Bases moleculares de la desmielinización causada por mutaciones en el gen GJA1 que codifica la conexina 43 astrocitaria.

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA BASES MOLECULARES DE LA DESMIELINIZACIÓN CAUSADA POR MUTACIONES EN EL GEN GJA1 QUE CODIFICA LA CONEXINA 43 ASTROCITARIA TESIS DOCTORAL ADELA ESCUDERO LÓPEZ BASES MOLECULARES DE LA DESMIELINIZACIÓN CAUSADA POR MUTACIONES EN EL GEN GJA1 QUE CODIFICA LA CONEXINA 43 ASTROCITARIA Tesis doctoral presentada por: ADELA ESCUDERO Para optar al grado de Doctora en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica por la Universidad de Sevilla Dirigida por los Doctores: LUIS C. BARRIO CALVO JESÚS MOLANO MATEOS Unidad de Neurología Experimental. Departamento de Investigación. Hospital Ramón y Cajal Unidad de Genética Molecular. Instituto de Genética Médica y Molecular. Hospital Universitario La Paz. Madrid 2017 ABREVIATURAS A Sensibilidad al voltaje. Parámetro de la función de Boltzmann A:A Acoplamiento astrocito-astrocito aa Aminoácido AD Herencia autosómica dominante A:E Acoplamiento astrocito-célula ependimaria ADN Ácido desoxirribonucleico ADNc Región codificante del ácido desoxirribonucleico AQP4 Transportador acuaporina-4 ARNm Ácido ribonucleico mensajero ATP Adenosín trifosfato AR Herencia autosómica recesiva Ca2+ Ión calcio Cl- Ión cloro CBX Carbenoxolona CF Carboxifluoresceína CNP 2',3'-nucleótido cíclico 3'-fosfodiesterasa CQ Cloroquina CT Dominio carboxilo terminal Cx Conexina Cx43WT Conexina 43 silvestre (wild type) DMEM Medio Dulbecco dKO Ratón al que se le ha anulado la expresión de dos genes, del inglés Knock-out dsRED Proteína fluorescente roja E1-E2 Dominio del asa extracelular primera - segunda EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EGFP Proteína fluorescente verde EGTA Ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N'N'-tetraacético Er Potencial de reversión F Segregación familiar FGF2 Factor de crecimiento fibroblástico 2 GFAP Proteína ácida fibrilar glial gh / Gh Conductancia macroscópica de los hemicanales (sin normalizar/normalizada) GJ Del inglés “Gap junction” uniones o placas en hendidura gj / Gj Conductancia macroscópica intercelular (sin normalizar/normalizada) Gjmax Conductancia intercelular máxima normalizada Gjmin Conductancia intercelular mínima normalizada gji / Gji Valor inicial de la conductancia intercelular (sin normalizar /normalizado) gjss / Gjss Valor de estado de la conductancia intercelular (sin normalizar /normalizado) h.d.a. Horas después del apareamiento h.d.i Horas después de la inyección Ih Corriente de hemicanal Ij Corriente intercelular Im Corriente transmembrana Imin / Imax Valor minimo/máximo de corriente transmembrana K+ Ión potasio LCR Líquido cefalorraquideo MAG Glucoproteína asociada a la mielina MBP Proteína básica de la mielina Mg2+ Ión magnesio MOG Glucoproteína oligodendrocitaria de la mielina MOPS Ácido 3-(ALmorfolín)propanosulfónico Na+ Ión sodio NAD+ Nicotinamida adenina dinucleótido N2a Línea celular de neuroblastoma de ratón N.A No acoplado NB Neurobiotina ND No descrito n.s. Diferencia no significativa estadísticamente NT Dominio amino terminal O:A Acoplamiento oligodendrocito-astrocito ODDD Displasia oculo-dento-digital O:O Acoplamiento oligodendrocito-oligodendrocito PBS Tampón fosfato salino PCR Reacción en cadena de la ADN polimerasa PDGFα Factor de crecimiento derivado de plaquetas PGE2 Prostaglandina E2 o dinoprostona PMD PMLD Enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher Enfermedad tipo Pelizaeus-Merzbacher Ratón KI Ratón al que se le ha insertado una mutación en un gen, del inglés Knock-in Ratón KO Ratón al que se le ha anulado la expresión de un gen , del inglés Knock-out R.E. Retículo endoplasmático RMN Resonancia magnética nuclear S Origen esporádico SB Sustancia blanca SDS Dodecilsulfato sódico SG Sustancia gris SNC Sistema nervioso central SPG Paraparesia espástica TM1, TM2, TM3 y TM4 Dominios transmembrana: primero, segundo, tercero y cuarto UTR Del inglés “UnTranslated Region”, región del gen no traducida U.A Unidades arbitrarias Vh Potencial de fijación Vj Potencial o voltaje intercelular Vm Potencial de membrana V0 Voltaje en el que la conductancia se reduce a la mitad. Parámetro de función de Bolztmann YP Yoduro de propidio Z Carga asociada al sensor RESUMEN Existe un grupo patologías de la mielina de etiología autoinmune y genética que se originan por alteraciones en moléculas claves implicadas en los mecanismos gliales que mantienen la integridad de la mielina en el sistema nervioso central. Entre ellas se encuentra la displasia oculodentodigital (ODDD), una enfermedad de herencia autosómica dominante causada por mutaciones en el gen GJA1 que codifica la conexina 43 (Cx43), y que se caracteriza por anomalías esqueléticas, malformaciones craneofaciales y que en ocasiones también cursa con paraparesia espástica, una patología causada por desmielinización. Sin embargo, se desconocen los mecanismos a través de los cuales las mutaciones dominantes de ODDD en la Cx43 astrocitaria pueden causar la destrucción de la mielina formada por los oligodendrocitos. Con este objetivo, en una primera etapa se realizaron los estudios genéticos en el gen GJA1 de pacientes con paraparesia espástica asociada a un fenotipo de ODDD y se identificaron en heterocigosis las mutaciones pR148Q y pV85M y en una segunda etapa, se realizó el su ensayo funcional. Los resultados de este ensayo muestran que la función de hemicanal y la función de adhesión de los canales intercelulares están preservadas en las dos mutaciones, sin embargo ambas mutaciones abolen la función de comunicación intercelular ya que los canales que forman no son funcionales. En la condición de heteocigosis de los pacientes, las dos mutaciones ejercen un potente efecto de inhibición dominante sobre el acoplamiento intercelular inducido por la Cx43 silvestre formando canales consigo misma y con la Cx47 oligodendrocitaria. Estos resultados sugieren que la desmielinización causante de la paraparesia espástica en los pacientes con displasia oculodentodigital podría originarse como consecuencia de la significativa reducción de la comunicación intercelular astrocito-astrocito y astrocito-oligodendrocito; esta vía de comunicación glial es esencial en el mecanismo de aclaramiento de los iones K+, que se acumulan en la región periaxonal internodal de las fibras mielínicas durante la conducción saltatoria, hasta el lecho vascular o al líquido cefalorraquídeo. ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 1 1.1 COMPOSICIÓN, FUNCIÓN y PATOLOGÍAS DE LA MIELINA EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL ............................................................................................................................................ 2 1.2 ESTRUCTURA, FUNCIÓN Y PAPEL FISIOLÓGICO DE LAS CONEXINAS .......................... 5 1.3 SINCITIO PANGLIAL ............................................................................................................... 7 1.3.1 COMUNICACIÓN ASTROCITO-ASTROCITO ..................................................................... 8 1.3.2 COMUNICACIÓN INTERCELULAR ASTROCITO - CÉLULAS EPENDIMARIAS ..............11 1.3.3 COMUNICACIÓN INTERCELULAR ASTROCITO - OLIGODENDROCITO .......................11 1.4 FUNCIÓN DEL SINCITIO PANGLIAL EN EL MECANISMO DE TAMPONAMIENTO DE POTASIO PERIAXONAL ....................................................................................................................12 1.5 PATOLOGÍAS CON AFECTACIÓN DE LA MIELINA ASOCIADAS A MUTACIONES EN GENES DE CONEXINAS GLIALES. MECANISMOS PATOGÉNICOS. .............................................13 1.6 HIPÓTESIS .............................................................................................................................23 II. OBJETIVOS ...................................................................................................................................24 III. MATERIAL Y MÉTODOS ...............................................................................................................26 3.1 ESTUDIOS GENÉTICOS........................................................................................................27 3.2 CONSTRUCCIÓN DE LOS VECTORES DE EXPRESIÓN ....................................................27 3.2.1 CONSTRUCCIÓN DE LOS VECTORES pBSXG ...............................................................27 3.2.2 CONSTRUCCIÓN DE LOS VECTORES pIRES .................................................................30 3.3 SISTEMAS DE EXPRESIÓN ..................................................................................................30 3.3.1 ENSAYO FUNCIONAL EN OOCITOS DE Xenopus laevis ................................................30 3.3.1.1 TRANSCRIPCIÓN IN VITRO ......................................................................................33 3.3.1.2 OBTENCIÓN, PREPARACIÓN Y MICROINYECCIÓN DE LOS OOCITOS ...............33 3.3.1.3 ANÁLISIS DE EXPRESIÓN TOTAL Y EN LA SUPERFICIE CELULAR .....................34 3.3.1.1 ESTUDIOS DE CAPTACIÓN DE COLORANTE EN OOCITOS AISLADOS ..............37 3.3.1.2 REGISTROS ELECTROFISIOLÓGICOS ...................................................................37 3.3.2 ENSAYO FUNCIONAL EN LA LÍNEA CELULAR N2a ........................................................40 3.3.2.1 CONDICIONES DE CULTIVO Y TRANSFECCIÓN EN LA LÍNEA CELULAR N2a ....40 3.3.2.2 ANÁLISIS DE EXPRESIÓN TOTAL EN LA LÍNEA CELULAR N2a ............................40 3.3.2.3 INMUNOCITOQUÍMICA EN LA LÍNEA CELULAR N2a ..............................................41 3.3.2.4 TRANSFERENCIA INTERCELULAR DE COLORANTE EN LA LÍNEA CELULAR N2a 41 3.3.3 ENSAYO FUNCIONAL EN CULTIVOS PRIMARIOS DE ASTROCITOS HUMANOS ........42 3.3.3.1 CONDICIONES DE CULTIVO Y TRANSFECCIÓN EN CULTIVO PRIMARIO DE ASTROCITOS HUMANOS ........................................................................................................42 3.3.3.2 ANÁLISIS DE EXPRESIÓN TOTAL EN CULTIVO PRIMARIO DE ASTROCITOS HUMANOS ................................................................................................................................43 3.3.3.3 INMUNOCITOQUÍMICA EN CULTIVO PRIMARIO DE ASTROCITOS HUMANOS ...43 3.3.3.4 TRANSFERENCIA INTERCELULAR DE COLORANTE EN CULTIVO PRIMARIO DE ASTROCITOS HUMANOS ........................................................................................................43 3.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ..........................................................................................................43 IV. RESULTADOS ...............................................................................................................................45 3.5 IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN GJA1 EN PACIENTES CON PARAPARESIA ESPÁSTICA ASOCIADA A DISPLASIA OCULODENTODIGITAL. ..........................46 3.6 ENSAYO FUNCIONAL DE LAS MUTACIONES IDENTIFICADAS EN LA CONEXINA-43 ASOCIADAS A PARAPARESIA ESPÁSTICA ....................................................................................49 3.6.1 BIOSINTESIS Y FUNCIONALIDAD DE LOS HEMICANALES MUTADOS DE Cx43 .........49 3.6.1.1 NIVELES DE EXPRESIÓN TOTAL Y EN MEMBRANA PLASMÁTICA DE LOS MUTANTES DE Cx43. TASA DE DEGRADACIÓN. ..................................................................49 3.6.1.2 PERMEABILIDAD A YODURO DE PROPIDIO. REGULACIÓN POR LA CONCENTACIÓN EXTRACELULAR DE CATIONES DIVALENTES. .......................................53 3.6.1.3 CORRIENTES DE LOS HEMICANALES. REGULACIÓN POR EL POTENCIAL DE MEMBRANA (Vm). ....................................................................................................................55 3.6.1.4 FORMACIÓN Y FUNCIONALIDAD DE LOS CANALES INTERCELULARES MUTADOS . ...............................................................................................................................59 3.6.1.5 FORMACIÓN DE UNIONES EN HENDIDURA ...........................................................59 3.6.1.6 ESTUDIOS DE ACOPLAMIENTO INTERCELULAR POR COLORANTE. .................59 3.6.1.7 ESTUDIOS DE ACOPLAMIENTO ELÉCTRICO INTERCELULAR. ............................61 3.6.1.8 DEPENDENCIA DEL VOLTAJE INTERCELULAR DE LOS CANALES INTERCELURES MUTADOS. ...................................................................................................64 3.6.1.9 EFECTO DE INHIBICIÓN DOMINANTE DE LAS MUTACIONES DE Cx43 SOBRE EL ACOPLAMIENTO INTERCELULAR INDUCIDO POR LA Cx43 ENDÓGENA EN UNA LÍNEA PRIMARIA DE ASTROCITOS HUMANOS. ...............................................................................69 3.6.2 INTERACCIÓN ENTRE LAS CONEXINAS SILVESTRE Y MUTADAS CON LA CONEXINA-30 ASTROCITARIA. ....................................................................................................72 3.6.2.1 EFECTO DE TRANSREGULACIÓN DE LA Cx43 SILVESTRE SOBRE LA EXPRESIÓN DE LA Cx30. ........................................................................................................72 3.6.2.2 FORMACIÓN DE UNIONES EN HENDIDURA DE Cx43 Y Cx30 ...............................74 3.6.2.3 ESTUDIOS DE ACOPLAMIENTO INTERCELULAR POR COLORANTE DE Cx43 Y Cx30 74 3.6.2.4 ESTUDIOS DE ACOPLAMIENTO ELÉCTRICO DE Cx43 y Cx30. DEPENDENCIA DE VOLTAJE INTERCELULAR (Vj) ................................................................................................77 3.6.2.5 Efecto de las mutaciones R148Q y V85M sobre el acoplamiento intercelular de Cx30 77 3.6.3 INTERACCIÓN ENTRE LAS CONEXINAS-43 SILVESTRE Y MUTADAS ASTROCITARIAS Y LA CONEXINA-47 OLIGODENDROCITARIA. ...............................................84 3.6.3.1 FORMACIÓN DE PLACAS INTERCELULARES ENTRE LAS Cx43 MUTADAS Y LA Cx47………….. ..........................................................................................................................84 3.6.3.1 ESTUDIOS DE ACOPLAMIENTO INTERCELULAR POR COLORANTE ENTRE LAS UNIONES HETERÓLOGAS FORMADAS POR LOS MUTANTES DE Cx43 Y LA Cx47. ........86 3.6.3.2 ESTUDIOS DE ACOPLAMIENTO ELÉCTRICO DE LOS CANALES FORMADOS POR LA Cx43 SILVESTRE Y MUTADAS CON LA Cx47. DEPENDENCIA DEL VOLTAJE INTERCELULAR........................................................................................................................87 V. DISCUSIÓN ....................................................................................................................................94 6.1 CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO DE LAS MUTACIONES DE ODDD ASOCIADAS A PARAPARESIA ESPÁSTICA..............................................................................................................96 6.2 SÍNTESIS Y FUNCIONALIDAD DE LOS HEMICANALES MUTADOS .....................................97 6.3 COMUNICACIÓN ASTROCITARIA. EFECTO DE LAS MUTACIONES SOBRE EL ACOPLAMIENTO MEDIADO POR Cx43 Y POR Cx30. .....................................................................98 6.4 COMUNICACIÓN OLIGODENDROASTROCITARIA. EFECTO DE LAS MUTACIONES SOBRE EL ACOPLAMIENTO MEDIADO POR Cx43-Cx47. ............................................................103 VI. CONCLUSIONES .........................................................................................................................106 VII. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................108 1 I. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 8 con los oligodendrocitos (A:O) y los oligodendrocitos entre sí (O:O) (Rash, Yasumura et al. 2001) (Figura 3, Tabla2). 1.3.1 COMUNICACIÓN ASTROCITO-ASTROCITO Los astrocitos expresan de forma mayoritaria la Cx43 seguida por la Cx30 mientras que sólo algunos expresan la Cx26 (Dermietzel, Traub et al. 1989; Dahl, Manthey et al. 1996; Nagy, Patel et al. 1999; Rash, Yasumura et al. 2001; Zahs, Kofuji et al. 2003; Altevogt and Paul 2004). En la especie humana, la Cx43 se expresa, a partir del duodécimo día de gestación, en astrocitos de sustancia blanca y sustancia gris así como en los pies astrocitarios perivasculares (Dermietzel, Traub et al. 1989; Kunzelmann, Schroder et al. 1999) mientras que la conexina 30 no se expresa hasta la tercera semana de vida en sustancia gris, donde colocaliza con Cx43 (Kunzelmann, Schroder et al. 1999; Nagy, Patel et al. 1999). La Cx26 a diferencia de las otras dos, se expresa de forma minoritaria, únicamente en algunos astrocitos de las leptomeninges y de regiones subcorticales del cerebro (Nagy, Lynn et al. 2011) . Los estudios in vitro de compatibilidad muestran que la Cx43 no se combina con la Cx26 (Elfgang, Eckert et al. 1995) ni con la Cx30, aunque hay controversia (Manthey, Banach et al. 2001; Orthmann-Murphy, Freidin et al. 2007), a diferencia de la Cx30 que sí es capaz de formar canales funcionales heterotípicos y heteroméricos Cx26-Cx30 (Yum, Zhang et al. 2007). Estos datos sugieren que existen cuatro tipos diferentes de canales que median la comunicación astrocitaria: canales homoméricos de Cx43, Cx30, Cx26 y canales heterotípicos/heteroméricos de Cx26-Cx30. (Figura 3, Tabla2). Es importante esclarecer, además de la compatibilidad entre conexinas, qué canales tienen mayor peso en la comunicación intercelular en astrocitos. Para ello, varios investigadores realizaron estudios del acoplamiento in vivo en ratones deficientes en una o varias conexinas astrocitarias. Los ratones deficientes en conexina Cx43 y en Cx30 (dKO Cx43/Cx30) mostraron bloqueo por completo del acoplamiento en hipocampo y presentaban desmielinización y vacuolización (Lutz, Zhao et al. 2009; Maglione, Tress et al. 2010). Al estudiar ratones deficientes únicamente en Cx30 se observó una reducción del acoplamiento en hipocampo del 20% (Dere, De Souza-Silva et al. 2003) sin embargo, cuando eran deficientes en Cx43 se observaba en rodajas de cuerpo calloso, un aumento de la expresión de Cx30 y una reducción del acoplamiento del 50% sin alteración de la mielina. Dicha reducción es significativamente menor a la esperada por sobreexpresión compensadora de la Cx30 (Theis, Speidel et al. 2004), sugiriendo que la Cx26 y la Cx43 son las conexinas que menos y más contribuyen al acoplamiento respectivamente y que la Cx30 podría compensar, aumentando su expresión, aunque no sustituiría por completo el acoplamiento entre astrocitos carentes de Cx43 (Tabla 3). INTRODUCCIÓN 9 Figura 3. Sistemas de comunicación intercelular neuronal y glial. Composición del sincitio panglial: neuronas (N), astrocitos (A), oligodendrocitos (O) y células ependimarias (E) donde se indican las diferentes conexinas expresadas por cada tipo celular. La Cx36 se expresa en neuronas; Las conexinas Cx43, Cx30 y Cx26 se expresan en astrocitos; las conexinas Cx47, Cx32 y Cx31.3 en oligodendrocitos y las conexinas Cx43,Cx37 y Cx40 en células ependimarias. La tabla resume la compatibilidad homotípica y heterotípica existente entre conexinas astrocitarias, oligodendrocitarias y oligodendro-astrocitarias (el círculo rojo indica controversia entre autores) Cx43 Cx30 Cx26 Cx47 Cx32 Cx31.3 Cx36 Cx43 Cx30 Cx26 A:A O:O O:A Cx43, Cx30, Cx26 Cx47, Cx32, Cx31.3 Cx43, Cx30, Cx26 Cx47, Cx32 Lecho vascular INTRODUCCIÓN 10 Tabla 2. Expresión y compatibilidad de conexinas de la glía. Tipo de célula glial donde se expresa la conexina: astrocito (A), oligodendrocito (O); Localización: sustancia gris (SG), sustancia blanca (SB); Compatibilidad con otras conexinas, y tipo de comunicación intercelular: A:A (astroctito-astrocito) O:O (oligodendrocito-oligodendrocito) y O:A (astrocitooligodendrocito). Con * se indican las compatibilidades en las que hay controversia. Cx Tipo glial Localización Compatibilidad con otras Cx Tipo Cx43 A SG y SB Canales homotípicos Cx43 Canales heterotípicos Cx43-Cx30* Canales heterotípicos Cx43-Cx47 No forma canales con Cx26, Cx32 ni con Cx31.3 A:A A:A* A:O - Cx30 A SG Canales homotípicos Cx30 Canales heterotípicos Cx30-Cx26 Canales heterotípicos Cx30-Cx43* Canales heterotípicos Cx30-Cx32 No forma canales con Cx47 ni con Cx31.3 A:A A:A A:A* A:O - Cx26 A Leptomeninges y regiones subcorticales Canales homotípicos Cx26 Canales heterotípicos Cx26-Cx30 Canales heterotípicos Cx26-Cx32 No forma canales con Cx43, Cx47 ni con Cx31.3 A:A A:A A:O - Cx47 O SG y SB Canales homotípicos Cx47 Canales heterotípicos Cx47-Cx31.3 Canales heterotípicos Cx47-Cx43 No forma canales con Cx30, Cx26, ni con Cx32 O:O O:O O:A Cx32 O SB Canales homotípicos Cx32 Canales heterotípicos Cx32-Cx30 Canales heterotípicos Cx32-Cx26 No forma canales con Cx43, Cx31.3 ni con Cx47 O:O O:A O:A - Cx31.3 O SG Canales heterotípicos Cx47-Cx31.3 No forma canales homotípicos Cx31.3 ni forma canales heterotípicos con ninguna otra Cx O:O - INTRODUCCIÓN 11 1.3.2 COMUNICACIÓN INTERCELULAR ASTROCITO - CÉLULAS EPENDIMARIAS Las células ependimarias son células ciliadas en contacto con el líquido cefalorraquideo (LCR) especializadas en el transporte de K+ y de agua. Al igual que los astrocitos este tipo celular expresa Cx43 (Rash, Duffy et al. 1997) (Ochalski, Frankenstein et al. 1997) (Rash, Yasumura et al. 1998), Cx30 (Dere, De Souza-Silva et al. 2003; Sohl, Odermatt et al. 2004) y Cx26 (Dermietzel, Traub et al. 1989) y tiene la capacidad de comunicarse con otros ependimocitos o con otros astrocitos a través de canales homotípicos homoméricos de Cx43 (Rash, Duffy et al. 1997) (Figura 3). 1.3.3 COMUNICACIÓN INTERCELULAR ASTROCITO - OLIGODENDROCITO Los oligodendrocitos humanos expresan tres tipos de conexina: Cx47, Cx32 y Cx31.3 (Kleopa, Orthmann et al. 2004) (Figura 3). La Cx29 de ratón, ortóloga de la Cx31.3 humana, se expresa en las fibras mielínicas de la sustancia gris y en el tracto corticoespinal a nivel adaxonal así como en el soma del oligodendrocito (Altevogt, Kleopa et al. 2002); la conexina 32 es más abundante en sustancia blanca (Kleopa, Orthmann et al. 2004), se expresa en la capa más superficial de la mielina y dentro de la misma donde puede formar canales de “tipo reflexivo” entre las sucesivas lamelas dando lugar a una vía de comunicación intramielínica (Kamasawa, Sik et al. 2005) mientras que la Cx47 se expresa en sustancia gris y sustancia blanca y se localiza en el soma de los oligodendrocitos donde colocaliza con Cx32 (Odermatt, Wellershaus et al. 2003). Los estudios de acoplamiento in vitro indican que la Cx31.3 no es capaz de formar canales funcionales homoméricos homotípicos (Liang, Su et al. 2011) mientras que las conexinas Cx47 y Cx32 forman canales homoméricos homotípicos pero no homoméricos heterotípicos (Magnotti, Goodenough et al. 2011). Estos resultados sugieren que la comunicación oligodendrocito-oligodendrocito está mediada a través de canales homoméricos homotípicos de conexina 47 en su mayoría, canales homoméricos homotípicos de Cx32 y canales heteroméricos homotípicos de Cx32-31.3 (Altevogt, Kleopa et al. 2002; Orthmann-Murphy, Freidin et al. 2007; Magnotti, Goodenough et al. 2011) (Tabla 2). Los estudios in vivo de estas conexinas oligodendrocitarias muestran resultados contradictorios. Cuando se estudia el acoplamiento entre oligodendrocitos en ratones que carecen de ambas conexinas Cx47-KO y Cx32-KO no se observa acloplamiento (Maglione, Tress et al. 2010) mientras que los ratones deficientes en Cx47 sólo o en Cx32 presentan un acoplamiento muy reducido en algunos trabajos (Menichella, Goodenough et al. 2003; Wasseff and Scherer 2011) y apenas disminuido en otros (Scherer, Xu et al. 1998). Estos datos sugieren que ambas conexinas contribuyen al acoplamiento entre oligodendrocitos pero deja sin resolver cuál de las dos contribuye en mayor o menor medida a este tipo de acoplamiento (Magnotti, Goodenough et al. 2011) (Figura 4). Los oligodendrocitos se acoplan además de con ellos mismos con los astrocitos. Como los oligodendrocitos expresan tres tipos de conexinas, Cx47, Cx32 y Cx31.3 distintas a la que expresan los INTRODUCCIÓN 12 astrocitos, la Cx43, Cx30 y Cx26, este tipo de comunicación A: O está mediada por canales de tipo heterotípico. Los estudios de inmunocitoquímica muestran que la Cx43, Cx47 y Cx30 colocalizan en las uniones en hendidura presentes entre los somas de los oligodendrocitos y astrocitos mientras que las Cx32 y Cx30 colocalizan en la parte más externa de la vaina de mielina (Altevogt and Paul 2004; Kamasawa, Sik et al. 2005). En relación a la compatibilidad, los resultados obtenidos in vitro sugieren que podrían formarse hasta cuatro tipos de canales heterotípicos funcionales entre: Cx43 - Cx47, Cx30 - Cx47, Cx30 - Cx32 y Cx26 - Cx32, descartando la funcionalidad del resto de combinaciones: Cx43 - Cx32 y Cx26 - Cx47 (Orthmann-Murphy, Freidin et al. 2007) (Tabla 2). En los estudios in vivo en ratones deficientes en Cx47 el acoplamiento A:O disminuye drásticamente (Odermatt, Wellershaus et al. 2003) mientras que los ratones carentes de Cx32 tienen el nivel de acoplamiento A:O menos reducido (Wasseff and Scherer 2011) sugiriendo que el acoplamiento entre astrocitos y oligodendrocitos estaría mediado principalmente por canales heterotípicos de Cx47-Cx43 y Cx47-Cx30 (Tabla 3). Estos resultados junto con la expresión mayoritaria de Cx43 en astrocitos indican de forma indirecta que la contribución de canales heterotípicos Cx43-Cx47 podría ser mayor al resto de combinaciones en el acoplamiento astrocito-oligodendrocito. 1.4 FUNCIÓN DEL SINCITIO PANGLIAL EN EL MECANISMO DE TAMPONAMIENTO DE POTASIO PERIAXONAL El sincitio panglial juega un papel esencial en el tamponamiento de potasio liberado al espacio periinternodal tras la descarga de un potencial de acción. Este proceso llevado a cabo por una red de células gliales se produce de forma rápida y eficaz con el objetivo permitir la activación de los canales de sodio y por lo tanto la generación de nuevos potenciales de acción (Vabnick, Trimmer et al. 1999; Mert 2007). La generación de un potencial de acción requiere la entrada de sodio en el axón a través de canales Nav1 localizados en los nodos de Ranvier, lo que implica un aumento intracelular de la concentración de este ión desencadenando una despolarización de la membrana plasmática neuronal que desencadena la activación de los canales de potasio internodales dependientes de voltaje, Kv1, y como consecuencia la salida de este ión al exterior celular (Hodgkin and Huxley 1946). En los axones mielinizados el espacio periaxonal del internodo está aislado y puesto que sólo retorna al axón una pequeña parte del potasio que se libera, éste se acumula llegando a alcanzar concentraciones desde 2 mM a 20-100 mM. Este incremento en la concentración implica la existencia de un gradiente de voltaje desde el espacio periaxonal hasta los pies astrocitarios vasculares que va desde -120 hasta +160 mV que favorecería la difusión de potasio (David, Barrett et al. 1992; David, Barrett et al. 1993). El proceso de tamponamiento de potasio implica la entrada al interior de la mielina del ión potasio a través de canales de potasio o de hemicanales de conexina (Figura 4). Posteriormente, el potasio difundiría hacia las vainas más superficiales de mielina a través de canales homotípicos homoméricos de Cx32 de “tipo reflexivo” (Balice-Gordon, Bone et al. 1998; Kleopa, INTRODUCCIÓN 13 Orthmann et al. 2004; Kamasawa, Sik et al. 2005). Una vez que llegan a la superficie pasaría a los oligodendrocitos vecinos a través de canales homotípicos homoméricos de Cx32 o de Cx47 y a los astrocitos a través de canales homoméricos heterotípicos Cx47-Cx43 y Cx47-Cx30 o Cx32-Cx30. Al alcanzar los pies vasculares de los astrocitos el potasio difundiría a través de canales Kir 4.1 hasta a la luz de los capilares o a través de canales homoméricos homotípicos de Cx43 hasta las células ependimales y de ahí al LCR. La difusión de potasio va a asociada a un transporte de agua mediado por acuaporina-4 (AQP4) para compensar las variaciones de osmolaridad y un transporte de cloro que compensa el balance de cargas (Rash 2010). La red de células gliales interconectadas a través de conexinas permitiría por tanto reconstituir rápidamente unos niveles bajos de potasio en el espacio periaxonal generando un mecanismo altamente eficaz esencial para una correcta conducción saltatoria de los potenciales de acción. 1.5 PATOLOGÍAS CON AFECTACIÓN DE LA MIELINA ASOCIADAS A MUTACIONES EN GENES DE CONEXINAS GLIALES. MECANISMOS PATOGÉNICOS. Se han descrito mutaciones en tres genes de conexinas - GJC2 (Cx47), GJB1 (Cx32) y GJA1 (Cx43) -asociados a leucodistrofias hipomielinizantes o desmielinizantes caracterizadas por un defecto primario en el proceso de formación o mantenimento de la mielina: (Orthmann-Murphy, Salsano et al. 2009; Paznekas, Karczeski et al. 2009; Henneke, Gegner et al. 2010; Abrams and Freidin 2015). La primera leucodistrofia hipomielinizante descrita fue la enfermedad Pelizaeus Merzbacher (PMD, MIM ID #312080) en 1985 (Inoue 2005). Es una enfermedad ligada al cromosoma X, que aparece en los primeros meses de vida, causada por mutaciones en el gen PLP1 (locus Xq22) que codifica la proteína proteolipídica 1 (Inoue 2005) y cursa ataxia, movimientos coreoatetósicos, disartria, espasticidad progresiva y patrón hipomielinizante difuso en la resonancia magnética (Renier, Gabreels et al. 1981). Unos años después, se describió otra forma de leucodistrofia hipomielinizante, denominada PLMD o enfermedad tipo Pelizaeus Merzbacher (MIM ID #608804) (Henneke, Gegner et al. 2010). Esta enfermedad presenta herencia autosómica recesiva y aparece como consecuencia de mutaciones en el gen GJC2 (locus 1q41), que codifica la Cx47 (Bugiani, Al Shahwan et al. 2006); (Uhlenberg, Schuelke et al. 2004). Clínicamente la PMLD, indistinguible de la PMD, muestra una alta variabilidad dependiendo del tipo de mutación de forma que encontramos desde formas más graves (grado 0), caracterizadas por hipotonía, nistagmos y muerte prematura, hasta fenotipos más leves (grado 4) que cursan únicamente con paraparesia espástica en la primera o segunda década de la vida (SPG44, MIM ID #608803). Hasta la fecha no se han dilucidado los mecanismos patogénicos que causan la PMLD/SPG44 por mutaciones en Cx47, sin embargo si se han hecho estudios funcionales de algunas de estas mutaciones sugiriendo que el fenotipo de PMLD podría estar directamente relacionado con el 14 Tabla 3. Modelos de animales genéticamente modificados empleados en el estudio de conexinopatías causantes de alteraciones de la mielina. Conexina/s delecionada/s o mutada/s; tipo celular donde se expresa la conexina: oligodendrocito ( O) o astrocito (A); modelo genético : Knockout constitutivo (KO), Knock-in (KI), Knockout condicional (KO-c) o doble Knock-out (dKO); fenotipo; efecto sobre el acoplamiento: oligodendrocito-oligodendrocito (O:O), astrocito-astrocito (A:A) u oligodendrocito-astrocito (A:O), y referencia bibliográfica. (ND = no descrito, ↓ : reducción del acoplamiento, ↑Cx: Aumento de la expresión de conexina, SI: se mantiene el acoplamiento, No: desaparece el acoplamiento). Conexina Célula Modelo genético Fenotipo O:O O:A A:A Referencia Cx47 O KO Fenotipo leve. Esporádica vacuolización en el nervio óptico. No alteración de la mielina del sistema nervioso periférico. ↓↓ o igual ↓ ND (Menichella, Goodenough et al. 2003; Odermatt, Wellershaus et al. 2003) Cx32 O KO Fenotipo leve. No afectación de la mielina a nivel central. Neuropatía periférica de aparición tardía y severidad moderada. ↓ Si ↓Cx30 (Scherer, Xu et al. 1998) Cx29 O KO No presenta ninguna anomalía de la mielina central ni periférica. Si Si ND (Eiberger, Kibschull et al. 2006) Cx43 A KO 100% Mueren al nacer ND ND ND (Reaume, de Sousa et al. 1995) KO-c astrocito-específico Fenotipo ODDD. No hay alteraciones de la mielina. Reducción parcial del acoplamiento entre astrocitos. No Si ↓50% ↑Cx30 (Theis, Speidel et al. 2004) Cx43G138R corazón-específico Fenotipo ODDD. No hay alteraciones en la mielina a nivel central. 80% muerte prematura ND ND ND (Dobrowolski, Sasse et al. 2008) Cx43G60S Inducción química Fenotipo ODDD. No hay alteraciones en la mielina a nivel central. ND ND ND (Flenniken, Osborne et al. 2005) Cx43I130T corazón-específico Fenotipo ODDD. 40% muerte prematura. No hay alteraciones en la mielina a nivel central. ND ND ND (Kalcheva, Qu et al. 2007) Cx30 A KO No hay alteraciones de la mielina. Sordera severa. Alteración de la respuesta emocional y de la reactividad hacia un nuevo ambiente. ND ND ↓20% (Dere, De Souza-Silva et al. 2003) Cx26 A KO-c No presenta fenotipo anormal. ND ND ND (Nagy, Lynn et al. 2011) Cx47/Cx32 O/O dKO Fenotipo grave. Hipomielinización, vacuolización fibras mielínicas, temblor, convulsiones tónicas y muerte prematura No No ND (Tress, Maglione et al. 2011) Cx30/Cx47 A/O dKO Fenotipo grave. Hipomielinización y vacuolización fibras mielínicas. Temblores, ataxia, y muerte prematura ↑Cx32 No No No (Tress, Maglione et al. 2012) Cx43/Cx32 A/O dKO Fenotipo. Vacuolización, ↓muerte prematura No ND (Magnotti, Goodenough et al. 2011) Cx43/Cx30 A/A dKO Fenotipo mediograve. Hipomielinización y vacuolización fibras mielínicas. ↓ ↓↓↓ No (Lutz, Zhao et al. 2009) (Wallraff, Kohling et al. 2006) INTRODUCCIÓN 15 Figura 4. Mecanismo de aclaramiento de potasio a través de conexinas. Detalle de un axón mielinizado. En primer lugar tras la descarga de un potencial de acción se libera potasio al espacio periinternodal (1), a continuación pasa a través de conexinas oligodendrocitarias por las vainas de mielina (2), hasta llegar a los oligodendrocitos que se comunican con astrocitos mediante canales intercelulares heterotípicos, (3). Después difundiría de unos astrocitos a otros mediante canales intercelulares de conexinas astrocitarias (4) y finalmente se libera desde los astrocitos al lecho vascular o LCR (5) a través de canales de potasio o canales intercelulares de conexinas. Astrocito 1 4 H2O Cl- Cl- H2O H2O 5 6 Astrocito2 Vaso sanguíneo (2mM K+) 3 K+ Axoplasma Na+ 2 1 +75mV -85mV (3 mM K+20-100mM K+) Ión sodio Ión potasio Canal Nav1 Canal Kv1 Canal AQP4 Canal CLC Cx47-Cx47 Cx43-Cx43 Cx47-Cx43 Canal Kir4.1 Δ160mV K+ Na+ Oligodendrocito Vainas de mielina Axón INTRODUCCIÓN 16 grado de pérdida de función de la Cx47 (Orthmann-Murphy, Freidin et al. 2007; Orthmann-Murphy, Salsano et al. 2009; Osaka, Hamanoue et al. 2010; Kim, Gloor et al. 2013). Las mutaciones en el gen GJB1 (locus Xq13.1) que codifica la Cx32 causan una de las formas de la enfermedad Charcot-Marie-Tooh (MIM ID #302800) (Bergoffen, Scherer et al. 1993), una neuropatía con desmielinización periférica primaria y degeneración axonal. La Cx32 a pesar de expresarse en oligodendrocitos y en células de Schwann cursa en pocos casos con desmielinización central transitoria (Hanemann, Bergmann et al. 2003; Xie, Zhou et al. 2016). Las manifestaciones clínicas o subclínicas no aparecen en ausencia completa de la región codificante de la Cx32 (Hanemann, Bergmann et al. 2003; Xie, Zhou et al. 2016) lo que sugiere que se deben a una ganancia de función en la proteína. Sin embargo, aún está por esclarecer el mecanismo patogénico. Una explicación que se ajusta a los estudios realizados en ratón, sería que estos mutantes de Cx32 ejercieran un potente efecto de inhibición dominante sobre la Cx47. En ratón, el doble dKO Cx47/Cx32, o el homocigoto para M286T (Cx47) y KO para Cx32, presentan un fenotipo mucho más grave, que incluye desmielinización, vacuiolización y muerte prematura, ausente en el modelo KO de Cx32 (Scherer, Xu et al. 1998; Menichella, Goodenough et al. 2003). Mutaciones en Cx43 codificada por el gen GJA1 (locus 6q22-24) causan la displasia oculodentodigital (ODDD) (Paznekas, Karczeski et al. 2009) en el 70% de los casos aunque también pueden asociarse otras patologías como ataxia visceroatrial, linfedema, glaucoma, síndrome Hallerman-Streiff o muerte súbita infantil (Tabla 4). El síndrome de ODDD, en general de herencia autosómica dominante y en casos aislados de herencia autosómica recesiva (Richardson, Donnai et al. 2004; Paznekas, Karczeski et al. 2009) presenta una alta variabilidad fenotípica intra e interfamiliar y se caracteriza clínicamente por anomalías craneofaciales, en las expremidades, dentales, oculares y neurológicas. La afectación de distintos órganos y tejidos se explica por el amplio patrón de expresión que tiene la proteína que expresa el gen GJA1, la conexina 43 (Cx43). La dismorfología craneofacial que normalmente presentan los pacientes de ODDD son hipoplasia nasal alar, pequeñas narinas antevertidas y una collumela prominente. Algunos pacientes presentan además orejas displásicas. Las anomalías oftalmológicas incluyen microoftalmia, microcornea, cataratas, glaucoma y neuropatía óptica y con menor frecuencia nistagmo y estrabismo convergente. En la zona bucal se puede observar sobrecrecimiento mandibular, labio leporino y paladar hendido, microdoncia, anodoncia parcial, hipoplasia del esmalte dental, caries y pérdida dental precoz. En relación a las malformaciones de las extremidades muestran sindactilia en dedos de las manos y los pies así como camptodactilia y INTRODUCCIÓN 17 Tabla 4. Mutaciones identificadas en el gen GJA1. En la tabla se muestra el genotipo de los pacientes analizados con la nomenclatura según su localización en el ADNc (los nucleótidos se han enumerado considerando la posición +1 a la posición de la adenina del codón ATG de iniciación de la proteína) y en la proteína; el tipo de herencia de la mutación (AD, autosómica dominante; AR, autosómica recesiva; F, familiar; S, esporádica; -, no descrito), el domino en el que se localiza dentro de la proteína (CT: dominio carboxilo terminal, NT: dominio aminoterminal, L: asa citoplasmática, E: asa extracelular, TM1-TM4: dominios transmembrana), el fenotipo asociados en los pacientes y la referencia bibliográfica. Fenotipo Herencia Dom Fenotipo Referencia Nucleótido Proteína R/D S/F c.5G>T p.G2V AD S NT ODDD (de la Parra and Zenteno 2007) c.6delT /c.301C>T p.G2fsX7 /p.R101X AR S/F NT ODDD (Jamsheer, Badura-Stronka et al. 2010) c.7G>A p.D3N AD F NT ODDD (Fenwick, Richardson et al. 2008) c. 13A>T p.S5C - NT ODDD (Himi, Fujimaki et al. 2009) c.19T>G p.L7V AD S NT ODDD (Paznekas, Karczeski et al. 2009) c.23G>T p.G8V AR S NT ODDD (Wang, Cao et al. 2015) c. 31C>T p.L11F AR S NT ODDD (Gabriel et al., 2011) c.32T>C p.L11P - NT ODDD (Kelly, Ratajczak et al. 2006) c.50A>C p.Y17S AD F NT ODDD (Paznekas, Boyadjiev et al. 2003) c.52T>C p.S18P AD F NT ODDD (Paznekas, Boyadjiev et al. 2003) c.61G>A p.G21R AD S TM1 ODDD (Paznekas, Boyadjiev et al. 2003) c.64G>A p.G22R AD - TM1 ODDD (Paznekas, Boyadjiev et al. 2003) c.65G>A p.G22E AD AD S F TM1 ODDD (Paznekas, Boyadjiev et al. 2003) DNA diagnostic Lab c.68A>C p.K23T AD S TM1 ODDD (Paznekas, Boyadjiev et al. 2003) c.75G>T p.W25C AD S TM1 ODDD /glaucoma (Furuta, Ikeda et al. 2012) c.79T>C p.S27P AD - TM1 ODDD (Richardson, Donnai et al. 2004) c.93T>G p.I31M AD F TM1 ODDD (Richardson, Donnai et al. 2004) c.97C>T p.R33X/p. R33X AR F TM1 ODDD (Richardson, Joss et al. 2006) c.119C>T p.A40V AD AD AD AD AD - F S S S TM1 ODDD (Paznekas, Boyadjiev et al. 2003) (Richardson, Donnai et al. 2004; Sargiannidou, Vavlitou et al. 2009) (Debeer, Van Esch et al. 2005) DNA diagnostic Lab (Paznekas, Karczeski et al. 2009) c. 120del GGTTGAGTCAGC p.A40delVESA AD F TM1 ODDD /glaucoma (Gabriel et al., 2011) c.121G>C p.V41L/ p.R127H (GJB2) AR S TM1 ODDD (Kellermayer, Keller et al. 2005) c.124G>A E42K AD S E1 SID (Van Norstrand, Asimaki et al. 2012) c.142G>A p.E48K AD S E1 ODDD (Feller, Wood et al. 2008) c.G139>C p.D47H AD F E1 ODDD (Jamsheer, Sowinska-Seidler et al. 2014) c.145_147dupCAG p.Q49dup AD S E1 ODDD (Paznekas, Karczeski et al. 2009) c.145C>A p.Q49K AD F E1 ODDD (Paznekas, Karczeski et al. 2009) c.146A>C p.Q49P AD S E1 ODDD (Paznekas, Karczeski et al. 2009) c.154_156dupTTT F52dup AD F E1 ODDD (Paznekas, Boyadjiev et al. 2003) 24 II. OBJETIVOS OBJETIVOS 25 2.1. PRIMER OBJETIVO. Identificación de mutaciones en el gen GJA1 en pacientes con Displasia Oculodentodigital (ODDD) que cursan con paraparesia espástica. 2.2. SEGUNDO OBJETIVO. Ensayo funcional de las mutaciones identificadas. 2.2.1. Estudio de la biosíntesis y funcionalidad de los hemicanales mutados. Se analizará la capacidad para llegar a membrana así como el efecto de inhibición dominante que pueden ejercer las mutaciones de ODDD en coexpresión con la conexina silvestre. Para ello se expresarán los mutantes solos o en coexpresión con el silvestre en un sistema de oocitos de Xenopus y en la línea celular N2a. Mediante técnicas inmunológicas, moleculares, celulares y electrofisiológicas en oocitos aislados se determinarán las diferencias de expresión y función en los hemicanales de los mutantes analizados. 2.2.2. Efecto de las mutaciones sobre la comunicación astrocito-astrocito. 2.2.2.1. Se estudiará la capacidad de formar uniones en hendidura y canales intercelulares funcionales así como el efecto de dominancia de los mutantes de ODDD solos o en coexpresión con la Cx43 silvestre mediante técnicas inmunológicas, moleculares, celulares y electrofisiológicas en el sistema de oocitos de Xenopus y en la línea celular N2a. 2.2.2.2. Se analizará el efecto de los mutantes sobre el acoplamiento mediado por Cx43 endógena en un clutivo primario de astrocitos empleando técnicas de inmunocitoquímica y transferencia de colorante 2.2.2.3. Se determinará la compatibilidad de la Cx43 sobre la Cx30 así como el efecto de los mutantes de ODDD sobre la Cx30 a través de técnicas inmunológicas, moleculares, celulares y electrofisiológicas en un sistema de oocitos de Xenopus y en la línea celular N2a. 2.2.3. Efecto de las mutaciones sobre la comunicación astrocito-oligodendrocito. Para poder determinar si los mutantes de ODDD ejercen algún efecto sobre el acoplamiento oligodendroastrocitario se emplearán técnicas de inmunológicas, moleculares, celulares y electrofisiológicas en células N2a y un sistema de oocitos de Xenopus que nos permitirán analizar la formación de uniones en hendidura así como la funcionalidad de los canales intercelulares heterotípicos. 26 III. MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL Y MÉTODOS 27 3.1 ESTUDIOS GENÉTICOS Este estudio ha sido aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica del Hospital Ramón y Cajal. Tanto las muestras como la información clínica de los pacientes y familiares que cursan con ODDD y paraparesia espástica fueron remitidas desde el Servicio de Neurologia del Hospital Ramón y Cajal y desde el grupo de Neurogenética de la Fundación Pública Galega de Medicina Xenómica tras obtener el consentimiento informado firmado por los pacientes. Se extrajo ADN a partir de sangre periférica de los pacientes y familiares utilizando el kit de extracción Gentra Puregene Blood® (Ref. 158489, Qiagen). Tras su cuantificación con el espectrofotómetro NanoDrop ND1000 se amplificó la región codificante del gen GJA1 con oligonucleótidos específicos (ANEXO I, Tabla 6) y la enzima Master Mix (Ref. M7505, Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante con las siguientes condiciones: 1 ciclo de desnaturalización inicial (1 minuto a 95°C), 35 ciclos de: desnaturalización, anillamiento y extensión (1 minuto a 95° C, 1 minuto a 60°C y 1 minuto y 30 segundos a 72° C) y 1 ciclo de extensión final (10 minutos a 72°C). El producto amplificado de 1395 pb se comprobó por electroforesis en un gel de agarosa al 0.8% (Tris Base 90 mM, Ref. 648310, Merck; ácido bórico 90 mM, Ref. 100165 Merck; EDTA 100 mM pH8, Ref. 324506, Merck; agarosa D-2, Ref. 8039, Conda y SybrSafe diluido 1:10000; Ref.S33102, Invitrogen) y se purificó con Exosap-it (Ref. 78202, Affymetrix) siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuenciación directa se llevó a cabo con oligonucleótidos específicos (ANEXO I, Tabla 6) empleando el kit BigDye Terminator v1.1 (Ref. 4337450, Applied Biosystem) y la posterior purificación se realizó Agencourt CleanSEQ (Ref. 000219, Beckman Coulter) según instrucciones del fabricante. Finalmente los cromatogramas obtenidos, tras la separación de los fragmentos en el equipo ABI3730XL, se analizaron con el programa Sequencher v.4.1.4 (Genes Code) (Applied Biosystems) consultando las bases de datos Ensembl (www.ensembl.org/), Human Genome Database (www.hgmd.cf.ac.uk) y National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/). 3.2 CONSTRUCCIÓN DE LOS VECTORES DE EXPRESIÓN 3.2.1 CONSTRUCCIÓN DE LOS VECTORES pBSXG El ensayo funcional en Xenopus laevis se realizó empleando el vector pBSXG derivado del plásmido pBLUESCRIPT SKII (Stratagene). La diferencia entre ambos vectores es que en el primero se ha sustituido la diana BglII por StuI y se han clonado las regiones 5' y 3' de la B-globina de Xenopus con el fin de aumentar la eficiencia de traducción (Figura 5). Al comienzo de este estudio ya disponíamos en el laboratorio del plásmido pBSXG con la secuencia codificante de la Cx43 humana clonada (Cx43-pBSXG), de la Cx30 humana (Cx30-pBSXG) y de la Cx47 humana (Cx47-pBSXG). MATERIAL Y MÉTODOS 28 Figura 5. Esquema de la estrategia de generación de los mutantes en el plásmido pBSXG. A) Resumen de la mutagénesis dirigida para generar la construcción V85M-pBSXG (A) y de la estrategia de clonaje para generar el plásmido R148Q-pBSXG (B). pBSXG 4.5 Kb P5’UTR βglobina 5’UTR βglobina T7 PT3 StuI 2º DNA genómico ATG (1) TAG (1149) X Arg(ATT)Gln (ACT) 1º B Fi ori Ampr Col E1 ori p.R148Q -pBSXG 4.5 Kb r P5’UTR βglobina 5’UTR βglobina T 7 PT3 HCx4 3 X 3º Fi ori Ampr Col E1 ori A p.HCx43 -pBSXG 4.5 Kb P5’UTR βglobina 5’UTR βglobina T7 PT3 HCx43 Fi ori Col E1 ori Ampr p.V85M-pBSXG 4.5 Kb P5’UTR βglobina 5’UTR βglobina T7 PT3 ATG (1) TAG (1149) Val (GTG)Met(ATG) HCx43 X Fi ori Col E1 ori Ampr MATERIAL Y MÉTODOS 29 La mutación p.V85M se obtuvo por mutagénesis dirigida empleando el plásmido Cx43- pBSXG como molde (ANEXO I, Tabla 6). Este proceso implica la amplificación del vector, la digestión del plásmido molde, la transformación en bacterias y la selección de clones positivos. La amplificación se llevó a cabo con oligonucleótidos específicos y la enzima Phusion Hot Start II DNA Polymerase (Ref. F549L, Thermo Fisher) partiendo de 25 ng de molde y en presencia de DMSO al 3%. Los oligonucleótidos reversos y complementarios, deben contener la mutación, tener una longitud entre 25- 45 pb, un contenido de GC > 40% y una temperatura de Melting (Tm) > 78 ºC según la siguiente fórmula: Tm = 81.5 + 0.41 (%GC) – (675/N) - % pares de bases modificados con respecto a la secuencia molde. El programa de temperaturas y tiempos fue: 1 ciclo a 95°C 3 minutos, 25 ciclos a 95° C 30 segundos, 60°C 40 segundos y 68°C 3 minutos y un ciclo a 68°C 5 minutos. Tras comprobar la amplificación por electroforesis se incubó parte del producto de PCR con 20U de DpnI (R0176S, New England Biolabs), 1hora a 37ºC. La transformación se realizó incubando en hielo durante 30 minutos 5 μl de producto de PCR digerido/no digerido con 100 μl de bacterias competentes E.coli de la cepa XL1Blue. A continuación se sometieron las muestras a un choque térmico de 1 minuto y 40 segudos a 42 ºC seguido de 3 minutos en hielo. Tras el choque térmico se añadieron 9 volúmenes de LB (Triptona 1%, Ref. 211705, Becton, Dickinson; extracto de levadura 0.5%, Ref. 212750, Becton Dickinson y NaCl 90mM, Ref. S9888, Sigma-Aldrich) y se incubó de nuevo durante 1 hora a 37 ⁰C. Finalmente las bacterias se sembraron placas LB-agar (Ref. L2897 Sigma-Aldrich) con 50μg/ml de ampicilina (Ref. A9518, Sigma-Aldrich) y se incubaron durante 16 horas a 37°C. Se seleccionaron 10 colonias obtenidas a partir del producto de PCR digerido, se crecieron en medio LB+ampicilina (50μg/ml), se extrajo el ADN con el kit MINIPREPS DNA Purification System (Ref. A1330, Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se analizaron por secuenciación directa empleando el mismo protocolo con el que se secuenció el ADN genómico. Una vez secuenciadas las colonias, se seleccióno una de las 9 que contenían la mutación p.V85M, y se obtuvo mayor cantidad de ADN con el kit QIAGEN Plasmid Maxi (Ref. 12162, Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El clon con la mutación p.R148Q en el gen GJA1 se resolvió por clonaje. Se amplificó apartir de ADN del paciente con la enzima Pfu Turbo DNA polymerase (Ref. EP0502, Thermo Fisher) y oligonucleótidos específicos (ANEXO I, Tabla 6) siguiendo las instrucciones del fabricante con las siguientes condiciones: 1 ciclo de 1 minuto a 95° C; 35 ciclos de 1minuto a 95° C, 1minuto a 60°C, 90 segundos a 72° C; y un ciclo de 10 minutos a 72°C. En paralelo se linearizó el plásmido pBSXG vacío con 20U de StuI durante 4 horas a 37° C (Ref. R0187S, New England Biolabs). Tanto el producto de PCR como el plásmido linearizado se purificaron con el kit QIAquick PCR Purification (Ref. 28106, Qiagen) y a continuación se ligaron ambos productos con la enzima Ligasa T4 (Ref.10481220001, MATERIAL Y MÉTODOS 30 Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. El resto del procedimiento para aislar y purificar los clones positivos fue idéntico al utilizado para obtener la construcción V85M- pBSXG. 3.2.2 CONSTRUCCIÓN DE LOS VECTORES pIRES El ensayo funcional en las células Neuro2a (N2a, ATCC CCL-131) y en cultivo primario de astrocitos humanos se realizó utilizando el plásmido p-IRES2-EGFP (Clontech). Este vector de expresión se caractariza por expresar bajo un mismo promotor dos proteínas independientes, la conexina clonada y una proteína fluorescente verde (EGFP) (Figura 6), facilitando la identificación de las células transfectadas esencial en el análisis de acoplamiento por colorante sin interferir en síntesis y/o función de las conexinas (Martin E 1998). En el laboratorio disponíamos al comienzo del estudio de dicho plásmido con la secuencia codificante de la Cx43 humana (Cx43-pIRES-EGFP y Cx43-pIRES- dsRED) clonada, la Cx30 humana (Cx30-pIRES-EGFP) y la Cx47 humana (Cx47-pIRES-EGFP). El plásmido V85M-pIRES2-EGFP se generó por mutagénesis dirigida (Figura 6) utilizando los mismos oligonucleótidos y el mismo protocolo que en el caso de pBSXG a excepción de las bacterias, E.coli DH5α, y el antibiótico, kanamicina 50 μg/ml (Ref. K4000, Sigma-Aldrich), empleados en la transformación. La construcción R148Q-pIRES-EGFP (Figura 6) se obtuvo por clonaje. A partir del plásmido R148Q-pBSXG se amplificó siguiendo las instrucciones del fabricante con oligonucleótidos específicos (ANEXO I, Tabla 6) y la enzima Pfu Turbo DNA polymerase (Ref. EP0502, Thermo Fisher). En paralelo se linearizó el vector pIRES2-EGFP incubando con 20U de SmaI (Ref. 10220566001, Roche) durante 4h a 37ºC. La purificación, ligación, transformación y selección de colonias se realizó del mismo modo que se llevó a cabo la construcción del vector R148Q-pBSXG a excepción de las bacterias, E.coli cepa DH5α, y el antibiótico, kanamicina 50 μg/ml (Ref. K4000, Sigma-Aldrich), empleado en la transformación. 3.3 SISTEMAS DE EXPRESIÓN 3.3.1 ENSAYO FUNCIONAL EN OOCITOS DE Xenopus laevis El ensayo funcional en Xenopus requiere varias etapas con una duración aproximada de 4-5 días. En primer lugar se obtienen los oocitos, a continuación se inyectan con ARN sintetizado previamente in vitro, se forman los pares y finalmente se realiza el análisis de expresión de conexinas en oocitos aislados, la captación de colorante a través de hemicanales y el registro electrofisiológico de canales intercelulares y/o hemicanales (Figura 7). MATERIAL Y MÉTODOS 31 Figura 6. Estrategia de generación de los mutantes en el plásmido pIRES2-EGFP. Resumen de la mutagénesis dirigida para generar la construcción V85M-pIRES-EGFP (A) y de la estrategia de reclonaje de la construcción R148Q-pIRES-EGFP (B). ATG (1) TAG (1149) Val (GTG)Met(ATG) X p.HCx43 pIREs2-EGFP 6.7 Kb SV40 poly A SV40ori P HSV TK poly A A. p.HCx43 pIREs2-EGFP 6.7 Kb SV40 poly A SV40ori P HSV TK poly A p.HCx43 pIREs2-EGFP 6.7 Kb SV40 poly A SV40ori P HSV TK poly A p.R148Q -pBSXG ATG (1) TAG (1149) X Arg(ATT)Gln (ACT) SmaI 1º 2º 3º B. p.R148Q pIREs2-EGFP 6.7 Kb SV40 poly A SV40ori P HSV TK poly A MATERIAL Y MÉTODOS 32 Figura 7. Etapas del protocolo de registro de oocitos aislados y pares. En primer lugar se extraen los oocitos de hembras de Xenopus, se seleccionan los estadíos V y VI, se elimina la capa folicular, se inyectan con ARN sintetizado in vitro, se aparean y se procede a: la extracción de proteína total o de superficie celular, a la captación por colorante de oocitos aislados, al registro electrofisiológico de los hemicanales o al registro electrofisiológico de los canales intercelulares. 1⁰Extracción quirúrgica 2⁰Eliminar capa folicular 3⁰Inyectar RNA sintetizado in vitro 4⁰Aparear oocitos Registro Electrofisiólógico de hemicanales Captación de colorante por hemicanales Extracción de proteína en oocitos aislados Registro Electrofisiólógico de canales intercelulares MATERIAL Y MÉTODOS 33 3.3.1.1 TRANSCRIPCIÓN IN VITRO La transcripción in vitro de ARN mensajero (ARNm) se realizó a partir del plásmido pBSXG que incluía la conexina de interés. Tras la linearizar 60 ug del vector con 90 U de SalI (Ref. 10348783001, Roche) se purificó (Ref. 28106, Qiagen) y se llevó a cabo la reacción de transcripción durante 3h incubando a 37 ºC la siguiente mezcla: 160 U de ARN polimerasa T7, 1X buffer de transcripción (Ref. P2075, Promega), 1 U del análogo “capping” m7G(5’)ppp(5’)G (Ref. 10904988001, Roche), 5mM de rATP, rCTP y rUTP y 3mM de rGTP (Ref. P1221, Promega), 10 mM de DTT (P117B, Promega) y 12U de inhibidor de RNAsa (Ref. 10877200, Roche). A continuación, eliminamos el ADN molde incubando 30 minutos a 37° C con 30U de la enzima DNasaI (Ref. 04716728001, Roche) y posteriormente purificamos con el kit Rneasy (Ref: 74106, QIAGEN) eluyendo en agua con DPEC (D5758, Sigma-Aldrich) para inactivar las RNAsas. Tras comprobar la integridad del ARN por electroforesis en un gel con: 18% formaldehido (Ref. 47629, Fluka), MOPS 1X y 1% de agarosa D-2 (Ref. 8039, Conda), se determinó la concentración de ARN y la pureza midiendo la absorbancia a 280 nm y a 260 nm en un NanoDrop ND1000. Únicamente se emplearon en los experimentos ARNs con una relación 260/280 nm de entre 1.8 - 2.0. Finalmente se hicieron alícuotas de 10 μg a las que se les añadió, para precipitarlo, antes de almacenar a -80 ºC, 1/16 del volumen de NaCl 5M y 2.5 del volumen de EtOH absoluto. Una hora antes de la inyección se centrifugaron las muestras 15 minutos a 14.000 rpm, se lavaron con EtOH al 80% en agua+DEPC y se resuspendieron en 10 μl de TAB diluído 1μg/μl en agua+DEPC. Este último paso es muy esencial para el estudio electrofisiológico de canales y hemicanales ya que el TAB es un oligonucleótido antisentido ( 5’- GCT TAG TAA TCC CCA TCC TGC CAT GTT TC- 3’) que reconoce la conexina endógena de Xenopus (xCx38) y bloquea específicamente su expresión (Barrio, Suchyna et al. 1991), permitiendo obtener corrientes/captación puras correspondientes a la conexina inyectada en ausencia de corrientes/captación endógena. 3.3.1.2 OBTENCIÓN, PREPARACIÓN Y MICROINYECCIÓN DE LOS OOCITOS Se anestesiaron las hembras adultas de Xenopus laevis con 2 g/L de ácido 3-aminobenzoico- etil-éster y mediante cirugía se les extrajeron varios folículos ováricos (Figura 7). Estos folículos se trocearon e incubaron a 18 ºC durante media hora en una solución con 1 mg/ml de colagenasa 1A (Sigma-Aldrich) en ND96 sin Ca2+ a pH 7.4 (96mM NaCl - Ref. S9888 Sigma-Aldrich, 2mM KCl - Ref.P4504 Sigma-Aldrich,1mM MgCl2 - Ref.172571 Merck, 5mM HEPES - Ref. H3375 Sigma-Aldrich, 2.5mM de piruvato - Ref. P2256, Sigma Aldrich y 10 ml/L de penicilina/estreptomicina a – Ref.15140- 122, Invitrogen). A continuación se lavaron los oocitos varias veces con una solución de ND96 a pH 7.4 con 2.8mM CaCl2 (Ref. 1016, Sigma-Aldrich) y se mantuvieron así hasta la finalización del experimento. Tras la colagenasa se seleccionaron los oocitos en fase IV y V de maduración y se eliminó bajo lupa MATERIAL Y MÉTODOS 40 mV. En caso de que el par esté acoplado eléctricamente para mantener fijo su potencial de membrana es necesario inyectar la misma corriente que fluye del O1 al O2 pero de signo contrario, Ij=-I2. Como resultado de cada pulso de voltaje aplicado a un par de oocitos acoplado obtenemos una señal de corriente con la que podemos calcular la conductancia intercelular (gj) según la ley de Ohm, gj= Ij/Vj (Figura 9D). A partir de la conductancia se calculó la dependencia de voltaje intercelular (Vj) en el estado estacionario Gj/Vj o y Ghj/Vm ajustando los valores a la siguiente ecuación Boltzmann: Gss={(Gmax – Gmin)/(1+exp[A(Vj/m – V0)]} + Gmin, donde la Gmax es la conductancia máxima, la Gmin es la conductancia residual no sensible a voltaje, V0 es el voltaje intercelular al cual la conductancia se reduce a la mitad (Gss = (Gjmax-Gmin)/2) y A es la pendiente o sensibilidad al voltaje, que viene definida como A= zq/kT dónde, z es el número de cargas equivalente de electrón (q) moviéndose a través de la membrana asociadas al sensor de voltaje (a 20ºC kT/q = 25.26 mV). Esta función aplica para transiciones entre dos estados de conductancia unitaria del canal con una diferencia de energía entre ellos que depende linealmente del voltaje (Harris, Spray et al. 1981; Spray, Harris et al. 1981). Las constantes Gmax, Gmin, A y Vo se trataron como paramétros libres y se calcularon con el método interactivo de error de mínimos-cuadrados (Sigma-Plot). 3.3.2 ENSAYO FUNCIONAL EN LA LÍNEA CELULAR N2a 3.3.2.1 CONDICIONES DE CULTIVO Y TRANSFECCIÓN EN LA LÍNEA CELULAR N2a La línea celular Neuro-2a (N2a, ATCC CCL-131) empleada en los experimentos, cedida al laboratorio por el Dr. Eric C. Beyer del Departamento de Pediatría de la Universidad de Chicago, se caracteriza por carecer de la expresión de conexinas. Se cultivó en una atmósfera humificada con 5% de CO2 a 37°C en medio Dulbecco (DMEM, ref. 42430025, Invitrogen) suplementado con el 10% de Suero Fetal Bovino (Ref. 10500, Invitrogen), y con 100 U/ml de penicilina/estreptomicina (Ref.15140- 148, Gibco). Al alcanzar un 60-70% de confluencia se transfectó con el vector pIRES2-EGFP vacío como control o con el mismo vector que contenía las conexinas o mutantes clonados. Para ello, se sembraron las células en placas multipocillo de 24 pocillos (Ref. CLS3337-50EA, Sigma-Aldrich) a las que habíamos colocado un cubre por pocillo (Ref. 40CIR1600621, Thermo Fisher) en el caso de los estudios de inmunohistoquímica y transferencia por colorante. Se sembraron 30.000 células por pocillo que se transfectaron pasadas 24h con 1μg de ADN y lipofectamina (Ref.11668-019, Invitrogen) siguiendo las indicaciones del fabricante. Entre 24 y 48 h después de la transfección se procesaron las muestras para su análisis. 3.3.2.2 ANÁLISIS DE EXPRESIÓN TOTAL EN LA LÍNEA CELULAR N2a La extracción de proteína total se realizó, después de 3 lavados con PBS1X (Ref. 14200-059, Gibco), añadiendo a las células 500μl de buffer de lisis (150mM NaCl, Ref. S9888 Sigma-Aldrich; 50mM MATERIAL Y MÉTODOS 41 TrisBase, Ref. 03118142001, Roche; 5mM EDTA pH8, Ref. E5134, Sigma-Aldrich; 5mM EGTA pH8, Ref. E4378, Sigma-Aldrich; 1% Tritón,1μg/μl Ref. T9284, Sigma-Aldrich; 1μg/ml de leupeptina, Ref. L2884, Sigma-Aldrich y 1mM de PSMF Ref.P7626, Sigma-Aldrich). A continucación se recogieron las células con un rastrillo (Ref: 83,183 Sarstedt), se congelaron toda la noche a -20 ⁰C y se sonicaron durante 30 segundos. Tras centrifugar el lisado 15 minutos a 14000rpm, se recogió el sobrenadante y se almacenó a -20 ºC. En los estudios de degradación en los que empleamos cloroquina se incubaron las células 3 horas antes de la extracción con 100 μM CQ (Ref.C-6628, Sigma-Aldrich). Los lisados obtenidos se analizaron por Western blot siguiendo el mismo protocolo que el utilizado para la proteína extraída de oocitos. 3.3.2.3 INMUNOCITOQUÍMICA EN LA LÍNEA CELULAR N2a La inmunocitoquímica se realizó 24 horas después de la transfección. En primer lugar se fijaron lavando con PBS1X (Ref. 14200-059, Gibco) e incubando con paraformaldehido (Ref. P6148, Sigma-Aldrich) al 2% y al 4% durante 10 minutos a 4°C. A continuación se añadió solución de bloqueo (PBS1X, Ref. 14200-059, Gibco; 5% de suero de cabra, Ref. 50007A, Labclinics-Serolab y 0.05% de tritón, Ref. T3284, Sigma-Aldrich) a temperatura ambiente y tras 20 minutos se incubó a 4°C durante toda la noche con el anticuerpo primario (ANEXO I, Tabla 8) diluido en solución de bloqueo. Al día siguiente retiramos el anticuerpo primario y se añadimos Höechst 33258 (B2883, Sigma-Aldrich) diluido 1:1500 durante 5 minutos, e incubamos de nuevo 40 minutos con el anticuerpo secundario (ANEXO I, Tabla 8). Finalmente, después de lavar con PBS y con agua, se montaron los cubres en portaobjetos con una gota de solución de montaje (ProlongGold, Ref. P36930, Invitrogen). Las imágenes de las preparaciones se adquirieron con un microscopio óptico de fluorescencia y un microscopio Nikon Eclipse Ti acoplado a un módulo confocal Nikon C1 y se procesaron con el programa NIS-Elements Advanced Research (Nikon). 3.3.2.4 TRANSFERENCIA INTERCELULAR DE COLORANTE EN LA LÍNEA CELULAR N2a Las células transfectadas (EGFP positivas) se empalaron con un microelectrodo que tenía una resistencia de entre 200 y 400 MΩ. Antes de inyectar, se bajó la ganancia para no tener fondo verde de la proteína GFP, se llenó el electrodo con 5-6 carboxifluoresceína 133 mM (CF, 376 Da, carga -2, Ref. 46945, Sigma Aldrich) diluida en acetato potásico (Ref. P3542, Sigma-Aldrich 0.1M) y tras inyectar la célula y se aplicaron pulsos hiperpolarizantes de corriente de entre 0.25-1 nA. Durante 10 minutos se registró la señal emitida a 540/40 nm excitando a 488 nm con un microscopio confocal y el programa de curso temporal Lasersharp (MRC-1024, BioRad). En el proceso de adquisición de las imágenes se definieron tres regiones de interés (o ROI): la célula que se inyectó o célula donadora, la célula receptora o aceptoras que son las células en las que hay o no difusión de colorante y otra región MATERIAL Y MÉTODOS 42 adicional del fondo. La cuantificación de la transferencia de colorante se llevó a cabo finalmente calculando la relación entre la intensidad de colorante de la célula aceptora (A) y la intensidad de colorante en la célula inyectada o donadora (D) que nos da el coeficiente de transferencia (A/D). 3.3.3 ENSAYO FUNCIONAL EN CULTIVOS PRIMARIOS DE ASTROCITOS HUMANOS A partir de una biopsia de lóbulo temporal realizada en una paciente diagnosticada de epilepsia y resistente al tratamiento con fármaco se obtuvo tejido cerebral humano. La paciente fue evaluada de acuerdo al protocolo del Hospital La Princesa de Madrid por el equipo dirigido por el Dr. Rafael Sola, y el procedimiento contaba con la autorización del Comité Ético de Ensayos Clínicos de dicho hospital y con el consentimiento informado de la paciente. El material de partida fue una masa de tejido de menos de 1 gramo, con sustancia gris y sustancia blanca de una zona libre de descargas epilépticas que era necesario resecar para colocar la rejilla de electrodos de estimulación con el fin de controlar la epilepsia. 3.3.3.1 CONDICIONES DE CULTIVO Y TRANSFECCIÓN EN CULTIVO PRIMARIO DE ASTROCITOS HUMANOS El tejido cerebral fue separado en sustancia gris y sustancia blanca, y cada pieza fue troceada en esterilidad en pequeños dados de aproximadamente 1 mm de lado, en medio Leibowitz L15 al que se añadió penicilina/estreptomicina (Ref.15140-148, Gibco). Se procedió a la dispersión mecánica mediante una pipeta automática P1000 con puntas de filtro estériles y se mantuvo el cultivo en medio Dulbecco MEM/Ham’s F12 (Ref. 42430025, Invitrogen, Ref. L0135-500, Biowest) suplementado con suero fetal bovino al 12% (Ref. 10500, Invitrogen), penicilina/estreptomicina (Ref.15140-148, Gibco) , HEPES 10mM (Ref.15630080, Gibco), L-Glutamina 4.5 mM (Ref. 25030081, Invitrogen), piruvato 2 mM (Ref. 11360070, Gibco), transferrina humana 100 μg/mL (Ref. 10652202001, Roche), insulina 25 μg/mL (Ref. 1882, Sigma-Aldrich), selenito sódico 30 nM (Ref. S9133, Sigma-Aldrich), putrescina 60 nM (Ref. P5780, Sigma-Aldrich), progesterona 20 nM (Ref. P7556, Sigma-Alddrich), D-glucosa (hasta 6 g/l), EGF 20 ng/mL (Ref. 100-15, Peprotech), FGF2 10 ng/mL (Ref. 100-18B, Peprotech) y LIF (ESGRO, 1 U/mL) en una atmósfera humificada con 5% de CO2 a 37°C. De este cultivo se generaron neurosferas (agregados que contienen células madre neurales) de las cuales se pudieron diferenciar neuronas y glia, al retirar los factores de crecimiento. En uno de los cultivos se generaron células adherentes al plástico, no refringentes y que proliferaban en medio con 10% de suero fetal bovino, que se identificaron como astrocitos por ser GFAP positivas en la inmunohistoquímica. Las células fueron expandidas en número y preservadas en congelación para estudios posteriores. En los experimentos de inmunocitoquímica y transferencia por colorante se sembraron en placas de 24 pocillos con cubres 3.000 células por cubre 72 horas antes de la MATERIAL Y MÉTODOS 43 transfección. Al alcanzar el 70% de confluencia, se transfectaron con los vectores de expresión pIRES- EGFP. La transfección se realizó igual que en células N2a mezclando 1 μg de ADN con lipofectamina e incubando la mezcla con las células durante 5-6 horas siguiendo las instrucciónes del fabricante. Para extraer proteína endógena del cultivo primario de astrocitos se sembraron 5x104 células en frascos de 75 cm3 de superficie (Ref: CLS430641 Sigma-Aldrich). Tanto la extracción de proteína como los ensayos funcionales de transferencia por colorante se realizaron 24-48 horas después de la trasnfección. 3.3.3.2 ANÁLISIS DE EXPRESIÓN TOTAL EN CULTIVO PRIMARIO DE ASTROCITOS HUMANOS Los estudios de expresión de proteína total se realizaron siguiendo el mismo protocolo que para células N2a. 3.3.3.3 INMUNOCITOQUÍMICA EN CULTIVO PRIMARIO DE ASTROCITOS HUMANOS La inmunocitoquímica se realizó siguiendo el mismo protocolo y empleando los mismos anticuerpos que con las células N2a (ANEXO I, Tabla 8). 3.3.3.4 TRANSFERENCIA INTERCELULAR DE COLORANTE EN CULTIVO PRIMARIO DE ASTROCITOS HUMANOS Los estudios de transferencia por colorante se realizaron siguiendo el mismo protocolo que para células N2a. 3.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se empleó el programa Sigma Plot para realizar el análisis estadístico de los datos. Las diferencias entre grupos se evaluaron con la prueba t de Student si los datos seguían una distribución normal o con la prueba U de Mann-Whitney en los casos en que los datos no siguieran una distribución gaussiana. Los grupos se consideraron significativamente diferentes en los casos en que el p valor fue <0.05 ANEXO I 44 Tabla 6. Secuencias de los oligonucleótidos utilizados para la amplificación/clonaje secuenciación o mutagénesis de los vectores generados. Tabla 7. Anticuerpos primarios y secundarios utilizados en la inmunodetección en el sistema de expresión de oocitos de Xenopus laevis. Tabla 8. Anticuerpos primarios y secundarios utilizados en la inmunocitoquímica realizada en la línea celular N2a transfectada y/o en el cultivo primario de astrocitos humanos (CxASTRO). NOMBRE SECUENCIA OLIGONUCLEÓTIDO 5’  3’ TÉCNICA Cx43ODDDdcha TGGGACAGGAAGAGTTTGCAC PCR Cx43ODDDizda CACCTGGTGCACTTTCTACAGCAC PCR S1-Hcx43 GATGGTGTCAATGTGGACATGCAC Secuenciación S2-Hcx43 GACTGTGGGTCTCAAAAATATGCT Secuenciación D179N AACAGTCCACCTGATGTGGGCA Secuenciación HCx43 p.V85M F GTCCTGCAGATCATATTTATGTCGGTACCCACACTCTTGTAC Mutagénesis HCx43 p.V85M R GTACAAGAGTGTGGGTACAGCCATAAATATGATCTGCAGGAC Mutagénesis ANTICUERPO EPÍTOPO ESPECIE REFERENCIA DILUCIÓN anti- Cx43 aa 252-270 Ratón MAB3068, Chemicon 1/500 anti- Cx30 C-terminal Conejo 71-2200, Invitrogen 1/500 anti- GAPDH Región WARS Pollo AB2302, Millipore 1/10000 antiratón IgG PO - Cabra RPN 2106, GE Healthcare 1/2000 anticonejo IgG PO - Cabra RPN 2106, GE Healthcare 1/2000 antipollo PO - Cabra 603-103-126, Rockland 1/4000 ANTICUERPO EPÍTOPO ESPECIE REFERENCIA DILUCIÓN anti- Cx43 aa 252-270 Ratón MAB3068, Chemicon 1/200 anti- Cx30 C-terminal Conejo 71-2200, Invitrogen 1/200 anti-Cx47 aa 344-399 Conejo suministrado por J. Orthmann-Murhy 1/5000 anti- GFAP Cadena completa Conejo Z0334, Dako 1/500 antiratón IgG Alexa Fluor 568 - Cabra A-11031, Thermo Scientific 1/500 anticonejo IgG Alexa Fluor 488 - Cabra A-11034, Thermo Scientific 1/500 45 IV. RESULTADOS RESULTADOS 46 3.5 IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN GJA1 EN PACIENTES CON PARAPARESIA ESPÁSTICA ASOCIADA A DISPLASIA OCULODENTODIGITAL. El estudio genético se realizó en dos familias españolas en las que clínicamente uno o más de sus miembros presentaban una paraparesia espástica (SPG) asociada a un fenotipo con malformaciones compatibles con padecer una displasia oculodentodigital (ODDD) (Tabla 9). Familia 1. El probando es un varón de 37 años que nos fue remitido desde la consulta de Neurología del Hospital Ramón y Cajal por presentar una paraparesia espástica asociada a una displasia oculodentodigital. El paciente refiere dificultad progresiva para la deambulación desde los 6 años y en la exploración física se observó que tenía una sindactilia tipo III, microognatia, mala implantación dental, hipotelorismo, pies valgos y cifoescoliosis y en la exploración neurológica una marcha espástica en tijera con un marcado piramidalismo. En la resonancia magnética nuclear se observó una marcada reducción del calibre de la medula espinal y una discreta atrofia cortical en secuencias potenciadas en T1 (Figura 10A). En la secuenciación del ADN genómico del probando se identificó en heterocigosis la mutación puntual c.443G>A en el exón 2, que predice la sustitución p.R148Q (Figura 10B). Dicha mutación no se identificó en los otros familiares del paciente analizados, la madre, el padre y la hermana, que no presentan signos de ODDD ni de afectación neurológica (Figura 10B,C), sugiriendo que se trata de una mutación de novo. La mutación R148Q se ubica en el asa citoplasmática de la Cx43 entre los dominios transmembrales TM2 y TM3 (Delmar 2004; Zhou, Yang et al. 2007) (Figura 10D). La posible naturaleza patogénica que podría resultar de la sustitución de un amino acido cargado positivamente por otro polar, como es el caso de la mutación R148Q, se ve reforzada por un alto grado de conservación de este residuo a lo largo de la evolución de los vertebrados en las conexinas ortólogas a la Cx43 humana (Figura 10E). Familia 2. La probando fue una mujer de 47 años de edad remitida desde la Fundación Pública Galega de Medicina Xenómica que acudió a la consulta por presentar marcha espástica en tijera y piramidalismo. En el examen médico se le detectaron muchos de los signos clínicos característicos de la ODDD: sindactilia bilateral del IV y V dedo, microftalmia, hipertelorismo, hipoplasia del pliegue del epicanto nasal alar y microdoncia con hipoplasia del esmalte dental. Respecto a los antecedentes familiares, la paciente refiere que su madre también tenía sindactilia y alteraciones en la marcha y que falleció por muerte súbita, y que el abuelo materno RESULTADOS 47 Tabla 9. Características clínicas y genéticas de los pacientes estudiados con paraparesia espástica asociada a displasia oculodentodigital. (S, esporádica; AD, autosómica dominante; M, masculino; F, femenino; ND, no determinado; SPG, paraparesia espástica). Familia 1 Familia 2 II:1 (caso índice) III:1 (caso índice) II:6 (hermana) IV:3 (hijo) Genotipo p.R148Q/WT p.V85M/WT p.V85M/WT p.V85M/WT Tipo de herencia S AD AD AD Género M F F M Edad del diagnóstico 41 47 N.D N.D Alteraciones neurológicas SPG SPG SPG SPG Malformaciones craneofaciales Hipotelorismo, microognatia Hipertelorismo, pliegue del epicanto nasal alar N.D N.D Anomalías oftalmológicas N.D Microftalmia N.D N.D Anomalías dentales Mala implantación dental Microdoncia con hipoplasia del esmalte dental N.D N.D Malformaciones esqueléticas Sindactilia tipo III, pies valgos y cifoescoliosis Sindactilia bilateral Sindactilia bilateral Sindactilia bilateral RESULTADOS 48 Figura 10. Estudio clínico y genético de la familia 1. A) Imagen de resonancia magnética nuclear mostrando una discreta atrofia cortical (izda.) y un marcado adelgazamiento de la médula espinal (dcha.). B) Cromatograma de la secuenciación del ADN del paciente (II:1) con la mutación c.443G>A (p.R148Q) en heterocigosis y de un familiar asintomático (I:2) sin la mutación. C) Árbol genealógico de los miembros afectados con SPG y ODDD (en negro) y los no afectados (en blanco) sugiriendo la aparición de novo de la mutación. D) Modelo de la estructura de un canal intercelular en el que se representa la localización de la mutación en el asa citoplasmática. E) Análisis de la conservación filogenética del residuo de arginina en la posición 148 en la Cx43 de distintas especies de vertebrados. A p.R148Q Homo sapiens 139 IEEHGKVKMRG 150 Pan troglodytes 139 IEEHGKVKMRG 150 Macaca mulatta 139 IEEHGKVKMRG 150 Canis lupus 139 IEEHGKVKMRG 150 Bos taurus 139 IEEHGKVKMRG 150 Mus musculus 139 IEEHGKVKMRG 150 Rattus norvegicus 139 IEEHGKVKMRG 150 Gallus gallus 139 IEEHGKVKMRG 150 Danio rerio 139 LEEHGKVKMKG 150 Xenopus tropicalis 139 LEEHGKVKMRG 150 D E C Individuo I:2 A T G C G A G G G Probando II:1 A T G C G/A A G G G B G/G G/G G/G G/A RESULTADOS 49 también falleció por muerte súbita. Entre sus cuatro hermanos, tiene una hermana con sindactilia y SPG, y entre sus cuatro hijos, hay uno de ellos que también tiene SGP y sindactilia. En conjunto, el árbol genealógico de esta familia de cuatro generaciones sugiere un patrón de herencia autosómico dominante en el que la sindactilia y la SPG cosegregan con el mismo grado de penetrancia en todos los miembros afectados (Figura 11A). En la secuenciación del ADN de la probando se identificó en heterocigosis la mutación puntual c.253G>A en el exón 2 de la región codificante del gen GJA1, que predice el cambio p.V85M; dicha mutación también se encontró en su hijo afecto, pero que no en ninguno de los otros hijos asintomáticos; y en su hermana afecta pero no en su hermano sano (Figura 11B). La sustitución de la valina85 por un residuo de metionina, también hidrofóbico, se localiza en el segundo dominio transmebranal de la Cx43 (Figura 11C); sin embargo, este residuo de valina está perfectamente conservado en todos las Cx43 ortólogas de todas las especies de vertebrados analizadas (Figura 11D). 3.6 ENSAYO FUNCIONAL DE LAS MUTACIONES IDENTIFICADAS EN LA CONEXINA-43 ASOCIADAS A PARAPARESIA ESPÁSTICA Para confirmar la naturaleza patogénica de las mutaciones identificadas y contribuir al esclarecimiento de los mecanismos patogénicos a través de los cuales estas mutaciones llegan a producir la paraparesia espástica se realizó su ensayo funcional. Dicho ensayo tiene como objetivo determinar cómo afectan las mutaciones en la región codificante a la funcionalidad de la Cx43 y qué efecto tiene la expresión de las proteínas mutadas sobre la Cx43 silvestre en la condición de heterocigosis de los pacientes sobre el acoplamiento astrocito-astrocito y astrocito-oligodendrocito. 3.6.1 BIOSINTESIS Y FUNCIONALIDAD DE LOS HEMICANALES MUTADOS DE Cx43 3.6.1.1 NIVELES DE EXPRESIÓN TOTAL Y EN MEMBRANA PLASMÁTICA DE LOS MUTANTES DE Cx43. TASA DE DEGRADACIÓN. Primero, se determinó el efecto de las mutaciones Cx43V85M y Cx43R148Q sobre el nivel de expresión total y en la membrana celular de la Cx43 en el sistema de expresión de los oocitos de Xenopus laevis. En este tipo de ensayo se inyectó un grupo de oocitos controles con el ARN de la Cx43 silvestre (Cx43WT), un segundo grupo con el ARN de cada una de las Cx43 mutadas a la misma concentración y un tercer grupo en el que se simulo la condición de heterocigosis de los pacientes inyectando en una relación 1:1 una mezcla los ARNs de la Cx43 silvestre con cada uno de los mutantes a la misma concentración final; como control negativo se inyecto un grupo de oocitos únicamente con el vehículo conteniendo el oligonucleótido antisentido de la Cx38 de Xenopus para RESULTADOS 56 Figura 14. Funcionalidad de los hemicanales Cx43R148Q y Cx43V85M: II. Corrientes de los hemicanales y su regulación por el potencial de membrana (Vm). A) Activación e inactivación de los 200 nA 1s Im Vm -80 -40 0 40 80 Gh 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Ghjss Ghji Control Cx43 A Im500 nA 1 s Vm (mV) -40 -20 0 20 40 60 Im (nA) -200 0 200 400 600 800 Ii 1.8 Ca2+ 1 Mg2+ Iss1.8 Ca2+ 1 Mg2+ Ii 0 Ca2+ 0Mg2+ Iss 0 Ca2+ 0 Mg2+ Icola 0 Ca2+ 0 Mg2+ Ii 1.8 Ca2+ 1 Mg2+ Iss 1.8 Ca2+ 1 Mg2+ Iss 0 Ca2+ 0Mg2+ Ii 0 Ca2+ 0 Mg2+ ER 500 nA 1 s Im IiIss Icola ER -20 -40 0 +60 +40 +20 500 nA 1 s Im Im500 nA 1 s 100 mV +60 mV 0 mV Vm 100 mV +60 mV 0 mV Vm i) ii) 500 nA 1s Im IiIss 200 nA 1s Im Cx43 R148Q V85M i) B Vm -80 -40 0 40 80 Gh 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Ghjss Ghji Vm -80 -40 0 40 80 Gh 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Ghjss Ghji ii) 100 mV 1 s +100 mV -100 mV Vm Control Cx43 R148Q V85M R148Q + Cx43 V85M + Cx43 gh (S) 0 2 4 6 8 N=5 n=5 N=5 n=6 N=5 n=5 N=4 n=5 N=4 n=6 N=5 n=7 * C 100 mV 1 s +100 mV -100 mV Vm 100 mV 1 s +100 mV -100 mV Vm 0 mM Ca2+ 0 mM Mg2+ 1.8 mM Ca2+ 1 mM Mg2+ RESULTADOS 57 hemicanales de Cx43WT por la despolarización progresiva del potencial de membrana; (i) corrientes transmembrana (Im) evocadas por pulsos despolarizantes (Vm; desde -40 mV a +60 mV en incrementos de 20 mV) en los oocitos controles y Cx43WT en presencia y ausencia de cationes divalentes en la solución extracelular (1.8 mM Ca2+ +1.0 mM Mg2+ y 0 mM Ca2++0 mM Mg2+) y (ii) curvas corriente/voltaje (Im /Vm) en las que se ha representado el valor promedio inicial y de estado de las corrientes (Ii e Iss) durante los pulsos y el valor inicial de las corrientes de cola (Icola) al retornar a -40 mV (Vh) (N=5); en concentraciones normales de cationes divalentes, las corrientes transmembrana fueron similares y de baja amplitud en ambos grupos de oocitos, sin embargo en ausencia de cationes divalentes la despolarización de los oocitos Cx43WT, pero no de los controles, indujo un significativo incremento en la amplitud de las corrientes, que inicialmente se activan y posteriormente se cierran con el grado de despolarización del Vm; al retornar al Vh la amplitud de las correspondientes Icola para los pulsos -20 a +20 mV aumentan y la cinética es de cierre y para los pulsos de +40 y +60 mV la amplitud disminuye y su cinética es primero de apertura y luego de cierre (recuadro en i). B) Dependencia de voltaje bipolar de los hemicanales de Cx43 silvestre y mutados; (i) corrientes transmembrana (Im) registradas en los oocitos que expresan la Cx43 silvestre (Cx43WT) y los mutantes (Cx43R148Q y Cx43v85M) en respuesta a un protocolo de pulsos de ±100 mV, en incrementos de 20 mV y 5 s de duración aplicado en un Vh = 0 mV y (ii) curvas de conductancia/voltaje (Gh /Vm) de los hemicanales en las que se representan el valor promedio inicial (Ghi) y de estado (Ghss) de la conductancia normalizadas respecto a su valor en el prepulso (N=5). Los hemicanales de Cx43R148Q y Cx43V85M como los de la Cx43WT muestran la misma dependencia de Vm con una rectificación rápida o “instantánea” de la Ghi, que aumenta con la polaridad negativa y disminuye con la polaridad positiva, y una Ghss con un valor máximo entre + 20 mV y que se reduce asimétricamente para las dos polaridades del Vm con distintos parámetros de sensibilidad a voltaje (ver parámetros de Botzmann en la Tabla 10). C) Niveles de expresión de las corrientes de los hemicanales mutados. Los oocitos se inyectaron solo con la Cx43WT, la Cx43R148Q o la Cx43V85M y con la combinación en una relación 1:1 de cada mutante con la Cx43WT a la misma concentración final (Cx43+ R148Q y Cx43+V85M); en comparación con la Cx43WT, los valores de conductancia macroscópica (gh) registrados en los oocitos R148Q y Cx43+R148Q fueron similares; sin embrago, en el caso del mutante V85M fueron significativamente menores y en la combinación Cx43+V85M intermedios a los de los oocitos Cx43 y V85M. Valores promedio ± s.e; *, p <0.05. RESULTADOS 58 ~1 ms, que se redujo en ~40% de -100 a +100 mV. El valor conductancia de estado (Ghss) fue máximo entre + 20 mV y se redujo asimétricamente para las dos polaridades del Vm, de forma más pronunciada y con una cinética más rápida para la polaridad positiva que para la negativa (Figura 14B, i-ii; ver parámetros de Boltzmann en la Tabla 10); además, durante los pulsos +80 a +100 mV, se observó un incremento neto de las corrientes/conductancia. Esta curva de dependencia de voltaje bipolar es compatible con la existencia de dos mecanismos de compuerta en serie que operan con la polaridad opuesta del Vm y que inducen el cierre completo del canal para la polaridad negativa (Fasciani, Temperan et al. 2013). A partir de este comportamiento de los hemicanales a nivel macroscópico se puede inferir que los hemicanales de Cx43WT están cerrados a valores hiperpolarizados del Vm, se abren progresivamente con el grado de despolarización y una vez activados se cierran parcialmente a potenciales de membrana de mayor polaridad positiva. Los niveles de expresión de las corrientes de los hemicanales mutados registradas en los oocitos Cx43R148Q en ausencia de cationes divalentes en la solución extracelular fueron similares a la de los oocitos Cx43WT, mientras que en los oocitos Cx43V85M mostraron una reducción de las corrientes significativa de aproximadamente el 50% (Figura 14C). En ambos casos, sin embargo, las propiedades de regulación por voltaje fueron indistinguibles a las previamente descritas para los hemicanales Cx43WT (Figura 14B, i-ii; ver parámetros de Boltzmann en la Tabla 10). Este valor de conductancia reducido en los hemicanales de V85M corresponde aproximadamente al 50% (Figura 14C) y se correlaciona con una menor captación de yoduro de propidio y una disminución de la expresión de proteína que llega a la superficie celular con respecto al silvestre (Figura 12A-i; 13, B). En los experimentos de co-expresión de cada uno de los mutantes con la Cx43WT en los que se inyecto una mezcla de ARN mutado y silvestre en una relación 1:1 y a la misma concentración final que cada uno por separado, para simular la condición de heterocigosis de los pacientes, los niveles de corriente de los hemicanales en los oocitos Cx43R148Q+Cx43WT fueron similares a los inducidos por la Cx43WT, y en el caso de la combinación Cx43V85M+Cx43WT algo menores e intermedios a los registrados en los oocitos Cx43WT y Cx43V85M, sin embrago esta diferencia no resulto estadísticamente significativa (Figura 14C). Estos resultados indican que, como los hemicanales de Cx43WT, los hemicanales de Cx43R148Q y en menor medida los de Cx43V85M son capaces de aumentan la permeabilidad de la membrana celular en condiciones de baja concentración de cationes divalentes en el medio extracelular. En resumen, los dos mutantes analizados, la Cx43R148Q y la Cx43V85M, son capaces de acumularse en la membrana celular y de formar hemicanales funcionales homoméricos, y probablemente también heteroméricos con la Cx43WT, con unas propiedades de regulación por voltaje RESULTADOS 59 y una dependencia de los cationes divalentes extracelulares superponibles a la de los hemicanales silvestres de Cx43. Cuantitativamente, el mutante Cx43R148Q solo y en combinación con la proteína Cx43 silvestre indujo el mismo nivel de acumulación de Cx43 en la membrana plasmática y un aumento similar en la permeabilidad de membrana y en las corrientes iónicas transmembrana que la Cx43WT; por el contrario, la mutación Cx43V85M redujo significativamente y en la misma proporción los niveles de expresión en la membrana plasmática y los cambios en permeabilidad y en las corrientes transmembrana, sin embargo en los experimentos de coexpresión no indujo un efecto de inhibición dominante sobre la Cx43 silvestre. 3.6.1.4 FORMACIÓN Y FUNCIONALIDAD DE LOS CANALES INTERCELULARES MUTADOS . En la última etapa de la biosíntesis de los canales intercelulares, los hemicanales aportados por cada una de las células se unen y el canal recién formado se abre (Sohl, Maxeiner et al. 2005), Además de la función de adhesión que desempeñan los canales intercelulares al mantener en íntima aposición las membranas de las células vecinas, estos canales a través de su poro ponen en comunicación directa los citoplasmas de las células permitiendo el intercambio de iones y otras moléculas de hasta 1 kDa. 3.6.1.5 FORMACIÓN DE UNIONES EN HENDIDURA La inmunocitoquímica realizada en las células N2a 24 h después de ser transfectadas transitoriamente con un plásmido conteniendo la región codificante de la Cx43R148Q o de la Cx43V85M y la EGFP como reportador reveló la presencia de placas intercelulares en la zona de aposición entre las células, que son compatibles con la formación de “uniones en hendidura” por la agregación de cientos de canales intercelulares, similares a las que se encontraron entre las células transfectadas con el plásmido Cx43WT, pero que no se observaron en aquellas células que fueron transfectadas con el plásmido control pIRES-GFP (Figura 15A, flechas). Del mismo modo, se observó la formación de placas intercelulares en aquellas células que fueron co-transfectadas con ambas construcciones en una relación 1:1 a la misma concentración final (Cx43WT+Cx43R148Q y Cx43WT+Cx43V85M) (Figura 15B, flechas). Estos resultados indican que tanto los mutantes por separado como en co-expresión con la Cx43 silvestre son capaces de formar canales intercelulares. 3.6.1.6 ESTUDIOS DE ACOPLAMIENTO INTERCELULAR POR COLORANTE. Para determinar la funcionalidad de estos canales intercelulares formados por los mutantes Cx43R148Q y Cx43V95M por separado o en combinación con la Cx43WT se realizó una serie de experimentos en los que mediante la técnica de difusión intercelular de colorante se determinó su RESULTADOS 60 Figura 15. Formación de placas intercelulares por las Cx43R148Q y Cx43V85M. La línea N2a fue transfectada transitoriamente con los plásmidos Cx43WT, Cx43R148Q y Cx43V85M por separado (A) y con mezcla mutante:silvestre 1:1 a la misma concentración final (B). Las imágenes de microscopía confocal de la inmunocitoquimica de Cx43 muestras en todos los casos la formación de placas en la zona de contacto entre las células EGFP+, que siguieren la formación de “uniones en hendidura”. capacidad para permear carboxifluoresceína (CF; PM= 376 Da, -2). En estos experimentos, primero se seleccionaron en cada tipo de cultivo un grupo de células EGFP+, en una de ellas se inyectó por iontoforesis la CF (célula donadora) y se monitorizó en las células vecinas (células aceptoras) la 10 μm α-Cx43 Cx43-EGFP 10μm V85M-EGFP R148Q-EGFP (V85M-EGFP + Cx43-EGFP) (R148Q-EGFP + Cx43-EGFP) 10 μm10 μm 10 μm 10 μm EGFP 50 μm A B RESULTADOS 61 intensidad del colorante transcurridos los siguientes 10 min (Figura 16A, i y ii). En los cultivos transfectados con la Cx43WT el porcentaje de células EGFP+ aceptoras a las que había difundido la CF fue del 53 %, y en la mayoría de los casos con un coeficiente de acoplamiento o relación entre las intensidades entre las células aceptoras/célula próximo a uno; sin embargo, no se detectó en ningún caso acoplamiento intercelular entre las células EGFP+ de los cultivos transfectados con la Cx43R148Q y Cx43V85M, ni tampoco en los cultivos co-transfectados con cada uno de los mutantes y la proteína silvestre (Figura 16B). Estos resultados siguieren que los canales homoméricos formados por las conexinas mutadas no son funcionales y que en caso de los experimentos de co-expresión la funcionalidad de los canales de Cx43 se inhibe por la presencia de las conexinas mutadas, probablemente como consecuencia de la formación de canales intercelulares de tipo heteromérico entre las conexinas silvestre y mutadas. 3.6.1.7 ESTUDIOS DE ACOPLAMIENTO ELÉCTRICO INTERCELULAR. Estos estudios de acoplamiento eléctrico se realizaron en pares de oocitos que habían sido previamente inyectados con el ARN que codifica para la Cx43WT, la Cx43R148Q y la Cx43V85M por separado y con una mezcla de los ARNs mutados con el silvestre en una relación 1:1 y a la misma concentración final. Primero, se evaluó la capacidad de cada uno de los ARN mutados para formar canales intercelulares funcionales de tipo homomérico-homotípico apareando oocitos inyectados con el mismo ARN (i.e., pares homotípicos) y se midió con la técnica de doble fijación de voltaje con dos electrodos en cada célula, los niveles de corriente macroscópica que fluyen entre una célula a otra (i.e. la corriente intercelular, Ij) a través de la población de canales intercelulares abiertos que se han formados durante el tiempo de apareamiento. A diferencia de los pares de oocitos inyectados con la Cx43 WT que desarrollaron unos valores de conductancia intercelular (Gj = Ij / Vj) elevados (22 ± 1.9 µS), entre los pares R148Q-R148Q y V85M-V85M no se detectó flujo de corriente intercelular, como ocurrió en los pares controles en los que no se inyecto ARN (Figura 17, A y B; Cx43-Cx43 vs. R148Q- R148Q y V85M-V85M), indicando que ninguno de los dos mutantes es capaz forma canales funcionales. Por el contrario, en el caso de los pares heterotípicos que se indujeron apareando los oocitos Cx43WT con los de Cx43R18Q o Cx43V85M se detectó acoplamiento eléctrico, indicando que los canales heterotípicos homoméricos que se forman por la unión de los hemicanales mutantes con los hemicanales silvestres son funcionales, pero con unos valores macroscópicos de conductancia intercelular muy reducidos, menores en ≈ 95% a los registrados en los pares silvestres (Figura 17, A y B, Cx43-R148Q y Cx43-V85M). En los experimentos que se simulan la condición de heterocigosis de RESULTADOS 62 Figura 16. Transferencia de colorante a través de los canales homoméricos de Cx43WT, Cx43R148Q y Cx43V85M y de los canales heteroméricos de la Cx43WT con los mutantes de Cx43. A) (i) Imágenes de microscopio confocal (i) de luz transmitida del cultivo (izda), de las células EGFP+ (centro, a alta ganancia del fotodetector) y de las células inyectadas con la CF (flecha) y de las células vecinas transcurridos 10 min desde el inicio de la inyección intracelular (dcha, a baja ganancia del fotodetector), y (ii) curso temporal de la intensidad en la célula donadora y en las células aceptoras. B) Porcentaje de acoplamiento. Solo se detectó difusión de CF entre las células EGFP+ de los cultivos de Cx43WT; dicho acoplamiento intercelular se inhibe en presencia de ambos mutantes. (promedio + SE, NA; no acoplamiento; N, nº cultivos, n, nº de células inyectadas, *, p<0.05). Tiempo (min) 0 2 4 6 8 10 Intensidad CF (U.A) 0 50 100 150 Tiempo (min) 0 2 4 6 8 10 Intensidad CF (U.A) 0 50 100 150 Tiempo (min) 0 2 4 6 8 10 Intensidad CF (U.A) 0 50 100 150 G 1200 Cx43-EGFP Ex: 488nm Em: 540 nm 2 1 3 2 1 3 G 900 2 1 3 G 1200 V85M-EGFP 2 1 G 900 2 1 2 1 G 1200 R148Q-EGFP 2 1 G 900 2 12 1 Tiempo (min) 0 2 4 6 8 10 Intensidad CF (U.A) 0 50 100 150 A B Célula 1 donadora Células 2 y 3 aceptoras Célula 1 donadora Célula 2 aceptora Célula 1 donadora Célula 2 aceptora 40 μm 40 μm 40 μm Tiempo (min) 0 2 4 6 8 10 Intensidad CF (U.A) 0 50 100 150 Célula 1 donadora Células 2 y 3 aceptoras Célula 1 donadora Célula 2 aceptora G 1200 (R148Q+Cx43)-EGFP 2 12 1 G 900 33 2 13 G 1200 (V85M+Cx43)-EGFP 2 1 G 900 2 12 1 40 μm 40 μm Cx43 R148Q V85M (R148Q+ Cx43) (V85M + Cx43) % células acopladas 0 20 40 60 80 100 N=5 n=30 N.A N=4 n=18 N.A N=3 n=12 N.A N=3 n=15 N.A N=3 n=11 CF CF CF CF CF i) ii) * * * * RESULTADOS 63 Figura 17. Niveles de acoplamiento eléctrico entre pares de oocitos inducidos por la Cx43R148Q (A) y la Cx43V85M (B) por separado y en combinación con la Cx43 silvestre. Los oocitos inyectados con los ARNs de la Cx43WT, la Cx43R148Q y la Cx43V85M o con una mezcla 1:1 de silvestre y mutante para la misma concentración final se aparearon en sus posibles combinaciones homotípìcas y heterotípicas. Los valores de conductancia macroscópica intercelular registrados muestran que entre los pares de Cx43-Cx43 se desarrolló un alto grado de acoplamiento eléctrico, mientras que los pares R148Q y V85M, como los controles, no se acoplaron; las combinaciones de pares heterotípicos entre los oocitos Cx43WT y los oocitos R148Q y V85M se acoplaron entre sí pero con muy bajos niveles de conductancia intercelular y la coexpresión de cada uno de los mutantes con la Cx43 silvestre produjo en todas las combinaciones ensayadas un potente efecto de inhibición dominante, reduciendo el acoplamiento a niveles residuales. (Valores promedio ± s.e; NA, no acoplamiento; N, nº experimentos y n, nº de pares de oocitos; *, p<0.05, h.d.a, horas de apareamiento). R148Q Control Cx43 - Cx43 R148Q - R148Q Cx43 - R148Q (Cx43+R148Q) -(Cx43+R148Q) Cx43 - (Cx43+R148Q) R148Q - (Cx43+R148Q) Conductancia intercelular (uS) 24 h.d.a 0 5 10 15 20 25 30 N.A N=3 n=12 N.A N=3 n=4 0.6±0.17 N=3 n=17 22±1.9 N=12 n=31 N.A N= 10 n=23 0.16±0.12 N=3 n=8 0.8±0.46 N=3 n=4 V85M Control Cx43 - Cx43 V85M - V85M Cx43 - V85M (Cx43+V85M) - (Cx43+V85M) Cx43 - (Cx43+V85M) V85M - (Cx43+V85M) Conductancia intercelular (uS) 24 h.d.a 0 5 10 15 20 25 30 N.A N=9 n=24 0.10±0.09 N= 12 n=39 0.11±0.02 N=3 n=5 0.64±0.26 N=3 n=17 0.21±0.11 N=3 n=9 N.A N= 10 n=23 22±1.9 N=12 n=31 A B * * * * * * * * * * RESULTADOS 64 los pacientes en los que aparean entre si los pares coinyectados con la Cx43WT y la Cx43R148Q o con la Cx43V85M en una relación 1:1, los niveles de acoplamiento intercelular fueron también residuales (<95%; Figura 17, A y B, Cx43+R148Q-Cx43+R1448Q y Cx43+V85M-Cx43+V85M), indicando que ambas conexinas mutadas producen un potente efecto de inhibición dominante sobre la funcionalidad de la Cx43 silvestre. Dicho efecto de dominancia negativa también se produjo apareando los oocitos que coexpresan la proteína silvestre con cualquiera de las dos mutadas apareados con los oocitos Cx43WT y en mayor medida con los oocitos que solo expresan cada uno de los mutantes (Figura 17, A y B; Cx43WT-(Cx43+R148Q) o Cx43WT-(Cx43+V85M) y R148Q-(Cx43+R148Q) o V85M- (Cx43+V85M). 3.6.1.8 DEPENDENCIA DEL VOLTAJE INTERCELULAR DE LOS CANALES INTERCELURES MUTADOS. A continuación se analizó si las mutaciones Cx43R148Q y Cx43V85M, además de reducir el grado de acoplamiento, podrían también alterar a las propiedades de regulación por el voltaje intercelular (Vj) de los canales intercelulares silvestres. La dependencia de Vj de los canales formados por la Cx43 humana se caracteriza, como ya ha sido descrito previamente (Bukauskas, Bukauskiene et al. 2001 ), por el cierre de las corrientes intercelulares (Ij) para gradientes de Vj por encima de 40 mV para las dos polariades del voltaje, a valores progresivamente menores y mas rapidamente con el incremento del Vj (Fig 18A-i). La curva Gj / Vj muestra que el valor instantáneo de la conductancia intercelular (Gji) no varía significativamente en función del voltaje aplicado, que el valor de estado de la conductancia (Gjss) es máximo entre +40 y -40 mV (Gjmax) y que se reduce progresivamente con el incremento del Vj hasta alcanzar valores residuales o de conductancia mínima distintos de cero (Gjmin) (Fig 18A-ii); los parámetros de sensibilidad a voltaje que se obtuvieron ajustando la curva Gjss / Vj para cada polaridad del Vj a una ecuación Boltzmann se muestran en la Tabla 11. Las propiedades de regulación por voltaje de los canales intercelulares que se forman entre los pares de oocitos en los que ambas células coexpresan la Cx43WT y la Cx43R148Q, fueron muy similares, sino idénticas, a las de los canales homoméricos de Cx43WT (Figura 18B, i y ii; Tabla 11). Sin embargo, los canales que se forman entre los pares de oocitos que coexpresan la Cx43V85M con la Cx43WT mostraron nuevas propiedades de regulación por voltaje ya que estos canales responden a los pulsos despolarizantes e hiperpolarizantes (>+60 mV) primero, con una reducción rápida de las corrientes intercelulares, como los canales de Cx43WT, seguida por un aumento progresivo con una cinética más lenta (Figura 18C, i y ii). También se analizaron las propiedades de regulación por voltaje del acoplamiento mediado por los canales con una composición asimétrica en Cx43, como son los canales de tipo heterotípico homomérico que se forman entre los pares Cx43WT-Cx43R148Q y Cx43WT-Cx43V85M (Figura 19) y RESULTADOS 65 Figura 18. Propiedades de regulación por el voltaje intercelular de los canales silvestres de Cx43 (A) y de los canales que median el acoplamiento entre los pares de oocitos coinyectados con la Cx43R148Q (B) o con la Cx43V85M y la Cx43WT (C). (i) Registro crudo de las corrientes intercelulares (Ij) inducidas por pulsos de voltaje intercelular (Vj) de +120 mV, en incrementos de 20 mV y de 5 s de duración; (ii) Graficas conductancia/voltaje representado el valor inicial (Gji, ○) y de estado de la conductancia intercelular (Gjss;●) o de la conductancia mínima (Gjmin en C); la curva para cada polaridad del Vj representa el ajuste de los valores promedio de Gjss a una ecuación de Botzmann con los parámetros que se muestran en la Tabla 11. La dependencia de Vj de los canales de Cx43WT se caracteriza a nivel macroscópico por un comportamiento óhmico de la Gji y una Gjss máxima entre + 40 mV que se redujo progresivamente hasta valores mínimos (Gjmin) con el incremento del gradiente de Vj para la dos polaridades del voltaje (curvas en azul); en el caso de los pares homotípicos Cx43+R148Q las propiedades de regulación fueron muy similares (B), mientras que en los pares homotípicos aplicados en Cx43+V85M la responde al Vj fue bifásica, primero disminuye el acoplamiento y luego aumenta (C).En (ii n= 6 pares de oocitos. Cx43 +V85M V1I2 Cx43 +V85M Cx43 Cx43 Cx43 +R148Q V1I2 Cx43 +R148Q 50 nA 1 s Ij IiIss Imin 500 nA 1 s Ij Ii Iss 50 nA 1 s Ij Ii Iss A Vj (mV) -120 -80 -40 0 40 80 120 Gj 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Gji Gjss Vj (mV) -120 -80 -40 0 40 80 120 Gj 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Gji Gjss V1I2 ii) 100 mV 1 s +120 mV -120 mV Vj 100 mV 1 s +120 mV -120 mV Vj 100 mV 1 s +120 mV -120 mV Vj B C i) ii) i) ii) i) Vj (mV) -120 -80 -40 0 40 80 120 Gj 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Gji Gjmin Gjss RESULTADOS 72 que se representa el curso temporal del acoplamiento dentro el cultivo, se observa que durante el llenado de colorante en la célula inyeactada o donadora ya se produce la difusión del colorante a las células aceptoras de primer orden y que en menos de dos minutos esta alcanza la misma intensidad que la de la célula donadora (i.e., el coeficiente de acoplamiento es 1); con el incremento de orden de las células aceptoras de orden superior la difusión es más lenta y el coeficiente de acoplamiento se reduce progresivamente (Figura 21B-ii). En los cultivos transfectados con los plásmidos que contienen la región codificante de la Cx43WT, la Cx43R148Q y la Cx43V85M y la EGFP como gen reportador, se verificaron con inmunohistoquímica frente a Cx43 (Figura 22A). El estudio de transferencia de la CF reveló que cuando el colorante se inyectaba en las células del cultivo GFP+ Cx43WT el número de células GFP- a las que difundía el colorante era similar al de los cultivos controles; sin embargo, en los cultivos en ninguna de las inyecciones de células Cx43V85M EFGP+ el colorante difundió a ninguna de las células vecinas EGFP- y en el caso de los cultivos Cx43R148Q a un porcentaje muy reducido, 5+1 % y con un coeficiente de acoplamiento muy bajo 0.1+ 0.01 (Figura 22, B y C) 3.6.2 INTERACCIÓN ENTRE LAS CONEXINAS SILVESTRE Y MUTADAS CON LA CONEXINA-30 ASTROCITARIA. Como los astrocitos además de la Cx43 expresan la Cx30 (Dermietzel, Traub et al. 1989; Dahl, Manthey et al. 1996; Nagy, Patel et al. 1999; Rash, Yasumura et al. 2001; Altevogt and Paul 2004; Levit, Sellitto et al. 2015), a continuación analizamos si las Cx43 mutadas (R148Q y V85M) interaccionaban funcionalmente con la Cx30 humana. Previo a este estudio fue necesario realizar una serie de experimentos dirigidos a esclarecer la compatibilidad funcional entre estas dos conexinas astrocitarias, dada la escasa información actualmente disponible y contradictoria a este respecto (Manthey, Banach et al. 2001; Orthmann-Murphy, Freidin et al. 2007) 3.6.2.1 EFECTO DE TRANSREGULACIÓN DE LA Cx43 SILVESTRE SOBRE LA EXPRESIÓN DE LA Cx30. En una primera aproximación se compararon los niveles de expresión de la Cx43 y la Cx30 inducidos en los oocitos inyectados con cada ARN a la misma concentración por separado y combinados. A las 48 h después de las inyecciones se valoró mediante western blot el nivel de expresión total de ambas conexinas. La cuantificación de la bandas de Cx43 y de Cx30 mostró que mientras los niveles de la banda correspondiente al monómero de Cx43 no varían entre los oocitos solo inyectados con el ARN de la Cx43 y los oocitos en los que se inyectó junto con la Cx30; los niveles de expresión de la banda correspondiente al monómero de la Cx30 en los oocitos coinyectados fueron significativamente menores, en ≈ 60 + 16%, para los mismos niveles de control de carga de GAPDH, respecto al de los oocitos exclusivamente inyectados con el ARN de la Cx30 (Figura 23A, i y ii). Los RESULTADOS 73 Figura 23. Efecto de transregulación de la Cx43 silvestre sobre la expresión de la Cx30. A) (i) Western blots para la Cx43 y la Cx30 de las muestras de lisado de los oocitos y de las células N2a inyectadas o transfectadas, respectivamente, con los ARNs o los plásmidos de la Cx43WT y de la Cx30 por separado o con una mezcla de cada uno ellos a la misma concentración final (en µg), y para GAPDH como control de carga y (ii) cuantificación de la intensidad de las bandas de 40 KDa de la Cx43 y de 30 KDa de la Cx30 normalizadas respecto a la banda de GAPDH (35 kDa). B) Western blots para la Cx43 y la Cx30 de las muestras de lisado de los oocitos inyectadas con el ARN de la Cx30 solo (0,25 µg) y con el ARN de la Cx43WT a baja y alta concentración (0,06 y 0.12 µg) en ausencia y presencia de cloroquina (CQ, 300 µg durante 24 h) y (ii) cuantificación de la intensidad de las bandas de 40 KDa de la Cx43 y de 30 KDa de la Cx30 normalizadas respecto a la banda de GAPDH (35 kDa). C) Tasa de degradación por la vía lisosomal de la Cx43 y la Cx30 (i y ii), calculada de los experimentos mostrados en B. La expresión de Cx30 se redujo en presencia de Cx43 (en A) y de forma dosis dependiente (en B); la tasa de degradación lisosomal de la Cx43 y en menor medida de la Cx30 se redujo en función de los niveles de Cx43 (en C). (Se representa ± s.e; N, nº de experimentos; *, p < 0.05). 0 20 40 60 80 100 120 intensidad de las bandas (%) * * Cx43 + + - + + + - + Cx30 - + + + - + + + oocitos N2a α-Cx43 α-Cx30 A B Oocitos Cx43 (40 KDa) Cx30 (30 KDa) GAPDH (35 KDa) Células N2a 0 100 200 300 400 Intensidad de las bandas (%) 0 100 200 300 400 Intensidad de las bandas (%) * Cx43 - 0,6 0,12 - 0,6 0,12 CQ - - - + + + α-Cx43 α-Cx30 Cx43 - 0,6 0,12 - 0,6 0,12 CQ - - - + + + i) ii) i) ii) i) Cx43 (40 KDa) Cx30 (30 KDa) GAPDH (35 KDa) 24h sin CQ 24h + 300 μM CQ N=5 N=5 N=5 0 100 200 Tasa de degradación de Cx30 Tasa de degradación de Cx43 0 100 200 Cii) 0,6 μg/ μl 0,12 μg/ μlCx43 - 0,6 μg/ μl 0,12 μg/ μl RESULTADOS 74 experimentos realizados en la línea celular N2a transfectando transitoriamente los cultivos con el plásmido Cx43-IRES-EGFP y Cx30-IRES_EGFP por separado y con una mezcla de cada uno de ellos a la misma concentración mostraron resultados muy similares (Figura 23A, i y ii). La reducción de los niveles de Cx30 en los oocitos aumentó con el incremento de la expresión de la Cx43 (Figura 23B, i y ii). En condiciones de bloqueo de la vía de degradación lisosomal con cloroquina (300 µm durante 24 h), se observó un incremento en la acumulación de ambas conexinas (Figura 23B, i y ii) con una tasa de degradación, calculada como la diferencia entre los niveles de expresión sin y con CQ, que en el caso de la Cx43 se redujo con el incremento de sus niveles de expresión; y en el caso de la Cx30 no varío con los niveles bajos de expresión de la Cx43 y se redujo en un 20% con los más altos (Fig, 23C, i y ii). 3.6.2.2 FORMACIÓN DE UNIONES EN HENDIDURA DE Cx43 Y Cx30 La imágenes de confocal de la ínmunocitoquímica de las células N2a 24 h después de que los cultivos fueran transfectados con la Cx30 o con la Cx43 mostró la presencia de placas en las zonas de contacto intercelular, sugerentes de la formación de uniones en hendidura, entre las células homólogas y su ausencia entre células heterólogas que expresan las distintas conexinas (Figura 24A), indicando que las Cx43 y Cx30 son incompatibles para formar canales intercelulares de tipo homomérico heterotípico. En los experimentos en los que las células fueron cotransfectadas con la Cx43 y la Cx30 se observó la formación de placas intercelulares de Cx43, de Cx30 y mixtas (Figura 24B); sin embargo, cuando se aparearon las células que expresan solo la Cx43 o solo la Cx30 con células que coexpresan las dos conexinas, solo se observaron en el primer caso placas de Cx43 y en segundo solo de Cx30 (Figura 24C), confirmando la incompatibilidad de las dos conexinas para formar canales intercelulares de tipo heterotípico-homomérico y tampoco de tipo homomérico-heteromérico, y sugiriendo que las placas mixtas observadas entre las células que coexpresan ambas conexinas corresponden a la agrupación de canales homotipicos-homomericos de Cx43 y de Cx30. 3.6.2.3 ESTUDIOS DE ACOPLAMIENTO INTERCELULAR POR COLORANTE DE Cx43 Y Cx30 Se estudiaron las propiedades de permeabilidad de los canales homotípicos homoméricos de Cx30 y Cx43 y de los canales heterotípicos homoméricos de Cx30-Cx43. Se empleó el colorante aniónico carboxifluoresceína (CF) y el colorante catiónico yoduro de propidio (YP). Para distinguir las células transfectadas con Cx43 y Cx30 se emplearon dos contrucciones que incluían dos proteínas fluorescentes: GFP para la Cx30 y dsRED para la Cx43. Las imágenes (Figura 25A) muestran que los canales homotípicos homoméricos de Cx43 así como los de Cx30 son permeables a ambos colorantes, sin embargo no se registró difusión de ninguno de los dos colorantes desde una célula que expresara Cx30 a una que expresara Cx43 ni viceversa. El curso temporal obtenido tras cuantificar la intensidad RESULTADOS 75 Figura 24. Formación de placas intercelulares por las Cx43 y Cx30. Se transfectó transitoriamente la línea celular N2a con los plásmidos Cx43 y Cx30 por separado y con la mezcla mutante-silvestre 1:1 a la misma concentración final (A, B y C). Las imágenes de microscopía confocal tras realizar inmunocitoquímica muestran la presencia estructuras compatibles con uniones o placas en hendidura entre células que expresan Cx43 o Cx30 ausente en todos los pares analizados de Cx43-Cx30 (A). El análisis de las células que coexpresaban las dos conexinas revela placas mixtas (B), sin embargo, los cocultivos de células que expresaban Cx43 o Cx30 con células que coexpresan Cx43 y Cx30 sugieren que las placas mixtas se deben a la colocalización de canales homotípicos homoméricos de ambas conexinas. 10 μm Cx30-EGFP / Cx30-EGFP α-Cx30 Cx43-EGFP / Cx30-EGFP α-Cx43 α-Cx30 (Cx43-EGFP + Cx30-EGFP) (Cx43-EGFP + Cx30-EGFP) α-Cx43 α-Cx30 Cx30-EGFP/(Cx43 + Cx30) α-Cx43 α-Cx30 Cx43-EGFP/(Cx43 + Cx30) Cx43-EGFP / Cx43-EGFP α-Cx43 (Cx43-EGFP + Cx30-EGFP) A C B 10 μm 10 μm RESULTADOS 76 Figura 25. Transferencia de colorante a través de los canales homoméricos de Cx43 y Cx30 y de los canales heterotípicos de la Cx43 con la Cx30. Se cocultivaron células N2a transfectadas con la Cx43 y con la Cx30. A) Imágenes con microscopio confocal de luz transmitida (izda), de las células EGFP+ (centro, alta ganancia del fotodetector, G:1200), y de las células inyectadas con CF o YP (dcha, flecha) (i). Curso temporal de difusión de colorante de la célula donadora y la célula aceptora (ii). B) Porcentaje de acoplamiento entre células que expresan Cx43-Cx43, Cx30-Cx30 y Cx43-Cx30. Se detectó un mayor nivel de difusión en pares de células que expresaba Cx43 comparado a los pares que expresaban Cx30, sin embargo, no se encontró acoplamiento en ninguno de los pares analizados entre células que expresaban Cx30 y Cx43 ni al inyectar la célula RED+ ni al inyectar la célula GFP+. NA; no acoplamiento; N, nº cultivos, n, nº de células inyectadas. % células acopladas 0 20 40 60 80 100 CF IP N.A N=3 n=4 N.A N=3 n=4 N=4 n=11 N=4 n=17 N=8 n=18 N=8 n=18 N.A N=3 n=3 N.A N=3 n=7 A B Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 Intensidad (U.A) 0 25 50 75 100 125 150 Célula 1: Donadora (Cx30) Célula 2 aceptora Cx30 Célula 3 aceptora Cx43 Tiempo (min) 0246810 12 Intensidad CF (U.A) 0 50 100 150 200 Célula 1 donadora Cx43 Célula 2 aceptora Cx30 Célula 3 aceptora Cx43 G 900 G 900 G 1200 G 1200 Cx43-dsRED Ex: 568 nm Em: 640 nm Cx30-EGFP Ex: 488nm Em: 540 nm 1 2 3 G 1200 G 1200 Cx43-dsRED Cx30-EGFP 12 3 40 μm 40 μm 1 2 3 12 312 3 1 2 3 CF YP i) ii) RESULTADOS 77 de fluorescencia (verde o roja) de cada célula marcada al inicio de la transferencia durante 10 minutos (CF) o 20 minutos (YP) muestra cómo aumenta la intensidad de verde de la célula que expresa Cx43 inyectada con carboxifluoresceína así como aumenta la intensidad de una célula adyacente que expresa Cx43 mientras que la célula que expresa Cx30 no ve modificada su intensidad de fluorescencia. En el caso contrario vemos como la intensidad de rojo va aumentando en la célula que expresa Cx30 inyectada con yoduro de propidio así como en la célula adyacente que también expresa Cx30 pero no aumenta en la célula que expresa Cx43 (Figura 25B). Se calculó el porcentaje de células acopladas analizadas con ambos tipos de colorante (Figura 25B) indicando que tanto para YP como para CF la Cx43 es más permeable que la Cx30 y que en ningún caso se encontró acoplamiento a través de canales heterotípicos con ninguno de los dos colorantes. 3.6.2.4 ESTUDIOS DE ACOPLAMIENTO ELÉCTRICO DE Cx43 y Cx30. DEPENDENCIA DE VOLTAJE INTERCELULAR (Vj) Mediante la técnica de fijación de voltaje con dos electrodos se midió la corriente transmembrana y se calculó el nivel de acoplamiento eléctrico según la fórmula: Gji=Iji/Vj. de los posibles canales formados por Cx43 y Cx30. Los pares de oocitos que coexpresaban ambas conexinas (Cx43+Cx30)-(Cx43+Cx30) tenían un nivel de acoplamiento eléctrico (Figura 26) similar al de los pares Cx43-Cx43 o Cx30-Cx30 mientras que los pares heterotípicos Cx43-Cx30 no estaban acoplados al igual que los oocitos control. Además de medir los niveles de acoplamiento eléctrico, se analizaron las propiedades de regulación por voltaje de los pares formados por canales de Cx43 y Cx30. En estos experimentos se observó que los canales homoméricos homotípicos de Cx30 (Figura 27A) tienen una sensibilidad a voltaje mayor que los canales homotípicos de Cx43 con un comportamiento simétrico para las dos polaridades. La curva Gjss/Vj (Figura 27B) ajustada una ecuación de Boltzmann (ver parámentros en la Tabla 12) muestra que estos canales adquieren un valor de conductancia máxima entre ±40 mV que disminuye bruscamente a un valor de conductancia muy reducido para pulsos de >±60 mV. Los canales homotípicos heteroméricos formado por oocitos que coexpresan Cx43 y Cx30 tienen unas propiedades de regulación por voltaje idénticas a los canales de Cx43 homotípicos (Figura 27A) donde se observa un valor de conductancia máxima para pulsos <±40 mV y un valor de conductancia mínima para pulsos de ± 120 mV. Estos canales no presentan rectificación instantánea pero sí rectificación del valor de estado (Figura 27B) que tras ajustar a una ecuación de Boltzmann (ver parámentros en la Tabla 12) indica una dependencia a voltaje del canal simétrica que disminuye para los dos polaridades menos sensible a pulsos de voltaje que los canales homotípicos de Cx30-Cx30. 3.6.2.5 Efecto de las mutaciones R148Q y V85M sobre el acoplamiento intercelular de Cx30 En el análisis de expresión de los mutantes en coexpresión con la Cx30 se identificaron dos bandas de 30 y 40 KDa correspondientes a los lisados de células contransfectadas con Cx30 y R148Q RESULTADOS 78 Figura 26. Niveles de acoplamiento eléctrico entre pares de oocitos inyectados con la Cx43 y la Cx30 por separado y coinyectados con ambas conexinas. Los oocitos se inyectaron con ARN de Cx43, Cx30 o con una mezcla 1:1 a la misma concentración final y se aparearon teniendo en cuenta todas las combinaciones posibles. Los valores promedio de conductancia macroscópica (± s.e) indican que a pesar de encontrar acoplamiento eléctrico en los pares que expresaban Cx43 y en los pares que expresaban Cx30, la combinación Cx43-Cx30, al igual que los controles no inyectados, no estaba acoplada. El resto de combinaciones presentaron un valor promedio de conductancia elevado al igual que los canales homotípicos homoméricos de Cx43 o Cx30 a excepción de la combinación Cx30-(Cx43+Cx30) donde se observó una reducción significativa del acoplamiento. (NA, no acoplamiento; N, nº experimentos y n, nº de pares de oocitos; *, p<0.05, h.d.a, horas de apareamiento). Control Cx30-Cx30 (0.12) Cx43-Cx43 (0.12) Cx30 (0.12) - Cx43(0.12) (Cx30+Cx43)-(Cx30+Cx43) (0.12+0.12) Cx30 (0.12) - (Cx30+Cx43) (0.12+0.12) Cx43 (0.12) - (Cx30+Cx43) (0.12+0.12) Conductancia intercelular (uS) 24 h.d.a 0 10 20 30 18.5±4.9 N=3 n=9 0.11±0.02 N=3 n=9 N. A N= 10 n=23 20.1±1.9 N=10 n=23 N. A N= 4 n=19 9.3±6.7 N=3 n=5 16±4 N=3 n=5 RESULTADOS 79 Figura 27. Propiedades de regulación por el voltaje intercelular de los canales de Cx43 (A), de los canales de Cx30 y de los canales que median el acoplamiento entre los pares de oocitos coinyectados con la Cx43 y Cx30 (C). (i) Registro crudo de las corrientes intercelulares (Ii) de los pares homotípicos homoméricos Cx30-Cx43 y Cx30-Cx30 y de los pares heteroméricos Cx43+Cx30/Cx43+Cx30 inducidas por pulsos de voltaje intercelular (Vj) de ±120 mV en intervalos de 20 mV de 5 segundos de duración.(ii) Curvas que representan los valores promedio Gj/Vj (±s.e) de la conductancia instantánea (Gi) y de la conductacia del valor de estado (Gss) para cada pulso de voltaje ajustadas a una ecuación Boltzmann (Tabla 12) (N=3, n=4). La curva Gj/Vj de los pares que expresan Cx43 se superpone a la de los pares coinyectados con ambas conexinas (Cx43+Cx30)- (Cx43+Cx30) y se caracteriza por presentar una conductancia máxima entre ±40 mV que disminuye de forma gradual hasta alcanzar el valor de conductancia mínimo con el pulso de ± 120 mV. En cambio, los pares que expresan Cx30, presentan una conductancia máxima entre ± 40 mV que disminuye drásticamente a partir del pulso de ± 60 mV alcanzando a partir de este pulso un valor mínimo de conductancia residual (N=3, n= 5). Cx43 Cx43 50 nA 1 s Ij Ii Iss Cx30 Cx30 V1I2Cx30 +Cx43 Cx30 +Cx43 V1I2 100 nA 1 s Ij Iss Ii A Vj (mV) -120 -80 -40 0 40 80 120 Gj 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Gji Gjss V1I2 Vj (mV) -120 -80 -40 0 40 80 120 Gj 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Gji Gjss Vj (mV) -120 -80 -40 0 40 80 120 Gj 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Gji Gjss 100 mV 1 s +120 mV -120 mV Vj BC i) i) i) ii) ii) ii) 100 mV 1 s +120 mV -120 mV Vj 100 mV 1 s +120 mV -120 mV Vj 100 nA 1 s Ij Ii Iss RESULTADOS 80 o Cx30 y V85M. Como control de carga se empleó GAPDH que migra a 36 KDa. Los resultados obtenidos de la cuantificación del western blot (Figura 28A) revelaron que la intensidad de la banda de Cx30 en los lisados de oocitos transfectados con Cx30 es igual a la intensidad de la banda del lisado de oocitos transfectados con Cx30 y el mutante R148Q mientras que disminuye significativamente (≈ 53 + 18 %) al coexpresarse con el mutante V85M del mismo modo que observamos al coexpresar Cx30 con Cx43 .También observamos una disminución de la intensidad de la banda de Cx43 en el mutante V85M comparado con R148Q mostrada previamente en el análisis de expresión de dichas mutaciones (Figura 12, A). Estos datos sugieren que el mutante R148Q ha perdido la capacidad que tiene la Cx43 de transregular la expresión de Cx30 mientras que el mutante V85M mantiene el efecto de regulación sobre Cx30 a pesar de presentar un nivel de expresión más reducido que la Cx43 silvestre. La inmunocitoquímica de células N2a reveló la formación de placas homotípicas homoméricas en células transfectadas con Cx30 o con R148Q pero en ningún caso se encontraron placas heterotípicas homoméricas de Cx30-R148Q al mezclar dos poblaciones de células transfectadas de forma independiente con ambas conexinas. Las células cotransfectadas muestran la formación de placas mixtas del mismo tipo que las que aparecen al coexpresar Cx30 y Cx43 (Figura 28B-ii). En el caso del otro mutante, se identificaron placas en células transfectadas con Cx30 o con V85M pero tampoco se observaron placas heterotípicas homoméricas en ninguno de los campos analizados (Figura 28B-i). La inmunocitoquímica de células cotransfectadas con Cx30 y V85M mostraron placas mixtas iguales a las de la Cx43WT cuando se cotransfecta con la Cx30 (Figura 28B-ii). Al analizar el nivel de acoplamiento eléctrico de los canales formados por oocitos inyectados con Cx30 y los mutantes de Cx43 no encontramos diferencias siginificativas entre los valores promedio de conductancia de los canales homotípicos homoméricos Cx30-Cx30 y los canales heteroméricos homotípicos (Cx30+R148Q)-(Cx30+R148Q) mientras que los canales heterotípicos Cx30-R148Q estaban no acoplados igual que los controles no inyectados (Figura 29A). En el caso del mutante V85M, los canales heteroméricos homotípicos (Cx30+V85M)-(Cx30+V85M) presentaban un valor promedio de acoplamiento eléctrico de 9.4 µS (± s.e), inferior a los 12.5 µS (± s.e) registrados en los oocitos inyectados con Cx30 pero no significatvamente diferentes (p=0,329). Sin embargo los pares homoméricos heterotípicos Cx30-V85M no estaban acoplados eléctricamente (Figura 29B). Las propiedades de regulación por voltaje se determinaron aplicando un protocolo de pulsos de voltaje de ±120 mV con incrementos de +20mV durante 5 segundos y se registraron las corrientes intercelulares (Ij). Los resultados del registro crudo (Figura 30A) indican que tanto R148Q como V85M RESULTADOS 81 Figura 28. Transregulación de la expresión y formación de placas de entre Cx30 y los mutantes de Cx43. A). Western blot de proteína total de oocitos inyectados con Cx30, Cx30+R148Q y Cx30+V85M. Se observan tres bandas de 40KDa, 30KDa y 35KDa correspondientes al monómero Cx43, Cx30 o GAPDH respectivamente. Histograma que indica los valores promedio ± s.e de la expresión de Cx30 sóla o en coexpresión con los mutantes de CX43 (N= 3, n=60-80). El mutante V85M disminuye de forma significativa la expresión de Cx30 cuando ambos se coexpresan, sin embargo, no se observan cambios en los niveles de expresión de Cx30 al coexpresar con R148Q (* = p<0.05). B. Imágenes de microscopía confocal que muestran placas en la zona de aposición entre dos células (flechas) en un cultivo transfectados con Cx30, un cultivo mixto de céulas transfectadas o con mutante de Cx43 o con Cx30 y en células cotransfectadas con Cx30 y mutante de Cx43. No se observaron placas heterotípicas entre Cx30 y R148Q (i) aunque sí se encontraron placas mixtas homotípicas heteroméricas al coexpresar Cx30+R148Q del mismo tipo que las encontradas cuando se coespresaban Cx30+Cx43 (ii). Se identificaron placas homotípicas homoméricas de V85M y de Cx30 o Cx30 y V85M. Como control de carga se empleó GAPDH que migra a 36 KDa. Los resultados obtenidos de la cuantificación del western blot (Figura 28A) revelaron que la intensidad de la banda de Cx30 en los lisados de oocitos transfectados con Cx30 es igual a la intensidad de la banda del lisado de oocitos transfectados con Cx30 y el mutante R148Q mientras que disminuye significativamente (≈ 53 + 18 %) al coexpresarse con el mutante V85M del mismo modo que observamos al coexpresar Cx30 con Cx43 .pero no heterotípicas al mezclar estas dos poblaciones de células (i). También se identificaron placas homotípicas heteroméricas mixtas muy similares a las formadas cuando se ceoxpresaban Cx43+Cx30 (ii). 0 40 80 120 160 200 240 Intensidad de las bandas (U. A) * * A B (Cx30-EGFP+V85M- EGFP) (Cx30-EGFP+R148Q- EGFP) Cx43 (40KDa) Cx30 (30KDa) GAPDH (35KDa) Cx30 R148Q V85M α-Cx43 α-Cx30 - + - + + + + + + + - - - + - - - - + + - - - + i) ii) Cx30-EGFP / V85M- EGFP Cx30-EGFP / R148Q- EGFP R148Q-EGFP / R148Q- EGFP V85M-EGFP / V85M- EGFP Cx30-EGFP / Cx30- EGFP α-Cx43 α-Cx30 10 μm Cx30-EGFP / Cx30- EGFP RESULTADOS 88 Figura 33. Niveles de acoplamiento eléctrico entre pares de oocitos que expresan Cx47, Cx43WT, y los mutantes en todas las combinaciones posibles. Los oocitos se inyectaron con ARNs de Cx47, Cx43, Cx43R148Q y Cx43V85M solos o coinyectados en una proporción 1:1 silvestre y mutado con la misma concentración final. Los valores promedio de conductancia macroscópica muestran unos niveles elevados de acoplamiento en los pares heterotípicos de Cx43-Cx47 no observado en los pares Cx47-R148Q ni en los controles no acoplados. En los pares Cx43-V85M los niveles de conductancia se redujeron en más de un 99 % al igual que en los pares heterotípicos heteroméricos que simulan la condición heterocigota de los pacientes Cx47- (Cx43+R148Q) y Cx47-(Cx43+V85M) donde se observan niveles de acoplamiento residual en ambos mutantes sugiriendo un potente efecto de inhibición dominante tanto de Cx43R148Q como de Cx43V85M sobre los canales intercelulares de Cx43WT-Cx47. (Valores promedio ± s.e; NA, no acoplamiento; N, nº experimentos y n, nº de pares de oocitos; *, p<0.05, h.d.a, horas de apareamiento). Control Cx47 (0.12) - Cx43 (0.12) Cx47 (0.12) - V85M (0.12) Cx47 (0.12) - R148Q (0.12) Cx47 (0.12) - Cx43/V85M (0.06+0.06) Cx47 (0.12) - Cx43/R148Q (0.06+0.06) Conductancia intercelular (S) 24 h.d.a 0 5 10 15 20 25 30 0.13±0.1 N= 6 n=30 0.3±0.09 N=3 n=34 N.A N= 2 n=7 1.3±0.6 N=4 n=9 16.2±2.3 N=7 n=26 N.A N= 10 n=23 * * * * RESULTADOS 89 Figura 34. Propiedades de regulación por voltaje entre Cx47- Cx43. A. (i) Registro crudo de corriente intercelular (Ij) en respuesta a pulsos de voltaje intercelular (Vj) de ± 120 mV de 5 segundos de duración con intervalos de 20 mV en pares homotípicos Cx43-Cx43 y Cx47-Cx47 y pares heterotípicos Cx43-Cx47. (ii) Curva Gjss/Vj de cada tipo de canal ajustada a una ecuación Boltzmann (Tabla 13). Los canales homotípicos de 43 y 47 a pesar de presentar cada uno una sensibilidad a voltaje específica (Tabla 13), son similares (Ai-ii, Bi-ii) mientras que en los canales heterotípicos se observa una mayor sensibilidad a voltaje a valores mayores de los pulsos de polaridad positiva aplicados a la célula que expresa Cx47 y una rectificación del valor de conductancia instantánea (Ci-ii). En (ii) se representan la ± s.e de n=5 pares de oocitos. 100 nA 1 s Ij Ii Iss A 100 nA 1 s Ij Iss Iss Ii Iss B -120 -80 -40 0 40 80 120 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Gi Gss HCx47 Vj (mV) Gj Vj (mV) -120 -80 -40 0 40 80 120 Gj 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Gi Gss -120 -80 -40 0 40 80 120 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Gi Gss Vj (mV) Gj Cx43 Cx43 V1I2 Cx47 Cx43 V1I2 Cx47 Cx47 V1I2 i) C i) i) ii) ii) ii) 100 mV 1 s +120 mV -120 mV Vj 100 mV 1 s +120 mV -120 mV Vj 100 mV 1 s +120 mV -120 mV Vj 500 nA 1 s Ij Ii Iss RESULTADOS 90 despolarizaciones e hiperpolarizaciones relativas de la célula que expresa la Cx47 oligodendrocitaria, en ≈ 35 % entre + 120 mV (Figura 34C, i y ii), indicando la existencia de direccionalidad en el acoplamiento eléctrico (i.e., en el movimiento de iones) entre los astrocitos y oligodendrocitos. En los canales de Cx47 y de Cx43, la amplitud de las corrientes intercelulares se redujo en función del gradiente de Vj y de forma simétrica para las dos polaridades del Vj (Figura 34A y B, i y ii), pero con unos parámetros de sensibilidad a voltaje específicos para cada tipo de canal (Tabla 13). En el caso de los canales híbridos de Cx47-Cx43 las corrientes intercelulares también disminuyeron con el incremento del gradiente intercelular de voltaje pero de forma asimétrica, con una mayor sensibilidad al voltaje pero a valores ligeramente mayores para los pulsos de polaridad positiva vistos por la célula Cx47 (Figura 34C, i y ii; Tabla 13). En los canales híbridos que forma el mutante Cx43V85M con la Cx43WT también se observó el comportamiento rectificador rápido para la misma polaridad del Vj (i.e., para la polaridad positiva relativa en el interior de la célula Cx47) pero significativamente más pronunciado, variando en ≈80 % entre + 120 mV (Figura 35A, i y ii); estos canales también difirieron de los formados por la Cx43WT en las propiedades de cierre de las corrientes, para la polaridad positiva en la célula Cx47 la reducción de las corrientes fue de baja amplitud y rápida y para la polaridad opuesta el comportamiento fue bifásico, primero las corrientes se cierran y luego se abren (Figura 35A, i y ii; Tabla 13). Por el contrario, las propiedades de regulación por el Vj en los canales que se forman entre los pares de oocitos Cx47-Cx43R148Q y Cx47-Cx43V85M fueron indistinguibles de las exhibidas por los canales Cx47-Cx43WT (Figura 35B y C, i y ii; Tabla 13). En resumen, estos resultados muestran que aun cuando los mutaciones astrocitarias Cx43R148Q y Cx43V85M no interfieren con la capacidad para formar canales con la Cx47 oligodendrocitaria, los canales resultantes o no son funcionales en el caso de la Cx43R148Q o inducen niveles de acoplamiento eléctrico residuales con propiedades aberrantes; en los experimentos de coexpresión con la Cx43WT, ambas mutaciones produjeron un potente efecto de inhibición dominante sobre el grado de acoplamiento astrocitario-oligodendrocitario mediado por los canales Cx43-Cx47. RESULTADOS 91 Figura 35. Propiedades de regulación por voltaje entre Cx47, Cx43R148Q y Cx43V85M. A) (i) Registro crudo la corriente intercelular (Ij) inducida por pulsos de voltaje de ± 120 mV (Vj) durante 5 segundos en incrementos de 20 mV (i) en pares de oocitos que expresan Cx47-Cx43V85M y pares que simulan la condición heterocigota de los pacientes Cx47-(Cx43+R148Q) y Cx47-(Cx43+V85M). (ii) Graficas Gji/Vj ajustada a una ecuación Boltzmann (Tabla 13) representado el valor inicial (Gji, ○) y el valor de estado de la conductancia intercelular (Gjss;●n=5 pares de oocitos). Los canales heterotípicos Cx47-Cx43V85M muestran el mismo comportamiento rectificador que observamos en los canales Cx47-Cx43WT pero más marcado y difieren de las propiedades de regulación por voltaje de los mismos mostrando un comportamiento bifásico en el que se observa una disminución de la amplitud de las corrientes a tiempos cortos seguido de un aumento de la amplitud sin llegar a alcanzar un valor de estado para pulsos negativos vistos por el oocito que expresa Cx47, a diferencia de los canales heterotípicos heteroméricos (Cx47-Cx43WT+Cx43R148Q y (Cx47-Cx43WT+Cx43V85M) donde no se observaron diferencias comparado con los de Cx47-Cx43WT. A 5 nA 1 s Ij IiIss Imin Cx47 V1I2 V85M 25 nA 1 s Ij Iss Ii -120 -80 -40 0 40 80 120 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Gi Gss HCx47 Vj (mV) Gj Cx47 V1I2 Cx43 +V85M B 25 nA 1 s Ij Iss Ii -120 -80 -40 0 40 80 120 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Gi Gss HCx47 Vj (mV) Gj Cx47 Cx43 +R148Q V1I2 100 mV 1 s +120 mV -120 mV Vj 100 mV 1 s +120 mV -120 mV Vj 100 mV 1 s +120 mV -120 mV Vj C i) i) i) ii) ii) ii) Vj (mV) -120 -80 -40 0 40 80 120 Gj 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Gi Gss Gmin HCx47 RESULTADOS 92 Tabla 10. Parámetros de la función de Boltzmann de la dependencia del potencial de membrana de los hemicanales formados por la Cx43 humana y por los mutantes de paraparesia espástica solos o en combinación con la Cx43 (condición heterocigota). Vm (-) Vm (+) Ghmax Ghmin A(mV-1) z V0 (mV) Ghmax Ghmin A(mV-1) z V0 (mV) Cx43 1.03 0.18 0.08 2.02 -89.04 0.98 0.15 0.59 14.90 22.78 R148Q 1.03 0.22 0.06 1.51 -86.7 0.99 0.20 0.60 15.15 23.12 V85M 0.96 0.19 0.08 2.02 -81.16 0.99 0.21 0.25 6.31 33.6 R148Q+Cx43 1.02 0.21 0.07 1.76 -77.38 0.99 0.22 0.59 14.90 21.45 V85M+Cx43 1.2 0.23 0.06 1.51 -93.75 0.90 0.22 0.54 13.64 23.71 La dependencia de voltaje de los hemicanales se calculó a partir de la curva Ghss/Vm ajustada a la siguiente ecuación Boltzmann para cada una de las polaridades: Ghss={(Ghmax – Ghmin)/(1+exp[A(Vj/m – V0)]} + Ghmin, donde la Ghmax es la conductancia máxima, la Ghmin es la conductancia residual no sensible a voltaje, V0 (mV) es el voltaje intercelular al cual la conductancia se reduce a la mitad (Gss = (Ghmax-Ghmin)/2) y A es la pendiente o sensibilidad al voltaje de cada hemicanal. Tabla 11. Parámetros de la función de Boltzmann para la dependencia del voltaje intercelular (Vj) de los canales astrocitarios formados por la conexina Cx43 y los mutantes de paraparesia espástica en combinación homotípica, heterotípica y heteromérica. Vj (-) Vj (+) Gjmax Gjmin A(mV-1) z V0(mV) Gjmax Gjmin A(mV-1) z V0(mV) Cx43-Cx43 1.00 0.28 0.10 2.53 -72.00 1.00 0.32 0.07 1.77 78.50 (Cx43+R148Q) – (Cx43+R148Q) 0.98 0.30 0.10 2.53 -73.08 0.98 0.22 0.06 1.52 68.69 (Cx43+V85M) -(Cx43+V85M) 1ª Boltz 1.00 0.49 0.07 1.77 -60.13 1.02 0.22 0.03 0.76 120.34 2ª Boltz 1.02 0.37 0.07 1.77 -71.82 1.02 0.8 0.17 4.29 74.19 *Cx43 – R148Q 1ª Boltz 0.98 0.42 0.29 7.32 -76.67 - - - - - 2ª Boltz 1.00 0.46 0.14 3.54 79.02 1.04 0.22 0.07 1.77 46.45 *Cx43 – V85M 1ª Boltz 0.89 0.52 0.12 3.03 -89.44 ND ND ND ND ND 2ª Boltz 4.00 0.74 0.03 0.76 -69.5 ND ND ND ND ND *(Cx43) – (Cx43+R148Q) 1.00 0.22 0.11 2.78 -63.42 0.98 0.45 0.11 2.78 84.3 *(Cx43) – (Cx43+V85M) 1.01 0.35 0.10 2.53 -61.84 0.99 0.33 0.07 1.77 65.80 La sensibilidad a voltaje de los canales intercelulares se calculó con los valores de la conductancia de estado normalizada (Gjss) ajustados para cada polaridad a una o a dos (1ª Boltz/2ª Boltz) ecuaciones Bolztmann: Gjss={(Gjmax – Gjmin)/(1+exp[A(Vj/m – V0)]} + Gjmin, donde la Gjmax es la conductancia máxima, la Gjmin es la conductancia residual no sensible a voltaje, V0 (mV) es el voltaje intercelular al cual la conductancia se reduce a la mitad (Gss = (Gjmax-Gjmin)/2) y A es la pendiente o sensibilidad al voltaje de cada uno de los canales intercelulares representados. *Oocito al que se ha referido la polaridad de Vj ND, no hay dependencia de voltaje. RESULTADOS 93 Tabla 12. Parámetros de la función de Boltzmann para la dependencia del voltaje intercelular (Vj) de los canales astrocitarios formados por conexina Cx30 con Cx43 o los mutantes de paraparesia espástica en combinación homotípica, heterotípicoa y heteromérica. Vj (-) Vj (+) Gmax Gmin A(mV-1) z V0(mV) Gmax Gmin A(mV-1) z V0(mV) Cx30- Cx30 1ªBoltz 0.99 0.36 0.36 9.09 -45.57 0.99 0.36 0.23 5.88 46.98 2ªBoltz 0.38 0.12 0.02 0.50 -99.99 0.39 0.12 0.03 0.76 98.13 (Cx43+Cx30)-(Cx43+Cx30) 1.00 0.21 0.08 2.02 -70.97 0.98 0.23 0.08 2.02 78.29 (Cx30+R148Q)- (Cx30+R148Q) 1ªBoltz 0.99 0.24 0.25 6.31 -48.09 0.98 0.13 0.18 4.54 51.99 2ªBoltz 0.29 0.14 0.07 1.76 -88.13 0.30 0.03 0.03 0.76 83.16 Cx30+V85M) - (Cx30+V85M) 1ªBoltz 0.99 0.29 0.28 7.07 -47.49 0.98 0.21 0.20 5.05 50.24 2ªBoltz 0.24 0.13 0.05 1.26 -76.24 0.34 0.09 0.02 0.50 81.23 La dependencia de voltaje de los canales intercelulares se calculó a partir de la curva Gj/Vj donde los valores de Gjss se ajustaron a la ecuación Boltzmann que se indica en la Tabla 11. Tabla 13. Parámetros de la función de Boltzmann para la dependencia del voltaje intercelular (Vj) de los canales heterotípicos oligodendroastrocitarios formados por conexina Cx47 y Cx43 o los mutantes de paraparesia espástica en combinación homomérica y heteromérica. Vj (-) Vj (+) Gmax Gmin A(mV-1) z V0(mV) Gmax Gmin A(mV-1) z V0(mV) Cx47 - Cx47 1.00 0.20 0.10 2.53 -74.77 0.98 0.11 0.06 1.52 78.25 *Cx47 - Cx43 0.99 0.12 0.10 2.53 -66.8 1.00 0.12 0.11 2.78 53.52 *Cx47-V85M 1.22 0.26 0.06 1.52 -42.59 ND ND ND ND ND *Cx47 – (Cx43 + R148Q) 1.02 0.12 0.13 3.28 -62.62 0.99 0.13 0.11 2.78 53.04 *Cx47 – (Cx43 + V85M) 1.01 0.08 0.11 2.78 -64.14 0.97 0.14 0.12 3.03 52.64 La dependencia de voltaje de los canales intercelulares se calculó según la curva de la conductancia normalizada respecto al voltaje (Gj/Vj) ajustando el valor de estado (Gjss) a la ecuación Boltzmann indicada en la Tabla 11. *Oocito al que se ha referido la polaridad de Vj ND, no hay dependencia de voltaje. RESULTADOS 94 V. DISCUSIÓN 95 Con la finalidad de esclarecer los mecanismos patogénicos a través de los cuales las mutaciones dominantes en la Cx43 astrocitaria producen la destrucción de la mielina en los pacientes con paraparesia espástica, en una primera etapa de este trabajo se identificaron dos mutaciones en heterocigosis en el gen GJA1, pR148Q y pV85M, en dos familias en las que la paraparesia espástica segregaba con el síndrome de displasia oculodentodigital (ODDD) y posteriormente, se realizó su ensayo funcional. En dicho ensayo in vitro se determinó que en comparación con la Cx43 silvestre los niveles de expresión total y en membrana de la Cx43 portando la mutación p.V85M, pero no la mutación R148Q, están reducidos a la mitad por estar incrementada su tasa de degradación por la vía lisosomal. Ambos mutantes fueron capaces de forman hemicanales funcionales homoméricos, y probablemente también heteroméricos con la Cx43WT, con unas propiedades de regulación por el potencial de membrana y una dependencia de los cationes divalentes extracelulares superponibles a la de los hemicanales silvestres de Cx43. Ninguna de las dos mutaciones interfirió con el proceso de unión de los hemicanales para formar los canales intercelulares completos, sin embargo, los canales que formaron no fueron funcionales; en los experimentos que simulan la condición de heterocigosis de los pacientes, las Cx43 mutadas ejercieron un potente efecto de inhibición sobre la funcionalidad de los canales de Cx43 silvestres expresados exógenamente en pares de oocitos o endógenamente en una línea primaria de astrocitos humanos, reduciendo el grado de acoplamiento intercelular a niveles residuales; dicho efecto de inhibición dominante no se había observado sobre el nivel de expresión de proteína total y en la superficie celular, ni a nivel de corrientes de hemicanal. Respecto al efecto de las mutaciones sobre la otra conexina astrocitaria, la conexina-30, los experimentos realizados mostraron que ni la Cx43 silvestre, ni las mutadas fueron capaces de combinarse funcionalmente con la Cx30, y que cuando se expresan juntas, la Cx43WT y la Cx43V85M, pero no la Cx43R148Q, produjeron un efecto de transdominancia negativa sobre la expresión y el acoplamiento inducido por la Cx30. En relación con las interacciones de los mutantes astrocitarios de Cx43 con la Cx47 oligodendrocitaria, encontramos que, aun cuando los ambos hemicanales de Cx43 mutada fueron capaces de unirse a los hemicanales de Cx47, los canales resultantes o no fueron funcionales como ocurrió en el caso de la Cx43R148Q o inducen niveles de acoplamiento eléctrico muy bajos con propiedades aberrantes, y que en los experimentos de co-expresión con la Cx43WT ambas mutaciones produjeron un potente efecto de inhibición dominante sobre el grado de acoplamiento astrocitario-oligodendrocitario mediado por los canales Cx43-Cx47. En resumen, los resultados de ensayo funcional indican que el principal efecto de las dos mutaciones es la supresión casi completa del acoplamiento intercelular mediado por los canales astrocitarios de Cx43 y por los canales de Cx43 astrocitaria con Cx47 oligodendrocitaria, que ocurre como consecuencia del potente efecto de inhibición dominante que ejercen las subunidades Cx43R148Q y Cx43V85M sobre la funcionalidad de los canales de Cx43 silvestre. 96 6.1 CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO DE LAS MUTACIONES DE ODDD ASOCIADAS A PARAPARESIA ESPÁSTICA En el análisis genético identificamos dos mutaciones en heterocigosis en el gen GJA1 en dos familias españolas que cursan con un fenotipo clínico de ODDD y paraparesia espástica no asociadas previamente a alteraciones neurológicas. La mutación p.V85M, descrita con anterioridad en un único caso de ODDD sin fenotipo detallado, segrega con la clínica que incluye sindactilia y paraparesia espástica en las tres generaciones estudiadas indicando un patrón de herencia autosómico dominante (Fenwick, Richardson et al. 2008). Existen, en cambio, cinco casos publicados de pacientes de ODDD que portan la mutación p.R148Q (Richardson, Donnai et al. 2004; Fenwick, Richardson et al. 2008; Paznekas, Karczeski et al. 2009). En ninguno de ellos se especifica la clínica de los pacientes ni si cursa o no con paraparesia espástica y sólo en 2 de ellos hacen referencia al tipo de herencia clasificándolos como enfermedad familiar por haber estudiado la mutación en 2 y 3 generaciones en cada caso. Al margen de estos estudios, el hecho de identificar la misma mutación en seis familias aparentemente no relacionadas sugiere que se trata de un residuo con una alta frecuencia de mutaciones, también conocido como sitio o región “hot spot”. La mutación p.V85M se localiza, según la única conexina cristalizada hasta la fecha, en el segundo dominio transmembrana (TM2) que junto con el dominio TM1 forman parte del interior de la pared del poro del canal. (Maeda, Nakagawa et al. 2009). En concreto, en base a los experimentos realizados con el mutante V84L de Cx26 se ha propuesto que el dominio TM2 juega un papel importante en la permoselectividad de los canales de conexina. En este estudio, Beltramello y colaboradores analizan la permoselectividad metabólica y los registros de actividad unitaria en cultivos de células HeLa transfectados transitoriamente y observan que el cambio de valina por leucina en la posición 84 en esta conexina a pesar de mantener el mismo nivel de conductancia unitaria y acoplamiento por colorante (Lucifer Yellow) que los canales de Cx26WT bloquea el acoplamiento metabólico mediado por Ins (1,4,5)P3 (Beltramello, Piazza et al. 2005). Sin embargo, el cambio de valina por metionina en la posición 85 de la Cx43 no es equivalente al mutante Cx26V84L ya que además de no observar en ningún caso difusión de colorante en cultivo de células N2a transfectadas con el mutante, no se registraron corrientes intercelulares en los experimentos de acoplamiento eléctrico con oocitos. La mutación p.R148Q, se localiza en el asa citoplasmática (CL) de la Cx43 (Zhou, Yang et al. 2007; Zhou, Yang et al. 2009) y parece tener un papel importante en la regulación mediada por calcio de los mecanismos de compuerta del canal. Dentro de este dominio se ha descrito una región acotada entre los aminoácidos 136-158 de Cx43 que a altas concentraciones de calcio interacciona directamente con la calmodulina (CAM) y a falta de definir el mecanismo exacto de acción, bloquea la apertura de los canales desencadenando la inhibición del acoplamiento entre células adyacentes (Lurtz and Louis 2007; Zhou, 97 Yang et al. 2007; De Vuyst, Wang et al. 2009; Myllykoski, Kuczera et al. 2009; Chen, Zhou et al. 2011)}. Un estudio realizado en células HeLa transfectadas con Cx43WT y con el doble mutante Cx43K146E,R148E- mostró que estos dos cambios en el asa citoplasmática permitían el acoplamiento intercelular en presencia de CAM y elevado [Ca2+]i a diferencia de los cultivos que expresaban la conexina silvestre (Zhou, Yang et al. 2007). Sin embargo, aunque estos datos sugieran que el residuo R148 es importante en la unión a calmodulina en nuestros experimentos observamos ausencia de acoplamiento entre células adyacentes o pares de oocitos que expresan el mutante Cx43R148Q a diferencia del doble mutante indicando la necesidad de realizar más experimentos que confirmen el papel de la mutación aislada sobre la regulación de los mecanismos de compuerta de la Cx43 mediada por calcio intracelular. Se han descrito en total 24 mutaciones en heterocigosis distribuidas a lo largo de todo el gen GJA1 asociadas a espasticidad, hipomielinización o hiperreflexia. (Tabla 5). Casi todas ellas se analizaron en un trabajo reciente en el que se intentó correlacionar sin éxito la localización, funcionalidad y/o efecto de inhibición dominante de los mutantes descritos con la aparición de alteraciones neurológicas sugiriendo la necesidad de estudios funcionales adicionales que permitieran establecer el mecanismo patogénico de la desmielinización causada por mutaciones en la Cx43. 6.2 SÍNTESIS Y FUNCIONALIDAD DE LOS HEMICANALES MUTADOS El análisis de los hemicanales de Cx43WT mutantes reveló una dependencia de voltaje más compleja que la descrita previamente caracterizada por un aumento de las corrientes inducido por despolarización en ausencia de cationes divalentes y en presencia de EGTA que puede bloquearse específicamente con agentes bloqueantes como la carbenoxolona (Contreras, Saez et al. 2003; Zu- Cheng 2003; Orellana, Diaz et al. 2011; Hansen, Ye et al. 2014; Calder, Rhett et al. 2015). Al igual que la Cx43WT, el mutante Cx43R148Q además de procesarse de forma similar es capaz de formar hemicanales con unas propiedades de regulación por voltaje y por cationes divalentes indistinguibles de las propiedades de los hemicanales de la conexina silvestre. Por otra parte, el mutante V85M presenta, una vez normalizado su nivel de expresión con el porcentaje que llega a membrana, un valor de conductancia total del hemicanal similar al de la conexina silvestre sin encontrar tampoco diferencias en las propiedades electrofisiológicas de los hemicanales mutantes con respecto a los de la Cx43. Los experimentos realizados con CQ, un agente inhibidor de la vía de degradación lisosomal indican que el porcentaje de Cx43V85M degradado a través de este mecanismo en 24h es el doble que en el caso de la Cx43WT a diferencia del mutante Cx43R148 donde observamos una reducción de la degradación vía lisosomal. Estos resultados sugieren que la reducción del nivel de expresión en superficie celular en el caso de la Cx43V85M se debe un aumento en la degradación vía lisosomal. En el caso del mutante Cx43R148Q, donde apenas hay efecto de acumulación de proteína tras la incubación 104 Cx43/Cx30/Cx47 R148Q V85M BIOSÍNTESIS Proteína total SI SI (=) SI (↓) Proteína de membrana SI SI (=) SI (↓) FUNCIONALIDAD DE LOS HEMICANALES Permeabilidad a colorante SI SI (=) SI (↓) Conductancia eléctrica SI SI (=) SI (↓) Regulación por Ca++ y Mg++ SI SI (=) SI (=) Regulación por voltaje SI SI (=) SI (=) Inhibición dominante - NO NO ACOPLAMIENTO TIPO ASTROCITO (MEDIADO POR Cx43) Uniones en hendidura SI SI SI Acoplamiento por colorante SI SI (↓↓↓) SI (↓↓↓) Acoplamiento eléctrico SI SI (↓↓↓) SI (↓↓↓) Regulación por voltaje SI SI (≠) SI (≠) Inhibición dominante - SI SI Cx30+Cx43 R148Q+Cx30 V85M +Cx30 ACOPLAMIENTO TIPO ASTROCITO (MEDIADO POR Cx30) Uniones en hendidura NO NO NO Acoplamiento por colorante SI - - Acoplamiento eléctrico SI SI SI (↓) Regulación por voltaje SI (= Cx43) SI (= Cx30) SI (= Cx30) Inhibición dominante - NO NO Cx47/Cx43 Cx47/R148Q Cx47/V85M ACOPLAMIENTO TIPO ASTROCITO-OLIGODENDROCITO (MEDIADO POR Cx47- Cx43) Placas SI SI SI Acoplamiento por colorante SI NO NO Acoplamiento eléctrico SI NO SI (↓↓↓) Regulación por voltaje SI NO (=Cx43/Cx47) SI (≠Cx43/Cx47) Inhibición dominante - NO NO En cuanto a la Cx47 y Cx43, un estudio realizado hace años de acoplamiento por colorante entre astrocitos y oligodendrocitos en nervio óptico de conejo indicaba que existía un flujo unidireccional de 105 pequeñas moléculas cargadas que generaban una barrera o filtro entre ambos tipos celulares. En el trabajo empleaban dos colorantes, Lucifer yellow (LY, -2, 443Da) y biotina (+1, 287 Da). En todos los casos observaban difusión de ambos colorantes desde astrocitos hacia oligodendrocitos, sin embargo, en sentido opuesto, de oligodendrocito a astrocito, no encontraron acoplamiento por LY y sólo encontraron difusión de biotina en un 26% (Robinson, Hampson et al. 1993) . La existencia de este filtro o barrera que limita la difusión bidireccional de iones o moléculas cargadas implica el establecimiento de una organización jerárquica dentro del sincitio panglial. Aunque se desconoce el papel fisiológico de este fenómeno, la barrera oligodendroastrocitaria podría ser relevante en el mecanismo de tamponamiento de K+ a través del sincitio panglial (Rash 2010). La entrada y acumulación de iones K+ en los oligodendrocitos desde el espacio periaxonal durante la conducción saltatoria tiene como consecuencia la despolarización en este tipo celular. En estas condiciones la difusión de K+ ocurre gracias al gradiente electroquímico así como a la selectividad positiva de cationes desde los oligodendrocitos hasta los astrocitos. Se desconoce el efecto que pueden tener otras mutaciones de Cx43 sobre el acoplamiento oligodendroastrocitario. Los resultados de este trabajo (Tabla 14) muestran que nuestros mutantes de Cx43 a pesar de formar placas o uniones en hendidura con la Cx47 generan canales intercelulares no funcionales ya que tanto el acoplamiento por colorante como el acoplamiento eléctrico está abolido prácticamente por completo. Únicamente encontramos baja probabilidad de acoplamiento (<6%) en el caso del mutante V85M con unas propiedades de regulación por voltaje muy similares a las de Cx43- V85M. Además observamos que el acoplamiento eléctrico en los pares que simulan la condición de los pacientes se reduce drásticamente en más del 98% en el caso de la mutación p.V85M y en más del 90% con la mutación p.R148Q. Este efecto tan marcado de inhibición dominante de los mutantes sobre el acoplamiento mediado por Cx43-Cx47 tiene un efecto directo sobre la comunicación entre astrocitos y oligodendrocitos dentro del sincitio panglial de forma que la difusión de los iones y pequeños metabolitos a través de los canales heterotípicos Cx47-Cx43 se ve reducida drásticamente. En resumen, la interrupción casi por completo de esta comunicación intercelular entre oligodendrocitos y astrocitos podría interferir en la difusión de los iones K+ que se liberan tras la descarga de un potencial de acción al espacio periaxonal. En esta situación, los iones no podrían difundir desde los oligodendrocitos hacia los astrocitos de forma que aumentaría la concentración de este ión en el interior de los oligodendrocitos provocando despolarización axonal, bloqueo de la conducción saltatoria, acúmulo de agua en el interior de la mielina y finalmente demielinización axonal. 106 VI. CONCLUSIONES CONCLUSIONES 107 1. Las dos mutaciones identificadas en heterocigosis en el gen GJA1, Cx43V85M y Cx43R148Q, en los pacientes con paraparesia espástica asociada a un fenotipo de displasia oculodentodigital, son de naturaleza patogénica y por tanto las causantes del síndrome. 2. Las mutaciones V85M y R148Q no interfieren con la capacidad de la proteína Cx43 para formar hemicanales en la superficie celular, ni alteran sus propiedades de regulación por los cationes divalentes extracelulares y el potencial de membrana; los hemicanales mutados son también capaces de unirse entre sí para formar canales intercelulares pero estos canales mutados no son funcionales ya que una vez formados no adquieren la conformación de canal abierto. 3. En la condición de heterocigosis de los pacientes, las subunidades mutadas R148Q y V85M son capaces de combinarse con la subunidades silvestres de Cx43 produciendo un potente efecto de inhibición dominante sobre el acoplamiento intercelular inducido por la Cx43 silvestre. 4. Respecto a la interacción de la Cx43 con la otra conexina astrocitaria, la conexina-30, se concluye que ambas conexinas no son capaces de combinarse entre sí para formar canales intercelulares y que la Cx43 ejerce un efecto de transdominancia negativa sobre la expresión y el acoplamiento intercelular inducido por la Cx30. Dicho efecto de transdominancia negativa también ocurre en el caso de la mutación V85M, sin embargo está ausente en el caso de la mutación R148Q. 5. En relación con los canales intercelulares híbridos que se forman entre la Cx43 astrocitaria y la Cx47 oligodendrocitaria, el mutante R148Q no formo canales funcionales con la Cx47 mientras que el mutante V85M indujo unos niveles de acoplamiento intercelular residuales con propiedades aberrantes; en la condición de heterocigosis de los pacientes, la presencia de las Cx43 mutadas produjo un potente efecto de inhibición dominante sobre el acoplamiento intercelular inducido por la Cx43 silvestre con la Cx47 oligodendrocitaria. 6. Estos resultados sugieren que la desmielinización causante de la paraparesia espástica en los pacientes con displasia oculodentodigital podría originarse como consecuencia de la reducción a niveles residuales de la comunicación intercelular entre los astrocitos y entre los astrocitos y los oligodendrocitos, causada por el efecto de inhibición dominante que ejercen las mutaciones sobre la funcionalidad de la Cx43 silvestre; esta vía de comunicación glial participa en el mecanismo de aclaramiento de los iones K+, que se acumulan en la región periaxonal internodal de las fibras mielínicas durante la conducción saltatoria, hasta el lecho vascular o al líquido cefalorraquídeio, y su supresión podría originar un incremento anormal en la concentración periaxonal de K+, despolarización axonal, bloqueo de la conducción, edema y finalmente, degeneración de la mielina. 108 VII. BIBLIOGRAFIA BIBLIOGRAFIA 109 Abascal, F. and R. Zardoya (2013). 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