53,191 - 736,52 (Nandy y Maiti, 2011) G5-ADN + 128 - 74 1,72 - 1283,42 ± 16,07 52,862 - 1230,56 (Nandy y Maiti, 2011) 34 término entrópico aumenta con la generación del dendrímero y la relación de cargas. Sin embargo, esta disminución de entropía es compensada por el término entálpico, donde la contribución electrostática juega un papel fundamental. Por otra parte, el papel de los contraiones del sistema resulta relevante, ya que la liberación de contraiones de ambos sustratos, Na+ para el DNA y Cl- en el dendrímero, en el proceso de complejación induce una ganancia entrópica adicional sobre el sistema. Por tanto, la energía libre de complejación está dominada por el término entálpico y la ganancia de entropía de los contraiones. 4.4 Ventajas de los dendrímeros frente a la administración clásica de fármacos Los sistemas transportadores de compuestos activos basados en dendrímeros junto con los citados más adelante (liposomas y nanopartículas), los cuales se engloban dentro de la nanotecnología aplicada a la medicina, van a presentar una serie de ventajas comparadas con la administración convencional de fármacos:  permiten aumentar la solubilidad de principios activos en los fluidos fisiológicos y, consecuentemente, un aumento en la biodisponibilidad  constituyen un ambiente de protección para evitar la rápida degradación o aclaramiento (aumento de estabilidad)  favorecen la acumulación en el sitio de acción  permiten el transporte dirigido o vectorización de moléculas activas a la diana terapéutica, con el consiguiente aumento de la selectividad y minimización de las reacciones adversas.  consiguen una liberación controlada y/o sostenida del agente terapéutico para mantener los niveles plasmáticos de fármacos y poder reducir la frecuencia de dosificación y la dosis de fármaco requerida. Estos vectores destacan sobre todo en su aplicación en terapias anticancerosas y antiinfecciosas, ya que los fármacos empleados en esos casos generan gran cantidad de reacciones adversas asociadas a la falta de especificidad y a su amplia biodistribución. Por tanto, este tipo de transportadores cobran gran importancia a la hora de desarrollar nuevas formas terapéuticas con el objetivo de solucionar algunos de los problemas a los que se enfrentan muchos fármacos, tanto a nivel de formulación (mejoras en la estabilidad, solubilidad..), como en cuanto a resultados terapéuticos y toxicidad asociada, mejorando la eficacia y seguridad (Wilczewska et al., 2012) (Safari y Zarnegar, 2014) (Ochekpe et al., 2009). 35 4.5 Análisis comparativo entre dendrímeros y otros vectores A continuación se van a exponer algunas de las ideas que se pueden extraer de la Tabla 8. A partir de los datos de la columna de toxicidad se pueden realizar las siguiente conclusiones:  Los dendrímeros presentan niveles más bajos de toxicidad en comparación con AuNPs y liposomas. Este hecho se corresponde con valores más elevados de IC50. Vector Toxicidad (IC50) Eficiencia de encapsulación o conjugación (%) Eficiencia de Transfección (%) ΔG Vector/ADN Dendrímeros (PAMAM G4) >10 mg/ml (Fischer et al., 2003) PAMAM G4- Doxorrubicina (encapsulación) ~ 100% PAMAM G4 78 ± 6,8 PAMAM G5 25,69 ± 3,8 PAMAM G6 13,1 ± 0,78 (Shakhbazau et al., 2010) (PAMAM G4:ADN) - 736,5 kcal/mol (Nandy y Maiti, 2011) Nanopartículas de oro (AuNPs) (1,2 nm) :140 (1,8 nm) : 30 (mmol/L) (Pan et al., 2007) (5 nm) : 50μM (15 nm) : 100 μM (Coradeghini et al., 2013) (30 nm) : 13,9 (50 nm) : 15,4 (90 nm) : 17,5 (μg/ml) (Mateo et al., 2015) AuNPs-NH3+: 1± 0,5 μM AuNPs-COO-: 7,37 μM (Goodman et al., 2004) AuNPs-CMquitosan- Doxorrubicina (conjugación) 83,3% (Madhusudhan et al., 2014) --------------- AuNP-SS-ADN (AuNP 20,2 nm) - 9,6 Kcal/mol (Lang, 2010) Liposomas neutro PC:Chol (4:1) 954 nmol/ml aniónico PC:Chol:PS > 2000 nmol/ml catiónico PC:Chol:SA 20 nmol/ml (Parnham y Wetzig, 1993) Liposoma- Doxorrubicina (EPC/Colesterol=5:5 ) (encapsulación) 50,3% (Takeuchi et al., 1999) DC- Chol/DOPE:ADN 25% PEG-DC- Chol/DOPE:ADN 15% (Zhang et al., 2010) Chol/DOPE:ADN - 7,7 kcal/mol (Keller et al., 2003) 36  En el caso de las AuNPs, existe una relación directa entre tamaño y toxicidad, presentando menor grado de toxicidad las nanopartículas de menor tamaño(  2nm). A partir de un tamaño superior a los 5nm, la toxicidad comienza de nuevo a aumentar con el tamaño del sistema, teniendo éstas una biodistribución más amplia y una mayor acumulación en órganos y tejidos. (Aillon et al., 2009) (Al-Qadi y Remuñán-López, 2009).  La toxicidad de las AuNPs es dependiente de la densidad de carga que le aporta la funcionalización de su superficie. Tras comparar AuNPs catiónicas (grupos amonio) y aniónicas (grupos carboxilato), ambas del mismo tamaño (2 nm), se observa que la toxicidad es mayor para las AuNPs de carácter catiónico. Este hecho se plantea en numerosos estudios que afirman que la carga positiva interacciona con las membranas biológicas produciendo su disrupción y lisis celular; mientras que la naturaleza aniónica de AuNP-COO- limitaría la interacción con las membranas por repulsión electrostática (Jia et al., 2017) (Goodman et al., 2004) (Aillon et al., 2009) (Al-Qadi y Remuñán- López, 2009).  La toxicidad de los liposomas van a ser más relevante en el caso de liposomas catiónicos, pero aún así su toxicidad no es significativa ya que sus componentes lipídicos van a ser degradados fácilmente por el organismo. En cuanto a la eficiencia de encapsulación (dendrímeros, liposomas) y/o conjugación (AuNPs), se observa que la capacidad de carga de los liposomas con moléculas activas es mucho más reducido si se compara con dendrímeros y AuNPs. Esto podría deberse a la inestabilidad química de este tipo de vector, ya que la hidrólisis y/o oxidación de los lípidos que componen su estructura supondrían la ruptura de la vesícula transportadora liberando el contenido de manera prematura. En términos de eficiencia de transfección se puede decir lo siguiente:  Es superior en el caso de los dendrímeros.  Existe una relación inversa entre la generación del dendrímero y su eficiencia de transfección. Algunos autores lo atribuyen a un aumento en el número de cavidades internas hidrofóbicas con la generación del dendrímero, que junto con los grupos superficiales hacen que el dendrímero adquiera un carácter más hidrofóbico e interaccione de esta manera con el ADN dificultando su posterior liberación intracelular (Shakhbazau et al., 2010).  En los liposomas se puede observar que la transfección disminuye con la pegilación de su superficie. Esto se puede deber a su carácter hidrófilo y neutro que va a dificultar la entrada a la célula y su liberación del endosoma una vez internalizado. 37 Otro término que se emplea como objeto de comparación es el incremento en energía libre (ΔG) del proceso de complejación vector-ADN. Se puede decir que a valores más negativos de ΔG, el proceso de formación del complejo está más favorecido, y podría significar un mayor grado de compactación del ADN. El proceso de complejación está más favorecido en el caso del dendrímero en comparación con liposomas y AuNPs. En líneas generales, y para estos ejemplos concretos, se podría decir que los dendrímeros presentan algunas ventajas con respecto a liposomas y AuNPs, como es una menor toxicidad, una mayor capacidad para transportar moléculas activas y un proceso de complejación con ADN más favorable. 5. CONCLUSIONES De la elaboración de esta revisión bibliográfica se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1. La toxicidad de los dendrímeros está relacionada, fundamentalmente, con la densidad de carga y el tamaño que poseen. Así, los dendrímeros catiónicos y de más alta generación son comparativamente más tóxicos que los aniónicos y aquellos de menor generación. Además, el tipo de amina presente en la estructura del dendrímero también afecta, aunque en menor grado, a su toxicidad, siendo los dendrímeros PAMAM menos tóxicos que los PLL o PEI. 2. Algunas de las estrategias para reducir la toxicidad consiste en la modificación de la carga superficial, entre las que destacan la pegilación, hidroxilación, acetilación o incorporación de grupos aniónicos; así como también el empleo de esqueletos dendríticos más biocompatibles y biodegradables como por ejemplo dendrímeros poliéter, poliéster, triazina, melamina. 3. Los dendrímeros de mayor generación sufren una excreción renal más lenta y una mayor acumulación en órganos. Los dendrímeros catiónicos son eliminados más rápidamente y se acumulan en hígado y/o riñón en mayor medida que los aniónicos. 4. El transporte de fármacos a su diana terapéutica se consigue mediante conjugación y/o encapsulación en las cavidades internas del dendrímero. La capacidad de carga y liberación posterior está influenciada por la flexibilidad/compactación de la estructura dendrítica. 5. Gracias a la densidad de carga positiva, los dendrímeros son capaces de compactar el ADN y otros polímeros para su transporte. Además, el mecanismo de complejación entre las dos macromoléculas está regido por interacciones electrostáticas, y supondrá una serie de cambios conformacionales por parte de ambas. En el caso particular del ADN, el grado de compactación depende, fundamentalmente, de la generación del dendrímero y, en consecuencia, de la relación de cargas dendrímero/ADN, así como de 38 las condiciones del medio (pH, concentración salina).Los parámetros termodinámicos indican que el proceso de complejación está más favorecido en el caso de dendrímeros de mayor generación con R>1. En el campo de la terapia génica destacan por generar menos efectos adversos y una menor respuesta inmunogénica. 6. Los dendrímeros suponen un avance hacia el desarrollo de nuevas formulaciones de agentes terapéuticos al presentar una menor toxicidad, una mayor capacidad de transporte de moléculas activas y un proceso de complejación más favorable que en el caso de liposomas y AuNPs. Aún así, todas estas propiedades van a depender de la composición, tamaño y funcionalización de cada uno de los vectores. 6. BIBLIOGRAFÍA Abbasi E, Aval S, Akbarzadeh A, Milani M, Nasrabadi H, Joo S, et al. 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