Uso de fármacos, con mecanismo de acción sobre la pared bacteriana, como adyuvante al tratamiento antimicrobiano para las infecciones causadas por bacilos Gram-negativos multirresistentes

TESIS DOCTORAL Uso de fármacos, con mecanismo de acción sobre la pared bacteriana, como adyuvante al tratamiento antimicrobiano para las infecciones causadas por bacilos Gram-negativos multirresistentes Rafael Ayerbe Algaba Sevilla 2019 Director 1: Jerónimo Pachón Díaz Director 2: Younes Smani Programa de Doctorado de Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica Departamento de Medicina Universidad de Sevilla AGRADECIMIENTOS El mundo de los significados es un universo en el que uno puede jugar a ser tan subjetivo como la objetividad de los colores o los sabores. Cuando la palabra ‘agradecer’ se construye en los pasos que unen la línea de un largo viaje, debe ser algo más que un sentimiento con el que mostrar gratitud. Y en ese valle tan frondoso, prefiero obviar el personalismo para saborear y exprimir el jugo de los que hoy saben y se sienten partícipe del afecto del que nacen estas palabras. Así es como me siento más cerca de la libertad en la que siempre he deambulado durante esta larga y gratificante travesía. Es evidente que en todo objetivo, ya sea personal o profesional, existe un liderazgo que guía y aconseja. Mi reconocimiento hacia quien han sido sinónimo de una vida completa y plena de esfuerzo. La dedicación del que camina convencido es tan admirable como incuestionable. Es de buen aventurero reconocer también a ese compañero de viaje que conduce tan cerca de ti, que traza un trayecto con el mirar de la experiencia y te traslada a la parada más cercana al objetivo. Debo agradecer que el motor nunca se haya detenido, y la sinceridad como gasolina ha sido tan vital como innegociable. No me olvido del comienzo, cuando lo desconocido es tan abrumador que simplemente el tiempo hace de juez para abrir la tapadera de la timidez. Pronto comprendí que llenar de humor la habitación de los que te rodean es sinónimo de cuidar el recurso humano. Las pequeñas grietas de un día gris nunca terminaron de resquebrajar los cimientos de un valor añadido en esta aventura. Y aquí es donde aparece la palabra amistad como la fuerza capaz de coger de la mano al compañerismo. Las horas finales de días en los que el atardecer avisaba de que no esperaría no eran obstáculo para que una buena conversación inundara las poyatas del laboratorio. Viajeros tan distintos en las formas de ser que se dejaron abrazar en el desafiante hecho de compartir destino final. Un libro abierto lleno de matices. Miedos e inseguridades a partes iguales, pero siempre con una risa que amenazaba con romper todos los demás temores. El respeto nos ha hecho tan fuertes como la voluntaria capacidad para haber construido esta amistad de la que hoy me siento profundamente agradecido. Estos años de viaje me han enseñado, además de lo mucho como profesional, a encontrarme y a conocer lo interior de aquellas personas que en su humildad me brindaron la oportunidad de ser mejor persona. Todo florece cuando la Raíz construye fundamentos para que esta experiencia haya sido una canción espectacular y, probablemente, irrepetible. FINANCIACIÓN TESIS DOCTORAL Ministerio de Economía y Competitividad, Instituto de Salud Carlos III. Proyecto de Investigación en Salud PI15/01358. “Eficacia terapéutica de MV5 y sus derivados como terapia combinada con colistina en un modelo experimental murino de infección grave por bacilos Gram-negativos”. Ministerio de Economía y Competitividad, Instituto de Salud Carlos III. Proyecto de Investigación en Salud PI16/01378. “Eficacia terapéutica de la oxiclozanida como terapia combinada con colistina in vitro y en modelos experimentales murinos de infecciones graves”. PRODUCCIÓN CIENTÍFICA RELACIONADA CON LA TESIS DOCTORAL Publicaciones 1. Vila-Farrés X, Parra-Millán R, Sánchez-Encinales V, Varese M, Ayerbe-Algaba R, Bayó N, Guardiola S, Pachón-Ibáñez ME, Kotev M, García J, Teixidó M, Vila J, Pachón J, Giralt E, Smani Y. Combating virulence of Gram-negative bacilli by OmpA inhibition. Scientific Reports 2017;7:14683. 2. Parra-Millán R, Vila-Farrés X, Ayerbe-Algaba R, Varese M, Sánchez-Encinales V, Bayó N, Pachón-Ibáñez ME, Teixidó M, Vila J, Pachón J, Giralt E, Smani Y. Synergistic activity of an OmpA inhibitor and colistin against colistin-resistant Acinetobacter baumannii: mechanistic analysis and in vivo efficacy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2018;73:3405-12. 3. Ayerbe-Algaba R, Gil-Marqués ML, Jiménez-Mejías ME, Sánchez-Encinales V, Parra-Millán R, Pachón-Ibáñez ME, Pachón J, Smani Y. Synergistic activity of niclosamide in combination with colistin against colistin-susceptible and colistinresistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 2018;8:348. 4. Miró-Canturri A*, Ayerbe-Algaba R*, Smani Y. Drug repurposing for the treatment of bacterial and fungal infections. Frontiers in Microbiology 2019;10:41. * Los autores han contribuido de igual manera. 5. Ayerbe-Algaba R, Gil-Marqués ML, Miró-Canturri A, Parra-Millán R, Pachón- Ibáñez ME, Jiménez-Mejías ME, Pachón J, Smani Y. The anthelmintic oxyclozanide restores the colistin activity in colistin-resistant Gram-negative bacilli. International Journal of Antimicrobial Agents 2019 Jul 9. pii: S0924-8579(19)30186-4. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2019.07.006. [Epub ahead of print]. Comunicaciones en congresos 1. Ayerbe-Algaba R, Sánchez-Encinales V, Parra-Millán R, Pachón-Ibáñez ME, Sánchez-Céspedes J, Pachón J, Smani Y. In vitro activity of niclosamide in combination with colistin against colistin-susceptible and colistin-resistant Gram negative bacilli. 26th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID). Ámsterdam, Holanda, 2016. 2. Ayerbe-Algaba R, Bayó N, Parra-Millán R, Seco J, Pachón-Ibáñez ME, Teixidó M, Pachón J, Giralt E, Smani Y. AOA-2 derivatives as outer membrane protein A inhibitors for treatment of Gram-negative bacilli infections. 11th International Symposium on the Biology of Acinetobacter. Sevilla, España, 2017. 3. Miró-Canturri A, Ayerbe-Algaba R, Parra-Millan R, Pachón-Ibáñez ME, Pachón J, Smani Y. In vitro activity of oxyclozanide in combination with colistin against colistinsuceptible and colistin-resistant gram-negative bacilli (GNB). 27th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID). A Viena, Austria, 2017. Otras publicaciones relacionadas con la línea de investigación 1. Parra Millán R, Jiménez Mejías ME, Sánchez Encinales V, Ayerbe Algaba R, Gutiérrez Valencia A, Pachón Ibáñez ME, Díaz C, Pérez Del Palacio J, López Cortés LF, Pachón J, Smani Y. Efficacy of lysophosphatidylcholine in combination with antimicrobial agents against Acinetobacter baumannii in experimental murine peritoneal sepsis and pneumonia models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2016;60:4464-70. 2. Parra-Millán R, Guerrero-Gómez D, Ayerbe-Algaba R, Pachón-Ibáñez ME, Miranda-Vizuete A, Pachón J, Smani Y. Intracellular Trafficking and Persistence of Acinetobacter baumannii Requires Transcription Factor EB. mSphere 2018;3 pii: e00106-18. 3. Ayerbe Algaba R, Álvarez-Marín R, Praena J, Smani Y. Escherichia coli causing meningitis in an adult: A case report and experimental characterization of its virulence. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica 2019;37:418-9. ÍNDICE DE CONTENIDOS 1 ABREVIACIONES 3 FIGURAS Y TABLAS 4 RESUMEN 5 I. INTRODUCCIÓN 8 1. Antibióticos y resistencia antimicrobiana: situación actual 9 2. Infecciones asociadas a la atención sanitaria (IAAs) 13 3. Bacilos gramnegativos (BGN): epidemiología, resistencia antimicrobiana, virulencia y tratamiento 14 3.1. Acinetobacter baumannii 15 3.1.1. Epidemiología 15 3.1.2. Resistencia antimicrobiana 16 3.2. Pseudomonas aeruginosa 18 3.2.1. Epidemiología 18 3.2.2. Resistencia antimicrobiana 19 3.3. Enterobacteriales 20 3.3.1. Epidemiología 20 3.3.2. Resistencia antimicrobiana 21 3.4. Mecanismos de virulencia de BGN 22 3.4.1. Proteínas de membrana externa 22 3.4.2. Adherencia bacteriana y formación de biofilm 25 3.4.3. Motilidad 26 3.4.4. Lipopolisacárido 27 3.4.5. Vesículas de membrana externa 27 3.4.6. Sideróforos 28 3.4.7. Quorum sensing 28 3.5 Opciones de tratamiento actuales 30 3.5.1. Colistina 30 3.5.2. Ceftolozano/tazobactam 31 3.5.3. Ceftazidima/avibactam 32 4. Nuevas terapias para tratar las infecciones por BGN 33 4.1 Compuestos o inhibidores anti-virulencia 33 4.1.1. Inhibidores de quorum sensing 34 4.1.2. Inhibidores de la adhesión bacteriana 34 ÍNDICE DE CONTENIDOS 2 4.1.3. Inhibidores de los sistemas de secreción 35 4.1.4. Terapia de fagos 35 4.2. Moléculas con acción sobre el sistema inmune 36 4.2.1 Lisofosfatidilcolina 36 4.2.3 Péptidos antimicrobianos 37 4.3. “Repurposing”: reposicionamiento de fármacos 37 4.3.1 Los antihelmínticos 38 4.3.2 Los anticancerígenos 38 4.3.3 Los antiinflamatorios e inmunomoduladores 39 4.3.4 Los antipsicóticos y antidepresivos 39 4.3.5 Otros fármacos 40 II. FUNDAMENTOS 42 III. HIPÓTESIS 44 IV. OBJETIVOS 46 V. RESULTADOS 48 1. Capítulo I. Estudio del mecanismo de inhibición de OmpA por el AOA-2 y optimización de sus derivados en el impacto sobre la virulencia de los bacilos Gramnegativos. 49 1.1. Artículo 1. Combating virulence of Gram-negative bacilli by OmpA inhibition. 50 1.2. Artículo 2. AOA-2 derivatives as outer membrane protein A inhibitors for treatment of Gram-negative bacilli infections. 81 2. Capítulo II. Efecto de los antihelmínticos sobre la eficacia de la colistina frente a bacilos Gram-negativos. 107 2.1. Artículo 3. Synergistic activity of niclosamide in combination with colistin against colistin-susceptible and colistin-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae. 108 2.2. Artículo 4. Repurposing oxyclozanide potentiates activity of colistin against colistin-susceptible and colistin-resistant Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella pneumoniae. 118 VI. DISCUSIÓN GENERAL 145 VII. CONCLUSIONES 155 VIII. BIBLIOGRAFÍA 157 INTRODUCCIÓN 9 1. Antibióticos y resistencia antimicrobiana: situación actual. La resistencia antimicrobiana es un desafío mundial debido a su alta morbilidad y mortalidad en el ámbito clínico (1). Fuentes de prestigio como la Organización Mundial de la Salud (OMS) ya han advertido sobre esta circunstancia, haciendo hincapié en que cada vez más bacterias presentan resistencia a la mayoría o incluso a todos los medicamentos antimicrobianos disponibles en el mercado, aumentando el número de infecciones graves que anteriormente resultaban fácilmente tratables (2). Entre estas infecciones, podemos encontrar la neumonía comunitaria y nosocomial, la bacteriemia, infecciones del tracto urinario, cistitis e infecciones comunes neonatales. También es importante destacar las infecciones del sitio quirúrgico postoperatorio y pacientes que reciben tratamiento contra el cáncer, trasplante de órganos y otras terapias avanzadas que son vulnerables a la infección (2). Según datos del Centro Europeo para la Prevención y Control de Enfermedades (ECDC; para European Center for Disease Prevention and Control), los porcentajes de microorganismos que presentan resistencia a los antimicrobianos, especialmente la multirresistencia, ha incrementado en Europa. La Red Europea de Vigilancia de Resistencia Antimicrobiana (EARS-Net; para European Antimicrobial Resistance Surveillance Network) muestra grandes variaciones en cuanto a porcentajes de resistencia antimicrobiana en Europa, dependiendo del microorganismo, el agente antimicrobiano y la región geográfica, lo que lleva a reflejar diferencias en el uso de antimicrobianos y las prácticas de control de infecciones según el país o el área geográfica (3). Más de la mitad (55,4%) de los aislamientos notificados de especies de Acinetobacter reportados a EARS-Net en 2016 por los países de la UE/EEE fueron resistentes a, al menos, uno de los grupos antimicrobianos bajo vigilancia regular (fluoroquinolonas, aminoglucósidos y carbapenémicos). Además, un tercio (33,9%) de los aislamientos de Pseudomonas aeruginosa informados a EARS-Net en 2016 fueron resistentes a al menos uno de los grupos antimicrobianos bajo vigilancia regular (piperacilina/tazobactam, fluoroquinolonas, ceftazidima, aminoglucósidos y carbapenémicos). En relación a Enterobacteriales, más de la mitad (58,6%) de los aislamientos de Escherichia coli y más de un tercio (34,5%) de los aislamientos de Klebsiella pneumoniae reportados a EARS-Net en 2016 fueron resistentes a, al menos, uno de los grupos antimicrobianos bajo vigilancia regular (aminopenicilinas, INTRODUCCIÓN 10 fluoroquinolonas, cefalosporinas de tercera generación, aminoglucósidos y carbapenémicos) (4). La situación de los bacilos gramnegativos (BGN) es especialmente preocupante debido al aumento de los porcentajes de resistencia antimicrobiana a nivel mundial (Figura 1) (5). Figura 1. Índice de resistencia a los medicamentos (IRM) en todos los países. Cada barra informa del IRM para los países que reportan resistencia a los antibióticos para 5 o más patógenos y para 15 o más combinaciones de patógenos y antibióticos durante al menos 1 año entre 2012 y 2015. Se muestran los datos del año más reciente (5). Este escenario conlleva a que las opciones terapéuticas de los pacientes infectados por BGN multirresistentes se limiten a un grupo reducido de antibióticos de última línea, como los carbapenémicos y que en los últimos 34 años no se han desarrollados nuevas familias antibióticas (Figura 2). Sin embargo, la resistencia a los carbapenémicos es considerada como un problema de salud pública de gran dimensión debido a la aparición de brotes graves con opciones de tratamiento muy limitadas (6). INTRODUCCIÓN 11 Figura 2. Línea temporal del descubrimiento de antibióticos y la aparición de resistencia. Figura extraída de “Health matters: antimicrobial resistance –GOV.UK”. El uso de fármacos antimicrobianos ha sido utilizado de forma masiva durante varias décadas, y su mal uso tanto en los seres humanos como en la veterinaria ha favorecido la selección y propagación de bacterias resistentes (2). En 2013, el consumo de antimicrobianos para uso sistémico en la comunidad varió de 10,8 a 32,0 dosis diarias definidas (DDD) por 1.000 habitantes y por día, dependiendo del país (3). Durante ese mismo año en España, las DDD por 1.000 habitantes y por día fueron de 22,4 (3). Al igual que en años anteriores, las penicilinas fueron los antibióticos prescritos con más frecuencia en todos los países, mientras que la proporción de consumo de otras clases de antimicrobianos varió considerablemente entre los países; por ejemplo, cefalosporinas y otros betalactámicos, macrólidos, lincosamidas y estreptograminas y quinolonas. Recientamente, se ha destacado que aquellos países con un elevado consumo de antibióticos tienen un mayor nivel de resistencia a los mismos en comparación a los países con un bajo consumo de antibióticos (Figura 3) (5). INTRODUCCIÓN 12 Figura 3. Índice de resistencia a los medicamentos (IRM) subyacentes para Suecia, Estados Unidos e India, por clase de antibióticos, en 2015. La fila superior (A, B) informa del uso de antibióticos y la resistencia a antibióticos para Suecia en 2015; la fila central (C, D) y la fila inferior (E, F) muestra la información correspondiente para Estados Unidos e India, respectivamente. Los gráficos de uso de antibióticos son la proporción de cada fármaco consumido del uso total de antibióticos incluido (5). Esta circunstancia está conllevando a diferentes países a tomar medidas en la optimización del uso de los fármacos antimicrobianos, incluyendo campañas de concienciación sobre su utilización de forma correcta y prudente. Estas políticas radican en la necesidad de mejorar la vigilancia del consumo de antibióticos a nivel de cada hospital en los países de la Unión Europea (3). Un ejemplo regional en Andalucía (España) de puesta en marcha de este tipo de planes es el programa integral de prevención y control de las infecciones relacionadas con la asistencia sanitaria y uso apropiado de los antimicrobianos (PIRASOA) que se inició en el año 2014 (7). En resumen, los altos niveles y sus tendencias de aumento de las resistencias antimicrobianas en BGN en Europa como en el resto de los continentes muestran la INTRODUCCIÓN 13 pérdida continua de eficacia terapéutica de los tratamientos antimicrobianos, especialmente en las infecciones asociadas a la atención sanitaria, poniendo de manifiesto la urgente necesidad de estrategias de respuesta integral dirigidas a todos los sectores que engloban la salud (3). 2. Infecciones asociadas a la atención sanitaria (IAAs) Las infecciones nosocomiales son aquellas infecciones que aparecen durante la hospitalización, que se manifiestan después de 72 horas o más de la admisión del paciente en el hospital, y que no estaban presentes ni en el período de incubación ni antes de la admisión del paciente (8). Estas infecciones se encuentran entre las principales complicaciones de la terapia médica moderna debido a la edad y la complejidad cada vez mayores de los pacientes, la mayor utilización de dispositivos invasivos y, con frecuencia, el uso inadecuado de la terapia antimicrobiana (9). Constituyen una causa principal de morbilidad y mortalidad entre los pacientes hospitalizados (10). Se estima que aproximadamente 4.200.000 pacientes adquieren una IAA en la Unión Europea cada año, y el número de muertes que se producen como consecuencia directa de estas infecciones es de 175.000 (3, 11). Constituyen uno de los problemas más importantes que se pueden producir en los servicios que cuidan de los pacientes críticos, lo que lleva a un aumento de la estancia hospitalaria, de la mortalidad, y por supuesto a un aumento de los costes económicos en relación a la salud pública (12). Los costes de estas infecciones son una importante carga económica para las organizaciones hospitalarias. Estas infecciones representan aproximadamente un coste de siete billones de euros por año en Europa, considerando solamente los costes directos (3). Las IAAs más importantes son aquellas relacionadas con los dispositivos invasivos; infecciones del torrente sanguíneo denominadas bacteriemias, infecciones del tracto urinario asociadas a catéter, neumonía asociada a ventilación mecánica e infecciones del sitio quirúrgico. Muchas de estas infecciones asociadas a los dispositivos y sitio quirúrgico son causadas por organismos multirresistentes como E. coli, P. aeruginosa, Clostridium difficile, Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM), y Enterococcus resistentes a vancomicina (9). Hay múltiples factores que contribuyen a las IAAs; aquellos asociados a la atención médica, factores ambientales y los relacionados con el paciente. Los factores relacionados con la atención médica incluyen el uso de dispositivos invasivos, procedimientos quirúrgicos y la presión selectiva por el uso excesivo de antibióticos. INTRODUCCIÓN 14 Los factores ambientales pueden ser sistemas de aire acondicionado contaminados y el diseño de la instalación hospitalaria. Los factores que tienen que ver con el paciente son aquellos relacionados con la severidad de la enfermedad, el uso de agentes inmunosupresores y las hospitalizaciones prolongadas (9). Todo lo referido al sistema de atención médica puede jugar un papel importante, así como la falta de programas de intervención efectivos diseñados para reducir estas IAAS. En Estados Unidos, se estima que las IAAs ocurren en aproximadamente dos millones de pacientes al año con un número total de muertes de 99.000, suponiendo un coste de 33 billones de dólares cada año (13, 14). Como estrategias para la reducción de las IAAs, se han utilizado enfoques amplios tales como la estrategia pasiva a través de protocolos de vigilancia y de respuesta rápida y oportuna (15). El estudio clásico que demostró la importancia de esto fue el Estudio para la Eficacia del Control de la Infección Nosocomial (SENIC), realizado en el año 1980 y publicado cinco años más tarde, financiado por el CDC, que incluyó 338 hospitales seleccionados al azar y estratificados por geografía, capacidad de camas para pacientes y el estado de enseñanza. En resumen, el estudio mostró que los programas de control de infecciones atendidos por epidemiólogos hospitalarios y los programas de vigilancia redujeron las infecciones nosocomiales en un 32% en comparación con aquellos entornos que carecían de programas de control de la infección (16). Se han llevado estudios recientes más concretos. Por ejemplo, en octubre de 2013, el Hospital Universitario de Carolina del Norte, con una instalación de 853 camas, implementó un nuevo programa de higiene de manos en todas las áreas para pacientes hospitalizados. La asociación entre el cumplimiento de la higiene de las manos y las IAAs, al ajustar los datos a nivel de unidad, mostró una mejora del 10% en la higiene de las manos, asociada con una reducción del 6% en el número general de IAAs (17). 3. Bacilos gramnegativos (BGN): epidemiología, resistencia antimicrobiana y virulencia. La aparición de BGN multirresistentes crea un desafío en el tratamiento de las infecciones nosocomiales a nivel mundial. Esta circunstancia de emergencia global ha sido reportada por organizaciones gubernamentales como el Reino Unido, que en un informe sobre la resistencia antimicrobiana cataloga a esta misma como la causa potencial de mayor número de muertes en el año 2050 (Figura 4). Los BGN suponen una de las causas más comunes de las infecciones nosocomiales, especialmente en la INTRODUCCIÓN 15 unidad de cuidado intensivo (UCI), incluyendo la mayoría de los casos de neumonía adquirida en el hospital e infecciones del tracto urinario y del 25% al 30% de las infecciones en el torrente sanguíneo y del sitio quirúrgico (18). Una de las causas más comunes de una IAA es la infección causada por bacterias como A. baumannii, P. aeruginosa y las Enterobacterias. Estas bacterias son consideradas como prioridad crítica para la investigación y el desarrollo de nuevos antibióticos por la OMS en 2017 (19). Figura 4. Muertes atribuibles a la resistencia a antimicrobianos cada año en comparación con otras causas importantes de muerte. Figura adaptada del informe “Review on Antimicrobial Resistance–GOV.UK”. (https://www.graphicnews.com/es/pages/34294/SALUD-Las- superbacterias-matarán -a-10m--de-personas-más -por-año). 3.1. Acinetobacter baumannii 3.1.1. Epidemiología Las especies de Acinetobacter son cocobacilos gramnegativos aeróbicos, glucosa nofermentativos, catalasa-positivos y no oxidativos. Entre estas especies, A. baumannii es el miembro más importante asociado con las IAAs en todo el mundo (20, 21). La mayoría de las infecciones por A. baumannii ocurren en pacientes críticos en la UCI INTRODUCCIÓN 16 (20, 22) y representan hasta el 20% de las infecciones en UCI en todo el mundo (20, 23). Además, la frecuencia de las infecciones adquiridas en la comunidad por A. baumannii ha ido aumentando gradualmente (20, 21). Este patógeno tiene una alta relevancia clínica debido a las infecciones graves que causa, tales como neumonía asociada a ventilación mecánica (NAVM) (24), bacteriemia, infecciones de piel y tejidos blandos, infecciones del sitio quirúrgico, infecciones del tracto urinario y sepsis (25), y con menor frecuencia, meningitis y endocarditis (26, 27). Las infecciones por A. baumannii son cada vez más frecuentes. Se han recogido tasas brutas de mortalidad del 30-75% debido a neumonía nosocomial causada por A. baumannii. Otros datos que se recogen muestran que la mortalidad atribuible a la infección por este patógeno oscila entre el 8% y el 43% (28). 3.1.2. Resistencia antimicrobiana Muchos estudios han demostrado que A. baumannii desarrolla rápidamente resistencia antimicrobiana, habiéndose aislado cepas resistentes a múltiples antibióticos (24). La OMS declaró que A. baumannii es uno de los organismos ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, K. pneumoniae, A. baumannii, P. aeruginosa y especies de Enterobacter), que evade de forma eficaz los efectos de los antibióticos (29). Se conocen varios mecanismos de resistencia de A. baumannii, entre los que se incluyen la degradación enzimática de antibióticos (β-lactamasas y enzimas modificadoras de aminoglucósidos), modificaciones de la diana, bombas de eflujo o expulsión y cambios en la permeabilidad (21, 30). Estudios recientes han demostrado que A. baumannii muestra una competencia natural para incorporar ADN exógeno a altas frecuencias, lo que implica una transferencia de genes horizontal muy frecuente en este patógeno (31). La acumulación de varios mecanismos de resistencia en A. baumannii han disminuido gradualmente el número de clases de antibióticos disponibles para tratar las infecciones por este patógeno en la práctica clínica. La inactivación de β-lactámicos por β-lactamasas es uno de los mecanismos más importantes de la resistencia antimicrobiana. En base a la homología de secuencia, las β-lactamasas se agrupan en diferentes clases moleculares: A, B, C y D (32). Existe una amplia gama de β-lactamasas de clase A; incluidas las de “Temoneira” (TEM), la variable sulfhidrilo (SHV), la de capacidad de hidrolización de la cefotaxima (CTX-M), la “Guiana” de espectro extendido (GES), el plásmido autotransferible de E. INTRODUCCIÓN 17 coli (SCO), la Pseudomonas de espectro extendido resistente (PER), β-lactamasa de espectro extendido de Vietnam (VEB), la carbenicilina de hidrolización de β-lactamasa (CARB) y la K. pneumoniae carbapenemasa (KPC). Aunque éstas se han reportado en A. baumannii, generalmente se consideran que desempeñan un papel menor en su fenotipo de resistencia, especialmente en resistencia a carbapenemas (33). Las β-lactamasas de clase B pueden conferir resistencia a la mayoría de los β-lactámicos debido a su amplio rango, su potente actividad carbapenemasa y la resistencia a los inhibidores. Aunque las metalo β-lactamasas (MBL) no son las carbapenemasas predominantes en A. baumannii, se ha encontrado la metalo-β-lactamasa tipo VIM, la imipenemasa (IMP) y la imipenemasa de Seúl (SIM), contribuyen a la resistencia de alto nivel a los carbapenemas. Más recientemente, se identificaron NDM (nueva Deli metallo-β-lactamasa) en A. baumannii. El gen blaNDM está integrado en el cromosoma dentro de una nueva estructura de transposón con dos copias de la secuencia de inserción ISAba125 en una cepa clínica de A. baumannii. Tal variabilidad del entorno genético de blaNDM-1 es el responsable de su rápida difusión (33). La secuencia de nucleótidos del gen de la cefalosporinasa cromosómica, que codifica una β-lactamasa AmpC, se caracterizó en A. baumannii por primera vez en un aislado clínico de España en el año 2000. Se ha demostrado que diferentes aislados de A. baumannii tienen secuencias de AmpC casi idénticas (no más de dos sustituciones de aminoácidos). Un análisis filogenético mostró que los genes de Acinetobacter ampC descienden de un ancestro común y están más estrechamente relacionados entre sí que los genes de ampC que se encuentran en otras especies de bacterias. La presencia de AmpC juega un papel importante en la resistencia de β-lactámicos en A. baumannii. La presencia de una secuencia de inserción con un promotor fuerte “upstream” de ampC en aislamientos clínicos de A. baumannii tiene el potencial de sobreexpresar AmpC, lo que resulta en una resistencia a ceftazidima de alto nivel (33). Las enzimas modificadoras de aminoglucósidos son el principal mecanismo por el cual A. baumannii confiere resistencia a estos antibióticos. Estas enzimas se pueden clasificar en acetiltransferasas, adeniltransferasas y fosfotransferasas. Están típicamente presentes en elementos transponibles y se transfieren entre bacterias patógenas. Varios estudios han mostrado que muchos aislados de A. baumannii multirresistentes producen una combinación de enzimas modificadoras de aminoglucósidos (20, 21, 34). En relación a la resistencia a polimixina, la modificación del lípido A, un componente del lipopolisacárido (LPS), con la adición de la 4-amino-4-desoxi-l-arabinosa (Ara4N) INTRODUCCIÓN 18 y/o la fosfoetanolamina se considera el mecanismo de resistencia a la colistina en BGN. Sin embargo, los genes de unión y biosíntesis de Ara4N no están presentes en A. baumannii, lo que sugiere que la modificación de lípido A por Ara4N no es adecuada para explicar la resistencia a la colistina en A. baumanni. Debido a esto, existen dos hipótesis principales sobre el mecanismo de resistencia a colistina en este patógeno; la primera es la pérdida de LPS debido a la inactivación de un gen de biosíntesis del lípido A, lpxA, lpxC o lpxD, que da como resultado la pérdida completa de la producción de LPS en A. baumannii, y la segunda es la hipótesis mediada por el sistema de dos componentes PmrAB. Al comparar la secuencia de ADN de los genes que codifican PmrA y PmrB entre las cepas susceptibles y resistentes a la colistina, se pudo demostrar que las mutaciones en los genes pmrA y pmrB están relacionadas con la resistencia a la colistina en A. baumannii (35). Las modificaciones en los sitios de la diana terapéutica también pueden inducir resistencia a antibióticos en A. baumannii. En ausencia de otros mecanismos de resistencia conocidos, se ha demostrado que la sobreexpresión de proteínas de unión a penicilina alteradas con baja afinidad por imipenem induce resistencia a imipenem. Las bombas de eflujo están asociadas con resistencia contra muchas clases diferentes de antibióticos, como imipenem y tigeciclina en este patógeno. Cuatro categorías de bombas de eflujo, entre las que se encuentran AdeABC, AdeM, TetA, TetB y AbeS, están relacionadas con la resistencia antimicrobiana en A. baumannii (20). Debido al rol de las porinas sobre la permeabilidad de la membrana, también juegan un papel importante en el mecanismo de resistencia. La expresión reducida de algunas porinas como CarO, Omp22-33, Omp33-36, Omp37, Omp43, Omp44 y Omp47 se asocia con resistencia a carbapenemas en A. baumannii (20, 36-38). La resistencia a la quinolonas se ha asociado con modificaciones en GyrA (una subunidad de la ADN girasa) y ParC (una subunidad de la topoisomerasa IV) en aislamientos de A. baumannii no relacionados epidemiológicamente (20). 3.2. Pseudomonas aeruginosa 3.2.1. Epidemiología P. aeruginosa es un patógeno oportunista que normalmente habita en el suelo y en las superficies de ambientes acuosos. Su adaptabilidad y su alta resistencia intrínseca a los antibióticos le permiten sobrevivir en una amplia gama de entornos naturales y artificiales, incluidos las superficies de las instalaciones médicas. Las infecciones por P. INTRODUCCIÓN 25 3.4.2. Adherencia bacteriana y formación de biofilm La capacidad de las bacterias para interactuar con las células eucariotas es el primer paso en el proceso de la patogénesis, seguido de su internalización en el huésped. Las bacterias invasoras alcanzan un compartimento en el que están protegidas contra los mecanismos de aclaramiento del huésped, pudiéndose así replicar y prepararse para acceder tanto a los tejidos como al sistema circulatorio. Hay diferentes estructuras, tanto desde el patógeno como de la célula huésped, por el cual las bacterias permiten su adherencia a la célula eucariota. Algunos de estos componentes bacterianos son la OmpA, estructuras pili y y de tipo fimbria (63, 81, 82). Por otra parte, también hay factores del huésped en la superficie celular que pueden mediar la adherencia bacteriana; tales como la integrina y fibronectina (83, 84). En este escenario, se ha demostrado que A. baumannii, expresando fosforilcolina en la membrana externa, se une a las células epiteliales de pulmón humano a través de del receptor de activación de plaquetas, la activación de la clatrina y arrestinas beta (85). Como muestra la figura 6, una vez que las primeras bacterias se adhieren a la superficie biótica y abiótica, el biofilm comienza a formarse. Estos biofilms son comunidades bacterianas unidas a la superficie dentro de una matriz de exopolisacáridos, proteínas y ADN extracelular (86), que confiere a las bacterias un mecanismo de protección para sobrevivir en ambientes desfavorables y durante la infección. El material de esta matriz, aunque es producido por las células individuales, forma estructuras que proporcionan beneficios para toda la comunidad, siendo responsable de que un antibiótico no sea eficaz contra estas bacterias (87). Estos biofilms son complejos y dinámicos (88), ya que las células que lo conforman no son estáticas y son heterogéneas. Esta capacidad permite que las bacterias colonicen equipamientos hospitalarios (89) y también superficies bióticas, como las células epiteliales (90). INTRODUCCIÓN 26 Figura 6. Representación de la formación de biofilm. La formación de biofilm comienza con [1] bacterias individuales flotantes que se disponen en una superficie. [2] Estas células bacterianas se agregan y se unen a la superficie, y [3] crecen y se dividen para la formación de biofilm. [4] Representa una formación de biofilm madura, y [5] parte del biogilm se dispersa para liberar bacterias flotantes libres para una mayor colonización (https://es.wikipedia.org/wiki/Biopelicula). Se ha demostrado que algunos genes están implicados en la formación de biofilms. Los sistemas de regulación de dos componentes y reguladores transcripcionales relacionados con los genes asociados con biofilm son de gran importancia (91). El gen más importante de A. baumannii es CsuE, que es el componente del complejo CsuA/BABCDE. Este gen está implicado en la producción de los pili, y su inactivación provoca que no pueda formarse el biofilm (92). También se ha de descrito en A. baumannii que la OmpA participa en la formación de biofilms en las superficies de plástico, y que es esencial para la adhesión a las células epiteliales del pulmón humano (82). En P. aeruginosa hay un grupo de genes, como cupA, que se requiere para la formación de biofilms en superficies abióticas, que está regulado por el regulador transcripcional MvaT, así como su implicación en el control de la formación de biofilms y la maduración en P. aeruginosa (93). En E. coli se ha establecido que la proteína CsrA sirve como un regulador en la formación de biofilms (94). 3.4.3. Motilidad Para moverse activamente sobre las superficies, las bacterias emplean varios comportamientos como “swarming”, “swimming”, “twitching”, “gliding” y “sliding” (95). El “swarming” y el “twitching”, las principales actividades de la motilidad, se producen sobre superficies blandas y húmedas. El “swarming” es usualmente el INTRODUCCIÓN 27 movimiento de propulsión causado por la rotación de los flagelos (96), mientras que el “twitching” es producido por la extensión de los pili de tipo IV (97). El “swimming” es el movimiento de bacterias individuales en líquido, alimentado por flagelos giratorios. El “gliding” es el movimiento en la superficie activa que no requiere flagelos o pili y consiste en complejos de adhesión focal. El “sliding” es la translocación de superficie pasiva que es alimentado por el crecimiento y facilitado por un agente surfactante (95). P. aeruginosa posee un flagelo polar y múltiples pili de tipo IV (98), por lo que moverse mediante motilidad de tipo “swarming” o “twitching”. P. aeruginosa conserva su flagelo polar pero sintetiza un motor alternativo requerido específicamente para moverse en las superficies y a través de entornos viscoso (99). Por el contrario, A. baumannii no tiene flagelo, y se ha demostrado que tiene la motilidad de tipo “twitching” (100). Sin embargo, E. coli utiliza múltiples flagelos orientados axialmente a lo largo del cuerpo de la célula para propulsarse a través de líquidos (101). Por el contrario, K. pneumoniae se considera no motil, aunque se ha descrito algún estudio en el que se evidencia una motilidad de tipo “swimming” gracias a un flagelo polar (102). 3.4.4. Lipopolisacárido El lipopolisacárido (LPS), que está presente en la membrana externa de los BGN, juega un papel importante en su virulencia. Está compuesto por tres dominios estructurales: un dominio hidrófobo conocido como lípido A (o endotoxina), un núcleo oligosacárido y un antígeno-O altamente variable constituido por unidades repetitivas de oligosacáridos (103). Se ha demostrado su toxicidad letal en ratones, pirogenicidad en conejos y la inactivación del complemento in vivo (104). Además, el LPS activa la respuesta inmune innata (105). Además, se sabe que la resistencia a la colistina en BGN es más común debido a la pérdida de LPS o a su modificación, causada por cambios en phoPQ y PmrAB, lo que resulta en un lípido A menos aniónico (106-108). 3.4.5. Vesículas de membrana externa Las OMVs son nanovesículas esféricas, con un diámetro de entre 20 y 200 nm, de la membrana externa, que tienen contenido periplásmico, y se producen comúnmente en BGN (109). Su composición es ADN, ARN, lípidos, LPS e incluso OMPs (110). Estas vesículas pueden transportar factores de virulencia y participar en la formación de biofilms así como en la transferencia de genes de resistencia a los antimicrobianos INTRODUCCIÓN 28 (111). Por lo tanto, las OMVs tienen gran relevancia no sólo debido a su importancia en la interacción huésped-patógeno, sino también por su capacidad para difundir los genes de resistencia. 3.4.6. Sideróforos Los sideróforos son moléculas de bajo peso molecular quelantes de hierro, de alta afinidad, esenciales en muchos BGN. Su función se ha definido como la quelación y entrega de hierro a las bacterias para su proliferación (112). Es bien conocido que el hierro es esencial para el crecimiento de las bacterias, por lo que estos microorganismos han desarrollado sistemas de adquisición de hierro altamente eficientes, también con el objetivo de obtener hierro del exterior de la propia bacteria (113) . Se han identificado diferentes sideróforos en A. baumannii, como la acinetobactina, acromobactina y fimsbactina A-F, así como la pioverdina y pioquelina en P. aeruginosa o la enterobactina y la aerobactina en E. coli (113). 3.4.7. Quorum sensing El quorum sensing (QS) es un mecanismo de las bacterias para comunicarse de célula a célula mediante la excreción de compuestos químicos (114). Es utilizado por las bacterias para coordinar la expresión de varios rasgos colectivos, incluyendo la producción de múltiples factores de virulencia, la formación de biofilms y de motilidad, una vez que se alcanza un umbral de población (115). El QS depende de la producción, secreción y detección de pequeños autoinductores difusibles, tales como lactonas acilhomoserinas (AHL), oligopéptidos autoinductores (AIP) y el autoinductor-2 (AI-2). Estas AHLs se producen en A. baumannii y P. aeruginosa por la familia LuxI, que interactúa con LuxR (116), mientras que AI-2 se produce en E. coli y K. pneumoniae (117). Existen evidencias tanto in vitro como in vivo que relacionan a los sistemas de QS con infecciones humanas (118). Por otra parte, se ha sugerido que el QS y los sistemas de regulación de la multirresistencia antibiótica podrían tener alguna relación evolutiva y una especial relevancia biológica debido a que los antibióticos también actúan como moléculas señal, y las bombas de eflujo para estos fármacos son también los exportadores para señales de QS (119). INTRODUCCIÓN 29 Tabla 1. Principales factores de virulencia de A. baumannii y su papel en la patogénesis. Tabla 2. Principales factores de virulencia de P. aeruginosa y su papel en la patogénesis. Tabla 3. Principales factores de virulencia implicados en la patogénesis de Enterobacteriales. Factor de virulencia Papel en la patogénesis Porinas (OmpA, Omp33-36, Omp22, CarO, OprD-like) Adherencia e invasión, inducción de apoptosis, resistencia sérica, formación de biofilm, persistencia Polisacárido capsular Crecimiento en suero, supervivencia en infección del tejido, formación de biofilm Lipopolisacárido (LPS) Resistencia sérica, supervivencia en infección del tejido, evasión de la respuesta inmune del huésped Fosfolipasa (C y D) Resistencia sérica, invasión, supervivencia in vivo Vesícula de membra externa Liberación de factores de virulencia, transferencia horizontal de resistencia antibiótica génica Sistema de adquisición de hierro (acinetobactina y NfuA) Supervivencia in vivo, persistencia, killing de células del huésped Sistema de adquisición de zinc (ZnuABC Y ZigA) Supervivencia in vivo Sistema de adquisición de manganeso (MumC y MumT) Supervivencia in vivo Sistema de secreción tipo II Supervivencia in vivo Sistema de secreción tipo VI Killing de bacterias competidoras, colonización del huésped Sistema de secreción tipo V Formación de biofilm, adherencia Proteína de unión a penicilina 7/8 y β-lactamasa PER-1 Resistencia sérica, supervivencia in vivo, adherencia CipA Resistencia sérica, invasión Tuf Resistencia sérica RecA Supervivencia in vivo SurA1 Resistencia sérica, supervivencia in vivo GigABCD Supervivencia in vivo, killing de células del huésped UspA Supervivencia in vivo, killing de células del huésped Pili Adherencia, formación de biofilm OmpR/EnvZ Killing de células del huésped FhaBC Adherencia, killing de células del huésped AbeD Killing de células del huésped Factor de virulencia Papel en la patogénesis Sistema de secreción tipo III Inyección de proteínas efectoras en las células del huésped LasR Quorum sensing RpoN Motilidad PvdS, PhuR Adquisición de hierro AlgU Formación de biofilm RetS Formación de biofilm MucA Formación de biofilm ExoA, ExoS Daño tisular, inhibición de la síntesis proteica LasA, LasB Daño tisular. Degradación de elastina Fosfolipasa C Daño tisular. Disminución de la actividad de neutrófilos en el aparato respiratorio. Ramnolípido Implicado en la infección pulmonar Factor de virulencia Papel en la patogénesis Cápsula Inhibe y evade la fagocitosis por las células del huésped, induce la maduración de células dendríticas, neutraliza la actividad antibacteriana de la defensa del huésped LPS El antígeno O proporciona resistencia sérica Sideróforo Recoge hierro esencial para sobrevivir, fenotipos hipermucoviscosos han sido vinculados a una mayor INTRODUCCIÓN 30 3.5 Opciones de tratamientos actuales El aumento de la resistencia antimicrobiana ha reducido la ventana terapéutica que abarcan los antibióticos. Bajo este escenario, la reintroducción de antibióticos utilizados previamente así como nuevas combinaciones constituyen las nuevas estrategias para tratar las infecciones causadas por cepas multirresistentes (120, 121). A continuación se describe una lista de algunos agentes antimicrobianos utilizados actualmente en el entorno clínico. 3.5.1 Colistina La colistina, también llamada polimixina E, es un lipopéptido aislado de Bacillus polymyxa. El grupo de las polimixinas fue descubierto en la década de 1940, siendo uno de los primeros antibióticos con actividad significativa contra BGN (122). Hay cinco tipos de polimixinas (A-E), pero sólo la polimixina B y E se han utilizado en los seres humanos (123). Sin embargo, en la década de 1970 fueron sustituidos en gran medida por otros antibióticos debido a su nefrotoxicidad y neurotoxicidad (124). Sin embargo, la toxicidad de la colistina fue reevaluada por algunos investigadores, que encontraron que la incidencia de la toxicidad es menos frecuente y grave en comparación con lo que se había informado con anterioridad (125). La alta prevalencia de infecciones por aislados multirresistentes ha producido que se reconsidere la colistina como una opción terapéutica, lo que ha conllevado a un aumento de su uso (123, 126). La colistina es solamente activa contra BGN multirresistentes, incluyendo A. baumannii, P. aeruginosa y Enterobacteriales (127, 128). En cuanto al mecanismo de acción, la colistina tiene una fuerte carga positiva y una cadena de acilo hidrófobo que le proporcionan una alta afinidad de unión a las actividad de fijación de hierro Ureasa Papel limitado en la precipitación de sales inorgánicas que conducen a la incrustación del catéter Fimbria tipo I Involucrado en la formación de comunidades bacterianas intracelulares Fimbria tipo II Importante para la formación de biofilms en superficies bióticas y abióticas Formación de biofilm Promueve la resistencia a la destrucción del hospedador y a los antimicrobianos, se ha demostrado experimentalmente que se ven facilitados en parte por las fimbrias y las cápsulas Resistencia antibiótica La resistencia a carbapenemas limita muchas opciones de tratamiento INTRODUCCIÓN 31 moléculas del LPS. La colistina interactúa electrostáticamente con el LPS, desplazando a los cationes divalentes de la molécula, provocando una desorganización de la membrana externa (129), incrementándose la permeabilidad de la envoltura celular y provocando pérdidas del contenido de la célula y, posteriormente, la muerte celular (130). En este contexto, la resistencia a la colistina ha surgido recientemente en todo el mundo, aunque a niveles relativamente bajos (131). Debido a este hecho, algunos investigadores han concluido que la adquisición de resistencia a la colistina en los pacientes se debe, entre otros, a la propia terapia de colistina y a la transmisión nosocomial de cepas resistentes a este antibiótico (132). Sin embargo, se ha reportado también la aparición in vivo de resistencia a la colistina en los seres humanos sin tratamiento previo con colistina o debido a una transmisión clonal (133). Recientemente, en E. coli, se ha descrito el gen mcr-1, transportado en un plásmido con alta eficiencia de conjugación, que codifica para una enzima fosfoetanolamina transferasa que cataliza un cambio que confiere resistencia a colistina (59). Además, este gen y sus variantes se han detectado en los aislados recuperados de la veterinaria en todo el mundo y de pacientes humanos (134-136). Esto implica que la evolución de la resistencia a la colistina en bacterias podría ser más compleja de lo que se pensaba hasta ahora. 3.5.2 Ceftolozano/tazobactam Uno de los tratamientos más recientes es la combinación de ceftolozano/tazobactam que fue aprobada por la FDA en 2014 y tiene indicaciones para el tratamiento de infecciones intraabdominales en combinación con metronidazol y para infecciones complicadas del tracto urinario. La combinación contiene una nueva cefalosporina, el ceftolozano, combinada con el inhibidor de la β-lactamasa tazobactam. Ceftolozano es estructuralmente similar a la cefalosporina de tercera generación ceftazidima, pero con una cadena lateral modificada que confiere una mayor actividad contra P. aeruginosa a través de una mayor resistencia a la hidrólisis y el flujo de salida. El tazobactam, que tiene décadas de uso como parte de la combinación del inhibidor de la β-lactámico/inhibidor de β-lactamasa piperacilina/tazobactam, restaura la actividad del ceftolozano en presencia de la mayoría de las clases β-lactamasas de clase A y algunas de clase C, y fue más potente que inhibidores de β-lactamasa como sulbactam o INTRODUCCIÓN 32 clavulanato para reducir la actividad enzimática en un 50% contra TEM-1, CTX-M-14 o CTX M-15 (137). El ceftolozano/tazobactam ha demostrado una actividad consistentemente potente contra P. aeruginosa en estudios in vitro, incluso contra aislados altamente resistentes a otras β-lactamasas. En una población altamente resistente de aislamientos de P. aeruginosa (39,1% multirresistentes, 11,6% sensible solo a la colistina) de 31 centros médicos en 13 países europeos, el ceftolozano/tazobactam fue el agente más activo de los que se probaron, inhibiendo el 84,5% de los aislamientos con una CMI ≤ 4-8 mg/L (137). En un estudio con aislados procedentes de un estudio de vigilancia de bacteriemia en Reino Unido, se mostró que el ceftolozano/tazobactam es activo contra el 91,5%-99,7% de las principales especies de Enterobacteriales. Esta actividad incluyó el 97,9% de las E. coli productoras de BLEE, pero solo el 84%-85% de las cepas de Klebsiella y especies de Enterobacter (138). Sin embargo, la combinación ceftolozano/tazobactam no ofreció ganancia en actividad en comparación con cefalosporinas de anteriores generaciones contra especies de Acinetobacter (138). 3.5.3 Ceftazidima/avibactam La combinación ceftazidima/avibactam fue aprobada por la FDA en 2015 con indicaciones para el tratamiento de infecciones intraabdominales en combinación con metronidazol y para infecciones complicadas del tracto urinario. La combinación contiene la cefalosporina tercera generación ceftazidima junto con el nuevo inhibidor de β-lactamasa no β-lactámico avibactam. La ceftazidima tiene actividad contra muchos BGN clínicamente relevantes, como P. aeruginosa; sin embargo, es fácilmente hidrolizado por una variedad de β-lactamasas, lo que limita su eficacia contra patógenos multirresistentes. Avibactam carece de actividad antibacteriana clínicamente significativa; sin embargo, inhibe un amplio espectro de β-lactamasas, con alta afinidad por las enzimas de clase A, C y algunas D, restaurando así la actividad in vitro de ceftazidima (137). Ceftazidima/avibactam es activo contra la mayoría de aislados de P. aeruginosa, incluyendo algunas cepas multirresistentes. De 3.902 aislados de P. aeruginosa en 75 centros médicos de Estados Unidos, el 96,9% fueron susceptibles a ceftazidima/avibactam, más alto que las tasas observadas para la ceftazidima sola, la piperacilina/tazobactam o el meropenem; 83,8%, 78,5% y 81,9%, respectivamente (137). INTRODUCCIÓN 33 En cuanto a Acinetobacter, a pesar de la adición de avibactam, la especie se mantiene resistente a la combinación, probablemente debido a la falta de actividad frente a las betalactamasas tipo OXA (distintas de OXA-48) y a la suma de múltiples mecanismos de resistencia que logra albergar este género. Por todo ello, ceftazidima/avibactam no se encuentra aprobado por la FDA para el tratamiento de infecciones por especies de Acinetobacter (139). Por el contrario, en un estudio con cepas procedentes de 94 hospitales de Estados Unidos, la combinación ceftazidima/avibactam inhibió al 99,9% de aislados de especies de Enterobacteriales, entre las que se encontraban aislados multirresistentes de E. coli y K. pneumoniae (140). 4. Nuevas terapias para tratar las infecciones por BGN La resistencia a los antibióticos es un problema clínico de enorme magnitud que se ve agravado por la falta de nuevos agentes terapéuticos. La retirada del sector farmacéutico del nuevo desarrollo de antibióticos ha agudizado el desafío de la resistencia generalizada y señala una necesidad crítica de innovación, como bien pueden ser los enfoques no antimicrobianos. Todas estas razones han hecho necesaria la búsqueda urgente de nuevas alternativas para el tratamiento y control de las infecciones causadas por BGN. Aproximaciones no bactericidas pero que puedan evitar la infección producida por estos patógenos, ya sean bloquear los factores de virulencia bacterianos o mediante la inmunización del huésped, podrían ser enfoques adyuvantes que logren alcanzar nuevos objetivos terapéuticos. Otro de estos enfoques podría ser el de aumentar la actividad antibiótica en las infecciones por BGN multirresistentes mediante la administración de antibióticos junto con compuestos adyuvantes no antibióticos, que podrían ser fármacos reposicionados para nuevo uso (114). 4.1 Compuestos o inhibidores anti-virulencia El creciente estudio sobre la patogénesis bacteriana y la comunicación intercelular ha revelado muchas estrategias potenciales para desarrollar nuevos fármacos con el objetivo de tratar las enfermedades causadas por bacterias. La interferencia con la virulencia bacteriana y las vías de señalización celular es un enfoque especialmente convincente, ya que se piensa que se aplica una presión menos selectiva para el desarrollo de resistencia bacteriana que las estrategias tradicionales, que tienen como objetivo eliminar bacterias o prevenir su crecimiento (141). INTRODUCCIÓN 34 Las bacterias perciben su entorno y, una vez en el huésped, responden iniciando un programa definido para activar factores de virulencia (141, 142). Estrategias de señalización anti-virulencia pueden interferir específicamente con la capacidad de la bacteria para reconocer las señales del huésped que alertan a estas bacterias que están en el sitio de la infección y activar factores específicos de virulencia que se necesitan para establecer dicha infección. Por este motivo, al prevenir la expresión o actividad de estos factores de virulencia, las bacterias son menos capaces de colonizar al huésped. Se cree que esta inhibición podría permitir que el sistema inmune del huésped, incluida la microbiota, pueda llegar a evitar la colonización bacteriana o aclarar cualquier infección establecida. Además, estas aproximaciones anti-virulencia podrían usarse potencialmente en combinación con antimicrobianos establecidos o novedosos de manera sinérgica para potenciar la vida útil de estas drogas (141, 143). 4.1.1. Inhibidores de quorum sensing Muchas bacterias emplean alguna forma de comunicación intercelular para alertar a los patógenos sobre su concentración bacteriana colectiva. Si se detectan altas concentraciones, los patógenos pueden cambiar sus perfiles de transcripción a un fenotipo más invasivo. Una gran variedad de moléculas naturales y sintéticas puede bloquear la detección del QS y mejorar los resultados en modelos experimentales de infección sistémica. Actualmente, ante la pregunta de si los inhibidores de la detección de QS tendrán un beneficio clínico práctico contra los patógenos multirresistentes, la respuesta sigue siendo objeto de debate científico (144, 145). Se ha demostrado en estudios recientes que extractos de Bacillus indicus, B. pumilus y otras especies de Bacillus, como el SS4, causó una inhibición significativa de las actividades basadas en QS en bacterias gramnegativas, como P. aeruginosa, S. marcescens y especies de Vibrio. Otro trabajo demostró que el extracto D11 (DL-homocisteina tiolactona) fue capaz de inhibir los sistemas de regulación lasR y rhlR de P. aeruginosa (144). 4.1.2. Inhibidores de la adhesión bacteriana Muchas bacterias, como E. coli uropatógena, usan una estructura de unión conocida como pilus para adherirse a la célula del huésped. Se ha demostrado que el tratamiento con pilicidas disminuye la eficacia de la colonización de aislados de este patógeno en el tracto urinario. Los pilicidas son miméticos de las subunidades de pilina que, cuando se incorporan a esta estructura, evitan la elongación y la formación de un pilus funcional. INTRODUCCIÓN 41 Figura 7. Mecanismos de acción de algunos fármacos reposicionados como compuestos antibacterianos. 42 II. FUNDAMENTOS FUNDAMENTOS 43 Muchas organizaciones están de acuerdo en que la aparición e incremento de infecciones por BGN multirresistentes se trata de una amenaza para la salud mundial que necesita soluciones y planes eficaces de manera urgente. La alta tasa de cepas resistentes a la mayoría o a todos los antibióticos utilizados en la práctica clínica está causando infecciones difíciles de tratar, y este problema está directamente asociado a tasas de mortalidad nada despreciables. En este escenario, otro factor negativo que agrava la situación es la falta de desarrollo de otras opciones terapéuticas para el tratamiento de estas infecciones. Por esta razón, existe una evidente necesidad de ahondar en el reto de desarrollar nuevos medicamentos o estrategias para combatir a los BGN multirresistentes y panresistentes. En este contexto, el estudio y la investigación para el desarrollo de alternativas terapéuticas no antimicrobianas, así como el reposicionamiento de fármacos con otro uso terapéutico, son dos de los enfoques científicos más prometedores. Así pues, se consideran como una nueva estrategia alentadora aquellas terapias dirigidas contra patógenos que bloquean los factores de virulencia bacteriana sin inhibir su crecimiento, siendo esto un factor importante ya que existe de esta forma una menor presión selectiva para la generación de resistencia. Ya se ha demostrado en un trabajo de nuestro grupo de investigación la eficacia de un péptido, AOA-2, inhibidor de la OmpA, tanto in vitro, reduciendo la capacidad infectiva de BGN contra el huésped, como in vivo, en modelos experimentales murinos de infección (147). Por tanto, resulta de interés la optimización de esta molécula, con el fin de generar una nueva librería de derivados que mejoren la actividad mostrada por el compuesto inicial. Por otro lado, una alternativa a las estrategias antimicrobianas también sería el reposicionamiento o “repurposing” de fármacos ya desarrollados y aprobados por la FDA. Estos medicamentos, aunque tienen una indicación para otro tipo de enfermedades, constituyen una librería de compuestos con un potencial de presentar actividad contra bacterias. Además, esto supone una gran ventaja en el esfuerzo económico que supone sacar un nuevo compuesto al mercado. En este contexto, los antihelmínticos, usados para el tratamiento de helmintos y lombrices tanto en humanos como en veterinaria, han mostrado un potencial efecto frente a diversos patógenos (168, 170, 171). Así, estos compuestos, usados como adyuvantes al tratamiento antibiótico, pueden ser una aproximación terapéutica muy interesante. 44 III. HIPÓTESIS HIPÓTESIS 45 Las hipótesis de esta tesis doctoral son las siguientes: Capítulo I. 1. El hexapéptido AOA-2 se une a OmpA con alta afinidad y selectividad. 2. El inhibidor de OmpA AOA-2 no tiene efectos sobre la respuesta inmune, innata y adaptativa. 3. La optimización del hexapéptido AOA-2 y sus derivados mejora sus actividades inhibitorias de OmpA en modelos in vitro de infección por A. baumannii, P. aeruginosa y E. coli. Capítulo II. A. Niclosamida 1. La niclosamida presenta una actividad sinérgica en combinación con colistina frente a cepas de A. baumannii y K. pneumoniae sensibles y resistentes a colistina. 2. La niclosamida tiene un efecto sobre las cargas eléctricas de la membrana bacteriana frente a cepas de A. baumannii y K. pneumoniae sensibles y resistentes a colistina. B. Oxiclozanida 1. La oxiclozanida presenta una actividad sinérgica en combinación con colistina frente a cepas de A. baumannii, P. aeruginosa y K. pneumoniae sensibles y resistentes a colistina. 2. La oxiclozanida tiene un efecto disruptivo sobre la membrana bacteriana frente a cepas de A. baumannii, P. aeruginosa y K. pneumoniae sensibles y resistentes a colistina. 46 IV. OBJETIVOS OBJETIVOS 47 El objetivo general de esta Tesis Doctoral es contribuir en el conocimiento sobre el desarrollo y evaluación del uso de fármacos no antimicrobianos como adyuvante al tratamiento antibiótico para las infecciones por BGN multirresistentes. Los objetivos específicos de cada capítulo son los que se describen a continuación: Objetivos del capítulo I 1. Estudiar el mecanismo de inhibición de OmpA por el péptido AOA-2. 2. Estudiar el efecto del AOA-2 sobre la respuesta inmune innata y adaptativa. 3. Modificar la estructura química del hexapéptido AOA-2 para la síntesis de sus derivados optimizados. 4. Estudiar la toxicidad in vitro e in vivo de los derivados optimizados. 5. Evaluar las actividades inhibitorias de los derivados de AOA-2 sobre OmpA de A. baumannii, P. aeruginosa, y E. coli. Objetivos del capítulo II A. Niclosamida 1. Estudiar in vitro el efecto sinérgico de la niclosamida en combinación con colistina frente a cepas de A. baumannii y K. pneumoniae sensibles y resistentes a colistina. 2. Determinar el mecanismo de acción de la niclosamida sobre las cepas dede A. baumannii y K. pneumoniae sensibles y resistentes a colistina. B. Oxiclozanida 1. Estudiar in vitro el efecto sinérgico de la oxiclozanida en combinación con colistina frente a cepas de A. baumannii, P. aeruginosa y K. pneumoniae sensibles y resistentes a colistina. 2. Analizar in vitro el efecto de la oxiclozanida sobre el perfil de las proteínas de la membrana externa de cepas de A. baumannii, P. aeruginosa y K. pneumoniae sensibles y resistentes a colistina. 3. Determinar el mecanismo de acción de la oxiclozanida en cepas de A. baumannii, P. aeruginosa y K. pneumoniae sensibles y resistentes a colistina. 48 V. RESULTADOS 49 1. CAPÍTULO I CAPÍTULO I. Artículo 1 50 1.1. Articulo 1. Combating virulence of Gram-negative bacilli by OmpA inhibition. La OmpA y las proteínas homólogas son un principal factor de virulencia de BGN tales como A. baumannii, P. aeruginosa y E. coli. Esta OmpA está implicada en la adherencia de estos BGN a superficies bióticas y abióticas, así como en la muerte in vitro e in vivo de las células del huésped. En este contexto, la OmpA constituye una diana idonéa para el desarrollo de péptidos con el fin terapéutico del tratamiento de infecciones causadas por estos BGN. En este estudio, se tuvo como objetivo evaluar la actividad in vitro e in vivo de un inhibidor de la OmpA en la infección por BGN, así como su mecanismo. En colaboración con el equipo del Dr. Ernest Giralt, se diseñaron in silico y se sintetizaron seis inhibidores de OmpA positivos y un péptido control negativo. Una vez evaluada la librería peptídica, el AOA-2, el mejor candidato, fue elegido para los estudios posteriores. La afinidad y selectividad de AOA-2 a OmpA fue estudiada mediante ensayos de resonancia magnética STD (Saturation transfer difference) y ensayos de difusión por resonancia magnética. El efecto in vitro de la interacción de AOA-2 entre las cepas A. baumannii ATCC 17978, P. aeruginosa PAO1, E. coli ATCC 25922, y las células epiteliales de pulmón humano (A549) se caracterizó mediante ensayo de adherencia, inmunofluorescencia, de unión a fibronectina, y con un ensayo de viabilidad celular. Además, AOA-2 presentó un efecto sobre la formación de biofilm en una colección de cepas estándar y clínicas de A. baumannii, P. aeruginosa y E. coli. En un modelo de sepsis peritoneal murino, se evaluó la eficacia terapéutica de AOA-2, 10 mg/kg/día por vía intraperitoneal, contra estos patógenos y se determinó la carga bacteriana en bazo y pulmones, así como la bacteriemia y la supervivencia animal. Los ensayos de resonancia magnética STD mostraron que a 8 μM de OmpA, las señales STD obtenidas con -0,75 y -0,5 ppm permitieron sugerir la interacción entre el AOA-2 y el sistema compuesto por OmpA-Triton-X100. Además, se observó una pequeña reducción en la difusión por RM en presencia de OmpA, y una señal detectable de ampliación y una pequeña deviación cuando OmpA fue añadida a AOA-2, lo que sugiere la presencia de una interacción entre OmpA y AOA-2. Por otra parte, se observó una reducción significativa de la adherencia bacteriana a las células A549 y la unión a la fibronectina después tras la incubación de las cepas ATCC 17978, PAO1 y ATCC 25922 con 0,25 y 0,5 mg/ml de AOA-2, así como la protección de estas células epiteliales de la muerte causada por las cepas ATCC 17978 y PA01. El péptido AOA-2 CAPÍTULO I. Artículo 1 57 CAPÍTULO I. Artículo 1 58 CAPÍTULO I. Artículo 1 59 CAPÍTULO I. Artículo 1 60 CAPÍTULO I. Artículo 1 61 CAPÍTULO I. Artículo 1 62 CAPÍTULO I. Artículo 1 63 Supplementary data Figure S1. Structural models generated by docking of peptide AOA-2 into the NMR solution structure of the transmembrane domain of E. coli OmpA (PDB 1G90) and into the homology model of A. baumannii OmpA generated as described under “Methods”. AOA-2 is displayed as sticks. CAPÍTULO I. Artículo 1 64 Figure S2. Structure of six cyclic hexapeptides and peptide control (SXV4) used in the study. CAPÍTULO I. Artículo 1 65 Table S1. MICs of the six hexapeptides for A. baumannii and E. coli. MIC: minimal inhibitory concentration Peptides MIC (µg/mL) A. baumannii ATCC 17978 P. aeruginosa PaO1 E. coli ATCC 25922 AOA-1 >500 >500 >500 AOA-2 >500 >500 >500 AOA-3 >500 >500 >500 AOA-4 >500 >500 >500 AOA-5 >500 >500 >500 AOA-6 >500 >500 >500 SXV4 >500 >500 >500 CAPÍTULO I. Artículo 1 66 Table S2. Percentages of A549 cellular viability assessed through mitochondrial reduction activity (MTT assay) in presence of anti-OmpA hexapeptides and control peptides (SXV4 and COL). COL: colistin. ND: not determined. Cellular viability (%) Peptides 0.25 mg/mL 0.5 mg/mL 1 mg/mL 5 mg/mL AOA-1 98.89 ± 0.41 99.69 ± 0.26 99.7 ± 0.38 ND AOA-2 98.09 ± 0.27 98.33 ± 0.4 98.48 ± 0.55 ND AOA-3 99.27 ± 0.21 99.7 ± 0.14 99.36 ± 0.3 ND AOA-4 99.47 ± 0.39 99.77 ± 0.17 100.13 ± 0.18 ND AOA-5 98.86 ± 0.08 100.05 ± 0.39 100.14 ± 0.46 ND AOA-6 98.31 ± 0.35 99.14 ± 0.44 99.38 ± 0.34 ND SXV4 98.17 ± 0.6 98.79 ± 0.28 98.55 ± 0.21 ND COL ND 91.85 ± 2.67 68.39 ± 2.93 9.88 ± 0.42 CAPÍTULO I. Artículo 1 73 References 1. Baumann, P., Doudoroff, M. & Stanier, R.Y. A study of the Moraxella group. II. Oxidative-negative species (genus Acinetobacter). J. Bacteriol. 95, 1520-1541 (1968). 2. Schaub, I.G. & Hauber, F.D. A biochemical and serological study of a group of identical unidentifiable gram-negative bacilli from human sources. J. Bacteriol. 56, 379-385 (1948). 3. Labrador Herrera, G. et al. Draft Genome sequences of seven multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strains, isolated from respiratory samples in Spain. Genome Announc. 4: e00083-16 (2016). 4. Smani, Y. et al. Platelet-activating factor receptor initiates contact of Acinetobacter baumannii expressing phosphorylcholine with host cells. J. Biol. Chem. 287, 26901-26910 (2012). 5. Holloway, B.W. Genetic recombination in Pseudomonas aeruginosa. J. Gen. Microbiol. 13, 572-581 (1955). 6. Peña, C. et al. Prospective multicenter study of the impact of carbapenem resistance on mortality in Pseudomonas aeruginosa bloodstream infections. Antimicrob. Agents Chemother. 56, 1265-1272 (2012). 7. Boyle, V.J., Fancher M.E. & Ross, R.W. Jr. Rapid, modified Kirby-Bauer susceptibility test with single, high-concentration antimicrobial disks. Antimicrob. Agents Chemother. 3, 418-424 (1973). CAPÍTULO I. Artículo 1 74 Datos adicionales no publicados 1. Estudio del efecto del AOA-2 sobre la respuesta inmune innata y adaptativa. 1.1 Fundamento Los resultados antes citados en el artículo 1 de esta Tesis Doctoral mostraron que el tratamiento con AOA-2 in vivo redujo la carga y la diseminación bacteriana en varios órganos, así como la bacteriemia, y aumentó la supervivencia animal, lo que permite plantear la hipótesis de que la disminución de las funciones bacterianas dependientes de la OmpA, tras su inhibición por AOA-2, molécula que no tiene actividad antibacteriana, permite controlar la infección a través de la respuesta inmune innata. Por ello, nos hemos interesado en el estudio del efecto de AOA-2 sobre la respuesta inmune innata y adaptativa. 1.2 Metodología 1.2.1 Cepas bacterianas Se utilizó la cepa CS01, una cepa clínica de A. baumannii sensible a colistina (CMI 0,03 mg/L) aislada del líquido cefalorraquídeo de un paciente con meningitis antes del tratamiento con colistina (182). 1.2.2 Grupos de estudio Se utilizó un modelo experimental de neumonía no letal. a) Control: animales a los que no se les administraron ningún tratamiento. b) CS01: animales a los que se les inocularon 8,4 log de UFC/ml de la cepa CS01 por vía intratraqueal. c) AOA-2: animales a los que se inyectaron el AOA-2 (10 mg/kg) 2 h por vía intraperitoneal. d) CS01+AOA-2: animales a los que se inyectaron el AOA-2 (10 mg/kg) 2 h tras la inoculación bacteriana de 8,4 log de UFC/ml de la cepa CS01 por vía intratraqueal. 1.2.3 Respuesta inmune innata Grupos de 9 ratones se sacrificaron a las 2, 4, 8, 12 y 24 h. De cada animal se extrajo la sangre mediante un corte en el plexo periorbitario, y se centrifugaron a 4 ºC durante 10 min a 3000 g para obtener el suero. Después, se midieron los niveles séricos de las citoquinas proinflamatorias interleucina-6 (IL-6), factor de necrosis tumoral alfa (TNF- CAPÍTULO I. Artículo 1 75 α) e interleucina-1β (IL-1β) y la anti-inflamatoria interleucina-10 (IL-10), (R&D Systems, casa, España). 1.2.4 Respuesta inmune adaptativa Grupos de 9 ratones fueron utilizados para los diferentes puntos temporales: 1, 3, 7, 14, y 30 días después de la administración del AOA-2. De cada animal se extrajo la sangre y el bazo (los esplenocitos). En cuanto al procesamiento, en ambas muestras se lisaron los glóbulos rojos con tampones específicos, se lavaron, se resuspendieron en un cóctel de superficie (tinción extracelular) usando los marcadores anti-CD4 (PE rat anti-mouse clone GKI. 5, BD Biosciences, España) y anti-CD8 (PE-Ly 7 rat atni-mouse clone 53- 6.7, BD Biosciences, España) para linfocitos T, y anti-CD19 (BV421 anti-mouse clone 6D5, Biolegend, España) para los linfocitos B, el marcador de viabilidad celular (eFluor 780, Sigma-Aldrich, Spain). Después, se lavaron con un Buffer FIX/Wash compuesto de suero fetal bovino a 2%, PBS y azida de sodio a 0,1% y se resuspendieron con el cóctel de marcadores intracelulares (tinción intracelular): anti-IFN-γ (nombre del anticuerpo, casa, país) y anti-TNFα (FITC rat anti-mouse clone XMGI.2, Biolegend, España), y se fijaron para su análisis por citometría de flujo (BD FACSCantoTM II, BD Biosciences, Estados Unidos). 1.3 Resultados 1.3.1 Respuesta inmune innata Para el estudio de la respuesta inmune innata, se midieron un grupo de citoquinas pro- y antiinflamatorias, TNF-α, IL-6, IL-1β e IL-10,, a diferentes puntos temporales: 0; 0,5; 1; 2; 6; 12 y 24 h. Para el grupo control sin infección se midieron solamente los puntos 0, 2 y 6 h, mientras que para el grupo de tratamiento con AOA-2 sin infección se midieron todos los puntos salvo el de 24 h. Para los otros dos grupos, grupo de infección sin y con tratamiento con AOA-2 se midieron todos los puntos temporales. Así pues, para el TNF-α, no hubo respuesta ni para el grupo control sin infección ni para el grupo de AOA-2 sin infección, siendo valores negativos en el ensayo, considerados como 0 pg/mL. Para el grupo de infección sin AOA-2, hubo respuesta a las 1, 2, 6 y 12 h, con valores de 79, 50, 126 y 37 pg/mL de TNF-α respectivamente, hasta descender a las 24 h a valores de 0 pg/mL. En el grupo de infección y tratado con AOA-2, hubo respuesta a las 1, 2, 6 y 12 h, con valores de 52, 38, 107 y 163 pg/mL de TNF-α respectivamente, para descender a las 24 h a valores de 0 pg/ml. CAPÍTULO I. Artículo 1 76 En cuanto a la IL-6, no hubo respuesta tanto en el grupo control sin infección como en el grupo de AOA-2 sin infección a ninguno de los tiempos medidos. Para el grupo de infección sin AOA-2, hubo valores de respuesta a 2, 6 y 12 h, produciendo 2624, 5550 y 5806 pg/mL de IL-6 respectivamente, hasta bajar a 1196 pg/mL a las 24 h. Para el grupo de infección tratado con AOA-2 tuvo valores de respuesta a 2, 6 y 12 h, produciendo 3470, 3607 y 4795 pg/mL de IL-6, hasta bajar a 370 pg/mL a las 24 h. Para la IL-1β, los grupos de control sin infección y AOA-2 sin infección mostraron valores basales de 4 pg/mL en todos los puntos temporales, así como el grupo de infección sin tratamiento. Para el grupo de infección tratado con AOA-2, los niveles de IL-1β se mantuvieron basales en 4 pg/mL, salvo un leve pico a las 12 h, con valores de 6,3 pg/ml de IL-1β. Por último, para la IL-10, tampoco hubo respuesta en los grupos control y el de AOA-2 sin infección. Para el grupo de infección sin AOA-2, el pico de respuesta, aunque leve, se dio a las 6 h siendo de 135 pg/mL de IL-10. Sin embargo, en el grupo infectado y tratado con AOA-2 el pico de respuesta se produjo a las 6 y 12 h, alcanzando valores de 160 y 597 pg/mL de IL-10 respectivamente. Figura A1. Efecto de AOA-2 sobre la producción de citocinas. Niveles de TNF-α, IL-6, IL- 1β, e IL-10 en suero determinados entre 0 y 24 horas en ratones controles, infectados con la cepa CS01 y tratados o no con AOA-2 (10 mg/kg). CTL: control. CAPÍTULO I. Artículo 1 77 1.3.2 Respuesta inmune adaptativa Se estudiaron las poblaciones de linfocitos B CD19+ así como los linfocitos T CD4+ y CD8+ tanto en sangre como en los tejidos del bazo y pulmón (Figura A2). En referencia a la población de linfocitos B CD19+, el tratamiento de AOA-2 en animales sanos mantuvo la población de estas células entre el 40% y el 55% en bazo y sangre a lo largo de todos los puntos temporales de 1, 3, 7, 14 y 30 días, mientras que en pulmón la población de CD19+ era menor, siendo del 37% el día 1, para descender hasta el 7% y 12% en los días 14 y 30, respectivamente. Para el tratamiento de AOA-2 en ratones infectados con la cepa CS01, los linfocitos B CD19+ se mantuvieron en niveles altos, rodeando los 60%, en bazo, mientras que en pulmón fluctuaba; alcanzaba el 20% de CD19+ a los 3 días, pero descendía posteriormente al 9% a los 14 días, para aumentar hasta el 16% en el día 30. En sangre, al igual que en bazo, los niveles de CD19+ se mantenían entre el 40% y el 60% en todos los días. En referencia a los linfocitos T CD4+, el tratamiento de AOA-2 en animales sanos mantuvo la población de estas células entre el 15% y el 22% en bazo y sangre a lo largo de todos los puntos temporales de 1, 3, 7, 14 y 30 días. Sin embargo, en pulmón la población de CD4+ era menor; el 9% en el día 1 hasta descender al 3% y 4% en los días 14 y 30, respectivamente. Para el tratamiento de AOA-2 en ratones infectados con la cepa CS01, los linfocitos T CD4+ se mantuvieron entre el 13% y 16% en bazo durante todos los días, mientras que en pulmón era menor y fluctuante; en el día 1 era del 10%, el día 3 descendían al 5%, aumentaba de nuevo al 10% en el día 14 y volvía a descender al 5% en el día 30. En sangre, la población de CD4+ descendían progresivamente a lo largo del tiempo; de un 21% el día 1 hasta un 10% el día 30. Por último, en relación a los linfocitos T CD8+, el tratamiento de AOA-2 en ratones sanos mantuvo la población de estas células en bazo entre el 11% y 14% en todos los puntos temporales. En el pulmón, la población de CD8 era menor; un 6% el día 1, 7% el día 7, 5% el día 14 y un 3% en el día 30. En la sangre, esta población de CD8+ se mantenía entre el 11% y el 14%, al igual que en bazo, pero descendía el día 30 a un 9%. Para el tratamiento de AOA-2 en animales infectados con la cepa CS01, la población de linfocitos T CD8+ en bazo era del 13% durante los días 1 y 3 y descendía hasta el 9% los días 7, 14 y 30. En pulmón, había un 10% de CD8+ el día 1, y descendían hasta el 3% el día 14, para volver a aumentar al 5% el día 30. En sangre, se producía un descenso considerable de CD8+, del 21% el día 1 hasta el 9% el día 14, para posteriormente aumentar al 12% el día 30. CAPÍTULO I. Artículo 1 78 Además, se estudió el ratio CD4+/CD8+ en el modelo experimental murino de neumonía en los diferentes tejidos en los diferentes grupos (Figura A3). En el bazo, los valores del ratio estaban por encima de 1 en todos los grupos de estudio y puntos temporales, si bien la tendencia a disminuir el ratio en el grupo de la infección sin tratamiento contrastaba con la tendencia en aumento en el grupo de animales infectados y tratados con AOA-2. En pulmón, el ratio más elevado se daba a los 14 días de la infección en el grupo de animales infectados y tratados con AOA-2, aunque este disminuía de nuevo a los 30 días de infección. Todos los demás valores de ratio se encontraban generalmente próximos a los del grupo control, que era entorno a 1. Los valores de ratio en sangre de los grupos infectado, tratado no infectado e infectado y tratado eran menores que el valor del grupo control, que se sitúa entorno a 3, salvo para para el pico de valor que se produce a los 7 días en el grupo de animales infectados y no tratados, aunque posteriormente disminuye a valores por debajo de 2 en los siguientes puntos temporales. CAPÍTULO I. Artículo 1 79 Figura A2. Efecto de AOA-2 sobre la respuesta inmune adaptativa. Poblaciones de los diferentes tipos celular CD19+, CD4+ y CD8+ en bazo, pulmón y sangre a diferentes puntos temporales. CAPÍTULO I. Artículo 1 80 Figure A3. Ratio CD4+CD8+ en bazo, pulmón y sangre en los diferentes puntos temporales. CAPÍTULO I. Artículo 2 81 1.2. Artículo 2. AOA-2 derivatives as outer membrane protein A inhibitors for treatment of Gram-negative bacilli infections. El conocimiento de la patogénesis bacteriana ha hecho posible utilizar diferentes aproximaciones terapéuticas enfocadas a bloquear la virulencia de la bacteria. En este escenario, el bloqueo para prevenir la adhesión de patógenos a las células huésped se considera un enfoque innovador para combatir la infección de bacterias multirresistentes. En estudios previos, identificamos que un hexapéptido cíclico, el AOA-2, inhibía la interacción de BGN como A. baumannii, P. aeruginosa y E. coli, evitando así el desarrollo de infecciones tanto in vitro como en un modelo experimental de sepsis murina. Con estos resultados prometedores, se decidió llevar a cabo la síntesis de una librería de péptidos derivados del AOA-2, con el fin de mejorar la actividad presentada por este compuesto. De esta forma, se obtuvieron diez nuevos péptidos con diferentes cambios y características estructurales; desde un reposicionamiento de la molécula a cambios de aminoácidos, así como adiciones de radicales químicos con el fin de mejorar la solubilidad, o incluso algunos péptidos que mostraron mejor score que la molécula madre. Como primer paso en la evaluación de estos compuestos, se demostró que ninguno de estos péptidos mostró citotoxicidad para las células A549. El efecto de estos derivados peptídicos y AOA-2 a 250, 125, 62,5 y 31,25 µg/mL en la unión de A. baumannii ATCC 17978, P. aeruginosa PAO1 y E. coli ATCC 25922 a las células A549 se caracterizó mediante los ensayos de adherencia bacteriana y de viabilidad celular. Tras un primer cribado se seleccionaron aquellos péptidos que habían reducido la adherencia bacteriana a las células A549 para los tres patógenos en estudio. Estos cuatro péptidos, RW01, RW02, RW03 y RW06 a 250 µg/mL redujeron la unión bacteriana a las células A549, respectivamente, a 80, 56, 53 y 28% (para la cepa ATCC 17978), a 40, 42, 20 y 31%. (para la cepa PAO1), y al 66, 61, 29 y 44% (para la cepa ATCC 25922). Además, dos de los cuatro péptidos, RW01 (para las tres cepas) y RW06 (para las cepas PAO1 y ATCC 25922) a 125, 62.5 y 31.25 µg / mL redujeron la unión bacteriana a las células A549 más que el péptido original AOA-2. A 31,25 µg/mL, RW01 redujo solo la unión de la cepa ATCC 17978 a células A549 cuando se comparó con AOA-2 (44 vs. 48%). Mientras tanto, RW01 y RW06, respectivamente, redujeron la unión bacteriana a células A549 en comparación con AOA-2 (50 y 46% frente a 87%, para la cepa PAO1 y 64 y 72% frente a 82%, para la cepa ATCC 25922). CAPÍTULO I. Artículo 2 82 Con respecto a los resultados de citotoxicidad, RW01 y RW06 a 125 µg/mL aumentaron la viabilidad de las células A549 en presencia de A. baumannii ATCC 17978 o P. aeruginosa PAO1, y en menor medida sólo RW01 aumentó la viabilidad de las células A549 en presencia de E. coli ATCC 25922. En resumen, el proceso de optimización de AOA-2 ha generado dos derivados con resultados in vitro que pueden considerarse prometedores. No obstante, son necesarios estudios in vivo que puedan, por un lado, respaldar estos resultados in vitro y, por otro lado, evaluar la eficacia terapéutica de ambos compuestos en monoterapia y en combinación con antibióticos clínicamente relevantes en infecciones graves por estos BGN. Este trabajo está pendiente de enviar para publicación a la revista Journal of Antimicrobial and Chemotherapy. CAPÍTULO I. Artículo 2 89 RW09, RW10, RW11 and RW13 (31.25, 62.5, 125 and 250 μg/mL, 30 min) and added to the A549 cells for 2 h at 5% CO2 and 37 °C. Subsequently, infected A549 cells were washed five times with prewarmed PBS 1X and lysed with 0.5% Triton X-100. Serial dilutions of these lysates were made and plated on blood agar plates (Blood-Agar Columbia, Becton Dickinson Microbiology Systems, USA) and incubated at 37 °C for 24 h for colony counting and then determination of CFU/mL that attached to A549 cells. 2.7 Statistical analysis Group data are presented as mean ± SEM. Student t-test was used to determine differences between means. Differences were considered significant at P<0.05. The SPSS (version 23.0) statistical package was used (SPSS Inc.). 3. Results 3.1 AOA-2 derivatives synthesis The optimization of the AOA-2 peptide was carried out through an iterative computational design process. This computational design was based on the use of docking techniques with flexible side chains and molecular dynamics, using the data on the interaction of AOA-2 and OmpA detailed above in article 1 of this chapter as experimental restriction. Previously, an exhaustive exploration of its accessible conformational space was made for each molecule. All the interaction calculations were carried out thanks to the access of the "Mare Nostrum" supercomputer of the "Barcelona Supercomputer Center" (BSC). Thus, a total of ten peptides derived from the lead compound, AOA-2 were synthesized (Table 1). CAPÍTULO I. Artículo 2 90 Different changes were carried out to optimize the lead compound. In RW01 solubility was enhanced by the addition of NH2 group. In RW02 and RW03 tryptophan analogs (3Pal: beta-(3-pyridyl)-alanine, and 2Nal: beta-(2-naphtyl)-alanine) were added. In RW06 and RW07 arginine analogs (Dab: 2,4-Diaminobutanoic acid, and lysine) were added. In RW08 and RW09 a repositioning of the hit sequence were made. The remaining peptides RW10, RW11 and RW13 showed a higher docking score than the AOA-2 peptide (Table 1 and figure 1). 3.2 In vitro toxicity of AOA-2 derivatives The study of the toxicity of the synthesized compounds was carried out. The percentage of cell viability on the A549 epithelial cells incubated for 24 h with the different peptides at decreasing concentrations was determined from 500 μg/mL to 3.5 μg/mL. None of the studied compounds showed cytotoxicity at the different concentrations used, being the cellular viability between 94 and 100 % (Table 2). 3.3 In vitro effect of AOA-2 derivatives on A. baumannii, P. aeruginosa, E. coli interaction with host cells 3.3.1 Bacterial adhesion asssay An initial stage of screening of the effect of all peptide derivatives on adherence of A. baumannii ATCC 17978, P. aeruginosa PAO1 and E. coli ATCC 25922 to host cells was carried out. First we showed that RW01, RW02, RW03 and RW06 at 250 μg/mL reduced the bacterial adherence against A. baumannii to 26.18, 43.58, 55.47 and 32.83% respectively, against P. aeruginosa to 40.08, 42.51, 20.71 and 31.14% respectively and against E. coli to 66.66, 61.11, 29.62 and 44.44% respectively. Moreover, RW07 and RW13 reduced also the bacterial adherence against P. aeruginosa to 68.38% and CAPÍTULO I. Artículo 2 91 43.46%, respectively, and against E. coli to 88.88 and 55.55%, respectively, but not against A. baumannii. In the case of RW08, bacterial adherence against A. baumannii and P. aeruginosa was reduced to 75.00 and 33.34%, respectively, but not against E. coli; whereas RW09, RW10 and RW11 reduced bacterial adherence only against P. aeruginosa at 35.34, 57.14 and 70.27% respectively, but not against A. baumannii and E. coli (Figure 2). In summary, four of the ten peptides derived from AOA-2, RW01, RW02, RW03 and RW06 have reduced the adherence of the three pathogens to host cells (Table 3). These four derivatives were selected for the following studies, in which the reduction of bacterial adherence was studied again but at decreasing concentrations of these peptides: 250; 125; 62.5 and 31.25 μg/mL, and compared with those of AOA-2. For A. baumannii, RW01 and RW06 at 250 μg/mL have reduced the adherence of ATCC 17978 to A549 cells to 26.18 and 32.83%, respectively vs. the the 36.62% observed by AOA-2. Also RW01 and RW06 at 62.5 μg/mL have reduced the adherence of ATCC 17978 to 38.42 and 41.52%, respectively, while AOA-2 at the same concentration has reduced only to 44.43% (Figure 3A). For P. aeruginosa, the four peptides RW01, RW02, RW03 and RW04 improved the results of AOA-2; for example, at 250 μg/mL they reduced the adherence of PAO1 to 40.08, 49.23, 20.71 and 31.14% respectively, while AOA-2 at this concentration only reduced the adhesion to 84.47%. For the other concentrations, only RW01, RW03 and RW06 improved the adhesion reduction with respect to AOA-2 (Figure 3B). For E. coli, RW01, RW03 and RW06 reduced the adherence of ATCC 25922 to A549 cells more than with AOA-2; for example, at 125 μg/mL they reduced this adherence to 55.62, 49.52 and 44.58%, respectively, while AOA-2 at the same concentration only reduced the adhesion to 70.73% (Figure 3C). CAPÍTULO I. Artículo 2 92 To summarize, RW01 and RW06 were selected as the peptides with the greatest spectrum of activity against GNB, due to their effect on bacterial adhesion wheb compared to the lead compound AOA-2 (Figure 4). 3.3.2 Cell viability assay The effect of RW01 and RW06 on cell viability in infected A549 cells was explored. Cell survival assesement by MTT assay showed that for A. baumannii treatment with RW01 at 125; 62.5 and 31.25 μg/mL increased the cell viability to 83.56, 75.12 and 72.60%, whereas cell viability of infected cells without treatment with R01 was 70.32%. The treatment with RW06 at the same concentrations increased cell viability to 86.96, 80.18 and 77.30%, respectively. For P. aeruginosa, treatment with RW01 at 125, 62.5 and 31.25 μg/mL increased the cell viability to 87.13, 84.34 and 75.69%, whereas cell viability of infected cells without treatment with RW01 was 67.27%. The treatment with RW06 at the same concentrations increased cell viability to 84.26; 73.85 and 72.28%, respectively. For E. coli, treatment with RW01 at concentrations of 125; 62.5 and 31.25 μg/mL increased the cell viability to 29.21, 24.32 and 23.08%, whereas cell viability of infected cells without treatment with RW01 was 16.50%. The treatment with RW06 at the same concentrations increased the cell viability to 22.97, 17.05 and 17.77% (Figure 5). 4. Discussion Nowadays the threat of antibiotic resistance requires a multiple approach that includes better administration of known antibiotics and the development of new alternative strategies to treat or prevent bacterial infections. CAPÍTULO I. Artículo 2 93 This study focuses on the paradigm of interference in pathogenesis, that is, disarming pathogenic bacteria by neutralizing their virulence factors (17). It was already demonstrated that a cyclic hexapeptide, AOA-2, was able to inhibit the interaction of GNB with host cells and consequently increased the viability of these host cells (11). At the same time, in vivo administration of this compound showed a large decrease in bacterial load in tissues as well as a reduction in bacteremia, together with a significant decrease in mice mortality, especially in A. baumannii. In this scenario, the drug discovery, such as AOA-2, should be considered as an initial stage for the development of a new class of agents with anti-virulence capacity, like other studies that are currently in preclinical stages of development, such as the compound M64 developed against the virulence factor MvfR of P. aeruginosa (18) or the compound 22, a byarilmannoside, against the FimK of uropathogenic E. coli (19, 20). The therapeutic efficacy of these virulence factors should also be further evaluated in in combination with antimicrobial agents used in the clinical setting. For example, AOA-2 has presented good therapeutic efficacy when combined with colistin in murine peritoneal sepsis model by colistin-resistant A. baumannii (12). Taking into account this approach as an adjuvant to antibiotic treatment, it is also necessary to optimize this peptide in order to develop a new library of compounds that improve the efficacy of the lead compound AOA-2. A number of peptides with biological activity, particulary in the field of antibacterial research, have led to new classes of antibacterial drugs (21). On the basis of the fact that AOA-2 has previously proved its utility a as an effective source of anti-virulence compound with specific mechanism of action (11), we have maintained this backbone as the fundamental core in our new derivatives. Three main points of variation have been considered: [1] increasing of peptide solubility by NH2 addition, [2] substituting CAPÍTULO I. Artículo 2 94 tryptophan and arginine by their analogs, [3] and repositioning the general structure of AOA-2. All these derivatives did not show toxicities in human lungs epithelial cells. Similarly, the lead compound AOA-2 did not show toxicity in these host cells (11). This data confirm that the variation made in the AOA-2 structure did not affect the viability of host cells. Bacterial adherence assays were employed to screen the efficacity of these derivatives. Through a various screening steps, two derivatives RW01 (solubility enhancer: NH2) and RW06 (analog of arginine: 2,4-Diaminobutanoic acid) have showed extended spectrum effect on the bacterial adherence to human lung epithelial cells and have been selected for the rest of the experiments. Whereas other tryptohan (3Pal: beta-(3- pyridyl)-alanine, and 2Nal: beta-(2-naphtyl)-alanine) and arginine (lysine) analogs or amino acids repositioning in the lead coumpound have showed short spectrum effect. This could be explained by the fact that these derivatives did not binded equally to OmpA and its homolgous of the all studied GNB, due to difference in the homology of OmpA sequence. Of note, OmpA of A. baumannii present a 58% of homology with OmpA of E. coli and its homologous in P. aeruginosa (22). Interestingly, RW01 and RW06 have prevented significantly the death of human lung epithelial cells caused by A. baumannii and P. aeruginosa, and with lesser effect against E. coli. These results are consistent with previous observations that the lead compound AOA-2 prevents more the cell death caused by A. baumannii and P. aeruginosa than by E. coli (11). The failure of both derivatives against E. coli may be attributable to the presence of other highly virulent factors circumventing the loss of OmpA (23). In summary, the optimization program of AOA-2 has generated two derivatives with in vitro promising results. In vivo studies are necessary to support these in vitro results and CAPÍTULO I. Artículo 2 95 to evaluate the therapeutic efficacy of both derivatives in monotherapy and in combination with clinically relevant antibiotics in severe infections by these GNB. Fundings: This study was supported by the Instituto de Salud Carlos III, Proyectos de Investigación en Salud (grants PI15/01358 and PI16/01378) and by Plan Nacional de I+D+i 2013‐2016 and Instituto de Salud Carlos III, Subdirección General de Redes y Centros de Investigación Cooperativa, Ministerio de Ciencia, Inno-vación y Universidades, Spanish Network for Research in Infectious Diseases (REIPI RD16/0016/0009) ‐ cofinanced by European Development Regional Fund “A way to achieve Europe”, Operative program Intelligent Growth 2014‐2020. Younes Smani is supported by the Subprograma Miguel Servet Tipo I from the Ministerio de Economía y Competitividad of Spain (CP15/01358). Competing Interests: No conflicts of interest to declare. References 1. Tacconelli E, Carrara E, Savoldi A, Harbarth S, Mendelson M, Monnet DL, et al. Discovery, research, and development of new antibiotics: the WHO priority list of antibiotic-resistant bacteria and tuberculosis. Lancet Infect Dis 2018;18:318-27. 2. 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Association of the outer membrane protein Omp33 with fitness and virulence of Acinetobacter baumannii. J Infect Dis 2013;208,1561-70. 17. Dickey SW, Cheung GYC, Otto M. Different drugs for bad bugs: antivirulence strategies in the age of antibiotic resistance. Nat Rev Drug Discov 2017;16:457-71. 18. Starkey M, Lepine F, Maura D, Bandyopadhaya A, Lesic B, He J, et al. Identification of anti-virulence compounds that disrupt quorum-sensing regulated acute and persistent pathogenicity. PLoS Pathog 2014;10:e1004321. 19. Jarvis C, Han Z, Kalas V, Klein R, Pinkner JS, Ford B, et al. Antivirulence isoquinolone mannosides: optimization of the biaryl aglycone for FimH lectin binding affinity and efficacy in the treatment of chronic UTI. Chem Med Chem 2016;11:367-73. 20. Cusumano CK, Pinkner JS, Han Z, Greene SE, Ford BA, Crowley JR, et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Sci Transl Med 2011;3:109-15. 21. 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Peptides Sequence Rational AOA-2 &Trp-D-Pro-Arg-Trp-D-Pro-Arg& Hit compound RW01 &Trp-(NH2) D-Pro-Arg-Trp-D-Pro-Arg& Solubility enhancer RW02 &3Pal-D-Pro-Arg-3Pal-D-Pro-Arg& Analogs of Trytophan RW03 &2Nal-D-Pro-Arg-2Nal-D-Pro-Arg& Analogs of Trytophan RW06 &Trp-D-Pro-Dab-Trp-D-Pro-Dab& Analogs of Arginine RW07 &Trp-D-Pro-Lys-Trp-D-Pro-Lys& Analogs of Arginine RW08 &Arg-D-Pro-Trp-Trp-D-Pro-Arg& Repositioning RW09 &Trp-D-Pro-Trp-Arg-D-Pro-Arg& Repositioning RW10 &Tyr-D-Pro-Ala-Tyr-D-Pro-Ala& Higher score RW11 &2Nal-D-Pro-Arg-3Pal-D-Pro-Arg& Higher score RW13 &3Pal-D-Pro-Arg-Trp-D-Pro-Tyr& Higher score CAPÍTULO I. Artículo 2 105 Figure 4. Bacterial adhesion assay of A. baumannii ATCC 17978, P. aeruginosa PAO1 and E. coli ATCC 25922 at 250 μg/mL of AOA-2, RW01 and RW06. *compared to the control, Student's t-test with P<0.05. CAPÍTULO I. Artículo 2 106 Figure 5. Cell viability assay of A. baumannii ATCC 17978, P. aeruginosa PAO1 and E. coli ATCC 25922 at different concentrations of AOA-2 derivatives RW01 and RW06.*compared to the infection group without treatment, Student's t-test with P<0.05. 107 2. CAPÍTULO II CAPÍTULO II. Artículo 3 108 2.1. Artículo 3. Synergistic activity of niclosamide in combination with colistin against colistin-susceptible and colistin-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae. En la época de la multirresistencia antibiótica, la colistina se considera como uno de los pocos antibióticos eficaces contra aislados clínicos multirresistentes de BGN como A. baumannii y K. pneumoniae. Sin embargo, en los últimos años, el fenómeno de resistencia a colistina entre estos patógenos es una realidad alarmante. En este escenario, las terapias de combinación como una alternativa terapéutica, entre la colistina y otros fármacos antiguos, puede conllevar a la restauración de la actividad de este antibiótico. Por esta razón, el objetivo principal de este estudio fue analizar la actividad de la niclosamida, un fármaco antihelmíntico utilizado para el tratamiento de la helmintiasis en humanos, en combinación con colistina contra cepas suceptibles a colistina (Col-S) y cepas resistentes a colistina (Col-R) de A. baumannii y K. pneumoniae. Mediante el ensayo de microdilución se determinaron las CMIs y se llevaron a cabo curvas de tiempo-muerte. También, se evaluó el potencial zeta de estas cepas Col-S y Col-R de A. baumannii y K. pneumoniae en presencia de la niclosamida. Así pues, la niclosamida en combinación con colistina mostró una mejor actividad contra estas cepas bacterianas. Las curvas de tiempo-muerte mostraron una actividad sinérgica entre la niclosamida y la colistina contra las cepas Col-S y Col-R de A. baumannii y K. pneumoniae, especialmente cuando se añadió una segunda administración de niclosamida o colistina a las 4 h de la curva tiempo-muerte. Las cepas Col-R de A. baumannii y K. pneumoniae, en presencia de niclosamida, exhibieron una mayor carga negativa (-34,95 ± 0.35mV y -38,85 ± 0.92mV) que en ausencia de niclosamida (-26,85 ± 3.65mV y -35,27 ± 0.72mV). Estos datos sugieren que la combinación de niclosamida con colistina puede ser una potencial alternativa para el tratamiento de las infecciones por BGN resistentes a colistina. En este sentido, los siguientes pasos de este estudio serían evaluar la eficacia terapéutica de esta combinación en modelos animales experimentales de infección. CAPÍTULO II. Artículo 3 109 CAPÍTULO II. Artículo 3 110 CAPÍTULO II. Artículo 3 111 CAPÍTULO II. Artículo 3 112 CAPÍTULO II. Artículo 3 113 CAPÍTULO II. Artículo 3 114 CAPÍTULO II. Artículo 3 121 CAPÍTULO II. Artículo 3 122 CAPÍTULO II. Artículo 3 123 CAPÍTULO II. Artículo 3 124 CAPÍTULO II. Artículo 3 125 CAPÍTULO II. Artículo 3 126 CAPÍTULO II. Artículo 3 127 CAPÍTULO II. Artículo 3 128 CAPÍTULO II. Artículo 3 129 CAPÍTULO II. Artículo 3 130 CAPÍTULO II. Artículo 3 137 CAPÍTULO II. Artículo 3 138 Supplementary data 2. Materials and methods 2.4 Checkerboard assay. The assay was performed on a 96-well plate as previously described [1]. Expanded details of this assay is given in supplemental material. Colistin was 2-fold serially diluted along the x axis, whereas oxyclozanide was 2-fold serially diluted along the y axis to create a matrix, where each well consists of a combination of both agents at different concentrations. Bacterial cultures grown overnight were then diluted in saline to 0.5 McFarland turbidity, followed by 1:50 further dilution in cation-adjusted Moeller Hinton Broth (Ca-MHB) and inoculation on each well to achieve a final concentration of approximately 5 × 105 CFU/ml. The 96-well plates were then incubated at 37°C for 18 h and examined for visible turbidity. The fractional inhibitory concentration (FIC) of the colistin was calculated by dividing the MIC of colistin in the presence of oxyclozanide by the MIC of colistin alone. Similarly, the FIC of oxyclozanide was calculated by dividing the MIC of oxyclozanide in the presence of colistin by the MIC of oxyclozanide alone. The FIC index was the summation of both FIC values. FIC index values of ≤0.5 was interpreted as synergistic. CAPÍTULO II. Artículo 3 139 Table S1. Primers list used in this study Pathogen Gene Primer name Sequence Amplicon size (bp) Reference A. baumannii pmrAB pmrAB-F ATGACAAAAATCTTGATGAT 1,335 2 pmrAB-R TCACGCTCTTGTTTCATGTA P. aeruginosa pmrAB pmrAB-F TGCAGGACCTCTACGAACTG 770 3 pmrAB-R AGCTCGGCAACCAGTTGATC pmrAB- F1 TTCGATCTCGACGAACTGCA 874 pmrAB- R1 ACCATGAACCTGCTGCTGTT pmrAB- F2 TGCTGTCGAGCCTCAACCTG 690 pmrAB- R2 CATCGACAAGGACATCGAGC pmrAB- F3 TTGATGGAGCAGATCCTGCT 689 pmrAB- R3 AAGATGATCCGTTACTACGA phoPQ phoP-F GACAACAACACCAAGCTGTT 593 3 phoP-R TGAGGATCAGGATCGGGAAG phoQ-F1 AGCGAATACCACCACGACC 587 phoQ-R1 GAGCATCAGACGGATGCGCA phoQ-F2 TGATGGAACAGCTCTATCCC 633 phoQ-R2 TTGAGCAGGCTCTCGAACT phoQ-F3 GAGGAGTTCTTCGTGTTCGA 606 phoQ-R3 GTCGCGATAGACCTTGTCCA phoQ-F4 AGCAGATAGGCTATCAGTTG 603 phoQ-R4 CCACTGAACATCCGCTCGAA K. pneumoniae pmrAB pmrA-F CGCAGGATAATCTGTTCTCCA 808 2 pmrA-R GGTCCAGGTTTCAGTTGCAA pmrB-F1 GCGAAAAGATTGGCAAATCG 659 pmrB-R1 GGAAATGCTGGTGGTCATCTGA pmrB-F2 CCCTGAATCAGTTGGTTTC 714 pmrB-R2 ATCAATGGGTGCTGACGTT mgrB mgrB- extF AAGGCGTTCATTCTACCACC 253 4 mgrB- extR TTAAGAAGGCCGTGCTATCC phoPQ phoP-F GAGCGTCAGACTACTATCGA 912 2 phoP-R GTTTTCCCATCTCGCCAGCA phoQ-F1 CCACAGGACGTCATCACCA 636 2 This study phoQ-R1 AGCTCCACACCATATAGCTG phoQ-F2 GAACAGGGCGACGACTCTG 617 This study This study phoQ-R2 TGAGAGCGGAAGTCAGGCT phoQ-F3 GATGCTGGAGCAGATAAGCC 621 phoQ-R3 GCAGGTGTCTGACAGGGATT CAPÍTULO II. Artículo 3 140 Table S2. Colistin MICs and description of Col-S and Col-R A. baumannii, P. aeruginosa and K. pneumoniae strains used in this study. Pathogen Strain Reference/Source Description Colistin MIC (mg/L) A. baumannii ATCC 17978 4 Colistin-susceptible reference strain 0.5 #11 5 PDR clinical isolate with R263C amino acid substitution of pmrB 256 #14 5 PDR clinical isolate with R263C amino acid substitution of pmrB 4 #17 5,6 PDR clinical isolate with R263C amino acid substitution of pmrB 4 #21 5,6 PDR clinical isolate with P170Q amino acid substitution of pmrB 128 #113 5,6 PDR clinical isolate with L5S, R207C and G426S amino acids substitution of pmrB 16 P. aeruginosa PAO1 7 Colistin-suceptible reference strain 1 M1 8 PDR clinical isolate with L70R aminoacids substitution of pmrA and V184I; G220D; R286Q; and Y344H aminoacids substitutions of pmrB >512 M2 8 PDR clinical isolate with L70R and D103Y aminoacids substitutions of pmrA, Y344H aminoacids substitution of pmrB and 422G nonstop codon insertion in phoQ >512 M3 8 PDR clinical isolate with L70R and D103Y aminoacids substitutions of pmrA, Y344H aminoacids substitution of pmrB, N187S aminoacid substitution in phoP and 422G nonstop codon insertion in phoQ 64 M4 8 PDR clinical isolate with L70R aminoacids substitution of pmrA, R286Q; L322P and Y344H deletion nucleotides (D aminoacid 46) of pmrB and L50P aminoacids substitution of phoQ 16 M5 8 PDR clinical isolate with L70R aminoacids substitution of pmrA and V5A; L171P; R286Q; L322P and Y344H aminoacids substitutions of pmrB >512 K. pneumoniae CECT 997 9 Colistin-susceptible reference strain 0.5 Kp07 2 Colistin-susceptible clinical isolate 2 Kp21 2 Clinical isolate containing IS1 transposase insertion at nucleotide 22 of mgrB 32 Kp29 2 Clinical isolate with a G56E and M215I amino acids substitution of pmrA, and R63P; S68N and R255G amino acids substitution of pmrB 16 PDR: pandrug-resistant. CAPÍTULO II. Artículo 3 141 Figure S1. Oxyclozanide produce no changes on the OMPs profile of Col-S and Col-R A. baumannii, P. aeruginosa and K. pneumoniae. Protein profile of OMPs of A. baumannii ATCC 17978 and #14 (A), P. aeruginosa PAO1 and M4 strains (B), and K. pneumoniae CECT 997 and Kp21 strains (C) strains in absence and presence of oxyclozanide (2 mg/L) incubated for 4 h or 24 h. Oxz: oxyclozanide. OMPs: outer membrane proteins. CAPÍTULO II. Artículo 4 142 Figure S2. Oxyclozanide effect on the integrity of bacterial cell envelope. TEM images of of A. baumannii ATCC 17978 and #14 strains (A), P. aeruginosa PAO1 and M4 strains (B), and K. pneumoniae CECT 997 and Kp21 strains (C) in absence and presence of oxyclozanide (2 mg/L) incubated for 24 h. Arrows indicate the inner and outer membranes. Oxz: oxyclozanide. TEM: transmission electron microscopy. CAPÍTULO II. Artículo 4 143 References [1] Stokes JM, MacNair CR, Ilyas B, French S, Côté JP, Bouwman C, et al. 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DISCUSIÓN GENERAL DISCUSIÓN GENERAL 146 La resistencia antimicrobiana supone una amenaza cada vez mayor para la salud pública mundial y requiere medidas por parte de todos los sectores del gobierno y la sociedad. Esta preocupación radica en la aparición de nuevos mecanismos de resistencia que se propagan a nivel mundial, lo que pone en peligro la eficacia de la prevención y el tratamiento de una serie cada vez mayor de infecciones por bacterias, entre las que se encuentran de forma subrayada especies de BGN, con el consiguiente aumento de la discapacidad y las muertes, y la prolongación de la enfermedad. De este problema surge una urgente necesidad de desarrollar nuevas moléculas con capacidad antibiótica y/o anti-virulencia, ya sean eficaces en tratamientos en monoterapia como adyuvantes al tratamiento antimicrobiano. En este contexto, el trabajo de esta Tesis Doctoral está enfocado en el estudio sobre la eficacia de nuevos compuestos, ya sean péptidos de nueva creación o moléculas reposicionadas, con diana sobre la membrana bacteriana, para el tratamiento de las infecciones causad por BGN. Capítulo 1: Estudio del mecanismo de inhibición de OmpA por el AOA-2 y optimización de sus derivados en el impacto sobre la virulencia de los BGN. Una de las aproximaciones terapéuticas con mayor interés en investigación para el tratamiento de infecciones bacterianas de cepas multi- y panresistentes es la combinación de agentes antimicrobianos con péptidos inhibidores de factores de virulencia del patógeno (143). En este escenario, como hemos descrito anteriormente, el desarrollo de una librería de hexapéptidos cíclicos para la inhibición de la OmpA, permitió la obtención de un compuesto, el AOA-2, con resultados prometedores tanto in vitro como in vivo. Nuestro grupo demostró recientemente que este inhibidor era capaz de reducir la adherencia de BGN como A. baumannii, P. aeruginosa y E. coli a células epiteliales del huésped, y con ello permitía aumentar la viabilidad de estas células durante una infección por estos patógenos. Además, en un modelo experimental de sepsis peritoneal por A. baumannii, el tratamiento con este AOA-2 redujo la mortalidad de los ratones, traduciéndose en una disminución de la carga bacteriana tanto en los tejidos como en la sangre (147). Además, posteriormente también fue descrita la actividad sinérgica de este péptido en combinación con la colistina en cepas resistentes a colistina de A. baumannii (183), por lo que el AOA-2 resulta un compuesto con resultados experimentales prometedores, usado tanto en monoterapia como en combinación con antibióticos de último recurso como la colistina. En este escenario,